P6.

Determinao da temperatura de desnaturao

(Tm) e do contedo G+C de um cido
desoxirribonucleico
Adesnaturaodecidosnucleicosacompanhadoporumaumentodaabsorvncianocomprimento
deondaa260nm.EsteaumentodeabsorvnciadenominadoporEfeitohipercrmico,oqualdeve
seseparaodasbasesdecadeiascomplementares.Estaseparao(desnaturao)permiteumamaior
absoro de fotes de radiao ultravioleta pelas orbitais das bases, que j no se encontram
emparelhadascomasrespectivasbasescomplementares.Existemvriosmtodosparapromovera
desnaturaodecidosnucleicos,nomeadamenteporaquecimento,aumentodepH,mtodosqumicos
(porex.,utilizaodeformaldedoquepromoveaformaodebasesSchiff,asquais,porsuavez,
impedemaformaodepontesdehidrognio),adiodeformamidaeabaixamentodaforainica.No
entanto,omtodomaisutilizadoindubitavelmenteatravsdoaumentodatemperaturadaamostrado
cidonucleico.
Nestetrabalhopretendesedeterminarexperimentalmenteatemperaturadedesnaturao(T m),oqual
estligadoestabilidadetrmicadamolculadecidodesoxirribonucleico(DNA)emestudo.Mandel
&Marmur(1968)determinaramqueestaestabilidadedirectamenteproporcionalaonmerodepares
guaninacitosina(GC)deumadadamolculadeDNA.Tmcorrespondetemperaturaqual50%
dasmolculasdeumdadocidonucleicoseencontramdesnaturadas(Fig.1).

Fig.1Curvadedesnaturaodeumcidonucleicoporaumentodatemperatura.Temperaturade
Desnaturao(Tm)correspondetemperaturaqualumadadamolculadeDNAseencontra50%no
estadodecadeiadupla(ds=doublestranded)e50%noestadodecadeiasimples(ss=single
stranded).

Procedimentoexperimental
1)PrepareumasoluodeSSC(NaCl0,15M;Citratodesdio0.015M;pH=7,0).
2)DissolvaasuaamostradeDNAemSSCdemodoaobterumaconcentraofinalde20gmL1.
3)ColoqueasuaamostraemumaclulaetapeacomParafilm.Verifiquequeamembranaplsticaque
colocoucomotampanointerferenasleiturasespectrofotomtricasarealizar.
4)Calibreoespectrofotmetrocomarespectivasoluodereferncia(branco)aumcomprimentode
ondade260nm.
5)Coloqueasclulascomasuaamostraeobranconumbanhoa25C.
6)Aguardealgunsminutosparaquesejaatingidooequilbriotrmicoentreoexterioreointeriordas
clulas.
7)Sequeoexteriordasclulasdobrancoedaamostra;calibrenovamenteoespectrofotmetrocomo
brancoeleiaaabsorvnciadasuaamostra.Estepassodeveserfeitoomaisrapidamentepossvel
paraimpedirqueasamostrasarrefeam.
8)Coloquenovamenteasclulasnobanho.
9)Aumenteatemperaturapara50Cerepitaospassos68.
10)Repitaopasso9paraasseguintestemperaturas:60,65,70,75,80C.
11)Aumente,sucessivamente,atemperatura2Catobservarumaumentodaabsorvncia,repetindo
ospassos68;quandoaabsorvnciacomearaaumentar,faaleiturasaumentandoatemperaturaem
apenas1C.
12)Corrijaosvaloresdeabsorvnciadevidoexpansodosolventeemrelaoaovalorobtidoa25C,
usandoosvaloresdaTabela1.EstesvaloressodesignadosporAt(A=absorvncia;t=temperatura).
13)ElaboreumgrficoemqueoeixodasabcissascorrespondetemperaturaemCeoeixodas
ordenadas,razoAt/A25.
14)DetermineoTmdasrespectivasamostrasdeDNA.DeterminetambmocontedoG+Cdasua
amostrautilizandoaseguintefrmula:
%GC=2,44(Tm69,3)

Bibliografia:
Mandel,M.&J.Marmur.(1968).Useofultravioletabsorbancetemperatureprofilefordetermining
theguaninepluscytosinecontentofDNA.MethodsEnzymol.12(B):195206.

Tabela1Quocienteentreovolumedeguaaumadadatemperatura(Vt)
emrelaoaovolumedeguaa25C(V25).

Temperatura(C)

Vt/V25

Temperatura(C)

Vt/V25

25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65

1,0000
1,0003
1,0005
1,0008
1,0011
1,0014
1,0017
1,0020
1,0024
1,0027
1,0030
1,0034
1,0037
1,0041
1,0045
1,0049
1,0053
1,0057
1,0061
1,0065
1,0069
1,0073
1,0078
1,0082
1,0087
1,0091
1,0096
1,0100
1,0105
1,0110
1,0115
1,0120
1,0125
1,0131
1,0135
1,0141
1,0146
1,0152
1,0157
1,0162
1,0168

66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105

1,0174
1,0180
1,0185
1,0191
1,0197
1,0203
1,0209
1,0215
1,0221
1,0228
1,0234
1,0240
1,0247
1,0253
1,0260
1,0268
1,0273
1,0280
1,0287
1,0293
1,0300
1,0308
1,0314
1,0321
1,0329
1,0336
1,0343
1,0351
1,0358
1,0365
1,0373
1,0380
1,0388
1,0396
1,0404
1,0411
1,0419
1,0426
1,0433
1,0441

Material:
Espectrofotmetro
Cloretodesdio
Citratodesdio
MedidordepH
Clulas
Micropipetas
Pontasamarelaseazuis
Tubosdemicrocentrfuga
4Tuboscomtampacomumvolumenoinferiora5mL(porturma)
Parafilm
Banhomariacomtermstato
Papelhiginico