Abstracto

La separacin de fases es un mtodo simple, eficiente y barato para purificar y

concentrar las protenas de membrana solubilizada con detergente. A pesar de
esto, la separacin de fases no se usa mucho o incluso conocido entre los
cientficos de protenas de membrana, y protocolos listos para su uso estn
disponibles por slo relativamente pocas combinaciones de protenas de
detergente / membrana. Aqu, resumimos los parmetros fsicos y qumicos que
influyen en el comportamiento de separacin de fases de los detergentes de uso
comn para los estudios de protenas de membrana. Se proporcionan ejemplos
para la purificacin con xito de las protenas de membrana utilizando este mtodo
con diferentes clases de detergentes. Como la eleccin del detergente es crtico
en muchas aplicaciones posteriores (por ejemplo, la cristalizacin de protenas de
membrana o ensayos funcionales), se discute cmo los nuevos protocolos de
separacin de fases se pueden desarrollar para un sistema tampn detergente
dado.

Introduccin
Los detergentes se utilizan para extraer protenas de la membrana de las
membranas biolgicas y para mediar su solubilidad en soluciones acuosas, lo cual
es un requisito previo para una mayor purificacin de protenas (1).Purificacin de
protenas de la membrana es generalmente tedioso (2), ya que se eliminan de su
entorno nativo de membrana en un tampn detergente que pueden mimetizar slo
parcialmente las propiedades fsicas y qumicas de una membrana lipdica. Por lo
tanto, muchas protenas de la membrana no conservan su actividad biolgica
despus de la extraccin, o lo hacen slo parcialmente o slo bajo condiciones de
tampn muy especiales.
Despus de la extraccin, purificacin de protenas de membrana se logra
generalmente por los mismos mtodos utilizados para la cromatografa de
protenas solubles, siendo la diferencia que los detergentes deben estar presentes
en las memorias intermedias en todo momento. Detergentes no interfieran con
intercambio inico o cromatografa de quelatos metlicos, y slo a veces con otros
mtodos de cromatografa de afinidad. En la cromatografa de exclusin por
tamao, el peso molecular aparente de protenas de la membrana se incrementa
por el detergente unido.
La separacin de fases es una poderosa alternativa o adicin a los protocolos de
purificacin basado en la cromatografa. Puede ser utilizado directamente en las
membranas solubilizadas, separando las protenas de membrana de las protenas
solubles y otras impurezas hidrfilas. Tales protocolos de purificacin brutos se
utilizan en la protemica membrana o como una primera etapa de purificacin,
seguido por cromatografa (3, 4).Alternativamente, la separacin de fases puede

ser explotado como una concentracin simultnea y etapa de pulido en una etapa
posterior de purificacin (5).
El uso de etapas de separacin de fase en la purificacin de protenas de la
membrana tiene una serie de beneficios.Los protocolos son simples de usar, no
requieren equipos de laboratorio complejos, son fcilmente ampliarse a grandes
volmenes, y son compatibles con la mayora de los mtodos
cromatogrficos. Especialmente, la eliminacin de compuestos hidrfilos es muy
eficiente. Por otra parte, las protenas de membrana pueden purificarse y se
concentraron al mismo tiempo, comparable en eficacia con protocolos de
precipitacin de las protenas solubles que emplean (NH 4) 2 SO 4 u otras
sales. Una posible desventaja del mtodo son las altas concentraciones de
detergentes implicados, que pueden ser desfavorable para la estabilidad de la
protena y puede interferir con los ensayos bioqumicos y procesos de unin. La
dilisis u otros mtodos como la absorcin de detergente o de filtracin en gel
pueden ser necesarias para eliminar el exceso de detergente de la solucin.
A continuacin, describimos los parmetros fsicos y qumicos que influyen en la
separacin de fases de las diferentes clases de detergentes de uso comn en la
purificacin de protenas de membrana. Se discuten los protocolos de separacin
de fases exitosas y dar pautas sobre cmo estos protocolos se pueden adaptar a
los nuevos sistemas tampn detergente.
Propiedades General de Detergentes
Los detergentes son molculas anfipticas por lo general consisten en un grupo de
cabeza polar o cargado y una cadena hidrocarbonada hidrfoba extendida. A
concentraciones muy bajas, estas molculas son solubles en agua como
monmeros. Al aumentar la concentracin de detergente por encima de la
denominada concentracin micelar crtica (CMC), las molculas de detergente
forman agregados con una distribucin de tamao muy estrecha, llamada
micelas. El tamao de las micelas es dependiente del tipo de detergente; para
detergentes usados tpicamente en la bioqumica de la membrana, el nmero de
agregacin (es decir, el nmero de molculas de detergente por micela) puede
variar de 2 a 3 para colato de sodio a aproximadamente 140 para Triton X100 (6). Por otra parte, el tamao de la micela y CMC dependen de la fuerza
inica y la temperatura de la solucin de detergente. Mientras que la CMC de
detergentes inicos disminuye con el aumento de las concentraciones de sal, pero
apenas se ve afectado por la temperatura, la CMC de los detergentes no inicos
es de slo poco afectada por la presencia de sales, pero aumenta al aumentar la
temperatura (7). Otros factores que influyen en el tamao de la micela y la CMC
son la presin, el pH y la presencia de impurezas (6).
Point Cloud y separacin de fases
El punto de enturbiamiento llamada puede ser alcanzado mediante el aumento de
la concentracin de detergente o cambiando la temperatura o la concentracin de

sal de una solucin micelar acuosa de detergente. La solucin micelar entonces se

convierte en turbia; las micelas se convierten en inmiscible con agua y forman
grandes agregados que se separar de la fase de agua. La mayora, pero no
todas las particiones de detergente en la fase rica en detergente, que a su vez
contiene todava una cantidad sustancial de agua. Dependiendo del detergente y
las condiciones de tampn, la fase rica en detergente puede ser completamente
transparente o turbia y se puede encontrar en la parte superior o por debajo de la
fase de detergente pobres. Este proceso se llama separacin de fases o, a veces,
la extraccin de nubes de puntos. La separacin de fases se produce debido a
una diferencia de temperatura dependiente de la entropa entre el sistema de una
sola fase y de dos fases. El efecto es similar a la precipitacin de protenas
utilizando polietilenglicol (PEG) o (NH 4) 2 SO 4, donde no hay suficiente agua libre est disponible para
mantener la protena totalmente hidratado y, por tanto, soluble. Del mismo modo, las micelas de detergente
agregarse y formar una fase separada en la que menos agua cubre su superficie,
y este comportamiento de agregacin es influenciada por la temperatura, sales, y
polmeros.
Diagramas de fase
La Figura 1 muestra dos ejemplos simplificados de diagramas de fase de
detergente en solucin acuosa, que muestra el comportamiento de fase de dos
detergentes diferentes al aumento de la temperatura y / o concentracin de
detergente. Todos los detergentes son monomrica en solucin a bajas
concentraciones. La lnea que separa la solucin de detergente monomrica de la
solucin de micelas representa la CMC que por s mismo es dependiente de la
temperatura. Por encima de esta concentracin, el detergente forma micelas de un
tamao definido. La frontera entre la solucin micelar y la separacin de fases en
el diagrama de fase se llama ya sea lmite superior o inferior consolucin. En la
Figura 1A, del punto de enturbiamiento del detergente se alcanza mediante el
aumento de la temperatura de una solucin de micela de concentracin intermedia
de cruzar el lmite inferior consolucin, mientras que el punto de enturbiamiento
del detergente en la Figura 1B se alcanza por la disminucin de la temperatura de
una solucin de micela del compuesto intermedio concentracin de detergente
para cruzar la frontera consolucin superior.Comportamiento de fase como en la
Figura 1A es tpico de detergentes a base de PEG, mientras que un lmite superior
consolucin como en la Figura 1B se observa para muchos detergentes de ion
hbrido y glicosdicos. Cuando se alcanza el punto de enturbiamiento, el
detergente se formar una fase separada, y la fase acuosa se agota de
detergente. A muy alta concentracin de detergente y baja temperatura (por lo
general en concentraciones que no son pertinentes a efectos bioqumicos), una
fase cristalina lquida formar que contiene molculas de detergente bien
ordenadas. Fases cristalinas lquidas se pueden clasificar en fases cbicas,
hexagonales, o laminares (8)dependiendo de muchos factores que no se discuten
aqu. Es importante tener en cuenta que la temperatura en funcin diagramas de
fase de concentracin puede cambiar drsticamente cuando se vara la fuerza
inica de la solucin. Por lo tanto, el punto de enturbiamiento de una solucin de
micela se puede alcanzar mediante la adicin de sal en lugar de cambiar la

temperatura. Esto ha sido estudiado extensivamente para detergentes de la familia

de Triton(9). Otros aditivos como glicerol o urea afectan en gran medida el
comportamiento de fase de un detergente, al igual que la presencia de lpidos en
micelas mixtas (10) y la adicin de polmeros (vase la seccin siguiente).

Figura 1. (A) Un diagrama de fase

simplificada de un detergente con
un lmite inferior consolucin.
(Click para ampliar)

El uso de separacin de fases para

purificar protenas de membrana
La separacin de fases a base de
detergente se desarroll a partir de la
separacin de fases a base de
polmero.Cuando
dos
polmeros
solubles en agua suficientemente
diferentes (por ejemplo, dextrano y
PEG) se mezclan en solucin a
concentraciones elevadas, se forman
dos
fases
acuosas
inmiscibles. Diferentes protenas se
repartir en las dos fases en funcin de sus propiedades fsicas y las propiedades
de los polmeros (11). Cuando se utilizan polmeros de diferentes cargas (por
ejemplo, catinico o derivados de PEG aninicos), una protena puede ser
desplazado de una fase a la otra simplemente cambiando el pH desde arriba por
debajo de su punto isoelctrico a baja fuerza inica del sistema de
tampn (12) . Las variaciones de este mtodo son sistemas de dos fases que
comprenden PEG y sal (13). Los sistemas acuosos de dos fases se han adaptado
a los procesos a escala industrial(14), pero slo se utiliza con poca frecuencia en
aplicaciones de laboratorio.
Sistemas de dos fases acuosas a base de polmero se puede utilizar para
protenas de membrana solubilizada con detergente, donde las propiedades del
detergente unido influir en la particin de la protena de membrana en
cuestin. Como esto implica dos polmeros, adems de la protena y el detergente,
tales sistemas son difciles de manejar, y la eliminacin de polmeros para
aplicaciones de aguas abajo es un desafo adicional. Pero el sistema PEGdextrano en combinacin con el detergente Triton X-100 ha sido utilizado con xito

para purificar Escherichia colifosfolipasa membrana externa (15) y Micrococcus

lysodeikticus B556 citocromo (16).
Los detergentes pueden eliminar gradualmente separada en la presencia de un
solo polmero, reduciendo la complejidad del sistema. En este caso, las propias
micelas de detergente toman el papel del segundo polmero. Esto funciona para
muchos detergentes no inicos en combinacin con PEG o dextrano y se ha
utilizado en la purificacin de protena de membrana (17). Cuando se aade una
etiqueta hidrfobo para protenas solubles de otro modo, pueden repartirse en la
fase rica en detergente en tales sistemas (18). La separacin de fases se puede
realizar tambin en sistemas sin otros polmeros, a condicin de que el punto de
enturbiamiento del detergente en cuestin est a una temperatura no es perjudicial
para la estructura y funcin de las protenas. Si este no es el caso, el punto de
enturbiamiento puede ser modificado por la adicin de sales o un cambio de pH,
como se explica en las siguientes secciones para las diferentes clases de
detergentes y que se muestra en la Figura 2. La separacin de fases de los
detergentes
es
fcilmente
ampliado
y
se
aplica
a
procesos
industriales (19, 20, 21).
La familia de Tritn
Protocolos ms indicadas para la separacin de fases se basan en detergentes de
la familia. Triton terc poli octilfenol (ethyleneglycolether) n est disponible
comercialmente bajo diferentes marcas comerciales. Las ligeras diferencias entre
los productos estn en el tamao medio de n y la distribucin del tamao del grupo
de cabeza a base de PEG.En Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), y Igepal CA630, n es 9,6, 9,0, y 9,5, respectivamente (22).
La separacin de fases clsico utilizado para protenas de membrana se basa en
el detergente Triton X-114 (n = 7-8) y fue desarrollado por Bordier en
1981 (23). Este detergente tiene un punto de enturbiamiento en alrededor de 22
C a concentraciones relevantes para el trabajo de protena de la membrana, lo que
permite una fcil separacin a temperatura ambiente, mientras que slo una fase
est presente cuando las muestras se mantuvieron en hielo.Muchas protenas de
membrana diferentes se han extrado y purificado usando el sistema de Triton X114 a partir de tejidos animales y vegetales, as como a partir de
microorganismos (22). Para una mejor separacin de las dos fases, un colchn de
sacarosa 6% puede ser utilizado; despus de la centrifugacin a temperatura
ambiente, la fase rica en detergente puede ser recogida desde debajo del colchn
de sacarosa (24). En los casos en que la temperatura ambiente no es favorable
debido a la estabilidad de la protena limitada, el punto de enturbiamiento de Triton
X-114 puede reducirse a 4 C mediante la adicin de 15% -20% de glicerol (25).
Triton X-100 tiene un punto de enturbiamiento de 64 C (23) y por lo tanto
necesita aditivos que reducen la temperatura de trabajo para la separacin de

fases con protenas de membrana. Adicin> 9% de (NH 4) 2 SO 4 o> 16% de NaCl

se reduce el punto de turbidez de 2% de Triton X-100 a la temperatura
ambiente (9), que puede ser explotada para el fraccionamiento de protenas de la
membrana (26). La fase rica en detergente se convierte en slido a
(NH 4) 2 SO 4 concentraciones> 20%, probablemente forman una fase cristalina
lquida como se discuti previamente. NP-40 comporta de manera similar, pero
necesita concentraciones de sal ligeramente inferior para la separacin de fases a
temperatura ambiente (9).
Todos terc detergentes a base de octilfenol absorben fuertemente la luz UV, que
puede interferir con los ensayos pticos. Adems, tienen CMC bastante bajas y no
pueden eliminarse de la solucin por dilisis. Por lo tanto, no son una opcin ideal
para muchas aplicaciones, aunque son detergentes suaves que rara vez
desnaturalizan las protenas de membrana.
La Familia Tween
Tween detergentes son steres de sorbitn de polioxietileno de cidos grasos
que se utilizan para la solubilizacin de protenas de membrana porque son
relativamente suaves detergentes que rara vez interfieren con ensayos
enzimticos (6). En cuanto a Triton y otros detergentes no inicos, los efectos de
la sal sobre el nmero de los detergentes Tween CMC y la agregacin son
bajos (27). La separacin de fases de una solucin de 2% de Tween 20 o Tween
80 puede ser iniciada mediante la adicin de 16% o 12%
(NH 4) 2 SO 4, respectivamente (9), o
por
la
adicin
de
PEG
o
dextrano (17). Tween 80 en combinacin con dos polmeros complejos se ha
utilizado para purificar apolipoprotena A1 humana y recombinante (28). Con
frecuencia, los detergentes Tween slo se utilizan para solubilizar protenas que
son a continuacin, utilizando el mtodo de Triton X-114 descrito bien debido a sus
propiedades muy similares de fases separadas. Tween 20 y Tween 80 pueden
reemplazar Triton X-100 en los protocolos de separacin de fases usando
polmeros (29).
Polioxietilenglicol monoter Detergentes
Monoteres de glicol de polioxietileno estn disponibles comercialmente en
muchos diferentes longitudes de cadena, ya sea como sustancias puras o mezclas
de una distribucin de tamao determinado. Una lista de los detergentes
disponibles PEG-monoter y sus puntos de enturbiamiento, CMC, y los nmeros
de agregacin se puede encontrar en varias revisiones de qumica
fsicos (30, 31). Se nombran C x E y de acuerdo a su longitud de cadena
alqulica (x) y el nmero de unidades de glicol de polioxietileno en el grupo de
cabeza (Y). Con frecuencia, estos detergentes son ms conocidos por sus
nombres comerciales (por ejemplo, Brij 35 para C 12 E 23 o Emulgen 147 para

C 12 E 25). El punto de turbidez de estos detergentes depende de la longitud de la

cadena alquilo, as como del grupo de cabeza; en longitud de cadena alqulica
constante, el punto de la nube aumenta con el tamao del grupo de cabeza (por
ejemplo, de 5 -8 C para C 8 E tres a 96 C para C 8 E 8). Al mismo tiempo, el
punto de turbidez disminuye con el aumento de tamao de la cadena alquilo (por
ejemplo, desde 43 C para C 8 E 4 a 4 C para C 12 E 4) (31). A pesar de esta
amplia variabilidad de puntos de enturbiamiento que debe permitir la separacin
de fases bajo casi cualquier condicin de tampn a temperatura ambiente, existen
pocos protocolos para la purificacin de protenas de membrana utilizando PEG
separacin de fases monoter. Recientemente, C 8 POE, un C 8 E x mezcla con x =
2-9 se ha utilizado en la purificacin de una protena de la membrana externa
bacteriana. El componente principal de C 8 POE es C 8 E 4, cuya nube de puntos es 43 C, pero la
nube de puntos se modific a la temperatura ambiente con la ayuda de 20% (NH 4) 2 SO 4 (5). Una ventaja
importante de C 8 POE sobre Tritn X-114 es su alta CMC, lo que permite una fcil
extraccin de exceso de detergente por dilisis. C 10 E 4 muestra las mismas
propiedades, favorables con la ventaja aadida de que la separacin de fases se
produce a temperatura ambiente ya en tampones con poca sal (32).
Al igual que con los detergentes de la serie Triton y Tween, monoteres de glicol
de polioxietileno se pueden utilizar en la separacin de fases a base de polmero
con dextrano o PEG. Un estudio detallado con la protenas de la membrana
bacteriorodopsina y colesterol oxidasa se hizo para los detergentes C 12 E 5,
C 12 E 8 y C 12 E 23 (es decir, Brij 35) en combinacin con T500 dextrano o PEG
40000. Ambos polmeros cambi el puntos de enturbiamiento de los detergentes
de tal manera que la separacin de fases se produjo a temperatura ambiente,
mientras que slo exista una fase a 4 C (17). Del mismo modo,
polivinilpirrolidona se puede utilizar para inducir la separacin de fases de
detergentes a base de PEG (33).
Detergentes glicosdicos
Los detergentes con grupos de cabeza glicosdicos se utilizan frecuentemente en
la cristalografa de protenas de membrana. Los detergentes ms comunes de
esta clase son alquilo beta-glucsidos y alquil -maltosides, con longitudes de
cadena de alquilo tpicamente van desde 8 a 14. Parece que los detergentes
glicosdicos tienen propiedades nicas en comparacin con detergentes que
tienen otros grupos de cabeza, que los hace especialmente adecuados para la
solubilizacin y estabilizacin de protenas de la membrana; la regin de interfaz
de micelas -dodecilmaltsido (-DM) proporciona un microambiente acuosa-like,
que no es el caso para otros detergentes (no-glicosdicos) (34). En los sistemas de
tampn que contienen PEG, los diagramas de fase de detergentes glicosdicos
muestran un lmite consolucin superior y por lo tanto se someten a separacin de
fases a baja temperatura (35)(Figura 1B). Esto puede ser explotado para la
purificacin de protenas de membrana, utilizando PEG (o dextrano) con -

octilglucsido (-OG), -dodecil-maltsido (17, 36), o -octylthioglu-coside (OTG) ( 37, 38). Dependiendo de la relacin de detergente y de lpidos, la
separacin de fases de -OG puede ocurrir durante la solubilizacin de la
membrana sin la adicin de polmeros y se ha utilizado para purificar receptor
nicotnico de acetilcolina (10).
Otros detergentes no inicos
N,
N-dimetildodecilamina-N-xido
(DDAO;
tambin
llamado
N,
Nlaurildimetilamina-N-xido o LDAO) ha sido utilizado con xito para purificar
centros de reaccin bacterianas a travs de la separacin de fases. En esta
aplicacin especial, se utiliz un cambio de pH 8,0 a un pH <7,0 para iniciar la
separacin de fases. La fase rica en detergente tiene una densidad muy similar a
la fase de agua en este sistema, lo que resulta en una emulsin que no se separa
fcilmente tras la centrifugacin (39). La separacin de fases es promovida por un
aumento de la temperatura, pero es inhibida por adicin de sal (40).
Digitonina, un detergente suave utilizado principalmente para la solubilizacin
selectiva de protenas de la membrana plasmtica eucariotas (41), se puede
utilizar en los procedimientos de separacin de fases. La separacin de fases se
lleva a cabo despus de la adicin de 13% de PEG 6000 a 0 C a digitonina
solubilizadas en membranas (por ejemplo, de staphy-lococci) (42).
Muchas otras clases de detergentes no inicos se utilizan en la bioqumica de
protenas de membrana y cristalografa para los que no existe informacin
detallada sobre los diagramas de fase y los puntos de la nube. Ejemplos de tales
detergentes son alquil-N-metilglucamidas (MEGA-8 a MEGA-10) (43) y 6-O- (Nheptylcarbamoyl) -methylglucosid (HECAMEG), todos los cuales son fcilmente
dializable y no desnaturalice las protenas de membrana incluso a altas
concentraciones.
Zwitterinica Detergentes
Muchos diagramas de fase de detergentes zwitterinicos muestran un lmite
superior consolucin (44), similar a la de los detergentes glicosdicos (Figura
1B). Su punto de turbidez aumenta al aumentar el tamao de la cadena de
alquilo.Desafortunadamente, existen estudios fsico-qumicas detalladas slo en
dimethylammonioethylsulfates de alquilo y alquil-sulfatos dimethylammoniopropyl
que se utilizan para la extraccin de pequeos compuestos orgnicos hidrofbicos
y
no
para
la
protena
bioqumica
de
la
membrana (44, 45). Dimethylammoniopropylsulfonates alquilo (longitudes de
cadena alqulica de entre 10 y 16, ms conocido como detergentes sulfobetana o
Zwittergents) son detergentes suaves utilizados para la solubilizacin de
protenas de membrana (46). Sus puntos de enturbiamiento se encuentran por

debajo de 0 C; por lo tanto, su lmite consolucin superior no se puede cruzar

para inducir la separacin de fases por disminucin de la temperatura a menos
aditivos tampn traer la nube de puntos a la temperatura ambiente (44). El
detergente bipolar basado en colato 3 - [(3-colamidopropil) -dimethylammnio]
sulfonato l-propano (CHAPS) (47) se utiliza con frecuencia para solubilizar
protenas de membrana; Sin embargo, no existe informacin sobre los diagramas
de fase o puntos en la nube, mientras que C 8 -lecithin est bien estudiado por su
comportamiento de separacin de fases, pero no se ha utilizado en la extraccin
de protenas de la membrana (48).
Detergentes aninicos
Dodecil sulfato de sodio (SDS) se utiliza con frecuencia en aplicaciones de
protenas, pero por lo general desnaturaliza las protenas. En cuanto a otros
detergentes aninicos, el comportamiento de la solucin de SDS es fuertemente
dependiente de la fuerza inica del sistema tampn. El nmero de agregacin de
SDS a ms del doble de 62 a 132, mientras que su CMC se reduce 16 veces a
partir de 8,1 a 0,5 mm cuando la concentracin de NaCl se incrementa desde 0
hasta 500 mM a partir de 25 C (49). Para inducir la separacin de fases SDS,
NaCl 0,4-0,5 M se aade a la mezcla de protenas SDS (50, 51). Obviamente, la
mayora de las protenas se desnaturalizan cuando se expone a altas
concentraciones de SDS, pero es concebible que las protenas de membrana
extremadamente estables (por ejemplo, algunas protenas de membrana externa
bacterianas) pueden purificarse usando SDS. El detergentes colato y desoxicolato
aninico parecen estabilizar protenas de membrana muy bien, pero se precipitan
despus de la adicin de sales y por tanto no puede ser utilizado para la
separacin de fases (9).
Catinico Detergentes
Los detergentes catinicos desnaturalizan mayora de las protenas, al igual que lo
hace SDS (52). Sin embargo, bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB o C 12 TAB)
ha sido utilizado con xito para aislar la rodopsina intacto de retina
bovina (53). Por lo tanto, tambin detergentes catinicos podran utilizarse en los
procedimientos de separacin de fases para el aislamiento de protenas de
membrana. Cloruro de tricaprililmetilamonio (Aliquat-336) en combinacin con
Na 2 SO 4 permite concentrar las toxinas peptdicas de muestras de agua a travs
de la separacin de fases (54). Varios protocolos de separacin de fases utilizan
mezclas de catinico con detergentes no inicos. La adicin de pequeas
cantidades de DTAB induce la separacin de fases de LDAO en la purificacin de
centros de reaccin bacterianas (39). Las mezclas de C 10 E 4 con C 10 TAB
mejorar la purificacin basada en la separacin de fase de glucosa
deshidrogenasa-6-fosfato (55).

Las mezclas de detergentes

En algunos casos, puede ser favorable para mezclar diferentes detergentes para
modificar las propiedades de separacin de fases de un tampn detergente. Las
mezclas de no inicos con detergentes catinicos se han utilizado con xito para
purificar protenas de la membrana (vase la seccin titulada catinico
Detergentes), y mezclas de C 10E 4 y plomo OTG a propiedades mejoradas de
separacin de fases en la purificacin de centros de reaccin bacterianas en
comparacin con los detergentes individuales ( 56). Una mezcla de Triton X-114 y
el detergente zwitterinico SB-10 asegura la solubilizacin completa y el
enriquecimiento de las protenas de membrana a travs de la separacin de fases
para los estudios de protemica, mientras que cada nico detergente
no (3). Muchos detergentes estn disponibles comercialmente como mezclas de
diferentes longitudes de cadena alquilo o grupo de cabeza, lo que los hace barato
y por lo tanto aplicable a los procesos a gran escala [por ejemplo,
Triton (57),Angrimul (58), o Lorol (21)]. Si el uso de una mezcla de detergentes
es aceptable para la purificacin de una protena de membrana depender
principalmente de las aplicaciones posteriores; en la cristalografa de protenas de
membrana, donde la pureza del detergente influye en la calidad del cristal, este
ser sin duda un problema.
La eliminacin del detergente
Las protenas de membrana particin en la fase detergente ricos durante la
separacin de fases. Las altas concentraciones de detergente en esta fase
pueden ser perjudiciales para la protena, y la viscosidad de la fase plantea
problemas tcnicos para la manipulacin de lquidos (por ejemplo, por pipeteado
de volmenes precisos). El cobro de la fase rica en detergente y diluyndolo es la
forma ms simple de volver a establecer una solucin micelar de una fase. La
dilisis contra un tampn con una concentracin de detergente definido slo
funcionar para detergentes con un alto CMC, pero tiene la ventaja de conservar
la alta concentracin de protenas de la fase rica en detergente. La filtracin en gel
se puede utilizar para el intercambio de tampn (59), como puede otros mtodos
de cromatografa tales como intercambio inico o cromatografa de
afinidad. Alternativamente, los detergentes se pueden unir especficamente y
eliminan, ya sea utilizando resinas de poliestireno hidrfobas (Bio-Beads,
Calbiosorb , o Amberlite XAD2, entre otros) (60) o ciclodextrinas. Las
ciclodextrinas se unen a monmeros detergentes. Se pueden aadir a la solucin
y se eliminan por dilisis junto con detergente lmite, ya que son ms pequeas
que las micelas de detergentes no dializable (61). Las ciclodextrinas tambin
pueden ser acoplados a resinas de cromatografa para la eliminacin del
detergente (62). Care tiene que ser tomado debido a que las protenas de la
membrana precipitarn si la concentracin de detergente se reduce a por debajo
de la CMC.

Cmo adaptar el protocolo a sus necesidades

El punto de partida para el desarrollo de un procedimiento de separacin de fases
es un tampn detergente cuyos componentes estn determinadas por la protena
de la membrana a purificar, como la mayora de las protenas de membrana
solubilizadas son estables slo en ciertos detergentes (63, 64). Este tampn se
ensay entonces por sus propiedades de separacin de fases. En los casos ms
simples, la separacin de fases se produce tras un aumento o disminucin de la
temperatura (vase la Tabla 1 y la Figura 1). Con frecuencia, la separacin de
fases puede ser iniciada mediante la adicin de altas concentraciones de
(NH 4) 2 SO 4 u otras sales. Del mismo modo, la mayora de los detergentes sern
sometidos a la separacin de fases tras la adicin de PEG, dextranos, u otros
polmeros de alto peso molecular. La estabilidad de la protena de membrana en
presencia de altas concentraciones de sal o de polmero tiene que ser
probado. Por otra parte, la atencin tiene que ser tomado que la protena no se
desnaturaliza cuando se exponen a las altas concentraciones de detergente que
se producen durante la separacin de fases. Pero si se cumplen estas
condiciones, las condiciones de separacin de fases se pueden encontrar para la
mayora de los casos, a pesar de diagramas de fases no estn disponibles para
muchos detergentes especiales. Informacin sobre las condiciones de separacin
de fases tambin se puede obtener a partir de ensayos de cristalizacin de
protenas de membrana, ya que muchas protenas de membrana se cristalizan a
partir de soluciones de detergente en condiciones cercanas a la del punto de
enturbiamiento del detergente (65, 66, 67).
Un simple titulacin de la memoria intermedia de detergente de eleccin con sales
o polmeros suele ser suficiente para establecer un protocolo til. La separacin de
fases se puede observar a simple vista, por mediciones de turbidez en un
espectrofotmetro, o por dispersin de luz esttica (68). Un anlisis ms detallado
de las propiedades y la cintica de separacin de fases se puede obtener
utilizando la transmisin combinada y las mediciones de dispersin de luz
esttica (69). Adicin de un colorante hidrfobo a la solucin puede mejorar este
ensayo del punto de enturbiamiento en combinacin con espectroscopia de
ultravioleta-visible (UV-VIS) o la deteccin de fluorescencia(70). A veces, la
separacin de fases se produce slo por encima o por debajo de cierta
temperatura incluso despus de la adicin de sales o polmeros; se recomienda
hacer las titulaciones a temperatura ambiente y a 4 C. La centrifugacin puede
acelerar la separacin de las fases.
Despus de recoger la fase rica en detergente, el exceso de detergente y sal o
polmero tiene que ser eliminado como se discuti previamente. Alternativamente,
la separacin de fases se puede hacer usando los protocolos establecidos
revisados aqu, seguido por intercambio de detergente utilizando mtodos
cromatogrficos o de dilisis. Un mtodo prometedor nueva separacin de fases

es el uso de polmeros que contienen grupos quelantes de metales capaces de

unirse etiquetas de polihistidina. Marcada con His protenas de membrana pueden
entonces repartirse en la fase de polmero (en lugar de la fase rica en detergente),
lo que permite una separacin de etiquetado de protenas de la membrana sin
etiquetar y la proteccin de la protena etiquetada por el contacto con
concentraciones de detergente extremas (71). Este mtodo tambin puede
utilizarse para purificar las vesculas de membrana que contienen protena
Histagged (72).