2.3.

Variantes experimentales Fermentacin

2.3.1. La conversin directa de la materia prima a etanol sin pre tratamiento (Variante I)

Muestras de pan de desperdicios (30 g de materia seca) se disolvieron en 150 ml de agua

destilada precalentada a 35 C en matraces de 300 ml.El pH de la suspensin se ajust a 4,5
utilizando 1 mol L 1 H2SO4 solucin. Se aadieron GSHE (2 ml por 1 kg de materia prima de materia
seca) y proteoltica (Neutras 0,8 L, 0,875 ml kg 1 de materia seca de materia prima) a las
preparaciones y el peso total de la suspensin se ajust a 200 g con agua destilada resultante en
una carga de materia prima de 150 g de materia seca por kilogramo de medio de fermentacin (los
experimentos se llevaron a cabo con baja carga de materia prima debido a que la materia prima
utilizada mostr alta capacidad de absorcin de agua y la aplicacin de la mayor carga de la unin
del sustrato dio lugar a la obtencin de slidos como la consistencia del medio Fermentacin lo
observado anteriormente [11,27]).Entonces la suspensin de residuos de pan se inocul con 2 ml
de suspensin de levadura dando concentracin inicial de levadura 1 g kg 1.Los matraces se
sellaron con tapones de goma con el tubo de llenado de la fermentacin de glicerol y un puerto de
muestreo como se describe por Kim et al. [28] y se colocaron en un bao de agua agitador WNB745 (Memmert, Alemania) a 35 LC con velocidad de agitacin de 150 rpm (2,5 Hz) durante 72 h.

Frmula estructural del etanol

2.3.2. Pre tratamiento enzimtico (Variante II)
Muestras de materia prima (30 g de materia seca) se diluyeron en
150 ml de agua destilada en matraces de 300 ml y pH de la
suspensin se ajust a 4,5 utilizando 1 mol L 1H2SO4. A continuacin
se aadi la preparacin Ceremix 6X MG (1,25 g de enzima por
kilogramo de materia seca de materia prima) y el peso total del
contenido de matraz se ajust a 200 g con agua destilada. Los
matraces se sellaron con tapones de goma para evitar la
evaporacin de agua y se colocaron en un bao de agua caliente a
45 C durante 20 min con agitacin constante[12].Despus las
suspensiones se enfriaron a 35 C, inoculados con levaduras, GSHE
y proteasa (Neutras0,8 L) y se aadieron adems procedimiento fue
el mismo que el descrito en la Seccin 2.3.1.

2.3.3. Pre tratamiento Microondas (Variante III)

Muestras de materia prima (30 g de materia seca) se extendieron en una capa fina sobre una
placa de Petri y se irradiaron en un horno microondas KOR-63X5 (Daewoo, China) durante 2 min

con 400 W de salida de potencia de microondas y la frecuencia de 2450 MHz. Despus de que las
muestras de pre tratamiento se enfriaron a temperatura ambiente en un desecador. Adems
procedimiento fue el mismo que en la Seccin 2.3.1.
2.3.4. Pre tratamiento ultrasnico (Variante IV)
Muestras de pan de residuos de tierra (30 g de materia seca) se arrastraban en ca. 150 ml de
agua destilada precalentadas a 35 LC en unos matraces cnicos de 300 ml.Los matraces se
colocaron en un bao de ultrasonidos SONIC-0,5 (POLSONIC,Polonia) durante 5 min, tal como se
describe por el fabricante el poder de la baera era 250 W Frecuencia y ultrasnica
Frecuencia fue de 40 kHz. Despus de este tiempo el procedimiento experimental fue el mismo
que en la Seccin 2.3.1.
Tratamiento ultrasnico se ha mostrado como una tcnica innovadora y eficiente para mejorar la
produccin de bioetanol. Principalmente, el
ultrasonido se utiliza para extraer el material
intracelular de biomasa, como maz, soja, material
ligno-celulsico, paja o residuos vegetales.

Aumento en la produccin de bioetanol

Disinteration / destruccin y la liberacin de

material intracelular de la clula

Mejorada la descomposicin anaerbica

Activacin de enzimas por sonicacin suave

Mejora de la eficiencia del proceso de lodos de alta concentracin

Las pruebas simples, escalado reproducible y fcil instalacin (tambin en ya existente produccin
corrientes) hace ultrasonidos una tecnologa rentable y eficiente. Confiable Sonificador industrial
para el procesamiento comercial est disponibles y que permitan someter a ultrasonidos
volmenes de lquido prcticamente ilimitados.

2.3.5. Hidrlisis y fermentacin separada (SHF) (Variante V)

Muestras de residuos de pan (37,5 g de materia seca) se ponderaron en las tazas de
maceracin y se diluyeron con 180 ml de agua destilada. PH de la suspensin se ajust a 6,0
utilizando 1 mol L1H2SO4o NaOHsoluciones. Las copas se colocan en un 12 LB-laboratorio
dispositivo de maceracin (Lochner Trabajo + Technik, Alemania) precalentado a 45 C. La
maceracin se llev a cabo con 150 rpm (2,5 Hz) Velocidad de agitacin y 2 LC 1minvelocidad de
calentamiento y enfriamiento. Cuando la temperatura de la suspensin alcanz 60 C (Termamyl
SC DS, 2 mL kg1de la materia prima seca estera-terfue agregado) y el bao del dispositivo de
maceracin se calent adicionalmente a 85 C. La licuefaccin de almidn se llev a cabo durante
60 min. A continuacin, las muestras se enfriaron a 55 C, su pH se ajust a 5,8 con 7,11 mol
L1H2SO 4, glucoamilasa (SAN L extra, 1,25 ml kg 1de materia prima de materia seca) y la proteasa
(Neutras 0,8 L, 0,875 ml1kgde materia prima de materia seca) se aadieron y la hidrlisis se llev a
cabo durante 90 min. Despus de este tiempo la simple se enfriaron a 20 C, el pH de las
muestras se ajust a 4,5 utilizando 1 mol L 1H2SO4solucin, y el peso total de los purs se ajust a

250 g con agua destilada que resulta en una ltima carga de materia prima a 150 g kg 1de pur. 200
g alcuotas de los purs se transfirieron a 300 ml matraces cnicos, inoculado con 2 ml de
suspensin de levadura (levadura concentracin de 1 g kgde pur 1) y sellado con tapn de goma
con tubo de fermentacin y el puerto de muestreo. Adems procedimiento fue el mismo que el
descrito en la Seccin2.3.1.
La configuracin comnmente empleada en el proceso de produccin de etanol implica un proceso
secuencial en el que la hidrlisis de la celulosa y la fermentacin de la glucosa se realizan en dos
reactores diferentes. En este proceso, denominado hidrlisis y fermentacin separadas (HFS), la
fraccin rica en celulosa es primeramente hidrolizada a glucosa. Una vez completada la hidrlisis y
separado el residuo de lignina, la glucosa resultante es fermentada y convertida a etanol.
La utilizacin de un medio lquido rico en glucosa hace posible la recirculacin de los
microorganismos tras la fermentacin.
La principal ventaja en este tipo de procesos es que cada etapa puede ser llevada a cabo en sus
condiciones ptimas de pH y temperatura. Esto permite realizar la hidrlisis a temperaturas
alrededor de 50 C, donde se encuentra el ptimo de actividad celuloltica en la mayora de
celulasas y -glucosidasas fngicas, y a un pH ptimo entre 4-5. Posteriormente se realiza la
fermentacin a temperaturas entre 30-37 C, donde se encuentra el ptimo para la mayora de
microorganismos etanolognicos (Jrgensen y col., 2007).
La principal desventaja en la HFS se debe a que la acumulacin de la glucosa y celobiosa en la
etapa de hidrlisis inhibe a las celulasas implicadas en el proceso, obtenindose, por lo tanto, bajos
rendimientosde sacarificacin (Stenberg y col., 2008; Xiao y col., 2004).
2.4. Mtodos analticos

La

fermentacin
se
evalu
gravimtricamente midiendo la
prdida de peso de medio de
fermentacin debido a la liberacin
de CO2 como se describi
anteriormente[12].Las
muestras
para el anlisis fsico-qumico (ca.
20 mlde alcuotas) se tomaron
cada 24 h de fermentacin. La
concentracin de slidos no
disueltos se determin como sigue:
10 g de medios de fermentacin
(con una precisin de 0,001 g)
fueron secados a travs de presecado (105 C, 4 h) y preponderado papel de filtro, los
slidos disueltos residuales se lavaron con 250 ml de agua destilada Los filtros con slidos
restantes no disueltos se secaron en un horno a 60 C por 12 h . Despus los filtros se enfriaron a
temperatura ambiente en un desecador y se ponderan con una precisin de 0,001 g.La diferencia
en el peso del filtro con y sin de partculas no disuelto dio la concentracin de ellos en el medio de
fermentacin que se expres como gramos de slidos no disueltos por kilogramo. Por HPLC, lo
que reduce el azcar y el anlisis de slidos disueltos las muestras de medios Fermentacin se
centrifugaron a 6.000 rpm (5243g) a 4 C utilizando MPW-351R centrfuga (MOP Med.
Instrumentos, Polonia) y sobrenadantes claros fueron tomadas para los anlisis. Los azcares
reductores-concentracin (como la glucosa) se determin utilizando el mtodo de DNS [26].El
contenido de slidos disueltos (extracto aparente) se determin mediante la medicin de la
densidad del medio de fermentacin clarificado tal como se describe anteriormente [29].La
concentracin de azcares (glucosa, maltotriosa y dextrinas (DP4 +)), subproductos de
fermentacin (Glicerol, cido lctico) y el etanol se determin usando cromatografa de lquidos de
Performance alta resolucin (HPLC).Antes del anlisis claro sobrenadante despus de la
centrifugacin de medios de fermentacin se diluy con agua bidestilada en un 1: v / v proporcin 3
y se filtr a travs de filtro de jeringa de nylon (0,2 l m).El anlisis se realiz mediante
cromatografa (Shimadzu, Japn) equipado con una columna Rezex ROA-Organic Acido H + (300
7,8 mm) (Phenomenex, EE.UU.).Se aplicaron los siguientes parmetros de anlisis HPLC:-anlisis
donde volumen 20 l L, elucin temperatura- 60 C, mviles fase 0,005 mol L 1 H2SO4, el flujo de fase
mvil tasa de 0,6 ml min-1.Los analitos se detectaron utilizando detector de ndice de refraccin (RID10A,
Sobre la base de los resultados obtenidos siguientes parmetros del proceso se calcularon a
intervalos de tiempo 24 h: tasa de produccin de etanol (r p[g L1h 1]) y el rendimiento de etanol
prctico (Yp[%; g kg1de azcares; g kg1de la materia prima de materia seca] sobre la base de la
reaccin estequiometria donde 1 kg de azcares (como la glucosa) se convierte en 511,1 g de
etanol [30].
2.5. El anlisis estadstico
Todos los experimentos y las determinaciones se realizaron en tripli-Cates.Resultados que se
presentan son valores medios con desviaciones estndar (n = 3). Los resultados tambin fueron
sometidos a anlisis de una va devariante (ANOVA) a nivel de significacin a = 0,05 utilizando
Estadstica 10,0 paquete(Statsoft, Inc., EE.UU.).Se utiliz la prueba de Duncan para determinar los
grupos estadsticamente homogneos (denota como cartas posteriores del alfabeto) y ms
diferencias significativas (LSD).

3. Resultados y discusin
3.1. Efecto del mtodo de pre tratamiento sobrelas propiedades fsico-qumicas de los
medios de fermentacin
La concentracin inicial de azcares reductores y los slidos disueltos en el medio de
fermentacin fue el ms alto en las muestras despus de la hidrlisis de tasa SEPA y la
fermentacin (SHF) pre tratamiento(Fig. 1A y B, respectivamente).Pre tratamiento enzimtico
utilizandopreparacin Ceremix 6X MG dio lugar a la hidrlisis preliminar y licuefaccin de pan de
residuos dando contenido inicial de azcares y slidos disueltosde ca. 25 y 30 g
L1respectivamente. Otros mtodos de tratamiento previo aplicado (microondas y ultrasonidos) no
afectadosconcentracin inicial de azcares y slidos disueltos en el comienzo de la fermentacin
en comparacin conla variante pre tratado. El microondas y pre tratamiento ultrasnico no
influyeron en el contenido de slidos no disueltos (ca. 131 g kg 1de medios de comunicacin) en
comparacin con muestras sin pre tratamiento(Fig. 1c).Hidrlisis preliminar de pan de residuos
conCeremix 6X MG caus partculas reduccin en los no di sueltos por ca. 80 g kg 1en comparacin
con muestras de control, micro-ondulados y sonificados, mientras que las muestras despus de
separada la hidrlisis de dos etapas con una amilasa, glucoamilasa y la proteasa (SHF) contenan
la cantidad ms baja de slidos no disueltos entre otros (ca. 30 g kg 1).
Estudios anteriores muestran que los diferentes mtodos de pre tratamiento influencian en las
propiedades iniciales de medios de fermentacin en las fermentaciones GSHE ayudados. Balcerek
y Pielech-Przybylska[22]estudiaron el efecto de pre hidrlisis trmica (al 56-57 LC) de almidn
triticale con una amilasa y no amilceos polisacrido enzima degradante en el curso de la
fermentacin con GSHE. El contenido inicial de azcares reductores en los medios pre tratados fue
mucho mayor en comparacin para muestras sin pre hidrlisis (ca. 11 y 4 g 100
ml1respectivamente).Shavanas et al.[21]lleg a la misma conclusin, mientras estudiaba el efecto
de licuefaccin preliminar de yuca almidn antes de la fermentacin con GSHE. Resultados
similares se obtuvieron en este estudio en muestras sometidas a pre tratamiento enzimtico donde
los polisacridos presentes en la materia prima eran preliminares hidrolizado por el complejo de
enzimas en preparacin Ceremix 6X mg (amilasas, proteasas, celulasasy otros).la ventaja de la
utilizacin de esta preparacin fue confirmado previamente en el pro-ceso de hidrlisis y
fermentacin de pan de residuos por separado al alto contenido de slidos de cargar[12].Por otra
parte el contenido de slidos no disueltos fue mucho menor enenzimticamente pre tratados
lechadas de pan de residuos

Fig. 1.Los cambios enlas propiedades fsico-qumicas de los medios de fermentacin de trigo-pan
de centeno residuos durante la conversin del almidn directo a etanol con GSHE (a) azcares
reductores,
(B) Slidos disueltos, (c) los slidos no disueltos (I -variante unpretreated, II - pre tratamiento
enzimtico, III - pre tratamiento microondas, IV - pre tratamiento ultrasnico, V - proceso
SHF).Resultados expresados como valores medios desviacin estndar (n = 3).
Tabla 1
Perfiles de carbohidratos durante la fermentacin de los medios preparados a partir de los residuos
de pan de trigo-centeno (I -variante unpretreated, II - pre tratamiento enzimtico, III - pre