Universidad Central de Venezuela

Facultad de Ciencias
Escuela de Biologa
Departamento de Biologa Celular
Unidad Docente de Gentica
Electiva 1451
Fundamentos de Gentica Molecular

Manual de Laboratorio

Autores:
Dra. Palmira Guevara
Lic. Riward Campelo Morillo
Lic. Richard Clark
Lic. Vernica Guariglia
Lic. Flix Moronta
Lic. Kamran Rizzolo

INDICE
1er BLOQUE Tcnicas bsicas en Gentica Molecular

INTRODUCCION

Prctica 1 Transformacin bacteriana

Anexo 1 Genes reporteros in vivo:

La protena de fluorescencia verde y vectores de
clonamiento

15

Prctica 2 Aislamiento de ADN plasmdico

Minipreparacin de ADN plasmdico

16

Prctica 3 Anlisis del ADN en geles horizontales

de agarosa

20

Prctica 4 Cuantificacin de ADN por espectrofotometra

26

Prctica 5 Caracterizacin de plsmidos recombinantes por

anlisis de restriccin

29

Anexo 2 Patrones de restriccin esperados para pEGFP y pEYFP

32

2do BLOQUE Aplicacin de tcnicas de la gentica

molecular al diagnstico de enfermedades hereditarias
humanas

33

INTRODUCCION

33

Prctica 6 Anlisis de perfiles genticos humanos

mediante PCR-RFLP:
deteccin de una mutacin puntal o single nucleotide
Parte I

polymorphism (SNP) en el gen de la -globina

34

Preparacin y tratamiento de muestras

37

1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal

39

Anexo 3 Consentimiento informado

Parte II

42

Ensayos de amplificacin mediante la reaccin en

cadena de la polimerasa (PCR)

Parte III

44

Digestin del amplicn con la enzima Bsu36 I y

anlisis del patrn de restriccin.

51

Anexo 4 Resultados esperados del diagnstico por PCR-RFLP en

el gen de la -globina humana

54

Anexo 5 Lectura: Gentica y Sociedad

55

BIBLIOGRAFIA

60

<!> GLOSARIO DE BIOSEGURIDAD

DE MATERIALES PELIGROSOS<!>
cido actico (concentrado) manipular con gran cuidado. Puede
causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar
guantes y lentes apropiados. Utilizar dentro de una campana.
Ampicilina puede causar dao por inhalacin, ingestin, o absorcin
cutnea. Utilizar guantes y lentes. Manipular en campana.
Bromuro de Etidio mutagnico poderoso y txico. Evitar inhalacin
del polvo. Utilizar guantes al trabajar con soluciones de BrEt.
Consultar para su descarte.
Cloroformo irritante a la piel, ojos, membranas mucosas, y tracto
respiratorio. Es un carcingeno votil y puede causar dao al hgado
y riones. Evitar inhalacin de vapores. Utilizar guantes y lentes.
Manipular en campana.
Dodecil sulfato de sodio (SDS) es txico, irritante, y posee un
alto riesgo de dao a los ojos. Puede causar dao al ser inhalado,
ingerido, o absorbido por la piel. Utilizar guantes y lentes. Manipular
en campana. No inhalar el polvo.
Etanol puede causar dao si es inhalado, ingerido, o absorbido por
la piel. Utilizar guantes y lentes apropiados.
Hidrxido de sodio y las soluciones que contengan hidrxido de
sodio son altamente txicas y custicas, deben ser manipuladas con
mucho cuidado. Utilizar guantes apropiados y mascarilla. Todas las
bases concentradas deben ser manipuladas de igual manera.
Isopropanol es irritante puede causar dao al ser inhalado,
inherido, o absorbido por la piel. Utilizar guates apropiados y lentes
de seguridad. El vapor no debe ser respirado. Mantener alejado del
calor, chispas, y la llama.
Luz UV y/o radiacin UV es peligrosa y puede causar daos a la
retina de los ojos. Jams se debe ver directamente la luz UV
desprotegida. La luz UV es tambin mutagnica y carcinognica.
Para minimizar el riesgo de exposicin, la fuente de luz UV debe ser
resguardada adecuadamente. Utilizar guantes protectores adecuados
al sostener materiales bajo una fuente de luz UV.

Fenol es extremadamente txico, altamente corrosivo, y puede

causar quemaduras graves. Puede causar dao por inhalacin,
ingestin, o absorcin cutnea. Utilizar guantes, lentes, y bata.
Utilizar dentro de una campana. Enjuagar con mucha agua y lavar
con agua y jabn cualquier rea de la piel que tenga contacto con el
phenol. !No utilizar etanol!
Tris puede causar dao si es inhalado, ingerido, o absorbido por la
piel. Utilizar guantes y lentes apropiados.

1ER
BLOQUE
Tcnicas
Gentica Molecular

bsicas

en

INTRODUCCIN
La contribucin de la gentica y en particular de la gentica
molecular, disciplina que nace con la publicacin del modelo de la
doble hlice para la molcula de ADN propuesto por Watson y Crick
en 1953, ha transformado la visin y la dimensin de las ciencias
biolgicas.

Esta

transformacin,

que

conlleva

el

entender

el

funcionamiento integrado de la clula desde la molcula responsable

de la herencia y los procesos que resultan de su mantenimiento y la
expresin de esta informacin en el fenotipo, han tenido un impacto
en todas las reas relacionadas a la biologa. Este alcance tiene
dimensiones

cotidianas

si

consideramos

que

la

transferencia

horizontal de conocimientos y tecnologas estn presentes en la

agroindustria y en los nuevos medicamentos a nivel mundial. Gran
parte de esta rpida transferencia tecnolgica es producto de un
conjunto de metodologas de rutina del trabajo en el laboratorio
conocidas como ingeniera gentica. Es posible aislar e identificar
secuencias especficas de genes o fragmentos del genoma de una
especie, insertarlos en vehculos o vectores de clonamiento y
transferirlos y expresarlos en otra especie, fundamentalmente con
objetivos asociados a la investigacin bsica. Sin embargo la
inmediata aplicabilidad derivada de la relativa accesibilidad de las
metodologas, incentivadas por su gran potencial de desarrollo
biotecnolgico, ha empujado los lmites de la biologa molecular y
sus aplicaciones fuera del mbito netamente acadmico, teniendo
hoy da una marcada presencia en la medicina, el desarrollo
agropecuario, el estudio de poblaciones, e inclusive la identificacin
de individuos a travs del perfil de su genoma y el desarrollo de
armas biolgicas. Las herramientas de la biologa molecular y el
5

conocimiento generado permiten derivar aplicaciones tiles y con

valor comercial que alcanzan a todos los sistemas biolgicos.
El conocimiento bioqumico de los procesos asociados al
funcionamiento y mantenimiento del ADN, fundamentalmente la
replicacin, la transcripcin, la recombinacin, la reparacin, su
empaquetamiento en los cromosomas y la segregacin durante la
divisin celular, han sido la base de las metodologas utilizadas en la
manipulacin de los genomas desde las primeras experiencias de
clonamiento de genes en los aos 70, la secuenciacin de genomas
completos durante los 90 y continan siendo punto de partida para
el diseo de nuevas tcnicas de anlisis en investigacin en el siglo
XXI. El dominio tecnolgico hoy permite la masificacin del anlisis
con el surgimiento de nuevas disciplinas como la genmica y la
protemica que investigan en masa los eventos celulares a nivel
molecular.
Con el objetivo de iniciar al estudiante de biologa en el
proceso de construccin y adquisicin del conocimiento en la
disciplina de la gentica molecular hemos diseado un manual de
prcticas que complementan los conceptos discutidos en la teora. En
esta primera parte, se describen las herramientas bsicas utilizadas
para el anlisis gentico molecular en el quehacer diario de un
laboratorio de investigacin. Estas herramientas aprovechan enzimas
y reacciones qumicas que ocurren naturalmente en las clulas desde
las formas de vida ms simples, tales como las clulas bacterianas y
los virus, hasta clulas eucariotas. El conjunto de estas herramientas
y reacciones dirigidas a la manipulacin del material gentico se
conocen como tecnologa del ADN recombinante. Las enzimas ms
importantes en este conjunto de herramientas son aquellas que
actan sobre la misma molcula de ADN: las enzimas de restriccin
que cortan el ADN en sitios especficos, las ligasas que permiten unir
dos molculas de ADN o ARN, las polimerasas que sintetizan nuevas

hebras de ADN, y las transcriptasas reversas que sintetizan ADN

complementario a partir de ARN.
La reaccin bioqumica no-catalizada ms importante para los
anlisis en la gentica molecular es la hibridacin mediante la cual
ocurre el enlace de dos hebras de ADN con secuencias nucleotdicas
complementarias. La hibridacin resulta de la tendencia natural de
molculas de ADN o ARN cadena-sencilla complementarias para
formar una doble-cadena estable.
El primer bloque comprende los ejercicios de transformacin
bacteriana, aislamiento de ADN plasmdico, minipreparacin de ADN
plasmdico, anlisis del ADN en geles horizontales de agarosa,
registro

anlisis

de

resultados,

cuantificacin

de

ADN

por

espectrofotometra y la caracterizacin de recombinantes por anlisis

de restriccin. Todas estas experiencias ponen en prctica los
fundamentos y conceptos bsicos presentados en la teora e
ilustrados en las referencias escogidas para su discusin.
El trabajo est dirigido para que al finalizar el curso el
estudiante

domine

los

conocimientos

fundamentales

de

la

metodologa del ADN recombinante y su aporte a los progresos en la

biologa molecular.
interpretar

una

Igualmente, deber estar en capacidad de

publicacin

sobre

esta

materia,

tanto

en

la

escogencia de una metodologa adecuada para alcanzar un objetivo,

como en la correcta interpretacin de los resultados.

PRCTICA 1
TRANSFORMACIN BACTERIANA
Objetivos

Familiarizar al estudiante con el fenmeno de transformacin

bacteriana y la transferencia horizontal de genes.

Conocer los mtodos de transformacin bacteriana en el

laboratorio.

Hacer competente una cepa de E. coli con tratamiento qumico

y transformarla con un plsmido.

Analizar transformantes a travs de medios selectivos.

Reconocer los usos prcticos de los genes reporteros y

marcadores selectivos.

Introduccin
La transformacin es un proceso por el cual las clulas
procariotas captan ADN libre presente en el medio. Es un fenmeno
que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero con
variaciones en su eficacia entre especies. Para que ocurra la
transformacin, la bacteria tiene que encontrarse en un estado de
competencia, en el cual la clula presenta modificaciones en su
pared y membrana, que permiten la entrada del material gentico
desde el exterior celular.
En el laboratorio se han normalizado tcnicas que inducen el
estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma
natural, como es el caso de Escherichia coli. Estas tcnicas se basan
en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen poros en la
pared celular. El tratamiento qumicos con cloruro de calcio (CaCl2) y
la electroporacin, que consiste en inducir la competencia mediante
la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso, son dos
mtodos utilizados con frecuencia en el laboratorio de investigacin.

Sin embargo tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo
se hacen competentes y se afecta la viabilidad de la clula.
La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de
enorme

utilidad,

que

nos

permite

introducir

plsmidos

recombinantes en casi cualquier tipo de bacteria. El mtodo que se

describe a continuacin es, por su simplicidad, uno de los ms
utilizados para transformar E. coli. Para seleccionar las clulas
transformantes, el ADN introducido llevar un marcador selectivo de
resistencia a antibiticos que proporciona una ventaja selectiva bajo
las condiciones de crecimiento, con respecto a las clulas no
transformadas y un gen reportero, que confiere un fenotipo de
emisin de fluorescencia fcilmente detectable. Ambos marcadores
genticos permitirn identificar las clulas transformantes.

Materiales, reactivos y equipos

Cultivo de Escherichia coli DH10B. Genotipo:

F- mcrA (mrr-hsdRMS-mrcBC) 80dlacZM15 lacX74
deoR recA1 endA1 araD139 (ara, leu) 7697 galU galK
- rpsL nupG

ADN del plsmido pEGFP o pEYFP

2 mL de medio LB lquido

10 mL de medio LB lquido+ estreptomicina 40 g.mL-1

3 Placas de agar LB +estreptomicina 40 g.mL-1

2 Placas de agar LB +ampicilina 100 g.mL-1

+estreptomicina 40 g.mL-1

20 mL 0,85% Solucin Salina

15 mL CaCl2 50 mM

Rastrillo de vidrio

Cava y hielo para incubaciones a 4C

Microcentrfuga.

3 Tubos de microcentrfuga estriles 1,5 mL

4 Tubos estriles 15 mL

6 Tubos de dilucin estriles

Baos de incubacin.

Micropipetas

Puntas para micropipetas 20-200 L y 1 mL

Pipetas estritles de 10 mL, 5 mL y 1 mL

10

Protocolo
Nota: Durante todo el proceso trabaje en condiciones de esterilidad.
Preparacin de clulas competentes
1. Previo al da de la prctica, partiendo de una colonia aislada,
inocular las bacterias en 2 mL de medio LB+ estreptomicina
(40 g.mL-1) en un tubo estril.
2.

Incubar a 37C con agitacin toda la noche.

3. Agregar 8 mL de medio LB+estreptomicina (40 g.mL-1) al

cultivo en fase estacionaria de la noche anterior.
4. Incubar a 37C con agitacin por 1 hora.
5. Transferir el cultivo a un tubo estril de 15 mL.
6. A partir de este paso trabajar a 4 C. Centrifugar durante 10
minutos a 5000 r.p.m.
7. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 2 mL
de solucin salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego
completar el volumen a 10 mL.
8. Centrifugar estrilmente a 4 C a 5000 r.p.m por 10 minutos.
9. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 10 mL
de CaCl2 50 mM recientemente preparado y fro.
10. Incubar 1 hora en hielo.
11. Centrifugar estrilmente y a 4 C a 5000 r.p.m por 10
minutos.
12. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de
bacterias en 1 mL de CaCl2 50 mM y guardar a 4C.

11

Transformacin
1. Pre-incubar dos tubos de 1,5 mL estriles en hielo. Marcarlos
como A y B. Colocar en cada uno 200 L de las clulas
competentes del paso 11 del protocolo de preparacin de las
clulas competentes.
2. Al tubo A, aadirle aproximadamente 0.1 g del ADN
plasmdico en un volumen no mayor a 10 L. Al tubo B no
colocarle el plsmido.
3. Incubar 1 hora en hielo cada tubo.
4. Someter las clulas a un choque trmico a 45C por 90
segundos exactos.
5. Agregar 1 mL de medio LB e incubar a 37C por 60 min.
6. Sembrar por rastrilleo 100 L de cada tubo en una placa de
LB+ampicilina (100 g.mL-1)+ estreptomicina (40 g.mL-1).
7. Para el clculo de la eficiencia de transformacin y control de
viabilidad realizar una titulacin del cultivo transformado (tubo
A)

hasta un factor de dilucin de 10-7 y 10-8. Sembrar por

rastrilleo 100 L de las diluciones 10-7 y

10-8 en placas de

agar LB.
8. Incubar las placas a 37C por 24 horas.
9. A las 24 horas registre el nmero de colonias en cada tipo de
placa y calcule el ttulo de clulas receptoras y de clulas
transformantes.
10. Evalu la expresin de los genes reporteros GFP o YFG segn
sea el caso, en las colonias transformadas exponiendo la placa
a la luz UV.
Nota: utilice lentes para protegerse la vista.
11. Sembrar

por

agotamiento

al

menos

cuatro

colonias

transformantes en placas de LB+ampicilina (100 g.mL-1)+

estreptomicina (40 g.mL-1) que utilizar en la prctica 2 para
el aislamiento del ADN plasmdico.

12

Preguntas de la prctica
1. Calcular

la

eficiencia

de

transformacin

en

base

la

concentracin de ADN plasmdico y en base al ttulo de las

clulas receptoras con las frmula:
n de colonias transformantes / g ADN aadidos)x10
n de colonias transformantes / ttulo de clulas receptoras)
2.

Describa qu se observa en la placa de LB+ampicilina

sembrada con 100 l del tubo B. Sabras explicar por qu?
Para qu se realiza este control?

3. Discuta el genotipo de la cepa utilizada E. coli DH10B. Por

qu se utiliza estreptomicina en el medio?
4. Desde

el punto de

vista gentico

Qu caractersticas

especiales deben tener las cepas bacterianas a ser usadas en

experimentos de transformacin?
5.

Discuta las caractersticas de los vectores pEGFP y pEYFP y su

relevancia para el clonamiento de genes. Qu importancia
tienen los sitios mltiples de clonamiento ubicados en las
regiones 5 y 3 de los genes GFP y YFP? Por qu es posible
observar el fenotipo de fluorescencia en las clulas E. coli
DH10B transformadas con los plsmidos pEGFP y pEYFP?

6.

Describa otros tipos de tipos de vectores de y estrategias de

clonamiento.

7.

Explique

qu

otros

mtodos

son

utilizados

para

hacer

competente a una cepa bacteriana.

8.

Desde el punto de vista evolutivo Cul es la importancia de

los fenmenos de transformacin bacteriana en la naturaleza?

13

Figura 1. Mapa de los plsmidos pEGFP y pEYFP. Se muestran: el

tamao del plsmido en kb, los sitios nicos de restriccin, los sitios
mltiples de clonamiento (MCS), los genes de resistencia a
ampicilina (Ampr), los genes reporteros EGFP/EYFP, el promotor del
operon Lactosa (PLac) y el origen de replicacin de pUC (pUCori). Los
nmeros en parntesis indican la ubicacin en pb desde el sitio 1.
(http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3078-5.pdf
y
http://www.clontech.com/images/pt/dis_vectors/PT3175-5.pdf).

14

ANEXO 1. Genes reporteros in vivo:

La protena de fluorescencia verde y vectores de

clonamiento
La Protena de Fluorescencia Verde (GFP por sus siglas en
ingls Green Fluorescent Protein), aislada originalmente de la
medusa Aequorea victoria, se utiliza como una molcula reportera
para analizar el funcionamiento in vivo de regiones reguladoras, as
como para determinar la localizacin subcelular de protenas. La GFP
emite una fluorescencia de color verde brillante al ser expuesta a luz
UV,

lo

que

la

hace

fcilmente

detectable.

Fluorescencia Amarilla (YFP por sus siglas

La
en

Protena
ingls

de

Yellow

Fluorescent Protein) se deriva de una mutacin puntual en el gen de

la GFP por lo que absorbe a una longitud de onda diferente y emite
una fluorescencia ms tenue. Ambas protenas son fcilmente
detectables y de amplio uso en el anlisis funcional de genes.
Los vectores de clonamiento pEGFP y pEYFP tienen su origen
en el plsmido pUC19 al cual se le ha insertado un fragmento de
ADN conteniendo a los genes GFP y YFP respectivamente (Figura1).
La estructura base del pUC19 proporciona el gen de resistencia al
antibitico ampicilina y un origen de replicacin relajado que
permite su propagacin en E. coli y genera mltiples copias del
plsmido en la clula. Los genes GFP y YFP estn insertados en fase
al codn de iniciacin del gen lacZ por lo que la protena de fusin
del marcador fluorescente se expresa a partir del promotor de lac.
De esta forma, el fenotipo de resistencia al antibitico
ampicilina y la presencia de fluorescencia servirn como indicativo
de la presencia del plsmido en una clula bacteriana hospedera. En
este

caso,

nos

servir

para

determinar

si

el

ensayo

de

transformacin tuvo xito. Sin embargo las aplicaciones y usos de

este tipo de plsmidos son muy amplias. Podras sugerir en qu
tipo de experimentos seran tiles los plsmidos pEGFP y pEYFP?

15

PRCTICA 2
AISLAMIENTO DE ADN PLASMDICO
Minipreparacin de ADN plasmdico
Objetivo

Manejar fundamentos tericos y prcticos del aislamiento de

ADN plasmdico y genmico en bacterias.

Estudiar el efecto de detergentes aninicos, como el Dodecil

Sulfato de Sodio (SDS por sus siglas en ingls Sodium
Dodecyl Sulfate), sobre la clula bacteriana.

Extraer y aislar de la clula bacteriana E. coli DH10B el

plsmido transformado en la prctica 1.

Introduccin
La lisis alcalina, en combinacin con el detergente Dodecil
Sulfato de Sodio, SDS, ha sido usada por ms de 20 aos para aislar
ADN

plasmdico

de

E.

coli.

La

exposicin

de

suspensiones

bacterianas a detergentes aninicos fuertes en valores de pH altos

desestabiliza la envoltura celular, desnaturaliza el ADN cromosomal
y las protenas, y libera el ADN plasmdico al sobrenadante. Aunque
la solucin alcalina separa completamente las bases apareadas del
ADN,

las

hebras

de

un

plsmido

circular

no

se

separan

completamente unas de otras debido a que estn topolgicamente

entrelazadas. Mientras la intensidad y la duracin de la exposicin al
OH- no sea demasiado larga, ambas hebras del ADN plasmdico se
renaturalizarn cuando los niveles de pH retornen a sus valores
neutros reconstituyendo una molcula de ADN doble cadena circular.
Durante la lisis, las protenas bacterianas, la pared celular
rota y el ADN cromosomal desnaturalizado constituyen grandes
complejos que se agregan y son cubiertos con SDS. Estos complejos

16

son precipitados eficientemente de la solucin acuosa cuando los

iones sodio son reemplazados por potasio. Despus que este
material ha sido removido por centrifugacin, el ADN plasmdico
puede ser recuperado del sobrenadante.
La lisis alcalina en presencia de SDS es una tcnica flexible
que trabaja muy bien con todas las cepas de E. coli y con cultivos
bacterianos en fase logartmica en un rango de 1 mL a >500 mL. El
ADN plasmdico circular cerrado recuperado del lisado puede ser
purificado de distintas maneras y en diferentes grados, dependiendo
de las necesidades del experimento.

Materiales y reactivos

Medio LB lquido+estreptomicina 40 g.mL-1+ampicilina 100

g.mL-1

Solucin Salina (NaCl 0,85 %)

Solucin I (glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris pH 8.0 25 mM)

Solucin II (NaOH 0.2 M, SDS 1%)

Solucin III (Acet. de potasio 3 M, cido actico glacial 5 M,

pH 4.5)

Solucin cloroformo:fenol (1:1)

Isopropanol grado Biologa Molecular

Etanol 70% v/v

Tampn TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 1 mM)

Microcentrfuga

3 tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1.5 mL

Micropipetas

Puntas para micropipetas 20-200 L

Hielo/cava

17

Protocolo
1. Previo al da de la prctica, partiendo de una colonia aislada,
crecer

toda

la

noche

un

cultivo

de

mL

de

medio

LB+ampicilina (100 g.mL-1) + estreptomicina (100 g.mL-1)

de la cepa bacteriana transformada con el plsmido pEGFP o
pEYFP obtenida en la prctica 1.
2. Transferir el cultivo a un tubo estril de 15 mL.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m.
4. Descartar el sobrenadante y resuspender las clulas en 2 mL
de solucin salina (0,85% SS) agitando el tubo. Luego
completar el volumen a 10 mL.
5. Centrifugar durante 10 minutos a 5000 r.p.m.
6. Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular
en 100 L de solucin I con agitacin.
7. Transferir este sobrenadante a un tubo de 1,5 mL.
8. Aadir 200 L de solucin II. Tapar el tubo y mezclar las dos
soluciones

invirtiendo

dos

tres

veces

el

tubo

muy

suavemente. Incubar en hielo por 5 min.

9. Aadir 150 L de solucin III fra. Mezclar por inversin del
tubo e incubar en hielo de 5 a 8 min.
10. Centrifugar a 14000 r.p.m. por 15 min.
11. Tomar el sobrenadante CON MUCHO CUIDADO, evitando
tomar del sedimento, pues ste es la principal fuente de
contaminacin por ADN cromosomal. De ser necesario,
centrifugue este sobrenadante una vez ms para asegurarse
que no contiene ninguna contaminacin.
12. Calcular el volumen de sobrenadante y extraer con un
volumen igual de mezcla cloroformo-fenol (1:1). Mezclar bien.
Nota: el fenol es muy corrosivo, evite su contacto con la piel.

18

13. Centrifugar esta mezcla por 3 min. a 14000 r.p.m. Deben

separarse dos fases.
14. Tomar la fase acuosa superior, con cuidado de no tocar la
interfase ni la fase fenlica, y transferirla a un nuevo tubo de
1,5 mL.
15. Agregarle un volumen de isopropanol igual al volumen del
sobrenadante. Mezclar por inversin e incubar por 10 min. en
hielo.
16. Centrifugar a 14000 r.p.m. por 15 min.
17. Eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento con etanol 70%
y centrifugar por 5 min. a 14000 r.p.m.
18. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y dejar el tubo en
posicin invertida sobre un toalln a fin de que drene todo el
etanol. Dejar secar completamente a temperatura ambiente.
19. Resuspender el sedimento con los cidos nucleicos en un
volumen no mayor a 50 L de tampn TE y guardar en la
nevera. Esta muestra que contiene al ADN del plsmido ser
examinada en un gel de agarosa en la prxima prctica.

Preguntas de la prctica
1. Explique cmo y por qu se logra separar el ADN plasmdico
del ADN cromosmico durante la lisis alcalina.
2. Explique qu se logra al aadir consecutivamente las
soluciones I, II y III?
3. En qu paso del protocolo se elimina al ARN? Con qu
tratamiento adicional podra eliminar al ARN?
4. Cmo se desnaturalizan las protenas?
5. Cmo se eliminan los lpidos de la preparacin?
6. Por qu se realiza un lavado con etanol 70%?
19

PRCTICA 3
ANLISIS DEL ADN EN GELES
HORIZONTALES DE AGAROSA
Objetivo

Manejar los fundamentos tericos de la electroforesis en geles

de agarosa.

Conocer y evaluar las ventajas de la tcnica de electroforesis

en

geles

horizontales

de

agarosa

para

el

anlisis

caracterizacin de cidos nucleicos.

Separar cidos nucleicos segn su tamao y configuracin.

Comprobar si la minipreparacin de plsmidos realizada en la

prctica 2 fue exitosa.

Reconocer las diferentes conformaciones del ADN circular.

Introduccin
La electroforesis en geles de agarosa es una de las tcnicas
analticas utilizadas en la caracterizacin de cidos nucleicos en base
a la forma y tamao de las molculas. La carga neta negativa,
producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una
migracin de las molculas hacia el nodo cuando se aplica un
campo elctrico; sin embargo la matriz, formada por la agarosa (un
polisacrido ramificado de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidrogalactosa altamente hidrofbico) en la sales del tampn, ofrece una
resistencia al movimiento (Figura 2). Las molculas lineales de
mayor tamao tendrn dificultad para pasar por los poros de la
matriz, quedndose en la regin superior del gel, mientras que los
fragmentos

de

menor

tamao

alcanzando la parte inferior del gel.

20

se

movilizarn

con

facilidad,

BOLSILLOS

Figura 2. Esquema representativo de una corrida electrofortica

Dependiendo de la concentracin de agarosa en el gel, la
matriz formada permitir la separacin efectiva de diferentes
tamaos

de

ADN

durante

la

electroforesis

(Tabla

1),

en

consecuencia, la masa molecular relativa puede ser calculada

utilizando un marcador de ADN de peso molecular conocido, como
referencia. Sin embargo existen otros factores que influyen en el
grado de resolucin de los geles de agarosa. La conformacin de las
molculas afecta la migracin. El ADN plsmidos migra en orden de
velocidad desde el ms rpido al ms lento, de acuerdo a si est en
forma superenrollada, lineal o circular abierta.
Tabla 1. Rango de separacin de molculas lineales de ADN doble
cadena por electroforesis en geles horizontales de acuerdo al
porcentaje de agarosa.

% de
Agarosa en
el gel
0,6
0,7
0,8
1,3

ADN (kb)
20-1,0
10-0,8
7-0,5
4-0,2

El voltaje es otro factor que influye en la velocidad de

migracin del ADN, a mayor voltaje una migracin ms rpida; sin

21

embargo el calor generado produce que el gel se derrita adems de

desmejorar la resolucin de la separacin de las molculas.
Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son
utilizados para separar fragmentos entre 100 pb hasta 20 kb. Para la
separacin de molculas de menor tamao se utilizan geles de
poliacrilamida y para molculas mayores a 0,1 Mb hasta 2 Mb se han
diseado los sistemas de electroforesis de campo pulsado (Pulse
Field Gel Electrophoresis o PFE) y electroforesis de campos
invertidos

(Field

Inverted

Gel

Electrophoresis,

FIGE),

ambos

realizados en geles de agarosa de alta concentracin (agarosa 1,5%

a 2 %).
Previa a la colocacin de la muestra en los bolsillos del gel, se
mezcla con el tampn de carga, compuesto por un reactivo que
incremente la densidad, como el glicerol o la sacarosa, y uno o dos
colorantes que permitan hacer el seguimiento de la corrida en
tiempo real. Generalmente se utiliza el azul de bromofenol y el cileno
cianol, los cuales estn cargados negativamente y migran a un peso
molecular equivalente a 5 kb y 300 pb de ADN doble cadena
respectivamente.
El mtodo ms conveniente y comnmente usado para la
visualizacin del ADN separado en estos geles de agarosa es la
tincin con el colorante fluorescente bromuro de etidio (BrEt), el cual
contiene grupos planares tricclicos que se intercalan entre las bases
del ADN, sin especificidad de secuencia. Bajo estas condiciones, el
colorante aumenta su fluorescencia, de modo que emite luz visible
(color naranja) cuando es excitado por radiacin ultravioleta.
Para el registro del resultado de la electroforesis que se
visualiza mediante la exposicin a la luz UV del gel teido con BrE,
desde hace algunos aos se utiliza un aparato de fotodocumentacin
que

digitaliza

la

imagen,

el

cual

especialmente diseados para este fin.

22

hace

uso

de

programas

Materiales y reactivos.

Agarosa 0,8% en tampn TAE 1X

Tampn TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM).

Tampn de carga III 6X. (azul de bromofenol 0,25% p/v;

cileno cianol 0,25% p/v; Glicerol 30% v/v)

Bromuro de etidio 0.5 g.mL-1

Agua destilada

Cmara de electroforesis horizontal/Fuente de poder

Peines, moldes y bandeja para la preparacin de geles

Balanza

Horno microondas

Fiola de 125 mL

Bandeja para tincin

Cilindros graduados de 100 y 500 mL

Papel Parafilm

Micropipetas

Puntas para micropipetas 20-200 L

Agujas de inyectadotas

Transiluminador UV/sistema de fotodocumentacin

Guantes desechables

23

Protocolo
1. Preparar 100 mL de la solucin de agarosa 0,8% en tampn
TAE 1X. Para ello, pesar 0,8 g de agarosa requeridos en una
fiola y agregar 100 mL del tampn TAE 1X.
2. Disolver la agarosa calentando hasta hervir en el microondas
por 2-5 minutos evitando la evaporacin. Dejar enfriar.
Cuando la temperatura se acerque a los 50C (temperatura
tal que se pueda visualizar a la solucin an como lquido),
verter la agarosa en el molde con los peines. Evite la
formacin de burbujas, en caso de que se formen, removerlas
con una aguja. Dejar solidificar el gel a temperatura
ambiente.
3. Una vez solidificada la agarosa, remover los peines y colocar
el gel en la cmara de corrida con tampn TAE 1X.
4. En un trozo de papel Parafilm fijado al mesn, mezclar 5 L
de la solucin de ADN con 2 L del tampn de carga 6X y
colocar cada muestra en el bolsillo correspondiente. Recuerde
colocar un marcador de peso molecular mezclado con tamn
de carga y tomar nota de la ubicacin de sus muestras.
5. Aplicar un voltaje no superior a 5 V.cm-1 y dejar correr hasta
que el primer colorante alcance partes del gel.
6. Al finalizar la corrida, y utilizando guantes, teir el gel en una
solucin de Bromuro de etidio a 0,5 g.mL-1 durante 1
minutos. Transferir el gel a una bandeja con agua destilada.
Registre

la

imagen

mediante

la

exposicin

sobre

un

transiluminador de luz UV (312 nm) y utilizando el aparato de

fotodocumentacin.
7. NOTA: El BrEt es un poderoso agente mutgeno. Use siempre
guantes. No permita su contacto con la piel.
No exponga ninguna parte de su cuerpo a la luz UV.

24

Preguntas de la prctica
1. Explique por qu la matriz del gel de agarosa ofrece
resistencia al paso de las molculas de ADN?
2. Por qu un fragmento de ADN de 10 kb no migra ms rpido
que un fragmento de 0,5 kb, cuando se someten a un campo
elctrico en la electroforesis en geles de agarosa, si el
primero posee mayor nmero de grupos fosfato y por tanto
ms cargas negativas?
3. Cules son las funciones de los tampones de electroforesis
como el TAE 1X? Qu otros tampones de electroforesis son
frecuentemente usados en laboratorio?
4. Con qu propsito se mezcla la solucin de ADN con el
tampn de carga? Cules son las funciones de cada uno de
de los componentes, el glicerol, el azul de bromofenol y el
cileno cianol?
5. Qu otros mtodos existen para la visualizacin del ADN en
geles de agarosa?
6. La

electroforesis

en

geles

de

agarosa

diferentes

concentraciones resuelve fragmentos desde 100 pb hasta 20

kb. Con qu otra metodologa se logra resolver fragmentos
menores a 100 pb? Explique.
7. En la prctica se utiliz un marcador de ADN de molculas
lineales. Sirve este marcador para calcular el peso molecular
de molculas circulares? Explique.

25

PRCTICA 4
CUANTIFICACIN DE ADN POR
ESPECTROFOTOMETRA
Objetivos

Conocer

manejar

el

fundamento

de

la

tcnica

de

espectrofotometra para la cuantificacin de la concentracin

de una muestra de ADN.

Estimar la concentracin de ADN plasmdico aislado de las

clulas transformantes de E. coli DH10B en la prctica 2.

Introduccin
Existen diversos mtodos para estimar la concentracin de
cidos nucleicos en una preparacin. Si la muestra es pura (no
contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas,
fenol, agarosa o incluso otros cidos nucleicos), su medicin
mediante espectrofotometra de la luz UV absorbida por las bases
nitrogenadas es la ms adecuada. Por el contrario, si la cantidad de
ADN o ARN es muy pequea, o si la muestra contiene grandes
cantidades de impurezas, la estimacin de los cidos nucleicos se
puede llevar a cabo por la intensidad de fluorescencia emitida por
compuestos como el bromuro de etidio.
En esta prctica se cuantificar la cantidad de ADN mediante
espectrofotometra, donde se tomarn lecturas de la Densidad
ptica (D.O.) a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm. La lectura
a 260 nm permite calcular la concentracin del ADN en la muestra.
Una D.O.260 de 1.0, corresponde aproximadamente a 50 g.mL-1 de
ADN doble cadena, a 33 g.mL-1 de ADN cadena sencilla, a 20-30
g.mL-1 de oligonucletidos entre 20 a 40 bases y a 40 g.mL-1 de
RNA. La relacin entre las medidas a 260 y 280 (D.O.260:D.O.280)

26

proporciona

un

estimado

de

la

pureza

de

la

muestra.

Las

preparaciones puras de ADN deben tener un valor D.O.260:D.O.280 de

1,8 a 2. Valores por debajo de este rango son un indicativo de
contaminacin con protenas o fenol.
Debido a su rapidez, simplicidad y ausencia de dao, la
cuantificacin de ADN por espectrofotometra ha sido ampliamente
utilizada. Sin embargo, esta tcnica es poco sensible, y para la
mayora de los espectrofotmetros se requiere una concentracin de
ADN de al menos 1 g.mL-1 en la muestra para poder realizar
estimaciones vlidas. En esta prctica utilizaremos la tcnica de
cuantificacin de cidos nucleicos mediante espectrofotometra, para
evaluar la muestra de ADN plasmdico aislado de las clulas
transformantes de E. coli en la prctica 2.

Materiales y Reactivos

Tampn TE (Tris-HCl pH 8.0 10 mM, EDTA 0.1 mM)

Tubos de microcentrfuga de 1,5 mL

Micropipetas P20, P200 y P1000

Puntas para micropipetas 20-200 L

Cubetas de cuarzo de 1 mL

Espectrofotmetro con lmpara de luz UV

Protocolo
1. Realizar una dilucin 1:200 (5 L en 1 mL) de la muestra de
ADN plasmdico aislado en la prctica 2 utilizando tampn TE,
en un volumen final de 1 mL.
2. Calibrar a cero el espectrofotmetro con tampn TE. Colocar
el volumen total de la dilucin de la muestra en una cubeta de
cuarzo de 1 mL. Mida y registre el valor de la D.O. a 260 y
280 nm.
27

3.

Estime la concentracin de ADN en la muestra utilizando la

siguiente relacin:
[ADN] = 50 g.mL-1 x D.O.260nm x factor de dilucin
Como alternativa a la estimacin directa de la concentracin

de ADN utilizando el espectrofotmetro, es posible correr la

muestra problema simultneamente con una serie de diluciones de
ADN plasmdico de concentracin conocida. Una vez realizada la
corrida electrofortica, teido el gel en una solucin de BrEt y
registrada la imagen, siguiendo las indicaciones del paso 6 del
protocolo de la prctica 3, estime la concentracin de la muestra
por comparacin con los ADNs de las diluciones.

Preguntas de la prctica
1. Por qu considera usted que es necesario realizar la
estimacin de la concentracin del ADN aislado?
2. Por qu se debe realizar una dilucin de la muestra antes de
medir la D.O. en el espectrofotmetro?
3. Por qu slo se toma en cuenta la D.O. a 260 nm en la
estimacin de la concentracin del ADN? Qu informacin
nos provee la D.O. a 280 nm? Por qu utiliz el valor de 50
g.mL-1 en la frmula para calcular la concentracin de su
muestra?
4. Calcule el grado de pureza de la muestra aislada en la
prctica 2 y compare con el valor terico. Discuta sus
resultados.
5. Compare sus resultados (Concentracin de ADN y relacin de
pureza D.O.260:D.O.280) con los del resto del curso. Discuta.

28

PRCTICA 5
CARACTERIZACIN DE PLSMIDOS
RECOMBINANTES POR ANLISIS DE
RESTRICCIN
Objetivos

Manejar los principios metodolgicos bsicos del uso de las

enzimas de restriccin para la caracterizacin de molculas de
ADN.

Evaluar mediante la tcnica de electroforesis en geles de

agarosa, los tamaos de los fragmentos generados por la
digestin con enzimas de restriccin de los plsmidos aislados
en la prctica 2 y comparar el patrn obtenido con el
reportado en los mapas fsicos.

Introduccin
Las enzimas o endonucleasas de restriccin, ER, son protenas
que reconocen secuencias definidas del ADN entre 4, 6 o ms
nucletidos, cortando en sitios especficos dentro de esta secuencia o
en sitios vecinos a ella. Desde su descubrimiento en los aos 70 se
han

aislado

ms

de

300

enzimas

de

restriccin

dndoles

denominaciones de acuerdo a las diferentes especies de bacterias

donde se originan; por ejemplo EcoR I fue aislada de E. coli, Hind III
de Haemophilus influenzae y Hpa I de Haemophilus parainfluenzae.
Las secuencias reconocidas por las enzimas de restriccin son
generalmente palndromos y cada enzima reconoce una secuencia
diferente. En su conjunto las ER constituyen una herramienta para
obtener fragmentos discretos de ADN con extremos cuya secuencia
es conocida. Los fragmentos de ADN resultantes de una digestin
con enzimas de restriccin pueden ser separados por electroforesis

29

en geles de agarosa en un rango de 200 pb a 20 kb. A la

combinacin de digestin con enzimas de restriccin y al anlisis
mediante electroforesis en geles se le llama anlisis de restriccin.
La representacin de una molcula de ADN, ya sea circular o lineal,
donde se indiquen a escala con el tamao en pb, la ubicacin de los
sitios de restriccin que poseen, se denomina mapa de restriccin.
En este ejercicio prctico se realizar la verificacin del mapa de
restriccin de los plsmidos pEGFP y pEYFP aislados en la prctica 2
(Figura 1).
Materiales y reactivos

ADN plasmdico aislado en la prctica 2

Enzimas Hae II, Xba I y EcoR I

Tampn 10X especfico de cada enzima

Agua bidestilada, autoclavada

Estufa a 37C

Tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1,5 mL

Micropipetas P20 y P200

Puntas para micropipetas 20-200 L

Protocolo
Nota: Cada equipo va a realizar tres digestiones por separado para
la muestra de ADN plasmdico, con cada una de las enzimas Hae II,
Xba I y EcoR I. Previo a montar las digestiones, registre los
reactivos, sus concentraciones y el volumen a utilizar en un cuadro
similar al descrito en la Tabla 2.
1. Siguiendo el orden de la Tabla 2, colocar la solucin de ADN
(pEGFP o pEYFP proveniente de la miniprep de la prctica 2),
en un tubo de 1,5 mL estril. Estime el volumen de la solucin

30

de ADN de acuerdo a la evaluacin del rendimiento del

aislamiento en el gel de agarosa y a la concentracin estimada
en el espectrofotmetro o a travs de comparacin en geles.
2. Aadir 1,5 L del tampn de la enzima (10x).
3. Agregar 0,5 L la enzima (Hae II, Xba I o EcoR I) .
4. Completar hasta 15 L con H2O bidestilada y autoclavada.
5. Incubar a 37C por 2 horas.
6. Analizar la digestin en una electroforesis en gel de agarosa al
0,8% en tampn TAE 1X. Mezclar 4 L de tampn de carga
con cada tubo de digestin previo a colocarla en el gel. Incluir
un marcador de peso molecular.
7. Utilizando guantes para manipular el gel, teirlo en una
solucin de BrEt 0.5 g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a
una bandeja con agua destilada.
8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador
UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.
Tabla 2 Registro de los reactivos, concentraciones y volmes a
utilizar en las digestiones con las enzimas Hae II, Xba I y EcoR I de
los plsmidos pEGFP y pEYFP.

Reactivo

Concentracin

Digestin

Digestin

Digestin

del stock

HaeII (L)

XbaI (L)

EcoRI (L)

15

15

15

DNA
Tampn

10X

enzima

8-10 u.L-1

H2O bd
Volumen
final

31

ANEXO 2. Patrones de restriccin esperados para pEGFP y pEYFP.

M)Marcador PM escalera de 1kb

1) pEYFP sin digerir
2) pEYFP colonia 1 dig. HaeII +
RNasa
3) pEYFP colonia 2 dig. HaeII +
RNasa
4) pEGFP sin digerir
5) pEGFP colonia 1dig. XbaI +
RNasa
6) pEGFP colonia 2 dig.
Rnasa

XbaI +

Figura 3. Resultado esperado del aislamiento de los plsmidos

pYGFP y pEGFP

y de su caracterizacin con las enzimas Hae II y

Xba I. Corrida electrofortica de las digestiones especificadas para

cada carril en un gel de agarosa 1% p/v en tampn 1x TAE.

Preguntas de la prctica
1. Investigar la nomenclatura de las enzimas de restriccin. Por
qu las enzimas utilizadas en la prctica se denominan Hae II,
Xba I y EcoR I?
2. Indar sobre el origen de las enzimas de restriccin y la
importancia de su uso en la biologa molecular.
3. Cules son los componentes del tampn de cada ER y cules
son sus funciones?
4. Estimar el tamao de los fragmentos generados en cada
digestin y comprelo con el mapa de restriccin en cada
caso. Visite el sitio www.bdbiosciences.com. Por qu en el
carril 6 de la figura 3 se observan cuatro bandas?
32

2DO BLOQUE
Aplicacin de tcnicas de la gentica
molecular al diagnstico de enfermedades
hereditarias humanas
INTRODUCCION
En la gentica clsica o Mendeliana el estudio del genotipo
implica la realizacin de cruces y el anlisis de las proles en las
diferentes generaciones que revelen la expresin de los genes y las
interacciones allicas a travs del fenotipo. Para el estudio de
enfermedades hereditarias en humanos se analizan los pedigres
familiares, no siempre disponibles, en la bsqueda de patrones
hereditarios

asociados

al

fenotipo

de

la

enfermedad.

Afortunadamente, hoy en da existe la posibilidad de analizar

directamente

al

genotipo

de

un

individuo.

Las

herramientas

disponibles, producto de la biologa molecular, permiten establecer

de manera exacta la secuencia de nucletidos en el ADN de un gen
determinando la presencia de mutaciones asociadas a un fenotipo
en particular. El potencial de las nuevas tecnologas radica en su
resolucin y sensibilidad. La combinacin de metodologas que
permiten aislar fragmentos especficos de ADN utilizando la reaccin
de amplificacin en cadena de la polimerasa o PCR, por su siglas en
ingls

Polymerase

Chain

Reaction,

mtodos

anlogos

de

amplificacin de cidos nucleicos, as como estrategias que detectan

variaciones en la secuencia de nucletidos, como lo son la
hibridacin molecular, secuenciacin directa del ADN o la ganancia o
prdida de sitios de reconocimiento y corte de enzimas de
restriccin
proporcionan

detectados
las

mediante

herramientas

tcnicas

necesarias

de
para

electroforesis,
identificar

la

presencia de mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias y la

certera

posibilidad

de

hacer

diagnstico

33

gentico.

Con

las

metodologas existentes y disponibles es posible detectar y analizar

la nica copia de cada uno de los genes presentes en una clula.
Histricamente fue Linus Pauling en 1941 quien acu el
trmino enfermedad molecular al directamente relacionar la causa
de la inmunoglobulinopata o anemia drepanoctica sickle cell con
la molcula de la hemoglobina. Por primera vez fue demostrado que
una protena anormal poda causar una enfermedad y que los genes
determinaban la estructura de las protenas. Utilizando el anlisis
electrofortico, Pauling y sus colaboradores observaron que la
hemoglobina

Hb-SS

mostraba

un

cambio

en

la

movilidad

electrofortica respecto a la hemoglobina normal Hb-AA; este

cambio era producto de una mutacin en el gen de la -globina que
daba lugar a un cambio en un aminocido en la protena madura. La
hemogloblina Hb-SS se origina de la sustitucin A -> T en el sexto
codn del gen de la cadena de -globina. Este cambio en un
nucletido cambia al sexto aminocido en la cadena peptdica de
cido glutmico a valina, cambio que a su vez afecta la forma y
funcin de la molcula de hemoglobina adulta. Los eritrocitos que
portan estas molculas pueden tener formas anormales que
obstruyen los capilares o son degradados en los riones. El individuo
que hereda un alelo mutado de -globina de uno de sus padres y un
alelo

normal,

se

dice

que

porta

el

carcter

tendr

una

hemoglobina adulta del tipo Hb-AS. Si tiene ambos alelos normales

para la -globina, este individuo tendr una hemoglobina adulta del
tipo Hb-AA. En caso de heredar ambos alelos mutantes el individuo
tendr una hemoglobina adulta Hb-SS.
La anemia drepanoctica es una enfermedad hereditaria
autosmica recesiva introducida en el continente Americano con el
trfico de esclavos desde frica y que afecta 1 de cada 600 afrodescendientes norteamericanos. Fue el primer desorden hereditario
en ser diagnosticado utilizando mtodos moleculares dirigidos al
genotipo. A finales de los aos 70, se realiz el diagnstico
34

molecular combinando tcnicas de hibridacin Southern utilizando

una sonda del gen de la -globina, marcada radiactivamente, para
detectar polimorfismos en el tamao de los fragmentos generados
por la digestin con una enzima de restriccin (diagnstico RFLP por
sus siglas en ingls Restriction Fragment Length Polymorphism).
Esta primera prueba era indirecta y detectaba el ligamiento gentico
de la mutacin en el gen de la -globina a la presencia/ausencia de
un sitio polimrfico Hpa I vecino al gen. En 1982 se identific la
mutacin puntual en el gen de la -globina que da origen a la Hb-SS
y posteriormente se determin que la mutacin destruye un sitio de
corte para la enzima Mst II y sus isoesquizmero Bsu36 I, asociando
directamente un RFLP al diagnstico gentico.
La metodologa del RFLP requiere del aislamiento de clulas
fetales mediante amniosistesis para la obtencin de suficientes
cantidades de ADN genmico a analizar en las hibridaciones
Southern. Este requerimiento del ensayo constitua una limitante que
ha sido solventada acoplando la amplificacin de la regin del gen de
-globina mediante PCR a la digestin del amplicn con la enzima
MstII o la Bsu36I. Luego del anlisis electrofortico de los patrones
de fragmentos generados en la digestin,

es posible identificar el

genotipo.
Las pruebas de diagnstico molecular estn disponibles en la
actualidad para un gran nmero de desrdenes genticos y
permiten evaluar familias completas, as como el realizar el
diagnstico prenatal del feto con profundas implicaciones sociales
que deben ser consideradas mucho antes de su implementacin. Es
necesario que se establezcan criterios y marcos referenciales,
conjuntamente con los programas de diagnstico, en los que se
contemplen aspectos como la certeza y efectividad de la prueba, su
verdadera utilidad, particularmente para enfermedades genticas
sin cura,

y el asesoramiento

consejo

gentico

que debe

acompaar al programa de diagnstico. En el caso de la anemia

35

drepanoctica, para la cual no existe un tratamiento curativo, se

considera que la nica medida a nivel mundial para prevenir
enfermedad es

el diagnstico

prenatal. El procedimiento

la
del

diagnstico molecular ha sido simplificado y estas pruebas pueden

ser

realizadas

de

forma

segura

en

muchos

pases,

lo

suficientemente temprano como para permitir una eleccin segura

de terminacin del embarazo.
En este segundo bloque del laboratorio realizaremos la
aplicacin de mtodos de biologa molecular para el anlisis directo
del genotipo con la finalidad de identificar la presencia de los alelos
salvajes y mutantes del gen de -globina asociados al fenotipo de la
anemia drepanoctica. Utilizaremos una metodologa sencilla para el
aislamiento del ADN del epitelio bucal, a partir del cual ser
amplificada una regin del gen de -globina que contiene la regin
N-terminal de la protena donde se ubica la mutacin. Mediante el
patrn de RFLP de este amplicn con la enzima Bsu36 I, ser posible
identificar el genotipo de la muestra con respecto al gen de la globina. Consideraremos en este bloque dos aspectos asociados y
consecuencia de la aplicacin de tcnicas moleculares al anlisis del
genoma para el diagnstico de enfermedades hereditarias y la
identificacin de individuos: la incorporacin del consentimiento
informado para los individuos participantes en las pruebas y una
lectura que ilustra la pertinencia de estas metodologas para
resolver problemas legales en los tribunales con un verdadero
impacto en la sociedad. De esta manera, el contenido del segundo
bloque del manual de laboratorio cubre los aspectos tcnicos bsicos
del anlisis a nivel del genoma de las enfermedades hereditarias
humanas como las implicaciones ticas de su aplicacin.

36

PRCTICA 6
ANLISIS DE PERFILES GENTICOS
HUMANOS MEDIANTE PCR-RFLP:
DETECCIN DE UNA MUTACION PUNTUAL O
SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISM, SNP,
EN EL GEN DE LA -GLOBINA
Objetivos

Aislar ADN genmico de clulas de epitelio bucal humano para

anlisis de RFLP-PCR

Manejar los fundamentos de la tcnica de amplificacin de

ADN por PCR.

Analizar mediante la tcnica de PCR-RFLP, la presencia de

mutaciones puntuales o del Single Nucleotide Polymorphism,
SNP, en el gen de la -globina humana responsable de la
anemia drepanoctica.

PARTE I
PREPARACIN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS
La

efectividad

en

la

aplicacin

de

una

reaccin

de

amplificacin de ADN o ARN depende principalmente de la calidad

del material de partida para el anlisis. En primer lugar es
imprescindible la seleccin adecuada de la fuente del material
gentico del organismo a identificar.
El origen del material gentico a evaluar puede ser variado.
En el caso de bacterias y parsitos la fuente ideal es el cultivo del
organismo. Sin embargo, no siempre es posible tener un cultivo por
razones tcnicas y/o biolgicas, en consecuencia se debe obtener
una muestra que contenga al microorganismo o su genoma, como
37

muestras de suelos, biopsias, sangre o suero. Para el anlisis de

genotipos humanos en el diagnstico de enfermedades hereditarias,
determinacin de filiacin e investigaciones fornsicas, se asla ADN
a partir de muestras de sangre o de clulas fetales provenientes del
lquido amnitico en el caso del diagnstico prenatal. Sin embargo,
la altsima sensibilidad de las tcnicas de amplificacin de ADN in
vitro permiten ampliar la fuente del ADN a todo tipo de muestras
que contengan clulas del individuo; clulas del epitelio bucal son
utilizadas

rutinariamente

en

el

anlisis

de

perfiles

genticos

humanos.
Una vez seleccionada la fuente de ADN, la muestra debe ser
sometida a un proceso de extraccin de cidos nucleicos con el fin
de preservarlos y evitar la accin degradativa de enzimas u otros
compuestos presentes inicialmente en la misma; as como eliminar
sustancias que interfieran o inhiban de alguna manera la reaccin de
amplificacin. El protocolo de procesamiento previo de la muestra
depende exclusivamente del tipo y origen de la misma, as como de
la calidad del material que se desea obtener. En general, los
mtodos de preparacin de muestras buscan degradar protenas y
extraer el ADN. Las protenas son desnaturalizadas o degradadas
enzimticamente

posteriormente

separadas

de

los

cidos

nucleicos. Luego de descartar las protenas, el ADN puede extraerse

por separacin del precipitado proteico o con extraccin fenlica.
Es importante saber que, siempre que se trabaje con
muestras
Informado

de
del

origen
sujeto

humano
al

debe

cual

se

existir
le

un

extrae

Consentimiento
la

muestra.

El

Consentimiento Informado es un proceso mediante el cual un sujeto

confirma voluntariamente su deseo de participar en un estudio en
particular, despus de haber sido informado sobre todos los aspectos
de ste que sean relevantes para que tome la decisin de participar.
El Consentimiento Informado se documenta por medio de un
formulario donde se registra por escrito la informacin del estudio y
38

la manifiesta aceptacin del individuo en participar, confirmando el

conocimiento de su contenido. Este documento es firmado y registra
la fecha de su elaboracin.

1.1 Aislamiento de ADN a partir de epitelio bucal.

El epitelio bucal est en constante regeneracin y sus clulas
son reemplazadas continuamente. Aprovechando esta propiedad,
este

protocolo

permite

extraer

ADN

genmico

de

clulas

provenientes la capa ms superficial del epitelio estratificado

mediante el raspado de las paredes internas de las mejillas y de las
encas, utilizando para ello hisopos de algodn.
La proteinasa K rompe enlaces peptdicos, lo que permite
digerir las protenas que se encuentren junto al ADN en el lisado
celular.

Materiales y reactivos

Proteinasa K 10 mg.mL-1

Tampn de lisis 1X (Tris-HCL 0,05 M pH 8; EDTA 0,05 M pH

8; glucosa 0,05 M; SDS 0,5%; NaCl 0,1 M)

Hisopos estriles

Micropipetas P20, P200 y P1000

Puntas para micropipetas 20-200 L, 1 mL

Baos de incubacin

Centrfuga refrigerada alcance a 10000 r.p.m.

Tubos plsticos estriles de 1,5 mL y 15 mL

39

Protocolo
NOTA: Recuerde rotular todo el material que vaya a utilizar.
1. Con un hisopo estril raspar o rayar generosamente la parte
interna de su mejilla derecha y el espacio entre su mejilla y
enca durante un minuto; intente recolectar tanto material
como le sea posible.
2. Colocar el hisopo con las clulas del epitelio bucal en el tubo
que

contiene

mL

de

tampn

de

lisis

1X.

Agitar

vigorosamente el hisopo para liberar las clulas en el tampn,

para transferir la mayor cantidad de clulas posibles.
3. Usando un segundo hisopo estril, raspar o rayar la parte
interna de su mejilla izquierda y el espacio entre su mejilla y
enca, as como en la parte ms interna de la boca como lo
hizo en el paso (1). Trate de recolectar la mayor cantidad
posible de material que le sea posible. Coloque el segundo
hisopo en el tubo con tampn de lisis como hizo en el paso
(2).
4. Tapar e invertir gentilmente el tubo 5 veces para mezclar el
contenido.
5. Agregar 1 L de proteinasa K (10 mg.mL-1) al tubo.
6. Tapar nuevamente el tubo e invertir gentilmente varias veces
para mezclar el contenido.
7. Incubar los tubos en un bao de temperatura a 37 C durante
20 minutos.
8. Pasado este tiempo, colocar los tubos en un bao de
temperatura a 50 C durante 10 minutos.
9. Aadir 200 l de NaCl 8 %. Tape el tubo e invierta
suavemente 5 veces.

40

10. Trasvasar el contenido de este tubo a un tubo de 15 mL.

Aadir lentamente por las paredes del tubo, 2 mL de etanol
100%. Deje reposar durante 5 min.
11. Transcurridos los 5 min., sellar el tubo con parafilm e invertir
5 veces para ayudar a precipitar el ADN.
12. Centrifugar durante 15 min. a 10000 r.p.m. Descartar el
sobrenadante y dejar secar todo el alcohol.
13. Resuspender el ADN en un volumen no mayor a 200 L de
tampn TE o agua MiliQ (calidad PCR, libre de ADNasas y
ARNasas)
14. Correr 5 L del ADN en un gel de agarosa 0.8% para verificar
la cantidad e integridad del ADN aislado.
15. Diluir el ADN 1/100 antes de iniciar el protocolo de PCR.

Observaciones

La recoleccin de un nmero abundante de clulas es crtica

para lograr los objetivos. Asegrese de emplear el tiempo
recomendado para la coleccin y transferencia de las clulas
del epitelio bucal.

Es muy importante incubar la solucin junto con la proteinasa

K a 37 C para purificar el ADN que se encuentra en la
solucin. Asegrese de realizar las digestiones durante el
tiempo recomendado, note que un mayor tiempo de digestin
permitir obtener un ADN mucho ms puro.

Preguntas de la prctica

Compare los pasos y reactivos utilizados en el aislamiento de

ADN plasmdico (Prctica 2) y ADN genmico (Prctica 6,
Parte I). Qu diferencias y similitudes observ?

41

ANEXO 3

CONSENTIMIENTO INFORMADO
En el Laboratorio de Gentica Molecular, como parte de la
Prctica 6, se propone realizar un anlisis de perfiles genticos
humanos mediante RFLP-PCR.
El objetivo del trabajo es evaluar, mediante esta tcnica, la
presencia de una mutacin puntual en el gen de la -globina
humana, responsable de la anemia drepanoctica.
Los datos obtenidos en este estudio contribuirn inicialmente
a la realizacin de la prctica, y posteriormente, con la acumulacin
de datos ao tras ao, podr llevarse a cabo la construccin de un
banco de datos de este polimorfismo, que eventualmente permitir
calcular la frecuencia de esta mutacin en la poblacin venezolana.
Yo, _______________________________C.l.:_________________,
Nacionalidad___________________Estado Civil ___________siendo
mayor de 18 aos, en uso pleno de mis facultades mentales y sin
que medie coaccin ni violencia alguna, en completo conocimiento
naturaleza, forma, duracin, propsito, inconvenientes y riesgos
relacionados con el estudio que mas abajo se ndica, declaro
mediante la presente:
1.- Haber sido informado de manera objetiva, clara y sencilla, de
todos los aspectos relacionados con la prctica nmero 6 del
laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular.
2.- Tener conocimiento claro de que el objetivo del trabajo antes
sealado es: es evaluar, mediante la tcnica RFLP-PCR, la presencia
de una mutacin puntual en el gen de la -globina humana,
responsables de la anemia falciforme.
3.-

Conocer

bien

el protocolo

experimental expuesto

por

el

investigador; en el cual se establece que mi participacin en el

trabajo consiste en donar al laboratorio de la materia electiva
Gentica Molecular de la Escuela de Biologa, Facultad de Ciencias,
42

Universidad Central de Venezuela, una muestra de clulas del

epitelio bucal.
4.- Que la muestra de clulas del epitelio bucal que acepto donar as
como la informacin que suministre al equipo de profesores del
laboratorio de la materia electiva Gentica Molecular coordinados por
la Dra. Palmira Guevara, ser utilizada nica y exclusivamente para
determinar la presencia de mutaciones puntuales en el gen de la globina humana.
5.- Que el equipo de profesores coordinados por la Dra. Palmira
Guevara, me ha garantizado confidencialidad, relacionada tanto a mi
identidad como de cualquier informacin a la que tengan acceso, por
concepto de mi participacin en el proyecto antes mencionado.
6.- Que bajo ningn concepto podr restringir el uso, para fines
acadmicos, de los resultados obtenidos en el presente estudio.
8.-.Que mi participacin en dicho estudio no implica riesgo ni
inconveniente alguno para mi salud, as como que dicho estudio no
forma parte de una terapia paliativa o curativa.
7.- Que cualquier pregunta que yo tenga en relacin con este
estudio, me ser respondida oportunamente por parte del equipo de
profesores antes mencionados con quienes me puedo comunicar por
el telfono 0212-605 1044 de la direccin de la Escuela de Biologa
con la Dra. Palmira Guevara.
8.- Que bajo ningn concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir
ningn beneficio de tipo econmico producto de los hallazgos que
puedan producirse en el referido proyecto de investigacin.
9.- Que los resultados de las pruebas realizadas me
entregados oportunamente.
Caracas a los ____das del mes de ___________ del 20___
Firma:
Nombre y apellido:

43

sern

PARTE II
ENSAYOS DE AMPLIFICACIN MEDIANTE LA REACCIN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR) DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE GLOBINA HUMANA

El desarrollo de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa o PCR

(del ingls Polimerase Chain Reaction) es uno de los avances
tecnolgicos de mayor impacto en las tcnicas de Biologa Molecular
y debido a sus mltiples aplicaciones constituye un importante
progreso en el rea de diagnstico e identificacin molecular.
Posiblemente, una de sus mayores ventajas corresponde a la
simplicidad de la reaccin y la relativa facilidad en los pasos de
manipulacin de material de trabajo, permitiendo la adopcin de la
tcnica de PCR en diversos mbitos.
En esta tcnica, la amplificacin de un fragmento especfico
de ADN, por ciclos sucesivos, es un proceso de multiplicacin
exponencial, que genera suficiente producto que puede acumularse
y ser visualizado.

De esta manera, una sola molcula puede

generar ms de un billn de copias de si misma, luego de 30 ciclos

de replicacin exponencial.
El PCR se utiliza para amplificar un fragmento definido de
ADN a partir de una mezcla compleja de material, usualmente
llamada ADN templado. Para la obtencin del templado se precisa
de un proceso de purificacin a partir de la muestra, tal como se
seala en la Prctica 6, Parte I del presente manual. Adems del
templado, se requiere el conocimiento de las secuencias de ADN que
flanquean al fragmento a ser amplificado, conocido como ADN
blanco. A partir de esta informacin se pueden disear y sintetizar
qumicamente dos oligonucletidos iniciadores. Cada uno de estos
oligonucletidos es complementario al extremo 3 de la hebra de
ADN de la secuencia blanco, un oligonucletido para cada una de las

44

dos hebras del ADN (Figura 4).

La tcnica de PCR es un proceso de sntesis in vitro de ADN,
en el cual se copia una hebra complementaria a partir de un
templando, extendindose en direccin 35 a partir de un
iniciador, cebador o primer. Consiste en tres pasos definidos de
tiempo

temperatura,

conocidos

como

desnaturalizacin,

alineamiento y extensin, y cada conjunto secuencial de pasos o

ciclos es repetido de 30 a 40 veces (Figura 4).
En el primer ciclo el templado de ADN doble cadena es
inicialmente desnaturalizado por calentamiento de la mezcla de
reaccin a una temperatura por encima de 90C. Con esta primera
etapa, la regin de ADN que ser especficamente amplificada
(secuencia blanco o diana) se hace accesible, dentro de la muestra
de ADN total.

Posteriormente, la temperatura se baja hasta

alcanzar entre 40 a 60 C para iniciar el segundo paso, el

alineamiento de los oligos o cebadores. En este perodo los
cebadores, presentes en exceso en la mezcla de reaccin, se ubican
mediante hibridacin por complementaridad de bases con la
secuencia blanco. Los oligonucletidos alineados actan como
iniciadores para la sntesis del ADN, dado que proveen del grupo
hidroxilo 3 libre para la ADN polimerasa. La precisin en la
temperatura de esta fase es crtica y est definida por el Tm de cada
cebador, en cada sistema de PCR debe optimizarse tomando en
cuenta este parmetro.

Las reacciones que no estn optimizadas

pueden generar productos de ADN adicionales al blanco especfico si

la temperatura esta muy por debajo del Tm o pueden no producir
ningn producto amplificado si son muy elevadas.
El tercer paso, la sntesis del ADN o extensin, es realizada a
72 C por una ADN polimerasa termoestable, mas comnmente
llamada Taq ADN polimerasa, porque es originaria de la bacteria
Thermus aquaticus. Finalmente, el ADN sintetizado posee los sitios
de anclaje para los oligonucletidos, sirviendo como templado para
45

los sucesivos ciclos de PCR.

Cada sistema de PCR sigue el mismo principio bsico, sin
embargo la secuencia de los oligonucletidos, los componentes de la
mezcla de reaccin, as como las temperaturas y los tiempos de
cada paso de un ciclo son especficos. En la presente seccin se
presentan un esquema general de los pasos de la reaccin de PCR
con rangos de temperaturas para diversos sistemas.

Figura 4. Pasos de cada ciclo en la reaccin de PCR

2.1 Diagnstico molecular de la anemia drepanoctica: PCR-RFLP,

amplificacin de un segmento del gen de la -globina mediante la
reaccin de PCR
El diagnstico de la anemia drepanoctica se realiza por
diferentes mtodos, las pruebas moleculares detectan la presencia
de la mutacin a nivel de la protena o directamente en el gen. En el
primer caso se evala el cambio de la movilidad de la hemoglobina
en electroforesis en acetato de celulosa, isoelectroenfoque o

46

cromatografa lquida de alta resolucin, asociado a la presencia de

una valina en lugar de un cido glumico en la posicin seis de la
cadena de -globina (Figura 5). La mutacin puntual que resulta en
el cambio del codn GAG del cido glutmico al codn GTG de la
valina, tambin cambia el sitio de reconocimiento de la enzima de
restriccin MstII y su isoesquismero Bsu36I. En la prueba de PCRRFLP de la anemia drepanoctica que incluimos en este manual,
luego

de

la

amplificacin

de

un

fragmento

de

536

pb,

correspondiente a la regin N-Terminal del gen de la -globina, se

realizar una digestin de este amplicn con la enzima Bsu36 I y se
evaluar el patrn de los fragmentos generados en la restriccin
(Figura 6) para la identificacin del genotipo del individuo entre
homocigoto normales HbAA, homocigotos que sufren la enfermedad
HbSS y heterocigotos o portadores del caracter con hemoglobina
HbAS.

GAG
Mutacin
en el
Codn 6
GTG
Acido glutmico 6
Reemplazo del aa
Valina 6
Variante de hemoglobina

HbAA, HbAS y HbSS

Forma
del
eritrocito
Normal

Falciforme

Figura 5. Esquema del origen de los eritrocitos falciformes.

47

Materiales y reactivos

Tubos de PCR (200 L)

Micropipetas P10, P20 y P200

Puntas para micropipetas 10 L, 20-200 L

Termociclador

H2O bi-destilada para PCR

Tampn de PCR 10X

dNTPs 1,25 mM

Cebador A (forward) 20 M
5-GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G-3

Cebador B (reverse) 20 M
5-GCT CAC TCA GTG TGG CAA AG-3

MgCl2 50 mM

Muestra de ADN 50 ng.L-1

Muestras de ADN controles (50 ng.L-1 ) de individuos HbSS,

HbAS y HbAA

ADN Taq polimerasa 5 U.L-1

Agarosa

500 mL Tampn TAE 1X

Transiluminador de luz UV/Sistema de fotodocumentacin

Solucin de Bromuro de Etidio 0,5 g. mL-1

Fiola 125 mL

Observaciones

Se debe tomar en cuenta que la mezcla de reaccin debe

realizarse en un rea libre de ADN (irradiada con luz UV al
menos 15 minutos antes de comenzar a trabajar). Debido a
48

que se utilizarn varios tubos de reaccin, se recomienda

realizar una mezcla madre y luego distribuirla en los tubos
por cantidades iguales, para finalmente agregarle el ADN.
Todo el material debe estar identificado.

A partir del ADN aislado de clulas del epitelio bucal (parte I

de la prctica 6), y de los ADNs controles se amplificar un
fragmento de 536 pb correspondiente al gen de la -globina
utilizando

los

cebadores

(forward)

(reverse).

Dependiendo de la eficiencia del aislamiento se deben realizar

previamente

diluciones

de

la

muestra,

hasta

alcanzar

aproximadamente 100 ng.mL-1 de ADN.

Protocolo
1. Se llevarn a cabo cinco reacciones de amplificacin una con
la muestra problema, tres con cada uno de los ADN controles
y el control de contaminacin sin ADN.
2. La mezcla de reaccin se debe preparar siguiendo el orden
indicado en la Tabla 3. En un tubo de mezcla madre de
reaccin se deben agregar los volmenes calculados de H2O
calidad PCR, tampn de reaccin 10X, MgCl2 50mM, dNTPs
1,25mM, cebador A 20 M, cebador B 20 M,

Taq ADN

polimerasa 2U. Mezclar muy bien para garantizar que la

mezcla sea homognea.
3. Enumerar cinco tubos para cada tipo de muestra, muestra
problema y controles. Repartir en cada tubo 48 L de la
mezcla madre de PCR.
4. Agregar finalmente 2 L de cada una de las muestras
comenzando por el control sin ADN al cual se le agregan agua
calidad PCR.
5. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el programa de
amplificacin denominado ANEMIA (Tabla 4).

49

6. Luego de realizar la amplificacin correr un gel de agarosa al

1% en tampn TAE 1X para verificar la presencia del producto
esperado. Analice 20 L de cada reaccin ms 3 L de tampn
de carga 6X.
7. Utilizando guantes para manipular el gel, teirlo en una
solucin de BrEt 0.5 g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a
una bandeja con agua destilada.
8. Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador
UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 3. Reactivos para la reaccin de amplificacin

Cantidad
por tubo

Total (4n)

( L)

(L)

Concentracin
final en el tubo

36,6

146,4

Tampn de PCR 10X

20

1X

MgCl2 50 mM

2 mM

dNTPs 1,25 mM

0,2 mM

Cebador A 20 M (*)

0,4 M

Cebador B 20 M
(**)

0,4 M

0,4

1,6

0,04 U.L-1

50

192,0

Mezcla de reaccin

1n
H2O calidad PCR

ADN Taq polimerasa

5 U.L-1
ADN 50 ng L-1
Volumen final

50

Tabla 4. Programa ANEMIA

No de
Paso

Temperatura Tiempo Ciclo repeticiones

(C)

(min.)

inicial

94

Denaturalizacin

94

Hibridacin

55

Extensin

72

Extensin final

72

del ciclo

Denaturalizacin

51

40

10

PARTE III
DIGESTIN DEL AMPLICN CON LA ENZIMA Bsu36 I Y ANLISIS
DEL PATRN DE RESTRICCIN.

A partir del producto de amplificacin del gen de la cadena de

la hemoglobina humana se realizar la digestin con la enzima
Bsu36 I, isoesquismero de la enzima Mst II. Los patrones de
restriccin luego sern visualizados en un gel de agarosa y
analizados para determinar el genotipo.
Materiales y reactivos

Producto de amplificacin por el programa PCR ANEMIA

Enzima Bsu36 I

Tampn 10X especfico de la enzima

Agua bidestilada y autoclavada

Solucin de EDTA 0,5 M pH 8,0

Estufa a 37C

Microcentrfuga

Tubos plsticos de microcentrfuga estriles de 1,5 mL

Micropipetas P20 y P200

Puntas para micropipetas 1-10 L, 20-200 L

Guantes desechables

Protocolo
1.

En un tubo estril de 1,5 mL realice la mezcla de digestin

siguiendo el orden de la Tabla 5.

2.

Incubar a 37C por un perodo de 2 h.

3.

Detener la reaccin adicionando EDTA 0,5 M (pH 8.0) a una

concentracin final de 10 mM.
52

4.

Analizar todo el producto de la digestin mezclado con 3 L

de tampn de carga, mediante electroforesis en un gel de
agarosa al 3% en tampn TAE 1X. Incluir un marcador de
peso molecular.

5.

Visualice el resultado mediante tincin del gel en una solucin

de BrEt 0,5g.mL-1 por 1 minuto. Transferirlo luego a una
bandeja con agua destilada. Recuerde utilizar guantes.

6.

Registre el resultado exponiendo el gel a un transiluminador

UV y utilizando un aparato de fotodocumentacin.

Tabla 5. Reactivos de la reaccin de digestin.

Componente

Cantidad (L)

Tampn de la enzima 10X

1,5

H2O calidad PCR

7,5

Producto PCR

10

Enzima Bsu36 I 10U.L-1

Volumen final

1
20

Preguntas de la prctica
1. Cules son las caractersticas ms importantes que debe
tener

la

enzima

ADN

polimerasa

para

la

reaccin

de

puedan

ser

amplificacin in vitro?
2. Investigue

sobre

otras

enfermedades

que

diagnosticadas mediante el uso la tcnica del PCR.

3. Por qu debe agregrsele MgCl2 a la mezcla en la reaccin de
la polimerasa?
4. Por qu el EDTA detiene la reaccin enzimtica?

53

ANEXO 4
Resultados esperados del diagnstico por PCR-RFLP en el gen de globina humana
En la figura 6 se muestra un ejemplo de los patrones de
restriccin esperado cuando el producto e PCR de 536 pb del gen globina es sometido a digestin con la enzima Bsu36 I.

pb

Figura 6. Patrn de digestin del fragmento de 536 pb del gen globina cuando se digiere con Bsu36 I. M: Marcador de peso
molecular X 174 Hae III. 1 en pb; Amplicn de 536 pb PCR sin
digerir. 2: Digestin del ADN de un sujeto homocigoto para
Hemoglobina A (HbAA). 3: Digestin del ADN de un sujeto
heterocigoto (HbAS). 4: Digestin del ADN de un sujeto homocigoto
para Hemoglobina S (HbSS).

54

ANEXO 5

LECTURA
GENTICA Y SOCIEDAD
Tomado y traducido de Hartwell y col., (2000)
Genetics from genes to genome. McGraw Hill.
Pruebas de ADN mitocondrial reemplazan tipificacin HLA como
evidencia de parentesco en cortes argentinas.
Entre los aos 1976 y 1983, la dictadura militar gobernante de
Argentina

secuestr,

estudiantes

encarcel

universitarios,

asesin

profesores,

ms

trabajadores

de

10.000

sindicalistas

sociales, y otras personas opuestas al rgimen. Una gran cantidad

de nios lactantes de meses desaparecieron en la crcel junto con
los jvenes adultos, y cerca de 120 bebs nacieron en centros de
detencin. En 1977, las abuelas de algunos de estos nios
comenzaron a organizar vigilias en la principal plaza de Buenos Aires
para servir de

testigos

informar a

la poblacin sobre

la

desaparicin de sus hijos y nietos. Estas mujeres rpidamente

formaron un grupo defensor de los derechos humanos llamado Las
Abuelas de la Plaza de Mayo.
La meta de Las Abuelas fue localizar ms de 200 nietos a
quienes sospechaban an con vida, y reunirlos con sus familias
biolgicas. Para este fin, recolectaron informacin de diferentes
testigos, como parteras y carceleras, y formaron as una red
organizada para monitorear los documentos de inscripcin de nios
en jardines de infancia. Los certificados de nacimiento dudosos
podran revelar a un potencial nieto perdido. Este grupo tambin
publicit

su

trabajo

dentro

de

Argentina,

contactaron

organizaciones de otras partes del mundo, incluyendo la United

55

Nations Human Rights Comission y la American Association for the

Advancement of Science (AAAS).
Lo que el grupo de Las Abuelas de la Plaza de Mayo pidi a la
AAAS fue su ayuda para realizar los anlisis genticos vlidos en la
corte. Para el momento, la democracia haba remplazado al rgimen
dictatorial militar y Las Abuelas de la Plaza de Mayo pudieron
argumentar casos legales ante tribunales relativamente imparciales;
los nios que haban sido secuestrados entre los 2 o 3 aos, o recin
nacidos, tenan entre 7 y 10 aos de edad. An cuando Las Abuelas
de la Plaza de Mayo haban recogido una gran cantidad de evidencia
circunstancial, los tribunales argentinos no aceptaron esta evidencia
como prueba de identidad de un infante y su relacin biolgica a una
familia en particular. Sin embargo, los tribunales reconocieron que, a
pesar de que el tamao y las caractersticas fsicas de los nios
habran cambiado, sus genes -que los relacionaban inequvocamente
a sus familias biolgicas- no lo habran hecho. Las Abuelas de la
Plaza de Mayo, quienes se haban documentado de manera
autodidacta sobre el potencial de estas pruebas genticas, buscaron
ayudar con los detalles necesarios para obtener y analizar dichas
pruebas. A partir de 1983, los tribunales argentinos acordaron
aceptar

los

resultados

de

estas

pruebas

como

evidencia

de

parentesco.
En 1983, la mejor manera de confirmar o descartar la relacin
entre dos o ms individuos (por ejemplo, un nio con sus abuelos)
era comparando protenas (codificadas en genes) que constituyen los
antgenos de los linfocitos humanos (HLAs por sus siglas en ingls,
Human Lymphocyte Antigen). Las personas tienen una combinacin
nica de marcadores HLA en sus glbulos blancos, o linfocitos, y
estos marcadores son lo suficientemente diversos como para
conformar una especie de huella molecular. El anlisis de HLA puede
llevarse a cabo incluso si los padres del nio han fallecido, debido a
que por cada marcador HLA, un nio hereda un alelo de los abuelos

56

maternales y un alelo de los abuelos paternales. Los anlisis

estadsticos pueden establecer la probabilidad que un nio comparta
genes con unos abuelos en particular, debido a que son parientes,
en comparacin con la probabilidad que el nio comparta estos
genes por casualidad.
La AAAS puso en contacto a Las Abuelas de la Plaza de Mayo
con Mary Claire King, quien entonces trabajaba en la Universidad de
California. En los aos 80, King ense a un equipo mdico
argentino a analizar los diversos marcadores HLA de los glbulos
blancos. Luego Las Abuelas obtuvieron los tipos de HLAs de la mayor
cantidad posible de personas vivas en una familia con algn nio
perdido, construyendo as un banco de datos de HLA. Cuando
apareca un nio o nia a quien crean perdido, analizaban su patrn
de HLAs y trataban de conseguir una correspondencia dentro del
banco de datos de HLA. Dependiendo del nmero de alelos
diferentes que portaba este individuo y la rareza de sus variaciones,
la probabilidad que un nio en cuestin perteneciera a la familia que
lo reclamaba variaba de 75% a 99%.
Al final de

los aos 80, la combinacin de evidencia

circunstancial y gentica, haba ayudado a reunir a 49 nios con sus

respectivas familias biolgicas. En uno de los casos, una abuela que
haba sido secuestrada el 5 de septiembre de 1976, junto con su hija
embarazada, y luego fue dejada en libertad, contact a Las Abuelas
de la Plaza de Mayo buscando ayuda. Diez aos y medio despus, en
abril de 1987, fue reunida con su nieta. Esta nia haba nacido el 5
de noviembre de 1976 y fue registrada a nombre de un oficial de la
polica de un centro carcelario. Su lugar de nacimiento permanece
desconocido. Sin embargo, su abuela en una entrevista de abril de
1987 dijo: Fue muy fcil comprobar que ella era mi nieta gracias a
las pruebas de sangre. Analizaron mi sangre, la de mi esposo y la de
sus otros abuelos y los resultados mostraron ms de un 99%
positivo.

57

A medida que transcurri el tiempo, y los casos fciles fueron

resueltos, se evidenci las limitaciones de las pruebas de HLA. Para
mediados de los 80, por ejemplo, haba muy pocos parientes vivos
en algunas familias como para poder establecer una relacin
confiable a travs de la tipificacin por HLA. Pero el surgimiento de
nuevas tcnicas como el PCR y la secuenciacin de ADN hizo posible
el anlisis directo del ADN.
La profesora King junto a dos colegas, C. Orrego y A. C.
Wilson, utilizaron las nuevas tcnicas para desarrollar una prueba de
ADN mitocondrial (ADNmt) basada en la amplificacin por la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls polymerase
chain reaction) y la secuenciacin directa de una regin altamente
variable, no codante, del genoma mitocondrial. El ADN mitocondrial
tiene varias caractersticas que lo hacen una herramienta ms
poderosa que la tipificacin de HLA para confirmar o descartar el
parentesco en una determinada familia, como lo son: la herencia
materna, la ausencia de recombinacin, una regin altamente
variable y no codante de 331 pb, y un alto nmero de copias de
ADNmt

por

clula.

La

herencia

materna

la

ausencia

de

recombinacin permiten que, mientras exista un pariente materno

vivo con el cual comparar, este enfoque poda resolver los casos de
parentesco ms disputados. La regin no codante extremadamente
polimrfica hace posible la identificacin de nios a travs de la
relacin directa de su ADNmt con slo una persona - su abuela
materna, su ta o su hermano- en lugar de a travs de anlisis de
clculos estadsticos evaluando cuatro personas; la probabilidad que
dos individuos no relacionados sean idnticos en los 331 pb de
ADNmt es prcticamente nula. Finalmente, el gran nmero de copias
ADNmt por clula incrementa la probabilidad de aislar ADN e
identificar los cuerpos de presuntos padres que han sido hallados
luego de muchos aos.

58

Para validar este enfoque de identificar abuelas con sus

nietos, King y sus colaboradores amplificaron las secuencias de tres
nios

sus

emparentado

tres

abuelas

con quien. La

maternas

sin

prueba de

saber

quien

estaba

ADNmt relacion sin

ambigedades a cada nio con su respectiva abuela. De esta forma,

luego de 1989, Las Abuelas incluyeron la informacin del ADNmt en
sus registros.
Hoy en da, los nietos/as-hijos/as de los desaparecidos/as,
han alcanzado la adultez y han obtenido independencia legal.

pesar que la mayora de sus abuelas han muerto, pueden an

descubrir el paradero de sus familias as como su identidad biolgica
a travs de la data de HLA y ADNmt que Las Abuelas recopilaron.

Preguntas de la lectura
1. Qu significan las siglas HLA?
2. Cules son las limitaciones de la identificacin de relaciones
de parentesco o filiacin utilizando los marcadores de HLA?
3. Por qu el genoma mitocondrial proporciona una herramienta
ms poderosa para estos fines?

59

BIBLIOGRAFA

Fleming A.F. (Editor) 1982 Sickle-cell disease a handbook

for the general clinician. Churchill Livingstone. Edimburgo,
Londres y Nueva Cork.

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