FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUMICA
Alumno: _______________________________________ Cdigo: _________________
Alumno: _______________________________________ Cdigo: _________________
PRACTICA 1: EXTRACCION DE ADN Y VISUALIZACIN DEL ADN

OBJETIVOS:
1. Realizar la extraccin de ADN a partir de clulas humanas de la mucosa bucal
2. Discutir la importancia de la extraccin de ADN en la investigacin.
3. Analizar el efecto de los diferentes reactivos empleados en la tcnica de extraccin de ADN.
4. Comprender la utilidad de la tcnica de electroforesis en el estudio del ADN.
5. Ganar experiencia en el manejo y principio fundamental de una maquina moderna para la
cuantificacin del ADN.
1. FUNDAMENTO TEORICO
Los cidos nucleicos tienen como principales funciones la transmisin y expresin de la
informacin gentica. A travs de estas funciones determinan no solo la estructura sino que
tambin regulan todos los procesos fisiolgicos y metablicos de los seres vivos. Existen dos
tipos de cidos nucleicos, denominados cido desoxirribonucleico (ADN) y cido ribonucleico
(ARN), estos compuestos son polmeros de nucletidos, los cuales a su vez se conforman de
tres molculas diferentes (azcar pentosa, base nitrogenada y fosfato).
En las clulas eucariticas el ADN se encuentra en el ncleo asociado a protenas
denominadas histonas formando la cromatina. Tambin aparece en organelas como
mitocondrias y cloroplastos. (figura 1). En procariotes (Ej: bacterias) el ADN se localiza en el
citoplasma y no presenta una membrana de proteccin.

Figura No 1. Niveles de organizacin del ADN en clulas eucariotas. Tomado de La qumica del
genoma en Locos por la biologa. Julio 20, 2011. Disponible en la web:
http://locosporlabiologia.wordpress.com/2011/07/20/la-quimica-del-genoma/

El ARN es un tipo de cido nucleco de menor tamao que el ADN. Existen varios tipos de ARN:
mensajero (ARNm), ribosomal (ARNr) y de transferencia (ARNt) con diferentes funciones, todas
asociadas con la expresin de la informacin contenida en el ADN. El ARN es sintetizado en el
ncleo en el proceso de transcripcin y ejerce sus funciones en el citoplasma.
El estudio de la estructura y propiedades de los cidos nucleicos ha permitido la comprensin
de procesos asociados a mecanismos de enfermedades genticas e infecciosas, respuesta
inmune, desarrollo de clulas cancerosas y resistencia a antibiticos, los cuales han sido
empleados en una serie de campos de la salud. El anlisis de la secuencia de los cidos
nucleicos as como el desarrollo tecnolgico de sus procesos, han sido la base para el diseo
de vacunas, produccin de frmacos, mejoramiento de la calidad nutricional de especies
vegetales y animales, resistencia vegetal a plagas, control de enfermedades parasitarias,
terapia y regulacin gnica.
Los cidos nucleicos pueden ser aislados mediante la ruptura de la membrana celular y la
nuclear, dejndolos libres en el lisado celular, para su posterior limpieza y precipitacin. Esto se
consigue mediante choque osmtico (ej; NaCl 3M), homogenizacin mecnica, digestin
enzimtica (ej; proteinasa K) o tratamiento con detergentes (ej; SDS) o cidos (ej; HCl).
Despus de centrifugar para descartar las clulas intactas, organelas y restos de membranas, el
sobrenadante que contiene los cidos nucleicos solubles, es tratado con agentes como fenol,
mezclas de cloroformo-alcohol isoamlico o una solucin concentrada de sales (ej: cloruro de
sodio 5M) que permiten separar las protenas al desnaturalizarlas. El ADN que era soluble en la
fase acuosa se precipita despus de la centrifugacin. La preparacin de ADN puede ser de
mayor concentracin y pureza al adicionar etanol fro. Despus de ser secado y disuelto en un
buffer apropiado, el ADN puede ser visualizado mediante su separacin en un gel de agarosa y
tincin con un colorante como el Bromuro de etdio o el SYBR green. Bajo luz ultravioleta estas
molculas son fluorescentes y por estar unidas al ADN se pueden observar indirectamente las
molculas de ADN con un color producto de la capacidad de fluorescencia del colorante.
Estos mtodos de visualizacin son importantes ya que combinan la capacidad de los geles de
agarosa de separar las molculas de ADN por tamaos con la capacidad de observar cada una
de estas molculas debida al efecto del colorante.
Otra forma importante de analizar los cidos nucleicos es mediante su capacidad de absorber
luz ultravioleta. Esta caracterstica se usa principalmente para la cuantificacin de la
concentracin de cidos nucleicos en una solucin. En esta prctica tendr la oportunidad de
interactuar con uno de los equipos ms sofisticados y modernos para dicho fin, el NanoDrop.
Disfrute la prctica.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.
2.2 Equipos de proteccin personal
Usar durante todo el desarrollo de la prctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Est prohibido su intercambio con
los dems compaeros de laboratorio.
2.3 Manejo de Residuos qumicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos
generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:
1.

Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales estn
debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.

2.

Verter nicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y
potencialmente peligrosas. No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el
desarrollo de la prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del laboratorio,
quien le indicar la forma correcta de hacerlo.

3. METODOS
3.1 REACTIVOS:
Tabla 1. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

ITEM
Solucin de SDS al 10%
Etanol al 96%, fro a -20C
Solucin de NaCl 5M
Solucin de SYBR Green
Buffer TE (Tris-HCl10 mM /EDTA 1mM)
Agarosa
Agua destilada

CANTIDAD
5mL
20mL
60L
50 L para todo el curso
500 mL para todo el
curso
1g para todo el curso
-

3.2. MATERIALES
Tabla 2. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

ITEM
Probeta de 10mL
Pipeta graduada de 5mL
Pipeta graduada de 10mL
Propipeta
Micropipeta de 20L
Micropipeta de 100L
Pipeta Pasteur
Vaso de precipitados de 50mL
Vaso de precipitados de 100mL
Tubo Falcon de 50mL
Tubo eppendorf de 1,5mL
Caja de Petri
Plancha de calentamiento con agitador
Magneto

CANTIDAD x equipo
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
4
1 para todo el curso
1 para todo el curso
1 para todo el curso

3.3. EQUIPOS
ITEM
Camara de electroforesis pequea
Transiluminador Ultravioleta
Equipo NanoDrop

CANTIDAD PARA EL CURSO

1
1
1

3.4. PROCEDIMIENTO
I. EXTRACCIN DE ADN DE CLULAS DE MUCOSA ORAL
1. Deposite en una probeta una muestra de saliva (aproximadamente 5mL).
2. Tome 2,5 mL de la muestra y depostela en un tubo Falcon. Adicione 2,5mL de solucin SDS
al 10% y agite por inversin.
3. Adicione 50L de solucin de NaCl 5M y nuevamente agite.
3. Aada 10mL de etanol al 96% (debe estar a una temperatura de -20C). Agite por inversin
(muy suavemente).
4. Anotar observaciones.
5. Remover el ADN con una punta de micropipeta, y transferirla a un tubo eppendorf.
6. Secar el botn de ADN a 55C por 10 minutos.
7. Adicionar 1mL de Buffer TE. Agite por inversin.

VISUALIZACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS:

1. Se extrae 5L de la solucin de ADN y se pasan a un pozo en la caja de Petri que contiene
agarosa al 1% (preguntar al instructor).
2. Adicionar 1L de solucin SYBR Green en el pozo. Deje difundir durante 4 minutos y observe
bajo luz ultravioleta (transiluminador)*

*NOTA:

La exposicin al Ultravioleta puede quemar su retina irreversiblemente, y lastimar su

piel. Por ello, es imprescindible que use el equipo de proteccin adecuado.
El bromuro de etidio es un intercalador de DNA por ende mutagenico. Maneje con sumo
cuidado.
3. Usando una micropipeta de volumen apropiado mezcle 5 uL de la solucin de DNA con 10 uL
de SYBR Green (pregunte al instructor antes de proceder). Asegrese que las dos soluciones
estn bien mezcladas.
4. Con la ayuda de su instructor siembre la muestra en el pozo designado para ello en el gel
de agarosa al 1% provedo por el instructor.
5. Una vez los dems grupos hayan realizado la siembra proceda a conectar la cmara de
electroforesis a la fuente de poder y usar los valores recomendados por el instructor. No olvide
ver el gel al final de la prctica en el transiluminador.
6. Coordine con el instructor para llevar la muestra de ADN al nanodrop para medicin de la
absorcin de luz por la muestra. Tome nota de la absorbancia y de la longitud de onda utilizada
ya que este valor ser importante para medir la concentracin de AND presente en la muestra.

4. RESULTADOS
Anote los resultados obtenidos con cada una de las tcnicas de visualizacin de cidos
nucleicos.
Haga dibujos donde esquematice lo observado en cada caso. Organice los resultados para
presentar en el informe de laboratorio.

5. PREGUNTAS
1. Elabore un esquema del procedimiento realizado en la prctica.
2. Explique la funcin o fundamento de los siguientes reactivos en la extraccin de ADN:
a) El SDS
b) El cloruro de sodio
c) El etanol al 96%
3. Explique porque es posible observar el ADN con Luz UV cuando se tie con SYBR
Green o con Bromuro de etdio. Cul es el mecanismo de tincin de estos reactivos?

4. A qu parte de la estructura de la molcula del ADN se debe la absorcin de luz

ultravioleta observada en el nanodrop?
5. Usando los valores reportados en la literatura (investigue) y el valor de absorbancia
arrojado por el nanodrop calcule la concentracin de ADN presente en su muestra.
6. Explique en que se basa la separacin de molculas de ADN en geles de agarosa
usando como ejemplo lo que observ en el gel que se realiz en la prctica de
laboratorio.
6. Bibliografa.
1. Bioqumica de Stryer
2. Bioqumica de Lehninger
3. SAMBROOK J, FRITSCH E, MANIATIS T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd
edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold S, Spring Harbor Laboratory.1989.
4. Sitios de internet:

platea.pntic.mec.es/~cmarti3/bio/ADN/adn3/ppal.htm
www.hospitalameijeiras.sld.cu/.../...
http://www.hospitalameijeiras.sld.cu/hha/mpm/documentos/BIOLOGIA%20MOLE
CULAR%20Y%20GENETICA/GP/EXTRACCION%20DE%20DNA%20A%20PAR
TIR%20DE%20MUCOSA%20BUCAL.pdf