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INTRODUCCION:
Se han descrito muchos mtodos diferentes para la determinacin
cuantitativa de protenas. Estos mtodos difieren entre s en
sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez. La
seleccin del mtodo adecuado se realiza considerando las
caractersticas de las muestras que se desea analizar, que pueden ser
extractos de tejidos o clulas animales o vegetales, lquidos biolgicos
de inters en bioqumica clnica (suero, orina), muestras obtenidas en el
curso de la purificacin de una protena, fracciones de una columna
cromatogrfica, muestras de una protena pura, etc.
En general los mtodos utilizados para la determinacin cuantitativa de
protenas consisten en la determinacin absorciomtrica directa o en
ensayos de tipo colorimtrico, turbidimtrico o fluoromtrico.
Absorciometra de protenas
La mayora de las protenas presentan un mximo de absorbancia a 280
nm aproximadamente, debido principalmente a la presencia de residuos
de triptfano y tirosina, y en mucha menor proporcin fenilalanina. Los
residuos de histidina, cistena y cistina tambin presentan bandas de
absorbancia en el ultravioleta cercano, pero se encuentran a menores
longitudes de onda y son de menor intensidad. La posicin exacta del
mximo de absorbancia, as como el coeficiente de extincin molar de
una protena depende de su composicin aminoacdica. Por consiguiente,
solamente para soluciones de una protena pura, conocida, cuyo
coeficiente de extincin se ha determinado previamente, se puede
calcular la concentracin a partir de su absorbancia.
Se han efectuado estimaciones de la concentracin total de protenas en
mezcla a partir de la absorbancia a 280 nm (A280) o usando la razn
A280/A260 (mtodo de Warburg), que permite corregir el error debido a
la contaminacin por cidos nucleicos, los cuales presentan un mximo
de absorbancia a 260 nm. Las protenas tambin absorben fuertemente
a longitudes de onda menores a 240 nm, debido principalmente a la
contribucin de los residuos de aminocidos aromticos, as como de los
enlaces peptdicos (bajo los 220 nm). La literatura describe mtodos
para efectuar estimaciones de concentracin utilizando la absorbancia en
esta regin. Sin embargo, todas estas estimaciones pueden llevar a un
error considerable debido a la presencia de contaminantes o a una
composicin aminoacdica atpica.
Ensayos colorimtricos
Los ensayos ms usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el
ensayo usando cido bicinconnico (BCA). Los ensayos de Biuret y de
Bradford se utilizarn en el presente prctico. El ensayo de Lowry es de
sensibilidad algo menor que el de Bradford (0,025 - 0,5 mg/ml), sin
embargo es ms confiable, pero es ms complicado.
Cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret
El reactivo de Biuret (sulfato cprico en medio alcalino), reacciona con
compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos dando una
coloracin violeta. El color desarrollado se debe a un complejo de
coordinacin entre el Cu+2 y cuatro tomos de nitrgeno que provienen
de dos cadenas peptdicas. El mtodo de Biuret sirve para la
determinacin de concentraciones entre 10 y 100 mg/ml.
Los dipptidos y los aminocidos (excepto serina y treonina) no dan esta
reaccin. Interferencias: pptidos, Tris, sacarosa y pigmentos biliares
tambin generan el color, sales de amonio y sacarosa afectan el color.
PARTE EXPERIMENTAL
1. ENSAYO DE BIURET
MATERIALES
- Preparacin Reactivo de Biuret:
Colocar 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO 4 x 5 H2O) y 6 g de tartrato de
sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. Agregar
alrededor de 500 mL de agua destilada y agitar hasta disolucin.
Agregar lentamente y agitando constantemente, 300 mL de hidrxido de
sodio 2,5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente.
Agregar 1,0 g de ioduro de potasio y agitar hasta que est totalmente
disuelto. Diluir a 1000 mL y guardar en frasco de polietileno. Este
reactivo es estable indefinidamente. (Se entregar preparado).
- Espectrofotmetro.
- Solucin patrn de albmina 80 g/L
PROCEDIMIENTO
CURVA DE CALIBRACION
Atencin: realice el ensayo de la muestra en forma paralela a la curva
de calibracin. - Disponga de seis tubos y coloque en ellos los
volmenes de solucin que se indican en la tabla:
Tubo
Material
Agua
Muestra
Biuret
Concentracin
referencia
destilada
(L)
(mL)
(mg/mL)
(L)
(L)
15
10
10
15
20
Blanco
20
Muestra
20
CURVA DE CALIBRACION
TUBO
Agua (L)
6
20
M
---
Estndar(L)
7,5
10
15
20
---
---
Muestra (L)
R. Bradford
(mL)
Conc.
Protena
--1
--1
--1
--1
--1
--1
20
1