ISPITIVANJE OSETLJIVOSTI

BAKTERIJA NA ANTIBIOTIKE I
HEMIOTERAPEUTIKE

ta je antibiogram?

Postupak za ispitivanje osetljivosti

bakterija na antibiotike i
hemioterapeutike

Metode antibiograma
Fenotipske
Difuzioni
metod

Dilucioni
metod

Genotipske
detekcija gena
rezistencije na
antibiotike

Kombinovani metod
(E test)
Automatizovani sistemi za
identifikaciju bakterija i ispitivanje
osetljivosti na antibiotike

MIK: minimalna inhibitorna koncentracija

najmanja koncentracija antibiotika
koja spreava rast i razmnoavanje
bakterija
MBK: minimalna baktericidna koncentracija
najmanja koncentracija antibiotika
koja izaziva smrt bakterija

Disk difuzioni metod antibiograma

Zasniva se na principu difuzije antibiotika kroz vrstu
hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom
bakterijskom kulturom.

Iz iste bakterijske
kulture uzeti 4-5
kolonija ezom

Pravljenje suspenzije
odreene gustine od
ispitivane bakterijske
kulture

Poreenje bakterijske
suspenzije sa
standardom odreene
gustine

Disk difuzioni metod antibiograma

Ravnomerno nanoenje bakterijske
suspenzije brisem na celu povrinu agara
(najee Mueller-Hinton) da bi se dobio
konfluentan porast

Bris natopiti suspenzijom

bakterija i ocediti viak
tenosti lakim pritiskom o
zidove epruvete

Pravilno

Nepravilno

Disk difuzioni metod antibiograma

Stavljanje diskova sa odreenim (standardnim)
koncentracijama antibiotika pincetom
Raspored diskova sa
antibioticima

Inkubacija u termostatu na 37C od 16 - 24 h

ta se deava tokom inkubacije?

1. bakterije se umnoavaju
2. antibiotik difunduje kroz podlogu
Koncentracija antibiotika postepeno i radijalno opada sa
udaljavanjem od diska sve do take gde vie nije
inhibitorna i gde se pojavljuje porast bakterija.
Nastaje zona inhibicije rasta.

37C
24 h
vrsta hranljiva
podloga zasejana
istom bakterijskom
kulturom

Antibiogram
diskovi

itanje
rezultata

Oitavanje rezultata disk difuzionog

metoda antibiograma
Zona inhibicije rasta: okrugla zona oko diska sa
antibiotikom u kojoj nema vidljivog porasta bakterija

Merenje prenika zone inhibicije

Tumaenje rezultata disk difuzionog

metoda
3 kategorije osetljivosti:

osetljiv verovatnoa uspeha terapije je

visoka nakon primene uobiajenih doza antibiotika,
datih na uobiajeni nain
I intermedijarno (umereno) osetljiv
mogui uspeh terapije ako se antibiotik da u
maksimalnim koncentracijama i pareneteralnim
putem
R rezistentan - nikada se ne primenjuje u
terapiji; bez obzira na dozu, terapija je vrlo verovatno
neuspena

Tumaenje rezultata disk difuzionog metoda

Dijametar zone inhibicije rasta

Primer preporuenih zona

Staphylococcus aureus

Uporediti izmerene
prenike zona inhibicije
ispitivane bakterije sa
standardnim
preporuenim zonama
za odreenu bakteriju i
odreeni antibiotik

Ampicilin

29

Imipenem

16

14-15

13

Meticilin

14

10-13

Hloramfenikol

18

13-17

12

Gentamicin

15

13-14

12

Ciprofloksacin

21

16-20

15

Trimetoprim+
sulfametoksazol

16

11-15

10

Vankomicin

15

Ampicilin

17

14-16

13

Imipenem

16

14-15

13

Hloramfenikol

18

13-17

12

Gentamicin

15

13-14

12

Ciprofloksacin

21

16-20

15

Trimetoprim+
sulfametoksazol

16

11-15

10

Escherichia coli

Meticilin

Vankomicin

28

Rezultati disk difuzionog metoda antibiograma

Disk difuzioni metod

Prednosti:
istovremeno se
ispituje osetljivost na
vei broj antibiotika
Jednostavan i jeftin
relativno brz (24 h)

Ogranienja:
ne moe se odrediti
MIK

Kvalitativan metod u rutinskoj upotrebi

Ogranienje kvaliltativnog metoda

antibiograma
Kvalitativna metoda - disk difuzioni metod
antibiograma (rezultati S, I, R)
postoji
opasnost od prevelike ili marginalno efektivne doze
Problematino!
Posebno kod tekih pacijenata sa invazivnim
bakterijskim infekcijama i sa primarnim osnovnim
oboljenjem (insuficijencija jetre, bubrega....) kod
kojih je vano precizno dozirati lek

Znaaj odreivanja minimalne inhibitorne

koncentracije (MIK) antibiotika
Poznavanje MIK odreenog antibiotika za dati
bakterijski soj koji je izolovan od pacijenta
omoguava individualno doziranje antibiotika
MIK se smatra referentnim kriterijumom za
definisanje osetljivosti mikroorganizama

MIKROBIOLOG
Odreivanje MIK antibiotika
za odreeni soj bakterija
izolovan od pacijenta
FARMAKOLOG
Poznavanje farmakolokih
parametara za taj antibiotik
(zadravanje u organizmu,
vreme eliminacije,
penetracija u tkiva...)
KLINIAR
Postavljanje ispravne
dijagnoze i sagledavanje svih
faktora rizika kod pacijenta

IZBOR NAJBOLJEG
ANTIBOTIKA U
ODGOVARAJUOJ
DOZI ZA DATOG
PACIJENTA

Mogunosti odreivanja MIK antibiotika

Dilucioni metod
antibiograma
Agar
dilucioni
metod

Bujon
dilucioni
metod

E test

Dilucioni metod antibiograma

dilucioni: niz dvostrukih razblaenja
antibiotika u odgovarajuoj podlozi
Prema podlozi u kojoj se prave
razblaenja antibiotika:
1. bujon dilucioni metod
2. agar dilucioni metod

Bujon dilucioni metod antibiograma

Bakterijska suspenzija
100 l

MIK: najmanja
koncentracija
antibiotika koja
inhibira porast
bakterija (bujon
ostaje bistar)

0,5

0,25

0,125

37C

MIK

0,06

0,03

Bujon
+
Antibiotik (g/ml)

24 h

MIK = 0,25 g/ml

Mikro bujon diluciona tehnika u

ploama za mikrotitraciju

Bujon dilucioni metod antibiograma

Prednosti:
mogunost
odreivanja MIK

Ogranienja:
ispituje se osetljivost
jedne bakterijske
vrste na jedan
antibiotik
sloena tehnika
izvoenja
trajanje > 24 h

Kombinovani metod
antibiograma: E test
Zasniva se na principu difuzije antibiotika kroz vrstu
hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom
bakterijskom kulturom.
Opadajui gradijent koncentracije antibiotika na E test traci.

12
8
4
3
2
1.5
1
.75
.50
.35
.25
.10
.05
.02
.01

12
8
4
3
2
1.5
1
.75
.50
.35
.25
.10
.05
.02
.01

37C

24 h

Plastina traka impregnirana

antibiotikom u gradijentu
koncentracije

Zona inhibicije: elipsa

E test i disk difuzioni metod:

razlike u zoni inhibicije

itanje rezultata E testa

vrednost MIK:
oitava se na skali
koncentracija na E test
traci
na mestu gde linija zone
inhibicije rasta preseca
ivicu E test trake

MIK

Interpretacija
Interpre
tacija
S.pneumoniae/PenG
S: 0.064
I: 0.125-1
R: 2 g/ml.

R
I
S

Rezultati E testa

E test
Prednosti:
direktno oitavanje
vrednosti MIK
istovremeno se
ispituje osetljivost na
vei broj antibiotika
jednostavan
relativno brz (24 h)

Ogranienja:
visoka cena

Automatizovani sistemi za istovremenu brzu

identifikaciju bakterija i ispitivanje osetljivosti na
antibiotike

1. Priprema suspenzije
bakterija

2. Unos bakterijske
suspenzije u panele sa
biohemijskim supstratima
3. Unos panela u aparat i antibioticima

4. Inkubacija u
aparatu; rezultati se
oitavaju posle 12/24
sata i tumae u skladu
sa preporukama

Molekularne metode za detekciju gena

rezistencije na antibiotike
Metode molekularne biologije - DNK probe, PCR
elije/tkivo
ili

uzorci

elektroforeza

Izolovana
DNK

Slika u gelu

Prirema PCR
reakcije

Amplifikacija
- PCR

Analiza dobijenog
PCR produkta

biblioteka

Umnoavanje
gena rezistencije
na antibiotik

Disk difuzionim metodom antibiograma

DA

Kojim metodama je
mogue utvrditi
vrednost MIK?

Bujon dilucionom metodom antibiograma

DA

Agar dilucionom metodom antibiograma:

DA

E testom:
DA

Molekularnim metodama
DA

Netano!!!!
Disk difuzioni metod antibiograma omoguava
kvalitativno ispitivanje osetljivosti bakterija na
antibiotike i vrednosti se izraavaju kroz kategorije
S, I, R

Tano!!!
Bujon dilucionim metodom antibiograma je mogue
kvalitativno ispitati osetljivosti bakterija na
antibiotike i vrednosti se izraavaju preko koncetracije izraene
u g/ml

Problematino, jer zahteva dosta vremena i komplikovan je

za izvoenje
Nije rutinska metoda

Tano!!!
Agar dilucionim metodom antibiograma je mogue
kvalitativno ispitati osetljivosti bakterija na
antibiotike i vrednosti se izraavaju preko koncetracije izraene
u g/ml

Problematino to zahteva dosta vremena i komplikovan je

za izvoenje
Nije rutinska metoda

Tano!!!
E test omoguava
jednostavno isitivanje osetljivosti bakterija na
antibiotike izvodi se kao i disk dufuzioni metod,
a rezultati se izraavaju preko g/ml

Problem je to su E test trake skupe

Koristi se za indikovane situacije (teki pacijenti, izolati bakterija iz
primarno sterilnih regija)

Netano!!!!
Molekularnim metodama je mogue utvrditi
prisustvo gena rezistencije na neki antibiotik, ali ne i
vrednost MIK

SKRAENICE ANTIBIOTIKA

A
Conet
Cef3
Met
Chl
G
Cip
B
V

Ampicilin
Imipenem
Ceftriakson (Longaceph)
Meticilin
Hloramfenikol
Gentamicin
Ciprofloksacin
Trimetoprim+sulfametoksazol (Bactrim)
Vankomicin

Razblaenje antibiotika:
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,06
0,03