Tcnicas de PCR: Aplicaes e Padronizao

de Reaes
BSc. Daniel Perez Vieira
(Protozoologia-IMTSP/ Laboratrio de Biologia Molecular-IPEN)
Aula 1 - PCR: Princpios e tipos de Reao
Breve Histrico
Desenvolvida por Saiki, et al. (1985) e principalmente por Mullis, et al. (1987).
Kary Mullis, que percebeu que possua uma importante ferramenta em mos,
tentou publicar seus experimentos nas duas revistas cientficas mais importantes
do mundo, a Science, americana, que prontamente lhe negou a publicao, e a
Nature, britnica, que procedeu da mesma forma. Mullis, resignado, conseguiu
publicar ento seu artigo sobre amplificao do gene da -globina humana na
Methods in Enzymology, de impacto infinitamente menor.
Apesar dos fracassos iniciais, a Perkin-Elmer Cetus, uma reconhecida empresa
de insumos para pesquisa comprou-lhe a patente, o que lhe rendeu bons lucros,
no antes de ser agraciado com o prmio Nobel de Qumica em 1993.
Hoje a Perkin-Elmer repassou os direitos Roche Molecular Systems (valor da
compra: US$ 300.000.000,00), que possui todas as patentes envolvidas no
processo de PCR, inclusive as relacionadas aos termocicladores convencionais.
Porm, a tecnologia tornou-se to difundida que o custo de pagamento da patente
tornou-se acessvel s suas concorrentes, e a variedade de reagentes e aparelhos
atualmente no mercado grande.

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Fig. 1: Kary Mullis,

inventor da PCR, em
foto de 1994 ( Nobel
Academy)

Na verdade, Saiki j havia descrito a tcnica, mas Mullis inovou: Conseguiu

especificidade na cpia de apenas segmentos especficos, introduzindo o conceito
de primer de PCR, e na utilizao de uma DNA polimerase termoestvel. At
ento, a precursora da PCR demandava grandes quantidades de enzima,
adicionadas a cada ciclo de amplificao. Alm disso, desenvolveu-se vrios
equipamentos para a automatizao da adio da enzima aps cada ciclo, todos
de custo elevadssimo (os primeiros termocicladores). Mullis utilizou a ento
recm descrita Taq, DNA polimerase termoestvel isolada da bactria de fontes
termais Thermus aquaticus. Esta enzima se mantm estvel em temperaturas de
at 117C, com temperatura tima de 72C. Estes dois passos tornaram a tcnica
muito mais fcil de se realizar.
Porm, a realizao manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de
tubos em vrios banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constitua um
fator dificultante do processo. Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o
primeiro termociclador automtico. At hoje, a maioria dos termocicladores
automticos funciona com o mesmo princpio: aquecimento por resistncias
eltricas e refrigerao com ventoinhas e tubulaes em serpentina preenchidas
por etileno glicol. Aperfeioou-se os sistemas de contagem de tempo, para
aumentar a confiabilidade das reaes. Em meados dos anos 90 surge o padro
Peltier, cujo bloco de aquecimento composto por uma liga metlica que aquece
ou resfria de acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada.

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Fig. 2: Termociclador
atual. Observa-se a
presena do bloco de
ensaio.

A repercusso da inveno da PCR foi to grande, que o mdico Michael

Crichton, escritor de Parque dos Dinossauros, afirmou que teve a idia de
escrever este roteiro ao ler a descrio da tcnica, fato que refora a idia da
versatilidade do processo. Ainda sobre a repercusso da tcnica, hoje existem
grandes empresas e grupos de pesquisa tentando descobrir alternativas PCR,
sem grande expresso devido ao sucesso da criao do qumico norte-americano
Kary Mullis.
Fundamentos e Objetivos
Multiplicar um trecho especfico do DNA (gene ou parte dele, regies
supervariveis, Junk DNA, etc.) utilizando desoxinucleotdeos como monmeros
at um ponto em que sua concentrao em dada soluo seja to alta que possa
ser facilmente detectvel por mtodos simples e clssicos de separao e
identificao de substncias. Portanto, Kary Mullis na verdade props uma tcnica
que consegue resolver um grande problema da anlise de cidos nuclicos: sua
baixa quantidade na maioria dos tecidos vivos.
A multiplicao destes trechos especficos se d alternando-se a temperatura de
ensaio entre: a) Denaturao das cadeias do DNA genmico; b) anelamento
(annealinng) dos primers, usados para delimitar a seqncia a ser amplificada; c)
temperatura tima especfica da enzima: 72C; d) reincio do ciclo.
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Fig. 3: Esquema dos processos realizados numa reao de PCR. Aps a denaturao das fitasmolde, ocorre o pareamento dos primers. A enzima, representada em verde, adiciona os
desoxinucleotdeos complementarmente s fitas-me.

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Fig. 4: Passos finais de uma reao de PCR. A figura mostra as duas fitas-me, pareadas com as
suas fitas-filha complementares, sintetizadas a partir da adio dos desoxinucleotdeos pela
DNA polimerase.

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A quantidade de DNA final segue uma funo exponencial, onde:

N = N0 . 2n
N = Nmero final de cadeias de DNA
N0 = Nmero inicial de DNA molde (template)
n = Nmero de repeties do ciclo

Portanto, a concentrao final do DNA molde na soluo muito maior (da

ordem de 235 ) do que a inicial, possibilitando a sua identificao.
Reagentes Necessrios para a Reao
A reao SEMPRE parte de um DNA molde, extrado convenientemente da
amostra, ou de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA
complementar). O ideal que o cido nuclico esteja livre de impurezas
(protenas, lipdeos, outro cido nuclico, reagentes de extrao, etc.) e numa
concentrao mnima de 5g/mL, apesar de quantidades bem menores poderem
ser utilizadas (em medicina forense, chegou-se a utilizar quantidades de at 10-12
mol de DNA).
A DNA polimerase: A mais utilizada ainda a Taq, numa concentrao que varia
de 1 a 4U por microlitro de soluo. Normalmente, a maioria das DNA polimerases
disponveis no mercado so fornecidas conjuntamente com uma soluo-tampo
especfica, cuja composio varia de acordo com o fabricante. Basicamente, estas
solues contm ons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as
condies de reao. Alguns tampes contm ainda detergentes (Tween 20,
Triton X-100, Nonidet P-40), inibindo a formao de dmeros das cadeias
enzimticas, protenas estabilizantes (BSA = Bovine Serum Albumin = Albumina
Srica Bovina) e algumas substncias que agem na denaturao da cadeia molde

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de DNA (DTT = Dithiothreitol, -mercaptanoethanol), quebrando as pontes de

hidrognio entre as bases.
Um reagente de importncia crtica o MgCl2 , doador muito estvel de ons
Mg2+, que so cofatores indispensveis para atividade da enzima. Algumas
enzimas utilizam outros ons metlicos como cofatores. Um desses casos, e talvez
o mais interessante a enzima Tth (Thermus thermophillus) Polimerase. Esta
enzima possui atividade DNA polimersica em presena de ons Mg2=; porm, na
presena de Mn2+ esta mesma enzima apresenta atividade de uma transcriptase
reversa, ou seja, sintetiza DNA a partir de uma cadeia de RNA.
Os desoxinucleotdeos so a matria-prima propriamente dita para a sntese das
fitas-filhas. So compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados
no

carbono

da

desoxirribose.

So

adicionados

pela

polimerase

complementarmente fita-me. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTPs em

concentraes iguais reao.
Os dNTPs so ligados fita-me pela polimerase numa rea delimitada pelos
primers, que so pequenas seqncias de DNA (12 a 35 bases) complementares
s bordas
Tipos de reao de PCR mais comuns
RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction): Esta reao composta de 2
partes: a transcrio reversa e a amplificao propriamente dita. Seu principal
diferencial que na verdade esta reao no parte de um molde de DNA
diretamente extrado da amostra; a amostra fornece o RNA, que convertido em
cDNA (DNA complementar). Ferramenta til em estudos de expresso gnica,
pois avaliando o mRNA, podemos detectar quais protenas esto sendo
efetivamente expressas. No entanto, o estudo direto do RNA (principalmente o
mRNA) invivel, devido sua alta sensibilidade a vrios fatores e a altas
temperaturas. O primeiro passo da reao consiste na sntese de uma fita de DNA

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utilizando como template uma fita de RNA numa reao catalisada por uma
transcriptase reversa. Usualmente, so utilizadas duas enzimas desta classe,
extradas de vrus: a AMV (Avian Mieloblastosis Vrus) e a M-MuLV (Moloney
Murine Laeukemia Vrus). Alm disso, tambm so utilizados primers, mas
inespecficos e nunca em pares. So oligonucleotdeos compostos por vrias
timinas consecutivas (6 a 35), que so anelados s regies Poly-A (ou A-Rich) do
RNA, ricas em adeninas. Aps este ciclo, obtm-se o cDNA que ser utilizado na
PCR. importante ressaltar que o round de transcrio reversa no altera o
nmero de fitas de RNA ou DNA.
Multiplex PCR: Mais de um segmento genmico amplificado numa nica
reao, cada um com seu par de primers especfico. Esta vantagem pode
simplificar alguns experimentos, como a investigao de paternidade, onde vrios
marcadores genmicos devem ser analisados. Tambm til para a introduo de
um controle de reao (a ser discutido posteriormente).
Nested PCR: Para melhorar a especificidade e a eficincia da reao, o segmento
genmico amplificado primeiro de forma abrangente, copiando at mesmo
seqncias localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a
amplificao da real seqncia-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser
realizadas

concomitantemente,

ou

em

duas

reaes

separadamente,

caracterizando o Semi-Nested PCR.

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Fig. 5: Esquema de uma reao de Nested PCR. O produto da amplificao do 1 Round

utilizado com template no 2 round. No final das duas etapas, obtm-se um produto menor que
o da primeira amplificao. Este tipo de reao tem como vantagem o ganho em especificidade
e eficincia, uma vez que o DNA-molde do 2 round est em concentraes altssimas, e os
primers da segunda etapa tm menos chances de anelamento em seqncias inespecficas, dada
a reduo do tamanho do molde.
PCR Competitiva: Alm do DNA molde, adicionado reao um outro trecho
de DNA, de seqncia, tamanho e concentrao conhecidos (controle), cujas
extremidades so complementares tambm aos primers que iro amplificar a
seqncia-alvo. O resultado a amplificao de dois trechos de DNA: a de
interesse e a controle. Esta ltima, levando-se em conta a quantidade inicial e
dados sobre a eficcia da reao serve de padro para a quantificao do DNAalvo. Em resumo, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as
condies da reao, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. Esta
tcnica utilizada principalmente em kits diagnsticos (Carga Viral de HIV).

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Identificao dos produtos das reaes

Eletroforese: Os ensaios de eletroforese se valem do princpio que determina que
a carga global de uma fita de DNA negativa. Portanto, uma soluo que possua
ons livres (eletroltica) e que tenha molculas de DNA em suspenso pode ser
purificada aplicandose uma dada voltagem. Ao final do processo as cadeias de
DNA estaro prximas ao catodo (positivo), atraente de molculas de carga
negativa. No entanto, o foco da tcnica separar os fragmentos por tamanho,
uma vez que a reao gera fragmentos de mesma extenso. A soluo
peneirar o resultado da PCR por peneiras moleculares. As cadeias so
empurradas atravs da peneira pela corrente eltrica, e de acordo com o
tamanho dos furos dela, elas sero retidas ou liberadas. Na verdade, nos valemos
do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da
peneira, e cadeias menores viajam mais rapidamente atravs dela. A distncia
que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a
distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo
gel. So os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que so
misturas de trechos de DNA com tamanhos variveis, normalmente eqidistantes
entre si. Por exemplo, um Ladder de 50bp quer dizer na prtica que ele mostrar
vrias bandas, cada uma maior 50 pares de base do que a anterior (50bp, 100bp,
150bp, 200bp, 250bp...).
Existem dois modelos bsicos de eletroforese: Baseada em gis de agarose ou
em gis de poliacrilamida. As duas substncias formam tramas de poros de
tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua
eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem
e amperagem aplicada. Em qualquer um dos casos, estas substncias so
dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que
recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente
eltrica (Tampo de Corrida).Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o
TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (Tris-Acetato EDTA) Quanto aplicao das
amostras no gel, importante ressaltar que antes disso elas so misturadas a

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uma outra (Tampo de amostra), que tem como funo aumentar a viscosidade da
amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes
que a voltagem seja aplicada no sistema. Alm disso, o tampo de amostra possui
um corante, que possibilita a visualizao do andamento da corrida. Usualmente,
pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (Corante), Xileno-Cianol e
Glicose (aumentam a viscosidade), dissolvidos no tampo de corrida apropriado
para cada reao.
Apesar da sua versatilidade e relativo baixo nvel de dificuldade de realizao, a
eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas
quanto ao tamanho, e no quanto seqncia.
Agarose: Polissacardeo em forma de p. Quando suspenso em soluo aquosa
e aquecido dissolve-se completamente, solidificando-se vagarosamente conforme
a temperatura cai. Enquanto est em forma lquida, colocado num molde que lhe
dar o formato de um bloco quando resfriar. Enquanto isso so feitos pequenos
furos (poos) em uma das suas extremidades, perpendicularmente ao seu
comprimento com o uso de um pente; so os poos que recebero o produto da
PCR.

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Fig. 6: Montagem de gel de agarose. A agarose fundida despejada nesta cuba de montagem,
onde deixada at a polimerizao. Na foto pode-se ver o pente, utilizado para a formao dos
poos. Aps o trmino da polimerizao, o pente retirado e em seu ligar ficam espaos cujo
volume pode variar de 10 a 150L, dependendo do volume de agarose e do sistema de
montagem

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Aplica-se uma voltagem entre as extremidades do gel que varia entre 10 e 200 V,
e corrente de 50 a 3000mA. So utilizadas concentraes de 0,5 a 3% de agarose
no gel. Quanto maior a concentrao, maior a sua capacidade de distinguir
fragmentos de tamanhos prximos, fator denominado DEFINIO. Por exemplo,
um gel de agarose a 1% pode separar fragmentos com uma diferena de tamanho
de 80 pares de bases, enquanto a 2,5% pode-se separar fragmentos com
diferena de no mnimo 30 pares de bases.
A visualizao dos produtos no gel aps a corrida se d pela reao de ligao do
DNA com Brometo de Etdio. Este composto tem a capacidade de inserir-se nas
fendas da cadeia de DNA e apresenta fluorescncia quando excitado com
radiao ultravioleta. Pode-se adicionar o EtBr (10g/mL) no gel liquefeito antes
da corrida ou levar o bloco a uma soluo de EtBr com a mesma concentrao e
deixar descansar por alguns minutos.

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Fig. 7: Gel de agarose montado em cuba de eletroforese e sendo submetido uma voltagem de
69V.

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Fig. 8: Gel de agarose corado com Brometo de Etdio e visualizado num transluminador,
aparelho que emite raios UV. As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas
fluorescentes. A seta mostra a corrida do padro de peso molecular.

Poliacrilamida: Polimeriza-se a partir da reao da acrilamida (C3H5NO) com a

Bis-Acrilamida (N,N- Metileno-bis-acrilamida) em presena de perssulfato de
amnio e catalisada por TEMED (N,N,N,N-Tetrametiletilenodiamino). A mistura,
dissolvida no tampo de corrida desejado, posta rapidamente para polimerizar
numa cuba de montagem semelhante utilizada para agarose, mas orientada
verticalmente. Tambm posto um pente para a formao de poos.

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Fig. 9: Gel de poliacrilamida em polimerizao. Pode-se visualizar o pente ainda inserido no

sistema.

Aps a polimerizao, os procedimentos so os mesmos em relao a um gel de

agarose: Cobertura pelo tampo de corrida na cuba de eletroforese, aplicao das
amostras e do ladder, aplicao da corrente eltrica.

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Fig. 9: Gel de poliacrilamida montado em cuba de eletroforese e sendo submetido uma

voltagem de 69V.

Normalmente, utiliza-se gis com concentraes de 4 a 25% de acrilamida. A

poliacrilamida apresenta definio muito maior do que a agarose: um gel de 10%
pode em certas condies separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por
apenas um par de bases
A identificao dos produtos pode ser feita pela colorao com EtBr, porm o
mtodo mais utilizado a impregnao do DNA contido no gel por nitrato de prata.
Logo aps a corrida e gel fixado com uma soluo de etanol e cido actico,
para impedir a eluio (forma borres no gel) das amostras. Em seguida,
colocado por alguns minutos numa soluo de nitrato de prata. Este composto
escurece quando oxidado, o que feito passando o gel para uma soluo
contendo hidrxido de sdio e formaldedo. A colorao por prata de bem mais

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fcil visualizao do que a oferecida pelo EtBr, alm de ser mais segura, levandose em conta o fato de que este altamente carcinognico.

Fig. 8: Gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata. Devido alta sensibilidade do
mtodo de colorao, observa-se bandas inespecficas e DNA no amplificado no p da foto. A
seta indica a corrida do Ladder.

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