Protease, atau, yang mengikuti rekomendasi dari NC-IUB (komite nomenklatur IUB,

peptida-peptida, yang merupakan kelas enzim hidrolase dan di antara beberapa

enzim aktif pada tulang punggung dari polipeptida. Beberapa ratus enzim ini
dikenal dan, secara umum, mengkatalisis reaksi hidrolisis yang sama dati ikatan
peptida (dua kelas spesifik disajikan pada kotak 12 dan 13). Orang mungkin
bertanya mengapa aktivitas seperti kekuatan berguna bagi ahli kimia organic yang
tertarik pada sebuah katalis yang memediasi dengan tepat pada suatu hidrolisis
ikatan polipeptida. Sebagai katalis, realita untuk definisi akrab dalam kimia,
protease mengubah tingkat keseimbangan termodinamika reaksi dicapai, tetapi
tidak mengubah bahwa kesetimbangan itu sendiri. Ini pasti menyiratkan bahwa
enzim ini bekerja reversibel di kedua arah reaksi. Konstanta kesetimbangan untuk
reaksi sebaliknya pada kisaran 10-3 sampai 10-4 L mol-1. Akibatnya, mudah untuk
mengenali bahwa dengan enzim yang paling efisien, protease tidak dapat bertindak
sebagai katalis universal dan sempurna untuk dapat membentuk ikatan. Beberapa
kelemahan, terutama:
1. pembentukan setidaknya dua produk sintesis, yaitu bahwa yang diinginkan dan
asil donor dihidrolisis, karena aktivitas hidrolitik asli enzim;
2. paling penting, kekhususan dari protease yang tersedia tidak memungkinkan
semua produk yang diinginkan untuk dirakit dan, karenanya, hanya reaksi dengan
senyawa terkait erat dengan residu asam amino yang disukai adalah relevansi
praktis sedangkannon-proteinogenic gugus asam amino tidak substrat biasanya
diterima;
3. khususnya di sintesis dengan peptida lagi, ada risiko permanen sisi-reaksi
proteolitik dari kedua senyawa awal dan produk yang terbentuk;dan
4. pelarut, aditif, dan kondisi reaksi dapat sangat mempengaruhi aktivitas enzim
dan stabilitas. Karena sifat protease yang jauh dari alat yang sempurna untuk
mengkatalis suatu spektrum yang luas dari sintesis organik, terutama yang berbasis
pada aktivitas terbalik dr enzim
Upaya lebih lanjut yang menentukan bagi mengatasi keterbatasan ini - untuk
menekan kompetitif asil hidrolisis donor, untuk mengubah spesifisitas enzim, dan
untuk menekan proteolitik sisi-reaksi yang tidak diinginkan. Banyak perhatian telah
dikhususkan untuk pendekatan untuk rekayasa media sintesis di mana Reaksi
dilakukan (lihat juga Bab 6.3 dan 6.4). Secara historis studi ini telah terutama
difokuskan pada penyelidikan pada perilaku protease terhadap organic pelarut,
awalnya digunakan sebagai co-pelarut dan kemudian pelarut murni praktis tanpa
kadar air. Ini harus, bagaimanapun, harus diingat bahwa selain pelarut organik
pendekatan-pendekatan lain yang berguna untuk memanipulasi sifat enzim.
Meskipun kurang populer, setidaknya jika jumlah publikasi yang dianggap sebagai
satuu-satunya kriteria, ini termasuk studi media dingin dan beku, di cairan
superkritis seperti karbon dioksida dikompresi atau propana, dan padat menjadi

padat pada sistem reaksi. Sejumlah besar tinjauan dokumen pembangunan yang
mengesankan ini dan menyoroti aspek-aspek penting dari Biokatalisis senyawa nonberair secara rinci. Selain itu, review baru-baru ini meliputi temuan terbaru dan
yang paling penting di seluruh bidang protease. Karena diskusi tentang topik ini,
meskipun
menarik, terhalang oleh keterbatasan ruang, kontribusi ini tentu selektif dan
berfokus pada dua pendekatan yang efisien lain berdasarkan rekayasa dari substrat
(reaktan) dan enzim itu sendiri.
5.2 Rekayasa substrat
Jika reaksi selanjutnya tak diinginkan yang diamati selama sintesis katalis protease
itu begitu penting diurai oleh enzim. Reaksi samping ini hanya menunjukkan bahwa
spesifisitas enzim untuk donor asil tidak bohong cukup di atas spesifisitasnya untuk
produk peptida. Karena perubahan structural dalam asam amino blok bangunan
dari reaktan dikesampingkan, gugus pergi dari donor asil, esensial bagi memediasi
penerimaan dari bagian asil dalam pendekatan kinetis dikendalikan socalled, tetap
hanya variabel untuk menekan reaksi kompetitif. Manipulasi gugus pergi yang
spesifik pada komponen karboksil umumnya digunakan dalam praktek. Upaya ke
arah ini awalnya reaksi diaktifkan dengan reaktan peptida yang terurai sensitif dan
akhirnya menyebabkan pengembangan dari '' pendekatan 'mimetics substrat'.
5.1.3 Konsep klasik Manipulasi gugus pergi
Persyaratan struktural untuk substrat protease adalah kehadiran asam amino
tertentu di rantai C dari bagian asil, misalnya Arg atau Lys di kasus tripsin. Donor
asil kekurangan spesifik asam amino, oleh karena itu, biasanya bukan target untuk
sintesis protease terkatalisasi. Juga, karena berbeda spesifisitas protease terhadap
gugus asam amino diakui oleh enzim, hanya
5.1 Pembentukan Protease terkatalisasi oleh donor asil dengan residu asam
amino yang paling spesifik di rantai C dapat ditambah tanpa sisi-reaksi proteolitik.
Sebaliknya, kopling yang kurang spesifik
gugus asam amino hasil berhasil hanya jika reaktan peptida tidak
mengandung salah satu rekan-rekan yang lebih spesifik. Dalam kasus di mana
perbedaan antara kekhususan yang kurang jelas, meninggalkan manipulasi
kelompok dapat digunakan untuk
meningkatkan spesifisitas donor asil awalnya kurang spesifik atas bahwa dari
lebih spesifik dan, dengan demikian, lebih pembelahan-sensitif asam amino bagian
yang terletak di dalam
reaktan. Pendekatan umum ini ditunjukkan sepuluh tahun yang lalu oleh Jakubke

et al. [3] dan sejak itu telah dikonfirmasi beberapa kali [2]. Meninggalkan
manipulasi kelompok juga telah ditemukan untuk menjadi sarana umum yang
bermanfaat meningkatkan aktivitas enzim menuju awalnya kurang spesifik donor
asil dan, dengan demikian, untuk mempercepat laju reaksi. Secara khusus, laba
sintesis skala preparatif dari reaksi yang lebih tinggi
tingkat meninggalkan donor asil kelompok-rekayasa. Misalnya, sekitar 90% dari
protease clostripain mahal bisa diselamatkan hanya dengan menggunakan Z-LysSBzl bukan Z-Lys-OMe sebagai donor asil dalam reaksi pertama dari sintesis
bertahap dari
yang sangat trifungsional tetrapeptide H-Lys-Tyr-Arg-Ser-OH [4]. Berbeda dengan
efek pada laju reaksi, hanya efek marginal dari kelompok meninggalkan pada
produk
hasil yang diharapkan, karena pembentukan spesies enzim identik asil
yang harus menjalani partisi identik ke dalam produk peptida dan
kompetitif terhidrolisis asil donor. Meninggalkan perbedaan yang berhubungan
dengan grup dalam produk
hasil hanya dapat hasil dari konsumsi asil donor tidak lengkap atau perbedaan
antara tingkat hidrolisis spontan dari donor asil yang berbeda.
5.1.4
Substrat mimetics-dimediasi Sintesis
Berbeda dengan manipulasi kelompok meninggalkan klasik berfokus pada adaptasi
kelompok meninggalkan untuk memenuhi kekhususan S0 subsite protease, di
substrat
mimetics kelompok meninggalkan dimanipulasi untuk mengikat ke situs aktif enzim
(S1
posisi; notasi subsite menurut Ref. [5]; Kotak 15). Alam itu sendiri dapat dianggap
sebagai prototipe semacam ini rekayasa substrat. Memang, peptidil transferase
ribosom, ahli alam untuk pembentukan ikatan peptida, tidak mengakui asam amino
yang digabungkan tapi tRNA untuk yang diesterifikasi. Ini
Strategi memungkinkan sintesis peptida di kedua cara tertentu dan universal yang
menggunakan enzim tunggal hanya untuk mengkatalisis ikatan dapat formasi
langkah. dalam substrat

mimetics pergeseran lokasi dari bagian spesifik dari peptida ini Cterminus ke dalam
kelompok meninggalkan juga disertai dengan pergeseran aktivitas enzim,
memungkinkan serin dan sistein protease untuk bereaksi dengan asam amino nonspesifik atau
urutan peptida (Scheme 5.1.1). Yang penting, untuk kegiatan yang luar biasa ini
tidak ada manipulasi lebih lanjut, baik enzim atau media reaksi, yang, pada
prinsipnya,
perlu. Contoh pertama dilaporkan mimetics substrat seperti itu asil-4amidino dan -4-guanidinophenyl ester (Kejaksaan Agung) (Skema 5.1.2, senyawa 2
dan 3)
yang ditemukan diakui oleh protease awalnya Arg-spesifik hampir
independen dari urutan peptida masing-masing [6]. Menariknya, ini non-kekhususan
untuk bagian asil sama berlaku untuk asam l amino kode dan rekan-rekan mereka
dconfigured dan bahkan untuk sterik terhalang, satu-dialkylated amino
asam.
Keumuman pendekatan ini telah dibuktikan oleh penelitian dari Glu-spesifik
V8 protease; ini mendirikan mimetics substrat pertama, thioesters karboksimetil
(SCM), untuk protease-non-arginin spesifik [7]. SCM bagian 6 dipilih secara empiris,
atas dasar kesamaan struktural dekat dengan sisi-rantai
spesifik residu Asp dan Glu. Menariknya, meskipun spesifisitas terbatas V8
protease, kelompok SCM ditemukan untuk bertindak sebagai meniru cocok mediasi
penerimaan gugus asil awalnya non-spesifik, seperti yang ditemukan ester
Kejaksaan Agung
dan protease Arg-spesifik. Akhirnya, perpanjangan mimetics substrat pendekatan
untuk
kelas sintetis penting ketiga protease, yang khusus untuk amino aromatik
Asam gugus, telah dijelaskan untuk Chymotrypsin sebagai contoh [8]. Pendekatan
docking computerassisted telah digunakan untuk memprediksi fungsi kelompok
Kejaksaan Agung
sebagai situs pengakuan buatan untuk enzim ini; ini akhirnya dikonfirmasi oleh
reaksi sintesis peptida.

Penerapan mimetics substrat untuk sintesis polipeptida lagi memerlukan kombinasi

dengan metode kimia, terutama fase padat sintesis peptida (SPPS; Box 25), untuk
menyediakan akses ke rantai panjang reaktan mimesis substrat.
Masalah ini awalnya ditangani dengan menggunakan strategi resin oxime [9].
Dengan menggunakan ini
Pendekatan dan Boc kimia beberapa ester peptida dalam bentuk mimetics substrat
yang berbeda disintesis dan telah kemudian menjabat sebagai komponen karboksil
untuk trypsin-, V8 protease-, dan kimotripsin-katalis kondensasi fragmen. Lagi-chain
mimetics substrat juga dapat dibuat dengan Fmoc SPPS oleh
memanfaatkan strategi resin keselamatan menangkap. pembelahan Aminolytic atau
thiolytic dari diaktifkan
peptida-resin linkage menghasilkan mimetics substrat siap ligasi enzimatik. Oleh
menggunakan pendekatan ini dan clostripain sebagai katalis versi asam amino
semua-d
WW domain dari manusia peptidil-prolyl-cis / trans-isomerase Pin1 (Kotak 1)
memiliki
disintesis dengan hasil yang baik dan kemurnian yang sangat baik (Scheme 5.1.3)
[10].
Selain peptida linier, mimetik substrat mendekati juga memungkinkan sintesis
dari isopeptides [11]. Prasyarat untuk kegiatan ini adalah penggunaan iso-jenis sub
strategic mimesis yang mengarahkan aktivitas sintesis intrinsik protease ke
rantai samping karboksil bagian dari Asp dan Glu (Scheme 5.1.4). Mirip dengan
mimetics substrat linear, iso-jenis rekan menanggung ester meninggalkan grup
spesifik lokasi
yang, bagaimanapun, terkait dengan bagian o-karboksil dari Asp dan Glu bukannya
di C-terminus dari donor peptida. arsitektur yang berbeda ini menyebabkan
pergeseran
dalam kegiatan sintetis enzim ke sisi-rantai Asp dan Glu; ini akhirnya
hasil dalam pembentukan isopeptides.
Lebih efisien daripada metode lain, mimetik substrat memungkinkan protease untuk
bereaksi

tidak hanya dengan asam amino non-spesifik kode, tetapi juga dengan non-amino
donor asil acidderived. Dengan menggunakan Kejaksaan Agung ester dari 4phenylbutyric asam (PBU-Kejaksaan Agung) dan
asam benzoat (Bz-Kejaksaan Agung) sebagai donor, berbagai amida asam amino
dan peptida sebagai
akseptor asil, dan clostripain dan kimotripsin sebagai katalis yang sesuai
produk peptida isosteric bisa diperoleh di hasil yang sangat baik [8, 12]. Dengan
menggunakan
spesifisitas unik clostripain terhadap komponen amino pendekatan bisa
bahkan diperluas untuk sintesis berbagai N-linked neo-peptidoglikan.
Pendekatan ini memungkinkan kopling selektif gugus karboksilat berasal dari
rantai samping dari Asp, Glu, dan C-terminus peptida baik dengan monomer
sederhana dan dengan karbohidrat yang sangat kompleks, misalnya d-glukosamin,
dgalactosamine, asam muramic, dan moenomycin A (Scheme 5.1.5) [13]. bahkan
dapat
obligasi sepenuhnya struktur luar peptidic menjadi sasaran sintetis dari
pendekatan. Misalnya, asam yang diturunkan non-amino komponen karboksilat,
misalnya PBU-Kejaksaan Agung dan Bz-Kejaksaan Agung, dan sejumlah besar
komponen amino non-peptidic, misalnya alifatik dan amina aromatik, alkohol amino,
non-a-amino
asam karboksilat, dan diamina, telah efisien ditambah [12]. Untuk menyimpulkan,
ini
Kegiatan yang luar biasa membuka kemungkinan baru mudah sintesis dari
spektrum yang luas dari peptida linier, isopeptides, semua-d peptida, peptida
isosteres, peptidekonjugat karbohidrat, dan non-amino amida asam karboksilat asam yang diturunkan
di bawah
kondisi ringan yang luar biasa tidak bisa diraih dengan pendekatan protease klasik.