Gua de Prctica de Microbiologa General

Primera unidad
1. Tema N 4: Cultivo de microorganismos

1. EQUIPOS/MATERIALES y REACTIVOS A UTILIZAR EN LA PRCTICA:

Material Biolgico:
1. Cultivo en caldo nutricio, de mezcla de 5 especies bacterianas. Incubacin a 37C por 24 hrs.
2. Muestras de agua de regado, tierra, leche, regin nasofarngea, conservas contaminadas, agua de mar,
orina, procesos supurativos externos y secreciones vaginales y uretrales.
3. Tres placas de agar corriente o nutritivo.
4. Tres ms para demostracin de aislamiento por difusin.
5. Un frasco con agar fundido.
6. Un tubo con agua destilada estril, un tubo vaco estril, asa de siembra y varilla de vidrio estriles, pipetas
Pasteur, hisopos, gradillas, lpiz graso o plumn, batera de coloracin Gram.
7. Microscopio, centrfuga y estufa graduada a 37C.

2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
7.1 PRECAUCIONES ANTES DE REALIZAR EL AISLAMIENTO
1. Limpiar con alcohol la mesa de trabajo.
2. Desinfectarse las manos con alcohol para eliminar las bacterias de nuestras manos y as no contaminar
los medios de cultivo.
3. Conectar 3 mecheros a las llaves del gas y prenderlos, regularizando en oxgeno.
4. Esterilizar el asa hasta que obtenga un color rojo vivo, dejarlo enfriar en un extremo del agar.
5. Tomar una gota de la muestra y comenzar el estriado. Evitar destapar completamente la tapa de los
medios de cultivo para evitar contaminacin.
6. Repetir el proceso segn la tcnica de estriado que se utilice, girando la caja y esterilizando el asa cada
vez que se gire la casa, sin tomar muestra.
7. La tcnica general de siembra depender de:
a) Estado fsico del material a sembrar (slido o lquido)
b) Estado fsico del medio de cultivo (agar o caldo)
c) Ambiente en el cual crece el microorganismo (aerobiosis, microaerofilia o anaerobiosis)

7.2 AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACAS PETRI

A.- AISLAMIENTO POR EL MTODO DEL ESTRIADO
Aplicar el mtodo de Estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes.
TCNICA N1
1. Agitar el tubo que contiene la muestra problema
2. Con la mano derecha, calentar el asa de siembra en aro al rojo vivo.

3. Con la mano izquierda sostener el tubo que contiene muestra problema; destapar el cultivo con el dedo meique y
margen cubital de la mano derecha. Flamear la boca del tubo.
4. Despus de enfriar el asa de siembra durante 5 segundos, retirar los microorganismos del tubo de la
muestra problema con el asa de siembra. Evitar tocar las paredes del tubo.
5. Flamear nuevamente la boca del tubo.
6. Tapar el tubo y colocarlo en la gradilla.
7. Nuevamente, tomar con la mano izquierda la placa Petri con agar, descansando la base sobre los dedos medio,
anular y meique; el ndice acta de bisagra y con el pulgar, levantar la tapa lo suficiente para el paso del asa
cargada. Esta operacin se realiza a la altura del mechero encendido.
Descargar el inoculo con el asa de siembra en un punto marginal de la superficie del medio y con el asa misma, realizar
las estriado utilizando el mtodo estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes, cuidando de no
romper el medio
8. Finalmente flamear nuevamente el asa (Ver los pasos 1 -8 , en la figura 9 )
9. Rotular datos sobre el dorso de la placa Petri sembrada as: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha.
10. Colocar las placas en la estufa en posicin invertida e incubar a 37C por 24 h. Mediante la incubacin de las
placas de manera invertida, el problema de la humedad en la cubierta se reduce al mnimo.
Resultados:
A las 24 h, evaluar y observar colonias aisladas en la placa. Reportar en el informe de Laboratorio las
caractersticas morfolgicas de las colonias aisladas segn la Figura 13

Figura 9. Rutina para inocular una placa petri

Estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes:

1. Divide la placa de Petri en cuatro partes iguales con un marcador permanente.
2. Flamear el asa y dejar enfriar (puede enfrarlo tocando una porcin no usada del agar cercano a la
periferia del mismo)
3. Tomar un inculo de la muestra problema
4. Colocamos el inculo en el extremo de la placa.
5. Con el asa de siembra se distribuye el inoculo varias veces con estras en forma de ZIGZAG en S, con
escasa separacin unas de otras (1-3 mm) en el cuadrante 1. (Figura 10 )
6. Gire el plato de Petri 90 y toque con el asa una esquina del cultivo en el
cuadrante 1 y arrstrelo varias veces a travs del cuadrante 2. El asa no
debe entrar de nuevo al cuadrante 1
7. Gire el plato de Petri 90. Repita el paso N 6 en el cuadrante 3
8. Sin flamear de nuevo, repita el paso N 7, comenzando en una esquina del
cuadrante 3 y arrastrndola al cuadrante 4. No deje que el asa toque los
cuadrantes 1 a 3.

No flamear el asa entre estra y estra, de tal forma que en el cuarto cuadrante, al ir agotando la
muestra del asa, tendremos los microorganismos aislados. (Figura 10)
9. Finalmente, tapar la placa, dejando caer suavemente la tapa con el control de los dedos pulgar e ndice

Figura 10. Mtodo de estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes

Recomendaciones para el mtodo de estriado por agotamiento:
- Es importante no volver a repasar el cuadrante que ya hemos sembrado (a excepcin del primer
cuadrante). Para conseguir que al final de la estra tengamos colonias aisladas
- Es importante no cruzar las estras (no tocar con el asa la estra anterior) para reducir el inculo a
cada estra y obtener colonias aisladas. Puede, alternativamente, flamear el asa al terminar cada
cuadrante y tocar la punta del asa la ltima estra anterior para ir arrastrando un pequeo inculo a la
siguiente estra.
- Tambin es importante que en los primeros cuadrantes hagamos la estra ms junta y en los ltimos
dos cuadrantes hagamos las estras ms separadas

B.- AISLAMIENTO POR DISEMINACIN

Se practica mediante la pipeta Pasteur estril o pipeta graduada para la toma del inoculo. Esta, por la capilaridad,
permite el ascenso del inoculo el cual es depositado en un margen del medio y esparcido sobre el medio de cultivo con
una esptula de Digralsky.
La placa Petri del cultivo debe destaparse lo suficiente como para permitir la estrecha penetracin de la esptula de
siembra; as se evita la contaminacin. Ver los pasos de la tcnica en la parte experimental.
PROCEDIMIENTO.1.-Tomar el inoculo de la muestra problema con la pipeta Pasteur y depositar una gota sobre el medio de la placa Petri,
que descansa en posicin normal sobre la mesa.
2.-Devolver el sobrante al tubo de cultivo.
3.-Destapar con la izquierda la placa Petri, lo necesario para introducir la esptula de Digralsky y diseminar la gota por la
superficie del medio.
4.- Desechar la esptula en el frasco bactericida. .
5.- Rotular: nmero de grupo, tipo de siembra y fecha.
6.- Incubar igual a los mtodos anteriores.
NOTA: En caso de cultivo muy turbio, el inoculo debe ser muy pequeo. Si est diluido, inocular en el medio ms de una
gota.

Resultados:
A las 24 h, evaluar y observar colonias aisladas en la placa. Reportar en el informe de Laboratorio las
caractersticas morfolgicas de las colonias aisladas segn la Figura 13

Figura 11. Mtodo de aislamiento por diseminacin

C.- AISLAMIENTO POR DIFUSIN.

Se practica de preferencia en ANLISIS CUANTITATIVOS BACTERIANOS. Por ejemplo, una muestra de agua en la
que se desea conocer el nmero de microorganismos por ml.
PROCEDIMIENTO.E! profesor har la demostracin con una muestra de tierra a 3 diluciones: 10 1, 102 y 103. Para los fines de la tcnica
seguir cuidadosamente lo indicado por el instructor luego de la demostracin.
1. Tome una pipeta estril y transferir 1 ml de la muestra problema a un tubo con 9 mL de ADE (Tubo 1)
2. La muestra problema es diluida primero al 1/10, 1/100, 1/1000, etc. de acuerdo a la turbiedad.
3. Se toman alcuotas (1ml) de cada dilucin
4. Se depositan separadamente en placas Petri vacas y estriles.
5. Sobre cada una de las placas se vierte agar fundido (10-15 ml) y enfriado a 45C. La mezcla se agita
moderadamente con movimientos ondulantes. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma
homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
6. Se espera a que el medio solidifique, se rotulan los datos y se incuban las placas en posicin invertida, a 37C.
Las placas de cultivo para incubacin se colocan invertidas para evitar que el agua de condensacin de la cara
interna de la tapa humedezca la superficie. Se asegura el crecimiento de colonias aisladas.

7. A las 24 horas aparecern colonias aisladas en superficie y profundidad, a diferentes planos. Estas ltimas, de
forma lenticular y de dimetros diversos. Los clculos matemticos de las cuentas es motivo de otra prctica.
Resultados:
A las 24 h, evaluar y observar colonias aisladas en la placa. Reportar en el informe de Laboratorio las
caractersticas morfolgicas de las colonias aisladas segn la Figura 8

Figura 12. Mtodo de aislamiento por difusin

ESTUDIO DE LA MORFOLOGA DE LA COLONIA
Registrar las caractersticas morfolgicas de las colonias (Forma, Elevacin, Borde, Superficie, Pigmentacin,
Apariencia general, Tamao) despus de realizar los 3 mtodos de aislamiento y registrar lo siguiente:

FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide.

ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umbilicada.
BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc.
COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color
blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
OPACIDAD: Transparente, opaca, etc.
CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa
bacteriolgica para determinar la consistencia.
TAMAO: Estimar el dimetro en mm.

Figura 13. Caractersticas morfolgicas de colonias bacterianas

3. RESULTADOS O PRODUCTOS

4. DISCUSION:
5. CONCLUSION:
6. CUESTIONARIO:
1. Explique por qu los siguientes pasos son esenciales durante el aislamiento de microorganismos:
a. Flamear el instrumento de inoculacin antes y despus de cada inoculacin.
b. Sostener las tapas de los tubos en la mano como se hizo.
c. Enfriar el instrumento de inoculacin antes de obtener el inculo.
d. Flamear el cuello de los tubos inmediatamente despus de destaparlos y antes de volver a taparlos.
2. Usted tiene un cultivo lquido mixto y desea obtener cultivos puros. Cmo procedera?
3. Por qu se utiliza una aguja para aislar colonias individuales de una placa sembrada por estras?
4. Cmo puede determinar si la colonia que se eligi para aislar es un cultivo puro?

5. En una placa de agar nutritivo se tiene una colonia con bacilos Gram positivos endosporados mezclados
con bacilos no formadores de endospora. Usted requiere salvar el bacilo endosporado en cultivo puro.
Consulte un mtodo apropiado para obtener este tipo de bacteria. Haga un esquema.
6. El hecho de obtener bacterias de una misma colonia, con morfologa diferente, ejemplo bacilos largos y
formas cocoides, o con diferente reaccin a la coloracin de Gram, nos permite afirmar que no se trata
de un cultivo puro. Explique por qu no se trata de un cultivo puro
7. Describa las caractersticas morfolgicas de Bacillus subtilis.
8. Cul es el objetivo o finalidad del mtodo estriado por agotamiento?
9. Mencione brevemente el proceso de purificacin de un aislamiento bacteriano obtenido en una placa de
agar slido.
10. Porque se deben incubar las placas en posicin invertida?
11. Explique brevemente mediante un esquema la metodologa para realizar siembra por diseminacin y
difusin. Realice un esquema para ambos.
12. Cules son las diferencias de sembrar microorganismos en medio slido y lquido. Cul cree que es
mejor usar para obtener colonias aisladas?
13. Definir los siguientes trminos:
a) Esterilizacin
b) cultivos mixtos
c) Cultivo puro o axnico
d) Subcultivo
e) Siembra
f) Aislamiento
g) Colonias:
h) Unidades Formadoras de Colonias
i) Estriar:
j) Estriado por agotamiento

Referencias bibliogrficas consultadas y/o enlaces recomendados

LANSING M. PRESCOTT. 2004 Microbiologa. Quinta Edicion. Mc Graw Hill.

(Biblioteca UC: 616.01 / P85 2004)

SIEMBRA Y AILAMIENTO.
Disponible en web

https://conalepfelixtovar.wordpress.com/2012/09/26/tecnicas-y-metodos-de-aislamiento-yseleccion-de-microorganismos/
http://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/09/tecnicas-de-semeadura.html