Transcription

BIOL201
Daniel Gautheret
daniel.gautheret@u-psud.fr

Chapitre 1: Transcription et RNA polymrase

Chapitre 2: Initiation, longation et terminaison
Chapitre 3: Rgulation: lexemple procaryote
Chapitre 4: Maturation de lARN chez les eucaryotes

V. 2012.0

Chapitre 1

Transcription et RNA polymrase

Lintuition de la transcription
Chez les eucaryotes:

ADN dans le noyau

Machinerie de synthse dans

le cytoplasme

Hypothse dun lintermdiaire ARN

Etapes-cl de la dcouverte de
lARN messager
1957: concept dun adaptateur ARN (Crick)
1956-57: Dcouverte progressive dune nouvelle fraction
dARN, polymorphe
1959-60: dcouverte dune ARN polymrase capable
de synthtiser de lARN partir dADN.
1961. Mise au point des techniques dhybridation ADNARN sur filtre de nitrocellulose. -> lARN est
complmentaire dun seul brin dADN
1961. Dmonstration de lexistence dun ARN messager
(Jacob & Monod)
1961. Purification dARN polymrase bactrienne et
synthse in vitro dARN partir de matrice ADN
4

Rappel: diffrences ADN/ARN

ARN

ribose

ADN

dsoxyribose

Bases de lADN et de lARN

Base puriques

ADN: T

ARN: U

Base pyrimidiques

Structure des ARN

O
P
O
H2C

Molcule ordonne
linaire
Oriente 5P->3OH
Grand nombre de
structures secondaires
possibles

Dcodage du gne dans la cellule bactrienne

ADN

ARN polymrase

Ribosome
grande sous-Unit

ribosome
Ribosome
petite sous-Unit

ARNm
Protine

ARNr
ARNt
aminoacides

Membrane cellulaire

Les principaux ARN dans une bactrie

ARN ribosomiques (ARNr)
Grande sous-unit 23S (3000nt) et 5S (120nt)
Petite sous-unit 16S (1500nt)
Composition en bases: 25%A 21%U 32%G 22%C

ARN de transfert (ARNt)

4S (70nt)

ARN messager (ARNm)

Instable (demi-vie courte)

Grande varit de molcules
Entre 300 et 5000 nt
Taux de synthse lev

Dcodage du gne dans la cellule eucaryote

ADN
ARNr
ARNt

ARN polymrase

Pr-ARNm
Maturation

ARNm
ribosome
Protine

Membrane cellulaire

10

Distribution des ARN dans une cellule

eucaryote
Cytoplasme
ARN ribosomiques (ARNr)
Grande sous-unit 28S et 5,8S
Petite sous-unit 18S

ARN de transfert (ARNt)

4S

Noyau
Distribution diffrente du
cytoplasme
ARN gants (10000 100000nt)
Turn-over rapide

ARN messager (ARNm)

Plus stables quARNm bactriens
Grande varit de molcules
Entre 300 et 5000 nt

Ide dARN prcurseurs prsents dans le noyau

11

ARN prsents dans une cellule typique de

mammifre (fibroblaste de souris en culture)
ARN cellulaire
total (%)
lquilibre

ARN
Synthse
totale (%)

Prcurseurs nuclaires dARNr

39

ARNr cytoplasmique
Pr-ARNm

71
7

58

ARNm cytoplasmique
Petits ARN stables (surtout ARNt)

3 !
15

Toute la varit des ARNm est comprise dans ces 3% !

12

Comparaison transcription/rplication:
copie des 2 brins dADN au cours de la rplication

From Wikipedia: DNA replication

13

Comme pour la rplication: polymrase synthtise de 5 vers 3

5
ARN synthtis

Matrice ADN

14

Copie dun seul brin dADN par lARN

polymrase
5
3

5
3

A G

A G

G A

5
T

A G

G G

G A

G G

G A

G G

G
A
T

3
5

A AC C GG T
U
T G C
C
A
G

Brin matrice =
brin transcrit

U A C A
A T G

G
C

3
5

bulle
15

Les gnes peuvent rsider sur un brin ou

lautre de lADN
Exemple de transcription dans une rgion gnomique: il y a des gnes
sur les deux brins.

Sens de la transcription sur le brin matrice

ADN 5

ATG

3
5

AUG

Sens de la transcription sur le brin matrice

16

Les tapes de la transcription

Site de terminaison

Site dinitiation

Initiation

Elongation

Terminaison

17

Structure de lARN polymerase de T7

18

Structure de lARN polymerase bactrienne

bulle

19

Structure de lARN polymrase dE. coli

Core enzyme

Coeur (Core)
Complet (Holo)

Holoenzyme

7000 molcules/cellule
alpha rpoA
36500
beta
rpoB
151000 site catalytique
beta
rpoC
155000 liaison
omega rpoZ
11000 assemblage du core
sigma rpoD
70000 interaction avec promoteur
20

Les 3 ARN polymrases eucaryotes

21

Activits des 3 ARN polymrases

eucaryotes
Pol I: la plus active. Synthtise les ARNr sauf 5S.
Dans le nuclole.
Pol II. Synthtise les prcurseurs dARNm. Dans le
noyau.
Pol III. Activit faible. Synthtise les ARNt et
autres petits ARN nuclaires (snRNA), et ARNr 5S.
Dans le noyau
22

Les 3 ARN polymrases de Saccharomyces cerevisiae

>
>

>

>

23

24

Pour la structure de la RNA

polymrase II de levure en cours
de transcription
25

RNA POLYMERASE II de Saccharomyces cerevisiae

26

27

Structure de lARN polymrase II :

Longueur considrable
du domaine C-terminal (queue CTD)

CTD: rptition dune cinquantaine de squences

Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

28

Initiation

Dbut de transcription
ARN polymrase

La polymrase se fixe au
promoteur sur lADN duplex

promoteur

La polymrase dnature le
duplex. Formation de la bulle
de transcription

La polymrase catalyse la
liaison phosphodiester des
deux premiers rNTP
29

Zone hybride ADN/ARN

Elongation
La polymrase avance 3>5 sur
le brin matrice en dnaturant le
duplex et en ajoutant des rNTP
lARN

5
ARN natif

Terminaison

Fin de transcription

Au site darrt de transcription,

la polymrase relargue lARN
termin et se dissocie de lADN
ARN termin
30

Chapitre 2:
Initiation, Elongation et
Terminaison de la transcription

31

Initiation

Dbut de transcription
ARN polymrase

La polymrase se fixe au
promoteur sur lADN duplex

promoteur

La polymrase dnature le
duplex. Formation de la bulle
de transcription

La polymrase catalyse la
liaison phosphodiester des
deux premiers rNTP
32

Initiation chez les bactries

33

Structure dun promoteur bactrien

Promoteur
-35
Squence
consensus

-10

TTGACA

C
C

N
N

N17

TATAAT

Rgion transcrite
N5-9 A/G

-35

-10

Reconnaissance du promoteur par le facteur sigma

34

Caractrisation de la rgion promotrice

(Modification des bases, Mutations des paires de bases)
Modification
empchant
la liaison de
la RNA pol

-35

-10

Start

Modification
vite en
prsence de
RNA pol
Mutation
nuisant
lactivit du
promoteur
Points de
contact
dduits

La plupart des points de contacts se trouvent sur la mme face de lADN

35

Reconnaissance dun promoteur par lARN polymmase:

Affinits relatives du core enzyme et de lholoenzyme pour lADN

Initiation
Elongation
terminaison

Holoenzyme
Core
Core+fact term
Core + sigma

Fixation au promoteur
Abandon promoteur
Dcrochage de lADN
Recyclage

36

Exemples de facteurs sigma

chez E. coli

37

Initiation chez les eucaryotes

38

RNA Pol-I
La synthse du
prcurseur des ARN
ribosomaux
a lieu dans le
nuclole

39

Initiation de la transcription par la RNA pol I

(synthse des ARN ribosomiques)
Les ARN pol. eucaryotes ne se fixent jamais seules: facteurs de transcription
Un core factor constitu
de nombreux facteurs

Core Factor

TBP

+ pol I et Rrn3p
Rrn3p

Complexe dinitiation

Pol I
40

ARN pol III: le gne 5S nest pas contrl par un

promoteur en amont
Mise en vidence dune rgion interne de contrle de la transcription
activit

dltions

+
+
+
+
+
+
-

ICR=Internal control region

+1

+40

+80

+120

gne ARN 5S

Mais comment la polymrase

Peut-elle se placer correctement?

dltions

+
+
+
+
activit

41

Explication: le complexe dinitiation de la

transcription de la pol-III

TFIIIC

TFIIIB

Gne tRNA
Pol III

TFIIIB

Gne ARNr 5S
Pol III

TFIIIC
TFIIIA
C
42

Squence de la rgion ICR du gne codant pour lARN5S de Xenopus

laevis et structure du facteur de
transcription TFIIIA qui se fixe sur la rgion ICR
Rgion ICR

TFIIIA
12 acides amins

43

Trois familles de doigts de zinc

44

Reprsentation schmatique de linteraction de lADN

avec les doigts de Zinc en tandem contenus dans le facteur TFIIIA

45

La RNA pol. II

46

Dtermination de la rgion promoteur dun gne dpendant de lARN polymrase II

Les rgions

sont dltes

47

Identification de 3 Rgions ncessaires linitiation de la

transcription, en amont du gne codant pour la -Globine

Expriences de mutations ponctuelles

Boite
GC

Boite
CAAT

Boite
TATA

48

Les promoteurs utiliss par la pol-II sont des combinaisons

varies de courtes squences consensus

49

Formation du complexe de
dmarrage pol-II
Complexe prinitiation

TATA
+ TBP

+ TFIIH
Transcription basale
Sans activation

+ TFIIB

Pol II
+

+ TFIIE

TFIIF
CTD
50

Elments de contrle du promoteur pol-II :

les lments distants

enhancers

promoteur

gne

enhancers

UAS= upstream
activating sequence

51

Comment fonctionne un enhancer?

Modle simplifi dactivation de la transcription

Enhancer
Boucle dADN

Activateur de transcription

TBP
TATA box

RNA Pol
Site dinit.
52

TBP peut sassocier des facteurs (les TAF)

et former le complexe TFII-D:
Activation de la transcription

TAF250

TAF80
TAF110

TAF60
TAF40

TAF30
TBP
TATA

TAF30
TAF150
Initiateur

TAF: TBP-Associated Factors : ouvrent la chromatine, acetylent histones etc.

53

Niveau basal / Niveau activ

interactions

TBP

promoteur

Transcription
basale

Activateurs
TAF250

TAF80

TAF110
TAF60
TAF30TAF30
TAF40
TAF150

TBP

promoteur

Transcription
active
54

TBP est ncessaire linitiation de

la transcription par chacune des 3
polymrases eucaryotes

TBP
TBP

Pol III

Pol II

TBP
Pol I
55

Structure de la TBP de levure en

complexe avec une boite TATA

Structure en selle de cheval

Fixation dans sillon mineur

56

Un mlange
dinteractions:
- non-spcifiques
(coller lADN sur les
groupements P)
- spcifiques
(reconnatre la
squence TATA)

57

Torsion de la double hlice dADN

58

Elongation de la transcription:
ncessit de quitter la rgion du promoteur
TFII B/D/E/F/J

Pol II

TATA

Chez les bactries :

relarguage du facteur
sigma
Chez les eucaryotes :
phosphorylation de la
queue CTD par TFIIH

CTD
phosphorylation de la
queue CTD

TFII B/D/E/F/J
TATA

Pol II

P
CTD P P P P

Complexe
dlongation
59

Elongation de la transcription
RNA pol
A

5
3

A G

A AC C GG T
U
T G C
C
A
G

Matrice ADN
= brin non-codant

T
G

bulle
A
T

3OH
A
T

U A C A
A T G

G
C

G
C

G A

G G

NTP suivant
60

Procaryotes:
la terminaison rho-indpendante
ADN
ARN

dissociation
From: www.vetmed.iastate.edu/departments/vmpm/

61

Procaryotes: la
terminaison rhodpendante
(modle)
Blocage du ribosome sur
codon Stop permet la fixation
de la protine Rho sur un site
Rho utilization site
La fixation de Rho cause le
dcrochage de la polymrase

62

Terminaison chez les eucaryotes

Arrt caus par la polyadenylation (voir
dernier cours).
Aprs arrt: maturation de lARN

63

Chapitre 3:
Rgulation de la transcription:
le modle procaryote

64

La rgulation de lexpression
Pourquoi lexpression des gnes doit-elle
tre rgule?
Division cellulaire
Diffrentiation
Rponses lenvironnement

65

Induction / Repression
Induction/rpression: rponses lapparition
dun substrat particulier
Induction:
En absence de lactose: pas besoin denzyme de
mtabolisme du lactose
En prsence de lactose: induction. Lenzyme est
produite

Rpression
Une enzyme dE.coli synthtise le tryptophane
En prsence de Trp dans le milieu: pas besoin
denzyme: rpression
66

Mtabolisme du lactose

67

Au dpart: deux gnes connus

Annes 50

Gne z (lac Z) : gal

Gne i:
Souche inductible: i+
Souche constitutive: ii+

gal

z+
inducteur

i-

gal
gal

z+
inducteur

gal
68

Inducteur=lactose ou analogue

Lexprience Pajama*
(*Pardee, Jacob, Monod, 1959)

F
Donneur: bactrie F (pili)

donneur

receveur

Receveur: bactrie F-

i+

z+
X

i-

z69

Lexprience Pajama
IPTG: inducteur analogue du lactose qui
contrairement au lactose nest pas reconnu par
beta-gal. Donc reste dans la cellule.

donneur

receveur

i+

z+

Ajout IPTG

X
i-

z-

Interprtation:
1- introduction du gne z+ dans receveur i- > fabrication Bgal
2- introduction i+ > bloque synthse de gal (i est un rpresseur)
3- en prsence dinducteur, le rpresseur ne fonctionne plus

70

Jacob, Monod, 1961:

Fonctionnement de lopron (1)

71

Fonctionnement de lopron (2)

72

Les mutants qui ont permis

dtablir le modle dopron:
Genotype

Noninduit

induit

I+,Z+

Sauvage

I-,Z+

Pas de rpression

I-,Z+ / F I+,Z+

Restauration rpression par action trans

Is,Z+

Is: represseur insensible linduction

Is,Z+ / F I+,Z+

Is agit encore en trans

Oc,Z+

Oc: oprateur constitutif. Ne reconnait pas I

O+,Z- / F Oc,Z+

O+ ne rpare pas Oc: action en cis

Is,O+,Z+ /F I+,Oc,Z+

Oc dominant sur Is

73

Leffet de linducteur sur le rpresseur

nest pas absolu
Rpresseur
oprateur

2 x 1013

Rpresseur +inducteur
2 x 1010
Affinit

autre DNA
Spcificit

2 x 106
107

2 x 106
104

Diffrence
daffinit

74

Symtrie de la squence de loprateur

de lopron lactose
Mutations rendant constitutive lexpression de lopron:

5 TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT 3
3 ACCTTAACACTCGCCTATTGTTAA 5
Oc

mutations

A TGTTA
T ACAAT

C
G

T
A
75

Structure du complexe rpresseur lac /oprateur

Le rpresseur est un
homodimre
Chaque sous-unit est
reprsente par une couleur
diffrente.

76

77

Encombrement de lARN polymrase bactrienne, de

lADN et du rpresseur du phage

78

La rpression catabolique
Le glucose (un catabolite) rprime la synthse de gal
Glucose

ATP

cAMP

CAP
cAMP
CAP

En absence de glucose: augmentation du taux dAMPc qui forme un complexe

avec la protine CAP et lactive.
En prsence de glucose: baisse du taux dAMPc: empche lactivation de CAP

79

une rgulation positive

80

Site de fixation du complexe

CAP-cAMP sur le promoteur
GTGAGTTAGCTCAC
CACTCAATCGAGTG

Promoteur
lacI

Site CAP

+1
lacZ

Fixation rpresseur
Fixation RNA-polymrase

81

Conditions de rgulation

82

Principes de rgulation positive et ngative

83

La rgulation de la synthse du
tryptophane chez coli
1.Contrle au niveau de linitiation de la
transcription
2.Contrle au niveau de la terminaison de la
transcription

84

Trp: contrle de linitiation

Un rpresseur, trpR se fixe sur 3 oprateurs et
contrle la transcription :
De lopron trpEDBCA qui code pour les enzymes de la
voie de bioysynthse du tryptophane partir du
chorismate
Du gne aroH qui code pour un enzyme impliqu dans
la premire tape de la voie de synthse des acides
amins aromatiques
De son propre gne trpR (autocontrle)
aroH GCCGAATGTACTAGAGAACTAGTGCATTAGGCTTATTTTTTTGTTATGATGCTAA
Trp AATCATCGAACTAGTTAACTAAGTACGCA
trpR TGCTATCGTACTCTTTAGCGAGTACAACC

85

Contrle au niveau de linitiation de la transcription

par le rpresseur TrpR

86

Trp: contrle de la terminaison

La transcription de lopron peut sarrter
prcocment aprs la synthse dune squence leader
qui prcde les rgions codant pour trpEDBCA:
mcanisme dattnuation

87

Le modle dattnuation
Peptide leader avec 2 codons trp
En prsence de trp:
Passage du ribosome
Formation dune structure
terminatrice
Blocage transcription
En absence de trp:
Blocage du ribosome
Formation dune structure
anti-terminatrice
Poursuite de la transcription

88
trp trp

Vue densemble de lopron tryptophane d E. coli

ARNm de lopron Trp
ARNm du leader de Trp
promoteur

attnuateur

oprateur
Site dinitiation de
la Tp

Terminaison
de la Tp

Composant I
anthranilate
synthtase

Composant II
anthranilate
synthtase

Anthranilate
isomrase

Tryptophane
synthase

Tryptophane
synthase

Xie et al. Genome Biology, 2001:3

Terminaison
de la Tp

89

Et les eucaryotes?

90

Stratgies de rgulation de la
transcription chez les eucaryotes
Stratgies plus complexes que chez les
procaryotes
Transport des protines cytoplasme>noyau
Modification/activation des protines
Glycosylation, actylation, etc

ADN non nu:

Chromatine ouverte / ferme

Maturation variable des ARNm

Un prARNm peut donner des ARNm diffrents
91

Chapitre 4:
Maturation des ARN chez les
eucaryotes

Expression des gnes : eucaryotes et procaryotes

Eucaryotes

Procaryotes

cytoplasme
noyau

intron

exon

ADN

ADN

Transcription

Transcription
ARNm

Pre-ARNm
Coiffe 5 et queue polyA
coiffe

Traduction

AAAAAA
Epissage
AAAAAA

ARNm
Export

AAAAAA
Traduction

93

Boucles formes par hybridation dun ARN messager

eucaryote avec lADN gnomique

Les deux tapes de la raction

catalytique dpissage
Pr-ARNm
Exon 1

Intron

AG GUAUGU
Site 5

Exon 2

UACUAAC
Site de
branchement

YAG G
Site 3

Etape 1
Etape 2

Exon 1
AG

Exon 2

A AG G
G
U

lasso
intermdiaire

ARNm mature
Exon 2

Exon 1
AG G
A AG
G
U

lasso final

Epissage in vitro dun

ARN: Mise en vidence
sur gel des produits
intermdiaires

Produits intermdiaires obtenus

au cours de la maturation des
ARN

Les deux ractions de transestrification

GU du site 5 intron

A du site de branchement

Lasso

Lpissage est ralis

par un complexe
ribonucloprotique:
le spliceosome

Ux=snRNP
=snRNA+Protines

FORMATION ET RECYCLAGE DU
SPLICEOSOME

Catalyse et epissage par le complexe des

snRNP U1,U2,U5,U4/U6

Retour sur les squences consensus des

introns spliceosome

Pourquoi une telle conservation dans tous les gnes

eucaryotes?

Les snRNA U1 et U2 intragissent avec

les squences consensus

(reference missing)

Mutation: blocage pissage

Mutation compensatoire:
restauration de lpissage

Autoepissage des introns de groupe I et de

groupe II

(GMP
exterieur)

Comparaison entre la structure des introns de

groupe II et les snRNA du spliceosome

Epissage alternatif
3 gnes de dtermination du sexe chez la drosophile,
pisss diffremment chez les males et les femelles:

Lpissage est
co-trancriptionnel

Facteurs dpissage

Coiffe de
lextrmit 5 du
pr-ARNm

La Coiffe est mise en place ds le dbut de

la transcription

Ajout coiffe

Mise en place de la queue poly-A

en 3 du messager

Polyadenylation et terminaison

Les transcrits sont

clivs et
polyadnyls.

CTD et Terminaison
Facteurs dpissage
(protine SR, snRNP)

Pr-mRNA

Cleavage/polyadenylation
factors (CPSF, CstF)
Facteurs dlongation

CTD

Pol II

Elongation

Etapes de
transcription et
maturation Complexe de coiffe +

facteurs dpissage
(SF) sur queue CTD

Preinitiation complex

capping complex
spliceosome

spliceosome
ARNm mature
+ protines fixes

LARNm est en permanence recouvert

de protines
(heteronuclear
RiboNucleoProtein
complex)

L export nuclaire par les pores

Importance de coiffe et queue poly-A pour le

dmarrage de la traduction
Ribosome

elF3: facteur dinitiation

-> dmarrage traduction

Maturation des ARN

ribosomiques et
assemblage des
petites et grandes
sous-units du
ribosome

Eucaryotes: ribosome =
5.8S+5S+28S+18S
+protines