Professional Documents
Culture Documents
ThinghiemVisinh Lazk0
ThinghiemVisinh Lazk0
PHN II:
TH NGHIM
VI SINH VT HC
32
Th nghim vi sinh vt hc
Khi nim:
Lm mi trng thc hin vic phn lp, nhn ging, gi ging vi sinh
vt, ng thi nui cy v nghin cu cc c im sinh hc ca chng.
2.1.
+ Cn, ong tht chnh xc tng thnh phn mi trng v pha ch theo
ng trnh t hng dn trong ti liu.
+ Mi trng lng: Cn, ong cc ct ri cho ho tan vo nc.
+ Mi trng c:
Cn agar ri ngm vo nc
Cn ho cht ri ho tan trong nc.
33
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
35
Th nghim vi sinh vt hc
Agar
thch
Mi trng
lng
Mi trng
thch nghing
Thch ng
a thch
36
Th nghim vi sinh vt hc
Khi nim :
Th nghim vi sinh vt hc
38
Th nghim vi sinh vt hc
hp.
+ Dng que gt thy tinh phn phi dch mu tri u khp mt thch.
+ Tip tc s dng que gt ny gt mu cho u khp mt thch a ptri
th 2 ri a th 3.
+ t cc a ptri 1, 2, 3 trn vo t m nhit thch hp sau mt thi
gian nht nh tu ging vi sinh vt ta s nhn c cc khun lc ring r t cc
a th 2 v 3.
b. Phn lp vi sinh vt k kh:
+ Dng mi trng c trong ng nghim em chng cch thu loi b
khng kh trong mi trng.
+ ngui mi trng cn 45 - 50 0C.
+ Ht 0,1 ml dch nghin cu cho vo ng mi trng, y nt li, lc
trn quanh trc ng nghim.
+ Rt nhanh mi trng ng nghim vo np di ca a ptri v y
tht nhanh np trn li, sao cho gia mt np v mi trng khng cn khng
kh.
+ Dng parafin hn kn phn tip xc gia 2 np ca a petri v nhit
thch hp.
+ Sau khi vi sinh vt pht trin, chn cc khun lc ring r trong khi
mi trng, dng que cy ct c khi mi trng ri cy vo mi trng lng
thch hp.
2.3. Kim tra tinh khit ca ging mi phn lp
C nhiu cch kim tra:
1. Kim tra vt cy:
Quan st s sinh trng ca vi sinh vt qua vt cy trn mi trng c.
+ Nu vt cy c b mt v mu sc ng u, thun nht chng t ging
mi phn lp tinh khit th gi li.
39
Th nghim vi sinh vt hc
t.
- y nt bng, t m nhit 25 - 26 0C trong 48 - 72 h.
- Kt qu:
+ Xut hin lp vng xm c nhiu vi khun Bacillus sublitis v c
kh bao gi cng c bo t ca vi khun ny.
+ Soi knh hin vi : T bo Bac. sublitis c hnh que, di, bo t hnh
van nm xa tm hay gn tm khun lc. T bo c kch thc (3 - 5 x 0,6) m.
3.2.
40
Th nghim vi sinh vt hc
41
Th nghim vi sinh vt hc
1.1
Tn ging vi sinh vt
Ngy cy
vo thnh ng nghim, di nt bng mt cht.
- Tay tri cm 2 ng nghim: 1 ng ging
1 ng mi trng
- Tay phi cm que cy v kh trng trn ngn n cn cho n khi nng
dy cy
- Dng ngn t v ngn p t kp nt bng vo lng bn tay xoay nh,
ko nt ng ging ra
- H nng kh trng khng kh ming 2 ng nghim
- i khi que cy va ngui, kho lo a que cy tip xc vi khun lc
trong ng ging.
- Rt que cy ra, khng que cy chm vo thnh ng nghim v a
ng vo mi trng thc hin cc thao tc cy truyn.
- Kh trng li phn khng kh ni ming 2 ng nghim ri y nt bng
- Kh trng li que cy sau khi s dng xong
- Ch :
Nu ng ging l canh trng lng c vi sinh vt th dng pipet ht
canh trng thay que cy.
Thao tc kh trng ng ht bt u thc hin u nh ng ht sau
khi tho giy bao gi.
S dng xong cm ng ht vo dung dch crmic kh trng.
1.2.
trn
- Thc hin vic cy ging vo ng thch nghing bng cc thao tc tip
theo:
+ Ho ging u que cy vo git nc y ng nghim.
+ Nh nhng lt que cy trn mt thch theo cc kiu (hnh 3.1)
42
Th nghim vi sinh vt hc
Hnh ch chi
Hnh vng xon
Hnh vch ngang song song
Th nghim vi sinh vt hc
1.4.
44
Th nghim vi sinh vt hc
45
Th nghim vi sinh vt hc
III.
46
Th nghim vi sinh vt hc
4.1.
lu.
- Nhc im: Tn mi trng, cng sc v thi gian. Phm cht ban u
ca ging c th b thay i do nhiu nguyn nhn kh xc nh c th trong qu
trnh cy truyn.
2. Phng php gi ging trn mi trng thch c lp du khong:
- Yu cu ca phng php ny l s dng du khong nh parafin lng
hay vazlin phi trung tnh, c nht cao, khng cha cc sn phm c vi vi
sinh vt v v trng.
- Cch bo qun:
+ Kh trng du khong bng cch hp 1210C trong 2h. Sau sy kh
t sy (1700C) trong 1 - 2h; ngui
+ i vi vi sinh vt k kh :
47
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
49
Th nghim vi sinh vt hc
50
Th nghim vi sinh vt hc
II.
2.1.
2.3.
Nhum mu tiu bn c nh
a. Nguyn tc :
Th nghim vi sinh vt hc
3.1.
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
54
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
56
Th nghim vi sinh vt hc
Chun b mu :
xc nh gin tip hoc trc tip t bo vi sinh vt
1.1. Ly mu :
Tu theo loi vt phm cn xc nh m ta ly mu nghin cu vi s
lng v khi lng khc nhau cho ph hp. Yu cu ca vic ly mu.
- Ly mu c tnh cht i din.
- Lng mu ly va phi, phn tch cc c tnh l, ho, sinh hc.
- Dng c ly mu, cha mu phi v trng.
- Ly mu xong phi phn tch ngay v khng c qu 24h.
- Mu ly phi c nhn ghi k hiu v ghi vo s nhng c im ca
mu v ni thu mu.
1.2. Pha long mu :
Chun b mt s bnh tam gic cha 90ml nc ct v trng, mt s ng
nghim cha 9ml nc ct v trng v mt s ng ht (1ml) v trng.
a. Mu trng thi lng :
- Pha long mu theo dy thp phn
57
Th nghim vi sinh vt hc
58
Th nghim vi sinh vt hc
Hnh 5.2
II.
Th nghim vi sinh vt hc
Khi thc hin quan st v m vi sinh vt, cho thm vi git formalin vo
trong mu, trn u. Pha long mu cn m sao cho trong mi nh ca bung
m c khong 5 - 10 t bo vi sinh vt. t c pha long nh vy cn
phi c lng c s lng vi sinh vt trong mu, ng thi phi th vi ln
trong qu trnh pha long. Mu phi c pha long bng dung dch pha long
cha 0,1% pepton v 0,1% laurylsulphate v 0,01% methyl blue. Tt c cc dung
dch pha long u cn phi c lc trc khi s dng. t mt git mu c
pha long vo vng m trn bung m khu vc bung m. Chnh th trng
sao cho mt th trng cha trn mt ln (4 x 4 = 16 nh). m s t bo hin
din trong 1 ln. Sau , chnh th trng tm 1 ln khc. m s t bo ca t
nht 5 ln. Ly tr s trung bnh.
Cch tnh mt t bo nh sau : th tch ca mt ln l 1/25mm2 x 1/10m
= 1/250mm3 hay 1/250 x 103cm3 = 4 x 10-6 ml. Nh vy, mt t bo ca huyn
ph mu l : N/ml = 0,25a x 106 t bo/ml (trong a l s t bo bnh qun trong
mt ln
2.2.
Phng php cy gt :
a. Phng php cy gt (hp tri)
- Tin hnh pha long mu theo phng php nu trn.
- Ghi vo y a Petri c mi trng thch cc thng tin :
. Nng pha long.
. Ngy cy.
-
Th nghim vi sinh vt hc
61
Th nghim vi sinh vt hc
2.3. Phng php nh lng bng cch thng k VSV bng phng php
pha long ti hn:
Phng php MPN (Most Probable Number)
Phng php MPN (phng php c s xc sut cao nht ; s ti kh) cn
c gi l phng php pha long ti hn hay phng php chun . y l
phng php dng nh gi s lng vi sinh vt theo s lng vi sinh vt c
xc sut ln nht hin din trong mt n v th tch mu. y l phng php
nh lng da trn kt qu nh tnh ca mt lot th nghim c lp li mt
s pha long khc nhau. Thng thng, vic nh lng ny c thc hin
lp li 3 ln 3 pha long bc 10 lin tip, tng cng 3 x 3 = 9 ng nghim.
Quy trnh thc hin nh lng theo phng php ny l nh sau :
Cho vo cc ng nghim c cha mi trng thch hp cho s tng
trng ca i tng vi sinh vt cn nh lng mt th tch chnh xc dung
dch mu 3 nng pha long bc 10 lin tip (v d 1/10, 1/100, 1/1000).
nhit v thi gian thch hp. Da vo kt qu biu kin chng minh s tng
trng ca vi sinh vt cn kim nh trong tng ng nghim (thng l cc hin
tng nh sinh hi, i mu, c ), ghi nhn s lng cc ng nghim dng
tnh tng pha long. S dng cc s liu ny v da vo bng Mac Crady
suy ra mt vi sinh vt c trnh by di dng s MPN/100ml hay s
MPN/1g mu. chnh xc ca tr s MPN ph thuc vo s lng ng nghim
lp li trong mi pha long ;
Bng 5.1: Bng tra mpn dng cho lot 3 ng nghim 3 nng
pha long lin tip
S lng ng
S lng ng
S
S
dng tnh
dng tnh
MPN/100
MPN/1
S mo mu s dng
S mo mu s dng
ml
00 ml
10
1
0,1
10
1
0,1
0
0
0
2
0
0
9
0
0
1
3
2
0
1
14
0
0
2
6
2
0
2
20
0
0
3
9
2
0
3
26
0
1
0
3
2
1
0
15
0
1
1
6
2
1
1
20
0
1
2
9
2
1
2
27
62
Th nghim vi sinh vt hc
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
12
6
9
12
16
9
13
16
19
4
7
11
15
7
11
15
19
11
15
20
24
16
20
24
29
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
63
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
34
21
28
35
42
29
36
44
53
23
39
64
95
43
75
120
160
93
150
210
290
240
460
1100
-
Th nghim vi sinh vt hc
Bng 5.2 : Bng tra mpn dng cho lot 5 ng nghim 3 nng
pha long lin tip
S lng ng
S lng ng
S
S
dng tnh
dng tnh
MPN/100
MPN/1
S mo mu s dng
S mo mu s dng
ml
00 ml
10
1
0,1
10
1
0,1
0
0
0
0
4
0
2
20
0
0
1
2
4
0
3
25
0
0
2
4
4
1
0
17
0
1
0
2
4
1
1
20
0
1
1
4
4
1
2
25
0
1
2
6
4
2
0
20
0
2
0
4
4
2
1
25
0
2
1
6
4
2
2
30
0
3
0
6
4
3
0
25
1
0
0
2
4
3
1
35
1
0
1
4
4
3
2
40
1
0
2
6
4
4
0
35
1
0
3
8
4
4
1
40
1
1
0
4
4
4
2
45
1
1
1
6
4
5
0
40
1
1
2
8
4
5
1
50
1
2
0
6
4
5
2
55
1
2
1
8
4
0
3
25
1
2
2
10
5
0
4
30
1
3
0
8
5
0
0
45
1
3
1
10
5
0
3
60
1
4
0
11
5
0
4
75
2
0
0
5
5
1
0
35
2
0
1
7
5
1
1
45
2
0
2
9
5
1
2
65
2
0
3
12
5
1
3
85
2
1
0
7
5
1
4
115
2
1
1
9
5
2
0
50
2
1
2
12
5
2
1
70
64
Th nghim vi sinh vt hc
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
2
2
2
3
3
4
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
3
3
4
4
5
0
0
0
1
2
0
1
0
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
9
12
14
12
14
15
8
11
13
11
14
17
20
14
17
20
17
20
20
25
25
13
17
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
-
65
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
-
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
0
1
2
3
4
5
-
95
120
150
175
80
110
140
175
200
250
130
170
225
275
350
425
250
350
550
900
1600
1800
-
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Da ci
0,5 kg
Nc mui 3 - 3,5%
ng
500 ml
2 tha c ph
- Cch lm:
+ Da ci b ho, ra sch, ct khc, ro.
+ Pha 500ml dung dch NaCl 3 - 3,5% v b sung thm vo 2 tha c ph
ng.
+ Xp da vo l thu tinh v m cht.
+ nc mui t t cho ngp da.
+ Ln men nhit 28 - 300C trong 2 - 3 ngy.
+ Vi khun lactic sng trn b mt rau qu l tc nhn ca qu trnh ny.
* Cch 2:
+ Cho vo bnh tam gic - 150 ml sa ti kh trng.
- 3 tha c ph sa chua khuy cho tht nhuyn
+ Lc bnh men ging tan u
+ t m 30 - 350C trong 3 - 4h ta c sa (chua) ng t.
69
Th nghim vi sinh vt hc
2.2.
Xc nh cc c trng ca qu trnh
a. Xc nh cc i tng vi sinh vt tham gia:
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
3 ml dch ln men
1 ml NaOH 20%
Vi git dung dch FeCl3 5%
+ Lc u ng nghim v un nng trn ngn n cn. Nu dung dch c
axit axtic th s c mu thm do st axtat c to thnh.
c. Phn ng nh lng axit axtic
+ Cho vo bnh tam gic c th tch 100 ml
10 ml dch ln men
1 - 2 git dung dch phnolphtalin 0,1%
+ Chun bng dung dch NaOH 0,1N
+ Tnh s gam axit axtic trong 10 ml dch ln men (Bit rng 1ml NaOH
0,1N tng ng vi 0,006g axit axtic).
IV. XC NH QU TRNH PHN GII XENLULOZA CA VI SINH
VT
4.1.
(g):
KNO3
2,5g
KH2PO4
1,0g
MgSO4
0,5g
NaCl
0,5g
0,01g
FeSO4
Mn2(SO4)3 0,01g
Nc ct
200 ml
- Nhng vo dung dch trong ng nghim mt di giy lc (20 x 1,5 cm)
- Dng kp st kp mt u di giy vo ming ng nghim.
- Cho vo ng nghim mt cc t nh (ngun vi sinh vt) ri t ng
nghim vo t m, gi 300C trong 7 - 15 ngy.
- Cc vi sinh vt phn gii xenlulza pht trin, tit ra men xenlulaza lm
cho giy b phn hu, ho nhy c mu vng, hng, lc, cht nhy c mu sc
chnh l khun lc ca vi khun.
- Xc nh cc i tng vi sinh vt tham gia qu trnh phn gii
xenlulza hiu kh
72
Th nghim vi sinh vt hc
73
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
76
Th nghim vi sinh vt hc
77
Th nghim vi sinh vt hc
78
Th nghim vi sinh vt hc
Nguyn tc
Trong qu trnh pht trin ca vi sinh vt, enzym lun lun c tng hp
tham gia vo qu trnh ng ho v qu trnh d ho.
Di y l phn thc nghim c tin hnh thu nhn ch phm enzym th.
1.2.
Th nghim vi sinh vt hc
Nguyn tc
Phng php nui cy chm l phng php vi sinh vt pht trin, sinh
sn v trao i cht trong lng mi trng. Mi trng dng trong nui cy
chm thng l mi trng lng.
80
Th nghim vi sinh vt hc
2.2.
- Chun b 50 ml mi trng trong bnh tam gic 250 ml. em tit trng
121 C trong 30 pht v ngui.
0
81
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
84
Th nghim vi sinh vt hc
85
Th nghim vi sinh vt hc
86
Th nghim vi sinh vt hc
87
Th nghim vi sinh vt hc
88
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
ln xung 5-10 ln. Dung dch mu ny c pha long l 10-2. Sau s dng
cng pipet hoc pipetman c u tip chuyn 1ml dch m ny vo ng nghim
th 2 cha dung dch pha long v thao tc tng t c dch mu vi pha
long 10-3. Tip tc thc hin tng t c cc pha long thp phn theo
cho n pha long cn thit. Lu nu pipet hoc u tip pipetman nguy c
b nhim trong qu trnh thao tc (chm tay, chm mt ngoi ng nghim, mt
ngoi bnh cha...), cn phi thay pipet hoc u tip v trng khc.
1.2.2. Cy mu
Chn 2 hay 3 pha long lin tip d kin cha 25-250 t bo vi sinh
vt trong 1ml cy ln a petri. Dng pipet v trng hoc pipetman vi u
tp v trng chuyn 1ml dch mu pha long chn vo gia a petri v trng.
Tng ng vi mi pha long cy t nht 2-3 a (tc l thc hin 2-3 ln lp
li). Sau khi cy vo mi a 10-15 ml mi trng PCA c un chy v
n nh 450C. Trn u dch mu vi mi trng bng cch xoay trn a petri
xui v ngc chiu kim ng h, mi chiu 3-5 ln ngay sau khi mi
trng. t cc a trn mt phng ngang cho thch ng c. Lt ngc v
cc a trong t m nhit 30 10oC trong 72 gi. Nhit v thi gian c
th thay i theo quy nh ca tiu chun.
1.2.3. Cch tnh kt qu
m tt c s cc khun lc xut hin trn cc a sau khi . Chn cc a
c s m t 25-250 tnh kt qu. Mt tng vi khun hiu kh trong 1g hay
1ml mu c tnh nh sau :
A (CFU/g hay CFU/ml) =
N
n1Vf1 + ... + nVf
i
i
235 + 246 + 26
= 2,4 x105(CFU/g)
2 x1x0, 001 + 1x1x0, 0001
90
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
92
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
N
xR
n1Vf1 + ... + nVf
i
i
2.4.1. Nguyn tc
Mu c ng nht ho c cy mt lng nht nh ln mi trng
thch chn lc thch hp cha lactose, 440C trong 24 gi, m cc khun lc
c hnh c trng ca Coliforms. Khng nh cc khun lc m l E.coli
bng cc th nghim IMViC.
96
Th nghim vi sinh vt hc
97
Th nghim vi sinh vt hc
Coliforms
Th nghim Indol
Th nghim IMViC
m s ng canh EC (+)
va Indol (+), tra bang
m s ng canh EC (+)
va IMViC ++--, tra bang
Coliforms
chu nhit
Coliforms
phn
98
E.Coli
Th nghim vi sinh vt hc
Mt
Coliforms
Th nghim
Indol
m s ng canh EC(+) va
IMViC ++--, tnh ty l khng
nh E.coli nhColiforms
Mt E.Coli
99
Th nghim vi sinh vt hc
IV.
4.1.
XC NH TNG NM MEN, NM MC
nh ngha v nguyn tc
Nm men v nm mc l nhm vi sinh vt rt a dng, cho n nay c
hn 400.000 loi nm men v nm mc c m t. y l nhm vi sinh vt
nhn tht, c vch t bo l lp v chitin, c nhn v cc bo quan khc. Tt c
cc loi men v mc u thuc nhm vi sinh vt d dng, chng cn ngun
carbon hu c cung cp nng lng t mi trng bn ngoi. V th vi sinh
vt ny thng xuyn c phn lp t thc phm hay cc ngun giu dinh
dng khc. C th phn bit c nm men v nm mc theo khi nim n
gin nh sau: nm mc l vi nm dng si, sinh sn bng bo t hay khun ty;
nm men l nhng t bo n tnh pht trin theo kiu ny chi, thnh thong c
th tn ti dng khun ty gi trong cc t bo kt nhau thnh chui. n v
hnh thnh khun lc ca nm mc v nm men l mm to nn 1 khun lc
khi nui cy trong mi trng. Mm c th l 1 bo t , 1 t bo hay 1 on ca
khun ty.
Qu trnh tng trng ca nm men v nm mc ph thuc vo rt nhiu
yu t t mi trng. Hu ht nm mc, nm men u thuc nhm vi sinh vt a
mt, nhit thch hp cho s pht trin ca chng trong khong 20 280C, 1
s t trong s ny a lnh hay a nng. Nc hot tnh cng l nhn t nh
hng rt quan trng n tng trng. Hu ht cc loi nm men v nm mc
pht trin tt trong c cht c nc hot tnh khong 85% hay ln hn, 1 s t
loi c th tng trng trong c cht c nc hot tnh thp hn khong 60
70%. Nm mc v nm men tng trng c vng pH t 2 9, trong pH thch
hp nht nm trong khong 4 6,5. Hu ht nm mc , nm men u thuc
nhm hiu kh bt buc, 1 s c th pht trin trong iu kin vi hiu kh. Mt
s c th tip nhn oxy nguyn t t c cht ca chng nhng d dng no ,
oxy vn l nguyn t cn thit cho qu trnh pht trin ca nm men v nm
mc.
Trong thc phm, nm men v nm mc hin din c th tng trng lm
thay i mu ca thc phm, 1 s c th to c t gy ng c thc phm.
Mt nm men v nm mc trong mu c xc nh chung di dng
tng nm men nm mc bng k thut pha long, tri v khun lc trn mi
trng Dichloran Glycerol Agar (DG18)hay Dichloran Rose Bengal
Chloramphenicol Agar (DRBC). Mi trng DG18 c s dng cho cc loi
mu thc phm c hm lng nc thp nh cc loi thc phm kh, go, ng
cc, tiu, cc loi thc c du, c hm lng ng hay mui cao. Mi trng
100
Th nghim vi sinh vt hc
Th nghim vi sinh vt hc
102
Th nghim vi sinh vt hc
Mu my phm
nh danh
103
Th nghim vi sinh vt hc
104