Instituto Politcnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnologa.
Tpicos selectos de biotecnologa I.

GRUPO 6BV1

Mtodos de deteccin de micoplasma.

Contaminacin por micoplasmas

Los micoplasmas son clulas procariotas pequeas (0,3 a 0,5 m de dimetro) que pueden formar
pequeas colonias similares a las que forma el agente productor de la pleuroneumona bovina (de
ah su nombre de "pleuropneumonia-like organisms", PPLO). No poseen pared celular y por ello
slo son capaces de crecer en ciertos medios. Existen varios grupos serolgicos de micoplasmas de
dos gneros (Mycoplasma y Acholeplasma). Los contaminantes responsables de las infecciones de
los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale (humano), M.hyorhinis
(cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y tambin de roedores). Los cultivos primarios
suelen estar libres de micoplasmas, pero muchas de las lneas celulares continuas estn
infectadas. La contaminacin suele proceder de suero animal contaminado con A.laidlawii y
M.arginini o de la tripsina de cerdo contaminada con M.hyorhinis. A pesar de que M.hominis,
M.pharyngis y M.salivarum se pueden aislar de la boca y la garganta humana, la mayor fuente de
contaminacin procede del uso de cultivos contaminados. Se citan datos de que alrededor del 50
al 95% de las clulas utilizadas actualmente estn contaminadas con micoplasmas. Dado que la
contaminacin con micoplasmas no es tan evidente como la contaminacin por bacterias o

levaduras es importante por una parte tener en cuenta el posible efecto de los micoplasmas sobre
el cultivo, y realizar controles peridicos de su presencia. Los efectos dependen de la especie
implicada. As las especies M.gallisepticum y M.mycoides son patgenos pero son poco frecuentes.
Otras especies no producen la muerte celular pero retardan el crecimiento celular. As por ejemplo
M.hominis parece retardar el crecimiento del cultivo pues consume toda la arginina presente
debido a su elevada actividad arginina deaminasa, mientras que A.laidlawii destruye rpidamente
los desoxirribonucletidos, y en un cultivo infectado es realmente difcil realizar medidas de
incorporacin de timidina tritiada pues sta es rpidamente convertida a timina.
Los requerimientos de los micoplasmas son complejos y slo crecen en medios donde hay clulas
en crecimiento. Parece que requieren los productos de degradacin de ADN celular, pues los
nuclesidos son factores de crecimiento esencial para los micoplasmas. Una observacin
cuidadosa de las clulas en cultivo puede dar un primer aviso de la presencia de micoplasmas:
aparicin de grnulos oscuros en el citoplasma. A continuacin se detallan algunas de las tcnicas
usadas en la actualidad para la deteccin de los micoplasmas:

Tincin con orcena (Fogh y Fogh, 1968).

o Sembrar las clulas sobre cubreobjetos de modo que no hayan alcanzado la
confluencia en 24 h.
o sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 mL de citrato sdico 0,6% y
aadir lentamente 1 mL de agua. Dejar 10 min y aadir lentamente 4 mL de fijador
de Carnoy (1:3 actico:etanol). Sacar todo el lquido y reemplazar por 2 mL de
fijador de Carnoy.
o dejar fijar durante 10 min. Dejar secar.
o teir 10 min con orcena, y lavar 3 veces con etanol absoluto.
o montar en DPX, observar con el microscopio de contraste de fase. Las clulas
contaminadas muestran los micoplasmas preferentemente en el borde celular y
en los espacios intracelulares.
o Autoradiografa de cultivos incubados con timidina tritiada. Un cultivo
contaminado muestra seal autoradiogrfica fuera del ncleo por efecto de la
degradacin de la timidina a timina propia de muchos micoplasmas.
o Tincin fluorescente con Hoechst 33258, 33217 o DAPI. Esta tcnica detecta el
DNA de los micoplasmas pues el colorante (Hoechst 33258 o 33532, o el DAPI) se
une especficamente al DNA. Se emplea la misma tcnica de tincin que para la
tincin nuclear.

Test de crecimiento para micoplasmas.

El efecto letal de la contaminacin por micoplasmas sobre el cultivo puede acentuarse mediante
la adicin al medio de 6-metilpurina desoxirribonuclesido (6-MPDR). Todos los micoplasmas
presentan gran actividad del enzima adenosina fosforilasa, capaz de convertir 6-MPDR (no txico)
en 6-metil purina y 6 metil-purina ribonuclesido, ambos txicos para las clulas de mamfero
(McGarrity y Carson, 1982).
Existen sistemas de cultivo de micoplasmas de gran sensibilidad que permiten detectar la
presencia de pequeas cantidades de contaminante. Es el caso del Mtodo directo de cultivo que
propone ATCC en su servicio de deteccin de micoplasmas. Este cultivo sin embargo tiene como
gran limitacin los 28 das que precisa.

Sonda DNA para micoplasma. Es una sonda de DNA tritiada capaz de reconocer el RNA ribosomal
de micoplasma en cultivos celulares. Es muy sensible, pero an cuesta 10 veces ms que el ensayo
de Hoechst. Supone obtener un lisado celular al que se aade la sonda de DNA, se hibrida a 72C
durante 1 h, se precipita y se lava el hbrido DNA/RNA y se cuenta la cantidad de radiactividad
retenida.

Deteccin de micoplasmas mediante PCR. Se han propuesto diversos mtodos para la deteccin
de micoplasmas mediante PCR, y se han comercializado kits, como el producido por la ATCC que
permite detectar 5 especies de micoplasmas responsables del 95% de las contaminaciones. En el
laboratorio se emplea un mtodo de deteccin mediante PCR que se basa en el descrito por
Wong-Lee y Lovett (1998). Empleando una sola pareja de cebadores correspondientes al RNA 16s
de 8 especies de micoplasma (M.hyorhinis, M.arginini, M.pneumoniae, M.fermentans, M.orale,
M.pirum, Acholeplasma laidlawii y Spiroplasma mirum).

Protocolo:
Secuencias de los cebadores:

Mico1: GGC GAA TGG

GTG AGT AAC ACG
Mico2: CGG ATA ACG CTT
GCG AC TAT G
Concentracin de trabajo
de los cebadores 10
pmol/L
Condiciones de PCR: 95C
1 min, (95C 1 min, 55C
1 min, 72C 1,30 min) 35
ciclos, 4C mantenido
Tamao esperado 0,5 kb

Para la eliminacin de los micoplasmas, en general se recomienda, si el cultivo es reemplazable,

eliminarlo, esterilizar todo y volver a empezar. Slo cuando el cultivo es irreemplazable o
importante se recomienda proceder a su eliminacin en el cultivo. Para ello hay varias
posibilidades:

Tratamientos antibiticos. Se ha descrito que la kanamicina (0,1 mg/mL) previene el

crecimiento del micoplasma (Fogh y Hacker, 1960), as como la tylocina (6,0 g/mL).
Asimismo son efectivos contra micoplasmas las quinolonas, como ciprofloxacina (Schmitt y
col., 1988), y MRA. Las quinolonas inhiben la DNA girasa procariota.
Tratamientos con sueros inmunes. El tratamiento del cultivo con sueros anti-micoplasmas
se ha revelado como efectivo, pero costoso.
Pase por un animal. En el caso de cultivos de lneas tumorales se ha revelado como
especialmente til la inoculacin a un animal de experimentacin y la recuperacin
posterior. El sistema inmune del animal limpia el cultivo de micoplasmas.

Referencias
Uphoff CC, Drexler HG. Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures by PCR
analysis. Hum Cell. 1999 Dec;12(4):229-36. Review.
Barile MF. Mycoplasma-tissue cell culture interactions. In: Tully JG, Whitcomb RF (ed). The
mycoplasmas. New York: Academic Press, 1979; 425-474.
McGarrity GJ, Kotani H. Cell culture mycoplasmas. In: Razin S, Barile MF (ed). The
mycoplasmas. New York: Academic Press, 1985; 353-390.