Procariotes

Laura Gmez, Camila Gmez y Diana Molina

Ingeniera Ambiental A

MARCO TERICO
El siguiente trabajo comprende el estudio de los principios de la preparacin de un
frotis bacteriano, la observacin de tincin Gram y simple a partir de su aplicacin
y desarrollo en la prctica de laboratorio.
Por ende, en primer lugar, es necesario iniciar con una breve definicin de lo que
es la tincin en general, segn (Definicinde, 2016) es un proceso y el resultado
de teir (otorgar un color a una cosa).
Para esto, se necesita de un microscopio y los materiales necesarios para llevar a
cabo las tinciones para cada muestra. En cuanto al microscopio, se ha de usar el
objetivo de 100x para garantizar una mejor resolucin y fijacin de la muestra.
Ahora, para la tincin simple, aqu es usado el cristal violeta, y como afirma
(Universidad Tecnolgica Nacional, 2009) El colorante utilizado sirve solo para
denotar la morfologa celular.
Y para la tincin Gram, se requiere el uso de cuatro pasos en los cuales se usan
cuatro soluciones, como se mencionara a continuacin:
Primer colorante (Cristal violeta): Es un colorante que cuando entra en contacto
con las clulas cargadas negativamente y cuando este reacciona con ellas, las
colorea.
Solucin mordiente (lugol): Es el encargado de fijar las tinciones, aumentando
as la afinidad entre el colorante y las clulas.
Agente decolorante (Alcohol cetona): Es un disolvente orgnico.
Colorante de contraste (Safranina): Es un colorante de distinto color que el
primer colorante.

Al terminar esta tincin, y al acercar la muestra al microscopio, aqu es donde se

apreciar el color de las bacterias. Si las bacterias toman un color azul, sern
Gram-positivas y si toman un color rosa, sern Gram-negativas. Ambas se
(Universidad Tecnolgica Nacional, 2009) tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. Lo anterior se
ilustrar a continuacin:

Tomado de:
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practi
co4.pdf

OBJETIVOS
1. Conocer los principios del cultivo de bacterias.
2. Reconocer las caractersticas microscpicas de las bacterias cultivables como
morfologa bacteriana y tipos de agrupaciones.
3. Reconocer algunas caractersticas de las colonias que crecen en medios de
cultivo.

METODOLOGA
1. Manejo del microscopio para observacin de las bacterias.

Primero se enfoc la muestra de las bacterias entregadas, luego se comenz a

visualizar por medio del microscopio empezando por el aumento ms bajo (4x) y
se fue incrementando (10x y 40x).
Para el ltimo aumento (100x) se utiliz una gota de aceite de inmersin sobre el
punto de luz en el que se us el tornillo micromtrico para obtener una imagen
ms clara.

1.1 Preparacin de un frotis bacteriano.

Primero se coloc una gota de agua en el portaobjetos limpio.
Segundo con el asa de siembra previamente flameada se traslad una cantidad de
cultivo bacteriano hacia la gota.
Tercero, se revolvi la mezcla hasta que quedara una forma homognea y se
extendi para formar una pelcula delgada.
Cuarto, se esper hasta que el lquido se evaporara.
Quinto, se fijaron las bacterias al portaobjetos con calor, luego, se pas por la
llama del mechero bunsen durante unos segundos.
Sexto, se agreg una gota de metanol para que la extensin de bacterias quedara
completamente seca y se retir el exceso de metanol, golpendolo sobre la mesa
de trabajo. Y por ltimo, se esper a que el metanol se evaporara completamente.

Tincin simple.
Se inici cubriendo el frotis con cristal violeta, se dej actuar durante 2 minutos,
luego se lav la preparacin con agua para eliminar el exceso de colorante, se
esper hasta que el portaobjetos se secara y por ltimo se observ la preparacin
en el microscopio con todos los objetivos, se utiliz aceite de inmersin para el
aumento de 100x.

Se dibuj la morfologa, segn la figura 3 (Morfologa bacteriana y tipos de

agrupaciones).

1.2 Tincin de Gram

Para esta tincin, primero, se hizo un frotis con el asa sobre el portaobjetos.
Segundo, se fij la muestra al calor sobre la llama del mechero.
Tercero, se agreg una gota de cristal violeta y se dej actuar por 1 minuto.
Cuarto, se lav el exceso de colorante con agua.
Quinto, se cubri la muestra con lugol durante 1 minuto.
Sexto, se lav el exceso de lugol.
Sptimo, se decolor con alcohol-acetona hasta que la preparacin perdiera el
color, esto se hizo durante 30 segundos.
Octavo, se lav con agua para eliminar el resto del disolvente.
Noveno, se ti con safranina por 1 minuto.
Dcimo, se lav con agua para retirar el colorante de contraste.
Onceavo, se sec la preparacin, y por ltimo, se observ la preparacin en el
microscopio con todos los objetivos donde se utiliz aceite de inmersin para el
aumento de 100x.

1.3 Manejo de muestras y toma del inculo para cultivo de bacterias

Primero, se comenz tomando el asa de siembra y se flame el filamento hasta
que este alcanzara un rojo incandescente. Segundo, se enfri en la proximidad de
la llama y se abri la muestra cerca al mechero y con el asa se tom un inculo.
Tercero, se sembr en el medio de cultivo estril donde se hizo estras como se
muestra en la gua. Cuarto, se cerr la caja de Petri y se coloc invertida y quinto
se incubo la muestra a 37C durante 24 horas.

RESULTADOS
Tabla 1. Imgenes de las bacterias a distintos aumentos.
Bacteri

Aumento 4x

Aumento 10x

Aumento 40x

Aumento 100x

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 6.

Figura 7.

Figura 8.

Types

Bocahu-mana

Morfologa bacteriana:

Figura 4: Bacilos
Figura 8: Cocos

Figura 9. Gota de agua en portaobjetos.

Figuras 10 y 10.1. Muestras de bacterias E-coli y S.A.

Figura 11. Calentando el asa bacteriolgica en el mechero bunsen.

Figura 12. Tomando una pequea muestra del cultivo de bacterias con el asa
bacteriolgica.

Figura 13. Poniendo la muestra del cultivo de bacterias sobre el portaobjetos.

Figura 14. Pasando la muestra sobre el fuego.

Figuras 15 y 16. Tincin simple con cristal violeta.

Figuras 17, 17.1 y 17.2. Tincin de Gram con cristal violeta, lugol y safranina

Figura 18. Muestra despus de usar alcohol cetona.

Figura 19. Muestras finales sobre portaobjetos.

Tabla 2. Bacterias con aumento 100x e identificacin segn su color (Grampositivas o Gram-negativas).
Bacteria

Tincin

Aumento 100x

Gram

E-coli

Negativo

Figura 20.

De Gram

S.A

Positivo
Figura 21.

Figura 22. Rplicas de los cultivos de bacterias originales.

Preguntas:
1. Cul es la funcin del aceite de inmersin?
Su funcin es aumentar la eficacia de los objetivos del microscopio.

2. Es posible cultivar todos los procariotes que existen?

Si, si se tienen datos sobre su reproduccin y se puede crear el hbitat ideal para
los organismos, se podran cultivar los procariotes.

3. Cules son los componentes bsicos de un medio de cultivo de bacterias?

Nutrientes, agua, sustancias orgnicas (carbohidratos), sustancias inorgnicas
(sales minerales), micronutrientes, agente solidificante (agar).

4. Segn sus observaciones, Cul es el tamao promedio de la bacteria E-coli?

De 0.5 a 2m.

DISCUSIN DE RESULTADOS
El experimento de apoyo (Annimo, 2016) tuvo como objetivo identificar
distintas clulas sanguneas como lo son los glbulos blancos (leucocitos) y rojos
(eritrocitos), a partir de varias formas de tincin (De Wright, de Giemsa, de Jenner
y de Pappenheim) con ayuda de un frotis sanguneo.
Teniendo en cuenta las tinciones mencionadas, el experimento afirma que
la tincin de Wright es una coloracin policromtica, pues al ser usada produce
diversos colores. Como resultado de este proceso, primero, se observ que los
glbulos rojos se tornaron color naranja o rosado, segundo, los ncleos de los

linfocitos y neutrfilos se tornaron color morado oscuro, los ncleos de los

monocitos, por su parte, se tornaron color morado claro.
En cuanto a la tincin de Giemsa, esta es usada para descubrir o identificar
posibles parsitos en la sangre. Como resultado, primero, se obtuvo que los
ncleos celulares se tornaron color morado intenso, segundo, los glbulos blancos
pequeos (granulacin eosinfila) se tornaron color pardo rojizo.
Seguidamente, para la tincin de Jenner, esta no produce ninguna
coloracin para los ncleos, no obstante, hizo que la coloracin de los glbulos
rojos fuese de color ms dbil, rojo plido.
Y por ltimo, para la tincin de Pappenheim, es la coloracin que resulta de
la combinacin de la tincin de Giemsa y la de Jenner, su funcin es resaltar el
color de los glbulos blancos y rojos.
Ahora,

en

comparacin

al

experimento

desarrollado

en

clase

Procariotes, se pudo observar que todas las tinciones tienen en comn pasos.
En primera instancia, la preparacin del frotis. Segundo, la adicin de los
colorantes y entre cada uno, un lavado con agua para eliminar el exceso de cada
uno de ellos. Y por ltimo dejar secar el frotis para posteriormente verlo a travs
del microscopio e identificar los microorganismos o clulas deseados segn la
coloracin adquirida al finalizar la tincin, como por ejemplo: las bacterias Grampositivas se tornaban color azul, mientras que las Gram-negativas adquiran un
color rosa.
Tambin que cada colorante requiere de un tiempo para actuar sobre el
frotis y poder, de este modo seguir ejecutando las siguientes tinciones.
Adems, en ambos experimentos se us el objetivo de inmersin (100x)
para alcanzar mayor resolucin de las muestras vistas a travs del microscopio.
En cuanto a las diferencias, el experimento citado, ilustr que las tinciones
(De Wright, de Giemsa, de Jenner y de Pappenheim) tomaban de dos a veinte

minutos sobre el frotis para actuar, mientras que la tincin simple y tincin de
Gram toman entre un minuto aproximadamente para actuar y ser lavadas.
En el experimento citado ya estaba predeterminado cual era la clula
sangunea, por su morfologa y estructura, a partir de esto, se quera observar qu
coloracin poda adquirir cada una de ellas, mientras que en el experimento hecho
en clase, se necesitaba de las coloraciones de las bacterias para definir lo que
eran (Bacterias Gram-positivas y Gram-negativas).

CONCLUSIONES
1. Fue posible observar e identificar la morfologa bacteriana con ayuda del
microscopio en el objetivo 100x, usando aceite de inmersin.
2. La tincin de Gram requiere de cuatro pasos y cuatro soluciones para generar
un resultado en cuanto al color de las bacterias, para posteriormente
clasificarlas en Gram positivas o Gram negativas.
3. Se aprendi a replicar cultivos de bacterias, con las herramientas adecuadas y
su debido proceso.
4. Ambas tinciones requieren de un frotis bacteriano, pero la tincin simple solo
necesita cristal violeta, mientras que la tincin Gram necesita de cuatro
soluciones como el cristal violeta, el lugol, alcohol cetona y safranina.
5. Las bacterias, en la tincin Gram se pueden identificar segn su color y
estructura, si es Gram positiva, su color ser azul y si es Gram negativa, su
color ser rosado.
6. Con ayuda del objetivo 100x, se pudo identificar la morfologa de las bacterias,
(Figuras 4 y 8).

REFERENCIAS

Annimo.
(2016).
Obtenido
https://qbhematologia.files.wordpress.com/2011/08/prc3a1ctica-3.pdf
Definicinde. (2016). Obtenido de http://definicion.de/tincion/

de

Universidad
Tecnolgica
Nacional.
(2009).
Obtenido
de
https://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologi
a/practico4.pdf