OBTENCION DE CULTIVO PURO

En la evaluacin del metabolismo de azcares en condiciones aerbicas y anaerbicas

se utilizaron dos medios de cultivo: medio Luria Bertani y medio mineral, ambos
suplementados con 10 g/l de azcar. En la evaluacin de crecimiento en mezclas de
azcares se utiliz medio mineral con 5 g/l para cada uno de los azcares evaluados.
En todos los casos los azcares se esterilizaron por calor hmedo (121 o C, 20 min) por
separado y se mezclaron, una vez fros y previo a la inoculacin, con los otros
componentes del medio. La composicin del medio Luria Bertani fue (por litro) 10 g de
Bacto-Triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de cloruro de sodio. La composicin
del medio mineral fue (por litro) 10 g de azcar, 4 g de (NH4)2SO4, 5.32 g de K2HPO4,
6.4 g de KH2PO4, 10 mg de cido ctrico, 0.4 g de MgSO4.7H2O, 5 mg de MnCl2, 40 mg
de CaCl2, 30 mg de FeSO4.7H2O. El sulfato de amonio y las sales de fosfato se
esterilizaron juntos (por calor) y se prepararon soluciones patrn de los otros
componentes del medio, los cuales se esterilizaron por filtracin (0.22 m) y se
adicionaron al medio base antes de inocular los cultivos.
Se us la cepa de B. subtilis BSR6.
BSR6 es una derivada de la cepa 168 y tiene una fusin transcripcional aprE-lacZ
integrada en el locus amyE de B. subtilis. La cepa se mantuvo en crioviales
conteniendo glicerol al 12 % y congelados a una temperatura de 70 o C, provenientes
de cultivos jvenes de una densidad ptica de 1.0 crecidos en medio de cultivo lquido
Luria (5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona y 10 g de NaCl por litro). Para los
estudios en fermentadores se utiliz el medio Schaeffer (conteniendo por litro: 8 g de
caldo nutritivo, 1 g de KCl, 0.12 g de MgSO4.7H2O, 0.1 milimoles de MnCl2; 1 milimol
de Na2SO4 y 0.001 milimoles de FeSO4; a pH 7). A este medio se le aadi glucosa,
nitrato o ambos. Para la preparacin de inculos, se tom una asada de un tubo de
conservacin congelado y se transfiri a un criovial de ensayo conteniendo 3 mililitros
de caldo Luria. Despus de 12 horas de 37 incubacin, un mililitro se transfiri a su vez
a un matraz Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 25 ml de caldo Luria y se dej crecer
en una agitadora hasta alcanzar una
densidad
ptica
de
1.0
(aproximadamente 2 h) y se emple
una porcin de estas clulas para
inocular los fermentadores. Tanto el
tubo como el matraz se incubaron a
37C y 300 rpm. El pH se control
automticamente a 7.0 mediante la
adicin de NaOH 0.5 M o 0.35 M
H3PO4 segn fuera necesario.

IDENTIFICACION DE LAS VARIABLES DEL PROCESO DE FERMENTACION

En las fermentaciones que se us, se tena control sobre las siguientes variables: pH, velocidad
de agitacin, formacin de espuma. Adems se mide el porcentaje de oxgeno disuelto. Los
pasos que hay que seguir para iniciar una fermentacin son:
Primeramente hay que calibrar el medidor de pH, ya que el valor medido por el electrodo y el
medidor de pH puede llegar a variar con el tiempo. La calibracin se logra con sustancias
llamadas buffers que tienen un valor constante de pH, que se toman como referencia para hacer
los pequeos ajustes en el medidor. El medidor de oxgeno disuelto es tambin calibrado antes
de iniciar la fermentacin.
Se coloca en el fermentador la fuente de nitrgeno. Adems se agregan los electrodos para
medir el porcentaje del oxgeno disuelto, el pH y el sensor de espuma. Tambin se colocan las
mangueras que servirn para la adicin de cido, base y antiespumante; as como las
mangueras que sirven para la toma de muestra y las que servirn para la entrada y salida del
oxgeno.
El fermentador se esteriliza en una autoclave a una temperatura aproximada de 120C y una
presin de 1.5 Kg/cm2, durante aproximadamente 15 o 20 minutos. Esto se hace para eliminar
cualquier microorganismo indeseable durante la fermentacin. Tambin se esterilizan los
matraces que contienen la fuente de carbono, el cido, la base y el antiespumante; as como
todo el material necesario usado durante la fermentacin como filtros de aire y pinzas para
presionar las mangueras.
Despus de esterilizar el fermentador se conecta el electrodo que mide el porcentaje de
oxgeno disuelto al medidor controlador para que comience a polarizarse, esto toma
aproximadamente
cinco
horas.
Se conecta todo el equipo necesario para la fermentacin (los controladores de pH y de
espuma, el medidor de oxgeno disuelto; las bombas peristlticas, el motor, etc.). No se deben
retirar los electrodos del fermentador para evitar la contaminacin del medio de cultivo.
Ya que se tienen todos los medidores y controladores funcionando, as como el abastecimiento
de oxgeno, se adiciona la fuente de carbono, esperando unos cuantos minutos para que se
estabilice la lectura de los medidores. La entrada del oxgeno es controlada por una vlvula que
la mantiene a una presin constante de 2 Kg/cm2.

Finalmente se agrega el inculo, y se

hacen los ajustes finales. Aqu
comienza la fermentacin.
Durante la fermentacin, se debe
tomar una muestra del medio cada 4
horas, para medir el crecimiento, y la
formacin de producto. Se debe vigilar
constantemente que el equipo funcione
correctamente durante la fermentacin.