Identifikacija izolovane

kulture bakterija
Metode za brzu dijagnostiku
bakterijskih infekcija

Dijagnostika bakterijskih infekcija

bakterioloka dijagnostika:
dokazivanje bakterija u uzorku
seroloka dijagnostika:
dokazivanje specifinih antitela

Kako dokazujemo i identifikujemo

bakterije u uzorku?
Izolovanje bakterija i identifikacija - osnov
konvencionalne bakterioloke dijagnostike
Metode za dokazivanje i identifikaciju
bakterija bez izolacije

Dokazivanje i identifikacija bakterija

u uzorku
identifikacija bakterija
u kulturi

metode bez
kultivisanja

preparat sa kulture

preparat iz bolesnikog

kulturelne osobine

materijala

fizioloko - biohemijske

fizioloko - biohemijske

osobine

osobine (H. pylori)

detekcija antigena

detekcija antigena

detekcija gena

detekcija gena

detekcija toksina / patogenog

potencijala

Ispitivanje mikroskopskih osobina

bojenje po Gramu
oblik bakterija
veliina bakterija
raspored bakterija

prisustvo pojedinih
struktura bakterijske
elije (kapsula, spore,
granule...)
pokretljivost

Ispitivanje kulturelnih osobina

Posmatranje izgleda kolonija:
oblik
veliina
Filamentozne
ivice
boja
Nepravilne
povrina
Glatke
konzistencija
prisustvo
Hrapave
hemolize

Pljosnate (zaravnjene)
Uzdignute
Konveksne
Upupene (udubljene)
Ispupene

Ispitivanje kulturelnih osobina

kolonije nepravilnih ivica

glatke, sjajne, pravilne

kolonije

Ispitivanje kulturelnih osobina

sluzave kolonije

Ispitivanje kulturelnih osobina

hrapave kolonije

Ispitivanje kulturelnih osobina

prisustvo hemolize

Ispitivanje kulturelnih osobina

prisustvo pigmenta

Ispitivanje fizioloko-biohemijskih
osobina bakterija
Sposobnost bakterija da:
razlau odreene supstrate
produkuju enzime
...
Kako se dokazuju?
brzi testovi
kultivisanje bakterija u podlogama sa
odgovarajuim supstratom

Ispitivanje fizioloko-biohemijskih
osobina bakterija
testovi koji zahtevaju kultivisanje bakterija

Test razgradnje ugljenih hidrata

Negativno

Pozitivno

Urea agar

Negativno Pozitivno

Ispitivanje fizioloko-biohemijskih
osobina bakterija
brzi testovi

katalaza test
Pozitivno

Negativno

koagulaza test
Negativno

Pozitivno

esto korieni testovi za ispitivanje

fizioloko-biohemijskih osobina
1. razgradnja ugljenih hidrata (saharoza, fruktoza, maltoza.....)
2. produkcija katalaze
3. produkcija koagulaze
4. produkcija oksidaze
5. produkcija vodonik sulfida
6. produkcija indola
7. korienje citrata
8. produkcija ureaze

Ispitivanje fizioloko-biohemijskih
osobina

Klasini metod izolacije i

identifikacije bakterija
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Uzimanje uzorka
Uzorak u transportnom medijumu
Zasejavanje hranljivih podloga
Inkubiranje podloge 24 h
U sluaju potrebe izolovanja u istoj kulturi inkubiranje podloge 24 h
Identifikacija (zavisno od metode moe zahtevati jo
24 h)
Po potrebi antibiogram (24 h)

u proseku traje 2 do 4 dana

Automatizovani sistemi za
kultivisanje i identifikaciju bakterija
Aparati za brzu
detekciju porasta
bakterija
Aparati za brzu
identifikaciju bakterija
prethodno izolovanih
u kulturi

Aparati za brzu (ranu)

detekciju porasta bakterija
automatizovani sistemi za kultivisanje bakterija
Princip rada:
visoko osetljivi metodi za
detekciju porasta bakterija
(turbiditet, kolorimetrija,
fluorescencija, radiometrija,..)

Primena:
Za hemokulture i ostale uzorke iz sterilnih regija
Za spororastue bakterije (uzronik tuberkuloze)

Aparati za brzu (ranu)

detekciju porasta bakterija

16 - 24 h

vs.

4 - 6 nedelja vs.

4-8h
10 - 12 dana
(bacil tuberkuloze)

Automatizovan sistem za identifikaciju

bakterija izolovanih u kulturi

Metode za dokazivanje i
identifikaciju bakterija bez izolacije
Mikroskopiranje

Detekcija specifinih antigena

Detekcija gena

DNK

Preparat iz uzorka bojen po Gram-u

Na prepratu se uoava prisustvo:

elija (epitelne, leukociti,...)

jedan ili vie vrsta mikroorganizama (bakterije, kvasnice;
Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije)

Prednosti:
brzina, jednostavnost

Nedostaci:
nedovoljna osetljivost i specifinost

Preliminarna informacija o prisustvu bakterija poseban znaaj za uzorke iz primarno sterilnih regija
Dijagnoza se retko moe postaviti na osnovu
preparata

Preparat iz uzorka bojen po Gram-u

rezultati za 15 do 30 minuta

direktni preparat brisa rane:

Gram pozitivni bacili i elije

direktni preparat uretralnog

brisa mukarca = dijagnoza
gonoreje

Detekcija antigena bakterija

antigen - antitelo reakcije
u uzorku
u kulturi
aglutinacija (lateks,...),
imunofluorescencija, ELISA....
osetljive (?); specifine; rezultati za nekoliko
minuta do nekoliko sati

Molekularne tehnike u bakteriolokoj

dijagnostici
Dokazivanje specifine sekvence DNK:
u uzorku
DNK
u kulturi
- hibridizacija nukleinskih kiselina
- tehnike amplifikacije (PCR)
- sekvenciranje DNK (16S rRNK)

Molekularne tehnike u bakteriolokoj

dijagnostici

Identifikacija bakterija

Detekcija specifinih osobina bakterija

bakterije koje se ne kultiviu

bakterije koje sporo rastu ili teko rastu
potreba za brzim rezultatom
u sluaju prednosti nad biohemijskim testovima
toksini, faktori virulencije,...

Tipizacija bakterija u epidemiolokim

istraivanjima
(diferencijacija bakterija u okviru iste vrste)

Hibridizacija nukleinskih kiselina

denaturacija na 94C

dvolanana DNK

dva jednolanana DNK lanca

hibridizacija na 65C

jednolanana DNK
+
obeleena proba

hibrid DNK-proba

Prednosti i nedostaci molekularnih

tehnika
Prednosti
brzina

Nedostaci
detekcija samo poznatog

visoka specifinost i detekcija nevijabilnih

bakterija
(senzitivnost)
mogunost
korienja kada
klasine metode
nisu primenjive ili
nisu pouzdane

nemogunost razlikovanja
infekcije od kliconotva
visoka cena

Seroloka dijagnostika bakterijskih

infekcija
indirektna dijagnostika infekcije na
osnovu prisustva antitela
ograniena primena u bakteriologiji:
za detekciju bakterija kod kojih je
kultivisanje teko ili nemogue

Seroloka dijagnostika
bakterijskih infekcija
ogranienja: period prozora; lano
pozitivni i lano negativni rezultati
aglutinacija (direktna, indirektna); testovi
neutralizacije; imunofluorescencija; ELISA;
Western blot;...