Cdigo gentico y sntesis proteica

Hitos en los inicios de los estudios de sntesis proteica

Temprano en los 50s, Paul Zamecnik encuentra que

corto tiempo despus de un pulso de aa radioactivos en
clulas animales, la marca se encuentra asociada a los
microsomas.

La hiptesis del adaptador de Crick a mediados de

los 50s (izquierda) y la observacin de Hoagland y
Zamecnik sobre la activacin de los aa con ATP y un
nuevo RNA soluble fueron otros pasos decisivos.
Luego vendra la resolucin del cdigo gentico

En 1961, Nirenberg vi que poliU incorporaba poli-phe,

poliC incorporaba poli-pro, poliA poli-lis, etc. Luego,
con polinucletido fosforilasa se hicieron polinucletidos
de composicin relativa de bases conocida, midindose
incorporacin de aa marcados en 20 tubos paralelos

Polinucletido fosforilasa (PNPasa)

participa en procesamiento y degradacin de mRNA

RNAn + XDP <-------> RNAn+1 + Pi

Severo Ochoa (izq) y Arthur

Kornberg (der), Premio Nobel de
Medicina 1959 por los descubrimientos de la PNPasa y DNA
polimerasa, respectivamente

En 1964, Nirenberg y Leder vieron que ribosomas aislados de E. coli unen aa-tRNAs
especficos si los primeros tienen unido un mRNA que posee secuencias complementarias
a los anticodones de los tRNAs. Despus se vio que bastaban trinucleotidos unidos a los
ribosomas para unir los aa-tRNAs.

Esta herramienta fue decisiva, ya que se identificaron unos 50 tRNAs unindose a tripletes especficos.
Pero tambin se vio que algunos tripletes no unan tRNA, mientras que otros unan a ms de uno!

Pero con estos datos no bastaba. A mediados de los 60, Khorana dise un sistema ms preciso
que la polinucletido fosforilasa para sintetizar poliribonucleotidos de secuencia conocida.

As, el polinucletido (ACACAC)n,

tiene codones ACA y CAC. Este
incorpora treo e his.

Un polinucletido (UUCUUC)n
puede ser ledo como UUC, UCU o
CUU. Este incorpora fen, ser y leu.

Combinando todos estos datos con los de las tablas anteriores se resolvi el
cdigo, incluyendo los codones de trmino, puesto que se sintetizaban
pptidos ms chicos. Por ej, una misma secuencia (GUAA)n da trminos en
distintos sitios (en rojo) de acuerdo a su marco de lectura. Concepto de
marco abierto de lectura u open reading frame (ORF).

Khorana y Nirenberg en la ceremonia

del Premio Nbel en 1968

Nirenberg
Khorana

RV con Marshall Nirenberg

2008

Cdigo gentico
(Ntese que los codones se leen en sentido 5 3 del mRNA)

Caractersticas del cdigo : 1) Contiene seales de iniciacin y trmino.

2) No hay sobreposicin en la lectura

La no sobreposicin se comprob por el efecto de inserciones y deleciones

3) Hay ms de un codn por aa: el cdigo es desgenerado

4) El cdigo es universal (salvo excepciones)

El caso especial de selenocistena y pirrolisina, dos aminocidos

que ocasionalmente se incorporan a protenas
Selenocisteina (sec o U): en proca y
euca. Mayor potencial de reduccin
que cis, por lo tanto se encuentra en
muchas protenas que se requiere
mantener reducidas. Un tipo especial
de tRNAser que reconoce el codon de
trmino UGA en un cierto contexto de
secuencia es cargado con ser por la aatRNA sintetasa cannica para ser.
Luego, otra enzima convierte la ser
unida al tRNA en sec.
Pirrolisina: en bacterias metangenas.
Tiene su tRNA especfico y aa-tRNA
sintetasa especficas. El tRNA
reconoce el codn UAG, pero se
conoce un solo caso: el del transcrito
del gen de la enzima monometilamina
metiltransferasa

Conceptos adicionales relacionados al uso del cdigo

a) Regla del balanceo (wooble)

El hecho que el nmero de tRNAs
para un aa fuese inferior al nmero
de codones llev a Crick a
postularla. Solo el apareamiento de
las dos primeras bases es fuerte.
Se requiere un mnimo de 32 tRNAs
para los 61 codones.
El wooble permite que el tRNA se
suelte ms fcilmente del mRNAribosoma durante la sntesis proteica.

b) Sobreposicin de genes. Por ejemplo, en el fago X174

La sobreposicin de genes es muy frecuente y la hay de varios tipos

c) RNA editing: existen diferentes tipos

deamination

deamination

Tpicas deaminaciones en la edicin del RNA

Mecanismo de insercin de Us

RNAs guas se aparean en determinados lugares al mRNA quedando algunas As de su

secuencia sin aparear. Las Us son insertadas mediante la accin de tres actividades
enzimticas presentes en el editosoma (TUTase = terminal uridyl transferase). Cuando
la edicin implica delecin de Us, en lugar de la TUTase opera una 3U exonucleasa
que acta sobre Us del mRNA que no estn apareadas al RNA gua.

Ejemplo de insercin de Us
La figura muestra el cambio en el marco de lectura que produce la insercin de 4 Us
en el transcrito del gen de la subunidad II de la citocromo oxidasa en la mitocondria
del Trypanosoma brucei.

Ejemplo clsico en mamferos: edicin del gen de la

apolipoprotena B-100, un componente de los LDL

La edicin tiene que ver con el diferente

destino metablico de los lpidos en el
hgado y en el intestino

En este caso, una citocina deaminasa presente solo en intestino transforma C en U

Actores de la sntesis proteica

I) Los ribosomas

En una bacteria hay 13.000 ribosomas (Nilsson et al, Biotechnol. Bioengin. 54, 461-467, 1997), mientras que
solo el RE de una clula eucaritica tiene 13 millones de ribosomas (Weibel, J. Cell Biol. 42, 68-91, 1969)

Los rRNA tienen mucha

estructura secundaria

El rbol de la vida de Woese, construdo con rRNA 16s

Carl Woese
30 dic 2012

En procariotes, los rRNAs junto a algunos tRNAs son procesados a partir de un precursor.

En E. coli hay 7 copias de este precursor, las que difieren en la identidad de los
tRNAs que contienen. Los sitios 1, 2 y 3 son cortados por RNAsa III, RNAsa P
(una ribozima) y RNAsa E, respectivamente.

En eucariotes, los rRNAs son

procesados a partir de un precursor
de 45s ya asociado a un complejo
preribosomal en el nuclolo.
El 5s se transcribe aparte.

Los snoRNPs (small nucleolar

ribonucleoproteins) son complejos
que evocan el splicesoma y dirigen
las modificaciones qumicas de las
bases.

Ejemplo de la accin de dos snoRNAs

Estructura del ribosoma bacteriano con una resolucin de 3.5

Science 310, 827-833, 2005
RNA 23s y 5s en la subunidad 50s
Se muestra tambin la protena L1

RNA 23s

1/3 de las protenas tiene contrapartes bacterianas

1/3 tiene contraparte en Archea
1/3 son nicas de eucariotes

Eukaryotic 40S ribosome. (A and B) A superposition of eukaryotic 18S RNA (blue)

and bacterial 16S RNA (yellow). (C and D) Corresponding views of eukaryotic 40S.
Proteins with bacterial homologs shown in cyan, those with archaeal homologs in gold,
and those unique to eukaryotes in red. Proteins eIF1 and RACK1 are magenta (C and D).

Los genes de las protenas

ribosomales en E. coli estn en
operones con subunidades de la
RNA pol y los factores de
elongacin Tu y Ts.
Ntese que hay una regulacin de la
traduccin (no de la transcripcin),
la que opera por unin de algunas
protenas a algunos genes de sus
respectivos operones.

Actores de la sntesis proteica

II) los tRNAs: 73 y 93 residuos en proca

y euca, respectivamente

Tienen bases modificadas

Procesamiento de los tRNAs en proca y eucariotes incluye accin de RNAsas,

modificacin de bases y adicin del CCA en el 3

(en euca)

Estructura tpica de trbol de los tRNAs

En rosado, las bases comunes a todos los tRNAs.
Los eucariticos tienen los brazos D y extra ms largos

pseudouridina

2-O-metilguanilato

Este brazo interacta con

el rRNA de la subunidad
ribosomal mayor

ribotimidina

5,6-dihidrouridina

Estructura de los tRNAs

Repaso: ejemplos de activacin de reacciones por ATP mediante adenilacin

1.- Biosntesis de cidos grasos

R-COO- + ATP

R-COO-AMP + PPi

2. DNA ligasa: adenilacin del 5P

3.- Biosntesis de protenas

aa + ATP
aa-AMP + tRNA

aa-AMP + PPi
aa-tRNA + AMP

Otra vez: la activacin de los aminocidos

Las aa-tRNA sintetasas son especficas para el aa, aunque haya ms

de un tRNA para algunos de ellos.

El producto final es un aa-tRNA

con el aa formando un ster de alto
contenido energtico al 3OH de la
ribosa de la adenina del CCA, el
que puede formarse directamente
en 3 (enzimas clase II) o primero
en 2 y luego transesterificarse
(enzimas clase I)

Sitios de reconocimiento de las aa-tRNA sintetasas

Las aa-tRNA sintetasas

tienen puntos especficos
de interaccin con su
correspondiente tRNA
(adems de hacerlo con el
aa y el anticodon)

Las bases azules

son comunes (por
lo que no pueden
dar especificidad),
pero las verdes y
naranjas se han
comprobado para
varias enzimas.

Las aa-tRNA sintetasas tienen un sistema de correccin por si se equivocan

(recuerda la actividad editora de las DNA polimerasas)

El aa-AMP se forma primero y queda unido al sitio activo. En lo que se ha llamado el segundo
cdigo gentico, casi todas estas enzimas tienen una oportunidad para asegurar su especificidad:
tienen un segundo sitio activo hidroltico para el aa-AMP en el cual no encajan los correspondientes aa sin activar o un aa-AMP distinto, el que es hidrolizado a aa + AMP. Ms an, aunque
lo llegara a cargar mal, la enzima todava puede hidrolizar el aa-tRNA a aa + tRNA.

Iniciacin en procariotes: formilacin de la metionina N-terminal

N10formil-FH4 + met-tRNAfmet fmet-tRNAfmet + FH4

La met es cargada el tRNAfmet por la

misma aminoacil tRNA sintetasa que
carga met en tRNAmet.
Esta modificacin da la especificidad
para la unin al AUG iniciador.
Cloroplastos y mitocondrias usan
tambin fmet. No as los eucariotes,
aunque en este caso el tRNA del
AUG inicial es distinto al de las met
interiores.

En procariotes, el codn del tRNAfmet es guiado a la posicin correcta en la subunidad 30s

del ribosoma por la secuencia Shine-Dalgarno, de modo que el fmet-tRNAfmet se une solo
al sitio P de dicha subunidad.

Iniciacin

IF-1: previene unin prematura de los

aa-tRNAs al sitio A

IF-2: ayuda a unin de fmet-tRNAfmet

al sitio P de la subunidad 30s.
Complejo con GTP.
IF-3: impide unin prematura de
subunidad 50s

nico aa-tRNA que entra al sitio P.

Ntese sitio E en subunidad 50s)

Elongacin:
3 etapas
a) Unin del aa-tRNA al sitio A
del complejo de iniciacin
70s formando un complejo
con EF-Tu y GTP. EF-Ts
permite reciclar EF-Tu.
El breve tiempo que toma
reciclar el Tu-GTP da la
ocasin de que salga del sitio
A un aa-tRNA cuando no hay
buen apareamiento codonanticodon

Experimento clsico de Dintzis (1961) para determinar el sentido

de crecimiento de la cadena polipeptdica

Us leu marcada en un sistema de sntesis de globina en reticulocitos

(eritrocitos inmaduros) y aisl molculas de globina recin terminadas.

b) Formacin del enlace peptdico.

El NH2 del aa en el sitio A acta
como nuclefilo, quedando el
dipptido unido a su tRNA. La
formacin del enlace peptdico es
catalizada por el rRNA 23s, actividad
que histricamente se ha conocido
con el nombre de peptidil
transferasa, ya que normalmente en
el sitio P hay un peptidil-tRNA
(transpeptidacin).
El ribosoma no chequea la identidad
del aa unido al tRNA: Lipman y
Benzer tomaron cis-tRNAcis y lo
convirtieron qumicamente a alatRNAcis, resultando que ala se
incorpor a las protenas en sitios
correspondientes a cis. Se confirma
que la fidelidad del proceso descansa
en las aa-tRNA sintetasas y en la
buena lectura de los codones

c) Translocacin. El ribosoma se
mueve un codon hacia el 3 del
mRNA, lo que deja al peptidiltRNA en el sitio P del ribosoma,
reaccin que es catalizada por la
traslocasa (G en la figura),
hidrolizndose GTP.
El tRNA deacilado queda ubicado
en el sitio E y sale del ribosoma.

Terminacin
Releasing factors
Se unen al codn de trmino y contribuyen
a la hidrlisis del polipptido desde el tRNA
y a la disolucin de todo el complejo

RF-1: reconoce UAA y UAG

RF-2: reconoce UAA y UGA

RF-3: hidroliza ATP
RRF: ribosome recycling factor
La hidrlisis de un GTP mediada por la
traslocasa ayuda a la disociacin del
ribosoma

Conceptos adicionales sobre sntesis proteica.

1.

Se gastan al menos 4 ATPs por cada enlace peptdico formado: 2 en la activacin de

los aa, 1 por IF2 o por Tu (GTP), 1 la traslocasa. El RF3 gasta un quinto ATP al
ltimo.

2.

Concepto de polisomas.

3.

Acoplamiento de la transcripcin y de la traduccin en bacterias.

4.

Plegamiento de las protenas.

5.

Modificaciones postraduccionales.

6.

Stringent response.

7.

Antibiticos.

8.

Degradacin de protenas.

9.

Iniciacin de la SP en eucariotes.

2. Polisomas

3. Acoplamiento transcripcin-traduccin en bacterias

Ocurre porque no hay transporte del mRNA del ncleo al citoplasma. El ribosoma
y la RNA pol no estn a escala, ya que el primero es 10 veces mayor.

4. Plegamiento de protenas: el rol de las chaperonas

(DnaK y DnaJ bacterianas son homlogas a las Hsp70 y Hsp40 eucariticas, respectiv.)

Las chaperonas tipo Hsp70 se unen a regiones ricas en aa hidrofbicos en pptidos an no plegados o denaturados. En
eucariotes tambin unen protenas que deben ser translocadas a travs de membranas antes de su plegamiento. En euca
no se conoce homlogo de GrpE.
Ms que para promover plegamiento, las chaperonas impiden agregaciones incorrectas. Las chaperoninas , en cambio,
(por ej el sistema GroEL/GroES) son absolutamente requeridas por ciertas protenas (15%) para su adecuado
plegamiento.

5. Modificaciones post-traduccionales
- remocin del formilo en proca
- acetilacin de la met terminal en euca (no siempre)
- prdida de pptidos seales en proca y euca
- N-glicosilaciones (asn) en el RE y O-glicosilaciones (ser, treo) en
Golgi y citoplasma
- fosforilaciones en ser, treo y tir
- metilaciones en lis y glu
- adicin de grupos isoprenos va cis, lo que ayuda a ciertas protenas
a anclarse en la membrana
- adicin de grupos prostticos (hem, biotina, FAD)
- procesamiento proteoltico (insulina, proteasas)
- formacin de grupos disulfuro, etc.

Ejemplo: direccin de protenas hacia el RE para su secrecin en eucariotes

signal
recognition
particle

El pptido seal es removido

durante el transporte o despus
que la protena llega a su destino
final

Ribosomas unidos al retculo

endoplsmico en una clula del
pncreas

Direccin de protenas hacia el RE para su secrecin en eucariotes

Secuencias de algunos pptidos seales: residuos hidrofbicos precedidos por uno o ms residuos bsicos

Gunther Blobel
recibiendo el
premio Nobel
de Medicina
1999

El profe con Gunther Blobel

Las protenas bacterianas tambin tienen pptidos seales segn el sitio de destino.
La figura no incluye protenas que se secretan al medio extracelular, pero el tipo de
pptido seal es el mismo

6. Stringent response
(la respuesta severa)

Cuando por falta de aa un

tRNA se carga en el sitio A
solo, se activa el stringent
factor, el que cataliza la
formacin de pppGpp, el que
se hidroliza a ppGpp, un
inhibidor de la RNA pol

7. Antibiticos

Erythromycin

Fusidic acid

Actan en las distintas etapas de la sntesis proteica

Mecanismo de accin de algunos antibiticos

Inhibitor
Chloramphenicol
Cycloheximide
Erythromycin

Fusidic acid
Puromycin

Spreptomycin
Tetracycline

Diphtheria toxin
Ricin/Abrin

Action
Inhibits peptidyl transferase on the prokaryotic large
subunit
Inhibits peptidyl transferase on the eucaryotic large
subunit
Inhibits translocation by the prokaryotic large subunit

Inhibits elongation in prokaryotes by preventing EFGGDP dissociation from the large subunit
An aminoacyl-tRNA analog that causes prematute chain
termination in prokaryotes and eukaryotes
Causes mRNA misreading and inhibits chain initiation in
prokaryotes
Inhibits the biding of aminoacyl-tRNAs to the
prokaryotic small subunit
Catalytically inactivates eEF-2 by ADP-ribosylation
Poisonous plant proteins that catalytically inactivate the
eukaryotic large subunit

La puromicina se asemeja un
aa-tRNA y forma un enlace
covalente con el polipptido
luego de unirse al sitio A, lo
que provoca terminacin
prematura.

8. Degradacin de las protenas

En E. coli acta una proteasa especializada
llamada Lon, que es dependiente de ATP.
En euca operan dos vas: una en lisosomas a
cargo de proteasas llamadas catepsinas y
otra va citoplasmtica universal en la que
participa la protena ubiquitina (76 aa).
Esta ltima se une a la protena blanco
mediante un enlace isopeptdico entre su gli
del C-term y a una lis de la ltima en un
proceso en que participan 3 enzimas. Luego,
a esta ubiquitina se le van agregando otras
por este mismo mecanismo, a travs de
varias lis en la propia ubiquitina,
formndose una poliubiquitina-proteina.

Finalmente, la protena poliubiquitinada es

degradada por el proteasoma, un complejo
ATP-dependiente de PM 2.5 x 106, que
constituye el 1% de la protena celular

Estructura de la ubiquitina,
destacando dos de sus siete lis

Diagramas de diubiquitina, con enlaces a travs de la lis 48 y 63

El proteosoma eucaritico
un core cataltico y dos partculas regulatorias

El core tiene 4 anillos, cada uno con 7 subunidades. De las celestes , tres son catalticas
(azules). A la vez, los dos anillos de subunidades estn flanqueados por dos anillos de
subunidades . Las partculas regulatorias que flanquean al core tienen c/u 18 subunidades.

9. Algunos conceptos sobre la

iniciacin en eucariotes
(principales diferencias con procariotes)

(no se muestran unidos

los extremos del mRNA)

eIF4F: eIF4E + eIF4G + eIF4A

Al comienzo los extremos del mRNA son aproximados

El complejo eIF4F (eIF4E + eIF4G + eIF4A que no se muestra) une el cap y PAB (polyA binding
protein) manteniendo los extremos unidos. El escaneo para buscar el AUG inicial lo inicia el
eIF4B desde el cap, ayudado por la helicasa eIF4A del eIF4F, que elimina las estructuras
secundarias del RNA. Regulacin de la traduccin puede ocurrir a travs de protenas que se unen
a las UTR y que tienen tambin afinidad por el complejo de iniciacin. Tambin puede haber
regulacin por fosforilacin de los eIFs, lo que los hace menos activos.
Se postula que durante la elongacin y el consiguiente movimiento del ribosoma, se mantiene la
circularidad del mRNA mediada por la interaccin entre eIF4F, eIF3 y la poly(A) BP