Henry

Laboratorio
en el
Diagnostico Clinico
Homenaje a
Todd-Sanford & Davidsohn
John Bernard Henry, M.D.
Distinguised Service Professor Director. Pathology 200 College of Medicine Dirce
lo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program Attending
Pathologist, University Hospital Siale University of New York Upstate Medical Un
iversity Syracuse, New York
Frederick R. Davey, M.D.
Prolessor and Chair. Department ot Pathology. State University ot New York Upsta
te Medical University. Syracuse. New York
Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D.
Prolessor ol Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; C
hair. Department ot Pathology and Laboratory Medicine. Harbor Veterans Affairs M
edical Center. Brooklyn. New York
Chester J. Herman, M . D , Ph.D.
Professor ot Pathology, Emory University School ol Medicine: Director. Pathology
. Grady Health System, Atlanta. Georgia
Gregory A.Threatte, M.D.
Professor ot Pathology; Director ot Core Laboratories and Outreach. Upstate Medi
cal University. Syracuse, New York
Richard A. McPherson, M.D.
Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot Clinical Pathology. Department ot Pat
hology. Medical College ot Virginia. Virginia Commonwealth University; Director.
Clinical Pathology. Medical College ot Virginia Hospitals, Richmond. Virginia
Gail L. Woods, M.D.
Prolessor ot Pathology; Director. Clinical Microbiology. University of Texas Med
ical Branch. Galveston. Texas

Contenido
Seccin I. Patologa clnica / Medicina de laboratorio
Gregory A. Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.
1. L a b o r a t o r i o clnico: o r g a n i z a c i n , objetivos y p r c t i c
a
John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec,
M
S.HIASCPI
3 50 60 79 92 108 138 148
DiM.WiUam
K
Dcnwyler.M.7
2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m d i c a
Gregory A. Threatte, M o
...
3. Principios de i n s t r u m e n t a c i n
. .
Andy N.D. Nguyen. MSM. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard He
nry, M D.
4. A u t o m a t i z a c i n d e l l a b o r a t o r i o clnico
Rodney S. Markin, /no, cft.O.
5. I n t e r p r e t a c i n de los resultados de l a b o r a t o r i o
Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. i o.
6. I n f o r m t i c a , t r a t a m i e n t o de i m g e n e s e i n t e r o p
e r a b i l i d a d
Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD
7. Estadstica e x p e r i m e n t a l
Gregory A. Tetrault. M.D.
8. G a r a n t a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clnico
Gregory A. Tetrault, M.D.
Seccin II. Qumica clnica
Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.
9. Evaluacin de la funcin r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r l i t
o s , e q u i l i b r i o cido-base y gases sanguneos
D. Roben Dufour, M D
159
10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b l i c o s , ionesinorgnicos y m a r c a
d o r e s b i o q u m i c o s del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o
Elena Nkolova Hrstova, M D, John Bernard Henry. M D

180 21 I 224 249 264 281 304 335

11. H i d r a t o s de c a r b o n o
Paul . Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD
12. Lpidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a
Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M
. Rifikind, MD.FR.CP
13. P r o t e n a s especficas
Richard A. McPherson. M o
14. E v a l u a c i n de la f u n c i n y el d a o h e p t i c o
D. Roben Dufour. M D
/5. E n z i m o l o g a clnica
D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD
16. Evaluacin de la f u n c i n e n d o c r i n a
Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o
17. Toxicologa y m o n i t o r i z a c i n t e r a p u t i c a de f r m a c o s
Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.

III

Seccin III. Orina y otros fluidos

Gregory A. Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.
18. E x a m e n bsico de la o r i n a
Christine Fller, M), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D
367 403 425 432 446
19. L q u i d o c e f a l o r r a q u d e o , sinovial y lquidos serosos del o r
g a n i s m o
Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D
20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g a y la e v a l u a c i n de la f e
r t i l i d a d
Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D
21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologas de r e p
r o d u c c i n asistida
AndrVan Steirteghem.MD.PhD.
22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de l
a gestacin
Robert Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi..
23. D i a g n s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s
gastrointestinales y pancreticas
David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.
462
Frederick R. Davey, MD.,
John Bernard Henry, M.D.
24. E x a m e n bsico de la sangre
Michael W. Morris.
M S , DLMIASCPISH.,
479
M D
Frederick R. Davey.
25. H e m a t o p o y e s i s
Frederick R. Davey. Mo, Robert . Hutchison. MD
520 542 586 623 . . 642 660 718 . . 776 806
26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s
M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D
27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos
Robert . Hutchson, M D, Frederick R. Davey, M.D
28. P l a q u e t a s en sangre
Jonathan L Miller, MO .Ph .D.
29. C o a g u l a c i n , fibrinlisis e h i p e r c o a g u l a c i n
Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .

30. I n m u n o h e m a t o l o g a
WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,ohn Bernard Henry, Mo
31. M e d i c i n a transfusional
Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO
32. H e m a f r e s i s
Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D
33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y clulas m a d r e
Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISB. John Bernard Henry, M D
Seccin V. Inmunologa e inmunopatologa
Richard A. McPherson, M.D., John Bernard Henry, M.D.
34. V i s i n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o
r n o s inmunolgicos
Richard A. McPherson, M.D.
817 821
35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u m i c a
Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura,
M
D
36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l
u l a r
850
He/ene MA Paxton. M.SMTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, . Maurice R.G. 0 Gorman,
M.Sc...D/ABMUI
V

Contenido
37. E v a l u a c i n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b
u l i n a s y la i n m u n i d a d h u m o r a l
Richard A. McPherson, MD
878 892 914
38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i
n
Ene Wagner, pto. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD
39. C i t o c i n a s y m o l c u l a s de a d h e s i n
HD o n s Massey, MD. FI D. DO S . Richard A. McPherson, M D
40. A n t g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o
r de histocompatibilidad del h o m b r e
Armead H. Johnson. iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.us
n.MD,udnh A.Wade. 8 k
927 949 963
41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e
r m e d a d
julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD
42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s
Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.
43. Evaluacin clnica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s r e u
m t i c a s sistmicas
Carlos Alberto Yon Mhlen,
MO.F*D..
974 990 1000 1016
Roben M. Nakamura.
M O
44. Vasculitis
Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.
45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecficas
David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D
46. E n f e r m e d a d e s alrgicas
Henry A. Homburger.MD.
47. D i a g n s t i c o y m a n e j o d e l c n c e r m e d i a n t e m a r c a
d o r e s t u m o r a l e s serolgicos
Jomes T.Wu. rto
1028
Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD
48. Infecciones vricas
Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD

1045 1072 1088 1119 1131 1144 1158

Fred W.Westenfeld.
MIIASCPISM
49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsas y m i c o p l a s m
a s
Gail L Woods, D . David H. Walker, MD
50. B a c t e r i o l o g a m d i c a
barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O
51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s
Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo
52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s
Michael 8. Sm;(i, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gai
l L Woods. M D
53. M i c o b a c t e r i a s
Gail L Woods. MD
54. E n f e r m e d a d e s m i c t i c a s
Washington C.Wmn.jr,
MD.MRA,
55. P a r a s i t o l o g a m d i c a
Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,ames W. Smith, MD.
1196 1241
56. P a t o l o g a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas
Martn G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D
57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnstico de las
e n f e r m e d a d e s infecciosas
Gail L. Woods, MD
1254
V

Contenido
Chester, J. Hermn. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.
58. I n t r o d u c c i n a la p a t o l o g a m o l e c u l a r
Chester / Hermn. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D
1273 1275 1287 1296 1304 1333 1344 1355 1372
59. Diagnsticos m o l e c u l a r e s : tcnicas y principios bsicos
Ehzabelli R. Unger.
PIo.
MD,
Margaret A. Piper.
PhD.MP.H.
60. R e a c c i n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologas
de amplificacin
james C. Zimring, MD. PID. Frederick S. No/te, no.
61. Tecnologas de la h i b r i d a c i n en serie
jacques Scnrenzet. M o Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.
62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n t i c a en la p a t o l o g a m
o d e r n a
Constance K. Stein, PhD.
63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnstico m o l e c u l a
r
Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coreton T. Garren, MD..PI
.D.
64. O n c o p r o t e n a s y d e t e c c i n t u m o r a l p r e c o z
.
Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William K
oslosky, M o., William Appruzzese, PhD.
65. T c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnstico de neoplasias h e m a t
o p o y t i c a s
David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD
66. D i a g n s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genticas
Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.
67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m
o r f i s m o y o t r o s m a r c a d o r e s genticos
Herbert F. Polesky, M D.
1390 1402
68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e anlisis d e l A
D N
Vctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H
1. Soluciones fisiolgicas, t a m p o n e s , indicadores cido-base, m a t e r i a
l e s de r e f e r e n c i a e s t n d a r y t a b l a de conversin de t e m p e

r a t u r a s 2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l

r p o r a l ( I M C ) 3 . C l c u l o a p r o x i m a d
anguneo t o t a l ( V S T ) 4. Tabla p e r i d i c a de
U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a
H. Peter Lehmann. Pt 0, jolin Bernard Henry, MD
1417 1420 1424 1425 1426
.. ...
VI

e ndice de m a s a c o
o d e l v o l u m e n s
los e l e m e n t o s 5 .
l ( S I )

Autores
Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D. Staff Pathologist. Veterans Affairs Med
ical Center; Assistant Professor. State University of New York Upstate Medical U
niversity, Syracuse. New York R a y m o n d D. Aller, M.D. Clinical Professor. D
epartment of Pathology and Laboratory Medicine. Emory University School of Medic
ine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical Affairs and Informatics. MDS Labo
ratory Services (United States). Nashville. Tennessee W i l l i a m A p p r u z
z e s e , Ph.D. Staff Member and Clinical Assistant Professor. Department of Env
ironmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons. New York. New
York Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D. General Manager. Research Laboratories. I
ncorporated. Tokyo. Japan Fujirebio
M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D. Professor of Bacteriology (Medical Microb
iology). Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit, National University
of Ireland, Galway; Consultant Microbiologist. University College Hospital Galw
ay. Galway. Ireland M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D. Technical Director. Ad
vocate Shared Services Laboratory. Park Ridge, Illinois C h a r l o t t e C u n
n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D. Professor, Departments of Medicine.
Pediatrics, and Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine. New York. New Yor
k S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D. Professor of Immunol
ogy: Vice. Chair of Academic Affairs, Department of Pediatrics; Director. The Im
munology Research Laboratory, Weill Medical College of Cornell University, New Y
ork. New York F r e d e r i c k R. Davey, M.D. Professor and Chair, Department o
f Pathology. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse.
New York J u l i o C. D e l g a d o , M.D. Instructor. Department of Pathology.
Harvard Medical School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory. Dana-Farber
Cancer Institute, Boston. Massachusetts M a r g o A . D e n k e , M.D. Associate
Professor. University of Texas Southwestern Medical Center. Dallas. Texas W i l
l i a m K. D e t t w y l e r , M.T. Senior Consultant. Health Systems Concepts.
Incorporated. Longwood. Florida D. R o b e r t D u f o u r , M.D. Professor of
Pathology. George Washington University Medical Center, Washington. DC; Clinical
Professor of Pathology. Uniformed Services University of the Health Sciences. B
ethesda. Maryland; Chief. Pathology and Laboratory Medicine Service. Veterans Af
fairs Medical Center. Washington. DC. M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D As
sociate Professor and Vice Chairman. Department of Pathology. University of Texa
s Medical Branch, Galveston. Texas A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z
, Ph.D. Associate Professor. Medical College of Virginia. Virginia Commonwealth
University; Technical Director of Molecular Diagnostics. Medical College of Vir
ginia Hospitals, Virginia Commonwealth. University. Richmond. Virginia
Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D. Professor (retired). The Johns Hopkins Univers
ity School of Medicine. Baltimore. Maryland Ulysses J . Balis, M O Instructor in
Pathology. Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital. Boston. M
assachusetts W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B Assistan
t Professor. Department of Clinical Laboratory Science, State University of New
York Upstate Medical University, Syracuse, New York M i r i a m Blitzer, Ph.D. P
rofessor and Chief, Division of Human Genetics. Department of Pediatrics. Univer
sity of Maryland, Baltimore. Maryland L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A
. Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine and Pathology, University
of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore
Medical Center, Neptune. New Jersey Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.
D., D.P.H. Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of
Physicians and Surgeons, New York, New York D a v i d J . B y l u n d , M.D. Lab
oratory Director. Scripps Reference Laboratory. San Diego. California Laura C o
o l i n g , M . D . M.SC. Assistant Professor. Department of Pathology. Universi
ty of Michigan Medical School; Assistant Director, Blood Bank and Transfusion Me
dicine, University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan
vii

M i c h a e l M. F r a n k , M.D. Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pedia

trics, and Professor of Immunology and Medicine, Duke University Medical Center,
Durham. North Carolina T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D. Associate P
rofessor, Department of Laboratory Medicine, University of Washington; Head, Cli
nical Microbiology Division. University of Washington Medical Center. Seattle. W
ashington C h r i s t i n e E. Fuller, M D . Fellow, Department of Pathology, Wa
shington University School of Medicine; Fellow. Department of Pathology, BarnesJewish Hospital, St. Louis, Missouri C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D .,
Ph.D. Professor of Pathology, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth
University; Medical Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of P
athology, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond. Virginia W a y n e W
. G r o d y , M.D., P h . D Professor. Divisions of Molecular Pathology and Medi
cal Genetics, Departments of Pathology and Laboratory Medicine and Pediatrics, U
CLA School of Medicine: Director, Diagnostic Molecular Pathology Laboratory, UCL
A Medical Center, Los Angeles, California R o b e r t J . H a r t z m a n , C A
P T , M C , U S N , M.D. Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment Pro
gram and Research Program, Naval Medical and Research Insitute, Bethesda. Maryla
nd R a n d a l l T. H a y d e n , M.D. Director. Clinical Microbiology, St. Jude
Children's Research Hospital. Memphis, Tennessee D a v i d G. H e i s i g , M.D
. Associate Professor of Medicine. Department of Medicine, State Universit of Ne
w York Upstate Medical University Syracuse. New York J o h n B e r n a r d H e n
r y , M.D. Director, Pathology 200, College of Medicine; Distinguished Service
Professor; Director, Transfusion Medicine & Transfusion Medicine Fellowship; Hem
apheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage Testing Laboratories; Attending Pa
thologist, University Hospital. State University of New York Upstate Medical Uni
versity, Syracuse, New York C h e s t e r J. H e r m a n , M.D.. Ph.D. Professor
of Pathology, Emory University School of Medicine; Director. Pathology, Grady H
ealth System, Atlanta. Georgia
J o n a t h a n R. H i b b s , M.D. Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth
Center. New York State Department of Health. David Axelrod Institute, Albany, Ne
w York H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D. Professor of Laboratory Medicine,
Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine. Rochester, Minnesota J
o a n H . H o w a n i t z , M.D. Vice Chair, Department of Pathology. State Uni
versity of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings County Hospital
Center, Brooklyn. New York E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D. Res
ident in Anatomic and Clinical Pathology. State University of New York Upstate M
edical University, Syracuse. New York C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S MT<A
SCP)SBB Adjunct Assistant Professor, Clinical Laboratory Science, College of Hea
lth Professions; Supervisor, Histocompatibility, Immunogenetics and Progenitor C
ell Bank, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New
York C a r o l y n K a t o v i c h H u r l e y , Ph.D. Professor. Department of
Microbiology. University Medical Center. Washington.
Georgetown DC
R o b e r t E. H u t c h i s o n , M.D. Professor of Pathology. Director of Clin
ical Pathology, and Director of Hematopathology, State University of New York Up
state Medical University. Syracuse, New York H a i x i a n g J i a n g , M . D ,
Ph.D. Assistant Research Professor. Department of Pediatrics. Duke University M
edical Center, Durham, North Carolina A r m e a d H. J o h n s o n , Ph.D. Profe
ssor, Department of Pediatrics, Georgetown University Medical School, Washington
. DC Y a s u s h i K a s a h a r a , Ph.D., D.M.SC Visiting Professor. Kyorin Un
iversity School of Public Health: Research Fellow. Keio University of Medicine.
Tokyo, Japan C a r l R. K j e l d s b e r g , M.D. Professor and Chair. Departme
nt of Pathology, University of Utah: University Hospital (Laboratory Services) C
hairman and Pediatric Pathology (Laboratory Services) Chairman. University of Ut
ah Hospital and Primary Children s Medical Center. Salt Lake City, Utah
viii

Autores
Paul E. K n u d s o n , M.D. Associate Professor of Medicine, Division of Endocr
inology. Diabetes and Metabolism: Joslin Diabetes Center. State University of Ne
w York Upstate Medical University. Syracuse, New York W i l l i a m K o s l o s
k y , M.D. Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New Yor
k A n t h o n y S. K u r e c ,
M.S., H ( A S C P ) D L M
R i c h a r d A . M c P h e r s o n , M.D. Professor of Pathology; Chair. Divisi
on of Clinical Pathology, of Virginia. Department of Pathology. Medical College
Virginia Commonwealth University; Director.
Clinical Pathology. Medical College of Virginia Hospitals. Richmond. Virginia J
o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D. Professor of Pathology; Director of Acade
mic Aftairs. Department of Pathology: Director of Special Hematology Laboratory.
Syracuse, New York M i c h a e l W. M o r r i s , Professor.
M.S.. D L M I A S C P I S H
Clinical Associate Professor. Department of Clinical Laboratory Science, College
of Health Professions: Administrator for Pathology Marketing and University Pat
hologists Laboratories, State University of New York Upstate Medical University.
Syracuse. New York M i c h a e l L a p o s a t a , M.D.. Ph.D. Professor. Depar
tment of Pathology: Director of Clinical Laboratories. Harvard Medical School. B
oston, Massachusetts R i c h a r d S. L a r s o n , M.D.. Ph.D. Assistant Profes
sor, Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Labor
atory Director, University Hospital Rapid Response Laboratories. University Hosp
ital. Albuquerque. New Mexico H. Peter L e h m a n n , Ph.D. Professor Emeritus.
Department of Pathology. Louisiana State University Medical Center. New Orleans
. Louisiana J o h n A. Lott, Ph.D. Professor. Department of Pathology, The Ohio
State University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio State University Hosp
itals, Columbus. Ohio R o d n e y S. M a r k i n , M . D . Ph.D. Professor and V
ice Chair, Department of Pathology and Microbiology: Associate Dean for Clinical
Aftairs. College of Medicine, University of Nebraska Medical Center. Omaha. Neb
raska H. D a v i s M a s s e y , M . D , Ph.D., D.D.S. Chief Resident in Patholo
gy. Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Vir
ginia Rex M. M c C a l l u m , M.D. Associate Clinical Professor of Medicine. Di
vision of Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke University School
of Medicine; Vice Chair for Clinical Services. Department of Medicine. Duke Univ
ersity School of Medicine and Hospital. Durham. North Carolina
University Hospital,
State
University of New York Upstate Medical University.
Department of Clinical Laboratory Science;
Manager. Department of Pathology. University Hospital. State University of New Y
ork Upstate Medical University, Syracuse. New York R o b e r t M . N a k a m u r
a , M.D. Professor. Departments of Immunology and The Scripps Experimental and
Molecular Medicine.
Research Institute: Senior Consultant and Chairman Emeritus, Department of Patho
logy. Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla. California A n d y N.D.
N g u y e n , Associate Professor. Director.
M S M E , M.D.
Department of Pathology.

University of Texas Medical School at Houston; Hematology Laboratory and Chemist

ry Memorial Hermann Hospital. Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director.
Coagulation Laboratory. Houston, Texas W a l t e r W . N o l l , M.D Professor o
f Pathology. and Molecular Genetics Dartmouth-Hitchcock Lebanon. Dartmouth Medic
al School. Diagnostic Laboratories, Center, Hanover. New Hampshire; Director. Cl
inical Chemistry Medical
New Hampshire
F r e d e r i c k S. N o l t e , Ph.D. Associate Professor. Medicine, Laboratory
Director, Laboratories, Atlanta. Pathology and Laboratory Clinical Microbiology
and Emory Medical Georgia Emory University School of Medicine;
Molecular Diagnostic Laboratories.
M a u r i c e R . G . O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi) Associate Profess
or-Pediatrics. Northwestern Diagnostic The University Medical School; Director.
Immunology and Flow Cytometry Laboratories. Children's Memorial Hospital. Chicag
o. Illinois
ix

Autores
H e l e n e M.A. P a x t o n , M.S., M T I A S C P ) Vice President of Manufactu
ring. Regulatory Affairs and Research and Development, PanBio InDx, Incorporated
. Baltimore. Maryland D a v i d H. P e r s i n g , M.D.. Ph.D. Medical Director.
Infectious Disease Research Institute; Vice President, Diagnostics Research. Co
rixa Corporation, Seattle. Washington M i c h a e l A. Pfaller, M.D. Professor.
Department of Pathology; Director, Molecular Epidemiology and Fungus Testing Lab
oratory, University of Iowa College of Medicine. Iowa City, Iowa M a t t h e w R
. P i n c u s , M . D , Ph.D. Professor of Pathology. State University of New Yo
rk Downstate Medical Center; Chair. Department of Pathology and Laboratory Medic
ine, Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York A l v a r o A .
P i n e d a , M.D. Professor of Laboratory Medicine and Director of Transfusion
Medicine Fellowship Program. Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Med
icine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota M a r
g a r e t A. Piper, Ph.D.. M . R H . Senior Consultant. Technology Evaluation C
enter. BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois H e r b e r t F. Pole
sky, M.D. Professor (retired), Department of Laboratory Medicine and Pathology,
University of Minnesota School of Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Dir
ector, Memorial Blood Centers of Minnesota, Minneapolis, Minnesota B a r b a r a
S. R e i s n e r , Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology: Associat
e Director. Clinical Microbiology Laboratory, University of Texas Medical Branch
. Galveston, Texas Basil M. R i f k i n d , M.D., F.R.C.P. Special Assistant for
Clinical Studies,
S i d d h a r t h a Sarkar, Ph.D. Clinical Professor, Department of Pathology: D
irector. Andrology Service. University Hospital, State University of New York Up
state Medical University. Syracuse, New York Jacques Schrenzel, Assistant Profes
sor. Consultant. Division University Hospital. M.D Geneva University Medical Sch
ool: of Infectious Diseases, Geneva Geneva, Switzerland
G r e g o r y P. S m i t h , M.D. Assistant Clinical Professor. Department of Pa
thology. University of Utah; Staff Pathologist, Department of Pathology. St. Mar
k's Hospital. Salt Lake City. Utah J a m e s W . S m i t h , M.D. Professor Emer
itus. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School
of Medicine, Indianapolis, Indiana M i c h a e l B. S m i t h , M.D. Assistant
Professor; Associate Director, Clinical Microbiology and Laboratory Information
System. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas C o n s t a n c e K
. S t e i n , Ph.D. Associate Professor of Pathology and Pediatrics; Director of
Cytogenetics and Associate Director of Molecular Diagnostics. University Hospit
al. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York
E v a n A . S t e i n , M . D , Ph.D.. F.C.A.P Voluntary Professor. Pathology an
d Laboratory Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio: President and
Chief Executive Officer, Medical Research Laboratories, Highland Heights, Kentu
cky R o b e r t L. S u n h e i m e r , M.S., M T ( A S C P ) S C Associate Profe
ssor in Clinical Laboratory Science. State University of New York Upsate Medical
University, Syracuse, New York G r e g o r y A. Tetrault, M.D. Medical Director
, Shared Laboratory Services. Chesapeake, Virginia
L.C..
National Institutes
G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D. Professor of Pathology; Director of Cor
e Laboratories and Outreach, Upstate Medical University, Syracuse, New York E l
i z a b e t h R. U n g e r , Ph.D., M.D. Acting Chief, Human Papillomavirus Sect
ion. Centers for Disease Control and Prevention; Clinical Associate Professor, D
epartment of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medic
ine. Atlanta. Georgia x

of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute. Division of Heart and Vasc
ular Diseases, Bethesda. Maryland R h o n d a K. Roby, M . R H Senior Forensic S
pecialist, Human Identification, Applied Biosystems. Foster City, California

Autores
E l i z a b e t h M . V a n C o t t , M.D. Director, Coagulation Laboratory, Mas
sachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Boston. Massachusetts A n d
r e V a n S t e i r t e g h e m , M.D.. Ph.D. Full Professor, Medical School; S
cientific and Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine, Medical Sch
ool and University Hospital, DutchSpeaking Brussels Free University. Brussels. B
elgium D a v i d S . V i s w a n a t h a , M.D Assistant Professor. Department o
f Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Staff Hematopathologis
t. University of New Mexico Health Sciences Center. Albuquerque. New Mexico C a
r l o s A l b e r t o Von M i i h l e n , M.D.. Ph.D. Full Professor of Rheumato
logy and Internal Medicine, Pontifical Catholic University School of Medicine, P
orto Alegre, RS, Brazil J u d i t h A. W a d e , B Sc. Professor, Department of
Surgery, and Faculty of Medicine, University of Toronto; Formerly Head, Histocom
patibility Laboratory, Toronto Hospital University Health Network, Toronto. Onta
rio. Canada Eric W a g n e r , Ph.D. Immunologist, Ste-Justine Hospital, Quebec,
Canada
R o b e r t E. W e n k , M.D.. M.S. Clinical Professor of Pathology. Pennsylvani
a State University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate Professor of Human
Genetics, University of Maryland; Attending Pathologist, Division Head of Clinic
al Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland F r e d W. W e s t e n f e l d
, M T ( A S C P > S M Clinical Faculty. University o Vermont: Microbiology Manag
er (Chief Technologist) Fletcher Allen Health Care. Burlington. Vermont D a v i
d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D. Professor and Chairman, Department of Pat
hology; Professor of Health Administration. Medical College of Virginia Campus.
Virginia Commonwealth University. Richmond, Virginia W a s h i n g t o n C . W i
n n , Jr., M . D , M.B.A. Professor of Pathology. University of Vermont College
of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory, Fletcher Allen Health
Care. Burlington, Vermont J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D. Assistant Profes
sor. Department of Pathology and Laboratory Medicine; Associate Director of the
Blood Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center: Associate Medical Di
rector. Central Kentucky Blood Center; Director of Transfusion Service. Cooper D
rive Division of the Veterans Affairs Medical Center, Lexington, Kentucky Hemaph
eresis Gail L. W o o d s , M.D. Professor of Pathology; Director. Clinical Micro
biology, University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas J a m e s T . W u
, PhD Professor of Pathology, University of Utah Health Science Center; Director
of Special Chemistry Laboratory. Associate Regional University Pathologists (AR
UP). Salt Lake City. Utah M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D. Associate Pro
fessor of Clinical Pathology, Northwestern University Medical School. Chicago: S
taff Pathologist, St. Francis Hospital. Evanston, Illinois E d m o n d J . Y u n
i s , M.D. Professor, Department of Pathology. Harvard Medical School: Director
. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer Institute. Boston. Massachusetts J a m e s
C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D. Pathology Resident, Department of Pathology and
Laboratory Medicine, Emory University. Atlanta. Georgia
Montreal.
D a v i d H. W a l k e r , M.D. Professor and Chairman. Department of Pathology;
Director, World Health Organization Center for Tropical Diseases. University of
Texas Medical Branch. Galveston, Texas Victor W . W e e d n , M . D , J.D. Prin
cipal Research Scientist and Director of Biotechnology and Health Initiatives, C
arnegie Mellon University, Pittsburgh. Pennsylvania R u t h S. W e i n s t o c k
, M . D , Ph.D. Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes and Metab
olism; Medical Director. Joslin Diabetes Center. State University of New York Up
state Medical University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs Medical Center,
Syracuse, New York E d u a r d o D e l a f l o r W e i s s , M.D. Attending Path
ologist and Director, Transfusion Service, Monmouth Medical Center, Long Branch,
New Jersey

CAPTULO 33

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CLULAS M A D R E
811
de la sangre perifrica tanto de pacientes como de donantes normales e incluso de
placenta o sangre de cordn.
Clulas madre de sangre perifrica
El impulso para el desarrollo de tecnologas que permitieran la recogida de CMH de
sangre pentrica fue su uso potencial para trasplante autlogo, en que el riesgo de
contaminacin de la mdula con clulas tumorales es alto. Debido a la relativa facili
dad de recogida de mdula sea por hemafresis, las clulas madre obtenidas de sangre pe
rifrica se usan de forma creciente en el entorno alognico. Un rea de gran importanc
ia puede ser la donacin de no familiares o voluntarios, en la que ms individuos pu
eden prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donacin de mdu
la cuando la hemafresis se ofrece como opcin frente a la recogida tradicional de md
ula sea. El procedimiento e instrumentacin utilizados para la recogida de clulas ma
dre de sangre perifrica se describen el Capitulo 32. De forma clara, la mayor ven
taja de las clulas madre obtenidas de sangre perifrica frente a la mdula sea es el t
iempo de injerto de neutrfilos y plaquetas, con una media de 8 a 12 das para las cl
ulas madre de sangre perifrica frente a las dos a cuatro semanas de la mdula sea (G
ianm, 1989). Esta rpida recuperacin claramente reduce la morbimortalidad asociada
por neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia
hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y dems. Se saba
que las CMH estaban presentes en sangre perifrica tras la recuperacin de la quimi
oterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el desarrollo de sistemas de he
mafresis que permitieran una recogida segura de un adecuado nmero de estas clulas p
ara proporcionar el injerto al receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988).
En la mayor parte de pacientes para trasplante autlogo. se ha establecido actualm
ente la recogida de un gran volumen de afresis I14-201/ procedimiento) como un pr
ocedimiento eficaz para recoger un nmero adecuado de CMH en un razonable nmero de
procedimientos para proporcionar una recuperacin hematopoytica adecuada. Las CMH s
on morfolgicamente indistinguibles de otras clulas mononucleares de la mdula sea o s
angre perifrica, por lo que resulta esencial la recogida de un nmero adecuado de cl
ulas para asegurar el injerto medular en el receptor. El objetivo tradicional pa
ra las recogidas de muestras de mdula sea persegua obtener un nmero suficiente de clu
las nucleadas que permitiera asegurar un nmero mnimo de clulas madre. Los injertos
de mdula sea pueden tambin ser evaluados para la actividad de clulas madre mediante
el uso de tcnicas de unidades formadoras de colonias (UFCs) (Iscove. 1971). Una m
uestra de clulas mononucleares del injerto se cultiva en medio de metilcelulosa c
on suplementos de factores de crecimiento hematopoyticos y aminocidos esenciales d
urante 10 a 14 das. Al final de este periodo, se examinan las placas buscando el
nmero y caractersticas de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Erit
roblsticas (BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Uni
dades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y me
gacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen ms de 50 clulas se valo
ran como una colonia. Las muestras con ms de 1 x 10 UFC por kg de peso del recept
or se consideran adecuadas. A medida que la recogida de clulas madre evolucion hac
ia el uso de procedimientos de hemafresis de sangre perifrica, se hizo necesario d
esarrollar un mtodo que se
:
pudiera realizar en el mismo da y que determinara el nmero de muestras de hemafresi
s necesarias. El mtodo ms aceptado para valorar las muestras de clulas madre de san
gre perifrica es la cuantificacin del nmero de clulas con antigeno CD34 por citometr
ia de flujo. El antigeno CD34 se encuentra limitado a las clulas primitivas de to

das las estirpes (Civin, 1989). La recogida de productos de hemafresis utilizando

el recuento de clulas CD34como ndice de la eficacia del injerto se ha mantenido p
ara el injerto hematopoytico (Berenson. 1991). La estandarizacin de la valoracin de
las clulas CD34 y la disponibilidad de los anlisis de citometria de flujo han oca
sionado que la medida de las clulas CD34+ se utilice por la mayor parte de los pr
ogramas para determinar el nmero y adecuacin de las muestras de clulas madre de san
gre perifrica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras de clulas madre de sa
ngre perifrica con mas de 3 x 10 clulas CD34+ por kg de peso corporal del receptor
se consideraban adecuadas para conseguir el injerto de neutrfilos entre 8 y 10 da
s.
f
La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requerira mltiples pro
cedimientos de recogida y afresis, dado que el nmero de CMH en sangre perifrica se
encuentra entre 1/10 y 1/100 del nmero de clulas en la mdula. En consecuencia, se r
equieren terapias de "movilizacin" para aumentar el numero de CMH circulantes y m
ejorar la eficiencia de la recogida por hemafresis. Richman (1976) descubri que mi
entras hay una cada en el nmero de clulas CD34+ circulantes despus de la quimioterap
ia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el porcentaje de clulas
CD34+ a medida que el recuento absoluto de neutrfilos comenzaba a recuperarse, a
menudo entre 1 4 y 21 das despus de la terapia. Este aumento en clulas CD34+ circul
antes es mayor con agentes quimioterpicos como citoxano y etopisida. Si la recogi
da por hemafresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar grandes
nmeros de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso aunque el recuen
to total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el periodo de aumento de clul
as CD34+ circulante es breve (dos a tres das), son crticos un estrecho control del
recuento de leucocitos y clulas CD34+ circulantes del paciente, as como el contro
l de los tiempos de recogida por hemafresis. Adems, algunos investigadores han seal
ado que la recogida de CMH en la fase de recuperacin tras quimioterapia reduce la
probabilidad de contaminacin por clulas tumorales en el producto de afresis. El us
o de factores de crecimiento hematopoytico como el Factor Estimulante de Colonias
de Granulocito-Macrfago (GM-CSF) y el Factor Estimulante de Colonias de Granuloc
ito (G-CSF) produce igualmente un aumento significativo en el nmero de clulas CD34
+ en sangre perifrica (Siena, 1989). Dosis de 5 a 1 0 ug/kg de peso corporal dura
nte 4 a 5 das causan un aumento de 5 a 10 veces en el nmero de CMH en sangre perifr
ica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser ms eficiente que el cebado con quimio
terapia para la recogida de clulas CD34*. L a combinacin de cebado con quimioterap
ia y el uso de factores de crecimiento (en especial G-CSF) provoca la mxima movil
izacin de clulas madre pluripotenciales en sangre perifrica, as como la necesidad de
menor nmero de procedimientos de hemafresis para recoger una dosis de CMH para tr
asplante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de traspla
nte autognico. Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alognico sano para
movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor seo y cefalea, resulta bien toler
ado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes
Tabla 33-6 Comparacin de las tuentes y productos de clulas madre hematopoyticas. Lu
gar de recogida y complicaciones Sangre de cordn (CMSC) Tipo de donante Producto
Lugar de recogida Complicacin principal Sangre de cordn umbilical Clula madre de sa
ngre de cordn Cordn umbilical de placenta en el nacimiento Insuficiencia de clulas
madre Autlogas (CMMO + CMSP) Paciente Mdula sea o CMSP Mdula intraoperatona o hemafre
sis Recurrencia de la enfermedad original Alognicas (CMMO + CMSP) Donante compati
ble familiar o no Mdula sea o CMSP Mdula intraoperatona o hemafresis Enfermedad inje
rto contra husped
cofdon
CMSP= clulas madre en sangre perifrica; CMMO= clulas madre en medula Osea; CMSC= c
l u l a s madre en sangre d e

812
S E C C I N IV

H E M A T O L O G A , C O A G U L A C I N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL
estn utilizando sangre perifrica como fuente de CMH en lugar de mdula sea, tanto par
a trasplantes alognicos como autognicos.
Sangre de cordn umbilical
Durante muchos aos, se saba que gran cantidad de unidades formadoras de colonias o
clulas madre estaban presentes en la sangre del cordn umbilical, pero no fue hast
a 1989 que se realizaron los primeros ensayos para utilizar clulas recuperadas de
cordn umbilical de placenta para el trasplante hematopoytico (Gluckman. 1989). El
xito aparente de muchos de estos trasplantes precoces de sangre de cordn ha dado
lugar a la organizacin de diferentes bancos de clulas de cordn en EE.UU. y en Europ
a en un intento por proporcionar otra fuente de clulas madre para los pacientes q
ue necesitan un trasplante alognico. Adems, como las clulas madre se obtienen de sa
ngre del cordn, parece haber un mayor grado de tolerancia para algunos tipos de i
ncompatibilidad HLA entre donante y receptor sin que aparezcan los grados 3 4 de
la GVH. Como consecuencia, el trasplante podra estar disponible para algunos pac
ientes que de otra forma no tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las clul
as madre de cordn umbilical se obtienen por canulacin de los vasos placentarios, c
on la placenta todava in tero o ms frecuentemente, despus del parto o por expresin di
recta de la sangre del cordn de la placenta despus del mismo. El nmero de CMH recup
eradas es directamente proporcional al volumen de sangre de cordn recogido, lo qu
e depende del tamao del nio/placenta y tambin de la experiencia del personal que re
coge la muestra (Wagner. 1992). Volmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en cent
ros con experiencia. Esto permitir obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 1
1 x 10 clulas nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (<40 mi) se suelen
descartar. Generalmente, las muestras de sangre de cordn umbilical no se procesan
para reducir el volumen, congelndose directamente en DMSO y almacenndose en nitrge
no lquido. Los trabajadores de banco con entrenamiento especfico no sufren distrac
cin por el cuidado de la madre y/o el nio en la sala de partos, y reducen el riesg
o de contaminacin bacteriana de la sangre del cordn.
6

macin de rosetas para eliminar poblaciones celulares no deseadas, en especial las

clulas T. En fecha reciente se han utilizado anticuerpos monoclonales dirigidos
a un receptor especfico de clula junto con complemento o ligadas con inmunotoxmas
como el ricino para producir una lisis de la poblacin de clulas tumorales contamin
antes. Ademas, con la llegada de la tecnologa de esferas inmunomagnticas (immunoma
gnetic bead technology). los anticuerpos monoclonales se pueden ligar a una de e
stas esteras. El complejo anticuerpo-esfera-clula tumoral se elimina al pasar la
suspensin celular por un campo magntico donde la poblacin de clulas n o deseadas que
dar retenida y las CMH son eluidas y recogidas. Las tcnicas de seleccin positiva se
dirigen a la presencia selectiva del marcador CD34 en las clulas madre hematopoyt
icas y la disponibilidad de anticuerpos monoclonales dirigidos al mismo. Mientra
s la tecnologa original utilizaba una columna a la que se ligaban anticuerpos mon
oclonales. en el momento actual se utilizan tcnicas de esferas inmunomagnticas. La
fraccin de clulas mononucleares obtenidas bien de la mdula sea, bien por hemafresis
de clulas madre, se incuba con el monoclonal anti-CD34 u otros monoclonales de in
ters. Se aade una suspensin de esferas inmunomagnticas marcadas con un segundo antic
uerpo. Este ltimo se liga al monoclonal anti-CD34 creando un complejo esfera-clula
diana marcado. Cuando la suspensin celular se somete a un campo magntico, el comp
lejo clula CD34-esfera magntica quedar retenido y la suspensin de clulas mononucleare
que contiene tanto clulas tumorales no deseadas como clulas T CD3+ ser desechada.
Las clulas madre CD34+ son entonces liberadas de las esferas magnticas mediante un

agente liberador y las esferas se eliminan mediante un nuevo campo magntico, dej
ando una suspensin celular que contiene aproximadamente un 90% d e clulas CD34-. L
a reduccin del numero total de clulas T CD3+ llega hasta una reduccin de 3.5 log,,.
La mediana de recuperacin para las clulas CD34+ es de aproximadamente el 50% de l
a cantidad inicial de clulas CD34+ presentes en el producto obtenido por hemafresi
s. Aunque todavia est permitido el uso para la seleccin positiva de clulas CD34+. e
sta tecnologa tambin se encuentra bajo activa investigacin para aplicaciones de sel
eccin negativa.
Una cuidadosa seleccin de la historia mdica y pruebas a la madre son esenciales pa
ra asegurar la calidad del producto de sangre de cordn, asi como la ausencia de e
nfermedad gentica. Adems de las pruebas de laboratorio habituales para enfermedade
s de transmisin serolgica, se realizan ms pruebas para enfermedades bacterianas y vr
icas. Mientras el almacenamiento de la sangre de cordn umbilical resulta una alte
rnativa para grados menores de histocompatibilidad y. en consecuencia, una ofert
a real para un mayor nmero de pacientes, presenta como limitacin la necesidad de a
umentar el nmero de CMH adecuadas para receptores de mayor tamao, asi como la de o
ptimizar los costes de inicio y mantenimiento de bancos de clulas de cordn.
Deplecin de clulas T
Las tcnicas para reducir el nmero de linfocitos CD3+ en los injertos hematopoyticos
alognicos, generalmente de mdula, se han dirigido a reducir la incidencia y sever
idad de la reaccin del injerto contra el husped (GVH). Muchas de las tcnicas descri
tas para depurar clulas tumorales, como la seleccin positiva de clulas CD34+, han s
ido tambin aplicadas para la reduccin de clulas T en el injerto (Tabla 33-8). Otras
tcnicas especficamente dirigidas a las clulas T han incluido aglutinacin con l e c
t m a de soja, formacin de rosetas E. combinaciones de ambas y diluciones a contr
acorriente. La lectina de soja produce una aglutinina especifica frente al recep
tor CD2 del linfocito. Aadiendo un paso de formacin de rosetas con eritrocitos de
oveja, se consiguen eliminar las clulas T restantes no aglutinadas por la lectina
de soja Este mtodo produce una deplecin de clulas T de 2 a 3 log., (Reisner, 1982)
.
Depuracin
Una vez recogidas las clulas madre hematopoyticas. bien de mdula o de sangre perifri
ca, a menudo resulta ventajoso realizar un procesado ulterior de las CMH recogid
as con el objeto de reducir una posible contaminacin por clulas tumorales o, en lo
s trasplantes alognicos. reducir el nmero de clulas T CD3+. Se han realizado dos ap
roximaciones no excluyentes entre s. La primera desarrolla tcnicas que persiguen e
liminar las clulas tumorales, tambin llamadas tcnicas de depuracin o seleccin negativ
a. La segunda utiliza mtodos para separar y recoger tan slo las clulas madre hemato
poyticas CD34-. descartando la fraccin celular restante que. presumiblemente, cont
iene clulas tumorales contaminantes: estos mtodos se denominan habitualmente tcnica
s de seleccin positiva (Tabla 33-7). Las tcnicas originales de depuracin empleaban
una variedad de mtodos especficos e inespeclicos para eliminar la poblacin celular n
o deseada En aquella poca se utilizaban frmacos citotxicos como la 4-hidroxiperoxic
iclofosfamida (4-HC) y etopisida (VP-16) para eliminar las clulas tumorales conta
minantes (Yeager, 1986). Estos mtodos son los equivalentes in vitro de altas dosi
s de quimioterapia, por lo que el mayor efecto negativo es el dao a las CMH. Otra
s tcnicas incluyen el uso de lectinas y/o for-

Tabla 33-7 Mtodos de depuracin de clulas madre Seleccin positiva Seleccin de clulas C
34. Columnas en fase slida Esteras magnticas Seleccin negativa Farmacolgicos 4-hidro
peroxiciclofosfamida (4-HC) Etopsido (VP-16) Inmunolgicos Clulas tumorales + AcMo +
toxina" Clulas tumorales + AcMo + lase slida" T o x i n a = complemento ricino, oro
s '" Fase slida = esleras magnticas.

CAPTULO 33

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CLULAS M A D R E
813
Tabla 33-8 Mtodos de deplecin de linfocitos Leclinas Lectina de soja con formacin d
e rosetas E Centrifugado a contracorriente Inmunolgicos Anticuerpos + complemento
Anticuerpos + lase slida Seleccin positiva
dios ms recientes tambin han demostrado un papel de las clulas asesinas naturales (
NK) en la reaccin "injerto contra leucemia". Otros han empleado combinaciones de
tcnicas como la seleccin de CD34+ y dilucin a contracorriente para crear dos poblac
iones celulares, una rica en clulas CD34+ y otra rica clulas N K con deplecin de clu
las T, aprovechando el hecho de que las clulas N K parecen tener efecto antitumor
al pero no contribuyen a la GVH (Skiera, 1999).
Criopreservacin de injertos hematopoyticos
Los injertos de CMH de origen autognico y muchas muestras alognicas se criopreserv
an y almacenan antes de su uso. El protocolo ms frecuente utiliza DMSO al 10% com
o agente protector, congelacin a ritmo controlado y almacenamiento en nitrgeno liq
uido, tanto en fase liquida como vapor. El uso de DMSO proporciona una important
e mejora en la viabilidad tras la descongelacin frente a agentes como el glicerol
. Dado que existe una toxicidad asociada con la infusin de productos de clulas mad
re con DMSO, otros investigadores se han dirigido al uso de bajas concentracione
s, adicin de hidroxietilalmidn u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en l
a mayora de los programas. Al intentar lavar los productos despus de la descongela
cin para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una prdida significativa
de clulas madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a reducir el volumen
del producto antes de su congelacin, reduciendo de esta forma la cantidad necesar
ia de DMSO.
La dilucin a contracorriente es un mtodo utilizado para la deplecin de clulas T que
utiliza la separacin caracterstica de clulas en un campo de centrifugado, de acuerd
o con el tamao y densidad de las diversas poblaciones celulares. Una de las venta
jas del sistema es que no se aaden agentes quimioterpicos o anticuerpos a la pobla
cin de clulas madre hematopoyticas, por lo que no se deteriora su funcin celular. Lo
s concentrados de capa leucoctica a partir de mdula sea se introducen en la centrfug
a a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fracciones celula
res de diferentes tamaos y densidades. El sistema posee una alta eficiencia en la
separacin de la fraccin rica en CFU-GM de la fraccin de linfocitos CD3+. Como no s
e provocan cambios en las clulas, la fraccin CD3+ puede ser cuantificada y parcial
mente aadida de nuevo a la faccin CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de
clulas CD3+. si se desea clnicamente (Noga, 1990). La recuperacin celular es alta
y. como los medios de dilucin son biocompatibles. los productos se pueden redifun
dir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del procedimiento es
el coste del equipo necesario y la necesidad de personal experimentado. La intr
oduccin de tcnicas con esferas inmunomagnticas para la seleccin positiva de clulas CD
34+ ha llevado al uso de estas tcnicas en el trasplante alognico para la deplecin r
esultante de clulas T CD3+, en especial de muestras obtenidas de clulas madre de s
angre perifrica. La tecnologa con esferas inmunomagnticas se aplica con facilidad a
las clulas madre obtenidas por hemafresis as como a los productos de mdula sea de gr
an volumen. Muchos centros han comunicado xitos con estos nuevos mtodos en la redu
ccin de clulas T CD3+ en trasplantes alognicos. en especial cuando donante y recept
or no son totalmente HLA-compatibles (HensleeDowney, 1997). Otra ventaja adicion
al tanto de las tcnicas de depuracin como de seleccin positiva es que ambas produce
n un volumen significativamente inferior de clulas madre para congelacin, recupera
cin y reinfusin al paciente. Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada

con la difusin de productos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes
derivados de la congelacin y almacenamiento para el laboratorio de clulas madre. E
n el momento actual, las tcnicas autorizadas para la depuracin y/o seleccin positiv
a para reducir la contaminacin por clulas tumorales son costosas, y se necesitan d
atos adicionales para valorar la eficacia clnica de estos procedimientos en la re
duccin de clulas tumorales. Algunos centros han comunicado un mejor pronstico media
nte el empleo de una combinacin de ambas, depuracin y tcnicas de seleccin positiva (
Clarke, 1998). Las tcnicas de seleccin tanto positiva como negativa producen una pr
dida concomitante de hasta un 50% en el nmero original de clulas CD34+, tanto por
toxicidad de diversos agentes (quimioterpicos, complemento), atrapamiento de comp
lejos en esferas magnticas, o prdida durante etapas necesarias de lavado. Para sol
ucionar este problema, el nmero de clulas CD34+ recogidas en la hemafresis inicial
y en la extraccin de mdula sea debe aumentarse para contrarrestar la prdida posterio
r durante el procesado. Esto puede ser difcil de cumplir en pacientes que son difc
iles de "movilizar". La principal desventaja de la deplecin de clulas T es el aume
nto resultante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de
GVH parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que no
muestran GVH. La presencia de la poblacin de clulas T del donante parece ser crtic
a en la reaccin "injerto contra leucemia", en el reconocimiento de los antigenos
del husped por las clulas del donante que genera una respuesta inmune que elimina
las clulas tumorales de husped. EstuReinfusin de productos de clulas madre
Independientemente de la fuente del injerto de clulas madre, las CMH se infunden
al paciente de forma similar a la transfusin de cualquier producto sanguneo. Las cl
ulas madre pluripotenciales. dotadas d e un receptor de membrana nico, se dirigirn
al espacio medular, reinjertndose y replicndose. Los productos que han sido criop
reservados con DMSO, en su mayor parte son descongelados e inmediatamente remfun
didos sin lavar. Las CMH recogidas por hemafresis sin procesado ulterior pueden c
ontener gran cantidad de eritrocitos. La criopreservacin con DMSO no conserva la
integridad de la membrana del glbulo rojo, por lo que estos productos contienen u
na gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en el
receptor oscilan desde leves caracterizadas por nusea, escalofros o cefalea, hasta
reacciones ms graves, que pueden incluir hipotensin, sepsis, insuficiencia renal
o incluso parada cardaca (Stroncek, 1991). Estas reacciones se muestran en la Tab
la 33-9. Los receptores de clulas madre criopreservadas generalmente reciben prem
edicacin con antihistaminicos y/o antiemticos. Tambin la hidratacin y el uso de diurt
icos estn indicados para reducir los efectos secundarios producidos por la admini
stracin de hemoglobina libre y el volumen de lquido infundido.
Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes transfundidos con product
os de clulas madre criopreservadas Frecuentes Escalofros Nuseas Vmitos Fiebre Cefale
a Disnea Inlrecucntes Insuficiencia renal Parada cardiaca Hipotensin Sepsis Facto
res asociados Volumen de tejido reinfundido Tipo y cantidad de crioprotector rei
nlundido Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alognicos) Contaminacin b
acteriana

814 BIBLIOGRAFA
SECCIN IV

HEMATOLOGA, COAGULACIN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

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S E C C I N
V
Inmunologa e inmunopatologa
Richard A. McPherson, M.D. John Bernard Henry, M.D.

C A P T U L O
34
" Visin general del sistema inmune y de los trastornos nmunolgicos
RICHARD A. MCPHERSON, M.D. CLULAS LINFOIDES Linfocitos T Linfocitos B Clulas prese
ntadoras de antgeno Clulas NK CLULAS NO LINFOIDES Neutrfilos y eosinfilos Basfilos y
astocitos FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas Complemento Citocmas 819 819 817 A
NTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO APLICACIONES CLNICAS DE
L ANLISIS INMUNOLGICO BIBLIOGRAFA 820 820 820 820
El sistema inmunolgico est estructurado para reconocer, responder y destruir a una
amplia variedad de organismos invasores como las bacterias, virus, hongos y pars
itos, que de otro modo, seran capaces de promover infecciones dainas para el cuerp
o. El descubrimiento de los componentes del sistema inmune a menudo ha venido de
l estudio de infecciones serias y de las reacciones especficas que emplea el cuer
po para combatir los organismos patgenos. En general, esta funcin inmunolgica se pu
ede resumir como la bsqueda de antigenos extraos que no pertenecen al cuerpo y su
destruccin. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de la apar
icin de antgenos nuevos extraos en clulas tumorales y trata de destruirlas dejando i
lesos los antgenos normales presentes en clulas sanas. Los estados de enfermedad p
ueden surgir debido a que diversos aspectos de la funcin inmunolgica se vean afect
ados. stos incluyen reacciones de hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, t
rasplantes alognicos de rganos o tejidos, la enfermedad de injerto contra husped: l
a bsqueda de la tolerancia en los trasplantes contina. Este capitulo resalta los c
omponentes del sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clnicas
de la inmunidad mas significativas.
Linfocitos T
Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la mdula sea, pasan
de la corteza a la mdula timica y durante este proceso sufren la maduracin. Este p
roceso implica una seleccin, de modo que las clulas que reaccionan con antgenos pro
pios se eliminarn, mientras que s e retienen otras clulas capaces de reconocer antg
enos mediante interacciones con molculas del complejo de histocompatibilidad (MHC
) (von Boehmer, 1994; Nossal. 1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y
un 70% de todos los linfocitos en la sangre, y se encuentran tambin en zonas par
acorticales de ganglios linfticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo
. Durante su maduracin, sufren una programacin gentica, en la cual el gen para el r
eceptor de antgeno de la clula T (TCR) se reordena para dar receptores proteicos q
ue son invariantes en su especificidad antignica, durante toda la vida de ese lin
focito y de sus clulas descendientes. La mayora (>95%) de los linfocitos T tienen
receptores de antgeno compuestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disull
uro, formando un heterodmero que se encuentra en la membrana exterior asociado al
complejo molecular CD3 (CD3 es un marcador para clulas T). Las subunidades prote
icas </. y \i del TCR poseen regiones variables, de unin y constantes (la cadena
a tambin contiene una regin de diversidad), con sus correspondientes secuencias en
el gen del TCR, el cual sufre un reordenamiento que produce una elevada especif
icidad en la unin de un determinado antgeno. Las protenas CD3 asisten en la Iransdu
ccin de la seal al interior de la clula cuando un antgeno se une al TCR en la superf
icie linfocitana (Janeway. 1994; Weiss. 1994). Un pequeo porcentaje de linfocitos
T presentan un TCR compuesto por subunidades y y que interaccionan de forma sim
ilar con CD3: estas clulas se encuentran generalmente en la superficie de mucosas
de los tractos grastrointestinal y respiratorio. Las proliferaciones de clulas T
se pueden dividir en neoplsicas (clnales) o benignas (policlonales). segn su ADN m
uestre de forma predominante una sola forma de reordenamiento
CLULAS LINFOIDES
Las clulas linfoides del cuerpo incluyen las clulas de los ganglios linfticos, bazo
, clulas de las superficies mucosas y clulas circulantes de la sangre. Derivan de
clulas madre hematopoyticas multipotentes. que se producen progresivamente desde e

l saco vitelino en el embrin, al hgado en el feto, y la mdula sea en el nio y durante

las fases adultas (Weissman, 1994). Las diferentes clulas linfoides se identific
an por la presencia de marcadores proteicos nicos presentes en su superficie y qu
e permiten a esas clulas desempear determinadas funciones.

818
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
gnico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y como ocur
re normalmente en una poblacin linfocitaria heterognea. El anlisis de linfocitos T
mediante citometria de flujo emplea una variedad de marcadores de superficie. El
CD4 se encuentra en un 60% de clulas CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/i
nductores que dirigen la funcin de otras clulas del sistema inmune secretando cito
cinas que estimulan varias funciones. Existen dos subpoblaciones de clulas CD4+:
T 1, que secreta interleucma 2 (IL-2) e interfern-y (IFN-y); y T2. que secreta IL4 e IL-5. Las clulas T1 facilitan las actividades de los macrfagos como la hipersen
sibilidad y la produccin de anticuerpos con accin opsonizante; las clulas T,,2 diri
gen la sntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en un 30% dlas cl
ulas T (asi, la relacin de clulas CD4 y CD8 en sangre es tpicamente 2:1). Estas clul
as T CD8+ presentan actividad citotxica y supresora en la respuesta inmune.
H
clulas B se produce tanto en la mdula sea, donde tiene lugar una seleccin negativa y
positiva, como en localizaciones perifricas. La estimulacin antignica de las clulas
B desencadena la formacin de clulas plasmticas que secretan inmunoglobulinas como
base de la especificidad en la inmunidad humoral. El complejo receptor de antige
no de la clula B utiliza la inmunoglobulina M (IgM) como componente de unin al antg
eno. La especificidad antignica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reo
rdenamiento, en el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. L
a cadena pesada se divide en regin variable, de diversidad, de unin y constante, m
ientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unin y consta
ntes. La maduracin de la respuesta mediada por anticuerpos implica el cambio de I
gM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reordenamiento gnico, aun
que el tipo de cadena ligera de una clula B permanece fijado. Las clulas B tambin p
resentan en su superficie receptores para el complemento (CD21. que es tambin el
receptor para el virus de Epstein-Barr [EBV] y hace que estas clulas sean suscept
ibles de una infeccin por EBV) y para la regin Fe de las inmunoglobulinas: tambin p
resentan COI9 y CD20. que se usan a menudo para la identificacin inmunolgica de la
s clulas B.
El mecanismo de reconocimiento antignico es diferente entre los dos subtipos de l
infocitos T. Las molculas CD4 se unen a las molculas de MHC de clase II presentes
en las clulas presentadoras de antigeno, mientras que las molculas de CD8 interacc
ionan con molculas de MHC de clase I. De acuerdo con esto, las clulas CD4+ reconoc
en antigenos slo en el contexto de MHC de clase II, y las clulas CD8+ los reconoce
n slo a travs de MHC de clase I.
Clulas presentadoras de antgeno Linfocitos B
Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de los linfoc
itos perifricos en sangre, y adems se pueden encontrar en la mdula sea, ganglios lin
fticos, bazo y otros tejidos linfticos. En el bazo y ganglios se agregan para form
ar los folculos Imfoides. La diferenciacin de Los macrfagos funcionan como fagocito
s mononucleares en procesos de inflamacin, y tambin procesan los antgenos ingeridos
y los presentan asociados a molculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las clu
las T no se activan con antgenos solubles y. por tanto, la presentacin de antgenos
de este modo es necesaria para la estimulacin de clulas T y la induccin de la
Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las clulas presentadoras
de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o miemos y presentan los frag
mentos peptdicos del antgeno, asociados a una molcula de MHC, a las clulas T . En la

clula T, un TCR especfico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el comple
jo antigeno-MHC. La activacin celular tiene lugar a travs del complejo CD3 y la ac
tivacin de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la clula B est compuesto por una molc
ula de Ig unida a la m e m b r a n a que se encuentra formando un complejo con o
tras protenas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconoc
imiento antignico. las T K celulares tambin se activan. La activacin coeslimuladora
de clulas T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligando
s (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulacin de la clula T a travs de las molcula
s CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la molcula CD40 de la clula B). (Adaptado
de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y We
iss A. L i t t m a n D: Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cel
l 1994; 76:263, con permiso).

CAPTULO 34

VISIN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS I N M U N O L G I C O S

819
inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrfagos tambin secretan citocinas como la
IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar directamente clulas
tumorales en su papel de inmunovigilancia. y adems, son tambin clulas efectoras en
algunos tipos de inmunidad celular (por ej. la hipersensibilidad retardada). La
s clulas dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones interstic
iales de otros rganos) y las clulas de Langerhans (presentes en la epidermis) pose
en numerosas extensiones citoplasmticas enriquecidas en molculas de MHC de clase I
I. Por tanto, son muy eficientes en la presentacin antignica (aunque probablemente
no sean fagocrticas) y se consideran muy importantes para esta funcin en todo el
sistema inmune.
Clulas NK
Las clulas N K (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los l
infocitos en sangre perifrica. No son clulas T ni B y anteriormente se las llam a
b a clulas nulas. Las clulas N K tienen la funcin de lisar otras clulas sin necesida
d de una previa sensibilizacin. Pueden atacar clulas tumorales. infectas con virus
y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a clulas aberrantes. Las clu
las N K se caracterizan por los marcadores de superficie CD16 y CD56, los cuales
se emplean habitualmente para su identificacin. CD16 es el receptor para la regin
Fe de la IgG y por tanto las clulas N K son capaces de lisar selectivamente aque
llas clulas que se encuentran recubiertas de anticuerpos (citotoxicidad celular d
ependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity],
importante en algunas reacciones de hipersensibilidad). Las clulas N K tambin sec
retan cilocinas como el IFN-y. Curiosamente, las clulas N K se pueden reconocer e
n una preparacin de un frotis de sangre tenido, c o m o linfocitos grandes y gran
ulosos.
linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la expo
sicin continuada a multitud de antgenos extraos y pueden permanecer durante aos medi
ante una secrecin continuada para sustituir a aquellas molculas que se pierden med
iante la limpieza normal de protenas circulantes. En las superficies mucosas, el
principal tipo de anticuerpo es la IgA en una forma dimrica especial que resulta
de su secrecin a ese lugar (vase Captulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD
(que reside en la superficie de clulas B donde puede estar involucrada en la tra
nsduccin de la seal inmunolgica. pero no adquiere concentraciones importantes como
molculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a travs de su unin a la superf
icie de basfilos y estimula la secrecin de sustancias vasoactivas de esas clulas en
presencia de alrgenos especficos). Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan un
indose a los antigenos invasores en la superficie de clulas extraas, bacterias, vir
us, etc. y facilitando su destruccin mediante efectores inespecficos como el compl
emento y las clulas NK. La monitonzacin de enfermedades mediante el anlisis de inmu
noglobulinas incluye un anlisis cualitativo para la deteccin clonal frente a la po
liclonal (p. ej., para el diagnstico de mieloma mltiple) y anlisis cuantitativo tan
to para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA (para detectar posibles defici
encias selectivas o combinadas o la sobreproduccin de tipos de inmunoglobulinas)
y para ttulos de anticuerpos especficos frente a antigenos individuales (como las
isohemaglutininas, neumococos, Haemophilus. ttano, difteria u otros microorganism
os)
Complemento
Este conjunto de protenas que interaccionan entre si tiene el papel de destruir e
nzimticamente las dianas (p. ej.. clulas, bacterias) a las que les dirigen los ant

icuerpos u otros medios (vase Captulo 38). La medida de los componentes del comple
mento tiene dos utilidades fundamentales en el diagnstico clnico: detectar deficie
ncias congnitas (que son relativamente infrecuentes) que pueden suponer una predi
sposicin a ciertas enfermedades como infecciones o la progresin hacia enfermedades
autoinmunes) y para detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad
en el momento de anlisis de una enfermedad autoinmune sistmica como puede ser el l
upus eritematoso sistmico.
CLULAS NO LINFOIDES
Estas clulas no estn programadas genticamente para reconocer antgenos especficos o in
teraccionar con clulas linfoides en la induccin de una respuesta inmune. En su lug
ar, son electores de reacciones inmunes desencadenadas por diversos factores.
Neutrfilos y eosinfilos
Los neutrfilos llegan a las regiones de inflamacin por la accin de quimioatrayentes
; entonces vierten sustancias txicas y enzimas de sus granulos que digieren indis
criminadamente estructuras celulares; los neutrfilos tambin ingieren restos celula
res al igual que los eosinfilos. retirndolos de los tejidos.
Citocinas
Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las respuestas inmu
nes celulares; son mediadores que actan a corto plazo y que son elaborados por al
gunas clulas y difunden a otras clulas donde actan (Paul, 1994). Muchas citocinas s
on pleiotrpicas en el sentido de que pueden aduar sobre muchos tipos celulares di
ferentes. Pueden actuar de forma endocrina estimulando clulas a una cierta distan
cia; pueden actuar sobre clulas que se encuentran en el espacio inmediato (estimu
lacin paracrina); tambin pueden estimular a las propias clulas que las han secretad
o (autocrina). Las acciones especficas de las citocinas incluyen la hematopoyesis
mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que inducen la produccin d
e granulocitos y macrfagos. respuestas de inmunidad natural (mediante IL-1. facto
r de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], interferones e IL-8), estimulacin de la multipl
icacin y activacin de linfocitos (mediante IL-2 y otros), y la activacin inespecifi
ca de clulas inflamatorias (vase Captulo 39). Todava se estn descubriendo nuevas cito
cinas a medida que van apareciendo ms detalles sobre la comunicacin clulaclula. El u
so clnico de las citocinas incluye tanto la supresin de la respuesta inmune en el
trasplante de rganos alognico mediante frmacos como la ciclosponna que inhibe la pr
oduccin de IL-2, y la estimulacin de la respuesta inmune en terapias frente al cnce
r o a infecciones. Estos ltimos tratamientos son en su mayora experimentales, aunq
ue trabajos recientes han demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frent
e al TNF-u puede prevenir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del
tratamiento con antibiticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fek
ade. 1996). Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias me
diante las cuales las respuestas inmunes se estimularn o inhibirn selectivamente d
e acuerdo con las necesidades clnicas concretas.
Basfilos y mastocitos
Los basfilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en su su
perficie receptores que se unen a IgE. La unin de IgE en la membrana de los basfil
os no es especfica del antgeno que reconoce la IgE. sino que es el resultado de la
suma de la accin de la cantidad total de IgE y los basfilos disponibles. Cuando e
l antgeno (o alrgeno) entra en contacto con su IgE especifica presente en la super
ficie del basfilo. la clula se activa y secreta sustancias como las histaminas que
median algunas hipersensibilidades. Asi, la especificidad de un basfilo est dirig
ida por la IgE que tiene unida a su superficie desde la sangre; tericamente, un b
asfilo podra tener mltiples molculas de IgE diferentes en su superficie y podra, por
tanto, reaccionar con muchos alrgenos diferentes.
FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas
Las molculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de clulas B para es
timular la secrecin de ms inmunoglobulinas: tambin pueden circular por la sangre y

aparecer en las superficies mucosas de los tractos respiratorio y gastrointestin

al, donde es probable que entren en contacto con microorganismos patognicos. Las
principales inmunoglobu-

820
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
El MHC (tambin denominado complejo antignico leucocitario humano. HLA) se encuentr
a codificado en el cromosoma 6 e incluye molculas de la Clase I (HLA A, B y C). m
olculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las molculas de la Clase III que inclu
yen algunos componentes del sitema del complemento y el TNF-u y TNF-|i (vase Captu
lo 40). Las funciones de los antigenos de las clases I y II ya se han analizado
brevemente en cuanto a su participacin en la presentacin antignica a clulas T. Estos
antgenos fueron descubiertos y su naturaleza altamente polimrfica fue descrita en
esludios de tolerancia inmunolgica y en el rechazo de trasplantes de rganos alogni
cos. En consecuencia, una de las utilidades clnicas ms importantes del tipo HLA re
side en el emparejamiento de donantes potenciales de rganos o tejidos con recepto
res que necesitan dicho trasplante. Otra aplicacin clnica significtiva es el tipo
de pacientes afectados y de miembros de sus familias para establecer el riesgo d
e desarrollar algunas enfermededades que se encuentran asociadas a tipos de HLA
concretos (p. ej., la espondilitis anquilosante con HLA B27) (vase Captulo 41). Ot
ra aplicacin ms del tipo HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes
que se han hecho refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la form
acin de anticuerpos anti-HLA tras ser expuestos a mltiples donantes (p. ej., tras
las transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplantes
de clulas progenituras hematopoyticas (HPC) (vase Captulo 31).
te a virus, hongos, protozoos, parsitos y tambin microbios intracelulares como myc
obacterias. Los pacientes con el sndrome de la mmunodeficiencia adquirida (sida)
son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes oportunistas cuando pie
rden sus clulas T CD4+.
APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS INMUNOLGICO
Las principales reas de aplicacin clnica de los ensayos inmunolgicos son las enferme
dades autoinmunes, el trasplante de rganos/tejidos y su rechazo, las inmunodefici
encias y las alergias La enfermedad autoinmune puede ser sistmica (vase Capitulo 4
3), estar restringida a rganos especficos (vase Captulo 45) o puede implicar vasculi
tis (vase Captulo 44). Muchos de los ensayos se basan en tcnicas que emplean anticu
erpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con autoantigenos especfic
os como puede ser el ADN de doble hebra. Otros autoanticuerpos se pueden identif
icar mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta que emplean secciones de r
ganos para identificar autoanticuerpos especficos como aquellos que se dirigen fr
ente al msculo liso, mitocondnas. clulas parietales y dems. Los avances tecnolgicos
han proporcionado fuentes purificadas de muchos autoantgenos importantes que form
arn parte de ensayos futuros para autoanticuerpos ms especficos y que permitan una
automatizacin ms eficaz. La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes
alognicos y las mmunodeficiencias se basan en la bsqueda de subpoblaciones linfoc
itarias con una particular importancia de las clulas T y de las CD4+. Ademas, los
estados de inmunodeficiencia congnita requieren un anlisis ms detallado de los ele
mentos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando generalmente con una
batera de ensayos convencionales para analizar la presencia y (uncin de linfocito
s. inmunoglobulinas y complemento, y pasando, cuando es necesario, a ensayos muy
esotricos en la bsqueda de desrdenes menos frecuentes (vanse Captulos 36 y 42).
MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO
Las respuestas inmunologas pueden daar tejidos normales adems de los organismos inv
asores que han desencadenado una respuesta. Estas respuestas se clasifican en cu

atro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de naturaleza anafilctica o alrgica:

est mediada por la IgE unida a la superficie de basfilos y mastocitos. Cuando antg
enos especficos (o alrgenos) se unen a la IgE de superficie, los basfilos se estimu
lan y liberan la histamina y otras Los trastornos alrgicos se evalan tpicamente a t
ravs de ensayos en la sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de
las reacciones piel, medida de la concentracin total de IgE en suero, y la cuant
ificaaon d e alrgicas. Estrategias clnicas para el tratamiento de asma y alergias
han la reactividad especfica de la IgE en suero con alrgenos comunes de la emplead
o distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar comida, el
polen y otros factores ambientales (vase Capitulo 46). los efectos de la histamin
a hasta la desensibilizacin. Un estudio reciente A medida que surjan nuevos descu
brimientos sobre las funciones inmunoemple con xito un anticuerpo monoclonal human
izado frente a la IgE para lgicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios d
e diagnstico clnico el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terap
ia podra, en el probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos
mas futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentracin de IgE en facto
res y actividades, para establecer diagnsticos correctos y monitorizar y suero. a
justar los tratamientos. El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antge
nos presentes en la superficie celular; el dao puede ocurrir mediante la unin y ac
tivacin del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicdad BIBLI
OGRAFA celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de clulas tumorales o
de parsitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los antiFekade
D. K n o x K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy tre
atment with antibodies against t u m o r necrosis lactor c. N Engl J M e d 1996:
cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la 3
35:311. miastenia gravis). Germain R: MHC-dependent antigen processing and pepti
de presentation ProviEl tipo III resulta de la formacin de inmunocomplejos, entre
antgenos exding ligands for T lymphocyte activation. Cell 1994. 76:287. J a n e w
a y C. Bottomly K: Signis and signs for lymphocytic responses. Cell 1994: genos
como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantgenos endge76:275. nos y auto
anticuerpos. El dao tisular tpico ocurre en rganos que contienen Milgrom H. F i c k
RB. Su JO, et al. Treatment of allergic a s t h m a with monoclonal antinumeros
os vasos sanguneos pequeos donde los inmunocomplejos circuIgE antibody N Engl J M
e d 1999. 341:1966 lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma n
atural los anti- Nossal G: Negative selection of lymphocytes Cell 1994; 76:229 P
aul W, Seder R. Lymphocyte responses and cytokines. Cell 1994; 76:241 genos endge
nos. von B o e h m e r H: Positive selection of lymphocytes Cell 1994: 76:219. E
l tipo IV est mediado por clulas, tambin se denomina hipersensibilidad Weiss A. Lit
tman D: Signal Iransduction by lymphocyte anligen receptors. Cell 1 9 9 4 ; reta
rdada, y depende del funcionamiento de las clulas T CD4+ o de la cito76:263. toxi
cidad de clulas T CD8+. El tipo IV es la base de la reaccin inmune frenWeissman I:
Developmental switches in the i m m u n es y s t e m Cell 1994; 76:207.

CAPTULO
35
Inmunoensayos e inmunoqumica
Yoshihiro Ashihara, Ph.D. Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc. Robert M. Nakamura, M
.D.
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuer
po Caractersticas de los antgenos Caractersticas de los anticuerpos Cintica de la re
accin antigeno-anticuerpo VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOEN
SAYOS Tipos de inmunoensayos Qumica de conjugacin Caractersticas de la fase slida IN
MUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS Origen y principios de la reaccin de pr
ecipitina INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS Principio de aglutinacin de partculas Resumen
RADIOINMUNOENSAYO Origen Principios y mtodos del ensayo Resumen INMUNOENSAYO ENZI
MTICO Origen y clasificacin Inmunoensayos enzimticos heterogneos Inmunoensayos enzimt
icos homogneos Resumen INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Origen y clasificacin Inmunoensay
o fluorescente heterogneo Mtodo fluoroinmunomthco 839 833 830 825 824 823 821 Ensay
o inmunofluoromtrico por particin radial Fluoroinmunoensayo en tiempo real Inmunoe
nsayo fluorescente homogneo Ensayo de polarizacin de la fluorescencia Inmunoensayo
de transferencia de la fluorescencia de excitacin Inmunoensayo de fluorescencia
protegida INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen Inmunoensayo quimioluminiscente
usando esteres de acridinio como marcadores Inmunoensayo electroquimioluminisce
nte AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de e
nsayo homogneos Sistemas de inmunoensayo heterogneos Secuencia prctica del inmunoen
sayo en el sistema analtico Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo het
erogneo Nuevos sistemas para la prxima generacin (sistemas modulares) SISTEMAS DE E
NSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIENTE 845 Origen
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltracin) Tir
as reactivas Instrumentos inmunocromatogrficos Resumen BIBLIOGRAFA 848 842 841
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuer
po
Los ligandos inmunolgicos se basan en la afinidad entre molculas, como la enzima y
el sustrato, la hormona y su receptor, el antgeno y el anticuerpo, y juegan un p
apel importante en los seres vivos. Las caractersticas de reconocimiento especfico
de los inmunoensayos (reacciones antgeno-anticuerpo) han pasado a ser ampliament
e utilizadas c o m o herramientas analticas, a pesar de la amplia gama de mtodos d
isponibles para el anlisis clinico en un laboratorio.
Los inmunoensayos se pueden utilizar para la deteccin tanto de antigeno como de a
nticuerpos. Para la deleccin de antigenos, el anticuerpo especfico correspondiente
debe prepararse como uno de los reactivos. Lo contrario se aplica para la detec
cin de anticuerpos. La sensibilidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante
el desarrollo de nuevos tipos de sistemas para la deteccin de la seal y la tecnolo
ga de fase slida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar menos de 0,1 p
g.'ml de antgeno presente en la sangre. Se pueden aplicar a la deteccin de hapteno
s como molculas pequeas: protenas y complejos proteicos como las macromolculas: y ta
mbin para cualquiera de los anticuerpos frente a alrgenos, agentes infecciosos y a
ntigenos autlogos.

822
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA
Caractersticas de los antigenos
Los antgenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede representar sit
ios antignicos (eptopos) para producir los correspondientes anticuerpos, desde molc
ulas pequeas como los haptenos y hormonas, hasta macromolculas como protenas, glcopr
otenas, glicolipidos y otros productos naturales. Algunos compuestos qumicos artif
iciales tambin pueden ser antgenos actuando como haptenos. Los antgenos deben tener
al menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos in
cluyen secuencias de aminocidos de peptidos presentes en protenas y estructuras pr
oteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.
2. La produccin de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad ilimitada
de reactivo homogneo con una afinidad y especificidad m u y constante. 3. Los an
ticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmunizacin con un antgeno s
in purificar. Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para s
u uso. que son las siguientes: 1. Reactividad insuficiente para la precipitacin o
aglutinacin debido a que la formacin del entramado del inmunocomplejo es dbil o no
ocurre cuando se emplean anticuerpos monoclonales. 2. Los antigenos con mltiples
eptopos heterogneos son ms difciles de caracterizar inmunoqumicamente con un solo an
ticuerpo monoclonal.
Caractersticas de los anticuerpos
La inmunoglobulma. una protena plasmtica importante, se refiere a anticuerpos en e
l contexto de funciones biolgicas de inmunoglobulmas especficas de antgeno. Los ant
icuerpos, por tanto, se producen en respuesta a estimulaciones antignicas. Los an
ticuerpos se componen de molculas funcionales y heterogneas que unen antgenos media
nte un dominio de unin al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina
: IgG, IgM. IgA. IgD e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tant
o la IgA como la IgM presentan dos subgrupos. Todas las molculas de anticuerpo co
nocidas presentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura
molecular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones varia
bles. El dominio hipervarable (sitio de unin al epitopo) puede ensamblarse para in
teraccionar con una amplia variedad de eptopos (determinantes antignicos). En un l
aboratorio de medicina se pueden distinguir dos categoras de anticuerpos: anticue
rpos como reactivos o anticuerpos como analitos. Los anticuerpos como analitos a
menudo se clasifican por los subtipos IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reac
tivos se preparan a partir de antisueros obtenidos a travs de la inmunizacin con u
n antgeno purificado.
Produccin de anticuerpos mediante tecnologa recombinante
Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresin para el fragmento F
de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosforilcolina em
pleando tecnologa recombinante en Escherichia col. Esta tcnica hace posible produci
r un anticuerpo quimrico fusionado con una enzima. Ha aparecido una tcnica lamada
phage display (una traduccin podra ser muestra de fagos) para la produccin de antic
uerpos (Wmter. 1994). En este mtodo fragmentos de anticuerpo de una especificidad
de unin previamente determinada se construyen de un repertorio de genes V de ant
icuerpo, eliminando asi la necesidad de inmunizacin y generacin de hibridomas. Los
genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por u
nin al antgeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias infectadas A
dems, la afinidad de la unin de los anticuerpos se mejora mediante mutacin. En un f
uturo prximo esta tcnica permitir el uso de anticuerpos especficos de alia avidez.
v

Anticuerpos
policlonales Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo
Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de accin de masas de la qumica se
pueden aplicar a la reaccin antgeno-anticuerpo. La cintica de una reaccin Ag-Ab rev
ersible es la siguiente (Steward. 1986): K Ag + Ab AgAb K
2
Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunizacin con un antgeno,
que presenta varios eptopos. En otras palabras, se generan anticuerpos especficos
frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo policlonal por un antgeno compl
ejo generalmente es mayor que la de un simple anticuerpo monoclonal. Para la inm
unizacin con molculas relativamente pequeas, como los haptenos o las hormonas, pued
en ser necesarias protenas transportadoras o carner.
Anticuerpos
monoclonales
Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anticuerpo li
bres. AgAb representa la concentracin del complejo antigeno-anticuerpo, y K' y K
son las constantes de asociacin y disociacin, respectivamente. El ritmo de formacin
del complejo antigeno-anlicuerpo se representa de la siguiente forma: K'|Ag][Ab
]-K^[AgAb|
Los anticuerpos monoclonales (Kehler. 1975) se han desarrollado empleando las sig
uientes biotecnologas: fusin somtica de clulas, seleccin del hibridoma resultante y d
ilucin lmite para obtener monoclonales. Se definen c o m o anticuerpos homogneos un
iformes dirigidos a epitopos especficos. Una linea celular establecida permite la
secrecin de todas las inmunoglobulinas especificas que reaccionan frente a un so
lo antgeno. Los anticuerpos monoclonales han permitido el anlisis de molculas, epit
opo por epitopo. gracias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerp
os monoclonales no tienen la habilidad de reconocer la molcula completa, en compa
racin con los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distin
tos antgenos con un epitopo comn parecen el mismo antgeno. El anticuerpo CA199 (Mag
nan, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas y tamaos mole
culares que poseen epilopos comunes formados por carbohidratos. Los anticuerpos
monoclonales permiten la identificacin de isoenzimas. subtipos, isotipos de prote
ina y cambios conformacionales de las molculas, puesto que pueden distinguir la mn
ima diferencia entre molculas. Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones
cruzadas con distintos antgenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar po
r la probable existencia de la misma secuencia de aminocidos, hidratos de carbono
o lpidos en distintas molculas. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales ha pe
rmitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo m u y tiles y prcticamente ideal
es para un laboratorio de diagnstico clnico. Los mtodos de produccin y las aplicacio
nes de los anticuerpos monoclonales se han analizado exhaustivamente (Nakamura.
1983: Zola, 1987). Las ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguient
es: 1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo m u y bien definido.
y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi. *' _ [AgAb] K ~[Ag][Ab]~
? 11
(constante de asociacin en
o limitado a las reacciones
anticuerpos a menudo poseen
e asociacin para mltiples
lugar de afinidad. El valor
de datos experimentales:
a a

el equilibrio o constante de afinidad). K es el parmetr

de sitio en sitio, a pesar de que los antgenos y los
mltiples dominios de unin en la molcula. La constante d
reacciones antgeno-antcuerpo se puede denominar avidez en
de K se puede obtener de las siguientes ecuaciones y

[Ab] = [Ab],-[AgAb] donde [Ab] es la concentracin del anticuerpo en el equilibrio

y [Ab]. representa la concentracin total de anticuerpo inicial.

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
823
a
"([Ab],-B)F
donde F es el anlgeno libre o analito, y B es el antgeno unido o analito. Una repr
esentacin de Scatchard se produce cuando la cantidad de antgeno unido (B) se repre
senta en eje el X y la relacin de los analitos B/F se representa en el eje Y. Dos
parmetros que se pueden determinar de una representacin de Scatchard son la const
ante de disociacin o afinidad, de la pendiente de la lnea, y la concentracin de los
sitios de unin al anticuerpo por el punto de corte de la recta con el eje X (Sca
tchard. 1949).
VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS
puestos cromforos, fluorforos. y ms tarde, compuestos quimioluminiscentes. Dependie
ndo del sustrato elegido, el mtodo de ensayo se puede definir como un inmunoensay
o enzimtico fluorescente o quimioluminiscente (Thorpe. 1984). Los inmunoensayos f
luorescentes (FIA) emplean fluorforos como sondas. Los fluorforos requieren de una
longitud de onda ptima para que su excitacin produzca una emisin de luz detectable
. La sensibilidad del FIA normalmente desciende debido al fondo inespecfico prese
nte en las muestras biolgicas. Existen fluorforos que poseen un retraso en la emis
in de fluorescencia de 100 ns (nanosegundos) y son apropiados para el uso en un F
IA en tiempo real. El empleo de un nuevo tipo de compuestos fluorescentes ha res
ultado en una mejora del FIA, como puede ser la eliminacin del ruido de fondo. Se
han introducido instrumentos sofisticados de modo que se pueden detectar concen
traciones bajas de analitos (10 M) mediante FIA.
1 5
Tipos de inmunoensayos
Una breve clasificacin y una lista de las caractersticas de vanos inmunoensayos ap
arecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitacin proporcionan el mtodo ms
sencillo por el que los antgenos y anticuerpos reaccionan entre ellos sin necesi
dad de una seal de deteccin. El complejo antigeno-anticuerpo en un gel o en fase lq
uida puede observarse cualitativamente c o m o un precipitado a simple vista, y
cuantitativamente mediante un detector. El inmunoensayo de aglutinacin de partcula
s (Kasahara, 1992b) emplea partculas inertes como sonda, en lugar de la precipita
cin directa de los complejos antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antgenos unidos
a partculas c o m o eritrocitos, ltex o un sol metlico reaccionan con el analito de
la muestra. Como resultado de esta reaccin inmune, las partculas grandes presenta
n un patrn de aglutinacin significativo que puede verse a simple vista. Y a l o w
(1959) describi el desarrollo de un RA empleando istopos radiactivos como sonda. Es
te avance permiti la deteccin cuantitativa de niveles residuales de analitos y con
tribuy al avance de la investigacin bsica y la medicina clnica. L a insulina, por ej
emplo, se cuantific mediante un RA, y sustituy al inmunoensayo de la insulina. El RA
se puede preparar como un procedimiento en fase slida para una separacin fcil de l
a sonda libre de la unida. Desde el desarrollo de los RA, la bsqueda de sondas alt
ernativas a los istopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desar
rollar inmunoensayos no isotpicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y otros
grupos de respuesta. El inmunoensayo enzimtico (EIA), que emplea enzimas como so
ndas, se desarroll al principio de la dcada 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y
rpidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las seales
dependiendo de la actividad cataltica de la enzima. En un intento de mejorar los

sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-

Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean compuestos quimioluminiscentes com

o sonda. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen molculas sintetizadas qumicam
ente y productos naturales como la aequorina. A diferencia de los fluorforos. la
mayora de los compuestos quimioluminiscentes requieren una estimulacin qumica, en l
ugar de energa lumnica, para generar la emisin de luz. La reaccin de reduccin-oxidaci
es un proceso comn a todos los ensayos quimioluminiscentes. La amplificacin de la
seal no se espera de las sondas quimioluminiscentes porque las molculas quimiolum
iniscentes generan un solo fotn por descomposicin molecular. Han aparecido una ser
ie de compuestos innovadores para la quimioluminiscencia que han resultado tiles
para su aplicacin en inmunoensayos. Un metal quelado con grupos tri-bifenilo emit
e luz a travs de una reaccin continua de reduccin-oxidacin en la superficie de los e
lectrodos (Blackburn, 1991). En los diversos tipos de ensayos mencionados anteri
ormente, los principales factores que afectan a la sensibilidad de un ensayo son
la constante de asociacin (afinidad o avidez) del reactivo, la intensidad de la
seal de las sondas y la relacin seal/fondo de la seal de deteccin reducida por el fon
do de la propia reaccin o por una reaccin inespecifica. Los istopos de yodo 1 2 5 (
l) requieren unos 7 millones de molculas para generar 1 fotn/segundo, basado en e
l clculo de la vida media de istopos radiactivos (Bounaud. 1987). Los sustratos qu
imioluminiscentes de enzimas pueden incrementar el nmero de eventos en una orden
de magnitud 6 veces mayor que el l. Esto se atribuye a la capacidad de amplifica
cin cataltica que poseen las enzimas.
,25 l2S
Qumica de conjugacin
En funcin del ensayo elegido, el mtodo de conjugacin que une una molcula con otras,
como enzimas (o cofactores) a antgenos (o anticuerpos) o antgenos (anticuerpos) a
una fase slida puede variar. La reaccin de acoplaTabla 35-1 Clasificacin de los inmunoensayos y sus caractersticas Seal de deteccin I
nmunoensayos de precipitacin Inmunoensayos de partculas No necesarias Clulas sangune
as. partculas artificiales (gelatina. partculas de ltex, etc.) Radioistopos ('1, H) E
nzimas
3
Separacin B/F* No necesaria No necesaria
Deteccin de la seal A simple vista, turbidez. nefelometra A simple vista, analizado
r de patrones, espectrofotometra. cmputo de de partculas Cmputo de fotones Espectrof
otometra. fluorimetria. cmputo de fotones Cmputo de fotones Cmputo de fotones
Sensibilidad ~10 |jg/m |t -5 ng/mM
Radiommunoensayos Inmunoensayos enzimticos Inmunoensayos fluorescentes Inmunoensa
yos quimioluminiscentes
Necesaria Necesaria Necesaria Necesaria
-5 pg/ml -0,1 pg/m|6(CL-EIA) -5 pg/ml
1 1
Fluorforos Compuestos quimioluminiscentes
-5 pg/ml
1
libre Los ensayos homogneos que se incluyen no requieren la 'Paso de lavado para
la separacin do la sonda unida en el inmunocompleo de la sonda que queda separacin

B/F. Dalos de Ritchie (1978) Datos de A u x (1988). 'Oatos de Isomura (1994) 'Da
tos de Sgoulas (1989)
:

824
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

cuerpos conjugados con una sonda. Las placas de microtiter o de tiras pueden cau
sar un "efecto de borde". Este efecto puede explicarse por las distintas cinticas
de la reaccin inmune o la actividad enzimtica con las vanado nes de la temperatur
a. Puede existir una diferencia en la temperatura entre los pocilios que se encu
entran en el borde de la placa y los que se encuentran en el centro. Una diferen
cia de unos 2 C puede observarse con un termmetro infrarrojo entre los pocilios d
el borde y los centrales a temperatura ambiente. La forma y tamao de la fase slida
son factores crticos que afectan a la cintica de la inmunorreaccin y a la capacida
d de unin del anticuerpo o antgeno de la fase slida. Partculas esfricas magnticas o d
ltex de 3.000 A de dimetro, poseen una superficie total mayor para la inmunoabsor
cin de lo que se obtiene normalmente con otras lases slidas. L a mayor superficie
total ayuda a reducir la duracin de la reaccin inmunolgica (Nishizono. 1991). mient
o aplicada se debera llevar a cabo en condiciones que eviten la reduccin de las pr
opiedades biolgicas de la protena. En el mtodo del glutarakJehido (Avrameas, 1978).
el glutaraldehido, con dos (o posiblemente ms) grupos aldehido como agente de ac
oplamiento, se ha empleado para la conjugacin de grupos amino proteicos. Este mtod
o se basa en reacciones mixtas, incluida la condensacin aldlica a elevado pH (la p
Ka del residuo NH es de 8.6 a 10.8). En este mtodo, mostrado en la Figura 35-1. e
l conjugado resultante presenta formas diferentes por la existencia de mltiples d
ianas de unin. El mtodo de la oxidacin con periodato (Nakane. 1966) para la conjuga
cin de anticuerpos, emplea la peroxidasa de rbano, que contiene grupos de hidratos
de carbono en su molcula. Los mtodos mencionados anteriormente no son apropiados
para la regulacin de reacciones especificas de diana, como ocurre cuando se requi
ere la estereoespecificidad configuracional del conjugado. Como se muestra en la
Figura 35-2, se han desarrollado mtodos de conjugacin nuevos (Kato. 1975; Kitagaw
a. 1978) empleando un reactivo de conjugacin sofisticado, el ster de m-maleimidobe
nzil-N-hidroxisuccinimda (MBS). El MBS es un reactivo bivalente que consiste en u
n ster activo y la maleimida. que pueden reaccionar con un grupo NH, y un grupo S
H, respectivamente. El grupo carboxilo tambin puede ser utilizado como una diana
especfica para la conjugacin con un residuo a- o i-NH presentes en una proteina em
pleando N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivo de conjugacin. El reactivo NHS t
ambin conjuga protenas o el grupo carboxilo introducido en una fase slida. Las partc
ulas que se emplean en los ensayos de aglutinacin de partculas se enumeran en la T
abla 35-2 El fenmeno de la aglutinacin de partculas (aglutinacin directa) causado po
r una reaccin inmune, se observ por primera vez en un ensayo para detectar la pres
encia de antigeno tras la incubacin con el suero de un paciente infectado. La agl
utinacin de eritrocitos tras la incubacin con el suero dio lugar al descubrimiento
de los grupos sanguneos ABO. Los inmunoensayos de partcula se basan en el princip
io de aglutinacin y emplean como reactivo un anticuerpo o un antigeno unido a una
partcula inerte, en lugar de la precipitacin directa de un complejo antigeno-anti
cuerpo. Como sonda, la partcula puede aumentar significativamente la sensibilidad
del inmunoensayo. independientemente de si la aglutinacin resultante se detecta
a simple vista o mediante instrumentos espectrofotomtricos para su cuantificacin.
Los entreoos, partculas de gelatina. Iiposomas. soles de metal, y varios tipos de
partculas de ltex, incluyendo el ltex modificado con xido de nierro o tintes, funcio
nan c o m o fases slidas tiles en estos ensayos. El dimetro de las partculas emplead
as en reacciones de aglutinacin vara entre 7 pm y 0,01 pm. N o existe una nica teora
que explique las reacciones de aglutinacin (Kasahara, 1992a) debido a la gran va
riedad de lamao de las partculas empleadas. Para partculas mayores de 3 pm a 5 pm d
e dimetro, no se observa a temperatura ambiente el movimiento browniano de partcul
as dispersas actuando de acuerdo con el coeficiente de difusin. Sin embargo, la t
eora de la energa potencial de la interaccin entre partculas, o la teoria de la reac

cin de coagulacin de coloides, se pueden aplicar a partculas pequeas c o m o pueden

ser las micropartculas de ltex. La IgM, por ser multjvalente, se estima que es una
s 750 veces ms eficiente en una reaccin de aglutinacin que una molcula bivalente de
IgG. La distancia entre partculas en una floculacin debe ser m e n o ro igual a 12
0 Adebido a la longitud de la molcula de anticuerpo. En resumen, los factores imp
ortantes a tener en cuenta en una inmunorreaccin de fase slida son las propiedades
de la superficie de las partculas, como su carga e hidrofobicdad, y la estabilida
d de la dispersin.
Caractersticas de la fase slida
Todos los inmunoensayos heterogneos que emplean conjugados con sondas, incluidos
los radioistopos, requieren al menos un paso para diferenciar el anligeno que ha
reaccionado para formar un inmunocomplejo (unido), del que permanece sin reaccio
nar (libre). La inmovilizacin de antigenos o anticuerpos en una fase slida se real
iza mediante uniones covalentes o mediante adsorcin tsica a travs de interacciones
no covalentes. Se han empleado como lase slida, partculas de gel hechas de agarosa
. poliacrilamida. cuentas de plstico o placas de poliestireno. y tambin partculas r
ecubiertas de oxido de hierro que pueden separarse en un campo magntico. A menudo
se utiliza la cara interna de un tubo o un pocilio de microtiter. como fase slid
a. Con estas fases slidas relativamente grandes, puede ser necesaria la agitacin d
e la mezcla de reaccin para acortar el tiempo necesario para que tenga lugar la r
eaccin inmune. El fenmeno prozonal o efecto de gancho, se debe a una elevada conce
ntracin de analito, y es probable que se observe en un inmunoensayo de un solo pa
so cuando se emplean cantidades limitadas de anticuerpo en fase slida, o cuando s
e usan antiINMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS Origen y principios de la reaccin de
precipitina
El precipitado que se forma cuando grandes complejos de antigeno se combinan con
anticuerpos para formar un entramado insoluble se ha utilizado ampliamente en l
a identificacin y cuantificacin de las reacciones de precipitina. La aplicacin de l
as tcnicas de precipitina posee las ventajas de la sensibilidad, especificidad y
sencillez. La limitacin que supone la sensibilidao de estos ensayos requiere de u
na importante consideracin. Incluso en las

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA
825
Tabla 35-2 Partculas empleadas como sonda en el inmunoensayo de aglutinacin de par
tculas Mtodo de ensayo Eritrocitos humanos humana (VIH) Eritrocitos de ave Mezcla
de eritrocitos animales (HBV) Ltex Ltex (color) Microcpsulas Parliculas de gelatina
Parliculas pohpeptdicas Partculas de silicato Partculas de oro Soles de metal Hema
glutinacin directa (Landsteiner) I lemaglutinacin eritrocito-anticuerpo: placa de
microtiter/portaobietos Hemaglutinacin directa Hemaglutinacin pasiva: placa de mic
rotitor Hemaglutinacin pasiva indirecta: placa de microtiter Aglutinacin pasiva in
directa: portaobjetos Aglutinacin pasiva indirecta: turbidimetra Aglutinacin pasiva
indirecta Inmunocromatografa Aglutinacin pasiva: placa de microtiter Aglutinacin p
asiva: placa de microtiter Aglutinacin pasiva indirecta: cmara CCD Aglutinacin pasi
va e indirecta Aglutinacin pasiva: placa de microtiter/cmara CCD Fotometria mejora
da con aglutinacin indirecta Aglutinacin indirecta Suministro Grupo sanguneo ABO An
ticuerpo para el virus de la Anticuerpo Irenle virus de la gripe humano Anticuer
pos de T allldum Antigeno de superficit del virus de la Hepatitis I Gonadotropma
corinica Ferriti na Gonadotropma corinica humana (hCG) Anticuerpo para T pallidum
Anticuerpos para HIV. T. pallidum Hemoglobina humana (hHb) Anticuerpo para T pa
llidum, y para HBs Anticuerpo para T pallidum Estrgeno total hCG. hHb id Biosenso
r
De Kasahara Y Principles and applications ot particle immunoassay En Nakamura RM
Kasahara Y. Rechnitz GA (ed ). Imnu Technology lor the 1990s Washington DC Amer
ican Society lor Microbiology. 1992b. pags. 127-147. con permiso
mejores condiciones de mejora de la sensibilidad que ofrecen nuevas tcnicas de di
fusin de luz. el lmite inferior de sensibilidad de ensayos de inmunoprecipitina se
mantiene en el orden de 0.1 a 0.5 mg/dl. Este umbral de sensibilidad es suficie
nte para la cuantificacin de las principales protenas sricas. La reaccin de precipit
ma forma la base de muchas tcnicas inmunoquimicas cuantitativas y cualitativas qu
e se emplean en los laboratorios clnicos (Kabat. 1961). Los factores que afectan
a la reaccin de precipitina fueron investigados detalladamente por Heidelberg en
1935, quien encontr que las proporciones relativas entre reactivos, condiciones d
e temperatura, pH y fuerza inica del medio, y las caractersticas de avidez y afini
dad del anticuerpo, son todas de igual importancia para la formacin del precipita
do inmune. En cuanto al patrn de formacin de precipitma cabe notar que existe un p
unto en que la precipitacin es mxima u ptima, denominado punto de equivalencia. La
adicin continuada de antgeno una vez que se ha alcanzado el punto de equivalencia
produce un efecto solubilizador del precipitado. El rango apropiado para la dete
rminacin de analitos debera de llegar hasta la zona de equivalencia. La optimizacin
de la concentracin del anticuerpo que se va a emplear como reactivo es necesaria
, al igual que la optimizacin de las soluciones tamponadas. Los mtodos de precipit
acin ms tpicos son los siguientes:
INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS Principio de aglutinacin de partculas
La reaccin de aglutinacin se puede emplear para detectar anticuerpos presentes en
individuos que han sido sensibilizados con antigenos especficos (aglutinacin direc
ta o pasiva) (Figura 35-3B). La aglutinacin inversa emplea un anticuerpo especfico
que se emplea para detectar antgenos solubles en el individuo (Figura 35-3A). Un
dominio de unin a haptenos (para drogas, hormonas o partculas pequeas) no forma un
a estructura entrecruzada, y por tanto no se aglutina a no ser que se inmovilice
en una fase slida. Como se muestra en los paneles A y 6 de la Figura 35-4. cuand
o se emplea una partcula o un transportador inmovilizado con un hapteno como reac
tivos, puede darse una inhibicin de la reaccin de aglutinacin que permite la detecc

in del hapteno. Este ensayo se basa en el principio de competitividad, en el que

la aglutinacin de partculas de hapteno con una cantidad limitada de anticuerpo, li
bre o unido a partculas, se inhibe debido a la presencia de hapteno libre present
e en la muestra. Adems, partculas marcadas pueden reaccionar con reactivos fijados
a una fase slida de la membrana. Este tipo de ensayo ha sido m u y popular como
un mtodo sencillo para la deteccin cualitativa de gonadotropma corinica humana (hCG
) y otros analitos.
Mtodos cualitativos del ensayo de precipitacin
Inmunodifusin sencilla (Williams. 1970) Inmunodifusin doble (Garvey, 1977) Inmunod
ifusin doble en dos dimensiones (Williams, 1970) Reaccin de electroinmunodifusin (R
itzmann, 1975) Inmunoelectroforesis (Rose. 1973)
Hemaglutinacin
Las pruebas de hemaglutinacin (Boyden, 1951) son sencillas en su realizacin y no r
equieren un equipamiento especial. Por este motivo, tanto los pases desarrollados
como los que se encuentran en vas de desarrollo, han adoptado una variedad de en
sayos de hemaglutinacin. Una de las pruebas de hemaglutinacin ms extendidas es la q
ue se emplea para la deteccin de anticuerpos contra Treponema pallidum. comercial
izado como Serodia-TP por Fujirebio, Inc (Tokio. Japn). En Estados Unidos, el ens
ayo de hemaglutinacin para Treponema pallidum se aprob en 1981 por el Center for D
isease Control (CDC). Tambin fue recomendado por la Organizacin Mundial de la Salu
d (OMS) gracias a su superioridad Irente a otros tipos de ensayo en cuanto a su
especificidad y sensibilidad (Kasahara. 1992b). En el ensayo de aglutinacin de Tr
eponema pallidum. el reactivo consiste en eritrocitos sensibilizados y desensibi
hzados de oveja, y una solucin diluyeme del suero para la reconstitucin de clulas s
ensibilizadas liofilizadas como control positivo Se pueden llevar a cabo ensayos
cualitativos y semicuantitativos mediante el uso del siguiente protocolo de dil
ucin del suero, empleando una placa de titer como recipiente de la reaccin: emplea
ndo una
Mtodos semicuantitativos del ensayo de precipitacin
Inmunodifusin radial sencilla (Manzini. 1965: Fahey, 1965) Electroinmunodifusin en
una sola dimensin (Axelsen. 1975) (electroforesis 'cohete")
Inmunoensayos
nefelomtricos
Se han desarrollado vanas tcnicas de anlisis por inmunoprecipitina que emplean sis
temas de dispersin de la luz (Ritchie. 1978). La formacin de los complejos inmunolg
icos se ha asociado a la cantidad de dispersin de luz y se ha empleado como la ba
se para la cuantificaon del antgeno Se han diseado instrumentos sofisticados que rpi
damente miden la dispersin de la luz. Las medidas de dispersin de la luz generalme
nte se denominan turbidimetrias o nefelometras.

826
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

A n t g e n o o haptcno conjugado en una p a r t c u l a

Anticuerpo en la muestra
Figura 35-3. Principios del inmunoensayo de aglutinacin pasiva de partculas para l
a deteccin de antgenos de mltiples eptopos [A) o de anticuerpos (B). (De Nakamura RM
, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology
for 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. c
on permiso.)
pipeta de 25 uj, poner cuatro gotas (100 ul) del diluyeme de suero en el pocilio
1 (Fig. 35-5) y una gota en los pocilios 2 y 4 del ensayo cualitativo (los poci
lios del 2 al 8 se van a utilizar para el ensayo cuantitativo). Los patrones de
aglutinacin resultantes se muestran en la Fig. 35-6. Los patrones negativos, que
indican que la reaccin inmune no ha tenido lugar, muestran partculas en floculacin
condensadas con una estructura entrecruzada en el fondo del pocilio. Por el otro
lado, los patrones positivos indican que la reaccin inmune ha tenido lugar, y mu
estran un patrn de aglutinacin de partculas extendido. Las partculas aglutinadas no
se pueden sedimentar ms para obtener una condensacin como en los patrones negativo
s, porque se pierde su forma global en la aglutinacin. En las filas primera y seg
unda, se emplearon el suero y las clulas no sensibilizadas (control negativo), re
spectivamente. Los individuos 1 y 2 muestran resultados negativos. Los individuo
s 3 a 8 muestran resultados negativos o positivos, dependiendo de la dilucin de l
a muestra. Se obtiene un resultado positivo para los individuos 7 y 8 hasta una
dilucin de 1:2.560 (filas 3 a 8). Existen tote de hemaglutinacin para la deteccin d
e anticuerpos frente al virus de la hepatitis (HBV), hepatitis tipo (HCV), el vi
rus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1/2), la tiroglobulina, microsomas tiroi
deos y otras sustancias. Ensayos de hemaglutinacin inversa se emplean para la det
eccin del antgeno de superficie de HBV. la a-fetoprotena (AFP), hemoglobina humana,
etc. La sensibilidad de las pruebas de hemaglutinacin es de aproximadamente 50 n
g/ml para la deteccin de antgeno (analito). Kemp (1988) desarroll un nuevo ensayo d
e hemaglutinacin que emplea un anticuerpo monoclonal especfico para el antgeno de s
uperficie de los eritrocitos humanos. Este anticuerpo puede reconocer un eptopo c
omn a diferentes tipos de eritrocitos y a clulas anormales, como las que se encuen
tran en casos de anemia falciforme. Tal y como se muestra en la Figura 35-7, los
eritrocitos de las muestras se emplean como partculas de fase slida, y la aglutin
acin resultante puede observarse a simple vista. Los anticuerpos bivalentes se
conjugan qumicamente para que un anticuerpo reaccione especficamente con los eptopo
s de superficie del eritrocito, y el otro es especfico para el antigeno diana o a
nalito. El ensayo se aplica para la deteccin de anticuerpos frente a VIH, adems de
para la deteccin de varios antigenos. A diferencia de otras formas de aglutinacin
convencionales, no requiere la separacin de plasma o suero. Este ensayo es simpl
e y ahorra tiempo, y adems, presenta ventajas en cuanto a la seguridad, porque el
imina la necesidad de la separacin del suero en el caso de muestras peligrosas po
sitivas para VIH o HBV.
Aglutinacin de partculas de gelatina
El desarrollo de una partcula especial de gelatina con una superficie muy hidrofli
ca que es capaz de evitar la unin inespecfica de materiales presentes en la muestr

a ha supuesto una alternativa a los eritrocitos (Ikeda, 1984). La partcula se pre

para por separacin de fases y entrecruzamiento tridimensional a 40'C y pH ptimo. L
a partcula resultante se tija con formaldehdo o glutaraldehido, y su dimetro es de
unas 3 um. Las propiedades fsicas de las partculas de gelatina en comparacin con la
s de los eritrocitos se muestran en la Figura 35-8. Una partcula de gelatina care
ce de antigenicidad y est, por tanto, libre de los problemas asociados con el emp
leo de anticuerpos heteroflicos cuando se emplean eritrocitos como partculas. Este
tipo de partcula artificial requiere una menor dilucin del suero para evitar las
uniones inespecificas y garantiza una deteccin ms sensible que en el caso de los g
lbulos rojos. Otras partculas sintticas (Hirayama, 1991) compuestas de cido L-glutmic
o y sus derivados han sido desarrolladas por Mirayama (1991) como alternativa a
las partculas de gelatina. Estas partculas sintticas se pueden teir de cualquier col
or porque las partculas son incoloras, al igual que las de gelatina. El ensayo de
aglutinacin de partculas de gelatina se emple inicialmente para la deteccin de anti
cuerpos frente al virus linfotrpico humano de tipo I (HTLV-1), que se descubri ini
cialmente c o m o un
f

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA
827
Menos agregados y de menor tamao
Figura 35-4. Principios del inmunoensayo de inhibicin de partculas para la deteccin
de antgenos con un solo epitopo (haptenos), empleando partculas de antigeno con a
nticuerpos libres (A) o fijados (8). (De N a k a m u r a RM, Kasahara Y. Rechnit
z GA |eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washin
gton, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

828
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
Figura 35-5. Ensayo de hemaglutinacidn para la deleccidn del antigeno de T. pall
idum (Serodia-TP, Fujireblo, Inc, Tokio, Japon) basado en prolocolos de ensayos
semicuantitativos (De Nakamura RM. Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical
Assays and Biosensor Technology for the 1 9 9 0 s Washington. DC. American Soci
ety for Microbiology. ASM Press. 1992. con permiso)
retrovirus humano. Este ensayo de aglutinacin (Ikeda, 1984) rpidamente se hizo muy
popular para la deteccin de VIH. HBV y HCV gracias a su alta sensibilidad y espe
cificidad, a su sencillez y a que no es necesario un control m u y estricto de l
a temperatura. L a aglutinacin de partculas de gelatina puede sustituir cualquier
ensayo basado en la hemaglulmacin, con la excepcin de ensayos que emplean los erit
rocitos de la muestra como partculas.
Aglutinacin con ltex
La aglutinacin con ltex (Galvin. 1984). utilizando partculas de ltex, se ha utilizad
o para la deteccin de vanos analitos. como la hCG para las pruebas de embarazo, y
la deteccin cuantitativa de otras protenas plasmticas con o sin instrumentacin. El
procedimiento de este ensayo cualitativo es sencillo. Por ejemplo, es posible qu
e uno solo tenga que mezclar unas gotas del ltex sensibilizado con el reactivo y
la muestra empleando un palito, sobre un cubre negro. Dos o tres minutos ms larde
, se puede detectar a simple vista la aglutinacin de fase invertida, como resulta
do de la inmunoreaccin. La aglutinacin con ltex se adapt para ensayos cuantitativos
empleando mtodos de deteccin lumnica basados en la turbidimetria (absorcin de la luz
) o nefelometra (dispersin de la luz). Con eslas tcnicas, la aglutinacin de ltex adqu
iere una mayor sensibilidad de subnanogramos por mililitro, mientras que la sens
ibilidad del ensayo midiendo la precipitacin intacta del complejo antgeno-anticuer
po es menor de 0.5 ug'ml.
longitud de onda empleada. La mayora de los reactivos de ltex disponibles de forma
comercial con un dimetro inferior a 1 pm. se aplican a analizadores qumicos automt
icos empleando principios de medida fotomtncos. Para mejorar todava ms la sensibili
dad, se trat de mejorar los reactivos y la instrumentacin, as como optimizar el tam
ao de la partcula, seleccionar la longitud de onda apropiada, y mejorar el softwar
e del sistema informtico que integra los datos. Ahora existen sistemas automatiza
dos que emplean partculas de ltex, y pueden procesar unas 200 muestras por hora co
n una sensibilidad de subnanogramos por mililitro.
Inmunoensayo por contaje de partculas
El inmunoensayo por cmputo de partculas (PACA: parde-counting immunoassay) (Masson.
1986) emplea el contaje celular ptico para obtener el descenso en partculas libres
despus de la inmunoreaccin. En el formato PACA, se puede medir tanto el ritmo del
ensayo, es decir, el ritmo en el que decrece el nmero de partculas libres, o el va
lor final cuando ha finalizado la reaccin. La medida del ensayo al final de la re
accin puede emplearse para obtener una sensibilidad del nivel de nanogramos por m
ililitro; sin embargo, se requiere un mayor tiempo de incubacin.
Inmunoensayos con otras partculas
Se han desarrollado inmunoensayos de dispersin cuasi-elstica empleando la medida d
el cambio en la respuesta a la distribucin del tamao de la partcula (Yarmush. 1987)
. Esla tcnica utiliza un haz de lser para medir la reduccin en la media del coefici
ente de difusin de las partculas como resultado de la reaccin inmune. Otros mtodos m
iden la variacin de anisotropa angular de la luz dispersada con el incremento del

tamao medio de la partcula.

Ensayo de turbidimetha con ltex
La absorcin de luz (prdida de luz mediante su dispersion en la superficie de una p
artcula) es proporcional al dimetro de la partcula y depende de la

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
829
Figura 35-6. Patrones de hemaglutinacin para detectar anticuerpos anti-I pallidum
(A) e interpretacin c o m o positivo o negativo a la dilucin linal del suero (6).
(De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biose
nsor Technology for the 1990s. Washington, DC. American Society for Microbiology
, ASM Press, 1992. con permiso.]
Glbulos rojos del dolanle
Reactivos bivalentes
Unin pero un aglutinacin
Figura 35-7. Representacin esquemtica de un ensayo basado en la aglutinacin autloga
de eritrocitos, empleando eritrocitos presentes en la muestra como partculas. (De
N a k a m u r a RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Bi
osensor Technology for the 1990s. Washington, DC American Society for Microbiolo
gy. ASM Press, 1992, con permiso.)

830
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Panculas ,ic
yciiiiiiKi
inirocitosdco\cia
Figura 35-8. Micrograta electrnica (x25.000) y propiedades tsicas de las partculas d
e gelatina en comparacin con los eritrocitos de oveja. (De Nakamura RM. Kasahara
Y. Rechnitz GA[eds]: Immunochemical Assays and Biosensor T e c h n o l o g y lor
the 1990s. Washington. DC. American Society (or Microbiology. ASM Press. 1992.
pg. 139, con permiso. |
Las partculas con dimetros parecidos a la longitud de onda consiguen una variacin a
ngular de la dispersin de la luz dependiente del tamao.
se ha descrito en el apartado Cintica de la reaccin de antigeno-anticuerpo, de la
siguiente ecuacin. B/F = K([Ab].-B)
a
Resumen
La hemaglutinacin indirecta y la aglutinacin de partculas de gelatina son ensayos q
ue, realizados en placas de microtiter, han sido m u y populares en procesos de
determinacin cuantitativa y cualitativa de diversos analitos. Estos ensayos no re
quieren instrumentos adicionales ni un control estricto de la temperatura. Lo ms
importante es que estos ensayos garantizan una sensibilidad igual o mayor que la
del inmunoensayo enzimtico convencional en lo que se reliere a la deteccin de ant
icuerpos frente a agentes infecciosos. El ltex como fase slida proporciona unas im
portantes ventajas cinticas, como un menor tiempo de nmunorreaccin. Por este motivo
, ha sido posible adaptar el ltex para su uso en instrumentos sofisticados, aplic
ando principios diferentes y dando como resultado un ensayo con una sensibilidad
de unos 3 rdenes de magnitud mayor que en los ensayos de inmunoprecipitacin conve
ncionales. El ltex es susceptible de presentar interferencias de factores descono
cidos en las muestras. Para eliminar este problema, se han utilizado varios abso
rbentes tanto en el reactivo como en el medio de incubacin. La gran ventaja del i
nmunoensayo de partculas es su simplicidad, ya que no requiere la separacin de los
reactivos libres de los unidos.
el eje Y es la relacin B.'F. que es proporcional a la cantidad de anticuerpo libr
e [Abj de [Ab],-B, igual al antgeno libre [Ag). As. la K, representa la pendiente
de la representacin. En esta figura, la constante de afinidad K, es 8.1 x 10 L'M
para el anticuerpo especifico para la ciclosponna. Las emisiones radiactivas, co
mo los rayos gamma del l, se pueden medir en trminos de cuentas por minuto (CPM)
utilizando un contador de centelleo gamma. Los radioistopos ms frecuentes y sus pr
opiedades se muestran en la Tabla 35-3. La eleccin de la sonda afecta considerabl
emente al protocolo del ensayo. Por ejemplo, una de las sondas ms utilizadas, el
l , necesita un tiempo relativamente corto para el conteo. pero no puede almacen
arse mucho tiempo debido a que tiene una vida media corta. Sin embargo, el triti
o ( H) requiere un tiempo mayor para el conteo. y por tanto incrementa la duracin
del ensayo. La mayo9 ;: Ia 1
RADIOINMUNOENSAYO Origen
Desde que apareci la tcnica del RA. el uso de radioistopos como sonda, que se desarr

oll en primer lugar por Yalow y Berson (1959]. se ha mejorado de una forma espect
acular en cuanto a sensibilidad y precisin. Se han introducido diversas variacion
es del mtodo en el laboratorio clnico. Hay dos tipos principales de RIAs, competit
ivos y no-competitivos, que requieren pasos de lavado para separar la sonda unid
a de la que permanece libre (conjugados). El ensayo competitivo sigue la ley de
accin de masas, que especifica la reaccin entre analitos y protenas de unin, recepto
res y anticuerpo. El tactor clave en la optimizacin del ensayo es la afinidad de
unin del anticuerpo. La representacin de Scatchard de la relacin entre anticuerpo u
nido y libre, frente a la concentracin del analito, se emplea frecuentemente para
evaluar la funcin del anticuerpo. La Figura 35-9 muestra la representacin de Scat
chard para la determinacin de la ciclosponna. Tal y como
Ciclosponna (pg/ml) Figura 35-9. Representacin de Scatchard de las caractersticas
de unin de anticuerpos a la ciclosporina (K = 8,1 x 10 L'M).
a 9

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
831
Tabla 35-3 Propiedades de los radioistopos empleados como sonda en los radioinmun
oensayos Actividad especifica
da de los RA actualmente emplean el l para realizar el proceso de conjugacin y man
tener la actividad biolgica de los reactivos. Un mtodo muy utilizado de conjugacin
de protenas con l es el mtodo de la cloramma-T (Hunter. 1962). La lirosina. en par
ticular, posee una mayor reactividad con el yodato debido a la presencia de un g
rupo hidroxi en la posicin para del anillo aromtico. L a seal puede medirse en trmin
os de CPM como emisiones de radiacin gamma. A diferencia de las enzimas, el emple
o de istopos como sonda, con un radio de Stokes pequeo, no suele afectar a la acti
vidad antignica, debido a la falta de alteraciones alostricas cuando se conjugan i
stopos con antgenos pequeos (haptenos).
l?5
l25
na competitivamente tanto con el conjugado c o m o con el antigeno. Entonces, el
complejo inmunolgico es capturado por un segundo anticuerpo especfico para el pri
mer anticuerpo, asociado a una fase slida. Cuando el segundo anticuerpo se asocia
a una fase slida fina, el complejo inmunolgico de la segunda reaccin puede separar
se como un precipitado, del resto de las molculas que no han reaccionado. Para la
determinacin de un anticuerpo, el anticuerpo unido a una sonda y el anticuerpo d
e la muestra reaccionan competitivamente con el antgeno (analito) fijado a la fas
e slida. Cuanto mayor sea la pendiente de la curva estndar, ms precisos son los dat
os que aporta. Los mtodos competitivos requieren cantidades menores de anticuerpo
o antgeno (analito) que los ensayos de tipo sandwich descritos ms adelante. Los e
nsayos no competitivos, originalmente demostrados por Miles (1968), han cobrado
mayor popularidad en los ltimos tiempos. Los ensayos radioinmunomtricos (IRMA) o e
nsayos de sandwich (Fig. 35-12), tienen una relacin alternativa entre el analito
y el anticuerpo. El ensayo competitivo clsico consigue una respuesta inmunolgica c
on una mnima cantidad d e anticuerpo, y el ensayo de sandwich emplea una gran can
tidad de anticuerpo en la fase slida. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales
ha hecho posible la elaboracin de grandes cantidades de anticuerpos especficos a
un coste moderado, permitiendo la explotacin del ensayo de sandwich. El ensayo d
e sandwich emplea un exceso estequiomtrico de anticuerpo y es ms sensible que un e
nsayo competitivo. Cuando se elimina por completo el fondo, la sensibilidad teric
a ltima del ensayo de sandwich es de una molcula de analito, lo cual es posible cu
ando la cantidad de anticuerpo utilizada en el ensayo se acerca al infinito. Com
o se muestra en la Figura 35-12, el anticuerpo en la fase slida primero se une al
antgeno (analito) de la muestra. Despus de la separacin B'F, el conjugado reaccion
a con el antgeno (analito) fijado a la fase slida, y la seal se puede medir despus d
e la eliminacin de los conjugados libres mediante un paso de lavado. Este ensayo
requiere antgenos con ms de dos determinantes antignicos. Cuando se emplean dos ant
icuerpos diferentes (es decir, un anticuerpo asociado a la fase slida especfico pa
ra un determinante antignco, y un anticuerpo conjugado especfico para otro determin
ante antignico), el protocolo de ensayo puede simplificarse haciendo el sandwich
en un solo paso. As, la fase slida puede mezclarse con el antgeno de la muestra y c
on el conjugado simultneamente. No se produce interferencia porque ambos anticuer
pos, tanto el de la fase slida como el conjugado, son capaces de reconocer distin
tos determinantes antignicos. En este ensayo la seal generada es proporcional a la
concentracin del analito presente en la muestra, al igual que en el ensayo de sa
ndwich en dos pasos. Este mtodo de ensayo se puede aplicar a la deteccin de anticu

erpos con un formato de ensayo que emplea antgeno en la fase slida y antgeno acoPrincipios y mtodos del ensayo
Se han desarrollado varios mtodos (exceso de antigeno) basados en la unin competit
iva (Ekins, 1960) a anticuerpos, entre antgenos con y sin sonda (analitos present
es en la muestra), para una amplia gama de analitos. Un mtodo competitivo convenc
ional se muestra en la Figura 35-10. En un principio, una cantidad conocida de a
ntigeno acoplado a una sonda y el antgeno de la muestra se mezclan y reaccionan c
on una cantidad constante de anticuerpo unido a una fase slida, como puede ser pa
rtculas de sefarosa o la cara interna de tubos de plstico. Despus de que la reaccin
inmune alcance el equilibrio, la mezcla se lava para eliminar los conjugados que
no han reaccionado y se separan los antgenos del complejo inmunolgico que permane
ce atrapado en la fase slida. El paso de lavado aparece como separacin B/F {bound:
unido/free: libre). Aplicando el principio de la competilividad, la representac
in del porcentaje de antigeno unido frente a la concentracin logartmica del analito
produce la curva estndar que muestra la Figura 35-10. La representacin de CPM sob
re la curva estndar nos da la concentracin del analito. Otro mtodo que emplea antic
uerpos se muestra en la Figura 35-11. El primer anticuerpo es especfico para un d
eterminado antgeno (analito) y reaccio-

832
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
->Conccnir;icit>ii de analto
Figura 35-11. Principio de un ensayo de RA competitivo empleando un segundo antic
uerpo para la separacin B'F (unido/libre). piado a una sonda. Para un formato en
dos pasos, se puede emplear el antgeno en la fase slida y un anticuerpo especfico p
ara el anticuerpo diana acoplado a una sonda. Empleando el formato de sandwich,
la sensibilidad del ensayo es elevada (Espinosa. 1987). Un ejemplo es utilizar I
RMA para la determinacin de la hormona estimulante del tiroides (TSH): el nivel d
e sensibilidad del ensayo es inferior a 0.07 pU/ml de TSH, en comparacin con unas
0,7 iiU/ml de un ensayo competitivo convencional de antgeno asociado a una sonda
.
Resumen
Comparado con otros inmunoensayos, los RIAs resultan ventajosos p o r varios mot
ivos: 1) precisin y elevada sensibilidad, 2) facilidad en la conjugacin del istopo,
3) deteccin de la seal sin optimizacin y 4) estabilidad frente a la interferencia
ambiental del ensayo, entre otros. Las desventajas del RA son la corta vida en al
macn de los reactivos y la necesidad de proteccin frente a la radiactividad nociva
. Adems, como se discute ms adelante,
Figura 35-12. Principio de un ensayo de RA de tipo sandwich empleando la fase slid
a, tambin conocido c o m o ensayo inmunorradiomtrico (IRMA).

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
833
Tabla 35-4
Comparacin del radioinmunoensayo. el nmunoensayo enzimtico heterogneo y el inmunoens
ayo enzimtico homogneo Pasos de la reaccin inmune Pasos de la reaccin enzimtica Pasos
para la deteccin de la seal
Ensayo Radioinmunoensayo Muestra* Analito o Ab marcado Inmunoensayo enzimtico het
erogneo Muestra+ Analito o Ab -Enzima marcado Inmunoensayo enzimatico homogneo Mue
stra* Analito o Ab Enzima o coladores marcado
Reaccin inmune con pasos de lavado para la separacin
No necesarios
Emisin radiactiva (rayos y)
Reaccin inmune con pasos de lavado para la separacin
Reaccin enzimtica con reactivos adicinalos
Densidad ptica Fluorescencia Luminiscencia
La reaccin inmune y/o sistmica se desarrolla en una sola solucin, que incluye el re
activo para el revelado de la serial enzimtica
La reaccin inmune y/o sistmica se desarrolla en una nica solucin que incluye el reac
tivo para el revelado de la seal enzimtica
Densidad ptica Fluorescencia Luminiscencia
los RA no pueden aplicarse a inmunoensayos homogneos, debido a que las seales de lo
s istopos no pueden modular las reacciones antgeno-anticuerpo.
INMUNOENSAYO ENZIMTICO Origen y clasificacin
Los inmunoensayos cuantitativos que emplean enzimas como sonda se desarrollaron
como una alternativa a los radioistopos (Engvall. 1971: Van Weeman. 1971; Avramea
s. 1971). Los ms utilizados son el ensayo inmunoabsorbente enzimtico (ELISA: enzym
e-linked immunosorbent assay), el EIA y la tcnica del inmunoensayo de multiplicac
in enzimtica (EMIT: enzyme-multiplied immunoassay technique), que es una marca reg
istrada de SYVACo. (D. Behring Inc., Cupertino, CA 95041) (Rubenstein, 1972). Es
encialmente, los EIA heterogneos son similares a los RA, excepto que emplean enzim
as como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogneos, eliminando lo
s pasos de lavado para la separacin B/F que de otro modo son necesarios. La Tabla
35-4 compara las caractersticas de los EIA homo y heterogneos con los RA. Mejoras
en los EIA han aportado muchos formatos innovadores con diferentes grados de rap
idez, sensibilidad, simplicidad y precisin. Las ventajas y desventajas de los EIA
se listan en la Tabla 35-5 (Nakamura, 1992).
ma y por la seleccin de la medida de la seal, entre los que la quimioluminiscencia
es el mtodo ms sensible. El lormato del ensayo de los EIA heterogneos, al igual qu
e los RA. se puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (vase Fig.
35-14). Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antigen

oenzima (Fig. 35-13A). mientras que los ensayos no competitivos (exceso de react
ivo) incluyen los ensayos inmunomtricos de sandwich de dos dianas y los ensayos i
ndirectos para medir anticuerpos (Figs. 35-13Sy Q. Los ensayos inmunomtricos de s
andwich han aumentado su popularidad para la determinacin de antigenos como hormo
nas, marcadores tumorales. protenas plasmticas y agentes infecciosos. Los ensayos
indirectos para la medida de anticuerpos (Fig. 35-13C) se han adoptado para la d
eteccin de anticuerpos frente a agentes infecciosos (p. ej., VIH. HBV. HCV) y aut
oanticuerpos
Tabla 35-5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo enzimtico A. Ventajas t Se p
ueden desarrollar ensayos sensibles gracias al efecto de amplificacin de las enzi
mas. 2 Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una larga vida de
almacenaje 3. Se pueden desarrollar mltiples ensayos simultneamente. 4 Se puede de
sarrollar una amplia variedad de configuraciones del ensayo 5. El equipamiento n
o es necesariamente caro y est ampliamente disponible. 6 No existen riesgos radia
ctivos durante el mareaje ni el desecho de los residuos. B. Desventajas 1. La me
dida de la actividad enzimtica puede ser ms compleja que la medida de la actividad
de algunos tipos de radioistopos 2. La actividad enzimtica se puede ver afectada
por algunos componentes del plasma 3. Los ensayos homogneos, actualmente, poseen
una sensibilidad de 10' M y no son tan sensibles como los radiommunoensayos. 4.
Los EIA homogneos para molculas proteicas grandes se han desarrollado, pero requie
ren reaclivos inmunoqumicos compiojos
J
Inmunoensayos enzimticos heterogneos
El principio de los ensayos de EIA heterogneos es similar al de los RA. excepto qu
e es la actividad enzimtica, no la radiactividad, la que se mide. Los EIA requier
en un proceso secundario para obtener seales mediante la reaccin cataltica de las e
nzimas. Como fase slida para separar los conjugados libres de los unidos, pueden
utilizarse placas de microliter, partculas de plstico, tubos de plstico, partculas m
agnticas y ltex con filtros, entre otros. El uso de pequeas partculas magnticas y de
ltex permite acortar el tiempo de mmunorreaccin, reduciendo asi el tiempo total qu
e requiere el ensayo. El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuv
o marcado por la introduccin de sustratos colorimtricos y fluoromtncos, y ms tarde d
e suslralos quimioluminiscentes. que incrementan la sensibilidad de la seal. Algu
nas de las enzimas ms utilizadas en vanos EIA heterogneos son la peroxidasa de rban
o, la fosfatasa alcalina, la (5-galactosidasa, la glucosa oxidasa. la ureasa y l
a catalasa. Las enzimas ms utilizadas junto con sus caractersticas aparecen en la
Tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando se utilizan enzimas puede determin
arse por la tasa de recambio de cada enziEIA = inmunoensayo enzimtico De Nakamura RM Kasahara Y Heterogeneous enzyme immun
oassays En Nakamura RM. Kasahara Y Rechnitz GA (eds): Immunochemical Assays and
Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC. American Society lor Microbi
ology. 199?. pags 149-167, con permiso

834
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 35-6 Caractersticas de las enzimas tpicas empleadas como sonda en los inmuno
ensayos enzimticos Caractersticas Fuente Tamao molecular (daltons) Actividad especfi
ca Tasa de renovacin" Medida de la enzima Medida de alta sensibilidad Mtodo de mar
eaje de la enzima Peroxidasa (EC 1.11.1.7) Rbano ca. 40.000 250 U/mg 10 000 Color
imetria, fluorimetria. luminometria Luminometra Oxidacin del periodato (mtodo de Na
kane) Enzima f5-galactosidasa (EC 3.2.1.23) E. coli ca. 530.000 600 U/mg 318000
Colorimetria, fluorimetria, luminometra Fluorimetria Mtodo de la dimaleimida, reac
tivo de entrecruzamiento' Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) Intestino bovino 140 0
00 1.000 U/mg 250 000 Colorimetria, fluorimetria, luminomelria Luminometria Mtodo
del glutaraldohdo, reactivo de enlrecruzamiento
' Nmero de molculas del sustrato producidas por una molcula de enzima en una reaccin
de un minuto; nmero de molculas/MU El reactivo contiene grupos qumicamente reactivo
s c o m o el maleimida y el succinimida.
1

>
Un EIA heterogneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos: 1. La fase slida un
ida a los reactivos se mezcla con el analito. independientemente de si el ensayo
se basa en el formato competitivo o no competitivo. 2. Despus de la adicin del co
njugado y la incubacin, hay unos pasos de lavado con una solucin tamponada que con
tiene un detergente, uno o dos pasos despus de la inmunorreaccin. La reaccin inmuno
lgica debe alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable
.
3. La fase slida, con el complejo inmune que contiene el antgeno conjugado a una e
nzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solucin de sustra
to enzimtico. 4. La reaccin enzimtica se detiene (no es necesario en el ensayo de t
asas) y el producto de la reaccin se mide con varios detectores dependiendo del s
ustrato empleado.
Ensayo
enzimtico
colorimtrico
En este ensayo, la reaccin enzimtica se realiza utilizando sustratos cromognicos pa
ra desarrollar un color mediante la reaccin cataltica principal. Por ejemplo, la p
eroxidasa de rbano, catalizando el ABTS [sal de diamonio de 2,2'-azino-di(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar un color verde, y la fosfatasa alc
alina, especifica para el p-nitrofenil fosfato para dar un color amarillo. Ambas
enzimas son los tipos ms utilizados en los inmunoensayos enzimticos colorimtricos.
Un espectrofotmetro se utiliza para medir la densidad ptima del cromgeno resultant
e. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir la densidad ptica en
tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizad
o que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresin de los resultados, ha
sta instrumentos manuales ms sencillos. Cuando la reaccin EIA se hace sobre una me
mbrana de nitrocelulosa (mtodo de transferencia Western) u otras membranas, se em

plean sustratos que generan tintes insolubles. Un test de embarazo para la hCG e
n un formato de inmunoensayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados
de la benzidina que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfa
to que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados
. El precipitado de color que se acumula en la fase slida por la accin de la enzim
a puede detectarse a simple vista. Tericamente, la medida de la densidad ptima est
limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determinacin de la densidad ptica
de analitos que requieren un amplio rango puede resultar problemtica, incluso cua
ndo se emplean un exceso de conjugado y fase slida con suficiente capacidad de ca
ptura en un ensayo de tipo sandwich.
2 2
Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los inmun
oensayos no isotpicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs, como
son los residuos radiactivos, radilisis de los analitos marcados, y la corta vid
a media del l. Ishikawa (1989) desarroll un EIA ultrasensible que puede detectar
3 fmoles de una IgG especfica. Para alcanzar este nivel de sensibilidad, se requi
eren varios pasos tediosos, c o m o la transferencia del inmunocomplejo de una p
rimera fase slida a otra distinta para reducir las seales de fondo.
l25
Inmunoensayo
enzimtico
fluorescente
LE N S A Y O de anticuerpo
Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimtico (EIA) empleando la fase slida:
(A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.
Los EIA fluorescentes son idnticos a otros EIA excepto en que utilizan sustratos
fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluorforo se genera por la reaccin enzimt
ica. Despus de la excitacin del fluorforo a su longitud de onda de excitacin ptima, s
e emite luz a una longitud de onda caracterstica. Instrumentos como un fluormetro
requieren una fuente de suministro de la luz de excitacin y un fotomultiplicador
como detector de la emisin de flores-

CAPTULO
35
INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
835
AMI'I'I)
AMIM)
Interim diario ( I
ESTADIO SI
Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimiol
uminiscente para la deteccin de la fosfatasa alcalina (ALP). La eliminacin hidrolti
ca del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrni
co iniciada qumicamente (CIEFL: chemically initiated electron exchange lummiscenc
e) con la descomposicin del AMPPD mediante la liberacin de dioxetano fenolato (AMP
D) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxe
tano tiene lugar mediante la formacin del intermediario de transferencia de carga
(CT) y la consiguiente rotura del perxido cclico. Tiene lugar una liberacin de ene
rga con emisin de luz.
cenca. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en la mues
tra. Estas sustancias aumentaran la seal de fondo, lo cual puede interferir en la
sensibilidad del ensayo. As. se debe prestar atencin a la eleccin de sustratos para
los EIA para evitar estos factores. Comparado con los EIA colorimtricos, los ens
ayos fluorescentes generan una intensidad de seal que es al menos de un orden de
magnitud mayor.
Inmunoensayo
enzimtico
quimioluminiscente
Los inmunoensayos enzimticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean sustratos quimi
oluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se emplean c o m o sonda La
reaccin enzimtica quimioluminiscente genera luz. similar a la bioluminiscencia. e
implica el uso de sustratos naturales como la luciferin-adenosina trifosfato (A
TP). Durante los ltimos 20 aos, se ha prestado mucha atencin a la aplicacin de la qu
imioluminiscencia en los inmunoensayos. y se ha desarrollado una variedad de sis
temas que combinan enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados
del luminol con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano par
a la fosfatasa alcalina, consiguen inmunoensayos m u y sensibles. Estos ensayos
son efectivos como herramientas en el diagnstico prctico. La reaccin de oxidacin enz
imtica de anlogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho en los CL-EIA. El e
mpleo de peroxidasa con H,0- es un mtodo frecuente que se puede cambiar por una e
nzima productora de H.O, como la glucosa oxidasa o la uncasa. El descubrimiento
de los potenciadores por parte de Thorpe (1985) para la quimioluminiscencia basa
da en luminol mejora notablemente la sensibilidad del ensayo. Los potenciadores
incluyen derivados del fenol y compuestos aromticos. Por ejemplo, la luminol-pero
xidasa con p-iodofenol c o m o potenciador consigue un incremento de la emisin de
luz de unas 2.800 veces en una mezcla de reaccin optimizada. Este ensayo puede d
etectar la TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las rea
cciones oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por mltiple
s factores que causan un aumento de las seales inespecficas de fondo (ruido). Bron

stein (1989a) desarroll un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina

que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo sustrato se conoc
e como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano3,2'-triciclo-[3.3.1.1]deca
no]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de adamantilo. No requiere mo
lculas adicionales para la emisin de luz quimioluminiscente, a diferencia del lumi
nol, que requiere compuestos oxidativos externos a las molculas de luminol. AMPPD
es una molcula nueva que constituye un sustrato completo porque est compuesta por
un grupo adamantilo c o m o estabilizador de toda la molcula, la unin de dioxetan
o como fuente de energa, el ster de fosfonlo como diana de escisin para la enzima,
y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola molcul
a. La estructura de la molcula y el proceso de reaccin para la generacin de luz se
muestran en la Figura 35-14. La escisin del enlace fosfoestrico del AMPPD por la f
osfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por
intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically nitiated elect
rn exchange luminiscence). mediante la liberacin del grupo dioxetano rico en elect
rones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda mxima de 477 nm se puede
detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuantas horas, dependiendo de la co
ncentracin de sustrato. El sistema de ensayo de la fosfatasa alcalina con el AMPP
D tiene una sensibilidad de menos de 10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka.
1991). El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que
se usa como sonda enzimtica. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instrumento
totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarrollo de siste
mas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sensibles. Se usan partcul
as frricas de 0.3 pm de dimetro c o m o tase slida para acortar el tiempo de mmunor
reaccin a unos 30 minutos y para proporcionar una mayor superficie de inmunoabsor
con. L a relacin entre la seal quimioluminiscente y la concentracin de analitos es l
ineal hasta unos siete rdenes de rango dinmico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishiz
ono, 1991) era 10 veces mayor que la de un RA convencional cuando se ensay la AFP;
se detect un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos. As. l
os nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejora sobre lo
s RA en trminos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza del proceso y estn
ganando en popularidad en el mercado.
2
Inmunoensayos enzimticos homogneos Origen
Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es disear in
strumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogneos de reactivos,
y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado
complicados, como los que requieren los EIA heterogneos. Las enzimas y sus cofact
ores son sondas ventajosas en los E I A homogneos porque la actividad enzimtica se
puede modular fcilmente cambiando los factores presentes en el microambiente de
la reaccin Ag-Ab. Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radio
istopo como seal. Actualmente, los EIA homogneos son menos sensibles que sus equiva
lentes heterogneos. Los EIA heterogneos convencionales tienen una sensibilidad equ
ivalente a la de los RA en muchas aplicaciones, mientras que los EIA homogneos (Na
kamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o dos rdenes de magnitud inferior
. Los EIA homogneos pueden necesitar reactivos inmunoqumicos complejos, pero los s
istemas de ensayo son rpidos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos conv
encionales. H a y varios tipos de EIA homogneos En cada uno de estos ensayos, la
interaccin antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda aco
plada a la enzima en presencia de sustrato. La modulacin de la actividad enzimtica
refleja el grado de reaccin inmunoqumica. En la Tabla 35-7 aparece una lista de l
as caractersticas de los EIA homogneos tpicos. Los EIA homogneos se pueden clasifica
r en ensayos de unin competitivos o no

836
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Tabla 35-7 Clasificacin y caractersticas de un inmunoensayo enzimtico homogneo tpico

Nombre y tipo de ensayo Competitivo' EMIT SLFIA ARIS Inmunoensayo de canalizacin
enzimtica Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina CEDA No competitivo' Inmunoe
nsayo de anticuerpo hbrido Conjugado Antigeno con hsozima. G6PD Antigeno con sust
rato Anigeno con grupo prosttico Antigeno con G6PD y hexocinasa Antigeno con avidi
na Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa Tipo de modulacin Inhibicin alostnca
Inhibicin alostnca Inhibicin alostnca Facilitacin mediante proximidad Inhibicin alost
ca Inhibicin aloslrica
s
Anticuerpos hbridos especficos para el Inhibicin alostrica antgeno y el inhibidor Inm
unoensayo de unin proximal Anticuerpo con G6PD y hexocinasa Cascada de suslratos
por proximidad Anticuerpo con amilasa Inhibicin alostrica EIHIA Anticuerpo con |Jgalactosidasa y anticuerpo Electo de cargas Inmunoensayo enzimtico mejorado frent
e al succinil Anticuerpo con peroxidasa Estabilizacin AEST La negrita indica que
el nombre de la enzima est escrito y la enzima descrita en detalle en el texto G6
PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoass
ays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Bio
sensor Technology for the 1990s Washington, DC, American Society lor Microbiolog
y. 1992a. pags. 169-82. con permiso.
competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos sin e
mbargo, la unin de anticuerpos especficos para haptenos a su ligando acoplados a u
na enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibicin
de la actividad enzimtica. Los haptenos libres presentes matos de ensayo, el antge
no (analito) se puede conjugar al sustrato o a un en la muestra o en el estndar l
iberan esta inhibicin compitiendo por la unin grupo prosttico de la enzima. Por el
contrario, los ensayos de unin no coma los anticuerpos. Asi, la actividad enzimtic
a es proporcional a la concentrapetitivos emplean un conjugado compuesto por un
anticuerpo acoplado a una cin de haptenos libres. Como regla general, el anticuer
po inhibe a la enzima enzima. De entre los distintos tipos de mtodos mencionados,
se presta espeinduciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para
la activicial atencin a cinco EIA homogneos. dad enzimtica (Rowley, 1975). La excep
cin al mecanismo de inhibicin es el ensayo EMIT para la troxina, que emplea la mala
to deshidrogenasa. En este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenas
a es inactivo enziInmunoensayo de multiplicacin enzimtica mticamente, pero pasa a u
na conformacin activa cuando se une al anticuerpo anti-tiroxina (Ullman, 1979). S
e cree que la tiroxina conjugada inhibe EMIT, el primer EIA homogneo, fue desarro
llado por Rubenstein (1972). la enzima mediante su unin al dominio cataltico, aume
ntando asi la K "apaEl sistema de EMIT est esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 .
En el EMIT, la rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a
la tiroxina del conjugacin de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad en
zimtica;
Forma inactiva del compi ej o enzimtico
Enzima
Forma activa del con jugado enzima-analito Figura 35-15. Diagrama del sistema de
inmunoensayo por multiplicacin enzimtica (EMIT) La actividad de una enzima que ac
ta c o m o sonda est inhibida por la unin del anticuerpo con el antigeno (analito)

conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno. Como enzimas se s

uelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensay
o, la actividad enzimtica es proporcional a la concentracin de analito. (De Nakamu
ra RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Techno
logy for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press
, 1992, con permiso.)

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA
837
Haz de excitacin
Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (S
LFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El sustrato, la |>galactosilum
beliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluoresc
ente El sustrato puede ser escindido por la enzima (1 gaiactosidasa para formar
un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno rea
cciona c o n un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisin
del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la concentracin del a
ntigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de l
luorescencia. (De N a k a m u r a RM. Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemi
cal Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Soci
ety tor Microbiology A S M Press, 1992. con permiso.)
dominio cataltico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa6-fosf
ato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las ms tiles porque tienen menos probabili
dad de verse afectadas por componentes del suero. Estos ensayos generalmente mid
en drogas a concentraciones de miligramos por litro. Sin embargo, el ensayo de l
a digoxina posee un limite de sensibilidad m u y inferior, en un rango de 0,8 a
2 ug'l.
Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado
El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substratelabeled tl
uorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un sustrato fluorognico
caracterstico, el umbeliferil (i-galactsido, unido a un antigeno (analito). El pr
oducto fluorescente que se produce por la accin de la |Vgalactosidasa es la umbel
ilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede actuar sobre el complejo sustrato-a
ntigeno cuando reacciona con un anticuerpo especifico. El antigeno libre (analit
o) presente en la muestra compite con el antigeno conjugado con el sustrato para
formar el complejo inmunologa) (Fig. 35-16). La concentracin del antigeno en la m
uestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescent
e resultante. Se puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y tambin
para protenas c o m o la IgG y la IgM. Una desventaja de este mtodo es que no se
utilizan las propiedades de amplificacin de la enzima, y por tanto, el sistema de
ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentracin molar de anal
ito de 10"' a 10 .
,c
piten por una cantidad limitada del anticuerpo especfico. En el equilibrio, el ni
vel de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) prese
nte en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, per
o no con la que est unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucos
a oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. L
a enzima activa se genera en este proceso, y adems, se ha incluido un mecanismo d
e amplificacin dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para analizar la pr
esencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que emplea el co
njugado de FAD. se ha adaptado rpidamente a la medida de protenas de elevado peso
molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985). y para otros haptenos
c o m o la fenitoma o diversas hormonas.
Inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica
El inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica (EIHIA). desarrollado por Ashihara
(1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un sustrato insoluo

le. Este ensayo es el ms apropiado para la determinacin d e antgenos (analitos) gra

ndes. El EIHIA puede ser homogneo porque el complejo inmunolgico del conjugado con
un antgeno grande bloquea la reaccin enzimtica con el sustrato slido (Fig. 35-18).
La u-amilasa se h a utilizado como sonda enzimtica para la deteccin de ferritna y A
FP. La reaccin inmune del analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede al
canzar su mximo en unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unin n o
competitiva requiere un tiempo de incubacin menor para alcanzar un nivel de detec
cin sensible. Empleando este mtodo, el rango de medida de la femtina en suero es d
e 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextranas
a como enzima alternativa (Nishizono, 1988). Tambin se h a aplicado el EIHIA en u
n formato sobre pelcula seca (Ashihara. 1991). La pelcula seca consiste en tres ca
pas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para la reaccin inmun
olgica y enzimtica. una zona de barrera, y una zona de revelado de color. Se utili
za un inhibidor especifico de la amilasa h u m a n a presente
Inmunoensayo de reactivacin de la apoenzima
El inmunoensayo de reactivacin de la apoenzima (ARIS) es un ensayo homogneo desabo
llado por Morris (1981) empleando el grupo prosttico, que consiste en un dinucleti
do de flavm adenna (FAD), conjugado al antigeno (analito) y la apoenzima glucosa
oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17, el antigeno (analito) y una c
antidad constante del conjugado analito-FAD. com-

838
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Forma activa Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivacin apoenzimtica (ARIS). Se emp
lea el antigeno unido al dinucletido de tlavin adenina (FAD). La apoenzima es la
apoglucosa oxidasa, que requiere FAD c o m o cofactor para su actividad. En el e
nsayo, la concentracin de antigeno (analito) es proporcional a la actividad enzimt
ica generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz G A [eds]: Immunochemical As
says and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lo
r Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.) en suero para prevenir el londo q
ue puede dar el suero. El ensayo para la deteccin de la protena C reactiva del sue
ro (CRP) se completa en 6 minutos, simplemente aplicando la muestra sobre la sup
erficie empleando instrumental qumico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sist
ema sigue siendo inadecuada para su aplicacin en analitos como pueden ser los mar
cadores tumorales. aplicacin de la tecnologa de ADN recombinante a los inmunoensay
os homogneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de s
intetizar una protena de p-galactosidasa dentro de un polipptido de gran tamao (una
enzima aceptora [EA]) y de un polipptido pequeo (una enzima donante [ED]). Las EA
y las ED se reconstruyen para formar tetrmeros con actividad enzimtica. En el ens
ayo (Fig. 35-19), un hapteno antgeno (analito) est unido a la ED. y el anticuerpo
especfico para ese analito se usa para inhibir el ensamblaje espontneo de la enzim
a activa. Los antgenos (analitos) presentes en el suero del paciente compiten con
los analitos en el conjugado de analito-ED por la unin al anticuerpo, modulando
la cantidad de |-galactosidasa activa que se forma. La seal generada por los sustr
atos de la enzima es
Inmunoensayo mediante clonacin de donadores de enzimas
El inmunoensayo mediante clonacin de donadores de enzimas (CEDA: cloned enzyme don
or immunoassay) se consigui por primera vez mediante la
Forma activa
Forma inactiva Figura 35-18. Inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica (EIHIA).
La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de Chaetomium gra
cile. conjugada con el anticuerpo especfico para un antgeno de alto peso molecular
. El antgeno de elevado peso molecular puede ser la ferritina o la a-fetoproteina
. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reac
cionado c o n el antgeno especifico. L a forma activa de la enzima puede reaccion
ar con un sustrato insoluble. La concentracin de antigeno es directamente proporc
ional a la actividad enzimtica de la reaccin del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara
Y, Rechnitz GA [eds]: I m m u n o c h e m i c a l Assays and Biosensor Technolo
gy for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. A S M Press
. 1992, c o n permiso.)

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
839
Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimticos clonados (CEDA). Los aceptores
de enzimas se asocian con los donadores de enzimas para formar un tetrmero de p-g
alactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociacin del aceptor enzimtico con e
l conjugado de antigeno-donador enzimtico. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz
GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washingt
on. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)
directamente proporcional a la concentracin de analito presente en el suero del p
aciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimtrico que no requiere pretr
atamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es apropiado para su
uso en analizadores qumicos automatizados.
Resumen
Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antgeno-anticuerpo, incluyendo aque
llos que implican a protenas sricas, hormonas, drogas, otros antgenos y anticuerpos
dirigidos frente a patgenos. Los EIA heterogneos que emplean sustratos cromognicos
pueden tener una sensibilidad comparable a la de los RA, y han ganado en aceptac
in para su aplicacin en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogneos emplean sustr
atos sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeas partculas c o m o f
ase slida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos de 1 pg'ml de a
nalito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los RA. Adems, la manipula
cin del ensayo se encuentra muy simplificada en los instrumentos totalmente autom
atizados. En comparacin con los EIA heterogneos, los EIA homogneos poseen ciertas l
imitaciones en cuanto a sensibilidad, rango de aplicacin y su aplicacin en analito
s de gran tamao. Adems, la elevada seal de fondo (ruido) y la relativamente baja sea
l del ensayo son inevitables debido a la eliminacin de los pasos de lavado para s
eparar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogneos son ventajosos porque e
stn basados en un formato sencillo de ensayo y se pueden adaptar a la instrumenta
cin automtica preexistente. En este momento, los EIA heterogneos con instrumentos t
otalmente automatizados, siguen siendo la mejor eleccin en cuanto a sensibilidad
y simplicidad, y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el
uso de radioistopos.

tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se encuentran

ahora muy establecidos en los laboratorios de anatoma patolgica. Durante los ltimo
s aos, se han desarrollados muchos procedimientos de FIA para detectar concentrac
iones de drogas, hormonas y una amplia variedad de protenas y polipptidos (Nakamur
a. 1992a). Al principio de su desarrollo, los FIAs analticos se vieron dificultad
os por el descenso de la sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo present
e en las muestras biolgicas. Gradualmente, la sensibilidad de los mtodos fluorimtri
cos fue mejorando, y se hizo posible la deteccin de analitos a concentraciones de
10 M. Tambin se consiguieron avances gracias a la mejora de la instrumentacin y l
a introduccin de sustratos nicos con unas reacciones inmunoqumicas y enzimticas ms pt
mas.
15
La seleccin del fluorocromo que se va a emplear c o m o sonda es importante. La s
onda debera ser estable y debera poseer un coeficiente de extincin molar y rendimie
nto cuntico elevados. Tambin debera emitir en longitudes de onda apropiadas sin int
erferir con las reacciones del ligando con su anticuerpo. Cuando se irradian la
mayora de los fluorforos o molculas fluorescentes con una longitud de onda apropiad
a, un electrn de la molcula sulre una transicin al estado excitado. A medida que el

electrn vuelve a su situacin inicial, se libera energa fsica en forma de un fotn de

menor energa (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de
fluorescencia muestra una longitud de onda de mxima emisin, caracterstica de un de
terminado compuesto fluorescente. Una de las sondas tpicas, el isotiocianato de f
luorescena (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns entre excitacin y
emisin, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio) presentan una fluoresc
encia retardada con un intervalo de varios cientos de nanosegundos. Los diversos
FIA se pueden clasificar en: 1) heterogneos y homogneos: 2) de ligando o anticuer
po marcado; 3) competitivos o no competitivos, y 4) de fase slida o no slida. Se d
iscutirn los mtodos ms empleados.
INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Inmunoensayo fluorescente heterogneo Origen y clasifica
cin
Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluorescentes com
o sondas inmunoqumicas para detectar antigenos en secciones Los protocolos de FIA
heterogneos incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes uni
das de las libres. El procedimiento de este ensayo es similar al de los inmunoen
sayos enzimticos heterogneos y los

840
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
radioinmunoensayos. La mayora de los ensayos comerciales disponibles emplean un s
istema con el antgeno unido a una lase slida o un anticuerpo. El ensayo puede o no
ser competitivo, una propiedad que comparte con los RIAylosEIA.
Mtodo fluoroinmunomtrico
El analito reacciona en solucin con un exceso de anticuerpos marcados. Los anticu
erpos marcados residuales se unen al exceso de antgeno unido a una tase slida. La
matriz de tase slida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona invers
amente con la concentracin de analito. Este mtodo es adaptable para el ensayo de h
aptenos y protenas complejas. El FIA en fase slida se desarroll para el anlisis sero
lgico de anticuerpos trente a la rubola, toxoplasmosis, antgenos vricos y anticuerpo
s antinucleares. Los mtodos de FIA heterogneos para la determinacin de antigeno se
desarrollaron para protenas sricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Cortis
ol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogneos es la re
duccin significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes presentes de
forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminacin fsica de los tacto
res de interferencia en el paso de separacin.
de excitacin de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en solucin e
miten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de polarizacin de la fl
uorescencia fue aplicado por primera vez a los procedimientos de inmunoensayo po
r Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada que se transmite a travs de la muestr
a puede excitar la sonda fluorescente independientemente de su unin al anticuerpo
. Sin embargo, como se muestra en la Figura 35-20. el movimiento trmico aleatorio
da lugar a que pequeas molculas que contienen un hapteno se muevan libremente en
la solucin perdiendo su orientacin polarizada. Cuando el antgeno sondado se une a u
n anticuerpo con una masa molecular superior a los 160 kDa, el movimiento molecu
lar se reduce lo suficiente como para aumentar la seal polarizada. Estudios que e
mplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuerpos no detectaron cambios en
la polarizacin al mezclar antgeno y anticuerpo marcado, aunque la reaccin inmune h
ubiese tenido lugar. Este mtodo es el ms til para la medida de antigenos pequeos y h
aptenos (Jolley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ens
ayo de muchas drogas y frmacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL). D
esarrollaron un analizador de nueva generacin, el IMx. para medir molculas de gran
tamao molecular como los marcadores tumorales. hormonas y antgenos relacionados c
on infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988). Combinaron dos principios en el ensa
yo, la polarizacin de la fluorescencia y el inmunoensayo enzimlico con micropartic
ulas (MEIA). La demanda de capacidades de acceso directo impuls a Abbott a desarr
ollar un analizador de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automati
zado, denominado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios cln
icos (Smith, 1993).
Ensayo inmunofluorimtrico por particin radial
En los mmunoensayos por particin radial, se emplea una cromatografa radial y el en
sayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982). El procedi
miento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos analitos presen
tes en el suero (Rogers, 1986).
Fluoroinmunoensayo en tiempo real
Esta metodologa hace uso de una instrumentacin especial y de sondas fluorescentes
especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el uso de sondas fl
uorescentes que presentan una fluorescencia retardada con un perodo de tiempo de

unos 100 ns o ms entre la excitacin y la emisin. Debido a que la mayora de las susta
ncias responsables de la fluorescencia de fondo poseen un periodo de decaimiento
corto, la medida de la fluorescencia retardada reduce significativamente los ef
ectos de la fluorescencia de fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiemp
o real, un instrumento especial que produce pulsos rpidos de luz que excitan al f
luorforo. La fluorescencia se mide un poco despus de la excitacin. As, el efecto del
fondo inespecfico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartarse (
Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluorforos que presentan fluorescencia retardada
y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los siguientes: 1
. Derivados pirnicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns. 2 Algunos meta
les raros quelados que poseen un periodo de decaimiento m u y largo de casi 50 p
s a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario (Sm ') y terbio (Tb ).
3 1 3
Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitacin
El mtodo de transferencia de la fluorescencia de excitacin (FETI) (UHman, 1976) em
plea dos sondas, la fluorescena como donador de fluorescencia y la rodamina como
aceptor. El sotiocianato de fluorescena (FITC) tiene un mximo de emisin de 525 n m y
la tetraetilrodamma posee un fuerte pico de absorcin a 525 nm. Asi. cuando el an
tigeno marcado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produce
un apagamiento (quenching) de la lluorescenca del FITC. Este fenmeno implica una
transferencia de energa de una sonda electrnicamente excitada a una sonda aceptora
. La tasa de transferencia de la energa es inversamente proporcional a la sexta p
otencia de la distancia entre las molculas donadora y aceptora. Para que se produ
zca una reduccin apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia e
ntre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este mtodo resulta til para el
ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multivalentes. Porciones separ
adas de un anticuerpo especifico se marcan con fluorescena y rodamina. La mezcla
de anticuerpos marcados con fluorescena y rodamina reduce la intensidad de seal de
la fluorescena ajustando la proporcin y la cantidad de donador y aceptor para que
puedan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energa. Estos
problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluorescentes. Se han cons
eguido mejoras en el mtodo FETI usando un marcador fluorescente como el criptato
trisbipiridnico de europio (III) [Eu ] como donador y un fluorforo como la alofico
cianina como aceptor (Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios
poseen un elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm tra
nsfiere energa a travs de una molcula aceptora a una excitacin de 620 nm y finalment
e emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en tiempo real. Mathis (1993) ha
desarrollado la transferencia de energa mediante la resonancia de fluorescencia
(FRET) empleando un metal quelante de criptatos y lo ha aplicado a la deteccin de
AFP y del antgeno carcinoembrinico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedo
x. Francia) desarroll un inmunoensayo homogneo automatizado, KRYPTOR. para la dete
ccin de marcadores tumorales como el CEA. CA 19-9. CA 125 y AFP empleando la emis
in del criptato amplificada en tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP e
ra de 0.25 ng.'ml con nueve minutos de incubacin
3
Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir muchos ana
litos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.
Inmunoensayo fluorescente homogneo
Por definicin, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogneas. No requieren la
separacin de los conjugados unidos y libres y. normalmente, no son sensibles a l
as interferencias de fondo de las muestras. Los FIA homogneos tambin poseen la ven
taja de ser rpidos Sin embargo, cuando se comparan con los ensayos heterogneos, pr
esentan ciertas desventajas. Los FIA homogneos tienen una sensibilidad limitada d
e aproximadamente 10 molar con una instrumentacin estndar. Pueden existir impureza
s marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos requieren un an
tigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros, y una instrumentacin
especial para alcanzar una mayor sensibilidad.

10
Ensayo de polarizacin de la fluorescencia
Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un solo pla
no. Cuando se observa desde un ngulo recto con respecto al haz

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
841
Baja p o l a r i z a c i n Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluoresce
ncia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlgeno, el conjugado marcado con un
a molcula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamao molecular
de ms de 160 kDa. la rotacin molecular del F unido se ve reducida y se mantiene la
polarizacin 8. en la presencia de antgeno. hay menos conjugado unido ai anticuerp
o, de m o d o que puede rotar libremente en la solucin, dando lugar a una disminu
cin de la seal polarizada.
Inmunoensayo de fluorescencia protegida
En este ensayo (Nargessi. 1979). el antgeno proteico se marca con fluorescena y a
continuacin se hace reaccionar con un anticuerpo especfico para el antgeno. El anti
cuerpo especifico inhibir estricamente la reaccin de un segundo anticuerpo especfico
para la fluorescena. que funciona absorbiendo la fluorescencia de la fluorescena
cuando se une al fluorforo. La habilidad del anticuerpo especfico para la fluoresc
ena de interaccionar con la fluoresceina cuando est unida a la superficie del anti
geno se ve disminuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de conce
ntracin de anticuerpos o de antgenos (analtos) en un sistema homogneo.
tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnstico prctico, y sus caracters
ticas se describen a continuacin
Ensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores
En este mtodo (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se conjugan di
rectamente con molculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden reaccionar oxi
dativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para producir intermediarios mu
y energticos que se descomponen en el fragmento excitado, generando luz. La emisin
de luz por parte de los esteres de acridinio es muy rpida, en unos 5 a 10 segund
os despus del inicio de la reaccin de oxidacin. La quimioluminiscencia de tipo flas
h, como se conoce este proceso, posee una relacin entre el espectro de emisin y el
tiempo de reaccin con una pendiente mucho ms acusada que la quimioluminiscencia d
e tipo resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es m
ayor que la de un RA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres de acri
dinio y la estabilidad de los conjugados con protenas durante periodos de almacen
aje se han mejorado mediante la modificacin de la molcula y la qumica de la conjuga
cin. Esta tecnologa probablemente aporte mejoras para los ensayos de algunos hapte
nos y de hormonas.

INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen

Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda molculas que generan qui
mioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol. esteres de acridinio, o
derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio [Ru(bpy).'i con triprop
ilamina (TPH) para la electroquimioluminiscenca. Bsicamente, el mtodo del ensayo no
difiere del de los inmunoensayos heterogneos. RA y FIA. La generacin de luz por de
rivados del luminol requiere OH iHfi. como iniciador qumico, o H,0 con la peroxid
asa como iniciadores de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridi
nio estimulados qumicamente con OH H O muestran un rendimiento cuntico quimiolumin
iscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras molculas quimiolumi
niscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998). Las sondas de
compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimicam e n t e en la superf
icie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensayo homogneos. Tanto los
CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec; ;

Inmunoensayo electroquimioluminiscente
El ECLIA emplea compuestos electroqumicos como sondas que generan luz electroqumic
amente, asociada al ciclo reactivo de la reaccin de oxidacin-reduccin. Con la optim
izacin de las soluciones de reaccin, la seleccin del mtodo de conjugacin apropiado y
el desarrollo de compuestos como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar l
a tecnologa quimioluminiscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991).
2-

842
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Protena Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un ster de
acridinio basado en la descomposicin oxidativa.
El Ru(bpy), * tiene un sitio de reaccin para la conjugacin de analitos usando un r
eactivo de activacin como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado con los anticuerpos, s
e puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para molculas grandes. El conjugado ge
nera luz en la superficie de electrodos de oro. El Ru(bpy), - en una fase slida y
el TPA se oxidan en la superficie de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA
', respectivamente. El TPA-' pierde electrones de forma espontnea. El Ru(bpy) puede generar una emisin de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado
basal a travs de una reduccin con TPA'. La eficacia de generacin de la luz (rendim
iento cuntico) depende de la proximidad entre el electrodo y el conjugado, y por
tanto, de la difusin del conjugado. Los conjugados libres pueden generar ms luz qu
e los conjugados fijados a una fase slida como resultado de una reaccin inmune. Es
to permite un acceso fcil al formato de ensayo homogneo, pero un ruido de fondo re
lativamente alto interfiere con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otro
s ensayos homogneos. El protocolo de ensayo para la determinacin de analitos es el
siguiente: microparticulas magnticas cubiertas de anticuerpo como fase slida se m
ezclan con la muestra para permitir la reaccin inmune. Despus de lavar para separa
r los conjugados libres de los unidos, una solucin con la fase slida se introduce
en un detector que posee un electrodo para medir la quimioluminiscencia. El limi
te de deteccin de un ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y
de 0,4 ng/ml para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra
ventaja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la deteccin de la seal que los
FIA y otros CLIA.
2 3 1 3 3 2
2
eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antgenos asociados c
on el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de crecimiento c
omo la calcitonina, existen en concentraciones m u y bajas en el suero, necesita
ndo as un sistema de deteccin m u y sensible para poder medir estos analitos (Nish
izono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los muchos mtodos, los ensayos quimio
luminiscentes y sus enzimas son los sistemas de ensayo ms sensibles capaces de de
tectar analitos presentes en concentraciones m u y bajas. Los instrumentos total
mente automatizados de los que se dispone ahora son tambin capaces de utilizar in
munoensayos enzimticos fluorescentes. Estos sistemas de ensayo se clasifican en v
arios grupos basndose en la generacin y deteccin de las seales y el tipo de fase slid
a. Con respecto a la deteccin de la seal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japn) y el
AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un mtodo de fluorescencia del inmunoensay
o enzimtico que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato especifico, el 4-metilu
mbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponibles para los inmunoensayo
s enzimticos de quimioluminiscencia. Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japn). Access (S
anofi Diagnostics Pasteur. Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los
Angeles, CA) han utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfos
foriladamantildioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson,
1994: Babson, 1991). El ster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha ap
licado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS 2010 (Roc
he Diagnostics. Indianapols. IN), se usa el Rufbpy)/' como sonda quimioluminiscen
te (Erler, 1998).

AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensay

o homogneos
A pesar de que muchos inmunoensayos homogneos se han desarrollado para protocolos
manuales descritos en este captulo, la mayora de ellos no han sido automatizados
todava. Para el mtodo EMIT, se pueden adaptar analizadores qumicos genricos automati
zados (Boyd, 1985). Algunos instrumentos estn disponibles para los inmunoensayos
fluorescentes homogneos, pero estos sistemas no son intercambiables entre s. El si
stema CIS Bio KRYPTOR se ha desarrollado con caractersticas especiales, incluyend
o el uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un mtodo de dos lo
ngitudes de onda para la correccin interna del estndar de intensidad de fluorescen
cia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensibilidad del lmite
de deteccin.
Secuencia prctica del inmunoensayo en el sistema analtico
La demanda de mercado esperaba una instrumentacin capaz de realizar un gran nmero
de ensayos con capacidad de acceso directo. Para cumplir estas necesidades, es n
ecesario mejorar los reactivos y evitar el tedio que implican los inmunoensayos
heterogneos. Para simplificar el sistema para su posterior aplicacin en un sistema
de ensayo totalmente automatizado, se disearon cartuchos individuales de reactiv
os previamente empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reaccin. Un
sistema genrico para los inmunoensayos con sondas heterogneas est esquematizado en
la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes del ensayo mediante un
programa de ordenador y carga los cartuchos de reactivos o las botellas para cad
a ensayo. Para un analito concreto, los cartuchos y la cubeta de reaccin se intro
ducen de forma automtica en el instrumento. Las muestras se transportan a la posi
cin apropiada para la dispensacin. El ensayo est diseado para emplear bandejas de re
accin o rotores que automatizan los pasos de mezclado y separacin, que dependen de
l funcionamiento de la primera y segunda inmunoreaccin, y la reaccin de generacin d
e la seal. Todos los pasos de la reaccin tienen lugar de forma secuencial en la lne
a de reaccin y las seales generadas se miden mediante un detector. Los resultados
del ensayo se imprimen en los siguientes 20 a 40 minutos y se envan automticamente
a travs de la red al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 20
0 ensayos por hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este siste
ma de acceso directo.
Sistemas de inmunoensayo heterogneos
Hasta el principio de los aos 80, la mayora de los inmunoensayos heterogneos se hac
ian de forma manual. Entonces Boehnger-Mannheim (que se fusion con Roche Diagnosti
cs en 1998) desarroll un analizador de acceso directo totalmente automatizado, el
ES-600, basado en los inmunoensayos enzimticos colorimtricos que empleaban la per
oxdasa de rbano como enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compaas trataron
de desarrollar sistemas de inmunoensayo enzimtico totalmente automatizados, que

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
843
Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo heterogneo
Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumentos, puede
n existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al formato de
la loma de muestras, control de la temperatura, la separacin BF, el arrastre, flu
jo de los desechos y dems. Asi. debemos prestar atencin a lo bien que funciona el
instrumento despus de su puesta en marcha.
Cubeta de reaccin
En un sistema de inmunoensayo. es muy importante disear las caractersticas de la c
ubeta con cuidado para obtener datos reproducbles. Los fabricantes emplean estas
cubetas para posibilitar un maneto rpido de los reactivos y del acceso directo. S
e ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso que contiene los reactivos y
la unidad de reaccin en el sistema Lumipulse. El sistema Immulite emplea una unid
ad de reaccin para la separacin B.'F. El
Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de inmunoensayo totalmente automatiza
do en un laboratorio clinico de automatizacin.

844
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 35-8 Nueva generacin de sistemas de inmunoensayo heterogneos AIA-21 (TOSOH)
Paquele de reactivos Cubeta de reaccin Principio de la reaccin Sustancia marcada S
ustrato enzimtico Detector de la seal Formato del ensayo Pretratamiento Flujo de l
a reaccin Duracin del ciclo (seg) Duracin de la reaccin (min) Temperatura de la reac
cin Numero mximo de analitos Capacidad (ensayos/hora) Fase shda Tiempo del primer r
esultado (min) Separacin B/F Mtodo de muestreo Aulodilucin de la muestra Liotilizad
o y empaquetado en porciones Recipiente de reaccin Inmunoensayo enzimtico fluoresc
ente Fosfatasa alcalina 4-metilumbeliterl tosalo Fluorescencia S-1. S-2, competiti
vo Si Rotatoria 30 10 o 40 min 37C 20 120 Partcula magntica (bcad> 50 Campo magntico
Pipeteando la sonda S ACS:CENTAUR ARCHITECT (ABBOTT) (BAYER DIAGNOSTIC) Paquete
de reactivos (en solucin) Cubeta desechable Inmunoensayo quimioluminiscente Ester
de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo S Rotalona 15 7 536 37"C 30 240 Partcula magntica 8-40 Campo magntico Chip desechable Si Solucin en u
na botella Cubeta desechable Inmunoensayo quimoluminiscente Ester de acndinio Ni
nguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo S Rotalona 18 29 37"C 25 200 Partc
ula magntica 30? Campo magntico Sonda fija Si ADVIA IMS (BAYER DIAGNOSTICS) Partic
ulas secas en la cubeta de reaccin Recipiente de reaccin Inmunoensayo quimiolumini
scente Fosfatasa alcalina? Foslato de dioxelano? Quimioluminiscencia S-1, S-2, c
ompetitivo ? Rotatoria 36 20 37"C 36 100 Partcula magntica
?
Campo magntico Pipeteando la sonda (tcnica del aceite) Si
AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reaccin nica que consiste en poc
ilios para el reactivo, la incubacin y para la muestra dentro de una misma cubeta
. El programa combina el contenido de esta cubeta en una unidad rnatricial. Esta
ltima puede emplearse para captar la fase slida de ltex, seguida de una separacin B
'F y de una segunda reaccin inmune de anticuerpo marcado con la fase slida.
Tipo de toma de muestra y dispensacin de fluido
En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos tipo
s diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminacin entrecruzada d
e muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el chip desechable
se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En el caso del sistema c
on punta fija, aunque la muestra original se divida en varias alcuotas pequeas, la
contaminacin entrecruzada sigue ocurriendo. As, el sistema del chip desechable es
la mejor forma de evitar la contaminacin y de minimizar los desechos biopeligros
os. Por otro lado, el coste de emplear estos chips para el ensayo es superior al
del sistema de punta fija. Tambin deben tomarse en consideracin las consecuencias
medioambientales de los chips desechables.
fase slida. Los sistemas I M x y AxSYM emplean micropartculas de ltex como fase slid
a y emplean una membrana porosa para atrapar el ltex para la separacin de particul
as de la fase slida de la lquida. Diagnostics Product Corp.. Los Angeles. CA ha de
sarrollado una unidad para los sistemas de separacin B/F, en la que la solucin de
reaccin sale de una unidad interior a una exterior de desechos, mientras que la f
ase unida permanece en un lecho de fase slida (0,5 cm). Una ventaja de estos form
atos, es que evitan la contaminacin entrecruzada y el arrastre de una mezcla de r
eaccin a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado. Todos los de
ms sistemas emplean particulas magnticas (magnette partiles y magnelic beads) en la
s que se puede conseguir una separacin rpida y fcil, mediante la aplicacin de un cam
po magntico.

Nuevos sistemas para la prxima generacin (sistemas modulares)

La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendimiento comerc
ial que se han introducido en los ltimos aos. Muestra las especificaciones instrum
entales de cada analizador. Reduciendo los tiempos de incubacin y de reaccin, se p
uede obtener un resultado rpido en unos 1 0 a 25 minutos. As, es posible una mquina
de alto rendimiento que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Adems, varios fab
ricantes han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos s
istemas analticos que se necesitan en un laboratorio clnico. Muchos laboratorios c
lnicos han introducido un sistema de transporte de muestras que se conecta con di
stintos instrumentos analticos controlados de forma independiente. Sin embargo, a
lgunos analizadores no son aplicables a este sistema porque la velocidad del ins
trumento o la duracin de su ciclo no se puede armonizar fcilmente con el resto de
software y hardware. Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laborato
ries) es un ejemplo de una mquina de nuevo concepto, en el que un sistema de orde
nadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo conectados a un anal
izador qumico. El ADVIA IMS. basado en un concepto similar, ha sido introducido p
or Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY), que puede realizar qumica clnica e inmunoens
ayos en una misma plataforma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto t
odava en desarrollo, que harn posible la simplificacin del laboratorio clnico a un c
oste final inferior.
Arrastre
El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentracin extrem
adamente alta, puede a veces dar lugar a diagnsticos clnicos errneos. Un tubo de pls
tico desechable para la muestra es la forma ms sencilla de evitar este problema.
Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias ventajas econmicas c o m
o se ha mencionado antes. Asi, la mayora de las tcnicas que conciernen a la ingeni
era de las muestras se han concentrado en minimizar el arrastre de la muestra med
iante pasos de lavado y mantenimiento de la punta. Ahora, hay varias puntas fija
s que permiten limitar el arrastre a menos de un orden de 10'. Incluso con un ar
rastre tan bajo, algunas muestras todava crean problemas (p, ej., una muestra fue
rtemente positiva para un antgeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguid
a de una muestra negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de softwar
e para comprobar dicho resultado, mediante un reanlisis automtico de los valores p
ositivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.
Separacin B/F y sistemas de lavado
En un inmunoensayo heterogneo, el conjugado unido debe separarse de la sonda libr
e. Esta separacin B'F depende de las caractersticas de la

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A
845
SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIEN
TE Origen
Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej., hCG para
el diagnstico del embarazo) ha simplificado el formato de los inmunoensayos: el
ensayo debe ser sencillo, rpido y reproducible. Teniendo en cuenta estas metas, s
e han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto h a dado como resultado una prim
era generacin de formato de ensayo de inmunoensayo enzimtico de flujo.
Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltracin)
La Figura 35-23 ilustra esquemticamente un instrumento tpico de inmunoensayo de fl
ujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que consiste en una me
mbrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un parche absorbente bajo l
a membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo y el procedimiento se descri
ben a continuacin. Varias gotas de la muestra de orina se aplican sobre la membra
na. La orina es absorbida por el parche y entonces se aade el tampn de lavado por
goteo y a continuacin una solucin con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la losl
atasa alcalina.
Tiras reactivas
Tambin se h a desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el coste de l
os materiales en comparacin con el formato del ensayo de flujo En este formato, l
a tira del ensayo contiene un rea con un punteado de anticuerpo en la punta de la
tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente manera: 1) se introduce l
a tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se introduce la tira en un r
ecipiente de lavado: 3) a continuacin se introduce la tira en una solucin de marca
do: y 4) finalmente se introduce la tira en un revelador de color si es necesari
o.
La inmunocromatografa consiste en la separacin B. F y generacin de la seal simultneas
, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso, como una membrana de ni
trocelulosa o una lmina de libra de vidrio. A travs de la accin capilar de la membr
ana, el analito de la muestra puede migrar del extremo proximal al distal. donde
existe un parche absorbente para mantener una velocidad de flujo capilar consta
nte. La zona de carga de muestra, la de mareaje y la de deteccin se encuentran en
tre los dos extremos. El mtodo inmunocromatogrfico se clasifica en varios formatos
. La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatogrficos tpicos El extremo prox
imal se usa como puerto de carga de la muestra, y est conectado a un parche que c
ontiene el antigeno o anticuerpo marcado, debajo del cual hay una membrana de ni
trocelulosa en contacto con el parche que funciona como una zona de deteccin. El
extremo distal de la membrana se encuentra unido a un parche absorbente que func
iona como una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstit
uye el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o ltex coloreado, qu
e forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este complejo migra a
la zona de deteccin. El anticuerpo o el antigeno inmovilizado en la zona de dete
ccin puede captar el complejo y formar una linea roja o azul positiva. El exceso
de sustancia de mareaje migra hasta el parche absorbente. La fase mvil en una mig
racin es la propia muestra. Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentr
acin de bihrrubina o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de l
os resultados a simple vista. En este formato, la seal que debe detectarse se pro
duce en la zona de deteccin con una zona donde se concentran partculas coloreadas.
Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo formato en platafo
rma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automtica, incluyendo un pas

o de lavado. El instrumento aparece de forma esquemtica en la Figura 35-25. En es

te formato, la posicin de cada una de las zonas es completamente diferente a la d
el resto de las mmunocromalografas mencionadas anteriormente. El extremo proximal
tiene una solucin de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso d
e lavado espontneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica sobre un
parche que est en el centro del instrumento y contiene un conjugado marcado seco.
El extremo distal se conecta a un parche absorbente. Se aaden dos gotas de la mu
estra al parche para que reaccione con el conjugado despus de su reconstitucin. La
mezcla de reaccin que contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el ant
icuerpo marcado puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente
que contiene la solucin de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye y p
asa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de deteccin. En este moment
o, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes del suero y el ex
ceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarn hacia el parche absorbente. Si
la muestra contiene el analito, el anticuerpo inmovilizado captura el complejo e
n la zona de deteccin para formar una linea coloreada. Este mtodo presenta algunas
ventajas que difieren de otros instrumentos inmunocromatogrficos que se revelan
con la muestra. En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipmico puede interf
erir en la evaluacin del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado
color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reservorio c
onectado puede no tener interferencias de estos componentes coloreados. Este ins
trumento ha sido til en la deteccin de HBsAg. anticuerpos anti-HB (Yamauchi. 1997)
y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasegawa, 1995). La mayora de los componente
s, como la membrana, el parche absorbente y el compartimento para la muestra tie
nen su sitio dentro de un molde de plstico.
Instrumentos inmunocromatogrficos
Con el fin de eliminar pasos de adicin de reactivos en estos dos formatos, se han
conseguido importantes mejoras empleando tcnicas inmunocromatogrficas. que han da
do lugar a un inmunoensayo simple y rpido.
Membrana de nylon
c
Resumen
Los instrumentos de inmunoensayo rpidos y sencillos se resumen en la Tabla 35-9.
Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo, Fig
ura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Seccin transversal de un Hybritech ICN de impreg
nacin o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones y vista superio
r del instrumento. Los anticuerpos de captacin se encuentran inmovilizados en el
centro de una m e m b r a n a de nylon que posee un parche absorben- de estos tr
es formatos. La mayora de los instrumentos inmunocromatogrficos te para absorber e
l fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugad
os marcados directamente, coloides de metal o ltex coloreado. Estos tipos de form
ato resultan apropiados para la migracin del inmunoc a d o y el tampn de lavado. E
l ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial. complejo, junto con la migra
cin de la solucin de muestra. Sin embargo, muparecido a un inmunoensayo enzimtico e
n dos pasos.

846
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatogrfico tpico mediante adic
in de la muestra. El desarrollo del ensayo se muestra en la parte inferior de est
a ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona c o m o porcin de carga de l
a muestra y consiste en un parche que contiene el anticuerpo o antgeno marcado co
n ltex coloreado o coloides de oro. El analto de la muestra forma un complejo con
el conjugado y migra a la zona de deteccin, inmovilizando asi el anticuerpo de ca
ptura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado y la muestra sobrant
e migran al extremo distal de la tira.
chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil a 20
0 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA p
ermite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra, 25 u
l. La corriente actual de ensayos rpidos para POCT se orienta hacia ensayos que emplean instrumentos de inmunocromatografa porque una persona con prctica,
como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede realizar el
ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a diferenc
ia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).
Figura 35-25. Instrumento inmunocromatogrfico que emplea EIA. Se aplica un mtodo
e amplificacin sensible a la inmunocromatografa empleando una enzima. La muestra
e aade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este mtodo,
e emplea una solucin de revelado como fase mvil, que puede servir como tampn de
ado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plstico y los re
sultados de un ensayo para anticuerpos TP.

d
s
s
lav

Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rpidas para los instrumentos de inmuno

ensayo Principio del ensayo Nombre del kit ... . (analito) _. Tipo de muestra Vo
lumen de muestra (ul) 5C 150-200 Fase mvil Tiempo de reaccin (min) 5 15 5 3 5-10 5
-15 15 5-10 15-20 5-20 -15 15 Sensiblilidad Alojamiento Fabricante
Formato inmunocromatogrfico Un paso Helisal One Step (Helicobacter pylori) (todo
en uno) Biocard Troponin I test Clearview hCG II QuickVue One-Step hCG CARD-I-KI
T Troponin I TROPT Troponin T Determine HBsAg BioSign Tumor HBs Insta test EASYSURE HBsAg
Toot
Sangre Suero Orina Orina Suero Sangre Sangre/suero Sangre/suero Sangre/suero Sue
ro Sangre Sangre
Plasma Suero Orina Orina Suero Plasma Plasma/suero Revelador Plasma/suero Suero
Revelador Plasma
Igual que ELISA 0.1 ng/ml 25 mlU/ml 25 mlU/ml 0,1 ng/ml 0.1 ng/ml 1 ng/ml?
MP"' MP MP MP MP MP TS' 'IF MF TC' MP MP
1
?
3 gotas (75?) 4 gotas (100?) 150 50 50 200 100-150 1 gota colgante
Cortecs Diagnostics Ltd. ANI Biotech oy Unipath Limited QU1DEL AboaTech Ltd. Roc
he Diagnostics' Abbott Princeton BioMeditech Corp. Morningstar Diagnostics West
Wind Plus, Inc. Craig Medical Distribution. Inc. Biosite Diagnosticst
?
0.5 ng/ml 1 ng/ml >4 ng/ml
PSA RapidScreen Test Triage Cardiac (Myoglobin CK-MB Troponin-I) AMRAD ICT Hepat
itis B Espline HBs-Ag TestPack PLUS hcG EASY-SURE HIV 1/2
?
?
Sangre/suero Plasma/suero Suero/orina Plasma/suero
?
25 25 40
Sangre/suero Revelador Suero/orina Revelador
5-15 15 5 10
2 ng/ml 0.5 ng/ml 50 mlU/ml
ccMP MP CC
j
Dos pasos
Amrad Corporation Ltd. Fujirebio Inc. Abbott West Wind Plus. Inc.
Mtodo inmunocromatogrfico de tiras reactivas AimStick PBD Orina

Volumen de la inmersin
22
Orina
3
20 mlU/ml
Craig Medical Distribution Dainabot Hybritech, Inc. Nyco Diagnostic Morningstar
Diagnostic Orgenics
Dainascreen HBsAg Formato de flujo ICON-II hCG NycoCard CRP Chagas dobule-spot t
est Combinacin de inmunocromatografia y flujo DoubleCheck HBsAg
Plasma/suero Suero Plasma de sangre completa Suero/plasma
Plasma/suero + solucin del conjugado Tampn, etc. Tampn, etc.
15
3,1 ng/ml
rs
TC MP
50 1 gota
2 10
10 ug/'ml 1
Suero/plasma
?
Tampn. etc.
15
2 ng/ml
MP
MP = reprsense moldes de plstico (moling plstic): TS = representa tiras reactivas {t
est strip): TC = representa una tapeta de reaccin ((es cara). CC = epresenta un ta
riete'o (cara case) Datos de T o w t (1995) t Datos de Bruni (1999)
j

848
BIBLIOGRAFIA
SECCIN V

INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA
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CAPTULO 35

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C A P T U L O
36

Examen de laboratorio del sistema inmune celular

Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP) Susana Cunningham-Rundles, Ph.D. Maurice R.G.
O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI)
CRITERIOS CLNICOS PARA LA EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA
INTERPRETACIN Decisin de analizar Inmunodeficiencia primaria frente a la secundar
ia Significado clnico de las pruebas de inmunodeficiencia Efecto de la edad en la
respuesta inmune Malnutricin y respuesta inmune Cncer APROXIMACIN METODOLGICA A LAS
PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR 853 Fases de estudio: fase de exploracin Fases de e
studio: fase de confirmacin Fases de estudio: estudios analticos de la inmunidad P
ROLIFERACIN LINFOCTICA COMO MTODO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmu
nologa celular Metodologa: determinacin de la activacin y la proliferacin linfoctica
n la evaluacin de la inmunodeficiencia celular El conocimiento dei sistema inmune
se ha mejorado enormemente gracias a la deteccin de determinadas anomalas en paci
entes con sospecha de dficit inmunitario. Estos avances han surgido de estudios d
e la diferenciacin y funcin de las clulas inmunes normales, de la delecin experiment
al de genes, y de anlisis detallados de sndromes de inmunodeficiencia humanos. Los
nuevos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las ba
ses funcionales de la desregulacin inmune en pacientes con mutaciones genticas pri
marias (congnitas) del sistema inmune o de infecciones congnitas secundarias (adqu
iridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no se pueden distinguir
por la presentacin clnica de las infecciones: la informacin gentica est convirtindose
en un importante componente para las pruebas e interpretacin diagnstica. La misin d
e la inmunologa clnica de laboratorio es transformar las nuevas lneas de investigac
in en pruebas altamente estandarizadas y clnicamente relevantes para cada paciente
en concreto. Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado pri
ncipalmente en tres reas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el impacto
de los defectos congnitos inmunes sobre la defensa del husped; 2) enfermedades aut
oinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad inmune excesiva o inapro
piada; y 3) deficiencias inmunolgicas adquiridas, en las cuales la infeccin daa dir
ectamente el sistema inmune, como en la infeccin por el virus de la inmunodeficie
ncia humana (VIH). Adems, los defectos inmunes celulares de enfermedades con cara
ctersticas de mala funcin inmunolgica, como las infecciones crnicas, el cncer, la mal
nutricin o las lesiones traumticas, proporcionan informacin esencial en la defensa
del husped mediada por la inmunidad. El concepto general de inmunidad" a menudo s
e ha confundido con el de inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpo
s potencialmente protectores frente a un agente infeccioso introducido por una i
nfeccin natural o por una inmunizacin. Debido a que la inmunologa, como actualmente
se utiliza en un laboratorio clnico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin.
1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real de
este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la inmunidad
humoral, la funcin inmune celular es fundamentalmente compleja y difcil de medir.
Las pruebas de inmunidad humoral bsicas miden la produccin de anticuerpos especfico
s elaborados en cierto momento c o m o respuesta a una infeccin por un virus o mi
crobio especfico; en contraste, los anlisis de la inmunidad celular miden las resp
uestas actuales. En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteracio
nes inmunes primarias, como las deficiencias de los complejos principales de his
tocompatibilidad (MHC) clase I y II, o el sndrome del linfocito desnudo (BLS) (To
urame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importancia
de la evaluacin estandarizada en el laboratorio clnico de las deficiencias inmunes
. El descubrimiento y el estudio de nios con trastornos relativamente raros pero
m u y importantes, como el dficit de adhesin leucocitario (LAD) (Springer. 1984: E
tizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos metodolgicos, a medida que
se iba demostrando en estudios recientes cmo se presentan estos defectos de adhe
sin (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nuevos estudios desde la identificacin de l
a enfermedad granulomatosa crnica (CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un g
rupo de enfermedades heterogneas con alteracin en la actividad de la cadena respir

atoria fagoci855 RECEPCIN Y ANLISIS Inmunofenotipificacin: aplicacin a las muestras

de rutina y leucmicas Anlisis del ADN Citometra de flujo cuantitativa: mediciones d
e intensidad de fluorescencia CONTROL DE CALIDAD Y GARANTA DE CALIDAD EN EL LABOR
ATORIO CELULAR BIBLIOGRAFA 865 FUNCIN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CLU
LAS 851 METODOLOGA: CITOMETRIA DE FLUJO Y DE IMAGEN Hardware y otras herramientas
859
859
874 874

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

851
tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han s
ido tiles en la identificacin del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997). Actua
lmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congnitos pueden ser cand
idatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999) o, en el futuro
, a la terapia gnica (Malech, 1999). Como la mayora de los linfocitos en sangre pe
rifrica son clulas en reposo, la reaccin inmune celular debe reproducirse o generar
se en el sistema de anlisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta,
mantener la reaccin proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi c
o m o de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunologa clnica cambi r
adicalmente durante los aos 80, debido al impacto de los importantes esfuerzos de
investigacin, incluyendo el uso de anticuerpos monoclonales para identificar clul
as inmunes, el descubrimiento de la regulacin de las citocinas de la respuesta in
mune, y sobre todo por la tremenda necesidad de comprender y controlar la aparic
in epidmica del VIH. La aparicin del VIH ocurri casi de forma paralela a la posibili
dad de identificar las clulas T CD4+. Los primeros anlisis de la inmunodeficienca f
uncional celular en el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basa
dos inicialmente en el anlisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (S
iegal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes funci
onales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo se presen
tan las pruebas inmunolgicas celulares actuales a la luz de tendencias futuras. L
a evaluacin de la inmunidad celular est cambiando desde los anlisis simples y punto
s finales fijos hacia un anlisis integrado de la funcin celular en varios niveles
que reflejen las interacciones celulares como un proceso dinmico.
teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnstico de una enfermedad inmu
ne primaria. Los cambios inmunolgicos pueden acompaar a muchas entidades clnicas in
cluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neoplasias, d
e enfermedades hematolgicas como la anemia de Fanconi, la hemofilia, la trombocit
openia inmune, los trastornos linfoproliferativos c o m o la histiocitosis, y la
s hemoglobinopatas como la anemia de clulas falciformes. la talasemia, adems de un
amplio grupo de anomalas cromosmicas c o m o el sndrome de DiGeorge. el sndrome de D
own, el sndrome de Bloom, la disqueratosis congenita de William, la epidermlisis a
mpollosa, y el sndrome de Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosom
a X). Las enfermedades autoinmunes como las enfermedades reumticas, la enfermedad
mixta del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistmico, l
a esclerosis lateral amiotrfica, la esclerosis mltiple y la miastenia gravis puede
n asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan ms adelante en los Captulos
43 y 45.
Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria
Las caractersticas principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmunodeficien
cia supuestamente adquirida por infeccin con VIH. debe distinguirse de los cambio
s inmunes asociados a otras condiciones clnicas descritas. Incluso a menudo las l
esiones traumticas como las quemaduras o los accidentes que originan una gran prdi
da de sangre o un dao visceral producen un periodo de vulnerabilidad a las infecc
iones. Adems, otras situaciones como las enfermedades premalignas o las infeccion
es subyacentes no diagnosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden pare
cer fenotipicamente idnticos a la inmunodeficiencia primaria. Mientras que la inf
eccin por el VIH puede diagnosticarse rpidamente mediante una determinacin directa,
el laboratorio de inmunologa clnica se emplea frecuentemente como un campo de pru
ebas antes de obtener del paciente o del tutor legal el consentimiento informado
para el anlisis del VIH. Esto se basa en la observacin de que entre los adultos V

IH-positivos. casi siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tant

o, c o m o resultado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertid
o ha llegado a considerarse como un marcador de la infeccin por el VIH. Sin embar
go, hay un cierto nmero de enfermedades que afectan al sistema inmune que pueden
producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un nmero de clulas CD4 tan extremadament
e bajo como el VIH. stas incluyen, aunque no slo estn limitadas a estos, al sndrome
de DiGeorge, el timoma benigno, el comienzo de la infeccin por el virus de la hep
atitis C (VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutricin calrico-proteica y las n
eoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversin del cociente
CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un nmero bajo de CD4. El lactante del c
aso n." 3 presentaba mltiples abscesos spticos del tracto gastrointestinal (Gl) y
se crea que tena un trastorno de la inmunodeficiencia primaria. Sin embargo, esta
evaluacin se hizo despus de un episodio de casi ahogamiento en una baera en la que
se encontraron indicios de un destapacaos. Las lesiones del tracto Gl por custicos
produjeron lesiones mltiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linf
ocitos T perifricos. El desequilibrio del conjunto de linfocitos T perifricos, per
o no el dao del tracto Gl. se resolvi rpidamente. Esle caso tambin muestra la necesi
dad de llevar a cabo una prueba de confirmacin tan pronto como sea posible cuando
el paciente est estable. Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se
presentan en el contexto de una infeccin o de cambios hematolgicos. Los trastorno
s p o r inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Captulo 42. La evaluacin de
laboratorio a menudo requiere de una valoracin por etapas, no solo para minimizar
la extraccin de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las pruebas disponi
bles con vistas a un diagnstico diferencial. Puede parecer que determinados diagns
ticos de presuncin se sospechan con demasiada frecuencia, por ejemplo, el sndrome
de Wiskott-Aldrich, aunque ste necesita descartarse en casos de trombocitopenia i
nexplicada. Sin embargo, un sndrome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si
slo se valora la respuesta a mitgenos en lugar de la respuesta frente a antgenos. y
con el tiempo el defecto inmune puede llegar a ser ms importante, de forma que s
ean necesarias pruebas de seguimiento.
CRITERIOS CLNICOS PARA LA EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA
INTERPRETACIN Decisin de analizar
Aunque en teora la interpretacin de las pruebas inmunolgicas comprende desde el abo
rdaje diferencial minucioso hasta el cribado, en trminos prcticos, la respuesta in
mune del paciente se estudia en el contexto de la presentacin clnica. Sin embargo,
como las pruebas inmunolgicas pueden ser caras y lentas, la eleccin de la prueba
a menudo depende de la sospecha clnica. C o m o hay pocas pruebas de la inmunidad
celular, si es que existe alguna, que sean total y especficamente diagnsticas, la
interpretacin debera realizarse con precaucin. La responsabilidad del laboratorio
de inmunologa clnica es establecer un nmero suficiente de pruebas, realizarlas de f
orma sensata para conocer la naturaleza y la extensin de la alteracin inmune y con
siderar un rango de posibles causas cuando se realice su interpretacin. Normalmen
te, la decisin de analizar la respuesta inmune en un paciente surge por una de la
s razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la inexplicable susceptibilid
ad a la infeccin, el aumento de la gravedad de infecciones habituales, o la reacc
in inusual a la inmunizacin son motivos para realizar una valoracin inmune. Las inf
ecciones inusuales, especialmente por agentes oportunistas o las infecciones gra
ves que no responden al tratamiento, y ciertos estados alrgicos o atpicos tambin pu
eden requerir un anlisis inmunolgico. En estos ltimos aos, la posibilidad de la infe
ccin por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria como prin
cipal diagnstico de presuncin. Sin embargo, como se tratar posTabla 36-1 Presentacin de una posible inmunodeficiencia Infecciones bacterianas f
recuentes Reaccin sistmica a virus inusualmente grave Desarrollo de la infeccin deb
ida a un organismo inusual como hongos o protozoos Reaccin sistmica despus de la va
cunacin con virus vivos Historia familiar de infecciones recurrentes Exposicin al
virus de la inmunodeficiencia humana

852
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH Con
junto de linfocitos Caso estudio 1. Inicial 2. Inicial 3. Inicial 1 semana 4. In
icial 3 anos 5. Inicial a los 5 meses 6. Inicial al ao 7. Inicial 8. Inicial 9. I
nicial 10. Inicial al da Edad 3 aos 6 aos 3 meses %CD3 56 73 29 43 89 93 83 76 36 5
1 0 64 65 72 %CD4 26 18 15 25 62 36 51 18 25 42 0 20 26 1 8 45 %CD8 29
L'ABS # 209 330 762 2.846 B74 272 2.734 96 304 2.794 0 No hay dalos No hay datos N
o hay datos No hay datos
Diagnstico Deficiencia idiopatica de CD4 Disqueratosis Inmunodeficiencia congnita
R/0 Lesin caustica gastrointestinal Aplasia de glbulos rojos Sndrome de Noonan Sind
rome de Williams Sindrome de DiGeorge Talasemia Neutropenia inmune Melanoma uvea
l Posthipertermia

6 aos 3 meses 4 meses 1 semana 12 aos 8 aos 50 aos

IO 15 32 57 31 48 7 12 24 33 47 51 35
ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.
Significado clnico de las pruebas de inmunodeficiencia
Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clnico es cmo eval
uar el significado clnico potencial de la respuesta inmune alterada in vitro. Los
estudios de trastornos relativamente bien definidos han demostrado que hay much
as diferencias significativas en el impacto clnico. Sin embargo, el uso de nuevas
estrategias de pruebas puede ayudar en la clasificacin de los pacientes segn el n
ivel y extensin del defecto. Por ejemplo, los estudios del sndrome de DiGeorge (Di
George, 1974), clsicamente una trada de aplasia tmica y paratiroidea y defectos con
otruncales. mostraban que existan diferencias importantes en la gravedad de las i
nfecciones que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reduccin del
nmero de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitgenos originada por la h
ipoplasia tmica. Inicialmente. se observ un alto grado de muertes asociadas a este
sndrome, pero con las nuevas tcnicas quirrgicas y mtodos anestsicos, se ha visto que
un nmero significativo de nios parecen desarrollarse normalmente sin infecciones
graves (Bastan, 1989). Sin embargo, algunos nios desarrollaron infecciones que no
respondan al tratamiento y, finalmente, mortales y n o hubo ningn modo de predecir
la evolucin. Recientemente, ha sido posible utilizar anlisis del fenotipo linfocti
co ms exacto y analizar los niveles de los defectos inmunes en el sndrome de DiGeo
rge. Utilizando anlisis longitudinales durante muchos meses y una aproximacin para
mtrica mltiple, parece que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consist
ente nmero de clulas T CD4, por la inversin del cociente CD4/CD8, y por la produccin
disminuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La
investigacin del significado de las deleciones monosmicas del cromosoma 22q11.2,
que son la principal causa del sndrome de DiGeorge, del sndrome velocardiofacial y
del sndrome de la anomala conotruncal de la cara, ilustran la importancia de la n
ueva informacin gentica. Slo el sndrome de DiGeorge fue descrito originalmente como
un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estudios orientados a la frecuenci

a de la inmunodeficiencia en los otros sndromes clnicos asociados con la microdele

cin del cromosoma 22q 11.2 han mostrado que en ms del 75% de los pacientes existe
evidencia de compromiso inmune (Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficie
ncia no se correlaciona con ninguna caracteristica fenotpica particular. La funcin
de las clulas T puede ser tan importante o ms importante en la infeccin por el VIH
que la prdida de las clulas CD4^ o la tasa de prdida. En algunas enfermedades asoc
iadas con virus, hay una considerable incertidumbre sobre lo estrecha que es la
asociacin entre el dlicit inmune detectado ex vivo y la funcin inmune in vivo (Land
ay. 1991; Lloyd. 1992). Mientras que los estudios recientes sugieren que la resp
uesta ortosttica alterada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del sndrome d
e fatiga crnica o que un aumento de las concentraciones plasmticas del factor de n
ecrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss. 1999), no
existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.
Efecto de la edad en la respuesta inmune
Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia durante proceso d
e envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan. 1994). Aunque hay una con
siderable variacin en esto y muchas veces es una consecuencia del estado nutricio
nal alterado (Mazari. 1998), es esencial que el laboratorio clnico proporcione re
sultados considerando distintos grupos de edad. El estudio de pacientes peditrico
s presenta hallazgos particulares para el diagnstico de laboratorio en la inmunod
eficiencia. El desarrollo del sistema inmune en el nio no est completo al nacer y,
adems, los nios n o han estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambient
ales anormales y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La expos
icin congnita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalas in
munes. Diferencias claves en la respuesta inmune peditrica incluyen una marcada l
infocitosis al nacimiento, una elevacin de las clulas B, un aumento del cociente C
D4+/CD8+, y la existencia de pocas clulas asesinas naturales (NK) (Fletcher, 1992
: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993). Estas diferencias se reflejan en la
s claras diferencias en el intervalo de normalidad de las subpoblaciones linfoci
tarias y deben tenerse en cuenta a la hora de evaluar los resultados (Denny, 199
4). Tambin, hay una importante diferencia en la respuesta a varios activadores co
mparado con los adultos. La respuesta neonatal de los nios prematuros a ciertos a
ctivadores microbianos puede ser ms potente que la de los adultos o que la de los
nios nacidos a trmino debido a los rpidos cambios en la regulacin inmune (Veber, 19
91: Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la program
acin perinatal (Prescott, 1998).
Malnutricin y respuesta inmune
Aunque generalmente se cree que la malnutricin es relativamente rara en los pases
desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutricin es relativamen
te frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad (Pennington. 1996). La mal
nutricin se asocia con la inmunodeficiencia y origina una vulnerabilidad importan
te a las infecciones (Chandra. 1993; Cunningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el
dficit de zinc puede presentarse como una inmunodeficiencia marcada que puede rel
acionarse con el dficit primario de la captacin de zinc en el tracto Gl, con una a
crodermatitis enteroptica o con un dficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; P
rasad. 1963). Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorcin asociada que a
lecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta proliferativa i
n vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (CunninghamRundles, 1981). Esto est asociado con el hecho de que el zinc es necesario para l
a actividad biolgica de la hormona tmica, necesaria en la produccin de las clulas T
luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para la activacin de las clulas T (Cunni
ngham-Rundles, 1996. 1998). Hay una

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

853
evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la res
puesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos especficos en la respu
esta inmune. La malnutricin puede ser un factor que aumente la complejidad de muc
hos casos clnicos. La interaccin de las infecciones con el metabolismo alterado se
cundariamente a la respuesta de fase aguda puede provocar cambios transitorios e
n los oligoelementos que produzcan la supresin transitoria de la respuesta inmune
. El estrs fsico puede tener efectos similares y provocar un aumento de la vulnera
bilidad a las infecciones en el contexto de la inmunosupresin (Cunningham-Rundles
, 1999). sle es un proceso bidireccional. La alteracin del crecimienlo puede ser e
l primer signo de la infeccin por el VIH en un nio VIH+ (Peters, 1998). Por ello,
como por otras razones, la evaluacin inmune debe ser un proceso continuo en el co
ntexto del tratamiento o de otros anlisis.
un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferacin reducida
capaz de ayudar a la clula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto los linfocitos
T de la lmina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se desarrollan de form
a relativamente independiente del timo y funconan de forma diferente a las clulas
T de sangre perifrica en el uso de la va de transduccin del CD2 en lugar de la va d
el receptor de clulas T/CD3. Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no s
e realizan habitualmente en los laboratorios de inmunologa clnica y. con raras exc
epciones, las clulas inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre
perifrica. Por esta razn, el uso de pruebas cutneas in vivo y el examen de la respu
esta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es til para el inmunlogo c
elular, ya que proporcionan otra forma de evaluacin. En cualquier caso, la utiliz
acin de aproximaciones sucesivas y la repeticin de anlisis son muy informativas.
Cncer
La inmunodeficiencia primaria est asociada con el aumento de la incidencia de cnce
r (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez est ms claro que hay tumores que se desar
rollan asociados a la infeccin por VIH (Davis. 1984; Chintu, 1995; Krown. 1996).
En el paciente con cncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reduccin en la re
spuesta ante un estmulo antignco puede asociarse al desarrollo de una neoplasia pri
maria, ocurrir durante las metstasis o estar causada por los efectos secundarios
del tratamiento. La reduccin en la respuesta inmune frente a los activadores no e
specficos estudiados ex vivo en ensayos de proliferacin se correlaciona con el est
ado de la entermedad y tiene un significado pronstico en la supervivencia (Heimda
l. 1999). A menudo se observa en los pacientes con cncer no tratado un cociente C
D4/CD8 invertido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987
). Los estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse
inmunolgicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta no protect
ora (Lee. 1997). El desarrollo de nuevos mtodos nmunoterapeticos est aumentando, sug
iriendo que la respuesta a antgenos especficos del tumor ser ms utilizada en el futu
ro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune tambin pueden utilizar
se en el seguimiento y evaluacin de la respuesta a los tratamientos como la IL-2
(Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cncer (Hsueh, 1998). En general, la quimi
oterapia producir una supresin transitoria de la respuesta inmune que se resolver e
n un corto periodo de tiempo, mientras que la radiacin puede tener efectos a larg
o plazo (Katz. 1993). La evaluacin de la respuesta inmune en el paciente con cncer
requiere de la utilizacin de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de
pruebas y activadores, que refleje los procesos relevantes, as como especificida
d en la respuesta.

Fases de estudio: fase de exploracin

La evaluacin de la funcin inmune en un paciente con una posible inmunodeficiencia
habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una exploracin de
las posibles reas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3. Estos estudios de
exploracin deben acompaarse de un anlisis de citometria de fluyo apropiada de las
subpoblaciones de linfocitos y, en nios, debe incluir del uso de marcadores de clu
las B para evaluar posibles cambios en estas, que pueden aparecer transitoriamen
te en los neonatos y reflejarse con una baja poblacin de clulas T. Tambin se recomi
enda el empleo de un marcador de clulas NK en nios de ms de 3 meses de edad, ya que
los niveles de esta poblacin pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (
Zola. 1983). Como existe frecuentemente una limitacin en la sangre que va a ser e
xtrada para estos estudios es esencial que la primera evaluacin incluya paralelame
nte un recuento sanguneo completo (CBC), en la muestra de sangre. Es esencial que
se lleve a cabo el recuento diferencial. La etapa de exploracin incluir un panel
de pruebas para evaluar la respuesta mitognica y frente a anligenos proliferativo
s. La respuesta proliferativa de linfocitos frente a un grupo de activadores con
tina siendo una de las herramientas ms sensibles para evaluar la funcin normal, y c
uando esta incluye un activador apropiado de clulas T y B puede ser utilizado esp
ecficamente para definir las reas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre, se
recomienda la utilizacin de distintas concenlraciones de cada activador. Adems, el
tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El uso de tubos que
contienen heparina de litio o cido etilenediamintetraactico (EDTA) no se recomiend
a para ningn estudio de funcionalidad de linfocitos. Deben utilizarse tubos con h
eparina sdica (sin conservante) o con citrato dextrosa (ACD). La sangre extrada en
tubos heparinizados tambin puede emplearse para el anlisis por citometria de fluj
o, aunque el tiempo para la preparacin de la muestra y su anlisis es critico (Nich
olson, 1993). La pregunta sobre cundo debe extraerse la sangre es importante. En
general, la mayora de los datos se han obtenido con sangre extrada por la maana y h
ay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no pued
e hacerse, es m u y til continuar manteniendo la uniformidad del tiempo de extrac
cin para cada paciente individual. Este hecho es ms crtico cuando se mide el nmero a
bsoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzacin de la enfermedad por VIH
o como parte de un ensayo clnico (Malone. 1990). Los estudios funcionales necesi
tan llevarse a cabo en sangre fresca anticoagulada siempre que sea posible (o sa
ngre almacenada a temperatura ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) a
ntes de que las clulas Tabla 36-3 Exploracin bsica en los estudios inmunolgicos Recu
ento sanguneo completo y anlisis dilerencial Anlisis de las subpoblaciones linlocit
anas (numero y porcentaje de clulas B y T) por citometria de flujo Activacin de li
nfocitos in vitro frente a mitgenos y activadores microbianos Inmunoglobulinas sri
cas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas si hay evidencia de infecciones cln
icas por bacterias encapsuladas En algunos casos, los niveles de inmunoglobulina
s son normales pero se producen anticuerpos no fijadores heterogneos, por tanto,
se necesitan estudios adicionales
APROXIMACIN METODOLGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR
Los estudios en humanos se han basado en la observacin de las clulas inmunes de sa
ngre perifrica ya que el compartimento perifrico es ms accesible y ms fcil de medir,
pero esta aproximacin puede no reflejar los sucesos regionales (Cunningham-Rundle
s, 1994a). Los conocimienlos sobre las diferencias entre la respuesta inmune sis
tmica y mucosa pueden explicar finalmente muchas paradojas actuales que surgen cu
ando se compara la respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del
husped in vivo (Xu-Amano, 1993). La funcin de la inmunidad sistmica celular parece
estar regulada a travs de los distintos patrones de funcionalidad de las citocin
as tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coadyuvan
tes tipo 1 (Th1), IL-2, e interfern-y (IFN-y). se favorece la defensa inmune celu
lar del husped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvantes tipo 2 (Th2), IL4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfocitos B (Barnes, 1993;
Yamamura, 1991). En contraste con la inmunidad sistmica, la actividad primaria d
e la respuesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de micr
oorganismos, toxinas y antigenos a travs de la secrecin y el transporte de la inmu

noglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por

854
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se enva por avin u otro transporte a
un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir un control par
alelo de la muestra extrada de una persona sana que sirva como un estndar interno
en el proceso de evaluacin.
Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutnea Falta de historia antignica aprop
iada cuando el panel no incluye activadores ubicuos Inmunodeficiencia primaria i
nlecciones vricas Malnutricin Enfermedades granulomatosas Neoplasias
Fases de estudio: fase de confirmacin Aspectos generales
.
Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se observen evid
encias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repitiendo pruebas s
obre aspectos especficos de las primeras series. Como poco, debe realizarse un pr
ueba positiva o negativa (rango normal y rango anormal). Pueden aadirse pruebas a
dicionales que proporcionen el punto de partida de estudios analticos. Es importa
nte organizar apropiadamente la extraccin de sangre cuando el paciente se encuent
re en el estado ms estable clnicamente. Se recomienda realizar por duplicado los e
studios bsales antes de llevar a cabo una intervencin, o incluso en la fase de con
firmacin. En algunos casos de posible inmunodeficiencia puede haber un secuestro
de clulas inmunes, que se refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el comp
artimento perifrico, como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confi
rmacin tambin debe incluir una cuidadosa reevaluacin de la historia mdica de los pac
ientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta eta
pa de confirmacin se muestran en la tabla 36-4.
Persistencia
timica
El roentgenograma de la silueta trmca puede no ser suficiente, ya que el timo tie
nde a la deplecin por estrs (Haynes, 1998). Aunque es difcil determinarlo con segur
idad, se ha visto que el tamao real del timo evaluado por resonancia magntica nucl
ear (MRI) se correlaciona con el nmero de linfocitos CD4+ en la infeccin por VIH (
Vigano' A, 1999). Estudios recientes sugieren que el timo humano puede considera
rse como un rgano compuesto por tejido linfoide central y perifrico. Haynes (1998)
ha postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las a
tocinas o de otros tactores producidos por las clulas inmunes perifricas del espac
io tmico penvascular. Como se describe en la seccin especfica sobre la evaluacin por
citometria de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T. la expresin de antgeno
s de maduracin normales adquiridos durante el desarrollo tmico ser suficiente para
identificar la presencia de un timo funcionante.
neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlacin global entre
la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia (Mass. 1998) pe
ro no ha sido til como herramienta analtica para determinar la razn de la falta de
respuesta. La prueba cutnea no es muy cuantificable. El empleo de la prueba cutnea
con derivados proteicos purificados (PPD) para evaluar la posible presencia de
Mycobactenum tuberculosis es una excepcin, aunque los individuos anrgicos no respo
nden y. adems, hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el

bacilo de Calmette-Gurin (BCG). Las causas de falta de respuesta en la prueba cu

tnea se muestran en la Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba c
utnea con inmunizacin de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se lleg a
utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigedad de
l mecanismo de respuesta subyacente. La introduccin del prueba de la ventana cutne
a" proporciona una medida ms cuantitativa e informativa de la respuesta inmune in
vivo debido a que la reaccin puede emplearse para determinar una respuesta tumor
al autloga (Black. 1998). Sin embargo, aunque con algunas reservas, la importanci
a de las pruebas cutneas c o m o demostracin convincente de que los defectos inmun
es que suceden in vitro pueden tener un significado pronstico in vivo, no debe se
r infravalorada.
Fases de estudio: estudios analticos de la inmunidad
Los estudios analticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6. Aunque la
descripcin completa de estos abordajes no se encuentra entre los objetivos de est
e anlisis, en general estos estudios son vlidos para definir el mecanismo subyacen
te del defecto inmune y proceder en una serie de etapas. Aunque hay diferentes m
odos posibles de hacerlo, un buen mtodo es evaluar el nivel general del defecto s
iguiendo el plan general de evaluar la presencia de los tipos celulares y las pr
oporciones relativas de cada uno a la vista de las reas de funcin general disminui
da y entonces poner en marcha los estudios de la funcin efectora.
Pruebas cutneas
En este momento puede ser importante la utilizacin de un panel de pruebas cutneas.
Este abordaje en la evaluacin de la inmunidad celular sirvi en un principio como
punto de partida para el desarrollo de las pruebas funcionales de la inmunidad c
elular y mide la respuesta de hipersensibilidad retardada directamente in vivo.
La experiencia con las pruebas cutFuncin inmune diferencial
Hay dos tipos principales de clulas implicados en la inmunidad (Haynes, 1990; Pau
l, 1993): 1) linfocitos T (clulas T) y 2) linfocitos B (clulas B). Los linfocitos
T se definen por la expresin del receptor del linfocito T el cual se une al antig
eno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el receptor de clulas T q
ue es esencial para su activacin
Tabla 36-4 Estudios analticos de confirmacin y de primera etapa Roentgenograma de
la sombra timica Prueba cutnea Actividad de las clulas asesinas naturales (si el n
io tiene 6 meses 0 ms) Produccin de citocinas en respuesta a la activacin con T-coad
yuvante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interfern-y, IL-4 y otros) Cultivo mixto de lin
focitos con el paciente como estimulador y con el paciente como respondedor Resp
uesta a la inmunizacin Prueba para la presencia de anticuerpos especficos segn la e
dad Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas (sustancias de
grupo sanguneo anti-A y anti-B) si el paciente es del grupo sanguneo A, B o O Prue
ba para el dficit de actividad de las enzimas adenosn deaminasa y purma nucletico f
osforilasa
Tabla 36-6 Estudios analticos e inmunorreguladores Desarrollo de los antgenos de l
a activacin durante la respuesta a la estimulacin, como el antigeno Tac, el recept
or de transterrina, regulacin del MHC de clase II sobre las clulas T , receptores
solubles y otros Respuesta do activacin precoz (p. ej, canales de calcio) Inmunor
regulacin Respuesta a IL-1, IL-2, interferones Desarrollo de funciones efectoras
Sntesis de inmunoglobulinas in vitro Actividad citotoxica de las clulas T Anlisis d
e clulas supresoras/factores de supresin Activacin de genes, anlisis del ciclo celul
ar Respuesta a la inmunizacin: inmunizacin de novo

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

855
Tabla 36-7 Fenotipificacin inmunolgica de las subpoblaciones de linlocilos Panel bs
ico de sangre perifrica (sangre, glbulos rojos Usados*) CD45/CD14 Inmunoglobulinas
control de isofipo de ratn CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3-/CD56 y 16 Clulas mononuc
leares aisladas, panel de activacin' CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isotip
o de ratn CD3/CD25 (IL-2R) CD3/HLA-DR
' Si el CD3 est bajo, entonces repetir y aadir CD2. Posteriormente, pueden aadirse
monoclonales trente al receptor de las clulas T acoplado con CD3. Tambin pueden ev
aluarse los marcadores de monocitos. Esto tambin puede realizarse utilizando reac
tivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como iniciador ' Despus de 2 das de
cultivo, extraer las clulas y lavarlas antes de teirlas con los anticuerpos monocl
onales escogidos: analizar las clulas control que no contienen activador, despus a
nalizar las clulas activadas. Los activadores pueden incluir mitgenos. IL-2 y/o ml
eilern-y.
conocidas como clulas que pueden matar inespecficamente (naturalmente) a las clulas
infectadas por virus y bacterias y que evitan las metstasis de las clulas tumoral
es. Sin embargo, las clulas NK tambin regulan funciones de las clulas T y B y la he
malopoyesis. Estas funciones de las clulas NK son, probablemente, dependientes de
su capacidad para producir linfocinas, particularmente IFN-y. Las clulas N K son
importantes para la activacin de las clulas fagociticas independientes de antgeno
durante las fases precoces de la infeccin y para favorecer el desarrollo de las cl
ulas Th1 especficas de antgeno. El sistema N K est por naturaleza activado y no tie
ne que ser inducido por antgenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan
con anticuerpos especficos, estas clulas pueden matar especficamente. La evaluacin f
uncional de esta poblacin celular puede llevarse a cabo de forma adecuada utiliza
ndo un anlisis rpido de liberacin de cromo conocido como un ensayo de citotoxicidad
NK empleando K-562s como dianas) o mediante citometra de flujo. Los estudios futu
ros estarn encaminados a detectar cmo las clulas N K ligan la inmunidad innata y la
adaptativa (Peritt, 1998).
Desarrollo de la respuesta inmune
Si se ha determinado que la poblacin de clulas est esencialmente intacta en ausenci
a de activacin, la cuestin de un fallo intrnseco puede estudiarse mediante muchos a
bordajes diferentes que incluyen el anlisis expandido de marcadores de superficie
de linfocitos, entre ellos los determinantes del receptor antignico de las clulas
T (TCR) y los antgenos de activacin como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7
). La ausencia de regulacin del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemp
lo. Aunque las poblaciones celulares pueden expresar un antgeno de diferenciacin n
ormal de referencia, tambin pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo cual pue
de ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las clulas T CD8+ que c
oexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las clulas CD8 que no expresan e
ste marcador y se encuentran expandidas en la enfermedad por VIH (Giorgi, 1989).
La ausencia de expresin de ciertas molculas, como el CD28. tambin es un indicador
importante. En algunos sndromes de inmunodeficiencia primaria, la regulacin del re
ceptor de IL-2 en respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden n
o estar translocados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematu
ramente (Cunningham-Rundles. 1990). El desarrollo de la respuesta puede ser anor
mal cinticamente, debido al retraso del reclutamiento secundario durante la fase
de amplificacin. Esto debe ser comprobado mediante estudios peridicos. En algunos
casos, n o pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas.
Las funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evaluacin
puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la respuesta aadi

endo citocinas pueden ser tiles, aunque pueden no mostrar la lesin al compensar y
no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias de anlisis pueden utili
zar sangre en lugar de clulas mononucleares aisladas (Bocchieri, 1995). Este sist
ema proporciona una excelente visualizacin, ex vivo, de la respuesta inmune, ya q
ue las relaciones reales entre las clulas no se alteran. Adems, este sistema puede
utilizarse para medir la produccin de citocinas (Petrovsky, 1995; De Grote, 1998;
Suni, 1998). Se aconseja al laboratorio de inmunologa clnica elegir estudios analt
icos bsicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base p
ara la comparacin. El establecimiento de los valores de referencia y el mantenimi
ento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especialmente para
ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sensibilidad de es
tas pruebas.
Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un am
plio grupo de antgenos, requieren la maduracin tmica para su funcin normal y median
la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las inmunoglobulinas d
e superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclonales como el CD19 o el CD2
0) y tras una activacin adecuada se diferencian en clulas plasmticas que secretan a
nticuerpos especficos, mediando, de este modo, la inmunidad humoral. La falta de
un timo normal comprometer la funcin de los linfocitos T y afectar a la activacin de
los linfocitos B dependientes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la mdula s
ea puede afectar tanto a la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de lo
s linfocitos B. aunque pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se d
escribe con ms detalle posteriormente en la Proliferacin linfoctica como mtodo In Vi
tro de evaluacin de la inmunidad celular. L a distincin entre respuesta inmune esp
ecfica y no especifica es una necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya qu
e el sistema debe ser capaz de distinguir entre lo propio y lo extrao. En general
, esto se logra medanle la incorporacin del sistema de autoantigenos del complejo
molecular MHC en la fase de reconocimiento antignico. El antigeno debe ser proces
ado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y conducir al
desarrollo de la memoria inmune. La funcin del procesamiento antignico se lleva a
cabo por las clulas presentadoras de antgeno (APCs), siendo el monocito la mejor e
studiada. Esta respuesta dispara la activacin y la proliferacin de los linfocitos.
y puede incluir la produccin de clulas electoras y la activacin de los linfocitos
B para producir anticuerpos. Este tipo de inmunidad, a menudo denominada inmunid
ad adaptativa. se mantiene como "memoria" y se desencadena tpicamente despus de in
munizaciones o infecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresin del antgen
o MHC de clase II puede detectarse en los linfocitos por citometra de flujo utili
zando anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor marcad
or de dficit de MHC de clase II (Tabla 36-7). Un segundo tipo fundamental de inmu
nidad puede describirse como la inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aum
enta con contactos repetidos. Esta inmunidad est mediada por las clulas fagocitica
s. algunas de las cuales, como el monocito. tambin pueden procesar y presentar an
tgenos, y las clulas NK. A diferencia de las clulas fagociticas. las clulas NK no es
tn desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la atocina
clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduracin de este sist
ema, est tambin disminuida al nacer. Esta tercera rama est representada por las clul
as NK. que no son ni clula B ni exactamente clulas T por no tener ni inmunoglobuli
nas de superficie ni el receptor de clulas T. Estas clulas, antes llamadas clulas "
K", clulas "nulas" o "tercera poblacin", ha eludido la clasificacin convencional po
r anlisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador ms de
finitivo de la clula N K (Trinchieri. 1998). Las clulas N K han sido ms
PROLIFERACIN LINFOCTICA COMO MTODO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inm
unologa celular Activacin y proliferacin linfoctica
Aunque el sistema inmune se divide clsicamente en componentes humoral y celular,
esta separacin n o es absoluta, ya que hay una considerable interdependencia entr
e las clulas B y las clulas T.

856
SECCIN V

INMUNOLOGA INMUNOPATOIOGA
El parmetro funcional de la inmunidad celular ms frecuentemente medido es la proli
feracin linfocitaria. La medida de la activacin/proliferacin de los linfocitos ha e
volucionado sustancialmente desde finales de los aos 50 e inicio de los 60. cuand
o la divisin celular se determinaba por el recuento del nmero de linfocitos que se
haban transformado en blastos. Estos mtodos fueron reemplazados por la cuantifica
cin de la incorporacin de precursores marcados de los cidos nucleicos (timidma trit
iada) en el cido desoxirribonucleico (ADN) recin sintetizado. Aunque este "anlisis
en masa' permanece como el procedimiento de laboratorio ms frecuentemente utiliza
do para medir la proliferacin celular, recientemente han aparecido nuevos reactiv
os y nuevos procedimientos para evaluar la activacin y proliferacin linfocitaria.
Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferacin de la su
perficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de clulas en fases especi
ficas del ciclo celular, la cuantificacin de citocinas y de receptores de citocnas
asociados a clulas y la posibilidad de evaluar el nmero de divisiones celulares e
n linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta seccin se revisan l
os acontecimientos moleculares implicados en la activacin y en la proliferacin de
los linfocitos T y se revisan algunos de los nuevos mtodos que se han desarrollad
o para evaluar las funciones del sistema inmune celular.
Determinacin de las vas bioqumicas de la activacin linfocitaria
Tras la interaccin especfica del mitgeno o el antigeno/MHC con los receptores aprop
iados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celulares que incluyen cam
bios en el transporte de membrana, redistribucin del sistema del ciloesqueleto (p
olarizando el linfocito hacia la APC) y la activacin de mltiples vas de sealizacin. E
stos cambios conducen finalmente a la diferenciacin de la clula T. a la secrecin de
citocinas. a la proliferacin, a la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones
actuales estn desvelando las complejas rutas moleculares y bioqumicas que conduce
n a la clula T activada por estas rutas. Constantemente se estn descubriendo alter
aciones especificas en estas vas y subyacen en muchas de las enfermedades de la i
nmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los anlisis de p
roliferacin en masa indican solo que no hay divisin celular o que esta es limitada
y no proporcionan informacin sobre las alteraciones subyacentes de la activacin d
el linfocito. Se requieren ensayos ms sofisticados para investigar las alteracion
es subyacentes de las clulas T.
superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de sealizacin por
si mismo. La estructura de reconocimiento antignico est compuesta por cadenas est
ructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuentemente por las cadenas y y 6)
y el complejo de transduccin CD3 est formado por cinco cadenas polipeplidicas inva
riantes, a. p\ e. y un dmero de cadena zeta. Cada una de las protenas del CD3 cont
ienen un residuo llamado residuo inmune de activacin de la tirosina (ITAM). que s
e une al dominio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f (que existe como
un homodmero f una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y) contiene
3 ITAM y es el componente ms significativo del complejo TCR. estando implicado en
la transduccin de la seal desde el TCR (Weiss 1994). Inicialmente descritos por R
eth (1989). estos residuos juegan un papel esencial en los acontecimientos inici
ales que siguen a la activacin de las clulas Tflrving. 1991). Las molculas CD4y CD8
de la superficie de las clulas T tambin estn unidas de forma no covalente al compl
ejo TCR Se unen a las molculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la AP
C y tambin estn implicadas en la transduccin de las seales de activacin Una vez proce
sado el antigeno, este es presentado a las clulas T en el contexto de los antigen
os del MHC. En general, las clulas T CD4+ responden a antgenos exgenos procesados y

presentados en el contexto de MHC de Clase II y las clulas T CD8+ responden a an

tigenos endgenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los C
D4 y los CD8 tambin estn asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontec
imientos precoces tras la activacin de las clulas T. Adems de estas interacciones y
las interacciones de las molculas estimuladoras, otro grupo de molculas (molculas d
e adhesin), presentes tanto en la APC como en las clulas T respondedoras, se unen
unas a otras y sirven para aumentar la avidez de la unin. Las molculas coestimulad
oras identificadas en las APC incluyen el B7 (CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (A
zuma. 1993). el antigeno estable al calor (HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 19
98; Wingren. 1995) Sobre las clulas T. la CD28 es la principal molcula estimuladora
y se une al B7: la CTLA-4. por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y es
t implicada en la disminucin de modulacin de la activacin de las clulas T (Linsley, 1
991b). El receptor en las clulas T para el HSA no ha sido identilicado. La presen
tacin del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las molculas coestimula
doras lleva a una respuesta anrgica (tolerancia) en posteriores exposiciones a es
e antgeno especifico pero no afecta a las respuestas a otros antgenos (Tan, 1993).
La posibilidad de hacer no inmunognicos a tumores inmunognicos transplantados tra
nsfirindoles el gen 87 (Townsend. 1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994)
sugiere que las molculas coestimuladoras juegan un papel importante en la activac
in de las clulas T in vivo.
Activacin de los linfocitos T inducida por antigenos
La activacin de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una serie
de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre la activa
cin de una clula T nativa frente a la activacin de una clula T de memoria. El antige
no es procesado por las clulas B o por los monocilos provocando el ensamblaje de
pptidos inmunognicos en los productos de los genes del MHC de clase I o II El comp
lejo pptidoMHC es presentado a las clulas T que portan el receptor apropiado de es
a clula T. Adems, la APC expresa una serie de molculas de adhesin y coestimulacin que
interactan con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de
la clula T. La unin aislada del receptor de la clula T no es suficiente para la ac
tivacin de la clula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 seales" para la activ
acin de la clula T (Brestcher, 1992). La primera seal que ocurre por la va TCR/CD4/C
D8 modula la transicin de la clula T en las primeras etapas de la activacin (p ej..
de G a G.). La 2- seal se produce por la via de los coestimuladores. ms concretam
ente por el CD28 y en menor medida por LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la induc
cin de la IL-2 y de otros genes de citocinas requeridos para la proliferacin y dif
erenciacin de la clula T hacia clulas efectoras.
0
Transduccin de seales despus de la estimulacin antigeno-especfica
La presentacin del antigeno a las clulas T conduce a la agregacin del complejo del
TCR-CD3 y a la activacin de la protena tirosina cinasa (PTK), El TCR por si mismo
tiene un pequeo dominio ciloplasmtico sin actividad de transduccin conocida. Es la
cadena asociada del complejo CD3, que contiene residuos ITAM y que se ha demostra
do que coprecipita la actividad de la protena tirosina cinasa Dos clases bien con
ocidas de familias citoplasmticas de PTK estn implicadas en las etapas mas precoce
s que siguen a la agregacin del receptor de clulas T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascad
as de sealizacin que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la va d e la coest
imulacin por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activacin de las tirosina
cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la activacin de tres vas. p2
T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La activacin del p21" activa las
prolena cinasas activadas por mitgenos (MAPK) que fosfonlan muchos factores de tr
anscripcin regulando de este modo la expresin gentica. La activacin de la tirosina c
inasa tambin activa a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y ori
gina la generacin de los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol tri
fosfato (IP3). El DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rpido y su
stancial aumento del calcio ciloplasmtico. El aumento del calcio libre activa la
fosfatasa calcineurina dependiente de calmodulma.
1b

Reconocimiento de las clulas T, activacin y transduccin de la seal

El complejo TCR est compuesto por una estructura de reconocimiento del antgeno het
erodimrica (esto es. el TCR) y un complejo de transduccin no unido covalentemente
que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

857

Estos procesos tambin conducen a la induccin de protenas de unin al ADN y a la trans

cripcin de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor de IL-2 requeridos pa
ra la proliferacin de la clula T. Para ms informacin sobre las vas de transduccin mol
cular tras la activacin del TCP. y el CD28, consultar a Wiss (1994). Zhao (1997),
Foletta (1998) y Halloran (1999). La comprensin de las vas que conducen a la acti
vacin de la clula T ha llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de mu
chas enfermedades de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a pro
porcionar estrategias teraputicas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se ha
n publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y estn asociadas con
la forma autosmica del sndrome de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en
humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena comn y de los receptores de in
terleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan anomalas de la transduccin y es
tn asociadas con la forma ligada al cromosoma X del SCID (Noguchi, 1993). Es inte
resante hacer notar que otras formas de SCI adquiridas autosmicamente estn asociad
as con las mutaciones en la protena tirosina Jak3 de la familia de protenas Jano.
la nica molcula de sealizacin asociada con la cadena comn y (Russell. 1995). A medida
que se van descubriendo ms anomalas subyacentes que conducen a la inmunodeficienc
ia de clulas T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse empleando u
n extenso sistema que identificar los trastornos de acuerdo con las alteraciones
en la diferenciacin, la maduracin y la funcin (Gelfand. 1993). Estas designaciones
podran comenzar a enfocarse en los defectos fisiolgicos o bioqumicos propiamente di
chos y pueden finalmente proporcionar nuevas opciones teraputicas. Para una revis
in de las alteraciones moleculares especficas que originan alteraciones en la acti
vacin y proliferacin de la clula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (199
3) y IUIS (1999).
estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad pro
tectora mediada por clulas como resultado de una baja dosis de inmunizacin o de in
feccin.
Metodologa: determinacin de la activacin y la proliferacin linfocitica en la evaluac
in de la inmunodeficiencia celular
Los defectos del desarrollo, las alteraciones genticas congnitas y las infecciones
adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Adems, las quemaduras g
raves, los traumatismos y las intervenciones teraputicas tambin originan mmunodefi
ciencias. Los anlisis en masa pueden emplearse para determinar si un individuo ti
ene o no una disminucin de la respuesta proliferativa de las clulas T y han estado
disponible durante algn tiempo pero estn limitados por una baja reproducibilidad
y por la limitada informacin que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologas h
a permitido la produccin de una variedad de reactivos que pueden emplearse para e
valuar mltiples actividades a lo largo de la via de activacin de la clula T. Estos
reactantes incluyen anticuerpos monoclonales especficos como marcadores de la act
ivacin de la clula T. reactivos y sistemas para la deteccin de citocinas intracelul
ares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioactivos del ADN desarrol
lados para evaluar la proliferacin linfocitica.
Procedimientos empleados para evaluar la activacin y la proliferacin de la clula T
El procedimiento ms frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmunidad celu
lar es una simple prueba cutnea. Una prueba cutnea positiva para la deleccin de una
respuesta de hpersensibilidad implica una inmunidad celular y una quimiotaxis de
monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las pruebas cutneas se llevan a cabo fcil
mente, los resultados negativos son difciles de interpretar, especialmente en nios

pequeos, y las pruebas cutneas no son tan sensibles como los ensayos de estimulac
in de linfocitos in vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad
mediada por clulas son la sensibilidad por contacto, la formacin de granulomas y
el rechazo alognico. Los linfocitos son los nicos en los que se expresan receptore
s de superficie capaces de identificar virtualmente cualquier molcula o sustancia
extraa (antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por
el reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la clula T. En general
, solo hay un nmero limitado de linfocitos circulantes capaces de reconocer un an
tigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extrao, las clulas proli
feran rpidamente de forma clonal para generar un gran nmero de clulas tanto efector
as como de memoria. Los primeros mtodos empleados para evaluar la proliferacin lin
focitica incluan el recuento manual del nmero de clulas antes y despus de la estimul
acin. Desgraciadamente, estas tcnicas requieren mucho tiempo y presentan muchos pr
oblemas tcnicos. En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos que miden los d
iferentes acontecimientos celulares que ocurren en la ruta de la divisin celular.
Hay que subrayar que los mtodos que miden los sucesos iniciales en la activacin d
el linfocito T pueden o no correlacionarse con la divisin celular.
Respuestas de la clula T
Recientemente, se ha preterido la designacin de la respuesta de la clula T tipo I
frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de la clula T
que originan unos patrones de secrecin de citocinas que se sabe que estn implicad
os en la inmunidad celular frente a los patrones de secrecin de citocinas observa
dos en la inmunidad humoral, respectivamente. Las respuestas tipo I se caracteri
zan por la secrecin de citocinas que se sabe que aumentan la inflamacin (promflama
torias) e inducen la activacin y la proliferacin de las clulas T y los monocitos, a
saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las respuestas tipo II se caracterizan por la secr
ecin de citocinas que suprimen la inflamacin (antiinflamatorias) y estimulan a las
clulas B a dividirse y diferenciarse en clulas secretoras de inmunoglobulinas (es
to es, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secrecin de
las citocinas del tipo I regulan la secrecin de las citocinas tipo II y vicevers
a (Paul. 1994). Por ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Chtelain, 1992)
como ih vitro (Seder, 1992:1993). las clulas T no se diferencian en clulas secret
oras de IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta i
nmune humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 pre
sentes durante la estimulacin de las clulas T nativas dirigirn la respuesta hacia u
n lado o hacia otro (Paul, 1994). Muchos factores estn implicados en la regulacin
del tipo de respuesta de la clula T que sigue a la estimulacin antignica. Adems del
ambiente de citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antgeno influy
e en el tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreas, 1995). La respuesta predomin
ante que se desarrolla Iras la activacin de la clula T tiene implicaciones clnicas
significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de tipo I a l
a infeccin por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora (Clerici, 1994).
Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la mayora de las perso
nas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen por intensa inmunodepresin
. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que la exposicin repetida a una dosis
baja de VIH-1 puede originar una inmunidad protectora celular tipo I. Los result
ados de estos grupos indican que entre el 39% y el 75% de las clulas mononucleare
s de la sangre perifrica (PBMC) de los individuos de alto riesgo (varones homosex
uales, adictos a droga va intravenosa y nios nacidos de madres VIH positivas) sero
negativos para VIH-1 y negativos para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
, secretan IL-2 en respuesta a la protena env in vitro. Estos cientficos proponen
que
Ensayo de incorporacin de timidina tritiada H (ensayo TdR)
Muchos laboratorios evalan la capacidad proliferativa de los linfocitos calculand
o el grado de incorporacin de nuclesidos radiactivos del ADN (timidina tritiada) d
urante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubacin prolongada de cultivos celular
es de mononucleares de sangre perifrica con mtgenos (tres a cuatro das) o con antgeno
s (5 a 10 das). En general, solo un nmero limitado de clulas T responden a un antig

eno in vitro; por lo tanto, las clulas deben cultivarse durante 5 a 10 das para de
tectar la respuesta. Los mitogenos, por otra pane, inducirn la rpida proliferacin d
e hasta el 100% de las clulas T. Por esta razn, la proliferacin puede detectarse en
tres o cualro dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva.
La transformacin linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtgeno fue descrita por
pri3

858
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
mera vez por Nowell (1960). Los mitgenos son, en general, los estimuladores ms pot
entes, ya que activan una gran proporcin de linfocitos en relacin con los aloantig
enos y los antigenos.
Citometria de flujo en la evaluacin de la activacin y la proliferacin linfocitaria
Los anlisis en masa, adems de sus inherentes problemas tcnicos, no proporcionan inf
ormacin sobre las subpoblaciones celulares especficas que estn respondiendo. La cit
ometria de flujo con su potencial multiparamtrico inherente se ha convertido en e
l instrumento de eleccin para el anlisis de la inmunologa celular. La figura 36-1 i
lustra algunos de los acontecimientos celulares que ocurren a lo largo de la rut
a de activacin/proliferacin de la clula T que pueden medirse por citometria de fluj
o. Para una revisin extensa de la citometria de llujo y de los mtodos empleados pa
ra evaluar la activacin y la proliferacin linfoctica. vase Bauer (1993) y Shapiro (1
995). Otro mtodo basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso importa
nte en los laboratorios clnicos es la medida de los linfocitos en varas fases del
ciclo celular. En general, los anlisis del ciclo celular se llevan a cabo midiend
o el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de ADN. El marcador
empleado ms frecuentemente es el yoduro de propidio. que interacciona estequiomtr
icamente con el ADN (esto es. la cantidad o intensidad de fluorescencia es propo
rcional a la cantidad de ADN de la clula). Utilizando complejos modelos matemticos
, es posible medir el porcentaje de clulas con un contenido en ADN entre 2- y 4 ,
que se correlaciona con el porcentaje de clulas en fase "S" del ciclo celular. E
n general, los linfocitos de sangre perifrica se encuentran en la fase de reposo
del ciclo celular, con menos del 5% de las clulas en la fase "S"
C
FLUORESCENCIA
I.O
lKH26
Figure 36-2. Empleo de marcadores de seguimiento PKH26 en linfocitos perifricos e
stimulados y no estimulados por mitgenos tras cinco dias en cultivo. La prolifera
cin celular se indica p o r la dilucin d e la intensidad fluorescente en c a d a g
eneracin sucesiva. (Modificada de Shapiro HM: Practical F l o w Citometry. 3* ed.
Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pg. 3 1 3 . Copyright Wiley-Liss. 1995. Reimpreso
c o n permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.) ware
necesario para el anlisis junto con los marcadores de rastreo (Sigma Immunochemic
als. St. Louis. MO). Una evaluacin de 14 de los marcadores utilizados ms frecuente
mente inform que dos de los marcadores. PKH26 y el ester succinimidilco del diacet
ato de carboxifluoresceina (CSFE). eran los ms adecuados por su capacidad para cu
antificar la proliferacin de los linfocitos (Parish, 1999). Este ensayo puede pro
porcionar la evaluacin ms fiable de la respuesta proliferativa celular en sistemas
de cultivo in vitro con ventajas importantes sobre los anlisis en masa habituale
s, permitiendo la medicin de subpoblaciones especficas de linfocitos. Los indices
de CSFE parecen correlacionarse ms estrechamente con los anlisis con TdR que la me
dida de las clulas CD69* (ngulo. 1998). La medida de la proliferacin linfocitaria e
mpleando las sondas marcadas PKH26 y el CSFE ha sido desarrollada, optimizada y
analizada para su empleo en aplicaciones clnicas (Allsopp, 1998; ngulo. 1998). La
posibilidad recientemente desarrollada de medir la produccin de atocinas asociada
s a las clulas a nivel de una sola clula tiene un importante potencial como herram

ienta clnica en la evaluacin de la respuesta celular inmune. Bsicamente, las clulas

son estimuladas, ya sea c o m o PBMC o como sangre completa, durante cuatro a se
is horas en presencia de reactivos que bloquean el transporte de membrana (brele
ldina A o monensma) para evitar la secrecin de atocinas. Entonces, se marcan las
clulas con anticuerpos monoclonales especficos de cada subpoblacin, se fijan, se pe
rmeabilzan y se marcan con anticuerpos monoclonales fluorescentes especficos para
el estudio de la citocina de inters (Jung, 1993; Prussia 1995). El ensayo se ha d
esarrollado en presencia de anticuerpos estimuladores para la deteccin sensible de
respuestas antignicas en cultivos de sangre tras periodos relativamente cortos d
e incubacin (Suni, 1998). Se ha prestado especial atencin al desarrollo de anticue
rpos que reconozcan las formas de nacientes de las citocinas (dentro del aparato
de Golg) y la optimizacin del tiempo de cultivo para detectar la mxima respuesta d
e las atocinas (Mascher, 1999). Los estudios clnicos han comenzado a demostrar la
utilidad potencial de esta tcnica. Por ejemplo, los pacientes que sufren quemadu
ras m u y graves y que muestran una deriva hacia la respuesta de citocinas Th2 p
ueden tener un riesgo mayor de desarrollar fracaso multorgnico (Zedler. 1999). Est
o puede ser m u y ventajoso, ya que no hay pruebas actuales que indiquen qu pacie
ntes sufrirn esta complicacin potencialmente
Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporacin de timidina trita
da por anlisis de induccin de marcadores de superficie celular combinados con una
medida del porcentaje de clulas en vanas fases del ciclo celular tras la activacin
(Cost. 1993). Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de
forma estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso
de marcador, se estimula la divisin de los linfocitos. Con cada divisin sucesiva l
a cantidad de marcador por clula se reduce a la mitad. La fluorescencia emitida p
or las clulas tras el cultivo puede modelarse permitiendo la estimacin del nmero de
divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodologa se ha estandarizado recienteme
nte en un equipo analtico que incluye el softFigura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activacin de
los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de S
hapiro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397
Copyright <g Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsi
diaria de John Wiley 8 Sous, Inc.)

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

859
mortal. Se estn realizando actualmente muchos estudios que evalan la utilidad clnic
a de esta prometedora nueva tecnologa. Se ha informado la expansin de esta tcnica p
ara incorporar la capacidad de medir simultneamente la proliferacin y la sntesis es
pecfica de citocinas a nivel de una sola clula pero todava no ha sido evaluada en u
n marco clnico (Mehta, 1997). Ciertamente, se estn desarrollando nuevas tcnicas que
miden los diferentes acontecimientos implicados en la activacin de la clula T. Ha
y mtodos y reactivos disponibles para medir los acontecimientos precoces de fosfo
rilacin/desfosforilacin hasta la transduccin de seales, la transcripcin de los genes
y la divisin celular. Segn se adapten estos mtodos a la actividad clnica diaria, pod
remos disponer de un arsenal de estos para evaluar muchos de los procesos implic
ados en la activacin y proliferacin de los linfocitos. Aunque un elevado nmero de e
stas nuevas tecnologas todava estn en manos de los laboratorios de investigacin, los
mtodos se estn simplificando y adaptando constantemente para su uso y evaluacin en
los laboratorios clnicos.
FUNCIN GRANULOCTICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS
Tanto los monocitos como los granulocitos derivan de un precursor comn. Los granu
locitos son extremadamente importantes en la respuesta inflamatoria precoz, y la
s alteraciones en sus funciones conducen a deficiencias importantes en la inmuni
dad celular. Estas suceden en cualquier punto de una serie de procesos necesario
s para la funcin de los granulocitos, incluyendo la dificultad en abandonar la va
sculatura (diapdesis), el movimiento hacia el agente agresor (quimiotaxis. quimio
quinesia). la opsonizacin del agente agresor (fagocitosis) y la destruccin por la
va de la generacin de radicales txicos del oxgeno.
sean ms relevantes y tiles en el laboratorio clnico (Weinberg. 1993). Recientemente
, la FDA aprob el anticuerpo monoclonal obtenido por ingeniera gentica trastuzumab
(Herceptin) para el tratamiento de pacientes con cncer de mama metasttico cuyos tu
mores sobreexpresan el gen HER2meu y al mismo tiempo aprob una prueba diagnstica e
n la que se usan mtodos de inmunohstoqumica (IHC) para la deteccin de la proteina HE
R2/'neu, que es la diana del anticuerpo. Otra prueba que utiliza la FISH para de
tectar la amplificacin de la expresin gnica de la proteina HER2/neu se est utilizand
o en laboratorios especialmente entrenados. Cada prueba complementa a la otra, p
oseyendo cada una distintas dificultades tcnicas y sensibilidad. El IHC suele pro
ducir falsos negativos debido a la existencia de artefactos y necesita ser revis
ado por otro mtodo. Con el FISH existe la posibilidad de falsos positivos (la exp
resin gnica no tiene por qu equipararse necesariamente con la amplificacin gnica). Co
mo sucede en muchas tcnicas, incluyendo el anlisis del ciclo celular en el ADN. ca
da uno de los nuevos marcadores y de las nuevas tcnicas deben ser definidos, eval
uados y correlacionados con los resultados del paciente antes de otorgarle o no
una utilidad clnica absoluta. Se ha introducido el desarrollo de instrumentacin qu
e combina la fuerza de la citometria de flujo y las ventajas estticas del anlisis
de imagen. Esos instrumentos, conocidos como citmetros de exploracin por lser, real
izan las mediciones tradicionales de citometria de flujo de dispersiones hacia a
delante, dispersiones laterales y fluorescencia en las clulas en suspensin o fijad
as en el portaobjetos. La experiencia con estos sistemas determinar si este abord
aje ofrece ventajas de las que no se dispone con la citometria de flujo actual y
con las configuraciones de sistemas de imagen (MartinReay, 1994) (Fig. 36-3). L
os citmetros de exploracin por lser y los anlisis de imagen no se desarrollan en est
e captulo. Los avances combinados en el procesamiento por pulsos electrnicos, ptico
s y en el almacenamiento de datos junto con los avances en la tecnologa de los or
denadores y del software han permitido que la tecnologa de la citometria de flujo

llegue a ser una rutina en el laboratorio. Adems, la amplia posibilidad de antic

uerpos monoclonales agrupados, que incluyen ms de 150 (Kishimoto, 1998), marcados
con muchos colores, directamente conjugados y en formato preformado ha permitid
o la deteccin simultnea de mltiples antigenos de superficie as como de constituyente
s citopiasmticos y nucleares. La posibilidad de desarrollar anlisis multiparamtrico
s es la mayor fuerza de la citometria de tiujo. Actualmente, la determinacin tant
o de los marcadores fenotpicos como de los intracelulares es una rutina en muchos
laboratorios. Los principales fabricantes han desarrollado el arte de la citome
tria de flujo convirtindolo en una ciencia de rutina en los laboratorios (ciencia
de "caja negra") para desgracia de muchos. Como se ha descrito, este fenmeno es
el resultado del uso de la citometria de flujo en la fenotipificacin de las pobla
ciones de las clulas T para la monitorizacin de los pacientes con VIH (Shapiro, 19
93: Centers for Disease Control [CDC], 1992; Calvelli, 1993). Antes de la aparic
in de la epidemia del VIH, la utilidad de la citometria de flujo en el laboratori
o le principalmente para la caracterizacin de las leucemias y de otras enfermedade
s hematolgicas malignas y para el anlisis del ADN de tumores en la fase de sntesis
(fase S) y el ndice de ADN (DI). Aunque la tecnologa de la citometria de flujo pue
de ser ms "caja negra", la epidemia de VIH ha aportado la citometria de flujo a u
n nmero mucho mayor de instituciones y laboratorios [College of American Patholog
y [CAP]. 1990-2000). Esto ha permitido a esta tecnologa ser una parte integral de
muchos diagnsticos y un importante complemento en el tratamiento de los paciente
s. A pesar de su simplificacin, persisten muchas cuestiones relacionadas con la r
egulacin de la FDA, la competencia de los anlisis y la gestin y reproducibilidad de
los datos. Eslo es particularmente cierto en lo referente al anlisis del ADN (CA
P, 1990-2000). No es el propsito de este captulo describir todos los matices de la
citometria de flujo o de la citometria de imagen. Todas las citometras de flujo
actuales pueden utilizarse adecuadamente como rutina en la fenotipificacin y anlis
is del ADN. La mayora de los problemas de los laboratorios son la imposibilidad d
e estandarizar los reactivos de control de calidad y los calibradores y la prdida
de mtodos rpidos y fiables para la transferencia y almacenaje de datos, compatibl
es con los sistemas de informacin del laboratorio. Se insta a los lectores a que
consulten las numerosas referencias para una seleccin apropiada del citmetro de fl
ujo o de imagen referente en cuanto a sus muchas configuraciones y capacidades (
Shapiro, 1993, 1995).
METODOLOGA: CITOMETRA DE FLUJO Y DE IMAGEN
El empleo de la citometria de flujo (anlisis celular basado en el lser) se ha conv
ertido en el estndar de la prctica del laboratorio clnico en el estudio de respuest
a inmune celular, como se indic previamente (Kamientsky. 1969; Hertzenber, 1976).
Las determinaciones de la inmunocompetencia e nmunomodulacn de los marcadores y re
ceptores de superficie especficos, la caracterizacin de la lnea por medio de la fen
otipificacin inmune de los linfomas y de las leucemias, la definicin de malignidad
empleando sondas especficas de cromosomas, as como el estudio de la heterogeneida
d tumoral por las mediciones multiparamtricas del ADN son estudios frecuentemente
realizados en muchos laboratorios, como se estableci previamente, y se detallan
en Keren (1989a. 1989b), as como en muchas otras referencias mencionadas a lo lar
go de este texto. La clasificacin de los tipos celulares por estos medios signifi
ca la posibilidad de definir las funciones biolgicas y efectoras en las bases mol
eculares y permite establecer las relaciones de estas mediciones con procesos y
definiciones de enfermedades. Estas son unas pocas de las aplicaciones que son p
osibles empleando las tecnologas basadas en el lser. Se utilizan dos tecnologas pri
ncipales. En la primera, conocida como citometria de flujo, se contabilizan las
partculas y se determinan las caractersticas fsicas y qumicas de las partculas que pa
san a travs de un flujo de lquido en una suspensin de clulas aisladas. En la segunda
, conocida como anlisis esttico, las partculas son estacionarias y la plataforma o
el lser se mueven como en un anlisis de imagen (Martin-Reay. 1994). La tecnologa de
l anlisis de imagen se est haciendo un hueco poco a poco en el laboratorio para la
evaluacin de citospines preparaciones de contacto {louch preparations). en prepa
raciones cromosmicas. y en secciones titulares para ciertas aplicaciones, como la
hibridacin n situ fluorescente (FISH) y de DNA. Los avances en la disponibilidad

de las sondas fluorescentes para la FISH y la representacin cromosmica en los aos r

ecientes har que estos anlisis

860
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Figura 36-3. El empleo de citmetro de exploracin por lser (LSC) produce dalos que s
on comparables a los datos de la citomelra de flujo: sin embargo, debido a que la
mquina se basa en cortes, hay algunas diferencias clave. A diferencia de la cito
melra de flujo, en la que toda la informacin de cada clula se encuentra en un solo
pulso electrnico para cada parmetro, la LSC emplea cientos de mediciones para calc
ular y extraer los parmetros para cada clula. Tambin es posible obtener parmetros de
rivados. El valor celular es la cantidad total de fluorescencia por clula, pero l
os parmetros derivados, como el rea celular y el valor pico, son tambin importantes
. La figura muestra los datos de una preparacin con cytospin de clulas HL-60 que f
ueron marcadas con yoduro de propidio (Pl). Se muestra el histograma de un solo
parmetro del valor rojo, as c o m o las tres posibles combinaciones de los parmetro
s rojos derivados. De particular inters es la agrupacin de clulas localizada debajo
de la letra c. La muestra tue teida con hematoxilina y eosina. y las clulas de la
s reas m a r c a d a s (videsupca) fueron trasladadas. Se muestran las lotos digi
tales de las primeras 20 clulas trasladadas a cada regin. Las clulas en la regin c e
stn en mitosis. mientras que las clulas en la regin d, b. y a se corresponden a clul
as a travs de las etapas G.a, G,b. y G;m del ciclo celular. (Cortesa de CompuCyte.
Cambridge, MA.)
Ms importante para los mdicos es la comprensin de la tecnologa, las fortalezas y las
debilidades en el control y garanta de la calidad, en la preparacin de la muestra
y en la interpretacin de los datos.
Hardware y otras herramientas Fuente luminosa y procesamiento de la seal
La citomelra de flujo actual rara vez se utiliza para realizar una clasificacin, y
esta propiedad persiste con los elementos de investigacin en los laboratorios al
tamente especializados. La citometra de flujo clnica emplea
ahora helio-nen o diodos lser y lser de ion de argn refrigerados por aire o un nico i
on de argn refrigerado por aire con emisin a 488 nm (Bogh. 1993). El lser actual ti
ene una salida de pocos milivatios, entre 10 y 20 mW, y dura ms de 6.000 horas. E
sos lseres, comparados con los previos refrigerados por agua, son fciles de manten
er, no requieren precauciones especiales de seguridad y son ms baratos de sustitu
ir. Si un laboratorio est interesado en desarrollar cinco o ms colores de anlisis e
mpleando sondas de Hoescht estimuladas con radiacin ultravioleta, entonces es nec
esario emplear grandes lseres refrigerados por agua de 5 W combinados con los lser
es refrigerados por aire, aunque los nuevos instrumentos con nuevos lser estn elim
inando la necesidad de los lseres relrigerados por agua. La

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

861
mayora de los citmetros de lujo multifacticos clnicos utilizan un lser simple de ion
rgn refrigerado por aire con un minimo de cuatro tubos lotomultplicadores. Las con
figuraciones instrumentales ms Irecuentes incluyen el Becton-Dickmson FACScan que
est siendo reemplazado por el FACS-Calibur (tiene un mdulo de clasificacin con cap
acidades limitadas) y el FACS Vantage para ocho o ms parmetros y categonzacin de al
ta velocidad. El Coulter Protile II y el Odho Cytoron, instrumentos de laborator
io habituales, ya no se fabrican y han sido sustituidos sobre todo por el Coulte
r XLs o el FACSCalibur. Beckman Coulter contina con el Coulter XL y software mejo
rado para el tratamiento de datos. Adems, el ASTRA de Beckman Coulter aade a la ca
tegonzacin de alta velocidad, ocho parmetros adicionales para el laboratorio de in
vestigacin. La introduccin del XL como ltima tecnologa en citometra de flujo con el e
mpleo de seales de procesamiento de pulso digital (Coulter, 1994; Shapiro, 1995).
con convertidores de analoga digital de alta resolucin (ADCs). invalida el uso de
los amplificadores logartmicos (log amps). Este es un importante avance ya que e
limina cuestiones de alineacin y baja sensibilidad en los lmites bajos (umbral) en
la medicin de la intensidad de fluorescencia. En la citometria de flujo tradicio
nal, las mediciones de la fluorescencia se realizan en una escala lineal pero ti
enen que ser convertidas a logaritmos para que la escala sea razonable (para col
ocar todos los puntos de inters). Este proceso en los instrumentos no digitales s
e lleva a cabo con el empleo de ACD con amplificadores logartmicos. Desgraciadame
nte, esta conversin de la seal lineal por medio del ADC a los amplificadores logart
micos ocasiona un ruido que origina un aumento de los coeficientes de variacin de
procesamiento de la seal (CV) al aumentar la seal fluorescente Esto hace que cada
medicin tenga diferente sensibilidad ya que el CV de la seal de conversin aumenta
con un mayor nmero de canales (Shapiro. 1995a). Aunque muchos tcnicos que utilizan
una citometria de flujo clnica realmente no entienden la causa de la sensibilida
d variable de los amplificadores logartmicos en sus instrumentos, se enfrentan a
los resultados o a la falta de respuesta en ciertas regiones de su escala logartm
ica. La linealidad es particularmente importante en la medicin del contenido del
ADN (como las mediciones del ADN se hacen en una escala lineal, los problemas de
la amplificacin logartmica se eliminan pero entran en juego otros factores electrn
icos similares) ya que el valor DI depende de su exactitud. Ademas, la alineacin
se est haciendo cada vez ms importante en la medida cuantitativa de la fluorescenc
ia de la proliferacin y la activacin (Auer. 1994; Shapiro, 1995) as como est afectan
do al valor pronstico de los valores de la fase S en ciertos cnceres. El laborator
io debe realizar medidas de linearidad. sensibilidad y resolucin, y controles de
calidad antes de desarrollar trabajos clnicos. Los controles de calidad diarios s
e definen posteriormente en este captulo. Se remite de nuevo a los lectores a rev
isar referencias apropiadas para ampliar con detalle (Bauer. 1993: Shapiro, 1995
).
en estos sistemas para proporcionar seguridad y una mxima sensibilidad con el uso
de sistemas basados en lser de baja potencia iBogh. "993). Todos los trminos empl
eados en la definicin de estos sistemas son confusos, incluyendo la tasa del fluj
o, la cubierta de presin, el tamao de la parte central, la velocidad resultante de
la partcula, el CV resultante, etc El factor ms importante que ha de comprender u
n trabajador de laboratorio es que en el anlisis del ADN, las clulas son analizada
s con un flujo bajo para aumentar el tiempo que permanece la partcula en el haz,
lo que permite una mayor sensibilidad y un mejor CV. En la inmunotipificacin. la
sensibilidad no es un problema especial, y el flujo de la partcula puede aumentar
se. Muchos sistemas clnicos estn comprometidos en acomodar las dos aplicaciones ms
frecuentes: la inmunotipificacin y el anlisis del ADN (Shapiro, 1993, 1995a: Goetz

man. 1993). Los citmetros de flujo de investigacin tienen mucha mayor flexibilidad
y el operador puede controlar el flujo de la muestra, la presin diferencial y el
tiempo
Colores y ms colores: aplicaciones de los fluorocromos
Muchos laboratorios todava emplean los fluorocromos ms frecuentes, el isotiocianat
o de fluorescena (FITC: 530 nm de emisin) y el ficoeritrin (PE; 575 nm de emisin) e
n la medida del ADN (Shapiro. 1995b). El FITC y el PC se conjugan directamente p
or el anticuerpo de inters y simultneamente se aaden a la muestra del paciente. Ya
no se requiere del uso de un anticuerpo secundario como una IgG de carnero antir
ratn (GAM) marcada con fluorescena para tener una mayor sensibilidad, y por lo tan
to se minimiza la fluorescencia de fondo. Muchos de los anticuerpos utilizados e
n la clnica en el estudio del VIH son premezclados y prediluidos para su empleo c
on sangre completa. El Pl puede utilizarse simultneamente con el anlisis de superf
icie realizado en el anlisis multiparamtrico del ADN, aunque esto requiere la cons
ervacin de la membrana celular (Clevenger, 1993). Existen ms tinciones disponibles
en el laboratorio clnico que permiten mediciones simultneas de cuatro colores con
anticuerpos monoclonales marcados directamente y excitados en un lser a 488 nm.
Esta disponibilidad est revolucionando el desarrollo actual de la citometria de f
lujo en la prctica de laboratorio Estas tinciones con una emisin roja o roja lejan
a incluyen el tndem PE Texas Red (625 nm de emisin), el tndem PE-Cy-5 (675 nm de em
isin) y la alolicocianina (675 nm de emisin), por nombrar unos pocos (Fig. 36-4).
Los primeros tndem eran problemticos ya que el exceso de PE libre en la solucin con
duca a un exceso de fluorescencia de fondo. Estn surgiendo nuevas tecnologas para l
a sntesis de estas tinciones, resolviendo muchos de los problemas tcnicos, y const
antemente se estn aadiendo nuevas tinciones para el empleo en el laboratorio clnico
(Clevenger. 1993). Con la disponibilidad de las tinciones rojas y rojas lejanas
, se puede desarrollar un anlisis de la poblacin de VIH en un nico tubo con gran se
guridad. Un tubo con 100 pL de sangre completa se lie simultneamente con CD45, PECy-5. CD3 PE-Texas Red. CD8 FITC y CD4 PE. Con el nuevo procesamiento de seal dig
italizado. la compensacin (wde inlral se lleva a cabo fcilmente, y se realiza el a
nlisis empleando el CD45 c o m o un agente iniciador mediante dispersin lateral (S
SC) y el anlisis simultneo de CD3. CD4 y el CD8 (Fig. 36-5). Otro fenmeno interesan
te es que estas nuevas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia c o
m o un iniciador en lugar de los parmetros habituales de dispersin de luz. Esto e
s posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes de la
mayora de las clulas o no tienen competicin autofluoresceme en estado natural como
se encuentra con el FITC. Adems, pueden excitarse a una longitud de onda que min
imiza la autofluorescencia de los constituyentes celulares como la riboflavina.
Por tanto, cuando ocurre un suceso raro (presencia celular <0.1% de la poblacin t
otal) empleando un iniciador fluorescente, se pueden analizar muchas clulas rpidam
ente Este mtodo tambin se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utiliz
ando fluoresceina como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el ncleo o el
citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. Los mtodos de evaluacin d
e sucesos raros son cada vez ms frecuentes y ms fiables para el laboratorio clnico.
Se han realizado y evaluado algunas investigaciones. En la evaluacin de la enfer
medad residual mnima (MRD) incluyen la PCR. la citometria de flujo combinada con
sondas nucleares, la citometria de flujo
Flujo celular
En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, pero como la mayo
ra de los instrumentos clnicos se utilizan en la medicin de las clulas CD4 en la mon
itonzacin de la enfermedad por VIH, la mayora de los sistemas clnicos utilizan un s
istema cerrado como precaucin de riesgo biolgico. El primero, conocido como un flu
jo celular de corriente en aire o de flujo en aire, permite que el punto de medi
da ptico se encuentre directamente sobre la corriente de muestra. Este tipo de fl
ujo celular minimiza la distancia entre la cmara de flujo y la punta del inyector
de la muestra y por lo tanto minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de
lavado de muestra necesario entre las mismas. Esta cmara permite una mayor varia
bilidad del grado de flujo de la muestra que en un sistema cerrado (Shapiro. 199

3: Bogh. 1993). Otras ventajas de las puntas en la corriente en aire son importa
ntes en la clasificacin celular y no se consideran aqu. En el sistema cerrado, a m
enudo referido como punta de cuarzo o clula de flujo, el punto focal est dentro de
la cmara. Las desventajas de estos sistemas de cuarzo son la fineza del cuarzo y
por ello la difraccin del haz del lser o la dispersin de la seal. Adicionalmente. l
a seccin cuadrada tan relativamente amplia (200/ pm) hace que sea ms difcil control
ar el flujo. El xito de estas clulas de flujo de cuarzo en el sistema clnico depend
e de la iluminacin y de las pticas de recogida. Los fabricantes conocidos han avan
zado mucho

862
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
Figura 36-4. Sondas fluorescentes frecuentes empleadas en la citometra de flujo m
ulticolor multiparamtrica (De Shapiro HM: Practical Flow Cytometry. 3- ed. Nueva
Cork, Wiley-Liss, 1995. pg. 245. Copyright Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permis
o de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)
con la utilizacin de mltiples marcadores que delinen el fenotipo leucmico y varias
aplicaciones del FISH. Los datos sugieren que la remisin real de la mdula sea en la
leucemia mieloide nunca ocurre realmente como se ha demostrado en el anlisis de
citometra de flujo; simplemente es un tema de nivel de sensibilidad y de deteccin
del suceso (Campana. 1995.1999). Esto
obviamente tiene grandes implicaciones cuando se correlacionan los resultados de
la citometra de flujo frente a los criterios morfolgicos de remisin y prediccin de
recidivas. Sigue evalundose cmo afectar esto a las estrategias de tratamiento en va
rias enfermedades hematolgicas malignas. Adems, el empleo de la PCR con transcript
asa inversa (RT-PCR) es ms habi-

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

863
tual. La deteccin de las seales de RT-PCR en pacientes que se encuentran en remisin
clnica todava no est clara, mientras que la deteccin del MRD por amplificacin de la
PCR de los genes del receptor antignico se ha correlacionado consistentemente con
los resultados del tratamiento (Campana, 1999). El empleo de fluorescencia mult
icolor ha permitido que el concepto del anlisis mulliparamtrico llegue a ser una r
ealidad en muchos laboratorios. Los parmetros pueden evaluar 1) diferentes poblac
iones funcionales de una poblacin celular particular empleando unas sondas fluore
scentes mtracelulares; 2) el empleo de muchos colores para identificar pequeos gr
upos de
otros sucesos no identificables de otra forma (como en el MRD): (3) el estatus d
e activacin celular en una etapa particular de la enfermedad (p. ej., el empleo d
el HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estadificacin del VIH empleando un ab
ordaje en ancla): (4) asi como observar la expresin de la superficie celular y el
DI o fase S de una poblacin particular de clulas al igual que definir la fase S C
D19 en la leucemia aguda. Obviamente, las posibles combinaciones son casi infini
tas y su sofisticacin est aumentada por la disponibilidad de marcadores especficos
y sondas de ADNARN (Fig. 36-6). A continuacin se expone un anlisis sobre algunas d
e esas investigaciones y tcnicas.
4 C O L O R (1)45/4/3/8
Figura 36-5. A. Empleo de la atometra de flujo de cuatro colores en el desarrollo
del panel de m o n i tonzacin del VIH. El mtodo d e m u e s t r a el e m p l e o
del CD45 c o m o estrategia de c o m i e n z o y el empleo del CD45 y la dispers
in de luz en el desarrollo de una diferenciacin en tres partes (H-6). El empleo de
la citometria de flujo de cuatro colores permite que las poblaciones de clulas T
sean medidas en el m i s m o tubo y que todas las clulas sean contadas. El histo
grama 7 se incorpora en la regin F contenida en el histograma 1 (FALX frente a SS
C). En el histograma 1. el e m p l e o de l a regin Q define los desechos. Si est
os son m a y o r e s del 1 5 % del total de sucesos, n o r m a l m e n t e se t
o m ac o m o una muestra inaceptable. Esta investigacin permite analizar t o d o
s los parmetros y c o m p a r a r l o s entre si. (Los anticuerpos monoclonales d
irectamente conjugados fueron de clones Coulter o ( S e c t o r Dickinson para e
l FTIC PE. Coulter para el ECD y de Callag Corporation para el Cy-5-CD45.) La il
ustracin contina en pgina siguiente

864
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Figura 36-5. Continuacin. B. panel de monilorizacin del VIH c o m o en A, excepto
que en este caso los paneles incorporan el empleo de un parmetro de recuperacin li
ntoctico calculado con FALS trente a SSC y CD45 y Irente a SSC. Adicionalmente, e
n H:2 se demuestra el empleo de una entrada-T. Estas estrategias de recepcin perm
iten calcular y comparar mltiples valores del CD3 trente a otros.
ID Pcnt 11 1.7 12 71.2 13 1.4 14 25.6

Figura 36-6. El empleo de la citometra de flujo multiparamtrica permite la deteccin

simultnea d eu n a superficie fluorescente (CD20 positiva) y por lo tanto la def
inicin de la linea celular y despus la posibilidad simultnea de medir la intensidad
de yoduro de propidio y as la medicin del contenido total de ADN. para identifica
r las clulas leucmicas especficas marcadas c o m o CD20. Esta tcnica evita la necesi
dad de aislar la poblacin de inters antes de la tincin del ADN y puede hacerse simu
ltneamente c o n la tincin de la mdula sea para la evaluacin leucmica. Otras poblacio
es, c o m o las citoqueratinas y otros m a r c a d o r e s de estirpe celular, p
ueden ser identificadas en t u b o s adicionales. La muestra de mdula sea fue teida
con CD20 FITC (Coulter, Miami, FL) y despus fijada empleando metanol, permeabili
zada usando Tritn X al 0.1%, y teida con solucin d e yoduro de propidio (Pl) y ARNa
sa estndar. L o s linfocitos d e sangre perifrica fueron utilizados c o m o contro
l normal no ciclico (no se m u e s t r a n los dalos).

CAPITULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

865
RECEPCIN Y ANLISIS Inmunofenotipificacion: aplicacin a las muestras habituales y le
ucmicas
El anlisis de las poblaciones celulares con la citometra de flujo emplea una combi
nacin de parmetros que. cuando se aplican, definen una poblacin especifica de clulas
. La citometria de flujo emplea parmetros similares a aquellos que se han emplead
o durante muchos aos en hematologa, incluyendo el tamao (por dispersin de luz hacia
delante), la granulacin citoplasmtica (dispersin lateral), las afinidades por marca
dores especficos y otros, y las combina con las herramientas inmunolgicas ya menci
onadas. Estas incluyen mltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o s
ondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien Pl o 4'6-diamidin-2fenolindol
(DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la deteccin simultnea de estos p
armetros por los sistemas analticos actuales. Durante muchos aos, la citometria de
flujo del laboratorio clnico slo poda emplear tres mediciones simultneas incluyendo
la dispersin de luz hacia adelante (FALS) frente al SSC, frente al FTIC o al PE.
La tincin de las poblaciones celulares estaba limitada por la no disponibilidad d
e anticuerpos monoclonales conjugados directamente, necesitndose la utilizacin de
un reactante GAM secundario o el empleo de anticuerpos marcados con botina. La de
finicin de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran tondo hizo nec
esario el uso de un algoritmo de resta canal por canal para diferenciar lo posit
ivo de lo negativo (Bagwell. 1993). En los casos en los que la poblacin celular t
iene un lmite definido entre negativo y positivo, se colocaba un cursor de modo q
ue no ms del 2% de los acontecimientos considerados como negativos cayeran a la d
erecha del cursor, diferenciando los acontecimientos positivos empleando un cont
rol isotpico emparejado. Aunque esta investigacin pareca razonable en aquel momento
(Lewis, 1993) y funcion bien con grupos celulares brillantes, se ha hecho bastan
te incmoda a la hora de identificar clulas leucmicas o de desarrollar anlisis de mar
cadores de activacin celular. Las clulas leucmicas eran particularmente problemticas
, porque cada leucemia tiene su propia intensidad fluorescente "relativa" y los
controles isotpicos pueden tener poca relevancia. La aplicacin de reglas estrictas
y rpidas a los cursores de posicin conduca a una infraestimacin de los grupos posit
ivos. El fallo de esta lorma de actuacin se hace especialmente dramtico en el anlis
is de la monoclonalidad de la expresin de cadenas ligeras K y A. A menudo se perda
n diferencias pequeas pero significativas. Se ha cuestionado en muchos casos el e
mpleo de isotipos de control en ciertas situaciones, tanto por las aberraciones
tcnicas asociadas con su utilizacin como por los costes aadidos al laboratorio. Los
nuevos algoritmos de software tienen la capacidad de realizar mediciones de int
ensidad y de definicin de grupos basndose en los significados de las intensidades
de las poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas asi como
la cuantilicacin del MESF real [vide intra). Claramente, ha de considerarse la n
ecesidad de recordar lo que estamos midiendo y comprender la biologa de la poblac
in de inters cuando se disea un protocolo de anlisis. Afortunadamente, algunos softw
are sofisticados y los mejores reactantes nos han permitido utilizar entradas mu
ltiparamtncas para identificar las poblaciones, antes que intentar hacer estimaci
ones de la expresin fluorescente empleando valores cursor. Muchos investigadores
han empleado la investigacin mulliparamtrica para definir grupos u otras poblacion
es de inters (Shapiro, 1995c; Loken, 1987; Terstapen, 1988,1990; Verwer, 1993; Po
rter, 1999). Estas investigaciones tienen muchas formas, y algunas de ellas se r
evisan aqu. Con la llegada de la florescencia multicolor surgi la necesidad de ana
lizar el nmero de clulas que expresaban uno o ms colores al mismo tiempo en una pob
lacin celular particular identificada por las regiones FALS y SSC. Cuando se desa
rroll este mtodo por primera vez. los cientficos estaban pensando bsicamente en clcul
os matemticos y recuento de todas las clulas y en el nmero de estas clulas que expre

saban uno o ms colores. Se desarroll una investigacin binaria para este anlisis, con
ocida como prisma (Coulter. Hialeah, FL). Las regiones de anlisis tenan una entrad
a difcil y fueron introducidas en el instrumento por el operador. Estas regiones
no se podan redefnir posteriormente utilizando listas de anlisis de modos,

provocando una frustracin importante. La tcnica fue modificada con posterioridad p

ara permitir ms recepciones, y otros fabricantes con el software realizaron esta
aproximacin binaria con base postanallica Loken entonces identific las poblaciones
de la mdula sea empleando el CD45 frente al SSC. una investigacin nica para identifi
car las poblaciones heterogneas presentes en la mdula sea (Fig. 36-7). Estos y otro
s iBorowitz. 1992) desarrollaron el concepto de patrones que identifican estados
leucmicos especficos. Shapiro emple una va de estimulacin para definir la evolucin d
este concepto (Shapiro, 1995c). Despus Loken promocion el empleo del anlisis de en
trada dual-paramtrico con CD45 y CD14 en la regin linloci tica del FALS frente al
SSC en sangre perifrica (Loken, 1990). Muchas agencias aceptaron y promovieron es
ta investigacin en la mayoria de los paneles de citometria de flujo para el VIH p
ara minimizar el efecto de los monocitos contaminantes en la poblacin Imfoctica ya
que podran interferir con el recuento real de linfocitos CD4. porque los monocit
os tienen receptores CD4 en su superficie (Passlick. 1989). Las agencias que ini
ciaron este tipo de anlisis incluan los Centros para el Control y Prevencin de Enfe
rmedades (CDC. 1992), el Instituto Nacional de Enfermedades Alrgicas e Infecciosa
s, la Divisin de SIDA (NIH, DAIDS) (Calvelli, 1993). el Estado de Nueva Cork, el
Comit Nacional para la Estandarizacin del Laboratorio Clnico (NCCLS. 1992) y el CAP
(1990-2000). Desgraciadamente, aunque esta investigacin solucion muchos problemas
, no asegura que cada tubo en el panel tenga los mismos contenidos que el tubo q
ue contiene el CD45 y el CD14, y la correccin purificada corregida puede ser sobr
eestimada, conduciendo a valores incorrectos del CD4 Estos temas fueron revisado
s durante una conferencia convocada por el CDC. un ao despus de que se publicaran
las lneas para el desarrollo del recuento del CD4 en el VIH (Steizer. 1993; CDC.
1993). Otros anlisis de esta investigacin se han desarrollado por el ACTG Flow Adv
isory Comittee en el programa DAIDS Proficiency CD4.CD8 iCDC. 1 9 9 3 ; Kagan, 1
993) y por el CAP en su programa de anlisis de competencia (Homberger, 1993). Una
nueva investigacin de recepcin fue evaluada en los paneles del VIH que siguieron
a la investigacin original de Loken para identificar los grupos de la mdula sea (Lo
ken. 1990). El empleo del CD45 como parmetro de entrada ha simplificado el anlisis
de la mdula sea, las leucemias y los paneles de VIH. En las revisiones de mdula sea
y leucemia, el CD45 normalmente se establece como un tercer o cuarto color y se
empareja con la dispersin luminosa anterior o la dispersin lateral; esto permite
la identificacin de una pobla cin potencial de blastos (malignos) La poblacin de bl
astos entonces se identifica empleando un panel de monoclonales utilizando los t
res parmetros de color disponibles (Fig. 36-7). En el VIH. el mtodo de CD45 en tub
o, con cuatro colores, permite la identificacin de una regin grande de linfocitos
iniciados, que son introducidos secundariamente para el CD45. Esto tambin puede h
acerse sin la utilizacin de los parmetros de dispersin luminosa, como se describi pr
eviamente (tambin puede hacerse empleando un panel de dos tubos, tres colores). R
ecientemente, nuevos productos (Becton-Dickinson y Beckman Coulter) aaden gotas p
recontadas ai tubo de contenido monoclonal y esto permite el recuento absoluto d
e irfo citos (conocido como flujo diferencial) para realizarse al mismo tiempo q
ue la fenotipificacin. Esto elimina la necesidad de realizar un recuento hematolo
ga) cuando se desarrollan las enumeraciones de clula T y elimina los problemas del
deterioro de los glbulos blancos al empaquetarse y permite un diferencial exacto
para obtener el nmero de clulas T exacto. Estos mtodos estn siendo incorporados en
los ensayos ACTG VIH y en oros laboratorios. Otra estrategia de recepcin es el em
pleo de dos o tres identilicadores de una poblacin particular de inters. Esta inve
stigacin, frecuentemente conocida como puerta de entrada (anchor gating), utiliza
las propiedades particulares de algunas clulas para investigar otro tipo de parme
tros. Cuando se aplican especficamente a linfocitos T, se considera como una puer
ta-T (Mandy. 1992). El empleo de una puerta de entrada (Paxton, 1995) es de espe
cial utilidad cuando se buscan los marcadores de actividad, como en las poblacio
nes de VIH CD3 CD8 que expresan CD38 y HLA-DR o para buscar la expresin de CD45Ra

y CD45Ro frente a CD3CD4 o CD3CD8. La ventaja de este mtodo es que es intuitivo

y que cada color acta como un control de calidad para la otra poblacin (Fig. 36-8)
. Adems, tenemos la posibilidad de identificar la expresin de marcadores biolgicame
nte relevantes en relacin

S66
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
3: P
4:
k ENTRADA Bl STIC A
ENTRADA DF. MEDULA OSEA 45 (1)34 C"D33 (1)45
Figura 36-7. Mdula sea utilizando entrada de CD45 frente a la tradicional entrada
de imagen luminosa: (paneles H1-H3): H1: FALS frente a SSC. H2: entrada linftica.
FTIC frente a PE, identificando la poblacin de blastos CD34/CD33 doble positiva
(61,1% de todos los linfocitos se identifican c o m o blastos). H3: Entrada tota
l. CD34/CD33 doble positivo (43,6% del total de acontecimientos identificados c
o m o blastos). H4: Blastos identificados por el CD45 frente al FALS son iguales
a 46,5% (letra regin k). con un 74,8% CD34/CD33 doble positivo. Paneles H5, H6,
H7: Dispersin lateral identificada p o r marcador fluorescente de inters (PE-CD33,
FITC-CD34. Cy-5 [tricolor] CD45). (Los anticuerpos monoclonales conjugados dire
ctamente fueron obtenidos tanto de Coulter c o m o de Becton-Dickmson para los c
lones FITC- y PE marcados. Coulter para los clones ECD marcados y Caltag Crp. [S
. San Francisco, CA] para los clones Cy-5 marcados.)
con las poblaciones funcional o biolgicamente relevantes. Esta evaluacin es buena
por si misma para cuantificar la fluorescencia (vanse histogramas 2 y 3. respecti
vamente). Aunque el concepto de fluorescencia cuantitativa no es nuevo, s lo son
las tcnicas para medir los equivalentes de fluorescencia o los umbrales de fluore
scencia u otros similares. Las mediciones cuantitativas de la fluorescencia se d
escribirn tras el anlisis y entrada del ADN. Otra investigacin para la puerta de en
trada se encuentra en la recogida de CD34, que emplea el CD34 y el CD45 teidos co
n o sin ADD como una evaluacin de viabilidad en la identificacin y enumeracin de lo
s progenitores celulares CD34. Estos mtodos tambin utilizan gotas para enumerar el
nmero de clulas recubiertas. Estos mtodos tienen gran utilidad en los protocolos d
e trasplante de mdula sea en los que los progenitores celulares se extraen de la s
angre del cordn, de la mdula sea o de sangre perifrica y, posteriormente, se reinfun
den (p. ej., The Internacional Society for Hematolherapy and Graft Engineering [
ISHAGE] (Fig. 36-9). Esta investigacin se ha convertido en el patrn para muchos la
boratorios que realizan trasplantes. La Figura 36-9 delinea dos mtodos estndar, el
ISHAGE y el protocolo Miln para desarrollar la enumeracin de CD34. Un sistema comercial llamado ProCount (Becton-Dickins
on) utiliza una investigacin similar y reactivos para automatizar el proceso. Adi
cionalmente. se ha diseado un mtodo capilar llamado ensayo Steller, un procedimien
to sin lisado ni lavado para el IMAGN 2000 (BectonDickinson).
Anlisis del ADN Generalidades
Conceptualmente, la realizacin del anlisis del ADN debera ser ms simple que el anlisi
s de inmunotipificacin, pero la revisin de los datos publicados y sus capacidades
pronosticas asi como los progresos por los laboratorios sobre las pruebas de com
petencia indican otra cosa (Nicholson, 1993; Coon, 1994; Trinidelli Danesi, 1997
). Se convoc una conferencia de consenso de ADN y los resultados se publicaron en
Cytometry (Shankey. 1993). Esta publicacin fue una revisin histrica de los princip
ales tipos de

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

867
tumores (en muestras en fresco, congeladas y en parafina) y del valor clnico de l
a medida de la ploidia por DI y el valor de la fase S. Estos parmetros fueron ana
lizados en trminos de efectividad como marcadores pronsticos. L a conferencia CAP
#26 de 1994 se bas en los marcadores previos y en marcadores indirectos de alguno
s tumores potenciales adicionales. En cada caso, el DI y la fase E fueron menos
predecibles como marcadores pronsticos de lo que se esperaba. Esto fue atribuido
a la variabilidad en la realizacin tcnica y al anlisis de estos ensayos (tanto en l
a preparacin de instrumentos c o m o de muestras) y en el riesgo inherente de la
heterogeneidad tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor. Se realiz
aron recomendaciones especficas en cada tipo de tumor para las medidas apropiadas
de control de calidad que deben realizarse y de la ausencia de involucin apropiad
a de los histogramas.
Preparacin de la muestra
Los mtodos de preparacin del ADN son razonablemente simples y baratos de realizar.
Existen muchas referencias para los mtodos originales, asi
como muchas modificaciones. Los mtodos ms frecuentes, desarrollados por Krishan. V
mdelov, Crissman. Steinkamp y otros (Rabinovitch, 1993; Vindelov, 1994), son aqu
ellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aquellos que utilizan bloques
de parafina con preparaciones de Hedley (1983). En cada caso, ya estn las clulas e
nucleadas o conservada la membrana celular, el marcador Pl de ADN es el que ms fr
ecuentemente se utiliza en la mayora de los laboratorios clnicos y ya se ha descri
to. La tincin Pl es directa a condicin de que se sigan el tiempo, la saturacin y lo
s parmetros de extraccin del ARN Las medidas de las alteraciones macroscpicas del c
ariolipo se realizan comparando el pico (intensidad fluorescente, captacin de Pl)
del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta medicin i
ncluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor, el ndice GyG,
o la linealidad del instrumento, linealidad medida por el paquete de software d
e deconvolucion (Bagwell. 2000) y el porcentaje del tumor presente (muestreado)
en la muestra. Es frecuente ver que los laboratorios publican el resultado de un
tumor diploide en una muestra que "no" contiene tumor. Los tumores con valores
casi diploides necesitan reglas de interpretacin estrictas, como la definicin de t
etraploidia. Surgen ms proFigura 36-8, La citometra de flujo con cuatro colores para realizar estudios func
ionales permite el estudio recproco de poblaciones celulares, c o m o sucede con
el estudio CD45Ro (definido c o m o memoria) y el CD45Ra (definido funcionalment
e c o m o nave) en un determinado subgrupo d e clulas T. Esta figura demuestra la
definicin de un ancla (Patxon. 1994) de CD3CD4 (regin E) evaluada en los histogra
mas 5. 6 y 7 para la expresin de RARO. Los histogramas 2. 3 y 8 determinan RARO y
las clulas no CD4. Esto se puede utilizar c o m o una determinacin comparativa de
los CD3 CD4 sin necesidad de un segundo tubo. La fluorescencia en cinco colores
debera permitir el uso simultneo de CD8. que debera medirse y compararse con los C
D4. Obsrvese la ausencia clara de tincin no especfica actualmente disponible utiliz
ando directamente clones conjugados. El procesamiento digital pulsado permite la
cuantificacin directa de estos marcadores en equivalentes de fluoresceina y la c
omparacin de un punto y otro en el tiempo en un estudio longitudinal mediante his
togramas simples con parmetros, c o m o es el caso de los histogramas 2, 3, 6 y 7
. (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a travs de CD45Ra y CD45R
o s e obtuvieron de Coulter y Becton-Dickinson. Todos los ensayos se realizaron
utilizando los mtodos de lisado de sangre completa estndares).

868
C8228950.02
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
C8228950.02
C8228950.02
Figura 36-9. Protocolos ISHAGE/Miln para la enumeracin del CD34. Arriba, la enumer
acin de las clulas CD34+ en sangre del cordn por anlisis de citometria de flujo util
izando el protocolo ISHACGE (filas de arriba y del medio) o el protocolo Miln (fi
la de abajo). Se define la estrategia de entrada para el ISHAGE. La estrategia u
tiliza la entrada secuencial para excluir los acontecimientos no CD34+ en la reg
in celular dim CD45 y para excluir las clulas muertas empleando 7AAD (no mostrado)
(fila superior). La fila del medio muestra el protocolo ISHAGE con un isotipo c
ontrol. El protocolo Miln utiliza un isotipo conlrol (diagrama de puntos del cent
ro, abajo) para establecer los cuadrantes, el inferior derecho se usa para exclu
ir los sucesos putativos C034+. (De Sutherland DR Anderson L, K e e n e y M, y c
ois: The I S H A G E guidelmes lor CD34+ cell determination by flow cytometry. J
H e m a t o t h e r 1996; 3:213, con permiso.)
blemas en la definicin de los agregados, dobletes, detritus, tratamiento de corte
s y restos de ncleo y la poblacin en fase S. La sigla, descriptiva y semicuantitat
iva, de BAD se utiliza en el paquete de software de anlisis para moldear los efec
tos de fondo, agregados y dobletes (Ravinovitch, 1993, 1994) (Figs. 36-10 y 36-1
1). El impacto de este parmetro en el anlisis es controvertido.
Las mediciones resultantes de la fase S y del DI utilizando un modo de anlisis pa
ramtrico simple (slo Pl) estn sujetas a estos algoritmos de deconvolucin. llevando a
una gran variabilidad entre los laboratorios (Coon, 1994). Los algoritmos de de
convolucin para el ADN se han estu diado de forma extensa (Coon. 1994: Rabinovilc
h. 1993. 1994. 1999: Wheeless, 1991: Shankey, 1993; Bagwell, 2000), pero muchos
modelos

CAPITULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE CELULAR

869
empleados para el anlisis necesitan un mayor estudio. El documento de consenso de
l ADN hizo recomendaciones especificas aplicables a ciertos tipos de tumores y s
ugiere que los laboratorios desarrollen anlisis en concordancia, pero incluso con
estas pautas existe un nivel de ambigedad en la interpretacin y rendimiento en el
laboratorio clinico. Estas ambigedades contribuyen a la discordancia de los resu
ltados en estudios comparativos asi como en las pruebas de competencia (Coon. 19
88, 1994; Wheeless. 1991). La dilicultad de llegar a un consenso hace que la int
erpretacin de los resultados sea ms difcil para los laboratorios nuevos y para ios
el nicos que estn intentando comparar los resultados de su laboratorio con la bib
liografa reciente en el tratamiento de sus pacientes Esto es especialmente cierto
en la clasificacin de los valores de la fase S. Las medidas de la (ase S estn suj
etas a los efectos de los restos y modelacin de los agregados como describieron R
abinovitch (1993. 1994. 1999), Bagwell ( 1 9 9 3 . 2000), Shankey (1993). Coon (
1988), Wheeless, (1991) y otros. El rea entre 2C y 4C est sujeta a interferencias
por artefactos. Adems, es de importancia clave que la decisin con respecto al modelo matemtico usado para un tumor determinado se mantenga constante y
que los datos del modo de lista se conserven sin cambios por si se necesitan ms
anlisis. Debido a la dificultad en el anlisis del histograma del ADN. algunos han
propuesto que las mediciones del ADN las realicen solo laboratorios expertos. La
actualizacin de la FDA no ha aclarado ningn mtodo y todava se considera como una pr
ueba en investigacin. Desgraciadamente, durante muchos aos la prctica clnica sugera o
tra cosa. Mltiples artculos proponen realizar las mediciones de ADN conjuntamente
debido al alto grado de variabilidad y de prdida de significado pronstico (ASCO. 1
996). Poste riormente. varios grupos han conseguido avances significativos para
resolver algunos de los temas en el anlisis (Rabinovitch. 1996) (Figs. 36-12 y 36
-13). Est en desarrollo un patrn o gua de la NCCLS para su emplee por los laborator
ios. En cualquier caso, deben hacerse estrictos controles de calidad para permit
ir mediciones significativas del ADN que puedan servir como marcadores pronsticos
y como medidas de la actuacin y prctica mdica.
Figura 36-10. Empleo de diferentes tcnicas de entrada para el anlisis del ADN A. P
ico tradicional frente a su integracin con la correspondiente excusin de dobletes.
El histograma de un parmetro (inserto) demuestra la intensidad lineal del yoduro
de propidio (Pl) demostrando un pico diploide (2N) y un pico aneuploide G -G c
o n el correspondiente G..M. B. Nuevo mtodo d e entrada (K.D. Bauer. c o m u n i
c a c i o n e s personales [1994]) utilizando el cociente del pico trente a la m
edicin integral y al FL3 (rea) Este mtodo est siendo evaluado para m a y o r consist
encia en la eva luacin d e los valores de la fase S C. Pico frente a integral dem
ostrando que el 66.8% de los acontecimientos s e encuentran en la puerta de la p
oblacin (pico frente a integral, puerta b).

870
4(H)
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
DIPLOID CVCLE
80818589.H83 FL3 HP's "A"
Figura 36-11. A y 8, El empleo de tcnicas con modelado informtico en dos tipos dif
erentes de muestras. En A. se demuestra una linea celular fijada. Esta preparacin
muestra pequeos restos y una buena recuperacin de la poblacin aneuploide. Ambas po
blaciones demuestran un buen CV. El valor de la fase S es constante para una lin
ea celular de la muestra. En B. se demuestra una seccin de una muestra en parafin
a con la presencia de restos y un pico casi diploide aneuploide. El CV es bueno,
y los restos son minimos. La muestra demuestra una fase S del 9%. (Cortesa de Mu
lticycle Software, Phoenix Flow System. San Diego. CA.)
Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los deri- un model
o esttico o un dibujo en el tiempo de todas las clulas analizadas. La integracin de
l rea para el nmero de clulas entre 2C y 4C en el histovados de la timidina, la bro
modesoxiuridina (BrdU). diversos abreviados, y grama del ADN no es capaz de dar
ninguna informacin respecto a las cluotros (Fig. 36-14) y naranja de acridina (ARN
) para mejorar la calidad de los las "detenidas" en S (las clulas en realidad det
ienen la sntesis de ADN) o modelos en la estimacin de las propiedades proliferativ
as y cinticas de un de medir el nmero de clulas normales infiltrantes que pueden es
tar tambin determinado tumor. Es importante recordar que las medidas de la prolif
eraproliferando. El valor de la fase S a menudo puede ser mayor que la capacicin
no son iguales que las medidas de la cuantificacin de la fase S, que son
c

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

871
Contenido de A D N / D A P 1 Figura 36-12. Representacin mulliparamtrica del conte
nido de ADN (escala vertical) Irente a la fluorescencia de la citoqueratina (esc
ala horizontal) que muestra una poblacin celular citoqueratina-positiva con menos
de 2N de contenido de A D N El estroma celular citoqueratina negativo se emplea
para establecer la referencia 2N. permitiendo esto la identificacin de las clulas
hipodiploides. El histog r a m a sin entrada convencional en el panel inferior
demuestra la imposibilidad de asignar un contenido de ADN a la poblacin celular m
ixta del t u m o r y de clulas estromales (Glogovac, 1999).
sito de este captulo desarrollar este tema. Aunque se estn realizando muchos estud
ios, las mediciones de la apoptosis todava no son parte de la rutina del laborato
rio clnico. Como se mencion anteriormente, el anlisis de laboratorio del ADN se ha
controlado mucho, y en algunas regiones, estos esludios ya no se reembolsan. Muc
hos investigadores de este campo han votado por la exclusin sistemtica de esta pru
eba del laboratorio, aunque tiene cierta utilidad en ciertos tumores. Bagwell y
otros, estn estudiando retrospectivamente la reevaluacin de un grupo de casos de cn
cer de mama para tratar de desarrollar un modelo pronstico unificado para los pac
ientes con cncer de m a m a con ganglios negativos En el anlisis se incluyen un to
tal de 350 histogramas de ADN unvariantes de tres centros de cncer de Suecia (Bagw
ell, 2000). El estudio est tratando de identificar y corregir los factores que pu
eden haber disminuido la utilidad de la fraccin de la fase S como describieron la
s recomendaciones de la Sociedad Americana de Oncologa Clnica (ASCO), para desarro
llar un modelo pronstico para el cncer de mama ganglio-negativo, para identificar
posibles avances en los mtodos de la citometra de lujo y para demostrar la utilidad
de estas tcnicas. Otro estudio de Rabinovitch (comunicacin personal. 2000) y col.
se ha publicado recientemente sobre 630 muestras de tumores de mama fijadas con
formol de mujeres menores de 45 aos empleando un anlisis bivariante de citoquerat
ina'ADN (Figs. 36-12 y 36-13). Este anlisis se desarroll para aumentar la capacida
d de detectar poolaciones tumorales mezcladas donde los ndices de supervivencia p
ueden disminuir y sus tumores hipodiploides o tetraploides pueden haberse perdid
o en el anlisis convencional del ADN. Se espera que estos estudios y otros hagan
resurgir lo que puede ser una herramienta pronostica y diagnstica til que previame
nte quiz fue infravalorada por su complejidad.
Citometra de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia
La definicin de los tipos celulares en trminos mmunolgicos c o m o las clulas efecto
ras implica la propiedad de estas clulas de regular, y a sea aumentado o disminuy
endo, las funciones moleculares especificas a travs de receptores de superficie.
Conocidas como fenotipos inmunolgicos (Poncelet, 1993). estas clulas necesitan otr
as propiedades mediles para definir sus papeles biolgicos en la maduracin y en los
procesos de enfermedad. Uno de los fenmenos observados es la diferente expresin de
antgenos de superficie celular (CD) en trminos cuantitativos relativos y absoluto
s. Antes de la disponibilidad de las medidas absolutas, los trminos descriptivos
como brillante u oscuro, bimodal. y dems, eran utilizados en la bibliografa para d
escribir un fenmeno visual de diferentes densidades antignicas. Aunque descriptivo
s, estos trminos son dificiles de definir y de estandarizar entre los laboratorio
s y entre los pacientes. Tambin pueden perder precisin a la hora de definir un hec
ho y no pueden emplearse objetivamente para monitorizar el tratamiento de los pa
cientes o la definicin (tipo celular) mediante la medida de la expresin de CD y el
solapamiento de la expresin. La evidencia sugiere que las diferencias cuantitati
vas en la expresin antignica en la leucemia linfoctica crnica y en otras leucemias p
uede ser importante para determinar el pronstico (Poncelet. 1985). Estas medidas

tambin se emplean en la definicin del MRD y en la investigacin del efecto o activac

in viral en la enfermedad por VIH (Poncelet, 1991). El porcentaje de clulas especfi
cas presentes a menudo no aporta una imagen clnica real. Esto es particularmente
cierto en los casos de leucopenia y cuando la poblacin de blastos es un porcentaj
e relativamente pequeo del total de clulas presentes. La citometra de flujo cuantit
ativa (QFCM) se define como la cuantificacin de la intensidad fluorescente (Fl) d
eterminada por la capacidad de unin del anticuerpo de un anticuerpo conjugado con
un fluorocromo. y es una medida indirecta de la cantidad de antgeno celular de s
uperficie por cada clula individual (Stelzer. 1997). Los investigadores (Poncelet
. 1985, 1986; Schwartz, 1994; Vogt. 1991. 1994) han descrito el empleo de granos
de polieslireno o lneas celulares mezcladas con cantidades saturantes de anticue
rpo para determinar el nmero de absoluto de receptores o de determinantes amgameos
por clula, tambin denominados densidad antignica (Poncelet. 1993). Las unidades AB
C se definen como la medida de la capacidad retal/va de unin del anticuerpo.
dad proliferativa real debido a artefactos de la heterogeneidad tumoral. El hist
ograma de un parmetro proyecta resultados razonables cuando se trata de una pobla
cin celular asincrnica, relativamente homognea. El mareaje por pulsos se utiliza ms
frecuentemente en grandes entornos acadmicos y ms a menudo para medir la efectivid
ad de la irradiacin y quimioterapia obteniendo medidas reales de las clulas G,. G.
. as como de los compartimentos G + M. lo que no es posible empleando medidas par
amtricas simples de la fase S. Pueden utilizarse otras tcnicas con sondas nucleare
s y citoplasmticas asi como marcadores de superficie para separar la poblacin de i
nters de la mezcla de tipos celulares. Este tipo de anlisis multiparamtrico es muy t
il para medir la lase S en las neoplasias hematolgicas malignas (Fig. 36-6). Pued
e identificarse la poblacin especifica de blastos por el FITC fluorescente y por
el FALS. y estos hechos pueden analizarse por el contenido de ADN y de la lase S
empleando el Pl. Los mtodos de tincin estn alterados para conservar las propiedade
s de la superficie nuclear o las propiedades nucleares (Clevenger. 1993: Ramaeke
rs, 1993: Carothers, 1994; Bauer, 1994: Rabinovitch. 1996: Poder. 1999). Estos mt
odos normalmente incluyen la tincin del marcador de superficie de inters (p. ej..
KI-67. ciclina B1. citoqueratina. CD10) con el anticuerpo monoclonal. fijacin en
alcohol (o fijacin comercial y permeabilizacin reaclante) y tratamiento con un det
ergente para permitir la entrada de Pl u otro marcador nuclear. Los mtodos de tin
cin se modifican selectivamente para conservar las propiedades de membrana y ncleo
especificas de la sonda de inters (Bauer, 1994).
Esludios de inters del ADN
Se ha publicado mucho en la bibliografa sobre la apoptosis (a menudo definida com
o muerte celular programada) y su relevancia en los parmetros tradicionales del A
DN y en otras consideraciones fenotipicas. No es el prop-

Figura 36-13. A Diagramas de contorno bivariantes de clulas de t u m o r e s tija

dos en parafina analizadas con ADN (Pl) frente a tincin de citoqueratina (FITC).
Al Una poblacin aneuploide de CK+ de cncer de mama: A2, Un cncer de m a m a mullipl
oide con una poblacin hipodiploide y casi Iriploide aneuploide. Vase que el conten
ido diploide de ADN se identifica por la localizacin de la poblacin celular CK. A3
. Un ganglio linttico axilar con metstasis de adenocarcinoma de m a m a . La prese
ncia de la poblacin celular muy pequea ce clulas aneuploides (2%) es ambigua en los
datos no m e t i d o s (vase Fig. 36-128): sin embargo, en la presentacin bivaria
bte. las clulas CK+ aneuploides son clar a m e n t e evidentes. A4, Tincin con cit
oqueratina de clulas de t u m o r prosttco extradas de biopsias fijadas en parafina.
La exclusin de las clulas C K del estroma en el anlisis del ciclo celular del ADN
incluye la medicin del 2,6% a 3.9% de la fase S. 8, Histograma de ADN de un gangl
io axilar con metstasis de adenocarcinoma de m a m a mostrando un dato sin entrad
a (lnea gruesa y lnea de puntos mostrando 1 0 x en la escala vertical) y el dato d
e la citoqueratina del ADN introducido (lnea d e guiones) L a presencia de clulas
aneuploides e s ambigua en los datos no metidos: si se reconocen c o m o una pob
lacin aneuploide, representan solo el 2% de las clulas, concordando con la a b u n
d a n c i a histolgica de linfocitos. (De Glogovac JK, Pierce R. P a l a n c a B
JA. Rabinovitch PS: Cytokeratin Immunofluorescence in D N A analysis of paraffin
extracted cells. Clin Immunol. Newslett, 1996; 16:157-161. c o n permiso.)

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE C E L U L A R

873
Este mtodo no necesita igualar los ndices de fluoresceinaprotena (F P). ya que las
clulas y el modelo se han teido con el mismo anticuerpo. El empleo de mediciones d
e intensidad fluorescente debera proporcionar al usuario un medio para evitar est
a situacin. El empleo de lineas celulares o microgrnulos para construir una curva
de calibracin estndar sigue ciertos supuestos (modilicado de Poncelet. 1986): 1. L
os anticuerpos en condiciones de saturacin deben unirse a la super ticie celular
a travs de una interaccin monovalente. 2 El nmero de lugares antignicos por clula pue
de inferirse de la cantidad de anticuerpo unido. 3. La intensidad fluorescente p
uede determinarse utilizando una curva de calibracin con clulas de diferente expre
sin antgnica o con granulos recubiertos de diferentes cantidades de mmunoglobulinas de ratn a las conce
ntraciones de saturacin del anticuerpo. Estas medidas estn sujetas a la variacin de
la capacidad de unin de los anticuerpos monoclonales especficos con la inmunoglob
ulina de ratn, asi como a las interacciones del poliestireno con los clones especf
icos. Puede que estas medidas no se puedan transferir de un laboratorio a otro y
pueden no ser las mismas para los diferentes monoclonales fabricados de la mism
a especificidad (Schwartz. 1994: Paxlon. 1995). 4. Se puede utilizar la intensid
ad de fluorescencia media del canal de estas partculas, determinada por citometra
de flujo, para estimar la molcula del fluorocromo soluble equivalente (MESF) de u
na determinada clula.
Figura 36-14. Este histograma demuestra el empleo del anlisis multiparamtrico del
ADN empleando BrdU c o m o sonda nuclear. Fue realizado empleando una lnea celula
r CEM de crecimiento exponencial que fue marcada con BrdU y despus con un anticue
rpo FITC anti-BrdU y teida para el contenido de ADN con yoouro de propidio (Pl).
L a figura de abajo demuestra un control negativo (linea celular no ciclada o li
nlocitos de sangre perifrica |PBL|) utilizados para validar la uncin con BrdU. Los
controles negativos son obligados para el xito de la interpretacin de estos anlisi
s Estos estudios proporcionan una mejor comprensin de las clulas que estn en el cic
lo y en qu fase del ciclo celular estn.

874
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
5. Estas medidas, si se llevan a cabo de torma indirecta utilizando una fuente c
onstante de inmunoglobulinas antirratones de cabra (GAM). son independientes de
las subclases de anticuerpo empleado para detmir el antigeno. 6. Estas determina
ciones pueden realizarse empleando monoclonales conjugados directamente a satura
cin utilizando patrones de granulos apropiados. Debe tenerse ms cuidado para evita
r problemas espaciales relativos al tamao de la molcula de tluorocromo y los ndices
de fluorescena'protena. Se puede obtener ms informacin recurriendo al documento con
sensuado de 1997 de U.S.-Canad que revisa los parmetros necesarios para la estanda
rizacin (Stelzer. 1997). Aunque precoces en su desarrollo, los fenotipos cuantita
tivos nos ayudarn a definir programas de software de anlisis de grupos para la cua
ntificacin e identificacin celular estableciendo la intensidad fluorescente media
de los canales como medida de separacin de clulas con diferentes fenotipos tuncion
ales.
CONTROL DE CALIDAD Y GARANTA DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR
En este captulo, se han tratado de resaltar las reas donde los mdicos asi como los
laboratorios deben prestar particular atencin a los mtodos utilizados y a las inte
rpretaciones realizadas en la evaluacin de la respuesta celular. La garanta de la
calidad y el control de calidad de los parmetros no estn bien definidos en esta rea
del laboratorio, y existen pocos estndares absolutos cuando se compara con los a
nlisis qumicos o las determinaciones de anticuerpos humorales. El xito del laborato
rio celular reside en su aproximacin al problema y en la evaluacin longitudinal de
la condicin que va a ser diagnosticada. Se seal claramente que los estudios de bas
e necesitan repetirse si la evaluacin original se lleva a cabo en un momento de e
strs inmunolgico. Los parmetros bsicos de las variaciones diurnas en las poblaciones
de linfocitos son obvios pero a menudo se olvidan o se pasan por alto. Malone (
1990) concluy que la variabilidad en las medidas del CD4 de los recuentos absolut
os se debe en un 50% a la biologa y en otro 50% se debe a otros problemas tcnicos.
Los factores que afectan la evaluacin longitudinal de las cantidades absolutas d
e CD4 en un ensayo clnico han sido revisadas por Fei (1993). Adems. Fahey (1990) r
evis el valor pronstico tanto humoral como celular de los anlisis en VIH. En otros
ensayos clnicos celulares, la variabilidad es inherente al ensayo debido a la fal
ta de formatos y mtodos estandarizados asi como a los reactivos. Adems, la calibra
cin de los instrumentos y la sensibilidad no estn bien monitorizados. Los ensayos
con linfocitos T citotxicos son particularmente difciles de estandarizar. Los ensa
yos histricos como la proliferacin mitognica son tambin difciles, con variabilidad en
tre los laboratorios. Por lo tanto, los laboratorios que ofrecen estas pruebas i
nmunologas deben tener una amplia base de dalos mediante la cual se pueda interpr
etar el resultado individual del paciente. Los laboratorios celulares deben esta
blecer rangos normales para sus ensayos y tener cuidado en que los rangos normal
es de adultos no se apliquen en los ensayos peditricos. Esto es particularmente p
roblemtico porque los rangos normales peditricos son difciles de determinar debido
a la falta de nios disponibles en el primer ao de vida, y la correcta interpretacin
de los resultados del laboratorio depende de ellos. Deben hacerse cuidadosament
e las comparaciones de los datos entre los laboratorios. Siempre que est disponib
le, un laboratorio de inmunologa celular debe utilizar los estndares adecuados en
el desarrollo de la citometra de flujo y en el anlisis del ADN y tener presentes l
as regulaciones federales y estatales con respecto al laboratorio, incluyendo la
Ley de 1988 (Human Health and Services Clinical Laboratory Improvement Acf). Ad
ems, deben participar en pruebas de capacidad, cuando estn disponibles, y estar in
cluidos en programas de formacin incluyendo evaluaciones de competencia para todo
el personal implicado en la prueba. Todos los ensayos desarrollados en el labor

a-

torio deben incluir un control normal y. cuando sea posible, controles durante e
l proceso para establecer la validez del ensayo. Las muestras enviadas deben ser
cuidadosamente controladas en cuanto a la exposicin al calor y al fro y el tiempo
desde que se extraen al paciente Debe acompaar a las muestras una historia clnica
para que se puedan realizar estudios particulares de modo que el director del l
aboratorio pueda realizar la correcta aproximacin a la prueba. Se ha publicado un
documento de consenso con recomendaciones sobre el anlisis inmunofenotipico de l
as neoplasias hematolgicas por citometra de flujo (Braylan, 1997). Este documento
fue minuciosamente desarrollado por los proveedores de la comunidad mdica interes
ados en cubrir los procedimientos de laboratorio, la seleccin de anticuerpos para
la identificacin de neoplasias, el anlisis de datos y la interpretacin, informes md
icos e indicaciones, en ausencia de equipos estandarizados y otros artefactos. L
a FDA ha puesto en marcha la Analyte Specific Regulation |ASF. 1998). que elimina
reactivos como los monoclonales para su empleo en la investigacin. Esta regla no
permite a los fabricantes decir a los empleados del laboratorio cmo emplear sus
reactivos. No pueden especificar las instrucciones de uso. La regla ASR proporci
ona unos reactivos estables, bien definidos, fabricados en buenas condiciones. T
odos los laboratorios que utilizan estos reactivos c o m o una prueba de fabrica
cin casera" deben desarrollar sus propios ensayos clnicos y estudios de validacin y
deben emplear una declaracin de descargo de responsabilidad en su informe final.
El documento de consenso permite al laboratorio desarrollar sus anlisis de un mo
do consistente y la definicin del significado clnico a un gran nmero de laboratorio
s e instituciones. El documento no es un patrn pero concuerda con otro estndar NCC
LS que est actualmente en uso. El laboratorio celular se enfrenta con una mayor d
ificultad de trabajo de interpretacin ya que los datos no son fcilmente estandariz
abas. Adems, la garanta de la calidad de la muestra y la evaluacin realizada depend
en de la cuidadosa documentacin de los parmetros biolgicos y logisticos que pueden
influir en el resultado. El futuro de las pruebas utilizadas en la evaluacin de l
os componentes celulares de la respuesta inmune residen en el desarrollo de nuev
os mtodos que conduzcan a una mejor estandarizacin. BIBLIOGRAFA Allsopp , Nicholls SJ
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CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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CAPTULO 36

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7

C A P T U L O
37
#
S Evaluacin del funcionamiento de las > inmunoglobulinas y la inmunidad humoral
Inmunoglobulina D 878 Inmunoglobulina E Resumen IMPORTANCIA CLNICA DE LAS INMUNOG
LOBULINAS Patognesis 880 881 DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES Inmunoelectroforesis Inmun
ofijacin Prevencin de las enfermedades y terapia BIBLIOGRAFA 891 888 886
Richard A. McPherson, M.D.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Molculas de anticuerpo Interaccin antg
eno-anticuerpo BASE GENTICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS PROPIEDADES GENERALES
DE LAS INMUNOGLOBULINAS Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G Inmunoglobulina A
Los anticuerpos son las molculas electoras de la inmunidad humoral (mediada por cl
ulas B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen especficamente a los antig
enos que estimularon su produccin. Las inmunoglobulinas constituyen un 20% de las
protenas plasmticas de un individuo sano. La actividad de los anticuerpos se asoc
ia a las protenas con menor velocidad de migracin en una electroforesis. las y-glo
bulmas. Este capitulo se centra en la discusin de las propiedades estructurales y
funcionales de las inmunoglobulinas, su evaluacin en el laboratorio y su importa
ncia clnica.
PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Molculas de anticuerpo
Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propiedades est
ructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford, 1991). Una m
olcula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de "Y". Presenta dos domi
nios de unin al antigeno en las puntas de la "Y" (regin Fab) y zonas de unin para c
omponentes del sistema del complemento y/o varios receptores de la superficie ce
lular en la cola de la "Y" (regin Fe). Cada molcula de inmunoglobulina est compuest
a por 2 cadenas pesadas (H: heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idnticas entr
e si. Estas cadenas polipeptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no
covalentes que se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios
de interaccin con el antigeno estn compuestos por partes de ambas cadenas. Cada un
a de las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una regin variable
de unos 110 residuos de aminocidos en el extremo amino-terminal (las puntas de l
a "Y"), que forma el dominio de interaccin con el anligeno, unido a una regin cons
tante. La regin conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces ms grande que en la c
adena L. Cada cadena est compuesta por repeticiones de dominios plegados de forma
semejante: una cadena L tiene un dominio de regin variable (V ) y un dominio de
regin constante (CJ. mientras que la cadena H tiene un dominio de regin variable (
V,.) y 3 4 dominios de regin constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la se
cuencia de aminocidos en
H
las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3 pequ
eas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo aminoterminal de
la molcula para formar el sitio de unin al antigeno. Cada dominio de unin al antgen
o tiene slo el tamao suficiente para unir un determinante antignico del tamao de cin
co o seis residuos de azcar. Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos dis
tintos (y, a, p. 8, e) y las cadenas ligeras de dos (,- y X), donde algunos de lo
s isotipos presentan subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos
y y , y y y.. Los isotipos se torman como resultado de variaciones en las region
es constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas
forman la base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pes
ada por s sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se denomin
an haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una letra de nue
stro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE).

2 3
Los anticuerpos tienen dos dominios idnticos de interaccin con el antigeno. El dom
inio de interaccin con el antigeno est compuesto por los aminocidos de un tipo de c
adena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molcula monomrica compuesta por 4 cadena
s (vase Fig. 37-1) posee dos sitios idnticos de asociacin con el antgeno, y se dice
que son molculas bivalentes. Estas molculas son capaces de entrecruzar molculas de
antigeno, si cada una de ellas presenta 3 o ms determinantes antignicos, formando
un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un determinado ta
mao, precipitar (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es importante fisiolgicamente
porque facilita ia internalizacin del antgeno. c o m o puede ser el expresado por
bacterias o por leucocitos lagociticos. Tambin interviene en la activacin del sis
tema del complemento. Adems, este entrecruzamiento puede ser necesario para desen
cadenar la produccin de anticuerpos (por la accin de linfocitos B) por parte del a
ntgeno. La eficiencia con la que el anticuerpo se une al antgeno y produce entrecr
uzamiento se ve aumentada gracias a una regin m u y flexible (regin de bisagra) qu
e se encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que vare
la distancia que separa los dos dominios de unin al antgeno. La multivalencia afe
cta a la avidez con que un anticuerpo puede unir determinados tipos de antgeno. U
n antigeno particulado (como una bacteria o un virus) presenta repeticiones de d
eterminantes antignicos en su superficie.

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

879
(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por otr
o lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque const
a de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco ms grande que un fragmento
Fab, unidos covalentemente; el resto de la molcula est cortada en fragmentos ms peq
ueos de varios tamaos (Fig. 37-1). Como los fragmentos F(ab'),son bivalentes, toda
va pueden entrecruzar antigenos y formar precipitados. Esto no ocurre con los fra
gmentos Fab puesto que son univalentes. Ninguno de estos fragmentos (subundades d
e anticuerpos) tiene las dems propiedades biolgicas de las molculas intactas de ant
icuerpos puesto que carecen de la cola (la regin Fe) que media estas propiedades.
Sin embargo, los fragmentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclon
al que se emplea teraputicamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi
niveles txicos y facilitando la eliminacin de la sustancia del cuerpo. Cada clon
de clulas B produce molculas de anticuerpo con un nico dominio de unin al antgeno. In
icialmente, las molculas se insertan en la membrana plasmtica, donde funcionan com
o receptores de superficie para el antgeno. Cuando un antigeno se une a los antic
uerpos en la superficie celular, activan a las clulas B, las cuales se multiplica
n, diferencian en una clula plasmtica, y sintetizan una gran cantidad de anticuerp
o soluble con el mismo dominio de interaccin con el antgeno, que se secreta a la s
angre. Los anticuerpos humorales protegen a los humanos y animales de infeccione
s, inactivando virus y toxinas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutan
do el complemento y diversas clulas para matar e ingerir los microorganismos inva
sores mediante sus dominios C en la regin Fe de la molcula. Las propiedades biolgic
as de los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1.
t L
IKKK'
OKIH
Figura 37-1. Representacin esquemtica de la molcula de inmunoglobulina G. Se muestr
an las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e intracale
narios que determinan los lazos Cada uno d e los lazos determina un dominio de c
adena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indican las regiones
de corte enzimtico ms probables en la regin "bisagra" por parte de la pepsina y pa
paina. Los fragmentos resultantes de la accin de la papaina se laman Fab y Fe. Lo
s fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2 fragmentos Fab unidos
por un puente disulfuro). La digestin de Fab con pepsina en las condiciones adecu
adas libera el fragmento F (V y V asociados de forma no covalente). La porcin de
la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab se denomina Fd.
v H L

Interaccin antgeno-anticuerpo
La unin de un antgeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el nmero de siti
os de unin contribuyen a la fuerza de la interaccin antgeno-anticuerpo. Esta unin re
versible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes relativamente dbiles, in
cluyendo uniones hidrofbicas y de hidrgeno, fuerzas de van der Waals e interaccion
es inicas. Estas fuerzas dbiles son efectivas slo cuando la molcula del antigeno est
lo suficientemente cerca para permitir que algunos de sus tomos puedan insertarse
en las regiones complementarias de la superficie del anticuerpo. Las regiones c
omplementarias de un anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos dominios de intera
ccin con el antgeno idnticos entre s, mientras que la regin correspondiente del antge
o es lo que se denomina el determinante antignico (epitopo). La mayora de las macr

omoleculas antgnicas presentan vanos determinantes antignicos distintos; si dos 3 ms

de ellos son idnticos, se dice que el antigeno es multivalente. La afinidad de u
na molcula de anticuerpo refleja la fuerza con que el determinante antignico se in
serta en un solo sitio de unin al antigeno, y es independiente del nmero de determ
inantes antignicos. Sin embargo, la avidez total de un anticuerpo por un antgeno m
ultivalente. como un polmero con
Una molcula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partcula de tal forma q
ue ambos dominios de interaccin antignica se encuentren unidos a determinantes ant
ignicos de esa misma partcula, en lugar de encontrarse en dos partculas adyacentes.
Cuando se produce este tipo de unin, la energa efectiva de la interaccin o avidez,
es mucho mayor que la que presenta una unin monovalente a dos partculas. Se ha de
mostrado que este mecanismo es m u y importante desde un punto de vista fisiolgic
o, en la neutralizacin de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la u
nin. El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su habi
lidad para unir antgenos. Intervienen en una gran variedad de actividades biolgica
s mediadas por la cola de la "Y", la regin Fe de la molcula. Esta parte de la molcu
la de anticuerpo determina lo que ocurrir con el antgeno una vez que se haya unido
. Inmunoglobulinas con la misma capacidad de interaccin con el anlgeno pueden pres
entar una variedad de regiones Fe distintas, por tanto, diferentes propiedades f
uncionales, como puede ser activar el sistema de complemento y unirse a receptor
es de Fe presentes en la superficie de macrfagos, facilitando asi la fagocitosis
de antgenos. Debido a que posee una localizacin expuesta y una estructura flexible
, la regin bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nombre
indica, esta regin confiere una cierta flexibilidad a la molcula, permitiendo que
adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anticuerpo se una a un
a sola partcula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos regiones de unin al antgeno
o. alternativamente, puede estirarse al mximo para unir dos partculas. Las propied
ades que aporta la regin bisagra a las molculas de inmunoglobulina estn relacionada
s con su alto contenido en prolina y residuos de aminocidos hidroflicos. Los puent
es disulfuro que se establecen entre las cadenas H en molculas de IgG. IgA y en I
gD se encuentran en la regin bisagra (Fig. 37-1). Las enzimas proteoliticas papai
na y pepsina escinden las molculas de anticuerpo en diferentes fragmentos caracte
rsticos que permiten un entendimiento de la relacin estructura-funcin de la protein
a. El corte con papaina produce dos fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fr
agmento de unin al antgeno) idnticos, cada uno de ellos con un dominio de unin al an
tigeno, y un fragmento Fe
Tabla 37-1 Dominio C3
Propiedades biolgicas de los dominios de inmunoglobulina (IgG) Funcin conocida o p
robable
C,,2 C..1/C
V H T V ,
1. Reacciones citotrpicas que implican (a) Macrfagos y monocitos (b) Mastocitos he
terlogos (c) Clulas citotxicas (K) (d) Clulas B 2. Ensamblaje no covalente de las ca
denas pesadas y ligeras 1. Unin al complemento (C1q) 2. Control del ritmo catablic
o 1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas 2. Ensamblaje cova
lente de cadenas ligeras y pesadas. 3. Espaciadores entre interacciones entre do
minios que conllevan unin del antgeno y funciones electoras 1. Unin al antgeno 2. Fo
rmacin de enlaces no covalentes entre cadenas pesadas y ligeras
De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of immun
oglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciudad de Canb
erra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso

880
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA Dadas las condiciones de valencia que permiten la form

acin de grandes agregados, el tamao de los complejos antgeno-anticuerpo que se form
an depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos reac
tivos. Si hay un exceso de antgeno o de anticuerpo es poco probable que se formen
grandes complejos (Fig. 37-2). El tamao y composicin de los complejos antgeno-anti
cuerpo no slo son importantes para las reacciones de precipitacin in vilro. tambin
son cruciales para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los c
omplejos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan mltiples re
giones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los recept
ores Fe de los macrfagos, los cuales los ingieren y degradan. Los complejos pequeo
s, formados en exceso de antgeno, slo presentan una regin Fe por complejo. As, se un
en pobremente a los receptores Fe de los macrfagos y se destruyen con menos efici
encia. En lugar de ser destruidos se pueden depositar en pequeos vasos sanguneos d
e la piel, rones, articulaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del co
mplemento, causando inflamacin y destruccin del tejido. Aunque parece que los comp
lejos antgeno-anticuerpo tienen una apariencia muy rgida, los anticuerpos son enti
dades dinmicas que sufren fluctuaciones estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 199
1). Cambios conformacionales pueden ser necesarios para la unin. Estos ajustes in
cluyen desplazamientos laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de
anillos aromticos, cambios conformacionales e incluso pequeas rotaciones entre dom
inios V y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrn, 1991).
H L
subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unin de todos los sitios
de unin juntos. Una molcula de IgG tpica se une con al menos 10.000 veces mayor fu
erza a un antgeno multivalente si ambos dominios de interaccin con el antigeno estn
implicados, que si slo interviene uno de ellos. Por el mismo motivo, si la afini
dad de los dominios de interaccin con el antgeno entre molculas de IgG e IgM es la
misma, la molcula de IgM (debido a que es un pentmero y por tanto posee 10 dominio
s de interaccin con el antgeno) poseer una avidez mucho mayor por un antgeno mulliva
lente que una molcula de IgG (que posee dos dominios de interaccin con el antgeno).
Esta diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerp
os producidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidade
s mucho menores que los que se producirn ms adelante. El aumento en la afinidad me
dia de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la inmunizac
in se denomina maduracin de la afinidad. Esto ocurre porque la respuesta humoral f
rente a un antgeno es heterognea, esto es, se producen anticuerpos con distintos d
ominios de unin al antgeno por parte de los clones de linfocitos B de respuesta. D
ebido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo de Ig producida al princ
ipio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso cuando cada uno de sus dom
inios de interaccin slo tiene una baja afinidad. El tamao del complejo antgeno-antic
uerpo se determina por la valencia del antgeno y las concentraciones relativas de
l antgeno y el anticuerpo. La reaccin de precipitacin de antigeno-anticuerpo se bas
a en el entrecruzamiento de antgenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si
slo est presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), molculas con un
solo determinante antignico no pueden entrecruzarse. Si un antgeno es bivalente,
puede formar pequeos complejos cclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mient
ras que un antgeno con tres o ms determinantes antignicos puede formar complejos tr
idimensionales que precipitan con facilidad. Sin embargo, la mayora de los antisu
eros producidos frente a un antgeno contienen una variedad de anticuerpos diferen
tes (una respuesta policlonal) que reaccionan con diferentes determinantes del a
ntgeno y pueden cooperar en el entrecruzamiento del antgeno. Por el contrario, ant
icuerpos homogneos (monoclonales) slo pueden precipitar molculas que presentan repe
ticiones idnticas de determinantes antignicos.

BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 molculas de anti
cuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genticos especiales para producir
una gran cantidad de molculas de inmunoglobulina, que se desarrollan durante la r
espuesta a un antgeno sin la necesidad d e involucrar un nmero excesivo de genes (
Edward, 1993).
6 9
Figura 37-2. L a s concentraciones del antgeno y del anticuerpo influencian el ta
mao de los complejos antgeno-anticuerpo que s e forman. Los complejos de mayor tam
ao se forman cuando a m b a s molculas estn presentes en aproximadamente la misma c
oncentracin molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos ms pequeos se
forman cuando existe un gran e x c e s o de antigeno. Ntese que los pequeos comple
jos formados en exceso de antigeno presentan pocas molculas de anticuerpo por com
plejo: por este motivo, no son eliminados eficientemente p o r los macrfagos de l
os fluidos extracelulares.

CAPTULO 37

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

881
Figura 37-3. Organizacin y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmu
noglobulinas (exones) en el c r o m o s o m a 12 de ratn. Cada gen V tiene tambin u
na secuencia lder que no aparece en la representacin Los genes de la regin constant
e se identifican mediante el isolipo de la cadena pesada, y existe ms de un gen p
ara los isotipos C, y C A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C estn c
o m puestos por mltiples exones, tal y c o m o se ilustra para el gen C (dominios
C,-C,...). Los sitios de recombmacin se encuentran en el e x t r e m o 5' de c a d
a uno de los genes C y t a m p o c o se muestran. La linea continua representa la
s secuencias intermedias (intrones) entre genes o segm e n t o s gnicos. Cada cad
ena pesada est codificada por cuatro segmentos gnicos diferentes. V, D. J. y C. (R
eproducido de M a r c u KB: I m m u noglobulin heavy-chain constant region genes
. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright de Cell Press).
M
Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codifican para l
as cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que codifican para las
cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas diferentes. En cada grupo,
distintos segmentos gnicos que codifican para diferentes partes de las regiones
variables de cadenas ligeras y pesadas se pueden poner en contacto mediante proc
esos de recombinacin especficos que tienen lugar durante la diferenciacin de clulas
B. Los grupos de genes de cadenas ligeras contienen uno o ms genes constantes (C)
y juegos de segmentos variables (V) y de genes de unin (J). El grupo de genes de
la cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diversi
dad (D) y segmentos J. Para generar una molcula de anticuerpo, un segmento gnico V
se recombina con otro segmento gnico J , dando lugar a un gen V para la cadena l
igera; y un segmento V se recombina con un segmento D y otro J para generar un ge
n V para la cadena pesada (Fig. 37-3). Cada uno de los segmentos gnicos generados
se cotranscribir con el segmento de la regin constante correspondiente para produ
cir un ARN mensajero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediant
e la combinacin de los diferentes segmentos gnicos que codifican para las regiones
V, y V. los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y mil
es de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millones de molc
ulas de anticuerpo diferentes.
H
una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo contacto con
el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hipermutacin somtic
a puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados de anticuerpos de alt
a afinidad que resultan mucho ms efectivos. Todas las clulas B producen inicialmen
te anticuerpos IgM. Ms adelante algunas pasan a producir otros tipos de anticuerp
os (isotipos) que poseen el mismo dominio de unin al antgeno (idiotipo) que la IgM
original (exclusin allica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combi
nacin con la exclusin allica permite que los mismos dominios de unin al antgeno (la m
isma cadena V y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propiedades bio
lgicas (funciones efectoras secundarias). As. este mecanismo de organizacin gmea per
mite la construccin d e molculas de inmunoglobulina con una variedad de especifici
dades. La diversidad de los anticuerpos depende de la presencia de mltiples segme
ntos gnicos, su reagrupacin en diferentes secuencias, la combinacin de distintas ca
denas pesadas y ligeras en la construccin de molculas de inmunoglobulina, y de mut
aciones somticas.
Este repertorio inicial de molculas de anticuerpo se puede expandir incluso ms med

iante la hipermutacin somtica, la cual se activa mediante la exposicin al antgeno. A

s, el papel que juega el antgeno en presencia de la mutacin somtica parece derivar e
n un refinamiento de la respuesta inmune y a una diversidad prcticamente ilimitad
a de molculas de anticuerpo. Mutaciones somticas puntuales tienen lugar en clulas B
(no en clulas germinales) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegaw
a, 1983). Las hipermutaciones somticas se encuentran, en su mayora, confinadas a l
os genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones contigu
os. Se estima que tendr lugar, aproximadamente, una mutacin en la regin V de la cad
ena H o L. en cada clula individual con cada divisin celular. Esto no slo aumenta l
a diversidad de anticuerpos, sino que tambin puede causar un cambio en la afinida
d con la que el anticuerpo se une a su ligando. Aquellas clulas B resultantes que
puedan unir al antgeno con mayor avidez presentan una ventaja sobre otras clulas
B que no son capaces de unir al antgeno con tanta avidez. A medida que decae la c
oncentracin de antgeno, aquellas clulas B que presentan receptores con mayor avidez
dominan la poblacin de clulas involucradas en la respuesta. Esto origina
PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS
(Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993) Los diversos tipos de inmunoglobulin
as humanas y sus propiedades estn resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina M
Esta glucoprotena es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre en las
primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la IgM se secret
a en forma de pentmero compuesto por cinco unidades de cuatro cadenas cada una. u
na macroglobulina con una velocidad de sedimentacin de 19S y una masa molecular d
e 900 kDa. Sin embargo, en trastornos autoinmunes humanos, como puede ser el lup
us entrematoso sistmico (SLE), la forma monomrica de 7S se puede detectar en canti
dades apreciables en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno p
oco frecuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de i
nmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.

882
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones
y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\ (denominados Lv1. Lv2
. Lv3) y del dominio V (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminocidos se
enumeran empezando por el extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se
ha observado una regin hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama tambin s
e ilustra la regin donde pueden encontrarse la mayora de las vanantes de inmunoglo
bulina. Los determinantes idiotipicos se encuentran exclusivamente en los domini
os V, y V. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. L
o s marcadores alotipicos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.
Debido a que la forma pentamrica de la IgM tiene un total de 10 dominios de unin a
l antigeno, resulla ms eficiente que su forma monomrica 7S o la IgG en el entrecru
zamiento del antgeno y en la activacin del sistema del complemento una vez unido a
l antigeno. Asi, esta elevada eficiencia en la unin y activacin del complemento, u
nido a su temprana
aparicin durante el transcurso de una infeccin, hace de la IgM un agente especialm
ente potente para combatir las invasiones microbianas. Cada pentmero de IgM conti
ene una copia de otra cadena polipeptdica. denominada cadena J (del ingls joming).
con un tamao molecular de 15 kDa. Este polipptido accesorio se produce por parte
de las clulas secretoras de

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

883
Tabla 37-4
P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s
IgM IgG IgA IgD

A Fisiolgicas Concentracin mg/ml en suero de un adulto normal 1.2-4.0 8.0-16.0 0.4

-2.2 0.03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <100 Por
centaie de la inmunoglobulina total 13 80 6 0.002 Porcentaje de distribucin intra
vascular 41 48 76 75 51 Ritmo de sintesis mg/kg/dia 2,2 35 24 0.4 0,003 Ritmo de
catlisis en suero, %/da 10,6 6 24 37 90 (o vida media/dia) (5-6) (18-23) (5-6.5)
(2.8) (2,3) Biolgicas Capacidad de aglutinacin +4 +2 + Capacidad de fijacin del com
plemento por la va clsica 4 Hipersensibilidad anafilctica homologa +4 + Anafilaxis h
elerloga en conejillo de Indias Fijacin a baslilos y mastocitos homlogos +4 + U
tolilica a macrfagos 1 + Transporte Iransplacentario + Unin al tactor reumatoide P
resencia en secreciones externas + +4 +2 Otras propiedades caractersticas: IgM Se produce en el inicio de la respuesta inmune, es la primera defensa electiva f
rente a la bacteremia. IgG Combate los microorganismos y sus toxinas en los flui
dos extravasculares IgA -Defiende las superficies externas del cuerpo. IgD -Pres
ente en la superficie de hnfocitos inmunocompetentes importante para la activacin
de clulas B y/o la inmunorregulacin

IgM Se trata de una glucoproteina acidica con un elevado contenido en residuos d

e cisteina y. por tanto, se asocia mediante puentes disulfuro al extremo carboxi
lo-terminal de dos regiones Fe de molculas monomricas de IgM adyacentes. Se cree q
ue la oligomerizacin se inicia en este punto. La IgM es adems, el primer tipo de a
nticuerpo secretado por las clulas B durante su desarrollo. Los precursores inmed
iatos de las clulas B. llamadas clulas pre-B. sintetizan cadenas u., pero no caden
as ligeras, que acumulan en el interior de las clulas. A continuacin las clulas pre
-B empiezan a sintetizar cadenas ligeras que se combinan con las cadenas u para
formar molculas de IgM monomricas. El conjunto formado por las dos cadenas pesadas
y las dos cadenas ligeras se inserta en la membrana plasmtica, donde funciona co
mo receptor para el antigeno. En este momento, las clulas se han convertido en li
nfocitos B y pueden responder al antgeno. Quizs debido a su gran tamao, el pentmero
de IgM secretado no se encuentra de modo significativo en los espacios interstic
iales; se encuentra confinado a la sangre y no atraviesa la placenta. La IgM es
un componente minoritario de las inmunogiobulinas secretadas en superficies muco
sas y en la leche materna. Filogenticamente, la IgM es la inmunoglobulina ms primi
tiva, y la mayora de las variantes de los genes de la cadena LI parecen haber evo
lucionado para dar genes de cadenas pesadas de otros tipos de inmunogiobulinas.
Otras propiedades fsicas y biolgicas de la IgM y de otros tipos de inmunoglobulina
s se citan en las Tablas 37-3 y 37-4.
necesitan al menos dos molculas de IgG para la activacin del complemento, en compa
racin con una sola molcula de IgM, que contiene cinco regiones Fe Las molculas de I
gG son los nicos anticuerpos que pueden pasar de la madre al feto. Clulas placenta
rias que se encuentran en contacto con la sangre materna poseen receptores que s

e unen a la regin Fe de la IgG y median su paso hasta el feto. Los anticuerpos pr

imero penetran por un proceso de endocitosis mediada por receptores y despus se t
ransportan a travs de la clula para liberarse posteriormente por exocitosis a la s
angre fetal. Otros tipos de anticuerpos no pueden unirse a estos receptores y. p
or tanto, no pueden atravesar la placenta. La habilidad de la IgG para cruzar la
placenta confiere una linea de defensa fundamental frente a la infeccin durante
las primeras semanas de vida del nio. Normalmente, el embrin humano empieza a reci
bir cantidades significativas de IgG materna por va transplacentaria a las 12 sem
anas de gestacin. La cantidad aumenta de forma constante hasta que, al nacer, el
suero del cordn contiene una concentracin de IgG comparable a la del suero materno
. Salvo que existan trastornos inmunolgicos. los niveles de IgG de un adulto se a
lcanzan en el sptimo ao de vida y a partir de este momento permanecen constantes.
Los anticuerpos IgG tienen un elevado coeficiente de difusin que les permite difu
ndir a espacios extravasculares del cuerpo con mayor facilidad que otros tipos d
e Ig. Como la IgG es la principal representante de las Ig en estos espacios, es
la principal encargada de neutralizar toxinas bactenanas y de unirse a microorga
nismos para facilitar su fagocitosis. Ademas, solo los anticuerpos IgG que se en
cuentran recubriendo clulas diana, como pueden ser clulas tumorales, pueden desenc
adenar su muerte extracelular mediante ADCC; las clulas NK responsables de la ADC
C presentan receptores para Fe de IgG. Existen cuatro subtipos de IgG humana, de
1 a 4. Las cuatro subclases reflejan la existencia de cuatro cadenas H distinta
s no genticamente (y1 a y4). que son similares pero no idnticas en cuanto a su sec
uencia de aminocidos y propiedades generales. Por ejemplo. lgG1 es el subtipo dom
inante en adultos humanos. La lgG3 es la ms efectiva en su unin al complemento, se
guida de lgG1 e lgG2. La lgG4 en la mayoria de los casos es incapaz de unirse al
complemento por la va clsica. Todos los subtipos excepto la lgG2 pueden atravesar
la placenta. Un resumen de las propiedades fsicas y biolgicas de la IgG se encuen
tra en las Tablas 37-3 y 37-4. y de los subtipos en la Tabla 37-5.
Inmunoglobulina G
La IgG es el isotipo mejor estudiado tanto a nivel estructural como funcional (B
urton. 1985). Los anticuerpos de este tipo constituyen la principal inmunoglobul
ina en sangre. Se producen copiosamente durante la respuesta inmune secundaria.
La regin Fe de las molculas de IgG se une a receptores especficos de clulas lagocfica
s, como macrfagos y leucocitos polimorfonucleares. incrementando asi la eficienci
a con que las clulas fagociticas pueden ingerir y destruir microorganismos infecc
iosos que se han recubierto con anticuerpos de IgG en respuesta a la infeccin. Es
tos anticuerpos unidos a clulas diana tambin pueden guiar a linfocitos NK (Natural
Killer) a destruirlos mediante un proceso de citotoxicidad celular mediada por
anticuerpos (ADCC del ingls antibody-dependenl cell-mediated cytotoxicty. La funcin
mejor conocida de la IgG es la activacin del complemento por la va clsica. La regin
Fe de la IgG puede unirse, y por tanto activar al primer componente del sistema
del complemento, que desencadena un ataque bioqumico que mata a los micoorganismo
s Se
Inmunoglobulina A
Los anticuerpos de esta clase constituyen el principal tipo de anticuerpo presen
te en las secreciones (leche, saliva, lgrimas y secreciones respiratorias

884
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 37-5 Propiedades de las subclases de inmunoglobulinas G IgGI A. Fisiolgicas

Porcentaje de IgG total en suero Ritmo de sntesis, mg/kg/dia en suero Ritmo de c
atlisis en suero, %/da (vida media, da) Relacin K/X Marcadores alotpicos (tipo de Gm)
B. Biolgicas Capacidad de fijacin del complemento por la via clsica Capacidad de a
dhesin a piel heterloga Transporte transplacentario Receptor en macrfagos Capacidad
de reaccin con protena A Actividades dominantes: Toxoide antitetnco Toxode antidiftr
co Antitiroglobulma Anti-ADN Anti-Fth Anli-lactor VIII Anlidextrano Anlilevano A
nti-cido teicoico Nmero de puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la regin de b
isagra Posicin de los puentes disulluro de las cadenas ligeras sobre las cadenas
pesadas 66*8 25 8 (23) 1,4-2,4 a, z, f, x igG2 23 8 ? 6,9 (23) 1,0-1,1 n igG3 7,
3 3.8 3,4 16.8 (7) 1.1-1,3 bo, bi, bz. g. st. etc +3 lgG4 4.2 2.6 ? 6.9 (23) 5,0
-7,0
+2

+ +
+
+ + + +
+ +
+
+
+
+2 +2 +2 +2 +2

+
+
+ +
+2

2 N214
+ 4 N131


5 N131
2
N131
e intestinales). Existe en forma de un monmero de cuatro cadenas (como la IgG) o
formando un dmero de dos unidades monomricas. Las molculas de IgA presentes en las
secreciones son dmeros que llevan una sola cadena J. similar a la asociada con la
IgM pentamrca, con una cadena adicional glicopolipeptdica llamada el componente se
cretor (SC) de 70 kDa. Los dmeros de IgA recogen el SC de la superficie de clulas
epiteliales que recubren el intestino, tos bronquios o los conductos galactforos,
salivares o lacrimales. El componente secretor se sintetiza en las clulas epitel
iales e inicialmenle se expone en la superficie extema de estas clulas, donde acta
con un receptor que une los dmeros de IgA. El complejo resultante de la unin del
dmero a su receptor se internaliza por endocifosis mediada por receptor, y se tra
nsfiere a travs del citoplasma de la clula epitelial en forma de vescula membranosa
, la cual se fusiona con la membrana plasmtica en el lado luminal de la clula
epitelial. La porcin extramembranal del receptor se escinde por accin enzimtica y s
e secreta como parte de la molcula de IgA secretora ([(/. ,L,,)/J(/.) al lumen. E
l extremo amino-terminal del receptor del dmero de IgA que permanece unido a este
dmero es el SC (Fig. 37-5). As, la molcula secretora completa de IgA es un product
o sinttico de dos tipos celulares, clulas plasmticas y clulas epiteliales. Adems de s
u papel en el transporte, el SC tambin puede proteger las molculas dimricas de IgA
de la digestin por parte de enzimas proteolticas presentes en las secreciones. En
los humanos se han clasificado los anticuerpos de IgA en dos subtipos, lgA1 e lg
A2, en funcin de la estructura antignica y la variacin en la disposicin de los puent
es disulfuro intercatenarios. As como la lgA2 es un componente menor del suero, e
ste subtipo es la forma dominante en las secreciones. Adems, la IgA secretada alc
anza los niveles de un adulto antes que
?
Figura 37-5. M e c a n i s m o por el cual el componente secretor m e d i a el t
ransporte de la molcula dimrica de IgA a travs de una clula epitelial. T o d o el co
mplejo se transporta desde el fluido extracelular al interior del lumen del tubo
epitelial. El componente secretor s e sintetiza en la clula epitelial c o m o un
a glucoprotena transmembranal y funciona c o m o un receptor en su superficie bas
olaleral para unir el dmero de IgA. El complejo IgA-receptor penetra en la clula e
n una vescula endoctic que cruza la clula y es exocitada en la superficie apical L a
escisin del receptor libera el dmero de I g A para su secrecin a la superficie ext
erior (luminal). La porcin del receptor que permanece unida al dmero de IgA se den
omina el componente secretor. Este mecanismo de transporte es responsable de la
deposicin de I g A en diversas secreciones exocrinas (p. ej., saliva, leche, bili
s, lgrimas y sudor) y en capas mucosas que protegen el revestimiento de los condu
ctos nasofarngeos, intestinales y del tracto genitourinario.

CAPTULO 37

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

885
la IgA en suero. El sistema de IgA en el tracto intestinal humano, por ejemplo,
puede estar plenamente desarrollado a los dos aos de edad, mientras que los nivel
es de IgA en suero no alcanzan las concentraciones de un adulto hasta los 12 aos
de edad. Debido a su presencia cerca de las membranas extemas, la IgA secretada
constituye u n a primera linea de defensa frente a microorganismos del ambiente
exterior Se ha postulado que la IgA inhibe la adhesin de microorganismos a la sup
erficie de las clulas mucosas, previniendo asi. su entrada en los tejidos. Una pr
opiedad de la IgA secretada que es importante en este aspecto es su multivalenci
a. que se asocia a una gran avidez por la unin de antgenos; esto puede resultar es
pecialmente relevante en la neutralizacin de virus. La actividad antiviral de ant
icuerpos de IgA se ha demostrado en individuos a los que se le ha suministrado c
ualquiera de las vacunas para la polio. La IgA secretada tambin puede combinarse
con determinados antgenos de la comida, impidiendo su absorcin al torrente sanguneo
y reduciendo asi la incidencia de reacciones alrgicas. Por eiemplo. las inmunode
ficiencias de IgA pueden desencadenar incrementos en tos niveles e incidencias d
e anticuerpos humorales dirigidos contra antgenos derivados de la comida y microo
rganismos intestinales. La IgA posee las siguientes propiedades efectivas: fija
el complemento mediante la va alternativa; a travs de un receptor especfico de Fe p
resente en macrfagos puede funcionar como una opsonina para la fagocitosis; y pue
de inducir la degranulacin de eosinfilos mediante un receptor especifico, que ha i
mplicado a la IgA en respuestas antiparasitarias. Las propiedades fsicas y biolgic
as de la IgA estn enumeradas en las Tablas 37-3 y 37-4.
Inmunoglobulina E
De los diversos tipos de inmunoglobulinas. la IgE est presente en la menor concen
tracin en suero (Tabla 37-4). Posee la habilidad de unirse a la piel humana (anti
cuerpo homoertotropico) y de iniciar aspectos de la reaccin alrgica (anticuerpo re
agnico) La actividad biolgica de la IgE se basa en su propiedad de unirse mediante
su regin Fe a basfilos y a su equivalente en los tejidos, los mastocitos L a IgE
puede ser importante tambin en la respuesta inmune humoral durante enfermedades p
arasitarias, ya que a menudo se encuentran elevados los niveles de esta inmunogl
obulina en suero de pacientes que presentan una infeccin por helmintos. La IgE pu
ede jugar un papel en el paso de leucocitos, anticuerpos y componentes del compl
emento a los locos de inflamacin desencadenando una reaccin de hipersensibilidad i
nmediala. Los anticuerpos de IgE representan un claro ejemplo de la naturaleza b
iluncional de las molculas de anticuerpo Su porcin Fe se une a las clulas diana mie
ntras que su porcin Fab se une al alrgeno (vase Capitulo 46 para el papel de la IgE
en enfermedades alrgicas y ensayos relacionados) Los niveles de IgE en suero en
determinadas condiciones se muestran en la tabla 37-6. Al igual que la IgA, la I
gE se produce principalmente en el revestimiento de los tractos respiratorios e
intestinales y forma parte del sistema secretor externo de anticuerpos. Una defi
ciencia de IgE se ha asociado de forma poco consistente con la deficiencia de Ig
A en individuos inmunodeficienles que presentan una excesiva susceptibilidad fre
nte a infecciones. La IgE no atraviesa la placenta y los complejos de IgE-antige
no no se unen al complemento por la va clsica (Tabla 37-4).
Inmunoglobulina D
A pesar de ser un componente minoritario del suero, la IgD es una de las princip
ales inmunoglobulinas de membrana presentes en la superficie de una proporcin ele
vada de linfocitos B, especialmente en recin nacidos. Durante el transcurso de la
diferenciacin de las clulas B. estas clulas sintetizan y presentan en superficie t
anto molculas de IgD como de IgM. Aunque esto aparentemente contradice la regla d

e "una clula, una inmunoglobulina", los dominios de unin al antgeno (idiotipos) de

ambas molculas y de sus cadenas ligeras son idnticos. Slo difieren en sus regiones
C. La IgD asociada a la membrana puede funcionar como uno de los receptores con q
ue las clulas B unen el antigeno y se estimulan para sufrir la proliferacin clonal
. Existen evidencias que sugieren que las clulas B que presentan IgM pueden respo
nder a ciertos antgenos T-independientes y que la adquisicin de IgD se requiere po
r parte de las clulas B para poder responder a la ayuda de clulas T necesaria para
las respuestas a antigenos T-dependientes. Adems, si las molculas de IgD se elimi
nan selectivamente de clulas B que presentan tanto IgD como IgM. aprovechando que
la cadena 8 es mucho ms sensible a la accin de la papaina, estas clulas pasan a se
r susceptibles de convertirse en tolerantes. El papel exacto de la IgD en una re
spuesta inmune sigue sin conocerse, pero la opinin general es que enciende, apaga
o modula la divisin o la diferenciacin de clulas B. La IgD generalmente se detecta
en suero a los seis meses de edad, y su concentracin a lo largo de toda la vida
es m u y baja. Sin embargo, en estados de enfermedad la concentracin de IgD puede
variar enormemente. En infecciones crnicas, los niveles en suero de IgD se eleva
n, al igual que los del resto de las inmunoglobulinas. Hasta la fecha, no se ha
asociado un incremento especfico de IgD con una enfermedad en concreto. Pacientes
con alergias y enfermedades autoinmunes no presentan variaciones de las concent
raciones normales de IgD. Generalmente, la IgD est ausente en individuos con hipo
gammaglobulinemia. Hasta la lecha, la IgD no tiene asignado un papel biolgico esp
ecfico como anticuerpo humoral. Se ha descrito la actividad de la IgD frente a un
cierto nmero de antigenos. La IgD de superficie, que tiene protenas semejantes a
las de la IgM de superficie, es un marcador de clulas B maduras, y su papel c o m
o receptor est aceptado a pesar de que la naturaleza y finalidad de la seal que I
ransmile siguen siendo controvertidas (Carsetti. 1993; Roes. 1993). La IgD no un
e al complemento, no atraviesa la placenta y no se une a clulas a travs de su regin
Fe. La forma secretada de IgD. al igual que la del resto de las inmunoglobulina
s. carece del pptido transmembranal en la regin carboxi-terminal que ancla la molcu
la en la superficie de las clulas B. Las Tablas 37-3 y 37-4 enumeran otras propie
dades de la IgD. Tabla 37-6 Niveles de IgE en suero en determinadas afecciones
Elevado
Dermatitis atpica Mieloma de IgE Hiper-lgE e inlecciones recurrentes Sndrome de Wi
skott-Aldrich Enfermedad de Hodgkin (especialmente en lases tardas) Aspergilosis
broncopulmonar Pnfigo Parsitos (como la ascariasis) Lepra Sida
De normal a elevado
Rinitis alrgica Asma alrgica Alveolitis extrnseca alrgica Fibrosis quistica Aspergil
oma Alergias a medicamentos Enfermedad heptica grave Urticaria alrgica Enfermedad
de Kawasaki Periarteritis nodulosa
Normal
Linfangiectasia intestinal Bronquiolitis Pnligo Tiroiditis Fallo renal crnico
De normal a disminuido
Leucemias Mieloma mltiple Deficiencia de IgA
Disminuido
Ataxia-telangiectasia Hipogammaglobulinemia ligada al sexo Hipogammaglobulinemia
congenita Hipogammaglobulinemia adquirida Deficiencia de IgE
Modificado a partir de Waldmanri TA Strober W, Polmar SH. Terry WD en Ishizaka K
Daylon DH Jr (eds) Tue Biological Role ol the Immunoglobulin E System. Washingt
on DC. US. Governrnenl Printing Oltice 1975 y Arbesman CA tvi Ishi/aka K. Daylon
DH. Jr (eds): The Biological Role ol the Immunoglobulin E System, Washington. D
C. U S. Government Printing Ottice, 1975

886
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAKXOGI'A
Tabla 37-7 Concentraciones d e inmunoglobulina e n suero Edad (Aos) 5-9 10-14 1519 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75+ Media d
e IgG (mg/ml) Media de IgA (mg/ml)
Hiperinmunoglobulinemia
NIVELES D EI N M U N O G L O B U L I N A SE NS U E R O Una interpretacin vlida de
los niveles de inmunoglobulinas en suero requiere un reconocimiento de las varia
ciones biolgicas que existen a lo largo de la vida de los individuos. Las vanable
s ms importantes son la edad, sexo y raza. Estudios en un grupo de individuos san
os de raza blanca (3.212) de u n a sola comunidad (Tecumseh, MI) mostraron que l
a concentracin media de IgG e IgA aumenta con la edad, con diferencias pequeas per
o significativas entre sexos. Las mujeres presentaban niveles mayores en suero d
e IgG y menores de IgA (Tablas 37-7 y 37-8) A pesar de que estas diferencias ent
re sexos para la IgG y la IgA son estadsticamente significativas, su significado
biolgico no resulta evidente. Los niveles de IgM en estos sujetos permanecieron r
elativamente constantes con la edad. Sin embargo, las mujeres lenan niveles medio
s de IgM (1,06 mg/ml) superiores a los hombres (0,77 mg/ml). Vanos estudios han
descrito que los niveles de inmunoglobulinas son m a s elevados en personas con
pieles pigmentadas. En la Tabla 37-8 se muestran los resultados obtenidos en una
poblacin birracial de individuos sanos del condado de Evans. Georgia. Los indivi
duos de color tenan niveles mayores de las tres inmunoglobulinas principales (IgM
. IgG e IgA) que los blancos. La mayor diferencia se encontr en la IgG. No se det
ectaron diferencias entre individuos urbanos y rurales en este estudio. Individu
os blancos de Rochester, Nueva York, tenan niveles en suero de IgG e IgM similare
s a los de individuos blancos de la Georgia rural. Un estudio trirracial en Durb
an, Natal, Sudfrica, demostr que varones adultos bantes tenan niveles significativam
ente mayores de IgM (32% ms), IgG (40% ms) e IgA (32% ms) en suero que individuos b
lancos de esta comunidad que nacieron en el mismo ao y pertenecan al mismo grupo s
anguneo ABO. Varones asiticos sanos mostraban aproximadamente un 20% ms de IgG. un
23% ms de IgA. y un 7% ms de IgM que individuos comparables de raza blanca. Un est
udio de individuos del rea metropolitana de Washington, D.C. demostr que individuo
s de color tenan niveles significativamente mayores de IgG que individuos blancos
pero niveles similares de IgA e IgM (Tollerud. 1995). Los grupos control emplea
dos en estos estudios se hicieron atendiendo a la edad. sexo, raza y tambin a div
ersos factores ambientales (Cassidy, 1974; Lichtman, 1967). Los incrementos de '
/-globulinas a menudo se detectan primero tras una electreforesis de protenas del
suero, una medida de las protenas totales o de albmina y fracciones de y-globulin
as. Los valores de referencia para las diversas inmunoglobulinas varan con la eda
d, sexo y raza (Tablas 37-7 y 37-8). Los incrementos de inmunoglobulinas pueden
ser monoclonales o policlonales. Las inmunoglobulinas monoclonales de un nico ind
ividuo son idnticas estructuralmente, y se cree que son el resultado de la expans
in clonal de una sola clula linfoide productora de inmunoglobulinas, y por tanto,
son especficas para un solo antigeno. Las inmunoglobulinas policlonales de un m i
s m o individuo son estructuralmente diferentes entre ellas en una o ms caracters
ticas importantes: por tipo, IgG, IgA o IgM policlonales: por su cadena ligera;
o por su especificidad antignica. Las inmunoglobulinas policlonales provienen de
la expansin clonal de varias clulas linfoides productoras de distintas inmunoglobu
linas. I N M U N O G L O B U L I N A SP O L I C L O N A L E S Los aumentos polic
lonales de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patolgicos (Tabl
a 37-9) (Buckley, 1977; Cushman. 1973). La electroforesis de protenas sricas es a
menudo suficiente para estable-

Varn blanco Mujer blanca Varn blanco Mujer blanca 10,28 10.41 10,55 10,69 10.83 10
.98 11.12 11.27 11,42 11,57 11,72 11.88 12,04 12.20 12.36 11.05 11.13 11 20 11 2
8 11.35 11.43 11.50 11.58 11,66 11,74 11,81 11.89 11,97 12.05 12.13 1.09 1,16 1,
23 1,32 1.40 1,50 1.59 1.70 1.81 1.93 2.06 220 2.34 2.49 2.66 1,10 1.15 1.21 I.2
8 1.35 1.42 1,49 1.57 1,65 1,74 1,83 1.93 2.03 2.14 2.26
Los dalos se obtuvieron de 3 213 muestras de suero recogidas de un grupo de suje
tos no praseleccionados de una sola comunidad sana (Tecumserv MI) (Cassidy. 1974
).
Resumen
En humanos existen cinco tipos diferentes de anticuerpos (IgM. IgG, IgA, IgD e I
gE). cuatro subtipos de anticuerpos IgG (lgG1, lgG2. lgG3 e lgG4) y dos subtipos
de IgA (lgA1 e lgA2). Cada uno de estos isotipos de anticuerpo posee una determ
inada cadena H (n, y, a. 8, e, y y, y . y y n, a. respectivamente). Las cadenas H co
ntienen la regin F e del anticuerpo, que determina qu otras protenas se unirn al ant
icuerpo y por tanto, las propiedades biolgicas del tipo y subtipo. Cualquiera de
las cadenas L (K- O X) pueden asociarse con cualquiera de las cadenas H.
3
Las diferencias estructurales entre los cinco tipos de inmunoglobulinas correspo
nden a las diferencias funcionales en sus lugares de produccin y accin, sus nivele
s relativos de sntesis en respuestas inmunes primarias y secundarias, y sus papel
es como efectores fisiolgicos. Por ejemplo, la IgG predomina tanto en sangre como
en los fluidos intersticiales, mientras que la IgM est principalmente confinada
a la sangre, y la IgA secretada se encuentra fundamentalmente en superficies epi
teliales. La IgD e IgE se encuentran principalmente unidas a clulas, la IgD en clu
las B. y la IgE en basfilos y mastocitos.
IMPORTANCIA CLNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Las inmunoglobulinas juegan papeles muy importantes en la patognesis, diagnosis,
prevencin y terapia de las enfermedades.
Patognesis
La hiperinmunoglobulinemia es una destacada caracterstica del mieloma mltiple y de
la macroglobulinemia de Waldenstrom. Anticuerpos contra antgenos nativos pueden
aparecer en enfermedades autoinmunes. tal y como se describe en los Captulos 43 y
45. La hipo- y agammaglobulinemia es a menudo una de las caractersticas ms destac
adas de algunas inmunodeficiencias (vase Captulo 42).
Tabla 37-8 Sexo Hombres
Concentracin de le G en suero en una poblacin birracial Edad (Aos) 15-34 35-54 55-7
4 15-34 35-54 55-74 N. de muestras 17 17 20 19 19 20 Media de la raza blanca ( SE
) (mg/ml) 11.2(7.3) 10.8 (5.9) 10,9(7.4) 10,6 (6,3) 12,3(3.4) 10,9 (6.1) N. de m
uestras 21
"
Media de la raza negra ( SE) (mg/ml) 13.4 (6.5) 13,5 (9,0) 13,3 (5.8) 15,6 (8.0)
15,4 (6,4) 14.2 (9,6)
20 I8 15 16
Mujeres
Estos datos son representativos de habitantes de Evans County, Georgia (Lichtman
. 1967)

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

887
Tabla 37-9
Hiperinmunoglobulinemias policlonales: algunas enfermedades asociadas Tipo de in
munoglobulina
Afeccin Inmunodeliaenaas Hiperinmunoglobulina E e infecciones recurrentes Sndrome
de Wiskott-Aldrich Disgammaglobulinemia tipo 1 Hiperinmunoglobulina A e infeccio
nes recurrentes Sida Infecciones Infecciones congnitas (sfilis. toxoplasmosis, rubo
la, citomegalovirus) Mononucleosis infecciosa Tripanosomiasis Parasitismo intest
inal Varias infecciones helmnticas Larva migrans visceral Granulomatosis crnica in
fantil Lepra Infecciones crnicas en general Enfermedades hepticas Hepatitis crnica
activa Hepatitis aguda Cirrosis biliar Hepatitis lupoide Trastornos pulmonares Sn
drome de hipersensibilidad pulmonar Sarcoidosis Beryliosis Trastornos autommunes
Lupus eritematoso sistmico Artritis reumatoide Muchos estados autoinmunes como l
a tiroiditis Escleroderma Enfermedad de la aglutinina fra Prpura anafilctica Otras
Sndrome do Down Amiloidosis Adiccin a narcticos Enfermedad de los lbulos renales
igE igA, igE IgM igA Todos los tipos IgM IgM o todas IgM o todas Todos los tipos
igE Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos, con prefer
encia de IgG Predomina IgG Predomina IgG Predomina IgM Todos los tipos Todos los
tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos igA o todos Todos los tip
os Todos los tipos IgM IgA Todos los tipos Todos los tipos IgM Todos los tipos
La incidencia de las inmunoglobulinas monoclonales (componentes M) en estudios d
e una poblacin no seleccionada se estima en 0,9% (Bachman. 1965: Axelsson. 1968;
Cohn 1985). En labratenos clnicos se encuentra una incidencia mucho mayor de result
ados positivos, puesto que los sueros son preseleccionados. El mieloma mltiple, l
a macroglobulmemia de Waldenstrm y neoplasias de clulas B son algunas de las enfer
medades asociadas con un aumento en el nivel de inmunoglobulinas monoclonales. A
ntes se crea que las gammapatias monoclonales eran poco frecuentes en casos de le
ucemia linfoctica crnica o de linterna Imfocitico bien diferenciado. Actualmente s
e ha demostrado que cuando se combinan la inmunofijacin y la electroforesis de al
ta resolucin para estudiar muestras de estos pacientes, la mayoria de ellos prese
ntan una gammapata monoclonal (Keren. 1988). Tambin se ha demostrado la existencia
de gammapatias en pacientes con linterna de Burkitt y leucemia linfoctica aguda
de clulas B. Aunque generalmente se desconocen las especificidades antignicas de l
as gammapatias monoclonales, algunas causan neuropatas paraproteinmicas. Este sndro
me clnico generalmente se debe a la interaccin de una paraproteina de IgM con una
glucoproleina asociada a la mielina (MAG), ganglisidos (por ej. GM. en la neuropa
ta motora y GD, en la neuropata sensorial) u otros glicoesfingolipidos (Ropper, 199
8). El trmino de gammapata monoclonal de significado indeterminado (MGUS: monoclon
al gammopathy of undetermmed signiticance) fue acuado por Kyle para categorizar i
ndividuos en los que se ha demostrado un componente monoclonal en el suero pero
que carecen de otras caractersticas que permitan el diagnstico de un cncer (Kyle. 1
982). Individuos con MGUS pueden tener hasta un 10% de sus clulas plasmticas en la
mdula sea. Esto es considerablemente menos que la plasmacitosis de mdula sea que se
asocia con el mieloma mltiple. Aproximadamente un 20% de individuos con MGUS des
arrollarn un trastorno linfoproliferativo de clulas B, siendo el ms comn de ellos el
mieloma mltiple, en un periodo de 10 aos. Algunos de los otros casos pueden desar
rollar leucemia linfoctica crnica, amiloidosis. linterna linfoctico diferenciado y
otras patologas que afectan a la proliferacin de clulas B. La mayoria de los casos
de MGUS no progresan hacia ninguna otra patologa clnica. Pacientes con MGUS poseen

cantidades del componente M de entre 300 y 3.000 mg'dl y normalmente no present

an la protema de Bence Jones en la orina. Se recomienda que estos pacientes teng
an un seguimiento mediante electroforesis de protenas sricas cada 6 a 12 meses par
a determinar si el proceso progresa o retrocede. Una consideracin especial es el
MGUS que se observa en pacientes Irasplantados que han recibido inmunosupresores
que afectan a las funciones de clulas T incluyendo la modulacin de la respuesta B
. Estas gammapatias monoclonales pueden ser transitorias hasta en un 75% de los
casos (Radl, 1985). Pueden ocurrir tanto en forma monoclonal como oligoclonal (S
tanko, 1989). y pueden coincidir con infecciones por citomegalovirus o por el vi
rus de Epstein-Barr (Drouet, 1999). Su progresin probablemente se estimula por lo
s elevados niveles de interleucina-6 circulantes (Nickerson, 1994).
cer esta condicin. La inmunoelectroforesis, inmunofijacin y determinacin de las inm
unoglobulinas individuales o cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden ayudar a
confirmar una distribucin policlonal o un aumento de uno o ms tipos de inmunoglobu
lina. El aumento de las inmunoglobulms sricas puede deberse a un descenso del cat
abolismo y un aumento de la sntesis. Los mecanismos de control de estos sucesos n
o se conocen bien. Las consecuencias de una elevacin de inmunoglobulinas son desc
onocidas. La mayor parte de las inmunoglobulinas no parecen estar dirigidas fren
te a un solo determinante antignico o grupo de ellos. Adems, la mayora de los autoa
nticuerpos no son monoclonales sino policlonales, En general, los incrementos pe
rsistentes de carcter policlonal en y-globulinas, se relacionan con una estimulac
in antignica de naturaleza crnica, o con una prdida de la regulacin de las inmunoglob
ulinas.
Tabla 37-10
Alteraciones asociadas a inmunoglobulinas monoclonadas
Inmunoglobulinas
monoclonales
L a s inmunoglobulinas monoclonales o los fragmentos de inmunoglobulinas se han
asociado con diversos estados patolgicos (Tabla 37-10) (Atkinson, 1977; Benbassat
, 1976: Schaefer, 1978; Wells, 1974; Kelly, 1985). Estas inmunoglobulinas tambin
se han llamado inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida.
Mieloma mltiple Macroglobulinemia de Waldenstrom Leucemia linfoctica crnica Otras l
eucemias : Linfomas I Gammapata monoclonal "benigna" j Sndrome de escape capilar s
istmico Amiloidosis i Enfermedad heptica crnica como la hepatitis activa, o la cirr
osis biliar primaria Trastornos autoinmunes, incluidas la artritis reumatoide. e
l lupus eritematoso sistmico. la tiroiditis. la anemia perniciosa, la poliarterit
is nodulosa o el sndrome de Sjogren Enfermedad de Gaucher | Varios tipos de cncer
Esferocitosis hereditaria I Infeccin por VIH, incluido el sida

888
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA Se recomiendan los siguientes tipos de antisuero: anti

suero completo humano; anti-lgG (cadenas y). anti-lgM (u), anti-lgA (a), anti-K
y anti-A (Fig. 37-6). Es importante darse cuenta de que no todos los antisueros
son semejantes en cuanto a fuerza y especificidad y es posible que un componente
M no se detecte con un antisuero y, sin embargo, pueda encontrarse con un segun
do antisuero. Asi, cada lote de antisuero debe compararse con un suero control p
ara su actividad mediante una difusin en gel, y para su especificidad con suero h
umano completo mediante IEP. La interpretacin de una IEP puede requerir una consi
derable experiencia, pero generalmente uno busca una variacin de una linea normal
mente uniforme, como puede ser porque se curva, presenta engrasamiento o tiene d
iferente movilidad. Ejemplos de IEP se muestran en la Figura 37-6. La IEP es una
tcnica til pero tiene sus limitaciones. Puede identificar la presencia de cadenas
pesadas y ligeras pero no asegura que lo que hay es efectivamente una molcula de
inmunoglobulina compuesta por dos cadenas pesadas y dos ligeras. Tambin es posib
le, aunque poco frecuente, que existan anticuerpos monoclonales por debajo del lm
ite de deteccin del sistema empleado. El umbral de deteccin puede determinarse dil
uyendo un anticuerpo monoclonal conocido y probndolo en IEP. Debido a que protenas
monoclonales pertenecientes a las IgM, IgA. IgD e IgE pueden estar presentes en
cantidades relativamente pequeas en comparacin con la IgG, la cadena ligera de la
inmunoglobulina no-lgG puede no ser detectada mediante IEP. La incapacidad para
detectar las cadenas ligeras de inmunoglobulinas presentes en menor concentracin
en presencia de una mayor concentracin de IgG, s e denomina efecto sombra (umbre
lla eflecl). Por tanto, pueden ser necesarios otros procedimientos para descarta
r la enfermedad de Franklin o de cadena pesada. Es posible que el suero que se e
st testando y el anticuerpo que se est utilizando no estn a la concentracin adecuada
y que no se detecte el componente M. Finalmente, puede ser que el antisuero que
se est usando no detecte los determinantes disponibles de un componente M concre
to. Si uno tiene una importante sospecha, puede ser til utilizar un segundo antis
uero de distinto origen.
DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
La evaluacin en el laboratorio de los niveles y funciones de inmunoglobulinas pue
de ayudar en el diagnstico y tratamiento de las patologas. El empleo de pruebas de
fijacin del complemento, de hemaglutinacin y otros inmunoensayos pueden detectar
un aumento o cambio en la titracin de anticuerpos frente a determinados antigenos
, como los que estn presentes en microorganismos. Las peticiones de examinar un s
uero para la presencia de protena monoclonal generalmente vienen de un mdico que r
econoce en un paciente los sntomas clnicos y signos de este tipo de trastorno, o d
el examen clnico de una electroforesis de proteina srica que sugiere la presencia
de una protena monoclonal. A menudo la sospecha del mdico de la existencia de una
discrasia de clulas plasmticas viene con la deteccin de anemia (con una o ms citopen
ias), niveles elevados de proteina total en el suero con un aumento de las globu
linas, y proteinuria: otras detecciones pueden incluir hiperuricema, hipercalcemi
a, un incremento de fosfatasa alcalina, dolor seo o lesiones lticas del tejido seo
en radiografas. Si efectivamente existe un componente M en la electroforesis de p
rotenas sricas, una medida cuantitativa de inmunoglobulinas por inmunodifusin radia
l, nefelometra u otra tcnica apropiada puede identificar la inmunoglobulina especi
fica si slo se encuentra elevado uno de los tres tipos principales de inmunoglobu
lina. Obviamente, esto no determina la cadena ligera de una inmunoglobulina mono
clonal ni detecta los mielomas de cadena ligera. Las gammapatas biclonales pueden
ser confusas. El empleo de inmunoglobulinas cuantitativas resulta til en la moni
torizacin del transcurso de la enfermedad y su tratamiento y puede ayudar a disti
nguir la condicin benigna de la maligna. Niveles de IgG monoclonal de 2 g/100 mi
o de IgA de 1 g/100 mi (Isobe, 1971) o superiores sugieren una condicin maligna.

En muchas inmunoctopatas malignas, la concentracin de inmunoglobulinas no monoclona

les se encuentra reducida. Asi, una deficiencia de inmunoglobulinas policlonales
sugiere la malignidad. Paradjicamente el paciente que posee una inmunocitopata ma
ligna es inmunodeficiente a pesar de que posee grandes cantidades de inmunoglobu
linas "sin sentido" producidas por un clon de clulas linfoides mal controlado.
Inmunofijacin
La IFE prcticamente ha sustituido a la IEP en el laboratorio clnico debido a su ra
pidez, sensibilidad y facilidad en la interpretacin; ambos procedimientos son com
parables en cuanto a sensibilidad. La IFE adems posee la ventaja de dar un result
ado ms rpido ya que no requiere la difusin a travs de gel. Muestras de suero del pac
iente se someten por duplicado a una electroforesis en gel de alta resolucin ante
s de aadir un antisuero monoespecfico directamente sobre las protenas separadas. Se
lava el gel, y los complejos antigeno-anticuerpo se tien y miden directamente (F
ig. 37-7). De vez en cuando, la concentracin de una protena monoclonal en el suero
de un paciente es tan alta que excede la capacidad de los anticuerpos para lorm
ar complejos que precipiten por IFE. Este fenmeno se corresponde con la zona de e
xceso de antigeno indicada en la Figura 37-2. El resultado es un halo de complej
os precipitados (donde las concentraciones se aproximan a la equivalencia) con u
na zona central clara donde existe el exceso de antgeno. Aunque este resultado pa
rece atpico, se puede interpretar y comprobar de forma directa repitiendo el IFE
con una mayor dilucin del suero del pctenle (Keren, 1999). Cualquiera de las dos tc
nicas puede aplicarse a otros fluidos corporales, siendo la orina el ms comn. Se p
ueden detectar cadenas ligeras monoclonales en la orina (protena de Bence Jones)
de ms de la mitad de los pacientes con mieloma mltiple (Isobe. 1971; Wells. 1974).
Cadenas ligeras policlonales pueden detectarse en pacientes con otros trastorno
s, normalmente formando parte de molculas de inmunoglobulina completas. La detecc
in de la protena de Bence Jones por calor se describe en el Capitulo 18. L a IEP/I
EF de orina es ms especfica y ms sensible que otros ensayos de Bence Jones ms antigu
os. Se pueden realizar IEP/IEF en muestras de orina con suficiente proteina o tr
as concentracin por liofilizacin o mediante membranas selectivas (Minicon, Amicon)
. La medida de la viscosidad del suero se estudia en el Captulo 27.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis (IEP) y la electroforesis con inmunofijacin (IFE) son muy
tiles en la deteccin de protenas monoclonales. Asi, en pacientes que presentan sig
nos sospechosos, sntomas o especialmente cuando se detectan signos hematopatolgico
s en sangre perifrica, mdula sea o ganglios linfticos, un IEP puede dar un diagnstico
. El que una electroforesis de proteina srica deba preceder a una IEP o IFE depen
de de la disponibilidad relativa de estas tcnicas y de la sofisticacin de cada lab
oratorio. Por ejemplo, una electroforesis en agarosa de protenas sricas detecta la
mayora de los componentes M. Sin embargo, la electroforesis en papel o acetato d
e celulosa no es tan sensible. Otro modo de seleccionar sueros para IEP o IFE es
revisando las determinaciones electroforticas de las protenas sricas. Otra manera
de abordar el anlisis sugerida por Keren y sus colaboradores (Keren, 1988) consis
te en determinar los valores del suero y la relacin K/X conjuntamente con una ele
ctroforesis de alta resolucin. La inmunofijacin del suero se realiza si no se dete
ctan anomalas en la electroforesis, ni hipergammaglobulinemia, ni hipogammaglobul
inemia. y si la relacin K/X no se encuentra dentro de los valores de referencia.
Tambin se recomienda la inmunofijacin del suero cuando la relacin K/X es normal per
o aparece una banda no identificada en la electroforesis. L a IEP es una tcnica s
ensible y relativamente sencilla empleada para detectar componentes M y sus cade
nas pesadas y ligeras. Permite una semicuantificacin de la concentracin de las inm
unoglobulinas. El suero de pacientes se debe comparar con sueros "normales" o un
grupo normal". Por ejemplo, de muestras de 100 a 200 mi de individuos sanos, se
hacen porciones de 1 mi que se congelan rpidamente en hielo seco y acetona y se c
onservan a -70 C. El suero control que no se ha utilizado no se vuelve a congelar
sino que se tira tras mantenerlo durante 3 dias a 4 C.

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

I
v

Figura 37-7. Presencia de inmunoglobulinas demostrada mediante inmunofijacin del

suero Se sometieron por duplicado muestras de suero de un paciente a una electro
loresis en geles de agarosa a pH 8.6. Las protenas separadas reaccionan con un an
tisuero monoespecilico, los geles se lavaron, fijaron y tieron. SP o SPE = muestr
a que no ha sido lavada o que no se ha sometido a reaccin con el antisuero: G o I
gG = muestra que ha reaccionado c o n anti-lgG: A o anti-lgA = muestra que ha re
accionado c o n IgA: M o anti-lgM = muestra que ha reaccionado con anli-IgM. K o
anti- = muestra que ha reaccionado con anti- ;Loanti- - muestra que ha reaccion
ado con anti- . A. "normar. B Componentes M de IgG-K (2). C. Componente M de IgA
- . D. componente M de IgM- . E. componente M de cadena F. componente M de caden
a .
Prevencin de las enfermedades y terapia
La inmunizacin pasiva es la administracin de anticuerpos preformados obtenidos de
otro individuo de la misma especie ( -globulinas homologas) o de una especie dif
erente ( -globulinas heterlogas); proporciona una proteccin inmediata frente a la
infeccin. La inmunidad dura poco y decae a medida que los anticuerpos se utilizan
y catabolizan. La proteccin pasiva durante el periodo neonatal se basa en la tra
nsferencia de anticuerpos maternos a travs de la placenta o el calostro (Penningt
on. 1991). Grupos de -globulinas humanas son tiles para la proteccin temporal fren
te a varias infecciones vricas o bacterianas (Berkman, 1990; Hammarstrm, 1990; Des
ai, 1991). Dependiendo de la dosis empleada y el momento de administracin, la enf
ermedad puede modificarse a una forma ms suave o puede prevenirse por completo. E
l efecto es ms completo y predecible si se usan preparaciones hiperinmunes prepar
adas a partir del plasma de individuos que estn convaleciendo de la enfermedad en
cuestin o que se han inmunizado
frente a ella recientemente. Estas preparaciones contienen una concentracin ms ele
vada de anticuerpos especficos. Tambin se pueden producir anticuerpos en animales,
como pueden ser los caballos, y en el pasado han tenido una importante aplicacin
. Sin embargo, la sensibilizacin a protenas externas puede desencadenar reacciones
clnicas como la anafilaxis, enfermedad del suero, pirexia y reacciones de Arthus
locales. Los anticuerpos monoclonales han revolucionado muchas reas de la medici
na, incluyendo la investigacin, diagnstico y terapia. Se han desarrollado anticuer
pos murinos, humanos y humanizados (Lefrano, 1990: Mountain, 1992: Morrison, 199
2; Ward. 1992; Shin, 1993). Muchos anticuerpos monoclonales. que a menudo reempl
azan a los antisueros policlonales. se usan con fines diagnsticos (Vase Cap. 35).
Quizs las aplicaciones teraputicas ms importantes se ven en el campo del trasplante
y la oncologa (Neame. 1994; Stevenson. 1990: Vitetta, 1993). OKT3. un anticuerpo
monoclonal munno frente al receptor CD3 de linfocitos, a menudo se emplea c o m
o terapia antirrechazo para bloquear la actividad de linfocitos T citotxicos en

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

891
Isobe T. Osserman EF: Pathologic conditions associated with p l a s m a cell dys
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ciente es el uso de un anticuerpo monoclonal frente al factor de necrosis tumora
l u para prevenir las reacciones de Jarisch-Herxheimer resultantes del tratamien
to con antibiticos en el caso de infecciones por Borrelia en ovejas (Fekade. 1996
). Anticuerpos monoclonales anticitocinas y antimolculas de adhesin de neutrfilos p
ueden resultar efectivos en condiciones asociadas con inflamacin aguda y liberacin
de cilocinas, por ejemplo, inhalacin de cido, isquemia o heridas de reperfusin (in
farto de miocardio, choque hemorrgico, reparacin de un aneurisma artico); y anticue
rpos que inhiben la adhesin de neutrfilos pueden resultar efectivos en el tratamie
nto de asma, fibrosis pulmonar, meningitis y malaria cerebral. Parece razonable
esperar que una multitud de aplicaciones teraputicas aparezcan en el luluro, en q
ue se disearn anticuerpos monoclonales que modulen las acciones de uno o ms mediado
res naturales de inflamacin, infeccin o proliferaciones malignas.

C A P T U L O
38
1
Complemento y cininas: mediadores de la inflamacin

Eric Wagner, PhD. Haixiang Jiang, M.D., PhD Michael M. Frank, M.D.
ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO Nomenclatura C3: molcula central d
e las vas de activacin del complemento Va clsica Va alternativa Va de la lectma fijad
a maosa Componentes finales del complemento Anafilotoxinas Regulacin de la activa
cin del complemento Receptores del complemento Biosntesis del complemento Gentica d
el complemento Complemento e inmunidad adquirida DEFICIENCIAS GENTICAS DEL COMPLE
MENTO EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN L
OS ESTADOS DE ENFERMEDAD Enfermedades reumatolgicas Enfermedades infecciosas Enfe
rmedades renales BIBLIOGRAFA 910 903 903 902 Enfermedades dermatolgicas 892 Enferm
edades hematolgicas Enfermedades neurolgicas Enfermedades cardiovasculares Biocomp
atibilidad Trasplante de rganos UTILIDAD CLNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO
ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales Evaluacin funcional de la va clsica M
anejo de las muestras Preparacin de eritrocitos Preparacin de eritrocitos de oveja
sensibilizados con anticuerpos Ensayo del complemento hemoltico total Ensayo de
la va alterna Niveles del complemento mediante ensayos antignicos Prueba de fijacin
del complemento CININAS Y SISTEMA DE GENERACIN DE CININAS 910 906 906

ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO

El trmino "complemento" se refiere a un grupo de glicoprotenas circulantes que fun
cionan facilitando la inflamacin y realizan un importante papel en la defensa del
husped. El dao tisular incontrolado es una posible complicacin de la activacin del
complemento, y existen una gran variedad de glicoproteinas circulantes as c o m o
protenas tisulares de unin a membrana que funcionan regulando la actividad del co
mplemento y disminuyen la agresin del complemento. La existencia de este sistema
de protenas fue inferido en los ltimos aos del siglo xix cuando qued claro que el su
ero fresco tena la posibilidad de lisar bacterias Gram negativas y vibriones clera
en presencia de anticuerpos especficos. A medida que las tcnicas para la purifica
cin y la identificacin de protenas se hicieron ms sofisticadas con los aos, qued clar
que haba un sistema muy complejo con muchas protenas interaccionando. En general,
el sistema funciona identificando clulas y microorganismos extraos y destruyndolos
Esto ocurre por lisis directa, por opsonizacin (el proceso de cubrirlos con pptid
os especficos del complemento reconocidos por receptores especficos de los fagocit
os para producir su ingestin) o provocando inflamacin con la atraccin de clulas fagocitos. Tambin ha quedado claro que el complement
o juega un papel para facilitar la respuesta inmune. El sistema de protenas del c
omplemento es ms antiguo filogenticamente que la inmunidad adquirida (anticuerpo)
y est presente en muchos organismos primitivos. Presumiblemente, proporciona un n
ivel de inmunidad natural y defensa del husped incluso en ausencia de anticuerpos
. Esto lo hace a travs de la va de la de lecitina unida a manosa (MBL) y la va alte
rnativa del complemento, que se tratan mas adelante. Los anticuerpos proporciona
n un nivel de especificidad aumentado y aumentan la eficacia mediando la defensa
del husped. En otras obras se puede encontrar una detallada historia del descubr
imiento del complemento y de las diferentes vias del complemento (Frank. 1998).
Nomenclatura
Hay tres vias pnncipales de activacin del complemento en el suero humano: la va cls
ica, la va alternativa y la via de la MBL (o va de la MBLectina). La Figura 38-1 m
uestra la secuencia de reaccin de cada va. La Tabla 38-1 proporciona informacin esp
ecifica sobre cada proteina del complemento plasmtica La nomenclatura para las pr
otenas del sistema del complemento

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

893
C5b678(9)n
Complejo de alague de membrana
Figura 38-1. Los componentes de las vas clsica, MBIecitina y alternativa convergen
para formar una convertasa que degrada al C3. En la via clsica, el complejo anti
geno-anticuerpo se une y activa secuencialmente al C1,C4y C2. En la va de la MBIe
ctina, la interaccin de la MBL con un carbohidrato en la superficie de un microor
ganismo origina la formacin de un complejo enzimtico (MBL-MASP-l-MASP-2, llam a d
o M en la figura) que se une y activa al C4 y al C2. En la via alternativa, el C
3 sufre la hidrlisis de su enlace tiol-sler. lo que induce un cambio en su conform
acin. Entonces se une al factor B (B), que es degradado por el factor D (D) para
formar una convertasa que es estabilizada por la properdina (P). El C3b, el prod
ucto de degradacin del C3, tambin tiene un residuo tiol-ester degradado y es capaz
de activar la via alternativa. La convertasa con C3b de todas las vas contina sec
uencialmente mediante la unin con los componentes de aparicin final hasta que la s
ecuencia de activacin se completa.
generalmente sigue dos convenciones (WHO. 1968: IUIS-WHO. 1981). Por razones his
tricas, las nueve protenas de la va clsica se nombran por la letra C seguida del nmer
o que cuenta su orden de aparicin en la secuencia de reaccin. Una excepcin importan
te es C4, que aparece antes que C2. Las molculas que son parte del complejo C1 se
denominan Clq, Clr y Cls. Las protenas que reaccionan nicamente en la va alternati
va son llamadas factores y se denominan con una letra mayscula (p. ej., factor B.
factor D). Adems, los fragmentos de las protenas del complemento resultantes de l
a ruptura proteoltica se denominan con una letra en minscula (p. ej.. C4a, C4b) do
nde a representa el fragmento pequeo y b representa el fragmento grande. La excep
cin a esta regla es C2, donde C2a es el fragmento grande y C2b es el fragmento pe
queo. Los posteriores fragmentos degradantes de los fragmentos grandes del comple
mento en un componente son denominados con una letra en minscula (p. ej., C3c, C3d). Los componentes que han perdido
su actividad normalmente se denominan con un prefijo con i minscula (p. ej.. iC3
b, iC4b). Las cadenas polipeptdicas de la protena nativa del complemento se denomi
nan con letras griegas (r/.. |5. y) excepto para el Clq, cuyas cadenas son denom
inadas A, B y C. Los componentes simples o complejos multicomponentes que tienen
actividad enzimtica se denominan con una barra sobre el componente o los compone
ntes. Las protenas de la recientemente descrita va MBLectina son denominados con l
as abreviaturas de los nombres de las protenas (p. ej., MBL para lectina lijada a
maosa, MASP para la proteinasa srica asociada a la MBL). Las protenas reguladoras
son denominadas con un ltulo o una letra descriptiva (p. ej.. protena unida a C4,
factor H). Las protenas reguladoras de unin a la membrana han sido denominadas con
nmeros CD y ttulos descriptivos (p. ej., protena

894
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
Tabla 37-8
Protenas del c o m p l e m e n t o en el plasma h u m a n o P e s o molecular (kD
a) 185 460 85 85 205 102 93 24 55 (monomoro) 200-400 93 7 C 190 110 too 150 70 1
05 550 88 150 84 70 20 Localizacin c r o m o s o m i c a 19p13.3-p132 1p34.1-36.3
12p13 12p13 6p21.3 6p21 3 6p2t 3 Desconocido Xpl 1 4-p 11 2 10p11 2-q21 3q27-28
1p36 3-36.2 9q33 5p13 5p13 1p32 (cadenas u y ) 9q22 3-q32 (cadena y) 5p13 11q11q13.1 1q32 4q25 1q32 17q11 Desconocido Desconocido Concentracin (mg'ml) 1 200-1.3
00 150 50 50 300-600 20 200 2 25 0.002-10 1,5-13 Desconocida 80 45 90 55 60 240
250 35 300-450 500 50 -5,4
Proteina Comn a todas las vias C3 Via clsica C1q Cir C1S C4 C2 Via alternativa Fac
tor B Factor D Properdina Va MBLecitina MBL MASP-1 MASP-2 Complejo de ataque a la
membrana C5 C6 C7 C8 C9 Protenas de control C1inh C4bp Factor I Factor H Protein
a S Clusterin Factor J
En presencia de un a c e p t o r adecuado, el tiol-ster interno p u e d e no sufr
ir la hidrlisis y degradarse, p e r op u e d er e a c c i o n a r con un nuclefilo
en u n a clula diana p a r af o r m a r una unin a m i d a o ster con el s u s t r
a t o diana del c o m p l e m e n t o de ataque. De e s t em o d o ,l a activac
in del C3 con la c o n s i g u i e n t e degradacin del tiol-ster p u e d e origina
r una unin c o v a l e n t e de l a molcula de C3 a ia superficie de la clula diana
. C3: molcula central de las vas de activacin As queda cubierta una diana con C3b. p
udiendo interaccionar con las cludel complemento las q u ee x p r e s a nr e c e
p t o r e sd e C3b. E s t a s incluyen t o d o sl o s fagocitos, l o s La protena
la m a d a C3 es f u n d a m e n t a lp a r a la funcin de las tres vias de linf
ocitos B y una poblacin de linfocilos T, activacin del c o m p l e m e n t o (la v
ia de la MBLectina, la via alternativa y la va El C3, c o n su c a d e n a a' uni
da c o v a l e n t e m e n t e a la diana y la c a d e n a \i clsica) y la compre
nsin del C3, su m e c a n i s m o de accin y sus funciones es unida debido a la un
in disulfuro intracatenaria. se d e n o m i n a C3b (Fig. 38-2). esencial p a r a
c o m p r e n d e r la activacin y la funcin de t o d a s las vias del c o m Es la
f o r m a en la q u e el C3 contina la c a s c a d a del c o m p l e m e n t oc
o n d u c i e n plemento. do a la lisis. Adems, de e s t a forma, la molcula p u e
d ei n t e r a c c i o n a r con las El C3 es una molcula de dos cadenas sinteti
zada en m u c h a s clulas, pard o s glicoproteinas circulantes, l o s factores H
e I. s i e n d o la s e g u n d au n a enzit i c u l a r m e n t e en los hepat
ocitos. f o r m a d a a partir de una molcula de c a d e n a m a proteoltica que d
egrada el C3 de la sangre. En la interaccin con los f a c nica, el pro-C3, y liber
ado a la circulacin. Las dos c a d e n a s (a y p) estn tores H e I. un pequeo frag
mento, el C3f, de 3 kDa. es liberado, s i g u i e n d o estabilizadas p o rp u e
n t e s disulfuro m t r a c a t e n a r i o ,yh a y un p u e n t e disulfuro d
o s degradaciones adicionales de la c a d e n a a en u n ac u r v a disulfuro d
e n t r o intercatenario estabilizando la interaccin de la c a d e n a a y la p (
Fig. 38-2). de la c a d e n aq u ec o n e c t a las p o r c i o n e sa m i n oyc
a r b o x i t e r m i n a l de la c a d e Las i n t e r a c c i o n e s hidrofbi
cas son tambin importantes, y la reduccin de los na a' (Fig. 38-2). Debido a las d
iferentes u n i o n e s disulfuro, la mayora del p u e n t e s disulfuro i n t r
a c a t e n a n o no origina la separacin de las c a d e n a s en C 3 bp e r m a
n e c e unido a la diana del c o m p l e m e n t o . ausencia de agentes que rom
pan la interaccin hidrofbica. Una vez realizada la degradacin del C3b p o r los f a
c t o r e s H e I. todava En la c a d e n a a del C3. hay un tiol-ster u n i e n

d o el sulfhdrilo de la c i s t e r n a ocurre otro c a m b i o conformacional. E

s t a molcula, a h o r a la m a d a iC3b. interen la posicin 988 con un residuo d
e glutamina de 3 aminocidos. E s t e tiol-ster a c c i o n ap o b r e m e n t ec o
n el CR1. el r e c e p t o r C3bC4b. p e r oi n t e r a c c i o n ac o n intern
o confiere una estructura inestable a la molcula de C3 El tiol-ster interla integr
ina p\, C R 3 (CDl1b CD18). El i C 3 b ya no p u e d ei n t e r a c c i o n a rc
o n las n o est o c u l t o en el c e n t r o hidrofbico de la molcula. P u e d e
ser d e g r a d a d o por protenas de la p a r t e final del c o m p l e m e n t
op a r a inducir la lisis. la hidrlisis gradual a m e d i d a que el a g u ap e n
e t r a en la molcula. Es degradaIgual q u ec o n el C3b. el iC3b facilita la fa
gocitosis u n i e n d o la d i a n a del c o m do m u c h o ms rpidamente una vez
d e g r a d a d a la c a d e n a alfa del C3 con libep l e m e n t o a los fagoc
itos m e d i a n t el o sr e c e p t o r e s de iC3b. E s t o si n c l u y e n r
acin del C3a ( f r a g m e n t o de 9 kDa) en el e x t r e m oa m i n o t e r m i
n a l de la c a d e t o d o s los lagocilos y los macrfagos, p e r o no i n c l
u y e n los linfocilos B o l a s na a. La c a d e n ar e s t a n t e se la m a a
'. El C3 nativo, p r e s e n t e en 1 , 2m g ' m l en clulas T. En p r e s e n c
i a de CR1, el C3b y el iC3b p u e d e ns u f r i rp o s t e r i o r e s el p l
a s m a normal, no i n t e r a c c i o n a con las clulas que e x p r e s a nr e
c e p t o r e s de d e g r a d a c i o n e s por el f a c t o r I. En ese caso,
una degradacin a d i c i o n a l se proC3. Sufre una gran alteracin c o n f o r m
a c i o n a l con la degradacin del tiol-ster d u c e en la porcin amino-terminal d
e la c a d e n a (/.. Una porcin de 4 1 k D a de interno. El C3 con el tiol-ster h
idrolizado interacta con las clulas que e x p r e la c a d e n aau n i d a por enl
aces a m i n o o ster a la diana p e r m a n e c e detrs, y s a nr e c e p t o r e
s de C3b. e s p e c i a l m e n t eC R 1 (receptor C3b C4b, CD35). es liberado
el C3c. q u ec o n t i e n e las p o r c i o n e sa m i n o t e r m i n a lyc a
r b o x i t e r
c o f a c t o r de m e m b r a n a .C D 4 6 ) y los receptores del c o m p l e m
e n t os o n denom i n a d a s con nmeros que siguen al pretijo CR (para los r e
c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o 1 a 4). L o s otros r e c e p t o r e
s del c o m p l e m e n t o se d e n o m i n a nc o n smbolos del c o m p l e m
e n t os e g u i d o s por la letra mayscula R.

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

895
mnal del C3b. u n i d a s por un disulfuro entre ellas, y unida por un disulfuro
a c o n v e r t a s a de la va alternativa descrita antes, d e g r a d a las molcu
las adiciola c a d e n a |5 (Fg. 38-2). La porcin r e s t a n t e unida c o v a l
e n t e m e n t e a la diana nales del C3 c o n t i n u a n d o la c a s c a d a
del c o m p l e m e n t o {vide mira). se d e n o m i n aC 3 d gyp u e d e sufr
ir una posterior degradacin a C3d. De nueD a t o s recientes sugieren que existe
una va M B L e c i t i n a que acta via M B L vo, e x i s t e un r e c e p t o r e
specfico p a r a el C3d y p a r a el C 3 d g (CR2, CD21). y serin proteasas la m
a d a s MASP-1 y MASP-2 ya sea p a r a la degradacin E s t er e c e p t o r est p
r e s e n t e en t o d o s los I m f o c i t o s B, en a l g u n o s linfocitos
T d i r e c t a del C3 por una de las e n z i m a sM A S Pop a r a la activacin d
e la va cly en a l g u n a s clulas epiteliales, pero no est p r e s e n t e en los
fagocitos. Se s i c a para formar la C3 c o n v e r t a s a de la va clsica. En c
u a l q u i e r caso, el C3a analiza c o n ms detalle posteriormente. se degrada
de C3. El tiolster es degradado y la molcula entonces es c a p a z de unirse a las
dianas. D e b eq u e d a r claro que el C3 sufre una hidrlisis o la El C3 en su
configuracin nativa no a c t i v a la via alternativa. Sin embargo, escisin a C3b,
una posterior degradacin a iC3b, y despus l ap o s t e r i o r el C3 (H 0) (tambin
la m a d o iC3) y el C3b interaccionan con los factores e c e p t o r e s celul
ares i n t e r a c c i o n a n p r o t e i c o s D, B y properdina de la via alt
ernativa para f o r m a ru n an u e v a enzi- degradacin a 3dg y a C3d. Los difer
entes r t a p a s especficas en la va de degradacin. m a , el C3bBb. la convertasa
da la va alternativa. Esta enzima es c a p a z de con el C3 en e d e g r a d a rp
o s t e r i o r m e n t e el C3 separando la c a d e n a a de las molculas adiD
e este m o d o ,e lC 3r e p r e s e n t al a proteina central d el a s tres vias
del c o m c i o n a l e s del C3 nativo. La hidrlisis interna gradual del C3 a C
3(H-,0). por lo plemento. La proteina no interaccona con ningn r e c e p t o r en
su l o r m a natitanto, p u e d em e d i a r la activacin de la va alternativa a c
t i v a n d o el C3 a una va. D e b es e r hidrolizada p a r a activar la va alt
ernativa e m t e r a c c i o n a rc o n los configuracin hidrolizada de C3. u n i
e n d o los factores B. D y properdina y r e c e p t o r e s de C3b. La separac
in del C3a de su c a d e n aap r o d u c e el m i s m o d e g r a d a n d o molcul
as adicionales de C3. Esto se d e n o m i n a "seal" interna efecto. E s t op u e
d e ocurrir a travs de la activacin de c u a l q u i e r a de las tres y se c r e
e que es b a s t a n t ei m p o r t a n t e en la activacin inicial del C3 por l
a va vas del complemento. L a posterior degradacin, c o m o se describi, conlleva al
ternativa. a una progresiva interaccin con los r e c e p t o r e s en diferentes
e t a p a s de las clulas p r e s u m i b l e m e n t em e d i a n d o la fagocit
osis por un l a d o y la regulacin El a n t i c u e r p o y los c o m p o n e n t
e s de la va clsica originan la produccin de de la r e s p u e s t ai n m u n ep o
r el otro. una va clsica C3 convertasa en la superlicie de las dianas, que, c o m
o la C3
2
Figura 38-2. S e c u e n c i ad e degradacin del
l p e s om o l e c u l a ra p r o x i m a d od ec
n t o se da en kilodaltons. L a se n z i m a sy c
a b l e s de c a d a degradacin ( d e s i g n a
on: A. C3 c o n v e r t a s a : B, f a c t o rHoC
a c t o r I; D, tripsina, e l a s t a s aop l a s

C3 e i n a c t i vacin del C3b. E

a d a c a d e n aof r a g m e
o f a c t o r e sr e s p o n s
d o s en l e t r a s maysculas) s
R 1+f a c t o r I; C. C R 1+f
m m a .

896 Va clsica
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
La activacin de la via clsica del complemento, descrita alrededor del ao 1 9 0 0 .
fue la p r i m e r a en s e r estudiada. E s t a via es r e s p o n s a b l e de
la activacin del c o m p l e m e n t o en la mayora de las clulas sensibilizadas c
on anticuerpos. L o s detalles de e s t a va estn publicados en otras obras (Volan
akis. 1998: Fries, 1987). N u e v e protenas n u m e r a d a sc o m p o n e n la
va clsica. La activacin de la via clsica n o r m a l m e n t e requiere la interaccin
entre un antg e n o y un anticuerpo fijador de C1. En humanos, solo la inmunoglo
bulina M (Ig M ) y la Ig G son efectivas en a c t i v a r la via clsica. L a efic
acia de la activacin d e la va clsica por las subclases de Ig G es la siguiente: Ig
G3>lg G1>lg G2; la Ig G4 no es c a p a z de activar el c o m p l e m e n t o .I
n t e r e s a n t e m e n te, un nmero d e molculas, diferentes d e las inmunoglo
bulinas. tiene la c a p a c i d a dd ea c t i v a r la via clsica a travs de la in
teraccin d i r e c t a con el C1q. E s t a s incluyen la prolena C reactiva, el c
o m p o n e n t e srico del amiloide P, el fi-amiloide. a l g u n a s bacterias g
r a m negativas, ciertos virus, el m i c o p l a s m a , protozoos y c o m p o
n e n t e s intracelulares c o m o el ADN, las m e m b r a n a s m i t o c o n d
r i a l e syl o s filamentos del ciloesqueleto (Gewurtz. 1993). Interesant e m
e n t e , las clulas apoptticas se unen al C1q (Korb, 1997) y tienen la capaL ac a
p a c i d a dd e las i n m u n o g l o b u l i n a sa g r e g a d a sp a r au n
i re l Ciq h ap r o cidad de activar la va clsica. Esto p u e d e ser de importan
cia crtica en la elip o r c i o n a d o las b a s e s para un nmero de p r u e b a
s diseadas p a r ad e t e c t a rl a minacin de las clulas apoptticas de la circula
cin. p r e s e n c i ad ec o m p l e j o si n m u n e s solubles e n las m u e s
t r a sd es a n g r ed e los pacientes. El C1q r a d i o m a r c a d o se aade a
la m u e s t r a de s u e r o o de p l a s m a , N o sc e n t r a r e m o s en l
a activacin del c o m p l e m e n t oc o m os u c e d e en las diax i s t e n t e
sp a r as e p a r a r el Ciq libre del u n i d o a los n a s sensibilizadas a a
nticuerpos. U n av e zu n i d a la i n m u n o g l o b u l i n a al objetivo, y
se usa una de las tcnicas e c o m p o n e n t e sp r o t e i c o s del suero. El
Ciq u n i d os u g i e r e la p r e s e n c i a de c o m el C1 se u n e a la i n
m u n o g l o b u l i n a y se activa. La n a t u r a l e z ap r e c i s a de l
a interplejos de i n m u n o g l o b u l i n a s en la m u e s t r a de suero o
de p l a s m a (Zubler. 1 9 7 6 ) . accin antgeno-anticuerpo-C1 n o est clara. El C
1 es u n a macromolcula d e 740 kDa que c o n s t a de una molcula s i m p l e de
C1q c o m p l e j a con dos c a d e n a s C 1 r y dos c a d e n a s C1S unidas t
o d a s en p r e s e n c i a de iones calcio. El C1q est Va alternativa f o r m a
d op o r seis subunidades, c a d au n ac o n t e n i e n d o tres c a d e n a s
polipeptdicas ( d e s i g n a d a s A. B y C). Las tres c a d e n a sf o r m a n
una triple hlice p a r e c i d a al La presencia de u n a segunda va de activacin
del c o m p l e m e n t o fue colgeno con r e g i o n e s globulares que constitu
yen la porcin carboxi-terminal de propuesta p o r primera v e zp o r Piilemer (19
54) pero fue a c e p t a d ap o r la la molcula. El C1q se u n e a las inmunoglob
ulinas a travs de sus cabezas glo- comunidad cientfica dos dcadas despus. Esta va de
activacin del combulares, m i e n t r a sq u e se u n e a otros a c t i v a d o r
e s de la va clsica c o m o la prop l e m e n t o parece s e r importante en la d
efensa precoz contra los m i c r o o r teina C reactiva y el ADN a travs de su re
gin p a r e c i d a al colgeno. L a sc a d e ganismos patgenos (Pangburn. 1984). Lo
s anticuerpos pueden activar la n a s C1r y C1S se u n e n a la regin similar al
colgeno del C1q. Se s a b e que el via pero n o r m a l m e n t e no s o n necesa
rios. El comienzo de la via alternativa p r i m e rc o m p o n e n t e de la via
clsica, el Ciq. se une al d o m i n i o Cy2 de la Ig G o en la superficie de un
a c e p t o rd e p e n d e de la capacidad del g r u p o carbonil al d o m i n i

o Cu3 de la Ig M. U n av e zu n i d o a la i n m u n o g l o b u l i n a , el C
1 qa d o p t a del grupo tiolster e x p u e s t o del C3b d e interaccionar ya s
ea con un grupo un c a m b i oc o n f o r m a c i o n a l que conlleva la autoac
tivacin de las dos c a d e n a s a m i d a o con uno hidroxilo de la protena o del
carbohidrato p r e s e n t e en la C1r. S ec r e e que e s t o origina la degra
dacin de las dos c a d e n a s C1r p a r ac r e a r superficie del objetivo (Law,
1979). La generacin del C3b se consigue por un s i t i oa c t i v o enzimticament
e e nc a d ac a d e n a . El C1r a c t i v a d o se e s c i n d e la denominada
C3 convertasa de iniciacin. En el suero, el C3 es hidrolie n t o n c e s en d o s
c a d e n a s C1s. E s t e C1 "activado" es u n ap r o t e a s a y tiene a d e zado a un ndice de 0,2% a 0,4% del depsito plasmtico por hora (Pangms, en a l g u n
o ss i s t e m a sm o d e l o , actividad estearasa. El C1s aclivado d e g r a burn, 1981). El C3 con un tiolster hidrolizado sufre un c a m b i o conformada e
l s i g u i e n t ec o m p o n e n t e de la c a s c a d a , el C4. El f r a g m
e n t om a y o r , C4b, se cional que le permite interaccionar con las protenas
que n o interaccionan une a la superficie del a c t i v a d o r ,m i e n t r a s
que el f r a g m e n t o pequeo, el C4a, es con el C3 nativo y se d e n o m i n
a C3(H,0) (tambin lamado iC3). El 03(^0) l i b e r a d o en la f a s e de fluido.
El C 4 a es u n a anafilotoxina y se d e s c r i b e en o t r a entonces tiene
la capacidad de interaccionar c o n el factor B en p r e s e n c i a seccin de es
te captulo. El C4b es a l t a m e n t e n t e reactivo qumicamente durande iones m
agnesio. El factor B. u n av e z unido al C3(H,0), p u e d e interacte u n o sm
o m e n t o s despus de la degradacin del C 4yp u e d e unirse a la s u p e r - ci
onar c o n el factor D y es degradado p a r a generar la convertasa de inificie
del a c t i v a d o r .L a unin a la superficie del a c t i v a d o r es r e l a
t i v a m e n t e ineficaz. ciacin C3(H;0)Bb y liberar un pequeo fragmento, el Ba.
E s t a degradaPor lo tanto, la mayora del C4b g e n e r a d o es hidrolizado y
p e r m a n e c e en la fase cin e sm e d i a d ap o r el factor D, u n a proteas
a srica q u ea d o p t au n a de fluido. De c u a l q u i e rm a n e r a ,a l g u
n a s de las molculas de C4b g e n e r a d a s se configuracin activa una vez rec
onocido su sustrato y vuelve a u n a conforu n e n a la superficie del a c t i v
a d o rc o m o un g r u p oa l r e d e d o r del l u g a r antgenomacin inactiva
una vez que se produce la degradacin proteoltica (Volaanticuerpo-Cl. Un lugar s i
m p l e antgeno-anticuerpo-C1 p u e d ee n t o n c e sc o n d u nakis, 1996). L a
convertasa de iniciacin C 3 degrada el C3 para g e n e r a r cir a la sedimentac
in de m u c h a s molculas de C4b. un C3b m e t a e s t a b l e a un ndice c o n s
t a n t e m e n t e bajo en la circulacin. El C 3 bm e t a e s t a b l ep u e d e
unirse covalentemente a la superficie del activador En p r e s e n c i a de ion
es magnesio, el C4b acta c o m o un lugar para la unin y entonces, c o m o el C3(H
0). unirse al factor B. Se ha propuesto q u e la yp o s t e r i o r degradacin d
el C2. El C1s, en asociacin con el C4b. d e g r a d a el presencia de cido silico e
n las glicoprotenas y glicolpidos asociados a C2 en d o sf r a g m e n t o s . El
f r a g m e n t om a y o r . C2a, p e r m a n e c e unido al C4b, la m e m b r a
n a previene la formacin de una C3 c o n v e r t a s a de la va alterm i e n t r
a s que el pequeo, el C2b. se libera en la f a s e liquida. Esle c o m p l e j o
nativa a u m e n t a n d o la afinidad del f a c t o r H (vase despus en Regulacin
m o l e c u l a r( C 4 b 2 a ) es i n e s t a b l e y tiene u n av i d am e d i
ar e l a t i v a m e n t ec o r t a debide la activacin del complemento) para el
C3b (Kazatchkine, 1979). C o m o do a la desintegracin que resulta de la disociac
in de C2a en una f o r m a inacen l a C3 convertasa de iniciacin, el factor D degr
ada al f a c t o rBp a r a tiva. E s t ec o m p l e j o (C4b2a) representa la c
o n v e r t a s aC 3 de la va clsica r e q u e generar la C3 convertasa de unin cel
ular C3bBb. Este c o m p l e j o se desinrida p a r a la unin y degradacin del C3.
El C2a en el c o m p l e j oC 4 b 2 a es la tegra rpidamente p e r o es estable
una vez unido a la properdina. que proe n z i m a que d e g r a d a el C3 en la
siguiente e t a p a de la c a s c a d a de activacin y longa la vida m e d i a de
la C3 convertasa de u n o a dos minutos a 18 minudel C 5e nu n ae t a p a poste
rior. E lC 2 ad e g r a d ae lC 3e nu nf r a g m e n t o grande, tos (Fearon, 19
75). Esta C3 convertasa estabilizada rpidamente degrada el C3b, que se u n e a la
s u p e r f i c i e del a c t i v a d o r , y un f r a g m e n t o pequeo, el ms

C3, que p u e d e unirse a la superficie del activador y e n t o n c e s se conC

3a. q u e es liberado en la f a s e de fluido y sirve c o m ou n a anafilotoxina
. C o m o sidera c o m o la amplificacin de la C3 convertasa de la va alternativa.
E s t a en el c a s o del C4. no t o d o el C 3 b se u n e a la superficie del
a n t i g e n o objetivo. amplificacin del C3b depositado en la superficie del a
c t i v a d o rp e r m i t el a E na l g u n o ss i s t e m a s modelo, a l r e
d e d o r del 5 % del C 3a c t i v a d os eu n ea l objeformacin de una C5 conver
tasa (C3b-BbP) (Kinoshita, 1988) que tiene la tivo. Adems, en a l g u n o sm o d
e l o s , un alto p o r c e n t a j e del C3 del objetivo se une
2 2 2 2
al a n t i c u e r p o Ig G c u a n d oe s t ai n m u n o g l o b u l i n a es l
a iniciadora de la activacin de la va clsica del c o m p l e m e n t o (Brown. 1983
). El n u e v oc o m p l e j og e n e r a d o (C4b2a3b) r e p r e s e n t a la C
5 c o n v e r t a s a de la va clsica y d i s p a r a la s e d i m e n tacin de los
c o m p o n e n t e s finales del c o m p l e m e n t o en la superficie diana.
La IgM y la IgG difieren en su c a p a c i d a dp a r aa c t i v a r la va clsica
del c o m plemento. P a r e c e que una molcula s i m p l es o b r et o d o de a
n t i c u e r p o s Ig M unida por mltiples lugares del anticuerpo a un antgeno p
u e d e unir una molcula de C 1 y disparar u n as e c u e n c i ac o m p l e t a
d e activacin del c o m p l e m e n t o . L a Ig M. con sus c i n c o sitios de u
nin antignicos, a d o p t au n a conformacin "bsica" en la superficie antignica p a r
a permitir mltiples interacciones con los antgenos. En contraste, la unin del C 1
a la Ig G requiere dos molculas d e Ig G una al l a d o de la otra en la mayora de
los e s t u d i o se x p e r i m e n t a l e s (Borsos, 1965). Ya q u e los ant
icuerpos Ig G se u n e nau n a superficie d i a n a de form a aleatoria y ya que
los antgenos p u e d e nn o ser distribuidos d ef o r m a unif o r m e en un o r
g a n i s m o diana, p u e d e ser n e c e s a r i a la unin de c i e n t o som
i l e s de I g Gs para generar un lugar de unin para el C1. La activacin de la va c
lsica por el c o m p l e j o Ig G-antgeno tambin p a r e c e facilitar la va a l t e
r n a t i v a (vase siguiente seccin) sobre la superficie del activador (Moore, 1
981).

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

897
embrago, es necesaria la insercin de mltiples copias de C9 a travs de la bicapa lipd
ica a travs de la interaccin inicial con la c a d e n a a del C8 p a r a producir
la c o m p l e t a actividad citoltica del M A C (Plumb. 1998). Se c r e e que el
c o m p l e j o C5b-8 sirve c o m o un iniciador para la polimerizacin del C9 en
Va de la lectina fijada a maosa la m e m b r a n a celular. El MAC, p o r microsc
opa electrnica, m u e s t r au n a estructura p a r e c i d a a un cilindro h u e
c of o r m a d ap o r el e n s a m b l a j e de sus R e c i e n t e m e n t e se
h a descrito una tercera via de activacin del c o m p l e c o m p o n e n t e se
n presencia d eu ne x c e s od eC 9 (Podack. 1984). E lm e c a m e n t o que ut
iliza una proteina srica, presente en alrededor d e1 . 5 ug mi. n i s m o por el
que el M A Cr o m p e la m e m b r a n a celular todava es c o n t r o v e r la M
B L (tambin lamada lectina unida a maosa o protena fijadora d e tido y p u e d e i
ncluir la distorsin d e la bicapa lipdica p a r af o r m a rp a r c h e s maosa). L
aM B L est presente en t o d o s los mamferos y pjaros, y peragujereados" (Esser,
1991) o, ms probablemente, la lormaan de un p o r o t e n e c e a la familia d e m
olculas lamadas c o l e c t m a s (Turner, 1996: Epst r a n s m e m b r a n a con
un c e n t r o hidroflico a travs del que los i o n e sp u e d e n tein, 1996). L
a familia de las colectinas incluye, adems de la MBL, las prop a s a r libremente
(Bhakdi. 1991). L a formacin del M A Ci n d u c e la lisis d e tenas del surfacta
nte p u l m o n a r A y D (SP-A, SP-D), la conglutinina bovina ciertas bacterias
y virus, y d e eritrocitos heterlogos. L a mayora d el a s y la CL-43 bovina (Eps
tein. 1996). La M B L est estructuralmente relacioclulas n u c l e a d a s resiste
n la citotoxicidad inducida p o r el MAC. E s t a pron a d ac o n el C1q. Su est
ructura primaria es u n ac a d e n a polipeptidica forteccin, e s p e c i a l m e
n t e del a t a q u e del c o m p l e m e n t op o r las protenas del m a d a po
r un ncleo colgeno y un dominio globular carboxi-termmal (Hanc o m p l e m e n t o
propias, es m e d i a d ap o r las molculas reguladores a s o c i a d a s sen, 1
998). T r e s de las c a d e n a s se asocian p a r a formar la subunidad de la
a la m e m b r a n a que previenen la formacin del M A C (vase despus Regumolcula. E
n el suero, la M B Ls ee n c u e n t r ac o m o una m e z c l ad e dmeros lacin de
la activacin del complemento) asi c o m o por la liberacin de proy hexmeros de su
subunidad primaria. L aM B Lr e c o n o c e ciertos carbohitenas del c o m p l e
m e n t o activadas p o r la s a n g r ed e la superficie celular. L a d r a t o
se x p r e s a d o s en la superficie de los m i c r o o r g a n i s m o s (es
decir, no lisis d e las clulas n u c l e a d a sm e d i a d ap o r el M A Cp u e
d e ocurrir p e r o r e c o n o c e carbohidratos c o m o la galactosa y el cido
silico que son los requiere mltiples lesiones por el M A C para producirse (Koski,
1983). Se na azcares terminales expresados en las glicoproteinas de los mamferos)
propuesto que la prdida d e cantidades subliticas d eM A Cp u e d ep r o t e g e
r (Epstein. 1996). En orden de importancia, los ligandos de la M B L son: a la
clula del consiguiente a t a q u e del c o m p l e m e n t o (Reiter, 1992). L a
s maosa, W-acetil-glucosalina, -fucosa, rv-acetil-manosamina y glucosa clulas nucl
eadas estn protegidas en parte de los efectos del M A C debido (Hansen, 1998). E
s t op e r m i t e a la M B L discriminar entre lo propio y lo a la eliminacin a
c t i v a de la superficie celular a travs de la reparacin de extrao. Se inform que
la M B L reaccionaba con un amplio n u m e r o de bacla m e m b r a n au n i d a
al r e c a m b i o lipidico (Mold, 1998). La formacin del M A C terias no c a p
s u l a d a sG r a m positivas y G r a m negativas, con virus, levadu- tiene un
efecto estimulante s o b r em u c h o s tipos de clulas nucleadas. E n t r e ras,
micobactenas. parsitos y protozoos (Epstein, 1996). U n a vez reconootros, estos
efectos incluyen la produccin de radicales reactivos del oxgec i d os u carbohidr
ato ligando, l aM B La d o p t au nc a m b i o conformacional q u e no por los n

eutrfilos y los macrfagos, la liberacin de ecosanoides por las c o n le v a la activ

acin d ed o s proteasas sricas asociadas a la MBL, la clulas tagociticas. la inducc
in de actividad p r o c o a g u l a n t ep o r las plaqueM A S P 1 y la MASP-2 (T
hiel, 1997). T a n t o la MASP-1 c o m o la MASP-2 t a s y las clulas endoteliale
s. la actividad proinflamatoria e n las clulas m u e s t r a n homologa estructura
l con el C1 r y el Cis, sugiriendo similitudes endoteliales y las clulas del mscul
o liso, la proliferacin d e clulas del c o n el complejo C1 (C1qrs). U n a vez act
ivada, la MASP-2 degrada el C4 msculo liso y de clulas endoteliales. y la iniciacin
de las vias d e transpara generar la C3 convertasa C 4 b 2 a (Vorup-Jensen. 199
8). La MASP-1 duccin de seales (Mold. 1998; Sims. 1995: Tudesco. 1997: Benzaquen.
tiene la c a p a c i d a d de degradar el C3 (Matsushita. 1998). sugiriendo q u
e 1994; Kilgore, 1996; Niculescu. 1999, 1993). e s t op u e d ed e s e n c a d e
n a r directamente la activacin de la va alternativa (Schweinle, 1989). Despus de
la generacin de la C3 convertasa de la va clsica, l a C4b2a, p o r el complejo MBLMARSP-1-MASP-2, la activacin Anafilotoxinas del c o m p l e m e n t os ep r o d u
c ec o m o en la va clsica con el posible reclutam i e n t o de la va alternativa
tambin (Suankratay. 1998). La via de la MBLeL a activacin de la va clsica, alternati
va o d e la M B L e c t i n a del c o m p l e citina tambin puede dispararse p o
r un complejo antgeno-anticuerpo Se m e n t o origina la generacin de los f r a g
m e n t o sp r o t e i c o s de! c o m p l e m e n t o demostr que una fraccin de
las molculas de Ig G que c a r e c e n de resique tienen i m p o r t a n t e sp a
p e l e s en diferentes f u n c i o n e s biolgicas c o m o la d u o s galactosa
terminal (llamados Ig G-GO), tal y c o m o se encuentran en opsonizacin. la fago
citosis, l a inmunomodulacin y l a generacin d er e a c el p l a s m a de paciente
s con condiciones patolgicas c o m o la artritis reuc i o n e s inflamatorias. L
a opsonizacin, la fagocitosis y la inmunomodulacin m a t o i d e . tienen la c a p
a c i d a d de interaccionar c o n la M B L y activar la va d e p e n d e ne ns
um a y o rp a n ed e los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t oe x p r e
s a d o s clsica (Malhotra, 1995). La M B Lp u e d e jugar un papel en la elimina
cin d e en las diferentes clulas del cuerpo, y se discuten en u n a seccin posterio
r. o r g a n i s m o s diana por los fagocitos a travs de la interaccin con un rec
epC o m os e discuti previamente, la activacin del c o m p l e m e n t o origina u
n a tor especfico p r e s e n t e en estas clulas (Hansen. 1998: T e n n e r . 19
95). L a degradacin proteolitica de m u c h a s protenas del c o m p l e m e n t o
c o n la consiregulacin d e la va de la M B L e c i t i n ap a r e c es e rm e d i
a d a por el Cl inhibiguiente liberacin en la f a s ed e fluido d e pequeos f r a
g m e n t o s que t i e n e n d o r (Matsushita. 1 9 9 6 )yp o r la cx-macroglo
bulina (Terai. 1995). efectos biolgicos. T r e s de e s t o sf r a g m e n t o s
liberados s e la m a n anafilotoxinas. S o n el C4a. el C 3 a y el C5a. L a s ca
raclerislicas e s t r u c t u r a l e syf u n c i o nales de estas molculas se de
scriben en un m l o r m ee x c e l e n t es o b r e el t e m a (Ember. 1998). El
C4a e s un pptido d e 8.7 k D a liberado del C 4 una v e z Componentes finales d
el complemento d e g r a d a d op o r el Cls . El C 3 a es un f r a g m e n t o
peplidico de 9 k D al i b e r a d o d u r a n t e la degradacin proteolitica sele
ctiva de la c a d e n a C3r/ p o r el C 2 a en Las tres vas principales d e activ
acin del c o m p l e m e n t o convergen en la la va de activacin de la C 3 convert
asa clsica y MBLectina. Tambin es libeactivacin del C3 y en el e n s a m b l a j e
del c o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a a d op o r la degradacin prot
eolitica del C3 p o r el pptido enzimticamente na (MAC), q u e est f o r m a d op o
r los c o m p o n e n t e s C5 a C9, U n a vez forma- r activo, Bb, en la via d
e la C3 c o n v e r t a s a alternativa. El C5a es un pptido d e das las c o n v
e r t a s a sd e la via clsica, de la M B L e c i t i n a (C4b2a3b) y de l a 1 1k
D a liberado de la c a d e n a a del C5 p o r la degradacin i n d u c i d ap o r
el C 2 a alternativa (C3b2Bb). el C5 es degradado. El f r a g m e n t og r a n
d e (C5b) pueo n v e r t a s a clsica o M B L e c t i n aop o r el B b (y quizs en
la de a s o c i a r s ec o n la m e m b r a n a celular e interaccionar c o n e
l C6. La siguien- en la va de la C5 c M B L e c t i n a ) en la va de la C5 c o n
v e r t a s a alternativa. En general, l a s anafilote e t a p a incluye la inte
raccin del c o m p l e j o C5b-6 con un fluido fase C7 forloxinas se definen p o
r sus e f e c t o s biolgicos s o b r e las clulas del msculo m a n d o un c o m p

l e j o trimnco con propiedades anfiflicas (alta afinidad p o r liso, los maslocit

os, los pequeos v a s o s sanguneos y los l e u c o c i t o s de s a n los constit
uyentes lipideos de la m e m b r a n a celular) (Podack, 1979). El C5bgre perifric
a. Los e f e c t o s especficos m e d i a d o sp o re s t o s pptidos i n c l u y
e n 7s e inserta en la b i c a p a lipdica de la m e m b r a n a celular pero no
e s sufie los m a s t o c i t o s y los basfilos c o n la c o n s i g u i e n t e
liberac i e n t ep a r aq u eo c u r r a la lisis celular. El C8 se a s o c i a
c o ne s t ec o m p l e j o tri- la degranulacin d cin de diferentes m e d i a d o
r e sc o m ol ah i s t a m i n a o la s e r o t o m n a . Adems, m o l e c u l a
r a travs de la interaccin con el C5b expuesto. El complejo C5b-8 inducen la agre
gacin neulroflica h u m a n a , la contraccin del msculo liso, el p e n e t r a a tr
avs de la b i c a p a lipdica p a r af o r m a r un pequeo poro transu m e n t o de
la permeabilidad vascular, la induccin d e la liberacin d et r o m m e m b r a n
ayp u e d e originar la lenta lisis de los eritrocitos (Ramm, 1982). Sin a
L 2 ? :
c a p a c i d a d de disparar la activacin de los c o m p o n e n t e s terminale
s del sist e m a del c o m p l e m e n t o .

898
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
b o x a n o de l o s macrlagos d e l conejilo de Indias, y la estimulacin de la Re
guladores del fluido sanguneo secreccin de m o c op o rl a s clulas c a l i c i f o
r m e s (Marn, 1985). Un e f e c t o i m p o r t a n t e de las anafilotoxinas s
obre los basfilos es originar vasodilatacin El control del p r i m e rc o m p o n
e n t e de la via clsica, el C1. est m e d i a d o a travs de la liberacin de histam
ina, c o n d u c i e n d o a un a u m e n t o del flujo sanpor el C1 inhibidor (
C1inh). El Clinh es una protena a l t a m e n t e glicosilada guneo en el l u g a
r de la inflamacin. La funcin del C4a g e n e r a l m e n t e es simid e1 0 5k D a
q u e tiene l ac a p a c i d a dd e disociar e lC 1a c t i v a d o (Davis. 1989)
. lar a la del C3a. S i ne m b a r g o , el C 4 a es m u c h om e n o s efectivo
en s u se f e c t o s El Clinh inhibe la autoactivacin del C1. la activacin del C
1 en el fluido sanbiolgicos s o b r e una b a s em o l e c u l a r . El C5a es si
n d u d a la ms p o t e n t e de las guneo, y la activacin del C1 en la s u p e r f
i c i e de los a c t i v a d o r e s de la va clanafilotoxinas h u m a n a s .P o
r ejemplo, e le f e c t o del C 5 ae s2 0 0v e c e sm a y o r s i c ap e r on o
e nl am a y o r i ad e los c o m p l e j o si n m u n e s (Doekes. 1983). E l Cl
inh q u e el del C 3 ay3 . 0 0 0v e c e sm a y o rq u e el del C 4 a originando
la contraccin es un inhibidor sern p r o t e a s a (serpin) que d i s o c i a el c
o m p l e j o C1 a c t i v a d o del msculo liso del leon del conejilo de I n d i
a sD e b e observarse, sin e m b a r unindose a las subunidades de C 1 ryC 1 s d
el complejo. M i e n t r a s el C 1 qp e r go, que la relativa efectividad de e
s t o s pptidos es t a n t o especfica de tejido m a n e c e en la superficie del
activador, el C 1 r y el C 1 ss o nl i b e r a d o s al fluido c o m od e especi
e. S eh as u g e r i d oq u ee lC 3 ae s efectivo s e l e c t i v a m e n t es o
b r es a n g u i n e oe nf o r m ad ed o sc o m p l e j o sd e Ciinh-Clr-Cls-Cl
mh (Ziccardi. los eosinfilos localizados en los l u g a r e s alrgicos, m i e n t
r a s que el C5a tiene 1979). R e c i e n t e m e n t e ,s ep r o p u s oq u ee
l Clinh tiene l ac a p a c i d a dd es e p a r a r e f e c t o en m u c h o s ot
ros tipos celulares (DiScipio. 1999). el c o m p l e j o Clqr s e n t e r o de l
a si n m u n o g l o b u l i n a sq u et i e n e nu n ab a j a afinid a dp o r
el Clq (Chen, 1 9 9 8 b ) o de objetivos sensibilizados c o n dosis b a j a s de
Adems de e s t e papel c o m o anafilotoxina. el C5a tiene otras m u c h a s pro
Ig G h u m a n a (Chen. 1998b). In vitro, el Clinh i n a c t i v a la m a n o s
a fijadora de p i e d a d e s biolgicas importantes. L a unin del C5a a los neutrli
los origina un lectina a s o c i a d a a sern proteasas (MASP) (Matsushita. 1996)
. El Clinh t a m a u m e n t o de la adhesin, la agregacin y la induccin de una r e
s p u e s t a oxibin inhibe al f a c t o r Xlla y a la calicrena del s i s t e m
a de c o n t a c t o .E s t et e m a dativa, y la liberacin de enzimas lisosmicas.
Adems, el C5a es fuertemenser tratado en la seccin C i n m a s y el s i s t e m a
de generacin de C i n m a s . Intete quimiotctico p a r a los m o n o c i t o s y
los neutrfilos. i n d u c i e n d o la migracin r e s a n t e m e n t e , el Clinh
demostr interferir con la proliferacin in vitro de los linde las clulas h a c i a
la f u e n t e de activacin del c o m p l e m e n t o . De e s t e modo, f o c i
t o s T y con el desarrollo de linfocitos T citotxicos b l o q u e a n d o la d e
g r a d a una reaccin inflamatoria de activacin del c o m p l e m e n t o local p
u e d e por tancin de la (5-microlobulina a desLys" p\-microlobulina p o rl o sl
i n f o c i t o sT to i n d u c i r un a u m e n t o del flujo sanguneo al tejid
o, la a d h e r e n c i a de los neua c t i v a d o s y por el C1r (Nissen. 1998
). Sin e m b a r g o , la r e l e v a n c i a in vivo de trfilos al endotelio loc
al, y la migracin directa de los f a g o c i t o s a los lugares estos hallazgos
no est an clara. Se h ai n f o r m a d o una proteina de 20 kDa inflamatorios. Los
neutrfilos agregados por el C5a pueden embolizar al pulcon actividad inhibitoria

sobre la funcin C1. la m a d af a c t o r J (Lopez-Trascasa. mn, originando c a m

b i o s en el intercambio g a s e o s op u l m o n a r e incluso la 1989). Se i
nform que inhiba la formacin del c o m p l e j o C1 (Lopez-Trascasa. m u e r t e .
Se c r e e que m u c h a de la inflamacin de los p u l m o n e sc a u s a d a por
1989) y despus a c t u a b a sobre la va alternativa inhibiendo la degradacin del
la formacin del c o m p l e j oi n m u n e est m e d i a d a por el C5a (Ward, 199
7). En a c t o r B (Gonzlez- Rubio. 1994) L a defensina, pptido-1 neulrofliu nm o d
e l oe x p e r i m e n t a ld e sepsis e n ratas, s eh ad e m o s t r a d or e
c i e n t e m e n t e C3 por el f co h u m a n o (HNP-1 ). tambin p u e d e inhib
ir al C1 en los lugares de inflamacin. que el C5a p u e d eb l o q u e a r las fu
nciones b a c t e r i c i d a s de los neulrfilos si se Se demostr que se una al C1
q en el fluido sanguneo y b l o q u e a b a la a c t i v a p r o d u c e en c a n
t i d a d e s suficientes, sugiriendo un papel p a r a la activacin del cin del c
o m p l e m e n t o mediada por la via clsica (van d e n Berg. 1998). c o m p l
e m e n t o en los a l t o s ndices de m o r t a l i d a do b s e r v a d o s en
l a sepsis (Czermak. 1999). La a c t i v i d a d del C 4 b es r e g u l a d ap o
r el f a c t o rI( a n t e sd e n o m i n a d oi n a c t i v a Los e f e c t o
s biolgicos de las anafilotoxinas estn m e d i a d o s por los r e c e p d o r del
C3b'4b) (Fries. 1987). El f a c t o rId e g r a d a la c a d e n a a del C 4 bp
a r a tores especficos e x p r e s a d o s por los dilerentes tipos celulares. E
s t o sr e c e p g e n e r a rd o s Iragmentos. el C 4 c y el C4d; el ltimo f r
a g m e n t op e r m a n e c eu n i d o tores se d e s c r i b e n en la seccin d
e los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o . a la clula. P a r a la prot
ehsis se n e c e s i t a un cofactor. la protena fijadora de C4 (C4BP). El C 4 B P
es una proteina de 570 kDa que tambin p u e d e unirse al C4b unido a partculas y
sanguneo, y desplazar al C2a de la via clsica de la C3 Regulacin de la activacin de
l complemento c o n v e r t a s a C4bza (Gilgli, 1979). Adems, el C 4 B Pc i r c
u l a en asociacin con a p r o x i m a d a m e n t ee l6 0 %d el ap r o t e i n a
S ,u nc o f a c t o rd e p e n d i e n t ed el a vitaLos graves e f e c t o s de
la activacin del c o m p l e m e n t op a r a inducir el dao i n aKp a r a la pro
teina C m e d i a n d o la degradacin de los f a c t o r e s de la c o a tisular
requieren mecanismos de control internos para: (1) limitar la inflama- m gulacin
Va y Villa. E s t a asociacin inhibe la actividad del c o f a c t o r de la prote
icin diseminada cercana, (2) evitar una excesiva activacin, y (3) proteger las na
S (Dahlbck, 1986) y p a r e c e inhibir la activacin del f a c t o r X a travs de l
as clulas husped de la lesin inadvertida. Se ha implicado un potente sistema i n t
e r a c c i o n e s del C 4 B Pt a n t o con la protena S c o m o con el f a c t
o r VIII ( K o p p e l de regulacin p a r ac o n t r o l a r la activacin del c o
m p l e m e n t o en cualquier etaman. 1995). U n a protena de 120 kDa con s i m
i l i t u d e se s t r u c t u r a l e s con el C2 pa de la c a s c a d a de la
activacin. Asi existen protenas sanguneas o asop e r of u n c i o n a l m e n t e d
istinta del C2 f u e aislada, y p u e d et e n e ra c t i v i d a dr e g u l a c
i a d a sam e m b r a n a que desarrollan una accin reguladora en la activacin d
o r as o b r e el s i s t e m a del c o m p l e m e n t o unindose al C4b ( H a m
m e r , 1989). del c o m p l e m e n t o( T a b l a 38-2).
?
Tabla 38-2 Protenas reguladoras del complemento Protenas Fases del fluido Cl inhib
idor Factor H Protena fijada a C4 Protena S (vilronectina) Clusterin Factor J Clula
asociada CR1 DAF (CD55) MCP (CD46) CD59 (protectina) HRF
Isoterma ms frecuente del CRI CRU receplor del complemento tipo 1. DAF= factor ace
lerador de la degradacin, MCP= proteina cofactor de membrana. HRF= tactor de rest
riccin homologo
Peso molecular (kDa) 105 150 550 84 70 20
Objetivo C1 C3b C4 C5b-7 C5b-7 C1. C3. B
Mecanismo de accin Disocia el complejo C1 unindose al C1r y C1s Colador para la in
activacin del C3b por el (actor I Cofactor para la inactivacin del C4b por el fact

or I Inhibe la insercin del MAC en las membranas celulares Inhibe la insercin del
MAC en las membranas celulares Inhibe la formacin del complejo C1 inhibe la degra
dacin de C3 por el Bb Disociacin de las C3/C5 convertasas cofactor par la inactiva
cin del C3b y el C4b por el factor I Disociacin de las convertasas C3/C5 Cofactor
para la inactivacin del C3b por el factor I Inhibicin de la formacin del MAC Inhibi
cin de la formacin del MAC
190" 70 45-70 18-20 65
C3b. C4b C3bBb. C4b?a C3b (C4b) C8, C9 C8, C9

CAPITULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

899
Debido a su papel crucial en las tres vas de activacin del complemento, el C3 est b
ajo un control rgido. El C3b sanguneo y el C3(H 0) son rpidamente inactivados por e
l factor I que degrada los tres pptidos unidos de la cadena a' del C3b (Davis. 19
82]. generando entonces una lorma inactiva de la molcula, la iC3b. que es incapaz
de atraer al C5 o al factor B. Esta degradacin mediada por el factor I requiere
al tactor H como cofactor. El factor H es una protena de 150 kDa que se une al C3
b y tienen actividad aceleradora de la desintegracin a travs de la va alternativa d
e la C3 convertasa adems de su actividad de cofactor para la degradacin del C3b me
diada por el factor I. Adems de regular al C3b en el fluido sanguineo, el factor
H se une al C3b unido a la clula y dispara la degradacin por el factor I. limitand
o asi la activacin por la va clsica (Ollert. 1995). Una vez que el C3b es degradado
en iC3b. que permanece unido a la superficie del objetivo, puede nteraccionar co
n el receptor del complemento tipo 3 (CR3) presente en las clulas fagocticas y pro
mover la fagocitosis (vase despus en Receptores del complemento).
?
tambin tiene la capacidad de servir como colador para la degradacin mediada por el
factor I de iC3b en fragmentos pequeos (Mitomo. 1987). El control del C4b y C3b
depositado en la membrana celular se lleva acabo posteriormente por la proteina
cofadora de membrana MCP, CD46). Esta protena es expresada en casi todas las clulas
, con la importante excepcin de los eritrocitos. Sirve como cofactor para la degr
adacin del C4b y el C3b en C4c y C4d. e iC3b. respedivamente. mediada por el fact
or I (Seya. 1986. 1989) pero es incapaz de promover la posterior degradacin del i
C3b Se inform que el MCP protege a la clula de la activacin de la va alternativa ms e
ficazmente que de la activacin de la va clsica (Kojima, 1993). Se ha sugerido que e
sta protena de 50 a 58 kDa juega un papel significativo en prevenir el dao celular
mediado por el complemento en aquellas clulas en las que se expresa (Liszweski,
1992). A diferencia del DAF. no protege a las clulas vecinas (vieintra). Otra prot
eina asociada a la membrana celular que controla la activacin del complemento a n
ivel de las C3 y C5 convertasas es el tactor acelerador de la eliminacin (DAF. CD
55). El DAF es expresado por todas las clulas de la circulacin, las clulas endoteli
ales y un nmero de clulas epiteliales iMorgan. 1994b). Esta protena de 70 kDa lunci
ona. como su nombre implica, acelerando la eliminacin de las C3 y C5 convertasas
tanto de la via clsica como de la alternativa. Interesantemente, tiene una mejor
capacidad de afectar a la C3 convertasa de la va clsica que a su contrapartida de
la va alternativa (Nicholson-Weller. 1982). El DAF media la disociacin del C2a y e
l Bb de las C3 convertasas (Fujita. 1987). a diferencia del factor H y CR1. que
tienen la capacidad de bloquear la unin de C2 a C4b o del factor B a C3b. El DAF
est unido a la membrana celular por un enlace glicosil fosfatidilinositol ms que p
or un dominio hidrofbico transmembrana, que ofrece a la molcula una gran mobilidad
y presumiblemente una mejor eficacia como inhibidor del complemento (Davitz. 19
87). Notablemente, el DAF no tiene actividad cofadora para la degradacin del C3b
y C4b mediada por el fador I. El control de los componentes finales del compleme
nto en la superficie celular se lleva a cabo por dos protenas unidas al glicosil
fosfatidilinositol. llamadas factores de restriccin homlogos (HRF) o proteina fija
dora de C8 y CD59 (tambin llamado proleclina. HRF-20. inhibidor de membrana de la
lisis reactiva y P-18). El HRF es una proteina de 65 kDa expresada en los eritr
o citos. las plaquetas, los linfocitos T, los linfocitos B. los neulrfilos y los
monocitos (Morgan. 1994b). El HRF funciona unindose al C8. inhibiendo la polimeri
zacin del C9 (Morgan, 1994b). Otra protena que inhibe el complejo de ataque a la m
embrana es el CD59, El CD59 es una protena de 20 kDa que se encuentra en una ampl
ia variedad de clulas incluyendo todas las clulas circulantes, las clulas endotelia

les, las clulas epiteliales, los espermatozoides, los podocitos glomerulares. num
erosas lneas celulares (Morgan. 1994b) e incluso las clulas del cerebro (Morgan. 1
996). Se demostr que se una tanto a la cadena |i del C8 como al domino b de la del
C9 (Chang. 1994). Inhibe la formacin del MAC sobre las clulas husped y acta de un m
odo intrnseco, esto es, proteger a la clula sobre la que se expresa. El DAF, HRF y
CD59 estn ausentes en las clulas de los pacientes con hemoglobinuria paroxstica no
cturna (HPN). debido a la unin de su glicosil fosfatidilinositol a la membrana ce
lular (Volanakis. 1998).
Hay un nmero de inhibidores sanguneos de los componentes terminales del complement
o que previenen la insercin del complejo de ataque a la membrana en las membranas
celulares. La protena S [S-protein). tambin llamada vitronectina, se une al compl
ejo C5b-7. previniendo as su insercin en la membrana celular (Podack. 1977) e inhi
biendo la polimerizacin del C9 (Johnson, 1994). Recientemente, se ha publicado qu
e la protena S se une al C5b y al C8 en el complejo C5b-9 (Su, 1996) y se une al
receptor de la cabeza globular del Clq (Ljm, 1996). Aunque el papel exacto de la
proteina S en la regulacin de la activacin del complemento in vivo es incierta. P
eake y col. mostraron que la proteina S forma un complejo con el sC5b-9 cuando e
l complemento es activado en conejos y que este complejo todava tiene la capacida
d de bloquear la lisis mediada por el C9 de los eritrocitos de oveja sensibiliza
dos llevando los componentes 1 al 7 del complemento (Peake. 1996). Clusterin (ta
mbin llamado Sp-40.40 o apolipoprotena J) es otro inhibidor sanguineo de los compo
nentes finales del complemento. Como la vitronectina. clusterin previene la inse
rcin del complejo C5b-7 en la membrana celular (Choi, 1989) y regula el complejo
de ataque a la membrana en los niveles C5b-7 y C9 (Berge. 1997). Todava se descon
oce el papel in vivo del clusterin. aunque recientemente se public que el cluster
in se deposita en las lesiones cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alz
heimer iVerbeek. 1998). Tambin, se ha publicado recientemente una asociacin signif
icativa entre los niveles bajos de clusterin y algunos signos clnicos del lupus e
ritematoso sistmico (LES), sugiriendo un control insuficiente de la inflamacin med
iada por anticuerpos (Newkirk, 1999).
Protenas reguladoras asociadas a las clulas
Adems de estar regulado en la lase liquida, la activacin del complemento tambin est
regulada en la superficie de muchos tipos celulares para limitar la lesin inadvet
ida a las clulas husped. Algunas de estas protenas no solo se unen a las protenas de
l complemento sino que actan como receptores. Una de estas protenas es el receptor
del complemento tipo 1 (CR1). La estructura del CR1 se describe con ms detalle e
n la seccin Receptores del complemento. La funcin del CR1 es unirse al C4b y C3b a
ctivado y servir como cofactor para la degradacin mediada por el (actor I de esto
s componentes en sus productos de degradacin inactivos. Adems de servir como colad
or para la degradacin mediada por el factor I del C3b en iC3b. el CR1 tambin promu
eve la degradacin posterior del iC3b por el factor I en C3dg. El C3dg puede ser d
egradado posteriormente en C3d por varias enzimas como la elastasa, la tripsina
y la plasmina (Davis, 1984; Ross, 1982). El CR1 tambin tiene una actividad aceler
adora de la desintegracin hacia las convertasas C3 y C5 de la va alternativa y la
clsica de la activacin del complemento. Al unirse a C4b o C3b. el CR1 tambin despla
za al C2a (va clsica) o al Bb (va alternativa), acelerando entonces la eliminacin de
las C3 convertasas. Interesantemente, el CR1 promueve la eliminacin acelerada de
la C3 convertasa unida a la superficie de la va alternativa mucho ms eficientemen
te que de la va clsica (Ross. 1982; Nicholson-Weller, 1982). Debido a que se expre
sa en los eritrocitos, ms que sobre otros tipos celulares, el CR1 ayuda al traspo
rte de los complejos inmunes que llevan el C3b a los lugares de degradacin de las
clulas de Kupffer del hgado (Cornacoff, 1988). Parece que otro receptor del compl
emento, el CR2,
Receptores del complemento
Los receptores que se unen a los componentes adivados del complemento han sido d
escritos en vanos tipos celulares Estos receptores controlan los efectos biolgico
s de los pptidos de activacin del complemento y estn unidos a muchas otras funcione

s celulares (Tabla 38-3). Esto ser descrito para cada receptor del complemento. L
os receptores del complemento que han sido mejor estudiados son aquellos que se
unen a los fragmentos de degradacin del C3. El receptor del complemento tipo 1 (C
R1. CD35, receptor de C3b'C4b) es una glicoprotena de cadena simple de 190 kDa (i
soforma ms frecuente). En humanos, se expresa en eritrocitos, fagocitos mononucle
ares. eosinfilos. linfocitos B, un subgrupo de linfocitos T, podocitos glomerular
es, clulas dendrticas foliculares (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996). Este
receptor del complemento se une tanto al C3b como al C4b. y. en menor medida, a
l iC3b. Se inform recientemente que el CR1 se una tambin al Clq (Klickstein. 1997).
Existen cuatro formas allicas diferentes del CRl que difieren en tama-

900 Tabla 38-3 Receptor CR1 CR2 CR3 CR4 C1qRp' C3aR C5aR
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Receptores celulares para los f r a g m e n t o s proteicos d e l c o m p l e m
e n t o Peso molecular (kDa) 190 (isoforma ms frecuente) 140 165 (cadena u) 95 (c
adena (5) 150 (cadena a) 95 (cadena |5) 126 48 43 Ligando C3b, C4b. iC3b C3d. C3
dg, iC3b iC3b C3d. C3b iC3b. C3b C1q. MBL. SP-A C3a C5a C5a desArg Papel fisiolgi
co Fagocitosis, aclaramiento del complejo inmune Activacin de las clulas B Fagocit
osis, adhesin celular Adhesin celular Fagocitosis Quimiotaxis, degranulacin de los
mastocitos del suero, aumento de la permeabilidad vascular Quimiotaxis. degranul
acin de los mastocitos del suero. aumento de la permeabilidad vascular
' Tambin han sido descritos otros receptores del Ctq. CR1 = receptor del compleme
nto tipo 1; CR2 = receptor del complemento tipo 2, CR3 = receptor del complement
o tipo3 CR4 = receptor del complemento Upo 4; C1qRp = receptor para la regin del
colgeno del Ctq; C3aR = receptor de C3a; C5aR = receptor de C5a; MBL = maosa fijad
ora de lectma: SP-A = proteina surfactante A; C5a desArg = prdida del residuo arg
iruna terminal del C5a tras la inactivacin por la carboxipeptidasa-N.
o y nmero de lugares de unin. La forma allica ms frecuente (llamada alotipo A o F) es
t formada por 30 unidades repetidas de 60 a 70 aminocidos, la mayora de las cuales
estn altamente conservadas. Estas unidades repetidas son llamadas repeticiones co
nsensuadas cortas (SCR). De estos 30 SCR, 28 estn agrupados en cuatro parejas de
repeticin de siete SCR cada uno. Esas parejas repetidas se denominan repeticiones
homologas largas (LHR). Como se seal en la seccin Regulacin de la activacin del comp
lemento, el CR1 sirve como cofactor para la degradacin del C3b mediada por el fac
tor I, el iC3b y el C4b y tiene actividad aceleradora de la eliminacin tanto sobr
e la via de la C3 y C5 convertasa clsica y alternativa. Un papel fisiolgico ms impo
rtante del CR1 est relacionado con la fagocitosis de las partculas envueltas por e
l complemento (partculas opsonizadas). El CR1 puede aumentar la unin de las partcul
as envueltas con Ig G y C3b o iC3b a los monocitos o los neutrfilos, aumentando e
ntonces la eficacia de la fagocitosis mediada por el receptor Ig G-Fc (Wright. 1
985; Sengelov. 1995). El CR1 tambin puede disparar la fagocitosis de los objetivo
s envueltos por el C3b en ausencia de IgG en los macrlagos activados por varios e
stimuladores como la libronectma. el acetato forfol mirislato. el interfern-y y l
a anafilotoxina C5a. El CR1 sobre los eritrocitos regula la funcin C3b sirviendo
como cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I y aumentando la
eliminacin de C3 convertasas. Se cree que el CR1 eritrocitario tiene un papel imp
ortante en secuestrar el C3b y el complejo inmune relacionado con iC3b. sacndolos
del plasma y facilitando su transferencia a los lugares de degradacin en el higa
do y en el bazo (Birmingham. 1995). Recientemente se propuso que la captacin depe
ndiente del CR1 de los complejos inmunes por los eritrocitos de la circulacin pue
de servir como mecanismo de inhibicin de la activacin excesiva de las clulas fagocti
cas o las clulas B (Nielsen, 1997). El CR1 tambin es expresado en las clulas B huma
nas y en las clulas dendrticas foliculares del bazo y puede tener un efecto inmuno
rregulador en estas clulas. Este tema se analiza con ms detalle despus, en la seccin
Complemento e inmunidad adquirida. Un receptor para el fragmento C3d del C3 se
encuentra en las clulas humanas |i las lineas celulares B, las clulas dendriticas
foliculares, algunas clulas T perifricas, algunas lineas celulares T, timocitos (A
hearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996), y es denominado CR2 (CD21). El CR2 es
una glicoproteina transmembrana tipo I, de 1 4 0 kDa, que sirve como receptor pa
ra el C3d. el C3dg, y se une dbilmente al iC3b. El CR2 tiene la capacidad de serv
ir como cofactor para la degradacin de iC3b unido a los objetivos mediada por el
factor I (Mitomo. 1987). El CR2 tambin es el receptor o sitio de unin a travs del c
ual el virus de Epstein-Barr entra en las clulas B, en la sangre, modalidad indep

endiente del complemento, para causar la mononucleosis infecciosa (Fingeroth. 19

84). Se cree que la principal funcin del CR2 es la regulacin de la respuesta inmun
e de las clulas B ante el antigeno (Carroll, 1998b). Este tema se discute con ms d
etalle despus, en la seccin Complemento e inmunidad adquirida. Un tercer receptor
del complemento, el CR3 (tambin denominado Mac-1, Cd11b'CDi8) es un miembro de la
familia de molculas de sdhesin de la |3
2
integnna leucoctica. Est formada por dos cadenas polipeptidicas con pesos molecula
res de 165 kDa (cadena a) y de 95 kDa (cadena |i) (Ahearn, 1998). Otros dos miem
bros de la familia de molculas de adhesin de la |i, integrina (LFA-1 y CR4) compar
ten la misma cadena p* con el CR3. El CR3 se expresa en los fagocitos mononuclea
res, granulocitos y clulas asesinas naturales (NK) (Ahearn. 1998), y en las clulas
microgliales (Morgan. 1996). El CR3 se une al iC3b, y al C3b y el C3d pero con
menor afinidad (Brown. 1991). En las clulas fagocticas, el CR3 dispara el proceso
fagocitico de un modo paralelo al CR1. El CR3 aumenta la ingesta de partculas rec
ubiertas con Ig G y C3 (Sengelov, 1995; Gaither, 1987). Otro papel importante de
l CR3 es la adhesin de los monocitos y los neutrfilos a las clulas endoteliales a t
ravs de la interaccin con su contraligando, molcula de adhesin intracelular tipo 1 (
ICAM-1). Esto permite la acumulacin de los fagocitos en los lugares de dao tisular
donde las clulas endoteliales son activadas. El receptor del complemento tipo 4
(CR4. CD11c/CD18) es una glicoprotena que comparte caractersticas con el CR3. Tamb
in es un miembro de la familia de molculas de adhesin de las miegrinas con una nica
cadena a de 150 kDa. Se expresa en las clulas mieloides. clulas dendriticas. clulas
NK. clulas B activadas, algunas clulas T activadas, plaquetas (Ahearn. 1998). y cl
ulas microgliales (Morgan, 1996). El CR4 se une al iC3b. y al C3b en m e n o r m
edida (Brown, 1991). Sin embargo, el papel exacto del CR4 en trminos de activacin
del complemento es desconocido y, como esta glicoprotena es una molcula de adhesin,
puede servir para ayudar" a la adhesin de los neutrfilos al endotelio durante el
proceso inflamatorio (Sengelov, 1995). Se han descrito varias molculas de superfi
cie celular con actividad receptora para el Clq. Son receptores (ClqR.. C1qRJ, m
odificadores de la respuesta (gC1qR. proteoglicano condroitin sulfato derivado d
e las clulas B). y protenas de unin (CR1, cClqR) (Tenner, 1998). El CiqR es una gli
coprotena de 126 kDa expresada en las clulas de origen mieloide. en las clulas endo
teliales, en las plaquetas y en las clulas microgliales (Nepomucenc, 1998). Se ha
mostrado que se une a la regin tipo colgeno del C1q (tenner,1998) y a las colecti
nas MBL y SP-A (Hansen. 1998). Se demostr que este receptor aumenta la fagocitosi
s de partculas subptimamente recubiertas con complemento o Ig G mediada por el CR1
y por el receptor Fe. Un segundo receptor, todava pobremente caracterizado, es d
enominado C1qR , se une al C1q e inicia la generacin de radicales txicos del oxgeno
por los neutrfilos, los eosinfilos y las clulas del msculo liso vascular (Tenner. 1
998). El receptor para las cabezas globulares del Clq (gCiqR) es una proteina de
33 kDa expresada en las clulas B, en los fagocitos mononucleares, en los neutrfil
os, en las plaquetas y en las clulas endoteliales. Se ha informado que induce la
quimiotaxis de neutrfilos humanos (Nepomuceno, 1998). Tambin se ha informado que o
tra molcula de superficie celular se une a la regin tipo colgeno del C1q (cClqR). E
sta protena de 56 kDa se expresa en una variedad de clulas, se une la Clq, a la MB
L y a la SP-A (Hansen, 1998) y tiene homologa con la calreticulma. Puede inducir
la fagocitosis de los objetivos recubiertos con Clq asi como mediar la citotoxic
idad, la produccin de anticuerpos y la secrecin de citocinas. El papel del CR1 una
3 o2

CAPITUIO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

901
v e zu n i d oa lC 1 qe st o t a l m e n t e desconocido. E si m p o r t a n t e
realzar q u ee l zados por los h e p a t o c i t o s o por las clulas extraheplic
as a m e n u d or e q u i e r e papel e x a c t o que juegan in vivo estas proten
as unidas al C1 q asociadas a las un estmulo g e n e r a d o en las r e s p u e s
t a s inflamatorias c o m o la interleucina-lu, clulas sigue e s t a n d op o c
o claro. la i n t e r l e u c m a 6 o el interfern-y. En oirs o b r a s se p u e d
e ver u n am e j o r desC o m o se trat a n t e r i o r m e n t e en la seccin An
afilotoxinas, los f r a g m e n t o s pepcripcin de la regulacin de la sntesis de l
as protenas del c o m p l e m e n t op o r las tdcos pequeos l i b e r a d o st r a
s la degradacin p r o t e o l i t i c a del C4. C3 y C5 t i e d i f e r e n t e s
clulas (Collen. 1998) I n t e r e s a n t e m e n t e los d a t o s del h i g a
d o y la n e np r o f u n d o se f e c t o se nl ar e s p u e s t a inflamatoria
. E s t oi n c l u y ee la u m e n t od e mdula sea h u m a n a (Naughton. 1996) y
el t r a s p l a n t er e n a l( T a n g , 1999) la p e r m e a b i l i d a dv
a s c u l a r , la degranulacin de los m a s t o c i t o s y la induccin de d e m
o s t r a r o n que. a u n q u e el higado es el l u g a r ms i m p o r t a n t e
de la sntesis del l aq u i m i o t a x i s .E lr e c e p t o r del C 3 ah u m a
n o( C 3 a R )h as i d oc l o n a d or e c i e n t e c o m p l e m e n t o , los
l u g a r e s extrahepticos p u e d e nc o n t r i b u i r a ios n i v e l e s d
e los m e n t e . Es una proteina t r a n s m e m b r a n au n i d a a la protena
G. de c a d e n a nica c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t oe ne lp l
a s m a . d e4 8k D a( E m b e r , 1998). E lC 3 a Rs ee x p r e s ae n las p l
a q u e t a s del conejilo d e Indias, en los m a s t o c i t o s de rata, en lo
s macrfagos alveolares h u m a n o s , en los neutrfilos. en los basfilos y en los
eosinfilos (Ember, 1998). Recientemente, Gentica del complemento se ha d e m o s t
r a d oq u e se e x p r e s a n en las clulas B de las amgdalas h u m a n a s M u
c h o s de los g e n e s que c o d i f i c a n las protenas, los r e c e p t o r
e s y las mol(Fisher, 1997) y en varias clulas del c e r e b r oh u m a n oi n f
l a m a d o (Gasque. 1998). c u l a s regul a doras del c o m p l e m e n t o h
a n s i d o c l o n a d o s y se l e s ha a s i g n a d o S eh ai n f o r m a d
oq u ee lC 3 au n i d oas ur e c e p t o r origina q u i m i o t a x i s eosinof
ilica: u n a localizacin cromosmica ( T a b l a 38-1). I n t e r e s a n t e m e n
t e ,e x i s t eu n a la degranulacin de los eosinfilos. los m a s t o c i t o s
y las plaquetas: la adheson unin para un nmero de genes que codifican las molculas
r e l a c i o n a d a s con de los eosinfilos y las plaquetas; y la supresin de la
s f u n c i o n e s de las cluo m p l e m e n t o .E s t o s grupos de unin i n c
l u y e n los g e n e s del M H Cc l a s e III las B a m i g d a l a r e si n c
l u y e n d o la produccin de inmunoglobulinas. D e b i d o a las el c (C2. f a c
t o r B y C4), los g e n e s de los r e g u l a d o r e s de la activacin del c
o m p l e s i m i l i t u d e se s t r u c t u r a l e se n t r e el C3 y el C4,
se pens que el C4a era c a p a z de m e n t o (protena fijadora de C4. CR1. CR2,
DAF, MCP y f a c t o r H). y los g e n e s i n t e r a c c i o n a rc o n el C3a
R. S i ne m b a r g o ,p a r e c eq u e no es as y el C 4 ah u m a n o o m p l e
j o de a t a q u e a la m e m b r a n a (C6. C7 y C9) (Schnein op u e d ei n t e
r a c c i o n a rc o ne lC 3 a Rh u m a n o( A m e s . 1997). a u n q u ep a r
e c eq u e de las protenas del c der, 1999). Las molculas de c a d a uno de e s t
o st r e sg r u p o sm u e s t r a nh o m o i n t e r a c c i o n ac o ne lC 3 a
R del conejilo d eI n d i a s (Lienenklaus. 1998). logia estructural, lo que su
giriere que las protenas del c o m p l e m e n t op u e d e n U nr e c e p t o rp
a r a la a n a l i l o t o x m a C5a (C5aR) se e x p r e s a en los neutrfilos.
derivar de una duplicacin gentica de un nmero limitado de g e n e s ancestralos m o
n o c i t o s , los basfilos, los eosinfilos, las plaquetas, los m a s t o c i t

o
n
l
c

s , las les. Es de inters que e x i s t e n dos g e n e sp a r a el C4. Origina

dos isolipos de clulas del parnquima heptico, las clulas del msculo liso v a s c u
a r del pulC4 la m a d o sC 4 A y C4B, los c u a l e ss o np r o d u c i d o s
o nf r e c u e n c i a (O'Neill. mn, las clulas endoteliales vasculares del pulmn
y umbilicales, las clulas 1978a: A w d e h , 1980). E s t o s dos p r o d u c t
o s gnicos difieren f u n c i o n a i m e n t ey epiteliales bronquiales y alveol
ares, l o s astrocitos, las clulas microgliales tienen diferente eficacia hemolit
ica. Una vez e x p u e s t o s al g r u p o tolster de la ( E m b e r . 1998) y la
s clulas T h u m a n a s (Nataf. 1999). El C 5 a R es una protemolcula. C4A f o r m
a un e n l a c ea m i d a con un a c e p t o r de la molcula en su na t r a n s
m e m b r a n aa s o c i a d a la proteina G de 43 k D a El C 5 au n i d o al C
5 a R microambiente. m i e n t r a s que la f o r m a C4B f o r m a un e n l a c
e ster. Adems, s e i n d u c e una a m p l i a variedad de e f e c t o sd e p e n
d i e n d o del tipo de clula diana. descubri que el C4A se une al CR1 con m a y
o r afinidad que el C4B (Reily. E s t o s incluyen las quimiotaxis de neutrfilos.
eosinfilos. basfilos y fagocitos 1997). Tambin t o d a s las protenas r e l a c i o
n a d a s con el c o m p l e m e n t om u e s m o n o n u c l e a r e s ; la de
granulacin de los m a s t o c i t o s de las serosas; la protran p o l i m o r f
i s m o (es decir, existen mltiples alelos con variables f r e c u e n c i a s du
ccin de r a d i c a l e s del oxigeno: facilitar la adhesin celular; y la produccin
en humanos). El c o m p o n e n t e ms polimrfico del c o m p l e m e n t o es el
C4, c o n d el e u c o t r i e n o syp r o s t a g l a n d i n a s en l o s neu
trfilos y l o s eosinfilos. E n ms de 35 alelos identificados (Schneider. 1997). L
a degradacin de los I t a g varios e s t u d i o s el C5a tambin demostr i n d u c
i r la produccin de protenas m e n t o s del C4A y C4B y su unin a los e r i t r o
c i t o s origina a los a n t i g e n o sd e de fase aguda, citocinas y anticuer
pos ( E m b e r , 1998). g r u p o sanguneo R o d g e r d s y Chido. r e s p e c
t i v a m e n t e (O'Neill. 1978b). L a s L o sr e c e p t o r e s de los factor
es H y B se h a n descrito en m u c h o s tipos de v a r i a c i o n e s allicas
del f a c t o ra c e l e r a d o r de la degradacin (DAF) o r i g i n a n el l e
u c o c i t o s y estn descritos en otras obras (Fres. 1987). Sin embargo, el sigs
i s t e m a de g r u p o sanguneo C r o m e r con el fenotipo I n a b que c a r
e c e de DAF. nificado fisiolgico de estos receptores todava no est claro. Las m u
t a c i o n e s puntuales, l a si n s e r c i o n e sol a sd e l e c i o n e s d
e l o s cidos n u c l e i c o sn o r m a l m e n t e van u n i d a s con d e f e
c t o s de las protenas del c o m p l e m e n t o (Schneider, 1997). C o m o se d
i s c u t e despus en la seccin D e f e c t o s Biosintesis del complemento gentic
os del c o m p l e m e n t o ,e s t a s son n o r m a l m e n t ep o c of r e c
u e n t e se n t r e la poblacin. El p o l i m o r f i s m o de l a s protenas del
c o m p l e m e n t o se evala t a n t o S ec a l c u l aq u ee l9 0 %d e los c
o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o del p l a s m as o n p o r los anli
sis f e n o t i p i c o sc o m op o r los genotipicos. Los d e t a le s de e s t
o s s i n t e t i z a d o s en el hgado y son protenas de f a s ea g u d a (es de
cir, su sntesis mtodos no sern di s cuti d os en e s t e captulo y el l e ctor es r
e m i t i d o al Capi t up o re lh i g a d oa u m e n t ae nl ar e s p u e s t a
inflamatoria p a r aa u m e n t a r los n i v e l e s lo 41 y o t r o s captulos
s o b r e el t e m a (Schneider. 1997; M a u f f . 1997). del plasma). El h e p
a t o c i t op r o d u c e la gran mayora de los c o m p o n e n t e s del c o m
p l e m e n t o , con la excepcin del C1q. el f a c t o r D, la p r o p e r d i
n a y el C7 ( M o r gan, 1997a). El C1q p a r e c e que es s i n t e t i z a d o
por las clulas epiteliales, l o s m o n o c i t o s 'macrfagos y los fibroblastos
. El principal p r o d u c t o r de f a c t o r D es el adiposito. La p r o p e
r d i n a es sintetizada m a y o n t a r i a m e n t ep o rl o sm o n o c i t o
sy los macrfagos o c u r r i e n d oa l g o de la sntesis en los l i n f o c i t o
s y en los granulootos. L a mayora del C7 del p l a s m a tambin p a r e c e orig
inarse por los m o n o c i t o syl o s macrfagos. a u n q u el o sl e u c o c i t
o sp o l i m o r f o n u c l e a r e sp a r e c e que a l m a c e n a n C7. Es
de inters que m u c h o s otros tipos celulares han sido descritos c o m os i n t
e t i z a d o r e s de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o in v
itro. Se ha p u b l i c a d o una e x h a u s t i v a lista de clulas que p r o d

u c e nc o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o (Morgan, 1 9 9 7 a ) .B
r e v e m e n t e , se ha i n f o r m a d oq u el o s linfocitos B y T, los m o
n o c i t o s , las plaquetas, los neutrfilos. los macrfagos. los fibroblastos, la
s clulas endoteliales. las clulas epiteliales, los queratinootos. los m i o b l a
s tos. las clulas del msculo liso, los a d i p o c i t o s y las clulas de la sinov
ial. cereb r oyt r a c t o genital sintetizan u n o o ms c o m p o n e n t e s de
l c o m p l e m e n t o .I n t e r e s a n t e m e n t e , los m o n o c i t o s
. los macrfagos. las clulas del tejido sinovial y los a s t r o c i t o s del c e
r e b r ot i e n e nl ac a p a c i d a dd es i n t e t i z a rt o d o sl o sc o
m p o n e n t e s de las vas clsica y alternativa. E s t op u e d et e n e ri m p
o r t a n t e si m p l i c a c i o n e s en la inflamacin especifica de tejido,
d o n d ed e b ee s t a rp r e s e n t e un m e c a n i s m o l o c a l i z a d
o de d e f e n s a del husped para eliminar las partculas extraas eficazm e n t e .
La produccin de c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t on o r m a l m e n
t e sintetiComplemento e inmunidad adquirida Est q u e d a n d o claro q u e el s i s t e m
a del c o m p l e m e n t oj u e g a un p a p e l i m p o r t a n t ee ne le s t
a b l e c i m i e n t od e las r e s p u e s t a si n m u n e s adquiridas. L a
depresin de las r e s p u e s t a s de a n t i c u e r p o s a la estimulacin anl
ignica se demostr en a n i m a l e s deplecionados transitoriamente de C3 (Pepys,
1974), en a n i m a l e s con d e f e c t o s genticos en el C2. C 4 o C3 (Btger,
1985; Ochs, 1983; O'Neil, 1988), y en p a c i e n t e s con d e f e c t o s genti
cos en C2, C4, C3 o CR3 (Ochs. 1986). El desarrollo r e c i e n t e de r a t o n
e s knockout sin C4, C3. o r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o tipos
1 y 2 (CR1 y C R 2s o np r o d u c t o s de la divisin de un m i s m o gen en el
ratn en oposicin a los h u m a n o s )h ap e r m i t i d o u nm e j o rc o n o c i
m i e n t o del papel del c o m p l e m e n t oe nl a sr e s p u e s t a sd e a
ntic u e r p o s al antigeno. E s t e efecto ha sido revisado r e c i e n t e m
e n t e (Carroll. 1998a: 1998b: Fearon, 1998). El c o m p l e m e n t op u e d e
influir en la r e s p u e s t a de a n t i c u e r p o s al antgeno de m u c h a
s maneras. Primero, el CR 1 y el CR2 son e x p r e s a d o s en las clulas B y e
n las clulas dendriticas foliculares (que estn p r e s e n t e s en el bazo). EL C
R2 est p r e s e n t e en la s u p e r t i c i e de las clulas B en asociacin con e
l CD19 y el TAPA-1. Una vez que se ha ligado el r e c e p t o r de la clula B p a
r a el antigeno y p a r a el CR2 ( c o m o ocurrir c u a n d o el ant-

902
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
geno esl unido al C3d), disminuye drsticamente el umbral para la activacin de la clu
la B. Tambin, el complemento ayuda en el atrapamiento de los complejos inmunes po
r las clulas dendriticas foliculares en el bazo. Esto facilita la formacin de cent
ros germinales donde las clulas B adquieren el fenotipo memoria. Por lo tanto, la
prdida de uno de los componentes iniciales de la via clsica de la activacin del co
mplemento o la prdida del CR1 y/o el CR2 conduce a una respuesta inmune inapropia
da al antgeno y, en algunos casos, puede conducir a la incapacidad para producir
una respuesta de anticuerpos secundaria. El complemento puede jugar un papel en
la generacin de clulas B CD5 positivas, las cuales producen anticuerpos "naturales
" (Carroll. 1998a). La activacin adecuada de las clulas B en respuesta a antigenos
parece depender, en algunos casos, de la activacin de los anticuerpos "naturales
" y el complemento (Boes, 1998: Lutz, 1999). Interesantemente, el complemento pa
rece importante en el mantenimiento de la tolerancia de las clulas B a los antgeno
s propios. Esto parece depender del componente del complemento C4, y del CR1 y d
el CR2 (Prodeus, 1998). Finalmente, el complemento (especialmente el C3) ayuda a
la generacin de una respuesta inmune adquirida al antgeno a travs de las clulas pre
sentadoras de antgeno (APCs). La presencia de productos de degradacin de C3 sobre
los antgenos aumenta la captacin del anligeno por las APCs (clulas B y otras APCs p
rofesionales que expresan CR1 y/o CR2), aumentando por lo tanto la eficacia de l
a presenlacin antgnica a las clulas T con la consiguiente respuesta mediada por las
clulas T (Boackle. 1998: Kerekes. 1998).
-
DEFICIENCIAS GENTICAS DEL COMPLEMENTO
Los pacientes con deficiencias del complemento genticamente controlados son m u y
raros pero son interesantes porque nos permiten determinar el papel de los comp
onentes del complemento en distintos fenmenos biolgicos y en diferentes estados de
enfermedad. En general, la ausencia de un componente sigue los principios de la
gentica mendeliana simple y es heredada c o m o un rasgo autosmico recesivo. Por
ello, los pacientes heterocgticos tienden a tener la mitad de los niveles normales
o menos, y los pacientes con defectos homocigticos tienen poca o indelectable ac
tividad del complemento. El gen de la properdina est en el cromosoma X. Se conoce
n deficiencias para todas las protenas ligadas a la activacin del complemento (Tab
la 38-4). Con el descubrimiento reciente de la va de la MBL de la activacin del co
mplemento lleg el sorprendente hallazgo de que el dficit en suero de MBL es bastan
te frecuente. Se calcula que aproximadamente el 5% de la poblacin tiene una de la
s tres mutaciones genticas reconocidas que conducen a la deficiencia de MBL (Sumi
ya. 1997). Se ha descrito una correlacin entre la deficiencia de MBL y las infecc
iones del tracto respiratorio superior, especialmente entre los 6 y 18 meses de
edad, demostrando la importancia de la va de la MBLecitina en la primera infancia
(Turner. 1996). Un estudio reciente sugiere que la variacin de genes de la MBL p
uede estar asociada con al menos un tercio de las inlecciones meningoccicas en la
infancia (Hibberd. 1999). Se ha informa?
Tabla 38-4 Deficiencias h e r e d a d a s d e l c o m p l e m e n t o y d e las
protenas relacionadas c o n el c o m p l e m e n t o Patrn de herencia Principal c
orrelacin clinica' Proteina Comn a todas las vas C3 Va clsica C1q C1r C1S C4> C2t Va
lternativa Factor B Factor D Properdina Via de la MBLectina MBL Complejo de ataq
ue a la membrana C5 C6 C7 Autosmica recesiva Autosmica Autosmica Autosmica Autosmica
Autosmica recesiva recesiva recesiva recesiva recesiva Infecciones pigenas recurre
ntes, glomerulonefritis Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES Glomerulon
efritis. LES LES LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis Infecc

iones por Neisseria meningitidis Infecciones pigenas recurrentes Infecciones pigen

as recurrentes, meningococcemia fulminante Infecciones recurrentes Infecciones d
iseminadas recurrentes por Neisseria. LES Infecciones diseminadas recurrentes po
r Neisseria Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad de Ray
naud Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Nada Angioedema hereditar
io, enfermedades autoinmunes' Angioedema, sndrome semejante al Behcet Inlecciones
pigenas recurrentes Inlecciones pigenas recurrentes, glomerulonefritis Asociacin e
ntre la expresin baja en eritrocitos y el LES Infecciones pigenas recurrentes, leu
cocitosis Hemoglobinuria paroxstica nocturna
Autosmica recesiva Autosmica recesiva Ligada al X Autosmica dominante Autosmica rece
siva Autosmica recesiva Autosmica recesiva
C8 (cadenas y a-y) Autosmica recesiva C9 Autosmica recesiva Proleinas de control d
el fluido sanguineo C1inh Autosmica dominante o adquirida C4bp Autosmica recesiva
Factor I Autosmica recesiva Factor H Autosmica recesiva Protenas unidas a clulas CR1
Autosmica recesiva ' CR3 Autosmica recesiva" DAF/CD59/HRF Adquirida
1
* Vase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y
componentes del complejo de ataque a la membrana, estn clnicamente bien. Un nmero s
ustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad au
toinmune. Las deficiencias del Ct al C9 estn asociadas con un CH50 de O. Las defi
ciencias de Ct. C4 y C2 estn asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen pr
ep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 esln asociadas con una ausencia o un
a baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 est asociada con
la ausencia o disminucin de la actividad quimiotctica en suero y puede estar asoci
ada con la ausencia de respuesta leucoctica a la infeccin. i La deficiencia en cua
lquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal defic
iencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales deficiencias tienen un
a incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos hete
rozigticos para la deficiencia de C2 tambin tienen un aumento de la incidencia de
enleimedades autoinmunes. Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas si
lentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida dislun
cional de la proteina Ct inhibidor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1
esta normal o disminuido, el nivel de C3 est siempre normal, y el nivel de C4 es
l disminuido. En la enfermedad adquirida, los niveles de Cl y C4 estn disminuidos,
el nivel del antignico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funciona
l del Cl inhibidor esta muy disminuido. La homocigosis para la expresin numrica ba
|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar a
sociada con el LES Tambin puedo detectarse un defecto adquirido en el nmero de CRI
Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padre
s de la mayora de los nios con delicit de CR3. LES = lupus eritemaloso sislmico. LE
D = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de maosa
1

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

903
do q u el a s infusiones de M B L purificada corrigen el d e f e c t o y la susc
eptibilidad Es importante r e c o n o c e r que la medicin de los niveles del c o
m p l e m e n t o a las i n f e c c i o n e s en los nios con deficiencias del M
B L (Valdimarsson, 1998). srico representa los niveles estticos de protenas que se
r e c a m b i a n rpiAdems, se h a sugerido que la deficiencia de M B Lc o n d u
c eae n f e r m e d a d e s damente. I n c l u s o en los individuos normales, e
l ndice fraccional catablico a u t o i n m u n e sc o m o el l u p u se r i t e m
a t o s o sistmico (Turner. 1996) y que es un de la mayora de los componentes que
han sido m e d i d o s est alrededor del f a c t o r de riesgo p a r a el a b o r
t or e c u r r e n t e (Christiansen. 1999). 2 % por hora. M u c h a s de e s t
a s protenas se c o m p o r t a nc o m or e a c t a n t e s de u e d e na u m e
n t a r drsticamente e n los L a deficiencia e n cualquiera d e los c o m p o n e
n t e sd el ac a s c a d a del c o m - fase aguda, y sus niveles en suero p e s
t a d o s inflamatorios. Sus ndices d ec a t a b o l i s m op u e d e na u m e n
t a re n p l e m e n t o tiene alguna asociacin con la susceptibilidad a infecci
ones (Figueroa. 1991; Densen. 1998). D e b i d o al papel central q u e el C3 ti
ene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminucin de
l nivel del c o m p l e m e n t op u e d e avalar la s o s p e c h a de q u e el
s i s t e m a del c o m p l e nizacin, la deficiencia de C3. de otros c o m p o
n e n t e s de la va alternativa, o m e n t o participa en el dao tisular, pero no
lo prueba. El hallazgo de un nivel de las molculas reguladoras c o m o los facto
res H e I est a s o c i a d a con un normal de c o m p l e m e n t o en el suero
no e x c l u y e la participacin del c o m p l e a u m e n t od el a incidencia d
e infecciones. Interesantemente, las deficiencias m e n t o en el dao tisular. P
or ejemplo, los p a c i e n t e s con cirrosis biliar tienen de los c o m p o n
e n t e s del c o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a n a (C5-C9) estn un
aumento del ndice catablico de C3, y se ha sugerido que el C3 p u e d e a l t a m
e n t ea s o c i a d a sc o nu na u m e n t od el a incidencia d e infecciones
p o r jugar un papel en el desarrollo de e s t a enfermedad. No obstante, el niv
el de Neisseria meningitidis, sugiriendo l ai m p o r t a n c i a de la lisis m
e d i a d ap o r el C3 en el suero de los pacientes c o n cirrosis biliar est cas
i s i e m p r e elevado. c o m p l e m e n t o en el control del m e n i n g o c
o c o La vacunacin e m p l e a n d ou n En e s t e caso, el a u m e n t o de la
sntesis e n c u b r e el c a t a b o l i s m oa u m e n t a d o . polisacrido c a
p s u l a rm u l t i v a l e n t ep a r a Neisseria meningitidis demostr ofreTamb
in debe reconocerse que la funcin del c o m p l e m e n t o en los diversos c e ra
l g u n a proteccin f r e n t e a la infeccin menmgoccica e nl o sp a c i e n t e
s c o m p a r t i m e n t o s del c u e r p op u e d es e r diferente. L a activ
idad del c o m p l e c o n deficiencia del c o m p l e m e n t o (Fijen. 1998).
m e n t o en la sangre de pacientes con artritis r e u m a t o i d e seropostiva
p u e d e O t r a caracterstica de la deficiencia del c o m p l e m e n t o ,e s
p e c i a l m e n t e en los s e rn o r m a l o elevada; sin embargo, la activid
ad del c o m p l e m e n t o del liquido c o m p o n e n t e s iniciales de la v
ia clsica (C1. C4, C2). es la asociacin c o n u e d e eslar s e v e r a m e n t e
disminuida. e n f e r m e d a d e sa u t o i n m u n e sc o m oe l LES. Y aq u e
e lc o m p l e m e n t oe si m p o r - sinovial p t a n t e en el a c l a r a m
i e n t o de los c o m p l e j o si n m u n e s de la circulacin, p u e d e ser M
u c h o s investigadores han i n t e n t a d o identificar qu va de activacin del
q u e la deficiencia de los c o m p o n e n t e s iniciales del c o m p l e m e
n t oc o n d u z c aa c o m p l e m e n t op r e d o m i n a en la mediacin del d
ao tisular o en los niveles disu n a degradacin inadecuada de los complejos i n m
u n e s con su acumulacin m i n u i d o s del c o m p l e m e n t o en u n a y ot

ra e n f e r m e d a de s t a b l e c i e n d o el" perfil e nl o s tejidos c o

m o el rion. R e c i e n t e sd a t o se x p e r i m e n t a l e s que e m p l e
a n del c o m p l e m e n t o " . La aproximacin ms s i m p l e a este p r o b l e
m a examina los r a t o n e s transgnicos sugieren que la a u t o m m u m d a da
s o c i a d a con la deficienniveles de varios c o m p o n e n t e s y da p o r
h e c h oq u e los niveles d i s m i n u i d o s de cia de Clq origina un a c l
a r a m i e n t oi n a d e c u a d o de las clulas apoplticas que. un c o m p l e
m e n t od a d o de una de las vias de activacin del c o m p o n e n t e es a su
vez. c o n d u c e al desarrollo de a n t i c u e r p o s autorreactivos (Bofto.
1998). ms frecuente que ocurra c u a n d o la va est activada. P o rl o tanto, si
u n C o m o se discuti previamente en la seccin C o m p l e m e n t o e inmunidad
adqui- p a c i e n t e tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles n o r m a
l e s de f a c t o r B, rida, la deficiencia del c o m p l e m e n t o( e s p e
c i a l m e n t e de C4 o C R 1C R 2 )t a m - s e g u r a m e n t e estar implica
da la va clsica. Si un paciente tiene niveles disbin p u e d e alterar el m e c a n
i s m o por el que las clulas B se h a c e n tolerantes m i n u i d o s de C3, f
actor B y properdina, y niveles n o r m a l e s de C4, probablea los antgenos pro
pios, c o n d u c i e n d o por ello a una a u t o i n m u n i d a d (Prodeus, m
e n t e estara activada la va alternativa. De esta manera, la determinacin de 199
8). E x i s t e nd e f i c i e n c i a s en l a s molculas reguladoras del c o m
p l e m e n t o l o s niveles d eu n nmero limitado d ec o m p o n e n t e sp u e
d ep r o p o r c i o n a r u n i d a s a la m e m b r a n a . La deficiencia de
C R 3 origina s e v e r a s infecciones pi- m u c h a informacin. E x c e p t u a
n d o el c a s o de alteraciones conlroladas gentig e n a syd e f e c t o s en l
a adhesin l e u c o c i t a n a (Fres. 1986; Morgan. 1991). La c a m e n t e del c
o m p l e m e n t o ,u n on u n c an e c e s i t ac o n o c e rl o s niveles d
et o d o s d e f i c i e n c i a en la c a p a c i d a dp a r ag e n e r a r el
e n l a c e glicosil fosfatidilinositol q u e los c o m p o n e n t e se x c e p
t o para objetivos de investigacin. u n ea l g u n a s protenas de control del c
o m p l e m e n t o a la m e m b r a n a celular oriUn i m p o r t a n t ea v a
n c e en e s t e rea es el e m p l e o de e n s a y o s de enzimas gina HPN. L o
sp a c i e n t e sc o n tal e n f e r m e d a d no tienen D A F .C D 5 9yH R F e
n fijadoras i n m u n o a b s o r b e n t e s (ELISAj p a r ad e t e c t a r los
c o m p l e j o se s t a b l e s la superficie de sus clulas y sufren u n a hemo
lisis intravascular crnica, tromf o r m a d o s en el s u e r o durante la activa
cin del c o m p l e m e n t o .E s t o se n s a y o s b o c i l o p e n i a y dis
minucin de la h e m a t o p o y e s i s (Jarva, 1999). L a deficiencia son m u y
sensibles y pueden d e m o s t r a r rpidamente q u e va del c o m p l e m e n del
C 1 inhibidor origina e la n g i o e d e m a hereditario, u n ae n f e r m e d
a d caracteri- to est activada en varios e s t a d o s de e n f e r m e d a d (Mo
rgan. 1994a). z a d ap o r episodios recurrentes de e d e m a subcutneo y s u b m
u c o s o . Esta defiEn la activacin, m u c h a s protenas del c o m p l e m e n
t oe x p r e s a nn u e v o s c i e n c i ap u e d eh e r e d a r s e o adquirir
se tras el desarrollo de a u t o a n t i c u e r p o sc o n antigenos (neoantgeno
s) que no son e x p u e s t o s en la protena n a t i v a plastra el C1 inhibidor
. L o sp a c i e n t e sc o n deficiencia del C1 inhibidor a m e n u d o mtica. E
l neoantgeno presente en el M A C pero n o presente en los c o m p o m u e s t r
a n niveles bajos de C4 y C2. d e m o s t r a n d o una activacin incontrolada n
e n t e sn a t i v o s termnales es quizs el ms interesante. El a n t i c u e r p o
p a r a del C1. Se c r e eq u e el a n g i o e d e m a hereditario es c a u s a
d o principalmente p o r e s t e neoantgeno e x i s t e y se ha utilizado p a r a
estudiar el nivel de neoantla prdida de la regulacin del s i s t e m ag e n e r a
d o r de cininas por el C1 inhibig e n op o r inmunofluorescencia as c o m op o r
E L I S A (Falk. 1 9 8 3 ; Sanders. d o r (Cugno. 1998; Davis. 1998). 1985). El
nivel de neoantgeno est elevado en sangre y en lquido cefalou c h o s pacientes con
activacin consiguiente del c o m p l e m e n L o sp a c i e n t e sc o nh y p o
g a m m a g l o b u l i n e m i aoi n m u n o d e f i c i e n c i ac o m b i n a
d a rraqudeo en m u g a r e s de s e v e r aam e n u d ot i e n e n disminuidos
los niveles de Clq. En parte, e s t o s nive- to (Sanders. 1986). Adems, est prese
nte en los tejidos en los l o m p l e j o terminal. Por ejemplo, est p r e s e n

t e en el tejido lesiol e sd i s m i n u i d o sd eC 1 qs e relacionan c o n los

niveles b a j o sd eI g Ge nl a circu- depsito del c n a d o en los glomrulos de
los p a c i e n t e s con glomerulonefritis (Falk. 1983) y lacin. P a r e c e que
el Clq i n t e r a c c i o n a con la IgG en la circulacin y que e s t a en la p
iel lesionada en los lugares de L E S activo (Biesecker. 1982). A q u e interacc
in c o n d u c e , a su vez. a una disminucin del c a t a b o l i s m o del Clq. r
encia del C3 depositado en la piel n o r m a l de p a c i e n t e sc o nL E Syc
o nt e s t de b a n d a para el lupus positivo, el neoantgeno M A C solo se e n c
u e n t r a en las lesiones. EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENF
ERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD E nm u c h o sc o n t e x t o s
d e enfermedad, las f u n c i o n e s del c o m p l e m e n t os o n n o r m a l
m e n t ep r o d u c i r inflamacin o dao tisular. C u a n d o el c o m p l e m e
n t o juega un p a p e l en el desanollo de la enfermedad, a m e n u d o es a c
t i v a d op o r un Enfermedades reumatolgicas a n t i c u e r p o anormal, un c
o m p l e j oi n m u n eop o rm a t e r i a l extrao. F r e c u e n t e L ae n f
e r m e d a d reumatolgica que ha sido evaluada ms e x t e n s a m e n t e m e n
t e es i m p o r t a n t ee v a l u a r el nivel de u n oyo t r oc o m p o n e n
t e del c o m p l e - en c u a n t o a la contribucin del c o m p l e m e n t o
a la actividad de la e n l e r m e d a d m e n t oc o m om e d i d ad el a activ
idad d eu np r o c e s od ee n f e r m e d a d .P o r ello, l o s es el L E S (A
gnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta e n f e r m e d a d se f o r m a n p a c
i e n t e sc o nL E Sa c t i v op u e d e nt e n e rd i s m i n u i d o s los ni
veles de C3 y C4, y grandes cantidades d ec o m p l e j o s inmunes. S ee n c u
e n t r a ni n m u n o c o m p l e j o s e s t o s niveles d i s m i n u i d o s
del c o m p l e m e n t op u e d e ns e g u i r s ec o m ou nm a r c a - circul
antes y u n i d o s a tejidos. E s t o si n m u n o c o m p l e j o sa c t i v a
n el c o m p l e d o ra p r o x i m a d od el a actividad d el ae n f e r m e d
a d . mento, y los productos de activacin del c o m p l e m e n t oc o n t r i b
u y e n a que

904
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
m a t i s m o severo o sepsis incontenible. H a y evidencia de activacin m a s i
v a contine la inflamacin. A m e n u d o estn disminuidos los niveles de C3 y C4 de
l c o m p l e m e n t o en estos pacientes, lo q u e sugiere q u el a sb a c t e
r i a syl o s en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los p
acientes c o n p r o d u c t o sb a c t e r i a n o s activan e lc o m p l e m e
n t o( H a m m e r s c h m i d t , 1980). e n f e r m e d a d activa. Algunos s
ugieren q u e un nivel bajo de C4 es el m e j o r P a r e c e que se activan la
va clsica y la va alternativa (Langlois. 1988). Se indicador de que la e n f e r m
e d a d contina activa. Sin embargo, hay pacientes f o r m a n factores inflamato
rios c o m o el factor activador de neutrfilos y el C5a. c o ne n f e r m e d a d
activa q u em u e s t r a n niveles n o r m a l e sd e C4. D ea c u e r d o H a
y evidencia de que los neutrfilos infiltran el pulmn, y se c r e e que los procon
otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantgeno del MAC p u e d e ser ducto
s oxidativos neutroflicos y las proteasas son responsables d em u c h o un indica
dor m e j o r de enfermedad activa (Gawryl, 1987). C o m o se trat preu l m o n a
rq u e ocurre. viamente, el c o m p l e m e n t op a r e c e jugar un papel ese
ncial en el aclaramien- del dao p to de l o si n m u n o c o m p l e j o s circul
antes, particularmente de aquellos q u e contienen isotipos a c t i v a n t e s
del c o m p l e m e n t o IgM o IgG. El depsito de C3b sobre el i n m u n o c o m
p l e j o procede de la activacin del complemento, que Enfermedades renales p e
r m i t e la interaccin con clulas que poseen el receptor de C3b (CR1). Con la unin
a los eritrocitos a travs del CR1. se impide que los complejos inmuEl c o m p l
e m e n t op a r e c e ser una c l a v e importante en el dao g l o m e r u l a r
en nes se difundan del p l a s m a a los tejidos d o n d ep u e d e n originar
dao. Los erim u c h a s de las glomerulonefritis (West, 1998). E s t o se d e m u
e s t r aam e n u d o t r o c i t o s que u n e nai n m u n o c o m p l e j o s
circulan h a c i a el hgado, donde los por el depsito de C3 y otros c o m p o n e
n t e s , en o c e r c a de la m e m b r a n ab a s a l i n m u n o c o m p l e
j o s son eliminados p o r un p r o c e s o que no disminuye la vida glomerular
. Adems, el M A Ch a sido r e c o n o c i d o en el dao g l o m e r u l a r en m e
d i a de los hemates (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). E n las enferpacientes
c o n glomerulonelritis y LES. Se ha d e m o s t r a d oq u e los p a c i e n t
e s m e d a d e s en las que el c o m p l e m e n t o es activado y estos p r o
d u c t o si n m u n o - c o ne n f e r m e d a d del s u e r od e b i d aai n
m u n o c o m p l e j o s circulantes tienen lgicamente activados se f o r m a n
en la circulacin, el nmero de CR1 por erilesin glomerular. En el anlisis del suero,
estos pacientes m u e s l r a n la actitrocito est disminuido. Esto p u e d e res
ultar de la eliminacin d e algunos d e vacin de las vas clsica y alternativa, o de a
mbas. Tradicionalmente, se h a l o s CR1 c u a n d o el c o m p l e j oi n m u n
e es retirado del eritrocito en el hgado credo que los complejos son depositados
en los glomerulus a m e d i d aq u e (Ross, 1985). Adems del LES, se ha publicado
que los eritrocitos de paciense filtra el p l a s m aq u e contiene los i n m u
n o c o m p l e j o s .U n av e z depositados, t e s con e n f e r m e d a d crn
ica por aglutininas fras. HPN, a n e m i a hemolhca e s t o sc o m p l e j o s act
ivan e lc o m p l e m e n t o .U np u n t od e vista alternativo e s autoinmune.
sndrome de Sjogren y neumona por Mycoplasma pneumoniae q u e los anticuerpos cont
ra las estructuras glomerulares f o r m a ni n m u n o c o m tienen r e d u c i
d o el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depsitos i n m u n e s plejos en el r
ion que luego activan el c o m p l e m e n t op a r ac a u s a r dao local h a n s
ido eliminados de los eritrocitos en estas e n f e r m e d a d e s (Atkinson, (D
aha, 1979). A u n q u e los anticuerpos frente a las estructuras de la m e m 198
6: Ross, 1985). brana basal glomerular son c l a r a m e n t e importantes en el

sndrome de Goodpasture, su papel global en las glomerulonefritis es ms cuestionab

le. El L a s protenas del c o m p l e m e n t o actan c o m o reactantes d e fase
a g u d ay papel del c o m p l e m e n t o en la e n f e r m e d a d intersticia
l y tubular est m e n o s los niveles p u e d e nn oe s t a r disminuidos incluso
e n situaciones e n las q u e claro; sin embargo, hay quienes c r e e n que el
c o m p l e m e n t o tambin funcioocurre la activacin del c o m p l e m e n t o .
Se encuentran niveles sricos del c o m ae n estos trastornos. Interesantemente,
e na l g u n o sp a c i e n t e sc o ng l o m e p l e m e n t on o r m a l e soa
u m e n t a d o s en la artritis r e u m a t o i d e juvenil, en el reu- n rulo
nefritis con ni v el e s m u y baj o s d e C3. una protei n a l a m a d a factor
nefrtim a t i s m o palindrmico. en la seudogota. en la gota, en el sndrome de Rei
ter co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la va de la C3 c o n v e r t a s a alternativa.
E s t e y en la artritis gonoccica. AI m i s m o tiempo, p a r e c e n existir n
iveles disminuifactor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb q u ea u m e n
t a la v i d am e d i a dos del c o m p l e m e n t o en el lquido sinovial en un
nmero de otras enfermede l a C3 convertasa de l a via al t ernati v a en ms de 10
v e c e s (Daha. 1 9 7 9 . d a d e s reumatolgicas. incluyendo la artritis reuma
toide. Se c r e e que la dis1976). El C 3 N e Fp a r e c e proteger a la C3 conv
ertasa de la va alternativa de minucin d e la actividad hemolitica total del c o m
p l e m e n t o (CH50; vase la eliminacin por la disociacin por el f a c t o r H (
Fearon, 1980). Se c r e eq u e despus en E n s a y o s del c o m p l e m e n t o
) y la presencia de productos de degrael C 3 N e F es responsabl e de l o s ni v
el e s tan baj o s de C3 p r e s e n t e s en e s t o s dacin del C3 y del f a c
t o rBr e p r e s e n t a n la activacin intraarticular en el lquip a c i e n t e
s pero n os ec r e eq u e juegue u n papel central e ne l desarrollo d el a do
sinovial de m u c h o sp a c i e n t e sc o n artritis r e u m a t o i d e seron
egativa. LES, nefritis. seudogota, gota, sndrome d e Reiter y artritis gonoccica.
Esto n o es cierto
a
en fluidos o b t e n i d o s de p a c i e n t e sc o n artritis degenerativa. En
fermedades dermatolgicas Enfermedades infecciosas C o m o en los otros grupos d e
e n f e r m e d a d e s sealados, se c r e e que el c o m p l e m e n t ot o m a
parte en el dao tisular en una variedad de e n f e r m e d a C o m o se mencion an
teriormente y c o m o se evidenci en hallazgos clnides dermatolgicas. Estas incluye
n el penfigoide ampollse el penfigoide cos en p a c i e n t e s con deliciencias
genticamente controladas del c o m p l e m p o lo s a adquirida, la m e n t o , e
l s i s t e m a del c o m p l e m e n t oj u e g a un papel crucial en la defens
a con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermlisis a m p o r t a n t
e tra l o s microorganismos. L o s pacientes c o ns e p t i c e m i ap o rG r a
m negativos dermatitis herpetiforme y el pnfigo vulgar (Yancey, 1998). Es i s a b
e r que los niveles sricos del c o m p l e m e n t o suelen e s t a rn o r m a l
e s o eleam e n u d o tienen niveles disminuidos de C3 y de c o m p o n e n t e
s de la va altervados en estos estados inflamatorios, y de q u e la i m p o r t
a n c i a del c o m p l e nativa, al igual que p a c i e n t e s con ciertas e n
f e r m e d a d e s fngicas c o m o la m e n t o es estimada por anlisis de inmun
ofluorescencia de las biopsias lisus e p t i c e m i a criptoccica. El c o m p l
e m e n t op u e d ee s t a r implicado en el dao lares y p o r estudios del liqu
ido de l a ampolla. Adems. G a m m o n y cois. tisular a s o c i a d o con la inf
eccin crnica. Se s a b e que los p a c i e n t e sc o n (1984) han desarrollado un
m o d e l o in vilro til para el e s t u d i o de e n f e r m e hepatitis infecc
iosa H b s A g positiva tienen una cada precoz en el C3 srico, a d e s cutneas m e
d i a d a sp o r anticuerpos anli-membrana basal. E s t o s q u ep o s t e r i o
r m e n t e vuelve a la normalidad. E s t op u e d ee s t a ra s o c i a d o co
n d autores h a nm o s t r a d oc o n c l u y e n t e m e n t e que e lC 5 ae su
ne l e m e n t oc l a v e signos de e n f e r m e d a dp o ri n m u n o c o m p
l e j o s (esto es, la artralgia). De u n a f o r m a similar, e lc o m p l e m
e n t op a r e c e jugar u n papel importante e nm u c h a s en la patognesis de
l penfigoide ampolloso y de la epidermlisis ampollosa adquirida. El C5a acta c o m
o un quimioatrayente necesario p a r a el aflujo d e i n f e c c i o n e s para

sitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la leucocitos polimor

fonucleares a los lugares de dao tisular en e s t a s enfergiardiasis y la malari
a. L a discusin detallada d e las interacciones entre el medades. s i s t e m a d
el c o m p l e m e n t o y los parsitos, las bacterias y los virus no s e e n c u
e n t r a dentro de los objetivos de e s t e capitulo y el lector d e b e remit
irse a revisiones sobre el t e m a (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moff
itt, 1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante r e c o n o c e r que lo
s nive- Enfermedades hematolgicas les del c o m p l e m e n t o srico en general n
o son un ndice fiable de actividad d ee n f e r m e d a de n estas condiciones. E
nm u c h o s tipos d ea n e m i a hemolitica a u t o i n m u n e ,e lc o m p l
e m e n t oj u e g a un papel i m p o r t a n t e en la opsonizacin de los eritro
citos, c o n d u c i e n d o a su Se h a estudiado el papel del c o m p l e m e
n t o en el sndrome de dificultad c l a r a m i e n t o por las clulas del s i s t
e m a reticuloendotelial. respiratoria del adulto (SDRA), un p r o c e s o frec
uente en pacientes con trau- a

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

905
Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento est claramente i
mplicado, los niveles sricos del complemento suelen ser normales. El complemento
es particularmente importante en el aclaramiento de clulas recubiertas con crioag
lutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos autoanticuerpos (aglutininas
frias) estn asociados con trastornos linfoprolferativos que siguen a infecciones,
o pueden ser hallazgos aislados, especialmente en los ancianos. Las aglutininas
fras generalmente se unen ptimamente a temperaturas subfisiolgicas, que se encuentr
an en algunas reas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos,
y las orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes
vuelven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas fras son anti
cuerpos IgM. El sndrome de la hemoglobinuria paroxistica fra (HPF), por ejemplo, r
esulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen a las clulas a t
emperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez calientes. Aunque el an
ticuerpo es diferente, los efectos fisiopatolgicos son similares. Otros autoantic
uerpos que activan el complemento se unen ms eficazmente a temperaturas calientes
. En general, estas aglutininas calientes son del isotipo IgG. En algunos casos,
estos anticuerpos pueden estar asociados con enfermedades malignas linfoprolfera
tivas y con infecciones virales. La mayora de los anticuerpos IgG reactivos al ca
lor encontrados en la anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son
pobres activadores del complemento en contraposicin con las aglutininas fras y co
n los anticuerpos frente a los grupos sanguneos anti-A y anti-B. Sin embargo, alg
unos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la lisis. En un
a anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria paroxistica noct
urna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de lisis mtravascular. S
e cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se lleva a cabo por la
va alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los niveles sricos del compleme
nto siempre son normales y el test directo antiglobulina es siempre negativo. El
defecto en la HPN es una prdida de protenas de enlace glicosil fosfatidilinositol
en la superficie de las clulas de los pacientes originado por mutaciones en el g
en fosfalidil glicano A (p/g-A). Entre otras protenas de unin a travs de este enlac
e de membrana estn el DAF y el CD59. dos molculas que controlan la activacin del co
mplemento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (vase anterio
rmente en Regulacin de la activacin del complemento). Se cree que la lisis de los
eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activacin incontrolada del compleme
nto en la superficie de estas clulas. Recientemente, se inform de que, aunque la pr
dida de DAF y CD59 de la superficie de los eritrocitos en pacientes con HPN es r
esponsable del aumento de la sensibilidad a la lisis mediada por el complemento,
la deficiencia de CD59 origina una mayor sensibilidad a la lisis celular que la
deficiencia de DAF (Shichishima, 1999).
temente, el tipo de clula glial ms abundante, el astrocito, demostr sintetizar in v
itro todas las protenas del complemento en condiciones inflamatorias (Morgan. 199
6). Adems, los astrocitos y las clulas microgliales expresan receptores del comple
mento n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar de la barrera hematoenceflica
. el cerebro tiene la capacidad de preparar una reaccin inflamatoria dependiente
del complemento c o m o mecanismo de defensa.
Enfermedades cardiovasculares
Se admite la implicacin del sistema del complemento en la lesin por isquemia'reper
fusin miocrdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi. 1997a). El mecanismo por
el que el complemento contribuye al infarto agudo de miocardio en los pacientes
todava no est claro. Sin embargo, se han demostrado los depsitos de los componentes

de las vas clsica y alternativa en el miocardio afectado junto con C5b-9 La produ
ccin de analilotoxmas que acompaan a la activacin del complemento parece ser respon
sable de la reaccin inflamatoria local. La demostracin ms clara del efecto del comp
lemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del modelo a
nimal de oclusin de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los conejos con deficien
cia genticamente controlada de C6 muestran una significativa reduccin del tamao del
infarto en comparacin con los conejos normales. Adems, la infiltracin neutrofilica
se redujo significativamente en los conejos con deficiencia de C6. sugiriendo u
n papel crucial de los componentes finales del complemento en la generacin de inf
lamacin local. El complemento tambin parece jugar un papel en el desarrollo de les
iones de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el
que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arteriosclerticas no
est claro. Sin embargo, el depsito de los componentes finales del complemento (C5b
-9) ha sido demostrado en las ntimas adelgazadas y en las placas fibrosas. La act
ivacin del sistema del complemento est asociada con etapas prelesionales y con la
progresin de lesiones arteriosclerticas (Niculescu, 1987; Seifert, 1989). Los cone
jos con dficit de C6 demostraron ser menos susceptibles que los conejos normales
a las lesiones arteriosclerticas inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).
Biocompatibilidad
Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el complemento, par
ticularmente la va alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En contacto con la
sangre o con los lquidos tisulares. estos materiales pueden activar el complemen
to y producir inflamacin local o dao tisular. Los materiales deben ser testados so
bre su capacidad de activar el complemento antes de ser utilizados ampliamente.
Trasplante de rganos Enfermedades neurolgicas
El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema nervioso se
ha hecho evidente en los aos recientes. Esto es algo sorprendente, ya que la bar
rera hemaloenceflica bloquea eficazmente la penetracin del complemento en el liqui
do cefalorraqudeo. La activacin del complemento fue demostrada en enfermedades com
o la miastenia gravis. la esclerosis mltiple, el lupus cerebral, el sndrome de Gui
llain-Barr y la enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El deps
ito de protenas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y se dem
ostr la activacin del complemento en el lquido cefalorraqudeo (LCR) de pacientes con
muchas de estas enfermedades. Presumiblemente, la inflamacin origina una ruptura
de la barrera hematoenceflica con la penetracin local de protenas del complemento.
Adems, algunas clulas sintetizan protenas del complemento. Hay evidencia de que la
activacin del complemento puede estar implicada en el dao a la mielina, originand
o de este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del perifrico.
Tambin se demostr que el complemento estaba implicado en la enfermedad de Alzheime
r y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alzheimer, un pptido derivado d
el amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y activa el complemento en las placa
s seniles del cerebro enfermo. InteresanEl xito del trasplante de rganos ha creado
un gran problema, la escasez de rganos humanos para satisfacer las demandas para
un nmero de pacientes que no deja de crecer que lo estn esperando como tcnica quirr
gica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes animales como el
cerdo en este campo como una lgica alternativa a los rganos humanos. Sin embargo,
los rganos porcinos vascularizados son susceptibles de una intensa reaccin de rech
azo, denominada rechazo hiperagudo. cuando son implantados en primales o en huma
nos (Platt. 1998; Dalmasso, 1992). Esta reaccin es mediada por anticuerpos que se
unen a las clulas endoteliales y la activacin del complemento. Se demostr que la a
ctivacin del complemento era crucial en el dao tisular en la reaccin hiperaguda de
los xenotransplantes. La activacin del complemento en las clulas endoteliales xeno
gnicas origina su activacin (es decir, las clulas endoteliales adoptan un fenotipo
procoagulante), que conduce a trombosis intravascular e intersticial y a hemorra
gia. Tal intensa reaccin se debe a la incapacidad de las molculas reguladoras del
complemento asociadas a las clulas porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar
la activacin del complemento humano. Por lo tanto, el xito de esta prometedora int
ervencin teraputica recae en la capacidad de controlar la activacin del complemento

. El papel del complemento en el rechazo de rganos huma-

906
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA ficiosa no est claro y puede incluir el bloqueo de anti

cuerpos a travs de las interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los rec
eptores Fe para IgG en las clulas lagocticas, la modulacin de las funciones de las
clulas T y B y la seleccin de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente
tiene un efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demo
strado interferir en la reaccin de shock dependiente de la via clsica de Frossm a
n en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del xen
omjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Adems, el tratamiento con ali
as dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibi el depsito de C3b y C5b-9
que normalmente se ve en los capilares del endomisio de estos pacientes (Basta,
1994). La IVIG inhibe la activacin del complemento a travs de su porcin Fe. El mec
anismo exacto por el que la IVIG bloquea la activacin del complemento en la super
ficie del objetivo todava no se comprende completamente. Informes han demostrado
que la IVIG puede prevenir el dao tisular mediado por el complemento interactuand
o directamente con el C 1 o previniendo la unin del C4 con la clula diana (Mollnes
, 1995; Miletic, 1996).
nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activacin del complemento
contribuye de algn modo a los episodios de rechazo agudo y crnico (Baldwin, 1995).
UTILIDAD CLNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO
La activacin del complemento contribuye indudablemente al dao lisular observado en
una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el empleo de agentes que bl
oquean la activacin del complemento debe mostrar su utilidad para limitar el dao t
isular. Desgraciadamente, no hay agentes disponibles para el uso en la prctica cln
ica. Se estn realizando investigaciones para desarrollar inhibidores del compleme
nto que demuestren eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en
el control de la infeccin, un inhibidor del complemento adecuado no debera interf
erir con esta funcin del complemento. Tambin se sabe que el C3a y el C5a son poten
tes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el inhibidor desea
ble deber actuar a nivel de la C3 convertasa clsica y alternativa para evitar la p
roduccin de estas anafilotoxinas. Se han producido muchos inhibidores recientemen
te y estn siendo desarrollados actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhi
bidores que se muestran como promesas en el rea clnica. Para una descripcin ms compl
eta de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento, se r
emite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998; Wagner, 19
98). Como se discuti previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la via
clsica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegracin de las C3
y C5 convertasas de ambas vas y sirve como cofactor para la degradacin del C4b, C3
b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta molcula representa un excelen
te candidato para la inhibicin teraputica del sistema del complemento en los estad
os de enfermedad. Una forma recombmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue pr
oducida y demostr mantener todas las propiedades de la protena nativa unida a la m
embrana. En una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe
que la activacin del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejora signif
icativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros: xenotranspla
nte cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alveoltis en un modelo
de reaccin pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesin tisular de isquemia/reperfus
in miocrdica (Weisman, 1990), desmielinizacin en un modelo experimental de encefalo
mielitis alrgica en ratas (Piddlesden, 1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995).
El sCR1 ha entrado ahora en la fase I de los ensayos clnicos en pacientes con inf
arto de miocardio y en pacientes con SDRA inducido por quemaduras. Otro inhibido
r del complemento que ha entrado tambin en la fase I de los ensayos clnicos es un
anticuerpo humanizado de cadena simple contra el C5 humano. La ventaja de tal an

ticuerpo es que permite el bloqueo de la activacin del complemento sin liberar C5

a y depositar C5b-9, lo que se sabe que promueve el potente dao tisular debido a
la inflamacin y a la activacin celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demost
r en modelos animales interferir en el rechazo hiperagudo de los rganos porcinos e
n sistemas de perfusin in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de a
rtritis en un modelo de ratn de artritis inducida por colgeno (Wang. 1995), para d
isminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratn de LES (Wang, 1996) y para dis
minuir el tamao del infarto en un modelo de rata con un modelo de lesin de isquemi
a/reperfusin miocrdica (Vakeva. 1999). EL anticuerpo anti-C5 humanizado demostr ser
un potente inhibidor del sistema del complemento in vitro (Evans, 1995). Los re
sultados de los ensayos clnicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir sign
ificativamente el dao al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirrgico
cardiopulmonar Rollins, 1998). Las preparaciones de IgG humana purificada para e
l empleo intravenoso (IVIG) se han empleado en un nmero de enfermedades autoinmun
es e inflamatorias como la prpura trombocitopnica idioptica, la enfermedad de Kawas
aki, el sndrome de Guillain-Barr y la miastenia gravs (Dwyer. 1992). Sin embargo, e
l mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su accin beneENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales
Estn disponibles los mtodos que permiten asegurar la determinacin de los niveles de
cualquiera de los componentes de las vas clsica, alternativa y de la MBLectma, as
como muchas enzimas y reguladores del sistema del complemento. Sin embargo, much
os de estos ensayos no estn disponibles en los laboratorios clnicos de rutina y es
tn restringidos los laboratorios de investigacin. Centraremos nuestra atencin sobre
las tcnicas que n o requieren para su realizacin un laboratorio especializado en
la investigacin del complemento. Para ms detalles relativos a mtodos que requieren
tcnicas ms especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley, 1985:
Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Wrzner, 1997). Los ensayos sobre el c
omplemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que miden las protenas del co
mplemento como antigenos en los lquidos biolgicos y aquellos que miden la activida
d funcional de un componente dado. Ambos tipos de tcnicas tienen ventajas e incon
venientes. Los mtodos de anlisis antignico (inmunoquimicos) generalmente son fciles
de realizar. Estos ensayos antignicos con altamente especficos, requieren menos re
actantes especializados, son ms baratos y se realizan en una cantidad de tiempo c
onsiderablemente menor. Los anticuerpos para las protenas del complemento humano
y para las protenas purificadas del complemento humano estn comercialmente disponi
bles. El Linscott's Directory ol Immunological and Biological Reagents (1998) es
una gua til para conocer los reactantes del complemento disponibles. Son sulicien
tes en estos ensayos, en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los
mtodos comunes de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razn, los ensayos ant
ignicos son fcilmente adaptables al laboratorio clnico. Por otra parte, los ensayos
antignicos no proporcionan informacin sobre la actividad de un componente ya que
pueden detectar los productos de degradacin asi como los componentes funcionalmen
te activos. La presencia en suero de pequeos fragmentos de una proteina con activ
idad antignica puede confundir los resultados. Algunos ensayos antignicos emplean
inmunodifusin radial. En estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir ms rpi
damente que la molcula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevad
os. Como ejemplo, el ensayo antignico ms frecuentemente empleado para el C3 mide s
u principal producto de degradacin, el C3c. por inmunodifusin radial. Para medicio
nes seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C durante un nmero de das para
permitir la completa conversin de C3 en C3c. En realidad, esto no se hace normal
mente y por ello representa un motivo de error, aunque el error es pequeo y norma
lmente no tiene consecuencias clnicas. En general, los ensayos antignicos no son t
an sensibles c o m o los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos
de un componente presente en ciertos lquidos corporales. La sensibilidad de los e
nsayos antignicos en cierto grado de la concentracin del anticuerpo empleado, y co
n los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antignica tan pe
quea como 10 pg/ml.

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

907
H a y kits disponibles que e m p l e a n la inhibicin de la unin de un sustraTabla
38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los to r a d i o m a r
c a d op a r ad e t e c t a r varios pptidos del complemento. Estos e n s a y o
s del complemento equipos estn disponibles para la medicin del C3a. C4a y C5a. La
utilidad Soluciones stock* de estas m e d i c i o n e s todava est debatindose. Est
disponible un infor1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS) m e detallado
sobre los procedimientos de m e d i d a de la actividad ltica funDisolver 85 g de
NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1 . 5 I de cional y sobre los ni
veles antignicos de los c o m p o n e n t e s de la va alteragua destilada. Ajusta
r el pH a 7.350.05 con CIH IN y llevar hasta 2 l de volumen con aguda destilada E
sta solucin es cinco veces la nativa (Minta, 1985). Tambin s eh a n descrito ensay
os diseados para concentracin de una solucin isotmca y puede almacenarse a 4"C m e d
i r la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el dur
ante al menos un mes. suero h u m a n o pero requieren reactantes especializados
que pueden no 2. cido disodio etilendiaminetertetr actico 0.01 M (stock EDTA) e s
t a r disponibles c o m e r c i a l m e n t e (Gaither. 1979). H a n sido desar
rollados Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila e n s
a y o s con ELISA para la medicin de productos de degradacin d e las da. Ajustar
el pH a 7.650.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de voluprotenas del c o m p l e m
e n t o o para los complejos formados tras l a activamen con agua destilada El
stock EDTA puede utilizarse durante al menos tres semanas con almacenaje a 4"C.
cin del complemento. H a y equipos comercialmente disponibles (Quidel. San Diego.
CA). Estos m i d e n los productos de degradacin de las prote3. Dextrosa con CaMg
' y gelatina (D5wg++) Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un
tubo sepanas del c o m p l e m e n t oam e d i d a que se generan tras la activ
acin del c o m rado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentnp l
e m e n t o empleando anticuerpos monoclonales especficos. L a activacin dolo has
ta que los granulos de gelatina estn disueltos Aadir la del c o m p l e m e n t o
por la va clsica p u e d e medirse siguiendo los niveles de solucin de gelatina a l
a solucin de dextrosa Aadir 2 mi de la soluC4d en suero frente a los de C4. Tambin,
la medicin por ELISA de los cin stock 4 y 2 mi de la solucin stock 5 a la mezcla A
justar el pH a 7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solucin
complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona u n a medida de la activacin del puede emple
arse durante una semana cuando se almacena a 4 C c o m p l e m e n t o a travs de
la via clsica. L a activacin de la va alternativa 4. MgCI. 1 M p u e d em e d i r
s ep o rE L I S A evaluando los niveles de los complejos Bb, o Preparar 100 mi d
e solucin que contenga MgCI, 2 M aproximadaC3BbBP o C3bP en la circulacin (Mayes,
1984). Se inform de que las mente. Medir la gravedad especilica de la solucin y de
terminar la m e d i c i o n e s de dichos complejos cuantifican tan p o c oc o m
o 10 a 20 ng/ml concentracin de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics' de
C 3 b P en suero. Este ensayo puede tambin emplearse para medir los (tablas de c
onversin para valores concentrados de soluciones acuoc o m p l e j o s de activac
in unidos a la superficie. L a activacin a travs d e sas) A|ustar la concentracin a
1 M aadiendo agua destilada Almacenar a 4C. cualquier via p u e d e monitonzarse m
idiendo los niveles de iC3b o de la lor5. CaCl 0.15 M m a soluble del complejo d
e ataque a la membrana. sC5b-9. Adems, los Se preparan 100 mi de una solucin de Ca
CK.3 M aproximadamente kits de ELISA estn disponibles para m e d i r la generacin
de anafilotoxmas Medir la gravedad especilica de esta solucin y determinar el CaC
l, en sueroplasma. Y a que el C3a y el C5a son rpidamente convertidos en como se
describe arriba Ajustar a 0 1 5 M aadiendo agua destilada s u sf r a g m e n t o
s desArg inactivos p o r carboxipeptidasa-N en el suero, estos Almacenar a 4"C.
e n s a y o s emplean anticuerpos monoclonales especficos para el C3a-desArg y el

C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI- Soluciones de

trabajo 1. VBS isolnico con gelatina y metales (GVBS++) S A proporcionan una her
ramienta excelente para evaluar la activacin del Aadir 200 mi de la solucin stock 1
(arriba) a 700 mi de agua destilac o m p l e m e n t oe n los lquidos biolgicos a
travs lanto d e la via clsica da en un malraz alorado de 1 I de volumen Aadir 1 mi
de la solucin c o m o de la va alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmen
te s o n stock 4 y 1ml de la solucin stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi d
e agua destilada calentando como se describi en la solucin stock caros y requieren
que el usuario establezca una curva de dilucin estn3. Aadir la solucin de gelatina
y ajustar el pH a 7.350.05 Llevar dar. P o r lo tanto, en un solo kit se puede in
cluir u n a cantidad limitada de hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS
++ debe prepararmuestras. se en Iresco una vez cada semana
2. Dextrosa-VBS Da en iones con metales y gelatina (DGVBStt)
Evaluacin funcional de la va clsica L o se n s a y o s funcionales del c o m p l e
m e n t os o nh e r r a m i e n t a s sensibles y p r e c i s a sp a r a proporc
ionar informacin sobre la actividad de un c o m p o n e n t e . A l g u n o s de
e s t o s mtodos p u e d e n utilizarse p a r a cuantificar la actividad del nive
l m o l e c u l a r , y otros p a r ae x p r e s a r la funcin del c o m p l e m
e n t o en unidad e s arbitrarias. L o s reactantes c o m e r c i a l e s estn di
sponibles p a r a valorar c a d ac o m p o n e n t ed e las vias clsica y alterna
tiva. Sin embargo, p a r a la m a y o r parte, estos e n s a y o s son desarroll
ados en un limitado nmero de centros de investigacin. M u c h o se n s a y o s fun
cionales requieren procedimientos q u er e q u i e r e nt i e m p oyc o m p o n
e n t e s del c o m p l e m e n t o relativamente m u y purificados, q u es o n
ms caros q u e aquellos requeridos p o r los e n s a y o s antignicos. Por l o tan
to, se limitar la descripcin d e los e n s a y o s del c o m p l e m e n t o a los
mtodos d e referencia para la evaluacin de la activacin t a n t o de la via clsica
c o m o de la alternativa. Los a m o r t i g u a d o r e s que se e m p l e a n
f r e c u e n t e m e n t e en la mayora de los laboratorios d o n d e se desarro
llan los e n s a y o s del c o m p l e m e n t os e describen e nl aT a b l a 38
-5. U n od e b e darse c u e n t ad e que la preparacin precisa de estos amortigu
adores e s crtica ya que c a m b i o s en la molaridad y en la concentracin del io
n m e t a lp u e d e n afeelar a los ttulos obtenidos.
Los amortiguadores de diferentes potencias inicas son preparados mezclando la sol
ucin stock 3 con la solucin de trabaio 1. El DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando
tres partes de la solucin citada primero con dos partes de la segunda solucin. El
DGVBS+t debe prepararse en Iresco.
3. EDTA-VBS isotmco (EDTA-GVBS)
Preparar el GVBS como en la solucin de trabajo 1 con la excepcin de utilizar 600 m
i de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las soluciones 4 y 5 no se aaden a
esta solucin. Aadir 100 mi de la solucin stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Lle
var a un volumen de 1 i con agua destilada Esta solucin es estable durante al men
os una semana a 4C
4. VBS isotnico con glicol etilen bis (b-aminoetil ter) N. N N. N acido tetraaceti
co e iones Mg- (EGTAGVBS+)
Aadir 50 mi de la solucin stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un matraz aforad
o de 250 mi de volumen Aadir 1.25 mi de la solucin stock 4 Disolver 0 25 g de gela
tina en 25 mi de agua destilada calentando como se describi en la solucin de Iraba
io 1 y aadir a la solucin. Preparar una solucin stock EGTA aadiendo 0.761 g de E G T
Aa 5 mi de agua destilada Disolver E G T A con NaOH 5 NI A|ustar el pH a 7,350.0
5 con acido actico al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con agua destilada Aadir e
sa solucin stock de EGTA a la solucin de trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y lleva
r a un volumen de 250 mi con agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Ire
sco. I"L a s soluciones s t o c k 1. ? y 3 d e b e na l m a c e n a r s e de 20"
C a -50"C d u r a n t e un

L o se n s a y o sq u em i d e nl a actividad hemolitica total e nu n am u e s t

r a( C H 5 0 ) periodo de lempo indefinido * De W e s tR C (ed) CRC H a n d b o
o k Ol C h e m i s t r y and F h y s i c sB o c a Ratn FL. CRC o la actividad fu
ncional de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o aislados en Press
1985-t986. con permiso g e n e r a le m p l e a n eritrocitos d e oveja c o m o
objetivos d el a lisis m e d i a d ap o re l c o m p l e m e n t o .L o s eritr
ocitos de oveja s o n ms sensibles a la lisis p o r antic u e r p o sym e d i a d
ap o r el c o m p l e m e n t oq u e los eritrocitos de otras especies. a d e c
u a d o s estn c o m e r c i a l m e n t e disponibles. La activacin de la via al
ternaAdems, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolpido (antgeno de Forsstiva d
el c o m p l e m e n t os em i d e fcilmente e m p l e a n d o eritrocitos de con
ejo. m a n )q u ep r o v o c au n ar e s p u e s t ap o t e n t ed e los anticue
rpos e nc o n e j o su n a E s t a s clulas son particularmente sensibles a la li
sis i n d e p e n d i e n t e de antiv e zi n m u n i z a d o se s t o sa n i m
a l e sc o n eritrocitos d e oveja. L o sa n t i c u e r p o s c u e r p o sm e
d i a d ap o r el s u e r oh u m a n o .

908
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) antiForssman de conejo. Como se describi anteriormente, este antgeno es altamente inmu
ngenc e induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos in
munizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con detal
le por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del antis
uero es destruida por la inactivacin con calor a 56 C durante 30 minutos. Los mtod
os para la titulacin del anticuerpo y para la preparacin de las clulas ptimamente se
nsibilizadas se explican en otras obras (Gaither, 1984). Es esencial que se util
ice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los eritrocitos de oveja de modo q
ue pequeas diferencias en la cantidad de anticuerpo sensibilizado no afecten al t
itulo. Los eritrocitos de oveja sensibilizados con cantidades ptimas de anticuerp
o se denominan EA Los componentes intermediarios de la clula con componentes del
complemento unidos a la membrana, que se utilizan en la titulacin funcional indiv
idualizada de los componentes, pueden prepararse utilizando componentes de compl
emento purificados Los mtodos para la preparacin de estos intermediarios celulares
ya se han descrito (Gaither, 1984).
Manejo de las muestras
El correcto manejo de las muestras es crtico para el correcto anlisis funcional de
l sistema del complemento. Par la mayora de los ensayos funcionales, se prefiere
el suero al plasma para el anlisis ya que los quelantes del calcio como el EDTA o
la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las muestras son diluidas ms d
e 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del plasma puede emplearse ya que la
dilucin sobrepasa el electo quelante. Para obtener el suero para los ensayos fun
cionales, la sangre debe dejarse coagular durante 30 minutos a una hora a temper
atura ambiente y despus en hielo durante al menos una hora. Si se necesitan estud
ios del fijador de C1q. se de|a la muestra coagular durante dos horas a temperat
ura ambiente. En este caso, la polimerizacin completa del cogulo parece facilitar
la precisin del ensayo. Para separar el suero, se recoge el cogulo y se centrifuga
de 0 a 4 C durante 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnopr
ecipitantes. la centrifugacin y formacin del cogulo de la muestra debe hacerse a 37
C ya que puede ocurrir la fijacin del complemento si la muestra se enfra. En cier
tos casos, la congelacin disminuir los ttulos de complemento considerablemente. Aun
que las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en menEnsayo del compleme
nto hemoltico total te que un ttulo considerablemente disminuido de complemento slo
puede reflejar un artefacto de una preparacin srica inadecuada. Si se sospecha El
ensayo ms simple sobre la va clsica mide el complemento hemoltico esto, el suero de
be prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activacin total. La ausencia
de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en del complemento. Las mues
tras de suero o plasma deben dividirse en varios los pacientes con dficit gentico
homocigotos. generalmente origina un ttuvolmenes pequeos y almacenarse inmediatamen
te a una temperatura de lo de complemento hemoltico total (CH50) de cero. Sin emb
argo, un valor -40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos
perionormal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales. dos
de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin prdida de la Cuando la hi
storia y los sntomas de un paciente sugieren una posible defiactividad. Cuando lo
s sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes ciencia, deben pedirse l
os ttulos hemolitico y anlignico de los componentes de empaquetarse en un contened
or con grandes cantidades de hielo seco. individuales. A menudo, el ttulo de CH50
ser una medida funcional adecuada de la actividad del complemento.
Preparacin de eritrocitos
La sangre de oveja estril se obtiene de una solucin estril de Alserver. La sangre a

nticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utilizarse y puede e

mplearse durante un mximo de seis semanas si se mantiene estril. La edad de las clu
las afecta mucho a los ttulos de la mayora de los componentes del complemento, y l
os ttulos pueden ser falsamente bajos si se utilizan clulas frescas. En condicione
s estriles, se extrae aspticamente y se centrifuga a 4 C un volumen de clulas. Se e
xtraen el sobrenadante y la capa leucocitaria. y se remtroducen las clulas en una
solucin tampn adecuada. Los detalles del lavado y sensibilizacin de las clulas con
anticuerpos se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alte
rnativa, se extrae aspticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa c
o m o la sangre de oveja.
Preparacin de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos
Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componentes individ
uales o el ttulo de complemento hemoltico total emplean eritrociEl titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la dilucin
de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan diluciones ser
iadas de la muestra y se aaden al EA (Tabla 38-6). En este caso, el punto linal d
el 50% se determina por la transformacin de los datos de Von Krogh. Esta frmula de
rivada empricamente convierte la curva dosis-respuesta en forma de S en una funcin
lineal. Se calculan los valores de / / 1 - / donde Yes la fraccin de glbulos rojo
s usados en el test de dilucin. Se construye una grfica en donde se representa el
logaritmo del volumen relativo del complemento frente a los valores del logaritm
o de V'1-V. Normalmente, se obtiene una lnea recta, y el titulo se calcula determ
inando el volumen relativo de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) E
sle valor se divide p o r el reciproco de la dilucin srica original (1:60 para el
suero humanoi para calcular la concentracin de complemento srico que lisa el 50% d
e las clulas El ttulo de complemento representa el nmero de unidades hemoliticas 50
% que estn presentes en 1 . 0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970). E
l suero de los conejillos de Indias con dficit de C4 est disponible comercialmente
y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una muestra.
El mtodo se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un nmero limitado de labor
atorios est disponible el suero de humanos y conejillos de

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

909
Tabla 38-7 Titulacin funcional de la va alterna (ensayo AH50)
'Si una muestra se suero muestra algn grado de hemolisis (color rojizo), se prepa
ra un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero n
o E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos s
e sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que estn mezclad
os con E E G T A GVBS+ = salmo isotnico tamponado con Veronal con gelatina, E G T
A y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS = salino isotnico tamponado con Veronal con
EDTA; CB = E solo con lampn; CL = E con agua destilada (lisis completa).
:
I n d i a s con dlicil de C2 y el de c o n e j o s con dficit de C6. E s t o s sue
ros son u n aa c e p t a b l e alternativa al e m p l e o de intermediarios celu
lares para titular los c o m p o n e n t e s individuales, ya que solo tienen la
prdida de una protena del c o m p l e m e n t o , Ensayo de la va alterna
En e s t e ensayo, el s u e r oh u m a n o( n o r m a l m e n t e diluido primer
o a 1:5) se diluye s e r i a d a m e n t e y se aade a eritrocitos de conejo que
no estn sensibilizados con un anticuerpo especfico en un tampn que contiene iones m
a g Prueba de fijacin del complemento n e s i o y cido etilenglicol tetraactico (E
GTA) para quelar los iones calcio (los Se dispone de una descripcin detallada de
este e n s a y o (Mayer. 1961), y i o n e s calcio son necesarios p a r a la act
ivacin de la via clsica, no p a r a la actiaqu no se detallar. Sin embargo, ya que l
as reacciones de fijacin del c o m vacin de la via alternativa) (Pangburn, 1988) (
T a b l a 38-7). El ttulo de la va l e m e n t o son de gran importancia en el di
agnstico clnico, s e tratarn brealternativa se d e n o m i n aA H 5 0 y representa
la dilucin final del suero h u m a n o p vemente. La tcnica de la p r u e b ad e p
e n d e de la c a p a c i d a d del c o m p l e m e n t o en el e n s a y o que
lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una grfica del suero fresco de
i n t e r a c c i o n a r con c o m p l e j o s antgeno-anticuerpo. En la simila
r a la descrita p a r a la litulacin del c o m p l e m e n t o hemoltico total par
a primera e t a p a de la reaccin, el c o m p l e m e n t o es i n c u b a d o co
n los m a t e r i a l e s d e t e r m i n a r el AH50. El suero h u m a n op u e
d ep o s e e rav e c e s anticuerpos que p u e d e nc o n t e n e r el antigeno
y el anticuerpo. Si se f o r m a nc o m p l e j o s ant"naturales" p a r a un c
a r b o h i d r a t oe x p r e s a d oa m p l i a m e n t e en las clulas d e o n
e lc o m p l e m e n t o del m i s m om o d oq u e los o t r a se s p e c i e s
diferentes de los h u m a n o s y de los primates. Si se m e z c l au n a geno-a
nticuerpo, interaccionan c c o m p l e j o s de a n t i c u e r p os o b r e el
a n t i g e n o de superficie c e l u l a ri n t e r a c c i o n a n alta concen
tracin de suero con los eritrocitos de c o n e j os ep u e d e inducir la c o n e
l c o m p l e m e n t o . El c o m p l e m e n t o es activado, los c o m p o n
e n t e ss o n fragaglutinacin, que p u e d e alterar la interpretacin del titulo
de A H 5 0 (Tomlinson, m e n t a d o s , y el c o m p l e m e n t o es "utilizad
o" o "fijado". En la s e g u n d a etapa, se 1997). P o r lo tanto, p u e d e se
r til a b s o r b e r el suero con c o n c e n t r a d o de erie z c l a se i n c
u b a a 37 C trocitos de c o n e j o lavados en hielo d u r a n t e 15 a 30 m i
n u t o sp a r ae x t r a e ru n a aaden las clulas de oveja sensibilizadas (EA).
y la m durante u n a hora. Si el s u e r o de la p r u e b ac o n t i e n e el
a n t i c u e r p oc o n t r a el cierta proporcin de anticuerpos naturales, d i
s m i n u y e n d o asi la aglutinacin antgeno utilizado, el c o m p l e m e n t o
se lija y p o r lo tanto no est disponible pac e l u l a r en el ensayo. ra lisa

r el EA. Por ello, la a u s e n c i a de lisis indica una reaccin positiva, y la

lisis c o m p l e t ai n d i c a un resultado negativo. Niveles del complemento
mediante H a y dos aproximaciones generales de las pruebas de fijacin del c o m p
l e ensayos antignicos m e n t o . En la primera, el s u e r oc o n c e n t r a
d o es el que p r o p o r c i o n a el c o m p l e m e n t o , y la cantidad de
c o m p l e m e n t o fijado se d e t e r m i n a por la titulacin del P a r a ut
ilizarla en e n s a y o s antignico, la m u e s t r a (ya sea suero o plasma) sue
ro antes y despus de la fijacin. En la segunda, se e m p l e au n a dilucin s ea l
m a c e n a congelada (20C o menos). La contaminacin bacteriana puede s u e r oq u
e proporciona suficiente c o m p l e m e n t op a r a la lisis de EA o p o c o
de originar la desnaturalizacin o la fragmentacin de las protenas, m i e n t r a s
i n c o unidades CH50) En este caso, se aaden las q u e el hielo y el deshielo no
tienen un electo a d v e r s oi m p o r t a n t es o b r e los ms del suficiente
(tres a c clulas sensibilizadas sin dilucin posterior d e la c a n t i d a dd ec
o m p l e m e n t o . niveles antignicos. En ciertos e n s a y o s del c o m p l
e m e n t o , la m u e s t r a se diluLa incubacin del material del test con el c
o m p l e m e n t op u e d eh a c e r s e a 37 C ye en salino para o b t e n e
r el ndice correlo de concenlracin para la adecuadurante una hora o t o d a la n o
c h e en fri. En general, la incubacin en fri orida cuantificacin. gina ttulos mayore
s. El c o m p l e m e n t op u e d ea c t i v a r s ep o r un nmero d e L o s anli
sis antignicos d e las proteinas del c o m p l e m e n t oh a c e n uso de a g e
n t e s diferentes de los c o m p l e j o s antgeno-anticuerpo c o m o las bacter
ias, una de las m u c h a s tcnicas de precipitacin inmune. La inmunodifusin radial
e n d o t o x i n a s y y-globulinas agregadas. P o r lo tanto, s o nn e c e s
a r i o sl o sc o n s i m p l e (RID) utilizando el mtodo ya sea de F a h e y o d
e Mancini es el mtotroles p a t ad e m o s t r a r que ni el suero ni el antgeno a
islados fijarn el c o m do e m p l e a d o ms frecuentemente para calcular una cua
ntificacin especfica plemento. El test de fijacin del c o m p l e m e n t oe s de p
articular v a l o r en t a n t o d eu n a protena. En a m b o s mtodos, el antgeno
se aade a los pocilios en que n o n e c e s i t a que l o s anti g enos o l o s a
n t i c u e r p o s estn p r e s e n t e s en su un gel q u ec o n t i e n e ant
icuerpo, y se f o r m a n anilos de precipitacin. El mtof o r m aa l t a m e n t e
purificada. P u e d e n utilizarse tanto antgenos solubles c o m o do de F a h e
ye m p l e a un anticuerpo que no est en exceso. El t i e m p o de difuparticula
dos, y se p u e d e nm e d i rt a n t o los antgenos c o m o los anticuerpos. sin
al que los r e s u l t a d o s son ledos es por ello crtico. Los p u n t o s de di
fusin o m p l e m e n t o es el e m p l e o finales no se alcanzan y p u e d e n
levar a m e d i c i o n e si n a d e c u a d a s de los nive-Una aproximacin alte
rnativa al test de fijacin del c de e n s a y o s con ELISA que m i d e n los p r
o d u c t o s de fragmentacin de las proles del c o m p l e m e n t o antignico.
El mtodo de M a n c i n i utiliza un e x c e s o de tenas del c o m p l e m e n t
o o de los c o m p l e j o sf o r m a d o s tras la activacin del a n t i c u e r
p o en un gel y es ms sensible y exacto. El mtodo de M a n c i n i se uticompleme
nto, c o m o se discuti previamente. De cualquier m o d o , estos ensaliza p o rm
u c h a s firmas c o m e r c i a l e sp a r a la preparacin de los cristales de
inmunodifusin. Existen disponibles equipos de inmunodifusin radial p a r a todos l
os c o m p o n e n t e s de la va clsica y alternativa. E s t o s equipos consiste
n e n cristales cubiertos d eu n a tina c a p ad ea g a r o s aa l2 %q u ec o n
t i e n e n anticuerpos monoespecficos. El suero proteico estndar (un pool estabil
izad od e suero h u m a n o normal) s e suministra, normalmente, e n soluciones
prediluidas. C a d a solucin estndar contiene una cantidad especfica de la protena q
ue s e est m i d i e n d o para su uso en la construccin d e la c u r v ad e refer
encia.

910
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es

degradada por la enzima convertidora de angiolensma para formar pptidos de bajo
peso molecular que pierden su actividad biolgica. Los inhibidores del sistema de
generacin de cininas incluyen el C1 inhibidor, la ,-macroglobulina, y el .-proteasa
inhibidor El Cl inhibidor y la -macroglobulina son los principales inhibidores de
la calicreina activa, ejerciendo el C1 inhibidor la influencia ms potente. El C1
inhibidor y la ,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hage
man activo. El angioedema hereditario resulta de la deficiencia gentica o adquiri
da del C1 inhibidor. Se cree que las caractersticas clnicas asociadas con esta enf
ermedad surgen de la prdida del control adecuado del sistema de generacin de cinin
as por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998) Tambin existen en el plasma los
qumingenos de bajo peso molecular y pueden actuar como sustrato de la bradicinin
a. Los qumingenos no son fciles de degradar por la calicreina del plasma, pero las
calicreinas tisulares presentes en las clulas pueden degradar el quiningeno de ba
|0 peso molecular a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente,
la lisil-bradicinna sufre la misma va de degradacin que la bradicinina, Se ha post
ulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de enfermedades. La brad
icinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el fluido nasal en la
rinitis. Tambin se ha sugerido un papel patognico para la bradicinina en enfermed
ades que van desde el asma al angiodema hereditario, asi como otras clases de en
fermedades edematosas incluyendo la inflamacin. Est claro que no se conoce totalme
nte el papel exacto del sistema generador de cininas en las enfermedades. Sin em
bargo, la brad cinina y sus derivados indudablemente son importantes en el edema
y el dolor asociados con la inflamacin.
yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados con la pr
ueba de fijacin estndar.
CININAS Y SISTEMA DE GENERACIN DE CININAS
El sistema de generacin de cininas es una va mediadora secundaria presente en el p
lasma y activa en las superficies celulares que controla la generacin de pptidos q
ue son importantes en la respuesta inflamatoria. Aqu ser descrito brevemente. Para
ms detalles, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Kozin. 19
92: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius. 1995). El pptido biolgicamente activo ms im
portante generado por este sistema parece ser la bradicinina, un nonapptido con p
otente actividad en muchos sistemas biolgicos. Es activa en aumentar la permeabil
idad vascular, vasodilatacin, hipotensin, induccin del dolor, contraccin de muchos t
ipos de clulas musculares lisas, y activacin del sistema de la fosfolipasa A, con
su funcin de activacin del metabolismo del cido araquidnico celular. Aunque en mucha
s cosas se parece al sistema del complemento, el sistema de generacin de cininas
del plasma es ms simple debido a que est compuesto solo por cuatro protenas plasmtic
as. Los elementos tisulares tambin generan cininas. Las principales protenas del s
istema de generacin de cininas comprendidas actualmente son el factor de Hageman.
el factor de coagulacin XI, la precalicrena y el quiningeno de alio peso molecular
. El factor XI circula en el plasma como un complejo con el quiningeno de alto pe
so molecular con una relacin molar de 2:1. La precalicrena tambin circula en un com
plejo con el quiningeno de alto peso molecular con una relacin molar de 1:1. En co
ntraste, el factor de Hageman circula como una protena plasmtica de cadena simple,
no formando complejos. Al igual que en la secuencia de activacin del complemento
, la secuencia de generacin de cininas sigue una va especfica. Interaccionando con
superficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente con
cristal o naturalmente con muchos materiales activos biolgicamente como el lipido
A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de Hageman es deg
radado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa) tiene actividad proteolt

ica y despus activa y degrada las molculas del tactor de Hageman adicionales para
generar ms aHFa. La degradacin de la cadena simple del factor de Hageman (peso mol
ecular de 80 kDa) libera las cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y
28 kDa. respectivamente) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar e
nzimtico activo del factor de Hageman reside en la cadena ligera. Muchas enzimas
proteolticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y activar al factor de Ha
geman. El HFa mteracciona con el complejo del factor XI y el quiningeno de alto pe
so molecular para activar el factor XI a factor Xla, originando la activacin de l
a cascada intrnseca de la coagulacin. El HFa tambin interacciona con el complejo qui
ningeno de alto peso molecular-precalicreina para degradar la cadena simple de la
precalicrena en una molcula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas
por puentes disulfuro. La precalicrena degradada tiene actividad enzimtica proteo
ltica localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones
ocurren mucho ms eficazmente cuando las protenas se unen a superficies cargadas ne
gativamente, las cuales son crticas para la activacin de la cascada. La calicreina
activada degrada al qummogeno de alto peso molecular en muchos lugares, liberan
do bradicinina. La calicreina activa, generada por la degradacin de la precalicren
a, tambin es capaz de degradar posteriormente el HFa a un producto de menor peso m
olecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede degradar y acti
var al complejo quiningeno de alio peso molecular- precalicrena pero no permanece
en la superficie de unin y no interacciona eficazmente con el complejo quiningeno
de alto peso molecular-factor XI. La bradicinina tiene una vida media corta ya q
ue se inactiva rpidamente por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina
carboxi-terminal para formar des Arg bradicinina. Esta molcula ya no tiene la act
ividad de la bradicinina de contraer el msculo liso y no puede inducir la salida
de lquido vascular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos d
e sus
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CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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-

C A P T U L O
39
Gtocinas y molculas de adhesin
H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S. Richard A. McPherson, M.D.
CITOCINAS lnterleucina-1 lnterleucina-2 lnterleucina-3 lnterleucina-4 lnterleuci
na-5 lnterleucina-6 lnterleucina-7 lnterleucina-8 y las quimiocnas lnterleucina-9
lnterleucina-10 lnterleucina-11 lnterleucina-12 lnterleucina-13
914
lnterleucina-14 lnterleucina-15 lnterleucina-16 lnterleucina-17 lnterleucina-18
Factor transformante del crecimiento |i Factor de necrosis tumoral Interfern-y MO
LCULAS DE ADHESIN CELULAR Integrinas Selectinas PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFA 924 924 92
2
CITOCINAS
La secrecin y la unin de las citocinas es el equivalente celular a estar "en lnea".
El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un Internet" de comu
nicacin entre las clulas. Las seales de las citocinas son recibidas sobre la superf
icie celular y no slo como simples mensajes, sino tambin como combinaciones comple
jas e imperceptibles sinrgicas y antagnicas que regulan procesos como la respuesta
inmune, la migracin celular y la cicatrizacin de las heridas. Para responder a lo
s mensajes especficos de las citocinas, las clulas despliegan miles de receptores
de superficie de citocinas, presentados como mltiples antenas. Utilizando estos r
eceptores, las clulas seleccionan, procesan y responden a combinaciones de citoci
nas solubles y de unin a sustratos de manera dependiente de la densidad y el esta
do de activacin de los receptores de superficie. El trmino "citocina" se refiere a
los productos solubles de las "clulas" en senlido genrico. Muchos tipos celulares
son capaces de producirlas, pero para la mayor parte son la clula T y el macrfago
las factoras virtuales de citocinas. y por esta razn muchas familias de citocinas
se conocen como interleucinas (IL). Aunque los bioanlisis son a veces el mtodo de
referencia para la deteccin de la actividad de las citocinas, normalmente llevan
mucho tiempo y son difciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equip
os de ensayo con enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) estn ampliamente dispon
ibles para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las tcnicas moleculares
(reaccin en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridacin n situ) se emplean en labora
torios ms modernos para identificar la presencia de citocinas con alta sensibilid
ad y para localizar ms precisamente una citocina de un tipo celular particular. E
n los aos recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero slo se presentan aq
uellas para las que se conoce suficiente informacin.
lnterleucina-1
La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres protenas: la IL-1r/. y la IL-1|3
(los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA
), un antagonista especfico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello, 1998)
. Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflamatorias han si
do mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la I L 1 1 5 son sinte
tizadas como protenas precursoras intracitoplasmticas de 31 kDa que son degradadas
para generar las formas biolgicamente activas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convert
ida en su forma activa a travs d e la accin de proteasa extracelulares, aunque la
proforma no degradada puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberad
a por los queratinocitos, por las clulas T colaboradoras tipo II (Th2) o por los
timocitos. La pro-IL-l f 5 se convierte intracelularmente en su forma biolgicamen
te activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima asociada a la a
poptosis. Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 k D a
ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la seal cuando se une tanto a IL-1
a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa ms restringido (para neutrfilos,

monocitos y clulas B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la seal intracelular, in

cluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo tanto se ha des
crito como un receptor "seuelo" que acta como un "escondite" para las molculas de I
L-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se asocia con una proteina accesori
a (IL-1 RAcP). Juntos sealizan el ncleo a travs de muchas vas de cinasas de protenas
asociadas a macrotbulos (MAP) que activan los factores de transcripcin nuclear inc
luyendo el factor nuclear (NF) K(. entre otros (O'Neill, 1996). La molcula antagon
ista IL-IRA es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la seal de transduc
cin intracelular. Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatori
as, la IL-1 exhibe miles de efectos biolgicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

915

complejo mayor de histocompatibilidad antgeno.'receptor de clulas T (MHC/TCR) medi

ando la activacin de las clulas T como un componente importante de seal no conocida
, y aumenta la actividad de las citocinas derivadas de la clula T como la IL-2 a
travs de la regulacin a la alta del receptor de IL-2. La IL-I estimula la prolifer
acin de la clula progenitora hematopoytica (CPH) en sinergia con los factores estim
ulantes de colonias hematopoyticos, y cuando se administra aislada moviliza neutr
ofilia derivadas de la mdula sea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en
promover el crecimiento y proliferacin de algunas lineas celulares leucmicas, pero
es citotxica directamente para algunas clulas mlecladas por virus y para algunas
clulas tumorales. La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del cido ara
quidnico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos como
intermediarios, y su capacidad para inducir la produccin y liberacin de cantidades
de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinflamatoria. En los l
ugares de inflamacin, la IL-1 origina una regulacin a la alta de los receptores de
molculas de adhesin sobre el endotelio vascular y estimula la produccin de quimioc
inas conduciendo a la acumulacin local de leucocitos. En situaciones de alergia c
omo la hipersensibilidad Tipo 1, la IL-1 puede aumentar la liberacin de histamina
de los basfilos y eosinfilos, contribuyendo esto a la broncoconstriccin al estimul
ar al msculo liso vascular. La IL-1 es responsable de la produccin de reactantes d
e fase agua por el hgado (p. ej.. complemento, pplido C reactivo) a expensas de pr
otenas transportadoras como la albmina. Para pagar el coste de los aminocidos de la
sntesis masiva de pptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular, acontecimiento q
ue explica la mialgia que acompaa a algunas enfermedades. La IL-1 contribuye a la
dilatacin vascular y a la hipotensin en el choque sptico a travs de la induccin de x
do ntrico (NO) en las clulas endoteliales. y tambin puede ser un significativo medi
ador del choque cardiognico. En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promue
ve la fiebre, la aorexia, el sueo de ondas lentas y la letargia, as como la liberac
in de corticodes del hipollamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la pro
liferacin de clulas sinoviales. el depsito de colgeno, la resorcin del cartlago y el
ueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias como la ar
tritis reumatoide (AR). Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1
origina profundas reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas p
or las dosis bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompaante de la hematopoy
esis, que puede disminuir el punto ms bajo y acortar el periodo de supresin medula
r en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991). Sin embargo
, el efecto beneticioso de la administracin de IL-1 est limitado por su profunda t
oxicidad. Un nivel elevado de IL-IRA puede ser ms sensible como marcador de activ
idad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1. El aumento
de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio, los procedim
ientos de ciruga general, y en personas asintomticas que tienen el virus de la inm
unodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Adems, la severidad de la enlermedad a menu
do es mejor indicada por los niveles de IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Est
o puede ser cierto en enfermedades del hgado, en estados autoinmunes y en enferme
dades infecciosas (Dinarelio, 1996,1998). L a elevacin del IL-1 RA puede represen
tar un importante esfuerzo para minimizar los intensos efectos txicos de los nive
les sistmicos aumentados de IL-1: la inyeccin de IL-1 RA en ratones justo antes de
darles endotoxina intravenosa aument la supervivencia. La IL-1 RA administrada a
pacientes con choque sptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependient
e medida al da 28, pero este efecto no se observ uniformemente en ensayos posterio
res ms grandes (Fisher, 1994). El mejor xito con la terapia con IL-1 RA se obtuvo
en un gran estudio doble ciego completado en pacientes con artritis reumatoide.
Los resultados indicaron una reduccin dependiente de la dosis de IL-1 RA en el ed

ema articular, y una reduccin significativa en las nuevas erosiones seas (Bresniha
n, 1998). Otros ensayos clnicos que evaluaban la eficacia de la administracin de I
L-1 RA en la enfermedad injerto contra husped (EICH) cortico-resistente mostraron
una mejora en la mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).
lnterleucina-2
La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminocidos, miembro de la fam
ilia de las citocinas de cuatro hlices-!/ (Bazam, 1990), con dos puentes disulfur
o en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido secuenciado en el c
romosoma 4. La activacin de las clulas T y la liberacin de la IL-2 resulta de la in
teraccin entre el TCR y el anligeno presentado en asociacin con las molculas de MHC
sobre las clulas presentadoras de antigeno (APCs) (Fraser, 1991). El receptor pa
ra la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito compuesto por una caden
a o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 k D ayu n a cadena y de 64 kDa (Waldmann
. 1998). El IL-2R existe en tres formas moleculares: un complejo de alta afinida
d para las subunidades a. [J. y y. un complejo de afinidad intermedia de las sub
unidades |i y y, y un receptor de baja afinidad hecho solo de IL-2Ru. Solo el IL
-2R</|ly y el IL-2R|iy son capaces de Iransducir la seal tras la unin con el ligan
do. En las clulas T y en las clulas asesinas naturales (NK). la IL-2 activa vas mtr
acelulares incluyendo la JAK-1 y la JAK-3 de la familia de las cinasas Jane, que
actan a su vez en sus sustratos. STAT-3 y STAT-5. de transductores de la seal y a
ctivadores de la familia de Iranscnpcion de los factores de transcripcin. Los gen
es diana de las vas de sealizacin activadas por IL-2 incluyen el bcl-2. c-myc. c-ju
n. y c-los (Gmez, 1998). Ya que comparten las cadenas ot y y de las subunidades d
el receptor, la IL-2 y la IL-15 tienen actividades biolgicas solapadas. Junto con
la IL-15. la IL-2 estimula la proliferacin in vitro de las clulas T CD4/CD8+ acti
vadas, las subpoblaciones de clulas T y/5, y las clulas NK (Burln, 1994), mientras
que promueve la funcin citoltica de los linfocitos T citxicos (LTCs) y de las clulas
asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Burton, 1994; Grabstein. 1994). Adems,
ambas citocinas pueden inducir la proliferacin de las clulas B estimuladas, y la sn
tesis de IgM. La IL-2 es tambin quimiotctica para las clulas T (Wilkinson. 1995: Ar
mitage. 1995). In vivo, la IL-2 puede jugar un papel indispensable en el manteni
miento de tolerancia a lo propio, ya que los animales con dficit de IL-2 desarrol
lan enfermedades de inmunodeficiencia y autoinmunes como la anemia hemolitica y
la enfermedad inflamatoria intestinal (vVillerford, 1995). Los ratones sin IL-2R
-|5 desarrollan espontneamente activacin de clulas T y diferenciacin celular plasmtic
a de clulas B. con aumento de los niveles sricos de IgG e IgE (Suzuki, 1995: Wang.
1996). Esto sugiere que la IL-2 puede provocar la induccin a la anergia o a la a
poptosis en la muerte celular de clulas T por activacin (AICD). La readministracin
de linfocitos infiltrantes de tumor aislados (TIL) que han sido expandidos y act
ivados in vitro con IL-2 y OKT3. con infusiones farmacolgicas de dosis de IL-2. s
on terapias prometedoras para los tumores malignos inmunogenicos como el melanom
a maligno (Goedegebuure. 1995). La actual terapia inmunosupresora para los recep
tores de alotransplantes incluye los inmunosupresores ciclosporina A, FK-506, y
Rapamicina. Estos agentes se unen a las dianas inmunofilinas inlracelulares, cre
ando un complejo frmaco-inmunofilina que bloquea la capacidad del factor nuclear
de las clulas T activadas (NF-AT) de activar los genes de la IL-2 necesarios para
la proliferacin de las clulas T, y otros genes necesarios para la activacin de las
clulas B (Ho. 1996), produciendo asi inmunosupresin.
lnterleucna-3
La actividad de la IL-3 fue detectada por primera vez en cultivos de linfocitos
espemeos de ratn, donde induca a la enzima 20-i/-hidroxiesteroide deshidrogenasa (I
hle, 1981). Es una protena de 26 kDa sometida a un estricto control regulador y e
xpresada en una poblacin de clulas restringida que incluye las clulas T activadas,
las clulas NK. los mastocitos y algunos megacariocitos (Blalock, 1999). La sntesis
adecuada de IL-3 requiere la activacin de las clulas T a travs del complejo TCR'CD
3 Esto inicia las vas mtracelulares conduciendo a la activacin del NF-KB, que se i
ntroduce en el ncleo para transactivar la expresin del gen IL-3 (Park, 1993: Link,
1992). El receptor de IL-3 (IL-3R) es un miembro de la familia gnica de los rece

ptores de citocinas y tiene una cadena | 5 especfica de ligando asociada no coval

entemente con una cadena de transduccin de seal |i. El gen que la codifica ha sido
secuenciado en el cromosoma 5 (Blalock. 1999)

916
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA te en una cadena u especfica de ligando y una cadena |5

de transduccin de seal comn a los receptores para la IL-3 y GM-CSF (Tavernier. 199
1). Los dominios intracitoplasmticos de las subunidades </. y \i contiene regione
s implicadas en la unin del JAK-2 y el JAK-1. respectivamente, que son necesarios
para la transduccin de seales. No se ha descrito completamente la total distribuc
in tisular del IL-5R. pero parece estar restringida a los baslilos y eosinfilos. La
IL-5 es producida por las clulas Th2 que liberan la cilocma cuando son estimulad
as apropiadamente. Los mastocitos. las clulas NK. las clulas B, los eosinfilos, las
clulas malignas y algunas clulas transformadas por virus son capaces tambin de sec
retar IL-5. La IL-5 promueve la diferenciacin, la migracin, la activacin, la degran
ulacin y la supervivencia de los eosinfilos. Estudios en ratones implican a la IL5 aislada en la estimulacin de la produccin de eosinfilos in vivo (Tominaga. 1991;
Dent, 1990). La IL-5 es responsable de la induccin de la acumulacin, activacin y de
granulacin de los eosinfilos tras el contacto antignico, posiblemente a travs de su
gran actividad quimiotctica, de su capacidad de producir una regulacin a la alta d
e ciertas molculas de adhesin presentes en los eosinfilos como CD11b. y promoviendo
la liberacin de granulos de IgG inducida (Wang, 1989: Walsh, 1991; Fujisawa. 199
0). El papel de la IL-5 en la enfermedad humana puede incluir la produccin de dao
en la membrana basal observado en el penfigoide ampollse promover la infiltracin e
osinfila en los lugares de infestacin parasitaria, y promover la produccin de antic
uerpos del receptor de la antitirotropma en la enfermedad de Graves. Adems, la eo
sinofilia local de la enfermedad de Hodgkin puede estar asociada con la capacida
d de las clulas de Reed-Sternberg de liberar IL-5. En las respuestas alrgicas, la
IL-5 liberada por los mastocitos lisulares puede servir para promover la acumula
cin de eosinfilos en los tejidos (revisado en Lalani. 1999). Actualmente, se emple
a el ELISA para la medicin in vilro de la IL-5, y las tcnicas de inmunofluorescenc
ia permiten la localizacin de IL-5 en clulas especificas, mientras que la hibridac
in in silu permite la precisa localizacin de la IL-5 en las clulas individuales.
Las clulas diana de la IL-3 incluyen los precursores in vilro de las clulas T y clu
las B. La administracin in vivo de IL-3 a dosis farmacolgica origina un aumento de
la produccin de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en ratones, mientras que la
sobreexpresin de IL-3 mediada por retrovirus en las clulas medulares conlleva el d
esarrollo de un sndrome meloproliferativo no neoplsico (Metcalf. 1986; Chang, 1989)
. Se ha sugerido un papel para la IL-3 en el desarrollo de la hipersensibilidad
por contacto, ya que los ratones con dficit de IL-3 muestran un desarrollo escaso
de la hipersensibilidad retardada del tipo hapteno especfico (Mach. 1998). Adems,
evidencias muestran un papel para la IL-3 en el desarrollo normal del SNC (Chia
ng. 1996).
lnterleucina -4
La IL-4 (Paul, 1991) desarrolla importantes funciones en la regulacin de la produ
ccin de anticuerpos, en la hematopoyesis, en la inflamacin y en el desarrollo de l
as respuestas T celulares efectoras. Es una protena compleja con muchos puentes d
isulfuro intramoleculares y muchos lugares de glicosilacin cuyo gen ha sido secue
nciado en el cromosoma 5. La produccin de IL-4 est altamente regulada y se restrin
ge a las poblaciones de clulas T activadas, mastocitos, bastilos y eosinfilos. Los
efectos biolgicos de la IL-4 estn mediados a travs de receptores de IL-4 de alta af
inidad (IL-4R) compuestos por una cadena a. especfica de ligando, y una cadena y
de seal de transduccin compartida por muchas otras citocinas incluyendo la IL-7 y
la IL-2. El dominio extracelular del IL-4R tiene homologa con el IL-5Ra y con el
IL-6R. La IL-4 activa las clulas B y promueve su diferenciacin, reflejando el hech
o de que la IL-4 fue descrita por primera vez en los sobrenadantes de cultivos d
e clulas T activadas y factor de crecimiento de clula B duplicado. Adems de inducir

la expresin de CD23 y molculas de MHC en las clulas B, regula la apoptosis de las

clulas B y el cambio de isotipo. particularmente de lgG1 a IgE (Brown. 1997). En
el conjunto de la hematopoyesis, la IL-4 estimula la formacin de colonias por los
precursores eritroides, megacariocticos. mastociticos y granulocito/monocticos, m
ientras promueve el desarrollo de poblaciones Th CD8+ y CD4+ (Sillaber, 1991; Er
ard, 1993). En la respuesta inflamatoria, la IL-4 induce la proliferacin de clulas
endoteliales, y origina una regulacin a la alta de las molculas de adhesin celular
del endotelio. Activando el endotelio de esta forma, la IL-4 permite el aumento
de la adhesin leucoctica a la superficie de los vasos de modo que las clulas infla
matorias migran a los lugares de inflamacin local. Adems, la IL-4 es quimiotctica p
ara los eosinfilos y facilita la citotoxicidad de los monocitos y de las clulas T
(Tepper, 1989; Crawford. 1993). Se encuentra un aumento de los niveles de IL-4 e
n enfermedades alrgicas como la dermatitis atpica y en la fiebre del heno, y los r
atones transgnicos para la IL-4 desarrollan un trastorno alrgico en el prpado (Tepp
er, 1989). La IL-4 tambin puede conferir un grado de proteccin ante algunos parsito
s extracelulares, y disminuir el dao de las respuestas autoinmunes inhibiendo las
respuestas prolongadas de clulas T (Finkelman, 1986; Rapoport, 1993). La IL-4 pa
rticipa en la inmunidad tumoral ya sea promoviendo a las clulas N K efectoras o l
a actividad tumorcida de los macrfagos (Bosco, 1990). Al mismo tiempo, la IL-4 est
implicada en el crecimiento de las leucemias de clulas T humanas in vilro. Como e
st asociada con un cambio de las clulas efectoras CD8+ a clulas no citotxicas, la IL
-4 puede jugar un papel en la progresin del sndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) (Erard, 1993). Los niveles elevados de IL-4 en las lgrimas y en la sangre
de pacientes atpicos determinados por ELISA sugieren un papel para la IL-4 en la
enfermedad alrgica y puede servir como marcador de severidad de la enfermedad (Pr
anos, 1998: Fujishima, 1995).
lnterleucina-6
La IL-6 fue identificada inicialmente en los sobrenadantes de cultivos de clulas
T cooperadoras como un agente capaz de inducir la proliferacin de una inmunoglobu
lna secretada por las poblaciones de clulas B. Sin embargo, sus acciones se extien
den a muchas clulas diana y ahora se reconoce como una citocina importante inmune
, hematopoytica y proinflamatoria (Hirano. 1998). La IL-6 es secretada como un ppt
ido de 184 aminocidos de alrededor de 21 kDa, dependiendo de su grado de glicosil
acin. El gen que codifica la IL-6 ha sido secuenciado en el cromosoma 7 (Hirano,
1986). La molcula de la IL-6 se caracteriza por cuatro asas a-helicoidales conect
adas por asas de pptidos interpuestas (Bazan, 1990). El complejo del receptor de
la IL-6 (IL-6R) (revisado en Hirano, 1998) es un miembro de la supertamilia de r
eceptores de citocinas y est compuesto de una cadena de unin a especfica de ligando
de 80 kDa (IL-6R) y una cadena de sealizacin |i no asociada covalentemente. la gp1
30. La subunidad (i es compartida por otros receptores incluyendo los de la IL-1
1 y del GM-CSF, y se marca por cuatro residuos conservados de cisteina y un domi
nio triptfano-serina-X-triptfano-serina en su regin amino-terminal. Esto puede expl
icar en la redundancia funcional observada en las actividades de estas citocinas
. El complejo IL-6R combinado forma un receptor de alta afinidad para la IL-6. p
ermitiendo la seal de transduccin a travs de las vas de la JAK/STAT. Una variedad de
clulas producen IL-6, incluyendo las clulas T y las clulas B, los monocitos y macrl
agos, los fibroblastos, los queratinocitos, los sinoviocitos, los condrocitos y
las clulas endoteliales. La IL-6 acta sobre las clulas T, los hepatocitos, los prog
enitores hematopoyticos y las neuronas. Es un potente factor de crecimiento para
las lneas celulares del meloma y el plasmocitoma humano, y tienen una accin autoenn
a y paracrina sobre los mielomas humanos trasplantados al ratn. En los hepatocito
s. la IL-6 estimula la produccin de varios reactantes de fase aguda, y en los rat
ones knockout por IL-6. estn muy disminuidas la liberacin de reactantes de la lase
aguda y de Ig.
lnterleucina-5
La IL-5 es un homodmero unido por disulfuros de 45 kDa. 134 aminocidos, que juega
un papel central en la maduracin, activacin y supervivencia de los eosinfilos, y en
el desarrollo de enfermedad atpica y eosinofilia. El gen IL-5 reside en el cromo

soma 5 en un grupo de genes que codifican la IL-3, la IL-4 y el factor estimulan

te de colonias de granulocitosmacrfagos (GM-CSF). Estructuralmente, est relacionad
o con el grupo de citocinas a-helicoidal (Milburn, 1993). El receptor para la IL
-5 (IL-5R) consis-

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

917
En las clulas hemalopoyticas, la IL-6 origina la proliferacin y diferenciacin de clul
as T, aumenta la formacin de colonias de progenitores hematopoyticos multipotencia
les e induce la maduracin de los megacanocitos. Estimula la formacin de osteoclast
os, la proliferacin de las clulas del msculo liso vascular, e induce la produccin de
l factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). En el SNC, la IL-6 per
mite la supervivencia de las neuronas colinrgicas, mientras que en el sistema rep
roductor induce la secrecin de gonadotropina corinica humana (hCG) por el trofobla
slo. Han sido observadas alteraciones en la produccin de IL-6 en pacientes con AR
, y se ha demostrado una significativa correlacin entre las concentraciones de IL
-6 e IgG en el lquido sinovial de pacientes con AR (Hirano. 1988; Hermana 1989).
En los modelos animales, la administracin de IL-6 parece participar en el desarro
llo de la glomerulonelritis membranosa proliferatva acelerada, simulando cambios
encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistmico (LES) (Rytfel. 1994). Otr
os estudios en ratones transgnicos sugieren un papel para la IL-6 en la aparicin d
e la diabetes tipo I y en la generacin de los plasmocitomas monoclonales malignos
(Suematsu, 1989; Hirano, 1991). La evidencia clnica sugiere que la determinacin d
e los niveles sricos de IL-6 en neonatos (Kusler, 1998) y en los pacientes con cnc
er en quimioterapia (de Bont, 1999) puede ayudar a identificar aquellos neonatos
con riesgo inminente de sepsis, y aquellos pacientes cuyos episodios febriles s
e deben a la quimioterapia ms que a la sepsis.
ratoria en los macrfagos Tambin es quimiotctica para los basfilos y para un subgrupo
de clulas T CD4/CD8+. Muchos tipos de clulas producen el pequeo peptido IL-8 inclu
yendo las clulas endoteliales, las clulas epiteliales, los fibroblastos, los neutrf
ilos. los monocitos. los macrfagos y las clulas T y. dependiendo de la clula de ori
gen, la IL-8 variar en la longitud de aminocidos. Tras la degradacin proteolitica d
e su secuencia precursora de 99 aminocidos, la IL-8 es secretada por las clulas en
doteliales existentes predominantemente como una proteina de 77 aminocidos y como
una proteina de 79 aminocidos cuando es producida por los leucocitos mononuclear
es. La IL-8 es liberada en respuesta a varios estmulos como los lipopoiisacandos
(LPS) y los leucotrienos, y aunque puede existir como un homodimero unido no cov
alentemente, tiene su gran actividad quimiotctica c o m o un monomero (Paohni. 19
94). Dos receptores con significativa homologa en los aminocidos median los electo
s biolgicos de la IL-8: el receptor A de IL-8 (IL8RA) y el receptor B de IL-8 (IL
-8RB), que difieren en su afinidad por el ligando. El IL-8RA aparentemente tiene
mayor afinidad y especificidad por el ligando, mientras que IL-8RB muestra meno
r afinidad y especificidad por el ligando y es capaz de unirse a otras protenas q
uimioatrayentes relacionadas con la IL-8. La inyeccin intradrmica de IL-8 origina
una intensa e inmediata infiltracin de neutrfilos alrededor de las venas con un ex
udado de plasma local. Para alcanzar las reas de inflamacin, sin embargo, los leuc
ocitos deben primero atravesar el endotelio local. Esto est en parte facilitado p
or la IL-8. que altera la expresin de integrinas neutrofilicas activando el CD11/C
D18 a su conformacin de alta afinidad, y dispara la expresin de la L-selectina. La
IL-8 puede formar parte del gradiente quimioatrayente regulado a la alta unido
a la superficie celular de las clulas endoteliales vecinas a la inflamacin que sig
uen los leucocitos activados. Como proteina soluble, la IL-8 forma un gradiente
quimiotclico en los tejidos, guiando a los leucocitos extravasados a los lugares
de inflamacin. Adems de la secrecin de IL-8 inmediatamente tras su produccin, la IL8 puede ser almacenada en los cuerpos de Weibel-Palade. donde est disponible para
la liberacin inmediata independente de su sntesis (Rot, 1996). Interesantemente, a
unque acta predominantemente como quimiotctica. el aumento de los niveles de IL-8
en el sistema circulatorio est asociado con la disminucin de la acumulacin de neutrf

ilos en los lugares de inflamacin, aunque se observa una neutroM a sistmica (Hechtm
an. 1991). Esto tambin sugiere una (uncin antiinflamatoria para la IL-8. Los estud
ios han destacado el papel de la IL-8 en varios estados inflamatorios desde la a
rtritis crnica a la sepsis. Algunos han sugerido medir los niveles de IL-8 en ori
na como medida para monitonzar la severidad de la enfermedad glomerular (Wada. 1
994). Desde la identificacin de la IL-8 como la primera quimiocina en 1987. la su
perfamilia de las quimiocinas ha sido una coleccin de pequeas molculas solubles sie
mpre en aumento importantes para la migracin de los leucocitos a los lugares de i
nflamacin. Las quimiocinas desarrollan su papel eficazmente y con gran especifici
dad por medio de la activacin de integrinas leucocitarias, particularmente la LFA
-1, la MAC-1 y la VLA-4. para unir el ICAM-1 y el VCAM-1 de las clulas endotelial
es. Las quimiocinas son crticas en la hematopoyesis, en la angiognesis, en la acti
vacin de las clulas T y las clulas NK, en la patognesis del VIH y en el desarrollo d
el SNC La superfamilia se divide actualmente en cuatro familias basadas en la po
sicin de sus primeras y segundas cuatro cisteinas en la secuencia de aminocidos. L
a lamilia CXC (familia u) tiene un aminocido que separa las primeras dos cisteina
s: la familia CC (familia |i) no tiene aminocidos intercalados; en la familia C (
y), los miembros han perdido las cisteinas una y tres; y la familia de quimiocin
as CX3C (6) tiene tres aminocidos intercalados. La familia CXC se divide posterio
rmente en miembros que tienen un residuo E-L-R en su secuencia amino-terminal. y
que poseen actividad angiogmca y actividad quimiotctica neutroflica. La familia de
quimiocinas CC contiene miembros quimiotcticos para los monocitos, los linfocito
s, los eosinfilos, los basfilos, los mastocitos y las clulas NK. Sus miembros puede
n tambin regular la hematopoyesis en la cavidad medular, e inducir la degranulacin
de los mastocitos y los eosinfilos. La linfotactina es el nico miembro de la fami
lia de quimiocinas C. Tiene su m a y o r expresin en el timo, donde sirve para re
clutar precursores de clulas T inmaduros de la mdula sea. An no se ha definido otras
funciones para esta quilnterleucina-7
La IL-7 se identific por primera vez como una glicoprotena murina de 2 5 kDa que m
ostraba electos poliferativos in vilro en las clulas pre-B (amen, 1988). Aunque in
icialmente se describi como un factor de crecimiento de las clulas B, despus se enc
ontr que la IL-7 era crtica tanto para la linfopoyesis de las clulas T como B, as co
mo para movilizar las clulas progenituras mieloides (Grzegorzweski, 1994). En hum
anos, el cido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-7 ha sido detectado en rganos
inmunes y hematopoyticos, como el timo, el bazo, la mdula sea y el hgado fetal (Kom
schhes. 1995) La atocina activa es producida por los queratinocitos epidrmicos, l
as clulas epiteliales intestinales y las clulas estromales de la mdula sea y el timo
. El receptor de la IL-7 (IL-7R) es un miembro de la superfamila de receptores de
la hematopoyetina, teniendo una cadena y en comn con los receptores de las inter
leucinas, -2. -4, -7. -9 y -15, lo que explica en parte los efectos solapados y
redundantes que estas citocinas tienen en las poblaciones de clulas T. El IL-7R h
a sido identificad tanto en clulas mieloides como linfoides (Foxwell. 1992) Los r
atones transgnicos para la IL-7 desarrollan un aumento del nmero de clulas B y T y
de sus progenitores. Los anticuerpos neutralizantes para el IL-7R administrados
a ratones originan una gran disminucin del nmero de timocitos, y clulas de linaje B
medulares, con disminucin del nmero de clulas B y T en el bazo y en los ganglios l
infticos (Peschon, 1994). Los ratones knockout para la IL-7 y el IL-7R muestran an
mayores reducciones de las mismas poblaciones celulares. Debido a esta importan
te funcin linfopoytica, la IL-7 acelera la reconstitucin de las clulas T y B en los
ratones irradiados letalmente. con mnimos efectos en el compartimento mieloide. L
a IL-7 estimula el crecimiento y aumenta la actividad citotxica sobre las clulas T
maduras y las clulas T citotxicas, respectivamente. In vitro. las clulas T aislada
s de la lmina propia intestinal proliferan en respuesta a IL-7 exgena y muestran u
n aumento de la capacidad de responder a anticuerpos anti-CD3 y a IL-2, sugirien
do un papel para esta citocina en el aumento de las respuestas inmunes mediadas
por clulas (Watanabe, 1995). Se han sugerido papeles clnicos para la IL-7. Estos v
an desde aumentar los compartimentos de las clulas T de aquellos que padecen SIDA
, hasta el tratamiento de cnceres a travs del aumento de la actividad LAK.

lnterleucina -8 y las quimiocinas

La IL-8. un miembro de la superfamilia de las quimiocinas, es responsable de la
acumulacin de neutrfilos en los lugares de inflamacin (Hoch. 1996) Induce la traslo
cacin del calcio, la quimiotaxis, el cambio de tipo, la polimerizacin de la actma.
y posiblemente tambin la actividad de 'a cadena respi-

918
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA (CFU-GM) a partir de progenitores CD34+. La IL-9 ejerc

e su actividad de promover el crecimiento sobre las lneas de mastocitos, y tambin
puede regular la diferenciacin de los mastocitos (Eklund, 1993). Se ha sugerido q
ue la IL9 induce la resistencia a parsitos in vitro de las clulas dependientes de
los mastocitos, y junto a la IL-4 puede facilitar la produccin de IgE e IgG (Loua
hed, 1995). Se ha sugerido un papel para la IL-9 en el SNC por su capacidad de m
antener el aumento de la extensin neuronal y promover la excitabilidad sobre cult
ivos de lineas celulares del hipocampo de progenitores de ratones inmortalizados
(Mehler, 1993).
miocna. La familia de quimiocinas CX3C tambin tiene un solo miembro en la actualid
ad, la fractalcina (la neurotactna). Es diferente de las otras quimiocinas en que
es relativamente grande, con 373 aminocidos, con el dominio quimiocina encontrad
o en los primeros 76 residuos. Anclada a las superficies celulares por un tallo
tipo-mucina, la porcin extracelular puede ser liberada de la superficie celular p
ara actuar como quimiotctica para los monocitos, las clulas T y las clulas NK in vi
tro. Se ha sugerido un papel para la fractalcina en el proceso inflamatorio debi
do a su regulacin a la alta del endotelio en el SNC de ratones con encefalomielit
is autoinmune experimental (EAE), en presencia de factor de necrosis tumoral (TN
F). Ya que la fractalcina tambin se expresa en el cerebro normal, tambin puede jug
ar aqu un papel no patolgico. La mayora de las quimiocinas se encuentran en la fami
lia CC, mientras que las familias C y CX3C tienen solo un miembro cada una. Las
quimiocinas ejercen sus efectos a travs de la unin a miembros de la superfamilia d
e receptores de siete dominios transmembrana, una familia de molculas acopladas a
la protena G que crece rpidamente. Las clulas no inmunes como los fibroblastos y l
as clulas del msculo liso vascular pueden tambin producir y liberar quimiocinas par
a dirigir a las clulas inflamatorias a los lugares de inflamacin, y pueden respond
er ellas mismas a las quimiocinas. Las quimiocinas pueden promover la progresin d
e enfermedades. En la sepsis, la IL-8 es central en la acumulacin de neutrfilos en
varios rganos, y en la progresin del desarrollo del estado final de enfermedad. O
tras quimiocinas incluyendo RANTES (reguladas en activacin clulas T, normales expr
esadas y secretadas), GROi/. y la MIP-1u son activas en el choque sptico, y puede
proporcionar dianas para la intervencin teraputica. En las respuestas granulomalo
sas, la presencia de MIP-1 se correlaciona con la formacin de granulomas. Del mism
o modo, en la EAE, el modelo animal de la esclerosis mltiple, la progresin y la re
cada de la enfermedad est afectada positivamente por la administracin de anticuerpo
s neutralizantes para la MIP-1u y la MCP-1.
lnterleucina-10
La IL-10 es una potente atocina antinflamatoria (Fiorentmo. 1989). Es una protena
de 160 aminocidos con una masa molecular de 18,5 kDa (Kim, 1992), que contiene cu
atro residuos cistena y dos puentes disulfuro que mantienen su estructura helicoi
dal y su actividad biolgica. La codifica un gen secuenciado en el cromosoma 1. El
receptor de IL-10 (IL-10R) es expresado sobre todo en las clulas hematopoyticas,
y es una proteina de 90 a 110 kDa cuyo dominio extracelular se une a las molculas
dimerizadas de IL-10 (Tan. 1995). La transduccn de seales de la IL-10 est mediada a
travs de la va de la JAK/'STAT (Lalani. 1997). Aunque muchos tipos de clula, inclu
yendo las clulas Th2. las clulas T CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrfagos, los
mastocitos, los queratinocitos, los eosinfilos, las clulas epiteliales y muchas clu
las tumorales son capaces de producir IL-10, es el monocito el que produce la ma
yor cantidad de IL-10 en la mayora de las situaciones inflamatorias (Lalani, 1997
). Ya que puede ser producida de un modo autocrino y regular su propia produccin
a travs de mecanismos de retroalimentacin negativos, la IL-10 regula la respuesta
inflamatoria necesaria en el foco inflamatorio (Tan, 1995). La IL-10 acta Inhibie

ndo la produccin de citocinas proinflamatorias como la IL-1et, la IL-B, la IL-6, l

a IL-8, el TNF-a. el G-CSF. el CM-CSF y las quimiocinas incluyendo la IL-8 y la
MIP-1u, suprimiendo la transcripcin de sus genes correspondientes (Goldman, 1997)
. La IL-10 tambin suprime la liberacin de los radicales libres del oxgeno e inhibe
la actividad microbicida dependiente del xido ntrico en los macrfagos (Fleming, 199
6). En situaciones alrgicas como el asma, la produccin de IL-5 es crucial en la in
iciacin del evento. In vitro, la IL-10 previene la produccin de IL-5 en las clulas
T ThO, Th2, y de reposo y regula a la baja la expresin de MHC de Clase II sobre l
as APCs. Tambin inhibe la expresin de MIP-1u en los neutrfilos, monocitos y macrfago
s humanos; inhibe la produccin de qumiotcticos activos en los lugares de inflamacin
crnica; y puede nactvar directamente la funcin de los eosinfilos y causar la muerte d
el eosinfilo. Estos hallazgos sugieren el potencial de la IL-10 para limitar la i
nllamacin area crnica (Petrolan, 1999). Los estudios con animales tambin han sugerido
un papel teraputico para la IL-10 en proporcionar una proteccin mucosa en la enfe
rmedad inflamatoria intestinal, y en disminuir los niveles sricos de IL-8 en los
animales con pancreatitis aguda necrotizante. En los modelos de sepsis, los rato
nes inyectados con IL-10 estaban protegidos frente a inyecciones intraperitoneal
es de endotoxina que. de otro modo, seran letales. La IL-10 puede servir como fac
tor de crecimiento para muchas lneas celulares malignas como los linfomas de clula
s B cultivados de pacientes con SIDA, el linfoma Burkitt y las clulas del mieloma
maligno. La produccin de IL-10 en otras enfermedades malignas puede proporcionar
una forma de eludir las respuestas locales de las clulas T. Sin embargo, los est
udios tambin demuestran la capacidad de la IL-10 de inhibir el crecimiento de las
clulas de la leucemia mieloide crnica in vitro (Benjamis, 1992; Kim. 1995). La IL
-10 puede participar en la induccin y perpetuacin del LES y la actividad de la enf
ermedad se correlaciona con los ttulos de IL-10 (Houssiau, 1995). Est implicada en
otras enfermedades autoinmunes incluyendo la miastenia gravis, la enfermedad de
Graves, el sndrome de Sjgren, la polimiositis, la psoriasis, la esclerosis sistmic
a, el pnfigo vulgar, el penfigoide ampolloso y la enfermedad de Kawasaki (Lalani,
1997). Adems, la deteccin de IL-10 elevada en suero determinada por ELISA en paci
entes con carcinoma de clulas pequeas de pulmn y adenocarcinoma de colon puede ser
un predictor til de la progresin de la enfermedad clnicamente indetectable (De Vita
. 1999, 2000).
lnterleucina-9
La protena IL-9 humana todava no ha sido purificada, pero a travs de la expresin del
ADNc (Renauld, 1990) se cree que la protena madura contiene 144 aminocidos con cu
atro lugares de glicosilacin potencial. Su gen se ha secuenciado en el cromosoma
5, donde los genes de otros factores de crecimiento y de los receptores de los f
actores de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF y CSF-1R) se agrupan. El ADNc p
ara el receptor de IL-9 (IL-9R) codifica una cadena ot de 522 aminocidos especifi
ca de ligando miembro de la superfamilia de receptores hematopoyticos, que se aso
cia con una cadena y de sealizacin de transduccin que es compartida con la IL-2, IL
-4. IL-7 y la IL-15. El hecho de que haya una subunidad del receptor comn utiliza
da por estas citocinas puede explicar algunas de las redundancias de la activida
d observadas entre ellas. Una vez unida a la IL-9, la cadena y recluta la activi
dad de la tirosina cinasa JAK-3 (de la familia de las cinasas Jano), mientras qu
e la IL-9Roc se asocia con la JAK-1. Tambin puede presentar un papel para la prot
eina de adaptacin 4PS/IRS2 (Yin, 1995). En humanos, la expresin de IL-9 est aparent
emente limitada a las poblaciones de clulas T CD4+ CD45 RO positiva (clulas T memo
ria), y a las clulas T CD45-RA+ en presencia de IL-4 e IL-10 (Houssiau, 1995). Se
requiere una cascada de citocinas que incluya la IL-2, la IL-4 y la IL-10 para
mediar su expresin. Adems, el virus tipo 1 linfotrpico de clulas T humanas (HTLV-1)
transformante de clulas T constitutivamente produce IL-9 en respuesta a una ruta
de induccin an desconocida. El papel fisiolgico de la IL-9 en las clulas normales lo
dava no es conocido, pero las clulas T aisladas en fresco en cultivos a largo plaz
o responden a la larga a una actividad de crecimiento promovida por la IL-9, y e
n cultivos de clulas T murinas sufren transformacin tumoral (Uyttenhove, 1988). In
teresantemente, del 5% al 10% de los ratones transgnicos que sobreproducen IL-9 d
esarrollan espontneamente linfomas linfoblsticos (Renauld, 1994). y la IL-9 es pro

ducida en las clulas tumorales de la enfermedad de Hodgkin y del linfoma anaplsico

(Merz, 1991). Lo ltimo muestra la posibilidad de una curva de respuesta autocrin
a de la IL-9 (Demoulin. 1998). En el sistema hematopoytico. la IL-9 y la eritropo
yetina parecen reforzar la maduracin de los progenitores entroides in vitro, y pu
eden promover el crecimiento de unidades formadoras colonias de granulocitos/mac
rfagos

CAPTUIO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

919
lnterleucina-11
La IL-11 es una citocma pleotrpica con numerosos efectos en muchos tejidos incluy
endo la mdula sea, el cerebro, el intestino y los testculos. El ADNc de la IL-11 co
difica un precursor polipeptidico de 23 kDa, 199 aminocidos, con una secuencia lde
r de 21 aminocidos que parecer carecer de lugares potenciales de glicosilacin y de
residuos cisteina. El gen codificante se ha secuenciado en el cromosoma 19, y s
u estructura tridimensional contiene probablemente cuatro residuos (5-hlce (Czupry
n, 1995). El receptor de la IL-11 (IL-11 R) est formado por una asociacin no coval
ente de una cadena i/, especfica de ligando y una cadena p de transduccin de seal,
la gpl30. El complejo IL-6R tambin utiliza la subunidad gp130 como cadena de seali
zacin, explicando algunos de los solapamientos en las acciones de estas cilocinas
(Cherel, 1996). Cuando se asocia con el IL-11R|5 (gp130), la afinidad de unin pa
ra la IL-11 es mayor y se genera una seal biolgica a travs de la formacin de homodmer
os de gp130. Se cree que estos activan las vas de transduccin incluyendo las cinas
as JAK. las cinasas MAPK. las protenas cinasa ribosomales S6, y la familia de cin
asas Src (Fuhrer. 1996). El ARNm de la IL-11 ha sido detectado en muchos tejidos
estimulados incluyendo los fibroblastos, las clulas epiteliales, los condrocitos
. los sinoviocitos, los osteoblastos y las clulas del glioblastoma. Las evidencia
s indican que la IL-11 es una potente citocina antiinflamatoria (Trepicchio. 199
8: Redlich, 1996) que. al igual que la IL-6. puede regulara la baja la funcin efe
ctora macrofgica inhibiendo la expresin de los genes del TNF-a, la IL-1p. la IL-12
y el xido ntrico, a travs de la prevencin de la translocacin nuclear del factor de l
a transcripcin nuclear NF-Kp" (Trepicchio. 1998). Sus efectos hematopoyticos (Du.
1995) incluyen un papel en la megacariocitopoyesis, y la estimulacin de la eritro
poyesis, la proliferacin y diferenciacin macrofgica, y la produccin de inmunoglobuli
nas por las clulas B. Adems, regula la diferenciacin y maduracin de los progenitores
de clulas mieloides en combinacin con el factor de clulas madre (SCF), y puede par
ticipar en la linfopoyesis. En cultivos de mdula sea a largo plazo (LTBNMCs). la I
L-11 aumenta la celularidad de las clulas estromales adherentes y promueve la hem
atopoyesis en estos cultivos. En los pacientes en quimioterapia, la terapia con
IL-11 mejora la recuperacin de la hematopoyesis y de la funcin inmune, y disminuye
la morbilidad de la supresin de la mdula sea por la quimioterapia. La IL-11 tiene
tambin extensos efectos no hematopoyticos (Du. 1995). La IL-11 puede funcionar en
la inflamacin pulmonar y es producida por la estimulacin alveolar y por las clulas
pulmonares epiteliales en grandes cantidades. Los virus respiratorios son potent
es estimuladores de la sntesis de IL-11 en el pulmn, y la IL-11 es detectada en la
s secreciones nasales de nios con infecciones del tracto respiratorio superior (E
inarsson, 1996). La IL-11 tambin est implicada en el control del crecimiento de la
s clulas epiteliales gastrointestinales, ya que muestra una inhibicin reversible d
e la proliferacin de las lineas celulares madre de las criptas intestinales in vi
tro. La IL-11 tambin puede ser capaz de conferir proteccin mucosa al epitelio gast
rointestinal tras la radiacin y la quimioterapia (Keith. 1994). Otras actividades
de la IL-11 incluyen el desarrollo de los osteoclastos in vilro. un papel en la
supervivencia tanto de las neuronas sensitivas como motoras, la estimulacin de l
a liberacin in vivo e in vitro de reactantes de lase aguda y la regulacin del meta
bolismo de la matriz exlracelular (ECM). En la biologa lumoral, la IL-11 acta sinrg
icamente con otras citocinas para promover el crecimiento de las lineas celulare
s de la leucemia humana y estimula la formacin de la colonia de blastos leucmicos
(Hu. 1993; Lemoli. 1995). Se ha detectado un efecto trombootopoytico beneficioso
en pacientes con enfermedad de Crohn que reciben IL-11 recombinante (Sands. 1999
).

las clulas NK CD56+. el receptor de la IL-12 (IL-12R) es un miembro de la superfa

milia de receptores hematopoyticos y tiene una homologa significativa con la gpl 3
0 y con los receptores del G-CSF y del factor inhibidor de leucemia (LIF). La IL
-12 es producida principalmente por los monocitos y los macrfagos, por las clulas
dendriticas (APC profesionales) y, en una pequea cantidad, por los neutrfilos y lo
s queratinocitos. Su produccin est regulada a la baja por la IL-10 y el TGF-p. y s
u sntesis esta aumentada por el IFN-y. La sntesis de IL-12 es inducida rpidamente e
n las clulas fagociticas por ciertos tipos de bacterias, patgenos intracelulares i
ncluyendo los protozoos y los hongos, y en menor medida los virus. Tambin puede p
roducirse con la interaccin homotipica del antigeno CD40 en las clulas T activadas
y en los fagocitos (Trinchieri, 1997). La IL-12 tiene un papel vital como citoc
ina proinflamatoria. En modelos de choque sptico implicando inyecciones intraperi
toneales de endotoxina en ratones, se encontr que la IL-12 promueve la sobreprodu
ccin de IFN-y. que por un mecanismo de relroalimentacin positivo induce la liberac
in de ms IL-12. Finalmente, la sobreproduccin de IFN-y origina la muerte del animal
. El importante papel de la IL-12 en esta serie de eventos sale a la luz por la
observacin de que la inyeccin de anticuerpos neutralizantes anti-IL-12 en ratones
rescata alrededor del 90% de estos de la muerte (Trinchieri, 1994). Las evidenci
as sugieren que la IL-10 inhibe la produccin de IL-12 por los fagocitos, y que la
IL-12 por si misma estimula la produccin de IL-10, sirviendo por ello como regul
ador negativo de su propia produccin (Meyaard, 1996). Las evidencias experimental
es en animales sugieren un papel exacerbante para la IL-12 en ciertas enfermedad
es autoinmunes incluyendo la diabetes autoinmune. la artritis, el modelo animal
de la esclerosis mltiple (EAE) y l a colitis (Trinchieri. 1997). En situaciones a
lrgicas, la IL-12 juega un papel paliativo a travs de su capacidad de regular a la
baja la produccin de IL-4, IL-5 e IgE. El electo es asombroso en la hiperrespues
ta de la va area inducida por antigeno en modelos de ratn (Gavett. 1995). L a IL-12
tiene significativos efectos antitumorales y antimetastsicos en modelos de ratn i
n vivo (Zitvogel. 1995) que parecen estar mediados por la produccin de IFN-y y po
r otros mecanismos no especilicos. Sin embargo, se ha notado toxicidad gastroint
estinal, heptica y hematolgica en ensayos clnicos con rlL-12 sobre pacientes con ca
rcinoma de clulas renales. Debido a su papel en promover las respuestas de memori
a de Th1 a las vacunas, la IL-12 puede ser importante como adyuvante de las vacu
nas.
lnterleucina-13
La IL-13 es una proteina de 12 kDa. 132 aminocidos, clonada por primera vez de li
nfocitos T activados y clones de clulas T en 1993, con cuatro lugares de N-glicos
ilacin y dos puentes disulfuro. Su gen de 4.5 kb se ha secuenciado en el cromosom
a 5 en el grupo de genes que contiene la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-9 y el GM
-CSF. Se cree que posee una estructura (-helicoidal, con cuatro hlices r* y dos ca
denas plegadas p, El receptor de la IL-13 (IL-13R) se expresa en las clulas B. mo
nocitos, basfilos. eosinfilos. mastocilos. clulas endoleliales, fibroblastos, quera
tinocitos y ciertas clulas tumorales. Aparentemente, no se expresa en linlocitos
T humanos La IL-13 y la IL-4 comparten un componente del receptor comn, el gp140,
una protena de 65 a 70 kDa que sirve como receptor de baja afinidad (IL-13Ra) pa
ra la IL-13, como el receptor tipo II de IL-4 (IL-4Ru). No es sorprendente, ento
nces, que la IL-13 simula muchas de las acciones biolgicas de la IL-4. Cuando se
une a su ligando, el IL-13R y el IL-4R inducen la fosforilacin de la tirosina del
JAK-1 en las clulas hematopoyticas. y del JAK-2 en las clulas no hematopoyticas. se
guido por la activacin del STAT-6 y de la PI3-cinasa (Keegan, 1996: Burd, 1995).
La IL-13 es liberada por las poblaciones clnales de clulas T CD4CD8+ ThO, Th1 y Th
2 en respuesta a la estimulacin antignica especfica o a la activacin policlonal, y p
or los mastocitos, los basfilos y los eosinfilos tras la estimulacin a travs de sus
receptores de alta afinidad para la IgE (CD23) (Keegan. 1996). El ARNm de la IL13 es inducido en las clulas B normales tras la correcta estimulacin, y la protena
IL-13 y su ARNm han sido detectados en enfermedades malignas y en clulas B transf
ormadas por el virus de Epstein-Barr (VEB). sugiriendo un posible papel para la
IL-13 en el desarrollo de enfermedades malignas de las clulas B (de Vnes, 1998).

Interleucina-12
La IL-12 es una citocina heterodimrica de 70 kDa formada por dos cadenas unidas c
ovalentemete (p35 y p40), que son codificadas por dos genes separados (Trinchier
i. 1994). La IL-12 promueve la diferenciacin de las clulas humanas tipo Th1, prepa
rndolas para incrementar la produccin de interfern-y (IFN-y). y aumenta las capacid
ades citolticas de las NK y de las clulas T (Heufler. 1996). Estudiado inicialment
e en las clulas T activadas y en

920
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA estimula la proliferacin de mastocitos in vitro e m viv

o. La IL-15 es quimiotctica para las clulas T, recatndolas a los lugares de inflama
cin, y se ha sugerido un papel similar en la sinovial de pacientes con AR (Mclnne
s, 1996). Otras evidencias indican un papel para la produccin de IL-15 en las sit
uaciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, la hepatitis C y la sarcoidosis
. En estas situaciones, la IL-15 puede servir para reclutar los linfocitos activ
ados hacia reas de inflamacin donde sern capaces de liberar citocinas adicionales p
ronflamatorias y ejercer sus efectos citotxicos (Kirman. 1998).
Sobre los linfocitos |3, monocitos y macrfagos, la IL-13 induce una aumento signi
ficativo de la expresin de molculas de MHC Clase II y CD23, sugiriendo un papel pa
ra la IL-13 en facilitar la capacidad de presentacin de antigenos de estas clulas
a las clulas T. Es quimiotctica para los monocitos. y promueve la proliferacin de l
as clulas B activadas, e in vitro parece promover la formacin de colonias de megac
ariocitos y aumentar la proliferacin de clulas progenitoras murinas en la mdula sea.
La IL-13 es en su mayor parte una citocina antiinflamatoria, y se ha notado un
importante papel para ella en la respuesta alrgica. La IL-13 es capaz de inducir
la secrecin de IgE de cultivos de clulas B humanas y de aumentar la expresin de la
molcula de adhesin proinflamatona VCAM-1 en las clulas endoteliales. Este hecho y l
a observacin de que la sntesis de IL-13 est aumentada en situaciones atpicas en el p
ulmn en los asmticos y en pacientes con sinusitis crnica mientras que est disminuida
en respuesta a la administracin de corticoesteroides pone de relieve la importan
cia de la IL-13 en las situaciones de alergia (de Vries. 1998). Al mismo tiempo,
la IL-13 parece atenuar la respuesta alrgica regulando a la baja la capacidad de
las clulas endoteliales y de las clulas del msculo liso de la va area de liberar el
quimiotctico RANTES de los linfocitos T y de las clulas inflamatorias (Tony.
1994).
Interleucina-16
Reconocida inicialmente como un factor quimiotctico en cultivos de clulas mononucl
eares de sangre humana perifrica estimuladas con mitgenos (Center, 1982), la IL-16
est reconocida como un quimiotctico promflamatorio de clulas T. Los linfocitos est
imulados con mitgenos producen IL-16 como una molcula precursora que es degradada
y secretada como una protena de 17 kDa, 130 aminocidos. Solo tras la agregacin en h
omotetrmeros la IL-16 parece poseer actividad biolgica (Bazan, 1996). Se cree que
la IL-16 contiene seis lminas de pliegues (i incluyendo la secuencia de aminocidos
, glicina-leucina-glicna-fenilalanma. que se cree que facilita las interacciones
proteina-protena como la autoagregacin. El gen que codifica la IL-16 ha sido secue
nciado en el cromosoma 15. La superficie de las clulas CD4 parece servir como rec
eptor de superficie para la IL-16 soluble, y es absolutamente necesaria para la
sealizacin biolgica (Cruikshank, 1994) a travs de vas que pueden incluir la fosforila
cin del p56 .
w
El pretratamiento con IL-13 inhibe la produccin de citocinas
o la IL-1i/ y la IL-1(i, la IL-12 y el IFN-ypor los monocitos
Su regulacin a la baja de la produccin de factor tisular y
de la produccin de trombomodulina pone de relieve tambin su
toria.

proinflamatorias com
activados por LPS.
su regulacin a la alta
naturaleza antiinflama

Interleucna-14
La IL-14 probablemente fue nombrada prematuramente y no parece ser una molcula di
stintiva.

Interleucina-15
La IL-15 es una protena de 14 a 15 kDa, 114 aminocidos, identificada por primera v
ez como un factor de crecimiento celular en los sobrenadantes de las lineas celu
lares epiteliales de rones de mono (Grabstem. 1994). Aunque su secuencia de aminoci
dos primaria es nica, su estructura tridimensional contiene dos puentes disulfuro
y se parece bastante a la de otros miembros de la familia de citocinas de cuatr
o u hlices de unin, que incluye a la IL-2. citocina con una actividad funcional si
milar. El gen que codifica la IL-15 se ha secuenciado en el cromosoma 4. cerca d
el gen de la IL-2 (Anderson. 1995a). El receptor de la IL-15 (IL-15R) est compues
to de tres subunidades proteicas: una cadena IL-15Ra especfica de ligando, y unas
cadenas p y y idnticas a las cadenas [J y y del IL-2R. Este hecho explica las ac
tividades similares de IL-15 y la IL-2. La IL-15Ru comparte homologa con la IL-2R
a, aunque su distribucin tisular es diferente, y al igual que la IL-2R, es incapaz
de transducir una seal a menos que est asociada con las cadenas de Iransduccin de
seal |5 y y (Anderson, 1995b). Mientras que el IL-15R en las clulas T utiliza al J
AK-1 y al JAK-3. en los mastocitos emplea la va JAK-2/STAT-5 (Johnston, 1995). Lo
s macrfagos. los fibroblastos, los queratinoctos. las clulas epiteliales y otros te
jidos secretan IL-15. pero a diferencia de la IL-2. no es secretada por los linf
ocitos. De cualquier modo, la distribucin tisular de la IL-15 es amplia, identifi
cndose tambin transcripcin de ARNm en monocitos y macrfagos, clulas de Langerhans. cl
las dendritas y clulas endoteliales. El ARNm de la IL-15 parece almacenarse en un
a muestra translacionalmente inactiva que est disponible para la traslocacin preco
z en la respuesta innata a la infeccin. La produccin de IL-15 por los macrfagos en
la fase inicial de la infeccin microbiana puede servir para activar a las clulas N
K como parte de la respuesta a la infeccin (Cosman. 1995). Al igual que la IL-2,
se ha mostrado que la IL-15 participa en la coestimulacin de las clulas T en proli
feracin, en la induccin de la actividad de citocinas en las clulas T. en la prolife
racin de las clulas NK. y en la activacin de la proliferacin de las clulas B y libera
cin de mmunoglobulinas (Kirman, 1998). Los modelos murinos sugieren un papel esen
cial para la IL-15 en el desarrollo de las clulas NK. A diferencia de la IL-2. la
IL-15 puede aumentar anablicamente la masa muscular esqueltica, y se ha demostrad
o que
La IL-16 es liberada por las clulas T tras la estimulacin con mitgenos. antgenos, hi
stamina y serotonina. Los cultivos de eosinfilos y mastocitos tambin liberan IL-16
en presencia de GM-CSF. y tambin PMA e ionforos de calcio, respectivamente. La IL
-16 tambin h a sido identificada en los sobrenadantes de cultivos de clulas epitel
iales respiratorias extradas de asmticos. La IL-16 sirve como quimiolclico para las
clulas T CD4+ y otras clulas perifricas inmunes que expresan CD4. incluyendo los m
onocitos y eosinfilos. y es un factor de crecimiento competente para ellos y esti
mula la progresin del ciclo celular en clulas CD4+ humanas (Cruikshank. 1994). Ade
ms, la IL-16 promueve el aumento de la adhesin al ECM por los eosinfilos, y regula
a la alza la expresin de HLA-DR sobre los monocitos (Wan, 1995). Sobre los cultiv
os de clulas T, la IL-16 inhibe la expresin del IL-2R mediado por el TCR y la prod
uccin de IL-2, y puede hacer a estas clulas insensibles al AICD. El resultado in v
ivo puede ser el aumento de la acumulacin de clulas T CD4+ cebadas que responden a
citocinas en los lugares de inflamacin, que estn protegidas de la AICD mediada po
r TCR (Cruikshank, 1994). Se ha informado que los asmticos tienen IL-16 constante
mente presente en el epitelio de su va area con clulas T CD4+, sugiriendo un papel
para la IL-16 en el reclutamiento de estas clulas en el asma. Los modelos murinos
sugieren un papel para la IL-16 en la inflamacin granulomatosa. La IL-16 tambin p
arece suprimir la transcripcin del VIH en las clulas T infectadas por el VIH a tra
vs de la activacin de un factor represor no identificado.
Interleucina-17
Conocida inicialmente como antigeno 8 de los linfocitos T citotxicos (CTLA-8), la
IL-17 es una citocina proinflamatoria de 32 kDa secretada c o m o homodmeros uni
dos covalentemente por un restringido grupo de clulas T memoria activadas (Yao, 1
995; Fossiez, 1996). El gen que codifica esta citocina descrita recientemente ha
sido mapeado en el cromosoma 2 y su expresin parece estar estrechamente regulada

. La IL-17 se expresa predominantemente por las clulas T CD4+ CD45-RO en respuest

a a una variedad de seales de activacin incluyendo la Con A, el PHA, el anti-CD3 m
Ab, el antiCD28 mAb y el Pl (Fossiez, 1996). Los estudios en ratones sugieren qu
e. en contraste con la expresin restringida de la IL-17. el receptor de la IL-17
(IL-17R) es una protena novel ampliamente distribuida especialmente abundante en
el bazo y el rir

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

921
Evidencias recientes implican la va de sealizacin JAK/STAT en la transduccin de seale
s por el IL-17R (Subramaniam. 1999). Algunas evidencias parecen sugerir un papel
para la IL-17 como inhibidora del crecimiento de las clulas T activadas en raton
es (Yao. 1995a). Esto mismo an no ha sido demostrado en sistemas humanos. La IL-1
7 tambin parece regular al alza la produccin de IL-6. IL-8. PGE y xido ntrico, y su
secrecin por los fibroblastos cutneos, los sinoviocitos. las clulas endoteliales, l
as clulas del epitelio bronquial y las lineas celulares del carcinoma de rion. La
IL-17 induce indirectamente la proliferacin de clulas progenitoras hematopoyticas C
D34+ cocultivadas con fibroblastos, y finalmente promueve la diferenciacin de est
as clulas a neulrfilos (Yao, 1995b). La IL17 tambin induce la expresin de ICAM-1 sob
re los fibroblastos in vitro (Fossiez, 1996).
;
Se ha sugerido un papel in vivo para la IL-17 en la proteccin frente a la infeccin
bacteriana, y debido a su capacidad para inducir la produccin de altos niveles d
e citocinas incluyendo la IL-6. la IL-18 y el MCP-l. puede servir para regular e
l proceso inflamatorio (Dalrymple, 1996). Evidencias recientes sugieren la posib
ilidad de que la IL-17 pueda promover indirectamente los tumores de cuello uteri
no en humanos (Tartour, 1999).

asocia despus con los componentes o transportadores de ECM como la a -macroglobul

ma. la albmina o la IgG. lo que facilita la captacin y el metabolismo del TGF-p. E
l TGF-p es bien conocido por su papel en el desarrollo, crecimiento y diferencia
cin de clulas epiteliales: en la carcinognesis. y en la inflamacin, la reparacin y la
angiognesis. Sus efectos biolgicos son transducidos a travs de cualquiera de los s
eis receptores descritos incluyendo las tres clases de receptores transmembrana
y muchos receptores solubles. De estos, los receptores del TGF-p" tipo I y tipo
II son capaces de transducir seales biolgicas, mientras que los receptores tipo II
I carecen de residuos de sealizacin y sirven sobre todo para almacenar y presentar
el TGF-|5 a los receptores de sealizacin. La seal biolgica es transducida al ncleo a
diendo protenas Smad (miembros de la familia relacionada con MAD) como intermedia
rios (Lopez-Casillas. 1993; Derynck, 1996). El TGF-jJ es producido por cualquier
linaje de linfocitos desde linfocitos hasta macrfagos y clulas dendrticas. y acta t
anto en la respuesta autocnna como paracrina. Sus actividades biolgicas son mucha
s y bien equilibradas, provocando efectos perjudiciales tanto el exceso como la
insuficiencia (McCartney-Francis, 1998). En ratones knockoute TGF-p, el 30% al 60
% de los embriones demostraron fallo en la angiognesis y en la hematopoyesis, y a
bortos espontneos, mientras que en ratones transgnicos con sobreexpresin de TGF-p.
la consecuencia es la hipoplasia pulmonar y la prdida de la diferenciacin epitelia
l respiratoria originando la muerte perinatal. El TGF-|i funciona tanto como lac
lor de proliferacin como inhibidor del crecimiento. Inhibe el producto del gen de
l retmoblastoma (Rb) e inhibe la expresin del protooncogn c-myc, provocando una al
teracin del equilibrio de las protenas reguladoras positivas y negativas que contr
olan el ciclo celular (Alexandrow. 1995) En ratones, la sobre o infraexpresin de
TGF-|4 origina hipo o hiperproliferacin de clulas epiteliales, en donde la hiperpr
oliferacin est asociada con carcinoma (Nogaard. 1995). En humanos, la agresividad
de las lneas celulares del melanoma y del carcinoma de colon aumenta con el aumen
to de la prdida de respuesta al TGF-|i. El TGF-|! tambin puede servir como supreso
r de tumores, ya que los anticuerpos contra el TGF-|i aumentan la carcmogenia de
las clulas del carcinoma de colon in vitro. En el compartimento hematopoytico (Mc
Carteny-Francis, 1998), el TGF-p controla la mielopoyesis, la linfopoyesis y la
supervivencia de las clulas dendrticas de Langerhans. En la respuesta inmune el TG

F-J5 mantiene el proceso inflamatorio a travs del aumento de la adhesin de las clul
as inflamatorias a travs de la regulacin a la alta de las integrinas. y quimiotctic
amente reclutando y activando linfoctos nativos. Interesantemente, los ratones kn
ockout de TGF-p desarrollan una hiperactividad frente a las clulas B parecida a l
a autoinmunidad, con infiltracin por un nmero considerable de macrlagos y linfoctos
de rganos incluyendo el corazn, el pulmn y el hgado (Kulkarni, 1993). El TGF-p puede
promover normalmente la tolerancia a lo propio regulando la maduracin de los lim
ocitos CD4+ y CD8+ de modo que clones aulorreactivos sufren apoptosis. En la per
iferia, una poblacin de TGF-|i producidos por las clulas Th2 mantienen la toleranc
ia perifrica promoviendo la anergia clonal. El TGF-p suprime la respuesta inflama
toria y promueve la curacin a travs de la inhibicin de la proliferacin de clulas T y
B. la inhibicin de la funcin de las clulas NK, la induccin de los antagonistas de ci
tocinas, la regulacin a la baja de la expresin de integrinas, y la inhibicin de la
liberacin de IgG. Sin embargo, la sobreproduccin de TGF-p no solo acaba con la res
puesta inflamatoria sino que produce una "excesiva" curacin, provocando una fibro
sis exuberante y una excesiva cicatriz (Wahl, 1994). Se ha propuesto un papel pa
ra el TGF-p en la aterosclerosis, en donde el TGF-ji insuficiente puede permitir
la formacin de la placa arteriosclerlica. En esta via, la formacin de la placa en
algunos ratones seleccionados es inhibida por la administracin de tamoxifeno, que
aumenta el TGF-p circulante.
lnterleucina-18
Llamada originalmente factor inductor de IFN-y (IFIF), la IL-18 es una proleina
de aproximadamente 18 kDa producida por los macrlagos activados, las clulas de Kup
ffer, los osteoblastos y los queratinocitos (Torigoe, 1997). La formacin de la IL
-18 biolgicamente activa requiere el procesamiento del precursor de 24 kDa por la
caspasa-1 (ICE) en las clulas de Kuplfer. El receptor de la IL-18 (IL-18R) es idn
tico a la protena relacionada con el IL-1R (IL-1 Rrp) (Torigoe, 1997), y cuando s
e une a su ligando el IL-18R induce la unin del ADN NF-vp. Se han identificado IL
-18Rs de alta y baja afinidad, pero sus papeles en la transduccin de seal no estn c
laros. La funcin primaria de la IL-18 parece ser la induccin del IFN-y en las clula
s Th1 activadas y en las clulas B anti-CD40 activadas (en presencia de IL-12). La
IL-18 tambin induce la sntesis por las clulas T de CM-CSF e IL6. y promueve la cil
otoxicidad sobre las clulas NK permitiendo la exocilosis de perforinas y granzima
A (Ushio. 1996). Los estudios in vitro sugieren un papel para la IL-18 fuera de
l sistema inmune (Udagawa, 1997; Stoll. 1997; Conti. 1997). Los papeles fisiolgic
os de la IL-18 pueden incluir la defensa contra la infeccin, y un papel en el rec
hazo de tumores. A travs de la supresin de la produccin de IgE. la IL-18 puede abor
tar la respuesta alrgica (Yoshimoto, 1997), pero la produccin no regulada de IL-18
est asociada con el dao del parnquima heptico en modelos animales. La IL-18 puede p
articipar en la patognesis de la linlohistiocitosis hemolagoctica (HL) a travs de l
a induccin de clulas Th1. La medicin de los niveles de IL-18 en la sangre perilrica
de los pacientes afectos puede facilitar un medio para la monitorizacin de la act
ividad de la enfermedad HL latente (Takada, 1999).
Factor transformante del crecimiento [i
El TGF-p es una citocina de 25 kDa definida en un bioensayo por su capacidad par
a mantener la formacin de colonias por los fibroblastos del rion de ralas normales
(NRK) en presencia de tactor de crecimiento epidrmico (Clark, 1998). En mamferos,
son producidas tres isoformas de TGF-|i (TGF-(11. TGF-|12 y TGF-P3) (McCartneyFrancis, 1998). El TGF-|i bioactivo es un homo- o heterodimero del pptido TGF-p d
e 12.5 kDa degradado por endopeptidasas desde el pro- TGF-p. Antes de su secrecin
, el dimero TGF-p de 25 kDa se une al pptido de unin latente del TGF-p de 75 kDa (
TGF-(3-lpb), y juntos se unen al pptido de latencia asociado al TGF-|J de 135 kDa
(TGF-(i-lap) form a n d o el complejo TGF-ji latente (TGF-(i-lc). El TGF-p-lc s
e encuentra en grandes cantidades en los granulos a de las plaquetas. Una vez li
berado, el TGF-p-lc se puede unir a los receptores de superficie celulares para
el TGF-p o puede adherirse a los componentes ECM y permanecer latente. Alternati
vamente, puede degradarse a su forma activa una vez secretado a travs de las sern
proteasas liberadas ya sea por la misma clula o por clulas vecinas. EL pptido de de

gradacin bioactivo se
Factor de necrosis tumoral
El TNF es una citocina proinflamatoria de 17 kDa (Beutler, 1995) que puede exist
ir como forma transmembrana de 26 kDa, o como pptido soluble que se homotrimenza
para formar la citocina fisiolgicamente activa de

922
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA
52 kDa. Su nombre deriva de su capacidad para malar clulas tumorales y para induc
ir la necrosis hemorrgica en tumores trasplantados a ratones. Es un miembro de la
familia de los ligados parecidos al TNF. formados todos por tres cadenas polipe
ptdicas y capaces lodos de unirse a miembros de una lamilia de receptores de TNF
relacionados estructuralmente (Beutler, 1994). La mayora de los efectos del TNF e
stn mediados a travs de dos receptores de superficie celular de alta afinidad: el
TNFR-I (CD120a, 55 kDa) y el TNFR-II (CD120b, 75 kDa) (Hohmann. 1989). Cuando so
n ligados, estos receptores median seales para la proliferacin y muerte celular pr
ogramada (apoptosis), con evidencias que muestran que esto ltimo est mediado a tra
vs de la induccin de la prdida de la integridad de la membrana mitocondrial y la li
beracin de protenas del especio intermembrana. En relacin con esto, el TNFR-I tiene
en su dominio mtracelular un residuo denominado "dominio mortal" que es necesar
io para la transduccin de la seal apopttica. Principalmente, producen TNF los macrfa
gos y los monocitos. pero otras clulas incluyendo los linfocitos, los mastocitos,
los neutrfilos, los queratinocitos. los astrocitos, las clulas microgliales, las
clulas del msculo liso y las clulas tumorales tambin lo producen. El TNF puede actua
r localmente en una funcin paracrina, pero tambin acta en lugares distantes a modo
de hormona. Los efectos biolgicos del TNF-a son numerosos (Kollias, 1999) e inclu
yen un efecto citotxico directo, la modulacin del crecimiento y diferenciacin tisul
ar, y un papel en las situaciones de inflamacin e infeccin crnica. Adems, el TNF-a e
s responsable del sndrome de caquexia tumoral y de la mayora de las infecciones pa
rasitarias. A travs de la estimulacin de los neutrfilos. el TNF-a aumenta la fagoci
tosis, la degranulacin y la actividad de la cadena respiratoria. Los efectos proi
nflamatorios adicionales incluyen la induccin del aumento de la formacin del facto
r activador de plaquetas (PAF) en los neutrfilos, la estimulacin de la secrecin de c
ido araquidnico, el aumento de la citotoxicidad anticuerpo dependiente mediada po
r clulas, y el aumento de la adherencia de los neutrfilos al endotelio activado po
r TNF a travs de la regulacin a la alta de la E-selectina; los efectos muestran el
papel proinflamatorio del TNF. Los modelos animales implican al TNF en la AF y e
n la enfermedad inflamatoria intestinal donde el TNF ejerce un efecto proinflama
torio a travs de la activacin de las clulas endoteliales y de la induccin de las qui
miocinas quimotcticas de neutrfilos. Adems, se ha propuesto un papel para el TNF en
las enfermedades desmielinizantes inflamatorias del SNC sobre la base de mltiples
estudios de esclerosis mltiple (EM) en humanos (Kollias, 1999). En pacientes que
sufren de fiebre recurrente transmitida por piojo (infeccin por Borrelia recurre
nlis), la administracin de anticuerpos bloqueantes anli-TNF ha demostrado suprimi
r la reaccin de Jarisch-Hexheimer (hipotensin persistente) que acompaa a la adminis
tracin del antibitico (Fekade, 1996).
MOLCULAS DE ADHESIN CELULAR
El pegamento que une los tejidos vivos en complejos organismos multicelulares es
t compuesto en parte de molculas de adhesin que se describen a continuacin. Estas co
mpleas glicoproteinas permiten la migracin celular durante la embriognesis y cicatr
izacin de heridas, y gobiernan el trfico de leucocitos, que es de importancia clav
e en la linfopoyesis y en la respuesta inmune. Las molculas de adhesin se dividen
convencionalmente en cinco grupos basados en su homologa estructural: cadherinas,
mucinas, integrinas, selectinas y molculas de la superfamilia de inmunoglobulmas
. Las cadherinas son expresadas en su mayora en las clulas epiteliales e interacci
onan con las otras de forma calcio-dependiente Las mucinas son protenas m u y gli
cosiladas que interactan principalmente con las selectinas. Los miembros de la su
perfamilia de inmunoglobulinas tienen dominios semejantes a las mmunoglobulnas e
interaccionan con las mtegrmas. las selectinas. y una con la otra. Las integrina

s y las selectinas se discuten ahora.

Integrinas
La familia de molculas de adhesin de las integrinas (revisadas en Gonzalez-Amaro.
1999) proporciona una unin fsica crtica entre los elementos externos a la clula (otr
as clulas y el ECM) y los elementos del interior de la clula (el citoesqueleto, la
s molculas intracitoslicas y el ncleo). Cada miembro de la familia de las integrina
s est compuesto de un heterodimero d e subunidades a y p unidas no covalentemente
(Tabla 39-1). Actualmente, estn completamente descritas las 16 subunidades a y l
as ocho |1 pudiendo originar ms de 22 combinaciones de heterodmeros. Las 14 princi
pales integrinas se dividen en cuatro subfamilias, difiriendo en los patrones de
expresin y en la especificidad de ligando. Las integrinas (i, (las integrinas de
la activacin final [VLAsJ) se crean por la asociacin de una subunidad de cadena |
i, (CD29) con cualquiera de las subunidades de la cadena o (CD49a a CD49f). Son
expresadas en todas las clulas que requieren un firme anclaje al ECM, y en los le
ucocitos, plaquetas y algunas clulas tumorales circulantes. Las integrinas p , qu
e tienden a ser expresadas principalmente por los leucocitos y las clulas mieloid
es, resultan de la asociacin de la subunidad de la cadena p (CD18) con cualquiera
de las mltiples subunidades rx Cuando se combinan con la subunidad a, (CD11a), s
e forma la integrina p LFA-1 (CD11a'CD18). La LFA-1 juega un papel crucial en la
adhesin leucocitana al endotelio vascular durante la migracin transendotelial. La
subunidad de
? 2
Tabla 39-1
Principales integrinas: estructura molecular e interaccin
Interfern -y
El IFN--/ (Samuel, 1991) es una proteina homodimera de 40 a 70 kDa, 143 aminocido
s, detectada por primera vez como un inhibidor derivado de las clulas T de la rep
licacin viral en cultivos de fibroblastos. Est codificado por una gen simple que e
st mapeado en el cromosoma 12. La clulas T y las clulas NK son las nicas fuentes con
ocidas de IFN. Las clulas T lo producen en respuesta a la estimulacin antignica o m
itognica, y las clulas NK lo producen en respuesta a IL-2, anticuerpos anti-CD16,
o en presencia de macrfagos activados (Carson, 1995). In vilro, el IFN es un pote
nte estimulador de los macrfagos y aumenta fuertemente su actividad tumoricida. O
rigina una regulacin a la alta de las molculas MHC en muchos tipos celulares inclu
yendo las APCs. Adems, regula la produccin de anticuerpos por las clulas B (Snapper
, 1987). y estimula a las clulas Thl. En respuesta a la infeccin, el IFN induce a
los macrfagos a matar a los microorganismos intracelulares a travs de la produccin
de metabolitos oxidativos y proteasas. Clnicamente, el IFN se ha empleado para au
mentar la capacidad bactericida de los fagocitos en los que tienen enfermedades
granulomatosas crnicas (Bolinger, 1992). Se ha mostrado poco prometedor como agen
te antitumoral.
L M N = laminina F B N = tibronectma F B G N librinogeno. VN = vitronectina. vWF
= factor de von Willebrand. VCAM = molcula de adhesin celular, L F A= antigeno li
nfocitico funcional: ICAM= molcula de adhesin mtracelular

CAPTULO 39
? M

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

923
la cadena p en asociacin con la subunidad (CD11b) forma el Mac-1 (CD11b/CD18), un
a integrina expresada en las clulas mieloides y en los fagocitos mononucleares. L
as subunidades a. de las integrinas son protenas de membrana con 120 a 180 kDa co
n dominios intracitoplasmticos cortos, un fragmento extracelular largo con siete
dominios homlogos, y muchos residuos de unin para iones metales (lugares de adhesin
dependientes de iones metales [MIDAS]) que se cree que funcionan convirtiendo l
a integrina de una conformacin inactiva a una activa. Tanto la subunidad a como l
a |i se unen a un ligando, pero se cree que generalmente la subunidad a proporci
ona especificidad de ligando. Los tallos intracitoplasmticos de las subunidades d
e las integrinas a y p se asocian con los componentes del citoesqueleto para tra
nsducir seales mtracitoplsmicas. En el proceso de transduccin de la seal, las integr
inas se asocian e interaccionan con las otras protenas asociadas a la membrana, c
on los componentes del citoesqueleto y con los componentes citoplsmicos no citoes
quelticos. La proteina asociada a integrinas (IAP o IAP 50) designada como CD47,
miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una de las protenas asociadas
a la membrana que a travs, sobre todo, de su asociacin con las integrinas (5-, pue
de funcionar como un transductor de seal. Otras protenas asociadas a la membrana i
mplicadas en la sealizacin de integrinas incluyen la caveolina-1 y el CD9, que estn
implicados en la formacin de picnosomas de la membrana celular y en la agregacin
plaquetaria. respectivamente. Las molculas citoslicas incluyendo la protena asociad
a a dominios citoplasmticos de integrinas (ICAP-1) ayudan a orquestar la compleja
actividad de la migracin de clula mediada por integrina p,. Quizs las asociaciones
intractoplasmticas de las molculas de integrinas mejor estudiadas son aquellas aso
ciadas con las protenas del citoesqueleto rx-actinina, talina filamina, vinculina
, tensina y paxilina. Estas protenas del citoesqueleto a travs de su asociacin con
las subunidades de las integrinas p,, |1 , y p , unen la integrina al citoesquel
eto y dirigen la migracin celular, la fagocitosis, la formacin de fibras de estrs e
n los lugares de contacto, la transduccin de seal intracelular, y unen las protenas
del citoesqueleto separadas.
2 3
integrinas que median la unin a los componentes menos ampliamente distribuidos, l
a distribucin tisular est ms restringida. La expresin de las molculas de integrina de
pende de la activacin celular, y puede estar regulada a la alta o a la baja en re
spuesta a estmulos especficos del ambiente externo, incluyendo la estimulacin local
por citocinas o la interaccin inmune. La interaccin de las integrinas leucocitari
as con las clulas endoteliales es crtica para la evolucin de las respuestas inflama
toria e inmune. Adems, el trasporte de las clulas linfoides a sus lugares de resid
encia y la diseminacin intravascular de las metstasis implican similares interacci
ones endoteliales mediadas a travs de las integrinas de superficie y otras poblac
iones de molculas de adhesin, las selectinas y sus ligandos. La extravasacin de leu
cocitos ocurre durante el transporte celular como el trfico de las clulas T y/6 a
las placas de Peyer, y como parte de la respuesta inflamatoria. Ambos procesos i
mplican etapas similares, empleando diferentes molculas de adhesin. En la inflamac
in el proceso comienza con la liberacin local de citocinas proinflamatorias como e
l TNF-ot, la IL-1 y el IFN-y, que activan el endotelio local para aumentar la ex
presin en su superficie de molculas de adhesin incluyendo miembros de la superfamil
ia de inmunoglobulinas, el VCAM-1 y el ICAM-1. Adems, las clulas endoteliales libe
ran agentes quimiotcticos incluyendo la IL-8, formando una superficie de unin y un
gradiente quimiotctico soluble reconocible por la transmigracin de clulas inflamat
orias, que las localiza en los focos inflamatorios. Este proceso para los linfoc

itos y los eosinfilos (Fig. 39-1) implica: (1) unin de los leucocitos circulantes
a la superficie endotelial principalmente por las selectinas endoteliles (select
inas E y P) y sus ligandos leucocitarios; y (2) movimiento leucocitario {rolling
), en donde a travs de la expresin rpida secuencial, principalmente de la integrina
leucocitaria VLA-4 y u p , la fuerza de cizallamiento (shean forc) proporcionada
por el torrente sanguneo mueve los leucocitos a lo largo de la superficie endote
lial, permitiendo poner estas integrinas en contacto con sus ligandos endotelial
es, el VCAM-1 y el MAdCAM-1. respectivamente. En el caso de los neutrfilos, el mo
vimiento o rodamiento est mediado solo por las selectinas. A medida que ruedan, l
as molculas de adhesin celular leucocitarias desencadenan acontecimientos bioqumico
s conduciendo a (3) la activacin leucocitaria y a la conversin de sus integrinas e
n estados activados. La ahora aumentada avidez y afinidad de, principalmente, LF
A-1 e ICAM-1 lleva a aumentar la adhesin celular
4 ?
El patrn de distribucin de las integrinas es amplio, especialmente entre aquellas
integrinas (principalmente las |5,) implicadas en anclar las clulas a los compone
ntes del ECM general como el colgeno y la laminina. Para estas
5. M i g r a c i n quimiotctica Figura 39-1. El movimiento de los linfocitos del
torrente sanguneo hacia los tejidos est regulado por la interaccin de la adhesina d
e la superficie del leucocito y de la superficie de la clula endotelial a travs de
un proceso de varias etapas que incluye el atrapamiento, laminacin, aplanamiento
y transmigracin (o diapdesis) cuya direccin la proporciona el gradiente quimiotctic
o.

924
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA de los niveles de citocinas seleccionadas y administra

ndo las citocinas apropiadas. En la actualidad, mientras no est claro, los ensayo
s clnicos continuados y las mejoras en los ensayos con citocinas dilucidarn finalm
ente qu intervenciones y mediciones de laboratorio son realmente tiles en la prctic
a clnica. BIBLIOGRAFA Alexandrow MG. Moses HL: Transforming g r o w t h lactor-bet
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leucocitaria endotelial, y a la larga (4) a detener el movimiento leucocitario,
y (5) la transmigracin leucocitaria del endotelio, aunque siguiendo a un gradient
e quimiotclico. Es todava tema de debate si los leucocitos pasan directamente a tr
avs de las clulas endoteliales individuales, o simplemente pasan entre las clulas e
ndoteliales adyacentes. Una vez atravesado el endotelio, la migracin celular medi
ada por integnnas a travs de la matriz extracelular por medio de un gradiente qui
miotctico completa el viaje de los leucocitos a los focos de inflamacin. Los estad
os de deficiencia para las integrinas |l, (deficiencia de adhesin leucocita tipo
I) y los defectos congnitos en la expresin de las selectmas y de los ligandos demu
estra el papel indispensable que juegan estos receptores en producir la respuest
a inflamatoria y en el trfico linfocita. En estos pacientes los neutrfilos son inc
apaces de salir del torrente sanguneo y de migrar a los lugares de inflamacin o in
feccin, creando en efecto un estado de supresin inmune con aumento de la susceptib
ilidad a las infecciones bacterianas y un neutrofilia perifrica paradjica (Bullard
, 1996). Los eventos que acontecen en el choque sptico, en la trombosis, en la le
sin de reperfusin y en las metstasis tambin requieren la actividad de las integrinas
y las selectinas. Este conocimiento ha llevado al empleo teraputico de anticuerp
os monoclonales, ligandos de molculas de adhesin solubles y otras intervenciones,
incluyendo los oligonucleticos antisensibilizantes para superar la enfermedad med
iada por las molculas de adhesin (Gonzalez-Amaro. 1998: Buckley. 1997).
Selectinas
La familia de las selectinas (Gonzalez-Amaro. 1999) contiene tres protenas homolo
gas. La L-selectina (CD62L) es expresada por la mayora de los leucocitos y se cre
e que juega un importante papel en el transporte o trfico de los linfocitos nativ
os y de memoria. La P-selectina (CD62P) es almacenada en los granulos </ y en lo
s cuerpos de Weibel-Palade de las plaquetas y de las clulas endoteliales. respect
ivamente, y es expresada en la superficie celular Iras la activacin celular. La E
-selectina (CD62E) se encuentra en la superficie de las clulas endoteliales activ
adas. Las selectinas interaccionan con los grupos carbohidrato como el sialil-Le
wis" y el sialil-Lewis* y posiblem e n t e con otros ligandos incluyendo las int
egrinas y los glicolpdos. No se ha determinado la total extensin de ligandos fisiolg
icos de las selectinas, pero se espera que la lista incluya molculas expresadas e
n los leucocitos y el endotelio, ya que las selectinas son importantes para las
interacciones leucocito-leucocito y leucocito-endotelio. El papel de las selecti
nas es doble: mediar la interaccin clula-clula y contribuir a la activacin celular a
travs de la sealizacin intracitoplasmtica. Al igual que las integrinas, las selecti
nas son crticas en el contacto y movimiento (rolling) inicial de los leucocitos s
obre el endotelio activado antes de la extravasacin. Tras la unin a la forma solub
le de la glicoproteina similar a la mucina GlyCAM-1 (un produelo de alta expresin
endotelial), la L-selectina es capaz de mediar la activacin de las integrinas B,
y su adhesin a la fibronectina. La P y la E selectina tambin pueden servir como m
olculas receptoras de transduccin de seal, ya que producen un aumento del Ca2+ mtra
celular libre en los leucocitos que se adhieren a las clulas endoteliales (Huang,
1993).

PERSPECTIVAS
Claramente, muchas de las citoemas y molculas de adhesin presentadas aqu juegan un
papel en los estados de enfermedad. Los mdicos esperan que un da se estimule la re
misin de las lesiones patolgicas mediadas por citocinas a travs de la manipulacin tn
vivo de los niveles y proporciones de las citocinas pro y antiinflamatorias. An
tes de que esto se pueda considerar seriamente, los investigadores y los laborat
orios deben continuar descifrando el lenguaje de las citocinas en las clulas, y d
esanoliando y retinando los ensayos significativos de stas. De momento es posible
monitorizar la enfermedad subclinica (IL-18), identificar poblaciones de nesgo
para la sepsis (IL-6). predecir la progresin de la enfermedad (IL-10) y disminuir
los efectos adversos de la enfermedad (TNF) a travs de la monitorizacin

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

925
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926
SECCION V

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c mice Proc Natl Acad Sci U S A 1989: 86:7547-7551.

C A P T U L O
40
Antigene leucocitario humano: compie mayor de h istocompatibiIidad del hom
Armead H. Johnson, Ph.D. Carolyn Kafovich Hurley, Ph.D. Robert J. Harfzman, Capt
, MC, USN, M.D. Judith A. Wade, B.Sc.
GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Gentica bsica Composicin del MHC L
ocalizacin de los genes del MHC Herencia Desequilibrio de unin Variacin tnica MOLCULA
S DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A. -B. -C Estructura de las molculas de clase I Org
anizacin de los genes de clase I Regulacin de la expresin de los genes de clase I F
uncin de las molculas de clase I Otros genes de clase I MOLCULAS DE CLASE II: SUBRE
GIONES HLA-DR. -DQ, -DP Estructura de las molculas de clase II Organizacin de los
genes de clase II Desequilibrio de unin de los genes en la regin de la clase II Re
gulacin de la expresin de los genes de clase II Funcin de las molculas de clase II O
tros genes de clase II CARACTERSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGNICOS UNIDOS POR LAS
MOLCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II NOMENCLATURA HLA Especificidades serolgicas y c
elulares 930 Designaciones allicas basadas en el ADN TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN
DEL POLIMORFISMO DEL HLA Tipificacin basada en el ADN de los alelos de clase I y
clase II Deteccin serolgica de las molculas de clase I y clase II 934 Deteccin celul
ar de las molculas de clase II TRASPLANTE DE RGANOS/TEJIDOS Bases genticas del tras
plante Concordancia de histocompatibilidad Trasplante renal Trasplante de rganos
no renales Trasplante alognico de clulas progenitoras hematopoylicas RESUMEN 936 BI
BLIOGRAFA 946 946 941 938 937 MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR 936 928 RECONO
CIMIENTO DE LAS MOLCULAS MHC EXTRAAS REPETICIN EN TNDEM Y POLIMORFISMO NUCLETIDO SIMP
LE EN EL MHC
936
936
La supervivencia depende de la capacidad del sistema inmune de reconocer y respo
nder a una multitud de sustancias extraas (antgenos). Aunque este mecanismo de def
ensa es bsico para la supervivencia en un mundo de microorganismos hostiles, este
mismo sistema de defensa tiene un impacto negativo cuando se trasplantan tejido
s de uno a otro individuo o cuando su mal funcionamiento dispara las reacciones
autoagresivas. Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) codific
an protenas esenciales en el reconocimiento inmune: las molculas de clase I y clas
e II (Fig 40-1). En el hombre, las molculas de clase I incluyen el antigeno leuco
citario comn (HLA-) HLA-A. HLA-B y HLA-C. y las molculas de clase II incluyen el H
LADR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas molculas son los clsicos antigenos del trasplante. Ot
ras molculas codificadas en el MHC son las molculas de clase III (vase Cap. 41). Es
tas incluyen los componentes del complemento ligados al MHC (C2, C4 y Bl), la 21
-hidroxilasa (CYP21), la protena 70 del golpe de calor (Hsp70) y el factor de nec
rosis tumoral (TNF).
Durante una infeccin, los microorganismos invasores pueden tanto infectar como se
r ingeridos por las clulas y entonces ser degradados a fragmentos peptidicos. Den
tro de la clula, las molculas del MHC de clase I o de clase II se unen a los fragm
entos antignicos derivados de los microorganismos. Una vez que los fragmentos ant
ignicos se han unido a las molculas del M H C y han sido translocados a la superfi
cie celular, los receptores de los linfocitos T interaccionan con el complejo fr
agmento antigenico-molcula de MHC, disparando tanto la respuesta inmune humoral c
omo la celular (Fig. 40-2). Las molculas de superficie celular especficas de las cl
ulas T, CD4 y CD8. actan para potenciar esta interaccin celular y para transmitir
las seales de activacin. Otras molculas de superficie celular actan para aumentar la
afinidad de las interacciones celulares (p. ej.. el CD2 y su ligando, el CD58 [
LFA-3] o el CD11a/CD18 (LFA-1J y su ligando, el CD54 [ICAM-1]) y para transmitir
las seales coestimuladoras (p. ej., el CD28 y sus ligandos, el CD80/CD86 [B7j y
el CD40 y su ligando, el CD154) (vase Cap. 39). El polimorfismo de los genes que

especifican las molculas

928
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Regin HLA clase II
Figura 40-1. M a p a del compiejo de genes del MHC en el c r o m o s o m a 6. El
HLA-DPB2 en la regin H L A clase II est localizado c e r c a del centrmero. El HLA
-F es el ms leiomnco. La regin entre el HLA-DRA y el HLA-B no se muestra. (De T h e
A n t h o n yN o l a n B o n eM a r r o w Trust: w w w . a n t h o n y n o lanor
g.uk/HlG. c o n permiso.)
MHC de clase I y clase II afecta a la especificidad de unin al antigeno de las mo
lculas, originando diferencias en las respuestas inmunes sobre los miembros de la
s especies. El mismo patrn de interacciones entre el exterior celular y el comple
jo MHC clase I o clase ll-antgeno y un linfocito T ocurre no solo en el reconocim
iento de los patgenos invasores, sino tambin en el reconocimiento de las molculas e
xtraas de clase I y clase II (aloantigenos) y en el reconocimiento de los antigen
os propios (autoantgenos) (vase Cap. 41). Y a que las molculas MHC extraas de clase
I y clase II son reconocidas c o m o antigenos "de trasplante", es beneficioso g
arantizar que el donante y el receptor son hislo- (es decir. Tejido) compatibles
(es decir. HLA emparejado). Las molculas de clase I y clase II tienen mltiples al
elos posibles en la poblacin. Por ello, garantizar la compatibilidad es a menudo
una tarea difcil, que requiere la colaboracin del personal mdico, del personal clnic
o que tipifica el HLA, y de los coordinadores del tejido donante (p. ej., redes
de donantes de rganos y registros o bancos de donantes de clulas hematopoyticas). E
n este captulo se trata la gentica, estructura, luncin, nomenclatura y las tcnicas d
e deteccin de los productos gnicos del MHC humano, el HLAA, -B y -C (clase I) y el
HLA-DR, -DQ y -DP (clase II). Tambin se discute la importancia de la concordanci
a del HLA en el trasplante. Adems de las listas de referencia del final del capit
ulo, en la Tabla 40-1 se nombran pginas web tiles que proporcionan tanto material
de referencia como actualizaciones de resmenes clnicos.
cromosomas (es decir, un nmero haploide) se transmite por cualquiera de los gamet
os dados. El doble, o nmero diploide de cromosomas, se restablece cuando se fusio
nan los gametos masculino y femenino para formar el cigoto. De este modo, para u
n rasgo determinado por un gen, siempre habr cuatro combinaciones genticas posible
s en la descendencia, cada una con una probabilidad de incidencia igual. Estas l
eyes de la segregacin y de divisin aleatoria se aplican a los genes del sistema MH
C. Las definiciones para trminos genticos que sern empleados este captulo se dan a c
ontinuacin (Crow. 1976; www.nhgri.nih.gov).
GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Gentica bsica
La primera ley de Mendel, la ley de la segregacin, esl basada en el principio de q
ue los rasgos hereditarios estn determinados por factores que estn distribuidos en
la progenie. En cualquier individuo, estos factores, o genes como ahora se llam
an, estn presentes en los cromosomas (vase Cap. 62). Cada gen tiene mltiples formas
(esto es. alelos). Como los humanos son diploides. hay dos genes por cada par d
e cromosomas homlogos. En la meiosis. los cromosomas se separan al azar durante l
a formacin de los gametos (ovocito y espermatozoide) de modo que solo ur,o de cad
a par de
Figura 40-2. Modelo de las interacciones moleculares implicadas en el reconocimi
ento antignico.

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

929
Tabla 40-1

Sitios web sobre HLA y trasplante Direccin Informacin Sociedad Amencada para la Hi
stocompatibilidad e inmunogentica. tipificacin estndar del HLA Base de datos de la
secuencia HLA, herramientas para la presentacin de alelos y para la manipulacin de
secuencias Informacin de nomenclatura de la Organizacin Mundial de la Salud Talle
r Internacional de Histocompatibilidad Programa Nacional de Donantes de Mdula sea
Informacin para el Trasplante de Mdula sea Banco de Donantes de Mdula sea Asociacin M
ndial de Donantes de Mdula Registro Internacional de Trasplante de Medula sea Estu
dio Colaborador de Trasplante United Network lor Organ Sharing Instituto de Inve
stigacin Nacional del Genoma Humano
w w w swmed edu/horne_pages/ashi/ashi.htm w w w wbi.ac.uk/imgi/hla/ w w w anlhon
ynolan org uk/hig w w w ihwc org o ww ihwg.org w w w marrow.org www.bml.org wwwb
mdw.org w w w worldmarrow org www.ibmtr.org www.ctstransplant.org wwwunos.org w
w w nhgn.nih.gov
Gen El factor unitario de la herencia. Cromosoma Transportador de los factores u
nitarios de la herencia. Locus Posicin de un gen en un cromosoma. Alelo Forma alt
ernativa de un gen en un locus nico. Homocigoto Tener idnticos alelos en un locus,
uno en cada cromosoma. Heterocigoto Tener diferentes alelos en un locus. uno en
cada cromosoma. Codominancia Estado en el que el alelo de cada locus expresa su
efecto caracterstico igualmente en el heterocigoto. Genotipo Composicin gentica de
un organismo o individuo. Fenotipo Caractersticas observables producidas por los
genes. Polimrfico Tener dos o ms genotipos frecuentes distintos mantenidos en la
poblacin. Cromosomas homlogos Los dos miembros de un par de cromosomas que tienen
su correspondiente locus gnico, uno derivado de cada progenitor. Entrecruzamiento
Cambio de segmentos entre cromosomas homlogos. Este proceso tambin puede llamarse
recombinacin. Alo- (antgeno. injerto) Se refiere a diferencias antignicas entre in
dividuos de la misma especie. Auto- (antgeno, injerto) Se refiere a tejidos o ant
igenos del mismo individuo (es decir, propios).
decir, estudios de entrecruzamiento en familias) y por tcnicas de biologa molecula
r incluyendo la clonacin gnica. la secuenciacin de ADN y elecIroforesis en gel con
campo pulstil. La ltima tcnica detecta la presencia de genes en grandes fragmentos
simples de ADN El orden de mapeo de los genes en el MHC es HLA-A. -B. -C. -DR. DO. -DP. siendo el HLA-A distal al centrmero (Fig. 40-1).
Herencia
Los genes del MHC estn muy ligados, esto es, se segregan en bloque a la descenden
cia. El complejo de genes ligados que reside en uno del par de cromosomas homlogo
s y que se segrega en bloque a la descendencia se denomina "haplotipo". Cada ind
ividuo hereda dos haplotipos M H C (uno de cada progenitor) y por ello tiene dos
alelos para cada uno de los genes. Esos alelos se expresan codominantemente. La
herencia de los genes del M H C sigue las reglas de la segregacin definidas por
Mendel. En una familia, cada nio hereda un haplotipo del MHC de la madre y otro d
el padre. Por convencin, los haplotipos paternos se designan como a y y los haplo
tipos maternos como c y d. Por ello, hay cuatro genotipos posibles del MHC en el
descendiente: ac. ad. be y bd. Ya que la posibilidad de heredar un haplotipo de
terminado es aleatoria, la probabilidad de incidencia de cualquiera de los cuatr
o genotipos es una entre cuatro para cada emparejamiento. En una familia con cin
co hijos, al menos dos de los nios tendrn un HLA idntico (asumiendo que no hay entr

ecruzamiento). En la Figura 40-3 se da un ejemplo de emparejamiento y de los cua

tro posibles genotipos. Aunque los genes del M H C estn muy ligados, hay casos de
familias en las que se ha producido un entrecruzamiento (Fig. 40-4). Se pens en
la frecuencia de entrecruzamiento entre dos genes ligados como medida de la dist
ancia de separacin entre los genes; sin embargo, los datos moleculares han sugeri
do la existencia de puntos calientes de recombinacin en el ADN implicado que pued
e aumenlar o disminuir la probabilidad de recombinacin durante la meiosis (Uemats
u, 1988)
Composicin del MHC
El complejo de genes de histocompatibilidad mayor en humanos est localizado en el
brazo corto del cromosoma 6 (es decir, 6p2l). Abarca 3.600 kb (kilobases) e inc
luye 224 locus gnicos identificados, de los que 128 est previsto que se expresen.
Se estima que aproximadamente el 40% de los genes expresados tienen una funcin en
el sistema inmune (Aguado. 1999). L o s genes HLA del MHC estn localizados en se
is subregiones: HLA-A. HLA-C. HLA-B. HLA-DR. HLA-DOy HLA-DP (Fig. 40-1). Cada su
bregn codifica un mnimo de una glucoprotena de superficie celular. Con una nica excep
cin, los genes del HLA son altamente polimrficos. esto es, cada uno de los genes d
el HLA tiene mltiples alelos en la poblacin humana. De hecho, los genes del HLA so
n los locus ms polimrficos conocidos en el hombre (Parham, 1995; Tabla 40-1, www.a
nthonynolan.org/uk/hig). Debido a que los genes del HLA especifican molculas que
tienen un papel importante en la respuesta inmune, se cree que el polimorfismo e
s esencial para la supervivencia de las especies y para mantenerse en la poblacin
por la seleccin.
Desequilibrio de unin
La observacin de que alelos en diferentes locus genticos ocurren en la poblacin en
el mismo haplotipo significativamente ms frecuentemente de lo que cabria esperar
sobre la base de la posibilidad aislada se denomina desequilibrio de unin. La fre
cuencia esperada de que ocurran a la vez dos alelos (f 1. f2) es el producto de
la frecuencia gnica de cada alelo en dicha poblacin ([Lju, = f1 x f2]). La frecuenc
ia observada se determina por estudios familiares en la misma poblacin. El desequ
ilibrio de unin es una caraclersLocalizacin de los genes del MHC
Los genes del MHC fueron asignados al brazo corto del cromosoma 6 (6p) sobre la
base de estudios citogenticos de cromosomas aberrantes (esto es, cromosomas que h
an sufrido una traslocacin). El orden y la posicin de mapeo de los genes del MHC f
ue determinada por anlisis de unin meitica (es

930
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
tica del MHC humano y se extiende desde el HLA-A hasta el HLA-DQ. El ejemplo mej
or conocido de desequilibrio de unin es el haplotipo A1, Cw7. B8, DR17(3), DR52,
DQ2 en caucasianos que es observado aproximadamente cuatro veces ms frecuentement
e de lo esperado. El significado del desequilibrio de unin como aplicacin a la com
petencia inmune y a la enfermedad se discute posteriormente en el Captulo 41 en e
l apartado Haplotipos extendidos.
Variacin tnica
Los datos acumulados del estudio de los grupos de poblacin mundial (Dausset. 1973
; Imanishi, 1992; Cadavid, 1997; Bugawan. 1999) demuestran que las frecuencias d
e los alelos del HLA difieren significativamente entre los grupos de poblacin tnic
a. Los haplotipos del MHC y el desequilibrio de unin de los alelos tambin difieren
. Estas observaciones deben tenerse en cuenta cuando se desarrollan alotrasplant
es de clulas progenitoras hematopoyticas de registros y bancos de donantes no rela
cionados como en el Programa Nacional de Donantes de Mdula de los Estados Unidos
(NMDP) (Perkins. 1994). Tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos
dictan el nmero de voluntarios requeridos para encontrar un donante HLA-idntico n
o emparentado para cualquier paciente. Algunos pacientes (i.e., aquellos con tip
os raros o inusuales) no pueden encontrar donantes idnticos no emparentados de en
tre ms de 6 millones de voluntarios listados en todos los registros de donantes m
undiales (Beatty 1995; Mori, 1997). La mejora en los mtodos para el injerto de clu
las progenitoras de donantes parcialmente HLA-idnticos puede permitir el trasplan
te en pacientes para los que no se pueden encontrar combinaciones cercanas (vase
Cap. 33).
cacin de acontecimientos recombinacionales que separaban las dos series allicas. E
stas dos series allicas fueron llamadas la primera o LA (ahora HLA-A) y la segund
a, o cuatro series (ahora HLA-B). Estos nombres derivaban de la descripcin de las
series allicas LA 1, 2, 3 hecha por Payne en 1967 y de las series allicas 4a, 4b
de van Rood en 1969. Un tercer locus fue propuesto por primera vez en 1970; sin
embargo, no se confirm hasta 1975, cuando se identific una familia con recombinacin
entre el HLA-B y el nuevo locus. Este tercer locus fue designado HLA-C tras el
Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975. Dausset (1981) recibi el Pre
mio Nobel de Medicina en 1980 por su original trabajo sobre el sistema HLA human
o.
Estructura de las molculas de clase I
Las molculas clsicas de clase I, denominadas HLA-A, HLA-B y HLA-C en el hombre, so
n heterodmeros formados de un polipptido glicosilado transmembrana (cadena pesada,
44 kDa) asociado no covalentemente con la |3microglobulina (12 kDa) (Fig. 40-5)
(Bjorkman, 1990). La cadena pesada de la molcula de clase I se ancla a la membra
na celular y est orientada con sus aminos terminales en el exterior celular. La p
^microglobulina est asociada con la regin extracelular de la cadena pesada y es ne
cesaria para la expresin de la superficie celular.
;
MOLCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A, -B, -C
Las molculas HLA-A y -B fueron las primeras molculas del MHC descritas en humanos
(Dausset, 1981; van Rood, 1993). Y a que estas molculas fueron definidas por resp
uestas de anticuerpos frente a los glbulos blancos (WBCs), son denominadas "antgen
os" leucocitarios humanos. Los anticuerpos leucocitarios fueron observados en hu
manos m u y pronto, en los aos 20, pero no fue hasta los aos 50 cuando comenz el es

tudio sistemtico. En 1952, Dausset demostr convincentemente la existencia de los a

nticuerpos leucocitarios (leucoaglutininas). Y a que estas leucoaglutninas no rea
ccionan con los leucocitos del anticuerpo productor pero reaccionan con un porce
ntaje de leucocitos del grupo de O de los eritrocitos de individuos no emparenta
dos, sugiri que estas leucoaglutninas eran aloantjcuerpos. Poco despus, Payne (1964
) inform de que el suero de pacientes que tenan reacciones febriles no hemolticas a
la transfusin de sangre contenia frecuentemente leucoaglutninas que demostraban l
a aloespecificidad. En 1958, Dausset describi el primer aloantgeno HLA "MAC* (ahor
a HLA-A2+HLA-28) y mostr que estaba genticamente determinado. Originalmente, se pe
ns que las especificidades de leucocito eran producto de un locus simple. Se esta
bleci un modelo de dos locus, cada locus con mltiples alelos, a travs de los estudi
os HLA en familias mediante la identifiFigura 40-5. Modelo esquemtico de la estru
ctura de las molculas de clase I y clase II.

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

931
Tabla 40-2
Ejemplos d e antigenos H L A r e c o n o c i d o s por la O M S (especificidades
) definidos por tipificacin serolglca y alelos HLA definidos por secuenciacin d e A
D N ' '
A n t g e n o s HLA-DQ Alelos' HLA-A A0101-0I04N A 02011-0230 A 03011-0304 A1101
-1105 A2301 A2402101-2420 A2501-2502 A2601-2612 A 2901-2904 A 3001-3007 A 310123104 A3201-3203 A3301-3304 A3401-3402 A3601 A4301 AGG01--6603 A68011-'6809 A6901
A7401-7403 A 8001 Alelos* HLA-DQ A1 DOA1 0101-0105 Alelos HLA-DBQI DOB 10501-05
04 DOB 1 06011-0615 DQB1 0201-0203 DOB 1 03011-0309 DOB 1'0401-0402
A n t g e n o s HLA-A
A1 A2 A203' A2I0 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9)' A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(
19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(I0) AG8(?8) A69(28) A74(
19) A80
DOI DQ2 DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(I) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(3)
DOA 10201
DOAI03011-0303 DQA 10401 DQA1 05011 - 0505 DOAI06011-06012
1
Adoptado de w w w anlhonynolan org uk/HIG con permiso de SGE Marsh Cada columna
de la tabla es independiente. Lsatelos HLA-A especilican los antgenos HLA-A. El an
tigeno A1 se especilica por lsatelos A'0101 o AVI 02 o A 0103. El AOfONesun alelo
nulo o no expresado Los alelos HLA-DQ) y HLA-DOBl especifican los antigenos HLADQ. El antigeno D05 (I) es especilicado por mltiples combinaciones diferentes del
DOAI y el DOB1 incluyendo (1) los alelos DOA1V101 y DAB1V501 y (2) DOAV0101 y D
OB10502 En el pasado las designaciones de la divisin seroigica eran dadas a especi
ficidades que parecan identificar el antigeno especificado por un alelo HLA simpl
e (p ej. A2 se divide en A203. A210. B7 se divide en B703: B39 se divide en B390
1 y B3902) Ahora se ha reconocido que otros telos pueden tambin codificar anli gen
os que llevan estas especificidades serctgicas y Comit de Nomenclatura de la OMS h
a recomendado que se desechen estas divisiones Los nmeros entre parntesis indican
la viea especificidad seroigica El tipo seroiogico puede listarse sin la vieja esp
ecificidad Por ejemplo, tanto A23(9) como A23 son designaciones correctas
!
Las cadenas pesadas del HLA estn codificadas en el MHC en el cromosoma 6 (Fig. 40
-1) (Shiina, 1999) y son altamente polimrficas. mientras que la IVmicroglobulina
est codificada en el cromosoma 15 y no se conoce que sea polimrfica en humanos. El
gen tpico de clase I est codificado por ocho Nuevas perspectivas en la estructura
de la molcula del HLA llegan cuando exones que corresponden a los segmentos de l
a molcula recin descrita se define la estructura tridimensional de la molcula de cl
ase I utilizando crista(Fig. 40-7). El primer exn codifica la regin 5 no traducida
y el pptido hidrolografa con rayos x (Bjorkman. 1987). La estructura de la porcin
extracelular se fbico lder. Los exones 2 a 4 codifican los tres dominios extracelu
lares: el muestra en la Figura 40-6A La molcula est formada por dos pares de domie
xn 5 codifica la regin transmembrana. Los exones sexto y sptimo codifinios estructu
ralmente similares: el u, tienen la misma conformacin terciaria que can la regin c

itoplasmlica y el exn octavo codifica la regin 3' no traduciel it, mientras que el u
- y la |5,-microglobulina lienen similares conformaciones da incluyendo el lugar
de adicin poly(A). Las secuencias intermedias (llamaterciarias. Los dominios a,
y [5,-microglobulina estn formados cada uno por dos hojas 3 plegadas antiparalela
s. una con cuatro cadenas y otra con tres cadenas, das mtrones) entre los exones
son transcritas a cido ribonucleico (ARN) pero son eliminadas durante el corte y
empalme del mensajero (ARNm). conectadas por un puente disulfuro. Los dominios
(t, y ix interaocionan uno con
La regin extracelular de la cadena pesada de clase I est dividida en tres dominios
llamados (/.,, u y a , teniendo cada uno alrededor de 90 residuos de aminocidos.
El dominio a, aminoterminal contiene un lugar de glicosilacin en el residuo aspar
ragina en la posicin 86. El segmento transmembrana (TM) de aproximadamente 24 ami
nocidos es el ms hidrofbico. mientras que el segmento intracelular carboxiterminal
de la molcula est formado principalmente por residuos hidrofilicos con un grupo de
residuos bsicos adyacentes a la superficie citoplsmica (CY) de la membrana celula
r. El polimorfismo de las molculas de clase I (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997. 1999) s
e define por el empleo de (1) anticuerpos especficos de clase I (anticuerpos aloa
ntisuero y monoclonales) que se unen a las molculas del HLA: (2) lnfocitos T citotxc
os (LTCs) que reconocen y destruyen en respuesta a la estimulacin in vitro por mo
lculas de clase I extraas o alogenicas; (3) imagen isoelctrica de las molculas de cl
ase I aisladas: (4) reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la tipific
acin del ADN de los alelos de clase I; y (5) secuenciacin de los nucletidos de los
alelos de clase I. La mayor parte del polimorfismo de la clase I proviene de las
diferencias en las secuencias de aminocidos encontradas en los dominios ot, y ce
, de la cadena pesada. El dominio (,es altamente conservado entre las molculas HLA
de clase I.
3
otro a travs de estas hojas plegadas (i y su estructura simula mucho la desenta p
ara el dominio de la regin constante de la inmunoglobulina. Los dominios a, y a es
tn unidos para formar hoja plegada |5 de 8 cadenas. Esta hoja se detiene por dos
hlices c t formando una ranura en la parte alta de la molcula. Esta ranura es el s
ito para la unin de los fragmentos peptidicos antignicos por la molcula de clase I
(Fig. 40-6S). Los lados y el fondo de la ranura estn formados por cadenas lateral
es de aminocidos que componen las hlices y las hojas plegadas |i Muchos de los ami
nocidos que alinean esta ranura son polimrficos. creando diferencias alelo-especfic
as en la especificidad de unin al antgeno entre los diferentes productos allicos de
clase I (Stern, 1994). Otros residuos en las regiones helicoidales de la ranura
interaccionan con el receptor de clulas T durante el reconocimiento del complejo
clase l-fragmento antignico por el linfocito T (vase Fig. 40-2).
Organizacin de los genes de clase I

932
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Figura 40-6. A. Modelo tridimensional de la porcin extracelular de l a molcula de
clase I. B. Vista superior de la m i s m a molcula mostrando la ranura de unin al
pptido (De Bjorkman PJ, Saper M.A, SamraouiB, el al: Structure of the human Class
I histocompatibility antigen, H L A A2. Nature 1987; 329:506. con permiso.)
antignicos en los linlocilos T (vase Cap. 36). La presentacin del antgeno por las mo
lculas de clase I permite a las clulas T detectar y crear una Las molculas HLA de c
lase I son expresadas como glucoprotenas transrespuesta citotxica contra el materi
al extrao (p. ej., un virus o protenas membrana en la superficie de muchos tipos c
elulares. Sin embrago, el nivel de anormales de clulas malignas). En el citosol.
los antigenos mtracelulares expresin de superficie puede variar importantemente (
Singer, 1990). El nivel (incluyendo las protenas propias y las protenas virales o
anormales) son basal de molculas de clase I es mayor en las clulas linfoides; las
molculas degradados en fragmentos peptidicos (Rock, 1999). Los fragmentos peptdide
clase I son indetectables en la membrana de otros tipos celulares como las cos
son transportados al retculo endoplasmtico donde se unen a la ranura clulas del cer
ebro, las clulas musculares y los espermatozoides. La secuende la parle alta de l
as recientemente sintetizadas molculas de clase I y cia de elementos localizados
por encima de los genes de clase I se unen a facentonces son transportadas a la
superficie celular (Pamer. 1998; T.H.Hansen, tores reguladores que controlan la
expresin en la superficie celular de las 1997) (Fig. 40-2). Cuatro genes, localiz
ados en la regin de clase II del MHC molculas de clase I. Durante una respuesta in
mune, la expresin en la super(Figs. 40-1 y 40-8), estn implicados en este proceso.
Dos de estos genes ficie celular de los genes de clase I puede ser regulada al
alza por las citocinas (LMP2 y LMP7) codifican componentes del complejo del prot
eosoma. una (p. ej., el interfern-Y y el TNF) unindose a los elementos reguladores
supeestructura macromolecular que degrada las protenas en el cilosol (Tanaka, ri
ores. Los tumores y ciertos virus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana
1997). Los otros dos genes {TAP1 y TAP2) codifican componentes de los [VIH]) pue
den suprimir la expresin de clase I (Brodsky, 1999). transportadores peptidicos q
ue mueven los pptidos del citosol al retculo endoplasmtico (Momburg, 1998).
Regulacin de la expresin de los genes de clase I
Funcin de las molculas de clase I
Las molculas HLA-A, -B y -C juegan papeles clave en la respuesta inmune. Primero,
en la respuesta inmune adaptaliva, las molculas de clase I se unen a pptidos deri
vados de protenas sintetizadas en el citosol y las presenta en la superficie celu
lar para que sean reconocidas por los receptores
Los LTC CD8+ reconocen el pptido procesado en conjunto con la molcula de clase I (
Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para determinar este mecan
ismo, los LTCs fueron generados por la estimulacin in vitro con clulas autlogas inf
ectadas con virus. El reconocimiento y la lisis de la clula diana fue especfica pa
ra cada cepa de virus preparada. El recono-

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

933
Figura 40-8. M a p a de la regin de clase II del MHC humano. Los producios gnicos
codificados por cada regin se nombran debajo No estn incluidos lodos los genes.
HLA-G. El HLA-G se expresa principalmente en las clulas extravellositarias del ci
totrofoblasto en la inlertase feto-materna, donde se cree que |uega un papel en
la tolerancia matemofetal (Le Bouteiller. 1999). El HLA-G. como ligando para al
menos tres N K y otros receptores de inhibicin celular, protege el tejido placent
ano de la accin citolitica de las clulas NK. Aunque el HLA-G tiene la capacidad de
unirse y presentar el antgeno procesado (es decir, pptidos) a las clulas T, la div
ersidad de pptidos unidos parece ser menor que la diversidad de pptidos unidos por
las molculas de clase I clsica. La reguHay dos grupos de receptores de NK: (1) el
receptor tipo C lectina CD94/NKG2 lacin de la expresin del HLA-G tambin difiere de
la de los genes de clase I cuyos genes residen en el cromosoma 12. y (2) los re
ceptores de clula aseclasicos, ya que el gen no contiene una seal de respuesta al
interiern; por sina similares a inmunoglobulinas (KIR) codificados por genes del
cromosoma ello, no es interiern mducible. Finalmente, las transcripciones del HLA
-G son 19. La funcin de las clulas N K parece ser regulada por un equilibrio entre
los unidas alternativamente originando al menos cuatro isoformas de unin a la re
ceptores de seal positivos que inician y los receptores inhibidores que membrana
y dos isoformas solubles de HLA-G. Se ha hipotetizado que las forsuprimen la act
ivacin celular. Ambos grupos de receptores reconocen los mas solubles pueden actu
ar como inmunosupresores especficos durante el ligandos HLA de clase I. Por ejemp
lo, los receptores KIR2D diferencian entre embarazo (Le Bouteiller, 1999). los l
igandos del HLA-C basndose en la presencia de residuos de aminocidos especficos en
los codones 77 y 80 (i.e.. asn77lys80 frente a ser77asn80). HLA-E. El HLA-E pued
e jugar un papel en la proteccin de la clula diana Otro receptor de NK. el KIR3D.
reconoce el polimorfismo del HLA-Bw4/Bw6 de la lisis mediada por la clula NK. Las
molculas de HLA-E se unen a un (Fig. 40-9). Un lercer receptor NK. el CD94/NKG2.
reconoce la molcula de grupo de pptidos hidrolbicos bastante idnticos derivados de
las secuencias HLA-E en complejo con el pptido lder HLA de algunos de los producto
s allider de las cadenas pesadas de la clase I clsica y del HLA-G. El HLA-E prelie
os de las molculas del HLA-A, -B. -C y -G (Brooks 1999). Las clulas N K pueden rec
onocer especficamente y lisar clulas alognicas que no expresan las molculas especfica
s de clase I expresadas por la clula efeclora (i.e.. "prdida de lo propio") (Valant
e, 1997). Esto puede ocurrir potencialmente incluso en pares de trasplantes apar
entemente HLA idnticos donde un miembro de la pareja es homocigotico y el otro es
heterocigtico (p. ej., donante: Bw4, Bw6: receptor: Bw6). Por ello las clulas N K
B w 4 especficas del donante pueden lisar las clulas sin B w 4 del receptor en un
injerto de progenitor celular hematopoytico. Esta respuesta puede ser unidireccio
nal en algunas situaciones. En el ejemplo, el donante no pierde ninguna molcula H
LA presente en el receptor, por ello, las clulas N K del receptor no detectan nin
guna prdida de lo propio. Y a que las clulas N K son relativamente radiorresistent
es y comprenden una subpoblacin de alrededor del 10% al 15% de los lintocitos de
sangre perifrica, la respuesta N K puede ser sustancial: sin embargo, no se conoc
e hasta el momento el papel absoluto de la actividad N K en la alectacin al trasp
lante (Ruggeri, 1999).
cimiento tambin estaba afectado por el polimorfismo allico de las molculas de clase
I. ya que slo las clulas diana infectadas viralmente que compartan el producto(s)
allico de clase I apropiado con el que responda fueron U s a d a s (Zmkemagel. 199
7a. 1997b). El ltimo requerimiento se denomina "restriccin MHC". Znkernagel y su c
olaborador Doherty recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1996 en reconocimie

nto a la importancia del concepto de la restriccin MHC en la inmunologa. Segundo,

la molcula de clase I tiene una funcin protectora en la respuesta inmune innata pr
eviniendo la lisis de la clula diana efectuada por las clulas asesinas naturales (
NK). A diferencia de los LTC. las clulas N K no requieren la activacin a travs del
reconocimiento de pptidos unidos a la molcula de clase I sino que pueden lisar y d
estruir las clulas diana que han perdido la expresin de la molcula del HLA clase I
clsica en la superficie celular. A travs de este mecanismo innato, las clulas N K j
uegan un importante papel en la supervivencia frente a los virus y a las clulas t
umorales quo regulan a la baja la expresin de la molcula de clase I para evitar el
reconocimiento por los LTC (Lainer. 1998: Long, 1999).
taliva como en la innata (O Callaghan. 1998) Sus genes son homlogos a los genes d
e la clase I clsica en estructura y los polipplidos codificados por estos locus ta
mbin se asocian con la |i,-microglobulina. Sin embargo, al igual que un nivel alt
o de polimorfismo allico es un marcador de los locus del HLAA, HLA-B y HLA-C, un
nivel ba|o de polimorfismo del locus del HLA-E. HLA-F y HLA-G es una caracterstic
a definitoria de estos genes. Adems, en comparacin con las molculas de clase I clsic
as, la expresin en la superficie celular de molculas de clase I no clsicas es baja
y la distribucin de estas molculas de clase Ib en los tipos celulares especilicos
varia.
A2 + B17
A2 - A69
Otros genes de clase I
Al menos se han identificado 20 genes adicionales no clsicos o de clase Ib en la
regin de clase I del cromosoma 6p por clonacin de genes (Aguado. 1999) Muchos de e
stos son seudogenes; sin embargo, muchos codifican y expresan ARNm de tipo clase
I y/o molculas. HLA-E. HLA-F y HLA-G. Estas molculas pueden ser mediadores clave
tanto en la respues'a inmune adapFigura 40-9. Vista superior de la molcula de cla
se I con sus residuos aminocidos polimrticos indicados por las especificidades B w
4yB w 6 y las especificidades d e reactividad cruzada A2 * A28 A2 - A69, y A2 +
B17. (Modificado de Parham P. y col: HLA-A. B. C: Patterns of polymorphism m pe
plide-bindmg. proteins. En D u p o n t B [ed]: Immunobiology of HLA. Vol 1 N e w
York. Springer-Verag. 1989, pg. 17. con permiso.)

934
SecciN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
senta estos pptidos de unin a la superficie celular para el reconocimiento por las
clulas NK. proporcionando un chequeo para la integridad de la va de presentacin an
tgnica (Lee, 1998a, 1998b; O'Callaghan, 1998). Los injertos cutneos en modelos de r
atones transgnicos sugieren que el HLA-E puede ser reconocido como un antgeno de t
rasplante (Pacasova. 1999). HLA-F. El papel del HLA-F es desconocido. Los modelo
s por ordenador predicen que ciertos residuos de aminocidos del HLA-F pueden cont
ribuir a una unin del pptido putativo en la hendidura, lo que indica un papel en l
a presentacin antignica del HLA-F (O'Callaghan, 1998). La expresin del HLA-F en la
superficie celular no ha sido detectada en reproducciones.
MOLCULAS DE CLASE il: SUBREGIONES HLA-DR, -DQ, -DP
Las molculas de clase II en humanos fueron reconocidas por primera vez por su cap
acidad para estimular a las clulas T alognicas en los cultivos mixtos de leucocito
s (CfvlL). Durante el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975, los C
ML fueron empleados para definir las series allicas del HLA-D (Thorsby, 1975). Ya
que los cullivos mixtos de leucocitos requieren siete das antes de que se puedan
obtener los resultados, se busc una deteccin serolgica rpida del HLA-D. En 1975, se
determin que el aloantisuero contena anticuerpos reactivos con las molculas muy as
ociadas con las especificidades previamente identificadas como HLA-D por tcnicas
celulares (Dausset, 1981). Tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad d
e 1977, estas especificidades serolgicas fueron denominadas DR, de especificidade
s D relacionadas, ya que se observ que el HLA-D y el HLA-DR estaban asociados per
o no eran idnticos el uno al otro. Los test serolgicos desarrollados con estudios
genticos e inmunoquimicos identificaron molculas adicionales de clase II. el DR52,
el DR53, el DR51 y el DQ. Las tcnicas celulares identificaron an otra molcula de c
lase II a finales de los aos 70 (Shaw, 1981). Esta molcula (ahora llamada HLA-DP)
fue descrita inicialmente como un antgeno secundario de la clula B (SB) ya que nor
malmente era muy baja o indetectable en CML primarios y requera una segunda fase
de estimulacin en el cultivo para la deteccin. Posteriormente, se sigui con la cara
cterizacin de las secuencias codificantes del ADN y las localizaciones de estos g
enes en el MHC empleando tcnicas de biologa molecular (Beck, 1999).
alta. Al igual que en las de clase I, muchos de las aminocidos que alinean la ran
ura de unin al pptido antignico son polimrficos, creando diferentes especificidades
de unin al pptido para los diferentes productos allicos de clase II. Al igual que l
as molculas de clase I, las molculas de clase II son altamente polimrficas (Tabla 4
0-2) (Bodmer, 1997, 1999). El polimorfismo de clase II est definido por 1) anticu
erpos especificos de clase II (anticuerpos aloantisuero y monoclonales), que se
unen a las molculas de clase II; 2) clulas T aloproliferativas que reconocen y pro
liferan in vitro en respuesta a molculas extraas de clase II; 3) electroforesis en
gel bidimensional de molculas de clase II aisladas; 4) hibridacin por endonucleas
a que difiere el ADN codificante de los genes de clase II empleando sondas espec
ificas de locus (una tcnica que detecta el polimorfismo ligado a los fragmentos d
e restriccin [RFLPIJ; 5) tipificacin del ADN basada en PCR de los alelos d e clase
II: y 6) secuenciacin de nucletidos de los genes de clase II. La mayor parte del
polimorfismo de clase II deriva de las diferentes secuencias de aminocidos locali
zados en los dominios a, y p, de las dos cadenas polipeptdicas.
Organizacin de los genes de clase II
En contraste con las molculas de clase I, tanto la cadena u c o m o la P de las m
olculas de clase II estn codificadas en una seccin de 1100-kb de la regin MHC (Figs.
40-1 y 40-8) (Beck, 1999). La regin de clase II incluye tres subregiones -DR, DQ

y DP- cada una de las cuales codifica al menos un gen expresado A (codificando
una cadena ) y uno B (codificando una cadena [}). Las comparaciones de secuencias
sugieren que ambos genes de clase I y de clase II surgen de sucesivas seres de d
uplicaciones gnicas durante la evolucin de este complejo gnico. La duplicacin origin
al en la regin de clase II origina con mayor probabilidad los genes A y B primord
iales. Duplicaciones gnicas ms recientes generan las subregiones DR. DQ. y DP que
contienen mltiples genes. Un gen A tpico contiene cinco exones codificando: 1) la
regin 5' aminoterminal no traducida y la secuencia lder; 2) el dominio a,; 3) el d
ominio tt 4) el pptido de conexin, la regin transmembrana, el residuo citoplasmtico,
y una porcin de la regin 3' no traducida; y 5) el resto de la regin 3' no traducida
incluyendo la seal de adicin poly(A). Un gen tpico de cadena | 3 es similar al gen
de la cadena a pero tiene un exn extra para el residuo citoplasmtico. Subregin DR
La subregin DR codifica una o dos molculas DR. dependiendo del haplotipo (Bodmer.
1997. 1999). La subregin contiene un gen simple expresado DRA que es similar en d
iferentes haplotipos difiriendo solo en la sustitucin de un aminocido simple conse
rvativo en el dominio citoplasmtico. El gen ms centromrico DRB, DRB1 (Fig. 40-8), c
odifica una cadena p altamente polimrfica que, cuando se asocia con la cadena a,
exhibe especificidades serolgicas desde DR1 a DR18 (Tabla 40-3). Esta molcula es l
a molcula de clase II predominante en la superficie celular, constituyendo al men
os ms de la mitad de la superficie celular total de las molculas de clase II. Hay
mltiples cidos nucleicos y, por ello, diferencias en la secuencia de aminocidos ent
re los alelos DRB1. El segundo gen expresado DRB, presente solo en algunos haplo
tipos de clase II, est localizado entre el locus DRB1 y el locus DRA (Fig. 40-8).
En
Estructura de las molculas de clase II
Las molculas de clase II HLA-DR. -DQ y -DP son heterodmeros formados por dos glico
protenas transmembrana no asociadas covalentemente, la cadena a (33 a 35 kDa) y l
a cadena |i (26 a 28 kDa) (Fig. 40-5) (Gorga. 1992). Ambas cadenas polipeptdicas
atraviesan la membrana celular y estn orientadas con sus amino-terminales hacia e
l exterior celular. Las regiones extracelulares de los polipptidos u y | 3 estn di
vididas cada una en dos dominios, denominados a, y a y P, y P , y cada dominio co
ntiene aproximadamente 90 residuos aminocidos. La cadena a tiene dos grupos carbo
hidrato, uno rico en maosa y un complejo tipo glicano, en los aminocidos 78 y 118,
respectivamente. Las cadenas p tienen un complejo tipo oligosacrido en el aminoci
do 19. Los dominios amino-terminales (/., y p, de las cadenas a y p contienen lo
s residuos polimrficos, mientras que los dominios de membrana proximales a y p son
altamente conservados y son homlogos a los dominios de la regin constante de la i
nmunoglobulina. Una regin de aproximadamente 12 aminocidos de tamao conecta el segu
ndo dominio extracelular a la regin hidrofbica transmembrana (23 aminocidos) y al p
equeo dominio intracitoplasmtico (8 a 15 aminocidos).
2 2
Basndose en la cristalografa, la molcula de clase II es similar en estructura a la
molcula de clase I (Brown. 1993) (Fig. 40-6). En la molcula de clase II, los domin
ios a, y p, de las cadenas a y p forman una cadena |5 plegada de ocho filamentos
unida a dos hlices u para formar la ranura de unin al antgeno en la parte alta de
la molcula. Los dominios a ? y p forman cada uno dos cadenas p plegadas antiparal
elas que soportan la ranura en la parte
?

CAPTULO 40

ANTGENO IEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..

935
Desequilibrio de unin de los genes de la regin de clase II
Las combinaciones especficas de los alelos DRB1/DRB3, DRB1/DRB4. DRB1/DRB5y DOA1/
DQB1 son frecuentes. Las combinaciones encontradas del DQA1/DQB1 pueden controla
rse en parte por la capacidad de las cadenas a y |i de aparearse (Kwok. 1993). A
dems, ciertos alelos DR y DQ son heredados conjuntamente ms frecuentemente de lo e
sperado, originando un desequilibrio de unin en la poblacin. La frecuencia de esta
s combinaciones difiere importantemente entre los diferentes grupos tnicos de la
poblacin. Por ejemplo, tanto los haplotipos DRBVttOI. DOBV0501 (DR11 [5]), DQ5[1ye
l DRB V0901. DOBT0303 (DR9, DQ9 [3)) se encuentran frecuentemente en las poblaci
ones de descendientes africanos directos; mientras tanto, estas combinaciones DR
-DQ se encuentran raramente en poblaciones descendientes de caucsicos. El entrecr
uzamiento entre locus DP y locus DR'DO es frecuente. Por ello, hay un mnimo deseq
uilibrio de unin entre los alelos DR/DO y los DP. Se han publicado las listas de
los haplotipos DRB1/DOA1DOB1 frecuentes (Begovich. 1992: Imanishi, 1992)
Regulacin de la expresin de los genes de clase II
Las molculas de clase II, HLA-DR, -DQ y -DP, se expresan constilutivamente en las
clulas presentadoras de antgenos (APCs) del sistema inmune incluyendo los monocit
os, los macrfagos, las clulas dendrilicas y los linlocitos B. Las secuencias de AD
N encontradas por encima de las secuencias codificantes de los genes de clase II
son criticas para la expresin. La unin de las protenas a estas regiones regula la
expresin de los genes de clase II. Las alteraciones en la capacidad de las protena
s de unin al ADN de interaccionar con las secuencias de ADN 5' reguladoras que el
iminan la expresin de los genes de clase II lleva a una inmunodeliciencia denomin
ada "sndrome del linlocito desnudo" (Kovats. 1994: Mach, 1996). Los genes de clas
e II son inducibles por el interfern-y (IFN-y) en muchos tipos de clulas (Mach, 19
96; Glimcher, 1992) y la expresin puede afectarse por otras citocinas (vase Cap. 3
9) (Guardiola, 1993). La expresin de molculas de clase II en las APCs puede modula
rse, particularmente en las clulas dendrticas, tras el depsito antignico y la inflam
acin. El nivel de expresin del complejo antgeno peptdico-clase II asi como la presen
cia de una seal coestimuladora en las APC maduras puede tener un importante papel
en el trasplante y en las enfermedades autoinmunes (Nepom, 1991: Banchereau. 19
98) (vase Cap. 41).
Figura 40-10. Modelo de las asociaciones as y trans de las cadenas DQu. y DQp\
las clulas que expresan los alelos DR. DRBV03. '11, '12. '13. '14. el segundo gen
DRB se denomina DRB3 (la nomenclalura HLA se describe a continuacin). El gen DRB
3 es polimrfico, aunque hasta el momento el nmero de alelos identificados es aprox
imadamente 10 veces menor que el nmero de alelos DRB1. El producto del DRB3 se co
mbina con el producto DRA para formar la molcula DR, que transporta la especifici
dad serolgica del DR52 (Tabla 40-3). En las clulas que expresan los alelos DRB1 4,
7 y '09. el segundo gen DRB se denomina DRB4. El producto DRB4 combinado con el
producto DRA forma la molcula que trasporta la especificidad serolgica del Df?53 (
Tabla 40-3). Finalmente, en las clulas que expresan los alelos DRBV15 y '16. el s
egundo gen DRB es denominado DRB5. Este producto DRB5 combinado con el producto
DRA transporta la especificidad serolgica del DR51 (Tabla 40-3). Los haplotipos q
ue expresan los alelos DRBV01. '08 o '10 normalmente no transportan un segundo l
ocus del DRB expresado. Hay excepciones a estas asociaciones. Por ejemplo, se ha
descrito un haplotipo que transporta DRBT15 sin un locus DRB5 (Wade. 1993). Sub
regin DO. U n grupo de genes A y B. DOA1 y DQB1. codifican el heterodmero DO que t
ransporta la especificidad serolgica DQ1-9 (Tablas 40-2 y 40-3 y Fig. 40-3) (Bodm

er, 1997, 1999). Las molculas DO representan aproximadamente del 15% al 20% del t
otal de molculas de clase II expresadas en la superficie celular. Los locus del D
OAJ y del DQB1 son polimrficos y debido a que sus productos proteicos pueden asoc
iarse tanto en trans como en cis. los heterocigotos pues expresar potencialmente
cuatro molculas DQ diferentes en sus superficies celulares (Fig. 40-10). Oros gen
es A y B tipo DQ en la subregin DQ como el DQA2 y el DQB2 son muy similares a los
genes DQA1y DQB1; sin embargo, no expresan ninguna protena funcional. Subregin DP
. La subregin DP contiene dos grupos de genes A y B (Tabla 40-3 y Fig. 40-8). Un
grupo, el DPA1 y el DPB1. codifica el producto proteico DP; el otro grupo est con
stituido por seudogenes. Tanto el gen OPA i como el DPB1 son altamente polimrfico
s (Bodmer, 1997,1999). El nivel de expresin del DP en la superficie celular es mu
y pequeo.
Funcin de las molculas de clase II
Las molculas de clase II actan como receptores antignicos en la respuesta inmune (F
ig. 40-2), unindose a fragmentos peptidicos antignicos procesados de antgenos exgeno
s como las bacterias. Los antgenos exgenos entran en la clulas a travs de la va de en
docitosis y son degradados en fragmentos peptidicos en los ltimos endosomas donde
se encuentran y se unen a las nuevas molculas de clase II ensambladas (Watts, 19
97). La unin de los fragmentos proteicos procesados a las molculas de clase II se
facilita por dos protenas codificadas en la regin de clase II del MHC. la DM y la
DO (Fig. 40-8). El pptido de unin est afectado por residuos polimrficos localizados
en la ranura de la molcula de clase II. El complejo del fragmento antignico unido
a la molcula de clase II es transportado entonces a la superficie celular para su
presentacin y reconocimiento por las clulas T circulantes. Los receptores antignic
os de los linfocitos T CD4+ interaccionan con el complejo clase ll-fragmento ant
ignico disparando la activacin de la clulas (Jorgensen, 1992). En el sistema experi
mental empleado para dilucidar este mecanismo, los linlocitos T electores fueron
estimulados in vitro con APCs autlogas previamente incubadas con el antgeno. Como
se observ para la clase I, el reconocimiento del fragmento antignico por las clula
s T electoras est influenciado por el polimorfismo allico del MHC. La clula T efect
ora es especifica para el pptido antignico promotor en conjuncin con el producto all
ico particular de clase II que originalmente present el antigeno (restriccin MHC)
(Rosenthal. 1973).

936
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Cada clula T activada por el reconocimiento del complejo del fragmento antignico u
nido a la molcula de clase II puede desenpear una o varias funciones (Paul, 1994),
La clula T CD4+ puede ayudar a los linfocitos B a diferenciarse a clulas plasmtica
s productoras de anticuerpo, o puede ayudar a otros linfocitos T a diferenciarse
a clulas citotxicas o clulas con funcin supresora. Adems, la clula T puede por s mi
funcionar como clula citotxica, matando directamente clulas con la diana apropiada
(p.ej.. clulas que expresan complejos de molculas de MHC de clase II con el antgen
o especfico), o como clula con funcin supresora, originando un debilitamiento de la
respuesta inmune. Las clulas T tambin producen un nmero de molculas biolgicamente im
portantes (como el IFN-yj que aumentan la respuesta inmune e incrementan la expr
esin de molculas de MHC en las clulas diana. Adems, las clulas T producen factores de
crecimiento como la interleucina-2 (IL2). Estos factores de crecimiento afectan
a un amplio rango de clulas de las clulas progenitoras hematopoyticas para madurar
a linfocitos.
motivo peptdico se unen a la molcula de MHC en los bolsillos que se encuentran en
la ranura de unin al antgeno (Stern. 1994). Los aminocidos polimrficos de las molcula
s de MHC rodean esta ranura y crean asi diferencias en las especificidades de un
in a los pptidos para las diferentes molculas del MHC. Los pptidos unidos a las molcu
las de clase I tienen una longitud de 9 a 10 aminocidos. Tanto los extremos carbo
xi- como aminoterminal del pptidos son atrapados en la ranura de unin de clase I f
ormando un complejo pptido-MHC "cerrado". Los pptidos unidos a las molculas de clas
e II varan en longitud de 12 a 30 aminocidos. A la vez que mantienen requerimiento
para los residuos especficos que se encuentran la porcin central del pptido. tanto
los extremos carboxi- como amino-terminal del pptido se extienden fuera de la ra
nura de unin de clase II formando un complejo pptidoMHC "abierto" (Stern, 1994).
Otros genes de clase II
Al menos han sido descritos otros cuatro genes de clase II, DOA. DOB. DMA y DMB.
que expresan sus productos proteicos (Fig. 40-8). Las protenas codificadas por l
os genes DMA y DMB forman el heterodmero DM. Las protenas codificada por los genes
DOA y DOB forman el heterodmero DO. Estos productos gnicos no son detectados en l
a superficie celular pero son expresados posteriormente dentro de la clula, local
izados en compartimentos intracelulares especializados donde las nuevas molculas
de clase II sintetizadas (DR. DO, DP) se unen con sus pptidos antignicos. La molcul
a DM regula la unin al pptido del HLA-DR. -DQ. -DP, teniendo una luncin de tipo aco
mpaante o corrector (Morris, 1994) que favorece la presentacin de los pptidos estab
les unidos. La molcula DO regula negativamente la funcin del DM (van Ham, 1997).
RECONOCIMIENTO DE LAS MOLCULAS MHC EXTRAAS
El alo-reconocimiento implica el reconocimiento por un linfocito T de una molcula
de MHC extraa en una clula por un segundo individuo (alognico). Una vez reconocido
, la interaccin dispara una serie de acontecimientos originando la activacin de la
clulas T y la iniciacin de una respuesta inmune no m u y diferente al reconocimie
nto de los patgenos (vase Cap. 36). Basndose en los datos de los modelos de traspla
nte de rganos vascularizados, se han propuesto dos vas de alo-reconocimiento (Saye
gh. 1996). L a va directa para el alo-reconocimiento implica la estimulacin de las
clulas T receptoras por un complejo MHC-pptido del donante (es decir, reconocimie
nto directo de las molculas MHC extraas intactas). La segunda ruta de alo-reconoci
miento, la va indirecta, implica la estimulacin de las clulas T receptoras por las
molculas de MHC propias a travs de la presentacin de los fragmentos peptdicos de las
clulas donante. La presentacin indirecta ocurre cuando las clulas presentadoras de

antigenos del receptor ingieren material celular del tejido injertado, degradan
el material intracelularmente. y presentan el pptido(s) alognico en complejo con
las molculas de MHC propias. Los pptidos derivados de las regiones polimrficas de l
as molculas MHC del donante son los principales candidatos para la estimulacin de
la respuesta inmune indirecta (Suciu-Foca. 1998; Gould, 1999; Harris, 1999).
CARACTERSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGNICOS UNIDOS POR LAS MOLCULAS MHC DE CLASE I
Y CLASE II
L a funcin de las molculas de clase I y clase II como receptores de unin a antigeno
s es similar; sin embargo, los pptidos que unen tienen diferentes caracteristicas
(Cresswell, 1994; Engelhard. 1994). Los pptidos derivados de las protenas sinteti
zadas de novo en la clula (antigenos endgenos como los antgenos virales), se asocia
n con las molculas de clase I en el retculo endoplasmtico. En contraste, los pptidos
de los antgenos solubles y particulados captados por la clula por la va de la endo
citosis (antigenos exgenos) se unen con las molculas de clase II en el compartimen
to endosomal. Tanto las molculas de clase I como las de clase II pueden unirse al
ternativamente a pptidos propios encontrados en estos compartimentos. Los pptidos
surgen de la degradacin normal de las protenas celulares. Algunos de estos pptidos
propios son fragmentos de las propias molculas de histocompatibilidad. Normalment
e, los pptidos propios unidos a las molculas del MHC no activan a los linfocitos T
. ya que son molculas a las que el sislema inmune del individuo es tolerante. Eso
s pptidos propios pueden, sin embargo, disparar la respuesta inmune iniciando un
proceso autodestructivo que conduce a la autoinmunidad (Nepom, 1991 ) (vanse Caps
. 43-45). La unin del pptido a las molculas del MHC ocurre solo cuando el fragmento
peptdico es de un tamao adecuado y contiene una secuencia particular de aminocidos
o un motivo que le permite unirse a una o ms molculas del MHC expresadas en dicho
individuo. Un ejemplo de un motivo para un pptido que se une a la molcula del HLA
codificada por el A'0201 es la leucina (o metionina o isoleucina) en el residuo
2 del pptido. un aminocido hidroflico en el residuo 3, y una valina (o leucina o i
soleucina o alanina) en el residuo 9. Los aminocidos que forman el motivo se deno
minan residuos de "anclaje" del pptido. Las diferentes molculas del HLA. ya sean l
as molculas codificadas por diferentes alelos en el mismo locus {HLA-A'0203. '021
1. o '0301) o las molculas codificadas por diferentes locus (B'4001 o DRBV0406) s
e unen a pptidos con diferentes motivos. Los aminocidos que forman el
REPETICIN EN TNDEM Y POLIMORFISMO NUCLETIDO SIMPLE EN EL MHC
Ms de 300 repeticiones en tndem cortas (STRs) han sido identificadas en la regin MH
C humana (Foissac, 1997). Tambin estn presentes mltiples polimorfismos de nucletidos
simples (SNPs). Un estudio de Abbal (1997) examin seis locus STR en el MHC en un
a poblacin de individuos no relacionados y encontr un fuerte desequilibrio de unin
entre los haplotipos HLA especificos y los marcadores STR. Ya que estos marcador
es cubren una regin del MHC mayor que los marcadores del HLA clsico empleados ahor
a, pueden proporcionar una aproximacin ms amplia para identificar a los individuos
MHC idnticos. Estos marcadores pueden, por ejemplo, ser utilizados para identifi
car un haplotipo MHC recombinante en una familia (Carrington, 1996) y aumentar l
a probabilidad de encontrar genes de histocompatibilidad del MHC apareados. Se h
an desarrollado mtodos moleculares seguros y reproducibles para identificar tanto
las STR como las SNP (Carrington, 1998).
MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR
Los antgenos de histocompatibilidad menor (mHag) son pptidos inmunogenticos que se
unen a las molculas de MHC y pueden ser reconocidos por las clulas T. En las clulas
progenitoras de injertos MHC idnticos, se puede inducir una enfermedad injerto c
ontra husped (EICH) por las diferencias

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

937
Tabla 40-4
G e n e s H menores y sus eptopos e n las clulas T
mHag H-Y H-Y H-Y H-Y H-A-2 H-A-1" H-A-1" Secuencia p e p t d i c a SPSVDKAPAEL"
FIDSYICQV IVDCLTEMY Desconocido YIGEVSVSV VLHDDLEA VLRDDLLEA
M o l c u l a s de r e s t r i c c i n HLA-B7 HLA-A2.1 HLA-A1 HLA-B60 HLA-A2.1 H
LA-A2.1
" Derivado de una proteina evolucionanamenlo conservada codificada en el cromoso
ma Y Derivado de un miembro de la familia miosina de clase I no formadora de fil
a mentos Tres ag menores estn en el articulo de levisiOn de Goulmy de 1997. pero
esta tabla completa nos la proporcion Els Goulmy No esta publicada y fue usada po
r la autora en su charla en el ASHI. Comunicacin personal de Goulmy (2000)

entre el mHag del receptor y del donante (Mutis, 1999). Las mHag pueden ser cual
quier producto gnico polimrfico codificado fuera del MHC que difiriera entre el do
nante y el receptor y que estimule la respuesta T celular (Goulmy, 1997; Simpson
, 1998). En la Tabla 40-4 se dan ejemplos de mHag. Como otras protenas antignicas,
las protenas polimrficas deben ser procesadas en fragmentos antignicos y el fragme
nto(s) peptidico polimrfico debe unirse con la ranura de las molculas del MHC. Deb
ido al requerimiento para la presentacin antigmca por las molculas del MHC, cualqui
er pptido polimdico debe transportar un motivo apropiado de unin especfica al MHC. P
or ello, no todos los individuos pueden presentar una respuesta a todas las mHag
incluso aunque exista una diferencia entre el donante y el receptor. Muchas mHa
g son presentadas a las clulas T CD8+ por las molculas MHC de clase I. Las respues
tas de las clulas T son iniciadas cuando el receptor de clula T reconoce los compl
ejos formados por los pptidos polmrticos de las mHag unidos a las molculas de MHC ex
presadas en las APC. Las mHag fueron definidas originalmente por el rechazo de i
njerto cutneo y por ensayos citotxcos con clones de clulas T. Estos pptidos polimrfic
s tienen una unin restringida a las molculas MHC de clase I, de modo que la defini
cin bioqumica de los componentes del pptido antignico de histocompatibilidad menor f
ue determinada por la elucin, purificacin y secuenciacin del pptido del mHag unido a
una molcula del MHC especifica (den Haan 1995). Estudios recientes han demostrad
o el significado potencial de las mHag en el trasplante clnico (Goulmy, 1997.1996
; Martin. 1997: Dupont. 1998). Se han demostrado linfocitos T con citotoxicidad
especfica para las m H a g en pacientes con EICH (Mutis. 1999). La disparidad del
receptor para una mHag (HA-1) se asoci con un aumento del riesgo de EICH tras el
trasplante de mdula sea empleando donantes hermanos genotpicamenle HLA idnticos La
importancia del apareamiento para otras mHag (HA-2. HA-3. HA-4, HA-5, H- Y) est m
enos clara. Se han desarrollado tcnicas basadas en el ADN para detectar diferenci
as en las mHag (Wilke. 1998: Tseng. 1998) y se han empleado en estudios para med
ir el impacto de estas disparidades en los resultados del trasplante.
cin se hizo ms discriminatoria. La definicin ms corta de la especificidad es llamada
la especificidad subtpica o privada. Las especificidades extensas y compartidas
se denominan especificidades supertpicas. Por ejemplo, el B44 y el B45 son especi
ficidades subtipicas de la especificidad supertipica B12 Por ello, una clula que
es tanto B44+ como B45+ tambin debera ser positiva para B12. La Tabla 40-5 enumera
ejemplos de los equivalentes supertipicos para las "divisiones" En los tests se
rolgicos. algunos aloantisueros se unen a mas de un producto allico del HLA. un fe
nmeno denominado reactividad cruzada. Esta reactividad cruzada serolgica entre los

productos allicos de los locus HLA-A y HLA-B ha sido extensamente estudiada y se

ha empleado para agrupar molculas en grupos antignicos de reactividad cruzada (CR
EG) (Rodey, 1987). Las molculas de clase I en un CREG comparten uno o ms determina
ntes que no son compartidos por molculas de otro CREG En la Tabla 40-6 se enumera
n ejemplos de CREG. Un determinante antignico (eptopo) compartido entre los miembr
os de un CREG se denomina especificidad pblica. Parte de la reactividad del CREG
puede explicarse porque se comparten secuencias de aminocidos entre las molculas H
LA en un CREG (Terasaki. 1992) La inclusin de especificidades HLA en un CREG no e
st estandarizada, ya que diferentes grupos de anticuerpos producen un nico patrn de
reaccin y dos investigadores diferentes con distintos grupos de reactantes puede
n identificar grupos de CREG ligeramente diferentes. Sin embargo, los grupos CRE
G se solapan considerablemente (Ellison. 1994). Las especificidades HLA-Bw4 y Bw
6 son epitopos amplios, pblicos, que residen en la misma molcula como las especifi
cidades subtipicas del locus HLA-B. pero estn en lugares diferentes. Por ello el
Bw4 y el Bw6 son un sistema diallico. y todas las molculas del locus (y algunas de
l locus A) transportan tanto la especificidad Bw4 como la Bw6. La regin de la molc
ula del H L A que transporta las especificidades Bw4'Bw6 ha sido identificada en
la hlice (/.. entre los residuos aminocidos 77 y 83 (Tabla 40-7 y Fig. 40-9) (Par
ham. 1991). Las especificidades serolgicas designadas por la OMS. localizadas en
las molculas de clase II, HLA-DR y -DQ. han sido asignadas c o m o se describi par
a las molculas de clase I (Bodmer. 1999, 1997) (Tabla 40-2). Originalmente se def
inieron por tcnicas celulares seis tipos de HLA-DP. Las molculas HLA-DP de clase I
I no se delinen adecuadamente por serologia. Hay 26 especificidades del HLA-D qu
e fueron identificadas en cultivos mixtos de leucocitos. Todas las especificidad
es HLA-D mantienen la designacin
Tabla 40-5
Ejemplos de divisiones* serolgicas
Divisiones A23.A24 A25.A26,A34,A66 A29.A30.A31. A32. A33. A74 A68.A69 B51.B52 B4
4.B45
Especificidades originales amplias A9 A10 A19 A28 B5 B12 B14 B15 B16 B17 B21 B22
B40 B70 DR2 DR3 DR5 DR6 DQ1 DQ3
B64.B65
B62.B63.B75.B76.B77 B38.B39 B57.B58 B49.B50.B4005 B54.B55.B56 B60.B61 B71.B72 DR
15.DR16 DR17.DR18 DR11.DR12 DR13.DR14 DQ5.DQ6 D07.D08.D09
NOMENCLATURA HLA Especificidades serolgicas y celulares
La terminologa HLA est designada por el Comit de la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS) para la Nomenclatura HLA (Tabla 40-2) (Bodmer 1999. 1997). Histricamente, l
as especificidades serolgicas y celulares definidas localizadas en las molculas pr
oteicas del HLA fueron asignadas en base a los resultados de los talleres intern
acionales durante los cuales los reactivos de tipificacin fueron intercambiados e
ntre los laboratorios participantes (sitio web del Taller Internacional de Histo
compatibilidad. 13 edicin, Tabla 40-1). Las asignaciones incluyen el nombre de la
molcula de HLA y una designacin numrica basada en el orden en que su especificidad
serolgica fue definida. Por ejemplo, el HLA-A1 (o solo A1) fue la primera especi
ficidad HLA-A asignada y el HLA-A80 fue la ms reciente. A lo largo del tiempo las
especificidades definidas serolgicamente lueron "divididas" a medida que la defi
ni4
En el pasado, las designaciones de divisiones serolgicas eran dadas a especilicid
ades que parecan idcnlilicar el antgeno especilico por un alelo HLA simple (p ei.
A2 se divida en A203. A210 B7 se divide en B703: B39 se divide en B390I y B3902)
Ahora se reconoce que otros alelos tambin pueden codilicar antigenos que llevan e
stas especificidades serolgicas y el Comit de Nomenclatura de la OMS ha recomendad
o que no se hagan estas divisiones Datos de Bodmer (1997)

938
Tabla 40-6 Creg A01C A10C A02C B5C B07C B08C B12C B21C Bw4 Bw6
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
C R E G y antgenos a s o c i a d o s Antgenos asociados
Al, A3. Al 1. A29. A30, A31, A36, A80 A10, A11. A19. A25, A26, A32. A33. A34. A4
3, A66, A74 A2, A9. A23. A24, A28. A68, A69, A203 A210, A2403, B17, B57. B58 B5.
B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102. B5103 B7, B8. B13. B22, B27. B40. B41, B42
. B47, B48, B54, B55, B56. B59. B60, B61. B67, B81, B82. B703 B8, B14. BI6, B18,
B38, B39, B59. B64. B65. B67. B3901. B3902 B12. B13 B21. B37. B40 B41, B44, B45
, B47, B49. B50. B60. B61. B400b B5, B15, B17, B21, B35. B46. B49. B50. B51, B52
. B53. B57. B58. B62, B63. B70, B71. B72. B73. B75, B76, B77. B78, B4005, B5102.
B5103 A9, A23. A24, A25. A32, B5. B13. B17, B27. B37, B38. B44, B47, B49, B51.
B52. B53. B57, B58 B59. B63. B77 A2403. B5102, B5103 B7. B8. B14, B18. B22. B35
B39. B40, B41. B42, B45. B48. B50, B54, B55, B56, B60. B61, B62, B64. B65. B6, B
70, B71, B72. B73, B75, B76, B78, B81, B82, B703, B3901. B3902. B4005
tific una nica especificidad serolgica, al antgeno DR determinado por el DRBV10103 s
e le dio la designacin serolgica DR103. El tercer y cuarto nmero en la designacin all
ica se refieren al orden en que el alelo fue descrito. Por ejemplo, el A'0201 fu
e el primer alelo A2 secuenciado y el A"0203 fue el tercero. Algunos alelos pued
en diferir en la secuencia de ADN de sus regiones codificantes pero su secuencia
de aminocidos predecida no difiere (a menudo llamada sustitucin imperceptible o s
inonmica). Estas combinaciones de alelos son identificadas por designaciones de c
inco dgitos. Los primeros cuatro nmeros son compartidos, mientras que el quinto dgi
to se utiliza para distinguir las secuencias de cido nucleico nicas de los alelos
(p. ej., B'27051 y B'27052). Adems, dos o ms alelos pueden tener un nombre de siet
e dgitos en el que se comparten los primeros cuatro dgitos (p. ej., DRB4'0103101 y
DRB4'0103102). Los dgitos cinco a siete indican que los dos alelos difieren slo f
uera de la regin codificante de la proteina. En el ejemplo nombrado aqu, la difere
ncia afecta al lugar del empalme del ARN del DRB4'0103102 originando la prdida de
la expresin del alelo (Sutton, 1989). Finalmente, los alelos que no son expresad
os como protenas en la superficie celular pueden tener aadida una Na sus nombres (
p. ej A'0215N, DRB4'0103102N) para indicar "nulo". Y a que cada alelo tiene una ni
ca designacin numrica, la designacin N no se escribe siempre (i.e., A'0215 y A'0215
N son el mismo alelo). Se describen nuevos alelos en las publicaciones habituale
s del Comit de Nomenclatura HLA de la OMS (Tabla 40-1, www.anthonynolan.com/HIG/
nomenc.html; Bodmer, 1999), y las secuencias de nucletidos de todos los alelos es
tn depositadas en un banco de datos computerizado (bases de datos GenBank. EMBL,
IMGT/HLA). Actualmente, hay, por ejemplo, ms de 140 alelos HLA-A designados. Cont
inuamente se estn identificando nuevos alelos y puede accederse a ellos a travs de
l sitio web.
Datos de Ellison (1994).
V, ya que estas especificidades son definidas funcionalmente por la medicin de la
estimulacin de la clula que responde. La estimulacin se genera por diferencias en
las molculas DR expresadas en las clulas estimuladoras y. en menor medida, por est
imulacin adicional por las molculas DQ y DP.
Designaciones allicas basadas en el ADN
Se ha utilizado la secuenciacin de nucletidos para identificar los muchos alelos d
iferentes que codifican las molculas HLA. Actualmente, la especificidad simple se
rolgicamente definida puede residir en dos o ms de 25 productos allicos diferentes

(Tabla 40-2). Cada alelo HLA es designado por el nombre del locus gnico seguido p
or un asterisco y un nmero de cuatro a siete dgitos que indica el alelo. Por ejemp
lo, el A"0221 es un alelo del gen HLA-A. el B'1510 es un alelo del gen HLA-B; el
DPBV0101 es un alelo del gen HLA-DPB1 y el DQAV0601 es un alelo del gen HLA-DQA
1. Los primeros dos nmeros en la designacin numrica de cada alelo se basan frecuent
emente en el tipo serolgico de la molcula resultante y/o de la secuencia nucleotdca
similar a otros alelos del grupo. Por ejemplo, la molcula de HLA-A expresada por
el alelo A'0201 porta la especificidad serolgica A2 definiendo el antgeno HLA-A2.
Sin embargo, la molcula de HLA-B expresada por el alelo B'1510 no tiene la especi
ficidad serolgica asociada al B15 pero porta la especificidad serolgica que define
al antgeno B71. Se design B'1510 por su secuencia de aminocidos prevista similar a
los antigenos B15. Las clulas que expresan DRB1 '1003 fueron definidas serolgicam
ente como DR-blank, DR1, o incluso DR13. Las secuenciacin de nucletidos identific u
n alelo con similar estructura de ADN a los alelos que portan la especificidad s
erolgica DR1 (p. ej., DRBV01Q1 y '0102) y el nombre de este alelo se bas en su sim
ilitud estructural. Cuando posteriormente se denTCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN DEL POLIMORFISMO DEL HLA
Las pruebas de histocompatibilidad o la tipificacin del HLA o la tipificacin tisul
ar se desarrolla en un nmero limitado de laboratorios ya que utiliza tcnicas y rea
ctantes especializados. Existen disponibles en el mercado equipos para las prueb
as basadas en ADN y serolgicas; sin embargo, la interpretacin de los resultados de
la prueba requiere una considerable experiencia y conocimiento. Los laboratorio
s de histocompatibilidad normalmente se encuentran en centros mdicos que tienen p
rogramas de trasplantes de rganos y/o de clulas progenituras hematopoyticas. En est
a seccin las tcnicas de identificacin del HLA se tratan de forma general. Para tcnic
as detalladas, se remite al Laboratory Manual (2000) de la Sociedad Americana de
Histocompatibilidad e Inmunogentica (ASHI) (en la Tabla 40-1 se incluye la pgina
web de la ASHI). Los laboratorios de identificacin del HLA estn acreditados por la
ASHI, por la Fundacin Europea de Inmunogentica (EFI) y por otras organizaciones.
Tipificacin basada en el ADN de los alelos de clase I y clase II
Aunque la tipificacin serolgica y celular de los antgenos HLA ha sido muy til, hay u
n nmero de inconvenientes en estas tcnicas. Con la llegada de los mtodos rpidos y fi
ables del aislamiento y caracterizacin de los genes de clase I y II y la determin
acin de las secuencias de nucletidos de los alelos de clase I y II, ha surgido la
posibilidad de utilizar mtodos basados en el ADN para la tipificacin del HLA. La t
ipificacin basada en el ADN de los alelos HLA es ahora una tcnica utilizada Irecue
ntemente en los laboratorios de tipificacin del HLA (Middleton, 1999: Hurley, 199
7a). 1. Es especifica. La especificidad de cada reactante tipificante de ADN (p.
ej.. sondas y cebadores de oligonucletdos sintticos) se define claramente y est bas
ada en una secuencia de nucletidos especfica conocida. Como los oligonucletdos emple
ados como reactantes en la tipificacin del ADN son sintticos, los reactantes no es
tn limitados y no debera existir variacin entre lotes en la especificidad.
/"

:
*
Tabla 40-7 Secuencias d e aminocidos q u e definen los eptopos Bw4 y Bw6 y ejemplo

s de alelos q u e especifican estas secuencias Bw4 Secuencia*

NLARIALR NLRTALR DLRTLLR SLRTLLR SLRIALR
Bw6 Alelo'
B'5301 B'2701 B-2705 B"2704 A'2501
Secuencia' SLRNLRG GLRNLRG
Alelo'
-3501 B'7301
' Codones 77-83. vase Figura 40-9. Solo se da un ejemplo de cada alelo

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

939
2. Es flexible. Los nuevos reactantes pueden designarse a medida que se descubra
n los nuevos alelos y se identifiquen las secuencias de nucletidos nicas. Las prue
bas pueden llevarse a cabo en muchos niveles de resolucin dependiendo de los requ
erimientos de tipificacin y del tiempo disponible para hacer las pruebas. 3. Es ms
robusta que otras tcnicas. La tipificacin del ADN no requiere linfocitos viables
y no est influenciada por la salud del paciente. Adems, las pruebas basadas en el
ADN son altamente reproducibles cuando se usan metodologas estandarizadas como el
test con una secuencia especfica de una sonda oligonucleotdica (SSOP) usan en con
junto un protocolo de test estndar (Ng, 1996; Hurley. 2000a). 4. Puede utilizarse
para grandes escalas de tipificacin. La cantidad de muestras facilitada por las
metodologas automticas y computerizadas reduce el coste y los errores. Los mtodos b
asados en el ADN son particularmente aplicables a la tipificacin HLA de grandes nm
eros de voluntarios para los registros de donantes. 5. Puede ser discriminativa
detectando toda la diversidad del HLA. Los alelos del HLA pueden especificar pro
tenas HLA que son indistinguibles empleando tipificacin serolgica. Por ejemplo, un
individuo que transporte el alelo DRBV0401 tendr el mismo tipo serolgico (DR4) que
un individuo que transporte el alelo DRBV0412 (DR4). Por ello, DRBt'0401 y DRBV
0402 son divisiones de la amplia especificidad DR4. Estas divisiones son identif
icadas por la tipificacin del ADN. No estn disponibles reactantes serolgicos sufici
entemente especficos para definir esta divisin. Hasta ahora, se han definido 30 su
bdivisiones del DR4. Hay otros muchos ejemplos de divisiones definidas utilizand
o tipificacin del ADN que no pueden identificarse empleando tipificacin serolgica;
algunas se enumeran en la Tabla 40-2. Los problemas de la tipificacin serolgica so
n particularmente agudos cuando hay que tipificar algunos grupos de poblaciones.
Por ejemplo, las poblaciones de origen directamente africano pueden expresar an
tgenos de clase I y clase II que son difciles de identificar con los reactantes se
rolgicos disponibles actualmente (Mytilineos. 1998; Yu. 1997; Bozon, 1997). La ti
pificacin del HLA basada en el ADN ha mejora muchsimo la capacidad de definir los
tipos de H L A en estas poblaciones. Preparacin y amplificacin del ADN. Cualquier
clula con ncleo puede utilizarse como tuente de ADN. Mientras que los eritrocitos
(RBC) no tienen ncleo, otras clulas de la sangre como los linfocitos son bunas fue
ntes de ADN. Las lineas celulares como los linfocitos B transformados por el vir
us de Epstein Barr tambin son buenas fuentes de ADN. A medida que las clulas trans
formadas pueden crecer en un cultivo de laboratorio, proporcionan un suplemento
de ADN que se puede reponer y son empleadas para proporcionar un ADN de referenc
ia para el control de calidad de las tcnicas de tipificacin, El ADN normalmente se
prepara de una pequea cantidad (0,2 mi a 1 mi) de sangre total. Se puede emplear
muchos protocolos diferentes para aislar el ADN de las clulas, y tambin hay equip
os disponibles en el mercado para la preparacin del ADN. La sensibilidad de la de
teccin de los tipos del HLA aumenta considerablemente con la amplificacin del ADN
que codifica los genes HLA utilizando la tcnica de la PCR (Saiki, 1998). Se debe
complementar con un par de oligonucletidos sintticos (cebadores) a las secuencias
alrededor de un gen especfico HLA para generar millones de copias de dicho gen pa
ra su uso en la reaccin de tipificacin del ADN. Algunas reacciones de tipificacin e
mplean secuencias promotoras que son compartidas por todos los alelos de un locu
s HLA: otras tcnicas de tipificacin emplean grupos de promotores que son compartid
os slo por un grupo de alelos del locus. El fijado de los cebadores a la muestra
de ADN durante la reaccin PCR usa las condiciones de la reaccin que garantizan que
los promotores se unirn a las secuencias perfectamente apareadas (secuencias dia
na) y no a secuencias de otros locus o de otros alelos que no estn apareadas. Aju
stando la temperatura del componente de fijado de la reaccin PCR, el laboratorio
de tipificacin puede controlar la especificidad de la amplificacin. Promotor especf

ico de secuencia. Un mtodo de identificacin de los alelos HLA utiliza promotores e

specficos de secuencia (SSP) en la reaccin PCR (Olerup, 1992; Bunce. 1995). Los pr
omotores se aaden para desnaturalizar el ADN que contienen los alelos HLA de los que derivaban las secuencias
promotoras. En ia subsiguiente reaccin PCR. solo estos alelos seleccionados son a
mplitcados. El ADN amplificado por los promotores es identificado por electrofore
sis en gel o, si el ADN es marcado con un colorante durante la amplificacin, por
fluorescencia. Este procedimiento es de utilidad en la tipificacin de un pequeo nme
ro de muestras en un corto periodo de tiempo. Hay equipos disponibles en el merc
ado. Hibridacin oligonucleotdica especfica de secuencia. Ha sido posible el empleo
de la hibridacin de SSOPs con ADN amplificado para identificar alelos (Gao, 1991;
Cao, 1999; Williams, 1997). Suele requerirse el empleo de mltiples sondas de oli
gonucletidos diferentes para definir un alelo HLA especfico o el empleo de un prom
otor especifico de secuencia unido con hibridacin con paneles de sondas. Un grupo
de oligonucletidos capaz de identificar cada alelo es hibridado a ADN amplificad
o desnaturalizado por PCR unido a un soporte slido. Las condiciones de hibridacin
se ajustan de modo que las sondas se aadan al ADN desnaturalizado que contenga lo
s alelos HLA de los que deriv la secuencia del oligonucletido. Los oligonucletidos
se encuentran marcados con una terminacin para detectar la hibridacin. Por ejemplo
, el oligonucletido puede asociarse a una enzima como la fosfatasa alcalina. Tras
la adicin de un sustrato, la losfatasa alcalina degrada el sustrato para produci
r un componente coloreado o para producir luz (quimioluminiscencia). Tras la vis
ualizacin. puede leerse el patrn de hibridacin para determinar los alelos presentes
. La Figura 40-11 ilustra la aproximacin con el empleo de una sonda de oligonuclet
ido para el alelo DOS?, DQBV0302, para identificar pacientes con diabetes depend
iente de insulina que tienen este alelo (Todd, 1987). El mtodo SSOP es muy exacto
, especfico y fiable (Ng, 1996; Hurley, 2000a). A menudo es utilizado en situacio
nes donde se tipifican muchas muestras en grandes grupos. Estn disponibles kits c
omerciales que utilizan este mtodo. En una tcnica relacionada, llamada el formato
reverso, las sondas de oligonucletidos se unen a un soporte slido (Bugawan, 1994).
El ADN de las muestras que va a ser analizado es amplificado empleando iniciado
res marcados con, por ejemplo, biotina. Entonces el ADN amplificado se hbrida a s
ondas inmovilizadas, que contienen las secuencias encontradas en los alelos pres
entes en el ADN. Tras la visualizacin (empleando un sistema de deteccin unido a la
avidna), se puede leer el patrn de hibridacin para determinar los alelos presentes
. Esta tcnica es til para la tipificacin tanto de un nmero de muestras pequeo como gr
ande. Hay equipos disponibles en el mercado que utilizan este mtodo. Polimorfismo
conformacional de secuencia especfica (SSCP) o anlisis heterodoble. Otro mtodo, au
nque poco usado, de identificacin de los alelos HLA analiza la movilidad del ADN
amplificado, ya sea desnaturalizado (SSCP) o como ADN doble renaturalizado (anlis
is heterodoble), tras la electroforesis (Arguello. 1996). La movilidad del ADN e
s comparada con la movilidad del ADN amplificado de los alelos HLA para definir
un alelo HLA. Esta tcnica es til en la tipificacin de un pequeo nmero de muestras y p
articularmente en las comparaciones entre individuos, por ejemplo, en una famili
a. Secuenciacn del cido nucleico. Un mtodo final de identificacin de alelos HLA impli
ca la determinacin directa de las secuencias de ADN de los alelos HLA transportad
os por un individuo (tipificacin basada en la secuencia [SBT]). Los alelos son id
entificados ya sea tras la amplificacin PCR para separar los alelos basados en SS
P o como una mezcla de dos alelos. La secuenciacn es una labor intensa y altamente
compleja pero puede usarse frecuentemente para determinar el HLA emparentado en
un nivel allico entre los pacientes de trasplantes de clulas progenituras hematop
oyticas y sus futuros donantes (Petersdorf, 1995a; Rozemuller. 1996; Scheltinga.
1997). Resolucin de la tipificacin basada en el ADN. El nivel de resolucin (i.e., l
a capacidad de discriminar entre alelos) obtenido por los mtodos de tipificacin de
ADN esl controlado por la eleccin y el nmero de iniciadores y/o sondas empleados e
n el ensayo y por el mtodo de tipificacin. Esta eleccin puede depender del tiempo d
isponible para el desarrollo de la tipificacin, del coste de la tipificacin, de la
experiencia del personal de laboratorio y del pro-

940
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
B
Figura 40-11. 4, Secuencias de nuclelidos de mltiples aletas D0B1. Las secuencias
presentadas cubren los codones para los aminocidos 50 a 60. Una raya indica que e
l nucle2 3 4 5 7 9 10 tido es idntico a l a secuencia d e la pade superior. En un
rectngulo est un oligonucleotide que es especifico para la se U I I H I I I I M B M
W H M T I I I U B H H H H M H H H M H H U cuencia DQBI'0302. B. Anlisis de trans
ferencia en m a n c h a (oof blot) con oligonucleotides de 17 pacientes IDDM (DM
I19) y un control. BML. El ADN amplificado q u e contiene secuencias DQBf de cla
se II de los pacientes le unido a la membrana e hibridado para el oligonucleotide
especfico marcado para la secuencia DQB1 '0302 (descrita previamente). Las seales
de hibridacin positiva indican los pacientes que tienen esta secuencia gnica DQB!
(pacientes DM1. 2. 4,7,10-16,19). (De Todd JA. Bell J, McDevitt HO: HLA-DQB gen
e contributes to susceptibility and resistance to insulindependent diabetes mell
ilus. Nature 1987; 329-599. con perII 12 1 3 14 1 5 16 17 IS 1') UML
psito de la tipificacin. Normalmente la tipificacin para registros de donantes a gr
an escala se lleva a cabo con una resolucin baja-intermedia, mientras que la tipi
ficacin de un posible donante de clulas progenituras hematopoyticas para un pacient
e especfico se realiza a un nivel de resolucin allica. A menudo se utiliza un abord
aje con mltiples pasos para identificar los alelos HLA por tipificacin basada en e
l ADN. Por esta razn, los tipos de HLA definidos por la tipificacin basada en el A
DN pueden mostrarse con diferentes niveles de resolucin. El nivel de resolucin baj
o (o genrico o seroigico) de tipificacin basada en el ADN produce un resultado simi
lar en apariencia y en detalle a un tipo seroigico. Por ejemplo, un tipo definido
por ADN. el DRBI'tl o el DRBV11XX. es el equivalente aproximado del tipo seroigi
co DR11. El "XX" indica que el alelo no fue definido. En este nivel de resolucin,
no es posible determinar cul de los ms de 30 alelos DRBI'11 tiene el individuo qu
e est siendo analizado. Aunque la tipificacin serolgica pues ser tan informativa co
mo la tipificacin de baja resolucin, los resultados son ms fiables con el anlisis ba
sado en el ADN. El nivel intermedio de resolucin de tipificacin basada en el ADN p
uede reducir las opciones enumerando mltiples posibilidades diferentes para el ti
po de un individuo, (p. ej., DRBV1101 o DRBl'1104). Finalmente, el nivel de reso
lucin alto (o a nivel allico) de la tipificacin basada en el ADN identifica el alel
o especifico que transporta un individuo (p. ej.. DRBV1104). Ya que la identific
acin de los alelos HLA puede basarse en la secuencia de informacin parcial, es pos
ible que la interpretacin de los resultados pase por alto alelos que eran descono
cidos en el momento de la tipificacin (Hurley. 1997b). Por esta razn, los laborato
rios tienen cuidado de mantener sus datos de tipificacin brutos (p. ej., qu promot
ores y qu sondas fueron positivos y negativos y las secuencias de nucieotidos de
los reactantes) de modo que los resultados puedan reinterpretarse a mediada que
se describan los nuevos alelos.
los ndices de error (Bozon, 1997; Yu, 1997). La reproductibilidad para especifici
dades determinadas serolgicamente del HLA-C y clase II es m u c h o menor. El HLA
-DP normalmente no se define por serologia. El ensayo seroigico de microcitotoxic
idad todava se utiliza ampliamente para las especificidades de clase I (HLA-A, -B
) pero ha sido sustituido por el anlisis basado en el ADN para las especificidade
s HLA-C y de clase II (HLA-DR, -DQ, -DPj en muchos laboratorios de tipificacin. E
l anlisis basado en el ADN con su mayor resolucin se utiliza para determinar el ti
po de HLA de individuos n o emparentados y de miembros de una familia especialme
nte si la segregacin del HLA no puede discriminarse con seguridad por serologia (

p ej.. familias donde los padres no estn disponibles o familias donde los padres
comparten un antgeno HLA). Por eiemplo. un descendiente hereda un DR4 de cada par
iente y por eso el es homocigotico para el antigeno DR4 (DR4. DR4). Sin embargo,
la tipificacin del ADN de alta resolucin puede identificar dos alelos distintos d
el antgeno DR4, el DRBf040t y el Dfl8r0403(heterocigtico para el alelo DRBV04), pr
oporcionando datos informativos para los anlisis de segregacin del haplotipo. Prep
aracin de los linfocitos. Los linfocitos utilizados rutinariamente en los ensayos
de tipificacin serolgica del HLA se obtienen rpidamente de la sangre total perifric
a sedimentndola con un gradiente de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos p
or densidad de centrifugacin. Los linfocitos de sangre perifrica separados (PBLs)
pueden emplearse para la tipificacin del HLA-A. -B. -C. Para analizar las especif
icidades serologicas del HLA-DR. DQ. es necesario o enriquecer los linfocitos B
o utilizar una tcnica de fluorescencia de dos colores especial para diferenciar s
imultneamente las clulas B y las clulas T no separadas. Ensayo de microcitotoxicida
d linfocitica. El fenotipo HLA se determina analizando la preparacin de linlocilo
s no separados (PBL) o los linfocitos T (para el HLA-A. -B. -C) o los linfocitos
B enriquecidos (para el HLA-DR, DQ) frente a un panel de aloantisuero HLA bien
caracterizado. El ensayo es un test de dos etapas. Durante la etapa de de sensib
ilizacin, los linfocitos son incubados con el antisuero. Se aade suero de conejo e
n exceso preanalizado y estandarizado como fuente de complemento y la mezcla se
incuba durante un periodo adicional. Si los linfocitos llevan una molcula de supe
rficie celular reconocida por los anticuerpos fijadores del complemento del aloa
ntisuero, los anticuerpos se unen a las clulas y las clulas son usadas subsiguient
emente tras la adicin del complemento. El ensayo termina con la adicin diacetato d
e fluoresceina y de bromato de elidi para las tcnicas de deteccin
Deteccin serolgica de las molculas de clase I y clase II
El anlisis de la microcitotoxicidad de los linfocitos. que ongnalmente se utilizo
en el sistema del ratn por Gorer y Amos y despus fue modificado por Terasaki y McC
lelland para el empleo en el sistema humano, ha sido usado para la tipificacin de
l HLA desde los aos 60. El anlisis seroigico del HLAA, -B, puede reproducirse en co
ndiciones controladas y estandarizadas; sin embargo, los anlisis a gran escala (p
, ej., para registros), pueden aumentar

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

941
fluorescentes, o tanto con eosina y formalina como con trypan azul y cido actico e
tilendiamineter (EDTA) para las tcnicas de visualizacin de colorantes. Las reaccio
nes se leen en porcentaje de lisis y se gradan numricamente. Cubetas de suero para
tipificacin del HLA. Los reactantes de tipificacin del HLA derivan del suero de i
ndividuos aloinmunizados (mujeres multparas, receptores de trasplantes, pacientes
multitransfundidos e inmunizacin planificada en humanos). Las placas con mltiples
pocilios de aloantisuero humano (esto es. cubetas de tipificacin del HLA) estn di
sponibles en el mercado. Debido a la complejidad antignica de los anlgenos HLA. de
ben utilizarse mltiples antisuero para definir cada especificidad. Muchos de los
laboratorios utilizan cubetas de al menos dos vendedores diferentes o pueden uti
lizar aloantisuero obtenido localmente. Como muchos aloantisueros no son verdade
ramente monoespeclicos y muchos presentan alguna reactividad cruzada, la reactivi
dad de cada antisuero debe analizarse cuidadosamente y conocerse para la interpr
etacin de los resultados. Esto requiere un estrecho control de calidad de cada nu
evo lote de cubetas de tipificacin con clulas de referencia bien caracterizadas. C
omo el titulo y la especificidad del anticuerpo formado por un individuo sensibi
lizado puede no ser constante con el tiempo, los suplementos de anlisuero son li
mitados. En un intento de crear un suplemento consistente y no limitado de react
antes, algunas compaas han producido anticuerpos monoclonales. Estos reactantes mo
noclonales no estn disponibles para todas las especificidades HLA. Reactividad cr
uzada. El aloantisuero HLA puede reaccionar con ms de un producto allico HLA. Este
fenmeno puede proceder de la poliespecificidad del antisuero y/o de la reactivid
ad cruzada y es responsable de los complejos patrones de reactividad de algunos
aloantisueros. El suero poliespecfico contiene dos o ms anticuerpos, que pueden se
r adsorbidos para retirar uno, con pequeo efecto sobre la reactividad del otro(s)
. El antisuero con reactividad cruzada contiene, ms frecuentemente, un anticuerpo
simple que reacciona con un determinante antignico compartido entre mltiples prod
uctos allicos HLA diferentes (p. ej., CREG o determinantes amplios, como se trat p
reviamente) (Rodey, 1994). Las reacciones cruzadas ocurren ms frecuentemente entr
e los productos allicos codificados por el mismo locus pero pueden ocurrir entre
productos allicos codificados por locus diferentes (p. ej., A2 + B17). En la Figu
ra 40-9 y en la Tabla 40-6 se dan ejemplos y la localizacin de los determinantes
de la reactividad cruzada.
con los subsiguientes acontecimientos, como la extensin de la EICH. todava son con
trovertidas.

TRASPLANTE DE RGANOS/TEJIDOS
La supervivencia a largo plazo de rganos slidos y de los injertos de clulas progeni
toras hematopoyticas representa uno de los retos ms importantes de la ciencia mdica
. El trasplante renal es la terapia de eleccin para la mayora de los pacientes con
enlermedad renal en fase terminal. El trasplante de progenitores celulares hema
topoytcos, de corazn, de pulmn, de higado y de pncreas est ganando una amplia aceptac
como tcnicas teraputicas con resultados satisfactorios. El principal obstculo al t
rasplante de rganos slidos y de progenitores de clulas hematopoyticas es el rechazo
mediado inmunolgicamente al tejido extrao. Por lo tanto, el xito de un aloinjerto d
epende de la capacidad para detener la reaccin inmune, lo cual puede realizarse p
or: 1) concordancia de histocompatibilidad entre el donante y el receptor; 2) te
rapia inmunosupresora del receptor (Suthanthiran, 1996); y 3) lograr que el rece
ptor no responda al aloantgeno o aloantigenos del donante (esto es, tolerancia) (
Remuzzi, 1995).

Bases genticas del trasplante

Las bases genticas del trasplante fueron determinadas por primera vez en 1916 com
o resultado de experimentos de trasplantes tumorales en ratones y posteriormente
se extendi a trasplantes de tejido normal (Snell, 1981). Se demostr que los injer
tos cutneos en linajes nativos que eran homocigotos en el locus de histocompatibi
lidad (esto es, injertos singnicos) tenan xito, pero los injertos entre dos linajes
nativos diferentes (alotrasplantes) eran rechazados. Adems, los aloinjertos de c
ualquier linaje nativo emparentado (dos copias de los mismos genes MHC; homocigo
tos) o de la primera generacin (F1) hibridada (una copia de cada uno de los dos g
rupos diferentes de genes MHC de dos padres homocigotos) sobrevivan en animales;
mientras tanto, los injertos de descendientes F1 hbridos de cualquier progenitor
(un haplotipo no emparentado) no sobrevivan. Estas observaciones establecieron la
s leyes del trasplante. En 1948, Gorer (Snell, 1981) delini el locus d e histocom
patibilidad mayor en el ratn, el H-2. Hay otros antigenos de histocompatibilidad
o H, que son denominados mHag. Aunque son llamados menores, la discordancia para
estos antgenos puede tener efectos importantes (Goulmy. 1997: Dupont, 1998).
Deteccin celular de las molculas de clase II
L a respuesta de una clula en el cultivo tisular a los aloantgenos en la superfici
e de una segunda clula se denomina cultivo mixto de leucocitos (CML) o reaccin lin
focitica mixta (MLR) (Hartzman. 1971). El CML es considerado una medida in vitro
de la disparidad de clase II entre individuos que reconocen determinantes encon
trados en las molculas de clase II. que son conocidos colectivamente como HLA-D.
La respuesta de las clulas T se produce unidireccionalmente impidiendo que se dup
liquen las clulas de uno de los dos individuos tratando dichas clulas con radiacin
o mitomicina-C antes de su adicin al cultivo. El CLM representa una respuesta sum
atoria de una clula respondedora a las diferencias en los mltiples determinantes e
n las molculas HLA de clase II (DR, DQ y DP) codificadas por los haplotipos de clu
las estimuladoras irradiadas. La respuesta a las molculas DR parece predominar.
A medida que existan evidencias convincentes en modelos animales experimentales d
e que las molculas codificadas por el MHC representan la mayor barrera gentica del
xilo del aloinjerto. la tipificacin del HLA fue utilizada en humanos para determi
nar y para optimizar la compatibilidad entre el injerto del donante y el recepto
r. Inicialmente, la influencia de los antgenos HLA en la supervivencia del injert
o fue investigada injertando piel no vascularizada entre miembros de una familia
. Como en los estudios de ratones hijos, los injertos cutneos entre hermanos HLA
idnticos sobrevivieron significativamente ms que los injertos entre hermanos padre
s o donantes no relacionados con un haplotipo emparentado. Estas observaciones s
e extendieron al trasplante renal durante los ltimos aos de la dcada de los 60 y lo
s primeros de la de los 70. Los datos ms recientes del Estudio Colaborador Intern
acional de Trasplante (CTS) en Heidelberg y de la United Network for Organ Shari
ng (UNOS) Registry en los Estados Unidos (analizado en UCLA), confirEl empleo de
l CLM en los laboratorios clnicos para determinar la histoman que el MHC es la pr
incipal barrera gentica en el trasplante de injertos compatibilidad ha declinado
debido a las limitaciones inherentes a la tcnica. El CLM puede estar influenciado
por la salud del paciente, por el tipo de enfer- renales (Cecka, 1999; Opelz. 1
999) (Fig. 40-12; para datos actuales vanse las pginas web sealadas en la Tabla 401). Los datos para el trasplante de medad y por la historia de una transfusin pre
via (Mickelson, 1996). Por estas clulas progenitoras hematopoyticas tambin reafirma
el papel del MHC en razones el ensayo CLM se ha reemplazado por mtodos de tipifi
cacin basala evolucin del trasplante determinado por la supervivencia del paciente
y por dos en el ADN, ms precisos. Actualmente, en algunos centros de trasplanla
EICH (Hansen, 1999) (Fig. 40-13). tes, el cultivo mixto de leucocitos se emplea
para identificar receptores de aloinjerto renal con hiporreactividad especifica
a las molculas HLA del donante tras el trasplante como una guia para reducir la i
nmunosupresin Concordancia de histocompatibilidad (Reinsmoen, 1993). Concordancia
de HLA. Aunque el nivel de concordancia del HLA es un elemento importante en el
resultado del trasplante, la concordancia de la histocompatibilidad significa d
iferentes cosas en diferentes situaciones y las estrategias para determinar esto

varan. Los criterios difieren con variables

Se ha utilizado el anlisis de dilucin limitada para definir la frecuencia de los l
infocitos T citotxicos (LTC ) o coadyuvantes (LTC) para predecir la extensin del a
lorreconocimiento en trasplantes de clulas progenitoras hematopoyticas (Madrigal,
1997). Las correlaciones de estas frecuencias
P p

942
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
100,
Tabla 40-8 E j e m p l o s d e asociaciones entre los alelos HLA y sus tipos ser
olgicos Alelos HLA A'0201 A '2603 A-660V B'2702 B'2708' B'1502 B-1503 B' 1536' DR
BV0301 DRB1V404 Antigenos HLA
A2 A26 A26 A66 B27 B7 B27 B75(15) B72 (70) No definido DR17(3) DR4 ' El laborato
rio puede asignar A66. o ms recuentemente. 26 a las clulas que transportan este ale
lo. ' Muchos laboratorios tipan serologicamente una clulas con este alelo c o m o
B7: sin embargo, la reactividad serolgica sugiere que la tipificacin difiere leve
mente del B7 "estndar' Las clulas que transportan este alelo no han sido carcter i/
adas soioiog camenle
1
dantes para cuatro de seis alelos o anligenos se denominan 4/6 concordancias. La
s diferencias aparentes en el nivel de concordancia pueden surgir a causa de la
metodologa de tipificacin empleada para asignar los tipos de HLA (p. ej tipificacin
serolgica frente a basada en el ADN). Las nomenclaturas serolgicas y ADN, aunque e
stn relacionadas, pueden diferir. En la Figura 40-12. Supervivencia a cinco aos de
aloinjerto renal (primer trasplante) de Tabla 40-8 se dan ejemplos de estas rel
aciones y se ha publicado una lista tres categoras de histocompalibilidad: herman
os HLA idnticos; un haplolipo d e vida relacionado: donante de cadver, llenos de h
ermanos donantes HLA idnticompleta (Schreuder. 1999). La definicin de una concorda
ncia tambin puede cos ( a m b o s con cromosomas H L A concordantes) tienen los m
ejores resultados Se variar dependiendo del tipo de resolucin. Un paciente y un d
onante pueden indica el numero de trasplantes estudiados (regresin p < 0.0001) (D
e Opelz G, parecer ser concordantes en el nivel serolgico (p. ej.. receptor: A2.
A26: Wujoak T, Dohler B. y col: H L A compatibility and organ transplant surviva
l. Rev donante: A2. A26): sin embargo, la pareja puede ser discordante en el niv
el de Inmunogenet 1999; 1:334, con permiso) alelos HLA (p. ej., receptor: A'0201
. A'260l: donante: A'0205. A'6601). El nivel de concordancia allico para las molcu
las de HLA clsicas puede optimizar el resultado de todos los injerios, tanto de rg
anos vasculares como de clulas progenituras hematopoyticas (Opelz, 1999; Petersdor
i, 1998). Sin que incluyen el tipo de injerto (p. ej., rgano slido vascularizado f
rente a proembargo, debido al gran nmero de alelos HLA, el nivel de concordancia
algenitor de clula hematopoytica), la enfermedad (p. ej.. leucemia mielode lico es d
ifcil. Por lo tanto, debe considerarse un nivel de concordancia que crnica (rente
a anemia aplsica), la edad del paciente y el protocolo clnico garantice un buen re
sultado para el mximo nmero de pacientes de todas las (p. ej., sangre de mdula fren
te a sangre de cordn umbilical: deplecin poblaciones tnicas. medular de clulas T fre
nte a no deplecin de clulas T) (vase Cap. 33). La concordancia normalmente incluye
la evaluacin de al menos tres locus, Tras el trasplante de clulas progenitoras hem
atopoylicas, los determiel HLA-A. el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordant
es, en cualquier nantes subtipicos o las diferencias allicas inician una importan
te respuesta resolucin, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o 0 di
scorcitotxica de clulas T conduciendo al rechazo del injerto y a la EICH. De danci
as. Cero discordancias (un trmino empleado en el trasplante de rganos hecho, los e
studios han mostrado que la concordancia de alta resolucin para slidos) tambin pued
e referirse a pares de donante/receptor, donde el donanlos alelos de clase I y c
lase II del donanle y el receptor puede mejorar el resulte no tiene diferencias
HLA detectables con el receptor, esto es, donde el tado tras el trasplante de mdu
la no emparentado. Los datos recientes sugiedonante es homocigoto para los alelo

s en uno o ms de los locus (p. ej., donan- ren que mltiples discordancias son mala
s para el resultado; sin embargo, el te homocigoto: A'0101: B'0801: DRBT0301: re
ceptor heterocigoto: A'0101: impacto tanto de las discordancias simples como del
locus especifico todava A'0301: B'0801: B'0702: DRBV0301. DRBV1501). Los individ
uos concorno est bien definido (Petersdorf, 1998: Sasazuki. 1998: Hansen. 1999).
Solo HLA-ID III RMANO n 4.343 1 -IIAPI. PARIATI-.se n- 18.071 CADVER n 105.360
Figura 40-13, Probabilidad de EICH aguda grados ll a IV en hermanos HLA idnticos
(concordancia genotpica HLA) y variabilidad en trasplantes de donantes medulares
haploidnticos emparentados con concordancia para el HLA-A. -B o DR/Dw (discordanc
ia HLA: 3 locus, 2 locus, 1 locus o 0 locus). La concordancia para el HLA-A, -B
y -DR fue definida por seroiogia. y la concordancia para el H L A D w fue defini
da p o rC M Lo por tipificacin de los alelos HLA-DRBl con SSOP. Todos los pacient
es recibieron mdula no modificada (sin deplecin de clulas T) tras un rgimen de prepa
racin que incluy la irradiacin corporal total. Se dieron ciclosporina y metotrexato
para la profilaxis de la EICH (De Hansen JA. Y a m a m o t o K. Petersdori E. y
col: T h e role of H L A matching in hematopoietic cell transplantation. Rev I
m m u n o g e n e t 1999; 1:359, copyright 1999 Munksgaard International Publish
ers Ltd. Copenhagen. Denmark, con permiso.)

CAPTULO 40

ANTIGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD.

943
una minora de pacientes que estn esperando el trasplante recibirn injertos de donan
tes totalmente concordantes (Hurley, 2000b). Para permitir a todos los pacientes
beneficiarse de trasplantes que salven la vida, la identificacin de los alelos n
o emparentados que son bien tolerados permitir la seleccin de donantes no emparent
ados estableciendo prioridades de acuerdo con el riesgo biolgico de los HLA especf
icos no concordantes. La concordancia ptima para los injertos de rganos slidos pued
e diferir de los requerimientos de concordancia para el trasplante de clulas prog
enituras hematopoylicas. Los datos recientes sugieren que tanto el locus HLA empa
rentado como el nivel de resolucin del anlisis del HLA contribuyen al resultado de
l injerto renal (Opelz. 1999). Actualmente la UNOS facilita la comparacin de rones
de cadveres basndose en las especificidades subtipicas. Ya que las concordancias s
ubtipicas se identifican infrecuentemente, se ha propuesto que las molculas HLA d
e clase I sean emparentadas para los amplios determinantes CREG. El CREG puede d
efinir los determinantes mmunodominantes reconocidos en la respuesta inmune humo
ral. Rodey (1994) mostr que del 80% al 90% de los aloanticuerpos HLA formados por
el receptor tras el trasplante de rion estn dirigidos contra los determinantes CR
EG. Los determinantes CREG son compartidos entre las dilerentes molculas HLA de c
lase I y. en contraste con las especificidades subtpicas. tienen una distribucin s
imilar entre los grupos de poblacin tnica. En el CREG se incluyen especificidades
subtpicas raras. Y a que el nmero de CREGs es menor que el nmero de especificidades
subtpicas. la probabilidad de emparentar un nivel CREG es mayor que para un nive
l subtpico o allico de HLA clase I. Por lo tanto, la distribucin de rganos basndose e
n la concordancia CREG debe originar una alta probabilidad de que se distribuyan
equitativamente injertos emparentados a receptores de todas las poblaciones tnic
as. Un anlisis retrospectivo de los datos de la UNOS corrobora estas predicciones
sobre la distribucin (Ellison, 1994), aunque los estudios todava estn en progreso.
El impacto de la concordancia CREG en el resultado del injerto es desconocido,
pero se est evolucionando. En Europa, una estrategia para eliminar el excesivo ti
empo de espera de los receptores con fenotipos HLA raros se implant en 1996 mient
ras se mantena la distribucin de los injertos bien emparentados (Opelz. 1999). Otr
as estrategias se centran en la concordancia de los fragmentos biolgicamente rele
vantes de las molculas del MHC (p. e| concordancia de eptopo) (Suciu-Foca, 1998; Ha
rris, 1999). Hasta hace poco, el reconocimiento directo de los aloantgenos se pen
s que era la principal via de respuestas de los injertos. Sin embargo, los estudi
os sugieren que la respuesta indirecta juega un papel significativo en el rechaz
o del injerto, al menos en los injertos de rganos slidos (Sayegh, 1996). Si se act
iva la via indirecta, entonces los epitopos peptidicos generados por la ruptura
proteolitica de la molcula HLA y no por la molcula HLA en si misma sern el estmulo i
nmunognico. Por ello pueden disearse nuevas estrategias innovadoras para la defini
cin de las discordancias deducbles basndose en el reconocimiento de los fragmentos
peptidicos. Por ejemplo, una estrategia puede considerar si las molculas HLA del
donante no emparentado sern interpretadas como inmunognicas en el receptor (es dec
ir, si las molculas HLA del receptor se unirn y presentarn estos epitopos). Tericame
nte, uno puede identificar secuencias peptdicas de HLA extrao no presentado por la
s molculas HLA especficas del receptor y por ello definir las discordancias deducbl
es para las molculas HLA dadas. La complejidad inherente en la interpretacin de lo
s resultados de la tipificacin del HLA y en la seleccin de un donante hace crtico i
ncluir un experto en los anlisis de hislocompalibilidad. Los expertos en la tipif
icacin del HLA conocern las ventajas y las limitaciones de cada mtodo de tipificacin
asi como la frecuencia de los alelos y los haplotipos en la poblacin, informacin
importante tanto en la bsqueda como en la seleccin de un donante adecuado. Deteccin
de anticuerpos especficos del HLA en el suero del receptor. Los pacientes pueden

sensibilizarse a molculas H L A extraas especficas a travs de una transfusin, el emb

arazo, o trasplantes anteriores. La evaluacin de la compatibilidad entre el recep
tor y el posible donante incluye el anlisis para esta sensibilizacin. El suero del
receptor es analizado antes del trasplante en un panel (linfocitos o molculas de
HLA solubles inmovilizadas) de un perfil HLA conocido para medir la reactividad
anticuerpo panel (PRA). En el momento del trasplante, el suero del receptor es
analizado con
los linfocitos prospectivos del donante para identificar la reactividad especfica
para el donante potencial en la prueba cruzada especfica de donante. Aunque las
tcnicas utilizadas para detectar el anticuerpo de unin pueden diferir entre los la
boratorios, los propsitos siguen siendo obtener un perfil de factores de riesgo i
nmunolgico del receptor en la lista de espera, que ser de ayuda al equipo mdico tan
to en las decisiones pretrasplante como en las postrasplante. La unin del anticue
rpo en el suero actual del receptor a los linfocitos Tdel donante es una contrai
ndicacin para el trasplante renal Anlisis del suero (PRA). La caracterizacin cuidad
osa del perfil de anticuerpo de los pacientes en espera de un trasplante es de a
yuda en la interpretacin de las concordancias cruzadas especificas de donante pre
trasplante. Los objetivos del anlisis PRA son: 1. Identificar el nivel de presens
ibilizacin del paciente a los antgenos HLA. Un paciente con un exceso de PRA del 6
0% (i.e., el suero del paciente reacciona con especificidades encontradas en al
menos el 60% del panel) tiene una menor probabilidad de concordancia cruzada don
ante-especfica negativa y, por ello, de recibir un trasplante de un trasplante no
emparentado. 2. Identificar la especificidad HLA de los anticuerpos para predec
ir el antigeno(s) HLA que sern evitados cuando se seleccionen los donantes. 3 Ide
ntificar pacientes con anticuerpos irrelevantes (p. ej.. IgM autoanticuerpos) de
modo que se puedan seleccionar las tcnicas apropiadas para evitar falsos positiv
os en la lectura en el momento de la concordancia cruzada donante-especfica. La c
aracterizacin del anticuerpo HLA especfico presente en el suero del receptor requi
ere un anlisis en un panel seleccionado de especificidades HLA bien definidas. Se
deben incluir en el panel de control los linfocitos o los antgenos solubles de u
n nmero suficiente de individuos para asegurarse de que se detectarn todos los ant
icuerpos dirigidos contra el HLA salvo los ms raros. En la medida de lo posible,
el panel de control debe permanecer igual de modo que los resultados sean compar
ables en el tiempo. El receptor de un trasplante renal forma frecuentemente anti
cuerpos frente a CREGs ms que frente a especificidades subtpicas (Rodey. 1994,1997
) de modo que el anlisis de la reactividad del panel debe considerar la identific
acin de CREG asi como la de especificidades subtpicas. La identificacin de especifi
cidades de anticuerpo en los pacientes que esperan el trasplante ayuda a la pres
eleccin de un donante potencial del que el receptor tendr una concordancia cruzada
final negativa. Los programas de ordenador ayudan en la seleccin (Claas, 1999: D
uquesnoy, 1999). La frecuencia del control y la seleccin de los ensayos empleados
para el control son decisiones basadas en el perfil inmunolgico del individuo re
ceptor. El descenso del empleo de las transfusiones sanguneas ha hecho innecesari
a la necesidad de un control mensual de las muestras de suero de todos los pacie
ntes (pgina web ASHI: Tabla 40-1). La presencia tanto de anticuerpos especficos HL
A de clase I como de clase II es detectada por el anlisis del suero en un panel d
e linfocitos (p. ej., por citotoxicidad directa dependiente del complemento o po
r ensayos de citotoxicidad aumentados con antiglobulina) o en un panel de molcula
s HLA soluble inmovilizadas con placas (es decir, ensayo con enzima unida mmunoa
bsorbente [ELISA]) o en gotas (es decir citometra de flujo). (Los ensayos se desc
riben con detalle en el manual ASHI [2000].) Una ventaja del ensayo con antigeno
soluble de fase slida es que puede ser diseado para detectar solo IgG. anticuerpo
s especlicos frente al HLA de clase I. Las muestras de suero de los receptores po
tenciales deben almacenarse a -70 C y protegerse del dixido de carbono y de la ev
aporacin Las muestras de suero caracterizadas almacenadas sern utilizadas en la pr
ueba cruzada especifica de donante para evaluar la compatibilidad con un donante
prospectivo. Prueba cruzada especfica de donante. L a concordancia cruzada de li
nfocitos analiza la presencia de anticuerpos, si los hay, en el suero de un rece
ptor potencial que reaccionan con los linfocitos del donante especfico. En el tes

t de reactividad cruzada, el linfocito es la clula diana de eleccin, ya que expres

a altos niveles de molculas HLA y es fcil de aislar. Este test es probablemente la
contribucin ms importante de los laboratorios de tipificacin de tejido HLA al tras
plante renal. El propsito de la reactividad cruzada es prevenir el rechazo hipera
gudo y detectar anticuerpos que identifiquen fac-

944
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
lores de riesgo inmunolgico en pacientes que esperan un trasplante. La aparicin de
l rechazo hiperagudo se correlaciona significativamente con la reactividad cruza
da de la citotoxicidad directa dependiente del complemento positiva (CDC) entre
los linfocitos T del donante y el suero del receptor en el momento del trasplant
e. La reactividad del suero vlido actual del receptor a los linfocitos T del dona
nte es una contraindicacin para el trasplante de injerto renal. La deteccin de ant
icuerpos reactivos al donante en muestras anteriores de suero de receptores no e
s una contraindicacin pero puede representar un nesgo para la prdida del injerto d
istinto del rechazo hiperagudo inmediato (Cardella, 1982; Geddes. 1999). La reac
tividad cruzada especifica de donante tambin se utiliza en algunos centros para p
redecir el fallo del injerto de clulas progenitoras hematopoyticas (Hansen, 1997).
Los requerimientos u mtodos para la reactividad cruzada especifica de donante es
tn determinados en los estndar de la Sociedad Americana de Histocompatiblidad e In
munogentica (Tabla 40-1) y en el manual de tcnicas ASHI (2000). Las tcnicas aceptad
as hasta el momento incluyen el Amos modificado CDC, la extensin del tiempo de in
cubacin de la CDC. la CDC aumentada con antiglobulina y la citometria de flujo. Tc
nicas de deteccin de anticuerpos. Diferentes laboratorios pueden utilizar diferen
tes combinaciones de ensayos para detectar anticuerpos. El nivel de sensibilizac
in detectado variar con el ensayo. El anticuerpo especifico detectado variar con la
clula diana. Citotoxicidad directa dependiente del complemento (CDC). La CDC dir
ecta incluye todos los ensayos que utilizan la adicin de complemento para detecta
r la unin directa del anticuerpo con los linfocitos. La fijacin del complemento po
r los complejos anticuerpo-antigeno sobre la superficie de las clulas originar la
muerte celular o la citotoxicidad. Los mtodos de CDC incluyen la tcnica bsica (no h
ay periodo de lavado antes de aadir el complemento), la tcnica Amos modificada (et
apa de lavado aadida antes de la adicin del complemento) y tcnicas de aumento del t
iempo de incubacin La etapa de lavado elimina el suero que puede contener sustanc
ias que dificultan la activacin del complemento. Las ventajas de las tcnicas de CD
C directa son que son reproducibles y que la correlacin con la incidencia de rech
azo hiperagudo es excelente. Tcnicas de reactividad cruzada indirecta. Las tcnicas
indirectas incluyen la citotoxicidad aumentada con antiglobulina (AHG) y la cit
ometria de flujo. Ambas utilizan un reactante especifico para la inmunoglobulina
humana para aumentar la deteccin de anticuerpos dirigidos contra el HLA. Las tcni
cas indirectas detectan la presencia de anticuerpos especficos frente a antigenos
de reactividad cruzada (CREG) que frecuentemente no son detectados en los ensay
os CDC. Las ventajas del ensayo por citometria de flujo incluyen la discriminacin
de las subclases de clulas unidas a las inmunoglobulinas (IgG frente a IgM) y la
caracterizacin de la clula diana que se une al aloanlicuerpo (linfocito T frente
a linfocito B frente a monocito). Autoanticuerpos. Se sabe que la presencia de a
utoanticuerpos circulantes en el receptor es nociva. Por ello, debe llevarse a c
abo una autorreactividad cruzada, preferiblemente cuando el paciente se incluye
en la lista de espera del trasplante. Si estn presentes autoanticuerpos. el suero
utilizado para la reaccin cruzada con el donante debe tener la autorreactividad
eliminada. Los autoanticuerpos son primariamente IgM y los anticuerpos HLA especf
icos son primariamente IgG (Barger, 1989) Tanto la inactivacin con calor a 63 1 C o
la reduccin con los agentes qumicos ditioeritrtol (DTE) o ditiotreitol (DTT) de cu
alquiera de los anticuerpos IgM potencales se utiliza para diferenciar entre anti
cuerpos IgM e IgG en las muestras de suero. Si la muestra de suero inactivada co
n calor o tratada con DTT es negativa, aun cuando la muestra no tratada sea posi
tiva, la mayora de los centros seguirn adelante con el trasplante. Sin embargo, el
DTT o la inactivacin con calor deben emplearse con precaucin, ya que no todos los
anticuerpos HLA especficos son IgG y por ello, si no se controla correctamente,

ambas tcnicas pueden eliminar la actividad IgG y la IgM. Anticuerpos frente a las
clulas B. En algunos centros puede llevarse a cabo una reactividad cruzada utili
zando linfocitos B del donante (reactividad cruzada de clula B) en los pacientes
sensibilizados. Una prueba de reactividad cruzada positiva frente a clulas B espe
cficas del donante no es una contraindicacin para el trasplante. El significado cln
ico todava no se
ha resuelto, pero la prueba positiva puede ser un factor de riesgo, particularme
nte en pacientes que han sido trasplantados previamente. Los anticuerpos detecta
dos en la reactividad cruzada de clula B pueden ser (1) especficos de clase II, HL
A-DR. -DQ. (2) anticuerpos de baja especificidad para el HLA-A. -B. -C (las clula
s B tienen una alta densidad de molculas de clase l y son ms sensibles a los ensay
os dependientes del complemento que las clulas T). y/o (3) anticuerpos no especfic
os del HLA (p. ej., autoanticuerpos). Para interpretar una reactividad cruzada d
e clula B positiva, puede ser necesario juntar el suero del receptor con plaqueta
s antes de desarrollar la reactividad cruzada con el donante. (Las plaquetas exp
resan molculas de clase I pero no de clase II.) Las dos tcnicas de reactividad cru
zada de clula B utilizadas ms frecuentemente son el CDC y los ensayos de citometri
a de flujo. Seleccin de las muestras de suero del receptor para la reactividad cr
uzada con el donante. En pacientes con sensibilizacin no detectable (es decir. 0%
PRA). puede usarse la muestra de suero disponible ms reciente para la reactivida
d cruzada especifica de donante. Si el paciente tiene anticuerpos preexistentes
o ha tenido un acontecimiento sensibilizante reciente, debe recogerse una muestr
a de suero en el momento (Le., en las 48 horas antes del trasplante). En recepto
res sensibilizados, las muestras representativas, incluyendo la ms reactiva o mue
stra de suero "pico", son analizadas en muchos centros ya que una muestra positi
va de donante anterior puede ser considerada un factor de riesgo particularmente
en el paciente que rechaz precozmente un injerto anterior en el periodo postrasp
lante (Mahoney, 1996).
Trasplante renal
La prctica actual es seleccionar donantes para receptores que son ABO compatibles
, tienen reactividad cruzada especfica de donante de clulas T negativa con un suer
o receptor adecuado y la mejor concordancia HLA disponible. El hallazgo original
de que los injertos de rion entre hermanos HLA idnticos sobrevivan significativame
nte ms que los injertos transplantados entre hermanos HLA no emparentados o combi
naciones de hermanos-parientes se ha confirmado consistentemente. La Figura 40-1
2 muestra el anlisis ms reciente de supervivencia a cinco aos de aloinjertos renale
s del registro internacional CTS entre tres categoras de donantes: (1) hermano HL
A idntico, 84% de supervivencia; (2) pariente vivo con un haplotipo, 73% de super
vivencia; (3) todos de cadver. 66% de supervivencia. El impacto de la concordanci
a para el MHC en trasplantes de parientes vivos se observa claramente comparando
las categoras 1 y 2. Resultados similares se observan en la base de datos de la
UNOS (Cecka, 1999). Aunque los resultados de los anlisis sobre injertos de parien
tes vivos confirman el papel del MHC como la mayor barrera gentica en el xito del
resultado del injerto, la demostracin y la aceptacin de la influencia positiva de
la concordancia HLA en el resultado del injerto en los trasplantes de cadver no e
mparentados ha sido ms controvertida. Sin embargo, los datos de la supervivencia
a largo plazo de estudios multicntncos colectivos son consistentes a la hora de m
ostrar un efecto altamente significativo de la concordancia del HLA en la superv
ivencia del trasplante renal de cadver (Fig. 40-14) (Opelz. 1999; Cecka. 1999). Ms
an, dos estudios de centros independientes, uno de Europa (Oslo) y otro del nort
e de Amrica (Toronto) han informado de una mejora significativa en la supervivenc
ia del injerto como una funcin de la concordancia del HLA (Fig, 40-15) (Leivestad
, 1999: Geddes, 1999). Un centro aislado puede requerir la priorizacin basada en
la concordancia HLA para trasplantar a suficientes receptores con injertos bien
emparentados para mejorar la significacin estadstica en el resultado de los anlisis
. Aunque los nmeros son pequeos, se ha observado una influencia altamente signific
ativa de la concordancia del HLA en el resultado de los injertos de rion de donan
tes vivos no emparentados (Opelz, 1999). Los injertos con cero discordancias (0

MM) de donantes cadver sobreviven significativamente mejor y aproximadamente tan

bien como los injertos de hermanos HLA idnticos (Figs. 40-12 y 40-14): por ello,
la UNOS ordena compartir de 0 MM rones La supervivencia del injerto en pacientes t
ras los primeros trasplantes de rion disminuye proporcionalmente a medida que aum
enta el nmero de discordancias de 0 MM a 6 MM (Cecka, 1999; Opelz, 1999). Sin emb
argo, para asegurar la distribucin equitativa de

CAPITULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

945
rganos a lodos los receptores, incluyendo aquellos con haplotipos HLA raros, se h
an adoptado por los programas de distribucin de rganos nuevos algoritmos para la p
riorizacin de receptores en lista de espera (Opelz, 1999). Los resultados de los
datos ms recientes tanto de supervivencia de injerto como de paciente pueden vers
e a travs de pgina web de la CTS (Tabla 40-1). La concordancia del injerto inicial
no solo aumenta el tiempo de supervivencia del injerto, sino que disminuye la p
robabilidad de sensibilizacin del receptor y facilita el retrasplante. La acumula
cin de pacientes altamente sensibilizados en la lista de espera es un problema si
gnificativo en muchos centros, ya que los pacientes esperan durante largos perodo
s de tiempo y pueden presentar problemas clnicos de difcil tratamiento (Sanfilippo
, 1992).
Trasplante de rganos no renales
La supervivencias de los injertos de corazn, hgado, pulmn y pncreas es buena, con en
tre un 58% y un 67% de supervivencia de los primeros injertos en cinco aos (Fig.
40-16). Los donantes normalmente no tienen concordancia en el tipo de HLA. y no
se hace rutinariamente una reactividad cruzada pretrasplante con el donante. Se
recomiendan los controles de anticuerpos sricos para identificar el estado de sen
sibilizacin como un factor de riesgo inmunolgico para el receptor. Si es posible,
los receptores de injerto y los donantes cadveres de injertos vascularizados no r
enales deben ser clasificados para el HLA para permitir anlisis retrospectivos. L
os datos recientes de la CTS internacional no muestran el efecto de la concordan
cia HLA en el resultado del trasplante de hgado: sin embargo, los datos de la CTS
muestran un impacto significativo de la concordancia del HLA-A. -B y -DR en el
resultado de los primeros trasplantes de corazn (Opelz, 1999). El perodo aceptable
para la preservacin de la isquemia fra puede limitar la extensin de la posible con
cordancia HLA en el trasplante cardaco.
Figura 40-15. Supervivencia a c i n c o aos de injerto cadavrico c o m o una (uncin
del nmero de antigenos HLA discordantes. El anlisis Kaplan-Meier de la superviven
cia del injerto con respecto a los antigenos discordantes H L A no se m u e s t
r ap e r o fue estadsticamente significativo (p = 0,01). (De Geddes CC, Cole E. W
a d e J. y col: Factors influencing long-term primary cadaveric kidney transpla
ntation-importance of functional renal m a s s versus avoid-ance of a c u t e re
jections- t h eT o r o n t oH o s p i t a experience 1985-1997. En C e c k a M,
T e r a s a k i P [eds]:Clinical Trasplants 1998. Copyright U C L A Tissue Typin
g Laboratory. Los Angeles. CA. 1999. c o n permiso.)
Trasplante alognico de clulas progenituras hematopoyticas
El trasplante de clulas progenituras hematopoyticas alognicas se lleva a cabo en ne
oplasias malignas y trastornos hematolgicos, en el fallo de la medula sea, en cier
tos trastornos metablicos heredados, como las enfermedades de depsitos de lpidos. y
en el sndrome de inmunodeficiencia congnita. A partir de una histocompatibilidad
inicial, el mejor donante es o uno m i s m o (trasplante autlogo) si la neoplasia
maligna no implica a la mdula sea o si la
Figura 40-14. Electo combinado de las discordancias serolgicas para el HLA-A. HLA
-B y HLA-DR en la supervivencia de los primeros injertos de rion de cadver. (MM =
discordante). La asociacin de la concordancia con el resultado del injerto fue es
tadsticamente signilicativa (regresin p < 0. 0001). El anlisis fue restringido a lo
s trasplantes para los que se inform la divisin de especificidades HLA-A y H L A B
al centro de estudio para el receptor y el donante (De Opelz G. Wujciak T. Dohl

er B. y col: H L A compatibility and organ transplant survival. R e vI m m u n o

g e n e t 1999; 1:334. c o n permiso.)
Figura 40-16. Supervivencia a cinco aos del injerto de los primeros trasplantes p
ara el trasplante de rganos vascularizados en injertos de corazn, rion de cadver, hga
do, pncreas, pulmn y cardiopulmonar. (Del Collaborative Transplant Study, proporci
onado p o ryc o n permiso del Dr.Gerhardt Opelz y tratado en Opelz, 1999.)

946
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
enfermedad no es gentica, o un gemelo idntico (trasplante smgnico). Las clulas proge
nitoras de donantes hermanos HLA idnticos son una fuente frecuente. Estas clulas d
onantes normalmente sern genticamente idnticas a las del paciente a lo largo de tod
a la regin MHC. El empleo de un hermano donante tambin aumenta la probabilidad de
que los genes no HLA que pueden afectar el xito del trasplante y que no estn bien
definidos (i.e., genes de histocompatibihdad menor) sean concordantes (Goulmy. 1
997). Los miembros de una familia haploidnticos tambin pueden ser elegidos como do
nantes (Aversa, 1998), aunque hay un mayor riesgo de EICH severa que en los dona
ntes HLA no emparentados. Basndose en los datos del Registro Internacional de Tra
splantes de Mdula sea (IBMTR) (Tabla 40-1; www.ibmtr.org). se llevaron a cabo ms de
16.000 trasplantes alognicos de mdula osea desde 1996 hasta 1997: el 75% utilizar
on donantes emparentados. Muchos pacientes (-70%) no tienen hermanos HLA concord
antes y se puede considerar el trasplante con clulas de un HLA concordante, de do
nante no emparentado. Para facilitar la bsqueda de un donante concordante, se han
desarrollados registros nacionales de donantes no emparentados alrededor del mu
ndo (Hansen, 1996), El NMDP en los Estados Unidos es uno de estos registros y co
ntiene ms de 3,9 millones de donantes HLA tipados, siendo el mayor registro de do
nantes no emparentados del mundo (Perkins, 1994; vase Tabla 40-1; www.marrow.org)
. Aproximadamente, el NMDP ha facilitado 8.100 (en el ao 2000) trasplantes de don
antes no emparentados desde que el registro comenz en 1987. Los injertos de clulas
progenitoras hematopoyticas estn entre los ms difciles de todas las tcnicas clnicas
or varias razones (Madrigal. 1997; Hansen. 1997). Primero, en el momento del tra
splante, los receptores estn casi totalmente inmunodeficientes. ya sea debido a l
a deficiencia heredada (inmunodeficiencia combinada severa [IDCS]) o a causa del
acondicionamiento pretrasplante (quimioterapia citotxica y radiacin). El acondici
onamiento se requiere para eliminar las clulas malignas y para prevenir al sistem
a inmune del receptor del rechazo de las clulas progenitoras del donante que son
infundidas muchos das despus del acondicionamiento. La cantidad de pretratamiento
citotxico es suficiente para eliminar los leucocitos circulantes, casi eliminar l
as plaquetas, y abrogar la produccin de nuevos eritrocitos. Por ello, el receptor
es profundamente susceptible a todo tipo de infecciones y ciertamente morir si n
o se le rescata con cuidados mdicos extraordinarios y con translusin de clulas prog
enitoras. El segundo nesgo es el potencial del ataque inmunolgco del receptor por
las clulas progenitoras alognicas trasplantadas originando una EICH. La EICH tiene
muchas formas y puede ser letal. A pesar de las dificultades, algunos centros d
e trasplantes han obtenido un xito excepcional. Los recientes informes de institu
ciones determinadas y la IBMTR sugieren una supervivencia libre de leucemia del
40% al 60% a los cinco aos tras el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas
no emparentadas a pacientes con leucemia mieloide crnica en fase crnica (Tabla 40
-1, www.ibmtr.org) (Hansen. 1998). La supervivencia de los pacientes con anemia
aplsica severa trasplantados con clulas de donantes no emparentados vara de un 30%
a un 50% a los cinco aos dependiendo de la edad del paciente (vase Tabla 40-1, NMD
P en www.marrow.org y www.ibmtr.org) y se ha informado en algunos centros de ndic
es de supervivencia cercanos al 90% (Deeg. 1998). Adems de mdula como fuente de clu
las progenitoras hematopoyticas. la obtencin de clulas progenitoras hematopoyticas d
e sangre perifrica movilizadas con factor de crecimiento (Anderlini. 1997) o de cl
ulas progenitoras de sangre de cordn umbilical (Cairo, 1997) aumenta la disponibi
lidad de donantes no familiares. Las nuevas aproximaciones a la inmunosupresin. i
ncluyendo protocolos de acondicionamiento menos agresivos (p. ej., "minitrasplan
tes") (Storb, 1999). pueden aumentar la disponibilidad del trasplante de clulas p
rogenitoras como tcnica teraputica en pacientes actualmente excluidos por su edad
o por su disfuncin orgnica. El trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas pued

e usarse tambin para generar respuestas inmunes dirigidas contra las clulas tumora
les. La recada de la enfermedad tras el trasplante es mayor en pacientes que han
recibido un injerto HLA concordante, lo que sugiere que algn grado de discordanci
a puede ser beneficioso en la estimulacin de la respuesta inmune contra las clulas
tumorales (Beatty, 1993). A medida que se vayan resolviendo los problemas de es
ta tcnica tan difcil, el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas puede conv
ertirse en uno de los mtodos ms
ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades
(vase Cap. 33). Tipificacin HLA para el trasplante de clulas progenitoras. Muchos f
actores, incluyendo la histocompatibilidad. influyen en el resultado del traspla
nte de clulas progenitoras hematopoyticas (Madrigal. 1997). El trabajo pretrasplan
te incluye la tipificacin del HLA-A. -B y -DR de todos los miembros disponibles d
e los familiares ms cercanos para identificar un donante concordante relacionado
y para establecer la herencia de los haplolipos. Tambin puede ser apropiada la ti
pificacin basada en el ADN de los genes de dase II. que se ha convertido en un es
tndar, y la tipificacin basada en el ADN de los genes de clase I se ha incorporado
en muchos centros. La tipificacin de la familia completa, la tipificacin del nive
l allico (i.e.. alta resolucin) de los locus especficos HLA de clase I y II. la tip
ificacin de otros locus en el MHC (repeticiones en tndem cortas o locus complement
ario), o el empleo de otras pruebas (p. ej., reactividad cruzada: mediciones de
precursores de clulas T citotxicas) para medir la compatibilidad (Hurtey. 1999) ta
mbin puede ser adecuado. El nivel de resolucin de la tipificacin del HLA requerido
difiere para el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas y renal. Parece q
ue para el trasplante de clulas progenitoras se necesita una alta resolucin de tip
ificacin HLA. mayor de la que es necesana para el trasplante renal, debido a que
el trasplante de clulas progenitoras incluye la transferencia de un sistema inmun
e completo al paciente. Las investigaciones actuales se centran en definir los l
ocus que deben considerarse en la seleccin del donante, el nivel de resolucin que
debe emplearse para la concordancia, y el efecto aditivo de las mltiples discorda
ncias. El nivel de concordancia requerido puede variar en cada enfermedad o prot
ocolo. Las evidencias sugieren que la concordancia de un donante y un receptor n
o emparentados para los alelos HLA-A. -B y -DRB1 est relacionada con una mejora d
el resultado. El impacto de la concordancia en el otro locus HLA (p. ej.. HLA-C
y HLA-DQ) est bajo estudio. Las discordancias aisladas pueden ser toleradas; sin
embargo, las discordancias mltiples parecen tener un impacto negativo en el resul
tado (Sasazuki, 1998; Petersdorf, 1998,1995b: Madrigal, 1997; Hansen. 1997). Ade
ms, el efecto positivo de la concordancia de histocompatibilidad en el resultado
debe evaluarse por el impacto positivo del trasplante precoz en el curso de la e
nfermedad. Los datos de la IBMTR y de la NMDP muestran que la supervivencia tras
el trasplante est reducida a medida que avanzan las lases de la enfermedad (dalo
s en las pginas web sealadas en la Tabla 40-1).
RESUMEN
Las molculas HLA de clase I y clase II codificadas en el complejo mayor de histoc
ompatibilidad tienen un papel significativo en la especificidad y en el carcter d
e las respuestas inmunes. El extenso polimorfismo de estas molculas proporciona l
a diversidad necesaria para asegurar la supervivencia en un ambiente de patgenos
hostiles y adaptativos. Desgraciadamente, esta capacidad del sistema inmune de d
istinguir lo propio de lo extrao se extiende al reconocimiento de las molculas de
HLA extraas tras el trasplante tsular. La definicin y la caracterizacin de los alelo
s y las molculas del HLA se han combinado con los protocolos clnicos para maximiza
r la compatibilidad y minimizar el impacto de la respuesta inmune sobre el tejid
o extrao. Estos avances han contribuido al desarrollo del trasplante como una mod
alidad de tratamiento con xito en la sustitucin del tejido enfermo.
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CAP
4 1
Complejo mayor de histocompatibilidad y enfermedad
Julio C. Delgado, M.D. Edmond J. Yunis, M.D.
GENES EN LA REGIN NO-HLA O CLASE III Genes BF. C2y C4 Factor de necrosis tumoral
de linfotoxina y (y ) y genes 949 MTODOS DE DETECCIN DE LA ASOCIACIN O CORRELACIN DE
LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES GENTICOS Polimorfismo gentico Fuerza de la asoci
acin 952 952 953 954 955 Anlisis del modelo de herencia basado en parejas de herma
nos Anlisis del modelo de herencia basado en estudios de poblacin Mtodo de clculo de
probabilidades (Lod RESUMEN BIBLIOGRAFA Score Method) 964 961
959
Genes de la protena 70 del golpe de calor COMPLOTIPOS HAPLOTIPOS EXTENDIDOS TIPIF
ICACIN DEL COMPLEMENTO PAPEL DE LAS MOLCULAS MHC CLASE I Y CLASE II COMO GENES DE
RESPUESTA INMUNE ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC Enfermedades que incluyen herencia
mendeliana de defectos en genes de MHC Enfermedades de etiologa y patognesis desco
nocidas
Para comprender el papel del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las
respuestas inmunes y en la patognesis de la enfermedad se requiere la definicin de
polimorfismo en la Clase I y Clase II, y los genes en la regin central del MHC.
algunas veces llamada regin no-HLA o regin Clase III. Debe mencionarse desde el pr
incipio que existen regiones del ADN donde aparecen recombmaciones con ms frecuen
cia de lo esperado (esto es, en el intervalo de HLA-DR a HLA-DP). Pero tiene par
ticular importancia el hecho de que hay zonas del ADN, o ADN fijado, donde raram
ente se observan recombinaciones. Las dos mayores constelaciones son la regin del
complemento en la regin central, y HLA-DR. DO en la regin Clase II Adems, el anlisi
s de los haplotipos MHC en muchas poblaciones ha permitido reconocer que una pro
porcin considerable de individuos tienen haplotipos especficos del grupo familiar
que tienen un intervalo de HLA-B a HLA-DR. DQ idntico. Eslos haplotipos. llamados
haplotipos extendidos se deberan considerar c o m o unidades genticas fijadas que
. estudiadas junto con variantes MHC que no forman parte de estos haplotipos. si
rven para ayudar a comprender las respuestas inmunes y la asociacin con la enferm
edad. Las variantes de los genes clase I y clase II se describen en el Captulo 40
. Aqu se tratarn los genes y alelos de la regin no-HLA, haplotipos extendidos, asoc
iaciones con la enfermedad y los mtodos para detectar la asociacin de las enfermed
ades con los marcadores genticos.
contiene genes que codifican protenas de diversa funcin. Aunque las molculas clase
I y clase II se distinguen por parecidos estructurales y funcionales compartidos
con los miembros de cada clase, las molculas de clase III pueden definirse slo co
mo no-I y no-ll. porque sus genes y sus productos no tienen rasgos comunes y no
son reconocidos por las clulas T. Incluye genes que codifican las protenas del com
plemento C2 (C2). factor B {BF). C4 (C4A y C4S), el esteroide microsomal enzimtic
o P-450 21hidroxilasa (CYP21). las citocinas como lactor de necrosis tumoral (TN
F). linfotoxina- (LT ). linfotoxina . (LF- ). tres miembros de la mayor familia
de la protena 70 del golpe de calor (HSP70-1. -2, -Hom) y varios genes ms (Trowsda
le. 1995). Se ha analizado toda la regin clase III mediante electroforesis en gel
con campo pulstil o clonando cromosomas artificiales de levaduras y vectores csmi
dos (Dunham, 1987; Kendall, 1990; Ragoussis, 1991; Sargent, 1989; Spies. 1989).
Se piensa que esta es una de las regiones con ms genes del genoma humano, con apr
oximadamente un gen por 15 kb (Fig. 41-1). Se han secuenciado varios genes entre
los genes C4A y HLA-B Algunos de ellos se han llamado G, genes localizados en b
andas Giemsa-negativas (G1-G11) o BAT. trascripciones asociadas a HLA-B (BAT 1-9
) (Sargenl, 1989; Spies. 1989). Gf codifica el factor 1 inflamatorio de alomjert
o, y la transcripcin del intertern- (INF- ) (Utans. 1995) Los genes G6 a G7 codifi
can protenas putativas que pertenecen a la superfamiha Ly-6. que se sabe son impo

rtantes en la maduracin de los leucocitos (Ribas, 1999). El transcriptor-1 especfi

co de leucocitos representa el homlogo humano del transcriptor del ratn B144 y cod
ifica un transcriptor inducible de IFN- . que existe en los tejidos linfticos, clu
las T. macrlagos y lineas celulares histocitarias (Holzinger, 1995). IKBL codilic
a un miembro putativo de la familia
GENES EN LA REGIN NO-HLA O CLASE III
Existen alrededor de 1.100 kilobases (kb) de ADN entre la regin clase I y Clase I
I. generalmente llamada regin no-HLA o clase III. Esta regin

CAPTULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

951
de protenas ikB involucradas en la regulacin de la expresin de los genes de citocin
as (Albertella. 1994). La secuencia completa de 1C7 ha revelado que este gen cod
ifica un nuevo miembro putativo de la superfamilia Ig (Neville, 1999). RD. SK12W
, DOM3Zy RP1 son cuatro nuevos genes encontrados entre Bf y C4. Las protenas RD y
Ski2w pueden estar relacionadas a empalmes del ARN, renovacin del ARN y la regul
acin de la traduccin. Las funciones de Dom3z y RP1 estn siendo investigadas (Yu. 19
98). La regin entre los genes C4A y HLA-DR se ha estudiado con los mismos mtodos.
Se han identificado vanos genes, incluyendo NOTCH-4, G18. PBX-2 (G17), RAGE. G16
, G15, G14. G13 (Creb-rp). GI2y TNX, en un segmento de 160 kb del ADN centromrico
al gen C4A (Aguado, 1996). Alguno de ellos (G13-G15). expresa protenas involucra
das en el metabolismo lipidico (Aguado, 1998. 1999). Un par de genes, TNXA y TNX
B. organizados en la orientacin transcripcional opuesta a otros genes en esta agr
upacin, codifican protenas extracelulares similares a tenascina y restrictina, que
estn presentes en el sistema nervioso central y perifrico y en el msculo liso (Yan
g, 1999).
Genes BF, C2 y C4
Los C2 y C4 de la via clsica y el factor B de la va alternativa del complemento so
n codificados por una regin 120 kb del ADN genmico de unos 300 kb de HLA-DR y 650
kb de HLA-B (Carrol. 1984). C2 y BF muestran una semejanza considerable en la se
cuencia de aminocidos y comparten un nmero de caractersticas fsico-qumicas y funciona
les, lo que sugiere que ambos genes surgieron por duplicacin en tndem de un gen an
cestral similar al factor B. Ambos son sern-proteasas (de la familia SERPIN de pr
otenas del plasma) y median la escisin de C3 durante la activacin de las respectiva
s rutas. C4, por otra parte, est relacionada estructural y funcionalmente con C3
y C5 y como contiene un tiolster interno muy reactivo, se relaciona con C3 y el i
nhibidor de la proteasa -macroglobulina. Aunque el gen para C3 est ligado ligeram
ente al MHC en el ratn, en el hombre est en un cromosoma completamente diferente.
Junto a 3' en cada locus C4 hay dos locus para el enzima adrenocorticoideo 21-hi
droxilasa (CYP21A y CYPB). (Carroll, 1985: Higashi. 1986: White. 1986). Los dos
genes tienen aproximadamente 3.4 kb de longitud y se dividen en 10 exones. En ci
erto modo son homlogos, pero tres mutaciones causan una terminacin prematura de la
transcripcin del gen CYP21A. convinindolo en unseudogen (White. 1988).

Hay un alelo no expresado (C2'QO) que se encuentra en el 2% de la poblacin caucsic

a europea. C4 se sintetiza como un nico gran polipptido de unos 200 kDa que sufre
un proceso postsinttico que incluye la prolelisis de una estructura de tres cadena
s unidas por enlace disulfuro. La cadena ms larga, de unos 87 kDa. es la cadena a
y transporta el tiolster interno. Durante la activacin de la va clsica del sistema
de complemento. Cls activado escinde un pequeo pptido con propiedades de analiloto
xina por el extremo a m m o de la cadena (/. C4. Hay dos locus distintos C4A y C
4B que codifican dos formas de C4. C4A y C4B se diferencian slo por cuatro residu
os aminocidos en la cadena a. entre las posiciones 1101 y 1106. Asombrosamente, C
4A acetila preferentemente grupos ammo, mientras que C4B acetila preferentemente
grupos hidroxilo. As, C4B es hemolticamente ms activo, pero C4A es ms activo que C4
B inhibiendo la formacin y disolviendo inmunocomplejos. Las variantes de C4 gener
almente transportan determinantes antignicos Rodgers (un epitopo Val-Asp-Leu-Leu
de la cadena C4A), y variantes de C4B transportan determinantes Chido (un epitop
o Ala-AspLeu-Arg de la cadena o. de C4B). Hay un polimorfismo gentico amplio, det
ectable por electroforesis de gel de agarosa en protenas C4A y C4B en todas las p
oblaciones examinadas (Awdeh, 1980). Se han reconocido al menos 18 alelos C4A. 2

1 alelos C4B y un gen no expresado (C4'Q0) de cada locus C4 (Mauff.1990). Se han

identificado producios genticos aberrantes o hbridos con caractersticas en parte C
4Ay en parte C4B Ms sorprendente es la variacin en el nmero de genes C4 en algn hapl
otipo individual. Aunque es ms habitual tener un C4A expresado y un C4B expresado
, la homoduplicacin y la heteroduplicacin son habituales, como son los haplotipos
con un solo gen C4 expresado. C4A'3y C4B'1 son los alelos ms comunes en casi toda
s las poblaciones. C4A'4. C4A'2. C4B'2y C4B'5 muestran una distribucin universal.
C4A'6 tambin se observa en muchas poblaciones excepto en algunos grupos mongoloi
des. C4B'3 se identifica principalmente en grupos caucsicos y africanos.
Factor de necrosis tumoral a (y |5) y genes de linfotoxina a y p
Los genes TNF y LTA o TNFB codifican potentes citocinas inmunomoduladoras que so
n producidas en respuesta a varios estmulos inflamatorios. El TNF-rx se produce e
n una variedad de clulas hematopoyticas y no hematopoyticas, y LT-a especficamente p
or linfocitos (Carroll. 1987). TNFo. y LT-a forman trmeros biolgicamente activos y
ambos se unen a los mismos receptores de 55 kDa y 75 kDa (Bazzoni. 1995).TNF-</
y TNFjj son codificados cada uno por genes separados y comparten aproximadament
e el 34% de la identidad de aminocidos (Carrol. 1987). Los genes que codifican TN
F y LTA estn localizados en una regin 7kb centromrica 250 kb del gen para HLA-B y t
elomrica 355 del gen para C2. TNF-a y LTa se mantienen como molculas de superficie
de las clulas o son liberadas de las clulas. LT-a se retiene en la superficie de
la clula por una regin transmembrana. La superficie TNF-a no resulta de la presenc
ia de una regin transmembrana sino ms bien de una membrana glicoproteica de 33 kDa
conocida como linfotoxina-p" (LT-(i) (Browning, 1993). L T j s " tiene un 21% y
24% de identidad con TNF y LT-a. respectivamente El gen para LTB contiene cuatr
o exones, giros de 2 kb y est localizado entre los genes TNF y LST1. Hasta la fec
ha, se han identificado nueve polimorfismos en los iniciadores TNF-a, localizado
s en los nucletidos -1031,-863, -857, -575. -376, 308. -244. -238 y +70 relaciona
dos con el lugar del comienzo de la transcripcin (Brinkman. 1994,1995: D'Alfonso,
1994: Hamann. 1995: Higuchi. 1998: Uglialoro, 1998; Wilson. 1992: Zimmerman, 19
96). Dos endonucleasas, EcoRI y Ncol, han mostrado modelos polimrficos con el gen
LTA (Messer, 1991; Partanen. 1998). La secuencia polimrfica para el enzima EcoRI
est localizada en el exn 4. mientras que la secuencia para Ncol se ha localizado
en el primer intrn del gen LTA. Se han identificado las secuencias de ADN que con
stan de longitudes variables de repeticiones TC.'GA o AC'GT o microsatlites dentr
o de la regin de los genes TNF usando secuenciacin con gel de poliacrilamida. (Ned
ospasov, 1991) H a y
El factor B es sintetizado por el gen BF. Durante la activacin de la va alterna de
l sistema de complemento, la proteina se escinde en un fragmento aminoterminal B
a de 30 kDa y un fragmento Bb de 60 kDa. Mediante electroforesis con gel de agar
osa. la protena muestra un moderado polimorfismo con dos alelos muy comunes, BF'F
(rpido) y BF'S (lento), dos alelos menos comunes, BF'F1 (ms rpido) y BF'S. tambin ll
amado BF'S07. (ms lento), y un husped de alelos raros. Con electroforesis, BF'F pu
ede subdividirse en dos subtipos, BF'FA y BF'FB. BF'FB tiene dos variantes, FB1
y FB2. Hay variantes de BF'S. llamados SSf, 2y 3. La sustitucin del aminocido resp
onsable de las variantes comunes de BF'FA. BF'FB y BF'S viene determinado por lo
s residuos encontrados en el Iragmento Ba. mientras que los de BF'F1 y BF'S estn l
ocalizados en el fragmento Bb. En las poblaciones caucsicas europeas, BF'F tiene
una frecuencia de 0,2, BF'S 0,77. SF'Ff 0,01. BF'S 0,01, y un recuento de alelos
raros slo un 0,002. BF'S es el ms comn en las poblaciones caucsicas, mongoloides y a
ustraloides, mientras que BF'F es la ms comn en las poblaciones negroides. BF'F1 s
e observa en grupos africanos asi como en algunas poblaciones caucsicas. El gen C
2 tiene 18 kb de longitud. Durante la activacin de la va alterna del sistema de co
mplemento, la proteina se escinde en los aminocidos 223 y 224, un enlace arginina
-lisina, en dos fragmentos. C2a y C2b. C2a es hemolticamente activa. A nivel prot
eico, C2 muestra por electroforesis un polimorfismo menor. Los alelos son C (comn
), un alelo 6 (bsico) menos comn con tres variantes bsicas raras y cuatro variantes
A (acidcas) raras. La localizacin polimrfica para el alelo C2'B es transportada po
r el fragmento C2A. C2'C supone ms del 95% de los genes C2 en la mayoria de las p

oblaciones. C2'B supone del 3% al 4% de los genes C2.

952
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
cinco microsatlites: los microsatlites TNFa y TNFb estn localizados en la regin telo
mrica 3.5 kb al gen TNFB y se han identificado 7 y 13 alelos, respectivamente. El
microsatelite TNFc est localizado en el intrn 1 del gen TNFB y tiene dos alelos.
TNFdy TNFe, que tienen siete y tres alelos, respectivamente (Jongeenel. 1991).
HAPLOTIPOS EXTENDIDOS
Del estudio de la distribucin de los complotipos segn las especificidades HLA-B y
HLA-DR en haplotipos normales caucsicos determinados por estudios de familias, se
hizo evidente que existia un notable desequilibrio de ligamiento que afectaba a
toda la regin. Se poda fcilmente reconocer el HLAB. complotipo, grupos de alelos D
R que mostraban tres puntos de desequilibrio de ligamiento estadsticamente signif
icativos (Fig. 41-2) y que definan los que se denominan haplotipos extendidos (Aw
deh. 1983). Estos haplotipos extendidos, que suponen al menos un 30% de los hapl
otipos normales caucsicos, tienen una estructura voluminosa y una secuencia de AD
N relativamente fija y transportan alelos si no idnticos, muy parecidos, incluso
cuando se encuentran en individuos sin relacin aparente. Otro rasgo importante de
los haplotipos extendidos es su asociacin con ciertos grupos raciales. En su may
ora, son muy caractersticos de un subgrupo tnico y tienen frecuencias ms bajas o no
existen en absoluto en otros grupos tnicos. Tienen presumiblemente su origen en e
l grupo donde su frecuencia como haplotipos intactos es la ms alta. Hay ms de una
docena de haplotipos extendidos comunes en los caucsicos (Alper. 1992). Se han de
scrito diferentes haplotipos extendidos para diferentes razas (p. ej. afroameric
anos) (Fraser, 1990). Estudios iniciales definieron los haplotipos extendidos co
mo el intervalo entre HLA-B y DR. Entonces se observ que otros alelos del MHC no
caracterizados en el intervalo probablemente estaban incluidos. Al contrario, a
pesar de que los alelos HLA-A han mostrado una variacin limitada para los haploti
pos extendidos, slo la mitad de estos haplotipos muestran asociaciones nicas signi
ficativas de alelos HLA-A (Alper. 1982). El gen HLA-Olue el ltimo en ser determin
ado. Segn la distancia gentica y los datos de identificacin previamente incompletos
de los pares HLA-B/Cw. era evidente que los haplotipos conservados tambin inclui
ran la regin gentica HLA-Cvt. Recientemente, se han asociado diferentes alelos HLACw con diferentes haplotipos extendidos (Tabla 41-2) (Clavijo, 1998). El autor h
a desarrollado el concepto de que los haplotipos extendidos poseen una fijacin al
ADN al menos en el intervalo HLA-B/DR y. por lo tanto, si transportan un gen de
susceptibilidad para una enfermedad, implcitamente todos los eiemplos independie
ntes de ese haplotipo mostrarn asociacin con esa enfermedad. Y al contrario, si el
haplotipo extendido no tiene un gen de susceptibilidad para una enfermedad, ent
onces l y los alelos que lo constituyen protegern frente a la enfermedad. Es esenc
ial conocer la distribucin tnica de un haplotipo extendido para evaluar si el hapl
otipo extendido en pacientes est aumentado comparado con una poblacin control tnica
mente equivalente o es realmente de hecho un marcador para la distribucin tnica de
la enfermedad.
Genes de la protena 70 del golpe de calor
Las protenas de estrs o protenas de goipe de calor se expresan en respuesta a una v
ariedad de estmulos de estrs a las clulas. Esta respuesta se ha observado en todas
las especies examinadas hasta la fecha. La familia de las protenas de estrs de 70
kDa tiene una alta identidad de secuencia de aminocidos desde los primitivos euca
notas hasta los humanos. Varios estudios han demostrado el locus para la protena
70 del golpe de calor (HSP70) en los cromosomas 6. 14, 21 y al menos en otro cro
mosoma autosmico (Hunt. 1985: Sargent, 1989). Tres genes que codifican a los miem
bros de la familia HSP70 estn localizados en la telomrica 92 kb al locus C2 {HSP70

1, HSP70-2 y HSP70- Hom). Los anlisis secuenciales de genes HSP70-1 y -2 han most
rado que hay genes carentes de intrn que codifican un compuesto proteico idntico d
e 641 aminocidos. HSP70-Hom tambin es un gen carente de intrn que codifica una prot
eina de 641 aminocidos y tiene un 90% de identidad de secuencia con HSP70-1 (Miln
er. 1990). Debido al alto grado de similitud de secuencias entre las regiones co
dificadoras de los genes HSP70. las sondas de ADN que corresponden a las regione
s codificadoras tienden a la hibridacin cruzada. Sin embargo, hay suficiente dife
rencia de secuencias entre las regiones no traducidas 5' y 3' del HSP70-1. -2 y
-Hom para designar cebadores de oligonucletido y sondas que permitan la ampliacin
especfica e hibridacin de los tres genes (Milner. 1992). Se han detectado tres sus
tituciones de nucletidos en las regiones 5' flanqueadoras y no traducidas de HSP7
0-1: una transversin A-*C en la posicin -110, una transicin T-C en la posicin +120, y
una transversin G->C en la posicin +190. Se ha demostrado que variaciones en la p
osicin -110 y +120 influyen en la movilidad en la electroforesis en gel de polacri
lamida. Se han reconocido tres formas allicas: HSP70-1 A (lenta), 8 (rpida) y C (i
ntermedia). Las sondas de oligonucletidos que contienen variaciones de secuencia
en la posicin -110 y +120 pueden tambin detectar los tres alelos. despus de una rea
ccin de ampliacin en cadena de la polimerasa especfica (PCR) del gen HSP70-1. En HP
S70-2. una transicin G->A en la posicin 1267 provoca la prdida de un lugar de restr
iccin Psl-I. La hibridacin de ADN digerido genmico Psl-I con una sonda HSP70 provoc
a un fragmento polimrfico de ADN. de 8,5 kb o 9 kb de longitud. En el gen HSP70-H
om. hay una transicin T~*C en la posicin 2437 que se encuentra dentro de un lugar
de restriccin Nco-I y produce dos fragmentos allicos de 1.5 kb y 0,5 kb, respectiv
amente.
COMPLOTIPOS
Tabla 41-1 En humanos, los genes C2 y BF estn muy cercanos el uno al otro, separa
dos por menos de 2 kb. pero BF y C4A estn separados por unos 30 kb. C4A y C4B estn
separados por unos 10 kb. Los cuatro genes complementarios muestran un notable
desequilibrio de ligamiento en haplotipos determinados por estudios de familias.
Es decir, aparecen en poblaciones juntas como grupos y en el mismo cromosoma co
n ms frecuencia de la esperada a la de sus alelos individuales ms o menos de la mi
sma manera que los alelos en los sistemas de grupos sanguneos Rh y MNS. No se han
documentado recombinaciones entre los genes complementarios. Por estas razones,
se consideran de forma correcta como unidades genticas nicas, o complotipos. arbi
trariamente designados por sus alelos BF. C2. C4A y C4B. Asi, BFS. C2'C. C4A'00.
C4B 1 es un complotipo que en forma abreviada es SC01. Hay ms de una docena de c
omplotipos en caucsicos que tienen frecuencias de casi un 0,01 o ms (Tabla 41-1).
El complotipo SC31 es el ms comn en la mayora de las poblaciones. En las poblacione
s negroides, FC31 es comn, como lo es SC42 en los mongoloides asiticos.

Complotipos comunes e n cromosomas normales d e poblaciones caucasoides* Complot

ipo Frecuencia
SC31 0,43 SC01 FC31 0.096 SC30 0.053 SC42 0,04 SC61 0.034 FC30 0,031 FC01 0.029
SC02 0.029 SC21 0.022 SB42 0.019 SC33 0,014 SC2(1, 2)0.013 SC32 0.011 "Los compl
otipos so dan c o m o letras abreviad is y nmeros, con cuatro alelos en orden arb
itrario: BF. C2. C4A. C4B - El locus C4B esta heleroduplicado

CAPTULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

953
Figura 41-2. La distribucin de haplotipo de los complotipos (haplotipos de los al
elos complementarios) SC01 {BF'S. C2'C. C4A'00. C4B'1) y SC21 (BF'S. C2'C. C4A'2
. C4B'/)en relacin con los alelos HLA-B en ordenadas y los alelos HLA-DR en abcis
as. Las alturas y anchuras que representan cada especificidad H L A son proporci
onales a las frecuencias de los alelos para las respectivas poblaciones. L o s r
acimos representan los desequilibrios de ligamiento y los crculos los haplotipos
extendidos (HLA-B16(38). SC21. DR4) en los judos asquenazies y [HLA-B8. SC01. DR3
) en los ingleses y. con un alcance m u c h o menor, en los judos. (De Alper CA.
A w d e h Z. Yunis EJ: Conserved. extended M H C haplotypes. Exp Clin lmmunogen1
992; 9:58; con permiso de S. Karger)
TIPIFICACIN DEL COMPLEMENTO
El sistema complemento est dividido en dos vas: la va clsica que contiene nueve dife
rentes componentes totalizando al menos 12 protenas, y la va alterna que contiene
cuatro. Tres de las 16 protenas estn codificadas dentro del MHC y manifiestan vari
antes estructurales heredadas que pueden estudiarse por tcnicas que detectan dife
rencias en la carga superficial neta debidas a diferencias en los aminocidos. Se
utilizan dos mtodos para separar las protenas (1) electroforesis en gel de agarosa
de alto voltaje para detectar variaciones de movilidad entre protenas a un pH de
terminado y (2) electroforesis en geles de poliacrilamida de capa fina, que demu
estra diferencias en puntos isoelctricos. Las protenas pueden observarse por electroforesis de inmunofijacin usando la insolubilidad de los complejo
s antgeno-anticuerpo o por la deteccin de actividad hemoltica funcional con geles s
obrepuestos donde los hemates de oveja sensibilizados con anticuerpos se combinan
con suero deficiente en complemento (Awdeh. 1983) (vase Cap. 38). Las protenas de
la va clsica |C2. C4A y C4B) y una de la va alterna (BF) estn codificadas dentro de
l MHC. son polimrficas. y por lo tanto tiles para la misin de los haplotipos del MH
C. Para la tipificacin de C2. las protenas se separan por electroforesis en gel de
poliacrilamida y se visualizan por hemolisis C2-inducida en geles superpuestos.
El suero humano normal diluido puede reemplazar el suero deficiente en C2 como
un reactivo porque C2 es el factor limitante en la va clsica (Fig. 41-3). La tipif
icacin de C4 requiere tres tcnicas diferentes: 1. Electroforesis de inmunofijacin t
ras el tratamiento con neuramimdasa. Los patrones producidos muestran tres banda
s para cada variante con alguna coincidencia entre ciertas variantes. Un tratami
ento adicional de la muestra con carboxipeptidasa reduce cada variante a una sol
a banda. 2. Deteccin de C4A frente a C4B mediante un ensayo funcional hemolitico.
Este mtodo distingue C4A o patrones sobrepuestos de C4B porque las variantes de
C4B tienen de 5 a 10 veces la actividad hemoltica de las variantes de C4A. 3. Rea
ctividad serolgica Rodgers (C4A) o Chido (C4B). El suero se incuba bien con antiRodgers humanos o con anti-Chido humanos para probar la inhibicin de la aglutinac
in con eritrocitos positivos apropiados.
Tabla 41 -2 Distribucin d e l alelo HLA-Cw e n relacin c o n haplotipos extendidos
c o m u n e s * Haplotipo extendido [HIA-R8. SCOI. DR3 HLA-B7. SC31. DR2 [HLA- B44
. FC31. DR7] [HLA-B44. SC30. DR4] (HLA-B57, SC6I. DR7 [HLA-B14. SC22. DR1] [HLA-B
35. SC31. DR5] HLA-B38, SC21. DR4] HLA-B 15. SC33. DR4) [HLA-B 18. F1C30. DR3I [HL
A-B 18. S042. DR2]' [HLA-B42. FC(1.90) 0. DR3f Alelo HLA-Cw 0701 0702 1601 0501
0602 0802 0401 1203 0304 0501 1203 1701
'Dalos Oe cromosomas de poblacin normal caucasoide de Boston. Datos de pacientes c
on deficiencia de C2 De Clavijo OP. Delgado JC. Awdeh ZL. y col: Tissue Antigens

1998. 52 282 Datos de cromosomas de poblacin normal negra que vive en Boston De
ClaV I J O OP, Delgado JC. Yu N. y col Tissue Antigens 1999: 54 303
:
Alternativamente, las variantes de C4 pueden tipificarse por reactividad Chido o
Rodgers mediante inmunotransferencia. Hay dos formas de detectar alelos nulos d
e heterocigotos C4. La electroforesis de muestras de C4 nulos (C4AVO y C4B'QO) d
emuestra ausencia de bandas en homocigotos pero en heterocigotos requiere la cua
ntificacin por inspeccin visual, por inmunoelectroforesis cruzada o por barrido de
nsitomtnco de los patrones de inmunofijacin. Un mtodo alternativo consiste en deter
minar la presencia y las relaciones de las cadenas (/ de C4A y C4B tras la elect
roforesis de inmunoprecipitados en gel de poliacrilamida en dodecil sulfato sdico
.

954
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
Hl
1 ) 2 B3 B4 5
B6 1 ) 7
Al
A7 A2 A3 A4 A3
A6
C4
Figura 41-3. Posiciones electrolorticas de vanantes de C4 relacionadas unas con o
tras (diagrama) Las variantes del locus C4B (Chido) se muestran a la izquierda,
y las del locus C 4 A (Rodgers) se muestran a la derecha Cada gen consta de tres
Bandas. Se observar que alguna de las variantes de C4B corresponden exactamente
a la posicin de las variantes de C4A (B7 y A2. p o r ejemplo) La distincin entre e
llas se hace mediante un gel de agarosa superpuesto sensible a C 4 donde slo las
variantes d e C4B tienen una actividad hemoltica activa C4 (Awdeh, 1980). El BQOy
AQO (alelos nulos) no muestran bandas. En la posicin ms baja (lado izquierdo) de
la figura, se muestran ejemplos del tipo comn C2 (C) y un heteroogoto (BC) median
te electroloresis en gel de poliacrilamida con gel de agarosa superpuesto, conte
niendo hemates de oveja sensibilizados con anticuerpos y una dilucin 1/90 de suero
h u m a n o normal. En la porcin ms baja (lado derecho) de la figura, se m u e s
t r a n ejemplos d e patrones electrolorticos de vanantes BF tras eleclroforesis
con gel de agarosa e inmunofi|acin con antisueros anti-lactor B Cada gen consta d
e una banda m a y o r y otras dos menores. El nodo estaba a la derecha.
La tipificacin del factor B se realiza despus de una electroforesis prolongada en
gel de agarosa e inmunofi|acin. Los modelos homocigticos constan de una banda mayo
r y unas bandas menores rodeando, y los patrones heterocigticos son la suma de do
s patrones homocigticos.
PAPEL DE LAS MOLCULAS MHC CLASE I Y CLASE II COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE
Los genes que controlan la respuesta inmune a antgenos extraos fueron descritos in
icialmente en modelos animales. Se demostr que estaban localizados dentro de la r
egin de la clase II del MHC. Se ha demostrado que las clulas presentadoras de anti
genos (APC) procesan fragmentos de antgeno y presentan a estos pptdos como complejo
s con las molculas clase I y clase II, inicindose as la respuesta inmune. En los lti
mos aos, se han producido avances significativos en la comprensin de la base molec
ular de la presentacin del antgeno MHC, bsicamente como resultado de la determinacin
de la estructura tridimensional de
las molculas de clase I (Bjorkman. 1987). y clase II (Brown. 1993). y la caracter
izacin de la unin de los pptdos a las molculas MHC (Jardetzky, 1991; Stem. 1994). La
estructura cristalina del pptido ligado a las molculas Clase II ha demostrado que
las cadenas laterales del pptido estn localizadas en pequeas cavidades, llamadas bo
lsillos, en el lugar de unin. Estos bolsillos varan de acuerdo a los aminocidos cod
ificados por cada alelo HLA. Las mutaciones puntuales en los genes clase II son
criticas para la unin del pptido y la presentacin y ocurre normalmente dentro o cer

ca de los bolsillos de unin al pptido. As, la diferenciacin de los alelos HLA es cru
cial para la interpretacin de HLA y asociaciones con la enfermedad. Los mtodos par
a la caracterizacin de los alelos clase I y clase II se han descrito en el Captulo
40. Parece que algunos bolsillos juegan un papel en algunas enfermedades. Por e
jemplo, ciertos alelos que codifican el bolsillo de unin al pptido. P4 o la cadena
DRp\ estn asociados con artritis reumatoide (Hammer. 1995) y lepra tuberculoide
(Zerva. 1996), mientras que otras que codifican el bolsillo P9 o la cadena DQ|i
estn relacionadas con la tuberculosis clnica (Goldfeld, 1998), pnfigo vulgar (Delga
do, 1997) y proteccin frente a diabetes insulino-dependiente (Todd, 1987).

CAPTULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD

955
ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC
Hay un nmero notable de enfermedades que muestran asociacin con HLA. La mayora, aun
que no todas, son autoinmunes y no muestran una herencia mendeliana bien definid
a. El gran nmero de enfermedades asociadas con HLA se debe al hecho de que el MHC
contiene muchos genes importantes y porque los genes de la regin, incluso los ge
nes no-HLA, son extraordinariamente polimrficos. En una regin donde la densidad de
genes se muestra anormalmente alta, esto provoca un gran nmero de genes de poten
cial susceptibilidad. Un problema importante con los genes de susceptibilidad de
MHC es su penetrancia incompleta, haciendo muy difcil, sino imposible, la segreg
acin formal habitual y los estudios de ligamiento. Adems parece probable que mucha
s enfermedades asociadas a MHC sean polignicas. Debido a estos problemas, el auto
r comenzar su exposicin con las alteraciones determinadas por MHC que muestran her
encia mendeliana y un 100% de penetrancia, al menos para el defecto bioqumico pri
mario.
y otras mutaciones que producen fallos en la transcripcin (Braun, 1990; Lokki, 19
99). El alelo C4A'O0. particularmente en individuos homocigticos o en aquellos co
n deficiencia completa de C4, se ha asociado con lupus eritematoso discoide y si
stmico (Dunckley, 1987; Nousari, 1999). Esta susceptibilidad probablemente se rel
aciona tambin con un manejo defectuoso de inmunocomplejos, como en la deficiencia
de C2 y otras deficiencias del primer componente del complemento (Fielder, 1983
). Los homocigticos C4B'Q0se han asociado con nefropatia de inmunoglobulina A (Ig
A). Adems, hay una incidencia 3.5 veces mayor de homocigticos C4B'Q0 en nios con me
ningitis bacteriana (Colten, 1992). El nivel de C4 en suero en pacientes con ale
los C4 nulos es extremadamente variable y no puede utilizarse con fiabilidad par
a detectar heterocigotos para una deficiencia completa, incluso aunque haya una
correlacin aproximada entre el nivel de C4 y el nmero de genes C4 expresados.
Hiperplasia suprarrenal congnita por deficiencia de 21-Hidroxilasa
Esta alteracin es clnicamente heterognea, con una forma grave con deplecin salina, u
na forma ms leve tarda manifestada en gran parte por masculinizacin en las chicas,
y una forma leve oculta. El vnculo con el MHC de esta alteracin le descubierto ante
s de que tuese detectada ninguna asociacin de MHC y antes de que se supiera que l
os locus CYP21 estaban localizados en el MHC. Posteriormente se encontr que en lo
s caucsicos europeos estudiados en el noreste de Estados Unidos y en Inglaterra,
el 20% o ms de los haplotipos en los pacientes con la forma con deplecin de sales
tenan el haplotipo extendido raro [HLA-A1. Cw6, B47, FC (91)0. DRB1 '07. DRB4'010
1. DQAV0201. DQBV0201] (Fleischnick, 1983). Se ha demostrado que este haplotipo
tiene una delecin tanto de C4B como de CYP21B. explicndose asi la gravedad de los
sntomas y la deficiencia completa del enzima en homocigotos para este haplotipo.
Entre los pacientes con la enfermedad ms leve y oculta, es comn un haplotipo exten
dido diferente; [HLA-B65. SC2(1.2>, DR1] (Sinnot, 1991). Este haplotipo es comn,
particularmente en el sur de Europa, y tiene una frecuencia en caucsicos de Bosto
n por encima de 0,01. En todas las formas de deficiencia de 21-hidroxilasa, la m
ayora de haplotipos de MHC no estn extendidos y hay una gran variedad de complotip
os, lo que sugiere que muchas mutaciones independientes han provocado una delecin
o una alteracin del gen CYP21B. De estas observaciones, se pueden extraer alguno
s principios generales para la posible aplicacin a estas enfermedades de herencia
y patognesis desconocidas que presentan asociacin o ligamiento con MHC. Primero,
si un gen de susceptibilidad para una enfermedad se produce en un haplotipo exte
ndido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarn asociaciones positivas con la e
nfermedad. Y al contrario, si esto no ocurre en un haplotipo extendido, todos lo

s alelos de ese haplotipo mostrarn una asociacin negativa con la enfermedad. Como
los haplotipos extendidos tienen fijacin al ADN en eiemplos independientes de hap
lotipo extendido asociado a enfermedad, y son comunes, las personas sanas deben
transportar genes de susceptibilidad. Todos los marcadores de enfermedad de MHC,
y particularmente los haplotipos extendidos, muestran un alto grado de especifi
cidad en la poblacin, Es por tanto particularmente importante en estudios de marc
adores de MHC para la enfermedad comparar alelos de enfermedad y haplotipos (los
de pacientes) con aquellos controles cuidadosamente emparejados tnicamente. Idea
lmente, el apareamiento tnico debera incluir regiones especficas de origen o subgru
pos tnicos.
Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de defectos en genes de MHC
Las variaciones frecuentes de los componentes del complemento humano y la cantid
ad de genes, junto al amplio polimorfismo de las protenas, hace que los genes de
complemento sean excelentes marcadores de asociaciones de enfermedad con el comp
lejo de histocompatibilidad (Yang, 1999).
Deficiencia de C2
La deficiencia del segundo componente del complemento se ha descrito slo en caucsi
cos y es el estado deficitario de protena del complemento ms comn en esa poblacin. A
proximadamente la mitad de los pacientes son asintomticos. Sin embargo, la defici
encia de C2 se ha asociado con polimiositis, infecciones piognicas recurrentes, pr
pura Henoch-Schnlein y vasculitis. El cuarenta por ciento de los casos descritos
tienen una enfermedad sistmica tipo lupus; sin embargo, slo el 16% de los hermanos
homocigticos deficientes en C2 han tenido alteraciones tipo lupus. Esto aconseja
con firmeza la investigacin de errores sistemticos. No obstante, existe una clara
tendencia aumentada de los sujetos homocigticos deficientes en C2 a tener altera
ciones tipo lupus, quiz relacionado con una depuracin o desagregacin defectuosas de
los inmunocomplejos. La deficiencia de C2 tipo I resulta de la homocigosidad de
l alelo nulo. C2"QO, que tiene una frecuencia de gen de un poco menos de 0,01. H
ay aproximadamente 1 homocigoto por cada 10.000 individuos. Casi todos los pacie
ntes tienen elementos de un haplotipo extendido [HLA-A25. Cw'1203, B18. S042. DR
BV1501. DQBI'0601. DQAV0102] que contiene un gen de deficiencia en C2 (Awdeh, 19
80; Clavijo, 1998; Truedsson, 1993). Las asociaciones de complotipo son ms frecue
ntes, seguidas por las asociaciones del DR, HLA-B, HLA-CW y HLA-A, de acuerdo co
n el orden de gen conocido. C2"Q0 resulta de la delecin de un gen de 28 pb que ge
nera un marco de lectura y un codn finalizador de 14 pb distal al final del exn 5.
La deficiencia de C2 tipo II (no asociada con ningn elemento de los haplotipos t
ipo I) es muy rara y produce un bloqueo selectivo de la secrecin de C2. El motivo
del bloqueo de esta secrecin no se conoce (Colten, 1992; Zhu, 1998).
Deficiencia de C4
Hay una alta incidencia de alelos nulos C4 en la poblacin general. El treinta y c
inco por ciento de individuos de todas las razas no expresan un gen C4A o C4B (e
sto es, portan C4A'Q0 o C4B'Q0), del 8% al 10% portan dos alelos nulos, y menos
del 1% no expresan tres alelos. Las deficiencias completas de haplotipos C4 (Ira
ns C4A'Q0. C4B'Q0) son extremadamente raras y pueden detectarse en heterocigotos
slo con estudios de familia. En contraste con la deficiencia de C2, la deficienc
ia de C4 se ha descrito en al menos nueve haplotipos MHC diferentes, incluyendo
aquellos con tipos BF diferentes, lo que sugiere que la deficiencia surge de un
nmero de mutaciones diferentes. C4A'O0 y C4B'O0 proceden de deleciones de genes,
codones finalizadores
Enfermedades de etiologa y patognesis desconocidas
Se han descrito un gran nmero de enfermedades que muestran asociaciones con MHC.
Estas alteraciones son m u y diferentes de unas a otras y, aunque la mayora tiene
n al menos algn aspecto inmunolgico, otras pocas no. Hay muchos problemas que impi
den comprender los mecanismos por los que se producen estas enfermedades, y los
anlisis de marcadores de MHC en pacientes y sus familias han clarificado el panor
ama slo secundariamente. El origen ms importante de confusin es un fen-

956
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
meno denominado penetrancia incompleta. Se ha observado ms claramente en gemelos
homocigticos que presumiblemente tienen genes idnticos. Si uno de estos gemelos ti
ene una de estas enfermedades (p. ej., diabetes mellitus tipo I). el otro gemelo
no tiene necesariamente la enfermedad. Para la diabetes tipo I. la relacin de co
ncordancia no es superior al 50c (Ftubinstein. 1977). Esto sugiere que la penetra
ncia de una enfermedad en un husped completamente susceptible es incompleta: aunq
ue hay una importante razn para considerar a los genes en el MHC como determinant
es de la susceptibilidad para la diabetes tipo I. slo el 15% de los hermanos con
MHC idntico de los pacientes tienen diabetes insulinodependiente. La diferencia e
ntre el 50% y el 15% muestra la influencia de los genes en un segundo locus (o l
ocu) no ligado a MHC, y tambin sugiere un factor o factores ambientales en la sus
ceptibilidad determinante. La penetrancia incompleta hace difcil la asignacin de u
na forma especifica de herencia y provoca que la probabilidad de encontrar famil
ias con ms de un miembro afectado en una o ms generaciones sea ba]a. Normalmente s
e utilizan las lamilias para determinar las formas de herencia. Otros factores q
ue complican la situacin son la incapacidad para determinar si se est estudiando u
n grupo de pacientes homogneos en trminos de determinacin gentica. Casi el 5% al 6%
de las familias seleccionadas al azar con un miembro diabtico tipo I tendr un segu
ndo nio afectado. De estas parejas hermanas, aproximadamente el 60% tendr un MHC i
dntico, el 35% sern haploidnticos, y un pequeo porcentaje no compartir haplotipos MHC
. Este patrn sugiere una herencia recesiva de un gen de susceptibilidad ligado a
MHC para la enfermedad. Esta conclusin tambin se basa en los resultados de los anli
sis de distribucin de homocigotos y heterocigotos para BF'F1 entre 1.100 diabticos
tipo I (Raum. 1981). Sin embargo, todavia se ha de explicar la desviacin del 100
% de identidad MHC de hermanos afectados. Entre las explicaciones que se barajan
estn el entrecruzamiento del locus de susceptibilidad y el MHC, genes impenetran
tes en padres susceptibles, y heterogeneidad en la forma de herencia, incluyendo
penetrancia variable en homocigotos comparado con heterocigotos. Esto ha conduc
ido a un vasto nmero de modelos de enfermedad sin encontrar una manera de hacer d
istincin entre ellos. Al menos, sin embargo, los estudios de familia proporcionan
datos de haplotipos muy tiles y generalmente permiten la asignacin de homocigosid
ad para un marcador HLA en los individuos de prueba. Tambin se ha establecido que
la asociacin MHC est basada en un ligamiento entre un gen de susceptibilidad y el
MHC. Se desconoce todavia el nmero de alelos de susceptibilidad diferentes para
una enfermedad en una poblacin especfica. Con respecto a esto, los haplotipos exte
ndidos pueden ser tiles porque, si estn aumentados en los pacientes, probablemente
representan un alelo nico de susceptibilidad que pudiera estar en cualquier luga
r en la regin de fijacin. Sin embargo, algunos pacientes presentan slo porciones de
esos haplotipos y esto proporciona indicios para localizar la participacin de lo
s alelos especficos. Otro indicio puede ser el reparto de alelos especficos por do
s o ms haplotipos extendidos diferentes.
una historia familiar de la enfermedad, la prevalencia entre los parientes HLA-B
27positivos es aproximadamente del 20%. Se han descrito al menos 1 4 alelos de H
LA-B27, HLA-B'2705 es el alelo que se encuentra ms comnmente en los sujetos normal
es. Se ha propuesto que la presencia de HLA-B40o HLA-B39en el otro haplotipo HLA
. incrementa ms la susceptibilidad a EA. lo que corrobora la hiptesis de que los a
lelos no-B27contribuyen a una susceptibilidad aumentada de EA. Las protenas bacte
nanas que muestran homologa estructural con HLA-B27 incluyen una secuencia de sei
s aminocidos entre los residuos 72 y 77 del HLA-B'2705 y los residuos 188 y 193 d
e una nitrogenasa reductasa de Klebsiella pneumoniae, y entre las posiciones 71
y 75 de los subtipos mayores HLA-B27 y una secuencia de cinco aminocidos de un pls

mido de una cadena atrilognica de Shigella flexnerii (Stieglitz, 1989). De todas

las enfermedades ligadas al MHC. la diabetes mellitus tipo I es la que ms se ha e
studiado (Lernmark. 1999; Nepom, 1991; Thorsby, 1992; Winler, 1993). La contribu
cin de HLA a la diabetes tipo I no se ha explicada adecuadamente. Existen conside
rables aumentos en el HLA-DR3y DR4 en pacientes caucsicos. En muchas pero no en t
odas las poblaciones de pacientes caucsicos con diabetes tipo I hay un exceso de
heterocigotos DR3/DR4 por encima del nmero de homocigotos DR3 o DR4 predecibles p
or el equilibrio Hardy-Weinberg. Las razones de esto no estn claras. Por anlisis d
el ADN. el aumento en DR4 se encuentra ante todo en el subgrupo de DR4 en desequ
ilibrio de ligamiento con DOBT0302. Aunque actualmente se considera que el ltimo
gen es un marcador principal y quizs un determinante primario de la susceptibilid
ad a la diabetes tipo I, existe slo en el 70% de los pacientes caucsicos, e inclus
o en aquellos que lo transportan, hay una variabilidad en el nesgo relativo para
diabetes: DRBV0401. DOBV0302 y DRBV0402 DOBV0302 estn asociados en gran medida c
on la enfermedad, mientras que DRBV0404, DOB1'0302\o estn menos. Adems, se ha obse
rvado que los pacientes HLA-DR1/DR4 transportan el alelo DOBV0302 en el haplotip
o DR4. Por lo tanto, parece probable que haya mltiples contribuciones de la regin
clase II a la susceptibilidad a diabetes DQA 1'0301 esta presente en todos los h
aplotipos Dispositivos, transporten DOB1 '0302 o no. y es posible que pueda cont
ribuir al nesgo. Por otra parte, DQ6 se encuentra negativamente asociado a la di
abetes tipo I. Los individuos heterocigoticos para DRBV1501 que tambin transporta
n un gen de susceptibilidad para la diabetes tipo I en el otro haplotipo no sufr
en riesgo en absoluto para la enfermedad (proleccin dominanle), como se espera en
una alteracin recesiva. Un modelo recientemente propuesto para la diabetes tipo
I que asume que DOB1 es un determinante directo de la susceptibilidad, sugiere u
na jerarqua de afinidades entre las diferentes molculas clase II que compiten por
unirse al mismo pptido de diabetes tipo I (no identificado). La susceptibilidad s
ucede si un producto del gen (por ej., DQBV0302) se une y presenta el pptido. En
presencia de un competidor de alta afinidad {DRBI'1501). esto no ocurre. El sine
rgismo (DR3/DR4) podra explicarse por la unin de un pptido de alta almidad a un dmer
o clase II frans-asociado. Un nesgo relativo diferente (DR1/DR4 o diferentes hap
lotipos transportando DOBV0302) puede explicarse por diferentes afinidades de aq
uellas molculas por el pptido. Otro modelo propone que un cido asprtico en el codn 57
de la cadena DOS protege (rente a la diabetes tipo I. La presencia excesiva en
pacientes de un aminocido dilerente. ms frecuentemente valina o serina. en esa pos
icin en haplotipos transportando HLA-DR3 o DR4 respalda este concepto. Varios est
udios han confirmado este hallazgo en caucsicos pero no en diabticos orientales. O
tros estudios proyectan la hiptesis de que la presencia de arginina en la posicin
52 del DQA1 es otro factor gentico. Se ha propuesto que la combinacin del cido no a
sprtico en la posicin 57 de DOB1 y arginina en la posicin 52 de DQA 1 es un importa
nte determinante de susceptibilidad para la diabetes tipo I mediada por genes DO
B1. Existe datos significativos respecto a la asociacin entre marcadores MHC y ar
tritis reumatoide (AR) (Auger. 1998: Nepom, 1992: Ollier, 1992). Para la mayora d
e las poblaciones estudiadas, el marcador asociado primario es HLA-DR4. En los c
aucsicos, por ejemplo, los alelos DR4 ms comunes asociados con AR son DRBV0401, 04
04 y 0408. y en pacientes japoneses, israeles y chinos, es DRBV0405. Otras especi
ficidades HLADR tambin se asocian con AR: DR1 se ha descrito en asociacin con AR e
n pacientes caucsicos, japoneses, espaoles, griegos e israeles: DR3
Enfermedades especificas sin evidencia de herencia mendeliana y con asociaciones
MHC
La Tabla 41-3 enumera algunas enfermedades asociadas a MHC y sus marcadores. Est
a lista no es exhaustiva y slo se tratarn algunas de ellas. La aplicacin de los mtod
os de anlisis ya citados slo ha permitido entender unas pocas de estas alteracione
s. Existe una asociacin marcadamente potente entre HLA-S27 y espondilitis anquilo
sante (EA) en poblaciones caucasoides. orientales y africanas (Khan, 1992). Entr
e los pacientes con EA, artropatas reactivas y uveitis aguda anterior, alrededor
del 90% de los pacientes caucsicos, comparado con un 5% o 10% de los controles sa
nos, tienen HLA-B27(Rubin. 1994). La asociacin de B27 con estos sndromes en cuatro
grupos raciales (caucsicos, negros, japoneses, indios americanos) sugiere que B2

7 por s mismo o un gen estrechamente ligado a B27 est involucrado en la patognesis

de estas enfermedades. Las diferencias en la prevalencia regional de EA se relac
iona tambin con la frecuencia de HLA-B27. Entre los individuos HLAB27 positivos e
n la poblacin en general, slo el 2% desarrolla EA Si hay

CAPITULO 41
COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD
957
Tabla 41-3 Ejemplos de asociacin entre HLA y enfermedad' Enfermedad Enlermedad de
Behcet Enfermedad celiaca Etnia Japoneses Chinos Caucsicos britnicos Antgeno HLA B
51 B51 DRB1-0301 DQB1*0201 DQAV0501 DRB 1-0301
DQB1*0201
Riesgo relativo 79 3.4 26.7 51 8 139 6.9 368
Caucsicos italianos
Caucsicos checos
Enfermedad de Graves
Caucsicos germanos Japoneses Caucsicos sardos Chinos de Singapur
Tiroidilis de Hashimoto
Caucsicos hngaros Caucsicos canadienses Caucsicos britnicos Caucsicos europeos
infeccin VIH Progresor rpido"
Progresor lento Enfermedad de Hodgkin Nefropatia membranosa idiopatica
Caucsicos (Europa/Amrica) Caucsicos britnicos
Japoneses
Sndrome nelrtico idiopatico
Caucsicos franceses Caucsicos germanos
Esclerosis mltiple
Caucsicos franceses Caucsicos europeos Japoneses
Narcolepsia
Caucsicos canadienses
Artritis reumatoide
Caucsicos franceses
Indios asiticos Chinos Japoneses
DQ Al'0501 10.9 DRB 1 "0701 4 DQA1-0201 67 DRB t '0301 12.2 11 DOAt-0501 DRB1-07
01 3.1 DQA 1-0201 2.9 DR3. B8. Cw7 3.?-5.5 DOAt'0102 9.2 A2 2.9 DPB1-0501 5.3 DR
BT1601 2,3 DRB 1 -0301 3,5 DR5? 7,3 DR52 3.4 DR53 4.1 DOA1-0301/0302 DQBV0201 3.
6 DQA 1 "0301/0302 DQB 1 '0301 9.7 Cw7 1.5 DQB 1 '0601 2,2 B7 3,4 B35 2.5 Cw7 2,
1 DQB 1-0605 9,2 DPB 1'0301 1,95 DRB3-0101 5.5 DRB 1 "0301 9.8 DQB 1-0201 21.6 D
QA 1'0501 6.7 DRB1M501 14,2 DQB 1-0602 16,8 DQAV0102 7,1 DR7 6,4 5,3 DQA 1-0201
DR7 2,8 DQA 1-0201 3.3 DRBT1501, DQB 1*0602. DQAT010? 3.0 Uno de DQAr010?/0103 o
0501 mas uno de DQB1 0602/ 13.0 0603/0604/0302/ o 0303 DRB T1501 1 030 DRB5-010
1 1 263 DR15 384 DQB 1 '0602 1 468 DQAT0102 537 DRBV1501 93.5 DR15 13.2 DQB 1-06

02 85.4 DQA 1-010? 28.6 DRB 1'01 3,5 DRB t-0401 4,1 DRB1'0404 107 DR1 34 DRBI-IO
Ot 3.8 DR1 6.8 FB-FS 3.1 3.6 DRB 1-0405
ledad mas rapido t 1988: 1:1185). id Conference New York. Oxford University Pres
s,
'Individuos infectados con VIH que transportan el haplotipo [HLA-B8. SC0I. DR3]
tienen un d( (Vase Stool CM. Ludan CA. Beatson. D. y col: HLA haplolype Al B8 Dr3
as a risk for HIV re Datos extrados de Tsuii K. Aizawa M. Sasa/uki T (eds) HLA 19
91 Proceedings of the 11'" Inter 1992
en kuwaites; Dfl6en indios Yakima americanos; DR9 en chilenos, y DflfOen paciente
s espaoles, griegos e israelies. Para explicar este amplio espectro de diferentes
asociaciones HLA-DR con AR. se ha propuesto que la secuencia de un pptido DRB1 c
ompartido est involucrada en conceder
susceptibilidad a AR. Los alelos asociados con AR comparten una secuencia de ami
nocidos m u y bien conservada en su tercera regin hipervariable (aminocidos 70 a 74
). Estos residuos podran afectar a la unin de pptdos y a su presentacin a las clulas
. As. s existe un pptido artri-

958
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
tognico. puede unirse preferentemente a molculas con la secuencia DRB1 de la AR. P
or el momento, no se ha identificado tal pplido. Una explicacin alternativa puede
involucrar un mimetismo molecular entre el DRB1 de la AR compartido y secuencias
antignicas de un patgeno que pueda inducir AR. Se ha encontrado una homologa de se
cuencia entre la secuencia compartida de AR y una HSP de 70 kDa de Escherichia C
oli. Varios artculos han demostrado una relacin entre la gravedad de la AR y la fr
ecuencia HLA-DR4 en aumento, en particular con DRBV0401. Se ha detectado que los
pacientes HLA-DR4-positivos con AR tienen una evolucin grave de la enfermedad, y
los pacientes homocigticos HLA-DR4 tienen ms probabilidad de sufrir una AR mas gr
ave. Tambin es posible que la produccin de factor reumatoide est asociada con DR4 E
l riesgo asociado con DRBV04 generalmente es mayor que el alribuible a DRBI'01 o
DRBV10. La AR se diferencia clnicamente de la artritis reumatoide juvenil (ARJ).
En contraste con la asociacin con DR4 en la artritis reumatoide. las asociacione
s HLA con ARJ son bastante diferentes. Adems, otras asociaciones HLADR varan con l
os subgrupos clnicos de ARJ (Stastny. 1993). Por ejemplo, se h a descrito que el
haplotipo HLA-DRB1'0801. DQAV0401. DQBV0402 est aumentado en todo el grupo paucia
rticular y en pacientes con la forma persistente pauciarticular. El haplotipo HL
A-DRBV1301. DRB3'0101. DOA1 '0103. DQB1 '0603 tambin se asoci con pacientes con AR
J pauciarticular persistente (Fernndez-Vina, 1994). Otras especificidades asociad
as con la ARJ pauciarticular persistente son DRBV1104 y DPBV0201. La ARJ pauciar
ticular que pasa a la forma poliarticular se ha asociado con: DRBI'01. DRBV0801.
DRBV1401. DQBV0501, DQBV0503. DQAV0101 y DPB1'0201. La ARJ pauciarticular con i
ritis crnica muestra una fuerte asociacin con DRBV1104. DR8y DR6. Adems de las asoc
iaciones Clase II, se ha observado un aumento significativo en HLA-A2 en pacient
es con ARJ pauciarticular. Los pacientes varones con comienzo despus de los ocho
aos tienen una frecuencia marcadamente aumentada de HLA-B27. En pacientes con ARJ
poliarticular y factor reumatoide negativo, DRBV0801 y DPBI'0301 han mostrado a
sociacin con la enfermedad. Teniendo en cuenta que la forma poliarticular de ARJ
es un caso de AR en la juventud, el DRBV0401 muestra una fuerte asociacin. En cau
csicos, los dos haplotipos extendidos suponen ms del 60% de los haplotipos en paci
entes con enteropata sensible al gluten (ESG) (Goggins, 1994; Marsh, 1992): [HLAB8. SC01. DR3] y [HLA-B44. FC-31. DR7). De manera anloga a la diabetes, existe un
aumento en HLA-DR5/7. Tanto HLADR3 como DR7 estn en desequilibrio de ligamiento
con HLA-DQ2 (DQBV0201. DQAV0501). Esta combinacin de genes DQB y DQA se encuentra
en el 98% de los pacientes con enfermedad celaca (EC). El pptido gliadina, que pr
eviamente se ha visto que exacerba la lesin EC in vitro e n vivo, parece que se una
a DQ2, aportando ms credibilidad a su posible papel en la patognesis de EC (Shidr
awi, 1998). Este hallazgo sugiere que HLA-DQ2 podra presentar al pptido gliadma a
las clulas T para su reconocimiento inmune. Diferentes estudios han apuntado la p
osibilidad de la existencia de alelos especficos HLA-DP asociados con ESG: DPBV01
y DPB1'03en el sur de Europa, y DPB1'03y DPBV04 en el Norte de Europa. El aumen
to en DBP'01 se encuentra asociado con HLA-DR3. lo que indica que el haplotipo e
xtendido [HLA-B8, SC01. DR3] a menudo se extiende a travs de DP en EGS. Los deter
minantes de susceptibilidad DP y DQ comparten un residuo cargado positivamente a
lrededor del codn 71 de la cadena-(5. pero su papel especfico an no est claro. Otro
marcador MHC recientemente asociado con ESG es el alelo de 8,5 kb del gen HSP702. que se conoce por estar ligado de forma inestable con haplotipos transportado
res de HLADR3 (Partanen, 1998). ESG y la dermatitis herpetiforme (DH) comparten
algunos rasgos clnicos y marcadores MHC. Los pacientes con DH han aumentado la fr
ecuencia de los mismos haplotipos extendidos asociados a ESG. Sin embargo, compa
rando el halotipo. es evidente que las dos alteraciones son diferentes: los gene
s de susceptibilidad para ESG estn dentro o cerca de la regin HLA-DR/DQ. mientras

que los de DH parecen estar entre el

a la regin del complemento (Ahmed.
dos tipos de haplotipos HLADR4. DQ8
4. DQ8] y [HLA635, SC31. DR4. DQ8] y

complemento y la regin HLA-DR/DQ. ms cercanos

1993a). El pnligo vulgar (PV) se ha asociado a
entre los pacientes judos [HLA-B38. SC31. DR
un haplotipo HLA-DR6. DQ5 [HLA-B55. SB45.

DR6. DQ5] en pacientes no judos. Estos hallazgos indican que dos mutaciones diero
n origen a genes de susceptibilidad MHC para el pnfigo vulgar. Uno, quiz el ms anti
guo, surgi en un precursor de [HLA-B38/35. SC2I/31. DR4. DQ8] en una poblacin judi
a y se difundi a poblaciones no judas. El otro, ms reciente, parece haber surgido s
obre [HLA-B55. SB45. DR14(6). DQ5] en el sur de Europa o en Asia y se difundi a o
tras poblaciones (Ahmed, 1991). La presencia de autoantcuerpos PV (desmogleina 3)
ha mostrado una fuerte evidencia de ligamiento con DRB1'1404, DQB1 '0503. DQA V
0101 (Delgado. 1997). El cuarenta y ocho por ciento de los parientes de los paci
entes con PV que comparten los haplotipos de susceptibilidad tienen bajos nivele
s de anticuerpo PV. Asi. la enfermedad parece producirse en individuos susceptib
les con bajos niveles de anticuerpo cuando un segundo factor, gentico o ambiental
, induce niveles altos, suficiente para producir vesculas (Ahmed, 1993b). La evid
encia que establece un papel directo de los genes HLA en PV surge de estudios qu
e muestran que un pptido de 15 residuos, idntico a un segmento de la desmogleina 3
. se une a un punto de un DRB1'0402 {Bho\. 1995). En el penfigoide cicatricial (
PC), HLA-DRBT04 y DQBV0301 se han asociado con la forma ocular de la enfermedad
(Ahmed, 1991). La forma oral de PC tambin est asociada con DQBV0301 (Delgado. 1996
). Estos resultados indican que DQBV0301 es un marcador comn para ambas formas, o
ral y ocular, de PC, lo cual puede formar un espectro de una sola enfermedad. Lo
s anlisis de la secuencia de aminocidos presentes en los alelos DQB1 en los pacien
tes con formas ocular y oral de PC mostraron que comparten residuos comunes en l
as posiciones 57 y de la 71 a la 77, y es posible que puedan ser tambin marcadore
s para esta enfermedad (Yunis, 1994). El MHC se ha asociado con una variedad de
enfermedades infecciosas En la malaria, ambas molculas HLA clase I y clase II se
han asociado con la proleccin de la enfermedad grave en Gambia (Hill, 1991). Un a
lelo especifico, HLA-DQBV0503. se ha asociado con la tuberculosis clnica progresi
va (Goldfeld, 1998) Esta asociacin es particularmente intrigante, ya que el alelo
DQBV0503 codifica un cambio en la posicin 57 del aminocido de la cadena [i (|i57)
, que afecta a la carga existente en el bolsillo de la unin al pptido putativo. P9
. de la molcula DQ. Se sabe que este bolsillo contiene residuos hidrofbicos. El al
elo DOS V0503 codifica el cido asprtico negativamente cargado en |557 en lugar del
aminocido valina ms comn, sin carga e hidrofbico Es posible que la presentacin de pp
idos restringida a MHC por los macrfagos infectados de tuberculosis est afectada e
n el grupo de pacientes que expresan este bolsillo en particular. El bolsillo de
unin a P9 cargado negativamente puede unirse a antigenos de tuberculosis con men
os efectividad o puede obtener una respuesta inmunognica disminuida. HLA-DRBV0901
esta ms representado en pacientes tuberculina (PPD) positivos en comparacin con p
acientes TB anrgicos. DfBJ '0901 es el nico alelo que codifica un cambio en la posi
cin 9 del aminocido de la cadena (i (|}9). que influye en la carga en el bolsillo
de unin al pptido putativo. P9. de la molcula D R El alelo DRBV0901 codifica el ami
nocido lisina cargado positivamente en (59 en lugar del cido glutmico ms comn y carga
do negativamente Es posible que la respuesta restringida a MHC a los pptidos PPD
est aumentada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo particular. El
bolsillo de unin a P9 cargado positivamente puede unirse a residuos de PPD con ms
eficacia o puede obtener una respuesta inmunognica aumentada Los antgenos HLA-B. B
-27. B51 y B57 se han asociado a la falta de progresin del sndrome de inmunodefici
encia adquirida (sida) (Kaslow. 1996) Las molculas HLA-B pueden ser clasificadas
por la presencia de un epitopo molecular B w 4oB w 6 o especificidad pblica, que
est definida por los residuos 79 a 83 en el extremo carboxi-terminal de la hlice a
, (Salter, 1989). El autor ha encontrado recientemente que la profunda supresin d
e la viremia por el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1). en ausenci
a de terapia antiviral con frmacos, est significativamente asociada con la homocig
osidad para alelos HLA-B que comparten el eptopo HLA-Bw4 (Flores-Villanueva, comu
nicacin personal). Estos datos sugieren que los pptidos que se unen a los alelos H
LA-Bw4 pueden mostrarse tiles en el desarrollo de vacunas basadas en pptidos. Los

polimorfismos de genes HLA clase III se han asociado a enfermedades. Se han estu
diado varios sistemas de alelos TNFy HSP-70 y micro-

CAPTULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD

959
satlites en relacin con los haplotipos extendidos (Tabla 41-4). El polimorfismo en
la regin promotora TNF-ot, localizada en el nucletido -308 afn al lugar de comienz
o de la transcripcin, se relacion con una aumentada susceptibilidad a la malaria c
erebral (McGuire, 1994), espondilitis anquilosante (McGarry, 1999), mortalidad p
or choque sptico (Mira, 1999) y leishmaniasis mucoculnea (Cabrera, 1995). Los micr
osatlites del TNF d3 y b4 y la vanante HSP-70-1 9.0 fueron encontrados en frecuen
cias ms altas en dos poblaciones distintas con agranulocitosis inducida por cloza
pma (Corzo, 1995; Turbay, 1997). Otros sistemas de microsatlites se han asociado
con artritis reumatoide (Mu. 1999) y lupus eritematoso sistmico (Sturfelt. 1996).
Es posible calcular la frecuencia del gen (g) sin conocer el tipo de herencia us
ando la frmula: 7 = i -v7
Fuerza de la asociacin
Se han ideado varios mtodos para detectar el grado de asociacin de los marcadores
genticos con los hipotticos genes para la susceptibilidad a la enfermedad. Uno es
calcular el riesgo de enfermedad entre individuos que transportan un alelo espec
ifico de un sistema polimrfico. En este clculo, el riesgo relativo (RR) o relacin d
e probabilidad (odds ralio) calcula el riesgo de transportar un marcador en una
poblacin de individuos enfermos comparado con una poblacin control. Ms interesante,
pero ms dificil de estimar, es el riesgo de tener una enfermedad en un individuo
que transporta el marcador (Tabla 41-5, vase tambin Tabla 41-3). Esta fuerza de a
sociacin es el A de Bergston y Thomson (Svejgaard. 1983), que es lo mismo que la
fraccin etiolgica (FE) (Miettinen. 1976). Si. en una poblacin de pacientes, individ
uos a transportan el carcter especifico pero individuos no y. en la poblacin norma
l (control), individuos c transportan el carcter, la informacin puede ser escrita
convenientemente en la tabla 2x2: Carcter positivo Paciente Control a c Carcter ne
gativo b d
MTODOS DE DETECCIN DE LA ASOCIACIN O CORRELACIN DE LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES
GENTICOS Polimorfismo gentico
El polimorfismo gentico se define como la existencia en la misma poblacin de dos o
ms alelos en un gen. cada uno con una frecuencia importante. La frecuencia se ha
determinado de forma arbitraria como mayor que el 1%. Hay dos grupos de polimor
fismo gentico; equilibrado o estable y transitorio. Un polimorfismo equilibrado s
e produce cuando dos o ms alelos se mantienen en una poblacin por seleccin. La vent
aja heterocigtica es el clsico ejemplo de polimorfismo equilibrado. El polimorfism
o transitorio representa una fase de cambios allicos conducida por deriva gentica
o por seleccin. El polimorfismo de un gen puede ser estable en una poblacin y tran
sitorio en otra, dependiendo del efecto de la seleccin. Para determinar el polimo
rfismo gentico es necesario encontrar una muestra representativa de la poblacin, v
alorar los individuos, contar los genes y estimar el nmero de genes contenidos en
la poblacin total. Por ejemplo, asumiendo que se ha estudiado una poblacin de 100
individuos para un rasgo gentico particular o alelo en un determinado gen, se pu
ede definir la frecuencia de fenotipo como el nmero de individuos que transportan
el rasgo o la variante gentica. Para calcular la frecuencia (/) de cada alelo, s
e suman las frecuencias de cada alelo, y luego se divide entre el nmero total de
alelos analizados:
La frecuencia del carcter en esta poblacin de pacientes (l\) es
f(x)+t(<i)+f{z)

Tabla 41-4
Constelacin de g e n e s TNF en relacin c o n haplotipos e x t e n d i d o s c o m
u n e s Complotipo C4A BF 0 3 3 6 3 2 2 3 I 3 HSP70 2 8.5 9 g 9 9 9 9 9 'i 9 8,
h Marcadores en el locus TNF d 862 -308 -856 I 3 3 3 4 3 4 3 4 3 4 2 1 1 1 l 1 1
1 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1
HLA-DR
C4B 1 1 1 1 1 1. 2 1 3 2 0
C2
1
e
u
b
HLA-B HLA-Cw
3 2 7 4
7
s s
I
c
5
i
;
s s
s
i 2 3
I1
s s s s
c c c c c c c c c
0
C
.A A
M

A A A A
3 3 3 3 3 3

hl numero de letras debajo de cada columna se refiere a una variante del alelo p
articular del complemento, protena 70 del golpe de calor (HSP70). polimorfismo de
microsatlite TNF o promotor TNF- estn asociados con las especificidades HLA como s
e resea Vase texto para explicacin En el caso de TNF-a -308 I y 2 representan las v
anantes -307/G y 307/A. respectivamente El alelo TNF-a -856/C se resena como 1 y
el alelo -856/T como 2 El alelo 862/C TNF-a se resena como 1 y el -862/A como 2
Dalos extrados y modificados de Clavijo OP Delgado JC. Awdeh ZL y col Tissue Ant
igens 1998. 54 303.
c
C
3 1 3 3
2 11 7. 8 6. 7 2 S 2 10 2 10 1
3 4 4 5 5 5 1 4 1 A 5
8 7 44 44 57 35 14 38 62 18 18
0701 070? 1601 0501 060? 0401 080? 1203 0304 1203 0501

960
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 41-5
Riesgo relativo (RR)* para alelos M H C e n varias e n f e r m e d a d e s HLA-A
HLA-B RR 1.6 Alelo
B8
HLA-DR RR 2.5 2.5 2,5 0,2 3,5 8,0 3,0 2,3 2,3 1.9 4.9 3.5 Alelo DR3 DR4 DR2 DR2
DR3 DR3 DR3 RR
\:
BF Alelo RR
Enfermedad Diabetes melhtus tipo 1
Alelo A1
B15 B18
B7
4,5 BF'Fl 0.1 4,2 17,0 2.2 4,4 BF'Fl BF'Fl 16,0 2,0
8
Esclerosis mltiplo Enteropala gluten Hepatitis crnica activa Glomerulonefritis memb
ranosa idioptica Hemocromatosis idiopatica
.
A3 A1 A1
1.8 i8 1,7
B7 B8 B8 B8
B18 A3 Al 4.8 2.0
B7
B14
B15
DRw6
DR4
3.1 2.9
n
pacientes con marcador controles sin marcador
x
H n =
pactonte9 sin marcador controles con marcador . ,

De manera similar, en riesgos disminuidos, para los cuales RR es menor de 1, se

puede usar el factor de prevencin (FP).
FP
0-RRK
RR
(i-<v)
Las fracciones FE y FP pueden variar entre 0 (no asociacin) y 1.0 (mxima asociacin)
Aparte de facilitar estimaciones de tener un marcador si uno ya tiene la enferm
edad, estos clculos ignoran el modo de determinacin gentica de la enfermedad en cue
stin, Esto es particularmente problemtico para modos recesivos o ms complicados en
los cuales ambos hapltipos son importantes para determinar la enfermedad pero se
da el mismo peso a los heterocigotos y homocigotos para un marcador dado (esto e
s, ambos son positivos para el marcador).
Anlisis del modelo de herencia basado en parejas de hermanos
El anlisis de la forma de herencia basado en pareas de hermanos se introdujo para
ayudar a superar los problemas de penetrancia incompleta de los genes de la enf
ermedad y las variaciones en edad al comienzo (Penrose. 1935). El mtodo se basa e
n la suposicin de que si el HLA y/o los genes estrechamente ligados a HLA no infl
uyen en el desarrollo de la enfermedad, entonces las parejas de hermanos afectad
os compartirn hapltipos HLA con una frecuencia normal: el 25% compartirn ambos haplt
ipos. el 50% compartirn uno y el 25% no compartir ninguno. As, se comparan distribu
ciones observadas y esperadas de hapltipos compartidos. Si los genes de susceptib
ilidad o sus marcadores estrechamente ligado son raros y totalmente penetrantes,
en una enfermedad determinada recesivamente, la distribucin de los hermanos que
comparten 2.1 y ningn haplotipo seria 100, 0. 0. respectivamente. Para la determi
nacin dominante, la relacin sera 33, 66, 0. Lo que se observa en diabetes, por ejem
plo (Rubinstem. 1977), es 60, 35, 5. ms cercano a las predicciones recesivas que
a las dominantes. Una vez que se ha establecido la forma de herencia, se pueden
establecer la frecuencia y la penetrancia del gen de la enfermedad (Thomson, 197
7).
proporcin de individuos que son homocigotos para el marcador. La aplicacin de este
mtodo al HLA-B27 y a la espondilitis anquilosante condujo, en terrenos estadstico
s, a la desestimacin de un mecanismo recesivo. Asi, se concluy que la susceptibili
dad a la espondilitis anquilosante es heredada como un rasgo dominante. De forma
similar, el mismo mtodo de anlisis se aplic a la distribucin de BF'Fl entre 1.107 p
acientes con diabetes mellitus tipo 1 (Raum. 1981). Para la herencia dominante,
se pronosticaron 1,89 homocigotos y para la herencia recesiva 6.2. Se encontraro
n siete homocigotos BF'Fl. un resultado consistente slo con la herencia recesiva.
Otros modos de herencia que podrian ser desestimadas por estas observaciones in
cluyen la dominante simple, episttica (enfermedad resultante de la presencia de g
enes no allicos) o superdominante (enfermedad con mayor penetrancia cuando dos al
elos especficos estn presentes que cuando se producen otras combinaciones, incluye
ndo homocigosidad para cada alelo especfico). Aunque un modelo mixto con diferent
e penetrancia para homocigotos y heterocigotos no podra ser excluido completament
e, otras consideraciones podran hacer insatisfactorio a tal modelo.
Mtodo de clculo de probabilidades (Lod Score Method)
Este es un mtodo estadstico de concordancia entre un locus marcador tal como en el
MHC y un gen de susceptibilidad a una enfermedad (Sutton, 1980): (1) el valor Z
es la relacin de la mxima probabilidad de encontrar o no concordancia (P F,/ 0]) en
un valor de recombinacin particular 0; y (2) el valor o (q) de frecuencia de rec
ombinacin, que es una medida de la distancia desde un locus determinado a un valo

r Z mximo. El clculo de probabilidades expresa la probabilidad de que alelos en do

s locus se separen juntos, en trminos de la relacin entre la frecuencia de recombi
nacin observada con la pronosticada si concuerdan independientemente. Varios valo
res de (q) de 0 a 0.5 se sustituyen en la ecuacin: P(F,/e) = 1/2 [& (i -or' + e-'
ii - ) ] Donde n = el nmero de nios en una familia determinada y r= el nmero de rec
ombinantes. La probabilidad de obtener un estudio genealgico para un valor determ
inado de 0 (frecuencia de recombinacin de 0 a 0,5) se expresa como la relacin de P
(FJ 0) en una familia en una fraccin 0 (de 0 a 0,5) de recombinacin dada a P (F./
0.5) en la misma familia, asumiendo que ninguna recombinacin pueda ser expresada
como el clculo de probabilidades (Z):
Anlisis del modelo de herencia basado en estudios de poblacin
Thomson y Bodmer (1977) han ideado un mtodo de anlisis de los datos de la poblacin
para marcadores estrechamente ligados a locus de susceptibilidad para enfermedad
es con penetrancia incompleta. En esencia, este mtodo predice la proporcin de homo
cigotos. heterocigotos y no portadores para el marcador ligado esperado en casos
de herencia dominante o recesiva. La diferencia principal entre los dos modos d
e herencia se obtiene por la
z - log
P(F,/0.5)

CAPTULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

961
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vor del ligamienlo y aquellos menores o igual a cero en contra del ligamiento. E
n general, un valor de Z mayor de 3 (para algunos valores de 0<0,5) significa qu
e las probabilidades a favor del ligamiento son 1.000 a 1 (p = 0,05) en oposicin
al no ligamiento o independencia. Es ms fcil calcular la concordancia para rasgos
codominantes (es decir. H L A y GLO) que para rasgos recesivos. En estudios de c
oncordancia de H L A y enfermedad, los padres pueden tener genes de susceptibili
dad impenetrantes dominantes o recesivos. Hay problemas bsicos para usar el mtodo
de clculo de probabilidades para detectar concordancias de genes parcialmente pen
etrantes, aparte de hermanos susceptibles impenetrantes. Si los genes de suscept
ibilidad son comunes, como parece ser en el caso de la diabetes tipo 1. por ejem
plo, los cruzamientos aparentes de hermanos no idnticos podran sugerir genes de su
sceptibilidad adicionales en un padre.

962
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA Sargent CA. Dunham I, Campbell RD: Identification of m

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5.

C A P T U L O
42
Trastornos nmunodeficitarios
Charlotte Cunningham-Rundles, M.D., Ph.D.
INDICADORES CLNICOS DE INMUNODEFICIENCIA EVALUACIN DEL SISTEMA INMUNOLGICO INVESTIG
ACIONES DE PRIMER NIVEL Historia clnica y recuento sanguneo inicial Inmunoglobulin
as Rayos X y tomografa computarizada Funciones pulmonares INVESTIGACIONES DE SEGU
NDO NIVEL Produccin de anticuerpos Subclases de IgG Inmunidad de clulas T Valoracin
funcional de las clulas T Anlisis de leucocitos polimorfonucleares Evaluacin del c
omplemento
963 964 964
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL Medidas enzimticas Histologa Ensayos con clulas ase
sinas naturales Anlisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares Citocinas y
receptores de citocinas
969
967
Marcadores adicionales de superficie celular Deficiencia de IgA y anticuerpos an
ti IgA Utilizacin de nuevos inmungenos para valorar la produccin de anticuerpos Gent
ica molecular y diagnstico prenatal RESUMEN BIBLIOGRAFA 972 972
La resistencia a la infeccin es una particularidad necesaria de la salud. Las pri
ncipales barreras a las infecciones son las barreras fsicas naturales, la piel, l
a produccin de moco en las superficies mucosas expuestas, y la funcin de las clulas
ciliadas del tracto respiratorio, intestinal y genital que tienen tendencia a e
liminar los microbios invasivos. Adems de estas barreras, un importante nmero de f
unciones inmunitarias ejercen una continua vigilancia: estas funciones pueden se
r no especificas no requiriendo ninguna sensibilizacin previa, y especificas, que
requieren una previa exposicin para sensibilizarse (Tabla 42-1). Las funciones i
nmunitarias estn compuestas por un conjunto interrelacionado de clulas inmunitaria
s y funciones inmunitarias, siendo los principales elementos 1) los Imfocitos B
produciendo anticuerpos, 2) los linfocitos T proporcionando funciones celulares,
3) el sistema (agocitario conteniendo leucocitos polimorfonucleares (PMN) y mon
ocitos / macrofagos 4) el sistema complemento y 5) las clulas asesinas (clulas NK)
. La enfermedad por inmunodeficiencia primaria surge debido a anormalidades de u
no o ms componentes de este grupo interrelacionado de funciones. Estas enfermedad
es fueron originariamente consideradas como enfermedades bastante poco frecuente
s, caracterizadas como enfermedades graves con un comienzo clnico en los primeros
aos de vida. Sin embargo, como en los ltimos aos se ha esclarecido el espectro de
estos defectos, est claro que estas enfermedades son mucho ms comunes de lo que or
iginariamente se crea, y la manifestacin clnica puede ser benigna. Lo ms importante
es que ahora est claro que estas enfermedades pueden ser diagnosticadas en nios ma
yores, en adolescentes y en adultos de todas las edades. La incidencia general d
e estas enfermedades de inmunodeficiencia se estima en aproximadamente 1 de cada
10.000, excluyendo la deficiencia selectiva de inmunoglobulina A (Ig A). Por ra
zones desconocidas, mas de la mitad de los defectos inmunes descritos incluyen d
efectos en la produccin de anticuerpos (Fig. 42-1). La Unin Internacional de Cienc
ias Inmunologas ha catalogado los defectos conocidos del sistema inmunitano.
que peridicamente se actualizan {Primary Inmunodeliciency Diseases. Report of an
lUIS Scientific Committee, 1999). En la Tabla 42-2 se muestra un enfoque general
de los principales sndromes inmunodeficitarios, clasificados por tipo.

INDICADORES CLNICOS DE INMUNODEFICIENCIA

El indicador clnico ms frecuente de un defecto inmune es la aparicin de "demasiadas
infecciones". Esta es la principal manifestacin en los bebs y nios con deficiencia
s inmunitarias y representa un reto significativo para el pediatra, ya que las i
nfecciones son m u y comunes en la infancia normal. Cuando las infecciones frecu
entes y prolongadas se acompaan de retraso en el desarrollo o si aparecen infecci
ones poco habituales, debe realizarse una evaluacin del sistema inmunitano. La co
nfirmacin de una enfermedad inmunodeficitaria en un hermano o pariente de primer
grado debera implicar una valoracin clnica cuidadosa y una investigacin de laborator
io, incluso sin antecedentes de infecciones graves o inusuales. Aprovechando las
caractersticas comunes de infeccin que aparecen en las enfermedades de inmunodefi
ciencia primaria, se han creado un grupo de signos de alarma para ayudar a la id
entificacin de individuos que tienen ms probabilidad de sufrir un defecto inmune (
Tabla 42-3). Quiz los indicadores ms importantes para emprender una evaluacin del s
istema inmunitario surgen al realizar una historia inicial cuidadosa. Junto con
las seales de alarma reseadas en la Tabla 42-3, el mdico deberia preocuparse por el
ementos en la historia que son inusuales, como antecedentes de enfermedad autoin
mune. adenopata significativa, la necesidad en un adulto de realizar una miringot
omia. herpes zster grave, o herpes zster que aparece en nios pequeos, etc. Estas man
ifestaciones adicionales pueden tambin indicar que deberia considerarse un defect
o inmune (Tabla 42-4).

964
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 42-1 Mecanismos de defensa del husped No especficos Barreras (piel, secrecio
nes, moco, lgrimas, saliva) Fagocitos (neutrofilos, macrfagos) Clulas asesinas natu
rales Complemento Citocmas Especficos Anticuerpos Funciones de clulas T
recurrentes del tracto urinario no son caractersticas de deficiencia inmunitaria;
el sistema inmune parece jugar un pequeo papel, si es que juega alguno, en la pr
evencin de pielonefritis y cistitis.
EVALUACIN DEL SISTEMA INMUNOLGICO
Basados en las consideraciones previas, cuando se sospecha un defecto inmunitari
o hay que hacerse estas preguntas: qu parte del sistema inmunitario debera investi
garse, qu pruebas se necesitan y hasta dnde deberan llevarse estas investigaciones.
La evaluacin del sistema inmune se lleva a cabo mejor por etapas, realizando pri
mero las pruebas de deleccin bsicas, hasta llegar a las pruebas ms complejas, segn e
l caso. En la Tabla 42-6 se ofrece una visin general de este abordaje por etapas.
Por supuesto; no es prctico investigar todos los sistemas en todos los pacientes;
sin embargo; el cuadro clnico y la edad del paciente indicarn al examinador qu par
te del sistema inmunitario es con ms probabilidad el causante. Por regla general,
la elaboracin de una historia cuidadosa y el examen fsico completo puede reducir
las posibilidades de problemas que implican principalmente a clulas T. clulas B, g
ranulocitos o el sistema complemento. La Tabla 42-5 enumera los sntomas y signos
clnicos y sus correlaciones con los elementos de defensa del husped. En muchos cas
os el tipo concreto de nfeccin(es) que el paciente ha padecido puede proporcionar
un indicador til sobre el defecto inmunitario ms probable (Fig. 42-2). Si predomin
an las infecciones por bacterias encapsuladas, se debera investigar la clula B, el
sistema de complemento o los sistemas fagocticos: si hay predominio de infeccion
es fngicas o vricas, puede estar defectuoso el sistema de las clulas T. Las infecci
ones recurrentes por Neisseria deberan alertar al mdico sobre la posibilidad de un
a deficiencia gentica de uno de los componentes del complemento. Las infecciones
recurrentes por Candida, incluyendo las aftas orales, no suelen ser un problema
alarmante si se han utilizado con frecuencia antibiticos. Sin embargo, la candidi
asis oral adquiere una mayor importancia cuando es resistente a una terapia loca
l sencilla y cuando persiste despus de seis meses de edad. Las aftas orales no se
consideran igual que la candidiasis mucocutnea, una enfermedad caracterizada por
diseminacin de la infeccin desde las membranas mucosas a la piel contigua incluye
ndo generalmente las uas de los dedos. Estas lesiones cutneas pueden presentarse d
e forma granulomatosa. La candidiasis mucocutnea siempre es anormal. Tambin es imp
ortante observar las circunstancias clnicas y no fijarse exclusivamente en el nmer
o o la gravedad de los episodios infecciosos. Por ejemplo, cuando un proceso inf
eccioso afecta a la misma zona anatmica repetidamente, es ms probable que la etiol
oga sea estructural y no un defecto de una de las defensas del husped. La osteomie
litis crnica en una localizacin, o episodios recurrentes de neumona que afectan slo
a un lbulo pulmonar, o infecciones recurrentes de una herida quirrgica son ejemplo
s de estas situaciones. Por razones desconocidas, las infecciones
INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL Historia clnica y recuento sanguneo inicial
Aparte de realizar una historia inicial y exploracin fsica, incluyendo medicin de l
a altura y peso, la primera prueba inmune es el hemograma completo (CBC). Un rec
uento de glbulos blancos (WBC) y diferencial proporcionar informacin sobre la morfo
loga y nmero de linfocitos pequeos (dimetro<10um). Se espera que haya ms de 1.200 lin
focitos por milmetro cbico. Puesto que menos (-10%) de los linfocitos son linfocit

os B, una deficiencia absoluta de linfocitos indica sobre todo deficiencia de clu

las T. Parte de la primera visita debe tambin incluir la obtencin de todos los exp
edientes mdicos anteriores, incluyendo informes patolgicos o diapositivas, y resul
tados de cultivos previos y radiografas.
Inmunoglobulinas
Como las enfermedades por deficiencia de anticuerpos son ms comunes que otros def
ectos inmunes, se debe empezar investigando las inmunoglobulinas y produccin de a
nticuerpos (Stiehm, 1996). Los anlisis cuantitativos de inmunoglobulinas se encue
ntran disponibles en todos los laboratorios comerciales y hospitalarios, y para
realizarse necesitan de muy poco suero (vanse Captulos 13 y 35). Como los valores
de inmunoglobulinas aumentan con la edad, es necesario para la correcta interpre
tacin que se compare con controles de edad (vase Tabla 37-7). Durante los primeros
meses, la IgG de origen materno es la principal inmunoglobulina presente en el
suero del nio. El punto ms bajo se ve aproximadamente a los tres meses. Sin embarg
o el nio puede sintetizar IgA e IgM: asi. la presencia de estas dos inmunoglobuli
nas (partcularmenle la IgM, que se sintetiza antes que la IgA) es una evidencia
Figura 42-1. Clasificando los defectos inmunes de u n a amplia poblacin de pacien
tes remitidos para anlisis inmunolgicos y tratamiento, casi un 50% de todos ellos
presentaban defectos en la produccin d e anticuerpos, incluyendo mmunodeficiencia
variable comn, deficiencia selectiva de IgA, deficiencia de la subclase IgG, nip
ogammaglobulinemia transiloria del nio y agammaglobulinemia ligada al c r o m o s
o m a X. Dalos t o m a d o s del M o u n t Sinai Medical Center, Immunodeficien
cy Clinic.

CAPTULO 42

TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
965
Tabla 42-2
Clasificacin d e las inmunodeficiencias primarias' Enfermedad Comentarios
Deficiencia combinada de clulas B y clulas T Disgenesia relicular Inmunodeficienci
a severa combinada (IDSC)
Sndrome hiper IgM
Ataxia-telangiectasia Timoma Sndrome Wiskott-Aldrich Deficiencia primaria de clula
T Anomalia de DiGeorge
Hipoplasia hematopoyetica generalizada Incluye: (1) La ligada al cromosoma X deb
ido a un defecto en la cadena del receptor IL-2. (2) herencia autosmica recesiva
de naturaleza desconocida: (3) causada por deficiencia de adenosma deammasa (ADA
); (4) causada por enzima recombinasa (RAG 1.2) delecluosa, (5) Sndrome de Omenn,
en muchos casos debido a la mutacin en el enzima RAG: (6) asociada con defectos s
eos (hipoplasia cartilago-pelo. enanismo de miembros cortos); (7) sndrome del lin
focito desnudo, baja expresin de la histocompalibilidad de los antigenos HLA clas
e II; (8) causada por un defecto en la cinasa JAK; (9) causada por un defecto en
el receptor IL-7. (10) causada por un delecto en el enzima ZAP-70 de las clulas
T IgM normal-elevada; defecto en la expresin de gp 39. un ligando de las clulas T
para CD40. el receptor de clulas B responsable del cambio del isotipo; neumona por
Pneumocystis, a menudo coiangitis asociada con neutropenia cclica, alta incidenc
ia de esclerosis, normalmente no se ve en las enfermedades de las clulas B frecue
nte Deficiencia comn de IgE lgG2 y/o IgA: alta incidencia de malignidad linforrel
icular defecto de la reparacin del cromosoma Detecto en clulas T variable; hipogam
magiobulinemia en algunos Trombocitopenia (plaquetas pequeas); no respuesta a ant
icuerpos de carbohidratos: eczema: herencia ligada al cromosoma x alta incidenci
a de malignidad linforeticular, clulas CD43+ no detectadas Facies caractersticas:
lesiones cardacas (lo ms tipico arco artico interrumpido); hipoparatiroidismo; la d
eficiencia en clulas T puede ser lo suficientemente grave como para ir asociada c
on deficiencia de anticuerpos, el defecto inmune por lo general mejora espontneam
ente: el limo est ausente en su forma completa, casi siempre fracaso del declive
normal Se produce inmunoglobulina, pero la respuesta al anticuerpo especfico est m
arcadamente deteriorada; delecto timico no caracterizado A menudo asociado con a
plasia de glbulos rojos primaria Las clulas T presentan pero no expresan CD3, nece
sario para la funcin del receplor de las clulas T Lesiones de piel granulomatosas;
a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo u otras endoermopatia
s. con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos Ausencia de clula
s B Clnicamente se presenta en el primer ao de vida, varones para la forma ligada
al cromosoma X y varones y hembras para las otras Aparece a los 2-4 meses de eda
d: dificultad para diferenciarlo del nadir normal de IgG que se produce durante
ese periodo IgM normal-elevada; defecto en la expresin de gp 39. un ligando de la
s clulas T para CD40, el receptor de clulas B responsable de la mutacin del isotipo
; la neumona por PiieumcKystis, no observada normalmente en las enfermedades de cl
ulas B. es frecuente: a menudo asociada con neutropenia cclica lgA<10mg/dl: IgG n
ormal a aumentada; alrededor del 12% con deficiencia de lgG2. deficiencia select
iva de IgA; la deficiencia ms comn (1/500 de los caucsicos): asociado con herencia
de antigenos de histocompatibilidad Bastante rara asociada a infecciones por Nei
sseha Importante defecto de anticuerpos clulas B presentes: puede presentarse def
iciencia de clulas T y aumentar con el tiempo Dobido a la supresin de los genes de

las cadenas pesadas do IgG. o produccin deficiente de isolipos de IgG selecciona

dos; asintomlica o asociada con infecciones, si la produccin de anticuerpos esta d
eteriorada Puede imitar sndromes de deficiencia de anticuerpos: deficiencias de C
3 clnicamente similares a panhipogammaglobulinemia; deficiencias de componentes d
e complemento, particularmente C6-C9, tienen inlecciones recurrentes con especie
s de Neissena Imita a los sndromes de de crnicas con bronquela enca de anticuerpos;
otitis recurrentes e infecciones pulmonares caracterstica
Sndrome de Nezelof Deficiencia de inosina fosforilasa (PNP) Ausencia de expresin d
e CD3 Candidiasis mucocutnea crnica Deficiencia primaria de clulas B Agammaglobulin
emia congenita ligada al sexo (Bruton) Defecto de p-cadena, cadena sustituida li
g. etc. Hipogammagiobulinemia transitoria de infancia Sndrome hiper IgM
Deficiencia selectiva de IgA Deficiencia selectiva de IgM Inmunodelicioncia comn
variable Deficiencia do subclase de IgG Defectos de complemento Deficiencia de c
omplemento Defectos estructurales Dismotilidad de cilios Defectos de origen desc
onocido Sndrome hiper IgE Candidiasis mucocutnea crnica
Sindrome de Job-Buckley (hiper-lgE); abscesos en piel y rganos, anormalidades seas
. anormalidades dentales Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con
hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo u otras endocrinopalas, con el tiempo, puede
aparecer una deficiencia de anticuerpos
Otros defectos Deficiencia molecular de adhesin a la clula Imita algo a los sndrome
s de deficiencias de anticuerpos: separacin retrasada del cordn (LFA-1/Mac-1) umbi
lical: respuesta inflamatoria pobre periodontitis. episodios spticos recurrentes
Para mSs delates vGase el articulo IUIS Primary Inmunodeliciency Diseases Report
of an IUIS Scientific Committee. Clin Exp Immunol 1999: 17 311-321. con perrras
o
convincente de que no existe panhipogammaglobulinemia. La panhipogam- dades sign
ificativas hasta la edad de seis meses; si embargo, despus d e la maglobulinemia
es la forma habitual de presentacin de la agammaglobulme- edad de un ao. un nivel
de IgA de 10 mg/dl o menos indica que la deficienmia ligada al cromosoma X. La I
gA habitualmente no se encuentra en canti- ca de Ig A ser un defecto permanente (P
lebani. 1986). En el sindrome hiper-

966
Tabla 42-3
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Diez signos de alerta d e inmunodeficiencia*
Tabla 42-5
Dos o ms episodios de neumona Prdida inexplicable de peso en adultos, fallo en el d
esarrollo en lactantes Abscesos recurrentes en rganos profundos o piel Uno o ms ep
isodios de infecciones senas tales como meningitis. sepsis, celulitis u osteomie
litis Historia familiar de deficiencia inmunitaria Infecciones recurrentes de odo
s, necesidad de sondas en adultos Candidiasis orales o cutneas despus de la edad d
e un ao Dos o ms meses con antibiticos orales con poco efecto Necesidad de antibitic
os intravenosos para curar infecciones Dos o ms infecciones de sinus en un ao
'Dos o mas pueden indicar inmunodeficiencia.
Sntomas clnicos d e deficiencia correlacionados c o n el tipo de defecto
inmunoglobulina M. se han visto niveles normales o elevados de IgM con ausencia
de IgA (Ramesh, 1998; Levy 1997). En general, las desviaciones de otros sotipos d
e inmunoglobulinas no se diagnostican como sndromes especficos. Sin embargo, los a
umentos marcados de IgE forman casi siempre parte del sndrome de hiperinmunoglobu
lina E (Buckley, 1978), son comunes en el sndrome de Wiskott-Aldrich, algunas def
iciencias de clulas T aisladas y se pueden encontrar en enfermedades crnicas granu
lomatosas. El sndrome de Wiskott-Aldrich caractersticamente muestra tambin un marca
do aumento de IgA en suero con bajo IgM (Ochs, 1998).
Radiografas y tomografa computarizada
Las radiografas y la tomografa computarizada (TC) y los estudios de resonancia mag
ntica (RM) tambin pueden ser tiles para valorar las deficiencias inmunitarias. La n
eumona crnica intersticial es frecuente en bebs, nios o adultos con deficiencias en
clulas T, y debera confirmarse con radiografas de trax. Con el tiempo, muchos pacien
tes con deficiencia primaria de clulas B (agammaglobulinemia, inmunodeficiencia v
ariable comn) pueden desarrollar fibrosis pulmonar crnica o bronquiectasias (Swenbe
rg, 1991; Cunningham-Rundles, 1999). La tomografa computarizada de trax en un paci
ente que presenta infecciones recurrentes del tracto respiratorio es la mejor pr
ueba para investigar una bronquiectasias; si estos cambios se han desarrollado,
se necesita seguir investigando. Antes se realizaban proyecciones laterales del
cuello para objetivar el tejido linfoide farngeo en nios. Sin embargo, no se recom
iendan las radiografas para la evaluacin de tejido linfoide cervical porque la inf
ormacin que stas proporcionan se obtiene ms fcilmente por otros mtodos alternativos.
Las proyecciones anteriores del trax pueden revelar una ausencia de la sombra tim
ica en nios pequeos, pero como el timo puede disminuir fcilmente debido al estrs, la
evaluacin del tamao del timo por este mtodo no es fidedigna. Las anormalidades seas
, sin embargo, pueden alertar al radilogo de un problema inmunolgico presente en l
a infancia. Un subgrupo de pacientes con inmunodeficiencias que implican anormal
idades de clulas T o B y T, sufren enanismo de extremidades cortas. Estos pacient
es muestran lesiones caractersticas, generalmente en las regiones metafisarias de
los huesos largos. Los pacientes con deficiencia de adenosina deaminasa muestra
n biselado de los extremos costales, cuadratura de los omplatos y articulaciones
inusuales de las apfisis transversales costales (Cederbaum, 1976).
Tabla 42-4

Hallazgos clnicos q u e sugieren u n a inmunodeficiencia de defecto o localizacin

inciertos
Defectos en el desarrollo Eczema intratable Dermatitis seborreica generalizada (
inmunodeficiencia grave combinada) Adenopatia, esplenomegalia Colitis ulcerosa m
anifestada antes del primer ao de vida Diarrea intratable Enfermedad autoinmune (
son habituales PTI o anemia hemolitica) Deficiencia hematolgica inexplicable (de
cualquier serie: eritrocitos, neutrlilos, plaquetas)
PTI = prpura trombocitopenica inmune.
Se piensa en una deficiencia de clulas T cuando 1. Vacunas de virus vivos o bacte
rias atenuadas producen enfermedades sistmicas o resultados inesperados (p ej., v
iruela generalizada, neumona de clulas gigantes con rubola, infeccin generalizada po
r Mycobacterium) 2. Un virus habitualmenie benigno ocasiona una infeccin contunde
nte (a menudo neumona) como varicela o citomegalovirus. 3. Candida oral no respon
de a la quimioterapia, no va asociada a la dermatitis de paal o anlibioterapia ex
cesiva, o persiste despus de seis meses de evolucin. 4. Candida est presente en sup
erficies mucosas y se traslada a reas cutneas contiguas a modo de candidiasis muco
cutnea. 5 El paciente sufre enanismo de miembros cortos (El pelo puede ser muy fi
no y tejidos laxos con hiperexlensibilidad de articulaciones y gran hernia umbil
ical) 6. Hay signos de enfermedad intrauterina de injerto contra husped (p. ej. d
escamacin, eritrodermia, alopecia, defectos en el desarrollo). 7. Enfermedad de i
njerto contra husped se produce tras la infusin de un hemoderivado 8. Se produce t
etania neonatal. (Buscar mandbula hipoplsica. surco nasolabial corto, orejas de im
plantacin baja con el pabelln corto, hipertelonsmo de anomala de DiGeorge.) 9. Lint
ocitos pequeos (< 10 en dimetro) con recuento permanentemente menor de 1 200/mm .
10. Infecciones debidas a organismos oportunistas o se produce un sarcoma de Kap
osi generalizado Buscar factores de riesgo asociados con sida. Se piensa en una
deficiencia de clulas B cuando 1. Infecciones recurrentes con pigenos exlracelular
es, Streptococcus, Staphylococcus. Haemophilus. 2. Hiperplasia linfoide nodular
de intestino es persistente 3 Infeccin intestinal por Giardia j Se piensa en un d
efecto combinado de clulas T y B cuando 1 Hay signos del sndrome de Wiskot-Aldnch
(supuracin de odos, trombocitopenia, diarrea sanguinolenta, eczema en el varn). 2 H
ay signos de ataxia-telangiectasia (La ataxia es el principal signo de la enferm
edad, especialmente cuando el nio crece Una caracterstica predominante es la telan
giectasia de la esclertica y los odos. La expresin facial es triste.) 3 Los sntomas
antes mencionados de las enfermedades de clulas T y B se producen juntos. Se pien
sa en un defecto bioqumico cuando 1. Hay sntomas de defectos combinados T y B con
cambios caractersticos en las radiografas en costillas, omoplatos, vrtebras (defici
encia de adenosina deaminasa). 2. Hay aplasia medular primaria de glbulos rojos y
otros sintomas del sndrome Blackfan-Diamond (deficiencia de nuclesidofosforilasa)
. Se piensa en un defecto de leucocitos cuando 1. Hay abscesos estaliloccicos de
piel recurrentes y graves; se pueden observar abscesos prolundos de rganos intern
os, pero menos habitualmente (sndrome hiperlgE o sndrome de Buckley-Job). Ms adelan
te aparecen abscesos en pulmn en casi todos los pacientes con sndrome hiperlgE 2.
Osteomielitis crnica o recurrente, nodulos linfticos que supuran, particularmente
cuando son causados por especies de Klebsiella o Serraba (enfermedad crnica granu
lomatosa). Se piensa en una inmunodeficiencia secundaria cuando 1 Hay una infecc
in viral concomitante o anterior (especialmente virus de Epstein-Barr. VIH). La i
nfeccin viral puede producirse en el tero y producir una enfermedad inmunodeficita
ria en el feto. 2. El paciente tiene determinadas enfermedades malignas (p. ej..
leucemia linloctica crnica, enfermedad de Hodgking. mieloma mltiple). 3 Se produce
acidosis, alopecia y convulsiones con candidiasis mucocutnea crnica (deficiencia
de botina) Deficiencias de biolina, zinc y selenio pueden producirse en paciente
s con prolongada hiperalimentacin.
3
4. El paciente est recibiendo inmunosupresores. 5. El paciente tiene una historia
consecuente con posible exposicin a VIH. 6. El paciente tiene los sintomas clnico
s de acrodermatitis enteroptica (deficiencia de zinc puede tambin ocurrir con hipe

ralimentacin prolongada).
I VIH = Virus de inmunodeficiencia humana

CAPITULO 42

TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
967
Subclases de IgG
La IgG consta de cuatro subclases, de la IgGl a la lgG4. que se distinguen por d
iferencias tanto estructurales como biolgicas (vase Tabla 30-4 y Tabla 42-7) (Norm
ansell, 1987; Schur, 1987). Aunque no se ha establecido el papel individual de c
ada una de las subclases de la IgG para diferenciarse del resto, los anticuerpos
a los antigenos de los carbohidratos se concentran en la subclase lgG2, y mucho
s antgenos de las paredes de las clulas bacterianas tienen naturaleza de carbohidr
ato (Scott, 1988). Asi. la ausencia de respuesta a lgG2 podra traducirse en un de
fecto para desarrollar proteccin (rente a infecciones bacterianas. Esta relacin es
ms convincente en el paciente ocasional con deficiencia de IgA que tambin tiene d
eficiencia de la subclase lgG2 y que no responde con anticuerpos ante una vacuna
c o m o la del neumococo. En aquellos pacientes con deficiencia de IgA e lgG2,
las pruebas de funcin pulmonar pueden ser significativamente anormales comparadas
con aquellos slo con deficiencia de IgA (Bjorkander, 1985). Una deficiencia en l
a subclase IgG tambin se ha sealado como causa de infecciones recurrentes en pacie
ntes con niveles normales o casi normales de IgG (Oxelius. 1979: Shackelford. 19
90: Wedgwood, 1986: Gross, 1992; Popa. 1994). A pesar de estos indicadores, la i
mportancia biolgica de la deficiencia de la subclase IgG no est clara. De hecho, a
lgunos individuos que carecen totalmente de genes para lgG2 IgA e IgE. estn sanos
(Lefranc. 1982: Migone, 1984). Adems, los anticuerpos anticarbohidrato lgG2 no s
on la nica fuente de proteccin de anticuerpos para estos antigenos. En realidad, u
na deficiencia significativa de anticuerpos, limitada a reacciones frente a anti
genos de carbohidratos, o ms defectos globales, se pueden encontrar en nios o adul
tos con niveles normales de inmunoglobulina total en suero (Ambrosmo. 1988). La
IgGl es el primer tipo de subclase de respuesta frente a antgenos de carbohidrato
s, producindose una conversin a respuesta lgG2 a medida
Figura 42-2. El espectro de agentes infecciosos encontrado puede indicar el sist
e m am m u n i t a r i o donde se encuentra el potencial detecto.
Pueden aparecer anormalidades seas en pacientes con el sndrome de hiperinmunoglobu
lina IgE: estas anormalidades incluyen osteoporosis generalizada, fracturas ante
un mnimo traumatismo, craniosinostosis y defectos en huesos de la lnea media (Gri
mbacher, 1999).
Funciones pulmonares
La inmunodeficiencia. especialmente si ha persistido durante algn tiempo, a menud
o afecta a las funciones pulmonares, a todos los volmenes pulmonares, debiendo ev
aluarse los volmenes espiratorios forzados, incluso si la radiografa de trax es nor
mal. Los pacientes con defectos de clulas B y T son propensos a infecciones pulmo
nares, que terminan en broncoespasmo, enfermedad restrictiva u obstructiva, o co
mbinaciones de estas anormalidades.
Tabla 42-6 Niveles de pruebas inmunolgicas Nivel* Primer nivel Medida
INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL Produccin de anticuerpos
Para reconocer el significado clnico de los niveles algo reducidos de mmunoglobul
ina en suero, se miden las respuestas especificas de los anticuerpos a antgenos p
reviamente administrados o que ya existen. Si el nio o el adulto recibieron previ
amente las inmunizaciones habituales, pueden cuantificarse los ttulos de anticuer
pos para los antgenos de esas vacunas. Si el nio no ha sido inmunizado o para los
adultos donde ha transcurrido ms tiempo desde la vacunacin, se debe producir una r

espuesta tras la administracin de la vacuna de recuerdo (Moen, 1986)). Las mejore

s respuestas a vacunas suceden con el ttanos, difteria, haemophilus y neumococos;
muchos laboratorios comerciales han desarrollado pruebas de sensibilidad que pu
eden utilizarse para calcular la produccin de anticuerpos. Lo que no est tan claro
es cmo interpretar cada respuesta; en general un aumento de dos a tres veces o ms
por encima de los niveles de referencia, y la existencia de niveles protectores
de anticuerpos, significa una adecuada respuesta a estas vacunas. Es importante
recalcar que no deben administrarse vacunas de virus vivos a los nios, o a cualq
uier miembro de la lamilia si se cuestiona el estado inmunolgico. Las vacunas del
sarampin, paperas, rubola, polio, bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y varicela no p
ueden ser usadas en esta poblacin. Si el paciente no tiene el grupo sanguneo AB, s
e pueden determinar los niveles de las isohemaglutininas A o B que convengan (Pa
rker, 1997). Sin embargo, debido a la relativa inmadurez, o quiz a la inadecuada
exposicin a edades menores de dos o tres aos, las isohemaglutininas pueden ser neg
ativas o de ttulos baios en nios pequeos, incluso en aquellos que tienen la inmunid
ad normal.
Historia y exploracin fsica CBC y diferencial Nmero de linfocitos (mortologia de li
nfocitos) Niveles cuantitativos do inmunoglobulina Radiografas Cultivos Funciones
pulmonares | Segundo nivel Respuestas a anticuerpos especficos Anlisis de subclas
e IgG Prueba de complemento Pruebas cutneas de hipersensibihdad retardada Anlisis
de marcadores de superficie de linfocitos Estudios de proliferacin de clulas monon
ucleares (usando clulas mitogmeas. alognicas y estimulacin de antigenos) Reduccin de
neutrfilos con tincin (equivalente al citmetro de flujo NBT) Tercer nivel Medidas d
e enzimas (adenosina deaminasa. PNP") Estudios de citotoxicidad de clulas NK Estu
dios de fagocitos (movilidad, glucoproteinas de superficie, bioqumica) Anlisis de
estructura e inmunohistolgico de rganos linfoides Produccin de citocnas Estudios com
plejos de complemento; defectos genticos Nuevos antigenos a pruebas de produccin d
e anticuerpos Biologa molecular, deleccin de portadores. diagnostico prenatal
" El nivel de medida se refiere a la localizacin clnica en la que se realiza y se
interpreta la prueba Las pruebas de primer nivel se obtienen fcilmente en hospita
les locales o en laboratorios comerciales El mdico de primaria dobe ser capaz de
interpretar estos valores. Las pruebas de segundo nivel se realizan si las condi
ciones clnicas lo justifican y algunas pueden necesilar mdicos con formacin especia
lizada para determinados anlisis Las pruebas de tercer nivel se realizan e interp
retan en centros con un inters aelrvo de investigacin en el tema. CBC recuento com
pleto de sangre NBT = nilroazul de tetrazolium; PNP = purina nuclesido fosforilas
a; NK = clulas asesinas naluraies

968
,
__
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
.
.
,
Tabla 42-7
Propiedades d e las inmunoglobulinas h u m a n a s IgM IgG IgA IgD

A. Fisiolgicas Concentracin normal en adultos, mg/ml 1.2-4,0 8.0-16.0 0,4-2.2 0,03

17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <10O Porcentaje t
otal de inmunoglobulina 13 80 6 1 0.002 Distribucin intravascular, porcentaje 41
48 76 75 51 Ritmo de sntesis, mg/kg/dia 2,2 35 24 0,4 0.003 Ritmo de catabolismo
en suero, 10.6 6 24 37 90 porcentaje/dia (o semivida. da) (5-6) (18-23) (5-6,5) (
2.8) (2.3) B. Biolgicas i Capacidad de aglulinacin +4 Capacidad de fijacin de compl
emento por la ruta clsica +4 + Hipersensibilidad homologa anafilctica +4 Anafilax
s heterloga de cobaya + Fijacin a mastocitos y basfilos homlogos +4 Unin citoflica
acrtagos + Transporte placentario al feto + Actividad de fijacin al factor reumato
ide + Presente en secreciones externas +4 +2 + Otras propiedades caractersticas:
IgM Producida rpidamente en respuesta inmune, primera defensa electiva contra la
bacteriemia IgG: Combate microorganismos y toxinas en fluidos extravasculares Ig
A Deliende las superficies externas del cuerpo IgD- Presente en superficie de li
nfocitos o clulas inmunocompetent.es, importante para la activacin y/o mmunorregul
acin de clulas B
;

_
.J
que el individuo madura (Scott, 1988). No hay evidencia de que los que se limite
n slo a respuestas IgG 1 tengan ninguna desventaja. Es obligatorio determinar la
importancia biolgica de una deficiencia en la subclase IgG, probando con una prod
uccin especfica de anticuerpos, generalmente mediante la administracin de vacunas c
omo ttanos, difteria, haemophilus y neumococo. Solamente se debera considerar que
tienen un defecto de inmunidad significativo aquellos sujetos con una deficienci
a clara de anticuerpos a un nmero de antgenos.
Valoracin funcional de las clulas T
Las pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada se utilizan habitualmente como
medidas de funcin de las clulas T. porque miden la capacidad de reconocer y de pr

esentar el antigeno, movilizar las clulas T y generar una respuesta especfica infl
amatoria. Y a sean los nmeros de clulas T normales, bajos o nulos, se debe comprob
ar la funcin de las clulas T si existe cualquier sospecha de existencia de un defe
cto celular de esta naturaleza. Sin embargo, el principal inconveniente cuando s
e realizan pruebas cutneas en lactantes es que no han tenido suficiente exposicin
para responder a los antgenos (Kniker, 1985). Asi, en el momento en que la valora
cin de las clulas T es particularmente importante, estas pruebas son inservibles.
Entre los tres y los cinco aos de edad, las pruebas cutneas adquieren ms fiabilidad
. Otro problema con las pruebas cutneas es que el antgeno debe ser inyectado intra
drmicamente con cuidado. Una idea ms definitiva sobre la capacidad funcional de la
s clulas T se puede obtener mediante valoraciones funcionales. Junto con las prue
bas cutneas utilizadas como mtodos de deteccin, para valorar la funcin de las clulas
T se emplea habitualmente una respuesta proliferativa in vilro. Se emplean gener
almente tres tipos diferentes de estimulo: mitgenos. antgenos y menos habitualment
e, aloantgenos. Los mitgenos son inespecificos (generalmente extractos de plantas)
, y estimulan linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ independientemente de la especif
icidad de los antgenos. Los aloantgenos (antgenos presentes en las clulas que contro
lan el rechazo en los trasplantes de rganos o tejidos) tambin estimulan las clulas
CD4+ y CD8+ de una forma relativamente inespecfica; en la prclica se pueden usar cl
ulas mononucleares irradiadas de un individuo sin parentesco. Las respuestas pro
liferativas a estos estimuladores indican la presencia de clulas T, pero una resp
uesta no garantiza la capacidad de eliminar los agentes infecciosos del husped. L
os pacientes con deficiencias significativas de clulas T pueden presentar alguna
respuesta mitgena o aloantgena. La prueba mejor relacionada con la capacidad a res
istir infecciones es la de las respuestas proliferativas a antgenos especficos (Lae
, 1985). En el caso de antigenos especficos se usa habitualmente ttanos, difteria
y candida. Se requiere una exposicin suficiente al antgeno para una respuesta posi
tiva; por consiguiente la proliferacin ante estmulos antignicos es poco habitual en
nios durante el primer ao de vida. Otra medida de respuestas especficas de clulas T
, que puede incluso utilizarse en lactantes, es cultivar clulas mononucleares de
sangre perifrica con concentraciones mitognicas del anticuerpo
Inmunidad de clulas T
El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha permitido la rpida enumeracin de clula
s T y subgrupos de clulas T, usando slo una pequea cantidad de sangre. Estos marcad
ores de anticuerpos se han clasificado, con la designacin "CD". para "antgenos de
diferenciacin"("c/usfer ol differentiation"). lo que quiere decir que un grupo de
anticuerpos monoclonales identifica una protena caracterstica determinada de un s
ubgrupo de clulas mononucleares seleccionadas. La designacin CD subdivide a las clu
las T (como un grupo, CD3-*-) en dos principales subgrupos, CD4+, algunas veces
llamadas clulas "colaboradoras", clulas involucradas en el inicio de las reaccione
s inmunes, secrecin de citocinas y aumento de respuestas de clulas B, y clulas T CD
8+. asociadas con funciones citolilicas (asesinas). Aunque estas actividades fun
cionales definen alguna de las actividades inmunolgicas de las clulas T CD4+ y CD8
+. ambas molculas sirven como molculas sealizadoras, que funcionan en unin con las p
rincipales clases I y II de histocompatibilidad de antigenos (MHC), y sirven par
a ampliar y estabilizar la unin del receptor de la clula T (TCR) con el antgeno. La
s enfermedades con inmunodeficiencia que derivan de la generacin defectuosa de clu
las T pueden dar lugar a un nmero bajo o nulo de clulas T CD3+, produciendo un baj
o nmero de clulas CD4+ y CD8+, o un nmero reducido de clulas CD4+ o CD8+. El sndrome
de DiGeorge, por ejemplo, provoca un nmero bajo de clulas CD3+ en general (Hong, 1
998); una deficiencia de la clase II MHC provoca un nmero bajo de clulas CD4+ (Kle
in,1993); y una anormalidad de la clula iniciadora, Zap-70. esencial a la activid
ad del receptor de las clulas T, provoca un nmero reducido de clulas T CD8+ (Eider.
1998). En general, si se sospecha un defecto inmunitario, se examina este panel
de marcadores de clulas T y se determina el nmero absoluto de clulas en cada grupo
, comparndolo con los controles normales de edad similar establecidos por el labo
ratorio.

CAPTULO 42

T R A S T O R N O S INMUNODEFICITARIOS
969
monoclonal anti CD3; este estimulador normalmente produce la proliferacin de loda
s las clulas T CD3+, mientras que la ausencia de proliferacin demuestra un grave d
efecto de clulas T (Hong, 1996).
zados de conejo; estas clulas son potentes activadores de la via alterna. Si algu
no de los ensayos es anormal, la identificacin del componente individual que es d
eficiente depende de pruebas inmunoqumicas o funcionales especializadas que sean
especficas para cada componente, (vase Cap. 38).

Anlisis de leucocitos polimorfonucleares

La enfermedad granulomatosa crnica (EGC) es la principal enfermedad de leucocitos
polimorfonucleares. Sus principales manifestaciones son adenopatia, neumona, abs
cesos en el hgado o los nodulos linfticos, y osteomielitis; la forma de herencia e
s ligada al sexo (la ms habitual) o recesiva autosmica (debido a mutaciones que af
ectan a las posiciones de los cromosomas 16p24,7q11.23 o 1 q25). El principal de
fecto es el error metablico que provoca el fracaso de la reaccin metablica que sigu
e a la ingestin fagoctica de las bacterias (Meischl. 1998). En consecuencia, no se
reduce el oxigeno molecular a superxido. No se produce el radical hidroxilo y el
perxido de hidrgeno y se pierde un importante mecanismo intracelular de eliminacin
bacteriana (Babior, 1978). Este defecto se compensa parcialmente por organismos
que producen perxido de hidrgeno en el interior de las clulas. En la enfermedad crn
ica granulomatosa, los organismos productores de catalasa, que destruyen el perxi
do de hidrgeno citoplsmico. sobreviven a la ingestin intracelular, se multiplican y
causan una respuesta de tejido granulomatoso. El Staphylococcus aureus es el mi
croorganismo involucrado ms habitual. Las infecciones crnicas con Serratia, especi
es de Klebsiella, Pseudomonas (ahora Burkholderia) cepacia, y especies de Asperg
itlus son particularmente molestas (Gallin. 1983. 1990). Ante una historia suges
tiva, se debera considerar en la primera consulta este diagnstico. La prueba llama
da la prueba del nitroazul de tetrazolium (NBT) es el mtodo clsico de laboratorio
para detectar la EGC (Park, 1968), pero ha sido sustituida en muchos laboratorio
s por un equivalente de citometria de flujo (0' Gorman, 1995) que se adapta mejo
r al estudio de muestras clnicas. Otra prueba de deteccin de la EGC es la medida d
e luminiscencia y produccin de superxido (Gallin, 1983, 1990) pero estas pruebas n
o se realizan en la mayora de los laboratorios. La caracterstica biolgica tundament
al del leucocito en la EGC es que fagoctar a las bacterias normalmente, pero no la
s destruir. Este comportamiento constituye la base de un ensayo de muerte de bact
erias para EGC El sndrome de hiperinmunoglobulina IgE (Buckley, 1978) es de algun
a form a fenotpicamente similar a la EGC, con abscesos recurrentes de piel y pulm
onares, pero incluyendo tambin anormalidades seas, facies anormales y candidiasis
cutneas: sin embargo, la funcin defectuosa de los PMN no es un rasgo claro de esta
enfermedad (Buckley, 1978). El defecto inmunitario en el sndrome de hiperlgE tod
ava no est muy definido y es difcil la clasificacin o asignacin de una causa inmunolg
ca o molecular. En una situacin de abscesos cutneos recurrentes y profundos, que g
eneralmente requieren incisiones para su control, debera considerarse el sndrome d
e hiperlgE. El diagnstico se sugiere por la manifestacin de niveles de IgE superio
res a 2.000 Ul/ml (pero tan elevados como 20.000 a 60.000 Ul/ml) con las manifes
taciones clnicas correspondientes (Grimbacker, 1999). Todava no estn disponibles pr
uebas diagnsticas o de confirmacin; sta es una enfermedad reconocida por un fenotip
o clnico, aunque se ha identificado una posible localizacin cromosmica (Grimbacher,
1999).
INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL Medidas enzimticas

Las deficiencias enzimticas relacionadas con el metabolismo de las purinas, adeno

sina deaminasa (ADA) y purina nuclesido fosforilasa (PNP) estn asociadas con defic
iencias inmunolgicas. El mecanismo bsico es el acumulo de metabolitos txicos que in
hiben la replicacin celular, produciendo finalmente la prdida de importantes linea
s celulares de linfocitos. La falta de adenosina deaminasa, que cataliza el cata
bolismo de adenosina a inosina, produce primero la prdida de clulas T (clulas T CD4
+ en particular) y con posterioridad clulas B. conduciendo a una forma comn de def
iciencia grave combinada de clulas T y B (Hirschhorn, 1995). Aproximadamente el 2
5% de las inmunodeficiencias severas combinadas (IDSC) son causadas por la defic
iencia de ADA. A menudo se observan anormalidades seas caractersticas que afectan
a las caderas, pelvis y omoplatos (Cederbaum, 1976). Como para muchos de los def
ectos inmunitarios primarios que primero fueron identificados en su forma grave,
la deficiencia de ADA tambin se ha diagnosticado en adultos con linfopenia de CD
4 y defectos significativos de clulas T (Shovlin, 1994). La deficiencia de PNP pr
ovoca deficiencia de clulas T con un efecto mnimo o nulo sobre las clulas B. Las en
zimas generalmente se miden en usados de hemates (Kizaki, 1977), pero si se han h
echo transfusiones sanguneas en los tres meses previos, el ensayo puede no ser ex
acto, y en su lugar se deben determinar en los fibroblastos de la piel, extrados
de una biopsia de piel.
Histologa
El timo normal y tejidos linfticos muestran rasgos estructurales caractersticos qu
e estn alterados o ausentes en las inmunodeficiencias (Borzy, 1979; Hong. 19996:
Abbas, 1994). En la prctica clnica actual, a menudo estos tejidos no estn disponibl
es, pero cuando se obtienen estos materiales de las biopsias, el examen microscpi
co de estos tejidos debera incluirse en la evaluacin inmunolgica. Las pruebas in vi
lro de las clulas obtenidas de estos tejidos son bastante reveladoras cuando se e
studian mediante reactivos monoclonales dirigidos a tipos especficos de clulas y m
arcadores activos.
Ensayos con clulas asesinas naturales
Las clulas NK forman un subgrupo de clulas, relacionadas con las clulas T. pero car
entes de un receptor para clulas T y con morfologa de grandes linfocitos granulare
s. Las clulas NK son detectadas por CD16, CD56 y CD57; la actividad ltca se correla
ciona mejor con la poblacin CD56+ (Trinchieri, 1989). La actividad funcional de l
as clulas N K puede medirse por ensayo de citotoxicidad Irente a una linea celula
r como K562; esto puede ser importante en el diagnstico de IDSC, el sndrome de Chdi
ak-Higashi y casos raros de deficiencia de clulas NK aisladas. Slo se ha descrito
un caso de ausencia completa de clulas NK. Este paciente presentaba importantes c
omplicaciones con varicela, herpes y citomegalovirus, pero era capaz de resistir
otras infecciones de manera normal (Biron, 1989).
Evaluacin del complemento
Se han descrito un nmero de defectos congnitos del sistema complemento: defectos i
ndividuales que conducen a 1) sndromes clnicos claros como angioedema hereditario
o la hemoglobinuria paroxistica nocturna, o a 2) una tendencia a enfermedades ba
cterianas recurrentes, o a (3) enfermedades autoinmunes (Schneider, 1999). Mucha
s de las deficiencias genticamente determinadas de la via de activacin clsica (C1,
C2, C3, C4) y de los componentes terminales (C5, C6, C7, C8 y C9) pueden detecta
rse mediante hemates de oveja sensibilizados con anticuerpos en un ensayo complet
o del complemento hemoltico (CH50). Este ensayo requiere de la integridad funcion
al de C1 hasta C9. Muchos laboratorios comerciales realizan este ensayo, pero pa
ra realizar la prueba con exactitud es necesario el suero recin extrado o que el p
lasma est congelado. Lo menos habitual son las deficiencias de los factores D, H,
e I y properdina componentes de la va alterna, que pueden detectarse por un ensa
yo hemoltico distinto que utiliza hemates no sensibiliAnlisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares
Aparte de la EGC, otros defectos de los PMN incluyen los defectos de mieloperoxi
dasa. y enfermedades de adhesin y movilidad celular. La deficiencia de mieloperox

idasa, heredada como un defecto autosmico recesivo, tiene una importancia clnica d
esconocida, habiendo sido descrita tanto en individuos asintomticos como propenso
s a la infeccin (Lehrer, 1969; Klebanoff, 1999). Los leucocitos, transportados a
travs del sistema circulatorio, son atrados a las reas de inflamacin interaccionando
con los receptores de clulas endoteliales conocidos como selectinas, que nteracci
onan con ligandos carbohidratos de los leucocitos tales como el sialyl-Lews" (ant
igeno del grupo sanguneo Lewis). Esto provoca una lenta accin rodante (rolling) a
lo largo de la pared del vaso, que "aparca" esencialmente la clula circulante, De
s-

970
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOIOGA res de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, e IL-15 (Candotti, 1997
). Como el IL-7 es esencial para el desarrollo normal de las clulas T del timo, u
n defecto en el receptor de IL-7 aislado provoca otra versin de IDSC (Puel, 1998)
. Hay otras enfermedades congnitas de inmunodeficiencia donde s e ha identificado
el defecto de una sola citocina. En varios casos raros, la carencia de secrecin
de defectos del receptor IL-2 en un nio constituye la base para el dficit inmunita
rio (Doi. 1988; Arnaz-Villena, 1992). Se ha descrito la deficiencia de IL-1 (Chu
, 1984). Otro defecto de citocinas, ms recientemente descrito, es el de la secrec
in de IL-12. que provoca una grave susceptibilidad a micobacterias y salmonela. O
tros sujetos, que tienen una mutacin en el receptor de INF-y. tienen la misma pre
sentacin clnica (deJong, 1998); Jouangy, 1999). En este momento se han clonado 18
citocinas que tienen una accin primaria sobre el sistema linltico (llamadas interl
eucinas). Se estn investigando las actividades biolgicas de cada una (Vanse Caps. 3
8 y 39).
pues, la activacin del leucocito provoca una expresin aumentada de las |5-2 integr
inas (CD11/18), que causa una firme adhesin de la clula a la pared del vaso, sigui
endo con la emigracin y la infiltracin del tejido (McEver, 1992). Aparecen anormal
idades de adhesin a la clula si hay defectos de la integrina CD18. la cadena p comn
de LFA-1, Mac-1 y molculas p150,95 (deficiencia de adhesin al leucocito [LAD-1])
(Anderson. 1987). Esta anormalidad provoca un desprendimiento postergado del cor
dn umbilical, lceras cutneas crnicas, periodontitis y leucocitosis. Las clulas afecta
das son los neutrfilos. monocilos. macrfagos. linfocitos y clulas NK. Hay defectos
demostrables de adherencia y funciones adhesin-dependientes como la difusin, fagoc
itosis y orientacin quimiotctica (Anderson, 1987). Tambin hay una segunda forma de
esta enlermedad deficitaria, que afecta principalmente a los neulrfilos y macrfago
s, donde un fallo en la expresin de un ligando selectina sialyl- Lewis' y un fall
o de conversin de GDP maosa en fucosa. provoca un sndrome clnico similar, pero aport
a a los individuos el grupo sanguneo Bombay (LAD-2) (Etzioni, 1993), Los defectos
congnitos de la movilidad de los neutrfilos se producen en las enfermedades de de
fectos de adhesin antes citadas, as como en otras enfermedades de neutrfilos, sndrom
e de Schwachman. sndrome de Chdiak- Higashi y deficiencias de granulos especficas.
Las dos primeras pueden reconocerse por los signos clnicos: hay anemia, trombocit
openia, insuficiencia pancretica en la primera y albinismo parcial oculocutneo en
la ltima (Inlrone, 1999). El examen morfolgico de los neutrfilos teidos muestra las
anormalidades caractersticas en la deficiencia de granulos especficos (Ganz. 1988)
. La quimiotaxis de los PMN tcnicamente es una prueba de laboratorio difcil y los
resultados irregulares pueden deberse simplemente al laboratorio (Cates. 1981) U
na quimiotaxis escasa a menudo es un signo inconstante de enlermedad; asi, no mu
estra una correlacin consistente con la sintomatologia. La evaluacin total de los
trastornos del movimiento exige una relacin ms estrecha con todo el cuadro clnico y
extensa experiencia clnica. La movilidad de los leucocitos generalmente se evala
por la migracin directa a travs de filtros de membrana o con agarosa (Nelson, 1975
: Cates. 1981). Otras pruebas para valorar la movilidad de los PMN incluyen inye
cciones de epinefrina y esteroides. que hacen que los PMN se desmarquen y abando
nen las reservas de la mdula. Se ha descrito una alteracin de actina, importante e
n la migracin de los PMN (Southwick. 1988). La ventana cutnea de Rebuck. que muest
ra la duracin y caractersticas de las clulas de la migracin en la piel, se utiliz en
el pasado para describir la respuesta inflamatoria pero no ha tenido mucha aplic
acin clnica (Southam. 1966); sin embargo, es un indicador biolgico real de las func
iones de los neutrfilos in vitro.
Marcadores adicionales de superficie celular
Para investigar la relacin proporcional de vanas subpoblaciones presentes de linl

ocitos. monocilos y clulas NK. existen un nmero de anticuerpos monoclonales, que p

ueden utilizarse en el anlisis de citometria de flujo en muestras de sangre inclu
so m u y pequeas. Adems de los marcadores d e superficie de clulas caractersticos de
las clulas T, clulas T colaboradoras o clulas T supresoras, clulas B o clulas NK. st
s y otros tipos de clulas se caracterizan por molculas superficiales funcionales,
tambin designadas como "CD" (del ingls: cluster o dilferentiation). En la Tabla 428 se explica un nmero de estos anticuerpos y sus blancos especficos. Al igual que
otros marcadores de clulas T, la mayora de las clulas T se unen al antigeno, median
te un receptor que consta de cadenas a y p Casi un 5% tiene un receptor compuest
o de cadenas y y 6. Estas clulas T se conocen como clulas T <r. / p y y i 6. respe
ctivamente; ambas pueden ser evaluadas por anticuerpos monoclonales apropiados y
tcnicas de tincin fluorescente. La seleccin positiva o negativa de las clulas T a /
13 viene determinada por la afinidad de la interaccin del receptor de la clula T c
on sus propios antgenos presentados como fragmentos de pptidos que estn en el retcul
o endoplsmico de las molculas MHC clase II y /o clase I de las clulas del estroma l
imico. Las clulas T y 1o" no expresan CD4 o CD8 durante la maduracin intratmica, y
la seleccin clonal no aparece esencial para la maduracin. La funcin del grupo minor
itario, las clulas y 15. no est clara. En contraste con las clulas T a / |i. las clu
las T yl 5 pueden unirse a dianas que no forman complejo con los antigenos del t
rasplante. Asi, pueden representar un mecanismo ms primitivo de defensa, anlogo a
la activacin alternativa del sistema de complemento, capaz de responder a los mic
robios previo al desarrollo de la inmunidad especifica. Las clulas localizadas en
el epitelio intestinal, linlocitos intraepiteliales, son principalmente del tip
o y / 6 (Abbas, 1994). No ha aparecido ninguna enfermedad congnita de inmunodefic
iencia que produzca una expresin defectuosa de las clulas T de las cadenas ut' |i
o y' 6. Sin embargo, se han descrito varios defectos de expresin del receptor de
CD3 (Alarcn. 1993) incluyendo una expresin escasa del complejo CD3 en su conjunto
y defectos heredados de las cadenas yo del receptor de clulas T. Se han descrito
mutaciones congnitas que afectan a la expresin de molculas MHC clase I y clase II.
Las molculas clase II se encuentran principalmente en las clulas presentadoras de
antgeno. que inician la respuesta inmune. Como se podra predecir, los defectos gent
icos en las molculas MHC clase II (de mutaciones que implican activacin del gen de
transcripcin de las MHC clase II) provocan un profundo estado de inmunodeficienc
ia, donde hay defectos de clulas T y de clulas B: en este sndrome, las clulas T CD4t pueden ser normales en nmero o deficientes (Klein, 1993). Los antgenos de clase
I se expresan en casi todas las clulas, y la eliminacin de un antigeno extrao puede
efectuarse por la unin de clulas T CD8+. Raramente, los delectes inmunes que prov
ocan deficiencia de clase I, una mutacin que incluye alguno de los transportadore
s peptidicos citoplsmicos de las MHC clase I, TAP-1 o TAP-2. producen un delecto
inmune caracterizado por una enfermedad pulmonar grave que se manifiesta en la i
nfancia tarda (Donato, 1995. de la Salle, 1999). El diagnstico de ambos defectos i
ncluye el examen de la expresin de estos antigenos MHC o clulas linfticas d e sangr
e perifrica.
Citocinas y receptores de citocinas
Las respuestas inmunitarias estn reguladas por los mediadores solubles, llamados
citocinas. que producen una mulliplicidad de acontecimientos inmunes mediante in
teracciones con los receptores de citocinas apropiados Muchas de estas citocinas
y receptores se han caracterizado. Los efectos de las citocinas son a menudo mlt
iples, con diferentes efectos en diferentes clulas (Lederer, 1995). Los receptore
s de las citocinas pueden contener cadenas compuestas, comunes a receptores para
varias citocinas diferentes; esto se repite en el sistema hematopoytico. donde l
os receptores para interleucina-3 (IL-3), IL-5 y el factor estimulante de coloni
as de granulocitos y macrfagos (GM-CSF) utiliza una cadena p comn, y el sistema li
nftico, cuyos receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-5 comparten otra cadena
p comn. En el ltimo caso, esta cadena p est codificada en el cromosoma X: la prese
ncia comn de esta cadena en este grupo de receptores de citocina esenciales es la
razn de por qu un defecto molecular a este nivel provoca un estado de inmunodefic
iencia profunda como la inmunodeficiencia ligada al cromosoma X (Noguchi, 1993;
Puck, 1993). Un mecanismo que es comn a un nmero de receptores de citocinas con do

s o ms cadenas es la fosforilacin y activacin de varios miembros de la familia de l

a cinasa Jak: stos incluyen IL-2, IL-3, IL-4. IL-5, IL-6. IL-7. IL-9, IL-10, IL-1
1, IL-12, IL-13. IL-15, GM-CSF, intertern-a (IFN-u), IFN-ji e IFN-y. Podra esperar
se que los defectos en la cinasa Jak especifica simulasen un defecto de la citoc
ina, o de su receptor; un ejemplo de esto es la versin de IDSC provocada por una
mutacin de Jak3, la cinasa asociada con la cadena p comn de los recepto-

CAPTULO 42

TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS
971
Tabla 42-8
Marcadores d e superficie d e leucocitos Comentario Timocilos corticales Clulas T
. clulas NK, receptor LFA-3 Parte del complejo del receptor de clulas T. un marcad
or pan-T Clulas T reactivas con antigeno HLA clase II (clulas colaboradoras) Marca
dores pan-T; presentes en un subgrupo de clulas Clulas T reactivas con antgeno HLA
clase I (clulas asesinas) Clulas T; activadas; limocitos, lugar de estimulo a la s
egunda seal Leucocitos excepto clulas (leucosialino): reducido en el sndrome de Wis
kolt-Aldrich Clulas T vrgenes (naive) (que no han reaccionado con antigenos), reci
entemente emigrado del timo Clulas T de memoria Antigeno comn de leucemia linlobla
stica aguda (ACLLA) Marcador pan-B Marcador pan-B Receptor CR2, EBV Marcador pan
-B Clulas activadas macrfagos, eosinfilos, plaquetas; el FcRIl de baja afinidad Clul
as B, carcinomas, monocitos; asociado con cambio de isotipo Linfoma de Burkitt C
R3, receptor C3bi Receptor CR4 Monocitos, granulocitos, clulas de Langerhans, mac
rfagos Clulas NK, granulocitos, macrlagos: el receptor FcRIIIA, FcRIIIb Clulas precu
rsoras hematopoyticas, clulas endoteliales Granulocitos, monocitos, NK, clulas B: e
l receptor CR1/C3b
FCYRIII
Marcador Series de clulas T CD1a CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD28 CD43 CD45 CD45RO Series
de clulas CD10 CD19 CD20 CD21 CD22 CD23 CD40 CD77 Series mieloides CDl 1b CD11c
CD14 CD16 CD34 CD35 Series NK
CD16
CD56 CD57 Molculas de adhesin CD11a CD11b CD11c CD18 CD62E CD62L CD62P Marcadores
de activacin CD25 CD30 CD38 CD69 CD70 CD71 CD154
Clulas NK (N-CAM, NKH-1); con CD16 usados para enumerar el nmero de NK en sangre p
erilrica Clulas NK. subgrupo clulas T (HNK-1) Leucocitos, cadena L-integrina (ligan
do ICAM-l) Granulocitos. monocitos, clulas NK; cadena M integrma del complejo LFA
-1 (MCA-1. fibringcno y receptor C30i) Granulocitos. monocitos, clulas NK; cadena
X integrma de LFA-1, gp 150-95 Leucocitos (integrina, cadena |5 de CD11) E- sele
ctina, ELAM-1. clulas activadas endoteliales L-selectina, clulas T y B, monocitos,
clulas NK. PMNs. eosinfilos. clulas progenitoras (LECAM-1.LAM-1) P-selectina; plaq
uetas activadas, clulas endoteliales Clulas y T activadas (receptor IL-2) Clulas y
T activadas, clulas Reed-Sternberg Clulas T activadas inmaduras Clulas y T activada
s clulas NK. macrfagos Clulas y T activadas, clulas Reed-Sternberg (ligando CD27) Re
ceptor de transierrina El ligando para CD40 en clulas B. asociado con hiper IgM
Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA
En el caso de ausencia completa de IgA. deberan determinarse los anticuerpos para
IgA, ya que la presencia de estos anticuerpos provoca anaflaxia en el transcurso
de la administracin intravenosa de productos sanguneos que contengan IgA. Los pac
ientes con deficiencia en IgA presentan una incidencia aumentada de enfermedad a
utoinmune y. dependiendo de la historia clnica, puede estar indicada la bsqueda de
otros autoanticuerpos (Cunningham- Rundles. 1996). Ya se ha mencionado la asoci
acin de deficiencia selectiva de IgA con deficiencia de subclase de IgG (Bjorkand
er. 1985).
nos, toxoide diftrico, o las vacunas de haemophilus o neumoccica. En la ma. yora de
los casos, la respuesta indicar la capacidad relativa del sujeto para producir u
na respuesta a la vacunacin de recuerdo. Sin embargo, otra herramienta valiosa es

la vacuna de investigacin, el bacterifago < J > X 174. Como este es un antgeno nue
vo de vacuna provoca en principio una respuesta primaria de IgM. y luego, tras l
a reexposicin, una respuesta secundaria de IgG. Usando <I>X174, los patrones de a
claramiento y las respuestas de isotipo se pueden medir, definiendo varios grado
s y subgrupos de deficiencias de clulas B (Ochs. 1971). Esto es muy til en pacient
es que ya han estado recibiendo inmunoglobulina intravenosa, ya que la infusin pa
siva de estos anticuerpos a intervalos provoca que no se puedan interpretar las
respuestas a vacunas estndar.
Utilizacin de nuevos inmungenos para valorar la produccin de anticuerpos
Para investigar la produccin de anticuerpos, en muchos casos es suficiente invest
igar la respuesta a los antigenos de las vacunas, como la /acuna del ttaGentica molecular y diagnstico prenatal
Actualmente se han identificado, clonado y secuenciado un nmero de genes involucr
ados en los sndromes de inmunodeficiencia primaria (Conley,

972
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA de Jong R. Altare F . Haagen IA. et al: Severe mycobac

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modelos de ratones knockout se producen para estudiar los efectos de los genes i
nvolucrados en la inmunidad. En casos sospechosos de inmunodeficiencia. los gene
s relevantes pueden ser examinados directamente. Estas tcnicas permiten el diagnst
ico de pacientes, y la identificacin de portadores. Cada vez est siendo ms posible
el diagnstico prenatal de un nmero de defectos inmunes. Si la mutacin especifica se
conoce, o si se sabe que el patrn de herencia est ligado al cromosoma X, se puede
n realizar anlisis de marcadores polimrficos ligados o deteccin de mutaciones espec
ificas usando muestras de vellosidades corinicas. ADN de amniocitos preparados di
rectamente de clulas fetales, o de lineas de clulas cultivadas y expandidas. Cuand
o el genotipo no se conoce, puede investigarse directamente en las clulas letales
el defecto funcional, aunque estas pruebas se deben realizar ms adelante durante
el embarazo y suponen ms nesgo. Por ejemplo, en los sindromes de IDSC. se puede
demostrar en la sangre fetal la linfocitopenia. un nmero descendido de clulas T y
una escasa transformacin de linfocilos (Durandy, 1985). Se pueden determinar defi
ciencias de enzimas en cultivos de fibroblastos obtenidos por amniocentesis. Se
puede realizar, si la sangre letal puede obtenerse sin contaminacin de sangre mat
erna, ausencia de antigenos HLA o valoracin de (unciones de las clulas T y quimiol
uminiscencia de granulocilos.
RESUMEN
La valoracin de las defensas del husped es un proceso extraordinariamente complejo
que supone la cooperacin del mdico, cientfico investigador y del patlogo. Una aprox
imacin lgica, basada en la apreciacin de los diversos sistemas involucrados en la d
efensa del husped y las diversas capacidades de los distintos laboratorios, puede
n llevar a un diagnstico en casi todos los casos. El impresionante xito de la tera
pia moderna, basada en los antibiticos ms recientes, la tecnologa del ADN recombina
nte y los trasplantes de mdula sea, favorece la definicin precisa y el tratamiento
de los estados de inmunodeficiencia inmunolgica.
BIBLIOGRAFA
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CAPJTUIO 42

T R A S T O R N O S INMUNODEFICITARIOS
973
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CAPTULO
43
Evaluacin clnica y de laboratorio de las enfermedades reumticas sistmicas
Carlos Alberto Von Mhlen, M.D., Ph.D. Robert M. Nakamura, M.D.
INTRODUCCIN Y CLASIFICACIN DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS LUPUS ERITEMATOSO
SISTMICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS TIPO LUPUS Factores etiolgicos en el lupus eri
tematoso sistmico Cules son los criterios diagnsticos para el lupus eritematoso sistm
ico? Qu son los sndromes y enfermedades "tipo lupus"? Perfil de autoanticuerpos en
el lupus eritematoso sistmico Lupus crnico discoide Lupus eritematoso inducido por
medicamentos y anticuerpos antihistona SNDROME DE SJOGREN ESCLERODERMIA Anticuer
pos frente a antgenos del centrmero Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa
I) Anticuerpos frente a ARN polimerasas Autoanticuerpos frente al antgeno nucleo
lar fibnlarina (U3-snRNP) Anticuerpos dirigidos a la regin organizadora nuclear A
RTRITIS REUMATOIDE Factor reumatoide Anticuerpo antiqueratina Factor antiperinuc
lear
974 974
Anticuerpo frente al antgeno nuclear asociado a artritis reumatoide Anti-RA33 y r
elacin con la artritis reumatoide POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS SNDROME DE ASTENI
A CRNICA CONCEPTO DE SNDROMES DE SUPERPOSICIN Enfermedad mixta del tejido conectivo
BIOLOGA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS AUTOANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
981 PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS 980 981
981
981
978 979
TABLA DE DECISIN PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES MTODOS DIAGNSTICOS E
N LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS VARIACIONES EN LAS METODOLOGAS USADAS PARA LA DET
ECCIN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE A ANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES Enzimoinmuno
anlisis
982
982
983
980
Inmunotransferencia RESUMEN BIBLIOGRAFA 987 987
INTRODUCCIN Y CLASIFICACIN DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS
Las enfermedades reumticas se caracterizan por la presencia de uno o ms anticuerpo
s que pueden estar dingidos contra componentes de la superficie, citoplasma o ncl
eo de la clula. El ltimo grupo, anticuerpos contra antigenos nucleares (AAN), es e
l sello de las enfermedades reumticas sistmicas (Nakamura, 1985.1986,1992; Tan, 19
82a, 1989). Se ha progresado mucho en la aclaracin de los mecanismos inmunes invo
lucrados en las enfermedades reumticas durante los ltimos 1 5 aos. Muchas de las en
fermedades reumticas tienen un perfil de anticuerpos distintivo con especificidad
es diagnsticas. Por otra parte, las funciones bioqumicas y biolgicas de muchos de l
os antgenos estn involucradas en la replicacin del cido desoxiribonucleico (ADN), el
corte y empalme de los precursores del cido ribonucleico (ARN). y el procesamien
to del ARN (Tan. 1989). La clasificacin de las diversas enfermedades reu-

mticas ha sido difcil debido a la falta de una base etiolgica constante para la may
ora de las enfermedades. Un subcomit del Colegio Americano de Reumatologia (Decker
. 1986) desarroll una clasificacin y vocabulario extenso L a clasificacin de las en
fermedades reumticas sistmicas y las alteraciones relacionadas realizada por el au
tor se muestra en la tabla 43-1.
LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS TIPO LUPUS
El lupus eritematoso sistmico (LES) es el prototipo de las enfermedades reumticas
sistmicas y posee los siguientes rasgos significativos (Nakamura, 1994a): 1. LES
es una enfermedad autoinmune que no es rgano-especfica, donde el dao tisular est med
iado principalmente por inmunocomplejos ADNanti-ADN.

CAPTULO 4 3
EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS
975
Tabla 43-1
Enfermedades reumticas sistmicas y trastornos relacionados
Lupus erilematoso sistmico (LES) Lupus erilematoso discoide (LED) Sndromes tipo lu
pus Lupus eritematoso inducido por medicamentos Sndrome de S|0gren Esclerodermia/
sndrome CREST (calcinosis cutis, fenmeno de Raynaud, trastornos de la mohlidad eso
fgica, esclorodactilia y telangiectasia) Artritis reumatoide (AR) Dermatorniositi
s y polimiositis Sndromes sobrepuestos a) Enfermedad del tejido conectivo mixto (
ETCM) b) AR y LES (rupus) c) LES y esclerodermia (lupodermia) d) Esclerodermia y
dermatomiositis (esclerodermatomiositis) e) Otros 10. Sndromes de enfermedad del
tejido conectivo que no estn definidos como para tener una categora clnica
comit para los criterios de LES de ARA public criterios revisados que incorporaban
nuevos conocimientos inmunolgicos y mejoraban la clasificacin de la enfermedad de
l LES (Tan. 1982b). Los criterios revisados en 1982 para la clasificacin de LES i
ncluan 11 categoras aadiendo 1) ttulo anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofl
uorescencia o ensayo equivalente y 2) anticuerpo a ADN nativo y/o antgeno Sm. En
contraste con los criterios de 1971, los criterios de 1982 retiraban el fenmeno d
e Raynaud y la alopecia por su falta de sensibilidad y especificidad. Cuando los
criterios de ARA de 1982 para la clasificacin de LES fueron comparados con los c
riterios de 1971, hubo una mejora definitiva en la sensibilidad y en la especifi
cidad. Los criterios de 1982 mostraban un 96,7% de sensibilidad y un 96% de espe
cificidad al ser evaluados con pacientes con LES conocido y controles (Tan. 1982
b). Los criterios de la ARA de 1982 consideraban que los pacientes tenan LES si c
umplan cuatro de los critenos secuencial o simultneamente en cualquier momento del
examen. En 1997, se public una actualizacin de los criterios, donde como cambios
se elimino la prueba de las clulas LE y se aadieron los anticuerpos anticardiolipi
na (Tabla 43-2) (Gladman, 1999).
Qu son los sndromes y enfermedades tipo lupus?
2. Es una enfermedad multisistmica que afecta a la mayora de las personas de todas
las edades y ambos sexos, aunque es ms prevalenle en mujeres en edad frtil. 3. La
enfermedad manifiesta un sistema inmune hiperactivo con mltiples anormalidades.
4. Los pacientes con LES manifiestan una respuesta de anticuerpos heterogneos y p
oliclonales, con reaccin de formacin autoanticuerpo incluyendo mecanismos similare
s a los vistos en una respuesta inmune tpica a inmungenos extraos (Fatenejad, 1998)
. 5. El caso tpico de LES presenta una media de tres anticuerpos circulantes dife
rentes presentes de forma simultnea. La prevalencia de anticuerpos vara por encima
de un amplio rango, y se han identificado ms de 25 tipos diferentes de autoantic
uerpos en LES (Nakamura, 1994a). Hay muchas enfermedades y sndromes que pueden co
mpartir ciertos rasgos clnicos con el LES pero no son LES y tienen diferentes eti
ologas y patognesis. Las enfermedades que se han enumerado en esta categoria inclu
yen vasculitis, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedades linfop
roliferativas, fiebre reumtica, glomerulonefritis, sfilis, hepatitis lupoide. lupu
s inducido por medicamentos y neoplasia oculta (Panush, 1993). Hay una categoria
m u y amplia de pacientes que manifiestan menos de cuatro de
Tabla 43-2
Actualizacin d e 1997 de los criterios revisados en 1982 para la clasificacin del
lupus eritematoso sistmico'
Factores etiolgicos en ei lupus eritematoso sistmico

Su etiologa sigue sin conocerse bien. Algunos de los factores etiolgicos important
es en LES son 1) endocrino-metablicos, 2) ambientales y 3) genticos (Chan, 1989).
El factor de riesgo ms fuerte para el desarrollo de LES es el gnero femenino (Hoch
berg. 1990). Se ha considerado que el LES puede tener una posible etiologa viral
(Pincus. 1982). La presencia de anticuerpos antinucleares se observ en trabajador
as de laboratorio con diversos niveles de exposicin a sangre de pacientes con LES
. La presencia de anticuerpos antinativos ADN fue mayor en trabajadoras de labor
atorio que en un grupo de mujeres no expuestas que no trabajaban en un laborator
io (p<.00l) (Zarmbinski. 1992). Estos resultados ayudan a mantener la hiptesis de
que un agente transmisible que puede existir en la sangre de pacientes con LES,
puede ocasionar la formacin de anticuerpos. Se han implicado algunos productos q
umicos en el LES (Hochberg, 1990). Se ha estudiado el sndrome del lupus inducido p
or medicamentos tipo hidralacma. procainamida e isoniacida. como pista en la pat
ognesis del LES. Diversos artculos demuestran el mecanismo de acetilacin como un fa
ctor de nesgo en el LES. Existen estudios que han demostrado una mayor relacin de
concordancia de LES en gemelos monocigticos y dicigticos (Block, 1975). La concor
dancia de LES estaba presente en 11 (58%) de 19 gemelos monocigticos. El resultad
o final de la interaccin de mltiples tactores etiolgicos es la activacin policlonal
de clulas B en pacientes LES con produccin de un amplio espectro de anticuerpos (N
akamura. 1994a).
Cules son los criterios diagnsticos para el lupus eritematoso sistmico?
En 1971, el Colegio Americano de Reumatologia (ACR: previamente la Asociacin Amer
icana de Reumatismo (ARA)) public entonos preliminares para la clasificacin de LES
(Cohn. 1971). Entonces se consideraba que los pacientes tenan LES si cumplan cuatr
o de los criterios secuencial o simultneamente durante cualquier momento del exam
en. En 1982, el subExantema malar Exantema discoide Fotosensibilidad lceras orales Artritis no erosi
va Serositis (pleuritis o pericarditis) Alteracin renal (proteinuna persistente c
ilindros celulares) Alteracin neurologa Alteracin hematolgica a) Anemia hemolitica c
on reticulocitosis. o b) Leucopenia < 4.000/mm' en >2 ocasiones, o c) Linfopenia
< 1 500 mm en >2 ocasiones, o d) Trombocitopema < 100 OOO/mm'en ausencia de un
medicamento culpable 10. Alteracin inmunolgica a) Anti-ADN; anticuerpo contra ADN
nativo en titulo anormal, o b) Anti-Sm presencia de anticuerpo contra anticuerpo
nuclear Sm. o c) Hallazgos positivos de anticuerpos antifosfolipidos basados en
: (t) un nivel anormal en suero de IgG o Igtvl anticuerpos anticardiolipina (2)
un resultado positivo para anlicoagulante de lupus usando un mtodo estndar, o (3)
un falso positivo en la prueba de la sfilis que se sabe que es positivo durante a
l menos seis meses y confirmado por inmovilizacin de Treponema palhdum o prueba d
e absorcin del anticuerpo fluorescente de treponema 11, Anticuerpo antinuclear po
sitivo Un ttulo anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofluorescencia o prueb
a equivalente en cualquier momento en el tiempo y en ausencia de medicamentos qu
e se sabe estn asociados con el sndrome de "lupus inducido por medicamentos" ' La
clasificacin propuesta esta basada en 11 criterios Con el propsito de identificar
a los pacientes en estudios clnicos, se ova que una persona tiene LES si estn pres
entes 4 o mas de los 11 criterios, en serie o simultneamente, durante cualquier I
ntervalo de observacin De Hochberg MC Updatmg the American College of Rheumalolog
y revised criteria for the classification ol syslemic lupus erythematosus (Carla
). Arthntis Rheum 1997; 40 1725, con permiso.
/
1 2 3 4 5 6 7 8 9

976
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
los criterios de clasificacin de ARA de 1982 para LES (Lzaro. 1989: LomOrta. 1980:
Schur. 1993) pero se considera que tienen enfermedades "tipo lupus". Estos paci
entes se han clasificado del siguiente modo: 1) enfermedad reumtica indiferenciad
a; 2) enfermedad no reumtica; 3) sndrome sobrepuesto; y 4) lupus incompleto, laten
te o incipiente. Schur recomendaba, de forma similar a los primeros criterios de
ARA para el diagnstico de la artritis reumatoide (AR), que los pacientes fueran
calificados como LES clsico (muchos criterios). LES definido (cuatro o ms criterio
s), LES probable (tres criterios) o posible (dos criterios). Los pacientes con d
os o tres criterios pueden ser considerados como incompletos, incipientes o late
ntes, adems de lupus posible y probable (Schur. 1993). Si se sigue a estos pacien
tes, algunos permanecen con sntomas leves, y como tales quedan clasificados como
"enfermedad indiferenciada del tejido conectivo": unos pocos desarrollan un LES
definitivo, pero muchos pueden evolucionar a otras enfermedades con un pronstico
mejor.
Tabla 43-3 Antgenos y autoanticuerpos en lupus eritematoso sistmico Antgenos ADN na
tivo ADN desnaturalizado Hislonas Sm Estructura molecular ADN doble cadena ADN c
adena simple H1. H2A. H?B. H3 H4 Protenas. 29 (B ), 28 (B) 16 (D), y 13(E) kDa en
complejo con U1, U2 y U4-U6 snRNAs: componente espliceosoma Frecuencia autoanti
cuerpo' 40-70% 70% 50-70% 15-30%
RNP nuclear (U1 RNP) SS-A/Ro
Perfil de autoanticuerpos en el lupus eritematoso sistmico
SS-B/La Ku
La caracterstica del LES es la presencia de un amplio espectro de autoanticuerpos
, incluyendo anticuerpos contra ADN nativo (ds-ADN), antgeno Sm, U1-nRNP, SS-A/Ro
, SS-B/La y otras varias protenas no-histona o complejos protena no-histona-ARN (N
akamura. 1994a). Existe una policlonalidad de anticuerpos en LES y esclerodermia
. y se ve raramente en las otras enfermedades reumticas sistmicas. El anti-ADN nat
ivo y anti-Sm generalmente son especficos para LES. El lupus eritematoso sistmico
se caracteriza por una respuesta de anticuerpos policlonales y heterogneos, y pre
senta una media de tres anticuerpos circulantes diferentes presentes simultneamen
te. La prevalencia de autoanticuerpos varia por encima de un amplio rango. Los a
nticuerpos contra ADN nativo e histonas se detectan en hasta un 40% y 70% de los
pacientes, respectivamente, y anticuerpos contra el antigeno nuclear de prolife
racin celular (PCNA) y ciclina o proteina Alu-ARN en el 3% o menos (von Mhlen. 199
5) (Tabla 43-3).
hnRNP protena A1 PCNA RNP ribosomal Hsp '!(.: Protena ALu ARN HMG-17 B, glucoprote
ina I
Proleinas, 70, 33(A) y 22(C) 30-40% kDa, en complejo conU1 snRNA, componente esp
liceosoma Protenas. 60 y 52 kDa, en 24-60% complejo con Y1-Y5 RNAs Fosfoprotenas.
48 kDa. 9-35% (ormando complejo con Y1 copias ARN Poi III naciente Protenas. 86 y
66 kDa 1-19% protenas unin a ADN Proteina nuclear. 34 kDa 31-37% Proteina. 36 kDa
, protena 3% auxiliar de ADN polimerasa Fosfoproteinas. 38. 16 y 10-20% 15 kDa as
ociado a ribosomas Proteina de golpe de calor. 90 kDa 5-50% Protena 68 kDa. 11 en
raro complejo con Alu-ARN Protenas asociadas a ADN 9 a 17 kDa 34-70% Fosfolpidos
aninicos. 25% cardiolipina

Anticuerpos contra ADN nativo o ADN bicatenaro

Anticuerpos anti- ADN bicatenaro (ds-ADN) son bastante especficos para LES y se ob
servan con una frecuencia del 75% al 90% en pacientes LES con enfermedad activa
(Buskila. 1992). Se han publicado muchos artculos previos de anticuerpos ds-ADN e
n otras enfermedades que no son LES. Sin embargo, el pensamiento actual es que l
os anticuerpos reactivos a ADN en las otras enfermedades eran realmente anticuer
pos anti ADN monocatenario. Las pruebas del anticuerpo ds-ADN a menudo utilizaba
n preparaciones de ds-ADN contaminadas con ADN desnaturalizado o monocatenario.
Una posible excepcin podra aparecer en el sndrome primario de Sjgren. una enfermedad
a veces difcil de diferenciar del LES en gente de ms edad. El anticuerpo contra A
DN juega un papel definitivo en la patognesis del LES. En estudios de pacientes L
ES. al anticuerpo contra ADN le sigue en aparicin el antgeno circulante ADN, una s
ecuencia de acontecimientos que terminan con la formacin de inmunocomplejos. Esto
s inmunocomplejos ADN-anti-ADN tienen un tropismo especial por las membranas bsal
es y se depositan enseguida en el glomrulo renal. Esto inicia un dao renal por mec
anismos inflamatorios que terminan con la activacin del complemento y la lisis de
clulas (Okamura. 1993). Los mtodos previos de deteccin de anticuerpos ADN fueron e
l mtodo de precipitacin insensible, fijacin de complemento y hemaglutinacin pasiva.
Los mtodos habituales son radioinmunoanlisis (RA), inmunofluorescencia indirecta (I
FA) sobre Crithidia luciliae y enzimoinmunoanlisis (ELISA) (Buskila, 1992). Estos
pueden detectar anti- ADN en el 75% al 90% de pacientes activos LES no tratados
.
Las frecuencias estn relacionadas sobre lodo con pacientes con enlotmedafl activa
. Modificado de Nakamura RM, Bylund DJ. T a n EM Curent status of available stan
dards lor quality improvement ol assays lor the detection of autoantibodies to n
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ban & Schwar/enberg. 1996. con permiso
Anticuerpos contra Sm y ribonucleoproteina nuclear
Los anticuerpos de precipitacin al antigeno Sm se han considerado marcadores alta
mente especficos para LES (Tan, 1989). Los anticuerpos contra S m y contra ribonu
cleoprotenas nucleares (nRNPs) se encuentran en pacientes con LES. Los antgenos Sm
y nRNPs se asociaban notoriamente, porque el nRNPs no se pudo aislar bioqumicame
nte del antgeno Sm. Lerner
(1979) emple las herramientas de la biologa molecular para demostrar que los antgen
os Sm y nRNP eran partculas subcelulares compuestas de pequeos ARN nucleares forma
ndo un complejo con protenas. La partcula unida por anti-nRNP est formada por un co
mponente ARN llamado U1 (U por rico en uridina). formando complejo con al menos
siete protenas que variaban en peso molecular de 12 a 68 kDa (Tan. 1989), y encon
trados con una frecuencia de 20% a 40% (ter Borg, 1990). Los antgenos de Sm const
an de varias protenas, llamadas convencionalmente B1 (29 kDa). D (16 kDa) y E (13
kDa) (Tan. 1989). Los anticuerpos anti B1/B purificados reaccionan de forma cru
zada con la protena D y viceversa, pero no se observa ninguna reaccin cruzada en p
equeas cantidades de sueros LES. As. hay al menos dos epitopos en la protena B1/B r
econocidos por sueros anti-Sm. Los antigenos reactivos con anti-Sm y ARN antinuc
lear estn por consiguiente en unin de protenas interactivas y ARN ocupados del cort
e y empalme del ARNm precursor (Tan, 1989). No hay rasgos clnicos caractersticos a
parentes en pacientes LES con anticuerpos anti-Sm (Barada, 1981). aunque algunos
autores afirman que estos anticuerpos se asocian a enfermedad renal u otras alt
eraciones del sistema nervioso central (SNC) Los pacientes q u e slo tienen antic
uerpos a nRNP presetan una baja lasa de anticuerpos al ADN y baja frecuencia de
enfermedad renal clnicamente aparente (ler Borg, 1990). Los anticuerpos anti-Sm y
anti-nRNP pueden detectarse por inmunodifusin, hemaglutinacin pasiva o contrainmu
noelectroforesis. Sin embargo, los mtodos antes mencionados no distinguen exactam
ente entre anticuerpos y pequeos polipptidos asociados a ARN nuclear Las reactivid
ades con los ARN individuales y polipptidos pueden demostrarse mejor por tcnicas d

e inmunoprecipitacin del ARN e inmunotransferencia, respectivamente. Se ha compro

bado que la inmunotransferencia es ms sensible que

CAPTUIO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

977
los mtodos convencionales para la deteccin de anti-Sm y anti-nRNP (Nakamura, 1994b
). Habitualmente. las pruebas de laboratorio ms ampliamente usadas para la detecc
in de anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP son la inmunodifusin y ELISA. Estas pruebas
pueden diferenciar entre anticuerpos Sm y nRNP pero no pueden definir los eptopos
de los anticuerpos especficos presentes en los sueros de los pacientes. La espec
ificidad de los anticuerpos y los eptopos se determinan mejor por mtodos de inmuno
transferencia Western Northern.
Anticuerpos contra protenas rbosomales P
Cerca del 10% al 20% de los sueros LES muestran anticuerpos dirigidos a tres fos
foproteinas rbosomales de 15, 18 y 38 kDa en ensayos en sangre completa (WB). La
asociacin de anti-rRNP con las principales enfermedades del SNC en LES. principal
mente los sntomas sicticos, fue descrita en un estudio retrospectivo (Bonfa, 1987)
. No se mostr ninguna asociacin con el empeoramiento cognitivo o depresin en pacien
tes con lupus. Se han encontrado diferencias significativas en la prevalencia de
anti-rRNP entre razas. Los estudios recientes se concentran en el papel etiopat
ognico de anti-rRNP en sntomas SNC en pacientes con lupus (Isshi. 1998; Nakamura,
1997),
Anticuerpos contra SS-A/RO y SS-B/La
Los pacientes con LES pueden tener anticuerpos contra SS-A/Ro slo, o pueden tener
ambos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. El poseer slo antiSS-A/Ro est fuertemente asoc
iado con el antgeno leucocito humano (HLA) DR2 y con ser joven (<22 aos de edad al
comienzo). La presencia de ambos. anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. en el LES est aso
ciado con HLADR3 y se ha visto en pacientes mayores (>50 aos de edad al comienzo
de la enfermedad). (Hochberg, 1985). Un estudio con 55 pacientes con LES mostr qu
e los pacientes con anti-SS-A/Ro slo tenan una enfermedad renal mucho ms seria (Hoc
hberg, 1985). Los pacientes LES slo con anti-SS-A/Ro tambin tenan una mayor inciden
cia de anticuerpos antiADN concomitantes que aquellos pacientes LES con ambos an
ticuerpos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La (Chan. 1989). Los auloanticuerpos anti-SSA
/Ro se han asociado ntimamente con la aparicin de nefritis, vasculitis, adenopatia
, fotosensibilidad y leucopenia en pacientes LES. Los anticuerpos anti-SS-A/Ro,
como los anticuerpos anti-SS-B/La, son anticuerpos importantes por su fuerte aso
ciacin con el sndrome de Sjgren. que se produce en ms de dos tercios de los paciente
s con este trastorno. El antigenoSS-B/La es una proteina celular unida a una esp
ecie de pequeo ARN, formando un pequeo RNP que puede funcionar en el procesamiento
de las copias de ARN polimerasa III (Chan, 1989)
Antgeno nuclear de proliferacin celular y anticuerpos Hsp-90
En el 3% de los pacientes con LES activo se detectaron anticuerpos contra PCNA y
no hay rasgos clnicos distintivos asociados con la presencia del anticuerpo (Miy
achi, 1978). Una posible asociacin con los rasgos SNC, como mielitis transversa,
se ha visto en nuestros propios pacientes (C.A. von Mhlen y R.M. Nakamura, result
ados no publicados). Se ha determinado que la protena PCNA est relacionada con el
ciclo celular, y se ha observado que los anticuerpos PCNA son sondas tiles en el
estudio de los agentes que regulan la replicacin del ADN, la proliferacin celular
y la transformacin del blasto. Se ha detectado un autoanticuerpo contra la protei
na del golpe de calor en mamferos, Hsp-90 (Minota, 1988). La Hsp-90 es una protena
del citoplasma y de la membrana plasmtica de 90 kDa. El autoanticuerpo contra Hs
p-90 fue observado en el 50% de los pacientes con LES y dos de seis pacientes co
n polimiositis.

Anticuerpos
antifosfolpido
en
Subgrupos clnicos de lupus eritematoso sistmico asociado a anticuerpos contra SS-A
/Ro
Los niveles elevados de anticuerpos SS-A/Ro estn relacionados con vanas alteracio
nes autoinmunes clnicas, incluyendo: 1) lupus eritematoso cutneo subagudo, 2) sndro
me neonatal de lupus eritematoso con bloqueo cardaco congnito y lesiones cutneas; 3
) deficiencia homocigtica C2 y C4 con enfermedad tipo LES; 4) vasculitis primaria
del sndrome de Sjgren, positividad de factor reumatoide y sntomas sistmicos graves
5) pacientes LES ANA-negativos y 6) LES con neumonitis intersticial (Bylund. 199
1). Los anticuerpos de precipitacin contra SS-A'Ro se han visto en el 65% al 95%
de los pacientes con subgrupos asociados de anti-SS-A/Ro. y ms del 90% tienen niv
eles anti-SS-A/Ro cuando se detectan por mtodos ELISA (Bylund, 1991).
el lupus eritematoso sistmico
El sndrome de anticuerpos antifosfolpido o anticoagulante lpico se caracteriza por
la presencia de anticuerpos circulantes contra fosfolipidos y rasgos clnicos de t
rombosis venosa y arterial, trombocitopenia, anemia hemolitica y varios sntomas s
istmicos. Se han encontrado anticuerpos antifosfolipidos frecuentemente en pacien
tes con LES y tambin en otras alteraciones c o m o las enfermedades infecciosas (
Alarcn-Segovia. 1992: McNeil. 1991). Los anticuerpos antifosfol pidos se encuentra
n en hasla el 60% de los pacientes con LES. Recientemente, se evidenci de forma c
lara que los anticuerpos antilosfolpidos son muy heterogneos, funcional e inmunoqu
imicamente, y son policlonales (McNeil. 1991). La cardiolipina (fosfolipido animc
o) se ha utilizado ampliamente en la deteccin de anticuerpos antilosfolipidos. La
mayora de los anticuerpos anticardiolipina reaccionan de forma cruzada con fosfo
lipidos zwitterionic (McNeil. 1991). Los anticuerpos contra fosfolipidos identif
icados pueden ser IgG o IgM, mientras que los anticuerpos a fosfolipidos de ion
dipolar son ms frecuentemente IgM. Los anticuerpos contra fosfolipidos son identi
ficados en pacientes LES de tres maneras (AlarcnSegovia, 1992): 1) prueba falsa-p
ositiva serolgicamente para sfilis por pruebas de Laboratorio de Investigacin de En
fermedades Venreas (VDRL). que es un ensayo de floculacin con partculas de carbn cub
iertas con colesterol, lecitina (fosfatidilcolina) y cardiolipina; 2) el ensayo
anticoagulante lpico, que es la prolongacin del tiempo de caoln parcial de trombopl
astina (KPTT) que no est corregido por el plasma normal; y 3) el inmunoensayo de
cardiolipina con el uso de cardiolipina u otros fosfolipidos negativamente carga
dos como antgenos. Los pacientes con LES reaccionarn generalmente con un grupo fos
fato cargado negativamente presente en la cardiolipina, cido fosfatdico. fosfatidi
lserina o fosfatidilinositol. Harris (1987.1990) coordin unos talleres internacio
nales para mejorar la precisin y exactitud de los inmunoanlisis de los anticuerpos
antifosfolipidos. Se prepararon sueros de referencia y se definieron unidades e
stndar (GPL y MPL). Una unidad GPL (MPL) es equivalente a 1mg/ml de una muestra e
stndar IgG (IgM) purificada por afinidad. Sin embargo, Lpez (1992) sugiri que un en
sayo IgA especfico para anticuerpos antifosfolpido es importante para valorar el sn
drome antifosfolpido en pacientes con LES. Parece que se encuentra una mayor prev
alencia del isotipo IgA para anticuerpos
Anticuerpos anti-Ku y anti-Ki
El sistema antigeno Ku consta de un par de protenas llamadas p70/'p80 (Francoeur.
1986; Reeves, 1992). Estas protenas poseen una alta afinidad por el ADN y se sab
e que son protenas de unin al ADN. interaccionando covalentemente con los extremos
de ADN nativo. Mediante pruebas de inmunoprecipitacin e inmunotransferencia, se
encontr el autoanticuerpo Ku en el 1 0 % de los sueros LES y no fue detectado en
100 de los sueros de esclerodermia examinados. En esludios con un enzimoinmunoanl
isis, Reeves (1992) mostr que el 39% de LES. el 55% de la enfermedad mixta del te
jido conectivo (MCTD) y el 40% de los pacientes con esclerodermia presentaban ni

veles bajos de anticuerpo contra la proteina Ku. El anticuerpo anti-Ki fue descr
ito por primera vez en Japn (Tojo. 1981) y se observ en casi el 10% de los pacient
es LES. Se advirti una relacin entre el antiKi y los rasgos clnicos de artritis, pe
ricarditis e hipertensin pulmonar en pacientes LES. El antgeno Ki le purificado del
timo de conejo y tena un peso molecular de 32 kDa. Sakamoto (1989) realiz un ELIS
A y observ anticuerpos anti-Ki en el 21.4% (30 de 140) de los pacientes LES. mien
tras que 11 de 140 fueron positivos para anti-Ki por pruebas de doble inmunodifu
sin.

978
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

antifosfolpido en las personas negras. Los ensayos recientemente desarrollados pa

ra autoanticuerpos de la glucoprotena I |i, parecen aportar especificidad a los h
allazgos, dado que se describi que la glucoprotena f es el eptopo especfico para anti
uerpos antifosfolpidos.
Lupus crnico discoide
Una forma benigna de lupus puede manifestarse como lesiones cutneas discoides" (c
on forma de moneda o disco) sin sntomas de enfermedad sistmica. Esta alteracin se l
lama lupus eritematoso crnico discoide (LEC) (Sontheimer.1992; Wallace,1992). Las
caractersticas clnicas y de laboratorio de LEC no se han definido claramente desd
e la adopcin de los criterios del Colegio Americano de Reumatologa revisados en 19
82 para la clasificacin de LES. Las lesiones cutneas del lupus discoide crnico son
las siguientes: 1) eritema localizado persistente. 2) escamas adheridas, 3) tapo
namiento folicular, 4) telangiectasia y 5) atrofia (Wallace. 1992). El lupus eri
tematoso subagudo cutneo (LESC), otro cuadro cutneo similar, consiste en lesiones
papuloescamosas o no cicatriciales con una asociacin principal al auloanticuerpo
SS-A/Ro. Tambin se han descrito variantes adicionales del lupus crnico discoide, c
omo la paniculitis lpica y el lupus urticarial (Sontheimer, 1992). Wallace (1992)
ha definido el lupus crnico discoide como el cumplimiento de la descripcin del lu
pus crnico discoide o LESC. o una de las variantes de LES donde no se renen los cr
iterios ACR para LES. Desgraciadamente, el lupus crnico discoide es una alteracin
cutnea autoinmune que carece de anormalidad serolgica que unifique el diagnstico. E
s una forma leve del lupus eritematoso que raramente evoluciona a LES. Por otra
parte, hay una superposicin considerable entre el lupus discoide y LES, ya que ha
sta un 15% de los pacientes con LES tienen lesiones cutneas discoides. Alrededor
del 6% al 12% de los pacientes con LES tenan lupus discoide durante un nmero varia
ble de aos antes del comienzo de la enfermedad sistmica (Wallace, 1992). Habitualm
ente presentan anticuerpos antinucleares, con una estimacin de prevalencia en el
lupus discoide del 6% al 50%. La relacin mujeres/hombres (2:1) est mucho menos inc
linada hacia las mujeres que la forma sistmica
mune sintomtica (Rubn, 1988). En pacientes asintomticos. el anticuerpo anti-histona
es predominantemente IgM y manifiesta una amplia reactividad con todas las hist
onas individuales. Los pacientes con enfermedad sintomtica desarrollan un nico tip
o de anticuerpo anti-histona IgG que. ms que reaccionar con las histonas individu
ales, presenta una reactividad especfica con el complejo dimero de histonas H2A-H
2B (Rubin. 1988) (Tabla 43-4). Asi. la IgG anti-(H2A-H2B) es un marcador til de d
iagnstico, con alta sensibilidad y especificidad para la enfermedad sintomtica, en
contraste con la forma benigna de autoinmunidad inducida por procainamida. con
anticuerpos IgM contra la histona individual. En ambos tipos de lupus eritematos
o inducido por medicamentos (hidralazina y procainamida). existen anticuerpos Ig
M en concentraciones ms altas que los anticuerpos IgG. El cincuenta por ciento de
todos los pacientes tratados con procainamida desarrollaron ANA despus de un ao d
e tratamiento (Tan. 1989). Los acetiladores lentos desarrollaron ANA ms rpidamente
que los acetladores rpidos (Woosley. 1987). Todos los pacientes con tratamientos
prolongados de procainamida desarrollaron una respuesta ANA positiva con indepen
dencia del fenotipo acetilador.
SINDROME DE SJOGREN
El sndrome de Sjogren es una enfermedad inflamatoria autoinmune D e gresiva marca
da por una progresiva sequedad de ojos, boca y otras mucosas (Schumacher, 1993).
La enfermedad puede evolucionar desde las glndulas exocrinas hasta una alteracin

sistmica asi como una alteracin linfoprolferativa de clulas B. Se halla mucho ms frec
uentemente en mujeres que en hombres, con una prevalencia creciente a lo largo d
e la vida adulta. A menudo asociadas al sndrome de Sjogren estn otras enfermedades
reumticas, como AR. LES. cirrosis biliar primaria o esclerosis sistmica (Tabla 43
-5). Las glndulas afectadas salivares o lacrimales son infiltradas con agregados
de linfocitos. Las manifestaciones extraglandulares incluyen adenopata. vasculiti
s cutnea, neumonitis intersticial, etc. Esta enfermedad se ha clasificado dentro
del sndrome primario de Sjogren (1). que no est asociado con otras enfermedades de
l tejido conectivo, y el sndrome de Sjogren secundario (2). donde est presente la
AR u otras enfermedades autoinmunes. Se sabe que el sndrome de Sjogren se produce
en una forma primaria, con el complejo seco (queratoconjuntivitis seca y xerost
omia) como marco caracterstico. Los autoanticuerpos en el sndrome de Sjogren norma
lmente se confinan a los antgenos SS-A/Ro y SS-B/La (Tan, 1989), pero el autor lo
s ha observado con otras especificidades solas, como complejo anti-Golgi o anti
NuMA. El anti SSA/Ro y anti-SS-B/La estn presentes en LES pero en prevalencas mas
bajas que en el sndrome de Sjogren. El anti ss-B/La se observa en un 60% de los p
acientes del sndrome de Sjogren y en un 35% de los pacientes LES. y anti-SS-A/La
en el 40% y 15%. respectivamente (Von Mlhen, 1995). La presencia de anti-SS-A/Ro
cuando va asociado con anti-SS-B/La
Lupus eritematoso inducido por medicamentos y anticuerpos antihistona
Una caracterstica del lupus inducido por medicamentos es la presencia de autoanti
cuerpos de histona. Las histonas son protenas bsicas moleculares que contienen alt
as relaciones molares de aminocidos cargados positivamente, lisina y arginna. Las
histonas se encuentran en las clulas eucariticas estrechamente asociadas al ADN ge
nmico. La subunidad de este complejo histona-ADN se llama nucleosoma, cuyo ncleo (
"core") tiene dos molculas de cada (H2A, H2B. H3 y H4). y una molcula de H1. junto
con ADN de unos 200 bp de longitud (Rubn. 1985,1987), En los estudios de lupus i
nducido por drogas, el enzima heptico acetiltransferasa parece jugar un papel imp
ortante (Woosley, 1987). La acetiltransferasa es un enzima que puede acetilar me
dicamentos como la hidralazina y procainamida, jugando un importante papel en la
desintoxicacin y excrecin del medicamento. Los pacientes con bajos niveles de ace
tiltransferasa eran ms propensos a desarrollar ANA y sntomas clnicos que pacientes
que eran tratados con hidralazina y tenan fenotipicamente niveles altos de acetltr
ansferasa. Los pacientes con altos niveles de enzima y que eran aceliladores rpid
os no eran inmunes al desarrollo de ANA. Estos pacientes, sin embargo, tuvieron
una dosis acumulada de hidralazina mayor y ms prolongada antes de desarrollar la
enfermedad. Estos hallazgos relativos a los fenotipos de acetltransferasa se han
confirmado en pacientes tratados con procainamida (Rubin. 1988). La procainamida
es el medicamento implicado ms habitualmente en la autoinmunidad inducida por me
dicamentos. La hidralazina, quinidina y otros medicamentos tambin se han implicad
o como causantes de la autoinmunidad inducida por medicamentos. En el lupus indu
cido por medicamentos, existen anticuerpos frente a ADN de cadena simple e histo
nas. La procainamida se utiliza para tratar a los pacientes con arritmias, y la
mayora de los pacientes desarrollan anticuerpos anti-histona. Sin embargo, slo del
10% al 20% de los pacientes tratados con procainamida desarrollan una enfermeda
d autoinTabla 43-4
Especificidades de los autoanticuerpos en el lupus inducido por medicamentos: as
ociaciones o b s e r v a d a s m s habitualmente en la bibliografa Especificidad
a anticuerpo asociada (prevalencia)
Medicamento inductor Procainamida
Complejo |H2A-H2B]-ADN (95%), H1 y otras histonas individuales Complejo |H2A-H?B
]-ADN (35%). histonas Hidralazina individuales H1. complejo |H2A-H2B)-ADN a-Meti
ldopa Complejo |H2A-H2B)-ADN Isoniazida Complejo [H2A H2BJ-ADN D-Penicilamina Co
mplejo [H2A-H2BJ-ADN (58%) histonas Quinidina individuales Complejo [H2A-H2BJ-AD

N Acebutolol Histonas totales Carbamazepma Gotas oftlmicas Timolol Complejo |H2AH2B)-ADN

De von Muhlen CA, Tan. EM: Autoantibody specilicilies in autoimmune rheumatic di
seases Rev Bras Rheumatol 1994 34 173. con permiso

CAPTULO 43 Tabla 43-5

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE L A S ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

979
Asociaciones clnicas frecuentes c o n el s n d r o m e d e Sjogren
Anticuerpos frente a antgenos del centromero
Los autoanticuerpos frente a antgenos del centrmero fueron detectados inicialmente
por microscopia de inmunofluorescencia. El antigeno del centrmero fue localizado
en la regin condensada de la metafase de los cromosomas. En estudios de inmunotr
ansferencia, los antigenos del centrmero constan de tres protenas: 16 kDa, 80 kDa
y 120 kDa. Existen autoanticuerpos de las protenas del centrmero en el 50% al 80%
de los pacientes con el subgrupo de esclerodermia llamado CREST. El veinticinco
por ciento de los pacientes con fenmeno de Raynaud idioptico con otros signos o snt
omas de CREST tienen anticuerpos anlicentrmero (Rothfield. 1992).
Artrilis reumaloide Tiroiditis auloinmune Lupus entemaloso sistmico Hepatitis crni
ca activa Pohdermatomiositis Crioglobulmemia mixta Enfermedad del tejido conecti
vo mixta Prpura hipergammaglobulinmica Cirrosis biliar primaria Vasculitis necroti
zante sistmica
es indicativa de un sndrome de Sjogren primario, a veces coexistiendo con LES. La
presencia de anticuerpos anti-SS-B es menor del 1% en artritis reumatoide (Tan,
1988). Existe tambin una asociacin notable entre antiSS-A'Ro y la presencia de va
sculitis sistmica y cutnea (Bylund. 1991). Se ha observado una asociacin de los ant
icuerpos SS-A/Ro y vasculitis en pacientes con enfermedad de tejido conectivo no
clasificada. Paprotnik (1999) encontr ttulos fluctuantes de anticuerpos contra SS
-A'Ro tanto en el sndrome de Sjogren primario como en el lupus eritematoso sistmic
o, pero sin correlaciones principales con la actividad de la enfermedad clnica.
Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I)
Un antigeno importante es Scl-70. que fue detectado inicialmente como una protena
de 70 kDa. Este fue ms tarde reconocido como un producto de degradacin de una pro
teina de 95 kDa. ADN Topoisomerasa I (Tan, 1989). El antigeno fue localizado en
distribucin puntiforme en el nucleoplasma y el nucleolo. En primeros estudios, lo
s autoanticuerpos frente a Scl-70 se detectaron en el 20% de los pacientes con e
sclerodermia no seleccionados por estudios de inmunodifusin (Tan, 1982a). En estu
dios posteriores, se detectaron autoanticuerpos Scl-70 en el 75% de los paciente
s con la forma difusa severa de esclerodermia por pruebas de inmunodifusin (Jarza
bek-Chorzelska, 1986). Este ltimo hallazgo probablemente se realiz por la mejor co
nservacin del antigeno topoisomerasa I en las pruebas, asi como la demostracin de
una mayor prevalencia del autoanticuerpo Scl-70 en pacientes con la forma difusa
severa de esclerodermia (Nakamura. 1992).
ESCLERODERMIA
La esclerosis sistmica (esclerodermia) es una enfermedad multisistmica del tejido
conectivo de etiologa desconocida donde son rasgos prominentes las lesiones vascu
lares y la fibrosis del tejido. La etiologa de la esclerosis sistmica sigue sin co
nocerse bien. Los pacientes con esclerosis sistmica producen espontneamente anticu
erpos frente a antgenos nucleares, nucleolares, y mitocondriales (Reimer, 1990; R
othfield. 1992). Un paciente con esclerodermia generalmente tiene una heterogene
idad restringida de tipos de anticuerpos. Un paciente determinado raramente tien
e ms de un autoanticuerpo detectado. La Tabla 43-6 enumera los diversos tipos de
autoanticuerpos descritos en la esclerodermia. Los pacientes con manifestaciones
cutneas difusas y de rpida progresin que afecten a las extremidades distales y a m
enudo proximales y el tronco tienen un riesgo mayor nesgo de desarrollar manifes

taciones viscerales precoces. Incluidos en la clasificacin de esclerodermia, se e

ncuentra un subgrupo amplio de pacientes que tienen una forma del sndrome CREST (
calcinosis del culis, fenmeno de faynaud, alteraciones de la motilidad esofgica, es
clerodactilia y elangiectasia). El subgrupo de pacientes CREST puede representar
del 20% al 30% de todos los pacientes de esclerodermia (Fritzler, 1980). Los pac
ientes con la variante CREST tienen una afectacin cutnea limitada a las extremidad
es distales de los dedos y la cara y generalmente un mejor diagnstico y evolucin c
lnica que los pacientes con afectacin cutnea difusa.
Anticuerpos frente a ARN polimerasas
Tres ARN-polimerasas catalizan la transcripcin de genes en ARN (von Mutilen, 1994
). Los autoanticuerpos contra las ARN polimerasas tienden a aparecer al mismo ti
empo en el mismo paciente, parecen ser especficos para esclerodermia y aparecen s
obre todo en individuos con esclerodermia difusa.
Autoanticuerpos frente al antgeno nucleolar fibrilarina (U3-snRNP)
El nombre fibrilarina procede de la localizacin del antigeno en el componente den
so librilar del nucleolo. Los anticuerpos antifibrilarina se ven en hombres jvene
s con esclerodermia y minima afectacin de las articulaciones (von Mhlen, 1994).
Tabla 43-6
A u t o a n t g e n o s y autoanticuerpos en esclerodermia
Estructura molecular 100 kDa nativo y producto de d e g r a d a c i n 70 kDa. AD
N topoisomerasa I Proteinas. 17, 80 y 140 kDa, localizadas en las placas de cine
tocoro internas y externas Complejo ARN Poi l de protenas subunidades. 210-211 kD
a Transcribe RNAm Transcribe 5S RNAr. RNAt Protena, 34 kDa, componente de partcula
U3 RNP Complejo empalme-soma Complejo de 11 proteinas. 110-120 kDa Protenas de u
nin a ADN Proteina, 40 kDa, complejos con RNAs 7S y 8S Frecuencia de anticuerpo 7
0% en esclerodermia; 20-59% en todos los pacientes; 13% en CREST 57%-82% en CRES
T. 8% en lorma difusa 4%-20% en esclerodermia. 13% en forma difusa 4% 23% en esc
lerodermia; 45% en forma difusa; 6% en CREST 6%-8%; 5% en forma difusa, 10% en C
REST 2%-5% en todos los pacientes; 24% en PM/ superposicin de esclerodermia 2%-5%
; 24% en PM7 superposicin de esclerodermia 1%-14% en esclerodermia; 26-55% en PM/
superposicin de esclerodermia 4%-10% en esclerodermia; 1-11% en forma difusa, 819% en CREST, hasta el 3% en PM/superposicin de esclerodermia Raro
Autoantgeno Scl-70 Centromero ARN Pol I ARN Pol II ARN Pol III Fibrilarina U1-nRN
P V PM-ScL Ku Th/To
NOR-90
Proteina, 90 kDa. localizada en la regin organizadora del nucleolo

980 Anticuerpos dirigidos a la regin organizadora nuclear

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
Los anticuerpos de la regin organizadora nuclear (NOR)-90 reconocen el factor de
transcripcin hUBF (human upstream oinding /actor) de la ARN polimerasa I en el ce
ntro fibrilar del nuclolo. Los OR son regiones donde los nuclolos se reconstituyen
despus de la mitosis, con grupos de genes ARN ribosomales, y zonas donde los anti
genos Scl-70. U3-ARN/librilarina, NOR-90 y ARN polimerasa I pueden ser detectado
s (von Mutilen. 1994).
ponente esencial en los eptopos reconocidos por estos anticuerpos (Schellekens. 1
998). Esta prueba de inmunofluorescencia es sensible pero menos especifica que A
KA en pacientes con AR. Entre un 49% y un 87% de pruebas APF-positivas se han de
scrito en pacientes con AR (Aho. 1994; Janssens. 1988) y hasta un 5% en otras en
fermedades del tejido conectivo o en controles normales. Tanto el A K A como el
factor antiperinuclear se han descrito en AR seronegativa en su primera etapa, p
ermitiendo una clara mejora en el diagnstico de la enfermedad. Se llev a cabo un E
LISA utilizando lilagrina publicada de epidermis humana, con una sensibilidad qu
e iguala la de A K A (Palosuo. 1998),
ARTRITIS REUMATOIDE
La AR es una alteracin sistmica autoinmune que se caracteriza por una artritis crni
ca, simtrica y erosiva de las articulaciones perifricas. Un gran porcentaje de pac
ientes presenta ttulos elevados de factores reumatoides sricos. Existen manifestac
iones asociadas no articulares, como nodulos subcutneos, vasculitis. fibrosis int
ersticial y otras similares. Los sndromes de Sjgren y Felty se producen habitualme
nte con AR. Se desconoce la causa primaria de AR. La mayora de los pacientes con
AR tienen los alelos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) Clase I
I DR4. DR1 o ambos (Schumacher, 1993). La AR est asociada con varios anticuerpos,
que pueden servir como marcadores de diagnstico y pronstico (Aho, 1994; Viander.
1997). Estos incluyen: 1. Factor reumatoide (RF) 2. Anticuerpo antiqueratna (AKA)
3. Factor antipennuclear (APF) 4. Anticuerpo (rente a antgeno nuclear asociado a
AR (RANA) 5. Anti-RA33 Los tres primeros, y posiblemente anti-RA33, pueden prec
eder al inicio de la AR clnica.
Anticuerpo frente al antgeno nuclear asociado a artritis reumatoide
El anticuerpo frente a RANA se encontr en pacientes con sndrome de Sjgren asociado
a AR (Tan. 1989). Se descubri, por estudios microscpicos de inmunofluorescencia. q
ue el RANA estaba localizado en el ncleo de forma finamente moteada. El RANA no f
ue detectable en cortes tisulares de muchos rganos en ratn, mono y humanos. Se det
ect tambin en dos lneas de clulas T humanas (Mol 4 y 1301) pero fue detectado en los
ncleos de tres lineas de clulas B (WIL2. Raji y Daudi). Las lneas de clulas B alberg
aban virus de Epstem-Barr (EBV). mientras que las lneas de clulas T no. Existia un
a clara relacin entre RANA y EBV. Antes de la transformacin de los linlocilos con
EBV, las clulas eran negativas para RANA. Sin embargo, despus de la transformacin,
los antgenos RANA se encontraban en el ncleo (Tan. 1989). El anticuerpo anti-EA (u
n antigeno prematuro de EBV) estaba presente tambin con mayor frecuencia en pacie
ntes con AR. En un estudio, se observ un gran nmero de pacientes con AR con ttulos
altos (>1:20) de anti-EA (Fenell. 1981). El lazo de unin entre EBV. AR y RANA no
ha sido definitivamente establecido. El fenotipo HLA. EBV y, durante la infeccin,
las deficiencias de inmunorregulacin y reactivacin de clulas infectadas por EBV la
tentes pueden jugar un papel en la patognesis de la enfermedad (Nakamura, 1992).
En los primeros estudios con anlisis de inmunodifusin, se delectaron anti-RANA en
dos tercios de los pacientes con AR (Tan, 1982a, 1989). Sin embargo, en artculos
posteriores, se encontr que la incidencia de anti- RANA estaba por encima del 90%

en pacientes con AR (Tan, 1988). En sujetos controles normales la frecuencia de

anti-RANA variaba del 6 c al 25% (Tan, 1988). Los estudios seroepidemiolgicos pa
ra anticuerpos virales de EB en AR han mostrado que haba una frecuencia mayor de
pacientes con AR con ttulos altos (>1:320) de anticuerpos frente al antgeno de cpsi
de viral EB. No hubo diferencia en la frecuencia del antigeno nuclear anti-EB o
los ttulos entre los pacientes con AR y los normales (Ferrell, 1981).
3
Factor reumatoide
Este anticuerpo est dirigido contra la porcin Fe de la molcula IgG. Los estudios de
l FR monoclonal y policlonal han mostrado un RF polirreactivo con especificidad
de unin por sustancias distintas de IgG. como componentes nucleares (Schumacher.
1993). El FR polirreactivo generalmente es de la clase IgM con baja afinidad. El
FR no es especfico para AR, y a menudo se observa en casos de infecciones crnicas
y otras condiciones. El FR en las enfermedades reumticas tiene una heterogeneida
d inmunoqumica considerable. Junto con el FR IgM comn, se han detectado tanto FR I
gA como FR IgG. El FR IgA se ha visto recientemente que est relacionado con enfer
medad grave con erosiones. La mayora de los FR en suero de los pacientes con AR r
eaccionan con la zona Ga no alotpica (o yl-2-4) presente en las molculas de lgG1,
lgG2 e lgG4. El FR reactivo con los grupos GM alotpicos presentes en lgG1 e lgG3
tambin pueden existir en el suero de los pacientes con AR. Adems, el grupo de los
FR est entre los nicos anticuerpos que claramente muestran que estn involucrados en
la patognesis de la enfermedad (Smolen, 1998).
Anti-RA33 y relacin con la artritis reumatoide
Hassfeld (1989) ha descrito un anticuerpo antinuclear (anti-RA33) que puede ser
especfico para la AR. A partir de extractos de clulas Hela, se descubri un antigeno
de aproximadamente 33 kDa que reaccionaba con el 36% de los 95 sueros de pacien
tes AR y con slo 1 de 170 pacientes control. El antgeno fue denominado RA33. y el
autoanticuerpo no tiene una relacin perceptible con otros anticuerpos antmucleare
s. El anli-RA33 no estaba relacionado con anti-histona. De 11 pacientes AR con a
nti-RANA, seis fueron positivos para anti-RA33. De los cinco sueros anti-RANA ne
gativos, dos fueron positivos para anti-RA33. (Hassfeld. 1989). Los anlisis de in
munotransferencia con extractos solubles de clulas Hela mostraban un autoanticuer
po dirigido frente a un antigeno de 33 kDa (anti-RA33) en el 30% de pacientes AR
austracos y ninguno en pacientes con espondilitis anquilosante o artritis psorisi
ca (Aho, 1994). Sin embargo, se observ una prevalencia de anti-RA33 en finlandese
s con AR del 6% (Aho, 1994).
Anticuerpo antiqueratna
Este anticuerpo reacciona con la capa crnea del esfago de rala (Young. 1979), El A
KA es un marcador para AR bastante especfico pero no muy sensible. La aparicin de
reacciones positivas en suero AR es del 36% al 59% y de 0% al 3% en individuos s
anos normales (Aho, 1994). La mayora de los sueros antiqueratna positivo son tambin
reactivos con el factor antperinuclear, sugiriendo que ambos antigenos comparten
algunas semejanzas.
POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS Factor antiperinuclear
Este anticuerpo es reactivo con granulos de queratohialma perinucleares de las cl
ulas de la mucosa bucal. El aminocido citrulina parece ser un comLa pohmiositis (
PM) es una enfermedad inflamatoria del msculo estriado de etiologa desconocida. Se
caracteriza por la presencia de infiltrados infla-

CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

981
matnos en el msculo esqueltico, con necrosis de fibras musculares y degeneracin asoc
iadas (Targoff, 1992). Cuando la enfermedad se acompaa de cambios tpicos en la pie
l, se denomina dermatomiositis. La polimiositis se caracteriza serolgicamente por
la presencia de un nmero de anticuerpos de vanas especificaciones dirigidos cont
ra diferentes sintetasas de ARN de transferencia (RNAt) (von Mhlen, 1994) (Tabla
43-7). Estos anticuerpos definen un subgrupo de pacientes con PM. artralgia. enf
ermedad pulmonar intersticial y un diagnstico ms insuficiente que los pacientes si
n los autoanticuerpos. Los anticuerpos frente a Jo-1 (histidil RNAt smtetasa) ap
arecen en el 23% al 36% de los pacientes PM. teniendo la mayora la enfermedad pul
monar intersticial (Targoff. 1992). Los autoanticuerpos frente a treonil y alani
l RNAt-sntetasa aparecen con una prevalencia ms baja en la miositis autoinmune. Se
ha descrito en pacientes con un sndrome clnico que muestren rasgos solapados de p
olimiositis y esclerodermia, un anticuerpo denominado anti- PM-Scl (Tan. 1988).
El anticuerpo anti- PM-Scl reacciona con un complejo de 11 polipeptidos que van
de 1 1 0 a 120 kDa. El Anti-PM-Scl muestra coloracin del nuclolo y nucleoplasma de
las clulas del sustrato por microscopa de inmunofluorescencia indirecta.
mera publicacin presentaban una combinacin de rasgos generalmente asociados a LES,
esclerosis sistmica y polimiositis. De modo caracterstico, por hemaglutmacin se de
tect un ttulo alto de autoanticuerpos frente a una ribonucleoprotena nuclear en tod
os los pacientes (Sharp. 1972). La falta de anormalidades renales y neurolgicas y
la excelente respuesta de estos pacientes a pequeas dosis de corticoides orales
justific inicialmente la clasificacin de estos pacientes como un grupo separado de
LES y esclerosis sistmica. Sin embargo, el concepto de MCTD como un grupo separa
do ha cambiado con el tiempo. Muchos piensan que MCTD representa un solapamiento
de esclerosis sistmica. LES y polimiositis (Nimelstein, 1980). Un grupo de pacie
ntes diagnosticados inicialmente como MCTD lueron estudiados de nuevo ocho aos ms
tarde y mostraron una evolucin general fuera del patrn de superposicin al de una en
fermedad nica, siendo el diagnstico ms prevalente el de esclerodermia (Nimelstein,
1980). Parece haber una gran superposicin que se manifiesta cuando los criterios
antes mencionados se aplican a u n a determinada poblacin de pacientes, y los est
udios no confirman totalmente la existencia de MCTD como una entidad clnica indiv
idual
SNDROME DE ASTENIA CRNICA
Aunque no pertenece al clsico concepto de enfermedades del tejido conectivo difus
o, el sndrome de astenia crnica (SFC) en una enfermedad con afectacin sistmica que s
e ha demostrado que est relacionada con la presencia de autoanticuerpos (von Mike
cz, 1997). De 60 pacientes SFC, el 68% fueron positivos para ANA. Utilizando clul
as Hep-2, los autores pudieron obtener palrones nucleolares (13%), moteados (25%
), perifricos (52%) y moteados densos y finos (5%). Los estudios de co-localizacin
mostraron unas protenas asociadas a lminas, factor SC-35 de empalme RNP, y viment
ina como posibles dianas, en lo que parece ser una seleccin para antgenos celulare
s insoluoles. La alta frecuencia de autoanticuerpos en el SFC puede ayudar a dis
tinguir esta entidad de otras enfermedades sistmicas reumticas.
BIOLOGA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS ANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
Muchos de los autoanticuerpos intracelulares, incluyendo los ANA, se han identif
icado como marcadores de diagnstico para las enfermedades reumticas, como el LES.
esclerodermia. sndrome de Sjgren, MCTD. lupus inducido por medicamentos y polimios
itis/dermatomiositis (Tan. 1989). Los autoanticuerpos en las enfermedades del ho
mbre se han utilizado como herramientas para estudiar varias funciones biolgicas

moleculares y mecanismos. Los ANA se han utilizado para investigar bibliotecas d

e expresin de DNAc. con posterior identificacin de autoantigenos. Se han estudiado
y aclarado las funciones biolgicas de muchos de los autoanticuerpos inducidos po
r autoantigenos. Las funciones biolgicas que se han demostrado que los anticuerpo
s inhiben son el empalme del pre-ARNm, replicacin del ADN. reparacin del ADN, tran
scripcin, transcripcin de ARNr, movimiento del cromosoma basado en el microtbulo du
rante la mitosis, y aminoacetilacin de ARNt (Tan, 1988, 1989; Casiano. 1996; Tan.
1997).
CONCEPTO DE SNDROMES DE SUPERPOSICIN
El sndrome de superposicin se utiliza para describir a los pacientes que muestran
sntomas de ms de una enfermedad. Por ejemplo, se han descrito pacientes que renen l
os criterios diagnsticos para LES y tambin tienen manifestaciones que sugieren un
segundo diagnstico como la AR (Lzaro, 1989). Se duda de si los sndromes de superpos
icin pueden representar la coexistencia de dos o ms enfermedades diferentes, o si
el sndrome constituye una entidad diferente.
PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS
Se ha observado que existen distintos perfiles de ANA en dilerentes enfermedades
reumticas sistmicas. Algunas caractersticas de stas incluyen la presencia o ausenci
a de ciertos anticuerpos y diferencias en los titulos medios de estos anticuerpo
s (Nakamura. 1986; Tan. 1988). No obstante, se debera tener cuidado del bajo valo
r predictivo positivo de la prueba de ANA en grupos con una baja prevalencia de
enfermedades reumticas sistmicas y en una poblacin de edad (Slater, 1996). Deben re
searse las siguientes caractersticas:
Enfermedad mixta del tejido conectivo
El concepto de enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) fue propuesto inicia
lmente por Sharp (1972). Los 20 pacientes descritos en la priTabla 43-7
A u t o a n t i g e n o s y autoanticuerpos e n pollmiosltis ( P M ) y dermatomi
ositis ( D M ) Estructura molecular
Proteina histidil ARNt sintetasa. 52 kDa Proteina treonil ARNI sintetasa. 80 kDa
Proteina alanil ARNt sintetasa. 110 kDa Complejo proteina nuclear, protenas 53 y
61 kDa Proteina, 54 kDa. en complejo con 7 SL ARN Complejo de 1t proteinas. 110
-120 kDa Complejo espliceosoma 56 kDa, componente RNP Glicil-RNAt sintetasa Isol
eucil-ARNt sintetasa
Autoanligeno
Jo-1 PL-7 PL-12 Mi-2 Partcula de reconocimiento de serial (SRP) PM-Scl UtnRNP 56
kDa EJ 0J
Frecuencia de anticuerpo
23%-36% 4% en PM
3%
15%-35% en PM. 5%-9% en DM 4%-5% en PM, no se produce en DM 8%-12% en PM. 25% en
PM/ superpo: 4%-17%en PM/DM 80% <3% en PM <3% en PM
de Tan ( 1988). Nakamura (1992) y von Mhlen y Tan ( 994)

982
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
1 Mltiples ANA observados frecuentemente en LES. a menudo con altos niveles de an
ticuerpos anti-ds-ADN. 2. Distincin de anti- Sm para LES. 3. Restriccin de ANA en
lupus inducido por medicamentos a anticuerpos antihistona. 4. Anticuerpos frente
a U1-RNP o anticuerpos nucleares frente a RNP presentes en varias enfermedades
reumticas con diferentes frecuencias. 5. La restriccin de ANA en MCTD frente a U1RNP o anticuerpos nucleares RNP. 6. Sueros de sndrome de Sjgren caracterizados pri
mariamente por la presencia de anticuerpos frente a SS-A'Ro y SS-B'La. 7. Pacien
tes con esclerodermia mostrando un perfil consistente en anticuerpos frente a Sc
l-70, el antgeno centrmero/cinetocoro y antgenos nucleares. 8. La presencia frecuen
te de RE AKA. APF. anti-RA33 y RANA en artritis reumatoide. 9. La presencia de a
utoanticuerpos Jo-1. Mi-2 y PM-Scl en PM/DM.
TABLA DE DECISIN PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES
La microscopa de inmunofluorescencia mediante extractos celulares humanos, como cl
ulas Hep-2. permite la deteccin sensible de anticuerpos en suero que reaccionan m
uy especficamente con varias protenas celulares y cidos nucleicos. Esta tcnica es es
encial en laboratorios de inmunologa dedicados al diagnstico rutinario de las enfe
rmedades autoinmunes humanas. De una inmunofluorescencia positiva se puede asoci
ar el patrn especfico con la presencia de un autoanticuerpo distinto en el suero d
e ese paciente particular. Como los patrones de los distintos autoanticuerpos ap
arecen en las distintas enfermedades, como se trat previamente, los laboratorios
ofrecen al mdico la posibilidad real de reducir la bsqueda del diagnstico. En la Ta
bla 43-8 se desarrolla una tabla de decisin teniendo en cuenta todo esto, as como
la clasificacin del patrn citoplasmtico para utilizarse en el laboratorio de rutina
(Tabla 43-9). Las Figuras 43-1,43-2 y 43-3 representan algunos ejemplos de los
patrones de inmunofluorescencia.
cuerpos frente a antgenos nucleares. La deteccin de anti-SS-A/Ro requiere de la im
plantacin y cumplimiento de varias recomendaciones tcnicas y de garanta de calidad.
Con el uso de las clulas de sustrato apropiadas que contengan el antgeno SS-A/Ro,
muchos de los llamados pacientes lupus eritematoso ANA-negativos mostrarn result
ados positivos en la inmunofluorescencia indirecta, Los anlisis de inmunoprecipit
ina y doble inmunodifusin (ID) se han utilizado para determinar la especificidad
de varios ANA. La especificidad del ensayo en doble inmunodifusin depende general
mente de la calidad de los otros sueros control usados en el procedimiento, asi
como de la naturaleza de la preparacin del antigeno. Las pruebas de inmunodifusin
no son muy sensibles. Las pruebas de inmunodifusin positivas tienen un alto grado
de especificidad como marcador diagnstico en ciertas enfermedades reumticas Exist
en equipos comerciales de inmunodifusin disponibles para la deteccin de anticuerpo
s frente a RNP. Sm, SS-A/Ro. SSS-B/La y Scl-70, asi como otros marcadores menos
comunes (Nakamura, 1994b). En la pasada dcada se han desarrollado un nmero crecien
te de enzimoinmunoanlisis con el uso de antgenos estndar purificados y recombinante
s (Saitta, 1992). Muchos de estos enzimonmunoanlisis han demostrado ser ms sensible
s que los mtodos de inmunodifusin anlogos. Asi, debido a la alta sensibilidad de lo
s enzimonmunoanlisis, se necesita determinar el rango de referencia de pacientes n
ormales y los valores discriminantes apropiados. Comparadas con las pruebas de i
nmunodifusin. las pruebas ELISA mostraron una sensibilidad mucho mayor pero tenan
una especificidad menor (Nakamura, 1992). Adems, las pruebas ELISA eran frecuente
mente positivas en ttulos bajos para anticuerpos en sueros de pacientes con enfer
medades reumticas que no fueran LES. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos fre
nte a Sm en pruebas de inmunodifusin se considera como altamente especifica para
LES. Sin embargo, en las pruebas ELISA el anlicuerpo Sm

Tabla 43-8 Tabla d e decisin para la identificacin de algunos autoanticuerpos u s

a n d o clulas HEp -2 y su asociacin con la e n f e r m e d a d 1 Patrn nuclear Env
oltura (bordo) Punteado, figura mittica negativa -> CBP Continuo, figura mittica n
egativa -> enfermedades hepticas crnicas Homogneo, figura mittica negativa -> LES, L
ES inducido por medicamentos Moteado Grande -> hnRNP en LES, Grueso -> Sm, RNP e
n LES. MCTD Fino - SS-A/Ro. SS-B/La en LES. SS Pleomorfo - PCNA en LES Discreto Fi
gura mittica positiva - * centrmero en SCL Figura mittica negativa -> p95 en PBC 2
Patrn nucleolar Homogneo -> PM-Scl en SCL Con grumos -> librilarma en SCL Moteado
Figura mittica punteada -ARN pol I. NOR-90 en SCL Figura mittica homognea - Scl-70 en
SCL 3 Patrn citoplasmtico Manchas densas finas -Jo-1. PL-7 PL-12 en PM/DM Homogneo
-> rRNP en LES Fibrilar -> actina, miosina en MCTD, CBP, HCA Segmentario -> a-ac
tinma, vinculina en MG. EC, CU Reticular -> mitocondna en CBP Polar -> Golgi en
SS, LES, infecciones virales Aparato fusiforme -> NuMA en SS, mediocuerpo, p330'
en cncer CBP= Cirrosis biliar primaria: L E S = lupus eritemaloso sistomico: M C
T D= enfermedad del tejido conectivo mixto. SS = sndrome de Siogron, SCL =escler
odermia. PM = polimiosilis; DM = dermatomiositis; HCA = hepatitis crnica i autoin
mune, EC = enfermedad de Crohn: CU = colitis ulcerosa. PCNA antgeno nuclear de clu
las proliferativas; N u M A = aniigeno nuclear milOlico-ascciado Modificado de K
rapl AR. von Mutilen CA Krapf FE. y coi: Atlas ol I m m u n o f l u o ^rescent A
utoaniibodies. Munich. Urban & Schwarzenberg, 1 9 9 6 con permiso J
MTODOS DIAGNSTICOS EN LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS
Los mtodos que habitualmente se utilizan en la deteccin de anticuerpos se enumeran
en la Tabla 43-10. Una prueba ampliamente utilizada en el cribado de autoanticu
erpos intracelulares es la microscopa de inmunofluorescencia (IFM) y las pruebas
de inmunoenzimas (Nakamura, 1994b). Las pruebas secundarias definitivas para la
identificacin especfica de ANA son la inmunodifusin. inmunoprecipitacin, aglutinacin
de partculas, mmunoenzima, inmunotransferencia y mtodos de radioinmunoanlisis (Teod
orescu. 1992). La estandarizacin de la inmunofluorescencia indirecta (IF)-ANA ha
resultado muy difcil (Nakamura. 1992; Fellkamp. 1996: Smolen. 1997). Muchos facto
res estn implicados en la realizacin de las pruebas IF-ANA. Incluyen 1) el sustrat
o y las variaciones de fijacin, 2) ptica microscpica, 3) mtodo y cuantificacin de res
ultados, 4) establecimiento del rango de referencia, 5) interpretacin de resultad
os, 6) sueros de referencia, y 7) especificidad y avidez de los ANA. El Comit de
Estandarizacin de ANA de la Organizacin Mundial de la Salud recomienda que 1) los
laboratorios deberan comunicar los resultados IF-ANA a ambas diluciones, 1:40 y 1
:60, y 2) deberan proporcionar informacin del porcentaje de individuos normales qu
e son positivos a esas diluciones dentro de su propia experiencia (Tan. 1997). B
ylund y Nakamura (1991) han mostrado la importancia de la deteccin de los autoant
icuerpos SS-A/Ro en las pruebas de cribaje de autoanti-

CAPTULO 43 Tabla 43-9

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE L A S ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

983
Clasificacin de patrones citoplasmticos en inmunofluorescencia indirecta Antgenos r
epresentativos Actina, mosina no muscular Enfermedades y asociaciones clnicas Ambo
s en hepatitis crnica activa, cirrosis heptica y miastenia gravis: actina en hepat
itis autommune. enfermedad de Crohn . hemodilisis a largo plazo. SHN. pero raro en D
CTD Antivimentina a menudo causada por reaccin cruzada con anticuerpos anti-hlix e
n muchas clases de condiciones inlecciosas o inflamatorias, y en hemodilisis a la
rgo plazo; raro en DCTD, ambos vistos en SHN: la queratina es sistema principal
en EHA (69%). tambin comn en DCTD y psoriasis Miastenia gravis. enfermedad de Croh
n. colitis ulcerosa
Patrones citoplsmicos en IIF (substrato celular) 1. Fibroso Fibras de estrs libras
lineales citoesquelticas. algunas veces con depsitos granulares pequeos (HEp-2. fi
broblastos) Filamentoso- filamentos y fibrillas separndose del borde nuclear (HEp
-2, PIK2 clulas epiteliales)
Vimentina. queratina
Segmental - slo pequeos segmentos de fibras (cuerpos densos peridicos) estn decorada
s (HEp-2. fibroblastos) 2. Moteado Moteado tino: pequeas motas esparcidas, la may
ora con londo homogneo o moteado denso fino (HEp-2) Moteado denso tino nuboso, cas
i homogneo en todo el citoplasma (HEp-2) Polo granular, perinuclear, en forma de
flecha, granular grueso, correspondiente a los apilados laminares del complejo G
olgi (HEp-2) Reticular gruesa reticular grueso difuso y granular (HEp-2) Pequeos
moteados esparcidos: irregularmente distribuidas molas citoplasmticas contables (
HEp-2) Reticular lino - reticular lino difuso y granular (HEp-2) AWCA-pANCA tinc
in perinuclear irregular; cANCA: motas densas, finas o gruesas (granulocitos de s
angro perifrica, lnea celular de leucemia HL-60)
a-actinma, vinculina. tropormosina
Muchas de las ammoacil-RNAt-sintetasas. PM: "sindrome Jo-1" (miositis y enlermed
ad pulmonar intersticial) principalmente Jo-1 rRNP. fosfoproteinas ribosomales A
parato de Golgi LES neuropsiquitrico Raro en LES, SS y otras enfermedades reumtica
s sistmicas; descrito en ataxia cerebelosa idioptica, degeneracin cerebelosa parane
oplsica e infecciones virales, incluyendo E B V y VIH CBP; esclerosis sistmica (43
%). raro en otras DCTD. anticuerpos del centrmero estn frecuentemente asociados Ni
nguno reconocido
Protenas en la membrana mitocondnai interna (M2 principalmente) Lisosomas o perox
isomas
Retculo endoplsmico(); otras protenas desconocidas Dianas pANCA mieloperoxidasa. cAN
CA dianas PR3 (proleinasa 3)
EHC. detectado en todos los tipos de condiciones inflamatorias (crnicas) Descrito
primero en vasculitis sistmica con glomerulonefritis necrolizante y enfermedad p
ulmonar inflamatoria: granulomatosis de Wegener (cANCA) y otras vasculitis necro
tizantes (pANCA); catepsma-G es el antigeno principal en colilis ulcerosa, enfer
medad de Crohn y colangitis primaria esclerosante hepatitis autommune; vasculiti
s en terapia PTU: recientemente descrito en AR (32%). IgM ANCA en tuberculosis y
malaria

ANCA = anticuerpos citoplsmicos antineutrotilos, EHA = enfermedad heptica alcohlica

; EHC = enlermedad heptica crnica. DCTD enfermedad ditusa del tejido conectivo; EB
V = virus EpsteinBarr; VIH = virus de inmunodeficiencia adquirida; IIF = test de
mmunolluorescencia indirecta. SHN suero humano normal; CBP = cirrosis biliar pr
imaria: PM = polimiositis. PTU - propiltiouracilo. RNP ribonucleoproleina, SS =
sindrome de Sjogren: LES lupus eritemaloso sistemico Modificado de von Mhlen CA,
Tan EM Autoantibody specificities in autoimmune rheumatic diseases Rev Bras Rheu
matol 1994 34:173. con permiso
era positivo en el 23% de 54 pacientes AR, 25% de 24 pacientes con esclerosis si
stmica, 9% de 11 pacientes con polimiositis, y el 2% de 59 pacientes normales (Ma
ddison, 1985). Una sensibilidad creciente y una especificidad decreciente podran
provocar falsos positivos en las pruebas. Ademas, se determinaron asociaciones c
lnicas con distintos anticuerpos principalmente utilizando tcnicas de ID.
anuales desde 1989 hasta 1992 (Charles. 1992; V a n Venrooij, 1991). En 1988 y 1
989, se dirigieron talleres de consenso para definir la concordancia entre labor
atorios en la deteccin de especificidades de autoanticuerpos en enfermedades reumt
icas. Veintiocho laboratorios participaron en el estudio y utilizaron diversas m
etodologas. Los objetivos del estudio del consenso iniciado en 1989 fueron 1) def
inir el consenso entre laboratorios en cuanto a la deteccin de autoanticuerpos y
especificidades. 2) probar si las discrepancias eran debidas a la metodologa util
izada, y 3) hacer recomendaciones para la calidad mejorada de resultados con sen
sibilidad mejorada y mayor especificidad.
VARIACIONES EN LAS METODOLOGAS USADAS PARA LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE A
ANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
Los mejores estudios referentes a los diferentes mtodos para la deteccin de autoan
ticuerpos frente a antigenos intracelulares fueron descritos por un Grupo de Est
udio de Consenso Europeo. El Grupo de Estudio de Consenso Europeo para la Detecc
in de Autoanticuerpos frente a Antgenos Intracelulares en Enlermedades Reumticas se
form en 1988 y ha dirigido cuatro talleres
Enzimoinmunoanlsis
En los estudios de 1988 y 1989. se observaron muchas reacciones falsopositivas.
Las reacciones falso-positivas estaban causadas por reactivos bloqueantes de baj
a calidad en el proceso; tambin, se usaban preparaciones de antigeno impuro. En e
l estudio de cooperacin de 1990 y 1991. el laboratorio que usaba ELISA funcion muy
bien, con pocos falso-positivos o resultados negativos extraos. Los ELISA tambin
funcionaron bien al clasificar los sueros con mltiples especificidades. El porcen
taje de laborato-

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

Figura 43-2. Inmunolluorescencia indirecta de clulas HEp-2 con auloanticuerpos pa
ra distinguir amgenos citoplasmticos (x400. m a n c h a FITC). A. Se observa el pa
trn caracterstico de autoanticuerpos frente al aparato de Golgi. con granulos orga
nizados en grupos en un poio de la clula y respetando los ncleos. B. Los autoantic
uerpos frente a miosina no muscular adornan las fibras de estrs del citoesgueleto
. Estos autoanticuerpos se encuentran en pacientes con miastenia gravis y enferm
edades hepticas crnicas. C, Autoanticuerpos antimitocondriales presentan un patrn g
ranular grueso que incluye todo el citoplasma, observado sobre todo en cirrosis
biliar primaria. Distintos puntos en el nucleoplasma obtenidos por el suero util
izado estn determinados probablemente por una segunda poblacin de autoanticuerpos
dirigidos contra un antgeno mtranucleoplsmico, un fenmeno no poco habitual en pacie
ntes con enfermedades hepticas. D. El patrn citoplasmtico granular denso, casi homo
gneo, obtenido con anticuerpos anti-r RNP. Ellos se dirigen a fosfoproteinas nbos
omales. y se asocian clnicamente con manileslaciones del sistema nervioso central
en pacientes con lupus eritematoso sistmico. Como se puede ver en el dibujo, no
es infrecuente que estos anticuerpos tambin tian el nuclolo en un patrn homogneo, aun
que dbilmente. (De von Mhlen CA. T a n EM: Autoantibody specilicilies in autoimmur
e rheumatic diseases. R e v Bras Rheumatol 1994; 34:173; c o n permiso.) Figura
43-1. Inmunolluorescencia indirecta con autoanticuerpos frente a antgenos nuclear
es y nucleolares en clulas HEp-2 (x40C. m a n c h a FITC) A, Autoanticuerpos fren
te a protenas laminares A, B y C de la envoltura nuclear dan un patrn homogneo nucl
ear en clulas HEp-2, asociados con un borde nucleoplsmico continuo. No se observa
ningn borde cuando los anticuerpos se dirigen contra histonas o ds-ADN. Los artcul
os previos sobre un patrn perifrico obtenido por anticuerpos anti-ds-ADN probablem
ente se deban a arielactos de fijacin. El patrn nucleoplsmico moteado que se ve en f
ies caracterstico de autoanticuerpos dirigidos contra antgenos nucleares extraible
s. como el anli-U1-nRNP mostrado aqui. Los nuclolos y las clulas en metafase son n
egativos. C, Autoanticuerpos anticenlrmero, observados tpicam e n t e en pacientes
con la forma limitada de esclerodermia (sndrome de CREST). pero tambin en cirrosi
s biliar primaria. Se observan distintas manchas en el ncleo en interfase. una po
r cada par de cromosomas, que se renen en las placas de metafase durante la divis
in de la clula (en el centro dos clulas en telofase). Autoanticuerpos frente a NOR90 y ARN-polimerasa I obtienen el m i s m o patrn en clulas HEp-2 (D). con motas n
ucleolares y puntos a lo largo de algunos husos de las clulas en metafase (en las
dos clulas dividindose en el centro). Pueden diferenciarse por otros ensayos, c o
m o la mmunotransferencia o la mmunopreciptacin. Los autoanticuerpos que se dirig
en contra la fibrilarina (U3-nRNP) lien de forma grumosa lodos los nuclolos (). (De
von Mhlen CA. Tan EM: Auloantibody specificities in autoimmue rheumatic diseases.
Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173: con permiso.)

986
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
Figura 43-3. Algunos otros patrones distintos en nmunofluorescencia indirecta de
clulas HEp-2 (x 400, m a n c h a FITC). A. Clulas al final de la metalase muestran
antigenos que se condensan en la mitad del cuerpo, tambin lamada la regin de puen
te intercelular. Los polos del huso de las clulas en divisin pueden estar adornado
s, como en 0, con anticuerpos frente al aparato mittico. c o m oN u M A (proteina
nuclear asociada a la mitosis). Los autoanticuerpos PCNA ofrecen un mosaico de
patrones nucleoplsmicos (C), que oscilan desde homogneos a distintos moteados, segn
las fases de la divisin celular (detalles en el texto). D, El patrn obtenido con
autoanticuerpos anti-p80-coiln, donde se pueden ver de una a ocho m a n c h a s n
ucleoplsmicas. (De von Mhlen CA, Tan EM: Autoantibody specilicities in autoimmune
rheumalic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173, con permiso.)
Tabla 43-10
M t o d o s d e deteccin de anticuerpos contra antgenos nucleares e intracelulares
Mtodo Extraccin del antigeno
Seccin tisular, lineas celulares Tejido y extractos celulares Tejido y extractos
celulares Extractos celulares Antgenos nativos purificados o recombinantes
Sensibilidad y utilidad
Tcnica sensible, utilizada a menudo como deteccin precoz Necesita una reaccin de pr
ecipitacin, alta especificada pero baja sensibilidad Elevada sensibilidad y veloc
idad comparada con las tcnicas de ID Alta sensiblidad, permite la deteccin de anti
cuerpos Irente a antigenos solubres c insolubles Alta sensibilidad y cuantilicac
in. puede determinar la clase de anticuerpo
Inmunofluorescencia con microscopa (IFM) Inmunodilusin doble (ID) Recuento por mmu
noelectroloresis Inmunoblot; Western blot (IB. WB) ELISA
From Nakamura RM. Bylund DJ. Ian EM: Curent status ol available standards for qu
ality improvement ot assays tor the detection of autoantibodies to nuclear and i
ntracellular antigens J Clin Lab anal 1994b: 8:360. con autorizacin.

CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE L A S ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

987
1
2
3
4
dad para los mejores reactivos comerciales es la revisin peridica del Colegio de I
nmunopatlogos Americanos.
Inmunotransferencia
Esta tcnica es muy sensible y es un importante mtodo para la caracterizacin de la n
aturaleza especfica de muchos de los autoanticuerpos. U n a importante ventaja de
l mtodo es que un anticuerpo especifico puede ser identificado mediante preparaci
ones de extractos de antgeno de clulas natural (Fig. 43-4). El Estudio de Consenso
Europeo observ lo siguiente con el procedimiento de inmunotransferencia (Nakamur
a, 1994b): 1. La preparacin del antgeno es m u y importante en el procedimiento de
inmunotransferencia 2. La deteccin de anticuerpos frente a nRNP. Sm y Scl-70 fue
aceptable. Este mtodo sensible es til en la deteccin de mltiples especificidades de
anticuerpo en la misma muestra. 3. El mtodo requiere controles cuidadosos a las
bandas de peso molecular. Por ejemplo, las bandas de histona pueden ser confundi
das con un antigeno centromrico (CENP-A, 19 kDa) y Scl-70 (topoisomerasa I) puede
ser confundido con otras bandas de100 kDa. 4. La degradacin de protenas puede pro
ducirse en el extracto de clulas de antigeno usadas para inmunotransferencia, esp
ecialmente Scl-70 y antigenos de centrmero. 5. El anti-Sm se distingue por la pre
sencia de anti-D (el antigeno D es una protena de 16 kDa contenida en todas las p
artculas principales nRNP). 6. Anti-SS-B/La se detecta enseguida por inmunotransf
erencia. Anti-SS-A'Ro se detecta mal por inmunotransferencia y es insensible, po
rque SS-A'Ro puede no demostrar la estructura apropiada para el reconocimiento.
SDS-PACI : l- yol
t u r a d o Ir iinli|>i'iiii: I I K L I la clula VIOIT -4 Sislenia lie ili'li'ccii
'in: l-pnuciiiu A
Figura 43-4. Ensayo de immunotranslerencia de autoanticuerpos c o m u n e s obse
rv a d o s en enfermedades reumticas. En la b a n d a 1 la zona de nitrocelulosa
fue investigada en un suero h u m a n o normal (control negativo), no aprecindose
ninguna reactividad, tal y c o m o se esperaba. Las siguientes 3 bandas m u e s
t r a n distintas franjas obtenidas por sueros controles positivos m e z c l a
d o s conteniendo especificid a d e s conocidas. La b a n d a 2 representa react
ividades c o n las nbonucleoproteinas (RNP) SSA (52 y 60 kOa), SSB (48 kDa), Sm
(B/B\ 28 kDa, y D. 14 kDa) y U1-nRNP (la protena de 70 kDa y una franja tenue alr
ededor 0e 1 9 kDa. el antigeno C; la protena A. con 32 kDa y tambin reconocida de
m o d o caracterstico p o r anticuerpos U1- n R N P . no se ve en este experiment
o). La banda 3 m u e s t r a las franjas obtenidas u s a n d o los prototipos de
antisueros h u m a n o s frente a Jo-1 (52 kDa), Ku (dos band a s alrededor de
las regiones de 70 y 80 kDa) y RNP ribosomal (15, 18 y 37 kDa). La pequea franja
por e n c i m a del antgeno de 52 kDa no est identificada. La banda 4 p r e s e n
t a las Iranias vistas ms comnmente utilizando sueros de pacientes con escleroderm
ia, p o r ejemplo, anti-ADN topoisomerasa I (Scl-70. 95 kDa), y anticuerpos anti
centrmero (16 kDa. CENP-A, y 80 kDa. CENP-B). A la derecha, se pueden v e r posic

iones en kilodaltons del amplio rango de pesos moleculares estndares. (De von M U
h l e n CA. T a n EM Autoantibody specificities m a u t o i m m u n er h e u m
a t i c diseases. R e v Bras Rheumatol 1994: 34:173, con permiso.)
RESUMEN
Hay muchos tipos de autoanticuerpos trente a antigenos intracelulares y nucleare
s en las diversas enfermedades reumticas sistmicas. Normalmente, se considera impo
rtante no slo detectar la presencia y cantidad del autoanticuerpo intracelular y
nuclear en el paciente, sino tambin identilicar la especificidad inmunolgica. Estu
dios anteriores han mostrado que distintos perfiles diagnsticos de los autoanticu
erpos se observan en muchas de las enfermedades reumticas. Algunas de las enferme
dades se caracterizan por la presencia o ausencia de un anticuerpo especifico, o
por diferencias en el nivel cuantitativo o titulo del anticuerpo. Se ha progres
ado mucho en mejorar la sensibilidad, especificidad y control de calidad de las
diversas pruebas de laboratorio para la deteccin de autoanlicuerpos frente a antge
nos intracelulares y nucleares. Los bilogos moleculares han utilizado muchos de l
os anticuerpos c o m o sondas biolgicas y han aclarado las lunciones biolgicas de
varios de los autoantgenos. Se ha progresado mucho en el conocimiento de la patogn
esis y mecanismos inmunes en las enfermedades reumticas.
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o l 1989; 1 : 3 7 6
os clnicos que usaban ELISA aument del 25% al 47% durante un periodo de cuatro aos,
de 1989 a 1992. Homburger (1998) public una comparacin enlre un ELISA comercial y
IF-ANA sobre clulas HEp-2, concluyendo que ambos mtodos eran sustancialmente equiv
alentes para detectar ANA clnicamente relevantes en pacientes con enfermedades re
umticas sistmicas. Llegando a la conclusin opuesta, Emlen (1997) prob seis equipos d
e ELISA comerciales y sac como consecuencia que existan diferencias significativas
en la deteccin de ANA por inmunofluorescencia y ELISA. Un grupo de cientficos int
ernacionales reunidos por la Organizacin Mundial de la Salud llevaron a cabo la r
ealizacin de muchos ELISA comerciales, mostrando que 1) ningn fabricante en partic
ular era claramente superior a otros en lo que se refera a la sensibilidad, espec
ificidad y precisin de sus productos y 2) las reas que necesitaban mejora estaban
en los equipos para la deteccin de anticuerpos frente a ds-ADN y antigenos Sm (Ta
n. 1999). Se debe tener gran cuidado a la hora de seleccionar reactivos ELISA y
equipos comerciales. Una buena fuente de datos de control de cali-

988
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA Nakamura RM. Peebles CL. Rubin RL Autoantibodies to nu

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CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

989
T e r Borg EJ. Groen H. Horst G: Clinical association ol antiribonucleoprotein a
ntibodies in patients with systemic lupus erythematosus Semin Arthritis Rheum 19
90; 20:164 Tb|o T, Kaburaki J, Hayakawa M: Precipitating antibody to a soluble n
uclear antigen TC with specificity lor systemic lupus erythematosus Ftyumachi 19
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ematosus J Rheumatol 1992:19:1380.

C A P T U L O
44
Vasculitis
Rex M. McCallum, M.D. David J. Bylund, M.D.
CLASIFICACIN PATOGNESIS DE LA VASCULITIS PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLNIC
AS DE LABORATORIO Pruebas de rutina Pruebas especiales Algunos patrones de prueb
a en vasculitis ANTICUERPOS ANTINEUTRFILOS CITOPLASMTICOS Mtodos de deteccin Especif
icidad antignica Asociaciones con enfermedad Interpretacin de la prueba
990 990 991
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SNDROMES VASCULTICOSIDIOPTICOS Poliarteritis nodosa Vari
antes de PAN Sndrome de Churg-Strauss Sndrome mixto de poliangetis Granulomatosis d
e Wegener Granulomatosis linfomatoide
993
992
Prpura de Henoch-Schnlein Arteritis de clulas gigantes (temporal) Arteritis de Taka
yasu Angetis primaria del sistema nervioso central Enfermedad de Kawasaki RESUMEN
BIBLIOGRAFA 998 998
Las manileslaciones clnicas y patolgicas de la vasculitis necrotizante sistmica son
proteicas. Los clnicos se enfrentan a un paciente que presenta una serie amplia
de sntomas y/ o signos confusos y contradictorios. El diagnstico de un sndrome vasc
ulitico necrotizante sistmico requiere una evaluacin minuciosa que relacione la hi
storia de un determinado paciente y la exploracin fsica con los datos de laborator
io. Aunque la vasculitis se puede producir en cualquier zona del cuerpo, se han
definido patrones distintos de la enfermedad y su tipificacin apunta hacia altera
ciones determinadas. El diagnstico especfico es importante porque el Iratamiento y
el pronstico dependen de los lugares y patrones de la afectacin del rgano (Langfor
d. 1995). La vasculitis necrotizante sistmica puede definirse patolgicamente como
una inflamacin causante de lesiones vasculares. Estas lesiones pueden incluir la
proliferacin de clulas ntimas dentro de la luz de los vasos, estrechando o incluso
cerrando ese espacio y causando isquemia y un posible infarto de estructuras ana
tmicas distales al lugar del dao vascular. Tambin, la pared del vaso puede debilita
rse hasta formarse un aneurisma o la ruptura del vaso. La vasculitis idioptica (p
rimaria) se produce cuando el dao inflamatorio vascular es el principal hallazgo
clinicopatolgico y no hay enfermedad subyacente. La vasculitis secundaria se prod
uce cuando las lesiones vasculares acompaan a una enfermedad subyacente (Tabla 44
-1). El foco de este captulo es la vasculitis idioptica y aquellas pruebas clnicas
de laboratorio tiles para su diagnstico y tratamiento. Como los mtodos de diagnstico
y tratamiento en los sucesos vasculares secundarios se centran en las enfermeda
des subyacentes, se tratan en los captulos correspondientes de este libro. Sin em
bargo, los comentarios relacionados con la valoracin de laboratorio del dao en el r
gano distal en la vasculitis idioptica estn relacionados con la vasculitis secunda
ria.
CLASIFICACIN
No existe un sistema de clasificacin estndar ampliamente aceptado para las afeccio
nes vasculares idiopticas. Histricamente, su clasificacin se ha basado en varias co
mbinaciones de hallazgos clnicos y patolgicos (Jennelte, 1998, 1997). aunque en lo
s ltimos aos las clasificaciones activas han mejorado debido a los resultados en l
a nomenclatura estndar (Hoffman. 1998; Hunder, 1990; Jennette, 1994). El esquema
de clasificacin que aparece en la Tabla 44-2 est modificado a partir del utilizado
en los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (Langford, 1995).

PATOGNESIS DE LA VASCULITIS
Ni la etiologa ni la patognesis de las afecciones vasculares se conocen excepto en
los ejemplos de dao directo en los vasos sanguneos por infeccin vascular, o vascul
itis secundaria. La mayora de las alecciones vasculares idiopticas se atribuyen a
daos vasculares mediados por la inmunidad inducidos por alguno de varios mecanism
os, incluyendo: 1) depsitos inmunocomplejos; 2) autoanticuerpos directos ligados
o a estructuras de las paredes de los vasos (p. ej., endotelio o antgenos de la m
embrana basal) o a neutrfilos cuando la vasculitis est asociada con el anticuerpo
antineutrfilo citoplasmtico (ANCA); y 3) inflamacin mediada por clulas T. Los efecto
s patognicos de todos estos mecanismos se unen en una va final comn d e dao vascular
que activa los mediadores humorales y celulares de la inflamacin. Las molculas de
adhesin que estn involucradas en la respuesta inmune normal parecen intervenir en
las respuestas inmunes patolgicas

CAPTULO 44

VASCULITIS
991
Tabla 44-1
Afecciones vasculares necrotizantes sistmicas secundarias
Tabla 44-3
Anticuerpos a s o c i a d o s con vasculitis Asociacin con e n f e r m e d a d Gr
anulomatosis de Wegener Poliarteritis microscpica Prueba principal Mtodos IFM. ELI
SA IFM, ELISA
Vasculitis relacionada con medicamentos Vasculitis relacionada con protenas extraa
s Vasculitis asociada con infeccin Vasculitis en neoplasias malignas Granulomatos
is linlomatoido Vasculitis urticarial hipocomplementmica Prpura hipergammaglobulinm
ica Vasculitis cnoglobulinmica Vasculitis por radiacin Vasculitis por trasplante (
rechazo vascular) Vasculitis asociada a enfermedades del tejido conectivo Artrit
is reumatoide Lupus eritematoso sistmico Sndrome de Sjogren Esclerodermia Dermatom
iositis/ polimiosilis Sarcoidosis Policondritis recidivante Sndrome del anticuerp
o anlilosfolipido Enfermedad de Behcet
Adaptado de Langford CA, McCallum RM Idiophatic vasculitis. In Belch JJF Zurier
RB (eds): Connective Tissue Diseases London. Chapman & Hall, 1995 pag 179. con p
ermiso
Anticuerpo ANCA (generalmente c-ANCA) ANCA (c-ANCA o p-ANCA) Anticuerpos anli C1
q
Vasculitis urticarial unin C1 q hipocomplementmica Anticuerpos antihepatilis B PAN
asociado a hepatitis B ELISA Anticuerpos antinucleares Lupus eritematoso sistem
ico IFM. ELISA (ANA) Crioglobulmas mezcladas Vasculitis cnoglobulinmica Cnoprecip
itacin, IEP.IF SSA (Flo). SSB (La) Sindrome de S|gren IFM. ELISA, ID Factor reumat
oide Artritis reumatoide LA, ELISA
ANCA = autoanticuerpos antineulrMos citoplasmaticos; c-ANCA = ANCA otoplasmticos E
LISA ensayo inmunosorbente ligado a enzimas: GBM membrana basal glomerular. ID =
inmunodilusion, IEP = inmunoelectroforesis; IF = inmunofijacin IFM = microscopa d
e inmunoflorescencia indirecta; LA aglutinacin del ltex. p-ANCA = ANCA perinuclear
; PAN = poliarteritis nodosa.
observadas en la vasculitis. Se observan anormalidades cuantitativas y cualitati
vas en la produccin de citocinas en la vasculitis sistmica. Se han descrito nivele
s aumentados de interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6. factor a de necrosis tumoral
(TNF-(x) y T N F J 5 (Arimura, 1993: Grau, 1998), asi como una produccin aumentad
a de TNF-u por las clulas mononucleares circulantes (Deguchi, 1990). Estos mediad
ores inician la infiltracin de clulas inflamatorias, la activacin del complemento y
cascada de la coagulacin, y la regulacin ascendente de otras molculas inflamatoria
s (Conn, 1993: Niles. 1995: Snellen 1997).
mente, la confirmacin histolgica o angiogrfica de la vasculitis debera obtenerse de
una biopsia de tejido o angiografia para el diagnstico definitivo previo a la ter
apia (Mandell. 1994). Las pruebas clnicas de laboratorio tienen un valor limitado
en el establecimiento de un diagnstico especfico de la vasculitis (Mandell. 1994)
, aunque los clnicos usan estas pruebas como ayuda en la identificacin de los patr
ones de la implicacin del rgano caracterstico de la vasculitis, evaluando el alcanc
e y la gravedad del dao en el rgano final, diferenciando la vasculitis idioptica de

las formas alternativas secundarias y estableciendo los valores bsales para su t

ratamiento. La asociacin de ANCA con ciertas afecciones vasculares idiopticas se h
a convertido en una importante ayuda en el diagnstico y tratamiento. Los ANCA se
tratan con detalle a continuacin. Cuando se evala a un paciente cuyo diagnstico dif
erencial incluye vasculitis, resultan tiles los siguientes principios relativos a
l uso e interpretacin de las pruebas clnicas de laboratorio.
PERSPECTIVA SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLNICAS DE LABORATORIO
Cuando se evalan pacientes con una enfermedad multisstmica complicada, el objetivo
del clnico es el diagnstico correcto hasta un nivel que permita un tratamiento ade
cuado. Como no existe una clnica patognomnica ni rasgos de laboratorio de la vascu
litis, el clnico debe utilizar combinaciones de hallazgos clnicos y de laboratorio
para reconocer los patrones de la enfermedad. Esto puede permitir un diagnstico
especfico o, ms comnmente, la clasificacin de la enfermedad del paciente como una de
ntro de un grupo de trastornos vasculticos con tratamiento similar, incluso cuand
o no se identifica ninguna entidad especfica. Decidir si un paciente tiene vascul
itis basndose estrictamente en los sntomas clnicos conlleva riesgos debido al ampli
o nmero de posibilidades de diagnstico diferencial y la falta de hallazgos patogno
mnicos. ConsecuentePruebas de rutina
Los pacientes cuya historia y exploracin fsica sugieren vasculitis idioptica a menu
do presentan una serie confusa de dolencias multisistmicas que han venido sucedie
ndo durante algn tiempo. Las pruebas de primer orden que hay que considerar inclu
iran las siguientes: cultivos para agentes infecciosos, si el paciente tiene fieb
re; recuento completo de sangre (CBC) con recuento diferencial; velocidad de sed
imentacin globular (VSG); anlisis de orina: panel qumico de la sangre; y pruebas pa
ra la funcin de un rgano especfico, como el hgado.
Pruebas especiales
Las pruebas especiales ayudan a diferenciar la vasculitis idioptica de las altern
ativas en el diagnstico diferencial activo. Las pruebas relevantes d e laboratori
o incluiran aquellas que identifican los auloanticuerpos circulantes que se enume
ran en la Tabla 44-3 e inmunocomplejos. La biopsia tisular dirigida para la conf
irmacin histolgica de la vasculitis y/o la angiograla se consideran las pruebas def
initivas para la vasculitis idioptica.
Tabla 44-2
Afecciones vasculares necrotizantes sistmicas idiopticas (primarias) Vasculitis de
pequeos vasos Granulomatosis de Wegener Prpura do Henoch- Schnlem Angeitis primari
a del sistema nervioso central Vascuhlis de vasos medianos Sndrome de Churg- Stra
uss Poliarteritis nodosa Enlermodad de Kawasaki Vasculitis de vasos grandes Arte
ritis de clulas gigantes (temporal) Arteritis de Takayasu
Algunos patrones de prueba en vasculitis
Son tiles ciertos patrones de resultados de pruebas clnicas de laboratorio: El hal
lazgo de leucopenia y/o trombocitopenia en afecciones vasculares idiopticas es ra
ro y sugiere diagnsticos alternativos tales como lupus eritematoso sistmico (LES),
neoplasia, alteraciones de la mdula sea, granulomatosis linfomatoide o hiperesple
nismo (Mandell. 1994). VSG. aunque es un hallazgo no especfico, est tpicamente elev
ada en afecciones vasculares idiopticas. Si la VSG no est elevada antes del tra-

992
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
tamienlo, el diagnstico no es arteritis de clulas gigantes (temporal) o granulomat
osis de Wegener (WG). Puede verse vasculitis con rasgos histolgicos de poliarteri
tis nodosa (PAN) asociada con pancitopenia en pacientes con leucemia de clulas pe
ludas (Mandell, 1994). Anemia con hemoglobina por debajo de 9 g/dl se produce po
r circunstancias distintas que la anemia de la enfermedad crnica, tal como la hem
olisis, el sangrado oculto o la enfermedad renal (Mandell, 1994). Cuando se sosp
echa PAN, deberan realizarse las pruebas para la funcin heptica, virus de la hepati
tis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV) y citomegalovirus (CMV) (Golden, 1994
; Mandell, 1994). De forma similar, son apropiadas las pruebas serolgicas para lo
s virus de la hepatitis B y C cuando un paciente tiene crioglobulinas, vasculiti
s leucocitoclstica o biopsia cutnea y / o enfermedad renal.
1 1
Creatina-cinasa (CK) en sangre elevada puede indicar miositis o isquemia muscula
r (Mandell, 1994). Las pruebas para los anticuerpos antinucleares (ANA) y el fac
tor reumatoide (FR) son tiles slo cuando se sospecha enfermedad del tejido conecti
vo o artritis. Pacientes con vasculitis reumatoide tienen un alto ttulo de FR. L
a eosinofilia en sangre perifrica se produce en una amplia variedad de alteracion
es inflamatorias. Alrededor del 15% al 20% de los pacientes con PAN o WG pueden
tener eosinofilia pero no con los altos niveles vistos en el sndrome de Churg- St
rauss (CSS). La identificacin de ANCA citoplasmtico (c-ANCA) apoya el diagnstico de
WG en pacientes con hallazgos clnicos de WG (Mandell, 1994). Pacientes con WG no
tratados no tienen leucopenia En la primera orina de la maana, tanto antes como
despus de la centrifugacin, se deberan examinar cuidadosamente las protenas, hematur
ia, clulas y cilindros que acompaan a la glomerulonefritis que se puede producir e
n las afecciones vasculares. Si la amiloidosis renal est en el diagnstico diferenc
ial, existe de forma tpica proteinuria sin clulas.
Figura 44-1. Patrn de anticuerpo citoplasmtico antineutrfilo citoplasmtico (c- ANCA)
. La mayora de los neutrfilos fijados con etanol m u e s t r a n una fluorescencia
citoplasmtica finamente granular con acentuacin central No hay tincin nuclear (x 4
00).
ANTICUERPOS ANTINEUTROFILOS CITOPLASMATICOS
Los ANCA reaccionan con antgenos neutrfilos citoplasmticos (Jennette, 1993). La ide
ntificacin de ANCA se ha convertido en un importante accesorio para el diagnstico
de la vasculitis sistmica necrotizante (Niles, 1993). En los ltimos aos, ha habido
tambin un gran inters en cmo ANCA puede ser importante en la patognesis de WG y otra
s afecciones vasculares sistmicas (Jennette, 1993,1994).
demuestran tincin citoplasmtica y 3) no especificidad por los neutrfilos (p. ej., l
os linfocitos en el portaobjetos no deberan teir cuando el verdadero ANCA est prese
nte) y 4) granularidad citoplsmica heterognea (Roberts, 1992; Saviage, 1998). El p
-ANCA se caracteriza por la tincin del rea perinuclear (Fig. 44-2). aunque la tinc
in nuclear mimetizando ANA puede producirse cuando existen ttulos altos de este au
toanticuerpo (Niles, 1993). El patrn de tincin perinuclear que define p-ANCA est ca
usado por la redistribucin de los antigenos diana desde el citoplasma neutrfilo ha
sta la regin nuclear cuando se usa etanol para preparar neutrfilos humanos como su
strato (Jennette, 1993). Cuando se utiliza formalina antes que alcohol para fija
r neutrfilos. el antigeno diana se inmoviliza, y el patrn de tincin inmunofluoresce
nte entonces es citoplasmtico (Jennette, 1993). El papel del uso de neutrfilos fij
ados con formalina para detectar ANCA en la labor diagnstica de rutina sigue sien

do una controversia (Chowdhury, 1999).

Especificidad antignica
La especificidad antignica de c- ANCA se ha identificado como una sern proteasa nu
clear de 29 kDa, proteinasa 3 (PR-3), situada dentro de granulos primarios de ne
utrfilos y lisosomas de monocitos (Niles, 1993; Roberts, 1992). El p-ANCA en vasc
ulitis se debe generalmente a anticuerpos frente a mieloperoxidasa MPO-ANCA) (Fal
k, 1988). De manera interesante, muchos p-ANCA no se dirigen hacia MPO pero bast
antes se dirigen a otros
Mtodos de deteccin
Existen varios mtodos de laboratorio incluyendo la microscopa de fluorescencia ind
irecta (IFM), enzimoinmunoanlisis (ELISA), radioinmunoanlisis. transferencia weste
rn. transferencia en marcha, citometria de flujo e inmunoprecipitacin que se han
utilizado para detectar ANCA (Roberts. 1992; Wieslander, 1991). IFM y ELISA son
los mtodos de prueba usados ms comnmente con este fin. El IFM es el mtodo ms sensible
para la deteccin de ANCA. IFM se realiza utilizando neutrfilos humanos normales a
islados como sustrato. Estos neutrfilos son citocentrifugados frente a portaobjet
os de cristal multiperforado, fijados con un 99% de etanol, y despus incubados co
n diluciones de sueros de pacientes. Los neutrfilos tambin pueden sujetarse a los
portaobjetos por adherencia, frotis o tcnicas de gota (Roberts, 1992, 1990). Los
portaobjetos son teidos con un conjugado de inmunoglobulina (Ig) poliespecfica mar
cada con fluorescena; el conjugado poliespecfico se recomienda porque se producen
IgM e IgA c-ANCA (Roberts, 1992). Los portaobjetos se leen en un microscopio de
fluorescencia. Usando IFM. hay dos patrones principales de tincin de neutrfilos; c
-ANCA y ANCA perinuclear (p-ANCA). El c- ANCA se caracteriza por una tincin finam
ente granular de citoplasma neutrfilo con una acentuacin central entre los lbulos n
ucleares; el ncleo por s mismo no lie (Fig 44-1). Los criterios tiles para diferenci
ar c- ANCA de tinciones citoplasmticas no especficas debidas a otros autoanticuerp
os incluyen los siguientes: 1) ausencia de acentuacin central; 2) menos del 95% d
e los neutrfilos
Figura 44-2. Patrn de anticuerpo antineutrlilo citoplsmico perinuclear (p-ANCA). La
mayora de los neutrfilos fijados con etanol muestran fluorescencia perinuclear y
nuclear sin tincin citoplasmtica ( x 400).

CAPTULO 44

VASCULITIS
993
enzimas ciloplasmticos neutrfilos incluyendo elaslasa, laclolernna. lactoperoxidas
a, lisozma, azurocidma o catepsma G (Hoffman. 1998: Jennette. 1993; Niles. 1993).
Los ELISA para detectar autoanticuerpos (rente a PR-3 (PR-3-ANCA) muestran una
buena correlacin con la presencia de c-ANCA cuando observadores experimentados re
alizan IFM (Niles. 1993; Robeds, 1992). Un ELISA para detectar PR-3 ANCA debe se
r validado cuidadosamente, lijndose de modo especial en el uso de tcnicas conocida
s en la preparacin del antgeno en fase slida y utilizando un control tanto de los p
asos previos como de pasos especficos en la absorcin para enlaces no especficos de
inmunoglobulina a la fase slida (Niles, 1993; Roberts, 1992: Wang, 1997). En Euro
pa se han hecho esfuerzos para estandarizar ELISA en fase slida (Hagen, 1996,1998
). Existen en el mercado disponibles ELISA autorizados tanto para PR-3 como para
MPO. La mayora utilizan un recubrimiento de antigeno estndar directo de placas mi
croperforadas de poliestireno para que la pureza del antgeno sea de vital importa
ncia en la definicin de la sensibilidad y especificidad analtica (Niles. 1993; Rob
erts, 1992). Son importantes los intentos para conservar la conformacin del antig
eno natural, ya que los ANCA frente a PR3 estn dirigidos contra los epitopos conf
ormacionales (Hoffman, 1998). La correlacin entre p-ANCA y la deteccin de mieloper
oxida en ELISA, sin embargo, no es buena (Roberts, 1992). Varios autoanticuerpos
incluyendo ANA, elastasa antineutrfila o ANA granulocito-especificos (GS-ANA) pu
eden producir un patrn p-ANCA en IFM. As los sueros que producen fluorescencia nuc
lear en IFM requieren una prueba adicional para confirmar MPO-ANCA. MPO-ELISA se
recomienda para confirmar la especificidad anti -MPO porque se sabe que los ver
daderos ANA o GS-ANA y MPOANCA se producen simultneamente. IFM usando clulas Hep-2
no hace esta distincin adecuadamente porque ANA y MPO-ANCA pueden producirse jun
tos, y GS-ANA puede ser negativo en clulas Hep-2 (Robeds. 1992; Specks. 1994). EL
ISA tiene limitaciones por lo que. por ltimo, cada laboratorio debe verificar cui
dadosamente las informaciones de un fabricante para que el clnico pueda recibir i
nformacin sobre las caractersticas de la realizacin Esto adquiere especial importan
cia en las situaciones clnicas confusas donde puede haber discrepancias entre la
presentacin clnica y los resultados de laboratorio y/o resultados discordantes ent
re IFM y pruebas ELISA.
antigeno diana en la enfermedad inflamatoria intestinal no se han definido plena
mente, aunque se han descrito autoanticuerpos contra lactoperoxidasa. proteina b
actericida del aumento de la permeabilidad (Hoffman. 1998), lactoferrina (Peen.
1993) o catepsina G (Jennette, 1993).
Otras
enfermedades
Los ANCA tambin se han descrito en otras enfermedades incluyendo lupus eritematos
o inducido por medicamentos, LES. sndrome de Felty y artritis reumatoide. sndrome
de Sigren, polimiositis y dermatomiositis. artritis reumatoide juvenil, artritis
reactiva, policondritis recidivante, sndrome del anticuerpo antifosfolipido. sndro
mes mielodisplsicos. virus de inmunodeliciencia humana (VIH), cromomicosis, amebi
asis invasiva, endocarditis subaguda bacteriana, fibrosis quslica y ciertas neopl
asias (Choi, 2000; Hoffman. 1998; Jennette, 1993: Peter. 1993). En las alteracio
nes del tejido conectivo, los ANA que mimetizan p-ANCA deben ser excluidos Mucho
s pacientes tratados con hidralazina parecen desarrollar MPO-ANCA (Roberts. 1992
). Vasculitis asociada a propiltiouracilo se ha asociado con ANCA positivo (Hoff
man, 1998).

Interpretacin de la prueba
La interpretacin de las pruebas de ANCA debera considerar vanos factores (Hagen. 1
998; Hoffman. 1998: Vassilopoulos.1999): Las pruebas ANCA no deberan utilizarse c
omo pruebas de deteccin sistemtica en grupos de pacientes no seleccionados donde l
a prevalencia de vasculitis es baja (Langford. 1998). Las pruebas de ANCA son ms
valiosas cuando se ordenan selectivamente en situaciones clnicas donde alguna tor
ma de vasculitis asociada a ANCA sea una posibilidad seria. El patrn de inmunoflu
orescencia c-ANCA deberia confirmarse usando PR3 ELISA (Savige. 1999). La reacti
vidad anti- PR3 se ve ms a menudo en WG activo o P A N pero puede verse en glomer
ulonefritis idioptica progresiva o CSS. c-ANCA en WG se considera altamente sensi
ble al sealar la enfermedad sistmica activa (67% a 97%) segn Vassilopoulos y Hoffma
n (1999). El valor predictivo de un ttulo aumentado de c-ANCA como presagio de un
a recidiva de WG est controvertido, pues no todas las elevaciones en el titulo de
c-ANCA se siguen de un empeoramiento de WG (Specks, 1994). El patrn p-ANCA en IF
M no es especfico desde el punto de vista diagnstico. Los sueros p-ANCA positivos
deberan probarse con ELISA para MPOANCA (Savige, 1999) MPO-ANCA se ve ms a menudo
en PAN, glomerulonefritis idioptica progresiva o CSS; sin embargo, puede verse en
WG. Ni un diagnstico de la vasculitis sistmica necrotizante ni una decisin para tr
atar debera basarse slo en un resultado de la prueba ANCA positivo. Un ANCA negati
vo no debera usarse para excluir la enfermedad Los autores consideran un c-ANCA p
ositivo como posible WG y una seal para una evaluacin ms exhaustiva. Por ltimo, la i
nterpretacin de una prueba para ANCA depende de la filosofa y experiencia de los c
lnicos individuales que tratan las vasculitis (Jennette, 1998).
Asociaciones con enfermedad Vasculitis
Tanto PR-3 ANCA (c-ANCA) como MPO-ANCA (p-ANCA) estn asociados con WG, PAN incluy
endo poliarteritis microscpica. CSS, glomerulonefritis idioptica necrotizante pauc
iinmune y progresiva y sndromes de superposicin de poliangitis (Cohn, 1991; Niles,
1993). PR-3-ANCA se identifica en alrededor del 90% de los pacientes con WG acti
va mientras que MPO-ANCA se identifica en menos del 10% de estos pacientes. El o
chenta por ciento de los pacientes con poliarteritis microscpica activa tienen o
PR3-ANCA o MPO-ANCA ms o menos con la misma frecuencia. MPO-ANCA se identifica en
pacientes con CSS o glomerulonefritis pauciinmune en el 70% al 80% de pacientes
con enfermedad activa; raramente, este ltimo grupo de enfermedades puede asociar
se con PR-3-ANCA antes que con MPO-ANCA. Se ha descrito la coexistencia de ANCA
y anticuerpos antiglomerulares de la membrana basal (anti- GBM) (Niles, 1993; Bo
nsib. 1993).
Enfermedad inflamatoria de los tractos gastrointestinal y hepatobiliar
Se han publicado vanos artculos sobre la asociacin de ANCA con enfermedades inflam
atorias del tracto gastrointestinal (Gl) y hepatobiliar (Jennette, 1993). Los pANCA se han descrito en aproximadamente el 75%-80% de los pacientes con colitis
ulcerosa activa o colangitis esclerosante primaria (Ellerbroek. 1994; Klein, 199
1: Lo, 1993), alrededor del 75% de los pacientes con hepatitis crnica activa; alr
ededor del 30% de los pacientes con cirrosis biliar primaria (Kallenberg. 1992:
Mulder. 1993) y el 20% de los pacientes con enfermedad de Crohn (Jennette, 1993:
Roberts, 1992). Las especificidades del
RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SNDROMES VASCULTICOS IDIOPTICOS Poliarteritis nodosa Epi
demiologa
PAN. como todas las afecciones vasculares, es una enfermedad poco comn. Las estim
aciones de la prevalencia de PAN han vanado desde 4.6 por 1.000.000 en Inglaterr
a, hasta 9.0 por 1.000.000 en el Condado de Olmstead. en Minnesota, y hasta 77 p
or 100.000 en una poblacin de esqu-

994
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA nes significativas por la medicacin en si. La ciclofosf

amida puede utilizarse para pacientes con PAN grave (afectacin Gl, cardaca y del s
istema nervioso central [SCN]), aquellos en los que fracasan los corticoides sol
os, y para restringir esteroides en pacientes que presentan efectos adversos sig
nificativos a estos (Langford, 1995). El pronostico para pacientes con PAN ha me
jorado en gran medida con el uso de glucocorticoides. atendiendo la media de sup
ervivencia de cinco aos del 13% al 50% y al 60%. L a mayora de los fallecimientos
se producen durante el primer ao, pero ya sea antes o despus de un ao de enfermedad
, la mortalidad se produce sobre todo o por infeccin o por complicacin del tratami
ento o por secuelas de la obliteracin del vaso, como el infarto de miocardio o id
us (Langlord. 1995).
males de Alaska hiperendmica para hepatitis B (Langford. 1995: Conn, 1993). PAN p
uede producirse en cualquier gnero y a cualquier edad, pero es ms comn en hombres (
relacin varones/hembras = 2:1) entre 40 y 60 aos de edad (Langtord. 1995). No se h
a observado predileccin racial (Conn.1993).
Rasgos clnicos
PAN es una vasculilis sistmica necrotizante que afecta predominantemente a arteri
as de pequeo a mediano calibre. Las manifestaciones clnicas de la PAN clsica son mu
y variables. Los pacientes a menudo presentan sntomas no especficos como fiebre, pr
dida de peso y malestar. La hipertensin es habitual y puede ser una importante cl
ave diagnstica. Aunque la PAN puede producirse prcticamente en cualquier rgano, la
afectacin sintomtica de la piel, articulaciones, nervios perifricos, tracto Gl y rone
s normalmente dominan el cuadro clnico (Conn, 1993). Las pruebas que indican una
funcin heptica anormal sugieren la posibilidad de una infeccin por hepatitis B conc
urrente (Langford. 1995). La afectacin pulmonar en la PAN clsica es rara e incluso
controvertida. Aunque algunos investigadores piensan que la PAN pulmonar se pro
duce (Lie, 1989), otros creen que estos pacientes tienen CSS o WG, donde la enfe
rmedad pulmonar es habitual (Langford, 1995: Fauci, 1998). La evolucin de la PAN
se caracteriza por remisiones, recidivas y, si no se trata, alia mortalidad (Fau
c, 1998).
Variantes de PAN
Dos importantes variantes de la PAN son la PAN cutnea y la PAN asociada con hepat
itis B. La PAN cutnea es una vasculitis necrotizante de las arterias pequeas muscu
lares en el tejido subcutneo. Por definicin, este es un proceso localizado que no
afecta a arterias viscerales y por consiguiente, no es una vasculitis sistmica. E
l diagnstico se establece por hallazgos histolgicos caracteristicos en biopsia de
piel con una evaluacin sistmica negativa. Las lesiones cutneas histolgicamente idntic
as pueden verse en la PAN sistmica; por lo tanto la PAN cutnea puede considerarse
un diagnstico de exclusin. Como regla, la PAN cutnea sigue un curso benigno, no pro
gresa a enfermedad sistmica y tiene un excelente pronstico a largo plazo (Langford
, 1995). La positividad del antigeno de superficie de la hepatitis B se ha encon
trado en hasta un 54% de los pacientes con PAN. Hay indicios que indican que la
hepatitis C tambin se asocia con PAN, aunque actualmente se conoce poco del espec
tro clnico de la enfermedad. La identificacin del intervalo entre la infeccin con h
epatitis B y el establecimiento de la PAN ha variado desde meses hasta aos, en pa
rte porque los pacientes tienen frecuentemente hepatitis B subclnica, sin diagnos
ticar, hasta que se diagnostica la hepatitis B asociada a PAN. Sin embargo, no s
e ha reseado ninguna asociacin entre la actividad inflamatoria en el hgado y la vas
culitis. Los pacientes con hepatitis B asociada a PAN tienen una mayor incidenci
a de pruebas de funcin heptica elevadas y aneurismas que aquellos con PAN no relac
ionada con hepatitis pero por otra parte son clnicamente similares. Desgraciadame

nte, la presencia de hepatitis B complica el tratamiento inmunosupresor, porque

la replicacin viral puede dar lugar a un riesgo aumentado de la enfermedad heptica
progresiva durante el tratamiento e incluso la hepatitis tulminante cuando cesa
la inmunosupresin. A pesar de estas cuestiones, la terapia corlicoidea es import
ante, ya que los pacientes con PAN asociada a hepatitis B no tratada tienen una
alta tasa de mortalidad. La terapia antiviral con intertern-a debera utilizarse en
todos los pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Guillevin, 1997). El interc
ambio de plasma puede ayudar a eliminar inmunocomplejos y mejorar el tratamiento
de algunos pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Langford, 1995: Guillevin,
1997).
Hallazgos clnicos de laboratorio
Los resultados de las pruebas clnicas de laboratorio, aunque no especficas diagnsti
camente, refleja la naturaleza sistmica inflamatoria de la PAN. Tpicamente, se enc
uentra una anemia normocrmica, leucocitosis neutroflica. hipoalbuminema. hipergamma
globulinemia y una VSG marcadamente elevada. La medida de la creatinina srica y e
l nitrgeno de urea en sangre (BUN) junto con un anlisis de onna para controlar la
proteinuria. hematuria y sedimento anormal son importantes para evaluar la funcin
renal normal. El ANA positivo o FR encontrado en el 1 0 % al 40% de estos pacie
ntes puede estar asociado con niveles disminuidos de componentes de complemento
C3 y C4. En todos los pacientes con PAN deberan obtenerse pruebas serolgicas para
el antigeno de superficie y anticuerpo de la hepatitis B (Langford. 1995; Conn.
1993). Con poca frecuencia se ve eosinofilia en sangre perifrica y, cuando est pre
sente en altos niveles, esto debera conducir a considerar un CSS (Fauci, 1998).
Diagnstico
La PAN puede ser difcil de diagnosticar, por su presentacin no especfica, el potenc
ial para la afectacin de diversos rganos de forma difusa, y la baja prevalencia. S
in embargo, una vez que se sospecha, el diagnstico de PAN se basa en la angiografa
y/o la demostracin histolgica de PAN en la biopsia tisular de la(s) zona(s) sinlo
mtica(s), como msculo, nervio, rion y testculos. Patolgicamente, la PAN es una arteri
ts necrotizante focal pero panmural de arterias musculares de pequeo y mediano tam
ao, que preferentemente se produce en los puntos de ramificacin de los vasos. La i
nflamacin necrotizante de clula mixta con necrosis fbrinoide, circunferencial o seg
mentaria en la pared del vaso, es la lesin que marca una PAN activa. La dilatacin
aneurismtica o microaneurismtica tambin son caractersticas de la fase aguda de la PA
N. El proceso inflamatorio se cura con librosis que puede conducir a una endarte
ritis proliferativa. Un rasgo caracterstico de la PAN es una mezcla de lesiones a
ctivas y/o lesiones en curacin adyacentes a segmentos normales de vasos sanguneos
(Langford, 1995). La angiografa puede ser especialmente valiosa para identificar
anormalidades Gl o cuando una posible biopsia de una zona sea inasequible. En pa
rticular, se debera considerar una angiografa antes de intentar una biopsia heptica
o renal cerrada con aguja en pacientes con sospecha de PAN, debido a la predile
ccin por aneurismas en estos lugares que aumenta el riesgo de sangrado grave (Lan
gford. 1995).
Sndrome de Churg-Strauss Epidemiologa
Se piensa que CSS es una condicin clnica rara; no hay datos epidemiolgicos amplios
disponibles (Conn, 1993). El CSS comienza tpicamente entre las edades de 15 y 69
aos, siendo los 38 aos la media de edad para el establecimiento de la vasculilis (
Langford. 1995).
Rasgos clnicos
El CSS. tambin llamada angetis alrgica y granulomatoss, es una vasculitis necrotizan
te sistmica caracterizada por una inflamacin granulomalosa vascular y extravascula
r, afectacin mltiple de rganos, y asociaciones con rinitis alrgica, asma grave e hip
ereosinofilia (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las manifestaciones clnicas de CSS p
ueden recordar a las de la PAN en muchos aspectos pero difieren en que la enferm
edad pulmonar es tpica y

Tratamiento y pronstico
Los pacientes con PAN se tratan con glucocorticoides. El objetivo del tratamient
o con glucocorticoides es el control de la enfermedad sin complicacio-

CAPTULO 44

VASCULITIS
995
la enfermedad renal es poco comn, generalmente menos grave en CSS que en PAN (Fau
c, 1998). El curso clnico de CSS a menudo se divide en tres lases distintas, aunqu
e en realidad, estas tres lases no siempre se identifican o pueden superponerse
(Langford, 1995): 1) una fase prodrmica caracterizada por enfermedad respiratoria
alrgica; 2) una fase eosinoflica caracterizada por hipereosmolilia en sangre peri
frica y tejido: y 3) una fase vascultica. La afectacin cardaca, bien carditis eosino
flica transmural o vasculitis coronaria, se produce en el 25% al 62% de los pacie
ntes con CSS y es la principal causa de muerte (Langford. 1995).
entre el establecimiento del asma y el establecimiento de la vasculitis se consi
dera un signo pronstico desfavorable.
Sndrome mixto de poliangetis
El sndrome mixto de poliangetis se produce en un grupo heterogneo de pacientes que.
por definicin, tienen una vasculitis sistmica necrotizante pero no manifiestan la
enfermedad de forma que se siten claramente dentro de una categora especfica de di
agnstico. Los pacientes con el sndrome mixto de poliangetis pueden tener los rasgos
combinados d e varias enfermedades vasculticas, signos patolgicos mezclados de mo
do similar, o sntomas atpicos que no encajan con una enfermedad/sndrome especifico
(Langford, 1995). El sndrome mixto de poliangetis tiene la capacidad de afectar a
mltiples sistemas de rganos. Aunque el pronstico para el sndrome mixto de poliangetis
no est establecido, existe la posibilidad de dao visceral serio y enfermedad pote
ncialmente mortal. Tanto desde el punto de vista diagnstico como teraputico, estos
pacientes deberan tratarse como s tuvieran un sndrome vascultico bien definido. Una
historia cuidadosa, u n a exploracin fsica y una evaluacin de laboratorio deberan p
ermitir definir el alcance de su afectacin sistmica. El diagnstico del sndrome mixto
de poliangetis debera demostrarse mediante biopsia o angiografa. Una vez que se ha
descubierto la presencia de una vasculitis sistmica necrotizante. y se han desca
rtardo otros diagnsticos, especficamente la infeccin, el tratamiento debera iniciars
e con corticoides y considerar el uso de agentes inmunosupresores adicionales, c
omo la ciclofoslamida (Langford, 1995).
Hallazgos clnicos de laboratorio
Un signo caracterstico del CSS es la notable eosinofilia en sangre perifonea, que
puede verse en cualquier fase de la enfermedad. El recuento de eosinfilos en san
gre perifrica alcanza los 1.000 eosinfilos por microlitro en el 80% o ms de los pac
ientes con CSS (Conn, 1993); sin embargo, la eosinofilia no puede encontrarse en
todos los pacientes debido a los previos tratamientos con esferoides para el as
ma o a la amplia y rpida fluctuacin que se puede producir en el recuento de eosinfi
los en esta enfermedad. La normalizacin del recuento de eosinfilos en respuesta al
tratamiento con esteroides es un rasgo de CSS. distinguindolo del sndrome hipereo
sinoflico en el cual la eosinofilia puede ser resistente a corticoides El grado d
e eosinofilia puede relacionarse con la actividad de la enfermedad vascultica en
algunos pacientes. Otros hallazgos de laboratorio en CSS son no especficos. La an
emia, leucocitosis y aumento de la VSG frecuentemente acompaan a la enfermedad va
scultica. Los niveles de IgE en suero pueden estar elevados. El FR en suero puede
ser identificado, pero el titulo es generalmente bajo. El complemento en suero
est descrito como normal (Conn. 1993). A diferencia de la PAN, no se ha descrito
ninguna asociacin entre CSS y hepatitis B (Langford, 1995).
Granuiomatosis de Wegener Epidemiologa
No existe una incidencia anual detallada disponible ni datos de prevalencia para

WG, pero se estima que WG es menos comn que PAN. La WG se produce en personas de
cualquier edad, raza o sexo, aunque se manifiesta predominantemente en caucasia
nos y tiene un cierto predominio en los varones (Conn, 1993). La edad media de c
omienzo son los 41 aos (Langford, 1995).
Diagnstico
Histricamente, el diagnstico de CSS se realiza exclusivamente con la demostracin hi
stolgica de la vasculitis eosinoflica necrotizante. infiltracin eosinoflica del teji
do, y granuloma extravascular. En la prctica, sin embargo, pocas muestras de biop
sia contienen todos estos hallazgos. Para aumentar la probabilidad de la identif
icacin y el diagnstico de CSS. se puede dar menos importancia a estos indicadores
clnicos e incluir rasgos clnicos. Un estudio ha recomendado los siguientes criteri
os: 1. Asma 2. Eosinofilia de sangre perifrica por encima de 1 , 5 x1 o clulas u7l
3. Vasculitis sislmica incluyendo dos o ms rganos extrapulmonares (Conn, 1993)
3
Rasgos clnicos
WG es un sndrome clnicopatolgico de naturaleza desconocida caracterizado patolgicame
nte por una inflamacin granulomatosa necrotizante d e los tractos respiratorios s
uperior e inferior, glomerulonefritis focal segmentaria, y una vasculitis necrot
izante que afecta predominantemenle a las arterias medianas y pequeas. La WG se m
anifiesta en las regiones de oido/narz/garganla con sinusitis, obstruccin nasal o
ulceracin, otitis media o prdida de audicin (Fauci. 1998: Lie. 1989). El cuarenta y
cinco por ciento de los pacientes con WG tienen afectacin pulmonar al principio,
y el 85% manifiestan una enfermedad pulmonar en algn momento durante el curso de
su enfermedad. Las manifestaciones habituales del pulmn incluyen infiltrados pul
monares, nodulos pulmonares, hemoptisis o pleuritis (Fauc, 1998). Aunque slo alred
edor del 18% de estos pacientes sufren inicialmente fallo renal, el 80% manifies
tan glomerulonefritis en algn momento en el curso de WG (Fauc. 1998). Otros signos
habituales de la enfermedad sistmica incluyen exantema cutneo, artralgias. liebre
, manileslaciones oculares y prdida de peso (Fauc. 1998: Lie. 1989). Aunque se han
descrito pacientes con WG limitado al tracto respiratorio sin afectacin renal ("
WG limitado"), por encima del 50% de los pacientes con esta enfermedad al inicio
desarrollan con el tiempo una enfermedad ms generalizada (Langford, 1995).
El diagnstico delinitivo todava requiere la demostracin de la vasculitis comprobada
con biopsia. Una biopsia abierta de pulmn frecuentemente no confirma todos los r
asgos histolgicos de CSS pero debe considerarse antes del establecimiento de la t
erapia, si se teme una posible infeccin. Cuando los sntomas clnicos as lo indican, l
as muestras de biopsia tiles se obtienen la mayora de msculo, nervio safeno, prstata
y rion. El diagnstico diferencial de CSS incluye PAN, WG y el sndrome hipereosinofl
ico (Langford. 1995).
Tratamiento y pronstico
Los corticoides son la base del tratamiento de CSS. La utilidad de la lerapia mm
unosupresora con azalioprina y ciclofosfamida no est bien estudiada (Langford. 19
95). El diagnstico precoz de CSS y corticoides ha llevado a estos pacientes a ten
er una tasa de supervivencia de cinco aos del 62%. La insuficiencia cardiaca cong
estiva y el infarto de miocardio causan el 48% de todas las muertes en CSS. La h
emorragia cerebral, fallo renal, perforacin o hemorragia Gl. estado asmtico e insu
ficiencia respiratoria tambin causan fallecimiento de los pacientes con CSS. Todo
s estos rasgos deberan llevar a considerar el uso de una terapia con un agente ci
totxico (ciclofosfamida) en combinacin con corticoides (Langlord. 1977). La poca d
uracn del intervalo
Hallazgos clnicos de laboratorio
Los hallazgos clnicos de laboratorio tpicos de WG incluyen leucocitosis moderada s
in eosinofilia acusada, anemia normocrmica leve y trombocitosis (Conn. 1993. Lang
ford, 1995). No se ha observado leucopenia en los pacientes no tratados y, asi,
esto ayuda a distinguir WG de otros trastornos. La presencia de c-ANCA apoya el

diagnstico. Los inmunocomplejos circulantes, determinados por enlaces Clq. se pue

den encontrar junto con niveles normales de complemento e hipergammaglobulinemia
: a menudo estn elevadas las cantidades de subclase IgA (Conn, 1993; Langford. 19
95). Los indicado-

996
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
res de afectacin glomerular incluyen hematuria microscpica o gruesa, proteinuria,
cilindros de hemates y/o creatinina srica elevada y BUN. Ms del 50% de estos pacien
tes son FR positivos, pero los ANA estn generalmente ausentes (Fauci, 1998; Langf
ord, 1995). Las pruebas serolgicas para autoanticuerpos anti-GBM son negativos. P
revio al tratamiento, el 80% de estos pacientes presentan una VSG elevada.
pulmones, donde clnicamente imita a la WG. Sin embargo, los hallazgos histolgicos
caractersticos incluyen la infiltracin marcada de vasos sanguneos ("angiocnlrica") y
la destruccin imitando a la vasculitis, pero la morfologa celular es ms sugerente
de linfoma o alteracin linfoproliferativa (Langford, 1995). No hay pruebas clnicas
de laboratorio especificas.
Diagnstico
Aunque los hallazgos clnicos y de laboratorio pueden ser sugerentes. el diagnstico
de WG debera hacerse solo con una biopsia probada, confirmacin histolgica o cuando
se h a comprobado la existencia de c-ANCA en el paciente con sinusitis, infiltr
ado pulmonar o nodulo y glomerulonelrilis (Langford, 1998). El tejido pulmonar o
btenido mediante biopsia abierta de pulmn olrece la mejor oportunidad para hacer
un diagnstico certero (Langford, 1995). La biopsia transbronquial no proporciona
el tejido adecuado para el diagnstico ms del 90% del tiempo. Aunque el tejido de c
abeza y cuello es directamente ms accesible, los rasgos patolgicos caractersticos s
e encuentran en menos del 23% de estas muestras de biopsas El tejido til desde el
punto de vista diagnstico de cabeza y cuello que mejor se obtiene, segn orden decr
eciente de frecuencia, es el de los senos paranasals, tejido nasal y regin subglti
ca. Los cambios glomerulares en el tejido de la biopsia renal, aunque sugerentes
de WG, son raramente diagnsticos (Langford, 1995). Aunque el espectro morfolgico
de WG es amplio, el marco de la lesin patolgica en WG es la vasculitis granulomato
sa y necrolizante. Los vasos afectados experimentan necrosis fibrmoide con infil
tracin precoz por leucocitos polimorfonucleares seguidos de clulas mononucleares.
El tejido pulmonar puede revelar cualquier combinacin de necrosis, vasculitis, e
inflamacin granulomatosa. aunque las muestras de biopsia no incluyen lodos estos
rasgos caractersticos. El hallazgo ms habitual en la biopsia renal es la glomerulo
nefritis necrotizante segmentaria presente en diversos grados en el 80% de las m
uestras. La vasculitis renal no relacionada con el glomrulo es poco comn y est pres
ente slo en el 8% de las biopsas. Muchas alteraciones pueden imitar la WG, incluye
ndo las enfermedades granulomatosas infecciosas o no infecciosas. CSS. sndrome de
Goodpasture, granuloma idioptico de media linea, granulomatosis Imfomatoide y ne
oplasias de las vas respiratorias altas o pulmones (Fauci, 1998). De estos, la in
feccin es una consideracin importante, ya que un diagnstico errneo puede tener fatal
es consecuencias cuando se trata de forma equivoca con terapia inmunosupresora (
Langford, 1995).
Prpura de Henoch-Schnlein Epidemiologa
La prpura de Henoch-Schnlein (HSP) se produce principalmente e n nios de edades com
prendidas entre los 4 y los 1 1 aos (Conn. 1993) pero tambin aleda a algunos adult
os. La HSP se presenta ms habitualmente e n primavera y generalmente sigue a una
infeccin de las vas respiratorias superiores (Conn. 1993). La HSP tiene un predomi
nio en los varones de 3:2 (Langford, 1995).
Rasgos clnicos
La HSP. llamada a veces prpura anafiladoide. es una vasculitis sistmica de pequeos
vasos clasificada como un subgrupo de la vasculitis de hipersensibilidad. No se

conoce la etiologa de HSP. Los hallazgos clnicos tpicos en HSP incluyen prpura palpa
ble no trombocitopnica, artralgias, lesin renal y anormalidades del tracto Gl (Lan
gford. 1995). El 70% de los pacientes con HSP manifiestan signos y sntomas gastro
intestinales incluyendo dolor abdominal espasmdico asociado con nauseas y vmitos,
sangre o moco en heces, hemorragia Gl potencialmente mortal, e invaginacin (Langf
ord. 1995). La enfermedad renal asociada se caracteriza por glomerulonefritis fo
cal proliferativa que tiene una expresin clnica variable que va desde la hematuria
aislada con cilindros de hemates, hasta insuficiencia renal aguda, y Iracaso ren
al crnico raro (Fauci. 1998; Langford, 1995; Lie, 1989).
Hallazgos clnicos de laboratorio
Los estudios clnicos de laboratorio en HSP son no especficos y resultan especialme
nte tiles para excluir otras alteraciones y buscar evidencia de afectacin renal. S
e pueden observar leucocitosis y VSG elevada. Las pruebas de CBC con recuento de
plaquetas y de coagulacin son importantes en la evaluacin de prpura cutnea; en HSP.
las prpuras no son de trombocitopenia. Deberan realizarse coprocultivos intermite
ntemente para buscar evidencia de prdidas de sangre oculta. Los niveles de comple
mento en suero generalmente son normales, aunque se ha descrito una asociacin ent
re HSP y la ausencia congenita del componente del complemento C2 (Conn, 1993). S
e deberan realizar anlisis de orina y medidas de creatinina en suero al comienzo d
e la enfermedad y dos veces a la semana hasta que los signos sislmicos hayan cesa
do (Langford, 1995).
Tratamiento y pronstico
Un rgimen de ciclofosfamda oral diaria y corticoides es la terapia de eleccin para
la WG. Utilizando este rgimen, el Instituto Nacional de la Salud public el logro d
e una marcada mejora o remisin parcial en el 91% de los pacientes, con remisin com
pleta en el 75%. Se observ una tasa de mortalidad global del 20%, el 13% de la cu
al podra atribuirse de forma completa o parcial a la WG. A pesar de esta marcada
mejora en la supervivencia y la remisin comparada con el 100% de mortalidad en lo
s pacientes no tratados, se observaron recidivas y morbilidad tanto de la enferm
edad como del tratamiento. La mitad de las remisiones completas fueron seguidas
de una o ms recidivas, que se produjeron entre tres meses y 16 aos despus de alcanz
arse la remisin (Langford. 1995) El metotrexato es una alternativa a la ciclofosf
amda en pacientes que no sufren de enfermedades en las que peligra la vida (Langf
ord, 1997). Durante el primer ao de WG. el alcance de la enfermedad renal es el f
actor ms estrechamente relacionado con el pronstico. Despus, la afectacin del pulmn s
e convierte en el indicador de pronstico ms importante, y la glomerulonefritis no
parece afectar significativamente al pronstico.
Diagnstico
La dificultad para diagnosticar HSP es rara, excepto cuando la afectacin de otros
lugares principales precede a la aparicin de prpura palpable. A diferencia de otr
as vasculitis necrolizantes, el diagnstico es clnico, con estudios de laboratorio
que se utilizan para excluir otras alteraciones. La biopsia renal, que demuestra
glomerulonefritis proliferativa, no es propiamente necesaria para el diagnstico,
aunque se utiliza para valorar la gravedad de la enfermedad y estimar el pronsli
co Las alteraciones que se han de considerar en el diagnstico diferencial de HSP
incluyen cualquiera que cause abdomen agudo, nefritis o prpura (Langford, 1995).
Tratamiento y pronstico Granulomatosis linfomatoide
La granulomatosis linfomatoide (GL) est considerada como una alteracin linfoprolif
erativa poco habitual que puede evolucionar a un linfoma maligno en aproximadame
nte el 50% de los pacientes. La GL afecta pnncipalmente a los El tratamiento de
HSP es de sostn y no existe un tratamiento especifico de beneficio probado para l
a nefritis de HSP. Aunque los glucocorticoides pueden ser tiles para disminuir el
edema, el dolor de articulaciones y el malestar abdominal, la terapia de manten
imiento c o n glucocorticoides no es beneficiosa, ya que no disminuye el nesgo d
e enfermedad recurrente o mejora el diagnstico renal (Langlord. 1995). Los analgsi
cos no sali-

CAPTULO 44

VASCULITIS
997
cilatos pueden suavizar el malestar de las articulaciones y tejidos blandos. La
terapia para adultos se parece a la de los nios, aunque la hipertensin en adultos
debe ser controlada cuidadosamente (Langford. 1995). El pronstico para esta enfer
medad generalmente autolimitada, que dura de 6 a 1 6 semanas, es bueno (Conn, 19
93). La tasa de mortalidad est alrededor del 1% al 3% (Langlord. 1995). y el Irac
aso renal es la causa principal de muerte (Langford, 1995). Aquellos que tienen
una presentacin nefrtica aguda, particularmente con sndrome nefrtico. tienen el peor
desenlace, con menos del 50% que recuperen la funcin renal y los anlisis de orina
normales en dos aos El porcentaje de glomerulos semilunares puede ser tambin un i
ndicador de pronstico til: sin embargo, es importante tomar conciencia de que el c
urso de HSP puede ser extremadamente variable. Los pacientes con anormalidades g
raves clnicas o histolgicas pueden recuperarse totalmente, y aquellos con cambios
benignos pueden evolucionar a insuficiencia renal. La enfermedad se repite en el
25% al 40% de los pacientes y consiste en su mayor parte en manifestaciones cutn
eas. El deterioro o la mejora puede ser ms notable durante los primeros dos o tre
s aos tras la resolucin del episodio agudo, aunque tambin se han observado cambios
significativos con ms posterioridad. Es extremadamente importante una revisin regu
lar con medidas de presin sangunea y anlisis de orina durante al menos los cinco pr
imeros aos siguientes a un episodio de HSP. (Langford, 1995).
cin de la vista que sigue a la ceguera secundaria a la arteritis GC. incluso con
una terapia de corticoides rpida a altas dosis.
Arteritis de Takayasu Epidemiologa
Como muchas de las alecciones vasculares idiopticas. la arteritis de Takayasu es
poco habitual, y la epidemiologa de esta enlermedad no se conoce exactamente. Est
a alteracin es ms prevalente en adolescentes y mujeres jvenes en edades comprendida
s entre los 10 y 30 aos; en realidad, entre el 80% y el 90% de los casos se produ
ce en mujeres. Aunque es ms comn en Japn, esta enlermedad no tiene limitaciones pro
badas raciales o geogrficas (Conn, 1993: Fauci, 1998).
Rasgos
clnicos
Arteritis de clulas gigantes (temporal) Epidemiologa
L a arteritis de clulas gigantes (GC) es una alteracin relativamente comn. Los estu
dios epidemiolgicos han demostrado una incidencia creciente con la edad. Un estud
io que inclua arteritis GC probadas con biopsia demostr una tasa de incidencia anu
al de 23,3 por 100.000 personas mayores de 50 aos (Conn. 1993). Casi todos los ca
sos de arteritis GC empiezan despus de la edad de 50 aos.
La arteritis de Takayasu es una vasculitis granulomalosa de las arterias elsticas
medias y grandes que causa estenosis vascular u oclusin; existe una fuerte predi
leccin por la arteria artica y sus grandes ramas, incluyendo las arterias pulmonar
es (Fauci, 1998; Langford. 1995). Esta enlermedad se llama a veces sndrome de la
arteria artica o arteritis granulomalosa idioptica. Los pacientes presentan sntomas
sistmicos agudos que incluyen fiebre, malestar, sudores nocturnos y prdida de pes
o. La isquemia en los rganos que reciben el aporte vascular a travs dellos vaso/s
afeclado/s causa seales y sntomas rgano-especficos. En la fase crnica obliterante, la
s pulsaciones de las arterias estn disminuidas o ausentes en las arterias implica
das (Langford, 1995), ms habitualmente en la arteria subclavia (Fauci. 1998). Son

habituales los soplos vasculares y la hipertensin (Langford. 1995). Otros hallaz

gos incluyen la regurgitacin artica, cardiomegalia secundaria a hipertensin artica o
pulmonar, e ictus (Fauci, 1998). La arteritis de Takayasu puede progresar lenta
mente, puede estabilizarse, o puede causar la muerte rpidamente (Fauci, 1998)
Hallazgos clnicos de laboratorio Rasgos clnicos
La arteritis GC es una entermedad sistmica caracterizada por una inflamacin vascul
ar granulomalosa que afecta a las arterias medianas y grandes. Aunque las arteri
as afectadas pueden estar en mltiples lugares, la arteritis GC clsicamente afecta
a la arteria temporal y/o otras ramas de la arteria cartida (Fauc. 1998) Las manif
estaciones clnicas incluyen fiebre, cefalea y claudicacin mandibular en pacientes
con ms de 50 aos La neuritis ptica isqumica puede provocar una ceguera repentina, pa
rticularmente en pacientes no tratados (Fauc, 1988). La arteritis GC est estrecham
ente asociada con la polimialgia reumtica, que se caracteriza por rigidez y dolor
cervical, de hombros, zona inferior de la espalda, caderas y muslos que es peor
por la maana y mejora con la actividad del da (Fauci, 1998). Los estudios de labo
ratorio de la arteritis de Takayasu definen una alteracin inflamatoria sistmica (L
angford. 1995). La VSG est elevada en el 75% al 100% de los pacientes, que tiende
a volver a la normalidad a lo largo del tiempo. Se cree que la VSG es un ndice f
iable de actividad inflamatoria y se ha utilizado como herramienta para monitori
zar la eficacia de la terapia. El poder de resolucin de la enlermedad. tanto sint
omtica como angiogrficamente. se ha visto que est correlacionado con la disminucin d
e la VSG. Los estudios hemalolgicos muestran con frecuencia una anemia normocrmica
de leve a moderada y/o leve leucocitosis. El FR y ANA son generalmente negativo
s. Puede haber hipergammaglobulinemia, hiperfibrinogenemia e hipoalbuminemia (Co
nn, 1993). Los inmunocomplejos circulantes pueden estar presentes en hasta un 50
% de estos pacientes pero no parecen relacionarse con la actividad de la enferme
dad.
Hallazgos clnicos de laboratorio
Los hallazgos clnicos de laboratorio incluyen una VSG elevada y anemia normocrmica
La fosfatasa alcalina en suero est habitualmente elevada. Se ha descrito una hip
ergammaglobulinemia, asi como niveles elevados de complemento e inmunocomplejos
(Fauci, 1998).
Diagnstico
La arteritis de Takayasu se diagnostica por los datos correlacionados de la hist
oria, la exploracin fsica y la angiografia. L a enfermedad debera considerarse como
una posibilidad diagnstica en cualquier mujer joven que carezca o tenga una frec
uencia de pulso perifrico marcadamente disminuida o que presente variaciones en l
a presin sangunea yo soplos arteriales (Fauci. 1998). Los hallazgos angiogrficos ca
ractersticos ayudan a confirmar el diagnstico clnico. La biopsia del tejido de diag
nstico para la confirmacin raramente se requiere o se hace (Fauci, 1998). La predi
leccin de este sndrome por mujeres jvenes es un rasgo importante que a veces lo sep
ara de otras consideraciones diagnsticas, particularmente de la arteritis GC (Lan
gford, 1995).
Diagnstico
El diagnstico se basa en la identificacin de las manifestaciones clnicas tpicas y un
a VSG alta en un paciente anciano que puede o no tener tambin sntomas de polialgia
reumtica (Fauci. 1998). El diagnstico se confirma por biopsia de la arteria tempo
ral.
Tratamiento y pronstico
La arteritis GC se trata con glucocorticoides. y la respuesta clnica a esta terap
ia es generalmente llamativa. El pronstico clnico es bueno, pues la mayora de los p
acientes consiguen y mantienen una remisin completa Iras la terapia corticoidea (
Fauci, 1998). Desgraciadamente, es rara la recuperaTratamiento y pronstico

En pacientes con entermedad activa, la terapia corticoidea es el tratamiento ini

cial de eleccin. Si la enlermedad activa persiste a pesar de los corticoi-

998
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGIA dificultad para obtener un diagnstico certero de esta

enfermedad, la biopsia es igual de importante para descartar otras posibles eti
ologas. Histolgicamente, existe una inflamacin segmentaria mixta con necrosis que a
fecta predominantemente a arterias craneales de pequeo y mediano tamao. La inflama
cin por granulomatosis puede estar presente. A menudo se detecta trombosis; las a
rterias extracraneales raramente se afectan (Langford, 1995; Rhodes, 1995). Por
eso, deben realizarse en todos los casos diagnsticos dilerenciales cuidadosos par
a decidir las pruebas apropiadas tanto para apoyar un diagnstico de PACNS como pa
ra descartar otros procesos. La combinacin de la resonancia magntica (RM) y LCR no
rmales tiene un fuerte valor predictivo negativo y excluye la consideracin de PAC
NS en la mayora de las situaciones clnicas (Calabrese, 1997).
des, se pueden administrar ciclofosfamida o metotrexato. Los vasodilatadores, an
ticoagulantes y antiinflamatorios no esteroideos se utilizan para el alivio sint
omtico. Puede ser necesana la intervencin quirrgica para la estenosis vascular sint
omtica o la oclusin (Langford. 1995). El curso clnico de la arteritis de Takayasu e
s variable. Aunque se produce la remisin espontnea, la mayora de los pacientes requ
ieren tratamiento. El pronstico parece estar relacionado con la presencia y grave
dad de las complicaciones. Las principales complicaciones incluyen la retinopati
a de Takayasu. hipertensin secundaria, insuficiencia de la vlvula artica y aneurism
a artico/arterial (Langford, 1995). La supervivencia desciende con el paso del ti
empo, a medida que aumenta el nmero y gravedad de estas complicaciones. Las muert
es relacionadas con la enfermedad generalmente se producen por complicaciones va
sculares, como insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio y
rotura de aneurisma (Langford, 1995).
Tratamiento y pronstico
El tratamiento intensivo est indicado para los pacientes donde se han descartado
otras alteraciones, el diagnstico de PACNS se mantiene, y hay evidencia de dificu
ltades neurolgicas progresivas (Calabrese, 1997). Se defiende la terapia combinad
a de corticoides y ciclofosfamida diarias; sin embargo, el pronstico de PACNS es
malo, con un 60% a un 70% de pacientes que fallecen por la enfermedad antes de u
n ao desde el diagnstico (Langford. 1995).
Angetis primaria del sistema nervioso central Epidemiologa
La angetis primaria del sistema nervioso central (PACNS) es una situacin rara dond
e la dificultad para hacer un diagnstico definitivo impide los estudios epidemiolg
icos. PACNS es ligeramente ms habitual en hombres que en mujeres (4:3) y comienza
a una edad media de 43 aos (Langford, 1995),
Enfermedad de Kawasaki Rasgos clnicos
Los pacientes con PACNS presentan cefaleas; dficit focales neurolgicos, y estado m
ental alterado, paraparesia. cuadriparesia. neuropatas craneales, ataques y ataxi
a (Calabrese, 1997; Fauci. 1998). Los sntomas iniciales estn ms generalizados y los
signos y sntomas focales generalmente se desarrollan ms tarde en el curso de la e
nfermedad (Langford. 1995). El quince por cenlo de los casos tienen afectacin de l
a mdula espinal (Calabrese. 1997). El curso puede ser progresivo rpidamente o crec
er y decaer durante un largo periodo de tiempo. Los sntomas sistmicos son raros. L
a enlermedad de Kawasaki o sndrome linfonodular mucocutneo es una forma de vasculi
tis que afela a arterias de pequeo y mediano calibre. L a enfermedad se produce tpi
camente en nios que presentan linfadenitis cervical y alteraciones en piel y muco
sas. La enfermedad de Kawasaki generalmente es autolimitada. pero la arteritis p
rovoca aneurismas coronarios en el 25% de los pacientes. La muerte se produce en
hasta un 3% de los pacientes, generalmente por vasculitis coronaria. Los autoan

ticuerpos de clulas anliendoteliales han sido determinados en pacientes con enfer

medad de Kawasaki (Fauci, 1995).
Hallazgos clnicos de laboratorio
Los estudios de laboratorio no son tiles para hacer un diagnstico de PACNS, pero j
uegan un importante papel en la exclusin de otras enfermedades. La VSG est elevada
en la mayora, pero no en todos, estos pacientes. Solamente se ha visto anemia en
el 17% de ellos, y otros parmetros hematolgicos son generalmente normales. El FR,
ANA y ANCA estn ausentes tpicamente. Sin embargo, el liquido cefalorraqudeo (LCR)
es generalmente anormal con hallazgos que incluyen presin de apertura aumentada,
protenas elevadas y pleocitosis linfoctica. Como el LCR puede ser completamente no
rmal, estas pruebas no siempre excluyen la posibilidad de vasculitis (Langford.
1995).
RESUMEN
El diagnstico de las afecciones vasculares sistmicas necrotizantes requiere un alt
o grado de sospecha y puede ser difcil debido al amplio nmero de consideraciones d
e diagnstico diferencial. No existen pruebas clnicas de laboratorio patognomnicas e
n pacientes con afecciones vasculares sistmicas necrotizantes. pero estas pruebas
son tiles para definir el alcance y los patrones de la afectacin del rgano. Los AN
CA y sus asociaciones con la vasculitis sistmica necrotizante. particularmente la
asociacin de c-ANCA con WG. se han convertido en una prueba serolgica importante
utilizada en la evaluacin de estos pacientes. Sin embargo, los mdicos y tcnicos d e
laboratorio que usan esta prueba deben entender a fondo las caractersticas opera
tivas, incluyendo limitaciones, de la misma cuando la realizan en su laboratorio
, La biopsia de tejido del lugar(es) sintomtico(s) con confirmacin histolgica de va
sculitis necrotizante contina siendo el procedimiento de laboratorio ms importante
para el diagnstico de las afecciones vasculares necrotizantes sistmicas.
Diagnstico
El diagnstico de PACNS contina siendo de exclusin. Los criterios diagnsticos propues
tos han incluido la disfuncin del SNC que no se explica por exploracin clnica, de l
aboratorio o neurologica: documentacin por angiograma y/o biopsia de una arteriti
s dentro del SNC; y ausencia de una vasculitis sistmica u otra condicin para la cu
al los rasgos angiogrficos o patolgicos podran ser secundarios. Debido a la inevita
ble dificultad en cuanto al ltimo criterio y el pobre poder discriminatorio de la
angiografa en cuanto a la enfermedad vascular inflamatoria frente a la no inflam
atoria (Calabrese, 1997), las biopsias de SNC estn infrautilizadas. El papel de l
a biopsia cerebral en el diagnstico de PACNS permanece en controversia, aunque al
gunos defienden que esta biopsia es esencial para hacer un diagnstico definitivo
(Calabrese, 1997). La exclusin de una biopsia cerebral como mtodo generalizado se
debe no slo a la naturaleza invasiva sino tambin por la incapacidad de demostrar l
a vasculitis histolgica debido a la naturaleza heterognea del proceso. El rendimie
nto de la biopsia puede aumentarse mediante la obtencin de muestras de vasos tant
o de parnquima como de la leptomeninge. Por la
BIBLIOGRAFA
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4 5
Enfermedades autoinmunes organoespecficas
David J. Bylund, M.D. Robert M. Nakamura, M.D.
MTODOS DE DETECCIN Microscopa de inmunofluorescencia indirecta PIEL Pnfigo Penfigoid
e Epidermlisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso Dermatitis herpe
tiforme Dermatosis IgA lineal Lupus eritematoso Vasculitis HGADO Autoanticuerpos
Enfermedades hepticas GLNDULA TIROIDES Enfermedades tiroideas Autoanticuerpos RION
Glomerulonefritis Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular
1000
GLNDULA SUPRARRENAL Enfermedad de Addison
1011
1001
PNCREAS Diabetes mellitus TRACTO GASTROINTESTINAL Anemia perniciosa Enteropatia s
ensible al gluten SISTEMA NERVIOSO Miastenia gravis Esclerosis mltiple
1011
1013
1013
1006
Neuropatas Autoanticuerpos contra protenas neuronales
1009
Autoanticuerpos contra ganglisidos neuronales OTROS RGANOS Corazn 1014
1010
Msculo RESUMEN BIBLIOGRAFA 1014 1014
Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse como sistmicas o enfermedades es
pecficas de rgano. En este capitulo se tratan la mayora de las enfermedades autoinm
unes organoespecficas enumeradas en la Tabla 45-1. La principal caracterstica clnic
a de estos trastornos autoinmunes es la inflamacin crnica, que generalmente se loc
aliza en un nico rgano especfico en cada enfermedad. Dentro de este grupo de enferm
edades autoinmunes, aparece con cierta Irecuencia un agrupamiento familiar. Los
autoanticuerpos ms relevantes pueden ser especficos de la especie o no serlo, pero
si exhiben especificidad por un antgeno presente en el tejido u rgano daado. En es
te capitulo tambin se incluyen algunas enfermedades con autoanticuerpos y lesione
s inflamatorias restringidas a uno o varios rganos, que combinan las caracterstica
s clnico-patolgicas de los dos tipos de trastornos, las enfermedades autoinmunes s
istmicas y las especficas de rgano. Como ejemplo de stas encontramos enfermedades au
toinmunes hepticas como la cirrosis biliar primaria (CBP) o la hepatitis autoinmu
ne (AiH). Si excluimos los autoanticuerpos antireceptores tiroideos, la implicac
in de los autoanticuerpos en la patognesis de las enfermedades autoinmunes especfic
as de rgano an no ha sido demostrada.
detectar la presencia de autoanticuerpos circulantes dirigidos contra rganos o te
jidos especficos. Sin embargo, gracias a la mejora de los aspectos tcnicos, los la
boratorios clnicos utilizan con mayor frecuencia los ensayos ELISA (anlisis de inm

unoabsorcin ligado a enzimas).

Microscopa de inmunofluorescencia indirecta
Este procedimiento es esencialmente el mismo para las distintas pruebas, excepto
por los suslratos utilizados como objetivo para los autoanticuerpos. El procedi
miento general es el siguiente: 1. Preparar diluciones para el cribado o dilucio
nes seriadas de los sueros de los pacientes, y de los controles apropiados con f
osfato salino tamponado (PBS). 2. Incubar en cmara hmeda durante 20 a 30 minutos l
as diluciones de los sueros de los pacienles y los controles sobre secciones de
tejido criopreservadas sobre portas de cristal multiporo. No permitir que se seq
uen los portas. 3. Sacar los portaobjetos de la cmara hmeda. Lavar brevemente y co
n cuidado cada portaobjetos, dos o tres veces, usando para ello PBS a temperatur
a ambiente. Despus lavar los portaobjetos en PBS durante 15 minutos, cambiando la
solucin de lavado una vez en este tiempo.
MTODOS DE DETECCIN
La microscopa de inmunofluorescencia indirecta (IFID), descrita brevemente ms adel
ante, es el mtodo que se utiliza con mayor Irecuencia para

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1001

Tabla 45-1 Enfermedades autoinmunes organoespecficas E n f e r m e d a d del r g

a n o Glndula tiroides Tiroiditis aulommune Autoanticuerpos Peroxidasa tiroidea T
iroglobulma Receptor de TSH Adrenocortical Protenas endoteliales paratiroideas Clu
las del islote Asociados a insulina Anti-decarboxilasa de c i d o glulmico PM -1.
Jo-1 Clulas parietales gstricas Factor intrnseco Clulas de conductos salivares Clula
s panetalos gstricas Colon; lipopolisacrido; asociado a p-ANCA Reticulina Transglu
tammasa tisular IgA de endomisio Gliadina Reticulina Msculo liso Microsomas heptic
os y renales ANA Mitocondrial ( M 2 ) p-ANCA AChR M t o d o / s de d e t e c c i
n ELISA. IFID sobre tiroides de mono no lijada IFID sobre tiroides de mono fija
da en metanol; hemaglutinacin pasiva, aglutinacin en ltex Ensayo de unin al radiorre
ceptor, bioensayo do cAMP IFID en corteza adrenal de mono o humana no fijada IFI
D sobre glndula paratiroides bovina no lijada IFID sobre pncreas humano no lijado,
grupo sanguneo O Radioinmunoprecipitacin ELISA. RA. inmunotransferencia ELISA; inm
unodifusin IFID en estmago/rin de ratn Ensayo de unin a vitamina B,. radiactiva IFID
n glndula salival humana no fijada IFID en sustrato de mucosa gstrica humana, de m
ono, de ratn o de rala IFID sobre colon humano o de rata, hemaglutinacin IFID en n
eutrfilos fijados en elanol IFID sobre rion de ratn ELISA IFID sobre e s f a g o de
mono ELISA IFID sobre n n de ratn IFID en estmago/rin de ratn IFID on oslmago/ri
ln; ELISA Clulas Hep -2 IFID en estmago/nn de ratn, ELISA IFID sobre neutrfilos fija
en elanol Inmunoprecipitaan de AChR conjugado con la-bungarotoxina (msculo esquelt
ico humano); ELISA
,26
Enfermedad de Graves Glndula suprarrenal Enfermedad de Addison Glandula parattroi
des Paratiroides Pncreas Diabetes mellitus dependiente de insulina Msculo Dermatom
iositis/polimiosilis Tracto gastrointestinal Gastritis atrfica Anemia perniciosa
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Enfermedad celiaca
Hgado Hepatitis autoinmunc
Cirrosis biliar primaria Colangitis esclerosante primaria Neurolgicas Miastenia g
ravis Enfermedades desmielinizantes (a saber, esclerosis mltiple)
Mielina; lubulina, proteina bsica de la mielina; FID sobre m d u l a espinal de m
amitero; ELISA; glucoproleina asociada a mielina inmunotransferencia Membrana ba
sal glomerular y pulmonar ELISA
Rones Enfermedad por anticuerpos anti-GBM Piel Pnfigo Penfigoide Dermatitis herpeti
forme Pnfigo paraneoplsico IgA BMZ Dermatosis lineal por IgA IgA ICS Pnligo por IgA
Espacios intercelulares (desmogleinas) BMZ (protenas de hemidesmosomas) Transglu
taminasa tisular IgA de endomisio ICS y BMZ
IFD sobre muestra de biopsia de piel. IFID sobre e s f a g o de mono o cobaya IF
D sobre biopsia de piel; IFID sobre esfago de mono ELISA IFID sobre e s l a g o d
e mono IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre epitelio de ve|iga de rata IFD sobr
e biopsia de piel humana. IFID sobre esfago de mono IFD sobre biopsia de piel hum
ana; IFID sobre esfago de mono
AChR = receptor de acetilcolina; BMZ = zona de memprana basal; IFD = microscopa d
e inmunofluorescencia directa; ELISA ensayo de inmunoabsorcin ligado a onzima; IC
S = espacios intercelulares IFID - microscopa de Inmunofluorescencia indirecta; p

-ANCA anticuerpos perinucleares anticiloplasma de neutrfilos; RA = radioinmunoensa

yo. TSH = hormona estimulante de litoides
4. Ir sacando cada portaobjetos por separado del bao de PBS. s e c a r el e x c e
s o de lquido de c a d a portaobjetos, y colocarlos de nuevo en la cmara hmeda. Di
spensar en c a d a pocilio la dilucin de conjugado m a r cado con fluorescena. I n
c u b a r los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos. No permit
ir q u e se sequen los portaobjetos. 5. Lavar los portaobjetos con PBS y azul de
Evans como colorante de contraste durante 10 minutos. 6. Montar los cubreobjeto
s. 7. Observar los portaobjetos al microscopio de fluorescencia. 8. Almacenar lo
s portaobjetos en la oscuridad a 4C.
PIEL
La deteccin de autoanticuerpos es muy til en el estudio de las enfermedades cutneas
ampollosas. En pacientes con enfermedades autoinmunes de la piel, los autoantic
uerpos incluyen aquellos dirigidos contra la zona de membrana basal (BMZ), los e
spacios intercelulares (ICS) o los vasos sanguneos drmicos, c o m o se recoge en l
a Tabla 45-2. Se encuentran disponibles algunas revisiones tcnicas excelentes que
detallan el uso de la inmunofluorescencia para el examen de la piel (Flotte, 19
95; Crosby, 1993).

1002
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 45-2 Enfermedades autoinmunes de la piel H a l l a z g o s inmunolgicos ese
nciales para el diagnstico Espacios intercelulares epidrmicos Pntigo Pnligo paraneop
lsico Zona de membrana basal Penligoide Penligoide gostacional Epidermlisis ampoll
osa adquirida Dermatosis lineal por IgA Dermatosis ampolloso crnica de la inlanci
a Papilas drmicas zona de membrana basal Dermatitis herpetilorme Hallazgos inmuno
lgicos tiles para el diagnstico Manifestaciones cutneas en enfermedades reumticas sis
tmicas Dermatomiositis/polirniosilis Lupus eritematoso Enfermedad mixta del tejid
o conjuntivo Policondritis recurrente Sindrome de Sjogren Esclerosis sistmica Vas
culitis
txica, lupus eritematoso sistmico (LES), miastenia grave (MG), penligoide y liquen
plano. Raramente se observan en individuos sanos (<1%) (Becker. 1993; Mutasim.
1993; Nousari, 1997).
Pnfigo
foliceo
Los subgrupos de pnligo foliceo incluyen el PF idioptico, PF endmico (fogo selvagem)
, PF inducido por frmacos y pnfigo eritematoso (PE). El principal antgeno en el PF
es la desmogleina 1 (Lin. 1998: Naparstek, 1993). IFD. Para todas las formas de
PF excepto para PE, el patrn de IFD e s similar al de PV. En algunos casos, el ma
reaje predomina en la epidermis superficial, a nivel de la capa granulosa. En PE
, hay un depsito lineal de IgG en ICS epidrmicos combinado con inmunorreactivos gr
anulares a lo largo de BMZ. IFID. La IFID debe detectar autoanticuerpos IgG ICS
en prcticamente el 100% de los pacientes de PF con enfermedad activa (Nousari, 19
97). Casi el 90% de los pacientes con PF tienen autoanticuerpos detectables cuan
do se utiliza esfago de mono para los estudios indirectos. El esfago de cobaya es
algo ms sensible ya que detecta el 10% restante de los pacientes y los ttulos indi
rectos tienden a ser mayores que los obtenidos cuando se utiliza esfago de mono (
Jiao. 1997).

Pnfigo Pnfigo
El pnfigo se refiere a un grupo de enfermedades que se caracterizan clnicamente po
r ampollas e histolgicamente por acantlisis. Existen tres subtipos principales de
pnfigo: pnfigo vulgar, pnfigo foliceo y pnfigo paraneoplsico (Nousari, 1999). Cada un
de estos subtipos se caracteriza por la existencia de autoanticuerpos contra la
s molculas de adhesin de los desmosomas. Para maximizar la sensibilidad diagnstica
de las evaluaciones iniciales, se utilizan tanto la IFID para detectar autoantic
uerpos circulantes como la microscopa de inmunofluorescencia directa, que resulta
ms informativa.
paraneoplsico
El pnfigo paraneoplsico (PNP), una enfermedad poco comn caracterizada por la presen
cia de ampollas dolorosas o erosiones de las membranas mucosas y piel, es una af
eccin de pacientes con neoplasias. Estas ampollas o lesiones aparecen en la boca,
pero tambin se han descrito en mucosas de otros lugares. Las neoplasias malignas
que se han asociado con PNP incluyen linfoma maligno, leucemia linfocitica crnic
a, limoma, carcinoma broncognico de clulas espinosas y sarcomas. PNP es relacionad
o con neoplasias benignas rara vez (Mutasim, 1993; Flotte, 1995; Camisa, 1993).

Pnfigo vulgar
El pnfigo vulgar es una enfermedad poco comn que aparece en todos los grupos racia
les y tnicos, aunque la incidencia es ligeramente superior en la poblacin juda. La
enfermedad afecta a ambos sexos y ocurre ms comnmente en individuos de entre 40 y
60 aos (Becker. 1993). La desmoglema 3 es el principal antgeno en el PV (Lin, 1998
; Naparstek. 1993). IFD. La I F D de piel perilesional muestra inmunofluorescenc
ia lineal/granular de inmunoglobulina G (IgG) y C3 en ICS sin depsitos en BMZ (Fi
g. 45-1). Este patrn se describe a menudo como en forma de "alambrada", que produ
ce el mareaje preferentemente de la mitad inferior de la epidermis. La IgG, espe
cialmente lgG4, est presente en cerca del 100% de los pacientes mientras que C3 e
st presente entre el 50% y el 100% de los pacientes, generalmente en reas acantolti
cas (Becker, 1993: Flotte, 1995, Lin, 1998). Se observan I g A o IgM inmunorreac
tivas en el 30% y el 50% de los pacientes (Izuno. 1986). Se muestra inmunofluore
scencia debida a C3 exclusivamente, sin IgG. en el pnfigo inducido por frmacos y e
n el imptigo (Nousari, 1997). IFID. L a IFID debe detectar autoanticuerpos IgG co
ntra la superficie de clulas epiteliales de la capa espinosa en el 100% de los pa
cientes con enfermedad activa (Nousari,1997). Se considera al esfago de mono como
el mejor sustrato tisular. La presencia de autoanticuerpos de PV es anormal a c
ualquier titulo. El ttulo se suele correlacionar con la actividad de la enfermeda
d, y ttulos que van en aumento pueden ser predictivos de una recada (Becker, 1993;
Crosby, 1993). Sin embargo, existen excepciones a esta correlacin, por lo que lo
s exmenes seriados de ttulos de IgG para monitorizar estos pacientes se deben corr
elacionar cuidadosamente con los hallazgos clnicos. Los pacientes que slo muestran
lesiones de la mucosa oral pueden no tener autoanticuerpos de PV circulantes de
tectables. En estos pacientes, el diagnstico se realiza utilizando IFD (Izuno, 19
86). Se detectan bajos ttulos de autoanticuerpos con las caractersticas de ICS de
forma poco frecuente en diversas condiciones como son las quemaduras de piel, al
ergia a penicilinas u oros lrmacos, necrlisis epidrmica
Figura 45-1. Inmunofluorescencia directa d e lesin de piel en el pnfigo q u e mues
tra depsitos lineales/granulares de IgG sobre las superficies celulares de los qu
eratinocitos (espacios intercelulares), sin fluorescencia en la zona de la m e m
brana basal (x 400).

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1003
Mutasim (1993) propuso los siguientes criterios para definir PNP: Erosiones muco
sas dolorosas y erupciones polimorfas de la piel, con lesiones papulosas que pro
gresan a ampollas y lesiones erosivas que afectan al tronco, las extremidades, l
as palmas de las manos y las plantas de los pies, asociadas con una neoplasia oc
ulta o clnicamente conocida. Acantlisis suprabasilar, necrosis de queratinocitos y
cambios en la mterfase vacuolar de secciones de tejido microscpicas y ligeras. I
gG contra ICS combinado con depsito lineal / granular de complemento e IgG a lo l
argo de BMZ. Autoanticuerpos circulantes contra ICS que se unen a epitelio vesic
al de roedor y esfago de mono o cobaya. Inmunoprecipitacin de un complejo de cuatr
o protenas queratinociticas unidas por los autoanticuerpos: esta es una herramien
ta de investigacin principalmente, pero puede ofrecer informacin clnica til en casos
difciles. PNP asociado a neoplasias malignas seala un pronstico extremadamente mal
o. Aunque se ha descrito la mejora clnica o la remisin de las lesiones mucocutneas
tras la reseccin del tumor, el tratamiento de PNP asociado a malignidad es de sop
orte. PNP asociado a una neoplasia benigna remiti tras la reseccin del tumor (Muta
sim, 1993). IFD. La IFD de piel perilesional o de mucosa de pacientes con PNP de
tecta IgG contra ICS mmunorreactivo con o sin componentes del complemento. Tambin
estn presentes depsitos granulares o menos frecuentemente lineales de componentes
del complemento (C3, C1q) en BMZ. adems de la inmunofluorescencia de IgG contra
ICS (Mutasim, 1993). IFID. La IFID con esfago de mono o epitelio vesical de roedo
r pone de manifiesto una IgG inmunorreactiva tanto en ICS como a lo largo de BMZ
. La unin a epitelio vesical de roedor (rata o ratn) es un hallazgo diferencial im
portante que diferencia PNP de otros tipos de pnfigo (LIU, 1993: Mutasim, 1993).
mi
Figura 45-2. Inmunofluorescencia directa de lesin de piel en el penligoide q u e
mueslra depsito intenso lineal de IgG a lo largo de la zona de m e m b r a n a ba
sal (x 400). Se puede identificar un patrn lineal epidrmico en BMZ en trastornos c
lnicos dispares, incluyendo el penfigoide de la membrana mucosa benigno, epidermli
sis ampollosa adquirida (EBA). penfigoide gestacional (herpes gestationis) y lup
us eritematoso ampolloso (BLE). Para ayudar a diferenciar estos trastornos, son t
iles las biopsias directas de piel separada en solucin salina (Domloge-Hultsch, 1
991). En BP y penfigoide gestacional, se localizan depsitos de IgG lineal en el l
ado epidrmico o techo de la separacin. Sin embargo, se puede observar inmunofluore
scencia lineal de C3 a lo largo del lado epidrmico y drmico de la separacin. En EBA
y BLE, se observan inmunorreactantes en el lado drmico de la separacin (Nousari,
1997). La correlacin clnica se convierte entonces en un factor importante en la re
solucin de las alternativas diagnsticas. IFID. La BP se caracteriza serolgicamente
por la presencia de autoanticuerpos circulantes contra BMZ. tanto cutnea como de
la m u c o s a oral. L a IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG contra B M
Z en cerca del 5 0 % de los pacientes con penfigoide. pero la sensibilidad aume
nta hasta el 7 0 % y 80% si se utiliza como sustrato piel separada en solucin sal
ina (Nousari, 1997; Domloge-Hultsch. 1991: Izuno, 1986). En el BP los autoanticu
erpos solo se unen al techo de la piel separada en el 80% de los pacientes. En E
B A y BLE. los autoanticuerpos se unen a la base, o suelo drmico, de la separacin
en el 50% de los pacientes (Korman. 1993; Crosby. 1993: Domloge-Hultsch. 1991).
Pnfigo IgA (Dermatosis intercelular IgA)
IFD. La dermatosis intercelular por IgA es una enfermedad vesculo-ampollosa inlra
epidrmica poco frecuente. Los estudios directos muestran una inmunofluorescencia
lineal en ICS que es suprabasilar. y particularmente acentuada en la epidermis s
uperior. IFID. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes I g A anti-ICS (Flott

e. 1995: Teraki, 1991).

Penfigoide Penfigoide ampolloso
El penfigoide ampolloso es una enfermedad ampollosa subepidrmica de causa descono
cida que aparece en pacientes de cualquier edad, pero que principalmente afecta
a adultos mayores de 60 aos. Esta enfermedad involucra de forma tpica las superfic
ies flexoras de brazos, piernas, ingles, axilas y abdomen inferior. Las membrana
s mucosas orales tambin pueden afectarse, pero estas lesiones raramente son el si
gno de presentacin predominante, un punto que diferencia el penfigoide del PV. Lo
s principales anlgenos en BP son dos protenas hemidesmosmicas de queratinocitos, un
a protena ntracelular de 230 kDa (antgeno penfigoide ampolloso 1) y una protena tran
smembrana de 180 kDa (antgeno penfigoide ampolloso 2) (Nousari, 1997; Lin, 1998).
IFD. La IFD sobre piel perilesional libre de ampollas del borde de una ampolla
fresca es sensible para el diagnstico y demuestra de forma tpica inmunofluorescenc
ia lineal en B M Z en cerca del 100% de los pacientes (Fig. 45-2). Los inmunorre
activos predominantes son C3 e IgG o C3 exclusivamente. Tambin I g A o IgM pueden
estar presentes en casi un 25% de los pacientes, generalmente en menor intensid
ad y en combinacin con IgG (Korman, 1993; Crosby, 1993; Izuno, 1986).
Penfigoide benigno de membranas mucosas
El penfigoide benigno de membranas mucosas (BMMP) o penfigoide cicatrizal afecta
de forma constante a las mucosas orales y oculares. Otras mucosas afectadas por
estas lesiones pueden ser la nasofaringe, laringe, genitales, recto y esfago (Mu
tasim, 1993). La curacin de la lesin est seguida de su cicatrizacin, y la ceguera es
la complicacin ms temida. IFD. El patrn de IFD es similar al que se observa en BP.
La sensibilidad es del 90% pero aumenta si se realizan biopsias adicionales. El
penfigoide cicatrizal localizado crnico, tambin conocido como penfigoide cicatriz
al de Brunstmg-Perry. es una variante del BMMP que se localiza en las regiones d
e la cabeza y cuello (Sarret. 1991). En esta variante, la IFD demuestra la prese
ncia de IgG exclusivamente, a lo largo de BMZ, sin I g A o IgM; los autoanticuer
pos circulantes contra BMZ son poco frecuentes (Izuno, 1986).

1004
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
IFID. L a IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG en menos del 33% de los p
acientes con BMMP cuando se utiliza exclusivamente mucosa oral como sustrato per
o slo en el 5% a 15% de los pacientes si se utilizan sustratos estndar (Crosby, 19
93; Sarret. 1991; Nousan, 1997). El estudio de piel humana separada en solucin sa
lina puede revelar IgA, IgG o ambos depsitos en cerca del 80% de estos pacientes
(Sarret. 1991). No existe correlacin entre la presencia y ttulo de autoanticuerpos
y la actividad de la enfermedad.
Penfigoide gestacional
Aunque es poco frecuente, la enfermedad ampollosa subepidrmica penfigoide gestaci
onal (GP) (herpes gestationis) se desarrolla durante el embarazo o poco tiempo d
espus (Izuno, 1986). Las lesiones son de forma tipica pruriginosas y se localizan
predominantemente en el abdomen o extremidades. IFD. Con IFD tan slo se pueden e
ncontrar tpicamente depsitos lineales de C3 en BMZ. Se detectan depsitos de IgG aso
ciados en el 30% al 40% de los casos, pero son raros los de IgA o IgM (Izuno, 19
86). IFID. Los depsitos de C3 slo pueden ser visualizados a lo largo de BMZ, pero
los ttulos de autoanticuerpos suelen ser demasiado bajos para ser observados util
izando sustratos estndar de IFID. Sin embargo se puede detectar el complemento ut
ilizando inmunofijacin de complemento si se utiliza como sustrato piel humana nor
mal separada en solucin salina (Izuno, 1986; Nousari. 1997).
Figura 45-3. Inmunofluorescencia directa oe lesin de piel en dermatitis herpetifo
rme mostrando deposicin granular de IgA predominantemente en las cspides de las pa
pilas drmicas (x 400).
patrn caracterstico de inmunofluorescencia en la mucosa muscular subepitelial de e
sfago de mono (Peters. 1989).
Dermatosis IgA lineal
L a dermatosis IgA lineal es un cuadro subepidrmco ampolloso poco comn considerado
como una entidad clnica distinta en vez de ser u n a variante de DH como se pensa
ba (Izuno. 1986; Crosby. 1993). La mayora de los casos son idiopticos. pero alguno
s se asocian con frmacos (Nousari, 1999.1995; Kuechle. 1994). La dermatosis crnica
ampollosa infantil es similar a la dermatosis IgA lineal, tanto clnicamente como
inmunopatolgicamente (Elenitsas, 1995). IFD. En casi el 100% de los casos, la IF
D demuestra depsitos lineales intensos de IgA a lo largo de BMZ pero ninguno en l
as papilas drmicas (Izuno. 1986). Aunque casos ocasionales pueden mostrar de form
a concomitante un mareaje dbil de C3 en BMZ, otros inmunorreactivos distintos de
IgA no suelen estar presentes. IFID. Se pueden detectar autoanticuerpos circulan
tes IgA contra BMZ c o n la IFID en cerca del 10% al 30% de los casos (Flotte, 1
995; Crosby, 1993).
Epidermlisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso
EBA y BLE son enfermedades ampollosas subepidrmicas adquiridas caracterizadas por
la presencia de autoanticuerpos contra la protena de colgeno lipo VII en BMZ (Gam
mon, 1993). E B A puede aparecer a cualquier edad, pero se presenta ms comnmente e
n adultos de entre 40 y 50 aos. Todos estos pacientes estn afectados por una combi
nacin de vesculas, erosiones, cicatrices, milia y despigmentacin de la piel, locali
zadas ms a menudo en superficies extensoras de piel susceptibles de traumatismo c
omo las rodillas, codos, o el dorso de manos y pies (Gammon. 1993) BLE ocurre en
pacientes con lupus eritematoso. IFD. Utilizando IFD, se observan inmunorreacti
vos lineares en BMZ en los pacientes con E B A y BLE, que suelen estar formados

por IgG y C3. Utilizando biopsias directas de tejido de piel separada por solucin
salina, los inmunorreactivos se localizan en el lado drmico, o suelo, de la vescu
la inducida. IFID. Solo el 40% de los pacientes con EBA tienen autoanticuerpos d
emostrables cuando se utiliza piel humana sin tratamiento salino como sustrato.
Utilizando la tcnica indirecta de piel separada en solucin salina, se pueden ident
ificar autoanticuerpos circulantes en cerca del 50% al 85% de los pacientes (Fin
e. 1994; Nousari. 1997).
Lupus eritematoso
El lupus eritematoso es una enfermedad caracterizada serolgicamente por la presen
cia de autoanticuerpos mltiples incluyendo anticuerpos antmucleares, anti-ADN nat
ivo, antihistonas y anti-Sm. IFD. Con la IFD, se observan depsitos caractersticos
gruesos, granulares y continuos de inmunoglobulinas y complemento a largo de la
B M Z epidrmica en el 50% al 95% de los pacientes con LES (Izuno, 1986). Los depsi
tos en B M Z del complejo de ataque a la membrana, C5b-9. en piel de la lesin pue
den ser marcadores de LES (Helm. 1993). A pesar de que estos pacientes tienen co
mnmente depsitos de IgG, IgM y componentes del complemento (C3 o C1q) (Fig. 45-4),
se pueden identificar inmunoglobulinas de todas las clases (Izuno, 1986). Cuand
o la piel no lesionada contiene al mismo tiempo inmunoglobulinas IgG, IgA o IgM
en el patrn tpico, es ms probable que el diagnstico sea LES (Izuno, 1986). Aunque es
caracterstico, este patrn de reaccin se puede observar en otras enfermedades como
la enfermedad mixta del tejido conjuntivo, oermatomiositis. reaccin de injerto co
ntra husped, erupcin por frmacos y vasculitis (Izuno. 1986). Por tanto es obligator
io correlacionar los resultados directos tanto c o n la presentacin clnica c o m o
con los resultados del estudio de una biopsia de piel por microscopia ptica. Est
a informacin es despus interpretada en el c o n t e x t o de los hallazgos directo
s individuales para clasificar el tipo clnico de LE. N u m e rosas publicaciones
citan la IFD con la finalidad del diagnstico de LES a partir de piel obtenida por
biopsia, con o sin lesiones, y de lugares expuestos o no expuestos al sol. En p
acientes diagnosticados con LES. la piel normal expuesta
Dermatitis herpetiforme
L a dermatitis herpetiforme es una enfermedad ampollosa subepidrmica pruriginosa
asociada a enteropatia sensible al gluten. DH tambin est asociada al tipo de histo
compatibilidad HLA-B8. DR3 (Crosby. 1993). IFD. La biopsia directa debe ser de l
a piel perilesional porque una biopsia de la piel lesionada podria resultar nega
tiva. La IFD delecta IgA granular en la cspide de las papilas en aproximadamente
el 80% al 100% de los pacientes con DH (Flotte, 1995) (Fig. 45-3). Puede haber d
epsitos de IgA a lo largo de BMZ de forma concomitante. Se encuentran con frecuen
cia depsitos de C3 con IgA, pero IgG o IgM se detectan poco frecuentemente (Izuno
. 1986). IFID. Los pacientes con DH no tienen autoanticuerpos contra BMZ detecta
bas. Sin embargo, se detectan autoanticuerpos IgA contra endomisio en el 80% de
los pacientes con DH. Estos autoanticuerpos son identificados por su

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1005
al sol se confirma c o m o positiva en cerca del 70% de los casos, mientras que
la piel normal no expuesta al sol es positiva en cerca del 40% de los pacientes
(Izuno, 1986). Sin embargo, el potencial para predecir la actividad de la enferm
edad o la afectacin renal de esta forma sigue resultando controvertida (Izuno, 19
86). Tal vez la aplicacin clnica ms prctica de las pruebas de laboratorio es el diag
nstico diferencial de LES del LE discoide (LED). Casi el 95% de los individuos co
n LED tienen depsitos en BMZ gruesos, granulares y continuos similares a los de L
ES (Izuno. 1986). Sin embargo, los hallazgos positivos con IFD en LED estn confin
ados a la piel lesionada, mientras que la IFD con piel con o sin lesin puede dar
hallazgos positivos en el LES (Izuno. 1986). El lupus eritematoso cutneo subagudo
(LECS) est caracterizado clnicamente por artritis, manifestaciones sistmicas leves
y autoanticuerpos antiSS-A/Ro. La IFD de biopsias de piel de estos pacientes de
tecta depsitos de inmunoglobulina o complemento en tan slo el 50% de las biopsias
de piel lesionada y en el 30% de biopsias de piel no implicada (Izuno. 1986). La
IFID es positiva en el 50% al 70% de los pacientes con LECS. Otras enfermedades
autoinmunes sistmicas importantes no ofrecen hallazgos especficos para el diagnsti
co ni por IFD ni por IFID. Aunque algunos pacientes tienen depsitos granulares de
IgM a lo largo de BMZ, se considera este hallazgo inmunopatolgico un marcador co
mpletamente inespecfico que puede ser detectado no slo en enfermedades autoinmunes, sino tambin en un
gran nmero de dermatitis o en la piel expuesta al sol de individuos clnicamente n
ormales (Izuno. 1986).
Vasculitis
Las vasculitis de la piel tienen varios sinnimos, incluyendo vasculitis leucocito
clstica, vasculitis alrgica y angeitis I vasculitis por hipersensibilidad. Histolgi
camente, los pequeos vasos sanguneos de la dermis muestran clulas endoleliales con
tumefaccin, exocitosis neutrofilica. detritus nucleares ("leucocitoclasis") y tro
mbos conjuntamente con eritrocitos extravasados. IFD. La siopsia de tales lesion
es dentro de las 24 horas de su comienzo, puede exhibir depsitos de IgM. C3. fibr
ingeno y algunas veces IgG (Fig. 45-5). Un resultado negativo no excluye la vascu
litis. La biopsia de una piel de ms de 24 horas podra no ser til puesto que el nico
hallazgo podra ser el marcaje no especifico del fibringeno. La confirmacin histolgic
a del diagnstico se hace por tanto esencial. La prpura de Henoch-Schnlem se diagnos
tica cuando se observa inmunofluorescencia vascular granular I g A con o sin C3
dentro del marco clnico apropiado.
Figura 45-4. Inmunolluorescencia directa de piel en lupus eritematoso que muestr
a inmunorreactivos I g G (A), C1q (B) e IgM (C) granulares, bastante continuos a
lo largo de la zona de la m e m b r a n a basal (x 400).

1006
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
tes con PBC, pero se observan en pacientes con infeccin por virus EpstenBarr, infe
ccin por citomegalovrus y otros trastornos infecciosos. Los NOMA estn dirigidos con
tra eptopos de los antgenos M2 y M9 en la PBC. pero no contra los mismos antgenos q
ue los AMA (Bylund. 1992). Aunque la trascendencia de los NOMA no est aclarada, s
u presencia en personas asociadas con pacientes de PBC ha generado preguntas sob
re la posible existencia de agentes contagiosos en los sueros de eslos pacientes
(Bylund, 1992).
Autoanticuerpos
antimsculo
liso
Los anticuerpos antimsculo liso (SMA) se encuentran en aproximadamente un 50% de
los pacientes con AiH clsica y suelen aparecer junto con ANA (Nakamura. 1991). Cu
ando se acompaan de un trastorno heptico, los SMA estn dirigidos contra actina F, q
ue forma parte del citoesquelelo Figura 45-5. I n m u n o f l u o r e s c e n c
i ad i r e c t a de piel en vasculitis cutnea de pequeos de la clula heptica en asoc
iacin directa con la membrana plasmtica de v a s o sq u em u e s t r ai n m u n o
f l u o r e s c e n c i a vascular de los vasos del p l e x o capilar super- las
clulas hepticas (Nakamura, 1991). Es tpico que el ttulo de SMA sea ficial. E s t a
biopsia es de un p a c i e n t e con prpura de Henoch-Schlnem y d e m u e s t r a
superior o igual a 1:80 en el suero de pacientes con AiH. Sin embargo, se el i n
m u n o m a r c a j ev a s c u l a r por IgA caracterstico de e s t a enfermedad
(x 400). pueden detectar ttulos bajos de SMA en pacientes con otros trastornos y
en individuos que aparentemente estn sanos (Nakamura, 1991).
HGADO Autoanticuerpos Autoanticuerpos antinucleares
Los autoanticuerpos antinucleares (ANA) se detectan ms frecuentemente por IFID, a
unque la identificacin de autoanticuerpos especficos por ELISA se est haciendo ms po
pular en los laboratorios clnicos. Los ANA son un grupo m u y heterogneo, y casi t
odos los subtipos que aparecen en los trastornos reumatolgicos se pueden encontra
r en personas con AiH. Los patrones tanto homogneos como moteados en clulas Hep-2
se pueden identificar ms frecuentemente en pacientes con AiH. Tambin se han descri
to autoanticuerpos especficos contra el ADN de doble cadena en enfermedades heptic
as (Manns, 1992). Se detectan ttulos de ANA superiores a 1:80 en casi el 80% de l
os pacientes con AiH (Nakamura. 1991). Sin embargo, tambin pueden encontrarse ANA
en el 60% de pacientes con PBC, 50% de pacientes con trastomos hepticos relacion
ados con el alcohol, en el 40% de pacientes con hepatitis viral tipo B y en el 2
5% de pacientes con AiH que tambin tienen autoanticuerpos antimicrosomales renale
s y hepticos (LKMA) (Nakamura, 1991). Se pueden identificar autoanticuerpos antic
entrmero en el 10% a 15% de los pacientes con PBC.
Se utiliza con frecuencia la IFID sobre sustrato de tejido estomacal de roedor p
ara detectar SMA, de manera que se tie la capa muscularis propria del estmago con
un patrn uniforme y constante (Fig. 45-7). Es caracterstica la tincin especfica de l
a muscularis mucosa y las paredes de los vasos sanguneos. Si se utiliza como sust
rato un bloque de tejido de estmago/rin de roedor, se puede producir un mareaje dbil
en las zonas mesangiales glomerulares debido a la presencia de actina F en esta
regin. Si se utilizan clulas Hep-2 en vez de otros sustratos, la IFID revela un m

areaje citoplasmtico de aspecto "cableado" cuando estn presentes los SMA.

Autoanticuerpos
antimitocondriales
Se han identificado nueve antigenos mitocondriales por separado que reaccionan c
on anticuerpos antimitocondriales (AMA). Los AMA dirigidos contra los antgenos M2
y M9 se consideran los marcadores diagnsticos ms importantes de PBC (Bylund, 1992
). Los A M A que se detectan por IFID usando como sustrato bloques de tejido de
estmago/rin de roedor muestran un patrn de fluorescencia tpico que refleja un mareaje
citoplasmtico homogneo de las zonas correspondientes a los tbulos renales y a las
clulas parietales; tambin son positivos los tbulos distales (Fig. 45-6). Este marea
je de los tbulos distales es un punto importante en la diferenciacin de la reactiv
idad de los AMA frente a los LKMA. que no producen mareaje en los lbulos renales
distales. El autoantigeno M2 es una mezcla heterognea que contiene diversos compo
nentes del complejo mitocondrial 2-oxo-cido dehidrogenasa. El autoantigeno domina
nte M2 en pacientes con PBC es la subunidad E2 de piruvato dehidrogenasa (PDH-E2
), de 70 kDa (Manns, 1992). El segundo autoantigeno mitocondrial ms comn es la sub
unidad de 50 kDa E2 de la cadena ramificada oxo-ceto-cido-dehidrogenasa (BCOADH-E
2) (Manns, 1992). Se pueden encontrar autoanticuerpos mitocondriales de aparicin
natural (NOMA) en personas que han tenido contacto cercano con pacientes de PBC
e incluso en el personal tcnico de laboratorio que procesa sueros con PBC (Bylund
, 1992). Los NOMA se producen raramente en pacienFigura 45-6. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimitocondriales
utilizando c o m o sustrato estmago/rin de ratn. Hay una inmunofluorescencia difusa
de los tbulos renales, incluyendo los tbulos distales (A, x 200) que tiene una ap
ariencia citoplasmtica homognea a m a y o ra u m e n t o (B, x 400).

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1007
zando transferencia westem. aunque este ensayo no est disponible fuera de los lab
oratorios de investigacin. Utilizando el procedimiento de transferencia western.
los L K M A se han agrupado en tres subtipos basndose en sus antigenos diana (Man
ns, 1992). Se ha identificado un componente de 50 kDa del citocromo P-450IID6 co
mo el principal antgeno de los LKMA-1 (Manns, 1992). Se encontr LKMA-2, dirigido c
ontra el citocromo P-450 IIC9, en pacientes que estaban en tratamiento con ticri
nafeno (Manns, 1992). un frmaco que h a desaparecido del mercado americano. Se ha
identificado LKMA-3 en sueros de pacientes con hepatitis viral crnica tipo D (Ma
nns. 1992).
Otros autoanticuerpos
hepticos
Figura 45-7. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimsculo liso uti
lizando como sustrato estmago/rin de ratn ( x 400).
Los restantes grupos de autoanticuerpos hepticos incluyen los autoanticuerpos ant
icitoesqueleto. anticitosol, antimembrana heptica, antilminas nucleares, especficos
de hgado y autoanticuerpos antirreceptor de asialoglicoprotena. Todos ellos han s
ido identificados en pacientes con enfermedades hepticas autoinmunes, pero su uso
como marcadores diagnsticos no est actualmente extendido (Nakamura, 1991).
Autoanticuerpos antimicrosomales de hgado y rion
Los L K M A producen el mareaje de los microsomas de hepalocitos y de tbulos prox
imales renales cuando se utiliza un bloque de tejido de estmago/rin de roedor como
sustrato para la IFID (Fig. 45-8). Los tbulos renales dislates son caractersticame
nte negativos en la inmunolluorescencia. La aparicin simultnea de AMA y LKMA es po
sible pero muy poco probable. Se est empezando a disponer de ELISA para detectar
LKMA en los laboratorios clnicos. La presencia de LKMA tambin puede ser confirmada
utiliEnfermedades hepticas
La Tabla 45-3 recoge los perfiles serolgicos tpicos en AiH, PBC y colangitis escle
rosante primaria (PSC). Estos son trastornos crnicos tpicamente definidos por conc
entraciones sricas de transaminasas elevadas al menos durante seis meses. El diag
nstico clnico diferencial comn incluye las enfermedades hepticas relacionadas con el
alcohol, dao heptico inducido por frmacos, hepatitis virales, o hgado graso de diab
etes mellitus u obesidad. Otros diagnsticos diferenciales menos frecuentes son la
hemocromalosis idioptica, la enfermedad de Wilson, el dficit de a,-antitripsina y
la afectacin heptica en enfermedades sistmicas.
Hepatitis
autoinmune
La AiH aparece de forma clsica en mujeres de aproximadamente 35 aos que presentan
una elevada concentracin srica de transaminasas. hipergammaglobulinemia. amenorrea
, artralgia y autoanticuerpos circulantes c o m o ANA. SMA y LKMA. Por delinicin,
estas pacientes no tienen evidencia serolgica de hepatitis viral, enfermedad de
Wilson u otras enfermedades en el diagnstico diferencial. Histolgicamente, la biop
sia heptica muestra hepatitis crnica con necrosis en sacabocados. La respuesta del

paciente a corticoides es espectacular y el fallo en la respuesta siembra dudas

sobre el diagnstico de AiH. La AiH es un grupo heterogneo de enfermedades de etio
loga dudosa. No hay caractersticas palognomnicas para la AiH. El Grupo Internaciona
l de Hepatitis Autoinmune (IAHG) h a integrado las caractersticas clinicas y de l
aboratorio que puede presentar un paciente en un sistema de puntuacin para diagno
sticar de forma definitiva o probable la AiH. La Tabla 45-4 recoge los parmetros
analticos de laboratorio clnico utilizados como criteno para diagnosticar AiH; en
la bibliografa se recogen otros criterios e interpretaciones por puntuaciones (Jo
hnson, 1993: Manns, 1998). De manera relevante, la ausencia de ANA, SMA o LKMA n
o excluye este diagnstico. Aunque la bibliografa mdica muestra subtipos de AiH basnd
ose en los patrones de autoanticuerpos, la utilidad clnica de estos subtipos no e
st clara, y la IAHG no recomienda la subdivisin de AiH basada en los perfiles de a
utoanticuerpos. Desde una perspectiva clnica, la AiH puede ser vista como una enf
ermedad heptica crnica caracterizada por la presencia de gran variedad de autoanti
cuerpos. La mayora de los expertos estn de acuerdo en que los tipos 1 y 2 de AiH s
on las principales formas de esta enfermedad, mientras que los subtipos adiciona
les aun deben demostrar sus resultados. Figura 45-8. Inmunolluorescencia indirec
ta de autoanticuerpos antimicrosomales de higado-rin utilizando c o m o sustrato e
stmago/rin de ratn. Aparece inmunofluorescencia de los tbulos renales proximales. per
o no en los tbulos distales. (A. x 200) que tiene una apariencia citoplasmtica fin
amente granular a m a y o r aumento (B. x 400). Puesto que los distintos subtipo
s de AiH estn ampliamente citados, la clasificacin de AiH de acuerdo con su perfil
serolgico se discute aqu brevemente. Los ANA caracterizan la forma clsica de hepat
itis autoinmune. el tipo 1. Los SMA tambin se detectan con frecuencia. Aunque los
AMA son marcadores diagnsticos de PBC especficos y sensibles, como se describe ms
tarde, tambin pueden ser detectados en cerca de 15% de los pacientes con

1008 Tabla 45-3

SECCIN V E n f e r m e d a d e s hepticas a u t o i n m u n e s
ANA LKMA

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
SLA
SMA
AMA
ANTI-HCV
p-ANCA
AC
Tratamiento Inmunosupresin Inmunosupresin Inmunosupresin Inmunosupresin Soporte, tra
ducir Soporte; traducir Inmunosupresin
Hepatitis autoinmune Tipo 1 Tipo 2a Tipo 2b Tipo 3 Tipo 4 PBC PSC AiC
+ 1
-H
i i i i i ++ i
i i
1 1 1
i
i +
l
-H + 1 1 1
i +
M
i
1 + 1 1
1
+
+
l
AiC = colangiiis autoinmune; ANA anticuerpos antmucleares. p-ANCA = anticuerpos

pennucleares anticitoptasma de neulrfitos. L K M A = autoanticuerpos a n t w r u

crosomales de hgado y rion; SLA = anticuerpos contra antigenos hepticos solubles; S
MA = anticuerpos antimusculo liso. AMA = anticuerpos antimitocondriales. HCV = v
irus de hepatitis C. PBC = cirrosis biliar primaria: AC = anhidrasa carbnica, PSC
= colangitis esclerosante primaria. Modificado de Manns MP Autoinmmune diseases
ot the liver Clin Lab Med 1992: 12 25-40 con permiso
... y
las caractersticas clnicas e histolgicas de AiH, incluyendo la mejora clnica como re
spuesla a la terapia mmunosupresora. Se considera que dichos pacientes tienen un
sndrome con caracterislicas que se "superponen" tanto con AiH como con PBC. El tt
ulo de AMA en este subgrupo de AiH raramente es superior a 1:40 (Bylund. 1992).
Adicionalmente. el antgeno especfico

Tabla 45-4 P a r m e t r o s d e laboratorio y puntuacin para

c o de hepatitis a u t o i n m u n e (AiH) Parmetros analticos
e aumento de fosfatasa alcalina respecto a transaminasas > 3.0 <
sricas totales, globulinas o IgG (x nivel superior normal) >2.0
1.0
Autoanticuerpos (IFID)

el d i a g n s t i
Bioqumica Proporcin d
3.0 Globulinas
1,5-2.0 1.0-1.5 <

Puntuacin
de estos AMA es similar al que se encuentra en la PBC clsica (Manns. 1992|. L a e
nfermedad heptica en la que se detectan LKMA, denominada AiH tipo 2, se ha subdiv
idido en dos grupos, los tipos 2a y 2b. Generalmente los pacientes con esta vari
ante de AiH tienen ANA y SMA negativos. Sin embargo, se detectan con frecuencia
autoanticuerpos contra mtcrosomas tiroideos, tiroglobulina y clulas parietales. L
a AiH de tipo 2 se caracteriza por bajos niveles de IgA y porque la hipergammagl
obulinemia es menos destacada que la observada en la AiH tipo 1 (Manns. 1992). L
a de tipo 2a aparece en mujeres jvenes que tienen altos ttulos de KLMA-1. serologa
negativa para virus de hepatitis C y enfermedad activa pero que responde a ester
oides. La variante de tipo 2b aparece en pacientes mayores y la preponderancia f
emenina es menor. Estos pacientes tienen ttulos bajos de LKMA-1, manifiestan enfe
rmedad heptica leve y a menudo tienen serologa positiva para el virus hepatitis C.
Su enfermedad tiende a responder menos a la inmunosupresin que el tipo 2a. Algun
os autores han propuesto un tercer grupo de AiH separado de los otros subgrupos
de AiH basndose en la identificacin de autoanticuerpos contra antigenos solubles d
e hgado (SLA) (Manns, 1992). Aunque la determinacin de estos autoanticuerpos podra
convertirse en importante puesto que se ha evidenciado como el nico marcador sero
lgico en cerca del 25% de los pacientes de AiH, los test fiables para detectar SL
A son tcnicamente difciles y an no estn disponibles para su uso habitual en el labor
atorio clnico (Manns. 1992). Puede ser que los altos ttulos de SMA dirigidos contr
a actina F caractericen un cuarto subgrupo de las AiH que se observa frecuenteme
nte en nios (Manns. 1992).
-2 +2
+3 +2 +1 0
Adultos ANA. SMA. LKM1 >1 80 1 80 1.40 <1:40 Nios ANA LKM >1:20 1:10 o 1:20 <11 0
SMA >1:20 1:20 <1:20 AMA Delectado No detectado Adultos y nios (si no se detecta
n ANA. SMA, LKM1) Otros autoanticuerpos hepticos (SLA. ASGP-R. LC1) Detectados No
deteclados Marcadores virales HAV o HBV aguda HCV por ELISA o RIBA ARN HCV por
PCR Otras inlecciones virales activas Seronegativo para virus conocidos Factores
genticos HLA-B8-DR3 o alotipo DR4
+3 +2 +1 0 +3 +2 0 +3 +2 0 -2 0 +2 0 -3 -2 -3 -3 +3 +1

Cirrosis
biliar primaria
La PBC es un trastorno crnico, progresivo y colestsico que sucede tpicamente en muj
eres jvenes o de mediana edad. Los pacientes pueden estar asmtomticos o tener sntom
as de colestasis (picores). Estudios de laboratorio han demostrado una elevacin d
e la fosfatasa alcalina con o sin hiperbilirrubinemia. as como un incremento de I
gM y AMA. Pueden producirse fenmenos inmunolgicos extrahepticos como el fenmeno de R
aynaud. complejo sicca. artritis reumatoide. tiroiditis. esclerodermia o enferme
dad celaca (Manns, 1992: Bylund, 1992). Histolgicamente, el hgado muestra varios es
tadios de colangitis destructiva no supurativa. Los AMA son los marcadores diagns
ticos ms sensibles y especficos para PBC. Como regla general, un ttulo de AMA super
ior o igual a 1:160 es altamente predictvo de PBC, aunque cerca del 10% de los pa
cientes de PBC tienen ttulos de AMA de 1:16 o menores (Bylund. 1992). Cerca del 9
5% d e los pacientes con caractersticas tpicas de PBC han mostrado tener anti-M2 o
anti-M9, mientras que el 5% restante de pacientes son A M A negativos. La causa
de la PBC es desconocida. Aunque esta enfermedad se asocia clsicamente con AMA sr
icos, el dao inmune mediado por clulas T a los conductos biliares interlobuhllares
intrahepticos predomina en las lesiones tisulares (Manns. 1991.1998: Batts. 1991
: Poupon, 1996). El reciente descubrimiento de anticuerpos contra retrovirus en
pacientes con PBC se ha atribuido a una respuesta inmune o a la reactividad inmu
ne contra protenas virales que comparten eptopos con retrovirus (Masn. 1998).
Adaptado de Johnson PJ. McFarlane IG. Convenors on behall ol the panel: Meeting
report International autoimmune hepatitis group. Hepatology 1993: 18: 998-1008.
con permiso

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1009
El diagnstico de PBC AMA negativo deriva de la presentacin clnica, hallazgos en la
biopsia heptica y colangiograta, siendo esta ultima realizado para descartar PSC.
Colangitis esclerosante primaria
La PSC ocurre de forma tpica en varones con historia de enfermedad inflamatoria i
ntestinal o diarrea. En el 50% de los pacientes, la enfermedad inflamatoria inte
stinal ligada a PSC es la colitis ulcerosa. El diagnstico de PSC se basa de forma
general en la colangiografa, que revela un patrn arrosariado caracterstico de los
conductos biliares debido a constricciones multifocales en estos lugares. La les
in histolgica ms destacada es la colangitis fibrosa de conductos biliares grandes o
pequeos, aunque en la prctica se puede observar un amplio espectro de lesiones in
flamatorias crnicas en la biopsia heptica. Estudios bioqumicos de rutina demuestran
la elevacin de la fosfatasa alcalina y un aumento de transaminasas con o sin hip
erbilirrubinemia. Aunque pueden estar presentes los ANA, los AMA no lo estn. Adems
, la IFID en neutrfilos fijados en etanol y formalma exhibe una alta prevalencia
de anticuerpos citoplasmticos perinucleares atipicos antineutrfilos descritos (Ban
si, 1996; Lo, 1994; Gur, 1995: Manns, 1992). Figura 45-9. Inmunolluorescencia in
directa de autoanticuerpos m i c r o s o m a l e s tiroideos utilizando tejido t
iroideo de m o n o no lijado c o m o sustrato (x 400).
Colangitis autoinmune
La colangitis autoinmune es una enfermedad heptica crnica colestsica que no parece
ser una variante de PSC (Goodman, 1995: Tsui, 1997). La presentacin clnica y la ap
ariencia histolgica del hgado se asemejan a la PBC. pero los hallazgos serolgicos i
mitan a los de la AiH tipo 1. No se detectan AMA. Adems se ha detectado un autoan
ticuerpo contra la anhidrasa carbnica en algunos pacientes con AiC (Gordon, 1995)
. Aunque la conexin entre AiC y PBC no est resuelta, la AiC podra ser lo mismo que
una PBC AMA negativa. Generalmente los pacientes responden a la inmunosupresin.
la poblacin lemenina adulta sin enlermedad clnica tiene anti-Tg o anti-TPO detecta
bles. lo que desata la pregunta sobre su significado patognico (Patrick, 1993) El
reemplazo de hormona tiroidea queda reservado para pacientes con hipotiroidismo
probado. Existen semejanzas entre la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Ha
shimoto (Utiger, 1991). Ambas estn asociadas con HLA-B8: ambas comparten fundamen
talmente una patognesis similar, y se cree que la enfermedad de Graves puede prog
resar hacia una tiroiditis de Hashimoto (Utiger, 1991; Patrick. 1993).
Autoanticuerpos
En las enfermedades tiroideas autoinmunes hay tres autoanticuerpos principales,
que incluyen los anti-TPO, anti-Tg y autoanticuerpos contra el receptor de la ho
rmona estimulante de tiroides (anti-TSHR) (Naparstek, 1993). Aunque los anticuer
pos anti-TPO y anti-Tg se consideran marcadores de enfermedad tiroidea autoinmun
e. su papel etiolgico no ha sido esclarecido. Pueden aparecer tambin en otras enfe
rmedades autoinmunes especficas de rgano. Los anticuerpos anti-TSHR. sin embargo,
desempean claramente un papel causal en la enfermedad tiroidea autoinmune (Napars
tek, 1993).
GLNDULA TIROIDES Enfermedades tiroideas
Las enfermedades tiroideas autoinmunes incluyen la enfermedad de Graves y la tir
oiditis de Hashimoto (Burek, 1995).
Enfermedad de Graves

El paciente con enfermedad de Graves presenta sntomas de hipertiroidismo y bocio

difuso. La mxima incidencia aparece entre la tercera y cuarta dcadas de la vida, y
la razn mujer/hombre es de 4 a 8:1; entre el 60% y el 70% de estos pacientes man
ifiestan adicionalmente trastornos oculares (Patrick, 1993). Los datos de labora
torio muestran un incremento en los niveles de triyodotironina (T) y tiroxma (T,)
. y tambin en la captacin de Tj. La terapia est dirigida a reducir la capacidad de
la glndula tiroides para responder a la estimulacin por autoanticuerpos. Esto se p
uede conseguir por una tiroidectoma subtotal, por administracin de yodo radiactivo
, o con la utilizacin de frmacos como propiltiouracilo o metimazol (Patrick, 1993)
.
Autoanticuerpos contra la peroxidasa tiroidea
Los anticuerpos anti-TPO van dirigidos contra un antgeno de 105 kDa contenido en
la fraccin microsomal del citoplasma de clulas epiteliales tiroideas (Burek. 1995)
. Aunque el mtodo de laboratorio que se utiliza ms comunmente para detectar anti-T
PO es la tcnica de hemaglutinacin pasiva cuantitativa (Nordyke, 1993). el ELISA ta
mbin puede utilizarse con este fin en los laboratorios clnicos. Histricamente, IFID
ha sido un mtodo popular y sensible para la deteccin de anti-TPO ("anticuerpos an
timicrosomales"). El test de IFID utiliza como sustrato secciones de tejido crio
conservado de mono o humano, no fijado y secado al aire. Los sueros positivos ma
rcan el citoplasma de las clulas epiteliales foliculares tiroideas pero no su ncle
o (Fig. 45-9). Se debe diferenciar entre anti-TPO y AMA cuando se observe mareaj
e citoplasmtico granular grueso: esto puede hacerse analizando los sueros con tej
ido de estomago/rin de ratn. Se pueden detectar anti-TPO en el suero de pacientes t
anto con enfermedad de Graves como con tiroiditis de Hashimoto, y su presencia y
titulo se correlacionan luertemente con la enfermedad clnica activa (Burek. 1995
). Existe cierta controversia entre los investigadores acerca de si la determina
cin de anti-TPO aislada es suficiente para detectar enfermedad tiroidea autoinmun
e de manera dable (Kaplan. 1999; Nordyke, 1993). El papel patognico de los anti-T
PO permanece sin esclarecer (Naparstek. 1993).
Tiroiditis de Hashimoto
La tiroiditis de Hashimoto es la forma ms comn de tiroiditis. y se caracteriza fun
cionalmente por una lenta progresin hasta hipotiroidismo. En pacientes con hipoti
roidismo. los niveles de T T. y captacin de T suelen ser bajos y la cantidad de h
ormona estimulante del tiroides (TSH) se incrementa anormalmente (Patrick, 1993)
. La incidencia de tiroiditis de Hashimoto es mxima desde la tercera a la quinta
dcadas, con una razn mujeres/hombres de 10:1. Los autoanticuerpos dirigidos contra
los antigenos de tiroglobuI m a (anti-Tg) y peroxidasa (microsomal) tiroidea (a
nti-TPO). son clnicamente los ms importantes para el diagnstico (Patrick. 1993), pe
ro hasta el 20% de
3

1010 Autoanticuerpos contra

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
tiroglobulina
Los anti-Tg estn dirigidos contra la tiroglobulina, que es la forma de almacenaje
de las hormonas tiroideas en los folculos de la glndula tiroides (Burek, 1995). S
e encuentran disponibles varios mtodos para la medida de anti-Tg, incluyendo la tc
nica de hemaglutinacn pasiva cuantitativa, IFID y ELISA. La tcnica de hemaglutinacn p
asiva cuantitativa tanto con hemaglutinacn con cloruro de cromo como con glbulos ro
jos recubiertos es el mtodo ms sensible y ampliamente utilizado para la deteccin de
anti-Tg (Burek, 1995). Los anticuerpos anti-Tg detectados por hemaglutinacn son i
dentificados con ttulos superiores a 1:1.000 en cerca del 80% de los pacientes co
n tiroiditis de Hashimoto (Burek. 1995). Los pacientes con enfermedad de Graves
(60%) o carcinoma de tiroides (30%) u otras enfermedades autoinmunes como la ane
mia perniciosa o el sndrome de Sjgren, y entre el 3% y el 18% de los individuos ap
arentemente normales, tambin pueden tener anti-Tg, pero sus ttulos de hemaglutinacn
son generalmente (>90%) inferiores a 1:1.000 (Burek, 1995). Para localizar antiTg, se realiza una IFID utilizando secciones de tejido criopreservadas de glndula
tiroides de mono. Se requiere la fijacin para impedir la prdida de tiroglobulina
durante las etapas de lavado. Se describen tres patrones de nmunofluorescencia cu
ando estn presentes los anti-Tg (Burek, 1995): 1) patrn flocular; 2) espacios colo
idales en sombra pero fluorescencia perifrica brillante; y 3) mareaje difuso, bri
llante, uniformemente marcado en un patrn de "vidrio molido" atribuido a la reacc
in de anti-Tg con CA2 (Burek, 1995). CA2, denominado segundo antgeno coloidal, se
detecta como nico marcador serolgico de las tiroiditis autoinmunes en el 5% y el 8
% de los pacientes que son positivos por IFID pero negativos para anti-Tg y anti
TPO utilizando otros mtodos (Bigazzi, 1992).
do del mtodo de deteccin (Bigazzi. 1992; Brunt, 1995). Los TSI. que suelen ser de
la clase IgG, estimulan la produccin de hormonas tiroideas activando el sistema d
e adenilato ciclasa tras su unin al TSHR (Patrick, 1993). Los ensayos para anti-T
SHR son tiles para confirmar la enfermedad de Graves en pacientes hipertiroideos
con resultados equvocos en los estudios habituales de laboratorio (Bigazzi, 1992)
. Adicionalmente, se puede utilizar un ensayo de anti-TSHR para monitorizar la t
erapia de sustitucin hormonal del paciente o para diagnosticar la tirotoxicosis n
eonatal (Bigazzi, 1992). Existen dos clases principales de ensayos para anti-TSH
R, denominados bioensayos y ensayos de unin; los aspectos metodolgicos son revisad
os en otros trabajos (Bigazzi, 1992; Patrick, 1993; Gupta, 1988). Nuevos ensayos
con el suero del paciente basados en la estimulacin de adenosin monofosfato cclic
o (cAMP) en clulas de tiroides de rata, mantenidas en cultivo tisular, pueden con
firmarse como una mejora sobre las dificultades tcnicas de los bioensayos (Burek.
1995). Los TSI son analizados en bioensayos que determinan el aumento de activi
dad mediado por TSHR por la medida del cAMP liberado o bien por la medida de la
captacin de yodo por clulas tiroideas mantenidas en cultivo (Brunt, 1995). Los TBI
I son analizados por la determinacin de la inhibicin de la unin de TSH marcada radi
activamente a su receptor o utilizando bioensayos con cAMP (Brunt, 1995).
RION
GLOMERULONEFRITIS
La glomerulonefritis es la principal causa de enfermedad renal primaria. Se pien
sa que los mecanismos mediados por inmunidad juegan un papel importante en la pa
tognesis de la glomerulonefritis, aunque la confirmacin experimental de dichos mec
anismos autoinmunes an no ha sido llevada a cabo. La IFD tiene un papel important

e en el estudio y diagnstico de la glomerulonefritis. Los patrones de reactantes

inmunes pueden ser divididos a grandes rasgos en aquellos que causan depsitos gra
nulares o lineales en el glomrulo u otras estructuras del rion examinadas con IFD.
Los depsitos granulares se han atribuido a complejos inmunes (IC) que abandonan
la circulacin o se forman in situ (McCIuskey, 1995). Los patrones de IFD de depsit
os inmunes asociados con las principales enfermedades glomerulares se resumen en
la Tabla 45-5. Se encuentran disponibles revisiones minuciosas de estos trastor
nos en varios textos (McCIuskey, 1995; Heplinstall, 1992). Sin embargo, para est
a exposicin, slo se presentan en mayor detalle los autoanticuerpos contra la membr
ana basal glomerular (anti-GBM).
Autoanticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de tiroides
Los autoanticuerpos anti-TSHR constan de dos grupos de autoanticuerpos que puede
n tanto estimular como bloquear los TSHR, causando respectivamente hipertirodsmo o
hipotiroidismo. Los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a estos receptores y
estimulan la produccin de hormonas se denominan inmunoglobulinas estimulantes del
tiroides (TSI), mientras que los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a los re
ceptores y bloquean la unin y (uncin de TSH se denominan inmunoglobulinas inhibido
ras de la unin de TSH (TBII) (Brunt, 1995, fvlooij, 1993). Los TSI son probableme
nte la causa del hipertiroidismo en la enfermedad de Graves (Bigazzi, 1992; Brun
t, 1995: Wilkin. 1990). Su prevalencia varia desde un 55% hasta un 95%, dependie
nf Tabla 45-5 Hallazgos por nmunofluorescencia directa en las principales enfermed
ades glomerulares Patrn de nmunofluorescencia y enfermedad Reactivos inmunes Depsit
os granulares, mesangiales y en GBM
Glomerulonefritis aguda postestreptoccica Nefritis lpica proliferativa difusa Glom
erulonefritis membranoproliferativa (MPGN. tipo I) Glomerulonefritis idioptica en
semilunas por complejos inmunes Enfermedad de depsitos densos (MPGN tipo II) Inf
ecciones crnicas (p.ej. endocarditis bacteriana) C 3 IgG difuso, IgM IgG, IgA, Ig
M, C 3 C 3 , IgG. IgM IgG. C 3 IgM C 3 (globular) IgM IgG. IgM. C 3
Granulares, predominancia mesangial
Nefritis lpica Mesangial Proliferativa focal Prpura de Henoch-Schnlein Nelropata IgA
IgG, C 3 , generalmente IgM e IgA IgG, C 3 , IgA; depsitos focales en el asa cap
ilar Predominantemente IgA; IgG. IgM, C 3 predominantemente IgA: a menudo IgG. I
gM. C 3 IgG C 3 . IgA. IgM IgM IgG C 3 , masas mtravasculares IgG, C 3 ; IgA e I
gM poco frecuentes Generalmente cadena ligera K, tal vez en TBM. vasos sanguneos,
intersticio
Granulares, predominantemente GBM
Nefritis lpica membranosa Crioglobulinemia mixta
Lineal, en GBM
Nefritis por anti-GBM Nefropata por cadenas ligeras
GBM = membrana basal glomerular; TBM = membrana basal tubular. Modificado a part
ir de McCIuskey RT, Collms AB, Niles JL Kmdney. En Colvin RB, Bhan AK, McCIuskey
(eds): Diagnoslic Immunopatthology, 2> ed. New York, Raven Press. 1995, pg 109.
con permiso.
...
.

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1011
Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular
La presentacin clnica en pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM vara en c
uanto que cerca de un 50% tienen enfermedad limitada al rion mientras que el otro
50% tiene sntomas tanto renales como pulmonares. Esta ltima presentacin es denomin
ada frecuentemente sndrome de Goodpasture. Raramente los pacientes con enfermedad
por anticuerpos antiGBM pueden tener enfermedad limitada a los pulmones (Wilson
, 1987). El diagnstico de la enfermedad por anticuerpos anti-GBM requiere la dete
ccin de autoanticuerpos anti-GBM contra el dominio NC1 del colgeno tipo I V (McCIu
skey. 1995), el denominado antgeno de Goodpasture. Los mtodos para la deteccin de a
nticuerpos anti-GBM incluyen IFID. ELISA y radioinmunoensayo (RA) (McCIuskey, 199
5: Wilson, 1987): algunos investigadores han desarrollado adicionalmente un test
sensible de transferencia western (McCIuskey, 1995). Debido a que la IFID es di
fcil de estandarizar y requiere experiencia para realizarse, los mtodos para la de
teccin se han centrado, en lugar de esto, en la validacin de RA o ELISA cuantitativ
os. Actualmente se encuentra disponible un kit ELISA con licencia comercial para
la determinacin de anticuerpos anti-GBM. Este ensayo determina los valores del p
aciente a partir de una curva estndar y permite dar resultados como rangos negati
vos, dudosos limitantes o positivos. La mayora de los pacientes con enfermedad po
r anticuerpos anti-GBM activa parecen tener valores superiores a 1 0 0 unidades.
Aunque se pueden obtener valores dudosos limitantes tanto en enfermedad por ant
icuerpos anti-GBM activa como latente, tambin hemos observado estos valores en pa
cientes con trastornos renales que no son enfermedad por anticuerpos anti-GBM. L
a coexistencia de anticuerpos contra el citoplasma de neutrdlos (ANCA) ha sido do
cumentada en algunos pacientes con glomerulonefritis rpidamente progresiva (RPGN)
(McCIuskey, 1995). La coexistencia de estos dos autoanticuerpos vara desde un 0%
hasta 40% de los pacientes con RPGN. lo que se acompaa por alguna evidencia de q
ue la presencia de ANCA en pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM pro
porciona un pronostico renal mejor (McCIuskey, 1995).
Adems de los autoanticuerpos adrenocorticales. se han detectado otros autoanticue
rpos en pacientes con enfermedad de Addison, incluyendo autoanticuerpos contra l
as clulas esteroideas y autoanticuerpos que se unen a los receptores de la hormon
a adrenocorticotropa (Muir, 1993).
PNCREAS
Diabetes mellitus (vase Cap. 11) Diabetes mellitus es el trmino diagnstico aplicado
a un grupo de trastornos metablicos que comparten la hiperglucemia como nexo comn
(Eisenbarth, 1995). El que la DM sea un diagnstico serio est documentado por el h
echo de que las complicaciones agudas y crnicas multiorgmcas justifican un 15% del
total del gasto econmico del sistema sanitario en EE.UU. (Schatz, 1995). Sin emb
argo, se ha hecho un progreso significativo en el cuidado de los pacientes diabti
cos gracias al conocimiento de que un control agresivo de la glucosa en sangre d
isminuye el riesgo de desarrollo y progresin de complicaciones vasculares (Schatz
, 1993).
Subtipos
clnicos
Existen dos subgrupos principales de DM: el tipo 1. DM msulino-dependienle (DMID
); y el tipo 2, DM no insulino-dependiente (NIDDM) (Eisenbarth, 1995). La DM tip
o 2 ocurre con ms frecuencia en individuos obesos mayores de 30 aos. Estos pacient

es tienen insulina plasmtica, pero en concentracin insuliciente para prevenir la h

iperglucemia (VanArsdel. 1993). Algunos pacientes tipo 2 tienen autoanticuerpos
asociados a insulina en su suero (VanArsdel, 1993). Los pacientes tipo 2 carecen
de la mayora de las otras caractersticas autoinmunes observadas en pacientes tipo
1, aunque la diferencia entre tipo 1 y tipo 2 no siempre es tan fcil (Eisenbarth
, 1995). Los pacientes tipo 2 se tratan por medio del control del peso y con med
icaciones que estimulen la produccin de insulina (VanArsdel, 1993). La DM tipo 1
se considera una enfermedad autoinmune crnica que aparece en individuos genticamen
te susceptibles y est causada por la destruccin de las clulas p productoras de insu
lina en los islotes de Langerhans pancreticos (Harrison, 1990). Esta destruccin de
las clulas |5 da lugar con el tiempo a una deficiencia de insulina e hiperglucem
ia crnica. En los Estados Unidos, la DMID aparece en 1 de cada 300 personas (esto
es, una incidencia media anual de 15 por 100.000 personas) (Eisenbarth, 1995).
Existe un slido soporte para concluir que la DMID es una enfermedad crnica autoinm
une (Harrison, 1990; Eisenbarth, 1995: Schatz, 1995). La deteccin de autoanticuer
pos circulantes precediendo a la manifestacin clnica de DMID refuerza esta conclus
in y proporciona una informacin importante respecto a la evolucin natural de la DMI
D y la capacidad para predecir su aparicin (Schatz. 11995). Los principales tipos
de autoanticuerpos circulantes en DMID son los siguientes: autoanticuerpos cont
ra las clulas de los islotes, autoanticuerpos contra el cido glutmico descarboxilas
a, autoanticuerpos contra insulina y autoanticuerpos asociados a insulinoma-2 y
2|i.
GLNDULA SUPRARRENAL Enfermedad de Addison
La insuficiencia adrenocortical crnica no tuberculosa, o enfermedad de Addison, t
iene una prevalence estimada de entre casos por 100.000 personas (Muir, 1993). D
el 65% al 70% de estos pacientes tienen autoanticuerpos circulantes contra los m
icrosomas y la membrana plasmtica de las clulas adrenocorticales. demostrable util
izando IFID sobre secciones congeladas de corteza adrenal humana (Patrick, 1993;
Burek. 1995; Muir. 1993). La 21 -hidroxilasa y la 17-t/hidroxilasa son dos auto
antigenos que se han identificado c o m o reactivos con autoanticuerpos adrenoco
rticales (Song, 1994). No se han encontrado autoanticuerpos adrenocorticales en
la enfermedad de Addison causada por tuberculosis u otros agentes exgenos (Patric
k, 1993). De manera destacable, cerca del 45% de los individuos asintomticos con
autoanticuerpos adrenocorticales desarrollan trastornos de la funcin adrenocortic
al en 2,5 aos tras la identificacin del autoanticuerpo (Muir, 1991). La enfermedad
de Addison asociada con autoanticuerpos es la que se diagnostica ms frecuentemen
te en personas entre 20 y 50 aos y es de dos a tres veces ms frecuente en mujeres
cuando se diagnostica despus de los 30 aos (Patrick. 1993; Muir. 1993). Las prueba
s de laboratorio muestran acidosis metablica. hiperpotasiemia. hiponatremia y baj
os niveles de cloruro y bicarbonato sricos. Los niveles de Cortisol plasmtico estn
disminuidos y los niveles de hormona adrenocorticotropa elevados (VanArsdel, 199
3). Consecuentemente, la terapia consistir en el reemplazo de glucocorticoides y
mineralocorticoides (Patrick, 1993). La enfermedad de Addison asociada con autoa
nticuerpos puede ocurrir por s misma, pero es ms comn que est acompaada por otras enf
ermedades autoinmunes c o m o parte de un sndrome autoinmune poliglandular (APS)
(Muir. 1993). Estas enfermedades acompaantes pueden incluir tiroiditis autoinmune
. anemia perniciosa o diabetes mellitus insulino-dependiente (Patrick, 1993).
Autoanticuerpos contra las clulas de los islotes
La IFID es el mtodo clsico para la deteccin de anticuerpos contra las clulas de los
islotes (ICA) (Atkinson, 1993). Se utilizan secciones congeladas de pncreas human
o como tejido de sustrato para detectar fluorescencia citoplasmtica, finamente gr
anular y especifica en todas las clulas de los islotes pancreticos (Fig. 45-10). S
e recomienda sangre humana del grupo O como sustrato para reducir las interferen
cias de fondo no especficas debidas a isohemaglutininas ABO. Utilizando IFID, los
ICA son detectables en cerca del 80% de los pacientes con DMID delectada de nov
o, entre el 3% y el 4% de parientes no diabticos de pacientes con DMID. y slo en e
l 0.5% de sujetos clnicamente normales (Atkinson, 1994). Los ICA consisten en aut
oanticuerpos que incluyen aquellos especficamente reactivos con autoanticuerpos c

ontra la descarboxilasa de cido glutmico (GADA), asi c o m o aquellos que son ICA
reactivos con anticuerpos no GADA (Atkinson, 1993; Kaufman, 1992).

1012
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA
identificar individuos con riesgo de DMID est siendo evaluado para determinar la
necesidad de estudios metablicos que aseguraren la intolerancia a la glucosa subc
linica y demanda de inmunoterapia en la fase preclinica de la DMID (Maclaren, 19
92). La determinacin de GADA utilizando ELISA puede mejorar finalmente la viabili
dad de la difusin del cribado de este autoanticuerpo. Adems de los autoanticuerpos
sobre los que se ha disculido antes, los pacientes con DMID tambin pueden tener
autoanticuerpos anti-TPO, contra clulas parietales y anti-adrenocorticales, por l
o que debe realizarse un cribado de estos autoanticuerpos en pacientes con DMID
al menos una vez (Maclaren. 1992).
TRACTO GASTROINTESTINAL
Figura 45-10. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra las clulas
de los islotes utilizando c o m o sustrato pncreas h u m a n o de grupo sanguneo O
(x 400).
Anemia perniciosa
La anemia perniciosa (PA) se caracteriza por aclorhidria rpida resistente a hista
mina, hipergastrinemia y dficit de vitamina B (Brown, 1995). El comienzo gradual
de los sntomas neurolgicos y el desarrollo de anemia megaloblstica son caracterstica
s tpicas del curso clnico de P A (Patrick, 1993). Morfolgicamente, la biopsia de mu
cosa del cuerpo del estmago contiene evidencias de grastritis atrfica crnica.
tt
Los ICA deben ser titulados en las unidades de la Juvenile Diabetes Foundation (
JDF) en referencia a un suero estndar de 80 unidades del Immunology of Diabetes W
orkshop; ttulos superiores a 20 unidades JDF parecen tener significado pronstico (
Maclaren, 1992). Se encuentran disponibles ensayos comerciales para ICA con sust
rato de primate.
Autoanticuerpos contra insulina
Se han identificado autoanticuerpos contra insulina (IAA) en cerca del 50% de lo
s pacientes con DMID en el momento del diagnstico y antes de empezar con la terap
ia insulnica (Atkinson, 1994). Los I A A se suelen determinar utilizando ensayo d
e radioinmunopreciptacn competitiva tcnicamente exigente. Este ensayo no puede disti
nguir entre IAA de aparicin espontnea de aquellos que aparecen como resultado de l
a terapia con insulina. Por tanto, se debe realizar el ensayo para IAA antes de
que la insulina sea administrada.
La PA est asociada con autoanticuerpos circulantes contra clulas parietales (APC)
en el 90% de los pacientes y contra el factor intrnseco (anti-IF) en entre el 60%
y 75% de los pacientes, aunque los anti-IF pueden ser ms especficos para PA(Burek
. 1995; Brown, 1995). Los APC son detectados por IFID llevada a cabo sobre bloqu
es de tejido de estmago/rin de ratn. Este bloque de tejido combinado permite la iden
tificacin del mareaje especfico de clulas parietales cuando no hay mareaje concomit
ante de tbulos renales como se vera en presencia de AMA(Fig. 45-11). Los anti-IF s
on detectados ms frecuentemente por RA. De los dos tipos conocidos de anti-IF, los
anti-IF tipo 1, o autoanticuerpos bloqueantes, impiden la unin de IF a la vitami
na B. , y los de tipo 2, o autoanticuerpos de unin, reaccionan con la vitamina B,
libre o complejada para inhibir la accin de IF (Karen. 1994; Patrick, 1993). Los
anti-IF tipo 1 estn considerados ms sensibles y especficos para el diagnstico de P
A (Karen, 1994). Sin embargo, la identificacin de APC o de anti-IF no es necesari
a para el diagnstico de PA, La PA puede ocurrir en asociacin con otras enfermedade

s autoinmunes como la liroiditis autoinmune o enfermedad de Addison y puede form

ar parte tanto de APS 1 como de APS 2 (Patrick, 1993).
; 2
Autoanticuerpos contra la descarboxilasa de cido glutmico
Los GADA se detectan en la mayora de pacientes recin diagnosticados de DMID y en c
erca del 80% de parientes de primer grado, prediabtcos, de pacientes con DMID (Hag
opian, 1993. Schatz, 1995). Los dos autoantgenos GAD, clasificados por peso molec
ular, se denominan GAD65 y GAD67 (Atkinson, 1993). Los GADA en pacientes con DMI
D son dirigidos en primer lugar contra la isoforma GAD65, que se encuentra princ
ipalmente en los islotes pancreticos y en el sistema nervioso central (SNC), dond
e acta como una enzima responsable de la formacin del neurotransmisor inhibidor cid
o y-aminobutrico (Barmeier, 1992; Luhder, 1994; Maclaren. 1988; Kaufman. 1992). L
a forma GAD67 predomina en los nervios perifricos (Falorni, 1994; Atkinson. 1993)
. Los GADA tambin estn asociados al raro sndrome del hombre rgido (Eisenbarth, 1995)
. De manera a destacar, un alto porcentaje de estos pacientes tiene DMID.
Enteropata sensible al gluten
La enteropata sensible al gluten (GSE), o espre no tropical, es una enfermedad del
intestino delgado caracterizada por malabsorcin de la grasa gastrointestinal, qu
e puede estar infradiagnosticada en Estados Unidos
Interpretacin y utilidad clnica de los autoanticuerpos en DMID
Los autoanticuerpos ICA. GADA, IAA e IA-2 se usan frecuentemente como marcadores
predctivos para DMID. Los ICA son un marcador especfico asociado con un riesgo el
evado de desarrollar DMID, pero los ICA no persisten. Los GADA se detectan gener
almente antes del diagnstico de DMID y generalmente disminuyen su titulo tras el
comienzo de la clnica de DMID (Schatz, 1994). Los GADA e IA-2, tanto separados co
mo juntos, parecen ofrecer la mejor utilidad predictiva para el cribado (Schatz,
1995). La identificacin de autoanticuerpos contra los islotes puede ser utilizad
a para confirmar la autoinmunidad en pacientes con DMID aguda, lo que diferencia
la DMID de tipo 1 de la de tipo 2. El uso de estos marcadores para Figura 45-11
. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos c o n t r a clulas parietales
gstricas utilizando estmago/rin de ratn c o m o suslralo (x 400).

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1013
(u-BTx) en RA competitivo para medir las diferentes formas de anti-AChR (Barna. 1
995). La M B T X es una proteina de veneno de serpiente que se une irreversiblem
ente a AChR, pero se une al receptor de Ach en un sitio diferente del lugar de u
nin de los anti-AChR (Rose, 1995). Los AChR se obtienen a partir de extractos de
msculo esqueltico humano denervado, c o m o puede ser a partir de amputaciones dia
bticas, o a partir de cultivo tisular. Para la determinacin, se marcan los AChR co
n u-BTx y despus son incubados con el suero del paciente para permitir que cualqu
ier autoanlicuerpo anti-AChR presente se una a los AChR en los sitios cercanos a
l lugar de unin de u-BTx. Tras la incubacin, los complejos radiomarcados son preci
pitados por inmunoglobulina anti-humana polivalente, y se procede a detectar la
radiactividad en el precipitado lavado, despus de la correccin de las uniones ines
pecficas. El grado de radioactividad en el precipitado es directamente proporcion
al a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente. Se pueden utilizar modif
icaciones de este ensayo de unin para identificar autoanticuerpos anti-AChR bloqu
eantes y moduladores. En un ensayo de bloqueo, se permite que el suero del pacie
nte, que contiene anti-AchR. incube con AChR antes de la adicin de a-BTx. La base
de esta tcnica es la premisa de que los anti-AChR capaces de bloquear la unin de
r/.-BTx tambin bloquean la unin de Ach a AChR (Rose. 1995). La cantidad de radiact
ividad en el precipitado es, por tanto, inversamente proporcional a la cantidad
de anti-AChR en el suero del paciente. Se piensa que los autoanticuerpos anti-AC
hR moduladores aceleran la degradacin de AChR, pero su determinacin en el laborato
rio clnico es tcnicamente difcil y no est ampliamente instaurada.
Figura 45-12. Inmunofiuorescencia indirecta de autoanticuerpos IgA contra endomi
sk) utilizando estmago de mono como sustrato (x 400)
(Ferguson, 1997). La hipersensibilidad al gluten, o derivados del gluten, es la
causa de GSE (Brown, 1995). La biopsia de intestino delgado de un paciente con G
SE es anormal de forma variable, pero los cambios caractersticos incluyen la atro
fia vellosilaria, elongacin de las criptas, lintocitos intraepiteliales y mitosis
en las criptas. Los pacientes con GSE manifiestan varias alteraciones inmunes h
umorales. Es interesante que los niveles de IgA en suero estn generalmente elevad
os en pacientes con GSE, excepto en aquellos con un dficit de IgA, lo que ocurre
en pacientes con GSE ms frecuentemente que en individuos normales (Brown, 1995).
Los pacientes con GSE pueden tener autoanticuerpos IgA circulantes antiendomisio
, antireticulina o antigliadina. Los autoanticuerpos IgA antiendomisio se detect
an por IFID utilizando esfago de mono como tejido sustrato (Fig. 45-12). La trans
glutaminasa tisular (ttg) es probablemente el autoantgeno del endomisio (Dietench
. 1997). Su identificacin est considerada sensible y especfica para el diagnstico de
GSE o bien GSE asociada con DH (GSE-DH) (Talal, 1997). La medicin del ttulo de au
toanticuerpo IgA antiendomisio puede ser utilizada para monitorizar la adherenci
a de un paciente a una dieta libre de gluten (Karen, 1994). Los autoanticuerpos
antirreticulina son detectados por IFID sobre un bloque de tejido combinado de e
stmago/rin de ratn. Estos autoanticuerpos son detectables en adultos (40%), asi como
en nios (60%) con GSE y tambin en adultos con GSE-DH (20%). Sin embargo, los auto
anticuerpos antirreticulina no son especficos para el diagnstico, pudiendo estar p
resentes tambin en pacientes con enfermedad de Crohn, miastenia gravis, sndrome de
Sjgren. y otras enfermedades del tejido conectivo. Los anticuerpos antigliadina
son deteclados por ELISA en casi todos los pacientes con GSE o GSE-DH (Brown, 19
95). El antgeno diana, la gliadina, se purifica a partir de gluten y es utilizado
en la fase slida del ELISA para detectar estos autoanticuerpos. Como los autoant
icuerpos IgA antiendomisio, los autoanticuerpos antigliadina pueden ser utilizad

os para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta sin gluten.

Esclerosis mltiple
La MS es una enfermedad desmielinizante relativamente corriente que involucra a
la sustancia blanca del cerebro y la mdula espinal. La MS ocurre ms frecuentemente
en mujeres que en hombres (razn de 2:1) y se manifiesta generalmente durante las
primeras etapas de la edad adulta con una amplia variedad de manifestaciones cln
icas posibles. Cerca del 50% de estos pacientes experimenta periodos alternantes
de enfermedad activa y remisiones, mientras que el resto sigue un curso progres
ivo crnico (Steinman, 1993; McFarland, 1995). El diagnstico de MS deriva de los ha
llazgos clnicos y la exclusin de cualquier otro trastorno. Aunque la causa de MS e
s desconocida, se considera a los mecanismos autoinmunes como importantes en la
patognesis de esta enfermedad (McFarland, 1995). Sin embargo, no hay ningn autoanl
icuerpo circulante lo suficientemente caracterstico en la MS como para ser acepta
do como diagnstico en las determinaciones de rutina del laboratorio clnico. Sin em
bargo, el examen de laboratorio de liquido cefalorraqudeo (LER) proporciona infor
macin importante que ayuda al diagnstico de MS en un marco clnico apropiado (Barna,
1987). La sntesis de IgG se incrementa anormalmente en el SNC de pacientes con M
S, de tal forma que la determinacin del ndice de IgG y la tasa de sntesis de IgG pr
oporciona resultados tiles, pero no especficos (McFarland, 1995; Zweiman, 1991; Ka
ren. 1994: Valenzuela. 1987). La determinacin de bandas oligoclonales en el LCR e
s tambin til en un marco clnico apropiado, ya que son identificadas en ms del 90% de
los pacientes con MS: sin embargo, su presencia no es especifica, puesto que pu
eden ser detectadas en pacientes con diversos trastornos como neurosfilis, vascul
itis SNC, enfermedad de Lyme. panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad d
e Creutzfeldt-Jakob, sndrome de Guillain-Barr y neoplasias (Karen, 1994). La elect
roforesis de protenas sricas tambin debe realizarse para asegurar que las bandas ol
igoclonales del LCR no son debidas a filtracin en el LCR desde el suero. Las band
as oligoclonales en el LCR se determinan generalmente por electroloresis de alta
resolucin en gel de agarosa con LCR concentrado
(Karen. 1994).
SISTEMA NERVIOSO Miastenia graves
La MG es un trastorno neuromuscular caracterizado por debilidad muscular asociad
a al ejercicio, fatiga y presencia de autoanticuerpos contra el receptor de acet
ilcolina (anti-AChFt). El AChFt, localizado en las membranas postsinpticas de las
fibras musculares esquelticas, une acetilcolina (ACh) que proviene de las termin
aciones nerviosas, lo cual causa una contraccin muscular cuando se ha liberado un
a cantidad suficiente de Ach (Naparstek, 1993: Rose. 1995). Los autoanticuerpos
anti-AChR interfieren en esta funcin neuromuscular, provocando debilidad muscular
y fatiga. Los autoanticuerpos anti-AChR se detectan en casi el 90% de pacientes
con MG (Rose. 1995). Se utiliza u-bungarotoxina marcada radiactivamente
Neuropatas
El centro de la atencin ms reciente es un grupo de sndromes neurolgicos que afectan
tanto al SNC como al sistema nervioso perifrico y estn asociados con autoanticuerp
os (Naparstek. 1993). Estos autoanticuerpos son detectados por ELISA. IFID o inm
unohistoqumica. La importancia de la iden-

1014
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
tlicacin de dichos autoanticuerpos se incrementa indudablemente si los estudios cln
icos correlacionan su presencia con una enfermedad particular o un beneficio ter
aputico. Sin embargo, hasta la fecha, estos autoanticuerpos no son especficos de u
na enfermedad y pueden incluso aparecer despus de un trauma al sistema nervioso.
Los autoanticuerpos contra componentes primarios neurales incluyen aquellos cont
ra protenas neuronales o contra ganglisidos neuronales (Zeballos, 1992).
RESUMEN
Los autoanticuerpos tienen un papel importante en el estudio de las enfermedades
autoinmunes organoespecficas. La deteccin de dichos autoanticuerpos puede ser imp
ortante en el diagnstico de algunas enfermedades autoinmunes organoespecficas, com
o la enfermedad de Graves, pero ms a menudo sirven como soporte ms que como elemen
to esencial para el diagnstico. De manera similar, aunque algunos de estos autoan
ticuerpos estn directamente involucrados en la patognesis de una enfermedad, por e
jemplo el pnfigo. a menudo su presencia es un marcador de dao inmunolgico subyacent
e atribuible a otro mecanismo de enfermedad, como es el caso de la DMID. Tcnicas
ms recientes de biologa molecular han revelado y continuarn hacindolo, la naturaleza
especfica de muchos antgenos diana de estos autoanticuerpos. Se espera que este t
rabajo llegue a elucidar los mecanismos de enfermedad subyacentes, permitiendo l
a mejora de las pruebas diagnsticas y. tal vez. de nuevas direcciones en las tera
pias. Los avances tcnicos en los ELISA han hecho de sta una tecnologa asequible par
a la mayora de los laboratorios clnicos, de manera que muchos ensayos para la dete
rminacin de autoanticuerpos especficos de rgano se encuentran disponibles donde la
IFID no es factible.
Autoanticuerpos contra protenas neuronales
Un subgrupo de pacientes con degeneracin cerebelosa paraneoplsica (PCD) tienen aut
oanticuerpos anti-Yo que generalmente son detectados al mismo tiempo que es desc
ubierta la neoplasia maligna. Los anti-Yo son detectables como fluorescencia cit
oplasmtica en las clulas de Purkinje utilizando IFID sobre tejido cerebeloso human
o. La identificacin de anticuerpos anti-Yo en un paciente sin malignidad conocida
debe iniciar una evaluacin minuciosa en busca de una neoplasia maligna (Zeballos
, 1992). Los anticuerpos anti-Ri son autoanticuerpos especficos de neurona, cuya
identificacin parece limitada a pacientes con carcinoma de m a m a y opsoclonus p
araneoplsico (Zeballos. 1992). Los anti-Ri son caracterizados por fluorescencia e
n el ncleo neuronal por IFID. Los anticuerpos anti-Hu tambin son visibles como flu
orescencia nuclear neuronal con IFID. Estos autoanticuerpos pueden ser identific
ados en pacientes con carcinoma de pulmn de clulas pequeas y encefalomelitis paraneo
plsica (Zeballos, 1992).
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n-dependent d i a b e t e sA u t o i m m u n i t y1 9 9 4 ;1 9 : 1 1 3 .
Autoanticuerpos contra ganglisidos neuronales
Los ganglisidos son componentes glicolipdicos que se encuentran en las membranas e
xtemas de las clulas nerviosas perifricas (Naparstek, 1993). L a s neuropatas motor
as perifricas pueden producirse en pacientes con gammapatas monoclonales IgM, cuya
paraprotena IgM reacciona con los ganglisidos GM. o GD, (Zeballos, 1992). Aunque l
os anticuerpos anti-GM, o anti-GD pueden ser identificados en una amplia variedad
de sndromes neurolgicos, su presencia en altos ttulos es ms caracterstica de enferme

dad de neurona motora que otras alternativas (Zeballos, 1992).

OTROS RGANOS Corazn Autoanticuerpos contra miocardio
Los autoanticuerpos contra miocardio se han descrito como parte de varias condic
iones que daan el msculo estriado cardaco, incluyendo infarto de miocardio, despus d
e ciruga cardiaca, y miocardiopata, aunque su identificacin puede ayudar a diferenc
iar la miocardiopata mediada por inmunidad de otras causas de miocarditis (Napars
tek, 1993; Burek, 1995). Se utiliza la IFID sobre secciones congeladas de corazn
de mono para detectar autoanticuerpos contra miocardio. El mareaje especfico de m
iocardio tambin puede determinarse excluyendo la reactividad de msculo esqueltico n
o cardaco. Desgraciadamente, los AMA o autoanticuerpos heterfilos pueden causar ma
reaje fluorescente que puede ser confundido con el que es debido a autoanticuerp
os contra miocardio.
Msculo Autoanticuerpos contra msculo esqueltico
Los autoanticuerpos contra msculo esqueltico tienen una aplicacin clnica limitada. S
e pueden observar ttulos bajos (<1:30) en individuos sanos, mientras que algunos
pacientes con trastornos miopticos pueden tener ttulos hasta 1:60. Aunque se han e
ncontrado ttulos altos (>1:60) de autoanticuerpos contra msculo esqueltico en pacie
ntes con MG. los ensayos de anti-AChR tienen mayor utilidad clnica en el diagnstic
o o monitorizacin de MG. Los autoanticuerpos contra msculo esqueltico se detectan p
or IFID sobre secciones congeladas de msculo esqueltico de los muslos de mono.

CAPITUIO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECIFICAS

1015
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MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA interacciones celulares Caractersticas

estructurales de la IgE Liberacin de mediadores desde las clulas efectoras sensibi
lizadas a IgE EVALUACIN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALRGICAS
1016
Protena IgE: mtodos de determinacin, valores normales y utilidad clnica Anticuerpos
IgE alrgeno-especficos: mtodos de determinacin, calificacin de resultados y utilidad
clnica Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibldad inmediata y para an
ticuerpos IgE alrgeno-especficos BIBLIOGRAFA 1026
Regulacin de la sntesis de IgE: influencias genticas e
1019
La prevalencia global de enlermedades alrgicas en los Estados Unidos excede el 20
%, y los sntomas y signos de la alergia son con frecuencia difciles de distinguir
clnicamente de otras etiologas (Huang. 1993). Por estas razones, los mdicos con fre
cuencia consideran la alergia (hipersensibilidad inmediata) como una posible eti
ologa de enfermedad en pacientes que se presentan con diversos signos y sntomas. C
uando se seleccionan apropiadamente, las pruebas de laboratorio son tiles para ev
aluar pacientes con enfermedades alrgicas, pero el conocimiento de los mecanismos
bsicos de la hipersensibilidad inmediata y el conocimiento de las relaciones empr
icas entre los resultados de las pruebas y su valor diagnstico predictivo son nec
esarios para optimizar la eficacia de las pruebas de laboratorio. Este captulo ab
orda estos lemas, empezando con una perspectiva general de los mecanismos bsicos
de la hipersensibilidad inmediata y procediendo a una descripcin detallada de las
pruebas de laboratorio aplicadas a los modos de cribado y diagnstico para evalua
r diferentes tipos de enfermedades alrgicas. Se ha hecho una mencin especfica de la
s aplicaciones de las pruebas de laboratorio que no son rentables o que pueden c
onducir a conclusiones clnicas incorrectas.
enfocado considerablemente en dos reas: estudios dirigidos al descubrimiento de g
enes que influyen en el desarrollo del fenotipo alrgico, y estudios celulares y m
oleculares dirigidos al descubrimiento de mecanismos genticos y biolgicos que infl
uyen en la sntesis y secrecin de la protena IgE y los anticuerpos IgE. Como el nive
l de la protena IgE en sangre se correlaciona fuertemente con la presencia de sig
nos y sntomas de enfermedad alrgica, estas dos reas de investigacin se solapan. Es b
ien sabido que las influencias genticas afectan a la probabilidad de que un indiv
iduo desarrolle una enfermedad alrgica (Meyers. 1998). Los individuos predispuest
os genticamente a menudo se conocen como atpicos, un sinnimo para el fenotipo alrgic
o clnico. Los resultados de los estudios epidemiolgicos genticos sugieren que los n
iveles en suero de la protena IgE estn influidos por lo menos por dos genes, y esa
herencia recesiva o codominante de alelos (an no definida) sobre esos locus infl
uye en el nivel basal de la protena IgE en suero (Meyers, 1991). El fenotipo IgE
elevado est caracterizado por niveles de protena IgE en suero varias veces mayor q
ue el fenotipo IgE bajo (Martnez. 1994). Como es lgico, los niveles elevados d e I
gE en suero se asocian a un fenotipo alrgico con aumento en la prevalenca de enfer
medades alrgicas, particularmente el asma. A nivel estructural, se han propuesto
varios genes candidatos que podran actuar para determinar el fenotipo alrgico (Tab
la 46-1). Los estudios analticos de enlace han identificado las localizaciones ap
roximadas de estos genes candidalos a nivel cromosmico. y los estudios posicional
es de clonacin corroboran la relacin de los genes putativos con genes conocidos pa
ra molculas mmunorreguladoras incluyendo receptores de citocina, antigenos leucoc
itos humanos y factores de transcripcin nucleares (Caraballo. 1999). Una regin del
cromosoma 5q incluye genes de diversas atocinas que se sabe influyen en la prod
uccin de IgE por clulas inmunocompetentes o reactividad bronquial incluyendo inter
leucma (IL)-3. IL-4. IL-5. IL-9 e IL-13 y el receptor (5-adrenrgico. respectivame
nte (Caraballo. 1999). El cromosoma 6p contiene el complejo del antgeno leucocita
rio humano (HLA) (vanse Caps. 40 y 41). Diversos haplotipos HLA estn asociados con

el fenotipo alrgico, ms marcadamente con el HLA-DR especfico y haplotpo DQ. Los pro
ductos genticos de estos locus juegan un importante papel en la determinacin de re
spuestas inmunes a protenas alergnicas a travs de un papel en la presentacin del ant
igeno (vase mas adelante). Otros diversos cromosomas contienen genes que pueden j
ugar un papel en determinar el fenotipo alrgico: el cromosoma 1 1 q contiene un g
en para el receptor de alta afinidad de IgE (F B|. el cromosoma 12q contiene gen
es para interfern-yy el factor de ereMECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA Regulacin de la sntesis de IgE: influenc
ias genticas e interacciones celulares
Las investigaciones bsicas a linales de los aos 60 conducen a la descripcin de una
clase distinta de inmunoglobulinas en humanos, la inmunoglobulina E (IgE). con p
otentes propiedades reactivas (sensibilidad cutnea) (Ishizaka, 1966a. 1966b, 1966
c). Este resultado marc el comienzo de la era actual de investigacin en cuanto a l
os mecanismos moleculares de las enfermedades alrgicas. Hasta ahora, se sabe much
o sobre los procesos que acontecen dentro de las membranas celulares de las clula
s efectoras sensibilizadas por IgE, que conducen a la liberacin de mediadores vas
oactivos. Estos mediadores causan directamente los signos y sntomas de la enferme
dad alrgica (vase ms adelante). Las investigaciones en este tema se han
'Mayo Foundation conserva los derechos sobre todos los dibujos e ilustraciones d
el presente capitulo.

CAPTULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS
1017
El modelo descrito anteriormente explica los mecanismos comunes que provocan la
sntesis de anticuerpos especficos IgG e IgE. pero ciertos mecanismos son particula
rmente pertinentes para la respuesta de IgE. Estos mecanismos originan la expans
in clonal de linfocitos B-lgE y el cambio de isotipo con la expresin de transcnpto
res maduros ms que de lneas germinales. Los linfocitos B requieren por lo menos de
dos seales activadoras para iniciar la sntesis de anticuerpos especficos (Vercelli
. 1989a). Una seal es emitida como resultado de una interaccin afn entre clulas T co
mplementaras y linfocitos B que muestran los antgenos procesados. Estos linfocitos
B, sin embargo, requieren de seales adicionales para iniciar la transcripcin del
C ' mRNA reordenado. En el caso de las IgE. se emiten seales importantes por IL-4
e IL-13. citocinas producidas por un subpoblacin de linfocitos Th. Sin embargo,
estas seales solas no son suficientes para inducir la sntesis de anticuerpos IgE m
aduros. cimiento basotilo. y el cromosoma 14q contiene genes para el receptor an
tigeno de clulas T y NF-KB1 (Caraballo. 1999). Se necesitan estudios adicionales
para determinar la extensin del polimorfismo de estos locus y los efectos de dife
rentes alelos de estos locus candidatos sobre el fenotipo alrgico. La habilidad d
e un individuo de responder a un anlgeno exgeno sintetizando anticuerpos especficos
est determinada genticamente por genes de la regin HLA-D (vase Cap. 40). Los produc
tos genticos de estos locus altamente polimrficos molculas de DR, DQ y DP de clulas p
resentadoras de antigenos son responsables del proceso de unin al antgeno procesado
para presentarlo a los linfocitos T inmunocompetentes. e iniciando por tanto un
a respuesta de anticuerpos (Bach. 1985; Korman, 1985; Trowsdale. 1985). L a sntes
is de anticuerpos especficos (incluyendo IgE) para antgenos Tdependientes resulta
de una sene de interacciones celulares que incluye la seal relacionada (contacto
clula a clula) y no relacionada entre clulas. Varios pasos estn implicados. Inicialm
ente. el antgeno es metabolizado por una clula presentadora del antgeno, por ejempl
o, una clula dendrtica o macrfaga, y el antigeno "procesado" se muestra en la super
ficie de la clula en una hendidura configurada para el antgeno constituida por molc
ulas superficiales de la regin HLA-D y Iragmentos procesados de un antigeno nativ
o. La interaccin afn entre el complejo antgeno procesado-HLA-D de una clula presenta
dora del antgeno y los receptores antgenos especficos en una poblacin complementaria
de linfocitos T colaboradores/inductores (clulas Th) origina la activacin de las
clulas Th, secrecin de citocinas y expansin clonal de la respuesta de los linfocito
s (Unanue. 1987). El mismo antigeno puede estar unido a anticuerpos expresados c
onstitutivamente en las membranas plasmticas de linfocitos B especficos de antgeno;
y estas clulas que procesan el antgeno internalizando el complejo antgeno-anticuer
po tambin son capaces de metabolizar y presentar el antgeno procesado. De nuevo, d
espus de la interaccin afn y la secrecin de citocinas. se produce una expansin clonal
de linfocitos B antgeno-especficos seguida de la sntesis y secrecin de anticuerpos
especficos (Fig. 46-1). La IL-4. junto con IL-13. IL-3 e IL-5, se produce por un
subpoblacin de linfocitos T llamadas clulas T2 (Mosmann. 1986: Parronchi. 1991) Lo
s electos de IL-4 e IL-13 son antagonizados por el interfern-y. que junto con la
IL-2 se produce en una segunda subpoblacin de linfocitos T llamadas clulas TI. Los
productos de citocina de esas dos subpoblaciones T influyen de forma opuesta en
la sntesis de IgE. Otras citocinas tambin influyen en la sntesis de IgE (vase Cap.
39). Las citocinas IL-5 e IL-6 originan la sntesis de anticuerpos IgE por linfoci
tos B comprometidos, pero ninguna es suficiente para emitir un seal "activadora"
para desviar un isotipo relacionado con la produccin de transcriptores C, reorden
ados (Vercelli. 1989b). Como se anot previamente, en el curso de una respuesta in
mune caracterizada por la produccin de anticuerpos IgE. los linfocitos B deben di
ferenciarse a clulas plasmticas que producen ms IgE que IgM (o IgD). Este proceso,
llamado desviacin de isotipo. incluye el reordenamiento de los genes inmunoglobul

inas a nivel del ADN. No se conocen todos los mecanismos asociados a la desviacin
del isotipo. pero se conocen mejor muchos de los requerimientos para la desviac
in del IgE. Un elemento importante es el ajuste del CD40 a los linfocitos B por e
l ligando CD40 en los linfocitos T. Si no existe ajuste del CD40, los linfocitos
B expuestos a IL-4 e IL-13 en presencia de las clulas presentadoras de antgenos y
los linfocitos T producirn transcriptores C, de la lnea germinal. Los esludios ex
perimentales sugieren que los efectos del ajuste de CD40 estn mediados intracelui
armente por la familia Src de tirosina cinasas. que estn implicadas en distintos
niveles de la activacin transcripcional (Vercelli. 1998)
Caractersticas estructurales de la IgE
La primera evidencia de que los anticuerpos IgE humanos poseen actividad reagnica
y son diferentes de otras inmunoglobulinas fue de los Ishizakas (Ishizakas, 196
6a, 1966b, 1966c). Estos investigadores cultivaron antisuero de ratn con una frac
cin aislada de inmunoglobulina rica en reagina aislada del suero de un paciente a
tpico. Despus de la absorcin con inmunoglobulinas purificadas de todos los istopos c
onocidos (IgG. IgA. IgM e IgD), el antisuero an reaccionaba con la globulina-y. p
resente en el suero de pacientes alrgicos. Despus de la inmunoprecipitacin con este
antisuero, se suprimi la actividad sensibilizadora cutnea del suero de diferentes
pacientes atpicos La evidencia definitiva de la singularidad inmunoquimica y la
actividad reagnica de IgE fue obtenida algo tarde cuando se descubri que las proten
as del mieloma humano reaccionaban con el antisuero antes mencionado (Bennich. 1
969). Los experimentos realizados con fragmentos de inmunoglobulina aislados pre
parados por digestin enzimtica de protenas IgE de mieloma indicaron definitivamente
que la actividad sensibilizadora cutnea requera de una regin F, intacta y que los
determinantes antignicos nicos para molculas de IgE se encontraban en el fragmento
F, (Bennich, 1969). Las propiedades fisicoqumicas y las funciones inmunologicas d
e diferentes regiones de la molcula IgE. determinadas por experimentos llevados a
cabo con protenas IgE de mieloma humano purificadas y fragmentos de inmunoglobul
ina preparados por digestin enzimtica. estn resumidas en la Tabla 46-2. La estructu
ra de la IgE humana se muestra en un diagrama en la Figura 46-2. Los anticuerpos
IgE humanos sensibilizan la piel para liberar histamina, un fenmeno llamado anaf
ilaxis cutnea pasiva. L a actividad sensibilizadora
Figura 46-1. Interacciones reconocidas y no reconocidas de clulas presentadoras d
e antigenos (APC). Clulas T colaboradoras /inductoras y clulas B originan la activ
acin y la expansin clonal de las clulas IgE-B (vase t e x t o para explicacin).

1018
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Tabla 46-2 P r o p i e d a d e s fisicoqumicas d e la nmunoglobulina E Cadena clas
e H Frmula molecular Coeficiente(s) de sedimeniacin Peso molecular Carbotndralo (%
) Determinantes antignicos Fijacin complementaria (clasica) Vida media en suero (da
s) Transferencia placentaria Actividad reaginica
E
E -L, 8 190 000 11,7 D,. D..2. D,3 Ninguna 2 Ninguna 4+; Los fragmentos que conti
enen Fe son inhibidores de la actividad sensibilizadora de la piel de IgE nalrvo
. pero los fragmentos con Fab. no
2
eos IgE de superficie celular (homocitotrpica). receptores de alta almidad para I
gE (F , Rl) localizados difusamente en las membranas plasmticas d e las clulas efe
ctoras. L a unin de los anticuerpos IgE a F, Rl es reversible pero de m u y alta
afinidad (K = 10" M ') (Wank, 1983). Mientras que los anticuerpos IgE en sangre
tienen una vida media de slo dos o tres das, la vida media de los anticuerpos IgE
en la piel delimitados por F Rl en mastocitos se estima que es superior a los 10
das. Se eslima que el nmero de receptores por clula oscila entre 40.000 y 500.000.
Mayores nmeros de receptores se encuentran en cultivos de basfilos en presencia de
IgE, posiblemente reflejando la sobrerregulacin de F., Rl expresada por IgE. F,
Rl es un receptor multimtnco. compuesto por subunidades a, |i. y y como las sigui
entes; (/.,. |i, y y . Los anticuerpos IgE estn delimitados por la subunidad-u; l
as subunidades -|i y -y contienen regiones transmembrana que funcionan en la seal
izacin transmembrana (Ravetch, 1991).
( a
/
cutnea de la IgE es lbil al calor; calentando a 56C durante dos horas se modifican
irreversiblemente los dominios C,3 y C,4 de la molcula IgE y se suprime la activ
idad sensibilizadora de la piel (Ishizaka, 1967). La aglutinacin de clulas elector
as tambin se suprime por la reduccin y alquilacin de los puentes disulfuro entre la
s cadena-,. Los agregados de IgE humano no se fijan al complemento por la va clsic
a, y no hay paso placentario significativo de IgE humano.
Liberacin de mediadores desde las clulas efectoras sensibilizadas a IgE
Los mastocitos y basfilos son las clulas electoras principales de las reacciones d
e hipersensibilidad inmediata. Ambos tipos de clulas contienen histamina en granu
los citoplasmticos que se tien marcadamente con tintes bsicos metacromticos (Siragan
ian, 1988). Los mastocitos y basfilos se desarrollan en la mdula sea a partir de clu
las madre pluripotenciales. un proceso que se estimula por IL-3 (Schrader, 1986)
. Los baslilos que circulan en la sangre tienen una vida corta, y estn bien difere
nciados, mientras que los mastocitos que se encuentran en tejidos prximos a los v
asos sanguneos y en tejidos conectivos adyacentes al epitelio del tracto respirat
orio, del tracto intestinal y de la piel son clulas con una vida larga capaces de
prolilerar en respuesta a estmulos mitgenos. Los mastocitos son heterogneos pero c
ontienen normalmente 10 veces ms del total de histamina por clula que los baslilos.
El mecanismo primario de liberacin de histamina desde los mastocitos y basfilos i
ncluye la seal transmembrana mediada por anticuerpos especfiLas molculas de F, Rl son mviles dentro de las membranas plasmticas de las clulas si
ntetizadas, como indican estudios llevados a cabo con anticuerpos anti-lgE conju

gados con fluorescencia. Esta movilidad para distancias cortas se cree que es im
portante en la liberacin de mediadores desde mastocitos y basfilos. Otros estudios
ms amplios con basfilos y mastocitos sensibilizados In vitro con protenas de mielo
ma IgE o con anticuerpos especficos IgE han mostrado que la formacin de puentes de
receptores IgE ocupados por antgenos multivalentes o por anticuerpos anti-lgE in
tactos o sus fragmentos F(ab')^ desencadena la liberacin de histamina. pero hapte
nos univalentes o fragmentos Fab de anticuerpos anti-lgE no. La importancia de l
a formacin de puentes de receptores tambin se ha demostrado por estudios llevados
a cabo con anticuerpos obtenidos de F Rl. Los anticuerpos intactos de F Rl causan
la liberacin de histamina. pero los fragmentos Fab no. Tomando en conjunto estos
resultados se propone que los puentes entre los receptores adyacentes son impor
tantes en la iniciacin de la liberacin de histamina (Siraganian. 1975). De acuerdo
con la "hiptesis puente", los anticuerpos IgE juegan un papel pasivo en la produ
ccin de la liberacin de mediadores vasoactivos. La seal inicial para la liberacin de
mediadores est proporcionada por los puntes cruzados de F Rl por un alrgeno multiv
alente, con IgE sirviendo como puente.
u
A pesar de los ensayos en los sistemas modelo, las criticas rutas moleculares qu
e siguen al puente de F.,. Rl y que permiten la liberacin de histamina de las clul
as sensibilizadas no estn bien definidas. Con respecto a este tema, es suficiente
mencionar que la sealizacin transmembrana mediada por F Rl en los mastocitos y ba
sfilos probablemente implica vanos pasos, incluyendo la movilizacin de Ca-' desde
los depsitos intracelulares y desde fuentes extracelulares a travs de la formacin d
e canales de Ca ; activacin de protenas aglutinadas de guanosin-trifosfato (GTP) un
idas a molculas de F , Rl, que permiten la activacin de protenas cmasas y metil-tra
nslerasas unidas a F,., Rl; activacin de adenil ciclasa con el aumento de la prod
uccin intracelular del adenosin monofosfato cclico; e hidrlisis de fosfolpidos que c
ontienen inositol por activacin de fosfolipasas A, y C, que generan diacil-glicer
ol y, seguido de nuevas hidrlisis, cido araquidnico (Bradlord, 1998).
Q : c
Figura 46-2. La estructura de la IgE humana.

Estos pasos son importantes por dos razones: muchas seales son importantes para l
a liberacin de mediadores desde los mastocitos y basfilos. y el tratamiento farmac
olgico de las enfermedades alrgicas a menudo implica el uso de frmacos que interfie
ren con estos mecanismos de sealizacin. Por ejemplo, la cromolma usada en el trata
miento de asma interfiere con la liberacin de mediadores desde los mastocitos blo
queando la formacin de canales de Ca^, y los corticoides interfieren con la sealiz
acin mediada por F Rl inhibiendo la hidrlisis de fosfolpidos mediada por la enzima
(Mazeruk. 1984). Adems, se sabe que el cido araquidnico liberado por los basfilos y
mastocitos tras la activacin de las fosfolipasas celulares es el sustrato para la
s enzimas de las rutas metablicas 5-lipoxigenasa y ciclo-oxigenasa, que conducen,
respectivamente, a la sntesis y secrecin de mediadores de inflamacin leucotrienos
y prostaglandinas (Fig. 46-3) (Lewis, 1981). El leucotrieno B.,. y prostaglandin
a D producen el movimiento de leucocitos, incluyendo eosindlos. y ellos estimulan
la agregacin, liberacin enzimtica. y generacin de superxido en los neutrfilos. Los l
ucotrienos C , D y E, son liberados por muchos tipos de clulas, incluyendo mastoc
itos pulmonares, perifonales y de la mdula sea, y leucocitos macrfagos. eosinfilos y
basfilos. Estos mediadores causan broncoconstriccin. aumentan la permeabilidad vas
cular en vnulas poscapilares y aumentan la secrecin de moco. Estos
u ? 4 ;

CAPTULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS
1019
Figura 46-3. Metabolismo del cido araquidnico por las rutas de 5-lipoxigenasa y ci
clooxigenasa.
tambin pueden mediar la prdida reversible de capacidad pulmonar observada en el as
ma humano. Desde el punto de vista molar, los leucotrienos son muchas veces ms po
tentes que la histamina. siendo estos los principales mediadores de los efectos
inflamatorios que caracterizan las reaccionas de hipersensibilidad inmediata (Sa
muelsson, 1983). Otro mediador lpido de la inflamacin, llamado factor activador pl
aquetario (PAF). es un sustituto derivado del glicerol generado a partir de fosf
olpidos tras la activacin celular. El PAF produce anafilaxia cuando se administra
en pequeas dosis a animales, y el anlogo en humanos se cree que es liberado por ne
ulrfilos y macrfagos alveolares. Los efectos biolgicos del PAF que ocurren durante
la anafilaxia incluyen la agregacin y degranulacin de plaquetas, contraccin del mscu
lo liso y aumento de la permeabilidad capilar (Barnes, 1988).
preciso de enfermedad alrgica o decidir un solo rgimen teraputico determinado en el
campo prctico. En nios y adultos, la hipersensibilidad inmediata puede ser el pri
mer mecanismo de la enfermedad o un factor contribuyente; y mientras que en el c
ampo prctico es posible establecer un diagnstico de presuncin de una enfermedad alrg
ica, a menudo el diagnstico definitivo y el tratamiento requieren de la identific
acin inequvoca del alrgeno(s) en particular. Esto es particularmente importante en
casos de enfermedad alrgica grave que se produce en individuos sin un antecedente
atpico o un antecedente familiar de enfermedad alrgica. La palabra atopia (o atpic
o) se utiliza sobre todo en la bibliografa mdica de la alergia para referirse a lo
s individuos con una historia familiar de enfermedad alrgica que tienen sensibili
dad demostrable a una variedad de alrgenos. Estos individuos se incluyen aqu por t
ener un fenotipo alrgico. Los individuos no atpicos pueden tambin sufrir enfermedad
es alrgicas y pueden desarrollan clnicamente reacciones de hipersensibilidad inmed
iata significativas a alrgenos que se encuentran repetidamente en su entorno. L a
caracterstica que distingue a los individuos atpicos es su tendencia a desarrolla
r sensibilidad a una variedad de alrgenos encontrados en condiciones ambientales
rutinarias (Hoekelman. 1974). La atopia clnica existe asociada a la normalidad. N
o se puede explicar la utilidad de las pruebas de laboratorio en el diagnstico y
tratamiento de las enfermedades alrgicas sin mencionar las pruebas n vivo de la hi
persensibilidad inmediata, particularmente la prueba cutnea y las pruebas de prov
ocacin rgano-especificas. Histricamente, se consideraban las pruebas in vivo como u
n criterio de diagnstico preciso y fiable. La capacidad de reproducir una reaccin
alrgica especfica por un mecanismo in vivo todava se considera por muchos alerglogos
como la tcnica ms sensible para demostrar la presencia de hipersensibilidad inmed
iata y para definir su especificidad. Las pruebas cutneas se realizan por la inye
ccin inlradrmica y por los mtodos de pinchazo cutneo (Bousquet, 1993). La respuesta
a la inyeccin intradrmica de un extracto alrgeno se grada determinando el dimetro del
grano y por la reaccin eritematosa inmediatamente despus de la inyeccin. Una reacc
in con 1+ se corresponde con un grano de 5 mm a 10 mm. Una respuesta de esta magn
itud habitualmente se considera como evidencia de una sensibilidad especfica a un
alrgeno. Los individuos altamente sensibles a menudo desarrollan granos de dimetr
os mayores de 15 m m con seudpodos. Las pruebas cutneas realizadas mediante un pin
chazo utilizan un alrEVALUACIN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALRGICAS
La enfermedad alrgica es un problema de salud pblica significativo. Como antes se
coment, ms del 20% de los adultos sufren alguna de las formas crnicas de la enferme

dad alrgica. Como muchos individuos atpicos desarrollan alergias durante la infanc
ia, la prevalencia de enfermedades alrgicas en nios proporciona otra estimacin de l
a magnitud de la totalidad de este problema mdico. El asma afecta aproximadamente
al 5% de los nios en edad escolar, y otras enfermedades alrgicas menos incapacita
ntes como la rinitis alrgica y el eczema, afectan aproximadamente un 15% y un 5%
de los nios, respectivamente. Segn una revisin, las enfermedades alrgicas menores af
ectan a casi el 40% de todos los nios de Estados Unidos. De forma rutinaria los md
icos apenas utilizan unas pocas pruebas de laboratorio para la evaluacin de enfer
medades alrgicas. Las pruebas para proteina IgE y para anticuerpos IgE alrgenos es
pecficos son los pilares. Antes de tratar los detalles de estas pruebas, es impor
tante apuntar que la utilidad de cada prueba viene determinada por el contexto c
lnico en el que se aplica. En el campo de la alergia clnica, las pruebas para prot
ena IgE y anticuerpos IgE se piden principalmente para el diagnstico y menos frecu
entemente para la valoracin pronostica, o como una ayuda en el tratamiento teraput
ico. L a utilidad de los resultados de la prueba en cada situacin est determinada
empricamente por si es difcil o no establecer un diagnstico

1020
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA 12.0(M)

geno exaclo ms concentrado, a concentraciones 1.000 veces superiores a las utiliz
adas en las pruebas intradrmicas. y su gradacin a menudo se omite. El dimetro medio
del grano en milmetros se apunta como un indicador del grado de sensibilidad. Se
puede obtener una estimacin ms cuantitativa de la sensibilidad a un determinado a
lrgeno mediante una tcnica de ajuste final. Esta tcnica es una modilicacin de los mto
dos mtradrmicos y de pinchazo cutneo. De forma senada se utilizan diluciones con 1
0 veces el extracto alrgeno estandarizado empezando con la solucin ms diluida. El o
bjetivo de la sensibilidad se define como la mayor dilucin que produce una reaccin
1+. Las pruebas de provocacin a determinados rganos son tiles en la prctica clnica y
con propsitos de investigacin. Las adaptaciones de esta tcnica incluyen la prueba
de provocacin bronquial en el diagnstico de asma: la prueba de provocacin rinoconju
ntival en el diagnstico de rinitis alrgica: la eliminacin de comida y prueba provoc
acin en el diagnstico del asma inducido por comida, urticaria y malabsorcin: y la p
rovocacin de una picadura en el diagnstico de sensibilidad anafilctica al veneno de
insectos (Naclerio. 1993). La aplicacin de pruebas de provocacin en situaciones c
lnicas rutinarias est limitada por la necesidad de un alrgeno exlrado bien caracteri
zado de potencia definida y por el nmero limitado de alrgenos que pueden ser proba
dos en un individuo en una nica ocasin. Como ejemplo, la eliminacin de comida y pro
cedimientos de provocacin que requieren de perodos de abstinencia de varios dias.
durante los cuales el consumo inadvertido de un alimento determinado puede inval
idar la prueba. Un obstculo importante para el diagnstico exacto en el campo de la
alergia clnica es la falta de extractos de alrgeno disponibles de potencia unifor
m e y composicin definida (Bousquet, 1995). Salvo en ejemplos seguros, como las c
onocidas hierbas, cspedes, caros y mohos, los constituyentes qumicos que provocan r
eacciones alrgicas no estn caracterizados para muchos alrgenos reconocidos. A pesar
de los esluerzos de los fabricantes por producir materiales estandarizados, a m
enudo los diferentes lotes del mism o alrgeno varian en potencia por apenas una s
ene de medidas. Se han utilizado diversas tcnicas para cuantificar la potencia de
alrgenos en el uso clnico, incluyendo medidas del contenido de nitrgeno de protenas
, pruebas cutneas de ajuste especfico, anlisis inmunoquimicos con antisuero animal
especfico, e inhibicin de la aglutinacin de anticuerpos IgE especficos por alrgenos s
olubles m w'fro (Gleich. 1974). La inhibicin de la aglutinacin de anticuerpos IgE
especficos por alrgenos en solucin acuosa es un mtodo excelente para comparar extrac
tos de alrgenos. La potencia de un extracto alrgeno est inversamente relacionada co
n la dosis de alrgeno soluble requerida para inhibir la aglutinacin de los anticue
rpos IgE en un control positivo de suero a una cantidad fija de alrgeno ajustado
en fase slida. La semejanza cualitativa y antignica de los diferentes lotes de alrg
eno y la cantidad de alrgeno presente se pueden estimar comparando las pendientes
y ED, de las curvas dosis-inhibicin. Los diferentes lotes de alrgenos que contiene
n la misma mezcla cualitativa de constituyentes alergnicos provocan lineas dosisinhibicin paralelas cuando el porcentaje de inhibicin se traza frente a la dosis d
e un extracto alrgeno soluble. El mtodo de inhibicin in vilro es til para comparar l
a potencia y las caractersticas antignicas tanto de alrgenos puros como de mezclas.
pero la habilidad de detectar pequeos cambios de concentracin en el rango de 0,5 a
4 U /mi disminuye comparada con concentraciones ms elevadas (Fig. 464). Se han r
ealizado numerosos estudios clnicos de las concentraciones de IgE en suero en suj
etos sanos (no alrgicos). En todos los estudios, hay tendencias estrictas en el d
esarrollo de niveles de IgE con la edad y con distribuciones de frecuencia de co
ncentraciones de IgE observadas en adultos sanos sin tener en cuenta los mtodos a
nalticos (Homburger. 1986). La distribucin de la frecuencia de las concentraciones
de IgE en adultos sanos se angula positivamente con los lmites de percentil 95 y

con un nmero exagerado de valores baios de IgE. Al calcular el percentil 95 de l

os limites normales, la mayora de los investigadores han tratado sus datos con tr
ansformacin logartmica, produciendo por lo tanto lmites superiores a lo normal que
son al parecer muy elevados cuando se comparan con las medias aritmticas (Barbee.
1981). Como se comentar ms tarde, estos limites superiores de lo normal sirven pa
ra reducir la sensibilidad diagnstica de la prueba de IgE en suero como una prueb
a de despistaje clnico de alergia cuando el lmite superior al normal se usa como v
alor de corte. La sntesis de IgE en el feto humano se produce incluso a las 11 se
manas de gestacin en el tejido fetal pulmonar y heptico, aunque el cordn umbilical
contiene IgE virtualmente no detectable. La concentracin media del cordn umbilical
es menor de 1 U/ml (Kimpen. 1989). Las concentraciones de IgE en el suero mater
no y en el cordn umbilical no se correlacionan, indicando que no hay paso placent
ario apreciable de IgE materna. La existencia de anticuerpos IgE especficos para
la leche de vaca en el cordn umbilical, pero no en el suero materno, indica que p
uede existir una sensibilizacin intrauterina y apoya la conclusin de que la protena
IgE detectada en el cordn umbilical tiene un origen fetal. Las concentraciones d
e IgE en suero de nios aumentan lentamente c o n el desarrollo o alcanzan los niv
eles adultos aproximadamente a los cinco a los siete aos de edad (Homburger, 1986
a). Varios estudios clnicos han mostrado un promedio un tanto ms alto de la concen
tracin de IgE en suero en nios de edades entre los 10 y los 14 aos que en adultos d
e 20 aos. El significado clnico de este descubrimiento no est claro. No se han obse
rvado diferencias entre los niveles de IgE en nios y nias de edades similares. En
individuos mayores de 70 aos de edad, hay una tendencia a un promedio de niveles
de IgE ms bajo que en los adultos jvenes menores de 40 aos de edad. La determinacin
de la proteina IgE en suero ha sido evaluada a fondo por su utilidad clnica en el
diagnstico de vanas enfermedades alrgicas, por su valor predictivo como un indica
dor de la probabilidad del desarrollo de enfermedad alrgica en bebs y nios asmtomlic
os. y como indicador pronstico en adultos con algunos tipos de enfermedad alrgica
crnica. La determinaProtena IgE: mtodos de determinacin, valores normales y utilidad clnica
Existen una variedad de mtodos inmunoquimicos disponibles comercialmente para det
erminar el IgE en suero, incluyendo desplazamiento competitivo e inmunoanlisis sa
ndwich y nefelometra (Homburger. 1993). Los mtodos n o isotpicos son los ms populare
s. Cada uno de estos inmunoanlisis es capaz de detectar IgE en suero a concentrac
iones tan bajas como 0,5 U/ml (1,2 ng/ml). Los mtodos sandwich de inmunoanlisis ut
ilizan una aproximacin analtica comn; un anticuerpo anti-lgE policlonal o monoclona
l, unido covalentemente a una fase slida, se incuba con una proporcin de suero o e
stndar, y la IgE unida se detecta mediante incubacin con el anticuerpo anti-lgE ma
rcado, purificado de afinidad, o monoclonal. La concentracin de IgE en muestras d
e suero se calcula comparndola con una curva estndar. L a mxima sensibilidad analtic
a se consigue en el rango de 7,5 a 50 U IgE /mi. Las concentraciones menores pue
den determinarse por mtodos sandwich.

CAPTULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS
1021
cin de IgE tambin es valiosa en la valoracin de pacientes en los que se sospecha qu
e puedan tener enfermedades de inmunodeficiencia. enfermedades parasitarias o el
raro sndrome hiper-lgE. El sndrome hiper-lgE fue descrito primero en 1972 por Buc
kley y col., que publicaron dos casos de pacientes con niveles altamente elevado
s de IgE en suero, dermatitis difusa, furunculosis recidivante y neumona con neum
atoceles secundarios a Staphylococcus aureus. Las publicaciones posteriores de p
acientes con este trastorno definen este sndrome clinico: las elevaciones de los
niveles de IgE en suero son extremas (de 2.000 a 50.000 U / mi), y los pacientes
tienen eosinofilia en sangre y tejidos y un habn fuertemente positivo inmediato
y reacciones enlematosas a alrgenos inhalados, plenes, alimentos, y antgenos bacter
ianos y de hongos. A pesar de estos descubrimientos, el asma no es comn en pacien
tes con el sndrome hiper-lgE (Buckley, 1978). La sntesis de IgE, como se refleja e
n los niveles de suero, se ha estudiado en pacientes con un sinfn de enfermedades
nmunodeficientes primarias Se han descrito niveles elevados de IgE asociados con
deficiencias incompletas de la inmunidad celular, incluyendo el sndrome de Wisko
tt-Aldrich, sndrome parcial DiGeorge y alinfoplasia timica (sndrome de Nezelof) (B
uckley. 1975). Las inmunodeficiencias en las que hay ausencia completa de sntesis
de mmunoglobulinas G, A y M, como la enfermedad inmunodeficienle aguda (SCID),
muestran caractersticamente una disminucin de la sntesis de IgE y niveles de IgE ma
rcadamente disminuidos en suero. Los niveles de IgE en suero son variables en pa
cientes con deficiencia de IgA: los pacientes con ataxia telangiectasia tpicament
e tienen niveles disminuidos, pero los pacientes con deficiencia aislada de IgA
pueden tener niveles normales o moderadamente aumentados (Buckley, 1975). La enf
ermedad alrgica no es comn en pacientes con inmunodeficiencias, a excepcin de los i
ndividuos con deficiencia de IgA selectiva que tienen niveles de IgE elevados en
suero. La sntesis elevada de IgE en pacientes con sndrome hiper-lgE o con deficie
ncias parciales de inmunidad celular posiblemente manifiestan una secrecin de IgE
aumentada producida por los linfocitos B que escapan del control regulador de l
os linfocitos T. La infiltracin parasitaria del tracto gastrointestinal o rganos p
arenquimatosos estimula intensamente la sntesis de IgE, y los estudios de laborat
orio con animales sugieren que los anticuerpos IgE especficos son importantes en
la defensa del husped frente a parsitos como el Nippostrongylus brasillensis y Sch
istosoma mansoni (Mulligan, 1965). Las concentraciones de IgE en suero superiore
s a 1.000 U/ml se encuentran de forma habitual en nios en reas de infestacin endmica
con parsitos. Se sabe que existen otras enfermedades parasitarias asociadas a ni
veles de IgE en suero aumentados, incluyendo la larva visceral migratoria (Toxoc
ara cams), capilariasis intestinal (Capillana philippinensis). esquistosomiasis.
anquilostomiasis y equinococosis. En pacientes con enfermedad parasitaria intes
tinal, se han evidenciado niveles de IgE en suero disminuidos considerablemente
despus de seguir un tralamienlo exitoso con frmacos antiparasitarios. Al revisar l
a utilidad de los niveles de IgE en suero como prueba diagnstica para la enfermed
ad alrgica, es importante tratar su uso en nios y adultos por separado. Los nivele
s de IgE en suero elevados al nacer o durante la
lactancia sucede a menudo antes del desarrollo de la alergia clnica (Kjellman, 19
84). Se observaron niveles de IgE en suero por encima del percentil 95 para la e
dad en el 75% de los nios con antecedentes de ambos padres de enfermedad alrgica;
y entre los nios sanos con niveles de IgE mayores de 1 SD por encima de la media
para una edad determinada, la incidencia de desarrollo de enfermedad alrgica dura
nte los siguientes 18 meses aumentaba en 1 0 veces ms en comparacin a un grupo con
niveles de IgE ms bajos. Aunque prevn el desarrollo de una futura enfermedad alrgi
ca, estos datos aportan relativamente poca informacin sobre cmo basar decisiones c

lnicas especificas. El diagnstico de enfermedad alrgica en los laclantes es complic

ada debido a que la rinorrea es la manifestacin ms comn de alergia en este grupo de
edad, pero las infecciones respiratorias son comunes durante la lactancia y pue
de ser imposible distinguirlas de la rinitis alrgica en la prctica clnica. Sin emba
rgo, como la enfermedad alrgica de inicio precoz parece estar asociada con manife
staciones clnicas ms agudas, es importante establecer el diagnstico de alergia lo a
ntes posible {vase ms adelant). El valor principal de las determinaciones de IgE en
nios parece ser la alerta para el mdico de una posible enfermedad alrgica cuando e
l diagnstico clnico de sospecha es diferente. Los niveles de IgE en suero superior
es a 20 U/ml en estos casos apoyan el diagnstico de enfermedad alrgica, pero un ni
vel normal de IgE no excluye el diagnstico de enfermedad alrgica durante la infanc
ia o en la vejez. Los resultados de otras pruebas diagnsticas, incluyendo pruebas
para anticuerpos IgE, pueden tomarse en consideracin en el diagnstico de exclusin
de enfermedad alrgica. En esas situaciones clnicas donde los signos de enfermedad
alrgica son inequvocos, por eiemplo eczema y rinitis en un nio con antecedente fami
liar de atopia, el nivel de IgE en suero proporciona una pequea informacin adicion
al. La situacin es bastante similar en nios mayores. La determinacin de la protena I
gE en suero tiene una sensibilidad diagnstica limitada para la enfermedad alrgica
cuando el limite superior del rango normal se utiliza como una cota diagnstica. E
n general, los nios con hipersensibihdad a varios alrgenos diferentes y mltiples en
fermedades alrgicas presentan niveles en suero elevados, y aquellos con hipersens
ibilidad a menos alrgenos y afectacin limitada a un rgano a menudo tienen niveles n
ormales (Berg. 1969). Este detalle se ilustra en los datos de la Tabla 46-3. La
sensibilidad diagnstica es mayor en pacientes con sensibilidad clnica a un numero
de alrgenos diferentes. En nios atpicos, la presencia de enfermedad cutnea y manifes
taciones gastrointestinales aumenta la probabilidad de que los niveles de IgE en
suero estn elevados (Havnen, 1973). Tambin h a y evidencias que apuntan que la fr
ecuencia de los niveles elevados de IgE en suero es mayor en nios con hipersensib
ilidad a los alimentos y a alrgenos del polen que en nios con hipersensibilidad a
alrgenos de polvo o moho (Berg. 1969). Los nios con enfermedad alrgica que afecta a
varios rganos tambin suelen tener elevaciones en IgE en suero de mayor magnitud q
ue aquellos con enfermedades ms limitadas; las elevaciones extremas ocurren ms a m
enudo en pacientes con manifestaciones cutneas. La especificidad diagnstica de un
nivel elevado de IgE para la enfermedad alrgica es excelente. La asociacin es tan
fuerte, que los
Tabla 46-3
Incidencia de c o n c e n t r a c i o n e s e l e v a d a
en n i o s alrgicos de e d a d e s de d o s a 16 a o
a c i o n e s d e e n f e r m e d a d e s alrgicas de
0 75 de nios con IgE en suero e l e v a d o 3 13 41 46
en suero elevado (%) 14 39 58 61 50 84

s de IgE en s u e r o
s con diferentes c o m b i n
n i o s en cada grupo 33 7
12 13 11 Incidencia de IgE

Diagnostico Slo asma Asma y rinoconjuntivitis Asma y dermatitis atpica ms otras enf
ermedades de hipersensibilidad Asma y urticaria ms oirs enfermedades de hipersensi
bilidad Asma y urticaria y dermatitis atpica ms otras enfermedades de hipersensibi
lidad Asma y alergia gastrointestinal ms otras enfermedades de hipersensibilidad

1022
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
nios asinlomlicos con niveles elevados de IgE a veces se califican como prealrgicos
, asumiendo que desarrollarn signos de alergia clnica en el futuro. La determinacin
de la proteina IgE en suero tiene una utilidad diagnstica moderada en la mayoria
de los adultos con sospecha de padecer una enfermedad alrgica. Los resultados de
estudios clnicos de alergia respiratoria adulta indican que aproximadamente el 5
0% de los adultos con asma extrnseca y menos del 5% de adultos con la denominada
asma intrnseca (no atpica) tienen elevados niveles de IgE en suero (Wittig. 1980).
Los adultos asmticos con hipersensibilidad a un nmero limitado de alrgenos habitua
lmente tienen niveles normales. Los mayores niveles de IgE en adultos caractersti
camente ocurren en aquellos pacientes con hipersensibilidad a diversos alrgenos y
combinaciones de asma, dermatitis atpica y rinitis. Al igual que en los nios, la
sensibilidad diagnstica limitada de los niveles de IgE en suero limita la utilida
d clnica de las determinaciones de IgE en aquellas situaciones donde el diagnstico
de enfermedad alrgica es ms incierto (Klink, 1990). Esto no quiere decir, sin emb
argo, que la IgE en suero no pueda determinarse en estos casos, pues un nivel el
evado tiene un alto valor predictivo de enfermedad alrgica. Los niveles de IgE en
suero han recibido una atencin particular en nios y adultos con dermatitis atpica.
Los mecanismos relacionados con la patognesis de la dermatitis atpica se desconoc
en por completo, pero el descubrimiento de niveles m u y altos de IgE en la mayo
ra de los pacientes con dermatitis atpica y enfermedad activa ha provocado diversa
s investigaciones de la relacin entre la actividad de la enfermedad y los niveles
de IgE. Aunque no hay un consenso, algunos estudios indican que las fluctuacion
es en la gravedad de las manifestaciones cutneas paralelas cambian anlogamente al
nivel de IgE en suero (Wuthrich. 1978). Las relaciones causales, si existen, per
manecen ocultas. La aspergilosis broncopulmonar alrgica tambin se asocia a una mar
cada elevacin del nivel de IgE en suero. Esta enfermedad ocurre tpicamente en paci
entes con asma extrnseca, generalmente de larga duracin. Los niveles de IgE en sue
ro estn elevados en casi todos los pacientes con aspergilosis alrgica cuando exist
e una infiltracin pulmonar aguda, pero los niveles de IgE pueden fluctuar conside
rablemente durante el curso de la enfermedad. Un nivel normal de IgE en un pacie
nte con enfermedad pulmonar activa excluye prcticamente este diagnstico (Imbeau, 1
978).
de estas caractersticas, la prueba de liberacin de histamina leucocitaria presenta
aplicaciones limitadas en la prctica clnica. Aproximadamente el 15% de los indivi
duos tienen leucocitos que no liberan histamina in vitro. Aunque se han desarrol
lado sistemas automatizados para la determinacin de histamina, este anlisis es incm
odo de realizar y caro. La prueba requiere de clulas sanguneas frescas y slo se pue
den analizar un nmero limitado de alrgenos utilizando una muestra nica de sangre. A
ctualmente, la prueba de histamina liberada se utiliza ms en investigacin que en l
a prctica clnica. La prueba de anticuerpo IgE. inicialmente conocida como prueba r
adioalergoabsorcin (RAST), es un inmunoanlisis sandwich anlogo en principio a la pr
ueba de Coombs indirecta. Se mezcla la muestra de suero en la que se quieren det
erminar los anticuerpos IgE con un alrgeno unido a un material en fase slida. Desp
us de la incubacin inicial, los componentes que no son anticuerpos se retiran, y e
l alrgeno inmunoabsorbente se incuba en una segunda fase del anlisis con anticuerp
os anti-lgE monoclonales o cromalografia marcada purificada. Los anticuerpos IgE
especficos fijados en la primera fase del anlisis se detectan con anticuerpos ant
i-lgE marcados unidos a la fase slida del complejo alrgeno (Gleich. 1975). Las con
centraciones reales de anticuerpos IgE no se determinan con precisin con estas tcn
icas. En el suero de algunos individuos alrgicos, las concentraciones de anticuer
pos IgE exceden la capacidad aglutinante de los alrgenos inmunoabsorbentes, y los

sobrenadantes incubados en la primera fase contienen cantidades residuales de a

nticuerpos IgE especficos. En un rango un tanto limitado de concentraciones, la a
glutinacin de anticuerpos en la segunda fase incrementa en proporcin directa a la
concentracin de anticuerpos IgE en suero y se puede obtener alguna cuantificacin.
Sin embargo, la aglutinacin final refleja cantidades y afinidades de los anticuer
pos presentes (Schellenberg, 1975). Como inicialmente describieron Wide y col. (
1967). la prueba del anticuerpo IgE empleaba alrgenos unidos covalentemente a got
as de Sephadex. Una variedad de otros materiales de fase slida se han utilizado c
on posterioridad, incluyendo partculas de celulosa, gotas de agarosa. discos de f
iltro de papel y placas de microttulaciones de poliestireno. Muchos de estos mate
riales de soporte pueden activarse qumicamente a formas intermedias lbiles que rea
ccionan con alrgenos en solucin acuosa para formar inmunoabsorbentes unidos covale
ntemente. La aglutinacin de alrgenos en las placas de microttulaciones se realiza p
or absorcin no covalente. Para la aplicacin clnica, la fase slida alrgeno inmunoabsor
bente puede contener todos los constituyentes alergnicos presentes en el extracto
alrgeno liquido, en las mismas proporciones que el extracto alrgeno original. Aun
que es posible controlar la unin de todas las protenas a inmunoabsorbentes, existe
n pocos datos disponibles para determinar si todas las protenas alergnicas relevan
tes se han fijado a algunos sistemas alergnicos clnicamente importantes. Existe un
amplio rango de alrgenos disponible para la prueba de anticuerpo IgE. Es posible
adquirir los reactantes en kits o se puede enviar el suero a un laboratorio de
referencia para su anlisis. Las diversas clases de alrgenos disponibles incluyen e
pitelio animal; alimentos; plenes de rboles, cspedes y hierbas; mohos; hongos: vene
nos de insectos; frmacos; y alrgenos ocupacionales. La mayora de las drogas son com
puestos de bajo peso molecular que no pueden fijarse fcilmente en una fase slida p
or los mtodos qumicos habituales. Algunas drogas macromoleculares, como la insulin
a, pueden unirse para producir reactivos satisfactorios. En el caso de la penici
lina, el grupo peniciloil puede conjugarse a la polilsina o a la proteina transpo
rtadora, que as puede fijarse a una fase slida apropiada para utilizarse en la pru
eba de anticuerpo IgE (Wide, 1971). No hay reactantes anlogos disponibles para de
tectar anticuerpos IgE de los conocidos determinantes antignicos menores de penic
ilina, responsables de algunas reacciones anafilcticas agudas a esta droga. No ha
y un acuerdo unnime para notificar resultados de las pruebas de anticuerpos IgE.
Varios mtodos comerciales utilizan un sistema de puntuacin que obtiene los resulta
dos de las muestras de pacientes a partir de la comparacin con la curva dosis-res
puesta de referencia obtenida de u n a serie de diluciones de un control positiv
o (Fig.46-5). En un intento de maximizar la sensibilidad analtica de estos mtodos,
se consideran positivos aquellos resultados superiores a 0,35 KU/L (unidades Ki
lla por litro) estndar. La concentracin de anticuerpos IgE puede expresarse tanto
en K U/L
Anticuerpos IgE alrgeno-especficos: mtodos de determinacin, calificacin de resultados
, y utilidad clnica
Las pruebas cutneas y de provocacin a un rgano son procedimientos establecidos para
la deteccin de anticuerpos IgE in vivo, como se coment previamente. Tambin existen
mtodos in vitro para detectar anticuerpos IgE en suero y en los granulocitos basf
ilos; los mtodos principales son la prueba del anticuerpo IgE especfico y la prueb
a de liberacin de histamina leucocitaria, respectivamente. La prueba de liberacin
de histamina leucocitaria le descrita por primera vez hace ms de 50 aos. Los leucoc
itos aislados de sangre perifrica por sedimentacin de dextrano se lavan y se suspe
nden de nuevo en un tampn que contiene iones Ca y Mg \ Entonces, se aaden concentr
aciones variables de un extracto alrgeno a un nmero determinado de leucocitos lava
dos, y la mezcla se incuba a 37C durante una hora. La reaccin se para congelando l
os tubos a 4C, y las clulas se separan por centrifugacin. La histamina secretada po
r los basfilos como consecuencia de la interaccin del alrgeno con las clulas unidas
a anticuerpos IgE se libera en el lquido sobrenadante y se aisla por extraccin con
butanol ya cido. La concentracin de histamina en el extracto se mide de forma flu
oromtrica o por inmunoanlisis especfico. El procedimiento fluoromtrico. realizado ma
nualmente, detecta aproximadamente 1 ng de histamina. El mtodo de inmunoanlisis es
un poco ms sensible. Los resultados se expresan como un porcentaje del total de

histamina celular liberada; la histamina total se determina en los usados cidos d

e leucocitos no expuestos al extracto de alrgeno (Lichtenstein. 1964),
2, 2
Los resultados de la prueba de liberacin de histamina leucocitaria definen la esp
ecificidad de los anticuerpos IgE ligados a clulas e indican la integridad funcio
nal de los mecanismos mediadores de liberacin. A pesar

CAPTUIO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS
1023
2(1.0(10
do. Sin embargo, en la mayora de los esludios clnicos los resultados de las prueba
s de anticuerpo IgE se han comparado con los resultados de las pruebas de diagnst
ico in vivo y los antecedentes de enfermedad alrgica. Est claro segn estos estudios
que la sensibilidad diagnstica varia considerablemente dependiendo del tiempo tr
anscurrido desde la exposicin a un alrgeno y la prueba, la clase de alrgeno examina
do, la edad del paciente y los rganos diana afectados (Homburger, 1986a). En los
objetivos de este capitulo, es til considerar las siguientes aplicaciones clnicas
por separado: enfermedad respiratoria alrgica, alergia a alimentos, sensibilidad
al veneno de insecto y alergia a lrmacos u ocupacional. Como los anticuerpos IgE
asociados a clulas median en la enfermedad respiratona alrgica, es razonable tener
en cuenta los resultados de las pruebas de provocacin a un rgano especfico c o m o
un criterio para determinar la sensibilidad hacia un alrgeno determinado. Divers
os estudios en adultos con a s m a o rinitis alrgica han mostrado una excelente r
elacin general entre los resullados de pruebas de provocacin y las pruebas de anti
cuerpo IgE llevadas a c a b o con alrgenos inhalados, incluyendo plenes de rboles,
cspedes y hierbas, mohos y caros. Los resultados de las pruebas cutneas y pruebas d
e anticuerpo IgE tambin concuerdan en la mayora de los casos. La mayora de los resu
ltados discordantes fueron pruebas cutneas dbilmente positivas en pacientes con pr
uebas de anticuerpo IgE negativo (Wide, 1967). En nios con enlermedad alrgica, los
estudios epidemiolgicos recientes han aportado un secuencia de desarrollo de sig
nos y sntomas de enfermedad que se acompaan de una secuencia predecible de sensibi
lizacin a diferentes clases de alrgenos (Bergmann, 1997). Esta denominada marcha a
lrgica a menudo empieza con alergia a alimentos en nios menores de tres aos asociad
a a manifestaciones gastrointestinales y dermatitis atpica seguida de enfermedad
respiratoria incluyendo a s m a y rinitis causadas por sensibilidad a alrgenos in
halados. La secuencia de deteccin de anticuerpos IgE que es paralela al desarroll
o de manifestaciones clnicas avanza con la edad de la siguiente forma: los anticu
erpos IgE de protenas de alimentos especialmente huevo y leche se detectan primer
o sobre los tres aos de edad, luego anticuerpos de alrgenos inhalados, empezando c
on alrgenos internos incluyendo epitelio animal y caros de polvo sobre los cinco ao
s de edad; y al final de la infancia, los alrgenos inhalados externos incluyendo
plenes. El desarrollo de sensibilidades en esta secuencia tiene implicaciones obv
ias para las pruebas clnicas en nios. Entre los nios con enfermedad respiratoria alr
gica, los estudios clnicos han mostrado que los resultados de las pruebas de anti
cuerpo IgE y las pruebas de provocacin concuerdan en muchos casos. De nuevo, la m
ayora de los resultados discordantes se han observado en nios con pruebas de provo
cacin positivas hacia extractos alrgenos altamente concentrados. Se observ una conc
ordancia importante en nios con alergia moderada o aguda, y en nios con pruebas de
provocacin negativas. Como muestran estos resultados, la sensibilidad diagnstica
de estas pruebas de anticuerpo IgE hacia alrgenos inhalados varia directamente co
n la magnitud de sensibilidad clnica en pacientes con alergias respiratorias (Ber
g, 1974). Tambin es oportuno preguntarse si concuerdan bien los resultados de ant
icuerpo IgE con las pruebas cutneas en casos de sospecha de alergia respiratoria.
En los estudios previamente mencionados, si los resultados de pruebas cutneas re
alizados con el mtodo del pinchazo se utilizaron para definir la sensibilidad hac
ia un alrgeno, se obtuvieron muchos ms resultados discordantes. La prueba de antic
uerpo IgE fue negativa en pacientes con pruebas cutneas dbilmente positivas, pero
se obtuvieron resultados positivos casi en el 90% de los pacientes con pruebas c
utneas fuertemente positivas. En general, las mejores correlaciones se observaron
con alrgenos de polen y alrgenos purificados, mientras que se observaron menores

grados de correlacin con alrgenos de polvo y moho. Los partidarios de la prueba cu

tnea defienden que datos como stos indican que la prueba cutnea es un mtodo diagnstic
o ms sensible, mientras los partidarios de la prueba de anticuerpo IgE sealan que
un alto porcentaje de las pruebas cutneas dbilmente positivas no son validadas por
pruebas de provocacin positivas. El argumento es un tanto terico; cualquier mtodo
diagnstico es fiable en pacientes con sensibilidad marcada a un alrgeno y ninguno
es completamente fiable para identificar ligeras discordancias de sensibilidad c
lnica. En este ltimo caso, los dos mtodos pueden proporcionar informacin diagnstica c
omplementaria.
0.35 0,7
3.5
17,5
50 100
Concentracin (kU-1)
Figura 46-5. Curva dosis-respuesta para la determinacin de anticuerpos IgE por in
munoanlisis de enzima fluorescente comercial. FU = unidades fluorescentes.
como en clases numeradas del O al V o VI. La mayora de los mdicos estn ms familiariz
ados con los sistemas de puntuacin basados en clases. Sin tener en cuenta el sist
ema usado para expresar los resultados, debera tenerse en cuenta que la mayora de
los resultados son semicuantitativos. Los resultados dudosos o dbilmente positivo
s pueden deberse a la variabilidad analtica (Jacob, 1982). El suero con niveles d
e proteina IgE marcadamente elevados tambin pueden producir resultados falsos pos
itivos, debido a una unin incrementada no especfica de IgE. Este fenmeno habitualme
nte no ocurre a no ser que la concentracin de IgE exceda de 1.000 KU / L, lo que
puede ocurrir en pacientes con dermatitis atpica o enfermedades alrgicas mltiples.
Los resultados de falsos negativos causados por la inhibicin de la unin de anticue
rpos IgE puede ocurrir en algunos sistemas analticos debido a la competicin por lu
gares de unin a alrgenos por anticuerpos IgG. Estos anticuerpos tienen afinidades
similares a los anticuerpos IgE y habitualmente se encuentran en concentracin de
microgramo por mililitro en el suero de pacientes tratados con inmunoterapia alrg
ena (Paull. 1978). Como las determinaciones de anticuerpos IgE no son tiles en pa
cientes tratados para determinar si existe sensibilidad clnica residual, se entie
nde que este problema habitualmente ocurre cuando la prueba de anticuerpo IgE se
usa mapropiadamenle. La sensibilidad analtica de una prueba de anticuerpo IgE en
parte est determinada por el anticuerpo anti-lgE marcado utilizado en la segunda
fase del anlisis. Los anticuerpos anti-lgE comerciales con afinidad purificada y
marcados funcionan bien como protenas detectoras y permiten la determinacin de ca
ntidades en nanogramos de anticuerpos IgE especficos. Los anticuerpos anti-lgE mo
noclonales marcados tambin estn disponibles comercialmente. Las recomendaciones pa
ra el uso clnico de la prueba de anticuerpo IgE se basan en los resultados de est
udios clnicos donde los resultados de la sensibilidad del anticuerpo IgE fueron c
omparados con oirs pruebas diagnsticas. En algunos casos, la decisin de identificar
los alrgenos especficos responsables de los signos clnicos est moderada al saber qu
e la terapia no ser diferente si se identifican los alrgenos agresores. Este ltimo
punto es importante en muchos pacientes cuyo tratamiento est basado en el uso de
frmacos que inhiben la liberacin de mediadores inflamatorios, producen broncodilat
acin o suprimen la inflamacin. Sin embargo, en la mayora de los individuos alrgicos,
el conocimiento de los alrgenos agresores es clnicamente til para decidir qu tipo d
e alrgenos deben usarse en un rgimen de inmunoterapia, como en pacientes con rinit
is alrgica o sensibilidad al veneno de insectos, o para conseguir evitar un alrgen
o en casos de sensibilidad anafilctica a alimentos o frmacos. Es difcil definir la
sensibilidad diagnstica absoluta y especfica de los resultados de anticuerpo IgE p
orque no hay un mtodo de referencia umversalmente aceptado para definir la sensib
ilidad hacia un alrgeno determina-

1024
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Las pruebas para anticuerpos IgE tienen ciertas ventajas comparadas con las prue
bas cutneas. No presenta riesgo para el paciente, y los resultados no estn influid
os por tratamientos concomitantes con antihistamnicos o broncodilatadores. Adems,
la prueba de anticuerpo IgE puede ser mejor que la prueba cutnea en ciertos grupo
s de pacientes, como los bebs, pacientes con dermografismo o pacientes con dermat
itis generalizada. Tambin hay desventajas. La prueba serolgica es cara si se hace
indiscriminadamente, y los resultados no son inmediatos. Recientemente, la prueb
a de anticuerpo IgE multalrgeno realizada con inmunoabsorbentes que tienen ms de un
alrgeno acoplado a su superficie se ha mostrado que es una prueba de deteccin sis
temtica sensible y eficaz en coste para la alergia por inhalacin. Se necesitan nue
vos esludios para documentar la utilidad de esta prueba como una prueba de detec
cin sistemtica en otras situaciones clnicas (Ownby, 1984). Como se coment previament
e, la sensibilidad a alimentos sucede precozmente en nios atpicos y se manifiesta
con una variedad de signos clnicos en bebs, nios y adultos, incluyendo eczema y der
matitis, rinitis y broncoespasmo, angioedema, urticaria, y rara vez anafilaxia.
La determinacin de anticuerpos IgE puede ser til en estos casos, pero existen posi
bles riesgos al interpretar los resultados de estas pruebas que deberan conocerse
. En la determinacin total excepto de la sensibilidad anafilctica a determinados a
limentos, el uso de provocacin con un alimento a doble ciego se considera el diag
nstico estndar (Bock, 1980). Sin embargo, las pruebas para anticuerpos IgE son tile
s para seleccionar alrgenos para pruebas de provocacin a doble ciego y para confir
mar el antecedente. Los resultados IgE positivos se supone que son clnicamente si
gnificativos si los resultados estn apoyados fuertemente por la historia clnica. S
in embargo, a diferencia de las alergias por inhalacin, la incidencia de resultad
os falsos positivos (anticuerpos IgE a comida detectables no parece que se asoci
en a signos clnicos) es considerable, particularmente en nios. Los resultados de l
as pruebas de anticuerpo IgE pueden utilizarse para predecir los resultados de l
a prueba de provocacin a alimento (Sampson, 1997). Los resultados negativos rara
vez se asocian a provocacin a alimento positiva: mientras que los resultados fuer
temente positivos pueden evitar la necesidad de pruebas de provocacin. Se necesit
an nuevos estudios clnicos para definir los lmites apropiados para anticuerpos IgE
a diferentes alimentos. A menudo se considera la sensibilidad a alimentos en el
diagnstico diferencial de enfermedades cutneas, enfermedad gastrointestinal o enf
ermedad respiratoria en bebs y nios jvenes. Los anticuerpos IgE especficos a aliment
os ms comnmente encontrados en bebs y nios pequeos son para protenas alrgenas en la
he de vaca y al huevo. Las principales protenas alrgenas en la leche de vaca son l
a w.-lactalbmina, p-lactoglobulina, albmina bovina, y casena. La relacin entre los a
nticuerpos IgE haca estas protenas y las manifestaciones de la alergia a leche de
vaca est establecida, pero existen anticuerpos IgE mediles en muchos nios atpicos qu
e toleran la leche de vaca. La prueba de anticuerpos IgE a leche de vaca no pued
e establecer un diagnstico de intolerancia a la leche debido a mecanismos distint
os de la hipersensibilidad (Liebman, 1981). Los resultados de pruebas para antic
uerpos IgE son mucho ms especficos y tienen valores predictivos positivos mayores
en casos de sensibilidad anafilctica o angioedema causados por alrgenos alimentari
os, por ejemplo, alergia al pescado o a frutos secos. En un estudio publicado, l
os autores encontraron al menos un resultado de anticuerpo IgE positivo en el 10
0% de nios con sensibilidad anafilctica alimentaria, 96% de nios con asma, y 92% de
nios con angioedema. En estos casos, la prueba de anticuerpo IgE es ms til porque
la historia clnica a menudo incrimina a alimentos particulares como alrgenos (Hoff
man, 1974). La prueba de anticuerpo IgE se utiliza comnmente para investigar la e
specificidad de la sensibilidad a alrgenos alimentarios en pacientes con dermatit
is atpica. Como se cit anteriormente, las pruebas cutneas pueden ser imposibles de

realizar en pacientes con enfermedad cutnea difusa o dermografismo. La interpreta

cin de los resultados de las pruebas en pacientes con dermatitis atpica es complic
ada por el hecho de que estos individuos a menudo tienen asma y rinitis concomit
antes con elevaciones extremas de IgE en suero. En estos casos, no es infrecuent
e encontrar niveles bajos de anticuerpos IgE a una diversidad de alrgenos. Las es
pecificidades clnicamente importantes se definen por resultados positivos varias
clases superiores al
nivel inferior de resultados positivos. A menudo es posible definir la especific
idad del alrgeno en estos pacientes mediante un proceso minucioso de eliminacin al
imenticia combinada con una prueba de anticuerpo IgE. La prueba de anticuerpo Ig
E es til en el diagnstico de sospecha de sensibilidad a veneno(s) de himenptero. Lo
s individuos sensibles a los venenos de abejas de miel, abejas, avispones o avis
pas tpicamente manifiestan signos de anafilaxs despus de un picadura: despus puede p
roducirse urticaria, angioedema, broncoespasmo o colapso cardiovascular. La mort
alidad publicada por reacciones sistmicas inducidas por picadura es de 30 a 40 ca
sos anuales, pero esta cantidad probablemente subestima la incidencia real. La e
volucin natural de sensibilidad al veneno no tratada no se conoce completamente.
En muchos pacientes con sensibilidad anafilctica documentada, es posible obtener
una historia clnica de reacciones progresivamente ms graves a sucesivos episodios
de picadura. Por otro lado, la sensibilidad al veneno aparentemente mejora en al
gunos individuos. La decisin de tratar a un paciente con inmunoterapia al veneno
se basa en la evaluacin clnica del riesgo de anafilaxia en posibles picaduras futu
ras. El indicador ms fiable de la sensibilidad al veneno es la respuesla a u n a
provocacin con una picadura controlada (Parker, 1982). Sin embargo, generalmente
no se realiza esta prueba y raramente se requiere en pacientes previamente no tr
atados para establecer el diagnstico de sensibilidad al veneno. Las pruebas cutnea
s al veneno y pruebas de anticuerpo IgE son tiles para confirmar la impresin de qu
e existe sensibilidad clnica y para definir su especificidad. En esta situacin clni
ca, la mayora de los esludios indican que la prueba cutnea es la modalidad diagnsti
ca ms sensible (Sobotka. 1978). Las pruebas de anticuerpo IgE al veneno son tiles
ante todo para confirmar los resultados de pruebas cutneas y para definir la espe
cificidad alrgena de la hipersensibilidad al veneno. Excepto cuando se provoca la
picadura, no hay pruebas in vilro o in vivo que realmente anuncien la respuesta
clnica a una picadura de insecto en un paciente tratado despus de inmunoterapia a
l veneno. Aunque los niveles de anticuerpos IgG en suero aumentan marcadamente c
on la inmunoterapia al veneno, no se ha definido un nivel lmite que pueda utiliza
rse para identificar a los pacientes que ya no son de riesgo. Las estimaciones s
emicuantitativas de anticuerpos IgE no son tiles clnicamente, y los niveles de ant
icuerpos IgE despus de tratamiento muestran que no hay relaciones consistentes co
n el estatus clnico. Medidas de anticuerpos IgE han sido tambin aplicadas al diagns
tico de hipersensibilidad a frmacos. Aunque muchos frmacos y sus metabolitos son c
apaces de provocar la sntesis de anticuerpos, slo hay datos clnicos y resultados de
determinaciones de anticuerpo IgE disponibles para la penicilina y sus metaboli
tos. La penicilina y su ismero, el cido penicilinico, se combinan con protenas del
suero mediante uniones amidas. El conjugado peniciloil-protena es el mayor determ
inante antignco, y el conjugado cido penicilinico-proteina es el menor determinante
antignco (Fig. 46-6). Los niveles mediles de anticuerpos IgM e IgG especficos para
el determinante peniciloil se obtienen comnmente en pacientes tratados con penici
lina, y aunque persisten ttulos elevados de estos anticuerpos en plasma durante p
eriodos relativamente cortos, a menudo pueden detectarse ttulos inferiores despus
del tratamiento (Sheperd, 1991). Los intentos realizados en el diagnstico de hipe
rsensibilidad a la penicilina han contado con pruebas cutneas con penicilina, pen
iciloil-polilisina y una mezcla menor de antgenos. Los resultados positivos de pr
uebas cutneas ocurren infrecuentemente, especialmente cuando la prueba se realiza
mucho despus del tratamiento con penicilina. Menos del 30% de los pacientes con
posibles antecedentes de hipersensibilidad inmediata a la penicilina tienen prue
bas cutneas positivas, y las reacciones de hipersensibilidad inmediata a la terap
ia con penicilina son raras en pacientes con pruebas cutneas negativas. Cuando se
utilizan los resultados de las pruebas cutneas como una referencia diagnstica, lo

s estudios clnicos han encontrado anticuerpos IgE mediles al determinante penicilo

il casi en el 100% de los pacientes con pruebas cutneas positivas. Los anticuerpo
s antipeniciloil son indetectables en sujetos control. Segn estos datos, es razon
able recomendar las pruebas in vitro para anticuerpos IgE-peniciloil slo en pacie
ntes con antecedentes de reacciones de hipersensibilidad reciente. Los resultado
s falsos negativos pueden ocurrir inmediatamente despus de reacciones mediadas po
r IgE y, aunque la mayora de los datos

CAPITULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS
1025
Figura 46-6. Metabolitos de penicilina, determinantes antignicos mayor y menor. (
De Rose NR, De M a c a n o EC, Fahey JL. et al [eds: ManualotClinical Laboratoy I
nmunoiogy. 4' ed. Washington DC. A m e rican Society tor Microbiology, 1992, pg.
719. con autorizacin.)
publicados indican que los resultados falsos negativos son raros, la ausencia de
anticuerpos especficos de peniciloil-polilisina no excluye completamente la posi
bilidad de significado clnico de los anticuerpos IgE a otros metabolitos de penic
ilina (Weiss, 1988). Las enfermedades alrgicas, particularmente el asma, tambin pu
eden deberse a una gran variedad de alrgenos encontrados en el lugar de trabajo.
El asma puede resultar tanto de mecanismos alrgicos como no alrgicos. La lista de
agentes etiologicos relacionados con el asma alrgico ocupacional es larga e inclu
ye los siguientes: protenas animales, enzimas, protenas de plantas, legumbres, anhd
ridos, sales metlicas, tintes, diisocianuros y polvo de la madera. Existen prueba
s de anticuerpos IgE disponibles para varios de estos alrgenos. Recientemente, se
ha puesto una especial atencin en las gomas de ltex como un alrgeno en el cuidado
de la salud laboral y en ciertos pacientes, por ejemplo, pacientes con espina bi
fida que han sufrido diversos procedimientos quirrgicos. La prueba de anticuerpo
IgE a la goma de ltex es til para identificar individuos sensibles (Yunginger, 199
4). Para finalizar esta seccin respecto a la prueba de anticuerpo IgE. es apropia
do resumir algunos de los puntos principales marcados anteriormente. La determin
acin de anticuerpos IgE es til y puede recomendarse en las siguientes situaciones
clnicas: 1) la evaluacin de nios con un antecedente lamiliar de enfermedad alrgica i
mportante y signos clnicos de enfermedad precoces: 2) la evaluacin de nios y adulto
s sospechosos de tener enlermedad respiratoria alrgica para establecer el diagnsti
co y definir la especificidad de la sensibilidad alrgena a plenes, polvo, antgenos
fungios y alimentos: 3) para confirmar la expresin clnica de sensibilidad a aliment
os especficos en pacientes con sensibilidad anafilctica o con asma y angioedema: 4
) para evaluar la sensibilidad a alrgenos de veneno de insectos, particularmente
como una ayuda en la definicin de la especificidad de veneno en aquellos casos do
nde las pruebas cutneas sean confusas; 5) para confirmar el diagnstico de hipersen
sibilidad a la penicilina en pacientes con sensibilidad anafilctica; y 6) para co
nfirmar la presencia de anticuerpos IgE a ciertos alrgenos ocupacionales, por eje
mplo, goma de ltex. La prueba de anticuerpos IgE no es til como una prueba de dete
ccin sistemtica para enfermedad alrgica, excepto si se realiza por un mtodo analtico
multialrgeno; y los resultados no son tiles para evaluar los efectos de
la mmunoterapia o excluir el diagnstico de sensibilidad anafilctica a venenos de i
nsectos en pacientes tratados. Las pruebas para anticuerpos IgE estn indicadas slo
en pacientes a los que se les ha realizado una historia mdica y exploracin (sica c
ompleta.
Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediatas y para ant
icuerpos IgG alrgeno-especficos
Previamente, se han mencionado varios mediadores de reacciones de hipersensibili
dad inmediata, incluyendo la histamina y los mediadores lpidos llamados leucotrie
nos y factores activadores de plaquetas. Cada uno de estos mediadores causan inf
lamacin en enfermedades alrgicas humanas o en modelos animales de alergia y analil
axia. Estos mediadores inducen muchos de los efectos biolgicos caractersticos de l
as reacciones alrgicas A pesar de estos descubrimientos, las determinaciones de l
os mediadores en lquidos corporales tienen una utilidad limitada clnicamente en el
diagnstico diferencial de enfermedades alrgicas. Las determinaciones de histamina

en plasma u orina pueden ser vlidas en pacientes con analilaxia cuando las prueb
as se realizan inmediatamente despus del episodio anafilctico (Friedman, 1989), pe
ro se requiere tener cuidado para obtener una muestra apropiada. La hemolisis pu
ede provocar niveles de histamina falsamente elevados en la sangre y los aliment
os ricos en histamina o colonizacin bacteriana pueden conducir a niveles falsamen
te elevados en orina. Una prueba muy til en este entorno clnico es la determinacin
de triptasa en sangre (Schwartz, 1987,1989). La triptasa es una proteasa de suer
o de 1 3 4k D a formada por cuatro subunidades unidas no covalenlemente y se enc
uentra en mastocitos y granulocitos basfilos. La liberacin de triptasa desde las cl
ulas sensibilizadas provoca una relacin cruzada de anticuerpos IgE citofilicos. T
ras la anafilaxia, los niveles de triptasa en sangre aumentan rpidamente (30 minu
tos a 1 hora) y permanecen elevados durante 12 horas. Por comparacin, la histamin
a se aclara rpidamente de la sangre con una vida media de minutos. Los leucotrien
os y factores activadores de plaquetas se activan localmenle y se encuentran en
concentraciones mnimas en los lquidos corporales (Lewis, 1984).

1026
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Otra clase de mediadores de la inflamacin de inters en la alergia son los pptidos a
nafilatxicos del complemento. C3a. C4a y C5a. producidos durante activacin de la c
ascada del complemento (vase Cap. 38). El papel de estos pptidos como mediadores d
e la inflamacin en la enfermedad alrgica no est bien establecido. Las anafilatoxina
s humanas probablemente no se producen por interaccin del alrgeno y anticuerpos Ig
E. Sin embargo, como el C5a provoca la contraccin del msculo liso y aumenta la per
meabilidad vascular, hay razones para una nueva investigacin de las anafilatoxina
s complementarias como mediadores inflamatorios en sndromes de anafilaxia. Los an
ticuerpos del isotipo IgE sensibilizan basfilos humanos y mastocitos durante larg
os periodos de tiempo, al menos 24 horas, y estos anticuerpos median directament
e la liberacin de histamina inducida por antgeno. como se coment anteriormente. En
diversas especies de animales, los anticuerpos IgG de una o ms subclases tambin se
ligan a clulas efectoras y originan la liberacin de histamina. No est bien estable
cido el papel anlogo de los anticuerpos IgG humanos. Algunos datos experimentales
sugieren que los anticuerpos IgG humanos de la subclase lgG4 se ligan a leucoci
tos basfilos y pueden mediar en la liberacin de histamina, y a menudo la concentra
cin de la proteina lgG4 en suero se encuentra por encima de lo normal en adultos
con asma (Homburger. 1986b). Sin embargo, los estudios clnicos no han podido demo
strar un papel de la determinacin de la proteina lgG4 o anticuerpos lgG4 en el di
agnstico o evaluacin pronostica en pacientes con asma.
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CAPTULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS
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nhalion signal directly to h u m a n B cells for IgE production. JI m m u n o l

1990:146:1836

C A P T U L O
47
ai Diagnstico y tratamiento del cncer mediante marcadores tumorales serolgicos
James T. Wu, Ph.D.
NEOPLASIA Y REGULACIN DEL CRECIMIENTO TIPIFICACIN DE MARCADORES TUMORALES Respecto
a la proliferacin celular Respecto a la diferenciacin celular Respecto a las metst
asis Respecto a otros procesos asociados al tumor Respecto a la transformacin mal
igna Mutaciones heredadas
1028 1030
EFECTO DE LOS ANLISIS DISEADOS Unin competitiva Formato sandwich Anticuerpo monoclo
nal frente al policlonal Anticuerpo heterfilo MARCADORES TUMORALES PARTICULARES a
- fetoprotena Molculas de adhesin Factores angiognicos P -microglobulina
?
1036
1037
Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales especficos APLICACIONES CLNICAS
Examen colectivo Diagnstico Monitorizacin del tratamiento Deteccin de recidiva Prons
tico RECOMENDACIONES EN LA PETICIN DE MARCADORES TUMORALES Nunca se base en los r
esultados de una sola prueba Cuando se piden pruebas consecutivas, asegrese de pe
dir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de anlisis
Asegrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva est el
evado en el paciente antes de la ciruga Valore la vida media del marcador tumoral
cuando se interprete el resultado de la prueba Valore cmo se elimina o metaboliz
a el marcador tumoral desde la circulacin sangunea Trate de pedir mltiples marcador
es para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnstico Pida marcadores no
especficos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad Controle la posibil
idad de efectos falseados Controle la presencia de marcadores tumorales ectpicos
Existe un gran nmero de marcadores tumorales en la circulacin sangunea. Como el niv
el sanguneo de marcadores tumorales por lo general refleja el volumen de clulas tu
morales y la actividad tumoral. la determinacin de los marcadores tumorales en su
ero se ha convertido en un medio atractivo para la deteccin y el diagnstico de enf
ermedades neoplsicas. incluso para el control de su evolucin, especialmente durant
e el tratamiento La facilidad en la extraccin de sangre y la sensibilidad de esto
s anlisis de marcadores tumorales no invasivos tambin hace que las pruebas serolgic
as sean muy superiores respecto a otras exploraciones clnicas basadas en mtodos fsi
cos. 1031

CA19-9. CA50yCA19-5 CA125 CA15-3 CA 72-4 Calcitonina Antigeno carcinoembrionario

1033 Oncoprotena c-erbB-2 (HER-2/neu) Cromogranina A CYFRA21-1 Ciclinas Receptor
es de estrgeno y receptores de progesterona Gonadotropina corinica humana LASA-P E
nolasa neuronal especfica p53 Protena pS2 Hormona paratiroidea relacionada con ppti
dos Antgeno prosttico especfico PSA libre Carcinoma de clulas escamosas Antgeno polip
tido tisular BIBLIOGRAFA 1041
NEOPLASIA Y REGULACIN DEL CRECIMIENTO
Para aprender cmo identificar, seleccionar y utilizar marcadores tumorales para e
l diagnstico de cncer y para el tratamiento de pacientes con cncer, es imprescindib
le que uno est familiarizado con los fundamentos de los procesos neoplsicos (vase C
ap. 64). Es importante tener en mente que h a y dos importantes procesos involuc
rados en el crecimiento celular, diferenciacin y proliferacin. En clulas normales,
ambos procesos se encuentran bien

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO D E L CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIGICOS Tumor

-l marcadores inmorales
1029

Figura 47-1. Ilustracin de cmo la prdida de regulacin en c'ulas cancergenas genera di

erentes marcadores tumorales y cmo estos procesos tienen que v e rc o n las dos i
mportantes reacciones en el crecimiento celular.
regulados y bajo un estncto control. Cuando alguno de estos procesos pierde su r
egulacin, aumenta el riesgo para las clulas normales de convertirse en clulas tumor
ales (Fig, 47-1). De hecho, cada vez que se produce un crecimiento tisular nuevo
, es importante diferenciar entre dos posibles causas del nuevo crecimiento: hip
erplasia o neoplasia. La mayor diferencia entre estos dos procesos similares tam
bin se relaciona con el control del crecimiento La hiperplasa tiene un propsito til
y est controlado por estmulos, mientras que la neoplasia no est regulada y no sirve
a ningn propsito. Por tanto, se puede entender que la proliferacin no regulada es
una caracterstica fundamental de todas las clulas neoplsicas, sin reparar en si el
tumor es benigno o maligno. El resultado de la proliferacin incontrolada nos llev
ar a la formacin de una masa anormal de tejido, conocido como tumor. Seguidamente,
el tumor continuar creciendo de forma irregular incluso despus de retirar el
Figura 47-3. Ilustracin de cmo los tumores estn compuestos de clulas heterogneas. Cad
a tipo de clula puede producir un m a r c a d o r tumoral diferente. Los tumores
de diferentes tejidos tambin son diferentes en cuanto a su composicin celular pero
pueden compartir clulas similares. Las baas de la derecha ensean la importancia de
l tratamiento de los mltiples marcadores tumorales para conseguir una sensibilida
d del 100%. Tambin indica que un patrn especifico de mltiples marcadores puede esta
r asociado con un tipo especial de tumor.
estimulo que provoca el cambio. Los tumores benignos se quedarn en esta primera f
ase y presentarn menos riesgo para el husped. Los tumores benignos tambin tienen ms
posibilidades de curarse mediante una extirpacin completa. No obstante, la inesta
bilidad gentica asociada a las clulas tumorales las hace ms susceptibles a mutacion
es adicionales, que pueden llevar eventualmente a una enfermedad maligna (Fig. 4
7-2). Los tumores malignos habitualmente se asocian a diagnsticos errneos y poca s
upervivencia debido a su capacidad y tendencia para extenderse y metastatizar po
r va linftica y sangunea. En general, todos los tumores benignos se encuentran bien
diferenciados. Las neoplasias malignas, por otro lado, varan desde bien diferenc
iadas hasta indiferenciadas. Aparentemente, el control de la proliferacin y difer
enciacin se pierde en los tumores malignos. Algunos de los tumores malignos parec
en tener la escasa diferenciacin fetal y producir sustancias similares a aquellas
encontradas en tejidos fetales, las comnmente conocidas c o m o protenas carcinoe
mbriognicas (Figs. 47-1 y 47-2). Las clulas malignas tambin pueden producir enzimas
proteolticas que facilitan su escape de su entorno inicial. El cncer en el ser hu
mano habitualmente se desarrolla a partir de clones mulantes de clulas como resul
tado de transformaciones neoplsicas. L a mayora de los cnceres tienen origen monocl
onal, pero se requieren mltiples mutaciones para producir clulas malignas. Las mlti
ples mutaciones que suceden en los tumores pueden provocar el desarrollo de la h
eterogeneidad celular del tumor. Es interesante observar que los tumores no esla
n compuestos de clulas homogneas; normalmente estn constituidos por subpoblaciones
celulares con fenotipos claramente diferentes (Schnipper, 1986). El proceso de e
volucin y progresin tumoral puede tambin generar diversidad biolgica dentro y en los
diferentes focos melastsicos. Una clula obtenida de un determinado tumor puede se
r distinta por varios factores:

Figura 47-2. Ilustracin de cmo clulas normales, despus de mltiples mutaciones, se con
vierten en clulas malignas. Los marcadores tumorales tienen dilerente capacidad d
e pronstico para las clulas tumorales y diferentes estados de desarrollo.

1030
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
tasa de crecimiento, receptores superficiales celulares, inmunogenicidad. expres
in de marcadores tumorales (Fig. 47-3). capacidad de invasin y metstasis, y respues
ta a drogas citotxicas (Fidler, 1982).
Respecto a la diferenciacin celular
Las protenas carcinoembnonanas encontradas en ambos tejidos, letal y tumoral, per
o no en el tejido adulto normal, normalmente carecen de alguna funcin fisiolgica c
onocida y presentan niveles de concentraciones en sangre de milmetros por nanogra
mo (Figs. 47-1 y 47-2) Por tanto, las determinaciones de las protenas carcinoembro
narias en sangre se deben realizar mediante inmunoanlisis. La especificidad y sen
sibilidad asociadas a estas protenas, aunque no son del 100, si son mucho mayores q
ue otras enzimas y metabolitos utilizados como marcadores tumorales en el pasado
. La concentracin serolgica de estas protenas carcinoembronarias no slo se correlacio
na bien con la actividad tumoral sino que tambin se utiliza para predecir el prons
tico. En general, las protenas carcinoembronarias no son convenientes en el examen
colectivo: primero, los anticuerpos policlonales contra estas protenas a menudo
tienen reacciones cruzadas con otras protenas normales, y segundo estas protenas c
arcnoembrionarias no aparecen lo suficientemente pronto en la sangre de pacientes
con cncer. Sin embargo, se han utilizado como pruebas complementarias de diagnos
tico de cncer y son extremadamente tiles para controlar el xito del tratamiento y p
ara detectar recidivas.
TIPIFICACIN DE MARCADORES TUMORALES
A pesar de que el cncer se origina por una transformacin maligna de una clula norma
l, hay pocas diferencias en cuanto a la expresin fenotpica entre una clula cancergen
a y una clula normal. Las mutaciones inducidas por el cncer no parecen alterar nin
guna de las expresiones genticas o lenolpicas excepto en las regulaciones del crec
imiento celular. En consecuencia, en los ltimos aos los esfuerzos para identificar
un marcador tumoral especifico o un eptopo tumoral especfico no han tenido xito. P
or otro lado, cualquier producto celular como enzimas, protenas sricas, metabolito
s, receptores, protenas carcinoembronarias, oncoprotenas y protenas codificadas por
genes supresores puede utilizarse como marcador tumoral siempre que tenga relacin
con algn proceso durante la formacin o el crecimiento tumoral. as c o m o en la tr
ansformacin maligna, proliferacin, diferenciacin y metstasis. La evaluacin clnica de
lgn marcador tumoral determinado depender de la intencin de su utilidad clnica y de
la especificidad y sensibilidad del marcador tumoral. El uso de marcadores tumor
ales como factores pronsticos o factores de riesgo tambin ha ganado ms y ms populari
dad en estos ltimos aos. La determinacin de los factores de riesgo es muy valiosa e
n la valoracin de la agresividad de un tumor y til en la seleccin de las estrategia
s de tratamiento (Fig. 47-4).
Respecto a las metstasis
Las metstasis tumorales tienen varios pasos importantes (Liotta, 1987). Primero,
las clulas tumorales tienen que penetrar en zonas cercanas, despus invadirn el torr
ente sanguneo o los vasos linfticos. Entonces, las clulas tumorales viajan a zonas
distantes, hasta que se alojan en lechos venosos o capilares de rganos distantes.
En este nuevo entorno, estas clulas tumorales han de penetrar de nuevo por las p
aredes vasculares para crecer en este nuevo lugar. Todos los productos celulares
liberados y sintetizados durante estos pasos son posibles factores de nesgo. Su
aparicin en el tejido tumoral o en la circulacin sangunea indica el riesgo o la ap
aricin de metstasis o un pobre pronstico. Las determinaciones de muchos de estos ma
rcadores, sin embargo, estn an limitadas a tejidos tumorales o citosoles de tejido

s tumorales.
Respecto a la proliferacin celular
Muchas hormonas gonadotropina corinica humana (hCG)). protenas sricas, enzimas (lact
ato deshidrogenasa [LD], fosfatasa alcalina []) y sus metabolitos (cido vanilmandlic
o [VMA], acido homovanlico [HVA], cido 5hidroxiindolactico [5-HIAA]) pueden llegar
a estar elevadas en los tumores debido a la alia velocidad de proliferacin de las
clulas tumorales. Sus concentraciones en suero aumentan incluso a concentracione
s mayores cuando un tumor benigno se convierte en maligno y metastatiza. Como la
s enfermedades benignas y no malignas tambin pueden tener niveles de marcadores a
ltos, no es conveniente el uso de estos marcadores para la deteccin sistemtica ni
para el diagnstico de cncer debido al gran nmero de falsos positivos. Estos marcado
res se utilizan para monitorizar a los pacientes durante el tratamiento.
Cncer de inania
Respecto a otros procesos asociados al tumor
Aparentemente, las actividades enzimticas de varias glucosiltransferasas rgano-esp
ecficas estn alteradas en clulas tumorales. Algunas de las glucosiltransferasas ele
vadas se han utilizado como marcador tumoral. La secuencia del azcar y la composi
cin de parte del hidrato de carbono de muchas glucoprotenas sricas, incluidas susta
ncias del grupo sanguneo y mucinas como CA 19-9. son marcadores tumorales resulta
ntes de la alteracin de la glucosiltransferasa. La AFP (alfa-fetoprotena) aislada
en pacientes con hepaloma primario tiene una fucosa adicional comparada con la A
FP de enfermedades benignas hepticas, un ejemplo de la fucosiltransferasa alterad
a en clulas del hepatoma (Wu. 1990).
Respecto a la transformacin maligna
Los oncogenes, que codifican protenas que funcionan en todos los niveles de regul
acin del crecimiento, juegan un importante papel en la transformacin celular (Druk
er. 1989). Estas oncoprotenas son similares a los productos normales de los proto
oncogenes excepto en que han perdido la tuerza reguladora de su actividad y no n
ecesitan seales de activacin externas para originar una proliferacin celular. La de
terminacin de la expresin tisular de estas oncoprotenas se ha utilizado para el pro
nstico. Una de las oncoprotenas ms extensamente estudiadas, llamada, proteina c-erb
B-2 (p185), se ha detectado en el suero por inmunoanlisis. Una investigacin poster
ior descubri que el dominio extracelular del c-eroB-2 podra fraccionarse y liberar
se a la circulacin sangunea. El dominio extracelular del p185 parece que se relaci
ona no slo con la cantidad de p185 expresado en la membrana de la clula tumoral, s
ino tambin con el cambio de la concentracin de muchos importantes marcadores tumor
ales sricos (Wu. 1995). Como la transformacin maligna es un acontecimiento especif
ico en la carcinognesis. cualquier producto celular asociado a este evento tiene
la posibilidad de ser un marcador tumoral especfico ms. Es posible que otros recep
tores transmembrana reaFigura 47-4. Ilustracin de cmo la afectacin ganglionar determina el riesgo de las p
acientes con cncer de m a m a y del propio tratamiento. Actualmente se utiliza un
panel con varios nuevos marcadores pronsticos determinados en el citoplasma del
t u m o r junto con la determinacin de ganglios para proporcionar u n a valoracin
ms correcta de los riesgos para las pacientes con cncer de mama.

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIGICOS

1031
Tampoco se necesita la caracterizacin e identificacin completa de la molcula que ll
eva el epitopo. Un hibridoma se puede preparar inyectando a un ratn una fraccin en
riquecida de la membrana de la clula tumoral o incluso toda la clula tumoral. Los
hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de inters se seleccionan par
a el procedimiento posterior de deteccin sistemtica. Una vez concretado el hibrido
ma, se obtendr un nmero ilimitado y consistente de anticuerpos monoclonales para d
iferentes utilidades. La especificidad tanto de los anticuerpos como del inmunoa
nalisis esta bien definida y es reproducible. Muchos de los problemas relacionad
os con los anlisis que utilizan anticuerpos policlonales. como la reduccin de una
gran parte de la variacin del anticuerpo e inconsistencias del anlisis, desaparece
rn o se reducirn sobremanera. Tambin han fracasado las tentativas para identificar
eptopos especficos tumorales usando anticuerpos monoclonales. Como sucede con los
marcadores tumorales identificados por anticuerpos policlonales, slo hay eptopos a
sociados al tumor (Fig. 47-5). No obstante, se ha demostrado que las pruebas par
a definir los marcadores tumorales para un tumor definido tienen una sensibilida
d y especificidad ms alta que otros que utilizan anticuerpos policlonales. Por ej
emplo. CA 19-9. CA 125 y CA 15-3 son mucho ms sensibles y especificas que el antge
no carcinoembrionario (CEA) en el carcinoma pancretico, ovarico y de mama, respec
tivamente. Estos marcadores (Tabla 471) estn recomendados para reemplazar la prue
ba del CEA policlonal en el diagnstico y tratamiento de pacientes con los carcino
mas previamente mencionados. Muchos eptopos asociados al tumor comparten con vari
os marcadores tumorales derivados de diferentes tumores. Por eiemplo. CA 19-9, C
A 15-3. y CA 125 se expresan en casi todos los carcinomas de distintos grados. A
dems de la participacin de unos eptopos determinados en ms de un carcinoma, tambin es
posible que una sola molcula exprese ms de un epitopo (Yu, 1991); por ejemplo, co
mo sucede cuando CA 15-3 y CA 1 2 5 son expresados por la misma molcula de mucina
en el suero.
Figura 47-5. Ilustracin de cmo se detinen e identifican los eptopos situados en la
superficie d eu n a gran molcula del m a r c a d o r lumoral mediante anticuerpos
monoctonales. Las diferentes molculas pueden compartir los m i s m o s eptopos. p
ero la composicin global o el modelo de mltiples eptopos en distintas molculas parti
culares pueden diferir entre ellas.
cionados con la transformacin celular puedan comportarse similarmente y ser tiles
como marcadores tumorales o indicadores de pronstico. Se necesitan amplios estudi
os detallados sobre el c-erbB-2 y otras protenas codificadas por oncogenes para e
valuar completamente el potencial de las oncoprotenas en el diagnstico y tratamien
to de pacientes con cncer.
Mutaciones heredadas
Aparte de los oncogenes, pero igualmente importantes, est un grupo de genes supre
sores que han sido descubiertos incluso ms recientemente. Las protenas codificadas
por genes supresores son responsables de la supresin del crecimiento celular. Es
tos genes supresores pueden sufrir supresiones o mutaciones resultando en la pro
duccin de productos del gen inactivos, que fueron encontrados en familias con alt
o riesgo de cncer. Se han identificado los distintos genes supresores y las proten
as que codifican. Por ejemplo, la p53 se ha investigado considerablemente por su
papel en distintos cnceres. Los genes supresores y sus productos son potencialme
nte tiles como marcadores tumorales para el examen colectivo e identificacin de fa
milias o individuos de alto riesgo. El descubrimiento de dos genes susceptibles
(o genes supresores tumorales) para el cncer de mama, llamados BRCA1 y BRCA2. ha

generado recientemente un tremendo inters (Miki, 1994; Wooster. 1994). Los estudi
os (Easton. 1993) sugieren que las mutaciones en el BRCA1 son responsables de ap
roximadamente la mitad de todos los casos de cncer de m a m a hereditario. Adems,
los portadores de las mutaciones del BRCA 1 tambin provocan un incremento del rie
sgo de cncer de ovario, colon y prstata (Futreal, 1994). El BRCA2, segundo gen sus
ceptible para el cncer de mama, se cree que se encuentra en casi el 70% de casos
de cncer de m a m a hereditario que no se debe a mutaciones del BRCA1 y est relaci
onado con un aumento de nesgo en el cncer de m a m a en hombres. El desarrollo de
inmunoanalisis para la determinacin de las protenas que codifican BRCA1 y BRCA2 e
st en proceso y debera servir para la identificacin de individuos de alto riesgo y
sus familias.
APLICACIONES CLNICAS
Es esencial que se entienda el significado de las pruebas de sensibilidad y de e
specificidad de los marcadores tumorales antes de hablar sobre las aplicaciones
de los marcadores tumorales (von Kleist, 1988; Sell, 1990). De hecho, la utilida
d clnica de un marcador tumoral depende casi totalmente de la especificidad y la
sensibilidad del marcador tumoral. Cuando el anlisis de un marcador tumoral se di
ce que tiene una sensibilidad del 100%. significa que el anlisis puede detectar a
todos los pacientes con ese tipo concreto de cncer, mientras que un anlisis con u
na especificidad del 100% significa que el anlisis identificar solamente a los pac
ientes con ese tipo especifico de tumor y no aquellos con enfermedad benigna o n
o maligna. En consecuencia, la sensibilidad es una medida de los verdaderos posi
tivos y se calcula con la siguiente frmula;
% Verdaderos positivos Sensibilidad = (% Verdaderos positivos + % Falsos negativ
os) Por otro lado, la especificidad es una medida de los falsos positivos y se c
alcula con la siguiente frmula; % Verdaderos negativos Especificidad = (% Verdade
ros negativos + % Falsos positivos)
Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales especficos
El desarrollo de la tecnologa del hibridoma ha tenido mucho impacto en la identif
icacin de marcadores tumorales. Antes de conocer una molcula completa de una estru
ctura protenica conocida, actualmente es posible centrarse en una pequea rea de sup
erficie, un epitopo o determinante antignico mediante anticuerpos monoclonales (F
ig. 47-5). Ya no se necesita purificar el antigeno para la preparacin de anticuer
pos policlonales en animales.
Tabla 47-1
Determinacin de m a r c a d o r e s tumorales mediante anticuerpos m o n o c l o
n a l e s E n f e r m e d a d maligna importante Carcinoma ovrico Carcinoma pancr
eatico Carcinoma de mama Carcinoma gstrico
M a r c a d o r tumoral CA 125 CA 19-9 CA 15-3 CA 72-4

1032
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
Teniendo en cuenta esta informacin, se puede comenzar a hablar de las siguientes
aplicaciones clnicas de los marcadores lumorales.
Monitorizacin del tratamiento
Una de las dos aplicaciones ms tiles de los marcadores tumorales implica el contro
l del curso de la enfermedad, especialmente durante el tratamiento. En la Figura
47-6 se muestra el cambio en los niveles en suero de diversos marcadores tumora
les durante el curso de un cncer ovrico en u n a paciente. El nivel en suero de lo
s marcadores tumorales refleja bien el xito de la ciruga o la eficacia de la quimi
oterapia. Cuando se detectan niveles elevados de un marcador tumoral despus de la
ciruga, esto puede indicar una extirpacin incompleta del tumor recidiva, o la pre
sencia de metstasis. L a determinacin de los marcadores tumorales en suero durante
la quimioterapia tambin aporta una indicacin de la elicacia del citostlico utiliza
do y una gua para la seleccin de los medicamentos ms efectivos para cada caso en pa
rticular.
Examen colectivo
El primer intento por parte de Gold (1965) en detectar el carcinoma colorrectal
en hombres mediante radioinmunoanlisis (RA) de CEA en suero llev al autor a la comp
rensin de que ninguno de los marcadores tumorales descubiertos tena la especilicid
ad y la sensibilidad para el examen colectivo. En la actualidad no se recomienda
el examen colectivo, especialmente en una poblacin asintomtica. Adems de la carenc
ia deseada de especificidad y sensibilidad de los marcadores tumorales, la baja
prevalencia del cncer y la baja sensibilidad y especificidad de los marcadores tu
morales en general tambin se opone al examen colectivo de los cnceres. Se temia qu
e la naturaleza no especfica de la mayoria de los marcadores tumorales examinados
pudiera crear demasiados falsos positivos y causar de forma innecesaria una ala
rma o preocupacin en la poblacin general. Por otro lado, hay excepciones donde el
examen colectivo del cncer est comprobado usando marcadores tumorales. El examen c
olectivo del hepatoma primario en China mediante el tratamiento de la AFP en sue
ro es un buen ejemplo de estas excepciones debido a la alta incidencia de cncer h
eptico en esta rea del mundo (Wu, 1987). La posibilidad del examen colectivo de cnc
er de ovario en mujeres con la determinacin en suero del CA 125 sigue en proceso
de investigacin. El diagnstico de cncer ovlico depende en principio de la ciruga. Sin
embargo, en la mayoria de los casos, en el momento de la deteccin del tumor, ste
se encontrar en estadio avanzado, donde la posibilidad de curacin es baja. La reco
mendacin de la identificacin sistemtica de cncer de prstata mediante la determinacin
el antigeno especifico prosttico (PSA) en suero junto con el tacto rectal digital
(DRE) se debe a la especificidad del tejido para el PSA (Wu. 1994) y a la alta
prevalencia del cncer de prstata en hombres a partir de los 50 aos de edad. Est espe
cialmente recomendado en hombres afroamericanos, debido a que el porcentaje de i
ncidencia para este grupo es casi el doble que para la poblacin general, y el por
centaje de mortalidad es Ires veces superior. El examen colectivo permite el tra
tamiento confinado al rgano, potencialmente curable del cncer de prstata descubiert
o en hombres con una esperanza de vida superior a 10 aos. La combinacin de la prue
ba del PSA y del DRE proporciona el mnimo coste considerado para la deteccin preco
z del cncer de prstata (Littrup, 1993).
Deteccin de recidiva
La segunda aplicacin ms til de los marcadores tumorales es controlarlos para la det
eccin de recidiva despus de la extirpacin quirrgica del tumor. Se sabe que la aparic
in de la mayoria de los marcadores tumorales circulantes tiene un "tiempo de adel

anto" de vanos meses (de tres a seis meses) antes de cualquier procedimiento fsic
o utilizado en la deteccin del cncer. La facilidad de su deteccin en sangre y la se
nsibilidad de los marcadores tumorales hacen que este proceso de control no inva
sivo sea aceptado de forma generalizada en la actualidad. La especificidad de lo
s marcadores tumorales no presenta un problema para esta aplicacin.
Pronstico
La estimacin de la agresividad tumoral y el pronstico para la evolucin del paciente
con cncer han ganado creciente popularidad en estos ltimos aos. El conocimiento de
la agresividad lumoral tambin ayuda al desarrollo de una terapia apropiada para
el paciente. Por ejemplo, la deteccin de marcadores tumorales. altamente asociada
con malignidad y metstasis, apuntar un tratamiento ms riguroso y sistmico. La mayora
de los marcadores tumorales se elevan cada vez ms cuando el tumor metastatiza. D
esdichadamente, muy pocos marcadores tumorales tienen un lmite bien definido entr
e estadios benignos y malignos. Los (actores de riesgo asociados al proceso de m
etstasis tumoral, como proteasas y molculas de adhesin, son habitualmente mejores m
arcadores para predecir el pronstico. Sin embargo, la mayoria de estos marcadores
an se determinan en tejidos tumorales y citoplasmas. El hallazgo del dominio ext
racelular de la protena c-eroB-2 en el suero y la correlacin entre el dominio extr
acelular del suero con los niveles de otros marcadores tumoDiagnstico
Los problemas tanto de la especificidad como de la sensibilidad asociados a la m
ayora de los marcadores tumorales excluyen su determinacin en el diagnstico del cnce
r. La frecuencia de deteccin de niveles elevados de marcadores tumorales en enfer
medades no malignas y la coexistencia observada entre las concentraciones normal
es y las concentraciones de marcadores tumorales en pacientes con cncer se oponen
a su uso en el diagnstico. La mayora de los marcadores tumorales usados en la act
ualidad no pueden distinguir las enfermedades malignas de las benignas. Los marc
adores tumorales, no obstante, siguen utilizndose con xito como prueba complementa
ria para la deteccin del cncer. Se han propuesto recientemente varios abordajes pa
ra mejorar la especificidad diagnstica de muchos marcadores lumorales. El uso de
mltiples marcadores es un abordaje que ha tenido gran aceptacin. Los patrones espe
cficos de mltiples marcadores tumorales parecen estar relacionados con determinada
s enfermedades malignas. Los principales inconvenientes para el uso de mltiples m
arcadores tumorales son el coste y los rigores de la propia seleccin de los marca
dores tumorales para incluirlos en el panel. Otro abordaje para mejorar tanto la
especificidad como la sensibilidad de un marcador tumoral. como en el caso de l
a prueba de PSA en suero, implica la medida de la velocidad (porcentaje de aumen
to en la concentracin de PSA en el tiempo) y la densidad (p. ej.. dividiendo la c
oncentracin de PSA en suero entre el volumen de la glndula prosttica, determinado p
or ecograla transrectal) (Benson, 1992). Un ligero aumento del nivel de PSA en su
ero asociado con una glndula prosttica pequea puede indicar cncer, mientras que la m
isma valoracin en un paciente con una glndula grande puede indicar slo una hiperpla
sia prosttica benigna (HPB).
Da
Figura 47-6. Ilustracin del c a m b i o de los niveles en suero de CA 1 2 5 en el
transcurso de la enfermedad en una paciente con cncer ovrico. Tambin se acenta el h
echo de que mltiples marcadores pueden aumentar o descender conjuntamente. Los ni
veles de los marcadores tumorales se normalizan dividindolos p o r sus cotas supe
riores normales.

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

1033
rales en suero es alentadora. Se espera que en un futuro cercano sea posible la
determinacin en la circulacin sangunea de estos factores de riesgo para el pronstico
.
tardarn 30 das para disminuir a un rango no detectable despus de un xito quirrgico.
Valore cmo se elimina o metaboliza el marcador RECOMENDACIONES EN LA PETICIN DE MA
RCADORES TUMORALES
Cuando se solicitan marcadores tumorales como prueba diagnstica complementaria y
para el tratamiento de los pacientes con cncer, se deben considerar las siguiente
s recomendaciones para evitar equivocaciones en los resultados de las pruebas.
tumoral desde la circulacin sangunea
A menudo se detectan marcadores tumorales elevados en suero en pacientes con enf
ermedad renal o heptica, dependiendo de si el marcador tumoral se elimina por fil
tracin glomerular o se metaboliza por el hgado. Por ejemplo, el CEA en suero a men
udo se eleva en pacientes con enfermedades hepticas porque el hgado daado es incapa
z de eliminarlo eficazmente de la circulacin sangunea, mientras que una |J-microgl
obulina (|i2M) elevada a menudo se detecta en pacientes con fracaso renal, donde
hasta la pequea molcula (2M tiene dificultad para atravesar la membrana glomerular
de una manera normal.
2
Nunca se base en los resultados de una sola prueba
Debido a que la mayora de los marcadores tumorales no son especficos, es difcil dif
erenciar entre enfermedades malignas y otras enfermedades benignas o no malignas
basndose en los resultados una sola prueba. La mayora de las elevaciones encontra
das en las enfermedades no malignas son frecuentemente transitorias, mientras qu
e en el cncer los niveles se mantienen elevados o aumentan continuamente. La peti
cin de pruebas consecutivas puede ayudar a detectar falsos niveles de elevacin deb
idos a elevaciones transitorias. El mejor ejemplo es la AFP en suero. La AFP ele
vada en suero puede detectarse en pacientes con hepatoma primario o con enfermed
ades hepticas. Sin embargo, en una segunda prueba dos semanas ms tarde la AFP en s
uero permanecer elevada en pacientes con cncer, mientras que en pacientes con enfe
rmedades hepticas la AFP en suero volver a un nivel normal.
Trate de pedir mltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad d
el diagnstico
Como se ilustra en la Figura 47-3, los tumores estn formados por clulas heterogneas
. Algunas pueden incluso ser clulas normales y otras pueden ser clulas tumorales h
eterogneas como resultado de una secuencia diferente de mltiples mutaciones. Cada
tipo de clula puede expresar un nico marcador o un numero de marcadores tumorales
caracterstico. El mismo marcador puede tambin ser producido por diferentes tipos d
e clulas. Puede que algunas clulas nunca produzcan un solo marcador. Como se ilust
ra en la Figura 47-3, los distintos tumores que derivan del mismo tipo de tumor
aparentemente pueden incluso ser heterogneos en su composicin celular. Igualmente,
se necesita ms de un marcador tumoral para proporcionar una sensibilidad en la d
eteccin del 100%. L a heterogeneidad en la composicin celular y el porcentaje de l
a distribucin celular de cada tumor explican por qu se necesita un nmero de marcado
res tumorales para alcanzar el 100% de sensibilidad de deteccin y por qu la sensib
ilidad de un marcador en particular tambin es diferente entre pacientes con cncer.
En la Tabla 47-2 se detallan mltiples marcadores tumorales relacionados con enfe

rmedades malignas particulares: la aparicin de marcadores tumorales caractersticos

en varias neoplasias se detalla en la Tabla 47-3. Esto explica por qu ninguno de
los marcadores tumorales utilizados actualmente tiene una especificidad y sensi
bilidad del 100%. y por qu el uso de mltiples marcadores mejorar la sensibilidad de
deteccin. Sin embargo, un nico patrn de mltiples marcadores puede identificarse en
tumores derivados de los mismos tejidos. Por tanto, al pedir mltiples marcadores
tumorales tambin se mejorar la especificidad. Por ejemplo, un patrn especfico puede
estar asociado a carcinomas de colon, de mama, de ovario y de pncreas cuando los
cuatro marcadores tumorales determinados por anticuerpos monoclonales, como CEA.
CA 19-9, CA 15-3 y CA 125, se miden simultneamente. Esta informacin es clnicamente
importante, ya que ms del 60% de los cnceres que se tratan son carcinomas derivad
os del epitelio celular (Wu, 1989). Se desarrollaron mltiples marcadores para una
estrategia de deteccin precoz mas especifica para el cncer ovrico. Se vio que el u
so de CA 15-3 y TAG72 junto con CA 1 2 5 puede aumentar la especificidad aparent
e de los anlisis de CA 1 2 5 para distinguir enfermedades malignas de benignas (B
ast, 1991). Se debera tener en cuenta que durante la seleccin de los mltiples marca
dores tumorales, slo se deberan de seleccionar los marcadores que son complementar
ios unos con otros. Aquellos numerosos marcadores tumorales que van paralelos a
la actividad tumoral no deberan seleccionarse para este propsito.
Cuando se piden pruebas consecutivas, asegrese de pedir todas las pruebas al mism
o laboratorio utilizando el mismo equipo de anlisis
Cada equipo comercial distinto puede generar diferentes resultados aunque todos
estn diseados para el mismo marcador tumoral. Cuando se piden desde el mismo labor
atorio tambin se garantiza una mayor seguridad en la ejecucin. Es importante asegu
rarse de que algunos cambios observados durante el proceso controlado se deben a
l cambio del volumen tumoral o a otras actividades tumorales y no a la variabili
dad de laboratorio (Fig. 47-6).
Asegrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva est el
evado en el paciente antes de la ciruga
Como ninguno de los marcadores tumorales tiene una sensibilidad del 100% en la d
eteccin de un determinado cncer, para estar seguro es importante que el marcador t
umoral concreto para detectar la recidiva est elevado antes de la ciruga. De lo co
ntrario, se deberan detectar mltiples marcadores antes de la ciruga para selecciona
r el marcador tumoral ms elevado que pueda controlar la actividad de la enfermeda
d.
Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de l
a prueba
Estime el tiempo requerido para que el nivel determinado antes de la ciruga dismi
nuya al nivel normal o. en el caso del PSA, a un nivel indetectable basndose en e
l conocimiento de la vida media de los marcadores tumorales. Es importante que l
a determinacin de las concentraciones de marcadores tumorales para determinar el x
ito de la extirpacin quirrgica de ese determinado tumor no se realice antes de las
dos semanas del postoperatorio. Sera preferible esperar todo un mes debido al ti
empo necesario para que los niveles de marcadores tumorales preexistentes en sue
ro desciendan a niveles ms bajos. Por ejemplo, la vida media del PSA en suero es
de aproximadamente tres a cuatro das; por tanto, 50 ng/'ml de PSA en suero
Pida marcadores no especficos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad
Si el nico objetivo es controlar la eficacia del tratamiento, debera considerarse
el uso de marcadores tumorales no especficos (Tabla 47-4). Aunque estos marcadore
s no especficos carecen de especificidad para el diagnstico y, en lo que respecta
a algunos tipos especficos de tumores, sus concentraciones son sin duda m u y sen
sibles a algunos cambios en la actividad tumo-

1034
Tabla 47-2
SECCIN V
INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA
Marcadores tumorales s e r o l g i c o s relacionados con enfermedades malignas
particulares Marcador importante Hormona del crecimiento Cortisol TdT B2M Otros
marcadores IGF-I Catecolaminas libres, DEA, 17-cetoesteroides, prolactina B2M en
suero. LASA-P LD Antgeno-T, inhibidor de urocinasa, CEA, TPA. citoqueratinas, gl
ucosammoglucosas Protema de Bence Jones, hidroxiprolma. calcio en suero Poliamin
as CEA, calcitonina. CA 549, CA M26. CK-BB. termina, B-hCG. LASA-P, prolactina,
protena P 21, PS-2 Histamina, ADH, bradicmina Anticuerpos AG-4. CA 125, CEA, TPA
CA 19-5, CA 19-9, CA 72-4, CK-BB, NSE Endorfina. lpotropina CA 19-9, CA 50, CEA,
ferritina, CK-BB. hCG. LASA-P, pepsingeno II, prolrombina
Enfermedades malignas Tumores pituitarios acromeglicos Tumores pituitarios suprar
renales Leucemia de lintocitos B crnica Linlocitos B malignos Cncer de vejiga Cncer
de hueso Tumor cerebral Cncer de mama Carcinoma broncognico Tumores carcinoides Cn
cer cervical Conocarcinoma Cncer colorrectal Leucemia mieloide crnica Sndrome de Cu
shing Tumores pancreticos endocrinos Carcinoma gstrico Gastrinoma Glucagonoma Leuc
emia de clulas peludas Tumores de cabeza y cuello Carcinoma hepatocelular Hiperca
lcemia maligna Enfermedad de Hodgkin Insulinoma Cncer de duodeno Tumores renales
Leucemia Cncer de pulmn Lmfoma Cncer medular de tiroides Antigeno de melanoma Micro
adenomas (pituitaria) Mieloma mlliple Mesotelioma Microadenomas Neoplasias endocr
inas mltiples Tumor testicular no seminomatoso Neuroblastoma Tumores no-islotes Cn
cer microctico Osteosarcomas Carcinoma ovrico Carcinoma pancretico
Foslatasa alcalina Desmesterol CA 15-3 Prolactina SCC hCG CEA TdT ACTH Polipptido
pancretico CA 72-4 Gastnna Glucagn Receptor IL-2 SCC AFP Pplido relacionado con PT
H Insulina ADH CEA TdT
CEA, ferritina, rGT, ALP. TPA, y-glutamiltranspeptidasa LASA-P. ferritina PptidoC, proteina I aglutinante IGF-I

Tumores de islotes pancreticos Cncer tiroideo papilar y folicular Tumores paratiro

ideos Feocromocitoma Tumores pituitarios Tumores placentarios Leucemia de clulas
plasmticas Carcinoma prostlico Carcinoma de clulas renales Sarcoma Seminoma Tumores
de bazo Cncer de clulas escamosas Crvix Pulmn Cabeza y cuello Cncer de estmago Terat
blastoma Cncer testicular no seminomatoso Cncer uterino Vipoma (pncreas)
NSE ALP, 2M, ferritina, LDH. protema mielina bsica. NSE adenosine deaminasa, PNP A
CTH, CK-BB, calcitonina. CA 72-4. CEA, AFP, lerritina. LASA-P. TPA B2M TdT. Ki-6
7, LASA-P Calcitonina NSE LASA-P relacionado con melanoma, i-dopa NSE, catecolam
inas plasmticas Prolactina Inmunoglobulina densa de cadena ligera y densa Protena
de Bence Jones. 2M. IgA cido hialurnico Prolactina Cromogranma A AFP hCG VMA HVA. N
SE. cistationina, ferritina, metanefrinas Insulina como factor de crecimiento AC
TH, ADH, CEA, CK-BB, NSE, bombesina, calcitonina ALP UGF, inhibina. AFP, isoenzi
ma amilasa, CEA. CK-BB. CA 125 hCG, galactosiltransferasas, LDH. TPA CA 19-5. CA
50. CA 72-4, CEA, CK-BB, ADH. ALP. CA 19-9 ferritina. isoenzima II galactosiltr
ansferasa. Y-glutamiltranspeptidasa, PAP Insulina Tiroglobulina PTH ntegro Cromog
ranma A, catecolaminas plasmticas Metanetnna FSH, LH, prolactina, TSH othCG libre
hCG a-hCG libre TdT PSA PAR ALP, CEA, CK-BB, TPA Renina, eritropoyetina, interl
eucina-4, prostaglandina A. CA 15-3, hormona paratiroidea, NSE, prolactma B2M NS
E Ferritina SCC SCC SCC CA 72-4 AFP hCG AFP SCC VIP
CYFRA 21-1 Ferritina CEA, NSE hCG. ferritina -hCG, LDH
La labia contina en la siguiente pgina

CAPTULO 47
DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS
1035
Tabla 47-2
M a r c a d o r e s tumorales serolgicos relacionados c o n e n f e r m e d a d e
s m a l i g n a s particulares (continuacin) M a r c a d o r importante Inmunogl
obulinas IgM Gastrina Otros marcadores 2M
E n f e r m e d a d e s malignas Enfermedad de Waldenstrom Sndrome de Zollinger-E
llison
ACTH = hormona adenocorticolropa: ADH = hormona antidiurtica; AFP -letoproteina;
ALP = tosfatasa alcalina; AMF = tactor de motilidad autocrino; 2M = beta microgl
obulina; HPB = hiperplasia prosttica benigna; CEA = antlgeno carcinoembrionario;
CK-BB = isoenzima BB creatina cinasa; DEA = dehidroepiandrosterona. FDP = produc
tos de degradacin de fibrina; FSH = hormona lollculo-estimulanle: Gl = gastrointe
stinal; GT = gamma-glutamil Iransferasa; hCG = gonadolropina orlonica humana. HV
A = cido homovanilico; IGF-I = factor de crecimiento insulinico I: IL-2 = interle
ucina; LASA-P = cido silico relacionado con lipidos: LD = laclato deshidrogenasa:
LH = hormona lutemizante; NSE = enolasa especlica neuronal PAP = fosfatasa cido pr
osttico: SCC = antigeno de clulas escamosas e carcinoma. TdT = deoxinucleotidol tra
nsferasa terminal; TPA = antlgeno de tejido polipptido; TSH = lirotropina; VIP po
hpptido intestinal vasoaclivo. VMA = cido vanilmandlico.
Tabla 47-3
E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s relacionadas con m a r c a d o r e s t u
m o r a l e s s e r o l g i c o s particulares E n f e r m e d a d e s m a l i
g n a s asociadas
Marcador tumoral" AFP -hCG. cadena libre 2M CA 15-3 CA 19-9 CA 72-4 CA 125 -hCG
Protena de Bence Jones Bombesina CA 549 CA M26 Calcitonina CEA c-erbB-2 oncoproten
a Cromogranina A CYFRA 21-1 Desrnesterol DEA ADN Ferritina Galactosillranslerasa
Isoenzima II galactosillranslerasa Gastrina Histaminasa hCG cido hialurnico IgA I
GF-I Receptor IL-2 Inmunoglobulinas Inhibira Insulina como factor de crecimiento
Catacalcina 17-cetoesteroides LASA-P Antgeno relacionado con melanoma Metanefrina
s Enolasa neuronal especifica Polipptido pancretico Proteina P 21 Catecolaminas pl
asmticas PNP POA PSA PAP Protena PS-2 SCC TdT Tiroglobulma TPA TAG 72 Inhibidor de
urocinasa VIP 'Vase Tabla 47-2 para abreviaturas.
Enfermedades importantes Carcinoma hepatocelular primario Tumores pituitarios Ne
oplasias de linfocilos B Cncer de mama Carcinoma pancretico y gstrico Carcinoma gstr
ico Carcinoma ovrico Coriocarcmoma Mieloma multiple Cncer microctico Cncer de mama Cn
cer de mama Carcinoma medular Carcinoma colorrectal Cncer de mama Feocromocitoma.
neuroblastoma Carcinoma de clulas escamosas del pulmn Tumores cerebrales Cncer adr
enal/pituitaria Carcinoma cervical Leucemia mieloide aguda Cncer de ovario Cncer p
ancretico Gastrinoma Cncer medular/tiroideo Coriocarcinoma Mesotelioma Mieloma mlti
ple Cncer hipofisario Leucemia Mieloma mltiple Tumores de clula granulosa Tumores d
e clulas no-islotes Cncer medular de tiroides Cncer adrenal/pituitaria Melanoma Feo
cromocitoma Carcinoma microctico de pulmn Tumor endocrino Cncer de mama Feocromocit
oma Leucemia Cncer pancretico Cncer de prstata Cncer de prstata Cncer de mama
Enfermedades menos importantes Teratoblastomas de ovarios y testculos Mieloma mlti
ple, linfoma de linlocitos B. leucemia linloctica de linfocilos B crnica y clulas r
eticulares, sarcoma enfermedad de Waldenstrom Carcinomas varios Carcinomas vanos
Carcinomas varios Carcinomas varios Cnceres testiculares (no seminomatosos). tum

ores troloblslicos
Cncer de tiroides, cncer de hgado, cncer renal Carcinomas varios Carcinomas varios N
eoplasias endocrinas mltiples, cncer microctico de pulmn, tumores carcinoides
Linfoma de Hodgkin, neuroblastoma y vanos carcinomas, leraloblastoma
Sndrome de Zollmger-Ellison Carcinoma gstrico, ovrico y de mama, tumores trofoblstic
os o de clulas germinales, cncer testicular
Insulinoma
Linfoma mediterrneo, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma maligno
Carcinomas varios, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin Neuroblastoma, gangl
ioneuromas Neuroblastoma, tumores renales
Hipertrolia prosttica benigna (HPB) Algunas leucemias Carcinoma de clulas escamosa
s del tero, crvix, SCC de pulmn y de cabeza y cuello
Leucemia Cncer tiroideo No especifico Carcinoma gstrico Tumores de vejiga Vi poma
Carcinomas varios Cncer colorrectal, de pulmn, pancretico y de ovario

1036
/* ' " ' "' " " """"" . '
SECCIN V
. . . . .

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA
Tabla 47-4 M a r c a d o r e s t u m o r a l e s n o especficos* Antlgeno Tenness
ee CEA (policlonal) Antigeno del tepdo polipplido cido silico relacionado con llpid
os Vase T a b l a 47-2 para abreviaturas.
B2M
El Colegio Americano de Mdicos tambin ha publicado las directrices clnicas en lo qu
e se refiere a la deteccin precoz del cncer de prstata. Subrayan la importancia de
la identificacin sistemtica del PSA y de la realizacin del DRE en la deteccin precoz
del cncer de prstata. Aunque el DRE no es tan sensible como el de la identificacin
sistemtica del PSA, detecla el cncer que de otro modo podra no detectarse con el P
SA (Coley, 1997a b).
EFECTO DE LOS ANLISIS DISEADOS
ral. Muchos de ellos son econmicos y fciles de determinar y son. por tanto, tiles p
ara controlar la terapia y para detectar una recidiva en pacientes con diagnstico
conocido. Por eiemplo. el cido silico P asociado a lpidos (LASA-P) puede cuantific
arse con un procedimiento de calorimetra simple, rpido y econmico y su concentracin
en suero est estrechamente relacionada con las concentraciones en suero de muchos
marcadores tumorales de alta especificidad. El impacto del diseo de una prueba,
incluida la seleccin de anticuerpos, no slo afecta a la sensibilidad y especificid
ad de la prueba y al porcentaje de concentracin, sino que tambin afecta al nivel d
e marcador tumoral donde aparece el electo trampa y si un resultado falso negati
vo o falso positivo provocar interferencias.
Unin competitiva
El primer RA desarrollado se bas en el formato de unin competitiva. L a combinacin d
e una prueba de unin competitiva con un antigeno marcado radiactivamente aportaba
la sensibilidad necesaria para cuantificar m u c h o s marcadores tumorales cir
culantes, especialmente las protenas carcmoembrionarias, en los rangos de concent
racin de nano y picogramo por mililitro. L a base de este formato de prueba inclu
ye la competicin entre una cantidad fija de antigeno marcado radiactivamente y de
l antigeno en la muestra con u n a cantidad limitada de anticuerpo. Despus de la
separacin del compuesto antgeno-anticuerpo del antigeno libre, la medida de la rad
iactividad del compuesto permitir la estimacin de la cantidad de antigeno presente
en la muestra. En la Figura 47-7 se presentan dos formatos de prueba diferentes
, uno para RA y uno para el enzimommunoanlisis absorbente (ELISA). No obstante, al
gunas sustancias que interfieren en la unin entre antigeno y anticuerpo provocarn
un resultado falsamente elevado. Lo que no se tuvo en cuenta es el hecho de que
la misma sustancia que interfiere y que est presente en un anlisis empleando el mi
smo antigeno y anticuerpo en formato sandwich producir un resultado falsamente ne
gativo (Wu. 1983). En la dcada de los 80 se mostr que los dos sistemas importantes
comercializados de CEA, uno de Abbott empleando un formato sandwich y uno de Ro
che usando el formato de unin competitiva, no producan el mismo resultado de CEA d
e las mismas muestras cuando las muestras contenan sustancias que interferan, c o
m o las giucosaminoglucanos.
Controle la posibilidad de efectos falseados
Uno de los inconvenientes del popular inmunoanlisis de tipo sandwich es la capaci
dad para provocar efectos engaosos (Wu. 1991). El efecto trampa que tiene lugar e
n un inmunoanlisis tiende a dar un valor falsamente bajo cuando la concentracin de

l marcador tumoral en la muestra sube por encim a de una muy elevada concentracin
. El nivel exacto de marcador tumoral donde puede producirse un efecto trampa de
pende del diseo de la prueba y de la concentracin de anticuerpos utilizada en el a
nlisis. El uso de la misma muestra para dos diluciones distintas (sin diluir y di
lucin de 1:10) revelar el efecto trampa. La muestra diluida 1:10 normalmente produ
cir un valor 1 0 veces menor que otra muestra no diluida. Si hay un efecto trampa
, la muestra diluida 10 veces producir un valor ms alto que la muestra original (d
espus corregir con el factor de dilucin). El anlisis del marcador tumoral deber repe
tirse con una muestra diluida 10 veces cuando el resultado de un inmunoanlisis de
tipo sandwich sea demasiado bajo para equiparar la gravedad clnica del paciente.

Controle la presencia de marcadores tumorales ectpicos

La expresin de marcadores tumorales tiene una regulacin gentica. Para tumores benig
nos, los marcadores producidos por el tumor normalmente son especficos para clulas
y estn relacionados con los productos celulares normales en una elevada concentr
acin (Figs. 47-1 y 47-2). Cuando el tumor benigno se convierte en agresivo y ms ma
ligno, las clulas comienzan a perder el control y se convierten en autnomas. Las p
rotenas que normalmente se encuentran en un estado fetal precoz, y no se expresan
en el tejido adulto normal, empiezan a aparecer en el tumor como resultado de l
a prdida de la regulacin de la expresin gentica. Esta es la razn por la que las prote
as carcinoembrionarias y los marcadores tumorales ectpicos normalmente se expresa
n en enfermedades malignas avanzadas. En otras palabras, la aparicin de marcadore
s tumorales ectpicos se asocia a un mal pronstico o metstasis. Por ejemplo, las con
centraciones elevadas de AFP en suero pueden detectarse en pacientes con cnceres
del tracto gastrointestinal con metstasis, aunque las pruebas de luncion heptica s
ean normales. En la Tabla 47-5 se muestran algunos de los marcadores ectpicos con
ocidos y las enfermedades malignas asociadas. Hay que tener en cuenta las recien
tes directrices sobre el uso de marcadores lumorales gastrointestinales y de mam
a publicados por la Sociedad Americana de Oncologa Clnica (Smith, 1999). Ellos rec
omiendan que se deberia realizar una autoexploracin mamaria mensual, mamografia a
nual de la m a m a conservada y de la contralateral, y una historia clnica detall
ada y exploracin fsica cada 3 6 meses durante dos aos, y despus anualmente. N o reco
miendan el uso de marcadores tumorales. como son CEA, CA 15-3 y CA 27.29. para e
l examen colectivo. Ni tampoco recomiendan de forma habitual la gammagrafia sea,
la radiografa de trax, el recuento hematolgico sanguneo, la ecografia heptica o las i
mgenes de tomografa computarizada.
Formato sandwich
El ELISA, usando el formato sandwich, se ha convertido en el mtodo ms popular para
la cuantificacin de marcadores tumorales. En este caso, un anticuerpo especfico e
s adsorbido a la tase slida. Despus se aade una solucin del antigeno y se deja que s
e una. Despus del tiempo suficiente de incubacin y lavado, se aade un anticuerpo ma
rcado con enzimas en la lase slida y se deja incubar. El anticuerpo marcado que n
o esta unido se retira y el resto de la fase slida contiene el antigeno "en sandw
ich" entre el anticuerpo adsorbido a la fase slida y el anticuerpo marcado. Luego
se
Tabla 47-5 AFP Calcitonina
M a r c a d o r e s tumorales ectpicos* Carcinoma Gl. renal, de pecho, de vejiga
y de ovario Carcinoma de pulmn, de clulas no-islolos. carcinoide. de mama, medular
y de ovario. feocromocitoma Para tumores endocrinos (carcinoma medular de tiroi
des, adenoma de adenohipfisis. carcinoma de clulas de islotes pancreticos) Carcinom
a colorrectal y tumores pancreticos endocrinos Carcinoma gstrico y pancretico, hepa
toma, adenocarcinoma ovrico tumores de clulas germinales de los testculos Carcinoma
tiroideo diferenciado
C'omo(jr;irun;i A
rx-hCG libre hCG

Tiroglobulina
"Vase Tabla 47-2 para abreviaturas

CAPTUIO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

1037
Aglutinacin competitiva
Formato sandwich
rando por tanto una respuesta analtica falsa. Se conoce que entre el 15% y el 40%
de los individuos puede tener uno o mas anticuerpos heterfilos. El mtodo estndar p
ara reducir la interferencia de anticuerpos heterfilos es incluir en el anlisis mu
cho suero de ratn o inmunoglobulmas de ratn no especificas en el inmunoanlisis.
MARCADORES TUMORALES PARTICULARES cx-fetoprotena
Figura 47-7. Ilustracin de las diferencias importantes entre los dos formatos de
prueba importantes de mmunoaniisis. La interferencia en la aglutinacin competitiva
p r o d u c e un valor falsamente elevado; en un formato sandwich produce un re
sultado falsamente bajo. La AFP es una protena fetal importante del suero y tambin
una de las ms importantes protenas carcinoembrionarias (Wu, 1987). La AFP se pare
ce a la albmina en muchas propiedades fisicoqumicas. En el feto, la AFP es sinteti
zada por el saco vitelino y por los hepatocitos fetales y en menor grado por el
tracto gastrointestinal fetal y el rion. La AFP elevada puede encontrarse en paci
entes con hepatoma primario y en tumores de clulas germinales derivadas del saco
vitelino. La AFP es el marcador serolgico ms til para el diagnstico y tratamiento de
carcinoma hepatocelular (HCC). Sin embargo, la AFP tambin se eleva de forma tran
sitoria durante el embarazo y en muchas enfermedades hepticas benignas. Debido a
la alta prevalencia de cncer de hgado en China y en otras ciudades en el sudeste d
e Asia, las pruebas de la AFP se han usado con xito en el examen colectivo de hep
atoma en esa zona del mundo. Las pruebas tanto de AFP como de hCG son tiles para
reducir los errores en el estadiaje clnico en pacientes con algunos tumores testi
culares y ayudan en el diagnstico diferencial de varios tumores de clulas germinal
es. Como se observ un aumento de la fucosilacin de la AFP (de ah la reactividad de
lecitina de lenteja de AFP serolgica) en el carcinoma hepatocelular primario, la
determinacin de la reactividad en suero de lentil lecitina con AFP ha sido til no
slo para diferenciar entre hepatoma pnmario y enfermedades benignas de hgado, sino
tambin para proporcionar una seal precoz que indique cundo se puede empezar a desa
rrollar un hepatoma en pacientes con enfermedades hepticas.
aade el sustrato enzimtico y el desarrollo colorimtrico resultante es proporcional
a la cantidad de antigeno en la solucin de la prueba. Aunque se disponen de otros
marcadores distintos de enzimas, la enzima sigue siendo el marcador ms popular.
La sensibilidad de ELISA puede acercarse a la del RA, especialmente cuando se usa
un sistema de amplificacin biotina-avidinalEngvall, 1971). Recientemente, el for
mato de prueba de la unin competitiva ha desplazado al procedimiento de sandwich.
A pesar de las muchas ventajas asociadas al nuevo formato, puede persistir el p
roblema de los efectos trampa al obtenerse un valor falsamente bajo de una muest
ra que contiene una concentracin altamente elevada de marcadores lumorales. Por e
jemplo, se produjeron valores falsamente bajos de CA 19-9 en el equipo Centocor,
empleando un formato sandwich, con muestras que contenan niveles altamente eleva
dos de CA 19-9. Sin embargo, cuando se utiliz el equipo de RA Biomira, basado en u
n principio de aglutinacin competitiva, se pudieron evitar completamente los valo
res falsamente bajos de CA 19-9. La utilizacin del equipo de RA Biomira tambin redu
ce el nmero de repeticiones debido a que el nivel de CA 19-9 en la muestra puede
aproximarse por la canlidad de radiactividad (Wu. 1991).
Molculas de adhesin

Las molculas de adhesin celulares (CAM) pueden dividirse en cuatro grupos importan
tes: caderinas. selectinas, una superfamilia de inmunogtobulinas e integrinas (W
u. 1997). Estas molculas de adhesin, especialmente la E-selectina, pueden contnbui
r al crecimiento tumoral y a las metstasis. Las molculas de adhesin intercelulares
solubles pueden encontrarse en el suero de pacientes con enfermedades malignas (
Hebbar. 1998).
Anticuerpo monoclonal frente al polielonal
El desarrollo por Kohler y Milstein (Milstein. 1983) de anticuerpos monoclonales
murinos (MAb) con tcnicas de hibridacin de clulas somticas permite un anlisis inmuno
qumico mucho ms detallado y molecular de antigenos asociados al tumor que antao era
imposible. Al combinar los anticuerpos monoclonales con la fase slida de la prue
ba en sandwich, se han desarrollado muchos anlisis nuevos que han eliminado numer
osos problemas relacionados con los anlisis pohclonales, que conllevan una escasa
reproducibilidad, muchas variaciones, pobre especificidad y reactividad cruzada
no especifica (Diamond. 1981). Tambin reduce las diferencias entre los diferente
s equipos y ampla el rango de concentracin lineal del anlisis. Siempre que se dispo
nga de un anticuerpo monoclonal, se recomienda su uso. Para conseguir una mayor
sensibilidad de la prueba, parece que el uso de una combinacin de mltiples MAb mej
ora la afinidad entre los mltiples MAb absorbidos en fase slida y el antgeno solubl
e.
Factores angiognicos
La angiognesis es la formacin de vasos sanguneos in situ; incluye la migracin ordena
da, la proliferacin y la diferenciacin de clulas vasculares. La neoformacin de vasos
sanguneos tambin es importante en la patogenia del crecimiento rpido y metstasis de
tumores slidos. Se han identificado muchos factores angiognicos incluyendo factor
es de crecimiento fibroblstico cido y base, angiogenina y factores de crecimiento
-o. y -|i transformados (Folkman, 1992; Wu, 1997). Ambos factores angiognicos y a
ntiangiognicos se han encontrado en el suero de pacientes con enfermedades malign
as (Morelli. 1998).
Anticuerpo heterfilo
El uso de MAb en inmunoanlisis y la creciente aplicacin clnica de MAb de ratones pa
ra dianas imaginarias y de la mmunoterapia establecen un nuevo problema. Los ind
ividuos tratados producen aparentemente anticuerpos heterfilos contra anticuerpos
murinos y esto interfiere con muchos de los inmunoanlisis de marcadores tumorale
s (Nahm, 1990). La interferencia de los anticuerpos heterfilos en suero humano pu
ede aumentar o disminuir los resultados de un inmunoanlisis. Estos anticuerpos re
accionan de un modo similar frente a antgenos en trminos de aglutinacin a anticuerp
os asociados a fase slida y marcados con una seal. Estos anticuerpos heterfilos se
pueden aglutinar en otro lugar distinto que el sitio analizado para la aglutinac
in, cruzando la seal del anticuerpo mediante el anticuerpo captura y gene|i -microglobulina
2
La [52M es la cadena ligera constante del antigeno del locus antignico de histoco
mpatibilidad humano (HLA) expresado en la membrana de la mayora de las clulas nucl
eadas. La |J2M slo tiene un peso molecular de 11,8 kDa. Cuando las clulas nucleada
s son metabolizadas. la cadena ligera (o |)2M) se vierte al lquido extracelular.
L a |52M es un marcador tumoral no especifico debido a que est elevado no slo en l
os tumores slidos sino tambin en las enfermedades linfoproliferativas (incluyendo
leucemia de linfocitos B crnica, linfoma de no Hodgkin y mieloma mltiple) (Wu. 198
6a). La concentracin de (32M se correlaciona con la actividad lintoctica y es un b
uen marcador para las neoplasias de la linea de linfocitos B. Se ha utilizado co
mo un indicador de la respuesta de los pacientes al tratamiento. Los niveles de
|2M en el liqui-

1038
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
po cefalorraqudeo (LCR) es til para detectar metstasis en el sistema nervioso centr
al (SNC). Se debera saber que las elevaciones sucesivas de en estas situaciones p
ueden tambin deberse al deterioro de la funcin renal, como sucede en el rion del mi
eloma.
CA19-9, CA 50 y CA 19-5
El CA 19-9 es el primer marcador tumoral de un grupo de nuevos eptopos. incluyend
o CA 125 CA 15-3 y CEA, definidos por anticuerpos monoclonales. Estos nuevos equ
ipos de monoclonales detectan los recin descubiertos epilopos y estaban destinado
s a sustituir las determinaciones policlonales de CEA en vanos carcinomas (Wu, 1
988a). El anlisis de CA 19-9 mide un carbohidrato angiognico determinante expresad
o en una mucina de alto peso molecular. El CA 19-9 es un eptopo reconocido por el
anticuerpo monoclonal 1116NS-199; se define como una lacto-W-fucopentosa II sia
lilada. La molcula, que transporta el epitopo CA 19-9, aparece como una mucina en
el suero de pacientes con cncer pero como un ganglsido en las clulas tumorales. El
CA 19-9 tambin est relacionado con las sustancias del grupo sanguneo de Lewis y slo
el antigeno serolgico de pacientes con cncer pertenecientes al grupo sanguneo Le(a
b) o Le(ab ) sern positivos para CA 19-9. Adems del CA 19-9, tambin se ha definido
otros dos marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales que son slo ligeramen
te diferentes del CA 19-9. Son el CA 19-5 y CA 50. El epitopo relacionado a CA 5
0 es muy similar al de CA 19-9 pero carece de residuo de lucosa, el mismo eptopo
encontrado en individuos con Lewis-negativo Le(ab~). Las concentraciones en suer
o de CA 19-9 no slo suelen estar altamente elevadas en carcinomas gstricos y pancr
eticos sino que son tiles para controlar el xito de la terapia y para detectar reci
diva en estos pacientes de cncer. Sin embargo, se ha visto que el CA 19-9 y CA 50
se complementan el uno al otro en el carcinoma pancretico y en otros carcinomas:
su uso simultneo mejorar la sensibilidad en la deteccin de estas enfermedades mali
gnas. El CA 19-5 es detectado por el anticuerpo monoclonal en ratones CC3C-195 y
reacciona tanto con el eptopo Le" como con el sialil-Le . El CC3C-195 se aglutin
a con alta afinidad con el antigeno del grupo sanguneo Le sialilado, pero exhibe
una baja afinidad con la forma no sialilada. Los niveles elevados en suero de CA
19-9, CA 50 y CA 19-5 tambin pueden verse en pacientes con carcinomas de colon,
pancretico y hepatocelular. La elevacin encontrada en enfermedades hepticas benigna
s puede deberse a coleslasis en estos pacientes (Wu, 1992).
a 1
variedad de adenocarcinomas, incluyendo mama, colon, pulmn, ovario y pncreas. El C
A 15-3 es un marcador muy sensible y especfico para controlar el curso clnico de p
acientes con cncer de m a m a metastlico. Significativamente ms pacientes tienen el
evados niveles circulantes de CA 15-3 que de CEA (96.2% frente a 69,8%). En gene
ral, el CA 15-3 se correlaciona con la progresin, la regresin, o la estabilidad de
la enfermedad en un mayor nmero de pacientes que el CEA Determinado CEA y CA 153 no se mejoran los resultados obtenidos slo con CA 15-3. Sin embargo, CA 15-3 ta
mbin puede estar elevado en hepatitis crnica, cirrosis heptica, sarcoidosis, tuberc
ulosis y lupus eritematoso sistmico (Tondini, 1988).
CA 72-4
El anlisis de CA 72-4 detecta un antigeno relacionado con adenocarcinoma humano p
arecido a la mucina, TAG-72, que tiene un alto peso molecular (>10 MW), como la
compleja molcula de mucina. Debido a que TAG-72 puede detectarse en el epitelio f
etal y en el suero de pacientes con diversos carcinomas, tambin se considera como
una proteina carcinoembnonaria. Sin embargo, slo se puede detectar CA 72-4 moder

adamente elevado en la mayora de los carcinomas. Actualmente, el CA 72-4 est consi

derado como el nico marcador til para el tratamiento de pacientes con carcinoma gst
rico, a pesar de su baja sensibilidad. El CA 72-4 puede ser til como uno de los ml
tiples marcadores para tumores derivados de clulas epiteliales. Los RA de CA 72-4,
CA 19-9 y CEA son complementarios unos con otros en la deteccin de diversos carc
inomas (Wu, 1992).
I,
Calcitonina
La calcitonina es una de las hormonas peptidicas circulantes que pueden llegar a
elevarse en pacientes con una tasa de recambio sea incrementada asociada a metsta
sis seas. La calcitonina puede encontrase ectpicamente elevada en carcinomas bronc
ognicos. Tambin se eleva en el carcinoma medular de tiroides.
Antigeno carcinoembrionario
El CEA es una glucoproteina con un peso molecular de aproximadamente 200 kDa. El
CEA es la primera de las denominadas protenas carcinoembrionarias que fue descub
ierta por Gold y Freedman (1965). El CEA sigue siendo el marcador tumoral ms exte
nsamente usado en la actualidad para el cncer gastrointestinal, pero la mayora de
los anlisis de CEA han reemplazado el anticuerpo policlonal por el anticuerpo mon
oclonal anti-CEA. Aunque el RA de CEA en suero no cumple con las expectativas ini
ciales, las intensas investigaciones sobre el CEA en los ltimos 20 aos nos han ens
eado muchas lecciones valiosas que tienen gran beneficio en el campo de los marca
dores tumorales. En un principio se pens que el CEA era un marcador especfico para
el cncer colorrectal. pero en nuevos estudios result ser un marcador no especific
o. Se aprendi en los estudios de CEA que los marcadores tumorales podian utilizar
se para seguir a los pacientes durante la terapia y para detectar las recidivas
despus de una ciruga exitosa. Tambin se descubri a travs de los estudios de CEA una a
sociacin entre una concentracin elevada en suero de marcador tumoral con metstasis
y mal pronstico. Como el CEA se metaboliza en el hgado, los daos hepticos pueden alt
erar la aclaracin del CEA y con ello provocar un aumento de los niveles en la cir
culacin sangunea. Se han observado concentracin elevadas de CEA en algunos paciente
s despus del tratamiento con radio y quimioterapia (Wu. 1986b).
CA125
El C A 125 es otro determinante angiognico definido por anticuerpos monoclonales
y tambin est relacionado con glucoproteinas parecidas a mucinas con un alto peso m
olecular (>200 kDa). El CA 125 se expresa en ms del 80% de los carcinomas epiteli
ales no mucinos ovricos. El CA 125 se encuentra en la mayora de los carcinomas de
ovano serosos, endometriales y de clulas claras (Jacobs. 1989). Sin embargo, los
pacientes sometidos a quimioterapia pueden mostrar un (also descenso del antigen
o CA 125, y un resultado negativo no siempre descarta la recidiva del tumor. El
CA 125, tambin se ha utilizado clnicamente en el seguimiento de tumores uterinos (
>60% estn elevados) y en tumores benignos, incluyendo endometnosis. Recientemente
, se est probando la determinacin de CA 125 en suero para determinar si puede util
izarse en la identificacin sistemtica del cncer ovrico Se ha indicado el uso de mltip
les marcadores para mejorar la especificidad y sensibilidad de las pruebas para
cncer ovrico (Wu. 1988b: Jacobs, 1989).
CA15-3
El CA 15-3 es un antigeno circulante relacionado con el cncer de mama identificad
o por dos anticuerpos monoclonales distintos. El anlisis emplea un anticuerpo mon
oclonal conjugado en fase slida, MAb 115D8. para capturar el antigeno MAM-6 en el
plasma humano y uno denominado MAb DF3 como marcador. MAb 115D8 se prepar contra
los glbulos grasos de leche desnalada humana mientras que MAb DF3 se prepar contr
a la linea celular MCG-7 del carcinoma de mama. El antigeno CA 15-3 est presente
en una
Oncoprotena c-erbB-2 (HER-2/neu)
El gen c-eroB-2 (HER-2/neu) es un miembro de la clase de los oncogenes relaciona

dos con la proteina tirosma cinasa. Se ha descrito que el gen c-erbB-2 se encuen
tra amplificado del 25% al 30% de cncer humano de mama y ovario. Se ha demostrado
que la amplificacin del c-eroB-2 es un predictor independente tanto de la recada c
omo de la supervivencia global, y es superior a todos los dems factores pronsticos
conocidos excepto cuando los ganglios linfticos son positivos. Recientemente se
ha

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

1039
deteclado que el c-eroB-2 es un til marcador para identificar a pacientes con cnce
r de mama, que se beneficiarn ms de altas dosis de quimioterapia adyuvante (Tandon
, 1989: Duffy, 1990). Hay una relacin directa entre la amplificacin del gen c-erbB
-2 y la sobreexpresin de la proleina c-erB-2. Como consecuencia, se ha visto que t
anto la amplificacin como la sobreexpresin de c-eroB-2 estn relacionadas con un mal
pronstico y con una escasa supervivencia y recidiva en diversos carcinomas. La p
rotena codificada por c-erbB-2 es un receptor transmembranoso de 185 kDa (p185);
tambin es una glucoprotena que tiene dominios intracelular, transmembrana y extrac
elular. La proteina c-erbB-2 muestra una semejanza estructural y funcional con e
l receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR). Recientemente se ha public
ado que el ectodominio de la oncoproteina c-erbB-2 se podra separar proteolticamen
te del receptor intacto y podra eventualmente descubrirse en la circulacin sangunea
Parece que el ectodominio secretado en la matriz extracelular del tumor de m a
m a corresponde con niveles de expresin de p185 en el tejido del tumor de mama. T
ambin parece existir una relacin entre el ectodominio serolgco y pl85. aunque no se
ha probado. En la actualidad hay estudios en marcha para determinar si el ectodo
minio serolgico de la proteina c-erB-2 puede utilizarse como un marcador pronstico
(Wu, 1995).
placenta y es una hormona heterodimrica compuesta por subunidades </. y p unidas
no covalentemente. Los trofoblastos malignos y no malignos sintetizan y secretan
no slo el dmero-(/p biolgicamente activo sino tambin las subunidades u y p no combi
nadas (o libres). Adems del dmero intacto, se ha detectado una subunidad p libre d
e hCG en el suero de las mujeres al inicio del embarazo y en pacientes con tumor
es malignos (vase Cap. 22). Sin embargo, se puede encontrar una elevacin de hCG en
tumores trofoblsticos, coriocarcinoma y tumores testiculares. Ms del 60% de los p
acientes con tumores no seminomatosos y entre un 10% y un 30% de los seminomas t
ienen una |i-hCG libre elevada. La determinacin de la subunidad p libre es til par
a la deteccin de recidiva de metstasis en el coriocarcinoma cuando la hCG intacta
sigue normal El anlisis de las subunidades hCG en suero puede ser especialmente ti
l en el tratamiento de pacientes con cancer seminomatoso, ya que en estos pacien
tes no se encuentra otro marcador tumoral elevado. El cncer testicular seminomato
so contiene hCG intacta y p-hCG o subunidades o libres en la misma proporcin; por
tanto, slo se necesita un anlisis para controlar a estos pacientes. Por otro lado
, en pacientes con cnceres no seminomatosos slo se encuentran hCG o subunidades phCG. La determinacin de las subunidades libres y de hCG intacta aumentar la sensib
ilidad de la prueba en pacientes con cnceres no seminomatosos. La produccin de p-h
CG ectpica libre se produce casi en el 30% de los pacientes con cncer urotelial, p
ero slo se detectaron la subunidad p-hCG libre y sus respectivos productos de deg
radacin, (i-core, en estas muestras clnicas. La -hCG es un marcador de malignidad e
n tumores endocrinos pancreticos (Madersbacher. 1992).
Cromogranina A
La cromogranina A es una importante protena soluble de los granulos cromafines. L
a cromogranina A puede liberarse de la mdula adrenal junto con catecolaminas tras
la estimulacin de nervios esplcnicos; sin embargo, no est limitada a clulas cromafi
nes de la mdula adrenal y neuronas simpticas: tambin existe en diversos tejidos neu
roendocrinos. Los niveles elevados de cromogranina A en suero pueden detectarse
en feocromocitomas y en el carcinoma microctico de pulmn (OConnor, 1984).
LASA-P
Los cidos silicos (cidos /V-acetilneuraminicos) son los derivados acilados del cido

neuramnico y los residuos terminales del extremo no reducido de las cadenas de ca

rbohidratos en glucoproteinas y glucolipidos. La LASA-P. por otro lado, se consi
dera como un marcador tumoral no especifico; se encuentra elevada en una varieda
d de enfermedades malignas, aunque tambin en enfermedades inflamatorias no malign
as. Esta ausencia de especificidad tumoral limita sustancialmente su utilidad co
mo un marcador tumoral para el diagnstico. La LASA-P tiene una sensibilidad muy b
aja, y slo se puede detectar en suero que contenga marcadores tumorales en elevad
as concentraciones, hablamos de rangos de mil nanogramos por milmetro de concentr
acin El mtodo ms comnmente usado para medir la LASA-P en suero es un procedimiento c
olonmtrico simple y baralo que utiliza cido tobarbitnco y resorcinol (Katopodis, 198
2).
CYFRA 21-1
CYFRA 21-1 es un fragmento de la citoqueratina 19 encontrada en el suero. Es una
subunidad del filamento de citoqueratina intermedio expresado en el epitelio si
mple y su anlogo maligno. La elevacin de CYFRA 21-1 indica un mal pronstico en el c
arcinoma de clulas escamosas de pulmn (Pujol, 1993).
Ciclinas
La progresin en el ciclo celular de las clulas eucariotas est controlada por la fam
ilia de ciclinas y las quinasas afines dependientes de ciclinas. Las distintas p
rotenas ciclinas se pueden encontrar en diferentes estadios del ciclo celular. Tr
es ciclinas diferentes marcan las diferentes fases del ciclo celular E para G, y
S precoz. A para S y G,. y B para G, tarda; la fraccin de clulas positivas para un cc
lico determinado predecir la fraccin en una fase determinada del ciclo celular. La
apariencia peridica de las ciclinas en las distintas lases del ciclo celular sug
iere que pueden utilizarse como marcadores de proliferacin tisular. Se ha detecta
do expresin elevada de varias ciclinas en extractos de cnceres humanos (Sherr. 199
6).
Enolasa neuronal especfica
La subunidad y de una isoenzima enolasa en la va glucoltica. que se encuentra pred
ominantemente en clulas neuronales y neuroendocnnas, se llama enolasa neuronal es
pecfica (NSE) y se identifica por inmunoanlisis. Los niveles elevados de NSE se pu
eden encontrar en tumores que se originan de clulas del sistema neuroendocrine Lo
s niveles de NSE en suero parecen ser marcadores relativamente especficos del cnce
r microctico de pulmn (SCLC) (85%). Se ha visto que es un marcador til para control
ar el tratamiento y predecir recadas en pacientes con SCLC (Burghuber, 1990).
Receptores de estrgeno y receptores de progesterona
La determinacin de receptores de estrgeno (RE) y receptores de progesterona (RP) e
n el citoplasma del tumor de m a m a se utiliza para identificar a las pacientes
que probablemente se beneficien ms de terapia endocrina. Los RE y RP positivos t
ambin indican buen pronstico, largo intervalo libre de enfermedad y larga superviv
encia en general. Aproximadamente del 55% al 60% de las pacientes cuyos tumores
primarios tienen RE positivos, y casi el 85% de las pacientes con RE y RP positi
vos, respondern a la terapia endocrina (Wu. 1997).
p53
La p53 es una fosfoproteina nuclear de 53 kDa y un regulador negativo del crecim
iento celular. Funciona como un supresor tumoral induciendo la expresin de produc
tos del gen que son responsables de la inhibicin o detencin del crecimiento y la p
roliferacin celular. La habilidad de la proteina p53 para regular la transcripcin
de estos genes diana se basa en la actividad aglutinante de la secuencia especfic
a del ADN y en la presencia de un dominio que puede activar la transcripcin cuand
o se une al dominio unido al ADN de otra protena. Es el dominio unido al ADN el q
ue parece ser sensible a la disrupGonadotropina corinica humana
La gonadotropina corinica humana es un miembro de la familia de las hormonas gluc

oproteicas, se sintetiza y secreta por los trofoblastos de la

1040
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
cin por mutacin y a ms lesiones relacionadas con cnceres humanos que producen en est
e dominio. Se ha visto que el gen codificador para p53 est mutado en casi la mita
d de prcticamente todos los tipos de cncer surgidos desde un espectro amplio de te
jidos. La inhibicin funcional de la activacin de p53 tambin parece jugar un papel e
n la gnesis tumoral humana. La sobreexpresin de algunos productos de oncogenes en
ciertos tumores sirve para aglutinar y enmascarar la activacin del dominio de p53
. La p53 puede determinarse tanto en tejido como en fibroblastos, clulas blancas
o en suero. Existe disponible en el mercado un inmunoanlisis de enzima sandwich d
e Oncogene Science para la cuantilicacin de protenas p53 desnaturalizadas mulantes
. Debido a la corta vida media (20 minutos), no se detecta la protena p53 en esta
do puro en la circulacin sangunea (Harris, 1993; Malkin. 1990).
Antgeno prosttico especfico
El PSA se sintetiza en las clulas epiteliales de la glndula prosttica y quiz sea el
mejor marcador tumoral descubierto hasta ahora. La especificidad tisular del PSA
hace que sea el marcador tumoral ms til disponible para la deteccin sistemtica y el
tratamiento del cncer de prstata. La ausencia de especificidad es el nico inconven
iente del PSA. Los procesos benignos como la HPB. la prostatitis y el infarto ta
mbin se correlacionan con niveles elevados de PSA en suero. Debido a su especific
idad tisular, el anlisis del PSA es particularmente til para controlar el xito desp
us de una prostatectomia quirrgica. La completa extirpacin de la prstata resultara en
un nivel de PSA indetectable; cualquier deteccin de PSA despus de una prostatecto
mia radical indicara persistencia de tejido prosttico o metstasis. En estos pacient
es, el incremento en las concentraciones de PSA despus de una ciruga con xito indic
a una recidiva de la enfermedad. Sin embargo, si la deteccin de PSA en suero desp
us de una prostatectomia radical se debe a una reseccin glandular incompleta y no
de persistencia de enfermedad, el nivel permanecer inalterable en los posteriores
seguimientos. H a y que saber que puede existir un aumento leve pero pasajero d
e los niveles de PSA durante la radioterapia, que no debe malinterpretarse como
progresin de la enfermedad. L a especificidad tisular del PSA tambin permite que e
sta prueba sea un excelente instrumento para detectar una recidiva despus de una
prostatectomia radical. Ha surgido una gran demanda para el desarrollo de una pr
ueba de PSA ultrasensible. Una prueba de PSA muy sensible permitira una deteccin p
recoz de recidiva y metstasis y proporcionara una mejor oportunidad para un tratam
iento con xito. Muchas de las pruebas de PSA actualmente disponibles en el mercad
o son capaces de detectar PSA en suero por debajo de 0,1 ng/ml. Se recomienda el
uso de PSA en suero junto con un DRE o ecografa transrectal de la prstata como in
strumento de examen para detectar cncer de prstata clnicamente significativo (Calal
ona, 1991; Brawer. 1992). El PSA es una serin proteasa capaz de unirse formando
complejos con diversos inhibidores de proteasa. En consecuencia, existe PSA en s
uero principalmente en forma de complejo PSA-ACT (PSA-ct.-anliquimotripsJna) (Ch
ristensson. 1993) (Fig. 47-8). Hay convencimientos de que la determinacin directa
del complejo PSA-ACT no slo elimina muchos problemas tcnicos relacionados con el
anlisis del PSA sino que tambin mejora la dilerenciacin de la HPB (hipertrofia pros
ttica benigna) del cncer de prstata (Wu, 1994,1998).
Protena pS2
L a pS2 es un pptido rico en cisteina inducido por estrgenos. Es una pequea protena
secretada por las clulas de la mama. Su deteccin en los citoplasmas de tumores de
m a m a permite que se pueda prever la respuesta a la terapia endocrina. Se ha v
isto que la expresin de pS2 est asociada a una supervivencia larga en general y li
bre de enfermedad. La pS2 negativa est asociada con recidiva precoz y mortalidad:

RE+ / RP+ / pS2+, del 85% al 97% tiene buen pronstico frente a RE+ / RP + / pS2, slo del 50% al 54% tiene buen pronstico
Hormona paratiroidea relacionada con pptidos
Las concentraciones en plasma de la hormona paratiroidea relacionada con pptidos
(PTH-RP) se encuentran elevadas en la mayora de pacientes con cncer asociado a hip
ercalcemia. Son secretadas por tumores asociados con hipercalcemia. Las formas c
irculantes de PTH-RP en estos pacientes incluyen tanto un pptido aminoterminal la
rgo como un pptido carboxitermnal con una secuencia similar homologa a la paratiri
na (PTH). El mecanismo por el cual PTH-RP induce hipercalcemia incluye aglutinac
in y activacin de receptores que tambin aglutinan PTH. La determinacin de las concen
traciones de PTH-RP puede ser til en el diagnstico diferencial de hipercalcemia re
lacionada con malignidad y asociada tambin con hiperparatiroidismo primario, sarc
oidosis, toxicidad de vitamina D o diversas neoplasias (incluyendo carcinomas de
clulas escamosas, renales de vejiga y de ovario). Se debera conocer que los pacie
ntes con afectacin de la funcin renal, pero sin hipercalcemia o cncer, pueden prese
ntar concentraciones en plasma de PTH-RP aumentadas (Burtis, 1990).
PSA libre
La determinacin del PSA libre (fPSA) y el clculo del %fPSA (%fPSA = [fPSA/PSA] x 1
00) se ha utilizado para diferenciar entre HPB y cncer de
En la circulacin sangunea, la mayora del PSA presente s e encuentra como complejo P
SA-ACT
Inmunoanlisis sandwich para el complejo PSA-ACT
Figura 47-8. La ilustracin muestra que la mayora del PSA existente en la circulacin
sangunea se e n c u e n t r a en forma de complejo PSA-ACT. La figura de la d e
r e c h a indica cmo se puede desarrollar un anlisis especfico para el complejo PSA
-ACT m e d i a n t e dos anticuerpos diferentes, uno para el P S A libre y otro
para ACT. en un formato s a n d w i c h

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIGICOS

1041
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pos monoconales especficos de citoqueratinas de epitelio simple. El TPA Engvall E.
Perlmann P: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Quantitative es un marcad
or sensible pero no especifico para diferenciar entre enfermedad assay of immuno
globulin G. I m m u n o c h e m i s t r y 1971; 8:871. en progresin y en remisin c
ompleta. Las elevaciones del TPA aparecen en Fidler IJ. H a r t IR Biological di
versity in m e t a s t a t i cn e o p l a s m s Origins and implicauna gran dive
rsidad de enfermedades inflamatorias y en el embarazo, asi como tions. Science 1
982: 2)7:998. Folkman J, Shing Y: Angiogenisis J Biol C h e m 1992: 267:10931 en
muchos tipos de t u m o r Muchos artculos insisten en el uso del TPA junto con u
t a t i o n s in p r i m a r y breast and otros marcadores, especialmente el CE
A, para controlar una gran diversidad de Futreal PA, Liu Q. Shattuck-Eidens D, e
t al: BRCAI m ovarian cancers. Science 1 9 9 4 266:120. carcinomas, incluyendo m

ama, colorrectal, ovario, vejiga y pulmn. El TPA tamGold P. Freeman SO: Demonstra
tion 61 tumor-specilic antigens in h u m a n colonic bin es vlido para detectar re
cidiva y para ayudar a diferenciar entre colangiocarcinomata by immunological to
lerance a n d absorption techniques. J E x pM e d 1965; 121 439. carcinomas (pos
itivo) y carcinoma hepatocelular (negativo). Harris CC. Hollstein M: Clinical im
plications ol the p 5 3 tumor-suppressor g e n eN Debe advertirse de que cualqui
er molcula puede utilizarse como marEngl J M e d 1993: 329:1318. cador tumoral si
empre que las variaciones en su concentracin reflejen H e b b a r M, Revillion F,
L o u c h e z M-M, et al: T h e relationship b e t w e e n concentrations of ci
rculating soluble E s e l e c t ma n d clinical, pathological, a n d biological
features cierta actividad celular tumoral. La valoracin de la utilidad clnica de u
n in patients with breast c a n c e r Clin Cancer R e s 1998; 4:373. marcador tu
moral particular se basa en su sensibilidad y especificidad. Ha J a c o b s I, B
a s t RC Jr: T h e CA 1 2 5 tumour-associated antigen: A r e v i e w ol t h e l
iteexistido una clara tendencia para mejorar la especificidad y sensibilidad de
rature H u m a n Reprod 1989; 4:1. la prueba al pedir mltiples marcadores tumoral
es. Sin embargo, todava Katopodis N: Lipid associated sialic acid test for t h e
detection ol h u m a nc a n c e r . Cancer R e s 1982: 42:5270 existen discrepan
cias respecto a cul y cuntos marcadores tumorales se Liotta LA: Biochemical m e c
h a n i s m s of t u m o r invasion and m e t a s t a s e s Ctrl Physiol deben i
ncluir en el panel de determinadas enfermedades malignas. El B i o c h e m 1987;
5:190. coste que conlleva la peticin de mltiples marcadores tumorales tambin Littr
up PJ. C o o d m a n AC, Metllin CJ: T h e benefit and cost of prostate c a n c
e r early puede ser prohibitivo. Existen varios marcadores tumorales nuevos posi
detection. CA Cancer J Clin 1993; 43:134. bles. Estos marcadores tumorales estn c
ompuestos de oncoprotenas. Madersbacher S, Klieber R, M a n n K: Free u-sbunit. f
ree |5-subunit of h u m a n chorionic gonadotropin (hCG), and intact h C G in se
ra ol healthy individuals a n d tesprotenas supresoras, molculas de adhesin, ciclin
as y factores angiogticular cancer patients Clin C h e m 1992: 38:370 nicos. stos
difieren sobre todo de los marcadores tumorales utilizados Malkin D U FP. Strong
LC, et al: Germ line p 5 3 mutations in a familial s y n d r o m e of actualmen
te en su asociacin con rutas metablicas especficas conocidas breast cancer, s a r c
o m a s and other neoplasms. Science 1990; 250:1233. o reacciones fisiolgicas. L
a mayora de los marcadores tumorales que se Miki Y. Swensen J, Shattuck-Eidens D.
et al: Isolation o f BRCA1. trie 17q-linked breast and ovarian cancer susceptib
ility gene. Science 1994; 266:66. emplean actualmente para el tratamiento de pac
ientes no estn asociados Milstein C, Cuello AC: Hybrid hybridomas and their u s e
in i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y con ninguna reaccin biolgica especfica
conocida. Posiblemente, midienNature 1983: 305:537. do estos nuevos marcadores t
umorales se proporcionar informacin Morelli D, Lasserini D. Cazzaniga S, el al: Ev
aluation ol the balance b e t w e e n angiosobre defectos ms especficos, lo que ay
udar al diseo de tratamientos genic and antiangiogenic circulating factors in pati
ents wilh b r e a s ta n d gastrointestinal cancers. Clin C a n c e rR e s 1998:
4:1221. ms apropiados. El mejor ejemplo es el clebre uso de Herceptin (un antiN a
h m MH, H o f f m a n n JW: Heteroantibody: P h a n t o m ol the i m m u n o a
s s a y Clin C h e m cuerpo monoclonal humano contra el ectodominio del receptor
c-erB-2) 1990, 36:829. en pacientes con cncer de mama metasttico. Slo las pacientes
con O'Connor DT, Bernstein KN: Radioimmunoassay of chromogranin A in p l a s m
a as a sobreexpresin de la oncoproteina c-eroB-2 (HEfl2) en su tumor son m e a s
u r e of e x o c y t o t i c sympatho-adrenal activity in n o r m a ls u b j e c
t sa n d patients with p h e o c h r o m o c y t o m a . N Engl J M e d 1984; 3
11:764. seleccionadas para el tratamiento Herceptin (Wu, 1999). Pronto estar disP
ujol J-L, Grenier J, Daures JP. et al: Serum fragment ol cytokeratin subunit 19
ponible un anlisis en suero de la oncoproteina c-erbB-2 (Wu, 1998). measured by C
Y F R A 21-1 immunoradiametric assay as a m a r k e r ol lung c a n c e r . Can
cer R e s 1993: 53:61. Schnipper LE Clinical implications of t u m o r cell hete
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the 1990s. Comparison of the n e w generation of m a r k e r s defined by m o n
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elevation ol s e r u mm a r k e r s in ovaran cncer bul not m benign disease. Cncer

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3:364. nosis in breast cancer. J Clin Oncol 1989; 7:1120. prstata, reduciendo por
tanto las biopsias innecesarias en pacientes con HPB. Un %fPSA alto (>23%) norm
almente se asocia a HPB, mientras que el cncer prosttico est asociado a un %fPSA ba
jo (<6%) (Catalona, 1995).

1042
SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA Wu JT. Clayton F. Myers S. Knight JA: A simple radial

immunodiffusion method for assay ol (^-microglobulin in serum. Clin Chem 1986a:
32:2070 Wu JT. Knight JA: Alpha-fetoprotein: Its use in clinical medicine ASCP c
heck sample. Clin Chem 1987 27:1. Wu JT. Knight JA: Monoclonal immunoassays for
tumor markers ASCP check sample. Clm Chem 1988a. 28:1. Wu JT. Knight JA, Knight
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cing the total PSA assay with Ihe assay for PSA(/.,-antichymotrypsin complex lor
the screening and managemenl ol prostate cancer J Clin Lab Anal 1998a: 12:32. W
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ays by glycosaminoglycans, and their removal Clin Chem 1983: 29:2049 Wu JT. Miya
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se of the ratio ol CA 125 to CEA. Clm Chem 1988b 34:1853 Wu JT, Nakamura R: Huma
n Circulating Tumor Markers Chicago. American Association ol Clinical Pathologis
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fine-needle aspirates. Am Clm Lab Sci 2000. 30:49-55 Wu JT, Zhang P, Lyons BW. W
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ent antigenic markers on moieties that bear CA 125 determinants Cancer Res, 1991
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ncer Res 1988: 48:4107 von Kleist S: What's new in tumor markers and their measu
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ide antigen (TPA) is related to the nonepidermai keratins 8. 18. and 19 typical
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ncer susceptibility gene. BRCA2. to chromosome 13q12-l3. Science 1994; 265 2088
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s Ann Clin Lab Sci 1989:19:17. Wu JT: Measurement ot AFP and its lectin reactive
isoforms in liver diseases and various malignancies. Ann Clin Lab Sci 1990: 20:
98 Wu JT: Assay for prostate specific antigen (PSA): Problems and possible solut
ions J Clin Lab Anal 1994: 8:51 Wu JT. Astill ME. Gagon SD. et al: Measurement o
f c-ertB-2 protein in sera from patients with carcinomas and in breast tumor tis
sue cytosols: Correlation with serum tumor markers and membrane-boumd oncoprotei
n. J Clin Lab Anal 1995; 9:151. Wu J T, Carlisle P: Low frequency and low level
ot elevabon of serum CA 72-4 in human carcinomas in comparison with established
tomor markers. J Clin Lab Anal 1992. 6:59. Wu JT Christensen SE: Effect ol dille
rent test designs ot immunoassays on "hook effect' of CA 19-9 measurement J Clin
Lab Anal 1991a. 5.228
1

S E C C I N
VI
Microbiologa mdica
Gail L. Woods, M.D. John Bernard Henry, M.D.

CAPTULO
48
Infecciones vricas
Michael Costello, PhD. Margare Yungbluth, M.D.
Cultivo de virus Deteccin de antigenos y deteccin molecular Serologa vrica Obtencin y
transporte de las muestras Equipos y material Sndromes clnicos infecciosos causad
os por virus INFECCIONES HERPTICAS MUCOCUTNEAS Aislamiento del virus del herpes si
mple mediante cultivo celular Deteccin directa del virus del herpes simple Diagnst
ico serolgico INFECCIONES VRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO 1053 Gripe (Influenza) Br
onquiolitis por virus respiratorio sincitial Crup Obtencin de muestras Ensayos pa
ra la deteccin de antigenos vricos Aislamiento de virus MONONUCLEOSIS INFECCIOSA E
INFECCIONES RELACIONADAS 1057 Diagnstico serolgico Mononucleosis infecciosa heterf
ilo-negativa Sndrome de la fatiga crnica INFECCIONES VRICAS CONGNITAS Y PERINATALES
Citomegalovirus Rubola Virus del herpes simple Virus de la inmunodeficiencia huma
na, parvovirus, enterovirus ENCEFALITIS Y MENINGITIS VRICA Diagnstico de laborator
io EXANTEMAS VIRALES GASTROENTERITIS VRICA Diagnstico de laboratorio HEPATITIS VRIC
A E INFECCIONES POR RETROVIRUS Virus de la inmunodeficiencia humana INFECCIONES
VRICAS EN HUSPEDES INMUNOCOMPROMETIDOS BIBLIOGRAFA 1065 1063 1064
1059
1050
1060
1067 1068
La virologa clnica es una ciencia que ha experimentado una profunda evolucin en los
ltimos 40 aos, de tal forma que hoy en da est claramente establecido que los virus
son la causa ms frecuente de enfermedades infecciosas en el hombre. El mbito de la
s enfermedades vricas es muy amplio, con manifestaciones que van desde el trivial
resinado comn hasta la reciente patologa consistente en un estado de inmunosupres
in de consecuencias fatales, resultante de la destruccin de los linfocitos T-CD4 p
or el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Los mtodos de cultivo inicialmente
disponibles para llevar a cabo el aislamiento e identificacin de los virus eran
complejos y tediosos y, en consecuencia, poco prcticos para ser utilizados de for
ma sistemtica en el diagnstico. Sin embargo, debido a la epidemia de infecciones v
enreas producidas por el virus del herpes simple, al incremento en el nmero de pac
ientes inmunocomprometidos que padecen infecciones oportunistas y al desarrollo
de agentes antivirales eficaces, se ha generado una fuerte demanda de servicios
de virologa clnica que sean accesibles fcilmente. En este contexto, hoy en da los ho
spitales, tanto los municipales como los universitarios, asumen como algo habitu
al la confirmacin de las infecciones respiratorias, del sistema nervioso central
(SNC), gastrointestinales (Gl) y diseminadas, causadas por virus. Un diagnstico e
specfico de una infeccin vrica es de gran ayuda para el mdico de cara a optimizar la
s condiciones de hospitalizacin del paciente y a administrar la quimioterapia ant
ivrica ms apropiada en cada caso; de este modo, se evitan o reducen los tratamient
os innecesarios y se consigue un ahorro significativo en los procedimientos diag
nsticos, implementando al mismo tiempo los mtodos d e aislamiento ms eficaces para
limitar la diseminacin nosocomial de los virus. Los beneficios secundarios para l
a salud pblica de una diagnstico preciso no deben ser pasados por alto; los datos
epidemiolgicos sobre la gnpe, el sndrome de inmunodeficiencia adqumda (sida), las
infecciones por arbovirus y enterovirus y el herpes venreo representan una inform
acin tan valiosa como la compilada sobre la tuberculosis, la salmoneltosis. la go
norrea y la sfilis.
Existen varios trabajos de excelente calidad que contienen informacin sobre la ta
xonoma y patogenicidad de los virus humanos (Fields. 1996; Topley, 1998; Murray.

1999). En este capitulo se revisan los sndromes infecciosos de origen vrico ms comu
nes y que son responsables de la mayor parte de pruebas diagnsticas que se llevan
a cabo en un laboratorio de microbiologa clnica tpico. Se analizarn los aspectos re
lativos a la organizacin del laboratorio, equipos y suministros, recogida de mues
tras y seleccin de las pruebas, junto con los mtodos habituales de aislamiento e i
dentificacin que tienen una mayor aplicacin prctica en clinica. Ya que las enfermed
ades vricas son tan comunes y afectan tanto a los nios y adultos sanos como a inmu
nocomprometidos, la mayor parte de hospitales municipales registran una mezcolan
za de casos clnicos que justifica la existencia de un servicio de virologa. En la
Tabla 48-1 se recogen los datos relativos al nmero de pruebas de aislamiento y de
deteccin de anlgenos, asi como las frecuencias de recuperacin en el General Hospit
al Lutheran, un centro mdico suburbano de 600 camas localizado en Chicago, con un
gran volumen de atencin pnmaria peditrica y de adultos y servicios de obstetricia
, neonatologia y hematologa'oncologia de alto riesgo. Esta mezcla de pacientes co
nlleva una amplia variedad de infecciones vricas comunes; en otros hospitales con
diferentes perfiles de especialidades mdicas se recuperarn bsicamente los mismos t
ipos de virus, aunque pueda haber variaciones en los porcentajes relativos de ai
slamiento. El tiempo medio requerido para la deteccin de la mayor parte de virus
es corto (a menudo, dos das o menos) y. desde luego, est en la m i s m a escala de
tiempo que se necesita para el aislamiento habitual de baclenas mediante cultiv
o. Ello es consecuencia del uso de pruebas rpidas para la deteccin de antigenos y c
idos nucleicos (utilizando las correspondientes sondas especificas) y de cultivo
s en "shell vial" que necesitan cortos periodos de incubacin. El porcentaje de re
cuperacin es alto -del 15% al 38%- y, por lo general, vanas veces superior al val
or que se obtiene en el caso de los

1046
I .
:
SECCIN VI

1
MICROBIOLOGA MDICA
: ,
~~
:
"
Tabla 48-1 Deteccin de virus: frecuencias de aparicin, tiempos de deteccin medios y
frecuencias de positividad viral (Lutheran General Hospital, Park Ridge, II) Vi
rus Virus del herpes simple Cilomegalovirus Adenovirus Virus de la influenza A E
nlerovirus Virus de la vancela-zsler Virus de la influenza B Virus de la parainfl
uenza Virus respiratorio sincitial Sarampin y paperas Total de muestras procesada
s Porcentaje de recuperacin de virus 1995 34% 3% 5% 6% 8% 2% 1% 6% 27% <1% 3.323
21% 1998 25% 4% 6% 11% 7 % 1% <1% 4% 41% 0% 3.040 23% Tiempos de deteccin medios
(das) 2 3 3 2 4 3 2 2 0,33 5
hemocultivos o los cultivos de heces ordinarios, los cultivos de micobacterias y
el examen en busca de parsitos y sus huevos (Costello, 1996). Muchos de los viru
s ms comunes muestran variaciones estacionales. Las epidemias de gripe y de las i
nfecciones por virus respiratorio sincitial (VRS) se repiten anualmente durante
los meses fros, al igual que sucede para las infecciones por los virus tipo 1 y t
ipo 2 de la parainfluenza. Las infecciones por adenovirus, virus tipo 3 de la pa
rainfluenza, citomegalovirus (CMV) y virus del herpes simple (VHS) tienen lugar
a lo largo de todo el ao. Las enfermedades provocadas por enterovirus se concentr
an al final del verano y principio del otoo (Fig. 48-1). Estos patrones de distri
bucin temporal de la incidencia de las diferentes infecciones provocan fluctuacio
nes en las necesidades de personal de laboratorio que son particularmente proble
mticas en los hospitales peditricos. En la Tabla 48-2 se muestran los tres mtodos p
rincipales para el diagnstico de laboratorio, todos los cuales tienen ventajas y
limitaciones. Las tcnicas de cultivo y deteccin de antigenos requieren que en la m
uestra existan virus viables o fragmentos del virus relativamente intactos; las muestras deben obtenerse
del lugar en donde est teniendo lugar la replicacin activa del virus, durante la
fase aguda de la infeccin. Debido a su mayor sensibilidad, las tcnicas de hibridac
in con sondas de cidos nucleicos especficas permiten una m a y o r libertad a la ho
ra de obtener el espcimen; sin embargo, la interpretacin de los resultados puede s
er ms difcil, puesto que es posible seguir observando valores positivos con estas
tcnicas, incluso durante la fase de recuperacin o convalecencia. Los ensayos con s
ondas pueden discriminar entre infeccin activa y latente mediante la deteccin de c
omponentes del genoma vrico que estn replicndose activamente; por ejemplo, el ensay
o de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la transcrptasa revers
a (RT) (RT-PCR) para ARN especfico de CMV indica replicacin activa del virus, mien
tras que la PCR especfica para ADN puede dar tambin un resultado positivo durante
la fase de latericia. El diagnstico serolgico tradicional requiere el anlisis de do
s muestras de suero, una tomada durante la fase aguda y la otra durante la de co
nvalecencia de la enfermedad, para poner de manifiesto un incremento de cuatro v
eces o superior en el ttulo de anticuerpos especficos frente al virus entre ambas
muestras. Aquellos mtodos que detectan IgM especficas frente al virus permiten dia
gnosticar la enfermedad aguda a partir de una nica muestra de suero obtenida dura

nte la lase aguda o al comienzo de la fase de convalecencia de la enfermedad. Po

r ltimo, las pruebas que identifican inmunoglobuiinas especificas del tipo IgG se
utilizan habtualmente para poner de manifiesto la existencia de un estado inmune
en el individuo frente a un determinado agente viral. En la actualidad, todos l
os materiales y reactivos necesarios para llevar a cabo el aislamiento de virus,
los ensayos de deteccin de antgenos virales y los mtodos serolgicos estn disponibles
comercialmente. Los laboratorios de virologa ya no necesitan mantener las lneas d
e cultivos celulares o preparar sus propios reactivos, al igual que un laborator
io de microbiologa general tampoco utiliza medios de cultivo y colorantes prepara
dos de forma casera. El nmero de virus que puede identificarse y cuantificarse me
diante ensayos de amplificacin de cidos nucleicos contina aumentando, aunque slo estn
disponibles unos pocos sistemas comerciales de aplicacin general basados en esta
tecnologa. En este contexto, los procedimientos particulares son la regla ms que
la excepcin y necesitan una buena experiencia tcnica y un severo control de calida
d para garantizar la precisin y Habilidad del diagnstico.
Adenovirus Herpes simple Citomegalovirus Varieela-zster Sarampin Paperas Virus res
piratorio sincitial
Parainfluenza tipos I y 2 Parainfluenza tipo 3
Influenza A y B
Enterovirus Arbovirus Rotavirus
Figura 48-1. Variacin de la aparicin de infecciones vricas en funcin de la estacin de
l ao.

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1047
Tabla 48-2 M t o d o s d e laboratorio para e l diagnstico d e las infecciones vi
rales Cultivo de tejidos Cullivo en tubo (monocapa estndar de clulas) Mtodos de cul
tivo potenciados mediante centrifugacin (monocapa de clulas en "shell-vials'/monoc
apa de clulas mixtas) Deteccin de antigenos/cidos nucleicos del virus en el espcimen
del paciente Tincin directa con anticuerpos fluorescentes (DFA) Enzimonmunoensayo
(EIA) Ensayos directos con sondas de cidos nucleicos (hibridacin in situ, HIS) y
tcnicas de amplificacin (PCR, RT-PCR, SD. bADN. LCR. TMA. HC. etc.) Secuenciacin de
genomas (VIH. VHC. ele.) Scrologia Pruebas con anticuerpos policlonales Mtodos e
specficos para IgM. IgG. e igA HIS = Inundacin in situ. T M A amplificacin mediada
po' transcripcin. PCR = reaccin en cadena de la polimerasa; R T P C R = reaccin en
cadena de la polimerasa de la transcriptasa reversa SD = desplazamiento de caden
a; bDNA = ensayo de ADN ramificado, LCR reaccin en cadena de la ligasa. VIH = vir
us de la inmunodeficiencia humana; VHC = virus de la hepatitis C A pesar de esta
s restricciones, los mtodos basados en la biologa molecular son particularmente at
ractivos para la identificacin de virus que se propagan lentamente, o incluso no
lo hacen, en los cultivos celulares, y, en teora, deberan proporcionar una sensibi
lidad y una precisin cuantitativa superior a la que tienen los sistemas convencio
nales.

Cultivo de virus
L a propagacin de virus en cultivos de tejidos se consigui por primera vez h a c e
ms de 50 aos, y hoy en da aun contina siendo el procedimiento ms verstil y amplio pa
a el diagnstico de las infecciones vricas. Muchos virus (aunque no todos) de impor
tancia clnica son capaces de replicarse en cultivos celulares, existiendo una cor
relacin entre la recuperacin del virus y la fase aguda de la enfermedad correspond
iente. Sin embargo, el cultivo requiere m u c h o esfuerzo y experiencia tcnica,
y generalmente implica al menos uno o dos das de espera para obtener resultados p
ositivos. La replicacin en tejidos de ratn recin nacido o en huevos embrionados pue
de ser preferible, o incluso esencial, para algunos virus incmodos: sin embargo,
la mayor parte de laboratorios clnicos confan en los cultivos de lneas celulares in
vitro. y, en consecuencia, la inoculacin en animales o huevos se realiza m u y r
aramente fuera de los laboratorios de investigacin o de las instituciones de salu
d pblica (Nalonen, 1998). Los cultivos de tejidos celulares se dividen en tres ca
tegoras: cultivos primarios, lineas celulares diploides y lneas celulares heteropl
oides. Los cultivos celulares primarios se preparan a partir del rgano original d
irectamente (como puede ser rion de mono o de conejo). Las clulas son separadas in
dividualm e n t e mediante triturado y tratamiento con tripsina, y la mezcla de
clulas resultante se transfiere a tubos de ensayo o "shell-vials", donde las clula
s se unen formando u n a monocapa confluente. El cultivo de clulas se recubre con
un medio que mantiene su viabilidad, consistente en una solucin salina tamponada
a pH fisiolgico que contiene sales minerales, glucosa, aminocidos, vitaminas y col
adores. El medio mnimo esencial de Eagle en solucin salina balanceada de Earl o de
Hanks es la combinacin utilizada ms frecuentemente c o m om e d i o nutritivo par
a los cultivos celulares: usualmente se le aade una baja concentracin de suero let
al bovino rico en protenas y pobre en inmunogtobulinas. con objeto de mantener en
buenas condiciones fisiolgicas la m o n o c a p a de clulas, pero sin favorecer s
u proliferacin. Las lineas de clulas diploides son generalmente fibroblastos que d
erivan de pulmn o de prepucios de recin nacidos, la mayora de los cuales tienen una
dotacin diploide d e cromosomas normal. Estas clulas se propagan en un medio de c
ultivo rico, con suero, y pueden ser subcultivadas de 20 a 50 veces antes de que
pierdan su viabilidad; algunos tipos celulares de esta categora son MRC-5, wl-38

y los fibroblastos procedentes de prepucio. Las lneas de clulas heteroploides der

ivan de tumores malignos y son clulas "inmortalizadas" que pueden ser subcultivad
as indefinidamente: tienen un genoma aneuploide y s e dividen rpidamente. Las lnea
s celulares heteroploides ms populares son HEp-2 (denvada de un carcinoma larngeo)
. HeLa (de un carcinoma cervical) y A549 (tambin de un carcinoma larngeo). Los cul
tivos primarios deben examinarse para comprobar que no estn contaminados por viru
s endgenos. Las lneas diploides y heteroploides deben examinarse peridicamente para
comprobar tanto la ausencia de contaminacin por micoplasmas c o m o que sigan si
endo susceptibles a la infeccin por virus. Lgicamente, si las clulas son adquiridas
comercialmente. todos estos controles, que implican una gran inversin de tiempo,
son responsabilidad de la firma suministradora. Las lineas celulares "hbridas" r
epresentan un nuevo concepto: en este caso, la monocapa est constituida por una m
ezcla de dos tipos celulares distintos capaz de permitir el crecimiento de una a
mplsima gama de virus. Un ejemplo de esta categora es el sistema R-Mix (Diagnostic
Hybrids) formado por clulas A549 y clulas de pulmn de visn. en un medio de mantenim
iento que contiene tripsina, y que permite la recuperacin de varios patgenos respi
ratorios, c o m o los virus de la gripe y parainfluenza. VRS y adenovirus. Los v
irus no infectan con igual afinidad todos los tejidos humanos y tambin difieren e
n su capacidad para replicarse en las lneas celulares de los cultivos de tejidos,
por lo que para incrementar al mximo las probabilidades de recuperacin cada espcim
en debe inocularse en diferentes lneas celulares. La Tabla 48-3 muestra una lista
de varias lneas de cultivos de tejidos con los virus que son capaces de infectar
las. Todas estn disponibles en el comercio y pueden suministrarse en tubos, shell
-vials, o en frascos a granel (Fig. 482). Cada laboratorio debe seleccionar las
lneas que necesite para cubrir todas sus necesidades, en tuncin de los tipos de vi
rus que ms frecuentemente se aislan a partir de la poblacin de pacientes que estn b
ajo su responsabilidad, aunque los requerimientos en el nmero y tipo de cultivos
celulares puedan variar para aiustarse a los cambios estacionales en la incidenc
ia de las diferentes infecciones virales. La replicacin de los virus en las monoc
apas de clulas se pone de manifiesto mediante el examen de la lmina de clulas con u
n microscopio invertido de contraste de fases, con objeto de observar las altera
ciones citopticas causadas por la proliferacin del virus. Las monocapas de clulas e
n tubo tienen una gran versatilidad: una nica lnea celular puede permitir el creci
miento de varios virus, siempre que cada uno de ellos cause un efecto citoptico (
ECP) distintivo, o bien

1048
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Deteccin de antgenos y deteccin molecular
La identificacin rpida (menos de un da de espera) de virus por mtodos directos es es
pecialmente til en los casos para los que hay disponible una terapia antivrica esp
ecfica (p. ej.. en las infecciones causadas por VHS. VVZ. CMV. virus de la gripe
o VRS) y cuando existe riesgo de infeccin nosocomial (como es el caso del virus d
e la gripe, VRS, rotavirus y VVZ). Los antgenos virales pueden ser detectados con
una sensibilidad y especificidad semejantes, tanto por inmunofluorescencia dire
cta (DFA) como mediante enzimoinmunoensayo (EIA). El test DFA tiene la ventaja d
e que permite observar la celularidad del espcimen, lo que permite establecer fcil
mente si la muestra es adecuada (Rossier, 1989). La realizacin del mtodo DFA requi
ere una inversin considerable de tiempo y esfuerzo, lo que es un inconveniente im
portante, ya que implica una carga adicional de trabajo en aquellos laboratorios
en los que se procesa un gran nmero de muestras. El EIA puede ejecutarse de form
a mucho ms automatizada y la interpretacin de los resultados obtenidos con el mism
o es menos subjetiva que la de los datos del test DFA, aunque el EIA no permite
determinar la calidad de la muestra. Para el mtodo DFA es recomendable utilizar u
n microscopio equipado con epifluorescencia, y deben Figura 48-2. Ejemplos de di
lerent.es tipos de cultivos de tejidos suministrados p o r fir- realizarse en pa
ralelo, de forma habitual, controles positivos y negativos. La m a s comerciales
. En los sistemas tradicionales en tubos, la m o n o c a p a de clulas mayor part
e de los procedimientos basados en el EIA estn adaptados para el c r e c e en u n
o de los lados de los mismos, y son transportados e incubados en la anlisis de m
uestras individuales, e incluyen tanto el control positivo c o m o el orientacin
c o r r e c t a (horizonlalmente) para que el medio de mantenimiento est negativo
incorporados directamente en las placas de un solo uso. Los proces i e m p r e
en contacto con la lmina de clulas. En los tubos shell-vial, la m o n o c a p a de
dimientos automatizados de EIA para el anlisis masivo combinan en un clulas est ad
herida sobre un cubreobjetos de vidrio que se encuentra en el fondo del recipien
te, junto con un volumen de 2 mi de m e d i o de mantenimiento, y se alma- mismo
equipo todos los componentes necesarios para el lavado, lectura espectrofotomtri
ca y procesado de datos. Los controles se realizan indivicenan, transportan e in
cuban en posicin vertical. dualmente para cada ensayo, y la interpretacin de los d
atos de la lectura se lleva a cabo de acuerdo con un valor de corte establecido
previamente. algn otro tipo de manifestacin caracterstica (hemaglutinacin, hemoadsor
cin, interferencia). Los ECP pueden aparecer entre uno y tres das (en el caso Los
mtodos de hibridacin y amplificacin detectan a los virus mediante el del VHS), o pu
eden tardar de 5 a 20 das en ser detectados (VRS, virus de la reconocimiento de s
ecuencias especficas del genoma de ADN o ARN vrico. varicela-zster [VVZ], CMV); por
tanto, la mayor parte de cultivos deben ser La hibridacin ir) situ (HIS) es una
tcnica directa utilizada en patologa quirrincubados dos semanas, o incluso ms. En la
tcnica que implica la utilizacin gica para identificar, mediante sondas especficas
, el virus del papiloma de cultivos celulares en shell-vials, la lmina de clulas d
escansa sobre un humano (VPH), CMV, VHS y parvovirus B19: la especificidad de la
m i s m a es cubreobjetos redondo, que se coloca en el shell-vial con la monoca
pa orientada excelente, aunque su sensibilidad por debajo de los valores ptimos l
imita, en hacia arriba. El espcimen es inoculado en el recipiente, que es seguida
mente gran medida, su aplicacin en clnica. Los mtodos de amplificacin han increcentr
ifugado para favorecer la adhesin de los virus a las clulas. Tras un corto mentado
la sensibilidad del diagnstico molecular ms all de los valores que, perodo de incub
acin, generalmente de uno a tres das, la monocapa de cluen este contexto, tienen lo
s ensayos para la deteccin de antgenos y las tclas es analizada mediante inmunofluo
rescencia para detectar la presencia de nicas de cultivo, mediante la amplificac

in exponencial de la secuencia oligoantgenos virales especficos (Gleaves, 1985). El

cultivo en shell-vials es un pronucleotdica del virus elegida como diana (PCR y
desplazamiento de cadena cedimiento idneo para identificar un nico tipo de virus (
VHS) o un nmero limi[SD]), la amplificacin de la seal quimioluminiscente (captura d
e hbridos [HC] tado de virus (VRS y virus de la gripe), y para agentes de crecimi
ento lento (CMV y ADN ramificado [bADN]), o por amplificacin de la sonda o la seal
(reaccin y VVZ). El material procedente de las lesiones vesiculares causadas por
el VHS en cadena de la ligasa [LCR] e Invader). La amplificacin por las tcnicas d
e es un candidato excelente para intentar el aislamiento del virus mediante la tc
PCR y bADN se ha convertido en el estndar de eleccin para la monitorizanica del cu
ltivo en shell-vials, la sensibilidad roza el 100% y el tiempo de espera cin cuan
titativa del VIH y el virus de la hepatitis C (VHC). L a PCR es el para los cult
ivos negativos se reduce de siete das a tan slo uno. Los shell-vials mtodo preferid
o por su gran sensibilidad para el diagnstico de la meningitis tienen una eficien
cia comparable o incluso superior a la del mtodo en tubo para por enterovirus y l
a encefalitis por VHS (Tang, 1998: Read, 1999); la deteccin la recuperacin de CMV
a partir de orina, aunque se recomienda realizar un culdel virus Epstein-Barr (V
EB) en el liquido cefalorraqudeo mediante PCR es un tivo suplementario en tubo a
partir de una muestra de sangre perifrica para diagnstico positivo de linfoma del
sistema nervioso central (SNC) en pacienaumentar las posibilidades de aislamient
o de este tipo de virus. En la Tabla 48tes con sida. La PCR cuantitativa de CMV
en fluido bronquioalveolar o en san4 se indican diversas situaciones en las que
la utilizacin de los cultivos en shellgre permite predecir una neumona viral en pa
cientes sometidos a un trasvials est recomendada para la deteccin de virus. plante
de mdula sea. La automatizacin de los mtodos de amplificacin, con la incorporacin de
estndares internos para detectar inhibicin y de protocolos experimentales configur
ados para evitar la contaminacin cruzada de amplicones, ha acortado los plazos de
obtencin de resultados y reducido los errores de interpretacin debidos a los fals
os positivos y negativos. Aunque todava no hay una gran cantidad de reactivos dis
ponibles en el mercado, hay varios sistemas para la identificacin de virus patgeno
s comunes basados en sondas gnicas que estn actualmente en fase de desarrollo. L a
visualizacin directa de los viriones mediante microscopa electrnica (ME), utilizan
do tincin negativa con cido fosfotngstico o fijacin con osmio seguida de tincin con a
cetato de uranilo. es un mtodo empleado para detectar aquellos virus que no crece
n en las lineas celulares estndar o para una demostracin rpida de la presencia de v
irus en una muestra. La ME ha sido una tcnica de gran ayuda, particularmente para
identificar el agente causal en c a s o s de gastroenteritis vrica: rotavirus. a
denovirus intestinales, virus Norwalk, astrovirus y calicivirus se multiplican m
u y pobremente, o no lo hacen en absoluto, en los cultivos de clulas en monocapa
. pero tienen caractersticas ultraestructurales distintivas que permiten su ident
ificacin al microscopio electrnico.

CAPTULO 48 Tabla 48-5

INFECCIONES VRICAS
1049
Aplicaciones de la serologia para el diagnstico de las infecciones virales Virus
IgG VHA, VHB rubola, sarampin, paperas. WZ IgM VHA, VHB. VEB. sarampin. paperas, ru
bola, parvovirus Bt9. arbovirus IgG: VIH. VHB, VHB. VHC, VLHT Sndrome de Rev (influ
enza, WZ) poslmlecciOn PEES (sarampin) IgG: VHB. VHC. VIH. CMV. VLTH
Aplicacin Demoslraci inmunidad preexistente Mtodo diagnstico pretendo por su relacin
coste/eficacia
Diagnstico de Control de la infec hemoderivados
VHA = virus de la hepatilis A: VHB = virus de la hepatitis B: VHC = virus de la
hepatitis C VEB = virus de Epstein-Barr; VIH = virus de la inmunodeliciencia hum
ana VLTH = virus de la leucemia humana de clulas T, PEES = panencela lilis escler
osante subaguda. Pora ver el signilicado de otras abreviaturas, consltense las Ta
blas 48-3 y 48 4
Serologia vrica
El diagnstico serolgico de las infecciones virales representa una alternativa atra
ctiva, ya que las muestras de suero pueden obtenerse, transportarse y almacenars
e con gran facilidad. La serologia viral tiene dos mbitos de aplicacin principales
: diagnosticar una infeccin reciente y poner de manifiesto la existencia de inmun
idad previa. El diagnostico de infeccin actual o reciente requiere la deteccin de
IgM especificas frente al virus en una muestra de suero obtenida durante la lase
aguda de la infeccin o durante la observacin de un incremento de cuatro veces o s
uperior en ttulo de IgG especficas entre dos muestras de suero, una tomada durante
la fase aguda y otra en la de convalecencia. Las IgM
especificas estn presentes en sangre generalmente durante la primera semana de la
infeccin primaria, para hacerse despus prcticamente mdetectables entre el pnmer y
tercer mes siguientes: el enzimonmunoensayo es ms sensible y es capaz de detectar
IgM persistentes aproximadamente durante el doble de tiempo del que es posible h
acerlo con la inmunofluorescencia. Se puede incrementar la sensiblidad y especif
icidad de los ensayos para detectar IgM eliminando del suero el factor reumatoid
e y las IgG, para evitar la competicin de estas ltimas con las IgM con los antigen
os virales. Las IgG especificas aparecen entre una y dos semanas despus de la inf
eccin primaria, y su titulo v a aumentando hasta alcanzar un pico entre las cuatr
o y las ocho semanas para comenzar a bajar a partir de este momento, aunque pued
en ser detectadas oe forma indefinida. La respuesta inmune secundana que aparece
c o m o consecuencia de una reinfeccin o reactivacin vrica da lugar a un perfil se
rolgico diferente: las IgM pueden aparecer transitonamente. con un titulo baio, m
ientras que el ttulo de IgG aumenta muy rpidamente, alcanzando el peo a unas conce
ntraciones ms altas que las observadas durante la respuesta primana Por supuesto,
estos son patrones o perfiles generales: la intensidad, especificidad y tipo de
respuesta (clase de mmunoglobulina producida) estn condicionados por el tipo del
virus infectivo, el sitio donde se ha producido la infeccin y la situacin inmunolgc
a del paciente. En las infecciones congmtas, los anticuerpos (IgG) matemos pasan
a la circulacin fetal a travs de la placenta, aunque cualquier otra clase de mmuno
globulinas (IgM, IgA o IgE) presentes en la sangre del leto, del cordn umbilical
o del recin nacido, son producidas por el feto o por el neonato en respuesta a un
a infeccin primana perinatal La serologia puede ser utilizada como un respaldo a
los mtodos de deteccin directa y de cultivo de virus, especialmente en el caso de
que la calidad del espcimen o las condiciones de transporte del mismo no hayan si

do las ms adecuadas. Si durante el primer examen del paciente no ha existido nada

que hiciese sospechar la existencia de una infeccin vrica, la serologia puede ser
el
Tabla 48-6
Obtencin de muestras para el diagnstico de los s n d r o m e s virales c o m u n e
s Virus VRS. parainfluenza 1,3, adenovirus. influenza A y B Influenza A y B VRS
. parainfluenza 3, influenza A y B, adenovirus VHS. adenovirus. clamidias. enter
ovirus. WZ. sarampin VHS. WZ. enterovirus VHS E s p c i m e n preferido y condici
ones de transporte SNF LBA transportar inmediatamente en hielo SNF o hisopado de
garganta en MTV. esputo. LBA. transportar inmediatamente en hielo SNF. LBA. his
opado de garganta en MTV: transportar inmediatamente en hielo Hisopados o exfoli
ados de la conjuntiva en MTV. transportar inmediatamente en hielo Fluido de vescu
las/clulas en MTV, frotis secados al aire, transportar inmediatamente en hielo Fl
uido de vesculas/clulas en M T V , frotis secados al aire; transportar cuanto ante
s LCR", hisopado de garganta, heces. transportar inmediatamente Validacin de los
e s p e c m e n e s Clulas columnares o macrfagos alveolares Clulas columnares o ma
crlagos alveolares Clulas columnares o macrfagos alveolares Clulas epiteliales Clulas
epiteliales Clulas epiteliales Pruebas ms tiles DFA. EIA cultivo
Sndrome Bronquiolitis/bronquitis
Gripe Neumona Conjuntivitis Exantema vesicular Infeccin genital Meningitis Encefal
itis Enteritis
DFA. EIA, cultivo DFA, EIA. cultivo DFA, EIA. cultivo DFA cultivo Cultivo. DFA P
CR. cultivo PCR. cultivo. DFA. serologia EIA, ltex. ME
Infeccin viral diseminada
Enterovirus. VHS. paperas WZ. adenovirus. VLCM, sarampin VHS, arbovirus, Biopsia
de tejido cerebral fresco. Enterovirus, rabia LCR. suero (arbovirus); transporta
r inmediatamente Rotavirus, adenovirus Heces frescas (heces, paales El hisopo deb
e estar (40.41), calicivirus. o hisopados rectales), cubierto ms de un Coronaviru
s, asirovirus. transportar cuanto antes 75% con las heces virus Norwalk CMV, VHS
. WZ, Orina (en hielo), sangre (a temperatura adenovirus ambiente), LBA, biopsia
pulmonar (en hielo); transportar inmediatamente
Cultivo, prueba cuantitativa para CMV. PCR cuantitativa (en investigacin)
SNF = secrecin nasofarngea: LBA = lavado bronquioalveolar. DFA = fluorescencia dir
ecta con anticuerpos; EIA = enzimonmunoensayo; MTV = medio de transpone para viru
s; VLCM = virus de la linlocoriomenmgitis LCR = liquido cefalorraqudeo. PCR = rea
ccin en cadena de la polimeasa; ME = microscopa electrnica Para ver el signilicado d
e otras abreviaturas, consltense las Tablas 4 8 - 3 y 4 8 - 4 'Los cultivos a par
tir de muestras de LCR pueden ser positivas en el caso de neonatos, pero raramen
te lo son en el caso de adultos con encefalitis causada por el VHS.

1050
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
nico procedimiento diagnstico disponible, una vez se haya descartado el empleo de
otras alternativas analticas como son el cultivo y la deteccin de antigenos o cidos
nucleicos vrales. La serologa tambin puede ayudar a clarificar los resultados obte
nidos mediante la tcnica del cultivo; por ejemplo, el aislamiento de enterovirus
a partir de heces en un paciente con encefalitis cobra una importancia mayor si
el ttulo de anticuerpos frente a estos virus aumenta. L a serologa es la eleccin lgi
ca para el diagnstico de infecciones causadas por virus que requieren el empleo d
e mtodos complejos para su aislamiento (VEB. VIH, herpesvirus humanos [HVH-6). o
inoculacin en animales (arbovirus. algunos virus Coxsackie A), o de aquellos cuya
manipulacin implica riesgos biolgicos graves (VIH, arbovirus). Para algunos tipos
de infecciones, la serologa es una alternativa ms rpida y barata; tanto el sarampin
como las paperas pueden diagnosticarse mediante el aislamiento del virus respon
sable, aunque las IgM especficas estn presentes en el suero del paciente, a partir
del tercer da desde el comienzo de la enfermedad, y su deteccin requiere menos ti
empo y expenencia que el diagnstico mediante cultivo. Los virus pueden incluso no
ser detectados cuando comienzan a manifestarse los sntomas de la infeccin: por ej
emplo, los arbovirus pueden desaparecer, a menudo, del lquido cefalorraqudeo en el
m o m e n t o en el que el paciente desarrolla la encefalitis, lo que h a c e q
ue la serologa sea el mtodo diagnstico de eleccin en este caso. Frecuentemente, en l
as infecciones con un prdromo prolongado puede existir un ttulo detectable de anti
cuerpos cuando se manifiestan los sntomas (VEB y mononucleosis). Las situaciones
clnicas especficas para el diagnstico serolgico estn resumidas en la Tabla 48-5.
pado con epilluorescencia para los ensayos de D F AeI F A y espacio de almacenam
iento a -70 C y a -20 C. para reactivos y especmenes Todos los equipos y producto
s esenciales para la identificacin de los virus ms comunes estn disponibles en el m
ercado. Los cultivos celulares son alimentados con una solucin salina balanceada
(SSB; puede utilizarse tanto la Hanks como la de Earle). a la que se aaden sustan
cias tampn. suero y una mezcla nutritiva como el medio mnimo esencial (MME) de Eag
le. El MME de Eagle es una mezcla definida de aminocidos, carbohidratos, vitamina
s, cofactores y el resto de requerimientos nutricionales que necesitan las clulas
en la monocapa. El suero bovino fetal (SBF) es el suplemento nutricional y horm
onal que con mayor frecuencia se aade al MME; se aade entre un 5% y un 10% de SBF
en el medio de crecimiento para el cultivo de tejidos y un 2% en el m e d i o de
mantenimiento. Los mayores problemas del SBF son la variabilidad que presenta d
e lote a lote y su alto coste: como alternativa ms econmica al SBF se puede utiliz
ar suero de ternera enriquecido (OmniSerum), que adems tiene una composicin mucho
mas estable y funciona aceptablemente para cultivar las lneas celulares utilizada
s para el aislamiento del VHS y otros tipos de virus. En el laboratorio tambin de
be existir una reserva de tripsina (solucin al 0.25%). tampn fosfato salino (PBS).
soluciones de glutamina y bicarbonato de sodio, medio de transporte para virus,
mezclas de antibiticos para descontaminar los especmenes y cido fosfotngstico al 2%
para microscopa electrnica.
a
Obtencin y transporte de las muestras
El xito en cualquier diagnstico de infeccin viral depende de que la muestra sea rec
ogida y transportada en condiciones adecuadas. El laboratorio debe establecer un
as directrices realistas para una ptima manipulacin del espcimen y una poltica de re
chazo de muestras inapropiadas. y hacer circular esta informacin entre el persona
l mdico y las unidades de enfermera (Tabla 48-6). Las muestras para cultivo y dete
ccin de antgenos y cidos nucleicos virales deben obtenerse durante la fase aguda de

la enfermedad, cuando la liberacin de los virus es mayor; la recuperacin de los v

irus es espordica y poco fiable durante la fase de convalecencia.
Los laboratorios que toman a su cargo por primera vez los sen/icios de diagnstico
de infecciones virales deberan comenzar su actividad con pruebas sencillas, como
el cultivo de VHS y la deteccin de antgenos virales. Durante los meses de inviern
o se pueden ir aadiendo otros protocolos analticos para el virus de la gripe. VRS
y rotavirus. La identificacin de CMV es prioritaria en aquellos hospitales en don
de existen pacientes inmunodeprimidos. En principio, puede considerarse el aisla
miento de enterovirus durante el verano y el otoo. A medida que la experiencia de
l personal tcnico vaya incrementndose s e pueden ir incorporando las tcnicas necesa
rias para el cultivo y deteccin de antgenos de VVZ, adenovirus y virus de la parai
nfluenza.
Sndromes clnicos infecciosos causados por virus
Un enfoque habitual en el diagnstico de laboratorio consiste en separar las enfer
medades virales de acuerdo con sndromes clnicos especficos, Un medio de transporte
para virus (MTV) contiene una solucin salina tamaconsejando al mdico que asocie un
grupo, lgico pero limitado, de virus con ponada. un estabilizador proteico, un i
ndicador de pH y antibiticos para inhibir la patologa que sufre el paciente. El la
boratorio debe solicitar informacin el crecimiento indeseado de bacterias y hongo
s contaminantes. Se han desespecfica sobre el paciente (datos demogrficos), el dia
gnstico clnico y los arrollado medios de transporte muy verstiles, que sirven tanto
para virus como posibles agentes virales asociados a la patologa, con objeto de
que el trabajo para clamidias y micoplasmas (M4. Flextrans): la m a y o r parte
de formulaciones analtico pueda racionalizarse y enfocarse hacia la utilizacin de
la prueba pueden conseguir estabilizar a los virus durante 24 horas como mucho (
Johnson. que sea ms rpida y eficiente y rinda los mejores resultados. En este capi
1990). T o d a s las muestras, excepto las de sangre, deben transportarse y alma
tulo se analizarn las siguientes enfermedades virales: cenarse a 4'C hasta el m o
m e n t o de proceder a su anlisis. A veces puede ser Infecciones herpticas mucoc
utaneas. inevitable tener que transportar el espcimen a temperatura ambiente, aun
que el Sndromes respiratorios en nios y adultos. clnico debe ser consciente de los
efectos negativos que esta circunstancia Mononucleosis infecciosa. puede tener e
n la recuperacin del virus. Las muestras de sangre para el aislaInfecciones congni
tas y neonatales. miento de virus deben mantenerse a temperatura ambiente todo e
l tiempo. Los Infecciones virales del sistema nervioso central. cultivos deben r
ealizarse el mismo da en el que las muestras lleguen al laboraExantemas e infecci
ones intestinales en nios. tono, preferiblemente dentro de las 36 horas siguiente
s al m o m e n t o de la recoHepatitis vrica e infeccin por VIH gida; al menos deb
e programarse una sesin de inoculacin de cultivos durante Infecciones vricas en el
husped inmunocomprometido. los fines de semana. Las muestras pueden congelarse a
-70 C slo como ltimo recurso; las muestras de sangre y orina y los especmenes respi
ratorios para el INFECCIONES HERPTICAS MUCOCUTANEAS aislamiento de CMV y VRS. res
pectivamente, no deben congelarse.
S
Equipos y material
La mayor parte de los equipos utilizados en virologa son relativamente baratos y,
a menudo, estn disponibles en las secciones de microbiologa e inmunologia de los
laboratorios. Para la inoculacin de los cultivos, y siempre que los mismos vayan
a ser manipulados, debe utilizarse una cabina de flujo laminar de clase II para
proteger al personal tcnico de los aerosoles infectivos y reducir la contaminacin
accidental de los cultivos. Tambin debe encontrarse disponible una centrifuga ada
ptada para acomodar los shell-vials. Asimismo son necesarios incubadores para ma
ntener las lineas celulares no inoculadas e incubar los cultivos inoculados; los
incubadores deben estar equipados, a ser posible, con un dispositivo que permit
a instalar un tambor giratono en su interior. Finalmente, es necesario disponer
de un microscopio invertido con contraste de fases para identificar los ECP en l

as monocapas de los cultivos celulares, un microscopio equiLa familia Herpesviridae contiene dos virus que tradicionalmente producen infecc
iones en la piel y en las membranas mucosas del cuerpo: el VHS y el VVZ. Ambas i
nfecciones son m u y comunes, y aunque no ponen en peligro la vida, el hecho de
que el tratamiento de las mismas con aciclovir sea m u y efectivo ha incrementad
o la demanda de diagnsticos rpidos, especialmente en el caso del VHS (Corey. 2000)
. El VVZ se describir ms adelante en el apartado de Exantemas virales. El VHS es u
bicuo e infecta a lodos los grupos raciales humanos a nivel mundial. Las dos cep
as del VHS. el serotipo 1 y el serotipo 2. comparten m u c h a s caractersticas b
iolgicas y moleculares e infectan preferentemente a las clulas epiteliales escamos
as; sin embargo, cada una de ellas tiene un perfil antignico distinto y una epide
miologa un tanto diferente. El VHS1 es altamente infeccioso y se transmite por la
saliva para infectar la boca, la faringe, los labios y la piel de la cara. Las
lesiones pueden aparecer, ocasionalmente, en la piel

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1051
Figura 48-3. E s q u e m a del protocolo experimental para el cultivo del VHS m
e d i a n t e el mtodo tradicional en tubo (izquierda) y el s i s t e m a shellvi
al (derecha). expuesta de los combatientes de lucha libre o en las m a n o s del
personal mdico tras un contacto directo con saliva infectada. L a mayor parte de
las infecciones por VHS1 se producen antes de la pubertad, especialmente en ind
ividuos pertenecientes a grupos con un nivel socioeconmico baio. A menudo la infe
ccin primaria es asintomtica. aunque una minora significativa de infectados tienen
fiebre y desarrollan una gingivoeslomatitis dolorosa (Kuzushima. 1991). El VHS1
infecta las clulas del ectodermo y. a medida que el virus se replica en el ncleo,
las clulas pierden su integridad citoplasmtica. pierden lquido y se separan unas de
otras, formando una vescula. Las bacterias de la microbiota de la piel y las muc
osas transforman las vesculas en pstulas, que terminan por ulcerarse cuando las clu
las epiteliales daadas se lisan por completo. Por lo general, las lesiones herptic
as curan sin dejar cicatriz a medida que se van regenerando las capas de la epid
ermis. La respuesta inmune trente a la infeccin por VHS1 implica la actuacin de la
s clulas natural killer (NK), linlocitos T citotxicos. y la produccin de anticuerpo
s neutralizantes. Sin embargo, ni los mecanismos de la inmunidad humoral y celul
ar son capaces de impedir la migracin del VHS a lo largo de los nervios sensorial
es hasta los ganglios trigminos, donde persiste por tiempo indefinido, en un esta
do durmiente, en el ncleo de las neuronas (Straus. 19891. Espordicamente, el VHS s
e reactiva y viaja de vuelta a travs de los axones neurosensonales hasta llegar a
la boca y la piel, donde vuelve a replicarse otra vez en el epitelio escamoso.
La mayor parte de las infecciones recurrentes son asinlomticas o producen vesculas
que slo tienen importancia desde el punto de vista esttico. Sin embargo, en los c
asos en los que existe un problema grave en los mecanismos de la inmunidad celul
ar (enfermos de sida o pacientes trasplantados), las inlecciones recurrentes por
reactivacin del virus pueden ser graves e incluso ltales. La encefalitis es otra
forma gravsima, aunque poco frecuente, de infeccin por VHS1. Estas dos complicacio
nes se describirn ms adelante, en otras secciones de este capitulo. La infeccin por
VHS2 tiene lugar a nivel del epitelio escamoso de la mucosa del aparato genital
, se transmite p o r contacto sexual directo y se ha convertido en un grave prob
lema de salud pblica en los ltimos 30 aos Millones de americanos se encuentran infe
ctados en la actualidad, y se estima que cada ao aparecen 500.000 casos nuevos. L
a recuperacin del VHS2 a partir de nios es m u y rara y generalmente suscita la so
specha de que pueda ser consecuencia de un abuso sexual; sin embargo, con el com
ienzo de la adolescencia la seroprevalencia aumenta de forma constante hasta la
madurez, siendo proporcional al nmero de contactos o compaeros sexuales (Fleming.
1997). La prevalenoa del VHS2 en Estados Unidos es del 22%: en individuos de 1 3
o ms aos, la seropositividad en relacin con la edad ha aumentado un 30% desde 1980
. El
Figura 48-4. Cultivo en m o n o c a p ad e clulas d e rion d e conejo, q u e prese
ntan ECP debidos a l a multiplicacin del VHS. Las clulas de rion de m o n o tienen,
habitualmente, u n af o r m a poligonal y se e n c a j a nl a t e r a l m e n t
eu n a sc o no t r a sp a r af o r m a r un m o s a i c o celular continuo. Las
clulas i n f e c t a d a s por el VHS en este cultivo de tres das exhiben una f o
r m ar e d o n d e a d a e hinchada, y varias clulas a d y a c e n t e s se han
fusion a d o para f o r m a r sincitios celulares gigantes. L a s zonas v a c i
a s en l a preparacin corresponder a aquellas reas de la m o n o c a p a del culti
vo en d o n d e las clulas infect a d a s han m u e r t o y se han lisado (aument
o: x 200: microscopa de c o n t r a s t e de fases).

1052
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Figura 48-5. M o n o c a p a de fibroblastos MRC-5 en s/iefl-wlque m u e s t r a
la presencia de antigenos del VHS en el citoplasma y ncleo de las clulas tras 16 h
oras de incubacin. El a s p e c t o de la m o n o c a p a de clulas es normal, y l
os ECP caractersticos an no son detectables (aumento: x 250: tincin D F Ap a r a an
tgenos del VHS) VHS2 produce un patrn de infeccin primaria y recurrente, con lesion
es mucocutneas semejantes a las que se observan con el VHS1. El virus se encuentr
a latente en los ganglios neurales sacros, y la reactivacin se produce con una fr
ecuencia del doble, al menos, de la observada en el caso del VHS1.
un tambor giratorio (Mavromoustakis. 1988). Aquellos cultivos inoculados a parti
r de muestras de lesiones genitales, en los que no es posible detectar los ECP c
aractersticos del VHS tras cinco/siete das de incubacin, pueden considerarse negati
vos: debido a que tambin pueden recuperarse otros virus (p. ej., VVZ. adenovirus.
enterovirus) a partir de ciertas localizaciones anatmicas no relacionadas con el
aparato genital, como la boca, la crnea o el cerebro, estos cultivos deben incub
arse durante dos semanas, al menos. Las clulas individuales infectadas por el VHS
se hinchan y adquieren forma redondeada, y el dao celular se extiende rpidamente
por toda la monocapa del cultivo, El VHS2 induce frecuentemente la formacin de si
ncitios. debido a la coalescencia de las m e m b r a nas plasmticas de las clulas
infectadas (Fig. 48-4). Este ECP es caracterstico, aunque no el nico, del VHS: un
tcnico con poca expenencia puede interpretar incorrectamente como ECP provocados
por VHS las alteraciones o cambios causados por otros virus, por toxinas bacteri
anas o incluso p o r tricomonas. por lo que se recomienda confirmar los resultad
os de la observacin con una tincin DFA. Para ello, la monocapa de clulas es retirad
a, transferida a un portaobjetos de vidrio, lijada con acetona y seguidamente tei
da con anticuerpos monoclnales o policlonales frente al VHS (Lipson. 1991). Los a
nticuerpos monoclonales especficos de tipo pueden distinguir entre VHS1 y VHS2 me
diante el test DFA, aunque el tiempo y los reactivos adicionales necesarios para
ejecutar la prueba hacen que se incremente el coste de la misma, aadiendo, por l
o general, muy poca informacin a los datos del examen clnico. El serotipado debe r
eservarse para aquellos casos en los que existan discrepancias de criterio entre
mdicos o manifestaciones clnicas ambiguas. La gran cantidad de peticiones de cult
ivo para VHS conducen al empleo de la tcnica de cultivo en shell-vials. mediante
la que es posible detectar los antgenos virales en la monocapa de clulas por medio
del test DFA tras un da de incubacin solamente (Gleaves, 1985) (Fig. 48-5). La de
teccin del VHS en los cultivos de los shell-vials empleando enzimoinmunoensayo o
hibridacin in situ, es una alternativa igualmente sensible y especifica (Espy. 19
88; Patel, 1991; Michalski, 1986). Tambin se han utilizado, aunque con resultados
variables, algunas adaptaciones del mtodo de cultivo favorecido por centrifugacin
que utilizan placas de microtitulacin en lugar de tubos (Woods, 1988; Ziegler, 1
988)
Aislamiento del virus del herpes simple mediante cultivo celular
Los especmenes tomados con una torunda y depositados en medio de transporte (MTV)
con antibiticos pueden conservarse entre 12 y 24 horas a temperatura ambiente (2
2"C), con una reduccin mnima en la viabilidad del virus. Los especmenes deben sembr
arse en los cultivos celulares en el m o m e n t o que llegan al laboratorio, au
nque pueden almacenarse en refrigeracin durante una noche, si as fuese necesario.
El aislamiento del VHS es todava el mejor test de diagnstico y es ms sensible que c
ualquier otro mtodo basado en la deteccin de antgenos virales o hibridacin con sonda
s de cidos nucleicos especficas; sin embargo, las tcnicas de amplificacin de cidos nu
cleicos son claramente superiores al cultivo. El VHS crece excepcionalmente bien

en una amplia variedad de lneas celulares: los fibroblastos humanos (WI-38. MRC5. prepucio) son una de las alternativas ms populares, aunque otras lneas celulare
s como HeLa, Vero y HEp-2, as como cultivos celulares de rabdomiosarcoma (RD), pu
lmn de conejo y pulmn de visn, tambin permiten un buen crecimiento del virus. Los cu
ltivos primarios de rion de mono (PMK) no son adecuados y. en consecuencia, no de
ben utilizarse. Generalmente se inoculan dos tubos con distintas lneas celulares
(uno con RK y otro con MRC-5): el procedimiento se resume en la Figura 48-3.
Deteccin directa del virus del herpes simple
La preparacin de Tzanck consiste en realizar un frotis directo del contenido de u
na vescula herprtica. que se tie por el mtodo de Giemsa para revelar la presencia de
clulas gigantes epiteliales multinucleadas (sincitios) y de inclusiones intranuc
leares. Estos hallazgos no son especficos de una infeccin por VHS; en este context
o, tambin se han visualizado cambios celulares idnticos, consecuencia de la infecc
in por VVZ (en vesculas de la varicela y del herpes zster). La preparacin de Tzanck
es positiva en el 67% de las lesiones herpticas, cuando stas se encuentran en fase
de vescula; a pesar de la rapidez con la que se ejecuta este procedimiento, la b
aja sensibilidad del mismo limita su utilidad prctica.
La inmunotincin de los frotis directos con anticuerpos frente al VHS, marcados co
n fluorescena o peroxidasa, elimina la posibilidad de confusin con el WZ y permite
la deteccin de antgenos virales incluso en ausencia de sincitios y en clulas que n
o muestran, todava, las inclusiones nucleares. Sin embargo, cuando se compara con
el mtodo del cultivo, el test DFA tiene, como El VHS se replica a gran velocidad
y los ECP aparecen entre el segundo y termnimo, entre un 20% y un 30% de error p
or falsos negativos (Lafferty, 1987; cer da, despus de la inoculacin, especialmente
si los tubos son incubados en Moseley, 1981) (Tabla 48-7). Todos los resultados
negativos en el test de deteccin directa deben ser considerados potencialmente c
omo falsos negativos, que T a b l a 48-7 Sensibilidad (%) de las tcnicas de aisla
miento deben ser validados mediante cultivos realizados en paralelo. Por otro la
do, el mediante cultivo, preparacin de Tzanck (frotis teidos diagnstico por PCR del
herpes mucocutneo genital tiene entre un 20% y un por el mtodo de Giemsa), inmuno
fluorescencia directa 30% ms de sensibilidad comparado con el mtodo del cultivo (S
lomka, 1998). ( D F A ) y tincin con inmunoperoxidasa (IP) a partir de La PCR es
ocho veces ms sensible que el cultivo para la identificacin de las lesiones del he
rpes simple infecciones asintmaticas (Cone, 1994). L a amplificacin de seal mediant
e Estadio Sensibilidad (%) del m t o d o captura de hbridos para detectar el ADN
del VHS tambin es superior al cultivo d e la como mtodo diagnstico (Cullen. 1997).
En su formato de ensayo mltiple Tzanck DFA IP Cultivo lesin para la evaluacin de la
enfermedad genital ulcerosa, la PCR mostr un 100% 67 76-87 76 Vescula 70-95 de se
nsibilidad para la deteccin del VHS. asi como una mejora sustancial en 58-67 75 Ps
tula 67-83 55 el diagnstico del chancroide y de la sfilis primaria (Orle, 1996). 3
2-67 30-38 55 lcera Costra 17 10 Diagnstico serolgico
Los valores mostrados son una combinacin de los indicados por Pindak (1986). Lang
enberg (1988) y Mavromoustakis (1988) en sus respectivos trabajos
Debido a que existe una homologa antignica considerable entre los serotipos 1 y 2
del VHS, es necesano utilizar antigenos purificados que sean espec-

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
VRS
1053
ticos de serotipo en los ensayos serolgicos. Utilizando antgenos selectos de la en
voltura de ambos serotipos del VHS y los mtodos de ELISA o de transferencia elect
rolorlica {Western mmunoblotting) se puede evitar la deteccin de anticuerpos con re
actividad cruzada (Ahsley, 1988; Lee. 1986). Hasta el momento, slo existe un sist
ema comercial de ELISA que ha mostrado una sensibilidad, especificidad y capacid
ad discriminatona aceptables (Ahsley. 1998). Sin embargo, un estudio longitudina
l en adultos jvenes seropositivos puso de manifiesto que la prdida de reactividad
era un comportamiento habitual, tanto en los ensayos comerciales como en los mtod
os de laboratorio (Schmid, 1999). El error debido a los falsos negativos conduce
a una subestimacin de los datos sobre seroprevalencia y limita, tambin, la utilid
ad clnica prctica del serodiagnstico. En cualquier caso, una vez que estn disponible
s los mtodos que permitan llevar a cabo una serotipificacin precisa, su aplicacin ms
importante ser la determinacin de anticuerpos especficos frente al VHS2 en mujeres
embarazadas para establecer el riesgo de transmisin neonatal (Brown. 1991).
Resfriados y faringitis son tratados clinicamente sin necesidad de realizar prue
bas de laboratorio; sin embargo, el nmero de peticiones de ensayos para la determ
inacin de antgenos o de cultivos para el diagnstico de las infecciones virales del
tracto respiratorio inferior puede sobrepasar fcilmente el de las pruebas equival
entes para la deteccin del VHS (Tabla 48-1 ). El virus de la gripe y el VRS son l
os patgenos ms importantes en adultos: en nios pequeos, la mayor incidencia correspo
nde al VRS, virus de la parainfluenza, virus de la gripe y adenovirus.
Gripe (Influenza)
Los virus de la gripe A y B causan anualmente, durante los meses fros, brotes de
enfermedades febriles, agudas, del tracto respiratorio superior e inferior, que
estn acompaadas de una serie de manifestaciones sistmicas. Por lo general, la influ
enza A es ms comn y produce una enfermedad ms grave que el tipo B. Debido a que los
antgenos virales experimentan cambios determinados por mutaciones puntuales o po
r recombinacin de fragmentos de ARN vrico y humano, los anticuerpos producidos dur
ante episodios anteriores de gripe proporcionan una proteccin escasa durante brot
es subsiguientes de la infeccin. La gripe es altamente contagiosa, y se extiende
de persona a persona a travs de aerosoles o por contacto con las manos contaminad
as (Troanor. 2000). El virus de la gripe se multiplica rpidamente en las clulas co
lumnares ciliadas de la fannge y el rbol traqueobronquial. La fiebre suele manife
starse de manera brusca: la necrosis del epitelio respiratorio causada por el vi
rus provoca dolor de garganta y tos, aunque otras manifestaciones asociadas, c o
m o mialgias, dolor de cabeza y un estado generalizado de debilidad, son, por l
o general, ms importantes y graves que los problemas respiratonos. Si no hay comp
licaciones, la enfermedad remite en cuatro o cinco das. Cada ao se producen aproxi
madamente 100.000 hospitalizaciones y 20.000 muertes en
INFECCIONES VRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO
Cada ao se producen en Estados Unidos varios millones de visitas ambulatorias y h
ospitalizaciones debido a las infecciones del tracto respiratorio, que en su may
ora estn causadas por virus. Las infecciones van desde resfriados irrelevantes has
ta patologas graves como la laringotraqueobronquitis (crup), la bronquiolitis y l
a neumona. Los nios y adultos sanos tienen el nesgo potencial de enfermar durante
las epidemias anuales de crup, bronquiolitis y gripe y la morbilidad y mortalida
d asociadas a estas infecciones pueden ser drsticas. El brote de gripe durante 19
98-1999 en Estados Unidos tuvo slo una gravedad moderada, pero el porcentaje de m

uertes debidas a la neumona asociada a la gripe alcanz el 8,8% (Update. 1999)

1054
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MEDICA
Estados Unidos como consecuencia de la gripe. En un porcentaje pequeo de afectado
s, la necrosis viral aguda se extiende hasta las clulas que recubren los bronquio
s, causando una forma grave de neumona potencialmente fatal (Yeldandi. 1994). Sin
embargo, la mayor parte de fallecimientos relacionados con la gripe estn provoca
dos por una neumona secundaria de origen bacteriano, que aparece c o m o consecue
ncia de la colonizacin del epitelio de la mucosa respiratoria daado por el virus,
por Staphylococcus aureus, Streplococcus pneumoniae, Haemophilus inlluenzae y ot
ras bacterias presentes en la orlaringe. La infeccin bacteriana es ms frecuente en
pacientes con una enfermedad pulmonar crnica o fallo congestivo cardaco preexisten
te. Muy raramente aparecen otras complicaciones asociadas a la gripe, como mioca
rditis, meningoencefahtis, sndrome de Reye y sndrome de Guillain-Barr. La gripe se
diagnostica mejor durante los dos o tres primeros das de la enfermedad, cuando se
produce una mxima liberacin de virus. El cultivo representa el mtodo diagnstico ms s
ensible, siendo los especmenes ms adecuados para este fin un aspirado de secrecion
es nasofarngeas (SNF), esputo obtenido mediante expectoracin y material recogido d
e la garganta con hisopo. El cultivo en shell-vials es una alternativa que ofrec
e una excelente sensibilidad y permite obtener los resultados tras un periodo de
incubacin de uno o dos das (Beekmann, 1996; Leonardi, 1994), lo que puede afectar
positivamente al tratamiento del paciente y a la prevencin de los contagios por
contacto. El cultivo medanle las tradicionales monocapas celulares puede tardar e
ntre dos y siete das en ofrecer resultados. La deteccin de antgenos del virus media
nte DFA es un procedimiento til para realizar un diagnstico rpido; el aspirado de S
NF contiene abundantes clulas columnares epiteliales infectadas por el virus, por
lo que representa el tipo de espcimen preferido para este fin. La sensibilidad d
el ensayo varia entre un 77% y un 93% para la deteccin del virus de la influenza
A y entre un 70% y un 80% para la influenza B; la especificidad es superior al 9
5% y est fuertemente condicionada por la experiencia del observador y la calidad
de la muestra. El material recogido de la garganta con hisopo contiene pocas clul
as columnares y, por tanto, no es adecuado para la tincin DFA. Los enzimoinmunoen
sayos comerciales tienen una buena sensibilidad para detectar antigenos virales,
si se utilizan con aspirados de SNF como muestra; la sensibilidad es menor si e
l espcimen utilizado es el material recogido con hisopo de la garganta del pacien
te (Leonardi, 1994). La deleccin de un antgeno especfico de los tipos A y B del vir
us (neuraminidasa) mediante inmunoensayo ptico tiene una buena sensibilidad diagns
tica que oscila entre un 80% cuando se utiliza el aspirado de SNF y un 83% con e
spulo obtenido por expectoracin (Mulford. 1999).
Tabla 48-8
R e c u p e r a c i n de virus a partir de secreciones nasofarngeas (SNF): relacin
con la calidad del e s p c i m e n * Nmero de % de muestras a partir muestras de
las que se logr la recuperacin de virus de SNF
243 1 930 6 27
Muestra (N = 2.173)
SNF con <1 clulas columnares por campo (observacin a x 250) SNF con 22 clulas colum
nares por campo (observacin a x 250)
Datos del Lulhoran General Hospital, desde enero 3e 1985 a mayo de 1990. un 11%
de especmenes tenan insuficientes clulas y ueron obtenidos de nuevo

ribavirina por va mtranasal o inmunoglobulmas frente al VRS por va intravenosa (Ot

tolmi. 1997: Hall. 1998). El VRS es particularmente frgil y lbil, y puede inactiva
rse si la muestra tarda un cierto tiempo en llegar al laboratorio. Una vez inocu
lado en los cultivos celulares, se replica lentamente, y los ECP aparecen tardame
nte; el tiempo necesario para el aislamiento oscila entre 3 y 1 0 das (Arens, 198
6; Tristram, 1999). La centrifugacin de la muestra en cultivos celulares en shell
vials incrementa la recuperacin del VRS y acorta a dos das el tiempo necesario par
a el aislamiento (Beekmann, 1996; Pedneaull, 1994: Smilh. 1991). La deleccin de a
ntgenos del VRS en secreciones respiratorias mediante DFA o EIA representa otra p
osibilidad para el diagnstico igual de sensible, o incluso ms, que el cultivo, y p
ermite obtener resultados en una banda de tiempo relevante desde el punto de vis
ta clnico: por tanto, estos mtodos se han convertido en la alternativa prctica defi
nitiva para el diagnstico del VRS (Rossier. 1989; Smith, 1991) El enzimoinmunoens
ayo es rpido y fcil de realizar, aunque los reactivos necesarios son caros y los p
rocedimientos existentes no permiten evaluar la adecuacin de la muestra. El test
DFA necesita ms tiempo para su ejecucin y experiencia para la interpretacin de los
resultados, aunque puede implementarse fcilmente para la deteccin de mltiples virus
y permite confirmar, de una forma sencilla, la calidad de la muestra.
Crup
El crup es una enfermedad generalmente causada por el virus de la parainfluenza
(VPI) (Hennckson. 1994: Vainionpaa. 1994). La incidencia del VPI1 y VPI2 se incr
ementa durante el otoo o la primavera, mientras que el VPI3 causa infecciones res
piratorias por igual a lo largo de todo el ao. Los diferentes tipos del VPI, part
icularmente el VPI3. son la segunda causa de infeccin viral del tracto respirator
io inferior en nios de menos de 6 meses. L a necrosis epitelial que produce la mu
ltiplicacin del virus en la laringe, la traquea y los bronquios, estrecha la luz
de los conductos, dificultando el paso del aire y causando ronquera, tos y un pa
trn de estridencias respiratorias debidas a la obstruccin que son caractersticas de
l crup. La inmunidad desarrollada es transitoria y las reinfecciones son frecuen
tes; sin embargo, en nios mayores y en adultos, los sntomas son menos graves y se
circunscriben al tracto respiratorio superior. El cultivo de las SNF es el mtodo
con mayor sensibilidad para el diagnstico, aunque la deteccin de antgenos del VPI e
n muestras de SNF es otro procedimiento que tiene tambin una buena sensibilidad,
que oscila entre el 69% y el 85% (Costello. 1993). Aquellas muestras que dan res
ultados negativos con el test DFA deben ser cultivadas para aumentar las posibil
idades de recuperacin.
Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial
El VRS es la principal causa de infeccin grave en el tracto respiratorio inferior
en nios y jvenes (Anderson, 1990; Hall, 1998). El VRS se transmite fcilm e n t e m
ediante gotas de aerosoles, y los brotes aparecen de forma recunente cada invier
no en Estados Unidos (Fig. 48-6). La inmunidad generada por el husped frente al v
irus es incompleta y de corta duracin, siendo frecuentes las reinfecciones, cada
vez con manifestaciones ms leves, a lo largo de la vida, aunque el VRS puede caus
ar tambin enfermedades pulmonares graves en los ancianos y los individuos inmunoc
omprometidos (Pohl. 1992; Hamngton. 1990). El VRS infecta, al igual que el virus
de la gnpe. las clulas columnares epiteliales, desde la nasofannge hasta los bro
nquiolos ms distales: la forma ms grave de presentacin de la infeccin es la bronquio
litis, especialmente en nios de menos de un ao. cuyas vas respiratorias, poco desar
rolladas, son obstruidas fcilmente por las clulas epiteliales necrosadas y los res
iduos originados como consecuencia del proceso inflamatorio. La obstruccin de los
bronquiolos produce un atrapamiento del aire e hipoxia, que puede ser lo sufici
entemente grave como para necesitar hospitalizacin. Las infecciones ms graves por
VRS se producen en nios prematuros, en nios que tienen una patologa cardiopulmonar
subyacente o una inmunodeficiencia y en receptores de trasplantes. Aproximadamen
te un 1% de los nios con bronquiolitis por VRS hospitalizados mueren por hipoxia,
fallo cardaco accesorio o sobreinfeccin bacteriana. Es importante un diagnstico rpi
do del VRS en los pacientes hospitalizados para instaurar medidas de control con
objeto de impedir la infeccin nosocomial (uso de mascarillas y guantes: aislamie

nto de los pacientes con diagnstico positivo) y para que comience a administrarse
inmediatamente
Obtencin de muestras
Todos los mixovirus y adenovirus respiratorios pueden infectar las clulas columna
res ciliadas del epitelio respiratorio, desde la nasofaringe a los alvolos. Por t
anto, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad respiratoria (crup, bro
nquiolitis. neumona o gripe), la mucosa del tracto respiratorio superior es la lo
calizacin ms accesible para lomar una muestra para el cultivo o un test de deteccin
de antgenos. Los especmenes deben obtenerse durante los primeros das de la enferme
dad, cuando la rephcacin del virus est en sus cotas ms altas. El material recogido
con hisopo de la garganta, depositado en MTV con antibiticos, es un material acep
table para el cultivo del virus de la gripe, aunque el rendimiento es entre un 1
0 % y un 20% menor: las muestras de esputo tomadas por expectoracin tambin son ad
ecuadas

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1055
tra de SNF d e b eh o m o g e n e i z a r s e con ser tampn fosfato salino que c
o n t e n g a p a r a el cultivo (Kimball. 1 9 8 3 : Yungblulh, 1998). en especi
al en el c a s o de una s u s t a n c i am u c o l i t i c a (Sputolysin) y s e
rc e n t r i f u g a d a a continuacin; el aquellos p a c i e n t e sq u e tienen
tos productiva. s o b r e n a d a n t er e s u l t a n t e se utiliza p a r a e
l cultivo, y el s e d i m e n t o se resusL a sS N F se r e c o g e nm e d i a n
t e la insercin de un catter a d o s a d oau n a p e n d e en tampn fosfato s a l
m o : a partir de esa resuspensin se h a c e un frojeringuila a travs de los orifi
cios n a s a l e sh a s t aa l c a n z a r la nasofaringe, instio r t a o b j e
t o sr e c u b i e r t o s con polk-lisina. Las l a n d os e g u i d a m e n t e
e n t r e 1 mi y 2 mi de s u e r o salino y a s p i r a n d oac o n t i n u a -t
is en lminas de tefln o en p e x t e n s i o n e ss ed e j a ns e c a ra l aire, s
e fijan s e g u i d a m e n t ec o na c e t o n aa l cin las s e c r e c i o n e
s de la m u c o s a por m e d i o de la leringa. T o d a s las m u e s t r a s
100%. y se tien con a n t i c u e r p o s especficos f r e n t eaa n t i g e n o s
virales, c o n d e b e ns e rt r a n s p o r t a d a s rpidamente en un bao de hi
elo p a r am i n i m i z a r la j u g a d o sc o n fluoresceina, utilizando azul
d eE v a n sc o m oc o l o r a n t ed ec o n prdida d e viabilidad del VRS. La c
alidad de las m u e s t r a sd e b e venlicarse a n t e s traste. Hay que observ
ar el nmero de clulas c o l u m n a r e s ciliadas asi c o m o el d ei n t e n t a
r levar a c a b o el cultivo o la deteccin de antigenos. A q u e la sm u e s gra
do de tincin inespecifica d e b i d a a la p r e s e n c i a de m o c or e s i d
u a l en el t r a s de SNF en las que se d e t e c t a n al m e n o s dos clulas
ciliadas c o l u m n a r e s fondo de la preparacin o de neutrlilos. La Figura 488 m u e s t r a una tincin del epitelio r e s p i r a t o r i o por c a m p o mic
roscpico (observacin a x 250) rinden D F Ad eu n am u e s t r ad eS N F positiva p
a r a influenza A .L a especificidad d e los u n a recuperacin cuatro v e c e sm
a y o r de patgenos respiratorios virales. anticuerpos a c o p l a d o s a fluor
esceina se e n s a y a frente a una batera de cultiEnsayos para la deteccin de antg
enos vricos vos de clulas control positivas; los patrones de tincin d e b e nm o s
t r a r una distribucin cel u l a r e i n tensi d ad c o n s t a n t e s de l a f
l u o r e s c e n c i a en t o d o s los l o t e s En la F i g u r a 48-7 se de
scribe un p r o c e d i m i e n t ob a s a d o en el cultivo y la tinde clulas an
al i z ados. En conj u nto, l o s mtodos de tincin fl u orescente ti e nen cin m e
d i a n t eD F Ap a r a la identificacin de virus respiratorios. U n a deteccin u
n ag r a n especificidad y sensibilidad ( C h e e s e m a n , 1986; H u g h e s
, 1988). r e p r o d u c i b l eyp r e c i s ad e antgenos virales m e d i a n t
eD F A requiere c i e r t a En la actualidad estn disponibles en el m e r c a d o
varios e n z i m o i n m u n o e n e x p e r i e n c i ap a r a la interpretacin
de la observacin al microscopio, p o r lo sayos (EIA) p a r a la deteccin del VRS
y el virus de la gripe. La e s p e c i f i c i d a d que. si es posible, d e b
e realizarse simultneamente un cultivo de virus y un y sensibilidad de e s t o ss
i s t e m a sc o m e r c i a l e s es b a s t a n t e buena, c o m p a r a b l
e e n s a y o de deteccin de antgenos. Los hospitales con una unidad peditrica a la
tincin D F A (Hughes. 1988: Miler, 1993;Thomas. 1991). Las m u e s t r a s de de
g r a n tamao e x a m i n a n de f o r m a peridica las m u e s t r a s respirato
rias p a r a e b e ne x a m i n a r s ep a r ad e t e c t a r la p r e s e n c i
a de clud e t e c t a r diferentes virus (VRS, influenza A y B. distintos tipos
de V P I y ade- SNF utilizadas para EIA d las ciliadas epiteliares columnares: p
a r a ello, se realiza un preparacin en novirus) d u r a n t e los m e s e s de
invierno, si el p r e s u p u e s t o lo permite. L o s e z c l a n d o una gota
de la m u e s t r a con una g o t a de solucin p a c i e n t e s adultos d e b e

ns e r analizados e nb u s c a del virus d el a gripe; e lV R Scmara hmeda, m sal

ina, que se o b s e r v a al m i c r o s c o p i o (x 250) p a r a verificar que
en el espcid e b et e n e r s e tambin en c u e n t a en el caso de pacientes ger
itricos. La m u e s Figura 48-7. E s q u e m a del p r o t o c o l oe x p e r i m e n t a lp a r a e
l diagnstico de i n f e c c i o n e sr e s p i r a t o n a s virales m e d i a n
t e cultivo (izquierda) y por el mtodo de i n m u n o f l u o r e s c e n c i ad
i r e c t a( D F A ) (derecha).

1056
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Figura 48-8. Tincin O e inmunofluorescencia directa de un frotis de un aspirado n
asofarngeo que revela la presencia de antigenos fluorescentes en el ncleo y el cit
oplasma de las clulas columnares ciliadas del epitelio y en los mononucleares ( a
u m e n t o x 250; tincin para antgenos especficos del virus de la influenza A). m
e n existen suficientes clulas columnares nasofarngeas. Las muestras tomadas de l
a garganta o de la nasofaringe con un hisopo contienen muy pocas clulas para pode
r llevar a cabo un preanlisis citologico.
Figura 48-10. Monocapa de un cultivo de clulas HEp-2. donde son apreciadles ios E
CP debidos a l a multiplicacin del VRS en las mismas. Es patente la presencia de
s ^ n c i t i o s multinucleados tras una incubacin de 9 das (aumento 200: m i c r
o s copia de contraste de fases). cacin del sistema basado en el cultivo puede a
mpliarse para la recuperacin de virus que no estn incluidos en los ensayos de dete
ccin de antgenos, como el virus del sarampin y los enterovirus (Johnston. 1990; Rab
alais, 1992). El matenal recogido con hisopo de la garganta, cuya finalidad nica
sea servir de muestra de partida para el cultivo del virus de la gripe, debe dep
ositarse en MTV con antibiticos inmediatamente despus de ser obtenido y transporta
rse rpidamente hasta el laboratorio, preferiblemente en un bao de hielo: la inocul
acin de los cultivos celulares no debe demorarse ms all de 48 horas y debera realiza
rse, preferiblemente, el mismo da en que el espcimen es obtenido. El recipiente co
n MTV debe agitarse enrgicamente antes de retirar y desechar el hisopo. El lquido
sobrenadante se utiliza para inocular, por duplicado, tubos shell-vial que conte
ngan cultivos tripsmizados de las lneas celulares MDCK (clulas Madin-Darby de nn de
perro) o PMK. Tras la centrifugacin para favorecer la adsorcin de los viriones a l
as clulas, se aade a los tubos un volumen de MME (medio mnimo esencial de Eagle) si
n suero bovino fetal (SBF), ya que el SBF puede contener anticuerpos frente al v
irus de la gripe. Despus de uno o dos das de incubacin a 35 C, las monocapas de clul
as son teidas mediante la tcnica DFA, con objeto de detectar los antgenos del virus
de la gripe (Reina, 1997). Adicionalmente. se puede inocular un tubo ms con clula
s PMK o MDCK. que se incuba en un tambor rotatorio y se examina para detectar la
multiplicacin del virus, aadiendo eritrocitos de cobaya recin obtenidos. Al igual
que los virus del sarampin y de la parainfluenza. el virus de la gripe no produce
ECP de forma constante, aunque es capaz de inducir la integracin de hemaglutinin
as en la membrana plasmtica de las clulas de los cultivos, lo que provoca que los
eritrocitos se adhieran a las clulas de la monocapa, hecho que revela que el viru
s se est replicando en stas. Si la cantidad de trabajo lo permite, los tubos deben
examinarse diariamente para detectar la hemoadsorcin (Minnich. 1987). Una vez se
ha apreciado la existencia de hemoadsorcin. la monocapa de clulas debe analizarse
con u n a batera de anticuerpos para determinar qu tipo de virus est presente. En
la Figura 48-9 se muestra una monocapa de clulas P M K en un tubo shell-vial en l
a que se ha multiplicado el virus de la influenza A. tras dos das de incubacin, y
un cultivo estndar de clulas PMK infectadas por el m i s m o virus, que muestra la
hemoadsorcin de los eritrocitos de cobaya, tras tres das de incubacin. La Figura 4
8-7 muestra un esquema del procedimiento de cultivo en tubos shell-vial aplicado
a las SNF, empleando una monocapa hbrida de clulas, formada por clulas A549 y ML (
de pulmn de visn), que conjuntamente permiten el crecimiento del VRS, adenovirus,
virus de la influenza A y B y los distintos tipos del virus de la parainfluenza
En comparacin con las lneas celulares tradicionales, el cultivo de tejidos hbrido t
iene, globalmente. unos porcentajes de recuperacin de entre el 96% y el 100%. con
tiempos de espera ms cortos, y unos costes totales reducidos (Schindler, 1999).
Aquellos laboratorios que se dedican exclusivamente al cultivo del VRS deben con
siderar la utilizacin de los tubos shell-vial en lugar de los tubos Ira-

Aislamiento de virus
En el caso del aislamiento de virus mediante cultivo, tienen validez los mism o
s requerimientos y restricciones respecto a la muestra que se tienen en cuenta e
n los ensayos de deteccin de antigenos. Los cultivos a partir de SNF procedentes
de adultos y nios no inmunodeprimidos pueden modificarse para ajustarse a las epi
demias estacionales de infecciones causadas por el virus de la gripe, VRS y VPI
(Fig. 48-6). Como mnimo, debe intentarse llevar a cabo el aislamiento del VRS y d
el virus de la gripe durante el invierno; si las disponibilidades de personal as
i lo permiten, tambin deben realizarse cultivos para el aislamiento del VPI y ade
novirus a partir de pacientes peditricos. En la Tabla 483 se muestra un listado d
e las lineas celulares que permiten el crecimiento de virus patgenos del tracto r
espiratorio mfenor. La tcnica del cultivo mejora globalmente el rendimiento diagns
tico, ms all del que se obtiene mediante el mtodo de deteccin de antgenos, aproximada
mente entre un 10% y un 20%, para lodos los agentes virales, excepto en el caso
del VRS. El mbito de apliFigura 48-9. Cultivo de clulas primarias de nn de m o n o infectadas p o r el virus
de la gripe A. segn se desprende de la aparicin de fluorescencia, tras una tincin
con anticuerpos especficos frente al virus (izquierda). Se observa la hemoadsorcin
de eritrocitos de cobaya sobre la m o n o c a p a de clulas inducida por la repl
icacin del virus (derecha).

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1057
dicionales para realizar los cultivos de tejidos, con objeto de reducir el tiemp
o necesario para el aislamiento. Las clulas HEp-2 o A549 en MME de Eagle enriquec
ido con suero bovino fetal (entre un 2= y un 5 % ) permiten la replicacin del VRS.
Las monocapas de clulas contenidas en los tubos deben examinarse diariamente par
a detectar la aparicin de ECP. En la Figura 48-10 se observan los tpicos ECP causa
dos por la multiplicacin del VRS en las clulas (formacin de sincitios multinucleado
s), patrn que depende del contenido en cationes y de la frescura del medio de man
tenimiento (Tristram. 1999). Los adenovirus tambin son capaces de replicarse en l
as lneas celulares A549 y HEp-2. produciendo un redondeamiento de las clulas de la
monocapa. que se hinchan, adquiriendo una morfologa que semea un grano de uva, ge
neralmente entre cinco y siete das de incubacin; el empleo de tubos shell-vial aco
rta el tiempo de deteccin de los adenovirus hasta los tres das Existen una serie d
e mtodos serolgicos para detectar anticuerpos especficos frente al virus en la sang
re del husped infectado, aunque son poco prcticos para llevar a cabo un diagnstico
rpido de cara a la gestin clnica habitual. Sin embargo, el diagnstico serologico es
de la mayor utilidad en los estudios de salud pblica.
miento para evitar el rechazo tras ser sometidos a trasplante, individuos afecta
dos por la enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X). la reactivacin d
el VEB no puede ser mantenida bajo control y se desarrollan enfermedades como la
leucoplaquia oral vellosa y el linfoma de clulas B. El VEB tambin est ligado al ca
rcinoma nasofarngeo en asiticos y al linfoma de Burkitt en frica; aparentemente, el
VEB acta como un iniciador en estas patologas, aunque son otros factores, como la
coinfeccin o la desregulacin del sistema inmune, los que conducen, posteriormente
, a la malignizacin.
Diagnstico serologico
Los linfocitos T citotxicos y los linfocitos apoptscos circulan p o r la sangre dur
ante la enfermedad (Fisher. 1996): la linfocitosis atipica |>10% de linfocitos t
otales) tiene, relativamente, una ba|a sensibilidad c o m o criterio diagnstico d
e la MI causada por el VEB. aunque tiene una especificidad total de al m e n o s
el 95%. El VEB puede ser cultivado en lneas celulares linfoblastoides, pero el a
islamiento del virus no es un hecho que permita distinguir entre inleccion prima
na o infeccin por reactivacin. Las pruebas serolgicas constituyen el principal mtodo
de laboratorio para el diagnstico de la MI (Schooley. 2000). La proliferacin poli
clonal de linfocitos B en la infeccin aguda por el VEB tiene c o m o consecuencia
la generacin de diversos autoantcuerpos transitnos y generalmente inocuos, tales c
omo IgM anti-i (aglutininas trias), factor reumatoide, y anticuerpo antinuclear.
Quizs el tipo ms inusual de inmunoglobulinas producidas durante la MI sean los an
ticuerpos heterfilos de Paul-Bunnell. Estos anticuerpos, que pertenecen a la clas
e de las IgM, tienen afinidad por los erilrocitos de bvido. caballo y oveja, pero
no estn dirigidos contra antgeno alguno del propio virus. Estos anticuerpos son,
aparentemente, producidos de forma aleatoria c o m o consecuencia de la prolifer
acin policlonal de los linfocitos B. inducida por el VEB. y aparecen durante la p
rimera semana de la enfermedad, disminuyen durante la fase de convalecencia y de
jan de ser detectados, usualmente, entre tres y seis meses despus. Durante la enf
ermedad del suero y ocasionalmente en otras infecciones virales, se generan dife
rentes anticuerpos heterfilos; sin embargo, los anticuerpos de este tipo, con una
fuerte afinidad por antgenos de los eritrocitos vacunos, que no es alterada por
adsorcin con antgeno de rion de cobaya (test de la adsorcin diferencial), son especfi
cos de una MI causada por el VEB. En algunas de las pruebas se mezcla directamen
te sobre un portaobjetos el suero del paciente con una suspensin del antigeno d e

nn d e cobaya, y seguidamente se aade el antigeno de eritrocitos vacunos o equinos

, que frecuentemente se encuentra adhendo a partculas de ltex; si es positiva, la
aglutinacin aparece de forma casi inmediata si en el suero del paciente hay antic
uerpos heterfilos. Los test de aglutinacin rpida, y sus modificaciones en fase slida
, tienen una especificidad enlre el 80% y el 90%, con un porcentaje de falsos po
sitivos m e n o r del 2% y un valor prediclivo positivo del 95% o supenor, por l
o que son herramientas de gran valor en la atencin primaria (Rogers, 1999: Farhat
, 1993: Lmderholm. 1994). Su principal limitacin es la sensibilidad, puesto que a
un cuando los anticuerpos heterfilos estn presentes en ms del 80% de adolescentes y
adultos este porcentaje baja hasta el 40% en el caso de nios pequeos con MI por V
EB. A medida que la infeccin por VEB evoluciona desde la fase primaria a la de la
tencia, van expresndose varios antgenos virales, de tal forma que los anticuerpos
especficos que se generan frente a los mismos son unos marcadores valiosos para d
eterminar el estadio en el que se encuentra el proceso infeccioso. Los antgenos q
ue se expresan tempranamente (EA) la ADN polimerasa y la timidma (cinasa) se sin
tetizan durante la fase aguda de la infeccin, durante la replicacin activa del vir
us, al igual que el antigeno proteico estructural (ACV) de la nucleocpsida del vi
rus. Las IgM frente al ACV son un marcador sensible y espeMONONUCLEOSIS INFECCIOSA E INFECCIONES RELACIONADAS
La mononucleosis infecciosa (MI) es una enfermedad linfoproliferativa sistmica, b
astante comn, que est causada por una inleccion primaria con el virus de Epstein-B
arr (VEB), El VEB pertenece a la familia Herpesviridae y. al igual que el VHS. t
iene una distribucin mundial, pudiendo infectar a la mayor parte de la poblacin. E
l VEB se disemina mediante la saliva contaminada: la infeccin primaria en la niez
temprana es generalmente asinlomtica, pero si se retrasa hasta los aos de la adole
scencia o la juventud adulta, entonces provoca, a menudo, la entidad clnica conoc
ida como mononucleosis infecciosa. En EE.UU. se detectan unos 150.000 casos de M
I anualmente (Schooley. 2000: Straus. 1993). El VEB infecta primero el epitelio
farngeo, por lo que el dolor de garganta y la fiebre son los sntomas que se manifi
estan tpicamente al inicio de la enfermedad. El VEB es fuertemente linfotrpico. un
indose al receptor para el C3d (CD21) presente en la superficie de los Imfocitos
B e iniciando una proliferacin policlonal blstica de clulas B. La respuesta de la i
nmunidad celular est mediada por las clulas NK y los linfocitos T-CD8 ctotxcos. que s
e encargan de destruir las clulas B infectadas, aunque estas clulas defensivas tam
bin contnbuyen a la patologa sistmica de la MI. Los linfocitos B infectados por el
VEB se acumulan en los ganglios linfticos del cuerpo, y los linfocitos T cilotxico
s infiltran las reas nodales interfoliculares, el bazo y el hgado y circulan como
linfocitos atipicos en sangre perifrica (Strickler. 1993). A medida que los mecan
ismos celulares van controlando la replicacin del VEB, los sntomas de la MI dismin
uyen y la Imfadenopata, la esplenomegalia y la hepatitis remiten. Como otros herp
esvirus, el VEB puede persistir en el husped en un estado latente. Un pequeo porce
ntaje de linfocitos B contienen en su ncleo ARN codificados por el VEB (EBER). as
i como el antigeno nuclear del VEB (ANEB) y otro antgeno, la proteina latente de
membrana (PLM), que mantienen el genoma durmiente del VEB en las clulas B transfo
rmadas; una excesiva proliferacin de las clulas B es controlada por los linfocitos
T-CD8. La reactivacin asinlomtica del VEB es un hecho frecuente, y hasta un 20% d
e los adultos sanos liberan, espordicamente, un pequeo nmero de viriones completos,
c o n capacidad infectiva, en su saliva. En individuos que se encuentran en una
situacin de mmunodepresin (enlermos de sida, pacientes sometidos a trataTabla 48-9 Perfiles s e r o l g i c o s e n las infecciones producidas por el vi
rus. d e E p s t e l n - B arr Anticuerpos heterfilos (IgM)
Ausencia de infeccin Infeccin primaria silenciosa Mononucleosis infecciosa Infeccin
primaria reciente Infeccin pasada remota Paciente inmunodeprimido con reactivacin
reiterada
ACV (IgM) +/++ -/+

ACV (IgG) + + + + +
EA (IgG) + ++ + + ++
ANEB (IgG) + + + + ++
+/++ -/+
*h
+/ACV = antgeno de la capsida viral EA= antgeno que se expresa tempranamente, ANEB =
antgeno nuclear del VEB.

1058
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
clico de infeccin primaria por el VEB. A medida que la mononucleosis aguda va remi
tiendo, un pequeo porcentaje de linfocitos B infectados por el virus escapan a la
destruccin mediada por las clulas T y albergan en estado de latericia el ADN del
VEB en forma de un episoma circular; el ANEB (antgeno nuclear del VEB) es el resp
onsable de la replcacin y supervivencia de dicho episoma. En consecuencia, las IgG
trente al ANEB aparecen, tpicamente, despus de que la fase aguda de la enfermedad
haya remitido Los patrones serolgicos que se detectan a lo largo de las diferent
es fases de la infeccin por VEB se muestran en la Tabla 48-9. Los mtodos con antic
uerpos fluorescentes (IFA) utilizan lneas de clulas linloblsticas. en las que la re
plcacin del VEB ha sido interrumpida en diferentes etapas, con objeto de caracteri
zar la expresin de antgenos especficos en cada una de ellas. Los tesl IFA tienen un
a buena sensibilidad y especificidad, aunque estn sujetos a una cierta subjetivid
ad en lo referente a la interpretacin de resultados. Los enzimoinmunoensayos (EIA
) que utilizan el antgeno ACV purificado u obtenido mediante tcnicas de ADN recomb
inante muestran una sensibilidad superior al 95% y una especificidad de casi el
100%. y adems tienen la ventaja de poderse llevar a cabo de forma automatizada, y
de que la interpretacin de los resultados no est afectada por criterios subjetivo
s de ningn tipo (Tranchard, 1999; Chan. 1998). Muchos mdicos confian en la demostr
acin de linfocitos atpicos en sangre perifrica, en el rastreo rpido de anticuerpos h
eterfilos y en la deteccin de IgM e IgG frente al ACV para diagnosticar la MI. Los
mtodos de referencia de deteccin cuantitativa de anticuerpos heterfilos en tubo, I
gG anti-ANEB y anti-EA (antgenos que se expresan tempranamente), son de ejecucin ms
compleja y tienen una menor aplicacin prctica.
cedimiento caro, que requiere ms tiempo para su realizacin que el diagnstico serolo
gico. La deteccin de IgM frente al CMV mediante IFA se complica por el hecho de q
ue las clulas infectadas por el CMV, utilizadas c o m o sustrato antignico, expres
an tambin un receptor para el fragmento Fe de la molcula de inmunoglobulina; el te
st de la inmunofluorescencia anticomplementaria (ACIF) es ms complejo desde el pu
nto de vista tcnico, pero reduce la aparicin de resultados falsamente positivos. L
os enzimoinmunoensayos (ELISA) especficos para IgM tienen, en conjunto, una preci
sin comparable a la del ensayo ACIF-IFA para la deteccin de este mismo tipo de ant
icuerpos (Roseff. 1993: Schaefer. 1988: Smith. 1987; VanEnk, 1991). El VHH6 tamb
in es un virus linfotrpico que produce la roseola infantil (exantema sbito), una en
fermedad exantemtica febril comn en nios pequeos (Pruksananonda, 1992; Braun. 1997).
Pasada la infancia, la infeccin primaria puede producir mononucleosis (Akashi. 1
993). La enfermedad aguda se puede diagnosticar mediante ensayos IFA y EIA especf
icos para IgM. y lambin por PCR, aunque en la actualidad estos mtodos an no estn dis
ponibles comercialmente (Steeper, 1990: Sumiyoshi, 1993; Chiu. 1998). L a infecc
in por VIH-1 puede producir un sndrome retroviral agudo q u e mimetiza. desde el p
unto de vista clnico, a la mononucleosis causada p o r el VEB (Kessler. 1987: Ste
eper. 1988). Hasta un 50% de pacientes desarrollan fiebre, linfadenopatia. linfo
citosis atpica y, ocasionalmente, dao hepatocelular leve o meningoencefalitis (Fox
. 1987). Los mtodos estndar de enzimoinmunoensayo especficos para el VIH son incapa
ces, por lo general, de d e t e c t a r anticuerpos especficos durante esta fase
temprana de la infeccin, aunque la cuantificacin por RT-PCR de virus en suero da u
sualmente valores elevados (del orden de 10' copias/ml) (Henrard. 1994). A parti
r del segundo o tercer mes. las pruebas serolgicas (ELISA, inmunotransferencia el
ectrofortica [Western immunoblottingj e IFA) dan sistemticamente resultados positi
vos en lo que respecta a la deteccin de anticuerpos anti-VIH especficos, al mismo
tiempo que las manifestaciones asociadas a la infeccin aguda van remitiendo (Clar
k, 1991). La Figura 48-11 muestra el esquema general de trabajo para llevar a c

a b o la evaluacin serolgica de un
is aguda. En cualquier caso, a pesar
nibles para la identificacin de los
no llega a ser determinada en el 5%

paciente que presente sntomas de una mononucleos

de la gran variedad de mtodos analticos dispo
agentes causales de mononucleosis, la etiologa
al 10% de los casos.

Mononucleosis infecciosa heterfilo-negativa

Entre los pacientes que presentan las manifestaciones clnicas caractersticas de la
MI, un 70% o ms dan positiva la prueba de anticuerpos heterfilos, lo que identifi
ca al VEB como el agente causal de la enfermedad. Del 30% de enfermos restante,
aproximadamente la mitad de ellos tienen IgM antiVCA, lo que tambin representa un
a evidencia de infeccin aguda por el VEB. Aproximadamente en un 15% de pacientes
con un sndrome febril de MI linfoproliferativa, el agente etiolgico identificado e
s Toxoplasma gondii, o bien otros virus como CMV, el virus del herpes humano 6 (
VHH6) o VIH; en el 5 % 10% restante de los casos no es posible determinar la eti
ologa. La toxoplasmosis se describe en el Captulo 55. La infeccin primaria por CMV
adquirida durante la infancia es, a menudo, asinlomtica, mientras que en los adol
escentes y en los adultos puede manifestarse como una enfermedad sistmica, febril
y linfoproliferativa. El aislamiento del CMV de la orina o de la saliva no es d
e gran ayuda, ya que la reactivacin asintomtica del virus es bastante frecuente. L
a recuperacin del CMV a partir de sangre perifrica representa una alternativa diag
nstica vlida por su sensibiliaad. pero es proSndrome de la fatiga crnica
En los ltimos 15 aos se ha prestado una considerable atencin, tanto en la prensa mdi
ca especializada como en la no especializada, a una entidad clnica que se caracte
riza por el hecho de que los pacientes alectados sufren una fatiga persistente i
ncapacitante, acompaada, a menudo, de fiebre, faringitis, linfoadenopata suave, ar
tralgias y mialgias (Holmes, 1988; Klonoff, 1992). En los pacientes sospechosos
de padecer esta enfermedad, debe

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1059
investigarse tambin la posibilidad de que existan tumores malignos ocultos, enfer
medades endocrinas y dolencias psiquitricas, aunque las caractersticas clnicas de e
sta enfermedad sugieren, con gran fuerza, un origen infeccioso para la misma, En
los estudios iniciales se propuso al VEB, tanto en infecciones primarias persis
tentes como reactivadas, como responsable del sndrome, ya que muchos pacientes te
nan ttulos elevados de anticuerpos frente a los antgenos VCA y EA del virus de Epst
ein-Barr. Sin embargo, los ensayos serolgicos nunca fueron estandarizados y los r
esultados descritos no fueron reproducibles (Holmes. 1987). y la deteccin del VEB
mediante tcnicas de cultivo a partir de saliva y de hibridacin in silu (HIS) en l
inlocitos circulantes no mostr diferencias entre pacientes con sndrome de fatiga c
rnica y poblacin control normal. Distintos estudios han implicado a otros agentes
infecciosos como CMV, VHH6, VLHT (virus de la leucemia humana de clulas T), e inc
luso Toxoplasma gondii. aunque no existe consenso sobre la etiologa de la enferme
dad (Gold, 1990). Las pruebas inmunolgicas y serolgicas no son de ayuda para el di
agnstico o la prognosis. En resumen, el sndrome de la latiga crnica sigue estando d
efinido por los sntomas clnicos ms que por los resultados de las pruebas de laborat
orio (Lloyd. 1998).
por CMV en la madre se manifiesta como una viremia que se extiende hematgenamente
al feto por va transplacentaria. y que comporta el nesgo ms elevado de provocar d
aos graves en los tejidos leales. La reactivacin del CMV en la madre conlleva que e
l virus pueda atravesar la placenta, aunque las IgG anli-CMV de la madre ejercen
un cierto efecto protector; en este caso, estos nios son, por lo general, asinto
mticos. aunque entre un 5% y un 15% de ellos pueden desarrollar una prdida sensori
al auditiva o tener problemas de desarrollo neuronal (Istas. 1995: Lazzarotta, 1
998). La deteccin del CMV a partir del liquido amnitico mediante PCR junto con el
aislamiento del virus por cultivo son los mtodos ms seguros para el diagnstico pren
atal (Hagay. 1996; Lazzarotta, 1998). La recuperacin del CMV mediante cultivo o P
CR a partir de la orina, saliva, lquido cefalorraqudeo o sangre del recin nacido ta
mbin es una alternativa diagnstica de gran sensibilidad, aunque los especmenes debe
n obtenerse dentro de las tres semanas siguientes al nacimiento para evitar conf
usiones con una posible infeccin posnatal (Warren. 1992: Nelson. 1995). La presen
cia de IgM frente al CMV en muestras de sangre tomadas del cordn umbilical, intra
utennamente o en el momento del parto, posee valor diagnstico, aunque tiene un po
rcentaje del 30% de falsos negativos (Fowler. 1992). La visualizacin de las tpicas
inclusiones nucleares producidas por el CMV en frotis otolgicos preparados a par
tir de orina tiene carcter especfico, aunque es una aproximacin diagnstica que tiene
muy poca sensibilidad; incluso las muestras obtenidas mediante autopsia pueden
poseer muy pocas clulas apropiadas para el diagnstico si la necrosis tisular est mu
y avanzada
INFECCIONES VRICAS CONGNITAS Y PERINATALES
El tero de la mujer embarazada es un entorno estril y aislado que protege al feto
de la agresin de los microorganismos extemos. La mayor parte de infecciones duran
te el embarazo son provocadas por las bacterias que se encuentran en la vagina,
y que ascienden a travs de una barrera cervical defectuosa, aunque las infeccione
s maternas pueden alcanzar al feto por el torrente circulatorio a travs de la pla
centa, o bien afectar directamente al nio en el m o m e n t o del parto vaginal.
Algunos ejemplos de infecciones perinatales son la toxoplasmosis (vase Cap. 55),
las causadas por diversos virus, como el de la rubola, CMV, VHS. VIH, parvovirus.
enterovirus, y por bacterias como Treponema paldum (vase Cap. 52). Muchas de las
infecciones maternales son silenciosas o producen sntomas leves solamente: sin em

bargo, el sistema inmunolgico inmaduro del leto es incapaz de desarrollar una res
puesta celular o humoral eticaz, por lo q u e la necrosis tisular puede ser m u
y grave o incluso fatal.
Rubola
El virus de la rubola (sarampin alemn) produce fiebre suave y una erupcin cutnea tran
sitoria en nios y adultos. El virus circula por la sangre, incluso en los casos l
eves, y la diseminacin transplacentaria de la viremia durante el primer trimestre
del embarazo provoca gravsimas maltormaciones cardacas, oculares y cerebrales en
el feto (Schluter, 1998). El sndrome congnito de la rubola es raro en la actualidad
, debido a las eficaces campaas de vacunacin peditrica y a los programas sistemticos
de revisin prenatal (Miller, 1984). Cuando se sospecha un caso de rubola aguda en
una mujer emDarazada. el mtodo ms sencillo para el diagnstico es el anlisis del sue
ro de la madre para detectar IgM especificas frente al virus, mediante enzimonmun
oensayo o IFA. El aislamiento del virus en cultivos de tejidos es una tcnica comp
leja que requiere mucho tiempo para su ejecucin, por lo que no se realiza de form
a ordinaria en la mayor parte de laboratorios clnicos. La deteccin del ARN del vir
us de la rubola a partir de liquido amnitico mediante RT-PCR tiene un 100% de sens
ibilidad y especificidad, pudindose llevar a cabo tambin con muestras de placenta
o de tejidos procedentes de autopsias (Revello. 1997). Los recin nacidos infectad
os congenitamente liberan, a menudo, el virus durante muchos meses e incluso aos.
El diagnstico de las infecciones perinatales se centra en dos aspectos: identific
acin de la infeccin aguda en la madre (en particular, la infeccin primaria) y verif
icacin de que el feto o el recin nacido est implicado. La mejor forma de establecer
la infeccin materna es mediante el aislamiento del microorganismo sospechoso, au
nque para ciertos agentes infecciosos esto es poco prctico o imposible de llevar
a cabo y, en consecuencia, la deteccin de IgM especificas, aunque imperfecto, sig
ue siendo el mtodo diagnstico ms aceptado. La infeccin en la madre atraviesa la plac
enta para alectar al feto entre el 30% y el 60% de los casos. La ecografia puede
detectar el dao en los rganos del feto (p. ej., microcalcificaciones. microcefali
a, hidrocefalia, organomegalia, hidropesa), aunque para probar que existe infeccin
fetal es necesario aislar el microorganismo mediante cultivo, demostrar la pres
encia de antigenos o secuencias de cidos Virus del herpes simple nucleicos del mi
smo en la sangre o en tejidos del feto, o detectar la existencia de La infeccin g
enital primaria por el VHS durante el embarazo conlleva un anticuerpos especficos
. En la Tabla 48-10 se muestra una seleccin de mtodos riesgo elevado de corioamnio
nitis herptica ascendente que puede conducir para el diagnstico de las infecciones
perinatales y congnitas ms comunes. a un aborto espontneo, alumbramiento prematuro
y a la exposicin del nio durante el parto vaginal por contacto mucocutneo (Brown,
1987). La infecAun cuando la monitonzacin de todas las mujeres embarazadas en bus
ca de cin genital primaria por el VHS. ms que las infecciones recurrentes, implica
anticuerpos frente al virus de la rubola es, en la actualidad, una prctica habiun
grave peligro para el nio por dos razones: la carga viral en la madre y el tual
de atencin primana. la realizacin de pruebas para detectar anticuerpos nmero total
de lesiones son normalmente mayores durante la infeccin prifrente a Toxoplasma go
ndii. VHS y CMV no est establecida. En particular, los maria y, por otro lado, au
nque el suero de la madre tiene IgM especficas, premtodos serolgicos para IgM puede
n exhibir una gran variabilidad intra e intersenta pocas (o incluso carece de el
las) IgG que puedan ejercer un electo prolaboratorio, con errores debidos a fals
os negativos y posilivos: los ensayos para tector transplacentario en el lelo (P
rober, 1987). IgG por si solos no son capaces de diferenciar entre infeccin mater
na primaria y recurrente o latente, y no pueden predecir que el feto est implicad
o. La mayor parte de los nios tienen una presentacin ceflica durante el parto,
Citomegalovirus
El CMV es la causa ms frecuente de infeccin intrautenna y afecta aproxim a d a m e
n t e a un 1% de los recin nacidos vivos en EE.UU. Alrededor de un 90% de estos
nios son asintomticos en el momento del nacimiento; el aislamiento del virus a par
tir de la orina o de la saliva o la deteccin de IgM especficas pueden ser los nicos

indicadores de infeccin congnita. Sin embargo, el restante 10% de individuos sint

omticos presenta ictericia junto con hepatoesplenomegalia y pancitopenias: aproxi
madamente un 10% muere y el resto queda con secuelas neurolgicas durante mucho ti
empo. La infeccin primaria
por lo que el cuero cabelludo y la cara s o n las partes del cuerpo del feto q u
e primero entran en contacto con el VHS durante el trnsito por el tracto genital
de la madre; otras zonas que tambin quedan expuestas con bastante frecuencia a l
a infeccin por el virus son el pecho y las nalgas, especialmente durante el parto
de nalgas. Las vesculas se desarrollan en todas aquellas localizaciones de l a p
iel y las mucosas donde ha tenido lugar la inoculacin directa con el virus. Puest
o que el sistema inmunitario del recin nacido est todava relativamente inmaduro, el
nico recurso que el nio tiene para alterar el curso de la infeccin es la IgG de la
madre frente al VHS; cuando esta proteccin pasiva est ausente, tiene lugar de for
ma incontrolada tanto la replicacin del virus c o m o su disem-

1060
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA tis de Tzanck o las tcnicas para la deteccin de antgenos dan resul
tados positivos a partir de las lesiones vesiculares, aunque no son lo suficient
emente sensibles como para reemplazar al diagnstico por cultivo (que ahora est dis
ponible en muchos laboratorios y permite obtener resultados positivos en 24 hora
s, en especial si se utilizan los cultivos en shell-viat). La tcnica de la PCR pu
ede identificar el ADN del VHS en el suero del neonato o en el liquido cefalorra
qudeo con una sensibilidad mayor de la que tiene el cultivo, aunque en ocasiones
no es posible utilizar este procedimiento diagnstico en el momento preciso, lo qu
e limita su utilidad (Kimura. 1991: Kimberlin. 1996)
nacin a diferentes rganos (Whitley, 1988). Las lesiones que aparecen en la conjunt
iva, en la mucosa oral y en la piel son, generalmente, reas en virus: si se prod
uce la diseminacin, virtuaimente cualquier rgano puede resultar infectado. Hoy en
da, en plena era del herpes genital, todava existe cierta controversia sobre cul de
be ser la estrategia ms adecuada que debe utilizarse en el parto, aunque algunos
esludios al respecto merecen ser destacados. El aislamiento mediante cultivo, re
alizado de forma sistemtica a partir de todas las madres o nios en el momento en q
ue se inicia el parto y en el de dar a luz. tiene un rendimiento bajsimo (0.2%) y
, en consecuencia, no es un mtodo recomendado (Prober, 1988). Los cultivos de con
trol del VHS a partir de mujeres embarazadas con un historial de herpes genital
recurrente tampoco pueden predecir qu madres liberarn el virus en el momento del p
arto (Arvin, 1986). Estudios realizados con mujeres que han experimentado su pri
mer episodio, reconocido clnicamente, de herpes genital durante el embarazo han d
emostrado que tan slo una mitad, aproximadamente, de estas mujeres haban tenido un
verdadero herpes genital, aunque estas madres expenmentaron complicaciones (amn
ionitis herptica, parto prematuro e infecciones neonatales graves) m u y frecuent
emente. En las mujeres con infecciones recurrentes se detectaron infecciones neo
natales con mucha menor frecuencia, que quedaron confinadas a las superficies mu
cocutneas, sin diseminacin visceral (Brown, 1987,1991). Es una prctica aceptada que
las mujeres que estn de parto y tienen lesiones genitales que hacen sospechar la
existencia de un herpes deben ser sometidas a una cesrea para prevenir una posib
le exposicin del nio al virus. Aquellas mujeres que tienen un historial previo de
herpes genital recurrente pueden dar a luz por va vaginal siempre que no se delec
ten lesiones activas, aunque en este caso se recomienda que se lleve a cabo un c
ontrol cuidadoso de los recin nacidos, incluyendo cultivos del VHS a partir de la
conjuntiva, mucosa oral y cualquier lesin cutnea sospechosa. La infeccin neonatal
por el VHS puede permanecer silenciosa durante varios das antes de que la enferme
dad se manilieste clnicamente A pesar de la terapia antivrica, la inleccin generali
zada es. con frecuencia, mortal; aquellos nios que tienen la infeccin confinada en
el sistema nervioso central pueden sobrevivir, aunque con un grave retraso ment
al permanente. El diagnstico de laboratorio de la infeccin por el VHS fue descrito
previamente en otra seccin de este capitulo. Las pruebas rpidas como los froVirus de la inmunodeficiencia humana, parvovirus, enterovirus
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede diseminarse hematgenamente al
feto, actuando como reservono del virus los trofoblastos de la placenta y los m
acrfagos de Hofbauer. Sin embargo, aproximadamente un 75% de las infecciones perna
tales se contraen en el momento del parto, al entrar en contacto el feto con la
sangre materna infectada El nesgo de infeccin pennatal por VIH oscila entre el 1
3 % y el 45%, dependiendo de la carga viral (VIH-1) en la madre, aunque el porce
ntaje de transmisin baja hasta un 8% si se administra cidovudina a la madre duran
te el embarazo y el parto. El parto por cesrea y el tratamiento con cidovudina re
ducen el riesgo de contagio por debaio del 1% Connor, 1994; Sperling, 1996). El d
iagnstico de la infeccin por VIH en la madre es sencillo (determinacin mediante enz

imoinmunoensayo de anticuerpos frente al VIH y posterior confirmacin de los resul

tados por medio de inmunotranslerencia electrolortica Western immunoblottingj o IF
A), y a todas las madres positivas se les debe administrar tratamiento profilctic
o. Las inmunoglobulinas maternas pasan a travs de la placenta y permanecen en la
sangre del nio hasta 15 meses; por tanto, los mtodos estndar de ELISA no pueden ser
utilizados para diagnosticar la infeccin neonatal. Las modificaciones del enzimo
inmunoensayo o de la inmunotransferencia electrolortica, encaminadas a la deteccin
de IgM o IgA (ninguna de estas molculas de anticuerpos pueden ser transferidas d
e forma pasiva al feto y, por tanto, si estn presentes en el suero, slo puede ser
debido a que el nio las haya producido), podran permitir el diagnostico de la
Tabla 48-10 Mtodos de laboratorio para el diagnstico de las infecciones virales co
ngnitas y perinatales*
' i ni
ni
A g e n t e pagteno CMV
Serologia materna EIA o ACIF para IgM
Cultivo, deteccin de antgenos. PCR Cultivo de CMV. sangre de la madre Cultivo de C
MV orina, saliva, sangre, tejidos (del recin nacido, primeras tres semanas) PCR p
ara CMV liquido amnitico, saliva, orina, LCR (del recin nacido, primeras tres sema
nas) Deteccin de inclusiones nucleares del CMV tejidos Cultivo de virus de la rubo
la: orina RT-PCR para virus de la rubola liquido amnitico. glbulos blancos letales,
tejidos Cultivo de VHS conjuntiva, mucosa oral, piel, LCR. tejidos (del neonato
) PCR para VHS: LCR. sangre (del neonato) Deteccin de inclusiones nucleares del V
HS te|idos, piel Cuantificacin de VIH (RT-PCR o bADN). PCR del ADN del VIH (en el
recin nacido), deteccin del antigeno p24 (en el recin nacido) RT-PCR para enterovi
rus LCR y sangre (del neonato) Cultivo de enterovirus: sangre. LCR. tejidos, hec
es, hisopados de garganta (del neonato) Visualizacin de inclusiones nucleares del
virus HIS para PB19 en entroblastos ADN del PB19 (a partir de sangre) PCR para
el ADN del PB19: plcenla, tejidos leales, sangre
Serologia del feto o del recin nacido EIA o ACIF para IGM
Rubola
EIA o IFA para IgM
EIA o IFA para IgM
VHS
EIA para IgM frente a VHS1 y VHS2 EIA o WB para el VIH; ensayos cuantitativos (H
T-PCR o bADN)
EIA o IFA para IgM
VIH
EIA para IgM e IgA, WB Monitorizar VIH mediante EIA para comprobar serorreversin
Enterovirus
Parvovirus E 19
EIA o IFA para IgM frente al PB19: PCR para el ADN del PB19

EIA para IgM'

"Se recomienda eliminai las IgG y el lactor reumaloide antes de llevar a cabo la
determinacin de IgM para ovilar los errores debidos a lalsos negativos 'Mtodos de
investigacin y de laboratorios de referencia. EIA = enzimoinmunoensayo. ACIF = i
nmunolluorescencia anticomplementaria; PCR = reaccin en cadena de la pdimerasa LC
R * liquido cefalorraqudeo. R T P C R reaccin en cadena de la polimerasa de la ira
nsciiptasa reversa VIH = virus de la inmunodeficiencia humana. bADN = ensayo de
ADN ramificado. W B = Western blotting (inmunotransferencia electrolortica). IFA
= ensayo de inmunofluorescencia indirecta; PBI9 = parvovirus B19. HIS = hibridac
in in sitir. para ver el signilicado de otras abreviaturas, consltense las Tablas
48-3 y 48-4.
k ,
J

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1061
infeccin pernalal con una gran precisin; sin embargo, la sensibilidad de estos mtodo
s depende de la edad del paciente, y son poco fiables durante los tres primeros
meses despus del nacimiento (Quinn. 1991). La deteccin del antgeno p24 del VIH tien
e una sensibilidad subptima durante el periodo inmediatamente posterior al nacimi
enlo (Burgard. 1992; Miles. 1993: Sisn. 1992). El ensayo de la PCR para el ADN de
l VIH detecta el genoma vrico que ha sido transcrito e integrado en las clulas lin
foides circulantes y tiene una sensibilidad de casi un 100% al mes de edad (Roge
rs. 1989). debido a la tpica estabilidad del ADN, este ensayo es vlido incluso cua
ndo se lleva a cabo a padir de especmenes de sangre seca. L a RT-PCR se utiliza p
ara el control cuantitativo de aquellos nios con diagnstico positivo de infeccin qu
e estn recibiendo una terapia antirretroviral combinada. El parvovirus B19 (PB19)
produce un tipo de exantema infantil, benigno y autolimitado, denominado eritem
a infeccioso (en ocasiones denominado "quinta enfermedad" o exantema escolar). A
proximadamente un 50% de mujeres jvenes son seronegativas para esta enfermedad. L
a infeccin durante el embarazo conlleva un riesgo de infecciones fetales del 25%;
las estimaciones de muerte fetal oscilan entre el 2% y el 38% (Alder. 1993). El
PB19 tiene como diana las clulas inmaduras del linaje eritrocitano. y la citotox
icidad virolitica causa anem i a y provoca hidropesa fetal (Anand, 1987; Gratacos
. 1995). Los eritroblastos infectados exhiben una inclusiones nucleares caracters
ticas que recuerdan a vidrio molido. Los parvovirus slo han podido cultivarse en
suspensiones de mdula sea humana que contengan clulas precursoras eritrocitarias. L
a infeccin aguda se diagnostica mediante la deteccin de IgM especficas en la sangr
e de la madre o del feto, hibridacin in silu o amplificacin del ADN viral por PCR
en muestras de lquido amnitico o de sangre del cordn umbilical (Erdman, 1991; Bruu,
1995: Zerbini, 1996). La infeccin por enterovirus es muy habitual en la poblacin
en general, con ms de 10 millones de casos detectados anualmente en EE.UU. La inf
eccin de la madre en un momento prximo al parto puede provocar la diseminacin del v
irus a travs de la plcenla y alcanzar el feto, sin que exista al mismo tiempo una
transferencia de IgG neutralizantes de la madre. El nio nace, entonces, con el vi
rus diseminado por las visceras, pero sin anticuerpos que puedan modificar el cu
rso de la infeccin. Algunos virus ECHO y Coxsackie A yBs e han asociado con infec
ciones de la madre en el ltimo trimestre de embarazo y del feto dentro del tero ma
terno o en el momento del parto; se han registrado brotes nosocomiales en los qu
e el virus ha sido transmitido por el personal sanitario. El virus ECHO 11 es pa
rticularmente virulento, causando necrosis hepatocelular y meningoencefalitis. G
eneralmente, la infeccin perinatal debida a otros enterovirus es benigna. Los vir
us ECHO crecen bien en cultivos de tejidos en tubos estndar y en tubos shell-vial
(utilizando las lneas celulares PMK. HDF y RD [cultivos celulares de rabdomiosar
coma]): los tipos de especmenes empleados para el cultivo incluyen sangre del neo
nato, liquido cefalorraqudeo, hisopados rectales y de garganta o tejidos (en caso
s de muerte). La tipificacin de los enterovirus puede realizarse en laboratorios
de referencia nacionales o locales (Modn, 1986).
nostico en estos casos. El virus que se aisla con m a y o r frecuencia en los ca
sos de encefalitis es el VHS. como consecuencia de una reactivacin del VHS1 laten
te que se extiende (a travs de los nervios craneales, trigmino y olfativo) hasta e
l crtex cerebral, produciendo una masa de tejido necrosado que ocupa una cierta e
xtensin. Anualmente se detectan unos 700 casos, con un patrn espordico no ligado a
cambios estacionales. La progresin de la enfermedad es muy rpida y la mortalidad e
levada, aunque un diagnostico rpido y el tratamiento con aciclovir reduce tanto l
a mortalidad c o m o el grado de incapacidad permanente (Whitley, 1995; Mitchell
. 1997). Los mosquitos son los vectores de cientos de virus neurotrpicos en el mu

ndo, pero slo cuatro arbovirus (de arthropod borne, transmitidos p o r artrpodos)
son encontrados de forma regular en EE.UU.: el virus de la encefalitis equina or
iental, de la encefalitis equina occidental, de la encefalitis de San Luis y el
virus Calilomia-LaCrosse. El nmero total de casos vara desde unos 1 0 0 hasta ms de
2.000 en aos de epidemia. La gravedad y mortalidad son ms elevadas en el caso del
virus de la encefalitis equina oriental, que es el m e n o s frecuente dentro d
el grupo (Calisher. 1994). La informacin actualmente disponible sobre la activida
d global de los arbovirus y los riesgos para los viajeros est disponible a travs d
e los Centros para el Control y Prevencin de Enfermedades en la siguiente direccin
: wvvw.cdc.gov/travel. Diversos enterovirus. especialmente los virus Coxsackie y
ECHO, producen encefalitis ocasionalmente; la poliomielitis (causada por el pol
iovirus, que produce una necrosis de la mdula espinal y de las neuronas motoras c
erebrales) ha sido eliminada en EE.UU. y en la mayor parte del mundo. El virus d
e la rabia se desplaza hasta alcanzar el SNC a travs de las fibras nerviosas, pro
duciendo lesiones necrticas en el cerebro (Smith, 1999). Raramente se detectan co
mplicaciones del tipo de la encefalitis en otras enfermedades virales c o m o el
sarampin, la parotiditis, la MI por VEB y la varicela (Kennedy. 1991): el VHH6 t
ambin causa encefalitis focal (McCullers, 1995). La demencia en las fases avanzad
as del sida est causada, a menudo, por una replicacn progresiva del VIH en las clula
s ghales del SNC (Atwood. 1993). En los pacientes inmunocompromelidos tambin se p
roducen infecciones necrotizantes por VHS, CMV y WZ, asi c o m o destruccin de la
oligodendroglia por papovavirus JC. Cerca del 75% de los casos de meningitis vri
ca en EE.UU. estn causados por enterovirus, que tpicamente siguen un curso benigno
. La meningoencefalitis crnica grave puede manifestarse en nios con hipogammaglobu
Imemia, y cualquier infeccin del SNC por enterovirus. con un componente de encefa
litis, es ms virulenta y tiene riesgo de dejar secuelas permanentes. Los enterovi
rus se transmiten fcilmente de persona a persona por va orofecal, existiendo una v
ariacin estacional, con brotes anuales durante el
Tabla 48-11
Virus a s o c i a d o s c o n e n f e r m e d a d e s d e l sistema nervioso cen
tral
Causas frecuentes Causas menos frecuentes
Sndrome
Meningitis asptica
ENCEFALITIS Y MENINGITIS VRICA
Las infecciones virales del sistema nervioso central son relativamente infrecuen
tes, aunque la morbilidad y mortalidad asociadas a las mismas son considerableme
nte altas. El diagnstico de laboratorio es importante para que los hospitales pue
dan organizar eficientemente el tratamiento de los pacientes y para que los orga
nismos pblicos responsables lleven a cabo el control de los insectos que son vect
ores para los arbovrus. La proliferacin de los virus en las membranas menngeas que
rodean el cerebro provoca una inflamacin aguda que cursa con fiebre, dolor de cab
eza, rigidez de nuca y pleocitosis en el lquido cefalorraqudeo. En la encefalitis,
la replicacn del virus tiene lugar en el parnquima cerebral: la inflamacin y la nec
rosis de los tejidos puede ser difusa o puede dar lugar a una lesin espacialmente
definida y masiva. Muchos virus estn asociados con cada una de las dos patologas
(meningitis y encefalitis), aunque el dao puede solaparse implicando a ambas loca
lizaciones anatmicas (meningoencefalitis) (Tabla 48-11). La encefalitis es una en
fermedad relativamente poco frecuente en EEUU registrndose unos 2.000 casos anual
es, aproximadamente El diagnstico preciso est limitado por el hecho de que algunos
virus neurotrpicos son delicados, siendo necesario el empleo de tcnicas molecular
es par? realizar el diagEnterovirus VIH Parotiditis

Parlisis Encefalitis
Enterovirus Allavirus Flavivirus Bunyavirus VHS Parotiditis Sarampin VIH Enterovi
rus
VHS CML WZ Hepatitis B Poliovirus Sarampin Poliovirus Rubola Rabia Hepatitis B Ade
novirus CML VVZ VRS Vacuna influenza CMV
Sndrome de Guillain-Barr Sndrome de Reye
HIV = virus de la mmunodeficien linfocitica. para ver el significadc 48-3 y 48-4
VEB CMV Inlluenza A y B VVZ

1062
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
9 1
y 2
i)
i)
9
9
9
'
8
9 9
0 0
3
4
5
6
7
MESES/AOS
Figura 48-12. Variacin estacional en el aislamiento de enterovirus (Lutheran Gene
ral Hospital. P a r k Ridge. IL) verano-otoo (Figura 48-12). Las infecciones por
los virus de las parotiditis, sarampin y adenovirus raramente se complican con un
a meningitis aguda. Las infecciones agudas por el VIH producen ocasionalmente un
a inflamacin menngea aguda (Fox, 1987). Aproximadamente en un 1% de infecciones pr
imarias de herpes genital por VHS2 se manifiesta una meningitis transitoria asoc
iada: el VHS2 es la principal causa de la denominada meningitis linfoctica benign
a recurrente de Mollaret. (diferentes combinaciones de clulas PMK, HDF, HEp-2, RD
y de mono verde Buffalo) permite el crecimiento de muchos enterovirus y de otro
s virus (VHS, VVZ, sarampin, parotiditis y adenovirus). Si se intenta llevar a ca
bo el aislamiento de virus, se debe inocular sin demora alguna un volumen de 0.1
mi a 0,2 mi en los cultivos celulares en tubo estndar o en tubo shell-vial. Los
ECP inducidos por los enterovirus comienzan c o m o un cambio picnlico focal, con
clulas aisladas que comienzan a redondearse y que rpidamente se extienden por la
monocapa del cultivo celular (Fig. 48-13). El ECP es detectable al cabo de unos
cuatro das hasta en el 69% de los cultivos positivos. La tipificacin de enteroviru
s puede realizarse en los laboratorios de salud pblica. En la Figura 48-14 se mue
stra un esquema de trabajo para el diagnstico de laboratorio de las infecciones vr
icas del SNC. Esta aproximacin experimental mejora el rendimiento del diagnstico y

favorece un uso eficiente de los recursos de los laboratorios, especialmente en

lo relativo a la identificacin d e las infecciones del SNC asociadas a los artrpo
dos. Un brote inesperado de encefalitis por el virus West Nile fue delectado rpid
amente gracias a los esfuerzos combinados de los laboratorios hospitalarios y gu
bernamentales (MMWR, 1999).
Diagnstico de laboratorio
El mtodo ms sencillo y sensible para diagnosticar la encefalitis viral es la ampli
ficacin del cido nucleico del virus a partir de una muestra de LCR. La identificac
in de enterovirus por RT-PCR y de VHS, VVZ, VEB. CMV y HHV6 mediante PCR es una a
lternativa diagnstica ms sensible que la basada en el aislamiento en cultivo de lo
s virus responsables, tanto de LCR como de tejido cerebral; se han desarrollado
algunos sistemas comerciales para la identificacin por PCR del VHS (Tang, 1998, 1
999a). Se recomienda llevar a cabo un examen del LCR para detectar la presencia
de protenas, as como un recuento de clulas, puesto que los herpesvirus raramente so
n identificados cuando ambos parmetros son normales en el LCR (Tang, 1999b). Ocas
ionalmente puede realizarse una biopsia de cerebro, si existen sospechas clnicas
de un posible tumor o una infeccin no viral. Una biopsia de un tamao de 0,5 cm es
ms que suficiente para llevar a cabo el estudio anatomopatolgico. realizar extensi
ones citolgicas para el examen directo, el anlisis por PCR y el cultivo pormenoriz
ado de los posibles agentes infecciosos. La obtencin del espcimen se describe en e
l Captulo 57. La recuperacin del VHS mediante cultivo celular se ha descrito con a
nterioridad en otra seccin de este mismo captulo; lambin debe intentarse el aislami
ento de otros virus, y la muestra debe ser inoculada en todas las lneas celulares
disponibles en el laboratorio. Las extensiones teidas mediante Giemsa o FDA pued
en poner de manifiesto la existencia de inclusiones nucleares herpticas o de antge
nos virales especficos. Muchos arbovirus y algunos enterovirus han de ser inocula
dos en animales de laboratorio para poder replicarse; si es necesario, la muestr
a de tejido puede congelarse a -70'C y enviarse a un laboratorio de referencia.
3
Los enterovirus son el agente infeccioso ms comn en la meningitis asptica aguda: la
RT-PCR se ha convertido en la tcnica idnea para la identificacin de enterovirus en
LCR, con unos rendimientos del 128% al 142% cuando se compara con el aislamient
o mediante cultivo celular (Rotbar, 1994, 1997; Kessler, 1997). Se necesitan ent
re 10 pl y 100 ul de LCR para la RT-PCR; los formatos simplificados de las prueb
as de microtitulacin han permitido acortar el tiempo de espera a 6 horas. El cult
ivo del LCR con la inoculacin de varias lneas celulares
Figura 48-13. M o n o c a p a de un cultivo de tejidos de clulas A549 d o n d e a
parecen los ECP causados p o r la multiplicacin de un enterovirus ECHO (aumento:
x 200; microscopia de contraste de fases).

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1063
Figura 48-14. Esquema del prolocolo para el diagnstico de la meningoencefalitis v
iral.
EXANTEMAS VIRALES
Varios tipos de virus atacan primariamente la piel: algunos infectan la epidermi
s escamosa directamente (herpes oral y genital, verrugas causadas por papilomavi
rus humanos o el molluscum conlagiosum provocado por poxvirus). pero la mayoria
de los exantemas son debidos a virus que afectan la piel y las membranas mucosas
por diseminacin hematgena (VVZ, sarampin, rubola, enlerovirus. parvovirus. VHH6) (C
herry, 1993). La mayor parte de estas infecciones son relativamente benignas y tp
icas de la infancia, que se diagnostican clnicamente, sin necesidad de pruebas de
laboratorio; sin embargo, el aislamiento del virus por cultivo, la identificacin
de antgenos virales o la confirmacin por mtodos serolgicos pueden ser de utilidad a
la hora de elegir la terapia antiviral, delimitar la extensin de la enfermedad e
n los casos graves o aplicar medidas de control de la infeccin en los pacientes h
ospitalizados. Los procedimientos diagnsticos de laboratorio se resumen en la Tab
la 48-12. El VVZ causa la varicela y el zster. En la varicela, el VVZ se disemina
mediante gottas de lquido infectadas en aerosoles que son inhalados, se multiplic
a en la nasofaringe y seguidamente penetra en el torrente circulatorio, por dond
e circula hasta alcanzar la piel (Weller, 1992). La replicacin del virus en el ep
itelio escamoso da lugar a la aparicin de unas vesculas pruriginosas que rpidamente
se transforman en lceras que eventualmente se recubren con una costra y curan si
n dejar cicatriz. En los nios, los sntomas sstmicos son suaves y las secuelas son ra
ras: en los adultos, mujeres embarazadas, neonatos y pacientes inmunocomprometid
os, la enfermedad puede ser ms grave, con neumona y afectacin visceral adems de las
tpicas lesiones en la piel (Gershon, 1976), Una vez que la varicela ha remitido,
la infeccin por el VVZ se mantiene latente en los ganglios sensitivos neuronales
(Mahalingham, 1991; Straus. 1989); con la reactivacin, el VVZ se extiende desde l
as races de los ganglios trigminos o dorsales hasta alcanzar nuevamente la piel, d
onde origina unas vesculas cutneas dolorosas. con una distribucin en dermatoma (zste
r). El zster es ms frecuente en ancianos y en pacientes francamente inmunocomprome
tidos; cuando aparece en adolescentes y adultos jvenes, puede ser indicativo de u
na infeccin subyacente por el VIH (Pana, 1994)
El liquido de las vesculas es rico en virus, siendo el espcimen ideal para el aisl
amiento por cultivo y la tincin DFA. Las clulas HDF permiten el crecimiento del VV
Z. El cultivo en tubos tradicionales es un mtodo lento y de p o c a sensibilidad,
pero si se utilizan tubos shell-vial para el cultivo, aumenta el rendimiento (h
asta un 75%) y la rapidez en la deteccin (Brinker. 1993). L a recogida de muestra
s a partir de las lesiones de la piel sospechosas de estar producidas por el VZZ
se lleva a cabo de la misma forma que en el caso de las vesculas causadas por el
VHS. De igual modo, el protocolo para el cultivo del V V Z es similar al que se
sigue para el VHS (Fig. 48-3); sin embargo, los cultivos estndar en tubo se incu
ban durante dos semanas y las monocapas de clulas en los tubos shell-vial se tien
a los tres y cinco das con la tcnica DFA, utilizando un conjugado para el WZ. L o
s ECP causados por el WZ aparecen c o m o pequeos parches de clulas redondeadas, h
inchadas y retrctiles en la monocapa de fibroblastos, y son semejantes a los que
aparecen como consecuencia de la proliferacin del CMV. Debido a que la conducta d
el VVZ en los cultivos de tejidos es algo problemtica, la tincin DFA de las clulas
presentes en las vesculas para detectar los antgenos virales es el mtodo diagnstico
ms rpido y sensible (Schrim, 1989). De los aproximadamente 70 serotipos de enterov
irus. varios son capaces de producir erupciones vesiculares o maculopapulares ge

neralizadas (Coxsackie B1 y A9, y virus ECHO 2, 4. 9,11,19 y 33). habitualmente

durante los meses clidos. La enfermedad de mano, pie y boca (causada pnncipalment
e por el virus Coxsackie A16) es tpica de nios pequeos, y se manifiesta con la apar
icin de vesculas en la lengua y en la piel de la palma de las manos y la planta de
l pie. Los miembros adultos de la familia del nio infectado tambin pueden desarrol
lar, ocasionalmente, la enfermedad con los sntomas caractersticos. El diagnstico de
laboratorio est limitado a la recuperacin del virus en cultivos celulares: la pie
l que recubre las vesculas, especialmente las de la palma de la mano y planta del
pie. debe levantarse completamente para dejar expuestas las clulas escamosas, qu
e deben recogerse frotando enrgicamente con un hisopo. Las infecciones por entero
virus tambin afectan al tracto gastrointestinal, por lo que el material recogido
con hisopo de la garganta y el recto es apropiado para llevar a cabo el cultivo.
La identificacin de enterovirus en cultivos celulares ha sido descrito en una se
ccin anterior de este capitulo. Ni la tincin
Tabla 48-12
Diagnostico d e laboratorio de las e n f e r m e d a d e s e x a n t e m t i c a
s vricas c o m u n e s Exantema Virus Varicela-zster Cultivo/Deteccin de antigenos
Preparacin de Tzanck Extensin para DFA* Cultivo (mayor sensiblidad en tubos s/tel
l-vial) Cultivo* Cultivo Cultivo de interferencia' HIS en eritroblastos infectad
os PCR Co-cullivo en linfoblastos* Cultivo* Frotis para tincin DFA
+
Serologia EIA o IFA (varicela) para IgM
Vancela/zsler
Erupcin cutnea por enterovirus (enfermedad de mano, pie y boca) Sarampin Rubola Erit
ema infeccioso Exantema sbito VHS
Enterovirus Sarampin Rubola Parvovirus B19 VHH6 VHS1 y VHS2
1
EIA o IFA para IgM" EIA para IgM" EIA o IFA para lgM
:
EIA para IgM'
'Mtodo recomendado 'Mtodos utilizados en los laboratorios de investigacin y/o refer
encia VHH = herpesvirus humano; para ver el significado de otras abreviaturas, c
onsltense las Tablas 48-3 hasta la 48-6

1064
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

DFA ni la serologa tienen utilidad para el diagnstico de los exantemas producidos

por enterovirus (Cherry, 1963,1993; DeChamps, 1988). El sarampin es una enfermeda
d viral altamente contagiosa que tiene sntomas sistmicos y respiratorios (liebre,
conjuntivitis, coriza, lesiones orales, tos y una erupcin cutnea eritematosa y mac
ulopapular generalizada) (Bellini, 1994). La vacunacin ha reducido en gran medida
la incidencia del sarampin en EE.UU., pero la enfermedad contina siendo un grave
problema en pases pobres, en donde est asociada con una gran morbilidad y mortalid
ad, debido a las complicaciones acompaantes (neumona) y a la malnutricin. El virus
causante puede aislarse de la nasofaringe al comienzo de la enfermedad, aunque l
a infeccin aguda se diagnstica ms fcilmente por tcnicas serolgicas, detectando las Ig
especficas frente al virus. La inmunidad adquirida tras la infeccin permanece, pr
esumiblemente, de por vida y se comprueba mediante la deteccin de IgG especificas
: sin embargo, la inmunidad debida a la vacunacin puede desvanecerse durante los l
timos aos de la adolescencia y la madurez. La infeccin que pueda producirse en est
as circunstancias produce una enfermedad atpica, con unas grandes posibilidades d
e sufrir neumonitis y con una erupcin no caracterstica. El diagnstico serolgico es p
articularmente til en el caso del sarampin atpico. El parvovirus B 1 9 produce un t
ipo de exantema infantil denominado eritema infeccioso (en ocasiones denominado
"quinta enfermedad" o exantema escolar), una enfermedad febril infantil que pres
enta una erupcin cutnea maculopapular distintiva que da a la cara una apariencia d
e "mejillas abofeteadas" (Erdman, 1991: Plummer, 1985). L a infeccin en los adult
os puede producir tambin ariralgias (Naides, 1990). Los parvovirus infectan las cl
ulas precursoras inmaduras del linaje eritrocitario, presentes en la mdula sea, y
pueden provocar crisis aplsica en pacientes con hemoglobnopata o con infeccin por VI
H (Harris, 1992). La infeccin primaria durante el embarazo puede ocasionar una ap
lasia de glbulos rojos en el feto, con anemia grave e hidropesa fetal. El diagnstic
o de laboratorio fue objeto de anlisis con anterioridad dentro de este mismo captu
lo. El virus de la rubola produce el denominado sarampin alemn, una enfermedad febr
il suave con una erupcin cutnea maculopapular transitoria (Cherry, 1993). La infec
cin en los nios no tiene mayores consecuencias, aunque en los adultos puede provoc
ar artralgias. La nica complicacin seria de la rubola es la diseminacin transplacent
aria del virus hasta alcanzar al feto, lo que conlleva un riesgo muy elevado de
aparicin de malformaciones congnitas. La infeccin aguda se diagnostica mediante la
deteccin de IgM especficas frente al virus. La comprobacin de la situacin mmunitaria
de una persona se determina fcilm e n t e investigando si posee IgG especficas fr
ente al virus. El VHH6, un virus linfotrpico capaz de infectar a los linfocitos B
y T, causa el exantema sbito (rosola infantil), una enfermedad autolimitada, comn
de la primera infancia, que se caracteriza por una fiebre elevada y la aparicin d
e una erupcin cutnea maculopapular fugaz, que desaparece al mismo tiempo que la fi
ebre remite bruscamente (Asano, 1994; Lpez. 1988: Salahuddin, 1986). La infeccin p
rimaria, por el VHH6 en nios mayores y en adultos est asociada a una enfermedad fe
bril linfoproliferativa, con caractersticas de MI aguda (descrita con anteriorida
d en este captulo) y que pudiera estar asociada con el sndrome de fatiga crnica, y
posiblemente con retinitis y neumonitis en pacientes inmunosuprimidos (Cone, 199
3). Tambin se ha descrito el diagnstico de laboratorio de la infeccin causada por e
l VHH6 en este captulo.
Figura 48-15. Deteccin de virus que producen gastroenteritis mediante enzimoinmun
oensayo (EIA) y microscopa electrnica (ME). bien se detectan infecciones sintomtica
s por rotavirus en ancianos ingresados en residencias (Marre. 1982). La transmisin
es por va orofecal. y en las reas de clima templado las epidemias por rotavirus t
ienen lugar durante los meses frios: sin embargo, en climas clidos los casos apar

ecen durante todo el ao. La deshidratacin con desequilibrio electroltico es la comp

licacin ms grave de la infeccin por rotavirus, y es la razn principal para hospitali
zar al paciente. Los rotavirus pueden sobrevivir transitoriamente en superficies
inertes, razn por la que deben extremarse las medidas de control y aislamiento p
ara prevenir la diseminacin nosocomial. Los serotipos 40 y 41 de adenovirus estn a
sociados con procesos de gastroenteritis y son responsables de un 1 0 % a un 20%
de las infecciones de este tipo en nios (Brandt, 1983). La enteritis por adenovi
rus es similar a la enfermedad causada por rotavirus, aunque no muestra variacio
nes estacionales. Los astrovirus han sido identificados como responsables de inf
ecciones nosocomiales y de brotes en asilos (Mitchell, 1993; Sastri, 1998): tamb
in se han detectado casos de gastroenteritis suave en adultos y de diarrea en pac
ientes infectados por el VIH (Grohman, 1993). Los calicivirus son responsables d
e entre el 1% al 6% de casos de gastroenteritis en nios pequeos y, ocasionalmente,
en ancianos (Dinulos. 1994). Los coronavirus raramente causan diarrea en nios. E
l virus N o r w a l k y otros virus morfolgicamente relacionados con l (Hawaii; Sn
ow Mountain) se incluyen dentro del grupo de los calicivirus; todos ellos provoc
an gastroenteritis aguda, que se caracteriza por que los afectados manifiestan nu
seas y vmitos ms intensos que la propia diarrea acompaante. Los nios mayores y los a
dultos son los ms frecuentemente afectados, aunque todos los grupos humanos puede
n ser afectados con independencia de la edad. Los virus N o r w a l k sobreviven
en aguas contaminadas, crustceos y alimentos preparados, y son responsables de n
umerosos brotes en todo el pas (EE.UU.) (Hedberg. 1993).
Diagnstico de laboratorio
T o d o s los virus causantes de gastroenteritis crecen pobremente, o no lo hace
n en absoluto, en las lneas celulares estndar. El diagnstico se ha basado tradicion
almente en la morfologa distintiva de cada uno de ellos mediante microscopa electrn
ica (ME) (Fig. 48-16). Las muestras de heces se centrifugan y se filtran, y una
alcuota de la muestra procesada se transfiere a una rejilla para ME y se tie con ci
do fosfotngstico. Los virus son teidos negativamente mediante este procedimiento,
lo que permite visualizar con gran facilidad sus caractersticas morfolgicas (tamao,
organizacin de la cpsida, caractersticas distintivas de la superficie). Si se aade
un anticuerpo especifico al filtrado de la muestra de heces, se consigue aglutin
ar las partculas vricas en acmulos, lo que facilita su reconocimiento e identificac
in (inmunomicroscopia electrnica). Los rotavirus son virus con una cpsida icosadrica
sencilla o doble, sin envuelta, que miden entre 55 nm y 75 nm de dimetro y tiene
n un aspecto que recuerda a una rueda. Los adenovirus entricos son morfolgicamente
idnticos al resto de adenovirus; tienen una cpsida icosadrica y tienen un dimetro e
ntre 70 nm y 90 nm. Los calicivirus tambin carecen de envuelta, tienen entre 30 n
m y 35 nm de dimetro y presentan una serie de depresiones en forma de
GASTROENTERITIS VRICA
La gastroenteritis vrica es una importante causa de morbilidad y mortalidad en to
do el mundo, con una mayor incidencia en los nios pequeos en pases en vas de desarro
llo. En EE.UU., la enteritis de origen vrico raramente es mortal, aunque se detec
tan del orden de 3 millones de casos anualmente, con unas 200.000 hospitalizacio
nes peditricas, aproximadamente Parashar, 1998). Los virus responsables son m u y
diversos, pero todos comparten la caracterstica de ser ubicuos. En bebs y nios pequ
eos, la diarrea grave est causada por rotavirus, adenovirus entricos, calicivirus,
astrovirus y coronavirus (Bates, 1993: Barnes, 1999). El virus Norwalk y otros v
irus parecidos provocan nuseas, vmitos y diarrea, principalmente en adultos (Hedbe
rg, 1993) (Fig. 4815). El tratamiento de todas la gastroenteritis virales es de
mantenimiento. Los rotavirus son responsables de al menos el 50% de los casos de
diarrea acuosa en nios pequeos y bebs en EE.UU.; la enfermedad tiene un pico en su
incidencia entre los 3 y los 15 meses de edad (Haffejee, 1991). Tam-

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1065
copa ordenadas regularmente en su cpsida. Los astrovirus tienen entre 27 nm y 30
nm de dimetro: ciertas estructuras de su cpsida dan lugar a una morfologa que semej
a a una estrella de seis puntas. Los virus Norwalk miden entre 24 nm y 40 nm, y
son virus sin envuelta, geomtncamente simtricos. Los coronavirus son los nicos viru
s, dentro de este grupo, que presentan una envuelta lipdica: los viriones son ms g
randes (tienen un dimetro entre 75 nm y 100 nm) y presentan unas estructuras en f
orma de bastn que se proyectan desde la cubierta, dando al conjunto la apariencia
de una corona. La morfologa de cada tipo de virus al microscopio electrnico es mu
y caracterstica, pero la ME no est disponible en muchos laboratorios. Se puede lle
var a cabo una deteccin sencilla y precisa de rotavirus en heces mediante nmunoens
ayos o aglutinacin con ltex. Ambos mtodos tienen una gran especificidad, pero el EI
A tiene una sensibilidad ligeramente superior (Dennehy. 1994,1999: Thomas, 1994)
. El diagnstico rpido es de gran ayuda en el caso de pacientes hospitalizados para
aplicar las medidas que eviten o reduzcan la diseminacin nosocomial de los virus
. Est disponible comercialmente un EIA para detectar antigenos de adenovirus entri
cos que tambin es sensible y especfico. Se han desanollado una serie de mtodos (EIA
, tcnicas de hibridacin directa o previa amplificacin con sondas de cidos nucleicos,
y ensayos genotpicos) para otros virus que producen gastroenteritis que estn disp
onibles en los laboratorios de investigacin y de sanidad pblica; estos mtodos han s
ido de particular utilidad en la evaluacin de los brotes relacionados con la inge
stin de alimentos contaminados.
HEPATITIS VRICA E INFECCIONES POR RETROVIRUS
Muchos virus afectan directamente al hgado. El virus de la fiebre amarilla y otro
s arbovirus hepatotxicos provocan una necrosis hepatocelular masiva. L a agregacin
de linfocitos atpicos en el hgado asociada a la infeccin p o r VEB. CMV. VHH6 y VI
H tambin provoca dao heptico como parte del sndrome de la mononucleosis. En paciente
s inmunodeprimidos. adenovirus. VHS, VVZ. C M V y virus ECHO causan, ocasionalme
nte, una hepatitis m u y agresiva (Hierholzer, 1992). De todos modos, la mayor p
arte de enfermedades vricas del hgado estn producidas por los virus de la hepatitis
A, B, C. D y E. que son todos hepatotrpicos y causan una lesin debida a la destru
ccin litica de los hepatocitos (Iwarson, 1992). El contagio por los virus de la h
epatitis A (VHA) y de la hepatitis E (VHE) tiene lugar de persona a persona, tra
nsmitindose por va oro-fecal. El V H A es un picomavirus sin envuelta relacionado
con los enterovirus que puede sobrevivir en agua contaminada y alimentos; los ma
riscos contaminados con aguas residuales sin depurar han sido responsables de va
rios brotes de gran envergadura. Las personas que viven en condiciones sanitaria
s deficientes, los nios en los asilos y en instituciones masificadas. y personal
sanitario o que est al cuidado de nios representan los grupos que tienen mayor rie
sgo de resultar infectados por el VHA (Iwarson, 1992). En los nios, la enfermedad
aguda es suave y, a menudo, asintomtica: ocasionalmente, los adultos
Figura 48-16. Observacin al microscopio electrnico de preparaciones de m u e s t r
a s de heces teidas negativamente con cido losfotngstico. A, Rotavirus: se aprecia
n distintos monotipos con cpsida sencilla o doble (aumento: x 200.000). 6. Adenov
irus: se aprecia el caracterstico patrn triangular en la superficie (aumento: x 10
0.000). C. Calicivims: se aprecian las depresiones superficiales en forma de c o
p a (aumento: x 200.000). En la micrografia se pueden observar tambin dos rotavi
rus (de m a y o r tamao) por encima de los calicivims. (Fotografas cortesa de Teres
a Valdivieso.)

1066
Tabla 48-13
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Caractersticas clnicas de las infecciones por virus de la hepatitis Hepatitis A He
patitis B Hcpadnavindae Percutnea. mucosas Al menos 8 12 semanas (14-180 dias) 10
% en adultos, 25% en nios. 80% en bes Si. elevado -1,4% Hepatitis C Flaviviridae Pe
rcutnea, mucosas Al menos 6 8 semanas (14-182 dias) 85% (un 20% desarrolla una ci
rrosis) S, bajo t%-2% Hepatitis D Virus satlites Percutnea, mucosas Uno (21-91 das)
5%-10%
?
Hepatitis E Calicivirus Fecal-oral Uno 6 semanas (14-63 dias) Poco (recuente
Clasificacin Via de iransmisin Genotipos Tiempo medio de incubacin (rango) Cronific
acin
Picornaviridae (Enterovirus 72) Fecal-oral Uno 4 semanas (10-50 dias) No
Riesgo de carcinoma hepatocelular Porcentaje de mortalidad. hepatitis aguda
No -0.3%
2%-20%, con cointeccin con VHB, 30% con sobreinleccin
No 1 %-2%; hasta un 20% en mujeres embarazadas
pueden desarrollar una enfermedad grave, aunque la hepatitis fulminante con resu
ltado de muerte es rara (un 0,6% o menos de los afectados). La recuperacin es tot
al y no existe estado de infeccin crnica. Existen vacunas para el VHA que son segu
ras y eficaces (Ashur, 1999). Se han producido brotes de la enfermedad debidos a
l VHE en pases en vas de desarrollo que tienen unas condiciones de alimentacin y de
potabilizacin del agua por debajo de los niveles ptimos, habindose descrito muy po
cos casos en EE.UU. (Viswanathan, 1957: Wald, 1995). Los ms frecuentemente afecta
dos son los adolescentes y los adultos jvenes. La mortalidad es muy baja, excepto
en el caso de las mujeres embarazadas, en las que el porcentaje de fallecimient
os puede alcanzar el 20% (Duff, 1998). El VHE no provoca infeccin crnica. El virus
de la hepatitis B (VHB) se transmite normalmente a travs de la sangre, y la infe
ccin se contrae, clsicamente, mediante transfusiones con sangre infectada o pincha
zos con agujas hipodrmicas contaminadas. Sin embargo, la transmisin vertical de la
madre al feto durante el embarazo, el contagio por cont a c t o sexual directo
y la exposicin a fluidos corporales, como la saliva en el ambiente familiar, tamb
in son rutas importantes para la diseminacin de la enfermedad. La infeccin aguda es
, frecuentemente, sintomtica y puede ser fulminante, causando una necrosis hepato
celular masiva de pronstico fatal en un 1% o 2% de los casos. La infeccin por el V
HB puede hacerse crnica, aunque el carcter crnico depende de la edad en la que se c
ontrajo la infeccin. Hasta un 90% de los nios que adquirieron la infeccin en el tero
, por transmisin vertical desde la madre, pueden convertirse en portadores crnicos
, comparado con el 25% que se detecta entre nios infectados con postenoridad al n
acimiento o el 10% entre los adultos. El dao hepatocelular es continuo durante la
infeccin crnica: en el 2% de los casos de infeccin crnica puede manifestarse una fo
rma crnico-activa de hepatitis con riesgo eventual de cirrosis (Lee, 1993; Overby
, 1992). La cirrosis por VHB es un factor de riesgo para desarrollar un carcinom
a heptico (CCH). L a infeccin por VHB puede ser prevenida en gran medida mediante
vacunacin. La vacunacin masiva de nios en Taiwan ha reducido de forma significativa

la incidencia del CCH peditrico (Chang, 1997).

La coinfeccin o sobreinfeccin del VHB con el virus de la hepatitis D (VHD) provoca
una aceleracin en la destruccin de hepatocitos y un incremento en los porcentajes
de mortalidad hasta valores de un 30%. El VHD es un virus incompleto que necesi
ta la intervencin de ciertos antgenos del VHB para poder expresarse y replicarse c
ompletamente. El VHD puede transmitirse de persona a persona en entornos familia
res, en aquellas reas donde el virus tiene carcter endmico (Amrica del Sur. frica. It
alia), aunque en EE.UU. las transfusiones sanguneas y la drogadiccin por va intrave
nosa son las principales causas de transmisin (Hadziyannis. 1997). En EE.UU., el
virus de la hepatitis C (VHC) es el responsable de la denominada hepatitis no A,
no B, siendo el responsable del 80% al 90% de los casos de hepatitis adquirida
tras una transfusin sangunea, antes de que se estableciesen, a partir del ao 1990.
los anlisis habituales para el control de la sangre y los hemoderivados (Cuthbert
, 1994). El consumo de drogas por va parenteral es, en la actualidad, el principa
l factor de riesgo; el personal sanitario infectado por haberse pinchado inadver
tidamente con agujas contaminadas constituye un porcentaje minoritario de casos.
La transmisin del VHC durante el embarazo, o c o m o consecuencia de relaciones
sexuales o contacto entre miembros en el entorno familiar, se da con una eficien
cia mucho m e n o r de la observada para el VHB (Rooney, 1998). El porcentaje de
casos de hepatitis fulminante con resultado de muerte es semejante al que se ob
serva asociado a la infeccin por el VHB. Sin embargo, ms del 75% de infecciones po
r el VHC se hacen crnicas y hasta un 20% acaban en cirrosis; el riesgo de desarro
llar un carcinoma hepatocelular tambin es elevado. El tratamiento con interfern-u
y ribavirina ha trado como consecuencia una disminucin progresiva de los casos de
infecciones crnicas por VHB y VHC, lo que puede modificar o prevenir, a largo pla
zo, las secuelas duraderas (Yoshioka, 1992; Christie, 1999). Desafortunadamente,
el porcentaje de respuesta es menor en las infecciones por el genotipo 1 del VH
C. que representan el 75% de todos los casos en EE.UU. (Gitnick, 1998). Las tcnic
as de segunda y tercera generacin de inmunotransferencia con protenas recombinante
s y los mtodos de enzimoinmunoensayo (EIA) tienen
Tabla 48-14
M a r c a d o r e s s e r o l g i c o s y antignicos en el diagnstico de la hepati
tis
VHA - aguda Antigua/posvacunacin VHB - temprana Perodo ventana En resolucin Crnica A
ntigua Posvacunacin VHC -aguda Crnica Antigua VHD - cointeccin Sobreinleccin VHE
+ = posUivo - = negalivo Adaptada de Biesemier KW. Parks D. Gertis C y cols : Vi
ral hepatitis serology at the University ol North Carolina Hospitals Update. Bul
l Lab Med 1994; 134:1; con permiso del editor.

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
1067
una elevada sensibilidad y especificidad en la deleccin de anticuerpos (rente al
VHC. Los pacientes seropositivos deben ser evaluados adiconalmente en busca de un
a infeccin persistente por el VHC. realizando estudios de la funcin heptica en los
mismos y. en algunos casos, una biopsia heptica, cuantificando mediante RT-PCR la
carga de ARN del VHC y, si procede, caracterizando el genotipo del virus (Lam,
1999). Los cinco virus de la hepatitis no se replican en las lneas celulares estnd
ar. La fase en la que se encuentra la infeccin queda definida mediante la deteccin
de IgM e IgG especficas y de antgenos virales (Biesemier, 1994). Las caracterstica
s clnicas de los virus do la hepatitis y los marcadores serolgicos de infeccin se r
esumen en la Tabla 48-14. A partir de individuos que han desarrollado una hepati
tis despus de haberles sido realizada una transfusin, se han aislado el virus de l
a hepatitis G'GVB-C (un flavivirus relacionado con el VHC) y el virus transmitid
o por transfusin (VTT), un virus con ADN de cadena sencilla. Sin embargo, ambos v
irus se encuentran frecuentemente en personas asintomticas, por lo que su asociac
in con una patologa heptica no est clara (Hadziyannis, 1998; Abe. 1999: Ding, 1999).
El tratamiento antirretroviral de gran eficacia (TARGA) con drogas perteneciente
s al menos a dos clases distintas de antirretrovirales (anlogos nudesidos inhibido
res de la transcriptasa inversa, inhibidores no anlogos e inhibidores de la prote
asa) ha mejorado de forma espectacular las expectativas de supervivencia y la ca
lidad de vida de los afectados (Saag, 1996; Shafer, 1999). La terapia tambin ha r
educido enormemente la transmisin perinatal. Desgraciadamente, continan apareciend
o variantes del virus resistentes a los antirretrovirales, incluso en aquellos p
acientes que estn recibiendo una terapia combinada, lo que refuerza la necesidad
de trabajar constantemente en la bsqueda y produccin de nuevos tipos de agentes an
tirretrovirales. El VLHT (virus de la leucemia humana de clulas T) infecta a los
linlocitos T-CD4- y causa una leucemia adulta de clulas T (LAT); la enfermedad se
da entre el 2% y el 4% de las personas infectadas por el VLHT-1 en reas endmicas
del Japn (Folks, 1998). El VLHT-I tambin causa mielopatia/paraparesis espstica trop
ical (HAM/TSP). una enfermedad degenerativa crnica caracterizada por un debilitam
iento progresivo de las extremidades inferiores, espasticidad y prdida de la func
in sensorial y del control de la vejiga (Manns, 1999). El VLHT-II se ha aislado a
partir de pacientes con leucemia de clulas T peludas o tricoleucemia, aunque la
relacin del virus con la enfermedad no est claramente establecida. Existen tcnicas
de enzimoinmunoensayo para la deteccin de anticuerpos que se utilizan en bancos d
e sangre.
Virus de la inmunodeficiencia humana
El VIH-1 es un retrovirus incluido dentro de la subfamilia Lentivirinae que en l
a actualidad parece estar diseminado por todo el mundo. El VIH infecta y destruy
e a los Imfocitos T-CD4, lo que da lugar a que se produzcan numerosas infeccione
s oportunistas y tumores secundarios en los individuos afectados (Phillips, 1992
; Stein. 1992; Poli, 1993: Schnittman, 1990). El VIH tambin es neurotrpico y puede
causar meningitis aguda y una encefalopata destructiva lenta (Atwood, 1993). La
mitad de los individuos con inteccin aguda manifiestan unos sntomas parecidos a lo
s de la mononucleosis (vase la seccin titulada Mononucleosis infecciosa heterfilo-n
egatva, en este mismo capitulo) antes de entrar en una fase asintomtica en la que
va teniendo lugar una destruccin progresiva de las clulas T-CD4. El tiempo medio n
ecesario para manifestar todas las caractersticas del sida es de 10 a 11 aos: entr
e el 5% y el 10% de los afectados desarrollan el sida en dos o tres aos, mientras
que entre un 5% y un 1 0 % de infectados mantienen estables los valores de recu
ento de linlocitos y permanecen asmtomticos indefinidamente (Muoz, 1995). Los nios

que han sufrido una infeccin vertical en el momento del nacimiento muestran gener
almente una progresin muy rpida de la enfermedad (Downs. 1995). Existen varios sis
temas comerciales basados en la tcnica del enzimoinmunoensayo, preparados con antg
enos purificados del VIH u obtenidos mediante recombinacin, que son capaces de de
tectar IgG especificas frente al VIH, entre dos y cuatro semanas despus de que se
haya producido la infeccin, con unos niveles de especificidad y sensibilidad exc
elentes. Los bancos de sangre buscan de forma habitual los anticuerpos frente al
VIH-2: esta es una estrategia deseable tambin en las reas de frica, donde la infec
cin es endmica. Un EIA que ha dado positivo para anticuerpos frente al VIH debe se
r repetido y a continuacin confirmado con un test adicional como la mmunotransfer
encia [Western immunoblotting, mediante el cual sea posible verificar que los an
ticuerpos del paciente reaccionan con antgenos especficos del VIH (MMWR, 1991). Lo
s resultados que se muestren en los informes serolgicos de laboratorio en relacin
con el VIH deben ser concisos, y debe evitarse el empleo de comentarios ambiguos
o confusos (Hewitt. 1992). El VIH puede propagarse en cultivos de tejidos, co-c
ultivando linlocitos o muestras de tejidos infectados del paciente con linfocito
s de un donante sano que hayan sido estimulados con fitohemaglutinma. mterleucin
a-2 e mterfern. Esta es una tcnica cara y compleja, y potencialmente peligrosa, qu
e no debe realizarse en los laboratorios de diagnstico ordinario. La necesidad de
tener que aislar el VIH mediante cultivo ha sido reemplazada por los mtodos de d
iagnstico molecular.
INFECCIONES VRICAS EN HUSPEDES INMUNOCOMPROMETIDOS
La respuesta inmune a la infeccin por virus implica una complea interaccin tanto de
factores humorales como celulares. El control de la infeccin aguda es llevado a
cabo por los procesos de la inmunidad celular. Los granulocitos natural M/er(NK)
de gran tamao que circulan por la sangre y los tejidos identifican aquellas clula
s que expresan antgenos virales (antigenos extraos o no propios) y las destruyen p
or lisis proteoltica. Al principio de la infeccin aguda, los antigenos virales son
procesados por los macrofagos y presentados a los Imfocitos T: las clulas T-CD4
producen citocinas que promueven la expansin clonal de las clulas T-CD8 citotxicas.
las cuales eliminan, a continuacin, las clulas hospedadoras que contienen antigen
os virales. Cualquier alteracin en la normal interaccin entre las clulas CD4, CD8 y
los N K reduce la capacidad del husped para controlar la enfermedad vrica. La inm
unidad mediada por clulas tambin juega un papel crtico en la supresin de virus que s
e encuentran en fase de latencia en el hospedador (tales como VHS. CMV y VEB). E
n los individuos sanos, la mayor parte de infecciones por reactivacin con estos v
irus son asintomticas o producen una enfermedad limitada que queda confinada a lo
calizaciones anatmicas concretas (p. ej.. el herpes oral o genital). Si los mecan
ismos de la inmunidad celular estn alterados, cualquier infeccin recurrente puede
dar lugar a un
L a amplificacin por PCR del cido nucleico proviral del VIH se utiliza, en princip
io, para diagnosticar la infeccin Iransmitida verticalmente durante los primeros
meses de vida del recin nacido (vase la seccin titulada Infecciones vricas congnitas
y perinatales, en este m i s m o capitulo). Los ensayos para determinar la carga
viral cuantifican los transcritos de ARN del VIH en el plasma. Estas determinac
iones tienen un valor prognstico y han representado una revolucin en el uso de la
terapia antirretroviral. Las reducciones en el nmero Figura 48-17. M o n o c a p
a de fibroblastos MRC-5 q u em u e s t r a los ECP causados de copias de ARN virc
o. hasta un valor de 0,5 unidades logartmicas por mi. p o r la replicacin del CMV
tras 11 das de incubacin (microscopa ptica de coninducidas por el tratamiento, se as
ocian con una progresin clnica ms lenta. traste de fases: aumento: x 100).

1068
SECCIN VI
MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 48-15 Direcciones d e inters e n Internet Nombre de la pgina
Centers tor Disease Control and Prevention Wold Health Organization Association
for Professionals m Infection Control and Epidemiology Medscape American Society
tor Microbiology European Society lor Clinical Virology National Centers lor In
lectious Diseases Pan American Society lor Clinical Virology Lab Explorer All th
e Virology on Ihe WWW Johns Hopkins Infectious Disease
Direccin en la web
http:/Avww cdc gov/ http:/Avww who.mt/ http://www.apic.org/ http://www medscapc.
com http//www asmusa org/ http://www.eur nl/FGG/VIRO/ESCV/ http://www cdc. gov/n
c idod/ hllp://www virology.org/ http://www.labexplorer.com/ hltp://www. virolog
y.net http/Avww.hopkins-id.edu/
proceso altamente agresivo a nivel local o bien a la diseminacin del agente patgen
o, produciendo lesiones multiorgnicas graves. El nmero de pacientes inmunodeprimid
os se h a incrementado de forma espectacular en los ltimos 20 aos. Los tratamiento
s con corticosteroides, quimioterpicos, radiaciones, drogas inmunosupresoras, asi
como la eliminacin de los linfocitos T-CD4 por la accin del VIH, causan dao en los
mecanismos que regulan la respuesta inmune celular y aumentan la susceptibilida
d a la infeccin por u n a gran variedad de virus. Infecciones pnmanas como la mon
onucleosis por el VEB. la gripe y la varicela son, a menudo, mucho ms graves en e
stas circunstancias. Tambin puede tener lugar una proliferacin d e los condilomas
genitales causados por papilomavirus humanos, con una progresin acelerada hacia l
a displasia escamosa y el carcinoma, tanto en mujeres como en hombres. A menudo,
las enfermedades vricas ms graves son consecuencia de la reactivacin en el hospeda
dor de virus durmientes endgenos (CMV, VHS y VVZ). En este contexto, se han descr
ito casos de necrosis de las lesiones mucocutneas orales y perianales causadas po
r el VHS, y zster con afectacin de varios dermatomas. Las infecciones vricas oportu
nistas ms comunes estn causadas por CMV. en pacientes infectados por el VIH y en t
rasplantados. Los enfermos de sida con unos valores de recuento de clulas CD4 por
debajo de 100 por mnv padecen retinitis por CMV como complicacin ms frecuente. Ta
mbin se dan casos de neumona, as c o m o de infecciones del tracto gastrointestinal
y del SNC causadas por CMV. T a m p o c o es infrecuente observar afectacin mult
iorgnica en autopsia (Drew, 1992). La infeccin por CMV produce las tpicas inclusion
es especficas en las clulas infectadas, aunque la observacin de las mismas carece d
e sensibilidad de cara al diagnstico. La sensibilidad se incrementa ligeramente r
ealizando tinciones con inmunoperoxidasa o hibridacin in silu (HIS). aunque el ai
slamiento del virus es la tcnica que goza de una mayor precisin diagnstica. El CMV
se replica casi exclusivamente en la lnea celular HDF: su crecimiento es lento, s
iendo necesario incubar durante siete dias. e incluso ms. para que se desarrollen
los ECP. Los fibroblastos infectados conservan inicialmente su morfologa fusifor
me, mientras que su ncleo se hincha y se h a c e ms refringente.
Eventualmente. toda la clula puede redondearse y distorsionarse, a la vez que el
virus se extiende a las clulas adyacentes, formando una zona de clulas daadas que v
a aumentando de tamao progresivamente (Fig. 48-17). La deteccin del CMV se acorta
en uno o dos das si se utilizan los cultivos en tubos shell-vial y se lavorece la
adsorcin de los virus a la monocapa de clulas mediante centrifugacin (Gleaves, 198
4, 1987). Las monocapas de clulas HDF se inoculan con leucocitos de sangre perifri
ca (separados mediante centrifugacin en gradientes de densidad), liquido del lava
do bronquioalveolar (LBA). orina o tejidos homogeneizados; tras unas 16 a 40 hor
as de incubacin, la monocapa se tie con un anticuerpo especifico frente al antigen
o precoz del CMV. conjugado con fluoresceina. Los fibroblastos infectados muestr
an una fluorescencia homognea por todo el ncleo (vase Fig. 48-18) L a especificidad

del mtodo es del 100% y la sensibilidad excelente cuando los cultivos celulares
se inoculan con orina, tejidos homogeneizados o L B A (del 95% al 100%). Sin emb
argo, la inoculacin de leucocitos de sangre perifrica en cultivos en tubos shell-v
ial tiene tan slo una sensibilidad del 75% comparada con la que se obtiene cuando
la inoculacin se lleva a cabo en monocapas en tubos estndar: por tanto, se recomi
enda siempre efectuar un cultivo suplementano. En los pacientes inmunocomprometi
dos. el CMV es la causa ms frecuente de viremia. aunque ocasionalmente estos indi
viduos pueden desabollar infecciones por VVZ, VHS. adenovirus y. a veces, entero
virus. Los cultivos tradicionales en lubo de clulas HDF y A549 incubados durante
1 4 das luncionan adecuadamente para la recuperacin de todos esos agentes y tambin
del CMV (Stanberry, 1994). Otra ventaja del aislamiento del CMV en tubos shell-v
ial es la facilidad con que esta tcnica permite realizar cultivos semicuantilativ
os (Buller, 1992: Slavin, 1992). El empleo de un inoculo estandarizado de clulas
(leucocitos o clulas del LBA) y un recuento de los ncleos fluorescentes que aparec
en en el cultivo celular tras la tincin con el anticuerpo especifico frente al an
tigeno precoz del CMV. conjugado con fluoresceina, proporciona u n o s datos que
tienen una cierta utilidad clnica a la hora de eslimar la gravedad de la infeccin
, controlar la respuesta al tratamiento y realizar una estimacin pronstica. En cua
lquier caso (cultivos celulares en tubos estndar o en tubos shell-vial), la recup
eracin del CMV se incrementa si los especmenes se inoculan inmediatamente despus de
haber sido obtenidos en cultivos celulares frescos (Brumbach, 1997; Roberts, 19
97). La infeccin por CMV en receptores de trasplantes de rganos o de mdula sea (alogn
ico) compromete seriamente el resultado de los mismos El virus puede daar directa
mente los rganos trasplantados, y la toxicidad de las drogas antivricas asi como l
a deliberada disminucin de la terapia inmunosupresora anti-rechazo tambin pueden r
epresentar una seria amenaza para la supervivencia del injerto. Los cultivos de
vigilancia ordinarios del C M V :enen una utilidad escasa para predecir el desarr
ollo de u n a enfermedad por C M Vy tomar decisiones clnicas (Falagas, 1997). L a
determinacin cuantitativa del antigeno pp65 del CMV en leucocitos de sangre peri
frica y la deleccin del ADN del virus mediante PCR son tcnicas ms sensibles que el c
ultivo y tambin son capaces de detectar la viremia con mayor antelacin (Mndez, 1998
; Boeckh. 1998). Los anlisis secuenciales suministran datos de alerta t e m p r a
n a que permiten ajustar con la mayor precisin posible las terapias antivirales
e inmunosupresoras. La deteccin del antgeno del CMV se lleva a cabo en los leucoci
tos de sangre perifrica, mediante el mtodo I F A (Erice, 1995; Storch, 1994; Landr
y, 1996); la principal limitacin de esta tcnica es la leucopema. La PCR cuantitati
va parece ser un procedimiento til para predecir infeccin p o r CMV en personas so
metidas a un trasplante de hgado o rion (Drouet. 1994.
Figura 48-18. Cultivo de fibroblastos MRC-5 en tubos shelt-vial donde se aprecia
un gran nmero de ncleos fluorescentes tras la tincin con el anticuerpo especfico fr
ente al antigeno precoz del CMV, conjugado con fluoresceina (aumento: x 250).

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
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CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS
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CAPTULO
49
Infecciones causadas por clamidias, rickettsias y micoplasmas
Gail L. Woods, M.D. David H. Walker, M.D.
INFECCIONES POR CLAMIDIAS Estructura Multiplicacin Chlamydia trachomatis Chlamydo
phila (originalmente Chlamydia) psittaci Chlamydophila (originalmente Chlamydia)
pneumoniae Diagnstico de laboratorio Tratamiento INFECCIONES POR RICKETTSIAS 107
6 1072 Infecciones causadas por organismos del gnero Ehrlichia Infecciones causad
as por Coxiella burnetii Infecciones causadas por organismos del gnero Bartonella
(Rochalimaea) INFECCIONES POR MICOPLASMAS Mycoplasma pneumoniae Micoplasmas gen
itales Diagnstico de laboratorio Tratamiento BIBLIOGRAFA 1085 1083
Infecciones causadas por organismos del gnero Rickettsia Tifus "scrub" (tifus de
las malezas) causado por Orientia tsutsugamushi
Las infecciones causadas por clamidias. rickettsias y micoplasmas en humanos se
consideran independientemente en este volumen porque los microorganismos respons
ables de las mismas son diferentes de la mayor parte del resto de bacterias en v
arios aspectos: son de tamao ms pequeo, la estructura de su pared celular es distin
ta y son parsitos intracelulares obligados, en particular las clamidias y la mayo
r parte de rickettsias.
INFECCIONES POR CLAMIDIAS
Las clamidias tienen tropismo por las clulas epiteliales columnares. Su pared cel
ular es semejante a la de las bacterias gramnegativas; poseen tanto cido desoxirr
ibonucleico (ADN) como cido ribonucleico (ARN). tienen ribosomas procariotas y so
n capaces de sintetizar sus propias protenas, cidos nucleicos y lipidos: se divide
n por biparticin; y son sensibles a ciertos antibiticos. A diferencia de otras bac
terias, las clamidias son "parsitos energticos"; son bacterias intracelulares obli
gadas que no pueden multiplicarse fuera de las clulas que las albergan y son inca
paces de sintetizar compuestos ricos en energa como el adenosn Irilosfato (ATP). L
as clamidias estn incluidas en el orden Chlamydiales. Una revisin reciente de la t
axonoma ha sugerido la creacin de tres familias, una de las cuales, Chlamydiaceae,
incluira las especies patgenas para el hombre (Everett, 1999). Se han propuesto d
os gneros en donde estaran englobadas tres especies patgenas humanas: Chlamydia tra
chomatis. Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci y Chlamydophila (orig
inalmente Chlamydia) pneumoniae. En la Tabla 49-1 se indican algunas caracterstic
as tiles para diferenciar las tres especies mencionadas. Adems, estos gneros incluy
en tambin otras seis especies que no han sido asociadas con infecciones en el ser
humano.
tes disulfuro. El cuerpo elemental es la forma infecciosa del organismo, y tiene
una capacidad de supervivencia limitada fuera de la clula hospedadora. Por otro
lado, el cuerpo reticular, con un dimetro entre 0.6 iim y 1 . 0 pm. es la forma m
tracelular, metablicamente activa, incapaz de sobrevivir en el medio ambiente exo
celular. El ADN circular de ambas formas se encuentra organizado, de forma compa
cta, en un nucleoide central y su genoma tiene un tamao de enlre 1,0 y 1,2 millon
es de pares de bases (pb). Entre los componentes de la membrana externa del cuer
po elemental, dos tienen importancia para el diagnstico. El ms importante es la pr
oteina mayontaria de la membrana externa (MOMP), una especie transmembranal que
posee epitopos, definidos en base a su reactividad frente a anticuerpos monoclon
ales, especficos de serovariedad. especie, gnero y familia. La infeccin por clamidi
as induce en el husped la aparicin de anticuerpos anti-MOMP especficos, aunque el p
apel protector de estos anticuerpos n o est claramente establecido. La membrana e
xtema de las clamidias tambin posee un antgeno de naturaleza hpopolisacaridica (LP
S), que es el antigeno mayoritario detectado mediante pruebas serolgicas, especif
icas de gnero, como indicador de infeccin por clamidias. Se han utilizado anticuer
pos monoclonales y anticuerpos polivalentes monoespecificos frente al LPS o la M

OMP, para detectar la presencia de antigenos de clamidia en especmenes clnicos, me

diante mmunofluorescenoa directa (DFA) y enzimoinmunoensayo (EIA).
Multiplicacin
Las clamidias se multiplican en el citoplasma de la clula hospedadora infectada.
El ciclo biolgico de desarrollo comienza con la adhesin del cuerpo elemental a mic
rovellosidades de una clula columnar susceptible; en cualquier caso, los receptor
es especficos implicados en esta interaccin n o han sido identificados todava. El c
uerpo elemental desciende entonces por la microvellosidad, hasta alcanzar la mem
brana plasmtica de la clula hospedadora, localizndose en invaginaciones o indentaci
ones de la misma Seguidamente, la clamidia penetra en la clula en un endosoma, do
nde las diferentes especies, C. psittaci C. pneumoniae y C. trachomatis, permane
cen durante su desarrollo mtracelular. El contenido de los endosomas que contien
en los cuerpos elementales de C psittaci no se acidifica, y no se produce la fus
in de aquellos con los lisosomas celulares; sin embargo, los endosomas con cuerpo
s elementales de
Estructura
Las clamidias presentan dos formas morfolgicamente distintas. Por un lado, el den
ominado cuerpo elemental, una forma esfrica, densa, con un dimetro entre 0.2 pm y
0,4 pm, que contiene ARN ribosomal procaritico y posee una pared celular rgida, de
bido a la gran cantidad de enlaces que se establecen entre los componentes prote
icos de la misma, a travs de puen-

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1073
Tabla 49-1
Caractersticas tiles para diferenciar las e s p e c i e s de Chlamydia y Chlamyodo
phila p a t g e n a s del h o m b r e Especies
Caracterstica Susceptibilidad a las sulfamidas Tincin de glucgeno de las inclusione
s Forma del CE
Chlamydia trachomatis S +
Clamydophila psittaci R
Clamydophila pneumoniae R
estados del sureste, homosexuales e individuos que han visitado paises fuera de
EE.UU., donde el LGV tiene carcter endmico. El LGV se transmite por contacto sexua
l directo, aunque tambin se h a observado transmisin del microorganismo a travs de
fmites y por aerosoles formados durante accidentes de laboratorio, asociada a cas
os de neumonitis. derrames pleurales y lintadenopatia mediastinica o hiliar (Jon
es. 2000). El reservono del agente infeccioso est constituido por personas infect
adas pero asintomticas o por individuos con infeccin uretral, cervical o anorrecta
l ignorada. El L G V es la nica infeccin causada por C. trachomatis que produce ma
nifestaciones multisistmicas y constitutivas. Durante la lase primaria se forma u
na vescula indolora o una ppula no indurada, de pequeo tamao, que aparece, frecuente
mente, en los genitales externos, entre tres das y tres semanas despus de la expos
icin al microorganismo, y que desaparece rpidamente sin dejar cicatriz. La lase se
cundaria se caracteriza por una linfadenopata supurativa local y otros sntomas com
o liebre, escalofros, anorexia, dolor de cabeza, mialgias y artralgias. comenzand
o entre dos y seis semanas despus de la infeccin. El examen histolgico de los gangl
ios linfticos afectados muestra la existencia de granulomas que rodean abscesos e
strellados. Los ganglios linfticos afectados aparecen enmaraados y eventualmente s
upuran, dando lugar a fistulas que sanan, con cicatrizacin, varios meses despus. L
a fibrosis y el drenaje linftico anormal resultante son responsables del estrecha
miento uretral o rectal y de la induracin y edema linftico de los genitales que ap
arece durante la tercera fase. El espectro clnico de las enfermedades de transmis
in sexual debidas a cepas de C. trachomatis que no causan LGV (cepas no LGV) es s
emejante al de las infecciones debidas a Neisseria gonorrhoeae (vase Cap. 50). En
el hombre. C. trachomatis es responsable del 30% al 50% de casos de uretritis n
o gonoccica. aunque un tercio de varones que albergan a C. trachomatis en su uret
ra no manifiestan sntoma alguno (Stamm. 1984). Muy raramente, la uretritis produc
ida por C. trachomatis evoluciona hasta una epiddimitis. Entre los varones homose
xuales, las cepas no LGV de C. trachomatis se han asociado a casos de proctitis.
El microorganismo se ha aislado tambin de la uretra de un 70% de individuos con
sndrome de Reiter no tratado asociado con uretritis (Keat, 1983). La infeccin geni
tal por C. trachomatis tiene una incidencia mayor en la m u j e r que en el homb
re y es ms frecuente entre mujeres jvenes, solteras o divorciadas, negras, de nive
l socioeconmico bajo y que tengan mltiples compaeros sexuales. La infeccin de la end
ocrvix por C. trachomatis puede ser asintomlica o bien producir una cervicitis muc
opurulenta. que puede extenderse h a s t a la uretra y la vejiga unnaria. dando
lugar al "sindrome uretral agudo" o piura sin bacteriemia, o hasta el endometno y
las trompas de Falopio. causando entonces endometritis o salpingitis. Las infec
ciones del tracto reproductivo superior pueden evolucionar hasta una enfermedad

inflamatoria plvica o provocar cicatrizacin y disluncin del sistema de transporte d

e los oviductos, lo que puede traducirse en infertilidad o embarazo ectpico. La d
iseminacin intrapentoneal de la infeccin puede provocar peritonitis aguda, perihep
atitis (sndrome de Fitz-HughCurtis), periapendicitis o inflamacin del bazo. Un peq
ueo porcentaje de adultos con infeccin genital por clamidias desarrollan una conju
ntivitis de inclusin. En los paises desarrollados donde las infecciones de transm
isin sexual por C. trachomatis tienen carcter epidmico, el microorganismo puede pas
ar de la madre al hijo durante el trnsito por el canal del parto. Estudios llevad
os a cabo en Norte Amrica indican que entre el 60% y el 70% de los nios expuestos
a C. trachomatis durante el parto por via vaginal resultan infectados por l a ba
cteria, mientras que la infeccin en aquellos que nacen mediante cesrea es muy poco
frecuente (Jones, 2000). Es posible recuperar a C. trachomatis de la conjuntiva
de los nios infectados tras una o dos semanas y a partir de la nasofaringe inmed
iatamente despus. La frecuencia de aislamiento a partir de la conjuntiva disminuy
e a partir de la quinta/sexta semana, aunque C. trachomatis puede ser recuperada
de la nasofaringe, conjuntiva, recto y vagina (habitualmente sin producir sntoma
s) durante varios meses. La conjuntivitis de inclusin, la manifestacin ms frecuente
de la infeccin por C. trachomatis en nios, aparece en casi el 80% de aquellos en
los que el cultivo a partir de la conjuntiva o el examen citolgico revela l a pre
sencia del microorganismo (Jones, 2000). Entre 2 y 25 das despus del nacimiento se
produce un H u i d o mucopurulento y la conjuntiva se inflama y se vuelve edema
tosa. Los sntomas generalmente desaparecen sin tratamiento en u n o s cuantos mes
es y sin dejar secuelas, aunque puede quedar cierto grado de cicatrizacin en la c
onjuntiva.
Redondeada Redondeada De pera o redondeada
CE = cuerpo elemental. S susceptible; Fl = resistente: * = positivo. - = negativ
o.
C. trachomatis pueden fusionarse entre ellos y. probablemente, con los lisosomas
. Entre seis y ocho horas despus de que el cuerpo elemental haya penetrado en la
clula husped, comienzan a producirse cambios en la estructura de la pared celular
asociados a la transicin a cuerpo reticular, se inicia la sntesis de ADN, ARN y pr
otenas y comienza la divisin por biparticin. Las mitocondnas de la clula hospedadora
migran y se sitan frente al endosoma, cuyo tamao va creciendo, lo que permite que
los cuerpos reticulados en multiplicacin utilicen el ATP generado por la propia
clula infectada. Los cuerpos reticulados comienzan a reorganizarse tras 1 8 a 24
horas despus de la infeccin; y, presumiblemente, cuando se agotan los nutrientes,
tiene lugar su maduracin y transformacin a cuerpos elementales, que son finalmente
liberados al medio extracelular. Las clulas infectadas por C. psittaci sufren dao
s importantes c o m o consecuencia de la multiplicacin de los microorganismos en
su interior, teniendo lugar la liberacin de las clamidias por la lisis de la clula
husped 48 horas despus de que se haya producido la infeccin. Por el contrano, C. t
rachomatis es liberada, entre 72 y 96 horas despus de la infeccin, tras la fusin de
la membrana que delimita el cuerpo de inclusin que contiene los cuerpos elementa
les con la membrana plasmtica, dejando una lesin en la m i s m a y permitiendo la
supervivencia de la clula hospedadora.
Chlamydia
trachomatis
Chlamydia trachomatis es la causa ms frecuente de enfermedades transmitidas por c
ontacto sexual en EE.UU. Asimismo, en regiones de Oriente Medio y del norte de A
frica y de la India, donde el tracoma es endmico, es una importante causa de cegu
era.
Epidemiologa, patologa y manifestaciones clnicas
El ser humano es el nico hospedador conocido para todas las cepas de C. trachomat

is conocidas. Las manifestaciones clnicas, asi c o m o la especificidad por el rga

no afectado en el cuerpo, vienen determinadas tanto por el mecanismo de transmis
in como por las propiedades de la cepa infectante. Desde un punto de vista epidem
iolgico, las infecciones por C. trachomatis se dividen en tres categoras: el clsico
tracoma, las enfermedades transmilidas por contacto sexual en adultos y las inf
ecciones perinatales. oculares y del tracto respiratorio. El tracoma clsico es un
a causa importante de ceguera en aquellas reas donde las condiciones sanitarias s
on inadecuadas y la higiene personal escasa, aunque es la causa de ceguera que,
a nivel mundial, puede ser prevenida ms fcilmente. Tpicamente, la infeccin se transm
ite entre los nios a travs de los dedos, mediante fmites y probablemente por las mo
scas. En reas donde la enfermedad es endmica, la conjuntivitis aguda provocada por
clamidias en adultos o en nios es poco frecuente, aunque muchos nios quedan infec
tados crnicamente pocos aos despus de su nacimiento. Exposiciones repetidas a C. tr
achomatis conducen, eventualmente, al desarrollo de queratoconjuntivitis folicul
ar crnica, cicatrizacin de la conjuntiva y pannus (invasin de la crnea por los vasos
sanguneos). Entre las enfermedades que se transmiten por contacto sexual directo
en adultos, y que estn provocadas por C. trachomatis. se encuentran el linfogran
uloma venreo (LGV) y la uretritis/cervicitis, con las complicaciones asociadas a
las mismas. El LGV tiene carcter endmico en Asia, frica y Amrica del Sur. En EE.UU.
se registran alrededor de 500 casos anualmente: la enfermedad afecta ms al hombre
que a la mujer, en una relacin de 3 a 1, y es ms frecuente entre personas pertene
cientes a un estrato socioeconmico bajo en los

1074
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Aproximadamente un 20% de nios que son infectados por C. trachomatis durante el n
acimiento desarrollan neumonitis intersticial. La enfermedad comienza entre las
dos semanas y los tres meses de edad (con un pico entre las tres y las seis sema
nas) con una congestin nasal, seguida de una caracterstica tos staccato con taquip
nea y crepitantes, pero sin fiebre. La mitad de ellos tienen o han tenido conjun
tivitis. Los sntomas se manifiestan durante varias semanas, aunque los crepitante
s inspiratorios y los cambios en el examen radiolgico del lrax pueden persistir du
rante meses.
Chlamydophila (originalmente
Chlamydia) psittaci
La neumona asociada con el contacto con pjaros fue descrita en Suiza por primera v
ez en 1879. La enfermedad fue rara en EE.UU. y Europa hasta finales de 1920. cua
ndo comenzaron a ponerse de moda los pjaros tropicales como mascotas. El agente p
atgeno responsable fue aislado por Bedson en 1930 a partir de muestras de tejido
humano y de ave durante la investigacin de un brote epidmico en el zoolgico de Lond
res.
prominente es la aparicin de una tos seca y persistente que, ocasionalmente, pued
e producir un esputo sanguinolento. El pulso cardaco es. a menudo, lento para la
temperatura corporal del paciente, y tambin es frecuente padecer una jaqueca inte
nsa y difusa. Son comunes otros sntomas c o m o malestar general, mialgias doloro
sas y artralgias. y tambin puede aparecer una erupcin macular (manchas de Horder)
que semeja las manchas rojizas de la fiebre tifoidea. Un cierto grado de obnubil
acin puede manifestarse al final de la primera semana, y unos pocos afectados tie
nen molestias gastrointestinales (Gl). Chlamydophila psittaci raramente causa en
docarditis destructiva: la mayor parte de personas afectadas tienen un historial
de enfermedad reumtica cardiaca o de malformaciones congnitas de las vlvulas cardac
as (Jones. 1982).
Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae
En 1986, una especie particular de clamidia se asoci con una patologa aguda del tr
acto respiratorio humano. El organismo, inicialmente considerado como una cepa d
e Chlamydia psittaci, fue denominado TWAR, siglas que correspondan a las letras d
e identificacin de los dos primeros aislamientos de la bacteria obtenidos: TW-183
. aislado en 1965 del ojo de un nio de un grupo control durante un ensayo de vacu
nacin realizado en Taiwan, y AR-39, recuperado ese mismo ao de la garganta de un e
studiante de la Universidad de Washington afectado de faringitis. Muy poco tiemp
o despus de su deteccin, los datos de los estudios de homologa de ADN y de las obse
rvaciones al microscopio electrnico pusieron de manifiesto que se trataba de una
especie diferente, inicialmente designada como Chlamydia pneumoniae, y que recie
ntemente ha sido reclasilicada como Chlamydophila pneumoniae (Everett, 1999; Chi
. 1987: Campbell, 1987; Cox. 1988). Las cepas de C. pneumoniae y C. psittaci tie
nen un 10% o menos de homologa en la secuencia de ADN. y ba|0 ciertas condiciones
el cuerpo elemental de C pneumoniae tiene forma de pera, mientras que en otras
es redondeado, como los cuerpos elementales de Chlamydophila psittaci y Chlamydi
a trachomatis.
Epidemiologa
La infeccin causada por ChiamydophUa (originalmente Chlamydia) psttacci (llamada

psitacosis) aparece distribuida mundialmente. Las aves de la familia de las psit

aciformes se consideran el principal reservorio del microorganismo responsable d
e la enfermedad, aunque la mayor parte de especies de pjaros pueden ser infectada
s por la bactena. Los animales infectados pueden, obviamente, enfermar y morir,
aunque frecuentemente slo muestran sntomas ligeros como anorexia, diarrea, letargo
y plumaje rizado. La enfermedad en humanos tiene carcter espordico y ha sido asoc
iada con el contacto con loros, canarios, palomas, gorriones, patos, gallos, ave
s de corral (principalmente pavos) y ocasionalmente mamferos. Ms de la mitad de lo
s 40 a 60 casos de psitacosis que se detectan anualmente en EE.UU. se dan entre
las personas que poseen pjaros como mascotas. Los empleados de las tiendas de anma
les, criadores de palomos, trabajadores en zoolgicos, veterinarios y todos aquell
os que por su actividad laboral estn en contacto con las aves tienen un mayor rie
sgo de padecer la infeccin. Se han detectado brotes epidmicos en plantas procesado
ras de pavos, principalmente entre los empleados que matan a las aves y las desp
luman y aquellos que realizan la evisceracin de los cuerpos (CDC, 1990). En las lt
imas dos dcadas, la prevalencia de la psitacosis en EE.UU. se ha reducido enormem
ente como resultado de la adicin de tetraciclma a los piensos que se les suminist
ran a las aves para su alimentacin, el tratamiento de las aves psitaciformes impo
rtadas antes de entrar en el pas y la cra domstica de periquitos. C. psittaci est pr
esente en la sangre, tejidos, excrementos y plumas de los pjaros infectados y pue
de permanecer acantonada varios meses despus de la infeccin aguda. La infeccin se t
ransmite al ser humano generalmente a travs de la inhalacin de aerosoles infectivo
s procedentes de heces, heces pulverizadas, y secreciones de aves infectadas por
C. psittaci. pero puede producirse tambin por la manipulacin de plumaje o tejidos
contaminados, picotazos o por contacto directo entre boca y pico. El contacto c
on los pjaros no tiene por qu ser directo o prolongado. La diseminacin persona a pe
rsona de C. psittaci es poco frecuente.
Epidemiologa
El concepto actual de la epidemiologa de la infeccin por Chlamydophila pneumoniae
se basa en los datos de estudios retrospectivos con muestras de suero recogidas
a partir de pacientes con enfermedades del tracto respiratorio. Alrededor del 50
% de los adultos tienen anticuerpos frente a C. pneumoniae. L a tasa de prevalen
cia de anticuerpos en nios es baja, aumenta de forma abrupta en los adolescentes,
contina aumentado durante la madurez y permanece con valores elevados en la veje
z; las tasas son entre un 1 0 % y un 2 5 % ms elevadas en varones. Los datos de l
os estudios serolgicos retrospectivos y prospectivos indican que la enfermedad ca
usada por C. pneumoniae tiene carcter endmico en EE.UU. y epidmico en Escandinavia
y Finlandia, aunque los brotes epidmicos no aparecen con una periodicidad estacio
nal consistente (Grayston, 1990. 1989). C. pneumoniae parece ser un patgeno buman
o primario que se transmite de persona a persona, sin que en la transmisin partic
ipe un reservorio avcola o animal alguno. El mecanismo y lugar de la transmisin, e
l periodo de incubacin y la infectividad del microorganismo no han sido determina
dos todava. Los datos obtenidos a partir de estudios retrospectivos realizados en
soldados finlandeses han puesto de manifiesto que los brotes epidmicos causados
por C. pneumoniae se prolongan de cinco a ocho meses, lo que sugiere que la infe
ccin se disemina lentamente, incluso en grupos de poblacin cerrados (Kleemola. 198
8).
Patogenia y patologa
Chlamydophila psittaci penetra en el cuerpo a travs del tracto respiratorio y es
transportada por los macrfagos hasta el hgado y el bazo, donde tiene lugar la mult
iplicacin de la bacteria. Seguidamente, los microorganismos pasan a la sangre y l
legan al pulmn, que es el blanco primario de la infeccin, y a otros rganos. El exam
en histolgico del tejido pulmonar revela la presencia de linfocitos en los espaci
os alveolares e intersticiales. Se pueden apreciar tambin pequeas hemorragias y ma
crfagos con inclusiones mtracitoplasmticas. El hgado, el bazo y los ganglios linftic
os hiliares aumentan de tamao y pueden mostrar focos de necrosis, y en los casos
graves pueden verse tambin afectados el miocardio, el pericardio, las meninges, e
l cerebro y las glndulas suprarrenales

Patogenia
La patogenia de la infeccin por C. pneumoniae es desconocida. Debido a que la enf
ermedad es. generalmente, suave y autohmitada. no hay disponibles dalos de autop
sias.
Manifestaciones
clnicas
Manifestaciones
clnicas
La psitacosis comienza bruscamente tras un periodo de incubacin de una a dos sema
nas, con fiebre y escalofros, o se manifiesta gradualmente con un aumento paulati
no de la fiebre y la sensacin de malestar general. Un sintoma
Se estima que C. pneumoniae es responsable de alrededor de un 1 0 % de los casos
de neumona detectados en u n a comunidad (Grayston, 1990). L a neumona es. usualm
ente, suave, con la aparicin de un nico infiltrado subsegmentano. aunque puede ten
er un carcter grave, especialmente en personas ancianas y en aquellos que tienen
enfermedades crnicas. Frecuentemente comienza con faringitis y ronquera, seguidas
de u n a tos persistente. Aunque la neumona es el sndrome ms frecuentemente asocia
do con la

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1075
Tabla 49-2 Tipos d e e s p e c m e n e s clnicos para la deteccin d e C. trachomat
is Entermedad Cervicitis mucopurulenta Sndrome ureiral agudo (mujeres) Endometrit
is aguda Salpingitis aguda Uretritis no gonoccica (hombres) Conjuntivitis de incl
usin Tracoma Linfogranuloma venereo Espcimen Hisopo endocervical orina" Hisopo ure
tral, orina" Aspirado endometrial Biopsia de trompas de Falopio Hisopo uretral,
orina" Hisopos o raspados conjuntivaies Hisopos o raspados conjuniivales Aspirad
o de nodulo linftico, biopsia de la lesin ulcerosa, suero Suero, aspirado traqueob
ronquial. hisopo nasofarngeo
Mtodos de deteccin directa no basados en el cultivo
Fluorescencia directa con anticuerpos. La prueba de deteccin mediante fluorescenc
ia directa con anticuerpos (DFA). que fue uno de los primeros mtodos no basados e
n el cultivo desarrollados para la deteccin de clamidias, permite la visualizacin
directa de los cuerpos elementales de C. trachomatis en frotis de los especmenes
clnicos. El tiempo total necesario para la ejecucin del procedimiento oscila entre
30 y 60 minutos. Es el nico mtodo que permite determinar directamente la calidad
del espcimen Las muestras que contienen clulas columnares o metaplsicas escamosas s
on adecuadas, mientras que aquellos especmenes en los que existen pocas clulas col
umnares, o tienen una excesiva cantidad de mucus, o en los que hay una excesiva
cantidad de clulas escamosas, no son aceptables. Sin embargo, la interpretacin de
los resultados de la observacin de los frotis es subjetiva, y la fatiga del anali
sta puede representar un problema en aquellas situaciones en las que hay que pro
cesar un gran volumen de muestras. En la actualidad hay disponibles anticuerpos
monoclonales procedentes de diferentes firmas comerciales. Los anticuerpos dirig
idos frente a la MOMP especifica de especie de C. trachomatis parecen ser los qu
e presentan u n a mayor especificidad, y producen una fluorescencia ms intensa qu
e la que se observa con anticuerpos dirigidos frente al LPS de las clamidias (Ces
. 1988). por lo que son los que se utilizan ms frecuentemente (Woods, 1994). Ocas
ionalmente, incluso los anticuerpos especficos de especie pueden teir otras bacter
ias distintas a C. trachomatis. posiblemente debido a una adsorcin inespecifica d
e las inmunoglobulinas o a una reactividad cruzada. La tincin de bacterias distin
tas de C. trachomatis es particularmente frecuente en el caso de especmenes recta
les; en consecuencia, el cultivo es el mtodo preferido en este supuesto, aunque e
xisten algunos reactivos para D F A aprobados para la evaluacin de muestras recta
les. Tambin se h a desculo la existencia de reactividad cruzada de anticuerpos mo
noclonales entre miembros de la familia Chlamydiaceae y Bartonella. La sensibili
dad de la tcnica DFA varia entre el 50% hasta casi el 100% en comparacin con el cu
ltivo como mtodo estndar, dependiendo de la prevalenca de la infeccin en la poblacin
que esl siendo objeto de evaluacin y del nmero de cuerpos elementales necesarios pa
ra obtener un resultado positivo (Bames, 1989). En general, la sensibilidad es ms
elevada, con valores de corte ms bajos para los cuerpos elementales y en poblaci
ones con u n a alta prevalencia de la enfermedad. La especificidad del DFA suele
ser superior al 95%. Enzimoinmunoensayos. Los enzimoinmunoensayos (EIA) detecta
n el LPS de las clamidias utilizando como sonda anticuerpos mono o policlonales
etiquetados con una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto col
oreado. Tanto los sistemas de fase slida, que utilizan plstico o microesferas recu
biertas con el anticuerpo, como los sistemas de membrana estn disponibles comerci
almente. El tiempo total de procesamiento oscila entre 15 y 30 minutos para los
sistemas de membrana, y entre tres y cuatro horas para los sistemas de fase slida
. Las ventajas de los EIA son la objetiva interpretacin de los resultados y la fa
cilidad de uso para procesar un gran nmero de muestras. Al igual que en el caso d
e la DFA. la sensibilidad de los EIA varia (entre cerca del 70% hasta el 100%) e

n comparacin con el cultivo como mtodo estndar, y tiende a ser ms elevada en poblaci
ones con una alta prevalencia de la enfermedad, como es el caso de aquellas pers
onas que acuden a una clnica para enfermedades de transmisin sexual (Bames. 1989:
Clarke, 1993: Ehret, 1993; Kluytmans. 1993: Mills. 1992; Warren, 1993). La espec
ificidad del EIA es del 95% o incluso superior. Las causas que explican los fals
os positivos son la presencia de una infeccin bacteriana del tracto urinario (Dem
aio, 1991) o la contaminacin del espcimen con m o c o cervical o secreciones vagin
ales. Este ltimo problema puede reducirse mejorando la tcnica de recogida de las m
uestras (eliminando el moco cervical y obteniendo una verdadera muestra endocerv
ical). asi como utilizando anticuerpos bloqueantes (Mills. 1992). Hibridacin de ci
dos nucleicos. Esl comercialmente disponible una sonda de ADN marcada con ster de
acridina, complementaria del ARN ribosomal de C. trachomatis. que permite la det
eccin directa de este microorganismo en especmenes urogenitales y conjuntivales. E
l mtodo requiere el empleo de un bao de agua y de un medidor de luminiscencia. El
tiempo total de procesamiento requerido est entre dos y tres horas. La sensibilid
ad de la prueba comparada con la del cultivo como mtodo de referencia varia enlre
las muestras endocervicales y los especmenes recogidos con hisopos ure.
Neumonitis (nios) "La orina es u n espcimen aceptablo para algunos enzimoinmunoens
ayos y pata las pruebas comerciales de amplilicacin de cidos nucleicos
>
infeccin por C. pneumoniae, los estudios serolgicos realizados durante brotes epidm
icos entre soldados han mostrado que tan slo un 10% de las infecciones por C. pne
umoniae evolucionan a neumona, lo que sugiere que la infeccin es, frecuentemente,
suave o asintomtica y no detectada. Otras manifestaciones de la infeccin por C. pn
eumoniae son bronquitis, faringitis, fiebre de origen desconocido, otitis, proce
sos seudognpales, miocarditis, endocarditis y posiblemente ateroesclerosis (Camp
bell, 1998).
Diagnstico de laboratorio Chlamydia trachomatis
El tipo de espcimen utilizado para el diagnstico de las infecciones causadas por C
. trachomatis est determinado por las manifestaciones clnicas de la enfermedad (Ta
bla 49-2). Los procedimientos especficos empleados para la recoleccin de los difer
entes tipos de muestras se describen en el Capitulo 57. La mayor parte de las in
fecciones afectan al epitelio de las membranas mucosas, por lo que los especmenes
deben recogerse directamente de la superficie afectada y contener una muestra a
decuada y representativa de clulas epiteliales Los fluidos purulentos no son un t
ipo adecuado de espcimen, por lo que deben ser eliminados antes de proceder a la
recogida de la muestra con un hisopo o un cepillo. De entre los diferentes tipos
de hisopos existentes, los que tienen la torunda de dacrn o rayn son los preferid
os. Los hisopos con mangos de madera no deben ser utilizados, ya que la madera e
s txica para la bacteria. Los hisopos de alginato calcico pueden resultar txicos p
ara las clamidias o para las clulas que permiten su crecimiento. Los hisopos con
torundas de algodn son aceptables, aunque ocasionalmente pueden resultar txicos pa
ra las clamidias.
Cultivo celular
Los cultivos celulares son actualmente el mtodo de referencia para el diagnstico d
e las infecciones causadas por clamidias y deben utilizarse cuando el diagnstico
es objeto de controversia y en los casos en los que existe sospecha de agresin o
abuso sexual. Las lneas celulares utilizadas ms frecuentemente son McCoy o mono ve
rde Butfalo. Ambas tienen una sensibilidad parecida, pero las segundas son ms fcil
es de mantener y ms resistentes a las sustancias citotxicas, habindose observado qu
e en las mismas se forma un nmero ms elevado de inclusiones y de mayor tamao (Krech
, 1989). La adicin de cicloheximida (0,5 pl-1,5 pl/ml) al medio de cultivo aument

a la sensibilidad. Las clulas crecen en m o n o c a p a en la superficie de cubre

objetos situados en el interior de sheil vials, o en placas de 24 pocilios, o en
la superficie de placas de cultivo de poliestireno de 48 o de 96 pocilios. Para
incrementar la recuperacin de C. trachomatis, los especmenes son sonicados o agit
ados en un mezclador vrt e x antes de ser inoculados, para liberar los cuerpos el
ementales de las clulas infectadas, y los shell vials inoculados o las placas de
cultivo son centrifugados. Tras 48-72 horas de incubacin, las monocapas de clulas
son fijadas y seguidamente teidas con anticuerpos monoclonales conjugados con flu
orescena. Si se utiliza un sistema de cultivo de 96 pocilios, se recomienda resem
brar los especmenes que son negativos a las 48 horas para incrementar la eficienc
ia del proceso de deteccin; sin embargo, la deteccin no aumenta significativamente
cuando se utiliza u n a estrategia semejante en el caso de emplear contenedores
o placas de 24 pocilios (Schacter. 1987; Zimmerman, 1992).

1076
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
trates en el hombre (del 76% al 97%) (Blanding, 1993: Clarke, 1993; Warren, 1993
; iwen, 1991; Kluytmans, 1994, 1991). La especificidad de la sonda es del 97% o
superior, y puede ser mejorada an ms mediante un ensayo de competicin (Woods. 1996)
. Amplificacin de cidos nucleicos. Existen diferentes mtodos para la deteccin direct
a de C. trachomatis en especmenes endocervicales y uretrales tomados con hisopo,
y en muestras de orina tanto de hombre como de mujer, basados en la amplificacin
de cidos nucleicos, que estn disponibles comercialmente en la actualidad. El tiemp
o total de procesado oscila entre cuatro y cinco horas. Los datos de estudios co
mparativos entre el mtodo de amplificacin de cidos nucleicos y el cultivo indican q
ue el primero es altamente especfico y ms sensible que el segundo (Vincelette, 199
9: Goessens, 1997; Ferrero, 1998: Wylie. 1998; Mahony, 1998; Toye. 1998; Carroll
, 1998; Puolakkainen, 1998). Dado el precio considerable del mtodo basado en la a
mplificacin de cidos nucleicos, el director de cada laboratorio debe determinar si
los beneficios compensan la inversin en su poblacin de pacientes.
Chlamydophila
pneumoniae
Verificacin de las pruebas no basadas en el cultivo
Los expertos del Centro para la Prevencin y Control de las Enfermedades (CDC) rec
omiendan que los resultados positivos resultantes de las tcnicas de rastreo (DFA,
EIA, sondas) deben confirmarse con una prueba complementaria si un resultado fa
lsamente positivo pudiera tener consecuencias mdicas, sociales o psicolgicas adver
sas (CDC, 1993). En poblaciones donde la prevalencia de la infeccin es baja, la c
onfirmacin puede ser algo habitual, pero debe tener carcter selectivo en poblacion
es con elevada prevalencia. La confirmacin mediante cultivo es un procedimiento pt
imo, pero requiere un segundo espcimen recogido bien durante la primera visita o
en una segunda sesin. Los test EIA con anticuerpos bloqueantes, los ensayos de co
mpeticin con sondas o la monitorizacin del medio de transporte con un test DFA pue
den ser mtodos de verificacin alternativos.
El diagnstico de la infeccin causada por C. pneumoniae se basa fundamentalmente en
los test de tipo serolgico (Grayston, 1990). El test de microinmunofluorescencia
frente al antgeno TWAR es especfico para C. pneumoniae. Las IgM aparecen unas tre
s semanas despus del comienzo de la enfermedad primaria, generalmente comienzan a
disminuir entre los dos a seis m e s e s siguientes hasta un nivel en el que no
pueden ser detectados, y pueden no reaparecer aunque haya una reinfeccin. Las in
munoglobulinas G se detectan entre seis y ocho semanas despus del inicio de la in
feccin primaria, permanecen de por vida, y su ttulo puede incrementarse una o dos
semanas despus de que se haya producido una reinfeccin. Los resultados de los test
serolgicos indicativos de una infeccin aguda son: un incremento de 4 veces o supe
rior del titulo de IgG entre dos muestras de suero tomadas en la lase aguda y de
convalencia de la enfermedad respectivamente, un nico ttulo de 1:512 o superior o
un titulo de IgM de 1:16 o superior. C. pneumoniae puede ser aislada en cultivo
s de tejidos, aunque crece peor que C. trachomatis (Roblin, 1992).
Tratamiento
Las tetraciclinas son el tratamiento de eleccin para las infecciones causadas por
clamidias. Para las infecciones genitales por C. trachomatis. otros agentes ant
imicrobianos eficaces son la eritromicina, la acitromicina, el sulfisoxazol y el
ofloxacino. Las infecciones oculares por C. trachomatis requieren un tratamient

o sistmico con tetraciclina (en adultos) o con eritromicina o sulfisoxazol (en ne

onatos); la terapia tpica suprime los sntomas pero no elimina al microorganismo. L
os macrlidos son una alternativa aceptable para el tratamiento de las infecciones
causadas por C. pneumoniae. Las sulfonamides son ineficaces frente a C. psittac
i y C. pneumoniae.
Pruebas
serolgicas
INFECCIONES POR RICKETTSIAS
El concepto de rickettsia se desarroll, histricamente, al mismo tiempo que se defi
na la naturaleza molecular y fsica de los virus (Weiss, 1988). En contraste con lo
s agentes virales que afectan al hombre, que tambin necesitan clulas eucariticas ho
spedadoras para su multiplicacin, las rickettsas son bacterias con una pared celul
ar tpicamente gramnegatva y su crecimiento es inhibido por determinados antibiticos
. Las rickettsas se diferencian, adems, de otras bacterias que tambin son parsitos i
ntracelulares obligados por su ecologa y modo de transmisin mediante insectos artrp
odos que actan como vectores. El esquema taxonmico tradicional de las rickettsas ba
sado en algunas de esas caractersticas fenotpicas. como son su multiplicacin intrac
elular y su transmisin va insectos artrpodos, necesita una modificacin importante a
la luz de los ltimos conocimientos derivados de los estudios de comparacin de secu
encias gnicas. Los gneros que contienen especies patgenas para el ser humano son Ri
ckettsia. Ehrlichia. Coxiella y Bartonella (originalmente Rochalimaea) (Weiss, 1
984). Basndose en las caractersticas genticas y fenotpicas. el agente etiolgico del t
ifus scrub o tifus de las malezas, Orientia (originalmente Rickettsia) tsutsugam
ushi ha sido incluido en un nuevo gnero independiente (Tamura, 1995). A pesar de
su tradicional relacin con la "rickettsiologa" y la transmisin por artrpodos, el gner
o Bartonella (originalmente Rochalimaea) incluye organismos que pueden crecer en
medios carentes de clulas y que no pertenecen al orden Rickettsiales (Brenner, 1
993). Adems, los miembros de los gneros Rickettsia. Orientia, Ehrlichia y Bartonel
la estn ms relacionados entre s que con las especies del gnero Coxiella. Agrupadas p
or gneros, en este captulo se describen las siguientes enfermedades: Rickettsia, f
iebre maculosa de las Montaas Rocosas, fiebre botonosa, fiebre de la picadura de
la garrapata africana, ricketlsiosis vesicular, tifus murino; Orientia, lifus sc
rub o tifus de las malezas; Ehrlichia, "ehrlichiosis" monocitica humana causada
por chaffeensis y las infecciones granulocticas originadas por phagocytophila y e
wingii; Coxiella, fiebre Q; y Bartonella, enfermedad por araazo de gato, angiomat
osis bacilar y peliosis, fiebre de las trincheras y bartonellosis sudamericana.
Las enfermedades causadas por cada gnero constituyen entidades clnicas coherentes
y agrupadas y, en conjunto, las enfermedades causadas por rickettsas plantean pro
blemas similares en lo que respecta a su diagnstico, con aproximaciones tcnicas se
mejantes para su solucin.
Las pruebas serolgicas tienen muy poca utilidad para el diagnstico de las infeccio
nes por clamidias por dos razones. En primer lugar, los anticuerpos frente a C.
trachomatis persisten durante bastante tiempo despus de que la infeccin remita, po
r lo que un resultado serolgico positivo no tiene por qu relacionarse necesariamen
te con un proceso infeccioso activo. Por otro lado, muchas pruebas serolgicas no
son especficos para C. trachomatis. ya que estos mtodos detectan anticuerpos frent
e a determinantes antignicos especficos de gnero. Las excepciones a esta norma estn
representadas por el diagnstico del LGV y de la neumonitis causada por C. trachom
atis en nios. Debido a que el LGV tiene un largo periodo de latencia y a que el d
iagnstico sufre, a menudo, retrasos, los anticuerpos estn generalmente presentes c
uando se t o m a la muestra de suero correspondiente a la fase aguda de la enfer
medad, por lo que, a menudo, no es posible detectar un incremento de cuatro vece
s en el ttulo de anticuerpos entre las muestras de suero tomadas en la fase aguda
y en la de convalecencia. Por tanto, un titulo nico o estable de 1:64 o superior
de fijacin del complemento apoya un diagnstico presuntivo de LGV. Para el diagnsti
co de la neumonitis por C. trachomatis en nios, la deteccin de inmunoglobulinas M

(IgM) especificas medante microinmunofluorescencia puede ser el mtodo de eleccin (u

n ttulo de 1:32 o superior es diagnstico).
Chlamydophila
psittaci
C. psittaci puede crecer en cultivos celulares, aunque su manipulacin slo es recom
endable en centros especialmente equipados y con personal experto, porque este o
rganismo es particularmente virulento y se ha asociado frecuentemente a infeccio
nes adquiridas en laboratorio. La infeccin por C psittaci se diagnostica usualmen
te por mtodos serolgicos. preferentemente comparando las muestras de suero obtenid
as en las fases aguda y de convalecencia, respectivamente. Un incremento de cuat
ro veces (o superior) en el ttulo de anticuerpos, entre ambas muestras en un paci
ente con sntomas de psitacosis. apoya un diagnstico positivo. Un nico ttulo de 1:32
o superior en un individuo con una patologa cuyos sntomas sean compatibles represe
nta una evidencia presuntiva de psitacosis. Los anticuerpos se detectan normalme
nte hacia el final de la segunda semana de la enfermedad, aunque un tratamiento
anticipado con antibiticos puede retrasar su aparicin durante varias semanas. Incr
ementos falsamente positivos en el titulo de anticuerpos se detectan raramente e
n individuos afectados de legionelosis.

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1077
Infecciones causadas por organismos del gnero Rickettsia Estructura y funcin
Las rickettsias de los grupos de la liebre maculosa y del tifus son bacterias ge
nticamente relacionadas que tienen una delgada morfologa bacilar (0.3 a 0,5 x 1 a
2 urn) y una pared celular tpica de gramnegativas que posee lipopolisacrido con de
terminantes antignicos que diferencian los dos grupos. Todas las especies del gner
o Rickettsia viven libres en el citosol de la clula hospedadora y s e multiplican
por biparticin Las rickettsias se adhieren a la clula hospedadora a travs de una a
dhesina de naturaleza proteica, penetran seguidamente mediante fagocitosis induc
ida y salen por ltimo del fagosoma hasta el citosol (Li, 1992, 1998: Walker, 1984
). Todos estos eventos tienen lugar en pocos minutos y estn asociados con una act
ividad fosfolipsica A , aparentem e n t e de origen rickettsial. Las rickettsias
del grupo de la fiebre maculosa se desplazan en el interior de las clulas infecta
das y durante el proceso de liberacin estimulan la polimerizacin de la actina F de
la clula hospedadora en un polo de la m i s m a (Heinzen, 1993). Aquellas ricket
tsias que poseen esta capacidad (p. ej.. R. rickettsii) salen ms rpidamente de las
clulas hospedadoras y se diseminan con mayor facilidad que aquellas especies que
no la tienen (p. ej.. R. prowazekii). que se dividen inlracelularmente para dar
lugar a un gran nmero de microorganismos hasta que la clula husped estalla, libera
ndo a las bacterias formadas en su interior. De acuerdo con los datos actuales d
e secuen?
cias de ADN. las especies del gnero Rickettsia que son patgenas del hombre han evo
lucionado en tres genogrupos (Tabla 49-3) (Roux. 1995.1997; Stolhard. 1995). El
grupo del tifus incluye las especies R. prowazekii y R. typhi. En el grupo de la
fiebre maculosa se encuentran las especies R. rickettsii. R. conorii. R. aponica
, R. atricae. R. honei. R sibinca y R. slovaca. Una subdivisin recientemente iden
tificada incluye a R. akari. R. australis y R tefe. Rickettsia akan y R. austral
is fueron consideradas Iradicionalmente c o m o miembros alejados de las otras e
species del grupo de la liebre maculosa. con las que comparten los antgenos de na
turaleza lipopolisacaridica.
Fiebre maculosa de las Montaas Rocosas
La ms grave de todas las rickettsiosis. la liebre maculosa de las Montaas Rocosas
(RMSF). tiene una tasa de mortalidad importante, habitualmenle del 5%, incluso e
ntre nios y adultos jvenes inmunocompelentes y sin patologa previa (Dalton. 1995a:
Paddock. 1999). En la naturaleza. Rickettsia rickettsii habita normalmente en la
s garrapatas: Dermacentor vanabilis. la garrapata americana del perro, en los do
s tercios del este de EE.UU. y California: Dermacentor andersoni, la garrapata d
e la madera de las Montaas Rocosas, en el este de EE.UU.; Rhipicephalus sanguineu
s. la garrapata del perro marrn, en Mxico: y Amblyomma cajennense. en Amrica del Su
r Estas garrapatas conservan a R. nckettsii en su intenor mientras mudan de una
fase a otra (larva, ninfa y adulto) y transovricamente de generacin en generacin. M
enos de un 1 por 1.000 de garrapatas son portadoras de clulas virulentas de R. ri
ckettsii,
Tabla 49-3
Infecciones causadas por Rickettsia. Ehrlichia, Coxiella y Bartonella Enfermedad
Distribucin geogrfica Transmisin
Mordedura de garrapata Mordedura de garrapata Mordedura de qarrapata Mordedura d
e garrapata Mordedura de garrapaia (presumiblemente) Mordedura de garrapata (pre
sumiblemente)

A g e n t e etiolgico
Fiebres maculosas
R. rickettsii R. conorii R. atricae R. sibirica R. japnica R. honei
Tifus
Fiebre maculosa de las Montanas Rocosas Amrica del Norte. Central y del Sut Fiebr
e botonosa Sur de Europa. frica. Rusia, Georgia. Oriente Medio, subcontinente ind
io Fiebre africana de las garrapatas Sur y este de frica Tifus de las garrapatas
del norte de Asia Rusia, China. Mongolia, Pakistn Fiebre manchada oriental Japn Fi
ebre manchada de la isla de Flinders Australia, sudeste asitico Tilus epidmico
R prowazekii
R prowazekii
Enfermedad de Bnll-Zinsser
R rowazekn R typhi
Tifus de las ardillas voladoras Tifus murino

Distribucin mundial (polencialmente) Heces de piojo infectado en dcadas recientes

en frica. en erosiones cutneas Amrica del Sur. Cenlroamnca, Mxico. Asia Distribucin m
ndial; en cualquier lugar Reactivacin de una infeccin latente donde residan person
as que hayan padecido en el pasado tifus epidmico Heces de pulgas o piojos de la
ardilla Estados Unidos infectados (presumiblemente) Distribucin mundial en zonas
tropicales y subtropicales Estados Unidos. Ucrania. Croacia, Corea Este de Austr
alia Estados Unidos Mordedura de acaro Mordedura de garrapa!; Mordedura o heces
de | (presumiblemente) Mordedura de acaro
Otras fiebres rickettsiales R akan Rickeltsiosis vesicular R australis Tifus de
la garrapata de Queensle R telis Tifus de la pulga del galo
Tilus scrub Orienlia tsutsugamushi Tilus setub (tifus de las malezas)
Sudeste asiatico Japn China Sri Lanka, India, Rusia asitica. Tadyikistn indonesia,
oeste del Pacifico, norte de Australia Estados Unidos, Europa. frica, Tailandia E
stados Unidos, Europa Estados Unidos Japn. Malasia Distribucin mundial
Ehrlichiosis
E. chatfeensis E phagocytophila E ewmgu
Ehrlichiosis monocitica humana Ehrlichiosis granulocitica humana Ehrlichiosis hu
mana por Ehrliclva cwingii Ricketlsiosis sennetsu Fiebre Q
Mordedura de garrapata Mordedura de qarrapata
M i D e c
i (presumiblemente)
Material seco procedente de animales infectados y. posiblemente, ingestin de alim
entos de origen animal o mordedura de garrapata Picadura de mosquito Araazo o mor
dedura de galo Araazo o mordedura de galo (presumiblemente) Heces mlectadas del p
iojo Pediculus
Barlonellosis

 bacillilormis B henselae B. clarridgeirae B quintana

Enfermedad del araazo de galo, angiomatosis bacilar y peliosis Enfermedad del araa
zo de gato (semejante) Fiebre de las trincheras
Oeste de America i Distribucin mundi; Distribucin mundial (probablemente) Europa y
Amrica del Norte

1078
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
que parecen ser medianamente patognicas para las garrapatas. Nuevas lneas de garra
patas se infectan al alimentarse de roedores enfermos, reponiendo la poblacin de
bacterias mantenidas transovricamente en las garrapatas. Las infecciones tienen l
ugar cuando y donde una persona se encuentra con una garrapata infectada por R.
r/crefs//(Helmick, 1984). Aunque en los ltimos aos se han detectado casos de RMSF en
prcticamente todos los estados de la unin, con excepcin de Hawaii, Alaska y Vermon
t. la mayor incidencia se ha registrado en los estados del Atlntico sur. desde Ma
ryland a Georgia, y los estados centrales del sur. Oklahoma, Missouri, Arkansas
y Tennessee. La mayor parte de casos aparecen al final de la primavera y en vera
no, aunque, particularmente en las latitudes ms sureas, pueden darse casos incluso
en invierno. L a mayor incidencia se detecta entre nios y otras personas que estn
expuestas a las picaduras de las ganapatas durante actividades al aire libre. L
a relacin entre casos y mortalidades es ms elevada entre afroamericanos, varones y
personas mayores de 30 aos. Casos fulminantes de RMSF (muerte al quinto da de la
enfermedad) tienen lugar asociados con una hemolisis moderada, por ejemplo, en h
ombres afroamericanos con una deficiencia en la enzima glucosa-6-fosfato deshidr
ogenasa (Walker, 1983). Las rickettsas son inyectadas a travs de la dermis del pac
iente, mediante las secreciones de las glndulas salivares de la garrapata infecta
da, entre 6 y 1 0 horas despus de que la garrapata se haya alimentado, y se disem
inan por todo el cuerpo por medio del torrente circulatorio, El endotelio vascul
ar es el blanco de la invasin intracelular, con un cierto grado de invasin de las
clulas musculares de los vasos sanguneos adyacentes. El endotelio infectado es daad
o por la produccin de molculas reactivas derivadas del oxgeno y, posiblemente, por
la actividad de la fosfolipasa A. (Silverman, 1992.1997). El dao en el endotelio
se manifiesta en un incremento de la permeabilidad vascular, edema, hipovolem i
a e hipotensin. Las consecuencias del dao vascular a nivel del sistema nervioso ce
ntral (SNC) y los pulmones, y que ponen en peligro la vida del paciente, son la
menmgoencefalitis rickettsisica y el edema pulmonar no cardiognico. En los primero
s estadios de la enfermedad, las lesiones muestran la presencia de rickettsias e
n las clulas endoteliales. sin trombos o respuesta celular alguna. En estadios ms
avanzados, el infiltrado linfohistoctico perivascular caracterstico se manifiesta
como una neumona intersticial, miocarditis intersticial, nodulos guales perivascu
lares en el cerebro y lesiones vasculares similares en la dermis, tracto gastroi
ntestinal, hgado, msculos esquelticos y rones. Las lesiones extensas pueden estar aco
mpaadas por hemonagias focales, pero rara vez por microinfartos, excepto en la su
stancia blanca del cerebro.

kettsia japnica se ha descrito solamente en Japn, mientras que las infecciones en

humanos causadas por R. australis y R. honeise han detectado exclusivamente en A
ustralia, Despus de un periodo de incubacin medio de siete das, estas enfermedades
comienzan con fiebre, dolor de cabeza y mialgias. Frecuentemente, se puede descu
brir una escara tras un e x a m e n cuidadoso de la piel en esa fase de la enfer
medad. En la patologa de estas fiebres maculares est perfectamente descrito que es
ta escara o botn negro conesponde al punto donde se produjo la inoculacin de la ri
ckettsia. c o m o consecuencia de la mordedura de la garrapata (Walker, 1988a).
La infeccin del endotelio y el dao causado por R. conorii en la escara produce nec
rosis drmica y epidrmica y edema perivascular, Entre las defensas del hospedador q
ue llevan a cabo la destruccin de las rickettsias intracelulares se incluyen los
linfocitos T y los macrfagos, que se infiltran alrededor de los vasos sanguneos de
la dermis infectados (Herrero-Herrero, 1987). La activacin de las clulas endoteli
ales por la accin de atocinas induce una actividad que destruye intracelularmente

las rickettsias, aunque la eliminacin final de los microorganismos est mediada po

r los linfocitos T citotxicos. La infeccin diseminada del endotelio se traduce en
la aparicin de una erupcin maculopapular. meningoencefalitis y lesiones vasculares
en pulmones, riones, tracto gastrointestinal y corazn (Walker, 1985). Existe una
correlacin entre el aumento moderado de la concentracin de transaminasas hepticas y
la aparicin de necrosis hepatocelular multifocal y lesiones semejantes a granulo
mas (Walker, 1986).
Rickettsiosis
vesicular
Rickettsia akan se mantiene en la naturaleza por transmisin transovrica en el acar
o Liponyssoides sanguineus, un ectoparsito del ratn domstico. Mus musculus. Este mi
croorganismo se ha aislado solamente en EE.UU., Croacia, Ucrania y Corea, aunque
ello pueda indicar simplemente que los estudios en relacin con la distribucin de
esta especie de rickettsia no son m u y amplios. Tras un periodo de incubacin de
aproximadamente 10 das, aparece una ppula en el lugar donde se produjo la picadura
del acaro que evoluciona hasta convertirse en una escara con un tamao entre 1 cm
y 2,5 cm. La enfermedad comienza con escalofros, fiebre, malestar general, fuert
e dolor de cabeza y mialgia. La erupcin, que aparece entre dos y seis das ms tarde,
es maculopapular inicialmente. ms tarde papular, y en los casos tpicos se vuelve
pustular y finalmente vesicular. Algunos pacientes tambin experimentan nuseas, vmit
os, faringitis, fotofobia, esplenomegalia y rigidez en la nuca. El examen histop
atolgico de la escara revela una necrosis coagulativa de la epidermis, daos en los
vasos sanguneos subyancentes y un infiltrado linfoctico perivascular en el que lo
s macrfagos parecen ser las clulas atacadas principalmente (Brettman, 1981; Kass,
1994; Walker, 1999). La linfadenopatia regional y la erupcin cutnea son consecuenc
ia, posiblemente, de la diseminacin del microorganismo por el sistema linftico y c
irculatorio, respectivamente,
La fase clnica de la enfermedad comienza habitualmente con fiebre, dolor de cabez
a y mialgias entre 2 y 1 4 das despus de la mordedura de la garrapata (Kaplowitz,
1981). Durante los tres primeros das de la enfermedad son frecuentes las nuseas, vm
itos, dolor y ablandamiento abdominal y diarrea. La erupcin cutnea que, generalmen
te, comienza entre el tercer y quinto da se inicia tpicamente con la aparicin de mcu
las alrededor de las muecas y tobillos, y ms tarde en brazos, piernas y tronco. La
s lesiones se vuelven maculopapulares, y en la mitad de los casos aparece una pe
tequia central en muchas de las mculas papulares. La afectacin caracterstica de las
palmas de las manos y las plantas de los pes se detecta slo en la mitad de los af
ectados como una manifestacin tarda. El fallo renal es una caracterstica de los cas
os graves de RMSF. La afectacin del sistema nervioso central es notoria; entre el
8% y el 10% de los afectados sufren ataques y c o m a como preludio a un desenl
ace fatal. En el 50% de los casos existe trombocitopenia, pero la coagulacin intr
avascular diseminada (DIC) es m u y poco frecuente (Elghetany, 1999).
Tifus murino
La infeccin endmica producida por R. typhi, transmitida por la picadura de la pulg
a, el tifus murino, es en la actualidad la enfermedad ms importante dentro del gr
upo del tifus en EE.UU.. causando una gran morbilidad en todas las regiones temp
ladas del mundo (Azad, 1990). Histricamente, las epidemias de infecciones por R.
prowazekii transmitidas por piojos han tenido u n a gran influencia en el desenl
ace de muchas campaas militares, y han constituido un grave azote entre las pobla
ciones vctimas de geas, hambrunas y desastres naturales (Patterson, 1993; Zinsser,
1935). Rickettsia prowazekii contina provocando infecciones en reas empobrecidas y
deprimidas del mundo y reaparece en situaciones como las que provocan la guerra
en Burundi y las condiciones sociales, polticas y econmicas actuales en la extint
a Unin Sovitica. El recrudecimiento de las infecciones latentes por R. prowazekii
puede tener lugar aos ms tarde de la infeccin primaria en inmigrantes procedentes d
e reas afectadas por el tifus. En EE.UU. se ha detectado una transmisin endm i c a

de R. prowazekii a partir de un reservorio infeccioso natural constituido por la

s ardillas voladoras y sus ectoparsitos (McDade, 1980).
1
Fiebre botonosa y otras fiebres maculosas
Rickettsia conorii ha sido aislada en el sur de Europa; norte, este y sur de fric
a; Israel; la India, Pakistn, Rusia, Georgia y Ucrania. L a ecologa de R. conoriiy
la epidemiologa de la fiebre botonosa estn ntimamente ligadas a las garrapatas, es
pecialmente Rhipicephalus sanguineus. que alberga a la rickettsia transovricament
e y transmite la infeccin al hombre cuando se alimenta (Walker, 1991). Se han dia
gnosticado casos importados en viajeros que regresan a EE.UU. y a pases del norte
de Europa desde frica y pases de la cuenca mediterrnea. La tasa de mortalidad entr
e los pacientes hospitalizados oscila entre el 1 , 4 % y el 5,6%, especialmente
en pacientes que tienen alguna otra enfermedad subyacente. Una enfermedad ms suav
e causada por R. aricae aparece con bastante frecuencia en viajeros que regresan
del sur de frica. La especie R. sibirica ha sido aislada en Rusia, China. Mongoli
a y Pakistn. RicEl tifus murino se da particularmente en zonas costeras tropicales y subtropical
es donde abundan las ratas (Rattus rattus) y las pulgas. Las pulgas absorben las
rickettsias de la sangre de las ratas infectadas, manteniendo la infeccin durant
e todo su perodo de vida normal. La transmisin transovrica solamente tiene lugar a
bajos niveles; por tanto, la transmisin horizontal

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1079
entre ratas es un tactor clave para el mantenimiento de R. typhi en la naturalez
a. Otros ciclos mamfero-artrpodo se encargan del mantenimiento de la rickettsia y
pueden ser responsables de la transmisin de la infeccin a los seres humanos (p. ej
., la pulga del gato. Ctenocephalides tefe, y la zarigeya en Texas y California)
(Schriefer, 1994b). Se cree que el ser humano es infectado, habitualmente, por i
noculacin intradrmica de heces contaminadas a travs de la piel erosionada por el ra
scado. Sin embargo, la inhalacin de aerosoles que contengan heces pulverizadas de
las pulgas o la propia mordedura de la pulga pueden ser tambin responsables de l
a transmisin en algunos casos Despus de un perodo de incubacin de entre una y dos se
manas, la enfermedad comienza con fiebre acompaada en algunos casos por una fuert
e jaqueca, escalofros, mialgias y nusea. En el 80% de los pacientes de piel blanca
aparece, entre el quinto y sexto da. un exantema macular o maculopapular, que es
particularmente evidente en el torso, porcentaje que baja hasta el 20% en perso
nas con la piel fuertemente pigmentada. Una baja proporcin de pacientes tienen to
s y presentan infiltrados pulmonares. Los individuos fuertemente afectados puede
n sufrir coma, ataques y otros sntomas neurolgicos. Aproximadamente un 10% de los
pacientes hospitalizados deben ser ingresados en la unidad de cuidados intensivo
s, y entre un 1% y un 2% de los afectados por el tifus murino fallecen (Dumler,
1991). Las lesiones patolgicas del tifus murino incluyen inflamacin endotelial e i
nfiltracin linfohistocistica perivascular que implican a los vasos sanguneos de la
dermis, SNC. pulmones, corazn, tracto gastrointestinal y rones (Walker, 1989). Las
consecuencias ms serias son la menmgoencefalomielitis y la lesin alveolar difusa.
un eptopo presente en el lipopolisacndo de la pared celular especifico del grupo d
e la fiebre maculosa se puede detectar la presencia de R. rickettsii. R. conorii
. R. akari, R japnica. R. australis. R. atricae. R. honei y R. sibinca en muestra
s de tejidos fijadas con formol e incluidas en parafina. mientras que otro antic
uerpo monoclonal especfico frente al lipopohsacrido de los miembros del grupo del
tilus se ha utilizado de lorma similar para la deteccin de R. prowazekii y R. typ
hi'(Walker. 1997b). En el m o m e n t o actual, no estn disponibles comercialment
e los reactivos para el diagnstico inmunohistoquimico de las rickettsiosis, aunqu
e es posible que en el futuro se desarrollen sistemas comerciales para la detecc
in de grupos especficos de rickettsias, utilizando los anticuerpos monoclonales ge
nerados en los laboratorios de investigacin. Una aproximacin muy particular para e
l diagnstico es la deteccin inmunocitolgica de R. conorii en clulas endoteliales des
prendidas que circulan por el torrente circulatorio del paciente. Estas clulas so
n capturadas a partir de las muestras de sangre por medio de microesferas magntic
as recubiertas por un anticuerpo monoclonal frente a componentes de la superfici
e de las clulas endoteliales humanas (La Scola. 1996a). En enfermos de fiebre bot
onosa, este procedimiento tiene una sensibilidad del 58% cuando se utiliza para
el examen de muestras nicas de sangre, y puede emplearse en los pacientes antes d
e la aparicin del exantema, que debe manifestarse para poder seleccionar las zona
s donde han de tomarse las muestras de piel por biopsia que permitan llevar a ca
bo el diagnstico por tcnicas inmunohistolgicas. El "estndar oro" en el diagnstico ser
olgico de las rickettsiosis es el mtodo de la inmunofluorescencia indirecta (IFA)
(Kaplan, 1986). El test indirecto con anticuerpos acoplados a peroxidasa ofrece
unos resultados parecidos. En EE.UU.. para las infecciones producidas por ricket
tsias de los grupos de la fiebre maculosa y del tifus, ttulos de 1:64 o superiore
s en el test IFA se consideran indicadores de diagnstico positivo cuando se da u
n a situacin clnica y epidemiolgica compatible En paises donde existe una alta prev
alencia de individuos con anticuerpos frente a estas rickettsias, debido hipottic
amente a una estimulacin por especies no patgenas de rickettsias o a infecciones s

ubclinicas o no diagnosticadas, son necesarios ttulos ms elevados para poder estab

lecer el diagnstico. En cualquier caso, un incremento de cuatro veces en el titul
o de anticuerpos en un test IFA hasta un valor, al menos, de 1:64 tiene valor di
agnstico. La sensibilidad del test IFA en el caso de la RMSF oscila entre el 94%
y el 100%, mientras que la especificidad es del 100%. Con unos valores de corte
en el titulo de 1:128. para las IgG. y de 1:32, para las IgM, el test indirecto
de la mmunoperoxidasa rinde valores semejantes y tiene la ventaja de que slo se n
ecesita un microscopio ptico convencional, en lugar de un microscopio con ilumina
cin ultravioleta. Otros test serolgicos disponibles comercialmente son la aglutina
cin con ltex y el enzimoinmunoensayo en fase slida (Kelly. 1995). Ambos mtodos ofrec
en informacin til para el diagnstico, requieren un equipo menos caro para su ejecuc
in, aunque no se consideran, generalmente, tan fiables como el mtodo IFA. Ciertame
nte, con estas tcnicas se obtienen resultados m u c h o ms fiables que los que se
consiguen con la prueba de Weil-Felix, que mide la aglutinacin de las cepas OX-19
y OX-2 de Proteus vulgaris (Kaplan, 1986). Este test de Weil-Felix, poco sensib
le e inespecfico, no debera utilizarse excepto en los casos de pases en desarrollo
en los que no es posible utilizar otro mtodo diagnstico.
Diagnstico de laboratorio
A diferencia de la mayor parte de enfermedades infecciosas cuyo diagnstico debe h
acerse durante la fase aguda de las mismas, que es cuando deben tomarse decision
es teraputicas criticas, las infecciones causadas por rickettsias se diagnostican
con mucha precisin, basndose en las sospechas clnicas y epidemiolgicas, y se tratan
de forma emprica sobre la base del diagnstico presuntivo (Kaplowitz. 1981). El anl
isis serolgico. que muchas veces se pretende llevar a cabo de forma equivocada en
los estadios iniciales de la enfermedad, slo confirma en la mayor parte de los c
asos el diagnstico inicial, poniendo de manifiesto un incremento de cuatro veces
o superior en el ttulo de anticuerpos, pero ya en la fase de convalecencia. Inclu
so cuando se utilizan los mtodos serolgicos ms sensibles, menos del 20% de los paci
entes poseen anticuerpos especficos frente a antigenos rickettsiales, detectables
en suero, cuando acuden por primera vez a la consulta mdica en busca de atencin.
Otras aproximaciones diagnsticas utilizadas en ese momento incluyen la visualizac
in de las rickettsias por mtodos inmunohistolgicos en las lesiones cutneas, la ident
ificacin inmunocitolgica de las rickettsias en clulas endoteliales desprendidas y c
irculantes, la deteccin de ADN rickettsial en muestras de sangre y tejidos median
te la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Furuya, 1995; Schriefer, 1994a; S
exton, 1994; Williams, 1994). y el cultivo de las rickettsias presentes en las m
uestras de sangre y tejidos, aunque la mayor parte de estas tcnicas no estn dispon
ibles en muchos laboratorios clnicos. Las rickettsias fueron puestas de manifiest
o por primera vez por Wolbach en muestras de tejidos de pacientes afectados por
la RMSF y por el tifus transmitido por piojos, utilizando el mtodo de tincin de Gi
emsa. durante e inmediatamente despus de la primera guerra mundial. Este mtodo, qu
e en esencia ya es un arte perdido, requiere mucha atencin y cuidado en los detal
les relativos a la fijacin y teido de las rickettsias, y en la actualidad no se re
aliza de forma exitosa en los labratenos histolgicos actuales. Una modificacin del
mtodo de Brown-Hopps tie una pequea proporcin de microorganismos, que aparecen c o m
o bacilos delgados entre las clulas endoteliales. Una aproximacin ms sensible y es
pecfica para visualizar las rickettsias es la inmunohistologa. bien por inmunofluo
rescencia o bien por tincin inmunoenzimtica. utilizando como sondas anticuerpos es
pecficos frente los agentes infecciosos del grupo de la fiebre maculosa o del gru
po del tifus (Dumler, 1990; Kaplowitz. 1983: Walker, 1989,1997b. 1999). La tincin
mediante inmunofluorescencia de muestras de biopsias de piel de pacientes con R
MSF tiene una sensibilidad del 70% y una especificidad del 100%. Los pacientes c
on fiebre botonosa, tifus murino y rickettsiosis vesicular han sido diagnosticad
os tambin mediante la deleccin mmunohistolgica de las rickettsias en las lesiones d
e los exantemas y las escaras Mediante un anticuerpo monoclonal Irente a
Tratamiento
Las rickettsiosis de los grupos de la liebre maculosa y del tifus se tratan de f
orma eficaz con deoxiciclina. tetraciclina o cloranfenicol (Raoult. 1991). Las f

luoroquinolonas son aclivas frente a las rickettsias in vitro: pata el tratamien

to de la liebre botonosa se han utilizado, con xito, ciprolloxacino. olloxacino y
pefloxacino, aunque estas quinolonas no han sido evaluadas todava para el tratam
iento de la RMSF.
Tifus scrub (tifus de las malezas) causado por Orientia tsutsugamushi
La pared celular propia de una bacteria gramnegativa de Orientia (originalmente
Rickettsia) tsutsugamushi difiere de la que presentan las otras especies de rike
ttsias pertenecientes a los grupos de la fiebre maculosa y del tifus: en este co
ntexto, la membrana extema presenta la lmina externa ms gruesa y la interna ms delg
ada, distintas protenas mayoritanas, y carece de lipopoli

sacrido y peptidoglucano (Jamura. 1995). La rickettsia productora del tifus scrub

crece en el citoplasma de la clula husped y sale de la misma mediante un proceso
que implica la formacin de una pequea evaginacin de la membrana plasmtica que englob
a a la rickettsia en trnsito hacia el medio exocelular. Orientia tsutsugamushi se
mantiene transovricamente en acaras del gnero Leptotrombidium (Traub, 1978). Los
huevos infectados eclosionan para liberar las larvas, la nica fase que se aliment
a en el hospedador animal. Las ratas se infectan despus de que las larvas que alb
ergan las rickettsias (chiggers) se alimenten de sus fluidos corporales, aunque
las larvas que estn alimentndose y se infectan con las rickettsias no trasmiten la
infeccin a su descendencia. Por tanto, los humanos y las ratas son slo huspedes ac
cidentales, no esenciales y terminales de la rickettsia que causa el tifus scrub
. Esta enfermedad se da en el rea comprendida dentro del tringulo delimitado por J
apn. Pakistn y el norte de Australia. La infeccin se contrae en zonas con vegetacin
densa, donde una gran poblacin de ratas alberga a su vez una gran poblacin de larv
as que contienen las rickettsias. La lesin patolgica bsica es el dao vascular con in
flamacin linfohistoctica perivascular. que se manifiesta en la zona de la piel don
de se produjo la inoculacin de la rickettsia y en el cerebro, pulmones, corazn, tr
acto gastrointestinal y rones. Despus de un perodo de incubacin entre 6 y 21 das, la
nfermedad comienza con fiebre, dolor de cabeza y. en algunos pacientes, mialgia,
los y sntomas gastrointestinales (Watt. 1999). En la mitad de los pacientes occi
dentales aparece una escara, normalmente antes del comienzo de la fiebre, que ra
ra vez aparece en los pacientes indgenas. Igualmente, en la mitad de los occident
ales afectados con infeccin primaria aparece un exantema macular o maculopapular,
entre dos y nueve das despus del comienzo de la enfermedad. Los pacientes graveme
nte afectados pueden manifestar hipotensin, meningoencefalitis, fallo renal agudo
y procesos hemorrgicos, A menos que se administre un tratamiento antimicrobiano
adecuado, un 7% de los casos son fatales. El tifus scrub puede tambin afectar a l
os excursionistas y otros viajeros expuestos a las larvas en las zonas en las qu
e la infeccin tiene carcter endmico. Para el diagnstico del tifus scrub en zonas endm
icas, un ttulo de 1 : 4 0 0 o superior en un ensayo de IFA tiene una especificida
d del 96% y una sensibilidad del 48%. Un incremento de cuatro veces en el ttulo d
e anticuerpos especficos hasta un valor de 1:200 o superior implica una especific
idad del 98% y una sensibilidad del 54%. Tambin estn disponibles para el diagnstico
el test indirecto de la inmunoperoxidasa, un inmunoensayo en fase slida y un tes
t de aglutinacin de la cepa OX-K de Proteus mirabilis. y parece ser prometedor un
ensayo con anticuerpos dirigidos frente a la protena superficial mayoritaria de
56 kDa, obtenida mediante tcnicas de ADN recombinante (Kim, 1993: Weddle, 1995).
El tratamiento con un antibitico del grupo de las tetraciclinas, como la deoxicic
lina, o con cloranlenicol es eficaz, excepto entre algunos casos registrados en
la parte norte de Tailandia (Watt, 1996).
1 0 8 0
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
lo que sugiere que pueden producirse ciertos cambios en la nomenclatura de estos
microorganismos. Un agente causante de ehrtichiosis granulocitotrpica en humanos
, identificado mediante PCR y secuenciacin del gen que codifica el ARNr 16S, es u
na coespecie de E. phagocytophilay E. equi. existiendo para esta ltima un precede
nte histrico (Chen, 1994), Otro agente que infecta a los granulocilos humanos, de
nominado Ehrlichia eivingii. presenta una gran semejanza con E. chafeensis (Ander
son, 1992).
Ehrlichiosis monocitotrpica humana
Ehrlichia chaffeensis es transmitida por garrapatas, principalmente por la espec
ie Amblyomma americanum. la garrapata Lone Star (estrella solitaria, nombre que

se le da al estado de Texas, en EE.UU.), pero tambin por Dermacentor variabilis e

Ixodes paciicus (Anderson, 1992a: Ewing, 1995; K r a m e r , 1999). Los casos de
tectados tienen carcter rural y estacional predominantemente, ya que el 68% de lo
s mismos aparecen entre mayo y julio (Fishbein, 1994). Los ciervos son un reserv
orio del microorganismo bien conocido, aunque los perros infectados tambin pueden
ser reservnos potenciales. Las garrapatas resultan infectadas mientras se alimen
tan en el estado de larva o de ninfa, portando las ehrlichias mientras experimen
tan la muda entre las diletenles fases de su ciclo, transmitiendo la infeccin dur
ante una posterior alimentacin con la sangre del animal hospedador. La ehrlichios
is monocitotrpica h u m a n a (HME) ha sido detectada en 47 estados de la Unin: la
mayor parte de los casos han aparecido dentro de la zona de dispersin de A. amer
icanum en los estados del tercio sudeste de EE.UU., delimitado por una linea tra
zada desde Nueva Jersey a Texas. El nmero de casos detectados es particularmente
elevado en Oklahoma, Missouri, Arkansas, Texas, Virginia. Tennessee y Georgia, D
esde que en 1 9 8 7 se detectara el primer caso de ehrlichiosis en EE.UU., ms de
700 pacientes con infeccin por E. chaffeensis confirmada en el laboratorio han si
do documentados en el CDC de Atlanta y ms de 1.500 casos en un laboratorio comerc
ial (Fishbein, 1994). Aproximadamente entre un 2% y un 3% de los casos han resul
tado fatales, aunque este porcentaje podra haber sido m u c h o ms elevado si no s
e hubiera aplicado un tratamiento antibitico eficaz en muchos pacientes (Fichtenb
aum, 1994; Fishbein, 1994). La gravedad de la enfermedad se refleja en el hecho
de que el 62% de los pacientes son ingresados. Aunque los casos graves aparecen,
a menudo, entre personas ancianas, los nios tambin son susceptibles a la enfermed
ad (Schultz, 1997). La duracin media de la enfermedad en una extensa serie de cas
os estudiados por el CDC. incluyendo aquellos en los que se administr tratamiento
, fue de 23 das. Los signos y sntomas corresponden a los de una enfermedad sistmica
que no tiene caractersticas clnicas distintivas para el diagnstico: fiebre (97% de
los casos), cefalea (81%), mialgia (68%). anorexia (66%), nuseas (48%), vmitos (3
7%). exantema (6% al inicio de la enfermedad. 25% durante la primera s e m a n a
y un 36% en conjunto), tos (26%), faringitis (26%), diarrea (25%). linfadenopata
s (25%), dolor abdominal (22%) y obnubilacin (20%). Entre las complicaciones grav
es se incluyen el sndrome de distrs respiratorio del adulto, la coagulacin intravas
cular diseminada y la insuficiencia renal. Los datos analticos clnicos muestran le
ucopenia (60%). trombocitopenia (68%) y valores elevados de transaminasas heptica
s (86%). La afectacin del sistema nervioso central viene indicada por ciertos snto
mas como ataques y coma, y se confirma por una pleocitosis en el lquido cefalorra
qudeo (LCR), por la presencia de E, chaffeensis y por un incremento de la concent
racin proteica en el LCR. y por la existencia de lesiones cerebrales que se ponen
de manifiesto mediante autopsia (Dunn, 1992; Ratnasamy, 1996; Walker, 1997a). E
n los pacientes nmunocomprometidos, incluyendo los enfermos de sida, la ehrlichio
sis monocitotrpica h u m a n ap u e d e ser una infeccin abrumadora, con un crecim
iento masivo de las ehrlichias y un desenlace fatal (Paddock, 1993; Walker, 1997
a). Tambin existe documentacin sobre infecciones suaves. Ehrlichia chaffeensis pro
duce u n a infeccin persistente en sus hospedadores naturales y al m e n o s ha s
ido documentado un c a s o semejante en humanos (Dumler, 1993b). Tras la entrada
del microorganismo mediante la picadura de la garrapata. E. chaffeensis se dise
mina por el organismo a travs de los sistemas linftico y circulatorio. Las mrulas d
el microorganismo han sido detectadas en el interior de los monocitos y los macrf
agos de la mdula sea, sangre perifrica (aunque raramente), sinusoides hepticos, bazo
, ganglios linfticos, meninges, rion y epicardio (Dumler. 1993a; Walker. 1997a). E
l examen de la mdula sea pone frecuentemente de manifiesto la existencia de granul
omas, hiperplasia mieloide y megacariocitosis. Otras lesiones detectadas han sid
o
Infecciones causadas por organismos del gnero Ehrlichia Estructura y funcin
Los especies del gnero Ehrlichia son bacterias gramnegativas de pequeo tamao (0,5 u
m). de morfologa cocobacilar, parsitos intracelulares obligados que viven en el in
terior de la vacuola citoplasmtica de los glbulos blancos sanguneos (Weiss, 1984).
La microcolonia intravacuolar de bacterias semeja a una mora cuando se observa b
ajo tincin por el mtodo de Wright-Giemsa, razn por la que a esta formacin se le da e

l nombre de mrula (del latn, mora). Conocidas y estudiadas desde hace tiempo c o m
o agentes causales de enfermedades veterinarias, las especies del gnero Ehrlichi
a han emergido ltimamente como patgenos humanos. Primariamente, las causas que han
llevado a esta nueva situacin han sido su reciente deteccin en humanos, su rpida c
aracterizacin con las herramientas moleculares analticas actualmente disponibles y
el incremento de las poblaciones y la distribucin geogrfica de las especies de ga
rrapatas que tienen como hospedador a los ciervos. La taxonoma de estos organismo
s est pendiente de revisin debido a los nuevos datos genticos que se han ido acumul
ando en los ltimos aos. Los patgenos animales c o m o Cowdria ruminantiumy Anaplasm
a margnale estn incluidos dentro de los gneros a los que pertenecen los agentes cau
sales de ehrtichiosis en humanos encontrados en EE.UU. La denominacin del gnero An
aplasna data de 1910,

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1081
infiltrados linfohistociticos perivasculares en el rion, meninges, cerebro y cora
zn; neumonitis mononuclear intersticial; focos de muerte celular semejante a la a
poptosis en el hgado, ganglios linfticos y bazo; hiperplasia reticuloendotelial di
fusa; eritrofagocitosis; y colestasis.
Infeccin por Ehrlichia ewingii en el hombre
Inicialmente identificada en 1971 como un patgeno del perro. E eiv/ngHtambin es tr
ansmitida por la garrapata A. americanum (Anziani, 1990: Ewing, 1971). Esta espe
cie comparte antgenos comunes con E. chaffeensis. aunque infecta principalmente a
los neutrfilos. En el informe sobre el descubrimiento de esta bacteria como patge
no humano, tres de los cuatro pacientes estudiados eran inmunocomprometidos, lo
que sugiere que los individuos inmunocompetentes pueden ser relativamente resist
entes a la enfermedad (Buller, 1999).
Ehrlichiosis
granulocitotrpica
humana
causada
por Ehrlichia phagocytophila
En EE.UU. se han documentado ms de 600 casos de ehrlichiosis granulocitotrpica hum
ana (HGE). detectados principalmente en ios estados de la parte norte del medio
oeste (Wisconsin y Minnesota) y los estados del nordeste (Nueva York, Connecticu
t, Rhode Island y New Jersey), aunque tambin se han confirmado casos de infeccion
es autctonas hacia el sur, a lo largo de la costa este, as como en California y en
Europa (Aguero-Rosenfeld, 1996; Bakken, 1996; Horowitz. 1998; Petrovec. 1997).
L a infeccin es transmitida por las garrapatas Ixodes scapulahs. I. pacificus e /
. ricinus. siendo el ratn de patas blancas (Peromyscus leucopus) y otros pequeos m
amferos el reservoro de la bacteria en EE.UU., mientras que el ciervo rojo, ovejas
, cabras y el ganado en general tienen ese papel en Europa (Hodzic, 1998). La pa
tologa viene pobremente definida por la observacin en sangre perifrica y diversos rg
anos de neutrfilos con mrulas en su interior, de infiltrados de macrfagos espumosos
en rganos del sistema reticuloendotelial. de infiltrados linfohistociticos vascu
lares perifricos y de apoptosis hepatocelular focalizada (Walker, 1997a). La mort
alidad est asociada frecuentemente con infecciones secundarias oportunistas provo
cadas por hongos y virus (Hardalo, 1995). Las manifestaciones de la ehrlichiosis
granulocitotrpica humana van desde formas asintomticas hasta casos graves, y much
os de los pacientes diagnosticados necesitan ser hospitalizados (Bakken, 1996).
La infeccin resulta mortal en menos del 1% de los casos, y es muy probable que al
gunas infecciones tengan un curso subclnico. La enfermedad comienza con escalofros
, fiebre, dolor de cabeza y mialgia. En la mayor parte de los casos aparece trom
bocitopenia, y leucopenia en cerca de la mitad de los afectados. El dato que ind
ica la existencia de dao hepatocelular es la deteccin de niveles elevados de enzim
as hepticas, y los pacientes gravemente enfermos pueden sufrir un choque sptico co
n afectacin multiorgnica.
eliminar cualquier interpretacin que signifique un resultado falsamente positivo
debida a la presencia de granulaciones txicas, cuerpos de Dhle. plaquetas superpue
stas o partculas contaminantes. La deteccin inmunohistoquimica de E chaffeensis en

muestras de tejidos se ha utilizado exclusivamente c o m o tcnica de investigacin

(Dumler, 1993a; Yu, 1993). El diagnstico serolgico es el procedimiento ms habitual
para la deteccin de la ehrlichiosis humana mediante IFA, empleando E chaffeensis
propagada en cultivos celulares y antgenos de E. phagocytophila (Nicholson, 1997
: Olano. 1999: Walls. 1999). Este mtodo es muy sensible para detectar seroconvers
in hasta un ttulo de 1:64 o superior entre dos y cuatro semanas despus del inicio d
e la enfermedad. El resultado esperado en una muestra de suero correspondiente a
la fase aguda de la enfermedad es la ausencia de anticuerpos. Por lano, el trata
miento debe iniciarse empricamente en base a factores clnicos y epidemiolgicos y no
quedar pendiente de la confirmacin diagnstica de laboratorio. Existen opiniones v
ariables respecto a cul debe ser el ttulo de anticuerpos presente en una nica muest
ra de suero que varan entre valores de 1:64 y 1:256 para E chaffeensis. Aproximad
amente en un 20% de pacientes afectados por H M E y HGE respectivamente se detec
ta reactividad cruzada entre E phagocytophila y E chaffeensis. En consecuencia,
en aquellas zonas geogrficas donde existe una superposicin de ambos tipos de infec
ciones (HME y HGE), o bien h a y una posibilidad evidente de quedar expuesto a l
a infeccin como consecuencia de un viaje, es esencial determinar el titulo de ant
icuerpos frente a los dos microorganismos. Una diferencia de cuatro veces en el
titulo es el criterio utilizado para distinguir entre ambos agentes infecciosos.
Aquellos casos en los que slo se detecta una diferencia de dos veces o menor se
diagnostican c o m o ehrlichiosis de etiologa indeterminada. Poder diferenciar a
E chaffeensis de E ewingii segn criterios serolgicos es ms problemtico, porque esta l
tima especie an no ha podido ser cultivada. La inmunotranslerencia (Western blot)
es. actualmente, una tcnica de investigacin til para distinguir las infecciones ca
usadas por E chaffeensis. mediante la deteccin de una familia de protenas de 120 k
Da y 28 kDa especificas, y las provocadas por E phagocytophila, que muestra un p
atrn de especies proteicas mayoritarias entre 42 kDa y 49 kDa (Asanovich. 1997: C
hen, 1997a, 1997b; Zhi, 1997). Los ensayos serolgicos basados en estos antgenos ob
tenidos mediante tcnicas de ADN recombinante parecen ser prometedores y podrian s
er desarrollados en un futuro prximo (Yu, 1999).
Tratamiento
La doxiciclina es muy eficaz para el tratamiento de las ehrlichiosis humanas (Ba
kken, 1996; Fishbein, 1994). El cloranfenicol tambin parece acortar la duracin de
la ehrlichiosis monocitotrpica humana (Fishbein, 1994), aunque los estudios lleva
dos a cabo m vitro con cultivos celulares revelan que tanto E. chaffeensis como
E. phagocytophila son resistentes a este antibitico, as como a ciertos antimicrobi
anos de prescripcin frecuente c o m o los p-lactmicos. macrlidos, aminoglucsidos y s
ullamidas (Brouqui, 1992: Klein, 1997). Ehrlichia phagocytophila es sensible a l
a rifampicina y a la rifabutina cuando se encuentra creciendo en cultivos celula
res.
Diagnstico de laboratorio
El aislamiento de las ehrlichias a partir de sangre humana en cultivos celulares
sin antibiticos, una herramienta utilizada en la investigacin, se ha logrado ms a
menudo con E. phagocytophila (en clulas HL-60) que con chaffeensis (en clulas DH-8
2), slo una vez con E canis (en una persona asintomtica). y an no ha sido logrado (
o al menos descrito en la bibliografa) con E ewingii(Childs, 1999: Dawson, 1991;
Goodman, 1996; Prez, 1996). La amplificacin del ADN de las ehrlichias por PCR, emp
leando cebadores especficos de especie, es un mtodo eficaz para el diagnstico de to
das las ehrlichiosis humanas, aunque no est disponible para su empleo de forma ge
neral (Anderson, 1992b; Buller, 1999; Chen, 1994; Comer, 1999; Everett, 1994). L
a sensibilidad del mtodo de PCR oscila entre el 79% y el 100% para el diagnstico d
e la ehrlichiosis monocitotrpica, y entre un 48% y un 86% en el caso de la ehrlic
hiosis granulocitotrpica causada por E phagocytophila (Anderson, 1992b; Everett,
1994). En fases ms avanzadas de la enfermedad, debido al menor nmero de microorgan
ismos en sangre o al tratamiento con tetraciclina, disminuye la sensibilidad del
mtodo de deteccin de ehrlichias basado en la PCR. Aunque sea un mtodo laborioso, l
a visualizacin de mrulas en los neutrfilos de sangre perifrica es una buena alternat
iva para el diagnstico de la ehrlichiosis humana, ya que puede llevarse a cabo en

cualquier laboratorio. Esta tcnica tiene una mayor sensibilidad (entre el 30% y
el 80%) para el diagnstico de las infecciones causadas por E phagocytophila que p
ara el de aquellas en el que la responsable es E chaffeensis (menos del 10%). Es
importante
Infecciones causadas por Coxiella burnetii Estructura y funcin
Coxiella burnetii se encuentra bastante alejada desde el punto de vista gentico d
el resto de rickettsias patgenas, y es el nico microorganismo integrado en el grup
o -/de las Proteobacterias. Estas bacterias gramnegativas tienen un aspecto vari
able que va desde una morfologa bacilar hasta una coccea, y mediante microscopa ele
ctrnica se han identificado dos lormas distintas: una representada por clulas larg
as (entre 0,5 pm y 1 , 2 pm) y otra por clulas densas de pequeo tamao (0.5 pm), que
podrian indicar la existencia de un ciclo de desarrollo. Se ha puesto un gran nf
asis en los fenmenos asociados con el cultivo de C. burnetii en el laboratorio, c
omo es la prdida de la capacidad para sintetizar completamente el lipopolsacrido de
la pared celular, tras un periodo prolongado de pases sucesivos en cultivos cel
ulares o huevos embrionados. El cambio consistente en la sntesis de una molcula tr
uncada de lipopolisacrido en lugar de la molcula completa del mismo, y que es anlog
o a la interconversin entre los fenotipos liso y rugoso que se da en la familia E
nterobacteriaceae, se ha denominado como variacin de fase, de fase I a fase II. L
a fase I se encuen-

1082
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Ira en la naturaleza y en los anmales y personas infectadas, mientras que la lase
II aparece tan slo en condiciones de laboratorio. Coxiella burnetii penetra en l
as clulas blanco, los macrfagos, por un proceso de fagocitosis pasiva y est fuertem
ente adaptada a las condiciones existentes en el interior del fagolisosoma (p, e
j la bacteria sintetiza superxido dismutasa y fosfatasa acida), donde tiene lugar
la mulliplicacin de la bacteria por fisin binaria.
Fiebre Q
El nombre de fiebre O deriva del desconocimiento de su etiologa cuando el sndrome
clnico-epidemiolgico fue descrito inicialmente c o m o liebre interrogante. La eco
loga de C. burnetii incluye infecciones silenciosas en animales: muchas especies
de garrapatas, ungulados (especialmente ovejas, vacas y cabras), otros mamferos (
incluyendo gatos y conejos salvajes), peces, pjaros y marsupiales (Mame. 1988.199
7). Los seres humanos se infectan principalmente p o r la inhalacin de aerosoles
que tienen su ongen en restos de los partos del ganado domstjco. aunque tambin por
la ingestin de leche contaminada no pasteurizada (Fishbein, 1992). Muchas de las
infecciones humanas tienen carcter de enfermedad ocupacional: se da entre emplea
dos de mataderos, granjeros y veterinarios. Por el contrario, los casos urbanos
no relacionados con una profesin de riesgo son, sin lugar a dudas, m u y poco fre
cuentes en algunos de los grupos de poblacin donde han sido evaluados, como suced
e por ejemplo entre los pacientes inmunocomprometidos en Francia (Brouqui, 1993)
. La mayor parte de las infecciones humanas son asintomticas (Mame. 1990). La enf
ermedad aguda se manifiesta, a menudo, como una afeccin febril mdiferenciada y au
tolimitada, o c o m o una neumona, hepatitis o meningoencefalitis (Drancourt. 199
1; Duponl, 1992). Los pacientes individuales con mialgias. anorexia y dolor de c
abeza raramente son investigados con objeto de diagnosticarles una fiebre Q, aun
cuando estos sntomas son la presentacin clinica ms clsica de esta inleccin, que repr
esenta, a su vez. un porcentaje significativo entre los pacientes que manifiesta
n dichos sntomas en algunos grupos de poblacin. Las manifestaciones de la forma ne
umnica de la fiebre Q son variables: la tos puede ser no productiva o estar ausen
te, y la neumona puede ser grave y progresar rpidamente o ser detectada radiolgicam
ente, visualizando la presencia de mltiples infiltrados radiolgicos redondeados o
segmentarios, con ausencia de sntomas pulmonares. La forma heptica de la fiebre Q
puede tener una presentacin clinica semejante a la de la hepatitis viral aguda o
la manifestacin patolgica de una hepatitis granulomatosa determinada mediante biop
sia. La fiebre Q crnica est considerada c o m o un sinnimo de endocarditis producid
a por C. burnetii. pero tambin aparece menos frecuentemente como consecuencia de
la infeccin de un aneurisma o de prtesis vasculares, o de osteomielitis(Brouqui, 1
993; Marrie. 1990). La forma de endocarditis crnica de la fiebre Q implica, gener
almente, a una vlvula artica o mitral previamente daada, produciendo una enfermedad
no febril que puede manifestarse con fallo cardiaco, bepatoesplenomegalia. ruid
os cardiacos cambiantes y prdida de peso. Las manifestaciones de la enfermedad as
ociadas a inmunocomplejos circulantes incluyen un exantema purprico asociado a va
sculitis o glomerulonefritis. La patologa de la fiebre Q aguda incluye neumona bro
nquiolo-alveolar intersticial mixta con clulas inflamatorias mononucleares e infl
amacin granulomatosa del hgado y la mdula sea (Walker, 1988b). Los granulomas asocia
dos a la fiebre Q presentan, a menudo, una vacuola central transparente rodeada
por un anillo de fibrina y por macrfagos epitelioides. De todos modos, estos gran
ulomas no son lesiones con valor patognomnico ni tampoco el nico tipo de granuloma
s que se detectan en el higado y la mdula sea de los pacienles afectados por fiebr
e Q. Las vlvulas cardacas alectadas en la endocarditis asociada a la fiebre Q mues
tran una inflamacin subaguda y crnica, con una gran cantidad de macrfagos espumosos

que tienen el citoplasma repleto de clulas de C. burnetii.

fase I pueden detectarse unas dos semanas despus del inicio de la enfermedad. En
general, la fiebre Q aguda se asocia con ttulos elevados de anticuerpos frente a
los antigenos de la fase II y bajos frente a los de la fase I. Mediante el test
de IFA, un ttulo de IgG y de IgM frente a antigenos de la fase II de 1:200 o supe
rior y de 1 : 5 0 o superior, respectivamente, tiene una sensibilidad del 5 8 %y
una especificidad del 92% para el diagnstico de la fiebre Q aguda. En la forma c
rnica de la enfermedad, se detecta un ttulo ms elevado de anticuerpos frente a la f
ase I (de 1:800 o supenor mediante el test de IFA) mientras que el titulo de ant
icuerpos frente a la fase II es. generalmente, igual o inferior al de la fase I.
Frecuentemente es posible detectar una respuesta de I g A frente a antgenos de l
a fase I en pacientes aquejados de fiebre Q crnica. Un ttulo de 1:128 o superior d
e anticuerpos frente a antigenos de fase detectados mediante fijacin de complemen
to se considera tambin que tiene valor diagnstico de fiebre Q crnica, si bien algun
os pacientes presentan ttulos inferiores. Debido a la reactividad cruzada existen
te entre Bartonella henselae y B. quintana con C. burnetii. n o debe llevarse a
cabo el diagnostico serolgico de la endocarditis causada p o r Bartonella hasta q
ue no se haya determinado el titulo de anticuerpos frente a C. burnetii (LaScola
. 1996b), que, en el caso de la endocarditis asociada a la fiebre Q, es sustanci
almente ms elevado que el detectado frente a Bartonella. Otros mtodos empleados pa
ra el diagnstico de la endocarditis asociada a la fiebre Q crnica son la tincin inm
unohistolgica, la microscopa electrnica, y la deteccin de C burnetii mediante PCR, a
unque todos ellos implican la utilizacin de tcnicas que son ms propias de la invest
igacin bsica. Coxiella burnetii puede ser recuperada a partir de la sangre o de la
s vlvulas cardiacas mediante cultivo in vttro utilizando un sistema de cultivo de
clulas HEL en shell vial, facilitado por centrifugacin. Este procedimiento puede
detectar e identificar la presencia de coxiellas en unos siete das, pero debe emp
learse solamente en instalaciones con medidas de bioseguridad de nivel 3.
Tratamiento
La doxiclma es eficaz para acortar la duracin de la fiebre O aguda cuando se admi
nistra durante los tres primeros das despus del comienzo de la enfermedad (Levy, 1
991). Las fluoroquinolonas representan una medicacin alternativa para aquellos pa
cientes que no pueden ser tratados con tetraciclinas. El tratamiento de la endoc
arditis asociada a la forma crnica de la enfermedad implica la administracin duran
te liempo prolongado de doxicclina y una quinolona simultneamente, aunque a menudo
esta pauta no es capaz de eliminar la infeccin (Marrie. 1997). El xito del tratam
iento viene indicado por una lenta cada en el ttulo de IgG frente a antgenos de la
fase I hasta un valor por debajo de 1:200, momento en el que puede considerarse
la posibilidad de suspender el tratamiento. La sustitucin de las vlvulas cardacas a
fectadas s e lleva a cabo, frecuentemente, por razones de tipo hemodinamico.
Infecciones causadas por organismos del gnero Bartonella (Rochalimaea) Estructura
y funcin
Los organismos originalmente clasificados dentro del gnero Rochalimaea han sido r
eclasificados como un gnero nuevo, Bartonella. mientras que la familia Bartonella
ceae h a sido suprimida del orden Rickettsiales (Birtles. 1996; Brenner. 1993).
Las especies patgenas del hombre. S. quintana (el agente etiolgico de la fiebre de
las trincheras, una de las pnncipales enfermedades transmitidas por piojos dura
nte la primera guerra mundial), B. henselae (el agente causal de la enfermedad p
or araazo de gato), B. elizabethae (asociada con endocarditis infectiva) y B. bac
illiormis (una bacteria transmitida por los mosquitos que provoca una forma febnl
de anemia hemoltica aguda y una lesin cutnea crnica denominada verruga peruana en A
mrica del Sur), han podido ser cultivadas en medios artificiales enriquecidos con
sangre en presencia de un 5% de CO-, Estos bacilos gramnegativos. parsitos intra
celulares facultativos, no producen cidos de los carbohidratos y. generalmente, s
e localizan en el interior de los entrocilos del animal mamfero que constituye su
hospedador natural. Entre las numerosas nuevas especies descritas del gnero Bart
onella, B. clarridgeiae podra s e r un segundo agente etiolgico de la enfermedad p

or araazo de gato (Kordick, 1997),

Diagnstico de laboratorio
El diagnstico de laboratorio de la fiebre Q se lleva a cabo, en la mayor parte de
los casos, mediante la deteccin de anticuerpos frente a C. burnetii (Fournier, 1
996. 1998). Los mtodos serolgicos utilizan antigenos caractersticos de ambas fases
(fase I y fase II) y. a menudo, evalan la produccin de anticuerpos especficos de cl
ase. Los mtodos del enzimommunoensayo y el IFA son altamente especficos y mas sens
ibles que los basados en la fijacin del complemento. En la fiebre Q aguda, los an
ticuerpos frente a los antigenos de la fase II aparecen m u y pronto tras la inf
eccin, mientras que los anticuerpos frente a la
Enfermedad por araazo de gato, angiomatosis bacilar y peliosis bacilar
Bartonella henselae es transmitida al ser humano por los araazos o mordeduras de
mascotas infectadas que estn bacterimicas durante muchos meses

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1083
aunque aparentemente parezcan sanas (Bergmans, 1997; Chomel, 1995; Heller, 1997;
Tapper, 1993). La bacteria se transmite entre gatos a travs de sus pulgas (Chomel
. 1996; Higgins. 1996). La naturaleza de la enfermedad est determinada, en gran m
edida, p o r el propio hospedador. En individuos inmunocompetentes, alrededor de
l 80% son jvenes menores de 21 aos que presentan una ppula o pstula cutnea en el punt
o donde se produjo la inoculacin del microorganismo, con una linfadenopatia regio
nal limitada. Menos del 2% de los pacientes sufren complicaciones en el hgado, ba
zo, pulmones, huesos, sistema nervioso central, retina, conjuntiva o piel como c
onsecuencia de la diseminacin del microorganismo por la sangre (Listn. 1996). Desd
e un punto de vista histopatlogico, las lesiones de la enfermedad por araazo de ga
to consisten en granulomas que rodean a microabcesos estrellados. En pacientes p
rofundamente inmunodeprimidos, la infeccin por B. henselae cursa con fiebre y bac
teriemia o con lesiones cutneas o viscerales angioproliferativas. Estas ltimas se
caracterizan por ser proliferaciones vasculares lobulares de clulas endoteliales
rechonchas con racimos de pequeos capilares que rodean a los capilares ectticos se
parados por un estroma edematoso, mucilaginoso o fibrtico que contiene cmulos de n
eutrfilos y de restos de los mismos, as como microcolonias granulares de bartonell
as. Cuando se forman en la piel, estas lesiones reciben el nombre de angiomatosi
s bacilar, mientras que cuando aparecen en el hgado y el bazo se denominan pelios
is heptica o esplnica. La infeccin tambin puede diseminarse a otras localizaciones.
Las lesiones angioproliferantes provocadas por B. henselae y B. quintana en paci
entes inmunodeprimidos son indistinguibles entre si y bastante parecidas a las d
e la verruga peruana causada por 8. bacilliformis (Koehler, 1997). Bartonella he
nselae, B. quintana y 8. elizabethae han sido descritas como agentes responsable
s de endocarditis infecciosa en humanos, al igual que B. vinsoniien perros (Dran
court, 1995).

ptimo se obtiene en medios de cultivo enriquecidos con sangre de conejo, en agar

chocolate o en agar con extracto de levadura y carbn activo. Las colonias tardan
entre 9 y 15 das, y en ocasiones incluso ms tiempo, en aparecer y ser detectadas.
Las especies del gnero Bartonella son bacterias gramnegativas de morfologa bacilar
, con una longitud entre 1 u . my3u . my un dimetro entre 0,2 u . m y 0,5 u.m. Ba
rtonella henselae da negativas las pruebas de la oxidasa, catalasa y ureasa y no
utiliza los carbohidratos. La identificacin definitiva requiere un anlisis de la
composicin de cidos grasos, secuenciacin de ADN o hibridacin con sondas especficas, t
nicas que se utilizan por lo general en los laboratorios de referencia (Scott, 1
996). La PCR representa un mtodo atractivo para el diagnstico molecular. Bartonell
a bacillilormis puede ser cultivada y aislada a partir de muestras de sangre o d
e las lesiones cutneas en agar infusin de cerebro y corazn, conteniendo un 0,4% de
agar y un 5% de sangre humana, de caballo o de cone|0. Originalmente, el diagnsti
co de la enfermedad por araazo de gato se basaba en una combinacin de datos clnicos
, epidemiolgicos y patolgicos. Los estudios morfolgicos, incluyendo la tincin de War
thin Starry, han sido utilizados como datos adicionales para el diagnstico de la
angiomatosis bacilar y la enfermedad por araazo de gato. La fiebre de Oroya puede
diagnosticarse mediante la visualizacin de las bartonellas en el interior de los
eritrocitos, que aparecen como formas cocceas o bacilares, ocasionalmente con mo
rfologas curvadas o en anillo, en muestras de sangre perifrica cuidadosamente teida
s mediante el mtodo de Giemsa. para evitar la aparicin de artefactos que pudiesen
conducir a una interpretacin errnea de lo observado. El diagnstico de las infeccion
es causadas por 8. henselae y 8. quintana se lleva a cabo habitualmente mediante
la demostracin de la existencia de anticuerpos especficos mediante inmunofluoresc
encia indirecta o enzimoinmunoensayo (Dalton, 1995b). El diagnstico serolgico de l

a endocarditis por bartonellas debe contemplar tambin la determinacin del ttulo de

anticuerpos frente a C. burnetii, que puede incrementar el ttulo de anticuerpos q
ue reaccionan cruzadamente con Bartonella (Maurin, 1997). El ttulo frente a la fa
se I de C. burnetii es m u c h o ms elevado que el de anticuerpos anti-8artone//a
en la endocarditis asociada a la forma crnica de la fiebre Q.
Fiebre de las trincheras y angiomatosis bacilar
Bartonella quintana produce una bacteriemia prolongada en pacientes convalecient
es, que constituyen, aparentemente, su reservono. Durante la primera guerra mund
ial, se estableci que la infeccin se transmita de persona a persona mediante la pic
adura del piojo {Pediculus humanus corporis) en las trincheras de la primera lin
ea del frente (Bruce. 1921), no habindose identificado otras fuentes o mecanismos
para la transmisin de la infeccin. A partir de las heces del piojo cargadas con B
. quintana, el microorganismo penetra por las erosiones de la piel que el propio
individuo se produce al rascarse tras la picadura, y aproximadamente ocho das ms
tarde comienzan a aparecer los sntomas de la enfermedad, que se manifiesta con un
nivel de gravedad variable. Los sntomas incluyen fiebre, que generalmente desapa
rece en menos de una semana, jaqueca, mialgias, dolor pretibial y la aparicin de
una erupcin macular evanescente. Las recadas se producen a menudo con intervalos d
e cuatro a cinco das. La bacteriemia en el ser humano afectado persiste durante s
emanas, m e s e s o incluso ms tiempo, siendo la fuente a partir de la cual los p
iojos se infectan, incluso aun cuando la persona se sienta relativamente saludab
le. En la actualidad se detectan casos de la enfermedad entre los grupos de alco
hlicos y vagabundos en ciudades amencanas y europeas (Spach, 1995).
Tratamiento
Por lo general, la enfermedad por araazo de gato es autolimitada, aunque parece r
esponder favorablemente al tratamiento con acitromicina. Los frmacos de eleccin pa
ra el tratamiento de la angiomatosis bacilar, peliosis por Bartonella, bacteriem
ia o endocarditis son eritromicina, acitromicina o doxiciclina (Guerra, 1993). E
ventualmente pueden producirse recadas que necesitan un nuevo tratamiento o inclu
so una terapia de mantenimiento a largo plazo. Para el tratamiento de la fiebre
de Oroya es preferible el cloranlenicol, debido a la efectividad de este antibiti
co frente a la sobreinfeccin por salmonellas. cuya aparicin est claramente reconoci
da. El tratamiento puede producir una reaccin semejante a la de Jarisch-Herxheime
r. que cursa con fiebre y otros sntomas sistmicos. La verruga peruana se trata con
rifampina por va oral. En el tratamiento de la fiebre de las trincheras se han u
tilizado con xito tetraciclina y cloranfenicol.
Fiebre de Oroya y verruga peruana
La bartonellosis sudamericana, que se manifiesta como una enfermedad aguda, deno
minada liebre de Oroya, o en forma de una lesin cutnea crnica llamada verruga perua
na, se transmite por la picadura del mosquito Lutzomyia. Los portadores humanos
asintomticos a largo plazo son el reservorio de la bacteria responsable, B. bacil
lilormis. Tras un perodo de incubacin de unas tres semanas aproximadamente, la lie
bre de Oroya comienza de una forma insidiosa con anorexia, dolor de cabeza, male
star y febrcula, o bien de manera brusca con escalofros, fiebre elevada y delirios
. Las bartonellas invaden los glbulos rojos sanguneos, provocando cambios en los m
ismos que se traducen en eritrofagocitosis y anemia. La verruga peruana, caracte
rizada por la aparicin de nodulos duros, con una coloracin que va de rojo a prpura,
que surgen en grupos durante un perodo de entre uno y dos meses y persisten dura
nte meses e incluso aos, es un cuadro que se manifiesta tras la liebre de Oroya,
o puede aparecer sin que existan sntomas previos de ningn tipo (Arias-Stella. 1986
).
INFECCIONES POR MICOPLASMAS
La capacidad de los micoplasmas para causar enfermedades en el hombre fue puesta
de manifiesto en 1962. cuando un organismo de este tipo (seguidamente denominad
o Mycoplasma pneumoniae) fue identificado c o m o el agente etiolgico de la enfer
medad denominada neumona atpica primaria (Chanock, 1962). Los micoplasmas son los

microorganismos ms pequeos conocidos con capacidad para vivir como formas libres.
Son bacterias pleomrficas, con forma esfrica, de pera o filamentosa, con un dimetro
entre 0,2 u , m y 0,8 p.m. La mayor parte de especies son anaerobias facultativ
as y se dividen por escisin binaria. Los micoplasmas constituyen un grupo nico ent
re las bacterias porque carecen de pared celular. Son incapaces de sintetizar lo
s constituyentes de la pared celular y necesitan que en el medio exista colester
ol (y otros esteroles relacionados) para poder llevar a cabo la sntesis de membra
nas. L o s micoplasmas tambin carecen de las rutas enzimticas necesarias para real
izar la sntesis de purinas y pirimidinas, por lo que necesitan medios de cultivo
complejos (como el caldo infusin de corazn de vacuno, enriquecido con suero de cab
allo, extracto de levadura y cidos nucleicos) para poder crecer in vitro. En este
captulo se tratarn las especies potencialmente patgenas, Mycoplasma pneumoniae y l
os micoplasmas genitales {Mycoplasma hominis y UreDiagnstico de
El hemocultivo
ra hemocultivo
na a partir de

laboratorio
por el procedimiento de lisis-centrifugacin y el sistema Bactec pa
han sido utilizados para la recuperacin de 8. henselae y B. quinta
los pacientes (Brenner. 1997). El crecimiento

1084
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
aplasma urealyticum). Las otras especies de micoplasmas forman parle de la micro
biota normal de los tractos respiratorio y genitourinario en el ser humano.
Mycoplasma Epidemiologa
pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae tiene una distribucin mundial. Las epidemias provocadas por
esta bacteria se dan en grupos de poblacin cerrados, como nios en escuelas, famil
ias, reclutas militares, tpicamente a intervalos de tiempo enlre cuatro y ocho aos
, especialmente al final del verano y comienzo del otoo. En los aos de los perodos
interepidmicos, los casos aparecen a lo largo de todo el ao y por lo general la in
feccin se extiende lentamente, siendo necesario para el contagio que exista un co
ntacto directo con una persona enferma. S i n embargo, durante las epidemias la
infeccin puede diseminarse rpidamente, y la deteccin de brotes puntuales que no par
ecen estar asociados a una exposicin cercana y prolongada al microorganismo sugie
re que M. pneumoniae puede transmitirse a travs de partculas de pequeo tamao present
es en aerosoles. La tasa de infeccin con M. pneumoniae es elevada en nios en edad
escolar y adultos jvenes, y la enfermedad aparece con mayor frecuencia en persona
s con edades comprendidas entre los 5 y los 20 aos, especialmente en aquellas que
se encuentran en la franja entre los 15 y los 19 aos. La infeccin por M. pneumoni
ae es frecuente en nios con menos de 5 aos, aunque por lo general es asintomtica o
produce tan slo una enfermedad suave con conza y silbidos respiratorios pero sin
fiebre o neumona (Femald. 1975).
Los antgenos intracelulares de M. pneumoniae que quedan expuestos c o m o consecu
encia de la fagocitosis y subsiguiente degradacin de las bacterias fagocitadas es
timulan la respuesta mediada por linfocitos T. que a su vez determina, aparentem
ente, la gravedad de la enfermedad Existe poca informacin sobre la patologa de la
enfermedad causada por M. pneumoniae, ya que la mayor parte de infecciones son a
utolimtadas. y m u y raramente se obtienen muestras de tejidos por biopsia para s
u examen. En los casos ltales se pueden observar zonas de consolidacin parcheadas
en los pulmones. El examen histolgico de los focos de tejido afectado revela la e
xistencia de bronquitis, bronquiolilis y neumonitis intersticial y alveolar con
acmulos peribronquioiares de linfocitos y clulas plasmticas, acompaados por macrfagos
y neutrfilos en el caso de que exista necrosis celular.
Manifestaciones
clnicas
Patogenia y patologa
Mycoplasma pneumoniae es un parsito superficial que coloniza el epitelio de la mu
cosa del tracto respiratorio. Su capacidad para adherirse a las clulas de la muco
sa respiratoria, escapar a la fagocitosis y modular la respuesta del sistema inm
une es fundamental para que se desencadene la enfermedad. Su movilidad por desli
zamiento puede permitirle penetrar a travs de las secreciones respiratorias, y su
forma filamentosa y flexible, que posee un orgnulo de adherencia terminal, facil
ita su localizacin en huecos y plegamientos de la membrana plasmlica de las clulas
hospedadoras y entre las microvellosidades y los cilios de las mismas, donde que
da protegido de la accin de las clulas fagocticas. La adhesin de M. pneumoniae a las
clulas hospedadoras est mediada por la protena P1, que mteracciona con glucoprotei

nas que contienen cido neuramnico. presentes en la superficie de la membrana celul

ar (Chandler. 1982; Geary, 1987). El perxido de hidrgeno y el ion superxido produci
do por M. pneumoniae puede causar dao en las clulas de la mucosa, provocando la de
tencin del movimiento de los cilios y el desprendimiento de las clulas superficial
es (Almagor, 1984) Algunos factores relacionados con el hospedador tambin parecen
estar implicados en la patogenia de la enfermedad producida por M. pneumoniae.
L a aparentemente elevada prevalencia de la infeccin por esta bacteria en nios y jv
enes, el carcter suave de la enfermedad en individuos pertenecientes a estos grup
os y la aparicin de una forma ms grave de la afeccin en personas con edades ms avanz
adas sugiere que la enfermedad grave podra ser consecuencia de la respuesta inmun
e del hospedador a la reinfeccin por el microorganismo; sin embargo, se desconoce
la naturaleza del mecanismo especfico responsable del dao celular en este caso Ad
ems, se sospecha que los sntomas exlrapulmonares (que se comentarn ms adelante) estn
mediados por una respuesta inmune, ya que M. pneumoniae se aisla con muy baja fr
ecuencia a partir de muestras no respiratorias. La interaccin de M. pneumoniae co
n el determinante antignico I de los glbulos rojos humanos, que contiene los resto
s de 2.3-sialil-poli-/V-acetilgalactosamina necesarios para el reconocimiento, p
uede causar una alteracin en dicho antigeno I, transformndolo en antgeno extrao que
estimule la produccin de aglutininas fras. Otros anticuerpos autoinmunes que se fo
rman durante la infeccin por M. pneumoniae (anticuerpos frente a pulmn, cerebro, ms
culo liso y Imfocitos) pueden tener un origen semejante. La primera linea de def
ensa durante la infeccin primaria por M. pneumoniae es la activacin del complement
o por la va alternativa y la fagocitosis de las bacterias a nivel de la superfici
e de las mucosas. Determinados componentes galactosilados y glucosilados present
es en la superficie de la membrana celular del microorganismo parecen tener la c
apacidad de inducir la produccin de anticuerpos, de los que los ms impodantes son
las IgA. que se encuentran predominantemente en las secreciones propias de la mu
cosa.
La manifestacin ms comn de la enfermedad causada por M. pneumoniae es la Iraqueobro
nquitis. La neumona, que aparece aproximadamente en un tercio de personas infecta
das, comienza de forma gradual entre dos y tres semanas despus de la exposicin al
microorganismo, con fiebre, malestar, dolor de cabeza, faringitis y una tos seca
persistente no productiva (Baum. 2000). Es frecuente una sinusitis clnicamente i
naparente, y tambin puede aparecer miringitis. Las radiografas de trax muestran una
bronconeumona unilateral en el lbulo inferior del pulmn y, ocasionalmente, infiltr
ados dilusos bilaterales. El recuento de leucocitos en sangre perifrica es normal
inicialmente. para aumentar a medida que la enfermedad avanza. En aproximadamen
te un 1 5 % de los afectados, aparece una erupcin cutnea maculopapular y. con meno
r frecuencia, vesicular, unos pocos das despus del comienzo de la enfermedad. Sin
tratamiento antimicrobiano la fiebre desaparece entre los 2 y 14 dias. pero el m
alestar general, la tos y las anomalas radioscopias persisten entre dos y seis se
manas. En un bajo porcentaje de nios y adultos, la neumona es lo suficientemente g
rave como para requerir hospitalizacin: en estos pacientes pueden aparecer absces
os pulmonares, derrames pleurales, infecciones bactenanas secundarias, bronquiec
tasias o recadas clnicas. Las manifestaciones extrapulmonares son poco frecuentes
e incluyen anemia hemoltica clnicamente aparente, asociada tpicamente con ttulos muy
elevados de aglutminas fras: eritema multiforme, eritema nodoso y urticaria; enc
efalitis, meningoencefalitis, mono o polineuritis y meningitis: miocarditis y pe
ricarditis, y artralgias y. raramente, artritis (Baum. 2000; Cassel. 1981: Ponka
. 1979)
Micoplasmas genitales Epidemiologa
En los nios, la colonizacin con micoplasmas genitales liene lugar en el momento de
l nacimiento cuando el feto pasa por el canal del parto infectado y. por lo gene
ral, persiste un poco menos de dos aos. Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma homin
is pueden ser aislados del tracto genital de hasta un 30% de las nias (con menor
frecuencia a partir del tracto genital de nios), y tambin pueden aislarse a partir
de nariz y garganta de un 15% de nios y nias (Klein. 1969). En un estudio se enco
ntr que el 20% de las nias prepberes estaban colonizadas con ureaplasmas y un 6% co

n M. hominis. aunque en nios prepberes los micoplasmas genitales fueran aislados m

u y raramente (Hammerschlag. 1978). La colonizacin con micoplasmas genitales des
pus de la pubertad es consecuencia del contacto sexual. Alrededor del 60% de muje
res aparentemente sanas, sexualmente activas, son portadoras de U. urealyticum e
n su vagina, mientras que un 20% lo son de M. hominis.
Manifestaciones
clnicas
Ureaplasma urealyticum es responsable de algunos casos de uretritis n o gonoccica
; ha sido asociado con fiebres posparto, corioamnionitis y nacimientos con peso
bajo, aunque no se ha probado que exista una relacin causal en este ltimo caso: y
tambin es raramente responsable de casos de uretrocistits crnica en individuos inmu
nodepnmidos (Taylor-Robinson. 1980. 1985: Casell. 1986). Mycoplasma hominis es u
no de los agentes causales de fiebre posparto y postaborto; y tambin es la causa,
aunque con m u y poca frecuencia, de casos de bacteriemia. artritis, peritoniti
s, meningitis, osteomielitis e infecciones de las heridas, principalmente en per
sonas inmunocomprometidas, aunque tambin en otras que no manifiestan, aparentemen
te, deficiencia inmunolgica subyacente alguna (Taylor-Robinson, 1980: DeGirolami.
1982: McMahon. 1990).

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

1085
Diagnstico de laboratorio Mycoplasma pneumoniae
Las muestras recomendadas para llevar a cabo el diagnstico de la infeccin causada
por M. pneumoniae son exudados de garganta tomados con hisopo y suero, aunque ta
mbin son aceptables el H u i d o del lavado broncoalveolar, esputo y biopsias de
tejido pulmonar. Un test serolgico no especfico que puede proporcionar informacin ti
l es la deteccin de aglutinmas fras, que son anticuerpos del tipo IgM (rente al an
tgeno I de los eritrocitos humanos. Estas aglutinmas aparecen al final de la prim
era o comienzos de la segunda semana de la enfermedad, al menos en la mitad de l
as personas infectadas, aunque su presencia no es diagnstico de infeccin por M. pn
eumoniae. El diagnstico definitivo se basa en la deleccin del microorganismo, o de
IgM especficas en suero, o en la observacin de un incremento de cuatro veces en e
l ttulo de IgG entre muestras de suero tomadas en la fase aguda y de convalecenci
a de la enfermedad. Para aislar M. pneumoniae. se inocula un sistema bifsico de c
ultivo que se incuba a 35C-37"C hasta un mximo de tres semanas en el interior de u
n contenedor sellado, en una estufa normal. Los cultivos se examinan al microsco
pio (x40) una o dos veces por semana para detectar en los mismos la presencia de
las tpicas colonias que recuerdan a un "huevo frito" (presentan una zona central
densa, rodeada de un rea menos compacta), embebidas en la matriz del agar del me
dio de cultivo. Tales colonias, tpicas de M. pneumoniae. deben ser analizadas par
a comprobar su carcter hemolitico {M. pneumoniae es |J-hemoltico) segn el siguiente
procedimiento: se prepara un agar al 1% en solucin salina al 0.85% que se mantie
ne fundido a la temperatura de 50 C. mezclndose a continuacin con sangre de oveja
o de cobaya para obtener una concentracin final de eritrocitos del 5%; seguidamen
te se deposita un volumen de la mezcla final resultante sobre la superficie del
medio de cultivo donde aparecieron las colonias, para obtener, tras la solidific
acin del agar, una delgada capa que cubra las mismas; el cultivo es reincubado du
rante 24 horas, examinndose seguidamente para detectar los halos de hemolisis com
pleta alrededor de las colonias. Debido a que el aislamiento de M. pneumoniae pu
ede requerir vanas semanas, los test rpidos resultan ms tiles para el diagnstico. Po
r ejemplo, la deteccin de IgM especficas en una nica muestra de suero es indicativa
de infeccin aguda. Si lo que se determina son IgG, entonces deben analizarse mue
stras de suero tomadas durante la lase aguda y de convalecencia de la enfermedad
, para observar un incremento de cuatro veces o superior en el titulo de anticue
rpos especficos.
se tien con una o dos gotas de una solucin de CaCI.-urea depositadas directamente
sobre la superficie del medio. Las colonias de U. urealyticum tienen un dimetro d
e 15 pm-16 pm y se tien de un color marrn oscuro en unos 5 minutos al entrar en co
ntacto con la solucin anterior. En caldo U. U. urealyticum provoca un cambio en e
l pH del medio, haciendo que el color del m i s m o vare de amarillo a rojo. En e
se m o m e n t o debe sembrarse por estria con el asa de platino una muestra del
cultivo en medio lquido en una placa con medio slido, para llevar a cabo el aisla
miento del microorganismo.
Tratamiento
La terapia antimicrobiana no est recomendada en el caso de faringitis o traqueobr
onquitis causada por iVf. pneumoniae. Una tetraciclma o un macrlido son antibitico
s adecuados para el tratamiento de la neumona inducida por M. pneumoniae. aunque
la terapia no alecta, aparentemente, a la transmisin del microorganismo. Las tetr
aciclinas son eficaces frente a M. hominis y la mayor parte de cepas de U. ureal
yticum. Alrededor de un 10% de ureaplasmas son, sin embargo, resistentes a la te

traciclina: las infecciones causadas por cepas resistentes responden bien, por l
o general, a la entromicma (Taylor-Robinson. 1986) o alguno de los nuevos antimi
crobianos de los grupos de los macrlidos o las quinolonas. BIBLIOGRAFA
Micoplasmas
genitales
Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis pueden recuperarse a partir del mate
rial obtenido a partir de la vagina, uretra o endocrvix con un hisopo, o bien de
muestras de orina, sangre, material de abscesos, secreciones prostticas, semen o
biopsias de tejidos. Se pueden utilizar varios sistemas de cultivo para llevar a
cabo el aislamiento de los micoplasmas genitales (Clyde. 1984; Yajko. 1984; Woo
d. 1985: Phillips. 1986). Tradicionalmente. se han utilizado procedimientos sepa
rados para cada especie (caldo U y agar U para U. urealyticum y caldo H y agar H
para M. hominis). debido a que el pH ptimo de crecimiento de los dos microorgani
smos es diferente (pH entre 5,5 y 6.5 para U. urealyticum y entre 6 y 8 para M.
hominis). Sin embargo, en la actualidad existen sistemas nicos de cultivo que per
miten detectar con gran eficacia ambas bacterias (Yajko, 1984; Wood. 1985: Phill
ips, 1986). Los cultivos en medio lquido se incuban en aerobiosis en tubos sellad
os. Los cultivos en medios slidos se incuban en anaerobiosis o en una atmsfera que
contenga entre el 5% y el 7% de C0 . y son examinados diariamente con el micros
copio. M. hominis tambin crece en agar sangre de ove|a. donde forma colonias visi
bles, no hemolticas. y en la mayor parte de medios lquidos para hemocultivo. aunqu
e en stos no produce evidencia visible y detectable de su crecimiento.
;
Las colonias de M. hominis. con un dimetro entre 200 pm y 300 pm y la tpica forma
de "huevo frito", aparecen tras cinco das, o incluso menos, de incubacin. En un me
dio liquido que contenga rojo de fenol como indicador de pH y un 0.1% de arginin
a, M. hominis transforma la arginina en amoniaco, provocando un cambio de color
en el medio, que pasa de rojo a amarillo. Las placas de agar U son examinadas di
ariamente durante cuatro das, y en el cuarto da
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CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS. RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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C A P T U L O
50
Bacteriologa mdica
Barbara S. Reiner, Ph.D. Gail L. Woods, M.D.
PROCESADO DE LA MUESTRAS Tincin de Gram Tcnicas de cultivo BACTERIAS DE IMPORTANCI
A MDICA Cocos grampositivos
1088
Bacilos grampositivos Bacterias gramnegativas Bacterias anaerobias
1091
BIBLIOGRAFA
1118
Es posible r e c u p e r a ru n aa m p l i a variedad de especies b a c t e r i
a n a s a partir de los diferentes tipos de especmenes clnicos. P a r ap o d e r v
alorar correctam e n t e la i m p o r t a n c i ad e s d e el p u n t o de vista
clnico de e s t o s organismos, es esencial t e n e ru np e r f e c t oc o n o c
i m i e n t od el a microbiota b a c t e r i a n aq u e existe n o r m a l m e
n t e en las diferentes localizaciones anatmicas de d o n d ep u e d e n p r o c
e d e r las m u e s t r a s clnicas q u e van a ser analizadas. En la T a b l a 5
0-1 se m u e s t r au n listado d et o d o s aquellos m i c r o o r g a n i s m
o sq u ep u e d e n encontrarse en diversos lugares y superficies del c u e r p
oh u m a n o sano. En algunos casos, el nmero de o r g a n i s m o s existentes p
u e d e ser e x t r e m a d a m e n t e elevado: p o r ejemplo. 10 organismos/c
nv en la piel. 10 organismos/ml en las s e c r e c i o n e s orales y 10'' organ
ismos'g en el c o n t e n i d o intestinal (colon). En c o n s e c u e n c i a ,
e sm u yi m p o r t a n t eq u el am u e s t r a obtenida t e n g au n a contami
nacin mnima con m i c r o o r g a n i s m o s perteneciente a la microbiota normal
. E s t e objetivo es difcil de lograr, p e r op u e d e conseguirse si se utiliz
an los procedimientos tcnicos apropiados. D i c h o s procedimientos, junto con l
as tcnic a sd ep r o c e s a m i e n t o utilizadas p a r ai n c r e m e n t a rl
a eficiencia e nl ar e c u p e racin de m i c r o o r g a n i s m o s patgenos, s
e p r e s e n t a n en el Captulo 57. E s t e captulo c o m i e n z a con una b r
e v e descripcin de los mtodos de laboratorio utilizados p a r a el p r o c e s a
m i e n t o de la muestra, orientado h a c i a el cultivo b a c teriano, s e g u
i d a de un anlisis m u c h om a s detallado sobre las especies bacterianas cons
ideradas generalmente c o m o patgenas del hombre.
6 v
PROCESADO DE LA MUESTRAS Tincin de Gram
Es difcil e n c o n t r a ra r g u m e n t o s en c o n t r a del h e c h o de qu
e el e x a m e n d i r e c t o de un espcimen clnico bajo tincin de G r a mr e p r
e s e n t a uno de los mtodos con m a y o r valor y utilidad entre los e m p l e
a d o s en el laboratorio de Tcnicas de cultivo microbiologa. Los resultados de la
tincin de G r a m proporcionan rpidamente una informacin valiosa que p u e d e ser
utilizada no slo por el clnico p a r a La seleccin de los m e d i o s de cultivo s
e realiza t e n i e n d o en c u e n t a que h a y elegir la terapia antimicrobi
ana apropiada, sino tambin por el tcnico de laboque proporcionar las condiciones pt
imas de crecimiento a los patgenos que ratorio, p a r a valorar la calidad de la
m u e s t r a y la profundidad c o n la q u ed e b ep u e d e ne n c o n t r a r
s e comnmente en una d e t e r m i n a d a localizacin o en un abordarse la carac
terizacin de algunos de los microorganismos aislados en espcimen concreto. H a y q

ue p r e s t a r una atencin e s p e c i a l a los requericultivo. En general, se

c o n c e d e una m a y o r atencin a aquellos o r g a n i s m o s m i e n t o s
nutricionales d e las bacterias a s o c i a d a sc o nu nd e t e r m i n a d op
r o c e s o que esln p r e s e n t e s en nmero elevado en especmenes que c o n t
i e n e n infeccioso, asi c o m o a la n e c e s i d a d de t e n e r que aislar
ciertas b a c t e r i a s patabundantes clulas blancas sanguneas (CBS) q u e a los
que se encuentran g e n a s que se e n c u e n t r a nf o r m a n d o una pobla
cin m i x t a con o t r o sm i c r o o r en bajo nmero en muestras en las que las
CBS estn ausentes. g a n i s m o s de la m i c r o b i o t a autctona o comensal.
Por tanto, p u e d e ser n e c e sario incluir m e d i o s selectivos y diferenc
iales junto c o n los m e d i o s de P a r ap r e p a r a r una extensin (frotis)
s o b r el a que realizar l a tincin, d e b e enriquecimiento estndar. repartirse
una alcuota de la parte ms p u r u l e n t aos a n g u i n o l e n t a de la m u
e s t r a s o b r e la s u p e r f i c i e de un p o r t a o b j e t o s limpio,
de tal f o r m a que la extensin preE la g a r sangre e su nb u e nm e d i od e
cultivo general e ne lq u ep u e d e n cres e n t e reas de diferente e s p e s o
r . En el c a s o de fluidos o r g a n i c e s originariamen- cer una gran dive
rsidad de bacterias y permite, adems, p o n e r de m a n i f i e s t o
te estriles, se p u e d e utilizar u n ac i t o c e n t r i f u g ap a r ac o n c
e n t r a r los m i c r o o r g a n i s m o sp r e s e n t e s en el espcimen de
10 a 1 0 0v e c e s (Peterson, 1988), U n av e z r e a l i z a d a la extensin s
e d e j a que s e q u e al aire, se fija m e d i a n t et r a t a m i e n t o co
n etanol. o por m e d i o de c a l e n t a m i e n t o suave, y se tie s e g u i
d a m e n t e con los r e a c t i v o s de la tincin de G r a m (cristal vicela, s
olucin de y o d o lugol], a l c o h o ly safranma). D e p e n d i e n d o de la e
s t r u c t u r a de la p a r e dc e l u l a r caracterstica de c a d a categora,
las b a c t e r i a sg r a m p o s i t i v a s resistirn la accin d e c o l o r a
n t e del m e t a n o l y conservarn el c o l o r prpura del cristal violeta, m i
e n t r a s que las g r a m n e g a t i v a s quedarn d e c o l o r a d a s y se
teirn de rojo con la safranina. Una vez realizada la tincin, las e x t e n s i o n
e s se observan con un objetivo d e bajo a u m e n t op a r ad e t e c t a r es
tructuras grandes, c o m o larvas d en e m a t o dos, espirales de C u r s c h m
a n n . granulos y partculas, m i c r o c o l o n i a s bacterianas y clulas o f
o r m a s fngcas. A continuacin, se e m p l e a el objetivo de inmersin en aceite p
a r ad e t e r m i n a r el tipo de bacterias presentes. D e b i d oa que es nec
esario que e x i s t a una concentracin de 10* de m i c r o o r g a n i s m o s p
o r mi en la muestra, para q u ep u e d a observarse al m e n o s1b a c t e r i
ap o r c a d ac a m p o microscpico c u a n d o se utiliza el objetivo de inmers
in (x 1.000), el frotis d e b ee x a m i n a r s em e t i c u l o s aye x h a u s
t i v a m e n t ep a r ap o d e rd e t e c t a r aquellos m i c r o o r g a n i
s m o s que estn en bajo nmero en el espcimen. D e b ed e t e r m i n a r s e el t
amao, la f o r m a y el tipo de tincin de G r a m de las b a c t e r i a so b s e
r v a d a s y dar u n a desenpcin lo ms d e t a la d ap o s i b l ed e la o b s e
r v a cin realizada; por e j e m p l o , indicar en el i n f o r m e que se h ad
e t e c l a d o la p r e s e n c i ad ec o c o sg r a m p o s i t i v o se n par
ejas, q u es ep a r e c e n a Streptococcus pneumoniae (Lmina 50-1), r e s u l t
a de m u c h a ms a y u d a que i n d i c a rs i m p l e m e n t eq u es eh a no
b s e r v a d oc o c o sg r a m p o s i t i v o sf o r m a n d oc a d e n a s .D
e b e i n d i c a r s eyc u a n t i f i c a r s e tambin l ap r e s e n c i a de
l e u c o c i t o s o hemates, asi c o m oc u a l q u i e rp o s i b l eb a c t
e r i ai n t r a c e l u l a rq u ep u d i e r ao b s e r v a r s e .

CAPTULO 50 Tabla 50-1

BACTERIOLOGA MDICA
1089
Frecuencia relativa de aislamiento ++ ++++ + ++++ ++++ ++++ + + +++ ++
++++ +
M i c r o o r g a n i s m o s q u e l o r m a n parte de la microbiota n o r m a
l de las p e r s o n a s sanas Microorganismos detectados Staphylococcus aureus
Staphylococcus apidermidis Eslreplococos del grupo vindans Especies del gnero Co
rynebacterium Propionibacterium acnes Malassezia lurlur Especies del gnero Candid
a Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Estr
eptococos del grupo viridans Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero La
ctobacillus Especies del gnero Actinomyces Especies del genero Peptostreptococcus
Especies del gnero Neisseria Haemophilus influenzae Especies del gnero Haemophilu
s Especies del gnero Bacteroides Especies del gnero Porphyromonas Especies del gner
o Prevotella Especies del gnero Fusobacterium' Especies del gnero Veilionella Espe
cies del gnero Treponema Especies del gnero Candida Staphylococcus aureus Staphylo
coccus epidermidis Streptococcus pneumoniae Estreptococos del grupo viridans Esp
ecies del gnero Neisseria Especies del gnero Haemophilus Staphylococcus epidermidi
s Especies del genera Pseudomonas Enterobacteriaceae Staphylococcus aureus Staph
ylococcus epidermidis Especies del gnero Haemophilus Bacterias supervivientes del
tracto respiratorio superior y de los alimentos Especies del gnero Especies del
gnero Especies del gnero Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Especies del gnero Enter
ococcus Lactobacillus Clostridium
Localizacin a n a t m i c a Piel
Boca y orolaringe
++ +
+
++
+
+ ii
++
++ ++++ ++++ +++ ++
Nariz
++
++++ +
++
+ + ++++ +
Oido externo
+
+
Conjuntiva
++++
Esfago y estmago Intestino delgado

++
+++
++
++
+++
Mycobacterium
Intestino grueso'
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Estreptococos del grupo B Estre
ptococos del grupo viridans Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Lac
tobacillus Especies del gnero Clostridium Especies del gnero Actinomyces Especies
del gnero Peptostreptococcus Especies del gnero Pseudomonas Otros no lermentadores
Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Especies del gnero Treponema Especies del gnero
Mycobacterium Especies del gnero Candida Especies del genero Mycoplasma Ureaplas
ma urealyticum Staphylococcus epidermidis Estreptococos del grupo B Estreptococo
s del grupo viridans Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Lactobacil
lus Especies del gnero Clostridium Especies del gnero Actinomyces
++ +
+
+
++
++ +++ ++++
+
++++ +
+
++++ ++++ + + + +/+/+ + +
+
Vagina
++++ ++
(La tabla continua en la pag. siguiente)

1090
c
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 50 -1 M i c r o o r g a n i s m o s q u e f o r m a n parte de la microbio
ta normal de las p e r s o n a s s a n a s (Continuacin) Localizacin a n a t m i c
a Microorganismos detectados Frecuencia relativa de aislamiento
Vagina (cont.)
Especies del gnero Bifidobacterium
Propionibacterium
acnes
Especies del gnero Peptostreptococcus Especies del gnero Neisseria Especies del gne
ro Acinetobactcr Enterobactenaceae
+ + + + + + + ++
*/Gardnerella
vaginalis
Bacteroidaceae Especies del gnero Candida Genitales externos y extremo distal de
la uretra Microbiota cutnea (vase ms arriba) Especies del gnero Mycoplasma
Ureaplasma
urealyticum
Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Peptoslreplococcus Enterobacter
iaceae Baderoidaceae Especies del gnero Mycobacterium'
+/+ + +/+ ++
"Menos prevalento en individuos desdentados. 'El 95% o mas de los microorganismo
s son anaerobios obligados. Los protozoos pueden estar prsenles en personas que v
iven en paises subdesarroliados 'Muy frecuente on ol esmegma de varones no circu
ncidados +-C+ = casi siempre presente: +++ usualmente presente + = presente con Ir
ecuencia: + = prsenle ocasionalmente: +/- = presente con muy poca frecuencia. Ada
ptada de Tramonl EC General or nonspecilic host delense mechanisms En Mandell GL
. Douglas RG Jr Bennett JE (eds) Principles and Praclice ol Inlectious Diseases
3' ed Nueva York. Churchill Livingstone. 1990. pag 33. con permiso.
la actividad hemoltica de los microorganismos sobre los hemates presentes en el mi
smo. Es posible crear medios selectivos para bacterias grampositivas como el aga
r CNA, aadiendo sustancias como colistina y cido nalidixico. o el agar PEA. que co
ntiene alcohol feniletlico. en donde el crecimiento de los bacilos gramnegativos
queda inhibido. El calentamiento de la sangre durante la preparacin del medio par
a obtener agar chocolate y la incorporacin de suplementos vitamnicos conducen a la
creacin de un medio enriquecido que contiene hemina (factor X) y NAD (nicotinami
da-adenina-dinucletido; factor

V) disponibles, sustancias cuya presencia es necesaria para poder llevar a cabo

el aislamiento de especies del gnero Haemophilus y otras bacterias delicadas. Los
bacilos gramnegativos pueden separarse de los grampositivos utilizando sustanci
as como la bilis y diversos colorantes que estn presentes en ciertos medios como
el agar MacConkey. en el que es posible, adems, distinguir bacterias lermentadora
s y no termentadoras de la lactosa en funcin del color de las colonias que forman
las mismas en dicho medio. En consecuencia, el agar MacConkey tiene carcter sele
ctivo y diferencial. En la
Tabla 50-2 Espcimen
Medios de cultivo r e c o m e n d a d o s para el aislamiento de m i c r o o r g
a n i s m o s a partir de diferentes tipos de e s p e c m e n e s M e d i o s p
ara bacterias aerobias y a n a e r o b i a s facultativas
THIO AS MAC ASC Otros
Medios para bacterias anaerobias*
BBA LKV
Fluidos Cefalorraqudeo Abdominal Pleural Sinovial Heridas Hisopo Aspirado Biopsia
de tejido Vas respiratorias Garganta Esputo Lavados bronquiales Vias genitourina
rias Crvix. vagina Otero, fondo de saco Prstata Uretra Orina Miccin (toma limpia) A
spirado suprapUbico Heces
X X

X

X

X X

X
X
X
X

X
X X
X" X X X X
X

ASS

X
X X MTM

X MTM
X
i
X

<
:
X
X
EH GN Campy
'Solo para muestras obtenidas a partir de una fuente apropiada y enviadas al lab
oratorio en un recipiente para anaerobios El caldo tioglicolalo (THIO) est recome
ndado slo para el fluido cerebroespinal procedente de una desviacin ventncular y e
l liquido de dilisis pentoneal ambulatoria continuada. ++Se puede utilizar agar A
S, pero es preferible emplear el agar ASS. THIO = caldo lioglucolato: AS = agar
sangre MAC = agai MacConkey ASC - agar sangre chocolate; HE = agar entrico Hektoe
n; GN = calcio de enriquecimiento: BBA = agar Brucella con sangre LKV = agar san
gre lacado con vancomicina y canamicma; ASS = agar selectivo para estreptococos:
MTM = medio de ThayerMar tin modificado; Campy = medio selectivo para Campyloba
cter. Adaptada de Washington JA II (ed ) Laboralory Proceduies m Clinical Microb
iology. 2" ed. Nueva York. Springer-Verlag, 1985. pp 95-123. con permiso.

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1091
Tabla 50-3 Duracin d e la incubacin d e los cultivos bacterianos Tipo de espcimen S
angre Fluidos Abscesos, heridas Tejidos Vias respiratorias Garganta Esputo Lavad
o bronquial Vas genitourinarias Crvix, vagina tero, tondo de saco Prstata Uretra Ori
na Material fecal Anaerobios Brucella Actmomyces Tipo de incubacin antes de consi
derar el cultivo negativo (das) 5-7 2-4 2 2-4' 2 1 2' 2 2-4' 2 2 : 1-3' 4-7 21-30
14-21
incubacin en su interior que mantienen la temperatura adecuada. Cada uno de los d
iferentes sistemas de incubacin para anaerobios tiene sus ventajas e inconvenient
es pero, en general, todos tienen una eficacia semejante para el aislamiento de
bacterias anaerobias de inters clnico Los cultivos bacterianos deben examinarse si
stemticamente tras un perodo de incubacin entre 18 y 24 horas. La excepcin a esta no
rma son los cultivos en anaerobiosis que se examinan a las 48 horas para permiti
r que las bacterias anaerbicas que son de crecimiento ms lento produzcan colonias
que puedan ser detectadas a simple vista. En la Tabla 50-3 se muestran los tiemp
os de incubacin recomendados para los diferentes tipos de cultivos. En general, l
os medios slidos se incuban durante 48 horas, mientras que para los medios lquidos
la incubacin puede prolongarse entre 24 y 48 horas ms. Hay que elaborar un inform
e preliminar tras examinar por primera vez el cultivo, que se va actualizando a
medida que se va disponiendo de nueva informacin adicional. Algunos resultados (p
. ej., observacin positiva de microorganismos bajo tincin de Gram en muestras de s
angre o lquido cefalorraqudeo [LCR]. aislamiento de un microorganismo cuya deteccin
implica que hay que tomar medidas efectivas para controlar la infeccin) son remi
tidos al centro sanitario inmediatamente despus de ser obtenidos. Los informes fi
nales se redactan una vez que se han completado todas las determinaciones analtic
as a partir del microorganismo aislado en cultivo.
'Las placas con medios solidos se eliminan despus de 48 horas; los tubos con medi
os lquidos se conservan durante 4 das "Los cultivos iniciales y tos subcultivos en
caldo enriquecido se examinan Iras 1 8 a 24 horas de incubacin para detectar col
onias lactosa negativas, si estas no estn presentes, los cultivos se consideran n
egativos para especies de Samonella y de Shigella Las placas para el aislamiento
de Campylobacter deben incubarse durante 72 horas.
BACTERIAS DE IMPORTANCIA MEDICA Cocos grampositivos Staphylococcus
Tabla 50-2 se muestra una gua para seleccionar los medios de cultivo que deben ut
ilizarse para el aislamiento de bacterias a partir de diferentes tipos de muestr
as clnicas. Los cultivos bacterianos se incuban generalmente a 35 C y se inspecci
onan inicialmente tras ser incubados entre 18 y 24 horas. La presencia de una co
ncentracin del 5 % al 10% de C0 estimula el crecimiento, y puede ser incluso esen
cial para que se produzca el mismo, en el caso de bacterias como Neisseria gonor
rhoeae. Haemophilus influenzae y S. pneumoniae, por lo que esta premisa en las c
ondiciones de incubacin debe cumplirse siempre que sea factible. Las excepciones
a esta recomendacin estn representadas por aquellos cultivos crecidos en medios di
ferenciales y selectivos (p. ej.. el agar XLD [xilosa-lisina-desoxicolato] o aga
r entrico Hektoen [EH]). en los que el hecho que permite distinguir entre distint
os tipos de colonias es un cambio en el pH, que puede verse afectado por la pres
encia de C0 .
? 2
Caractersticas. Los estafilococos son bacterias de morfologa esfrica, catalasa posi

tivas, que en los frotis teidos aparecen en grupos que semejan racimos de uvas (Lm
ina 50-2) Crecen bien en cualquier medio de cultivo que contenga peptona en cond
iciones tanto aerbicas como anaerbicas. pueden producir hemolisis en agar con sang
re de diferentes especies animales y formar pigmentos de color amarillo o anaran
jado cuando crecen en medios slidos. El crecimiento de los estafilococos se obser
va fcilmente en placas de agar sangre o en diferentes tipos de medios nutritivos
lquidos. Un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus aureus contiene
entre un 7.5% y un 10% de NaCI y manitol. Las pruebas que permiten distinguir l
os estafilococos de los micrococos (que generalmente son considerados como no pa
tgenos) se recogen en la Tabla 50-4 (Kloos. 1999). S. aureus se distingue de otra
s especies del gnero p o r su capacidad para producir coagulasa, enzima que es ca
paz de coagular el plasm a sanguneo. Se han identificado dos formas antignicamente
distintas de la coagulasa producida por la bactena: una de las formas que se en
cuentra ligada a la pared celular, recibe el nombre de factor de agregacin y se d
e t e c t a mediante la prueba de la coagulasa en portaobjetos, mientras que la
otra es la forma libre o no ligada y se detecla mediante la prueba de la coagul
asa en tubo. Manifestaciones clnicas y patogenia. S. aureus puede encontrarse for
mando parte de la flora autctona de la piel, ojos, vas respiratorias superiores, t
racto gastrointestinal, uretra y. con menor frecuencia, vagina En consecuencia,
la infeccin puede tener un origen endgeno o exgeno. Los factores que juegan un pape
l importante en el desarrollo de infecciones por S. aureus son las hendas y disc
ontinuidades en la superficie de la piel y mucosas, la presencia de
Para la recuperacin de bacterias anaerobias, los medios de cultivo deben colocars
e, una vez inoculados, en un ambiente anaerbico lo ms rpidamente posible. Hay dispo
nibles varios tipos de sistemas para el cultivo de anaerobios. Uno de ellos es l
a jarra de anaerobios, en la que se aade un pequeo volumen de agua en el interior
de un sobre que contiene unos compuestos qumicos que generan C0 y H al entrar en
contacto con el agua. El O. que queda en el interior de la jarra en el momento d
e ser cerrada es convertido en agua al combinarse con el H, por la accin cataltica
del metal paladio que se encuentra recubriendo unas lentejas de aluminio, que s
e hallan en el interior de un receptculo adosado a la cara interna de la tapa de
la jarra. Una modificacin de este sistema consiste en una bolsa de plstico transpa
rente, diseada para albergar una sola placa de agar nutritivo, que contiene su pr
opio generador de K, y catalizador de paladio individuales.
2 ?
Otra posibilidad para el cultivo en condiciones anaerbicas est representada por la
cmara de anaerobios, que consiste en una cabina grande de plstico transparente, c
errada hermticamente, y en cuyo interior se introduce una mezcla gaseosa carente
de oxgeno, compuesta por nitrgeno, hidrgeno y dixido de carbono. Todo el material qu
e ha de ser manipulado (muestras, placas, tubos) se introduce o se extrae de la
cmara a travs de un cierre de intercambio gaseoso. L a atmslera anaerbica se mantien
e en el interior de la cmara gracias al hidrgeno de la mezcla gaseosa y a la accin
cataltica de las partculas de paladio. Todas las manipulaciones en el interior de
la cmara se realizan a travs de unos guantes de neopreno que estn sellados a la par
ed frontal de la cmara o. en el caso de los sistemas "sin guantes'. a travs de ori
ficios en donde estn acopladas unas mangas de material plstico que se cien ajustada
mente a los antebrazos. Las cmaras poseen estulas de
Tabla 50-4 P r u e b a s para diferenciar los estafilococos d e los micrococos P
rueba Crecimiento en anaerobiosis en medio con glucosa Susceptibilidad a la liso
stafina Produccin de cidos en aerobiosis a partir de glicerol Oxidasa modificada p
ara la deteccin de citocromo c Susceptibilidad a la bacitracina Estafilococos Mic
rococos
+ S +
R

+
R
S

1092
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
7. Otras, p. ej.. abscesos viscerales imraabdominales: bazo, hgado, pncreas Figura
50-1. Secuencia patognica de la infeccin p o r Staphylococcus aureus. (De Cohen J
O [ed.]: The Staphylococci. Copyright 1972. reproducida por J o h n Wiley & Sons
. Inc.) cuerpos extraos e implantes, una enfermedad vinca previa, haber sido some
tido con anterioridad a una terapia antimicrobiana y padecer enfermedades subyac
entes con defectos en la inmunidad celular o humoral. Las infecciones causadas p
or S. aureus pueden afectar a una gran variedad de rganos y sistemas (Fig. 50-1).
Entre las ms comunes estn aquellas que afectan a la piel y sus discontinuidades,
tales como el imptigo. la foliculitis, la mastitis y las infecciones de heridas q
uirrgicas S. aureus es una de las causas principales de bacteriemia en pacientes
hospitalizados y puede provocar endocarditis, particularmente en personas que pa
decen valvulopatas del lado izquierdo y en consumidores de drogas por va intraveno
sa. Esta bacteria tambin es la principal responsable de abscesos epidurales y de
flebitis supurativa intracraneal, y puede recuperarse a partir de abscesos cereb
rales que aparecen tras un traumatismo. La meningitis causada por S. aureus es p
oco frecuente y generalmente aparece como consecuencia de un traumatismo ceflico
o un procedimiento neuroquirrgico. S. aureus es responsable de muchos casos de os
teomielitis, es la causa ms comn de artritis sptica en nios prepberes y ocasionalment
e provoca artritis sptica en adultos. En las zonas tropicales puede causar absces
os profundos espontneos en los msculos que afectan, predominantemente, a personas
desnutridas que padecen una infeccin parasitaria concomitante (Chiedozi, 1979). A
simismo, S. aureus es una causa frecuente de neumona comunitaria, generalmente as
ociada a la aspiracin de bacterias endgenas de la nasofaringe. Entre los factores
que predisponen se encuentran la infeccin por el virus del sarampin o de la influe
nza A, la fibrosis quistica y un estado de mmunodeficiencia. Sin embargo, la neu
mona por S. aureus en la poblacin general es poco frecuente. Por ltimo, entre las i
ntecciones en el tracto urinario causadas por esta bacteria se encuentran la pie
lonefritis y los abscesos parenquimatosos y perirrenales. Diversos factores jueg
an un papel relevante en la virulencia de S. aureus. Si est presente, la cpsula ti
ene propiedades antilagocitanas. Los peptidoglucanos de la pared celular tienen
actividad endotxica y estimulan la liberacin de atocinas por los macrfagos, la acti
vacin del complemento y la agregacin de las plaquetas. La protena A. una sustancia
inmunolgicamenle activa que se encuentra formando parte de la estructura de la pa
red celular, tiene propiedades antilagocitarias que dependen de su capacidad par
a interaccionar con el fragmento Fe de la molcula de las mmunoglobulmas (lg) G. O
tras protenas de superficie denominadas componentes de la superficie microbiana s
on capaces de reconocer ciertas molculas adhesivas de la matriz extracelular (MSC
RAMM) y pueden jugar un papel importante en la capacidad de los estafilococos pa
ra colonizar los tejidos del hospedador. S. aureus produce numerosas toxinas. La
exotoxma TSST-1 es responsable del sndrome del shock txico y las enterotoxinas (d
e la A a la E) causan intoxicaciones alimentaras. Las toxinas exfoliantes, las to
xinas epidermoliticas A y B, causan el enrojecimiento y desprendimiento de la pi
el que se observan en el denominado sndrome de la piel escaldada. Tambin producen
varias enzimas hidroliticas (proteasa. lipasa y hialuronidasa) que destruyen los
tejidos del hospedador, lo que probablemente facilita la diseminacin de la bacte
ria y el avance de la infeccin.

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1093
L a s enfermedades directamente relacionadas con la actividad de toxinas produci
das p o r S. aureus son el sndrome de la piel escaldada, las intoxicaciones alime
ntarias y el sndrome del shock txico. El sndrome de la piel escaldada se da en bebs
y en nios muy pequeos infectados por una cepa de S, aureus productora de toxinas e
xfoliativas. La enfermedad comienza de forma brusca con eritema cutneo, que en do
s o tres das es seguido por la acumulacin de lquido por debajo de la piel que provo
ca su separacin, por lo que cualquier friccin leve puede hacer que se desprendan g
randes colgajos o capas de la piel, dejando reas en carne viva que eventualmente
pueden cicatrizar completamente. La intoxicacin alimentana estafilococo que cursa
con nauseas, vmitos, retortijones abdominales y diarrea aparece entre una y seis
horas despus de haber ingerido alimentos contaminados con la enterotoxina estafi
loccica preformada. El sndrome del shock txico es una enfermedad multisislmica que a
fecta a aquellos individuos que no tienen anticuerpos contra la TSST-1 y han sid
o colonizados por cepas de S. aureus productoras de la toxina TSST-1 o. mas rara
mente, de enterotoxinas B o C. La enfermedad es ms frecuente en mujeres de entre
1 5 y 25 aos que utilizan tampones durante la menstruacin, aunque tambin puede dars
e en otras personas, sin que exista asociacin alguna con la regla, como es el cas
o de mujeres durante el perodo posparto, individuos que tienen una herida quirrgic
a o algn otro tipo de infeccin focal, o personas que han sufrido una intervencin qu
irrgica en la nariz o senos nasales. El sndrome del shock txico comienza de forma sb
ita con fiebre, mialgias, vmitos y diarrea: a estos sntomas les sigue hipotensin, s
hock hipovolmico y una erupcin cutnea eritematosa que afecta, sobre todo, a las pal
mas de las manos y a las plantas de los pies y que termina por producir una desc
amacin de la piel al cabo de una a dos semanas. El diagnstico es clnico, no siendo
necesario llevar a cabo el aislamiento de S. aureus para confirmarlo. Por lo gen
eral la persona afectada se recupera totalmente, aunque puede experimentar episo
dios repetidos.
tambin el polisacrido capsular, lo que aumenta la capacidad para detectar las cepa
s de S aureus resistentes a meticilma (oxaclina). S. saprophyticus y S. sciuri so
n las otras dos especies del genero que pueden dar positiva la prueba de aglutin
acin en ltex. Se han identificado muchas especies coagulasa negativas de estafiloc
ocos; sin embargo, con la excepcin de S. saprophyticus. que es una especie resist
ente a la novobiocina. la identificacin de estos aislamientos hasta el nivel de e
specie no es de utilidad prctica ni est clnicamente recomendada. Si es necesario, p
uede intentarse llevar a cabo dicha identificacin utilizando mtodos comerciales qu
e tienen una fiabilidad que oscila entre el 70% y ms del 90%. Alternativamente, l
os aislados pueden enviarse a un laboratorio de referencia con capacidad para re
alizar ensayos bioqumicos estndar. Con una finalidad epidemiolgica, para localizar
el origen de una infeccin o intoxicacin alimentaria, los estafilococos pueden iden
tificarse a nivel de cepa en base a diferentes parmetros, como la susceptibilidad
a diferentes baclerifagos. los perfiles plasmdicos y de cidos grasos celulares, lo
s patrones electroforticos de enzimas multilocus o el tipado cromosmico molecular
(electroforesis en campo pulsado y en campo pulsado reverso). Por lo general, es
tas pruebas slo pueden llevarse a cabo en los laboratorios de referencia. Sensibi
lidad a los antimicrobianos. Casi todos los estafilococos son resistentes a la p
enicilina. Dado que esta resistencia es debida a una |i-laclamasa inducibie. cuy
a sntesis esta codificada por un plsmido. la sensibilidad a la penicilina debe con
firmarse tras un periodo de induccin en un medio que contenga un agente |i-lactmic
o.
La resistencia a las penicilinas resistentes a penicilmasas (meticilina, oxaclina

. nafeilina) se detecta en un 70% a 80% de estafilococos coagulasa negativos y h

asta en un 40% de cepas de S. aureus. La resistencia a este grupo de agentes ant
imicrobianos depende del gen mecA. que codifica la sntesis de una protena que liga
penicilina anormal, la PBP2a. Tpicamente, la resistencia es heteLas infecciones
causadas por las especies coagulasa negativas de Staphyrognea, lo que significa q
ue slo unas pocas clulas (1 de cada W a 10") lococcus tienen lugar como consecuenc
ia de la implantacin de vlvulas carexpresan la resistencia. Debido a este hecho, n
a y que seguir un protocolo espediacas, prtesis articulares y desviaciones ventr
iculares. S. epidermidis es la cfico para garantizar la deteccin: para el mtodo de
difusin en placa debe utiespecie que est implicada con mayor frecuencia en este ti
po de infecciones. lizarse un disco impregnado con 1 itg de oxaclina; para el mtod
o de microdiluS. saprophyticus es un importante agente causal de bacteriuria, pa
rticularcn debe utilizarse caldo de Mueller-Hinton con cationes y un 2% de NaCI; t
anto mente en mujeres jvenes sexualmente activas. las placas de agar c o m o las
de microtitulacin deben incubarse durante 24 horas a 35 C. Para determinar la res
istencia a la oxaclina. se inoculan en vanos punDiagnstico de laboratorio. La obse
rvacin microscpica de cocos tpitos con un hisopo de algodn placas de agar Mueller-Hi
nton que contengan un camente redondeados, grampositivos y que se agrupan forman
do racimos en 4% de NaCI y 6 itg/ml de oxaclina, que se incuban seguidamente dura
nte los frotis realizados a partir de muestras tomadas de lesiones cerradas o no
24 horas. Se han desarrollado algunos procedimientos para detectar rpidamendrena
das, o del lquido de un hemocultivo positivo, es indicativa de la existe la resis
tencia a la oxaclina Entre stos se encuentran la ampliacin de citencia de una infecc
in estafiloccica. dos nucleicos y la hibridacin con sondas especificas para el gen
mecA. un enS. aureus produce coagulasa. una enzima que liga el fibringeno del pla
sma sayo de aglutinacin en ltex para la PBP2a y un ensayo de fluorescencia para sa
nguneo, provoca que las bacterias aglutinen o que el plasma coagule; prctilas bact
erias crecidas en presencia de oxaclina. Aunque los estafilococos resisc a m e n
t e ninguna otra especie del gnero Staphylococcus presenta esta enzima. tentes a
la oxaclina pueden parecer susceptibles a las cefalosporinas, tambin Alrededor del
95% de aislamientos de S. aureus se identifican mediante la prueo m o resistent
es a estos antibiticos, asi c o m o al imipenem. ba de la coagulasa en portaobjet
os, que detecta la enzima ligada a la pared celu- deben considerarse c lar bacte
riana (factor de coagulacin), y prcticamente todas las cepas se caracLa resistenci
a a la vancomicina ha sido detectada slo muy raramente en los terizan mediante la
prueba en tubo, que detecta la coagulasa extracelular. estafilococos. Las pocas
cepas resistentes aisladas tenan concentraciones
=
La prueba en portaobjetos se lleva a cabo mezclando una emulsin densa de microorg
anismos con plasma sanguneo en la supedicie de un portaobjetos de vidrio. La prue
ba es positiva si se observa aglutinacin en un plazo no superior a 30 segundos. S
. lugdenensis y S. schleileri son las otras dos especies que pueden dar positiva
la prueba de la coagulasa con esta tcnica. Para realizar la prueba en tubo, se t
ransfieren varias colonias a un tubo con plasma que se ncuba a 35 C durante 4 ho
ras, observndose seguidamente la formacin del cogulo. Si ste no se ha formado al cab
o del tiempo indicado, el tubo se reincuba a temperatura ambiente y se vuelve a
examinar tras un perodo total de 20 horas. La prueba debe examinarse despus de cua
tro horas, ya que la mayor parte de aislados de S. aureus coagulan el plasma en
este intervalo de tiempo y porque algunas cepas producen una actividad fibrinoht
ica que puede disolver el cogulo, pudiendo dar una reaccin falsamente negativa si
la prueba se lee a las 20 horas solamente. S. intermedius y S. hytcus tambin dan
positiva la prueba de la coagulasa con el mtodo en tubo, aunque estas especies so
n patgenos animales y muy raramente se encuentran presentes en especmenes humanos.
Hay disponibles algunos ensayos comerciales de aglutinacin en ltex que petmiten l
levar a cabo una identificacin rpida de S aureus. Estos ensayos detectan la existe
ncia de proteina A y del lactor de coagulacin, y algunos
mnimas inhibitorias (CMI) en el rango intermedio (de 8 ng'ml a 1 6 iig/ml). Los

Tabla 50-5 Clasificacin d e e s t r e p t o c o c o s y enterococos Hemolisis U A

B C Grupo de Lancefield Especies
oy
S. pyogenes S. agalactiae S dysagalactiae subesp equisimilus Enterococcus spp D
Vanantes de colonias pequeas Grupo anginosus de los grupos A. C. F. G o inclasifi
cables D Enterococcus spp D S bovis Variantes de colonias pequeas Grupo anginosus
de los grupos A. C. F. G o inclasificables Ninguno S pneumoniae Ninguno Estrept
ococos v

1094
SECCIN V!

MICROBIOLOGA MDICA
organismos con unos valores de CMI elevados para la vancomcina deben enviarse a u
n laboratorio de referencia para su confirmacin, y los casos confirmados deben no
tificarse al Cenrer lor Disease Control and Prevention (CDC).
Streptococcus y Enterococcus
Caractersticas. Los estreptococos son cocos catalasa negativos, grampositivos. es
fricos, ovoideos o lanceolados, dispuestos a menudo formando parejas o cadenas. S
on anaerobios facultativos. Algunas cepas necesitan CO;, para su aislamiento ini
cial, pero pueden perder este requerimiento al ser subcultivadas posteriormente.
Los estreptococos pueden ser clasificados en categoras m u y amplias en funcin de
l tipo de hemolisis que producen en agar sangre (Tabla 50-5). Aquellas cepas que
lisan totalmente los hemates alrededor de las colonias que forman en el medio se
denominan |5-hemolticos, y pueden ser clasificadas subsiguientemente en algunos
de los grupos de Lancefield, atendiendo a los componentes (carbohidratos y proten
as) antignicamente reactivos presentes en su superficie celular. Los miembros ms i
mportantes de este grupo son Streptococcus pyogenes (grupo A) y Streptococcus ag
alactiae (grupo B). Aquellas especies que causan una hemolisis parcial (producie
ndo un halo verdoso alrededor de la colonia) reciben la denominacin de -herrtoltica
s. Un miembro importante de este grupo es S. pneumoniae. Los estreptococos que n
o lisan los hemates son los y-hemolticos. Dentro de este grupo la especie ms destac
able es S. bovis. Algunas cepas de S. agalactiae tambin pueden ser y-hemolticas. L
a mayor parte de las especies a- y y-hemolticas son denominadas globalmente estre
ptococos del grupo "vindans", que incluye S. mutans. S. sanguis, S. mitis. S. sa
livariusy S. anginosus. El grupo de estreptococos previamente denominados como v
ariantes nutricionales (dependientes de piridoxal, vitamina B o tiol) ha sido in
cluido ahora en el gnero Abiotrophia.
6
sufrir una infeccin por un estreptococo del grupo A que posea una proteina M fren
te a la cual no haya generado anticuerpos especficos el hospedador afectado. Otro
componente importante de la pared celular es el cido lipoteicoico, que acta como
mediador en la adhesin de las bacterias a las clulas del epitelio respiratorio. S.
pyogenes sintetiza tambin alrededor de unos 20 productos extracelulares, que inc
luyen enzimas (estreptolisinas, hialuronidasa, estreptocinasa, desoxirribonuclea
sas [ADNsasj y nicotinamina-adenodinucleotidasa NADasaj) y toxinas eritrogenticas.
La estreptolisina O es una enzima oxgeno-lbil con carcter antignico que produce hemo
lisis en agar sangre en la zona subyacente a la superficie del medio de cultivo;
la estreptolisina S es una enzima estable frente al oxigeno, no inmunogenia, y
que produce hemolisis en la superficie del agar sangre. Ninguna de las dos estre
ptolisinas parece tener un papel en la patogenia de las infecciones en el hombre
. La estreptocinasa desarrolla una actividad fibrinolitica transformando el plas
mingeno en plasmina, mientras que la hialuronidasa puede favorecer la diseminacin
del microorganismo a travs del tejido conectivo. El papel de la ADNsa y la NADasa
en la patogenia es desconocido. Las toxinas pirgenas (eritrognicas), de las que s
e conocen tres serotipos (A,B, y C), son producidas por cepas de S. pyogenes que
contienen un bacterifago lisogenizado. Su carcter pirgeno es debido a su accin dire
cta a nivel del hipotlamo. La patogenia de la fiebre reumtica aguda no est bien com
prendida todava. Ciertos tipos antgnicos de la proteina M pueden tener carcter reuma
tgeno. La presencia de complejos de inmunoglobulinas y el componente C3 del compl
emento a lo largo del sarcolema de las miofibrillas cardacas en individuos aqueja
dos de miocarditis reumtica sugiere que la enfermedad es consecuencia de la forma
cin de anticuerpos frente al antgeno M de la pared celular de los estreptococos, q

ue tienen reactividad cruzada con componentes de los tejidos del corazn. En este
contexto, se ha identificado un antigeno de S. pyogenes que comparte eptopos comu
nes con la proteina M, aunque es antignicamente distinto de sta, y que exhibe reac
tividad cruzada con molculas de los tejidos cardacos (Barnett, 1990). El dao renal
en la glomerulonefritis aguda est causado por el depsito de inmunocomplejos (forma
dos por antgenos estreptoccicos y anticuerpos del hospedador frente a los mismos)
circulantes en los glomrulos renales y por la subsiguiente activacin del complemen
to. Tambin pueden estar implicados procesos de inmunidad celular frente a una mem
brana basal del glomrulo alterada, as como la activacin del complemento por la via
alternativa. Las infecciones ms frecuentes causadas por los estreptococos del gru
po B son la sepsis neonatal, la neumona y la meningitis. La colonizacin del tracto
genital materno se asocia con la colonizacin del recin nacido y el riesgo d e enf
ermedad neonatal, con infecciones que aparecen tempranamente (en los das inmediat
amente siguientes al parto) y un poco ms tardamente (despus de la primera semana de
edad). Con objeto de reducir la incidencia de las infecciones neonatales, el CD
C de Atlanta ha publicado una guia especfica que permite la identificacin precoz y
el tratamiento preventivo de mujeres colonizadas por estreptococos del grupo B,
asi c o m o la identificacin y tratamiento de neonatos con riesgo de desarrollar
enfermedad (Schuchat, 1996). Las infecciones por estreptococos del grupo B en a
dultos incluyen la endometritis de posparto, infecciones de las vas urinarias, ba
cteriemia, infecciones de la piel y tejidos blandos, neumona, endocarditis, menin
gitis, artritis y osteomielitis. Los estreptococos de los grupos C y G son semej
antes a S. pyogenes en el sentido de que pueden causar un amplio abanico de infe
cciones, incluyendo bacteriemia, endocarditis, meningitis, artritis e infeccione
s de la piel y las vas respiratorias. La faringitis causada por estos estreptococ
os es similar a la que provocan las bacterias del grupo A, excepto por que no ac
arrea secuelas no supurativas del tipo de las fiebres reumticas. S. pneumoniae ca
usa neumona, meningitis (especialmente en nios pequeos y ancianos), bacteriemia esp
ontnea (en personas que carecen del bazo), otitis, sinusitis y peritonitis espontn
ea. Esta bacteria forma parte de la microbiota normal que se encuentra en las vas
respiratorias superiores del 25% al 50% de nios en edad preescolar, y en cerca d
el 20% de adultos, individuos a los que se denomina portadores (Hendley, 1975).
La diseminacin del microorganismo se ve favorecida por las infecciones del tracto
respiratorio superior y por la masificacin en los entornos humanos. La neumona pu
ede desarrollarse cuando las defensas inmunitarias del husped estn debilitadas. L
a mayor parte de los casos tienen un origen endgeno y son consecuencia de la aspi
racin de secreciones orales que contienen microbiota normal, incluyendo a S. pneu
moniae. La
Los enterococos, previamente designados como estreptococos del grupo D debido a
que los cidos teicoicos de su pared celular reaccionaban con antisueros frente a
las cepas tpicas del grupo D, son lo suficientemente diferentes de los otros miem
bros del gnero Streptococcus como para ser incluidos dentro de un gnero independie
nte. Estos microorganismos son cocos grampositivos, anaerobios facultativos, que
se presentan aislados, en parejas, o formando cortas cadenas. La mayor parte de
enterococos son a- y y-hemoliticos. aunque algunas cepas pueden exhibir |5-hemli
sis en agar sangre. Otros gneros de cocos grampositivos. catalasa negativos, que
pueden aislarse a partir de especmenes clnicos son Leuconostoc. Pediococcus. Stoma
tococcus, Aerococcus y Lactococcus spp. Se considera que la virulencia potencial
de estos microorganismos es baja y, por lo general, slo son patgenos en hospedado
res inmunocomprometidos. Manifestaciones clnicas y patogenia. Una de las manifest
aciones clnicas ms comnmente asociada a los estreptococos del grupo A es la faringi
tis. La faringitis puede venir acompaada por la escarlatina, que se manifiesta en
forma de un exantema puntiforme sobre un eritema difuso que por lo general apar
ece nicialmente en el cuello o parte superior del pecho, posteriormente adquiere
carcter generalizado y finalmente acaba con descamacin de la piel. Entre las infec
ciones de la piel causadas por los estreptococos del grupo A se incluyen celulit
is, erisipela y pioderma. La fiebre reumtica aguda, que se caracteriza por manife
staciones como carditis, poliartritis, eritema marginado, corea y nodulos subcutn
eos, puede aparecer entre una y cinco semanas despus de haber sufrido u n a farin

gitis causada por un estreptococo del grupo A. La glomerulonefritis aguda puede

desarrollarse entre 10 das y tres semanas despus de padecer faringitis o pioderma
provocada por estreptococos del grupo A. A finales de los ochenta comenzaron a d
etectarse, cada vez con mayor frecuencia, una serie de sndromes clnicos graves cau
sados por estreptococos del grupo A, entre los que cabe destacar la fascitis nec
rotizante, la miositis, la escarlatina maligna, la bacteriemia y el sndrome del s
hock txico. Estos sndromes han sido asociados con porcentajes de morbilidad y mort
alidad del 30% o incluso superiores. Las causas de este incremento no estn claram
ente determinadas, aunque pudieran estar relacionadas con cambios en la prevalen
cia de microorganismos con potencial de virulencia incrementado (Kaplan. 1996). As
ociados a las clulas de S. pyogenes existen una gran cantidad de componentes estr
ucturales y enzimticos que actan como factores de virulencia. Uno de los ms importa
ntes es la protena M de la pared celular, que tiene actividad antifagocitaria. Lo
s anticuerpos generados frente a este antgeno confieren inmunidad especfica de tip
o permanente: sin embargo, debido a que existen ms de 60 tipos antignicamente dife
rentes de la proteina M, es posible

1095
Figura 50-2. E s q u e m a para la identificacin presuntiva de las especies |i-he
moliticas del gnero Streptococcus (+ = resultado positivo: - = resultado negativo
; S = susceptibilidad; R = resistencia). (Reproducida de Woods GL, Gutirrez Y: Di
agnostic pathology ol infectious diseases. Filadelfia. L e a & Febiger. 1993. co
n permiso dei editor.) transmisin de persona a persona durante las epidemias tien
e lugar por inhalacin de gotitas de humedad en aerosoles. El pnncipal (actor de v
irulencia en S. pneumoniae es el carcter fuertemente antifagocitario del polisaca
ndo capsular, por lo que aquellas cepas que poseen una gruesa cpsula mucosa, como
es el caso de las clulas del tipo 3, son particularmente virulentas. En la actua
lidad hay disponibles vacunas diseadas para ofrecer proteccin frente a la infeccin
por neumococos pertenecientes a los grupos predominantes atendiendo al antgeno ca
psular de los mismos. Asimismo, se dispone de una vacuna para ser administrada e
n bebs y nios que ofrece proteccin frente a la enfermedad invasiva por neumococo. L
a endocarditis bacteriana es la infeccin ms comn causada por los estreptococos del
grupo viridans; otras patologas incluyen abscesos en el cerebro o en el hgado, bac
tenemia y caries dental. La bacteriemia por S. bows ha sido asociada con proceso
s tumorales en el tracto gastrointestinal. Los enterococos no son muy patgenos; s
in embargo, estos microorganismos son una causa muy frecuente de infecciones de
las vas urinarias en personas hospitalizadas. Tambin pueden provocar endocarditis,
bacteriemia e infecciones de las heridas. Diagnstico de laboratorio. Los estrept
ococos crecen bien en agar sangre o agar chocolate, aunque el agar sangre es pre
ferible, ya que permite determinar las caracteristicas hemolticas del microorgani
smo. Cuando se siembra a partir de muestras anorrectales de mujeres embarazadas
tomadas con hisopo, con objeto de aislar especficamente estreptococos del grupo B
, las muestras deben ser inoculadas inicialmente en un medio liquido selectivo,
c o m o el caldo LIM (caldo de enriquecimiento para S. agalactiae basado en el m
edio de ToddHewitt modificado), para llevar a cabo un enriquecimiento de estos m
icroorganismos (Schuchat, 1996). Las pruebas que deben utilizarse en el laborato
no de microbiologa clnica para identificar presuntivamente las especies (3-hemoltic
as
Figura 50-3. Esquema para la identificacin presuntiva de las especies u-nemolitic
as y -/-hemoliticas de los gneros Streptococcus y Enterococcus (+ = resultado pos
itivo; - = resultado negativo). (Reproducida de Woods GL. Gutirrez Y Diagnostic p
athology of infectious diseases. Filadelfia. Lea & Febiger. 1993. con permiso de
l editor.)

1096
SECCIN VI
MICROBIOLOGA MDICA
En el caso de las colonias (/.-hemoliticas que no corresponden a S. pneumoniae.
asi como de las y-hemoliticas. debe realizarse la prueba de la hidrlisis del L-pi
rroltdonil-Li-naftilamida (prueba de la PYRasa); los enterococos son PYRasa posi
tivos mientras que los estreptococos del grupo vindans dan Los estreptococos del
grupo A pueden detectarse directamente en las muesnegativa esta prueba. Adems, t
odos los enterococos pueden crecer en pretras tomadas directamente de la gargant
a con un hisopo utilizando mtodos sencia de una concentracin del 6,5% de NaCI, mie
ntras que los estreptococomerciales diseados para proporcionar resultados rpidamen
te. Estos mtodos cos viridans son incapaces de hacerlo en esas condiciones. Los e
nterococos son muy especficos, pero dada su baja sensibilidad, que, segn diversos
estuhidrolizan la esculina en presencia de bilis (lo que provoca un ennegrecidio
s, vara entre el 31% y el 95% (Carroll, 1996: Wegner. 1992), un resultado miento
del medio asociado al crecimiento bacteriano), aunque hasta un 1 0 % negativo ob
tenido con los mismos debe ser reconfirmado mediante cultivo. Las de cepas de es
treptococos vindans tambin son esculina positivos Para llepruebas serolgicas encam
inadas a detectar anticuerpos frente a la estreptoJisina O y la AONsa B en muest
ras de suero obtenidas durante las fases aguda y de var a cabo la identificacin d
e los enterococos a nivel de especie son necesarias pruebas bioqumicas adicionale
s (Facklam, 1989a). La mayor parte de convalecencia se emplean fundamentalmente
para diagnosticar fiebres reumtilos aislamientos clnicos corresponden a E. laecali
s. cas o glomerulonefritis aguda tras una infeccin por estreptococos del grupo A.
Una cepa que sea |5-hemcJitica e hidrolice el hipuralo o d una reaccin positiva e
n la prueba del AMP cclico (cAMP) puede identificarse presuntivamente c o m o un
estreptococo del grupo B. Un aislamiento con estas caractersticas, obtenido a par
tir de una muestra procedente de una localizacin anatmica habitualmente estril, deb
e identificarse mediante serotipado (utilizando aglutinacin en ltex o coaglutinacin
) o con una sonda quimioluminiscente de ADN. Las sondas de ADN tambin pueden ser
empleadas para identificar estreptococos del grupo B crecidos en medio LIM u otr
os caldos de cultivo selectivos. Los aislamientos de estreptococos |t-hemolticos
de los grupos C, D, F y G pueden ser identificados mediante serotipado con ensay
os de aglutinacin en ltex. Hay disponibles pruebas de aglutinacin en ltex para la de
teccin directa de estreptococos del grupo B (asi como de S. pneumoniae. algunos s
erotipos de Neissena meningitidis. Escherichia cot y Haemophilus influenzae serot
jpo b) en muestras de LCR. suero y orina. Sin embargo, la Food and Drug Administ
ration (FDA) ha publicado un informe alertando sobre la posibilidad de obtener r
esultados tanto lalsos positivos como falsos negativos cuando se utilizan este t
ipo de pruebas para detectar la presencia de estreptococos del grupo B en muestr
as de onna (FDA. 1997). Adems, los datos de algunos estudios indican que la sensi
bilidad de estos ensayos en el caso de estreptococos del grupo B, S. pneumoniae.
N. meningitidis. E. coliy H. influenzae es menor o igual que la que posee la ti
ncin de Gram, excepto en los casos de meningitis en los que ya ha comenzado a apl
icarse el tratamiento con antibiticos. Asimismo, otros estudios han mostrado que
los resultados de estas pruebas tienen poca influencia en el proceso global de a
tencin y cuidado del paciente (Bhisitkul. 1997; Granoff. 1986; Maxson. 1994; Perk
ins. 1995). Por estas razones, y porque las pruebas para la deteccin rpida de antge
nos bacterianos son mucho ms caras y requieren ms tiempo y esfuerzo que la tincin d
e Gram, muchos laboratorios han prescindido de su uso o lo han limitado de forma
estricta. Las pruebas utilizadas para la identificacin presuntiva de los estrept
ococos - y y-hemolticos y los enterococos se muestran en la Figura 50-3. Las coloL
os estreptococos -hemolticos resistentes a la optoquina. y que dan negativa la pru
eba de la PYRasa. y los estreptococos PYRasa negativos, incapaces de crecer en p
resencia de un 6.5% de NaCI, se clasifican c o m o estreptococos no hemolticos (v
iridans). Dentro del grupo viridans. la identificacin de las especies individuale
s se lleva a cabo mediante pruebas bioqumicas convencionales (Coykendall, 1989).

Tambin hay disponibles sistemas comerciales para la identificacin de estos microor

ganismos. Es importante llevar a cabo la diferenciacin entre los enterococos que
han adquirido resistencia a la vancomicina y las especies de los gneros Leuconost
oc y Pediococcus intrnsecamente resistentes a este antibitico. Las caractersticas q
ue son de utilidad para cumplir este objetivo se muestran en la Tabla 50-6 (revi
sado por Facklam, 1989b). Las especies del gnero Abiotrophia no crecen en ausenci
a de piridoxal. A menudo se identifican inicialmente por el tenmeno del satelitis
mo, ya que forman colonias alrededor de otra de S. aureus. Las caractersticas dif
erenciales de las especies A. defectiva y A. adiacens han sido descritas por otr
os autores (Ruoff. 1990). Sensibilidad a los antimicrobianos. Los antibiogramas
de los estreptococos de los grupos A, B. C y G son predecibles. ya que todos est
os microorganismos son sensibles a la penicilina: por tanto, los ensayos habitua
les para determinar la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos son m n e c
e s a n o s salvo que no pueda utilizarse la penicilina en el caso de personas
alrgicas a este antibitico. Debido a que las cepas de S. pneumoniae con un grado m
edio (CMI entre 0.1 y 1.0 mgl) o elevado (CMI >2 mg/l) de resistencia a la penic
ilina estn diseminadas por todo el mundo, los aislamientos de esta especie deben
analizarse para determinar su susceptibilidad al antibitico utilizando el mtodo d
e difusin en medio slido con discos que contengan 1 pg de oxacilina. Aquellos aisl
amientos que no muestren susceptibilidad por este mtodo deben ser reevaluados uti
lizando la tcnica de la macrodilucin o de la microdilucin en caldo, utilizando medi
o de Mueller-Hinlon enriquecido con sangre de caballo lisada. o
2
del gnero Streptococcus se muestran en la Figura 50-2. Ms del 99c de aislamientos d
e estreptococos del grupo A son susceptibles a la bacitracina. aunque un porcent
aje muy pequeo de cepas del grupo B y entre un 10% y un 20% de aislamientos de lo
s grupos C y G tambin son sensibles a esta sustancia. Por tanto, los resultados d
e la prueba de la susceptibilidad a la bacitracina slo permiten llevar a cabo una
identificacin presuntiva. Un aislamiento puede ser identificado tentativamente c
omo un estreptococo del grupo A en base a la prueba de la hidrlisis de la t-pirro
lidonil-[i-naftilamda (lest PYR: PYRasa) (Wellstood, 1987). Todas las cepas del g
rupo A y ms del 99% de aislamientos de Enterocoecus dan positiva esta prueba. La
identificacin de un estreptococo del grupo A se confirma mediante serotipado con
un ensayo de aglutinacin en ltex, o por hibridacin con sondas de cidos nucleicos esp
ecificas.
nias a-hemolilicas, que son mucosas y planas con una depresin central, sugieren l
a presencia de S. pneumoniae, por lo que debe ensayarse la susceptibilidad de lo
s microorganismos presentes en las mismas al clorhidrato de etilhidroxicuprena, c
ompuesto al que comunmente se denomina optoquina (disco P); S. pneumoniae es sen
sible a la optoquina, mientras que otros estreptococos (/-hemolticos son resisten
tes Los presuntos aislamientos de S. pneumoniae realizados a parlir de localizac
iones estriles del cuerpo pueden ser identificados ms rpidamente por medio de ensay
os de aglutinacin en ltex que detectan el polisacando capsular, o mediante sondas
quimioluminiscentes de ADN

CAPTUIO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1097
medante la prueba E para determinar su CMI para la penicilina. Asimismo, pueden a
parecer resistencias trente a las cefatosporinas de tercera generacin; en consecu
encia, tambin debe determinarse la susceptibilidad de los aislamientos frente a e
stos agentes antimicrobianos. Los ensayos de susceptibilidad deben realizarse co
n las cepas de estreptococos no hemoliticos (viridans) aisladas de localizacione
s estriles del cuerpo, debido a que en estos casos puede existir resistencia a la
penicilina. Las especies del gnero Enterococcus tambin deben ser analizadas para
identificar, en principio, resistencia elevada a penicilina o ampicilina. estrep
tomicina y gentamicina. y resistencia a la vancomicina (Tenover. 1993).
Bacilos grampositivos Corynebacterium y Arcanobacterium
Caractersticas. Las corinebacterias o bacilos "difteroides". como son a veces den
ominados, aparecen en las extensiones teidas por el mtodo de Gram como bacilos gra
mpositivos. ligeramente curvados, con los lados no paralelos y. en ocasiones, co
n los extremos engrosados, lo que confiere una apariencia de maza (Lmina 50-3). E
stas bacterias son catalasa positivas. Existen 46 especies dentro del gnero Coryn
ebacterium. La mayor parte de las mismas raramente son patgenas para el hombre; l
as excepciones ms notables son Corynebacterium diphteriae y las especies o varied
ades estrechamente relacionadas con ella, como son C. ulcerans y C. pseudotuberc
ulosis. Las especies de inters clnico dentro del gnero Arcanobacterium son A haemol
yticum. A. pyogenes y A. bemardiae. Al microscopio bajo tincin de Gram, estos mic
roorganismos tambin aparecen como bacilos grampositivos con forma irregular. Las
arcanobactenas se diferencian de las corinebacterias por que dan negativa la pru
eba de la catalasa. Manifestaciones clnicas y patogenia. En el lugar de la infecc
in inicial a nivel de las amgdalas y la orofaringe. C. diphteriae se multiplica so
bre las clulas epiteliales y produce una exotoxina que provoca necrosis celular l
ocal e inllamacin subsiguiente. Las lesiones exudativas coalescen. formando unas
seudomembranas adherentes de color gris-negruzco. La toxina, que es producida so
lamente por las cepas de C. diphteriae infectadas por un fago lisognico que conti
ene el gen que codifica para la toxina, es absorbida y pasa al torrente circulat
orio, mediante el que se disemina sistmicamente, produciendo cambios degenerativo
s en el corazn, sistema nervioso y rones. La molcula de la toxina est formada por dos
subunidades: el fragmento A, que contiene el sitio enzimticamente activo, y el f
ragmento B. en donde se encuentra el dominio que determina la unin a las clulas de
l husped. La toxina diftrica se une a las clulas a travs de la subunidad B. sufre un
proceso de escisin y el fragmento A penetra en el intenor de la clula mediante un
mecanismo totalmente desconocido. Una vez en el citoplasma, la subunidad A bloq
uea la sntesis proteica, catalizando la inactivacin de la actividad translocadora
del ARN de transferencia, impidiendo la interaccin de este ltimo con el ARN mensaj
ero y deteniendo la incorporacin de nuevos residuos de aminocidos a la cadena poli
peptidica en crecimiento. La toxina puede alectar a cualquier clula del organismo
, pero las que resultan daadas ms gravemente son las del corazn, nn y tejido nervioso
. El propio microorganismo y la toxina que sintetiza producen un exudado seroso
y un infiltrado celular en la m u c o s a de la faringe, lo que conduce a la for
macin de unas seudomembranas de color grisceo. Aunque se considera que produccin de
toxina y patogenicidad son trminos sinnimos, las seudomembranas tambin pueden form
arse en personas infectadas por cepas no toxigenicas. La extensin de las seudomem
branas por arriba hacia la nasofaringe y por debajo hacia la laringe puede ser t
an masiva como para producir una obstruccin respiratoria. Aunque pueden producirse infecciones de otras partes del organi
smo por C. diphteriae. las ms frecuentemente observadas en EE.UU.son las de la pi

el. La va de transmisin de C. diphteriae es por inhalacin de gotitas de humedad exp

ulsadas de las vas respiralonas supenores o por contacto con un loco de infeccin c
utnea. Debido a que el resto de corinebacterias forman parte de la microbiota nor
mal presente en la piel y las mucosas, es difcil establecer su papel etiolgico. El
significado clnico de la deteccin de una de estas bacterias aumenta si el organis
mo observado en frotis teidos por el mtodo de Gram aparece acompaado por leucocitos
, si el aislamiento ha tenido lugar a partir de una localizacin estenl o si ha si
do recuperado a partir de muestras mltiples. Corynebactenum jeikeium se ha asocia
do de forma clara con infecciones que aparecen tras el implante de prtesis (p. ej
., vlvulas cardacas. LCR y articulaciones), se ha identificado como responsable de
cuadros de endocarditis bacteriana subaguda y ha estado implicado en una gran v
ariedad de infecciones oportunistas. Corynebacterium ureolyticum se ha relaciona
do con infecciones de las vas urinarias, asi c o m o con bacteriemia. endocarditi
s e infecciones de las hendas. Arcanobacterium haemolyticum ha sido asociado con
procesos de laringitis y con infecciones de las heridas y tejidos blandos, mien
tras que otras especies como A. pyogenes y A. bemardiae son responsables de la f
ormacin de abscesos. Diagnstico de laboratorio. Debido a que la difteria es, en la
actualidad, una enfermedad relativamente rara en EE.UU., el diagnstico clnico pue
de ser pasado por alto y el laboratono de anlisis puede errar a la hora de recono
cer los cultivos. Siempre debe proporcionarse al laboratorio un diagnstico tentat
ivo, de tal forma que los especmenes sospechosos puedan ser manipulados correctam
ente. Las connebactenas crecen en agar sangre sin mayor problema; sin embargo, e
l agar sangre cistina-telurito (CT) es el medio de cultivo pretendo para el aisl
amiento e identificacin del microorganismo. En el medio CT, las colonias que form
a C. diphteriae tras 48 horas de incubacin son de color gris o negro. Las colonia
s pueden ser tanto grandes como pequeas y planas convexas. Los medios de Lffler (c
on suero coagulado) o de Pai (con huevo coagulado!, que son ms deficientes desde
el punto de vista nutnctnal. son apropiados para cultivar microorganismos que exh
iban morfologas caractersticas al microscopio: apariencia pleomrfca, agrupacin en emp
alizada (los bacilos se disponen adosados lateralmente unos con otros) y presenc
ia de granulos metacromticos. La clasificacin de las corinebacterias, o bacilos di
fteroides. de la piel y la boca es difcil y confusa. Las caractersticas diferencia
les de algunas especies se muestran en la Tabla 50-7. Existen sistemas comercial
es disponibles para la identificacin de este grupo de microorganismos. Los aislam
ientos sospechosos de ser C. diphtenae deben ser analizados para establecer su c
apacidad de producir la exotoxina. La sntesis de la misma puede ser detectada in
vitro mediante la prueba de inmunodifusin de Elek, que consiste en sembrar sobre
una tira de papel de filtro impregnada en antitoxina y embebida en la masa del a
gar del medio de cultivo una nica estra en perpendicular del microorganismo que va
a ser estudiado, observando al cabo del tiempo de incubacin la aparicin de lineas
de precipitado que se forman con un ngulo de 45 grados en relacin con la lira de
papel y la estra del crecimiento microbiano. Se han descrito muchas modificacione
s de este mtodo, todas las cuales han conducido a la obtencin de resultados errneos
, como puede ser la no aparicin de lineas de precipitado con cepas genuinamente t
oxignicas o la lormacin de bandas de precipitacin mespecficas con microorganismos no
productores de exotoxina. Varios lactores, como son la concentracin del suero an
titoxina, la cantidad de inoculo, el tipo de suero de enriquecimiento utilizado
en el medio y el tiempo de incubacin, pueden afectar el resultado d e esla
Tabla 50-7 Prueba
Caractersticas diferenciales d e a l g u n a s e s p e c i e s del g n e r o C o
r y n e b a c t e r i u m y bacterias relacionadas C. diphteriae +
V
C. ulcerans + + + +
C. pseudotuberculosis + +
+

C. jeikeium +
Arcanobacterium haemolyticum +
A rcanobacterium pyogenes
+ Catalasa Hemolisis Gelatinasa Ureasa Reduccin de los nitratos Fermentacin de la sa
carosa + = positivo: - = negativo: v = variable.
V
v v
V
V

1098
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
prueba. Se han descrito mtodos alternativos basados en la PCR que pueden ser de u
tilidad para detectar el gen que codifica la sntesis de la exotoxina. Las especie
s de Arcanobacterium son catalasa negativas y (i-hemolticas en agar sangre. Las c
olonias que se forman despus de una incubacin de 48 horas son de pequeo tamao. Las m
ismas pruebas bioqumicas que se utilizan para la identificacin de las corinebacter
ias pueden utilizarse tambin en el caso de las arcanobacterias. La especie A. hae
molyticum produce fosfolipasa D, enzima que es responsable de una reaccin inversa
del cAMP cuando esta bacteria se incuba simultneamente con otra especie bacteria
na, Staphylococcus aureus, en agar sangre. A. haemolyticum inhibe la hemolisis a
lrededor de la estra de crecimiento de S. aureus, produciendo una zona con lorma
triangular en la que no se detecta hemolisis. Sensibilidad a los antimicrobianos
. Aunque el suero antitoxina sigue siendo el nico mtodo especfico para el tratamien
to de la difteria, tambin se administran antibiticos a los pacientes que manifiest
an la enfermedad y los portadores asintomticos de cepas toxignicas. C. diphteriae
es sensible a la penicilina, la eritromicina y la clindamicina. Debido a su elev
ada eficacia y a que es bien tolerada, la eritromicina es el antibitico que se ut
iliza con mayor frecuencia en este contexto; sin embargo, la penicilina-benzatin
a tambin puede ser de utilidad en aquellos casos en los que se espera que el paci
ente coopere en la pauta de administracin del antibitico. La sensibilidad a los an
limcrobianos de otras especies de corinebacterias o bacilos difteroides es bastan
te menos predecible. Por ejemplo. C. jeikeium es, usualmente. resistente a las p
enicilinas y cefalosporinas, sensible pero con mucha variabilidad a la mayora de
los restantes antibiticos y sensible casi de manera uniforme a la vancomicina. El
tratamiento de las infecciones causadas por estos microorganismos se ve complic
ado, a menudo, por unas defensas del husped disminuidas y por la presencia de prte
sis implantadas. Las arcanobacterias son sensibles a (5-lactmicos, rifampicina. t
etraciclina y macrlidos. Prevencin. La prevencin de la difteria se basa casi exclus
ivamente en programas de inmunizacin activa y pasiva, con administracin suplementa
ria de antibiticos para eliminar el estado de portador de cepas toxignicas durante
las epidemias.
quesos tiernos o frescos y de carnes elaboradas, en un 30% de diversos vegetales
(repollos, rbanos) y hasta en un 50% de carne cruda y aves d e corral (Broome. 1
993). Entre un 2% y un 20% de animales y personas pueden ser portadores transito
rios. Es m u y posible que alteraciones en el sistema inmunolgico del husped deter
minen el establecimiento de la enfermedad, ya que la m a y o r parte de individu
os aquejados de listeriosis son inmunodeprmidos. Los macrfagos y los linfocitos T
representan los principales mecanismos de defensa del hospedado! frente a la inf
eccin por L monocytogenes. La virulencia de este microorganismo est relacionada co
n la produccin de listeriolisina O, una protena de 52 kDa que liene actividad hemo
ltica y citotxica, que es excretada en condiciones de pH cido y baja concentracin de
hierro, como las que existen en el interior del fagolisosoma. Se cree que la pr
otena se une de forma irreversible al colesterol de la membrana del lisosoma. pro
vocando su rotura y permitiendo la multiplicacin bacteriana incontrolada en el ci
toplasma de la clula fagoctica. Las manifestaciones clnicas de la listeriosis son d
iferentes segn se trate de mujeres embarazadas, neonatos y personas inmunodeprimi
das, que constituyen los principales grupos de riesgo. Durante el embarazo, gene
ralmente en el primer trimestre del mismo, la listeriosis cursa con unos sntomas
semejantes a los de la gripe. La bacteriemia concomitante en la mujer afectada e
s responsable de la inleccin del feto. La infeccin puede progresar hasta una amnio
nitis que provoca un parto prematuro o un aborto sptico en el plazo de tres a sie
te das. La infeccin en la madre es autolimitada porque la fuente de la misma desap

arece con la expulsin del feto infectado y del resto del contenido uterino. La li
steriosis neonatal puede tener un comienzo temprano o tardo. En el primer caso, l
a enfermedad, que se puede manifestar en el mismo momento del nacimiento o unos
pocos das despus, es consecuencia de la infeccin en el interior del tero. El recin na
cido presenta una temperatura inestable, alteraciones hemodinmcas y problemas resp
iratorios; tambin son caractersticos de la enfermedad los granulomas, que aparecen
ampliamente diseminados, afectando sobre todo a la placenta, el tramo posterior
de la faringe y la piel, aunque eventualmenle pueden no estar presentes. La enf
ermedad de inicio tardo, que afecta a los nios nacidos a trmino de madres con embar
azos normales, debe tener su origen en una infeccin contrada posparto, aunque en l
a mayor parte de los casos la fuente de la m i s m a es desconocida. En este cas
o, los sntomas clnicos tpicos de una meningitis aparecen tras el nacimiento en un r
ango de tiempo muy amplio que va desde das hasta varias semanas despus. La listeri
osis en los adultos aparece generalmente en individuos inmunodeprimidos, aunque
en la tercera parte de casos no se ha identificado o asociado un factor de riesg
o con la infeccin. La mitad aproximadamente de estas infecciones cursan como una
meningitis; otras formas de listeriosis que afectan al SNC son la cerebritis y l
os abscesos en el troncoencfalo y el cordn espinal. La bacteriemia primaria o las
infecciones focales en localizaciones diferentes al SNC son m u y poco frecuente
s. Diagnstico de laboratorio. Las colonias son pequeas, de color gris azulado, y r
odeadas de una zona o halo estrecho de hemolisis |5 en agar sangre. La prueba qu
e permite diferenciar a L monocytogenes de los estreptococos del grupo B. que pu
eden formar colonias con una apariencia semejante, es la catalasa, que es positi
va en la primera y negativa en los segundos. L monocytogenes es mvil a temperatur
a ambiente y forma cidos a partir de glucosa, trehalosa y salicina. Otras caracte
rsticas de esta bacteria se indican en la Tabla 50-8. Sensibilidad a los antimicr
obianos. L. monocytogenes es sensible, usualmente, a la penicilina, ampicilina,
eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina y gentamicina. Recientemente, se han i
dentificado plsmidos que confieren resistencia a cloranfenicol, macrlidos y tetrac
iclinas en varias cepas de origen clnico. Para el tratamiento de las infecciones
causadas por esta bacteria se ha utilizado con xito la ampicilina sola o en combi
nacin con un aminoglucsido. En los pacientes que tienen alergia a la penicilina pu
ede utilizarse como alternativa teraputica el Irmetoprim-sulfametoxazol.
Listeria
Caractersticas. Las especies del gnero Listeria son bacilos grampositivos, no rami
ficados y no esponjados. El crecimiento ptimo de L. monocytogenes, la nica especie
del gnero patgena del hombre, tiene lugar entre 30"C y 37C; sin embargo, esta bact
eria puede crecer a 4C. Las colonias que aparecen a las 24 horas son pequeas y mue
stran una estrecha zona de hemolisis [i alrededor en agar sangre. A temperatura
ambiente este microorganismo exhibe una movilidad a saltos caracterstica que rara
mente se observa a 35C. Esta motilidad dependiente de la temperatura tambin se apr
ecia en los medios semislidos, en los que el crecimiento bacteriano se distribuye
en un rea cuyo permetro semeja a un paraguas en la parte superior del tubo. Manif
estaciones clnicas y patogenia. Listeria monocytogenes se encuenlra en el suelo,
polvo, agua, pasto, aguas residuales y leche entera sin pasteurizar. L a transmi
sin del microorganismo a travs de alimentos como las ensaladas de col, cebolla y z
anahoria, leche pasteurizada y quesos frescos ha sido la causa de las diversas g
randes epidemias que han tenido lugar en Norte Amrica y Europa (Fleming, 1985; Li
nnan, 1988). De acuerdo con los datos emanados del control microbiolgico de los a
limentos, L. monocytogenes ha sido detectada en el 2% al 3% de productos lcteos,
en un 20% de
Tabla 50-8 y
Caractersticas diferenciis d e Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopatiae
L. monocyogenes + + + + + + + E. rhusiopathiae
Prueba B-hemlisis Crecimiento a 4C Catalasa Movilidad Hidrlisis de la esculina Util
izacin del gluconate Voges-Proskauer Produccin de H-.S en agar TSI

Erysipelothrix
Caractersticas. Erysipelothrix rhusiopathiae es un bacilo grampositivo, catalasa
positivo, inmvil, anaerobio facultativo, que no forma esporas y que tiene una dis
tribucin mundial. Las bacterias presentes en las colonias lisas son bacilos de pe
queo tamao, rectos o ligeramente curvados, mientras que en las colonias rugosas lo
s microorganismos son bacilos largos y filamentosos.
+

CAPTUIO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1099
Manifestaciones clnicas y patogenia. rhusiopathiae se transmite de los animales a
l ser humano mediante heridas en la piel causadas por objetos contaminados o al
entrar en contacto con sangre, carne, visceras o heces de animales infectados. .
rhusiopathiae se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza en los anima
les tanto salvajes como domsticos, pjaros, peces, materia orgnica en descomposicin,
y causa infeccin en cerdos, ovejas, conejos, ganado, pjaros y aves de corral. Entr
e las personas con nesgo de contraer infecciones por esta bacteria se encuentran
los carniceros, empleados de mataderos, pescadores y manipuladores de pescado,
personal de granjas avcolas y veterinarios. La forma ms comn de la enfermedad erisi
peloide es una infeccin cutnea local que cursa con dolor, hinchazn y una erupcin en
la piel, consistente en una zona de color violceo ligeramente elevada y de progre
sin lenta, que aparece alrededor del punto en donde tuvo lugar la inoculacin del m
icroorganismo. L a hinchazn y el eritema migran perifricamente y la lesin involucio
na sin producir descamacin de la piel. La enfermedad sislmica es rara, aunque exis
ten informes sobre casos de septicemia y endocarditis causadas por E. rhusiopath
iae. Tambin son muy poco frecuentes los casos de artritis y abscesos cerebrales.
Diagnstico de laboratorio. La biopsia o los aspirados de tejidos de las lesiones
erisipeloides son los mejores tipos de especmenes para el cultivo. Los microorgan
ismos estn localizados profundamente en la capa subcutnea del borde externo de la
lesin; por tanto, el material recogido de la superficie de la piel con un hisopo
no es de utilidad para intentar el aislamiento. E. rhusiopathiae crece en agar s
angre o agar chocolate, pero puede necesitar hasta siete dias de incubacin para d
esarrollarse. Los medios convencionales para hemocultivo son adecuados para el a
islamiento de la bacteria a partir de sangre. E. rhusiopathiae es oxidasa y cata
lasa negativo y produce, tpicamente. H,S en agar TSI (agar triple azcar-hierro). E
s inmvil, no reduce los nitratos a nitritos y fermenta la glucosa y la lactosa. U
n rasgo m u y caracterstico de esta bacteria es el aspecto de su movilidad en un
medio con gelatina, inoculado en picadura e incubado a 22 O que semeja a un desat
ascador de tuberas. rhusiopathiae se distingue fcilmente de las especies del gnero L
istea (vase Tabla 50-8). Sensibilidad a los antimicrobianos. rhusiopathiae es sens
ible a las penicilinas, cefalosporinas, imipenem. eritromicina, clindamicina, cl
oranfenicol. tetraciclinas y fluoroquinolonas. pero resistente a las sulfonamida
s, aminoglucsidos y vancomicina.
este microorganismo pueden tratarse con ampicilina, porque no se ha encontrado q
ue tenga capacidad de producir [Mactamasa.
Bacillus
Caractersticas. Las especies del gnero Bacillus son bactenas aerobias estrictas o
anaerobias facultativas, de morfologa bacilar, formadoras de esporas, catalasa po
sitivas y grampositjvas. Con la nica excepcin de Bacillus anthraos. todas las espe
cies son mviles por medio de flagelos laterales o pentncos. Algunas cepas se tien
como gramnegativas y, debido al carcter variable de la prueba de la oxidasa, pued
en contundirse con bacilos gramnegativos. La caracterstica diagnstica ms fiable es
la capacidad que tienen las especies del gnero para formar endosporas, proceso qu
e tiene lugar de manera ptima en condiciones aerbicas entre 25' C y 30 C en una gr
an variedad de medios de cultivo. En las extensiones teidas por el mtodo de Gram,
las esporas aparecen c o m o zonas o huecos no teidos en el interior de las clulas
. Las endosporas pueden teirse por vanos procedimientos especficos. Manifestacione
s clnicas y patogenia. Entre las numerosas especies del gnero Bacillus. B. anthrac
ls es la nica que es fuertemente patgena de forma consistente. Deben extremarse la
s precauciones a la hora de manipular muestras y materiales en los que se sospec

he la existencia de este microorganismo. Las manipulaciones deben ser realizadas

en cabinas de bioseguridad por personal inmunizado y protegido con guantes, rop
as apropiadas y mscaras; las superficies de trabajo deben desinfectarse con hipoc
lorito o con fenol (ambos al 5%); al finalizar, todos los materiales y equipos u
tilizados deben ser descontaminados. Existen tres formas clnicas d e la enfermeda
d que produce B anthraos. el ntrax: cutneo, pulmonar e intestinal. En su forma cutn
ea, el ntrax se caractenza por la aparicin de una lesin macular rojiza de pequeo tam
ao que evoluciona hasta formar una vescula que termina por necrosarse. formando u
n a escara negra. Junto con estos sntomas, tambin puede haber linfadenopatia regio
nal y septicemia. Sin tratamiento, la mortalidad en esta forma de la enfermedad
est alrededor del 20%. La inhalacin de las esporas de B. anihracis puede producir
bronconeumonia aguda, mediastinitis y septicemia (enfermedad de los esquiladores).
La mortalidad en los casos diagnosticados de esta variedad del ntrax est prxima al
100%. La forma intestinal aparece c o m o consecuencia de la ingestin de aliment
os contaminados y cursa con nuseas, vmitos y diarrea. En algunos casos aparecen he
morragias intestinales, seguidas de postracin, shock y muerte. En las tres formas
del ntrax puede haber septicemia, que puede conducir a una meningitis purulenta
de pronstico fatal Un factor de virulencia determinante de la capacidad patognica
del microorganismo es la presencia de una cpsula formada por un polipptido neo en c
ido glutmico que inhibe la fagocitosis: los anticuerpos especlicos frente al antgen
o capsular no tienen efecto protector contra la enfermedad. La bacteria produce,
adems, una compleja toxina formada por tres componentes (factor edematoso, antgen
o protector y factor letal) que es la responsable de los sntomas del ntrax. Los se
res humanos se infectan al entrar en contacto con animales infectados o sus cadve
res o al ingerir o inhalar subproductos derivados de los mismos. El ganado vacun
o, ovejas, caballos y cabras son los animales que se infectan ms frecuentemente y
constituyen una fuente inmediata de formas vegetativas de la bacteria que espor
ulan y perpetan la contaminacin en el ambiente. Otras especies del gnero pueden cau
sar tambin enfermedad, aunque habitualmente sean formas saprofitas. En este conte
xto, Bacillus cereus se ha asociado con infecciones del odo, neumona, infecciones
de heridas oculares postraumticas, septicemia y endocarditis. Los pacientes con n
eumona y septicemia estn afectados, frecuentemente, por algn proceso de inmunosupre
sin. Esta especie puede ocasionar bacteriemia asociada con el uso de drogas por va
intravenosa o de dispositivos mtravasculares contaminados. Existen dos formas d
e gastroenteritis relacionadas con las especies del gnero Bacillus. La intoxicacin
alimentaria causada por Bacillus puede producirse entre una y seis horas despus
de la ingestin de alimentos contaminados con B. cereus que contienen preformada u
na toxina termoestable que el microorganismo ha sintetizado in situ. Los sntomas
principales de esta intoxicacin alimentaria son nuseas, vmitos, retortijones y, oca
sionalmente, diarrea. Clsicamente, esta forma de gastroenteritis es el resultado
de la elaboracin, en gran cantidad, de alimentos que no necesitan ser recalentado
s antes de servirse. L a cepa de fi. cereus tipo 1 crece particularmente bien en
Gardnerella
Caractersticas. Gardnerella vaginalls es una bacteria Gram variable y pleomrfica.
ya que puede aparecer en forma de bacilos delgados o cocobacilos. Es inmvil y cat
alasa negativa. El crecimiento se observa mejor tras 48 horas de incubacin en una
atmsfera enriquecida con un 5% de CO . Las colonias son pequeas y producen hemoli
sis (} en agar con sangre de conejo o sangre humana. Manifestaciones clnicas y pa
togenia. Este microorganismo se ha asociado con la vaginosis bacteriana, aunque
probablemente no sea el nico agente etiolgico de esta enfermedad. Ha sido aislado
a partir de la sangre de pacientes con fiebre posparto y tambin puede causar infe
cciones en los recin nacidos. G. vaginalls forma parte de la microbiota del recto
y el ano en adultos sanos de ambos sexos, as como en nios, y de la microbiota endg
ena de la vagina en mujeres en edad frtil. Diagnstico de laboratorio. El diagnstico
de la vaginosis bacteriana no requiere cultivo, sino que se lleva a cabo median
te examen directo de las secreciones vaginales para detectar la presencia de las
clulas clave, que son clulas epiteliales con el borde recubierto de bacterias, la
existencia de bacilos pequeos y cocobacilos gramnegativos, la ausencia de lactob
acilos (bacilos grampositivos delgados), un valor de pH superior a 4,5 y un olor

a aminas (a pescado) que aparece cuando se aade una solucin a la secrecin de KOH a
l 10%. Cuando se observa en cultivo. G. vaginalls puede ser identificado presunt
ivamente en base a la hemolisis que produce en agar de dos capas con sangre huma
na y T w e e n tras 48 horas de incubacin. Sensibilidad a los antimicrobianos. No
existe una recomendacin expresa sobre la realizacin de pruebas de susceptibilidad
de G. vaginalls a los antimicrobianos. por lo que no existe un protocolo especfi
co para llevar a cabo este anlisis. El metronidazol es la sustancia de eleccin par
a el tratamiento de la vaginosis bacteriana. Las infecciones sistmicas causadas p
or

1100
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
arroz rlo y es ms resistente al calor que otros tipos, por lo que esta forma de gas
troenteritis se manifiesta con mucha frecuencia asociada al consumo de arroz fri
to en los restaurantes chinos. La segunda forma de gastroenteritis causada por f
l. cereus es consecuencia de la contaminacin de platos de carne y vegetales y cur
sa con retortijones y diarrea que aparecen entre 8 y 16 horas despus de la ingest
in del alimento contaminado. En este caso los sntomas estn causados por una enterot
oxina termolbil. Diagnstico de laboratorio. En los casos en los que se sospeche la
existencia de la forma cutnea del ntrax, debe recogerse el lquido de las vesculas,
asi como material del borde de la escara, con un hisopo para realizar extensione
s para la observacin al microscopio y para el cultivo. Si hay sospecha de ntrax pu
lmonar, hay que obtener muestras de esputo para los frotis y el cultivo. En el c
aso de la forma intestinal hay que llevar a cabo un coprocullivo. En el caso de
que pueda tratarse de una meningitis deben realizarse observaciones microscpicas
y cultivos a partir del LCR. En la fase septicmica deben realizarse hemocultivos.
L a deteccin de bacilos grampositivos grandes y con los bordes rectos (aspecto d
enominado boxear) en los frotis realizados a partir de cualquiera de los especmen
es indicados en el prrafo anterior tiene valor diagnstico. La microscopa de fluores
cencia, disponible en algunos laboratorios de anlisis y en el CDC. permite llevar
a cabo un diagnstico presuntivo rpido. Las especies de Bacillus crecen bien en ag
ar con sangre de oveja. Las colonias de 8. anthracis son habitualmente planas, c
on bordes irregulares (forma que se denomina "cabeza de Medusa"), blancuzcas con
la superficie spera (aspecto de cristal esmerilado) y, usualmente. no hemolticas.
Cuando se tocan con el asa de inoculacin, las colonias son pegajosas y se levant
an como la clara de huevo batida. B. cereus y otras especies del gnero tambin form
an colonias con forma de cabeza de Medusa. El bacilo del ntrax es inmvil, tanto po
r la prueba de la gota pendiente como en medio semislido, mientras que las restan
tes especies son mviles. La determinacin de la movilidad por la tcnica de la gota p
endiente es una prueba til para diferenciar B anthracis de 8. cereus, pero debe h
acerse con cultivos jvenes de ambos microorganismos. El resto de pruebas bioqumica
s y caractersticas adicionales que pueden utilizarse para identificar los aislami
entos a nivel de especie han sido recopiladas por Logan y Turnbull (Logan, 1999)
. Las pruebas de virulencia se llevan a cabo inyectando subcutnea o mtraperitonea
lmente en ratones una suspensin ligeramente turbia de las bacterias, que se prepa
ra resuspendiendo en solucin salina las colonias crecidas en medio slido. No debe
utilizarse un cultivo en medio lquido para los ensayos de virulencia debido a los
productos toxignicos que otras especies de Bacillus pueden formar en caldo nutri
tivo. La muerte del ratn tiene lugar entre 24 y 72 horas despus de la inyeccin, y e
s posible detectar los microorganismos en frotis realizados a partir de muestras
de sangre del corazn, hgado y bazo. No es posible llevar a cabo de modo fiable el
diagnstico de la gastroenteritis causada por 8. cereus mediante coprocultvo. porq
ue este microorganismo puede formar parte de la microbiota autctona del intestino
. Por tanto, el diagnstico depende del cultivo cuantitativo realizado a partir de
l alimento sospechoso de estar contaminado. La presencia de un nmero igual o supe
rior a 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo en el alimento sospech
oso constituye una evidencia presuntiva de contaminacin alimentaria por 8. cereus
(Logan, 1999).
5
La enfermedad diarreica aguda producida por 8. cereus se puede prevenir mediante
la coccin correcta y la refrigeracin de los alimentos preparados en grandes canti
dades, para prevenir la proliferacin de las formas vegetativas de las bacterias y
la formacin de la enterotoxina.

Nocardia
Caractersticas. En los frotis de muestras clnicas teidos por el mtodo de Gram. las e
species de Nocardia aparecen como bacilos grampositivos largos y delgados, forma
ndo rosarios de clulas o ramificados (Lmina 50-4). La caracterstica ms destacable de
las nocardias es que son parcialmente cido-alcohol resistentes: las clulas se tien
positivamente con una modificacin de la tincin de cido-alcohol resistencia (ZielhNeelsen o Kmyoun), lo que diferencia a estas bacterias de las del gnero Actinomyc
es. que pueden tener una apariencia semejante cuando se observan bajo tincin de G
ram. La cido-alcohol resistencia parcial puede ser difcil de demostrar y puede vis
ualizarse mejor si se hace crecer al microorganismo en el medio de Middlebrook 7
H10 o en leche tornasolada. La mayor parte de las infecciones estn causadas por N
ocardia asteroides, seguida por N. brasiliensis y con mucha menor frecuencia por
N. olitidis caviarum. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las nocardias se encu
entran en el suelo y en la materia orgnica, tienen distribucin mundial y causan en
fermedades en animales y peces. L a infeccin en humanos es ligeramente superior e
n el hombre que en la mujer. La infeccin se contrae usualmente por inhalacin del m
icroorganismo, aunque tambin puede tener lugar por contaminacin de las heridas con
tierra, o cuando las bacterias penetran en el organismo a travs del tubo digesti
vo cuando un material contaminado entra en contacto con una zona ulcerada de la
mucosa digestiva. En los pulmones, las nocardias son fagociladas por los macrlago
s alveolares, multiplicndose en el interior de los mismos, lo que desencadena una
respuesta inflamatoria mixta (neutrfilos, linfocitos y macrfagos) que eventualmen
te da como resultado la formacin de abscesos y. ocasionalmente, de granulomas. Lo
s estudios realizados in vitro sobre los mecanismos de defensa del hospedador fr
ente a las nocardias sugieren la implicacin de los neutrfilos, los macrlagos activa
dos y las clulas T citotxicas. Aunque los neutrfilos son incapaces de destruir las
especies virulentas de Nocardia. inhiben su crecimiento, deteniendo el avance de
la infeccin hasta que los macrfagos estn totalmente activados Si la infeccin no que
da limitada al pulmn, los microorganismos pueden extenderse por crecimiento hasta
otros tejidos adyacentes, produciendo empiema, afectacin de la pared costal y se
nos drenantes, o diseminarse hemalgenamente formando abscesos, especialmente en e
l cerebro, tejidos subcutneos y rones. El principal factor relacionado con el hospe
dador, y que implica un riesgo elevado de contraer nocardiosis. es una disfuncin
en la inmunidad celular, aunque muchas personas infectadas por Nocardia spp. no
tienen problema reconocido alguno en su inmunidad celular y humoral (Wilson. 198
9) La enfermedad pulmonar es la manifestacin ms frecuente de la nocardiosis y se c
aracteriza por una serie de sntomas como fiebre, anorexia, prdida de peso, tos, di
snea y dolor pleural. La infeccin en la piel y el tejido subcutneo puede dar lugar
a pioderma, celulilis, formacin de abscesos (uno o mltiples), una afeccin linfocutn
ea semejante a la esporotricosis y aparicin de nodulos. En Amrica Central y del Su
r. la infeccin primaria de la piel con N. brasiliensis puede producir un actmomic
etoma (una masa granulomatosa indurada y localizada con conductos fistulosos por
los que m a n a pus y los denominados granulos de 'azufre"), generalmente en la
s extremidades inferiores. La enfermedad diseminada casi siempre est causada por
N. asteroides. en la mayor parte de los casos tiene su origen en el pulmn, y se m
anifiesta tpicamente en forma de abscesos mltiples que afectan al sistema nervioso
central. La piel es la segunda localizacin ms comn del cuerpo para la diseminacin d
e las bacterias, seguida por el nn, el hgado y los ganglios linfticos Diagnstico de l
aboratorio. Las especies del gnero Nocardia crecen aerbicamente en la mayor parte
de medios no selectivos c o m o agar con sangre de oveja y agar chocolate, agar
Sabouraud-dextrosa sin cloranfenicol o medio Middlebrook. Estas bacterias tambin
pueden ser cultivadas en el medio BCYE (medio tamponado que contiene sangre, car
bn vegetal, y extracto d e levadura), utilizado para el aislamiento de Legionella
spp. Es importante indicar que las especies de Nocardia no siempre sobreviven a
los procesos de descontaminacin de las muestras que se aplican en los protocolos
para el
Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el agente causal es sensible a varios
agentes antimicrobianos. la terapia con antibiticos del ntrax se centra en el uso

de la penicilina sola o en combinacin con estreptomicina. Ambos antibiticos son m

u y activos frente a 8. anthracis. aunque algunas cepas producen una |5-lactama
sa. La susceptibilidad de otras especies de Bacillus a las penicilinas y cefalos
pornas es extremadamente variable. Sin embargo, la mayor parte de especies son in
hibidas por tetraciclinas, aminoglucsidos y cloranlenicol a bajas concentraciones
. Prevencin. La prevencin del ntrax en el hombre depende del control de los animale
s infectados. La rpida deteccin de los animales enfermos, su aislamiento y tratami
ento, y la incineracin de los cadveres son procedimientos indicados cuando se dete
ctan brotes epidmicos espordicos. En las reas enzoticas se utiliza la vacunacin con p
reparados de esporas no encapsuladas. Aquellas personas que por su profesin pueda
n tener riesgo de quedar expuestas tambin deben inmunizarse.

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
noi
aislamiento de micobacterias. La incubacin en una atmsfera que contenga un 1 0 % d
e CO favorece el crecimiento de estos microorganismos. Las especies de Nocardia p
ueden crecer en 48 horas, aunque normalmente las colonias tardan en aparecer ent
re 5 y 20 das, y pueden presentar aspecto cerleo, una superficie m u y irregular o
un aspecto rugoso aterciopelado, generalmente pigmentadas con tonalidades que v
an del amarillo al anaranjado. La observacin de formas filamentosas que se tien ex
clusivamente con un mtodo modificado de tincin de cido-alcohol resistencia distingu
e a las especies de Nocardia de las micobacterias. Las nocardias se diferencian
de la mayor parte de los actinomicetos aerbicos comprobando la resistencia a la ls
ozima (las especies de Nocardia son resistentes, mientras que las de los gneros S
treptomyces. Rhodococcus. Gordona y Aclinomadura son sensibles a la enzima). Las
especies de Nocardia se distinguen atendiendo a su capacidad para hidrolizar ca
sena, hipoxantina, tirosina y xantina. Sensibilidad a los antimicrobianos. Las su
lfonamidas son usualmente los agentes antimcrobianos de eleccin: sin embargo, la t
erapia antimicrobiana ptima depende de la especie de Nocardia presente, del patrn
de resistencia o sensibilidad de la cepa en particular y del tipo de infeccin. Ot
ros agentes antimcrobianos de utilidad potencial son el trimetoprim-sulfametoxazo
l. la amicacina y el imipenem.
gnero Actinomadura son una causa frecuente de micetomas actinomicticos. la mayor p
arte de los cuales aparecen en pases tropicales y subtropicales, donde caminar de
scalzo incrementa las posibilidades de exposicin a los microorganismos a travs de
pequeas heridas punzantes en la planta de los pies. Tradicionalmente se ha consid
erado que las especies del genero Streptomyces tienen una escasa relevancia clnic
a: sin embargo, una de las especies, S. somaliensis, ha sido identificada como u
n agente causal de micetomas actinomicticos. Las restantes especies del gnero tien
en importancia mdica slo muy ocasionalmente. Diagnstico de laboratorio. Los actinom
icetos aerbicos son de crecimiento lento y pueden necesitar entre dos y tres sema
nas de incubacin para formar colonias. Estos microorganismos crecen en la mayor p
arte de medios no selectivos utilizados para aislar bacterias, micobacterias y h
ongos. Las especies de Rhodococcus crecen como cocobacilos dispuestos en zigzag.
En los medios lquidos se observan formas filamentosas con ramificaciones rudimen
tarias. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas y presentan pigmentos d
e color marrn claro, coral, anaranjado y rosa intenso, que aparecen tras varios da
s de incubacin. Las colonias de R. equi son de color rosa o amarillo plidos, o cor
al, y pueden tener una textura viscosa. Las especies del gnero Gordona forman col
onias lisas y mucosas que se adhieren al medio o secas y elevadas. Los pigmentos
que producen tienen colores que van del beige al salmn Las especies del gnero Tsu
kamurella son levemente acidoalcohol resistentes cuando se tien mediante una modi
ficacin del mtodo de Kinyoun. Aparecen como bacilos largos que se fragmentan en tr
es trozos y no forman hitas areas. Las colonias son circulares, con los bordes en
teros o rizados. Pueden tener una textura seca o mucosa con pigmentos de color b
lanco a anaranjado. Las colonias rugosas aparecen tras siete das de incubacin. Las
especies del gnero Actinomadura forman colonias con apariencia cerebriforme, cerl
eas, duras, membranosas, con pigmentos de color blanco, amarillo, rosa o rojo. L
as colonias del gnero Streptomyces son secas, con una textura que tiene una apari
encia de tiza o terrea, con aspecto amontonado o plegado, con pigmentos de color
blanco-grisceo a amarillo y con un olor que recuerda al de los stanos con humedad
. Producen u n a amplia variedad de pigmentos que dan color tanto a las hilas co
mo al sustrato donde crecen stas. Algunas especies no forman hitas areas.
Otros

actinomicetos aerobios
Otros gneros del grupo de los actinomicetos que incluyen especies de inters clnico
para el hombre son Rhodococcus. Gordona. Tsukamurella. Actinomadura y Streptomyc
es. Otro miembro de este grupo, Trophyrema whippelii. es un microorganismo no cu
ltivable que es el agente causal de la enfermedad de Whpple. Manifestaciones clnic
as y patogenia. Los miembros de este grupo de microorganismos son ubicuos y se e
ncuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, habiendo sido aislados del
suelo, aguas dulces y marinas y materia orgnica. Rhodococcus equies la nica especi
e del gnero Rhodococcus patgena para el hombre. Es un patgeno oportunista que afect
a a individuos con un grado de inmunodepresin profundo, en los que causa una neum
ona granulomatosa de progresin lenta. El microorganismo puede aislarse a partir de
la sangre de los pacientes infectados. La infeccin se adquiere probablemente por
va respiratoria, posiblemente como consecuencia de la exposicin a animales mlecta
dos. La capacidad del microorganismo para sobrevivir en el interior de los macrfa
gos y, en ltimo trmino, causar su destruccin parece ser la responsable de su poder
patgeno. Las infecciones causadas por las especies de los gneros Gordona y Tsukamu
rella son muy poco frecuentes. Las especies de Tsukamurella son patgenas solament
e cuando concurren ciertas condiciones clnicas (p. ej.. inmunosupresin, presencia
de cuerpos extraos o infecciones crnicas activas, como tuberculosis). Las especies
del
Bacterias gramnegativas Enterobacteriaceae
Caractersticas. Las enterobactenas son bacilos gramnegativos. aerobios o anaerobi
os facultativos, no formadores de esporas, inmviles o mviles por flagelos pertricos
, oxidasa negativos, que producen cidos por va fermentativa a partir de la glucosa
y reducen los nitratos a nitritos. Los gneros incluidos en este grupo son los si
guientes: Budvicia. Buttiauxella. Cedecea. Qtrobacter. EdwarTabla 50-9
Medios selectivo y diferenciales para enterobacterias A g e n t e bacteriosttico
para g r a m p o s i t i v o s Eosina Y Azul de metileno Cristal vilela Sales bil
iares Sales biliares Carbohidrato fermentable Lactosa' Lactosa Xilosa Lactosa Sa
carosa Salicina Lactosa Sacarosa Lactosa Glucosa Sacarosa Color de las colonias
Indicador Fermentador Eosina Y Azul de metileno Rojo neutro Rojo lenol Rojas o n
egras con brillo Rojas Amarillas No termentador incoloras incoloras Rojas S, D S
, D S. D Categora"
Medio Eosma-azul de metileno (EMB) MacConkey Xilosa-lisinadesoxicolato (XLD) Hek
toen entrico (HE)
Sales biliares
Azul de bromotimol Rojo neutro Sulfito de bismuto Azul Ge timol Azul de bromotim
ol
Amarilloanaranjadas Rojas # Amarillas
Verdes, azul verdosas Incoloras n Incoloras
S, D
Salmonella-shigella (SS) Sulfilo de bismuto (BS) Tiosullato-citrato-saies biliar
es-sacarosa (TCBS)''
Sales biliares Verde brillante Sales biliares, pH 8 6
S S S. D

' D = diferencial, S = selectivo Frmula de Levine. # Las sanemelas que producen H,

S forman colonias negras Utilizado para el aislamiento de especies del gnero Vibr
io
:
v

1102
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
siella. Enterobacter. Escherichia. Ewingella. Hafnia. Klebsiella, Kluyvera. Lecl
ercla, Leminorella. Moellerella. Morganella. Obesumbactenum, Pragia, Panloea. Ph
olorhabdus, Proleus. Providencia. Rahnella. Salmonella. Serralia. Shigella. Tatu
mella. Trabulsiella. Xenorhabdus. Yersinia y Yokenella. Solamente unos pocos de
estos gneros sern objeto de anlisis en este captulo. Manifestaciones clnicas y patoge
nia. Las bacterias de la familia Enterobactenaceae se encuentran presentes en la
s plantas, el suelo, las aguas y el intestino del hombre y de los animales. Se h
an asociado con una gran diversidad de infecciones clnicas que incluyen abscesos,
neumona, meningitis, septicemia e infecciones de las vas urinarias. Los microorga
nismos que estn implicados con mayor frecuencia en las infecciones en el hombre s
on Escherichia coii y varias especies incluidas en los gneros Klebsiella, Proteus
, Enterobacter. Salmonella, Shigella, Serralia. Citrobacter y Providencia. Las e
species E. coli. Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae son las que se encuen
tran con una mayor frecuencia en las vas urinarias. K. pneumoniae es el responsab
le que con mayor frecuencia se encuentra asociado a las neumonas causadas por bac
ilos gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Las especies
causantes de bacteriemias son E. coli. K pneumoniae y P. mirabilis. Los miembros
pertenecientes a los gneros que exhiben una acusada resistencia a los antibiticos
, como Citrobacter, Enterobacter y Serratia, son los responsables ms probables de
las infecciones nosocomiales atribuidas a esta familia. Las enterobacterias aso
ciadas con procesos diarreicos son diversas especies incluidas en los gneros Shig
ella. Salmonella. Yersinia y las cepas enterohemorrgicas, enteropatgenas. enteroto
xignicas. enteromvasivas y enteroadherentes de la especie E coli. Las especies de
l gnero Shigella se aislan m u y raramente de una localizacin que no sea el tracto
gastrointestinal, mientras que las del gnero Salmonella se aislan con mayor frec
uencia de otras fuentes como sangre y orina. Las endoloxinas, que estn presentes
como componentes estructurales de la membrana externa de la pared celular de las
enterobacterias. asi como en otros bacilos gramnegativos. son responsables en g
ran medida de la morbilidad y mortalidad asociadas a las infecciones causadas po
r estas bacterias. Las endotoxinas estn formadas por una parte lipidica y otra po
lisacardica. con un componente minoritario de naturaleza proteica. Estos componen
tes de la clula bacteriana pueden producir fiebre, escalofros, hipotensin, granuloc
itosis. trombocitopenia. coagulacin intravascular diseminada y activacin del compl
emento por las dos vas, clsica y alternativa. El shock endotxico es el resultado de
una septicemia por bacterias gramnegativas, donde la endotoxina reacciona con l
os macrfagos, leucocitos, plaquetas, complemento y otras protenas del suero para i
ncrementar los niveles sricos de ciertas protenas proteoliticas y de sustancias va
soactivas. con la consiguiente estasis sangunea, incremento de la vasoconstriccin
perifrica y disminucin del gasto cardiaco. Debe quedar claro que los efectos letal
es de las endotoxinas dependen de la activacin y respuesta de los macrfagos. y que
la produccin de caqueetma por los macrfagos activados desempea un papel fundamenta
l en la manifestacin del shock profundo y en las mltiples lesiones orgnicas (Tracny
, 1988).
Otros factores patognicos de las enterobacterias incluyen el antigeno K1. que est
presente en un elevado porcentaje de cepas de E. coli que causan meningitis neon
atal; la cpsula de K. pneumoniae. que. al igual que la de los neumococos, inhibe
la fagocitosis; el antigeno Vi de Salmonella typhi, que puede interferir con los
procesos que causan la muerte intracelular de este organismo: y diversos tipos
de antgenos superficiales como las umbras, que participan en la adherencia de los
microorganismos a las superficies mucosas. Los factores determinados por plsmidos
parecen desempear un papel importante en las propiedades invasivas de Salmonella

. Shigella y las cepas enteroinvasivas de coli. Adems, las enlerotoxmas termolbile

s (TL) y termoestables (TE) de E. coli estn codificadas por plsmidos. Las toxinas
TL estimulan a la enzima adenilato ciclasa en las clulas de la mucosa del intesti
no delgado, que, a su vez. activa el cAMP, lo que provoca una salida de lquidos y
electrlitos desde las clulas a la luz intestinal, produciendo diarrea acuosa. Por
el contrario, las toxinas TE parecen activar la guanilato ciclasa. Diagnstico de
laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos a partir de muestras conta
minadas se facilita en gran medida con el empleo de medios selectivos y diferenc
iales (Tabla 50-9). El agar EMB (con eosina y azul de metileno) y el agar MacCon
key pueden ser utilizados de forma indistinta como medios mnimamente selectivos y
diferenciales para la seleccin y diferenciacin inicial de los bacilos gramnegativ
os termentadores y no termentadores de la lactosa. Los medios XLD y HE son medio
s diferenciales con un carcter selectivo ms acusado, y son especialmente tiles para
recuperar especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras con un elevado
grado de contaminacin bacteriana, como son las heces. El agar bismuto-sulfito (B
S) es un medio fuertemente selectivo de gran utilidad para la deteccin de salmone
las durante los brotes endmicos o epidmicos de las infecciones causadas por estas
bacterias. Las especies del gnero Salmonella producen H;S y se reconocen fcilmente
por que las colonias que forman en los medios XLD, HE y BS presentan el centro
de color negro. Los medios de enriquecimiento como el caldo selenito F o el cald
o GN (para gramnegativos) son recomendables cuando se pretende detectar las espe
cies de los gneros Salmonella o Shigella que estn en bajo nmero en muestras de hece
s. El agar CIN (cefsulodina-irgasn-novobiocina) incubado a temperatura ambiente e
s selectivo y diferencial para la recuperacin de Y enterocohtica. Las colonias de
esta bacteria en agar CIN tienen una apariencia que se denomina "en ojo de toro
", con el centro rojo y los bordes transparentes. El agar MacConkey con sorbitol
como azcar fermentable permite diferenciar la cepa 0157:H7 de E coli asociada a
sndrome hemoltico urmico, porque a diferencia de oirs cepas de E. coli. sta es incapa
z de fermentar el sorbitol. Algunas enterobactenas pueden ser identificadas pres
untivamente m e d i a n t e la determinacin de unas pocas pruebas bioqumicas y car
actersticas de las colonias que forman. Por ejemplo, las especies de Proteus exhi
ben una movilidad en enjambre cuando crecen en agar sangre, las de Klebsiella fo
rman colonias mucoides voluminosas, las de Serralia pueden sintetizar un pigment
o rojo, las de Salmonella pueden producir H,,S y E. coli es indol positiva. La i
dentifica-

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1103
Tabla 50-10 Caraceristicas diferenciales d e las e s p e c i e s d e enterobacte
rias aisladas m s f r e c u e n t e m e n t e e n e l laboratorio d e microbiolo
ga clnica (Continuacin)
cin deliniliva requiere pruebas bioqumicas adicionales. Se han descrito innumerabl
es esquemas de identificacin basados en la realizacin de pruebas bioqumicas convenc
ionales para la identificacin de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. E
n la Tabla 50-10 se indican las caracleristicas diferenciales de las enterobacte
rias mas comnmente aisladas en los laboratorios de microbiologa clnica. Hay disponi
bles diferentes sistemas comerciales para la identificacin de la inmensa mayora de
enterobacterias que ofrecen una gran sencillez de uso y precisin. En algunos cas
os, la identificacin puede llevarse a cabo en unas pocas horas y con una elevada
fiabilidad mediante estos mtodos. Los sistemas semiautomatizados pueden combinar
la realizacin de las pruebas de identificacin con las de sensibilidad a los antimi
crobianos en un nico dispositivo. En general, todos estos sistemas tienen un grad
o de precisin muy elevado y permiten obtener resultados comparables. La clasifica
cin de las enterobacterias ha experimentado una profunda revisin en los ltimos aos c
omo resultado de los estudios realizados con tcnicas de hibridacin de cidos nucleic
os. Debido a que la agrupacin fenotipica basada en pruebas bioqumicas no est siempr
e de acuerdo con el parentesco gentico, se ha eliminado la categora de tribu (p. e
j., Klebsielleae, Proteae) para agrupar a las especies dentro de la familia. His
tncamente, el gnero Salmonella se ha divido en la siguientes especies: S. typhi. S
. paratyphi A y B, S. choleraesuis. S. typhimurium y S. enleritidis. Debido a qu
e todas estas especies estn muy relacionadas genticamente, actualmente slo se recon
ocen dos especies, S. entrica y S. bongori. cada una de las cuales incluye mltiple
s serotipos. Casi todos los serotipos conocidos estn incluidos en la especie S. e
ntrica (Brenner, 2000). El serotipado se basa en la reactividad inmunolgica de los
antgenos somticos "O" termoestables, que son fundamentalmente de naturaleza lipop
olisacaridica. y los antgenos flagelares "H", que son termolbiles y de composicin p
roteica. El serotipo typhi de Salmonella tambin sintetiza un antgeno capsular deno
minado Vi. que es de naturaleza polisacardica y termolbil. En la prctica, la mayor
parte de laboratorios clnicos identifican los aislamientos c o m o "especie de Sa
lmonella" basndose en las pruebas bioqumicas, utilizando seguidamente los sueros e
specficos de grupo para asignar el microorganismo aislado a un serogrupo especfico
. La identificacin a nivel de serotipo slo se lleva a cabo en los laboratorios de
referencia. Los aislamientos que se componan como Shigella desde el punto de vis
ta bioqumico tambin se clasifican atendiendo a la reactividad inmunolgica de sus an
tigenos "O" al igual que las cepas de E coli identificadas como causas potencial
es de diarrea, sndrome hemolitico urmico o prpura trombocitopenica. Hay disponibles
sistemas comerciales que permiten la identificacin de co//0157:H7 y la deteccin d
e algunos tipos de toxinas en los cultivos o en muestras de heces; sin embargo,
la realizacin de estas pruebas es llevada a cabo, generalmente, por los laborator
ios de referencia. Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de las en
terobacterias a diversos agentes antimicrobianos es m u y variable debido tanto
a factores intrnsecos como a mecanismos de resistencia adquiridos. La resistencia
intrnseca es el resultado de rasgos genticos que han aparecido evolutivamente antes de que los antibiticos comenzaran a utilizarse teraputicamente.
Un ejemplo de esto es la resistencia a la penicilina observada en especies de lo
s gneros Citrobacter. Klebsiella. Enterobacter y Serratia. Algunas de ellas son i
ntrnsecamente resistentes tambin a las cefalosponnas de primera generacin. La resis
tencia adquirida es el resultado de la exposicin a los agentes antimicrobianos. E

jemplos de la misma son las cefalosporinasas de tipo I producidas por Citrobacte

r treundh y Enterobacter cloacae. que confieren resistencia a ceftacidima, y las
|5-lactamasas de amplio espectro sintetizadas por K. pneumoniae o col!, que son
responsables de la resistencia a las cefalosporinas de tercera generacin. Debido
a que el patrn de resistencia de las enterobacterias es impredecble, las pruebas
de sensibilidad deben realizarse, como regla general, si se considera administra
r una terapia antimicrobiana. En caso contrario, c o m o pueden ser las infeccio
nes intestinales sin complicaciones causadas por salmonelas, en las que un trata
miento con antibiticos contribuye realmente a prolongar el estado de portador en
el individuo afectado, no es necesario llevar a cabo las pruebas de sensibilidad
.
Vibrio
Caractersticas. Las especies del gnero Vibrio son bacilos gramnegativos cortos, re
ctos o curvados, anaerobios facultativos, oxidasa positivos, generalmente mviles
por flagelos polares, capaces de fermentar los carbohidratos y de reducir los ni
tratos a nitritos. Algunas de las especies tienen importancia clnica (Tabla 50-11
). Manifestaciones clnicas y patogenia. Entre las especies del gnero. Vibrio vulni
ticus causa la patologa ms grave. Las infecciones de las heridas y la septicemia d
ebidas a esta bacteria son. a menudo, mortales. La enfermedad est asociada con el
consumo de ostras crudas o con heridas producidas al manipular ostras. En los c
asos graves casi siempre existe una afeccin heptica subyacente. Una funcin heptica d
isminuida provoca un aumento en la concentracin de hierro utilizable por el micro
organismo, lo que facilita su crecimiento, Las cepas 01 de Vibrio cholerae produ
ctoras de toxina colrica son responsables de las epidemias de clera, enfermedad qu
e se caracteriza por una masiva prdida de lquidos a nivel del intestino y que prov
oca deshidratacin en el paciente. La toxina colrica ejerce su accin unindose a la en
zima adenilato ciclasa de las clulas del epitelio de la m u c o s a del intestino
delgado causando su activacin, lo que trae c o m o consecuencia una hipersecrecin
de agua y electrlitos (Kaper, 1995). Las cepas no-01 de V. cholerae causan una g
astroenteritis autolimitada y no provocan epidemias de la enfermedad. Prcticament
e ninguna de las cepas no-01 de V. cholerae produce toxina colrica, aunque s que s
intetizan dos tipos de hemolismas y una enterotoxina termoestable. Las especies
V mimicus y V. parahaemolyticus causan gastroenteritis primariamente. La patogen
icidad en el caso de V. parahaemolyticus parece estar relacionada ms con el carcte
r invasivo de esta especie que con la produccin de enterotoxinas. Ms del 95% de ce
pas de V. parahaemolyticus ais-

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1105
ladas de pacientes con gastroenteritis producen una hemohsina exocelular que es
letal para el ratn cuando se le inyecta en dosis elevadas, lo que se conoce con e
l nombre de fenmeno de Kanagawa. Esta bacteria halfila est ampliamente distribuida
en las aguas marinas, contaminando a pescados y mariscos. Los brotes de diarrea
aguda tras la ingestin de pescado crudo han sido particularmente frecuentes en Ja
pn, pero tambin se han producido en EE.UU. y otros pases. Diagnstico de laboratorio.
Aunque antiguamente la preocupacin slo afectaba a los viajeros de EE.UU. que iban
a reas endmicas, recientemente se han detectado casos de enfermedad causada por V
. cholerae en este pais asociados a la ingestin de mariscos contaminados proceden
tes de la costa del golfo de Mxico. Adems, se han descrito casos de gastroenteriti
s por V. parahaemolyticus y otras especies halfilas del gnero Vibrio presentes en
mariscos contaminados en muchas regiones del pas, especialmente en zonas costeras
. Por consiguiente, es importante que los laboratorios clnicos tengan la capacida
d para realizar coprocultivos para el aislamiento de especies de Vibrio cuando e
st indicado, en funcin del historial (viajes realizados, alimentos consumidos) de
la persona sobre la que existe la sospecha de que est sufriendo infecciones de es
te tipo. Con la excepcin de V. cholerae y V mimicus, el crecimiento de los vibrio
s requiere que los medios de cultivo contengan NaCI. La mayor parte de medios de
cultivo slidos y lquidos utilizados habitualmente para el cultivo de bacterias co
ntienen sodio suficiente, por lo que no es necesario utilizar medios especales en
esos casos. Los medios selectivos que contienen sacarosa, como el agar con tios
ulfato, citralo y sales biliares (agar TCBS). son de gran utilidad para el culti
vo de Vibrio spp. a partir de muestras de heces. Algunas especies (V. cholerae y
V. alginolyticus) son capaces de fermentar la sacarosa y forman colonias de col
or amarillo en ese medio. Puede utilizarse un medio de enriquecimiento como el a
gua de peptona alcalina antes de realizar la inoculacin en medio slido selectivo,
con objeto de aumentar las posibilidades de recuperacin de las especies de Vibrio
a partir de muestras de heces. Los miembros del gnero pueden diferenciarse entre
ellos y de otros bacilos intestinales gramnegativos segn las caractersticas bioqum
icas que se muestran en la Tabla 50-11. En el caso de los vibrios halfilos puede
ser necesario utilizar medios que contengan entre un 1% y un 3% de NaCI para lle
var a cabo las pruebas pertinentes. Si se inoculan placas con agar TSI (agar tri
ple azcar-hierro) y agar LIA (agar lisina-hierro) con finalidad analtica, las reac
ciones observadas deben ser pendiente cida/fondo cido sin gas (A/A) o con formacin
de H S, y pendiente alcalina/fondo alcalino (K/K), respectivamente. No todos los
sistemas comerciales existentes para la identificacin de bacterias gramnegativas
son seguros para llevar a cabo la identificacin de las especies del gnero Vibrio,
y slo deben utilizarse cuando se ha comprobado previamente su Habilidad
?
para producir una enterotoxina. Tambin se ha descnto una hemolisina y un factor c
itoptico. Las especies de Aeromonas tambin causan infecciones de heridas traumticas
, diarrea o septicemia en pacientes inmunocomprometidos (Janda, 1991.1994). Diag
nstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos. termentadores y o
xidasa positivos, sugiere fuertemente la posibilidad de que se trate de una espe
cie de Aeromonas. Estos microorganismos crecen fcilmente en los medios de cultivo
convencionales, lormando colonias que recuerdan a las que producen las especies
del gnero Pseudomonas. con un color verdoso semejante al del vidrio triturado y
un olor afrulado. La m a y o r parte de especies son [i-hemoliticas cuando crece
n en agar sangre. El aislamiento de aeromonas a partir de muestras de heces se f
acilita si se utiliza agar sangre con ampicilina o medio CIN (agar cefsulodina-i
rgasn-novobiocina). Sensibilidad a los antimicrobanos. Las Aeromonas son sensibles

a las quinolonas. las cefalosporinas de tercera generacin, los aminoglucsidos, el

cloranfenicol y las tetraciclinas, aunque producen u n a |Wactamasa que es resp
onsable de la resistencia a las penicilinas y las cefalosponnas de primera gener
acin. Se ha comprobado que las Aeromonas albergan plsmidos R tanto de enterobacter
ias como de Pseudomonas spp. Los sistemas comerciales rpidos para las pruebas de
sensibilidad pueden no ser liables para este grupo de bacterias, por lo que se r
ecomienda el mtodo de difusin en disco.
Plesiomonas
Caractersticas. Plesiomonas shigelloses, la nica especie comprendida dentro del gne
ro Plesiomonas. es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, oxidasa y cata
lasa positivo, que fermenta la glucosa. Las ltimas evidencias obtenidas mediante
tcnicas de gentica molecular indican que el gnero Plesiomonas est estrechamente rela
cionado con el gnero Proteus de la familia Enterobacteriaceae. Manifestaciones cln
icas y patogenia. P shigelloses se encuentra en ambientes acuticos, con una distr
ibucin geogrfica limitada por la temperatura mnima de crecimiento de la bacteria, q
ue es 8 C. El microorganismo puede aislarse a partir de aguas dulces y de estuar
io en pases tropicales, y provoca gastroenteritis, a menudo tras la ingestin de ma
nsco crudo. Las heces diarreicas contienen, frecuentemente, leucocitos polimorio
nucleares y hemates, aunque los individuos infectados tambin pueden padecer una en
fermedad similar al clera. La gastroententis puede aparecer en casos espordicos o
en forma de epidemias. Las formas extraintestinales de la infeccin por P shigello
ides incluyen meningitis, septicemia, celulitis, artritis y endoftalmitis. Se sa
be relativamente poco sobre los factores de virulencia asociados a esta especie
bacteriana. P shigelloides parece tener carcter invasivo, y algunas investigacion
es sugieren la existencia de una actividad enterotoxigmca (Brenden, 1988). Diagnst
ico de laboratorio. P. shigelloides puede aislarse en diversos medios de cultivo
no selectivos y selectivos para enterobacterias, incluyendo el agar HE. La prod
uccin de cidos a partir de la lactosa tiene carcter variable, aunque por lo general
esta bacteria aparece como no termentadora de la lactosa cuando crece en medios
selectivos para bactenas entricas. Entre otras caracteristicas bioqumicas se pued
en citar las siguientes; es i n d c J positiva, reduce los nitratos a nitritos,
produce catalasa, da positiva la prueba del rojo de metilo y fermenta la glucosa
, la maltosa y la trehalosa (Brenden, 1988). Sensibilidad a los antimicrobianos.
P. shigelloides es sensible a una gran variedad de antibiticos, incluidos aminog
lucsidos, trimetoprim-sulfametoxazol. cloranfenicol. tetraciclinas y quinolonas.
La sensibilidad a las penicilinas es variable debido a la produccin de una |i-lac
tamasa similar a la de Aeromonas spp
Sensibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de sensibilidad a los antimicrob
ianos pueden realizarse mediante el mtodo de difusin en disco, utilizando agar Mue
ller-Hinton. El National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha
establecido los patrones de referencia para interpretar los resultados de las pr
uebas de sensibilidad de V. cholerae frente a la ampicilina. la tetraciclina, el
trimetoprim-sulfametoxazol. el cloranlenicol y las sullonamidas (NCCLS. 2000a).
No existen patrones de referencia para las otras especies del gnero.
Aeromonas
Caractersticas. Las especies de este gnero son bacterias gramnegativas de morfologa
bacilar, oxidasa y catalasa positivas, y anaerobias facultativas. Generalmente
son mviles por medio de flagelos polares, aunque algunas especies son inmviles. Pr
oducen cidos a partir de los carbohidratos, tanto por via oxidativa c o m o ferme
ntativa, y reducen los nitratos a nitritos. Manifestaciones clnicas y patogenia.
Las especies de Aeromonas se encuentran presentes en hbitats acuticos principalmen
te. Se han aislado a partir del agua potable, agua de ros, suelo y varios tipos d
e alimentos, y slo raramente de ambientes marinos. Estos microorganismos se han a
sociado con infecciones intestinales y extraintestinales. Aunque no existe una e
videncia definitiva que demuestre el papel de las Aeromonas en las infecciones g
astrointestinales, la presencia de especies de Aeromonas en muestras de heces se
asocia ms con un proceso diarreico que con un estado de portador asintomtico. La

diarrea se asocia con la capacidad que tienen algunas cepas

Campylobacter
Caractersticas. Los miembros del gnero Campylobacter son bacterias gramnegativas d
e pequeo tamao (0.5 pm -8 pm de largo por 0.2 iim-0,5 pm de ancho), curvadas (en f
orma de c o m a o de letra S). mviles y no formadoras de esporas, con un crecimie
nto ptimo en una atmsfera que contenga entre un 5% y un 10% de oxigeno solamente,
razn por la que estas bactenas se consideran microaerfilas. Campylobacter je/uni e
s la causa ms comn de enteritis bacteriana en los EE.UU. Otras especies del gnero a
sociadas con esta patologa son C. coli. C. tari y C upsaliensis. C. letus subespe
cie fetus causa tromboflebitis sptica, artritis, peritonitis, abscesos y pericard
itis (Penner, 1988), especialmente en personas con enfermedades crnicas subyacent
es.

1106
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Manifestaciones clnicas y patogenia. C. jejuni se encuentra distribuido por todo
el mundo, formando parte de la microbiota del tubo digestivo de animales salvaje
s y domsticos (ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos y aves de cor
ral, como pavos y pollos). Es la causa ms comn de enteritis bacteriana en EE.UU..
con una incidencia estimada de 1.000 casos por cada 100.000 individuos. L a inci
dencia de la infeccin es similar en el Remo Unido y en otros pases desarrollados,
mientras que en los pases subdesarrollados es incluso ms elevada. Las infecciones
tienen lugar, generalmente, durante el verano y el otoo y normalmente son consecu
encia de la ingestin de alimentos mal cocinados, en especial carne de pollo y otr
as aves de corral. Tambin se han asociado algunos brotes de enteritis por C. jeju
ni al consumo de leche y a fallos en los sistemas municipales de potabilizacin de
aguas. La infeccin puede ser desde asintomtica hasta muy grave. Las heces diarrei
cas pueden indistintamente contener o no sangre y leucocitos. Los sntomas pueden
durar hasta una semana y generalmente son autolimitados. Tambin pueden producirse
infecciones extramtestmales como bacteriemia. artritis reactiva, infecciones de
las vas urinarias y meningitis. C. ejuni tambin est reconocido como la causa antece
dente del sndrome de Guillain-Barr. La capacidad patognica de esta bacteria no est t
otalmente esclarecida: parece que primero coloniza la mucosa intestinal y luego
es capaz de atravesar la superficie epitelial para alcanzar los tejidos subyacen
tes. El habitat principal de C. telus subesp. lelus es el intestino de ovejas y
ganado vacuno, aunque tambin puede encontrarse en el tracto genital de estos anim
ales, en sus placentas, en el contenido gstrico de los fetos abortados y, con men
or frecuencia, en otros animales y en aves. Los mecanismos de transmisin al hombr
e no estn plenamente caracterizados. El contacto directo con animales infectados
es una posible causa de contagio, aunque menos de un tercio de individuos infect
ados tienen un historial de riesgo a la exposicin por razones profesionales o amb
ientales. Los alimentos y las aguas contaminadas pueden ser un vehculo para la in
feccin en humanos, aunque tambin sta puede producirse a partir de una fuente endgena
. Diagnstico de laboratorio. Una nica muestra de heces es apropiada, generalmente,
para detectar patgenos intestinales, incluyendo las especies de Campylobacter. E
l examen de la muestra en busca de leucocitos fecales no est recomendado porque sl
o aparecen en menos de un 25% de los casos. Est disponible un enzimoinmunoensayo
(EIA) para la deteccin de antgenos de C. jejuni y C. coli directamente en las mues
tras de heces. Pueden utilizarse diferente medios para el aislamiento selectivo
de las especies de Campylobacter. como agar carbn vegetal-cefoperazona-desoxicola
to, medio selectivo con carbn vegetal, medio semislido sin sangre (para movilidad)
, medio de Skirrow y agar Campylobacter con un 5% de sangre de oveja y cinco ant
imicrobianos (cefalotina, tnmetoprim. vancomicina. polimixina B y anfot e r i c
m a B). La mayor parte de especies necesitan una atmsfera de incubacin microaerfila
(5% de 0 , 10% de CO, y 85% de N,). que puede conseguirse mediante sistemas gen
eradores de gases disponibles comercialmente, La cantidad de oxgeno existente en
una jarra con vela es demasiado baja para permitir el crecimiento de Campylobact
er spp.. por lo que no debe utilizarse. La incubacin de los medios a 42' C increm
enta la selectividad para C. jejuni.
2
agentes. No existen hasta el momento mtodos estandarizados para llevar a cabo las
pruebas de sensibilidad en este grupo de microorganismos.
Helicobacter
Caractersticas. Las especies del gnero Helicobacter son bacilos gramnegativos curv
ados o en espiral, no esporulados. que miden entre 0,3 um-1.0 iim de ancho y 1 .

5 Lim-10 iim de largo. Son mviles por medio de mltiples flagelos localizados en a
mbos polos de la bacteria o de un nico flagelo monopolar, microaeroflicas y tienen
metabolismo respiratorio. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de H
elicobaterse encuentran en el Irado gastrointestinal de los mamferos y las aves.
La transmisin entre hospedadores es por va oral u oro-fecal. Helicobacterpylori es
t considerado como una de las especies "gstricas" del gnero. Esta bacteria vive den
tro de la capa mucosa del estmago adyacente al epitelio o inmediatamente por deba
jo de la misma. Tambin se encuentra transitoriamente en el duodeno, en la saliva
y en las heces. La infeccin por H. pylon puede provocar los sntomas de una gastrit
is aguda. La mayor parte de pacientes infectados desarrollan una gastritis crnica
activa que puede conducir a una dispepsia no ulcerosa o a una lcera duodenal. Es
ta especie se ha asociado con el 90% de los casos de lcera duodenal y con la prcti
ca totalidad de los de lcera gstrica. La infeccin por H. pylori tambin se ha relacio
nado con el carcinoma y el lintoma gstricos (Murray, 1993: Parsonnet, 1991,1994).
La prevalencia de la gastritis asociada a la infeccin por H. pylon aumenta con l
a edad, lo que sugiere que el microorganismo se adquiere a medida que la gente e
nvejece, Las especies "intestinales" del gnero, tales como Helicobacter (antiguam
ente Campylobacter) cmaedi y H. lenelliae. han sido implicadas en casos de gastr
oenteritis. Estos microorganismos invaden raramente el torrente circulatorio, pu
diendo ser aislados entonces mediante hemocultivo. Diagnstico de laboratorio. Los
mtodos no basados en el cultivo bacteriano se han utilizado clsicamente para el d
iagnstico de las infecciones causadas por H. pylori. Uno de estos mtodos se basa e
n la deteccin de urea en el aliento. Esta tcnica no invasiva detecta la actividad
utesica de H. pylori midiendo el CO etiquetado con C o C que se desprende en el a
ire expelido por el paciente al que se le ha administrado previamente urea marca
da radiactivamente. Los mtodos serolgicos tambin s e utilizan ampliamente en los pa
cientes sintomticos para detectar anticuerpos frente a H. pylon. En algunos casos
pueden obtenerse por biopsia muestras de tejido afectado que se examinan histolg
icamente mediante tincin con hematoxilina y eosina o por la tcnica de Gemsa. para d
etectar la presencia de bacterias con la morfologa tpica de H. pylon. Debido a que
el microorganismo hidrolza la urea m u y rpidamente, una alcuota de la biopsia de
tejido gstrico debe incubarse directamente en caldo urea o en placas con agar ure
a, para detectar la hidrlisis de la urea entre 1 y 24 horas despus. Desde hace poc
o tiempo, se encuentra disponible en el mercado un enzimoinmunoensayo para la de
teccin de antgenos de H. pylon en heces, que augura ser una alternativa muy promet
edora para el diagnslico no invasivo de las infecciones causadas por esta bacteri
a.
M l3 ?
Si se sospecha la presencia de Campylobacter spp. en un hemocultivo basndose en e
l historial clnico o en la apariencia del microorganismo observado bajo tincin de
Gram. el caldo debe ser subcultivado en un agar sangre no selectivo, que se incu
bar a 37 C en una atmsfera microaerofilica. En general, las colonias de Campylobac
ter spp. son de color gris, planas, irregulares y extensas, que pueden convertir
se en redondas, convexas y relucientes a medida que la humedad del medio va dism
inuyendo. La observacin de la morfologa tpica bajo tincin de Gram y una prueba posit
iva de la oxidasa a partir de una colonia crecida en un medio selectivo a 42'C s
on evidencias suficientes para identificar a un aislamiento como una especie de
Campylobacter. C. jejuni es capaz de hidrolizar el hipurato y es sensible al cido
nalidxico y resistente a la cefalotina. C. coli no hidrolza el hipurato. Las cepa
s de C. fetus subesp. ietus son resistentes al cido nalidxico, son incapaces de hi
drolizar el hipurato y no crecen generalmente a 42C. Sensibilidad a los antimicro
bianos. C jejuni tiene una sensibilidad variable a los agentes antimicrobianos.
La mayor parte de especies no son sensibles a las penicilinas y las cefalosporin
as. En el caso de infeccin intestinal, la eritromicina es el antibitico de eleccin,
con las quinolonas c o m o opcin alternativa, aunque se han detectado resistenci
as frente a ambos
Para el cultivo, las muestras de tejidos deben mantenerse a 4 C y ser procesadas
antes de que transcurran dos horas tras su recoleccin. Como medios de transporte

pueden utilizarse diferentes alternativas, como el caldo Brucella con un 20% de

glicerol, el medio Albem con cistena y un 20% de glicerol. solucin salina isotmca c
on un 4% de glucosa y el medio de transporte de Stuart. Las muestras procesadas
deben inocularse en alguno de los medios apropiados, entre los que se encuentran
el caldo infusin de cerebro y corazn, agar Brucella. agar Columbia y medio de Ski
rrow enriquecido con sangre o suero de caballo, o con sangre de oveja. Se recomi
enda que los medios contengan vancomicina, anfolencina y cefsulodina c o m o age
ntes selectivos, Una vez inoculados, los medios deben incubarse en una atmsfera m
icroaerofilica (5%-10% de CO. 80%-90% de N y 5%-10% de 0 ). con humedad elevada,
a 35 C. durante 5-7 das. La presencia de H (5%-8%) en la atmsfera de incubacin favo
rece el crecimiento de H. pylon.
2 ?
Por lo general, en los medios antenormente mencionados. H. pylori a lugar a colon
ias pequeas, de color gris y translcidas, formadas por bacilos espirales gramnegatv
os. cuando se observan en extensiones teidas por el mtodo de Gram, y que dan posit
ivas las pruebas de la oxdasa, la catalasa y la ureasa. Generalmente no se lleva
a cabo el aislamiento de las especies intestinales de Helicobacter a partir de h
eces. Las diferentes especies del gnero pueden

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1107

crecer y delectarse en los sistemas automatizados para hemocultivo que se emplea

n en muchos laboratorios, aunque en este caso puede ser necesano prolongar el pe
rodo de incubacin ms all de los cinco das estndar. Sensibilidad a los antimicrobianos
Para el tratamiento de las infecciones causadas por H. pylori se utilizan regmen
es de administracin combinada de antibiticos, que incluyen, usualmente. dos antibit
icos (metronidazol. clantromicina, tetraciclina o amoxicilina) y un medicamento
anticido. Se ha descrito la existencia de cepas que son resistentes al metronidaz
ol y a la claritromicina. Para realizar las pruebas de sensibilidad, el NCCLS re
comienda el mtodo de dilucin en agar, empleando agar Mueller-Hinton enriquecido co
n un 5% de sangre de oveja (NCCLS, 2000b).
que producen las bacterias de este grupo. Las reacciones se detectan usualmente
al cabo de 48 horas, aunque en algunos casos puede ser necesario prolongar la in
cubacin hasta siete das. Sensibilidad a los antimicrobianos. Como regla general, l
as pruebas de sensibilidad deben realizarse con todos los aislamientos de P. aer
uginosa con significado clnico. Esto es especialmente importante en el caso de ce
pas hospitalarias, que pueden ser resistentes frente a uno o incluso todos los a
gentes antimicrobianos que se utilizan para tratar las infecciones Entre stos se
incluyen los aminoglucsidos, las carboxi- y ureidopenicilinas, la celtacidima o c
efepima y las quinolonas.
Burkholderia y Stenotrophomonas Pseudomonas
Caractersticas. El gnero Pseudomonas ha experimentado una profunda revisin y en la
actualidad muchas de las especies que haban sido inicialmenle clasificadas dentro
de este gnero han sido reclasificadas dentro de los gneros Burkholderia. Slenolro
phomonas, Comamonas, Shewanella. Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas. Acid
ovorax y Brevundimonas. Entre las especies que permanecen dentro del gnero Pseudo
monas. P. aerugmosa es la que tiene mayor importancia como patgeno del hombre. La
s pseudomonas son bacilos gramnegativos. aerobios estrictos, catalasa y oxidasa
positivos. Su metabolismo es estrictamente respiratorio (oxidativo), nunca ferme
ntativo, utilizando el oxgeno como el aceplor final de electrones. Algunas especi
es son mviles por medio de flagelos polares. Manifestaciones clnicas y patogenia.
Las especies del gnero Pseudomonas se encuentran distribuidas en ambientes hmedos.
Algunos de los habitat ms inusuales en donde se pueden encontrar estas bacterias
incluyen los productos cosmticos, el agua de las piscinas y jacuzzis. y la parte
interior de la suela de las zapatillas. En este ltimo caso, esta es la fuente a
partir de la que pueden infectarse con P. aeruginosa pequeas heridas punzantes en
la planta de los pies. La especie del gnero responsable de la mayor morbilidad y
mortalidad hoy en da es P. aeruginosa. Aunque otras especies del gnero se aislan
a menudo a partir de especmenes clnicos, slo estn implicadas ocasionalmente en infec
ciones en el hombre. P. aeruginosa es ubicua en el ambiente hospitalario, encont
rndose presente en casi cualquier lugar en el que haya humedad, incluyendo equipo
s mdicos, soluciones desinfectantes y jabones. Se encuentra muy raramente lormand
o parte de la microbiota normal en las personas sanas, pero en los individuos ho
spitalizados la lasa de colonizacin se incrementa de forma proporcional a la dura
cin del perodo de hospitalizacin. P. aeruginosa puede producir infecciones graves e
n pacientes con quemaduras, que tienen heridas traumticas o quirrgicas, que han su
frido manipulaciones en sus vas urinarias, que tienen enfermedades en los sistema
s hematopoytico. reticuloendotelial y linftico, y en todos aquellos que tienen pro
blemas en sus defensas inmunolgicas de tipo humoral o celular. Las infecciones pu
lmonares causadas por estos microorganismos aparecen primariamente en pacientes
con fibrosis quistica La tasa de mortalidad ms elevada se da en individuos con le

ucopenia grave (<1.000 leucocitos neutrfilos polimorfonucleares [PMN] por mnr). P

. aeruginosa sintetiza un polisacrido mucoso, una endotoxina y varias proteasas q
ue inactivan los componentes del complemento, lo que conlleva una cierta inhibic
in de la opsonizacin y de la respuesta inflamatoria, contribuyendo a la invasivida
d del microorganismo. La exotoxina A causa dao celular, favorece la invasin de los
tejidos y es txica para los macrfagos. Diagnstico de laboratorio. A menudo es posi
ble sospechar la presencia de P. aeruginosa en los cultivos por el olor a uvas y
a humedad (o a tortilla de maz) de los mismos, el aspecto rugoso o de polvo de c
ristal de sus colonias y la presencia de pigmentos o de un brillo metlico en las
mismas. Su identificacin se puede llevar a cabo fcilmente determinando la prueba d
e la oxidasa (P. aeruginosa es oxidasa positiva), una reaccin pendiente alcalina/
fondo neutro en agar TSI, la capacidad para crecer a 42"C y la formacin de brillo
metlico y/o de pigmento en la pendiente de los tubos con agar TSI o agar P para
Pseudomonas. Otras caractersticas que pueden determinarse adicionalmente se indic
an en la Tabla 50-12. Las pruebas de utilizacin de los carbohidratos deben realiz
arse en el medio basal para la delerminacin del metabolismo xido-fermentativo (O-F
), que contiene una cantidad mnima de peptona (fuente de nitrgeno) y una concentra
cin relativamente elevada de carbohidrato, y que permite la deteccin de las cantid
ades muy pequeas de cidos Caractersticas. Las pseudomonas fueron inicialmente divid
idas en cinco grupos en funcin de los datos de homologa de sus cidos ribonucleicos
(ARN). Estudios taxonmicos recientes han dado como resultado una reclasificacin de
los microorganismos incluidos en cuatro de esos cinco grupos en varios gneros nu
evos: Burkholderia, Slenolrophomonas. Ralstonia, Brevundimonas. Comamonas y Acid
ovorax. Todas estas bacterias son grampositivas, tienen morfologa bacilar, no for
m a n esporas, son aerobias estrictas y, con la excepcin de Burkholderia mallei.
son mviles mediante flagelos polares. Son catalasa positivas y la mayor parte de
especies son tambin oxidasa positivas. En agar MacConkey estas bacterias no ferme
ntan la lactosa. Importancia clnica y patogenia. Estos microorganismos se encuent
ran en las aguas, el suelo y las plantas. Debido a su predileccin por los ambient
es en donde existe humedad, algunos de ellos pueden encontrarse en entornos hosp
italarios y tienen la capacidad potencial para producir infecciones nosocomiales
. Dos especies patgenas de importancia dentro del gnero Burkholderia son Burkholde
ria pseudomallei y Burkholderia cepacia. B. pseudomallei infecta por inhalacin o
a travs de heridas o abrasiones en la piel, causando la enfermedad denominada mel
ioidosis. La infeccin puede ser asintomtica. hacerse crnica o provocar una sepsis f
ulminante. L a melioidosis tiene u n a mayor prevalencia en el sudeste asitico y
en Australia, aunque tambin s e dan casos en otros ambientes tropicales y subtrop
icales. Burkholderia cepacia. un patgeno nosocomial que se encuentra en equipos c
ontaminados, medicinas y desinfectantes, puede causar bacteriemia. infecciones d
e las vas urinarias, artritis sptica e infecciones respiratorias. Tambin es un patge
no importante en los pacientes con fibrosis quistica o con enfermedad granulomat
osa crnica. Los enfermos de fibrosis quistica con infeccin crnica por este microorg
anismo tienen una tasa de supervivencia ms baja. Stenotrophomonas maltophilia es
un patgeno nosocomial importante. Los factores de riesgo que incrementan las posi
bilidades de colonizacin o de infeccin por este microorganismo son la respiracin as
istida, la terapia con antibiticos de amplio espectro, la cateterizacin y el estad
o de neutropenia. Las especies de los gneros Ralstonia. Brevundimonas. Comamonas
y Acidovorax se aislan con muy poca frecuencia a partir de las muestras clnicas.
Diagnstico de laboratorio. Las especies de estos gneros crecen bien en los medios
de cultivo estndar, como agar sangre y agar chocolate. El aislamiento de B. cepac
ia a partir de especmenes contaminados, c o m o el esputo, puede facilitarse util
izando medios selectivos, como agar PC (Pseudomonas cepacia). agar base para met
abolismo xido-fermentativo, con polimixina B. bacitracina y lactosa (agar OFBL).
y agar selectivo para B. cepacia (agar BCSA) Son necesarias una amplia variedad
de pruebas bioqumicas para poder distinguir cada una de estas especies. Una prueb
a bioqumica importante para diferenciar a S. maltophilia es la prueba de la oxida
sa, que es negativa para esta especie. Sensibilidad a los antimicrobianos. L a s
ensibilidad de estos microorganismos a los agentes antimicrobianos varia conside
rablemente. B. cepacia es muy resistente a un gran nmero de antimicrobianos, aunq
ue normalmente es sensible a la piperacilina, azlocilina. cefoperaxona. ceftacid

ima, cloranfenicol y trimetoprim-sulfametoxazol. Las cepas aisladas a partir de

pacientes con fibrosis quistica que han recibido sesiones de tratamiento con ant
ibiticos repetidas son probablemente resistentes a los antibiticos empleados. S. m
altophilia es intrnsecamente resistente a muchos antibiticos El trimetoprim-sulfam
etoxazol es el antibitico de eleccin, aunque las infecciones graves pueden necesit
ar un tratamiento combinado con diferentes agentes

Tabla 50-12
Caractersticas diferenciales de las p s e u d o m o n a d c e a s aisladas de mue
stras clnicas

CAPITULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1109
antimicrobianos. No existen mtodos estndar para la realizacin be las pruebas de sen
sibilidad para este microorganismo, por lo que es difcil obtener resultados preci
sos y reprodceles.
Acinetobacer
Caractersticas. Los microorganismos de este gnero son gramnegativos, tienen morfol
oga bacilar, a veces casi coccea, y son inmviles, oxidasa negativos y aerobios estr
ictos. En los frotis teidos por el mtodo de Gram aparecen a menudo dispuestos en p
arejas y pueden ser difciles de decolorar. Manifestaciones clnicas y patogenia. La
s especies del gnero Acinetobacter se encuentran habitualmente en el suelo y en l
as aguas, y con mucha menor frecuencia en la piel y mucosas de las personas sana
s. Es escasa la informacin sobre los factores de virulencia asociados a este grup
o de microorganismos, aunque parecen producir endotoxina en pequeas cantidades. A
unque son usualmente no patgenas, estas bacterias han sido asociadas, cada vez co
n una mayor frecuencia, con septicemia, neumona, bacteriuria e infeccin de las her
idas en el entorno hospitalario. Diagnstico de laboratorio. Las especies de Acine
tobacter pueden distinguirse fcilmente de otras bacterias del grupo de las pseudo
monas en base a su inmovilidad, su incapacidad para reducir los nitratos y dar n
egativa la reaccin de la oxidasa. Puede ser difcil llevar a cabo la diferenciacin d
e las especies que oxidan la glucosa: estos aislamientos se agrupan dentro del d
enominado complejo A calcoacelicus-baumannii(Gerner-Smidt, 1991) La mayor parte
de aislamientos glucosa-negativos y no hemolticos corresponden a la especie A. Iw
otfi. mientras que los hemolticos se identifican c o m o A haemolyticus. Sensibil
idad a los antimicrobianos. Las especies de este gnero son resistentes a la mayor
parte de los antibiticos |i-lactmicos y ammoglucsidos existentes. L a resistencia
a los aminoglucsidos est determinada por acetil-. adenil- y fosfotransferasas codi
ficadas por plsmidos Las especies de Acinetobacter son sensibles a doxiciclma. tr
imetoprim-sulfametoxazol. quinolonas, ureidopenicilinas, imipenem, ampicilina-su
lbactam y ceftacidima. Las pruebas de sensibilidad deben llevarse a cabo con tod
os los aislamientos que tengan inters clnico.
mente asociada con las lesiones actinomicticas. Sin embargo, en los ltimos aos esta
bacteria ha sido identificada, cada vez con mayor frecuencia, como agente causa
l de endocarditis bacteriana subaguda. periodontitis y abscesos cerebrales, habin
dose caracterizado dos factores de virulencia en la misma: una leucotoxina y una
colagenasa. Diagnstico de laboratorio. A. actinomycetemcomitans crece bien en ag
ar sangre y agar chocolate. Despus de 24 a 72 horas de incubacin, las colonias tie
nen entre 1 m my3m m de dimetro con el centro arrugado. El microorganismo es cata
lasa, oxidasa y ureasa positivo. Deben realizarse pruebas bioqumicas adicionales
para diferenciarlo de otros bacilos gramnegativos delicados, de crecimiento lent
o (vase Tabla 50-13). Sensibilidad a los antimicrobianos. Este microorganismo es
resistente a la penicilina, pero habitualmente es sensible a otros muchos antibit
icos como cefalosporinas, combinaciones de un [5-lactmico con un inhibidor de |il
actamasas, fluoroquinolonas y tetracichnas.
Eikenella
Caractersticas. Clasificados antiguamente como Bacteroides corrodens. los "bacilo
s corrosivos" anaerobios facultativos se han integrado en la especie Eikenella c
orrodens. que comprende microorganismos gramnegativos de morfologa bacilar, oxida
sa positivos, catalasa negativos, no fermentadores, c u y a s colonias pueden co
rroer el agar o hacer agujeros en el mismo. Su crecimiento se ve favorecido por
la presencia de CO (5%-10%) en la atmsfera de incubacin y generalmente requiere la

presencia de factor X en el medio de cultivo. Manifestaciones clnicas y patogenia

. Poco se sabe acerca de los factores que contnbuyen a la virulencia del microor
ganismo, que tiene un bajo nivel de patogenicidad en los animales. E. corrodens
se encuentra principalmente en la cavidad oral y se aisla con frecuencia de las
vas respiratorias superiores. Tambin se ha recuperado a partir de abscesos y otros
tipos de infecciones en casi cualquier localizacin del cuerpo, puede invadir el
torrente circulatorio y causar endocarditis. Los procesos infecciosos en los que
est involucrado e s t e microorganismo son generalmente mixtos (en combinacin con
otras bacterias). Diagnstico de laboratorio. E. corrodens crece en agar sangre o
chocolate, pero no en MacConkey. La caracterstica ms llamativa de los cultivos de
esta bacteria son las excavaciones que aparecen en el agar c o m o consecuencia
del crecimiento de la misma, aunque la capacidad de lormar agujeros no es expre
sada por todas las cepas. Las colonias tardan en aparecer (entre dos y cuatro das
) y por lo general son de pequeo tamao (entre 0,5 m m y 1,0 m m de dimetro). Usualm
ente deben distinguirse de las que lorman otros bacilos g r a m n e gativos deli
cados y de crecimiento lento (vase Tabla 50-13). Sensibilidad a los antimicrobian
os. E corrodens es sensible a las penicilinas, quinolonas y tetraciclinas. tiene
una sensibilidad variable frente los aminoglucsidos y es resistente a la clindam
icina y el metronidazol.
Actinobacillus
Caractersticas. Actinobacillus actinomycetemcomitans es una bacteria gramnegativa
, no formadora de esporas y con morfologa cocobacilar (bacilos cortos). Crece tan
to en condiciones aerobias como anaerobias. La presencia de C0 (entre un 5% y un
10%) en la atmsfera de incubacin favorece su crecimiento. Las colonias aparecen l
entamente en agar sangre y son de pequeo tamao.
?
Manifestaciones clnicas y patogenia. Estas bacterias se encuentran en la mucosa d
e las vas respiratorias y del tracto genitourinario de los animales y el hombre.
Generalmente slo causan infecciones en individuos inmunodeprimidos o cuando penet
ran accidentalmente en un tejido sano a travs de una herida traumtica. A. actinomy
cetemcomitans tiene un bajo poder patgeno. Su nombre deriva del hecho de que se e
ncuentra frecuenteLegionella
Caractersticas. Las especies del gnero Legionella son bacterias gramnegahvas de mo
rfologa bacilar, delgadas, no formadoras de esporas, que se

mo
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA Sensibilidad a los antimicrobianos. Los resultados de las prueb

as de sensibilidad no se correlacionan necesariamente con la respuesta clnica al
tratamiento; por tanto, no es necesario llevar a cabo dichas pruebas. La terapia
se realiza, generalmente, mediante la administracin de eritromicina y rifampicin
a. Otros agentes que tambin han sido utilizados son el trimetoprimsulfametoxazol,
las quinolonas, la claritromicina y la azitromicna.
tien dbilmente. Estas bacterias fueron identificadas por primera vez como agentes
causales de infecciones en el hombre durante una epidemia de neumona que afect a l
os miembros de la Legin Americana de Pennsylvania, reunidos en 1976 en Filadelfia
para celebrar el bicentenario de la asociacin. En la actualidad, el gnero incluye
ms de 20 especies y un cierto nmero de especies a las que todava no se ha asignado
nombre. La mayora de casos clnicos se deben a la especie Legionella pneumophila,
serogrupo 1. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Legionella se e
ncuentran en los entornos en los que existen niveles altos de humedad. La capaci
dad de estos microorganismos para multiplicarse en el interior de protozoos es,
m u y probablemente, un factor muy importante para garantizar la supervivencia d
e los mismas en el medio ambiente. La transmisin al ser humano tiene lugar a travs
de la exposicin a aguas contaminadas de orgenes diferentes (p. ej.. las que fluye
n de grifos, duchas y fuentes pblicas). No se cree que exista transmisin de person
a a persona o que la infeccin se pueda adquirir durante las manipulaciones de lab
oratorio. Las infecciones pueden ser subclnicas, no neumnicas, neumnicas o extrapul
monares. Usualmente, la infeccin se manifiesta en forma de una neumona aguda fibri
nopurulenta, con distribucin lobular. Histolgicamente, se aprecia un infiltrado al
veolar de neutrfilos y macrfagos acompaado por fibrina y extravasacin de hemates. Las
legionelas pueden encontrarse en el interior de los macrfagos alveolares. L. pne
umophila ha sido aislada tambin mediante hemocultivo. Diagnstico de laboratorio. L
as legionelas pueden aislarse en agar BCYE enriquecido con factores de crecimien
to, entre los que se encuentran la L-cistena, una sal frrica y el <y.-cetoglutarat
o. Este medio puede hacerse selectivo para el aislamiento de los microorganismos
a partir de muestras procedentes de localizaciones no estriles del cuerpo, aadien
do una mezcla de cefamandol, polimixina B y anisomicina, o de polimixina B, anis
omicina y vancomicina (Edelstein, 1987). El agar chocolate tambin permite el crec
imiento de las legionelas. El tratamiento del esputo con una solucin dbilmente aci
da (0.2 M HCI/KCI; pH 2,2) durante 4 minutos, o mediante calentamiento a 60'C du
rante 2 minutos, contribuye a reducir el nmero de otras bacterias presentes en la
muestra, aunque tambin puede provocar un descenso en el nmero de legionelas. Los
medios inoculados deben incubarse durante cinco das en una atmsfera hmeda que conte
nga entre un 2% y un 5% de CCy Las colonias son habilualmente iridiscentes y tie
nen una consistencia pegajosa. Aquellos aislamientos que tengan la morfologa tpica
al ser observados bajo tincin de Gram deben ser subcultivados en agar sangre, do
nde no debe observarse crecimiento alguno. Estas bacterias dan positivas las pru
ebas de la catalasa y de la oxidasa, aunque en este ltimo caso la reaccin es dbil,
son gelatinasa positivas y, a menudo, mviles. La identificacin de estos microorgan
ismos puede llevarse a cabo con gran precisin mediante pruebas serolgicas. utiliza
ndo anticuerpos especficos de tipo. Las legionelas pueden detectarse o identifica
rse mediante inmunofluorescencia directa (DFA) en las muestras o a parlir de las
colonias aparecidas en los medios de cultivo. La sensibilidad del examen median
te D F A oscila entre el 25% y el 75%, pero es considerablemente superior cuando
se lleva a cabo sobre muestras de tejido pulmonar obtenidas mediante biopsia. S
e ha detectado reactividad cruzada entre L. pneumophila y otras especies de Legi
onella, as como con algunas cepas de Bordetella pertussis. Pseudomonas lluorescen
s y Bacteroides tragilis. No se conocen los valores de sensibilidad de la tcnica
DFA para la deteccin de otras especies del gnero en muestras de esputo (Edelstein,

1987). Tambin existe una prueba para la deteccin de antgenos de L pneumophila del
serogrupo 1 en orina que tiene una sensibilidad del 80% al 90%, aunque hay que i
ndicar que la antigenuria puede persistir durante muchos meses tras la infeccin (
Edelstein, 1987). Tambin puede llevarse a cabo el diagnstico de la legionelosis se
rolgicamente, detectando un incremento de cuatro veces o superior en el ttulo de a
nticuerpos al menos hasta un valor de 1:128. Un nico ttulo de anticuerpos de 1:256
es una prueba presuntiva de una infeccin antigua. No se conoce la sensibilidad d
el diagnstico serolgico de la enfermedad causada por especies diferentes a L. pneu
mophila del serogrupo 1; en cualquier caso, la especificidad de las pruebas en e
stos supuestos es menor que la detectada en el caso de la infeccin causada por L.
pneumophila del serogrupo 1 (Edelstein, 1987).
Neisseria y Moraxella
Caractersticas. Estos gneros incluyen bacterias gramnegativas, aerobias, catalasa
y oxidasa positivas e inmviles, que presentan lorma coccea, apareciendo a menudo l
os cocos asociados en parejas con los lados adyacentes aplanados, lo que da una
apariencia de un rion o de granos de cal (Lmina 50-5). Estos microorganismos son al
go delicados, y en algunos casos necesitan que los medios de cultivo sean enriqu
ecidos con sangre, suero, colesterol o cido oleico para contrarrestar el efecto d
e algunas sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano que pueden estar pre
sentes en los medios, c o m o son los cidos grasos. Neisseria gonorrhoeae y N. me
ningitidis deben incubarse rpidamente en una atmsfera que contenga CO, para que pu
edan ser aisladas: sin embargo, este requerimiento depende de la cepa de que se
trate, vara con la fase de la curva de crecimiento en la que se encuentre el micr
oorganismo y desaparece a menudo con el posterior subcultivo. N. meningitidis y
la mayora d e cepas de N. gonorrhoeae no son inhibidas por diferentes agentes ant
imicrobianos, tales como vancomicina o lincomicina, colistina y nistatina, carac
terstica particularmente til para el aislamiento selectivo de estas especies a par
tir d e muestras donde existan otras bacterias. Algunos aislamientos de N. gonor
rhoeae (en especial las cepas AUH, que necesitan arginina, uracilo e hipoxantina
) son sensibles a la vancomicina. La posicin taxonmica de Moraxella catarrhalis es
objeto de estudio en la actualidad, habindose formulado la propuesta de que sea
trasladada a su propio gnero. Branhamella. En la actualidad ambos nombres estn en
uso. Manifestaciones clnicas y patogenia. Aunque se ha descrito que otras especie
s del gnero Neisseria, distintas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae, pueden caus
ar infecciones oportunistas en huspedes inmunocomprometidos, por lo general estas
especies no son patgenas. N. meningitidis puede colonizar las mucosas de las vas
respiratorias superiores, un hecho que es seguido al cabo de unos 7 a 10 das por
la formacin de anticuerpos bactericidas y hemaglutinantes. que no eliminan el est
ado de portador pero confieren inmunidad especfica de grupo. En unos p o c o s ca
sos, la enfermedad aparece rpidamente tras la colonizacin en lorma de meningococem
ia y meningitis. El microorganismo tambin tiene tendencia a invadir las membranas
serosas y los tejidos de las articulaciones, lo que conduce al desarrollo de pl
euritis, pericarditis y artritis. Entre un 5% y un 1 5 % de individuos sanos son
portadores de Ai. meningitidis en su nasofaringe, porcentaje que puede ser ms al
to en grupos cerrados, c o m o los soldados en los cuarteles. No ha podido estab
lecerse una correlacin directa entre porcentaje de portadores e incidencia de la
enfermedad, con la nica posible excepcin de grupos familiares grandes o de hogares
en los que ha habido un caso infantil durante epidemias de la enfermedad. Tambin
se han aislado meningococos a partir de muestras genitales, y aunque su signifi
cado clnico es desconocido en estos casos, pueden ser fcilmente identificados de f
orma incorrecta c o m o gonococos salvo que se hagan las pruebas adecuadas para
poder diferenciar las dos especies. El factor de virulencia ms importante de N. m
eningitidis es un complejo endotoxina-polisacrido que en animales de experimentac
in activa la cascada de la coagulacin, provocando el depsito de fibrina en los capi
lares (coagulacin intravascular diseminada), hemorragias en las glndulas suprarren
ales y en otros rganos y alterando la resistencia vascular perifrica, lo que condu
ce al shock y a la muerte. Las manifestaciones clnicas y la patogenia de las infe
cciones gonoccicas difieren un poco de las observadas en el caso de la infeccin po
r N. meningitidis. Los tipos patognicos (1 y 2) de N. gonorrhoeae se adhieren a d

istintos tipos de clulas humanas por medio de "pili", apndices muy delgados distin
tos de los flagelos que no son producidos por las clulas de los tipos no patgenos
(3 y 4). Estos "pili" que son antignicamente heterogneos, uno de los principales f
actores de virulencia en N. gonorrhoeae, pueden inhibir la fagocitosis e inducir
la formacin de anticuerpos especficos de cepa. Otros posibles factores de virulen
cia en N. gonorrhoeae estn menos claramente definidos. T a n t o N. gonorrhoeae c
o m o N. meningitidis producen una proteasa para IgA que puede jugar un papel

' La mayor parte de cepas sensibles a la vancomicina no crecen en agar Thayer-Ma

rtin Puede aparecer una reaccin dbilmente positiva en las pruebas rpidas para deter
minar la utilizacin de carbohidratos Biovar perllava. -. biovar flava. -. ' Alguna
s cepas son positivas y otras negativas = >90% de cepas positivas: - = >90% de c
epas negativas: D = variable
1 1

1112
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
importante en la patogenia, ya que las IgA son la clase de anticuerpo que predom
ina en las secreciones de las membranas mucosas. Moraxella catarrhalis puede enc
ontrarse en la orofaringe de nios y adultos sanos. Es una bacteria encapsulada qu
e tambin posee ''pili" que se prolongan ms all de la membrana externa de la pared c
elular y que desempean el papel de adhesinas. Las infecciones que causa con mayor
frecuencia son bronquitis, otitis, sinusitis y neumona (especialmente en el caso
de personas con una enfermedad pulmonar crnica subyacente) (Catlin, 1990). M. ca
tarrhalis tambin causa, aunque con mucha menor frecuencia, bacteriemia, endocardi
tis, meningitis, infecciones urogenitales y oflalmia neonatorum. Diagnstico de la
boratorio. Los aspectos ms importantes en el diagnstico de laboratorio de las infe
cciones causadas por N. meningitidis y N. gonorrhoeae son la eleccin del espcimen
clnico adecuado y su recogida y transporte hasta el laboratorio en condiciones ap
ropiadas (vase Cap. 57). Las cepas patgenas del gnero Neisseria son sensibles a la
desecacin y las temperaturas extremas, por lo que las muestras deben cultivarse rp
idamente para incrementar las posibilidades de recuperacin. Son bacterias mesfilas
y crecen mal. si es que lo hacen, a temperatura ambiente. Muchas de ellas neces
itan ser incubadas con prontitud en una atmsfera con C0 (2%-8%) para su aislamien
to inicial. Los medios basados en el agar chocolate son adecuados para su cultiv
o y deben contener una mezcla de diferentes antibiticos (p. ej., vancomicina o li
ncomicina. y colistina. nistatina o anisomicina y trimetoprim) si el aislamiento
ha de llevarse a cabo a partir de muestras contaminadas con microbiota autctona.
Los gonococos sensibles a vancomicina deben ser cultivados en un medio que cont
enga lincomicma; sin embargo, teniendo en cuenta el efecto sinrgico entre la linc
omicina y el trimetoprim, este ltimo debe suprimirse en los medios que contengan
la primera. Lo ideal es llevar a cabo la inoculacin directa en la misma cabecera
de la cama del enfermo e incubar las placas inmediatamente a 35C en una atmsfera c
on CO,. Si alguno de estos cultivos tiene que ser enviado a un laboratorio de re
ferencia para su anlisis, ha de incubarse primero durante la noche para asegurar
el crecimiento de los microorganismos.
2
tarse de N. meningitidis, debe confirmarse la identificacin mediante un ensayo de
aglutinacin en portaobjetos, utilizando una mezcla de anticuerpos polivalentes f
rente a los diferentes serogrupos o anticuerpos individuales para cada uno de el
los. Adems de las pruebas convencionales de degradacin de carbohidratos, debe dete
rminarse tambin la reduccin de los nitratos a nitritos y la produccin de ADNsa. Est
a ltima es particularmente til para la identificacin de M. catarrhalis. que es ADNs
a positivo, mientras que las especies de Neisseria dan negativa esta prueba. Los
inconvenientes de los mtodos convencionales son la necesidad de tener que emplea
r inculos densos de cullivos puros, los largos tiempos de espera y la incapacidad
de algunas especies delicadas de N. gonorrhoeae para crecer en el medio base ut
ilizado. Algunos sistemas comerciales pueden detectar la formacin de cido a partir
de los carbohidratos en un tiempo m u y corto (entre una y cuatro horas) (Knapp
, 1988). El inoculo debe prepararse a partir de un cultivo puro del aislamiento,
por lo que la identificacin puede realizarse generalmente a las 24 horas de habe
r llevado a cabo el aislamiento. Las reacciones acidas en el caso de algunas cep
as de N. gonorrhoeae y, en menor proporcin, de N. meningitidis pueden ser difciles
de interpretar o aberrantes en el caso d e algunos de los sistemas existentes,
por lo que las cepas de N. gonorrhoeae que son dbilmente productoras de cidos a pa
rtir de la glucosa pueden aparecer como glucosa negativas. Algunas cepas de N. c
inrea, especie que no produce cido a partir de la glucosa, pueden aparecer como gl
ucosa positivas en algunos de mtodos comerciales. Las pruebas sobre sustratos par

a enzimas permiten una identificacin rpida (entre una y cuatro horas) solamente pa
ra aquellos aislamientos de diplococos gramnegativos, oxidasa positivos, obtenid
os en un medio de cultivo selectivo (Kellogg, 1995; Knapp. 1988). Estas pruebas
son de utilidad para distinguir las cepas maltosa negativas de N. meningitidis d
e N. gonorrhoeae, aunque los cambios de color pueden ser sutiles y si, en consec
uencia, son interpretados de forma errnea pueden provocar que los aislamientos de
N. meningitidis y otras especies de Neisseria sean clasificados incorrectamente
como N. gonorrhoeae. Adems, las cepas de Neisseria cinrea y de Kingella denitrifi
cans que crecen en los medios selectivos para el gonococo pueden ser identificad
as equivocadamente como N. gonorrhoeae si no se realizan pruebas adicionales de
confirmacin de identidad. Los sistemas comerciales que combinan las pruebas con s
ustratos enzimticos con los mtodos convencionales modificados proporcionan una alt
ernativa rpida y precisa para la identilicacin de las especies de los gneros Neisse
ria y Haemophilus (Janda, 1987). Los mtodos inmunolgicos para N. gonorrhoeae (coag
lutinacin y tincin con anticuerpos fluorescentes) se ulilizan para la identificacin
de las colonias aparecidas en los medios de aislamiento primarios. La inmunoflu
orescencia c o n anticuerpos monoclonales tiene una gran sensibilidad y especifi
cidad en el caso de N. gonorrhoeae, pero puede dar lugar a falsos positivos con
otras especies de Neisseria y con Kingella denitrificans. habindose detectado tam
bin unin inespecfica a travs del fragmento Fe de la molcula de las IgG con otras bact
erias (Beebe, 1993; Dillon, 1988; Kellogg, 1995). Por tanto, se sugiere que esto
s reactivos sean utilizados solamente para identificar microorganismos gramnegat
ivos, oxidasa positivos, aislados en medios selectivos para gonococos. Puede emp
learse tambin una sonda quimioluminiscente de cidos nucleicos especfica para N. gon
orrhoeae, para la confirmacin de un aislamiento obtenido por cultivo o para la de
teccin directa de la bacteria en las muestras de exudados de la uretra o de la en
docrvix, recogidos con un hisopo (Hale, 1993; Limberger. 1992). Asimismo, hay dis
ponibles ensayos, basados en la amplificacin de cidos nucleicos para ser utilizado
s con las muestras de exudados uretrales y endocervicales, que parecen tener una
sensibilidad mayor que las tcnicas de hibridacin con sondas de cidos nucleicos o d
e cultivo microbiolgico (Carrol, 1998; Kehl, 1998). Los ensayos de aglutinacin en
ltex estn disponibles para la deteccin directa de antgenos de N. meningitidis en LCR
, suero y orina. Como ya s e coment previamente (vase el apartado de Streptococcus
dentro de este captulo), la sensibilidad de estas tcnicas parece ser menor o c o
m o mucho igual que la de la tincin de Gram; adems, los resultados de estas prueba
s parecen tener un efecto mnimo en lo que respecta a la atencin que recibe el paci
ente (Bhisitkul. 1997: Granoff, 1986: Maxson, 1994; Perkins. 1995). Por tanto, m
uchos laboratorios han dejado de ofertar estas tcnicas. Sensibilidad a los antimcr
obianos. Algunos aislamientos raros de N. meningitidis son resistentes a la peni
cilina; por tanto, deben realizarse

Un aislamiento obtenido a partir de un espcimen urogenital, que forme colonias co

n aspecto tpico en un medio selectivo, puede ser identificado presuntivamente com
o N. gonorrhoeae en base a los resultados de la observacin microscpica bajo tincin
de Gram y de las pruebas de la oxidasa y la catalasa. La observacin al microscopi
o de los frotis preparados a partir de las colonias sospechosas, teidos por el mto
do de Gram, debe revelar la presencia de diplococos gramnegativos con la morfolo
ga caracterstica, aunque los microorganismos tambin pueden aparecer formando tetrad
as, especialmente en los cultivos jvenes. Todas las especies del gnero Neisseria s
on oxidasa positivas y todas, con la excepcin de f V . elongata. son catalasa pos
itivas. Debido a que es posible recuperar otras especies del gnero, al margen de
N. gonorrhoeae, a partir de tracto genitourinario, es de la mayor importancia re
alizar pruebas confirmatorias de la identificacin, preferiblemente mediante ms de
un procedimiento, en especial en el caso de muestras extragenitales o cuando exi
sta la sospecha de un caso de abuso sexual. La confirmacin de N. gonorrhoeae y la
identificacin de otras especies del gnero Neisseria y de M. catarrhalis se basa e
n sus caractersticas bioqumicas y de crecimiento (Tabla 50-14) (Knapp, 1988). El mt
odo de identificacin estndar es la deteccin de la formacin de cidos a partir de azcar
s en un medio base (agar cistena-tripticasa de soja; medio CTA) y otras pruebas b
ioqumicas convencionales. Sin embargo, dados los inconvenientes de los mtodos trad

icionales, hoy en da se utilizan en muchos laboratorios sistemas de identilicacin

ms rpidos. Tambin hay disponibles procedimientos para la deteccin directa de N. gono
rrhoeae y N. meningitidis en las muestras clnicas. En principio, el tipado de los
aislamientos de ambas especies se lleva a cabo en estudios con un propsito epide
miolgico. En el mtodo estndar de identificacin, se analiza la produccin de cido a par
ir de glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa en medio CTA, comparando los resultad
os frente a los de un tubo control con medio de cultivo sin carbohidrato. Una ve
z inoculados, los tubos se incuban a 35C-37"C en ambiente aerbico y se examinan a
intervalos de 24 horas hasta que los resultados sean interpretables, o al cabo d
e 72 horas. Los resultados esperables para las especies de Neisseria y para M. c
atarrhalis se muestran en la Tabla 50-14. Sin embargo, de manera ocasional, un a
islamiento de N. meningitidis puede producir reacciones anmalas; glucosa y maltos
a negativas y ausencia de actividad sacaroltica. Si de todos modos en estos casos
existe la fuerte sospecha de que pueda tra-

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1113
Tabla 50-15 Especies H. H H H H. H.
Caractersticas diferenciales de las especies del g n e r o Haemophilus de importa
ncia clnica Requiere factor X
+ i +
Requiere factor V
+ + + +
Hemolisis
Catalasa
i + D
Crecimiento favorecido por el CO,
influenzae haemolylicus ducreyi parainfluenzae par aphrophilus aphrophilus
+
D + +
Para ver el significado de los smbolos utilizados, consltese la Tabla 50-10 Adapta
da de Campos J Haemophilus En Murray PR. Baron E Pfaller M. y col (eds 1 Manual
of Clinical Microbiology. 7' ed Washington, DC. American Society for Microbiolog
y. 1999. p 608. reproducida con permiso del editor.
n e c e s a r i a la p r e s e n c i a de l o sf a c t o r e s X y/o V en el m e
d i o de cultivo. El p r i m e r o de ellos es a p o r t a d o al m e d i o por
los hemates u s a d o s por e f e c t o del c a l e n t a m i e n t o (p. ej., e
n el a g a r chocolate), a u n q u e tambin p u e d e ser p r o p o r c i o n a d
o por glbulos r o j o si n t a c t o sh u m a n o s , de c a b a lo o de conejo.
El f a c t o r V es a p o r t a d og e n e r a l m e n t e por el e x t r a c t
o de l e v a d u r a que se aade al m e d i oop o ru n a suspensin de estafilococ
os, que se s i e m b r a en u n a nica estria s o b r e la s u p e r ficie del m
e d i oya l r e d e d o rd el ac u a lc r e c e nl a sc o l o n i a sd el a sc e
p a sd e p e n d i e n t e s de f a c t o r V (fenmeno d e n o m i n a d o satel
itismo). L a s caraderisticas difer e n c i a l e sd e las e s p e c i e sd ee s
t eg r u p os em u e s t r a ne nl aT a b l a 50-15. L o s requerimientos de fa
ctor X y V se e s t a b l e c e nd e t e r m i n a n d o la c a p a c i dad de l
a c e p a en cuestin p a r ac r e c e r o no en m e d i o s de c u l t i v o s qu
e c o n t e n g a nd i c h o s (adores. U n a alternativa p a r ae s t a b l e c
e rl ad e p e n d e n c i a del factor X es la p r u e b a de la porfirina p r
o p u e s t ap o r Kilian (1974) y q u ed e t e r m i n a la capacidad de las e
s p e c i e sd e p e n d i e n t e sp a r a utilizar el cido >-aminolevulnico en la
sntesis de p o r f o b i l m o g e n o y porfirinas. La formacin d e portobilmgeno
se p u e d ed e t e c t a r aadiendo r e a c t i v o de K o v a c al m e d i oy
Haemophilus observando el desarrollo de una coloracin r o j a en la fase a c u o
s a Alternativamente, se p u e d ed e m o s t r a r la formacin de porfirinas en
la m e z c l a en r e a c Caractersticas. Las e s p e c i e s de e s t e gnero son
b a c i l o syc o c o b a c i l o s cin por la fluorescencia rojiza que a p a r
e c ec u a n d o se i l u m i n a con u n a lmg r a m n e g a t i v o s de pequeo

tamao, pleomrticos, anaerobios facultativos, s p e c i e s de Haemophilus o x i d

a s a positivos y c o nr e q u e r i m i e n t o s de h e m i n a u otras porfir
inas (factor X) para de Wood. Las propiedades hemoliticas de las e p u e d e nd
e t e r m i n a r s e en a g a rs a n g r e de c o n e j o o de caballo. y/o nic
otinamina-adenina-dinucletidos o trinucletidos (factor V). Am e n u d od e b e dif
erenciarse a H. aphrophilus de otras e s p e c i e sc o m o Manifestaciones clnic
as y patogenia. L am a y o rp a r t e de e s p e c i e s de Actinobacillus actin
omycetemcomitans. Cardiobacterium hominis y Eikenella Haemophilus son h a b i t
a n t e sh a b i t u a l e s de l a s vas r e s p i r a t o r i a s superiores. c
orrodens ( T a b l a 50-15), t o d a s las cuales se han a s o c i a d o con end
ocarditis A l g u n a s de ellas p u e d e ne n c o n t r a r s e tambin e n los
t r a c t o s gastrointestinal y genitourinano. La diseminacin de persona a perso
na se p r o d u c e por inhalacin bacteriana subaguda. de gotcuias de h u m e d a
d liberadas con la respiracin. Las i n f e c c i o n e sc a u s a d a s El cultiv
o de H. ducreyi a partir de lesiones chancroides ha sido problemtico. por Haemoph
ilus spp. van d e s d e conjuntivitis y otitis m e d i ah a s t am e n i n g i t
i sy Un Irotis del m a t e r i a lo b t e n i d o de la lesin teido por el mtodo d
eG r a mp u e d e endocarditis. Las e s p e c i e sc o n s i d e r a d a sc o m
o patgenos h u m a n o s habituales ser de a y u d a si la observacin r e v e l a
la p r e s e n c i a de b a c i l o sg r a m n e g a t i v o s por son H. influ
enzae, H. parainfluenzae, H. ducreyi y H. aphrophilus. p a r e j a soe n filas (
" b a n d a d a sd e peces"). L am u e s t r ap u e d ei n o c u l a r s ee nm
e d i o basal G Ce n r i q u e c i d oc o nh e m o g l o b i n a (1%), s u e r o
b o v i n o fetal ( 5 % 1 0 % ) , IsoEl principal factor de virulencia de H. inf
luenzae es el polisacrido capsular, del V i t a l e X (1%; B B LM i c r o b i o l
o g yS y s t e m s )yv a n c o m i c i n a (3 tig/ml) o en a g a rM u e cual ex
islen seis tipos antignicamente distintos (serotipos del a al f). Las c e p a s l
ler-Hnton con s a n g r e de caballo (5%), solucin de e n r i q u e c i m i e n t
o con c o f a c que c a r e c e n de cpsula se d e n o m i n a nc o m o no tipabl
es. H. influenzae no prolores, v i t a m i n a s y aminocidos (1%) y v a n c o m
i c i n a (3 L i g V m l ) . d u c e endotoxna. y e s t ae s p e c i e es rpidamen
te f a g o c i t a d ayd e s t r u i d a por los macrfagos. a m e n o s que e x i
s t a n deficiencias en el f u n c i o n a m i e n t o de los antiSensibilidad
a los antimicrobianos. E n l a a c t u a l i d a d , el NCCLS c u e r p o sd el
o sf a g o c i t o s o del s i s t e m ac o m p l e m e n t o .T a m p o c os es
a b em u c h o (NCCLS. 2000a) r e c o m i e n d a levar a c a b op r u e b a s
de susceptibilidad frente s o b r e el p a p e l de l o sa n t i c u e r p o s e
n la i n m u n i d a d frente a l a si n f e c c i o n e s cau- a ampicilina, cl
oranfenicol. cefalosporinas de t e r c e r a generacin y m e r o p e p r u e b a sp a r ad e t e c t a r actividad |i-lactamsica en estos casos (SaezNieto, 1 9 9 2 ; Woods, 1994). Otros a g e n t e s antimicrobianos eficaces s o
n las cefalosporinas de a m p l i oe s p e c t r o y el cloranfenicol. Para el t
r a t a m i e n t o profilctico del posible c o n t a g i od e n t r o de los g
r u p o s familiares, p u e d e n utilizarse la nfampicina, la m i n o c i c l i
n a y las fluoroquinolonas. Debido a que la resistencia de N. gonorrhoeae a la
penicilina y la tetraciclna est m u ye x t e n d i d a (Fox. 1997). las r e c o m
e n d a c i o n e s actuales para el trat a m i e n t oc o n t e m p l a n la ad
ministracin de cefalosporinas de a m p l i oe s p e c t r o o de l a sn u e v a s
fluoroquinolonas. A u n q u e no p a r e c e existir resistencia frente a las c
efalosporinas, si se h a n descrito c a s o s de resistencia a l a s fluoroquino
lonas. En consecuencia, d e b e n realizarse pruebas de sensibilidad si los sntom
as persisten tras el tratamiento. L a produccin de | M a c t a m a s ap u e d e d
e t e c t a r s e con nitrocefina. una cefalosporina cromognica. P a r ad e t e
r m i n a r la susceptibilidad de N. gonorrhoeae a las cefalosporinas, las quino
lonas y otros a g e n t e s antimicrobianos, p u e d ee m p l e a r s e el mtodo
de difusin en disco, c o na g a r GC enriquecido con un 1o de suplemento de crecim
iento Casi todas las c e p a s de M catarrhalis p r o d u c e n |5-lactamasa, c
u y a presencia p u e d ep o n e r s ed e manifiesto c o n nitrocefina. L o s ai
slamientos son, p o rl o general, sensibles a cefalosporinas, trimetoprim-sulfam

etoxazol y a c o m b i n a c i o n e s que incluyan un antibitico |J-lactmco y un

nhibidor de |i-lactamasas. Prevencin. Las v a c u n a s de polisacridos c o n t r
a los serogrupos A, C. Y y W135 de N. meningitidis han sido autorizadas en los E
E.UU.. y su administracin est r e c o m e n d a d a en c a s o de militares, de p
e r s o n a s que viven en reas epidmicas de los pases en vas de desarrollo y de
ividuos c u y o bazo no es luncional o que c a r e c e n de dicho rgano. La profi
laxis con antibiticos d e b e limitarse a los c a s o s de contados familiares y
a aquellos q u eh a y a n p o d i d oe s t a re nc o n t a c t oc o n las s e c
r e c i o n e s orales d e los enfermos. L a n f a m p i c i n a es el antibitico
de eleccin habitual en estos casos. L a utilizacin de antibiticos a n t e s de e
t a re x p u e s t o al contado con el m i c r o o r g a n i s m o no est r e c
o m e n d a d a por los riesgos potenciales de sensibilizacin y aparicin de c e p
a s resistentes. La nica excepcin a esta regla es la aplicacin de solucin de n i
a t o de p l a t a o de p o m a d a de e n t r o m i c i n a en los ojos de los
recin n a c i d o sp a r a prevenir la oftalma g o n o c o c i c a o por clamidia
s.

ind

s
t r

s a d a sp o re s t a bacteria. L o sa n t i c u e r p o sv a na p a r e c i e n
d oc o nl a edad, p r e s u m i b l e m e n t ec o m oc o n s e c u e n c i a d
e una infeccin natural con H. inluenzae o c o n o t r a sb a c t e r i a s que c o
m p a r t a n homologa antignica con aqulla, por lo que la m a y o r parte de indi
viduos m a y o r e s de 1 5 aos p o s e e n anticuerpos. S ed e s c o n o c e cule
s de e s t o sa n t i c u e r p o s son p r o t e c t o r e s y a qu nivel actan.
D e s d e la introduccin de la v a c u n af r e n t e a H. intluenzae serotipo b
a m e d i a d o s de la dcada de los 80, ha habido un b r u s c od e s c e n s o
en la incid e n c i ad el a s infecciones invasivas c a u s a d a sp o r este m
i c r o o r g a n i s m o , tales c o m o la m e n i n g i t i s y la epglotitis
(CDC, 1994). Las cepas no tipables de H. influenzae estn ms frecuentemente asociad
as c o n la otitis a g u d am e d i aoc o n las e x a c e r b a c i o n e sa g u
d a s de la bronquitis crnica. H. parainfluenzae es u s u a l m e n t e una espe
cie c o m e n s a l de las vas respiratorias superiores, aunque p u e d ep r o v
o c a re n f e r m e d a d e sg r a v e s c o m o endocarditis. H. aphrophilus.
otra e s p e c i ec o m e n s a l del tracto respiratorio superior, tambin p u e
d ep r o d u c i r endocarditis, asi c o m oa b s c e s o sc e r e brales, neumo
na, meningitis y bacteriuria. H. ducreyi es el a g e n t er e s p o n s a b l e d
e la e n f e r m e d a d la m a d ac h a n c r o i d e (o c h a n c r ob l a n d
o )
Diagnstico de laboratorio. P a r a el a i s l a m i e n t od e Haemophilus s p p
.e s

1114
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
nem en el caso de H. influenzae aislado a parlir de muestras de sangre o de LCR.
Se ha observado resistencia a ampicilina y cloranfenicol, as como frente a trime
toprim-sulfametoxazol. tetraciclina y rifampicina, aunque con una menor frecuenc
ia en estos casos. La resistencia a las penicilinas est generalmente determinada
por la capacidad para producir |5-lactamasas: sin embargo, algunos aislamientos
raros son resistentes debido a alteraciones en la permeabilidad de la membrana e
xtema o en la afinidad de las protenas que ligan penicilina (PBP). Las pruebas de
sensibilidad para H. influenzae han de realizarse con un medio de cultivo espec
ial (Haemophilus Test Medium).
Bordetella
Caractersticas. Las especies del gnero Bordetella son bacterias muy pequeas de morf
ologa cocobacilar, aerobias estrictas, no fermentadoras, que necesitan cido nicoti
nico, cisteina y generalmente metionina, pero no hemina (factor X) o coenzima I
(factor V), para su crecimiento. Durante el mism o se produce un exceso de cidos
grasos que resultan inhibidores para un mayor crecimiento microbiano, razn por la
que es preciso aadir sangre, carbn vegetal, almidn o resinas de intercambio inico a
l medio para que adsorban selectivamente y eliminen dichos cidos grasos. Tras sub
cultivos repetidos en medios artificiales tiene lugar un fenmeno de variacin de fa
se de cepas lisas virulentas a rugosas avirulentas. Manifestaciones clnicas y pat
ogenia. Las especies de Bordetella se encuentran en las vas respiratorias de los
animales de sangre caliente. S. bronchiseptica afecta primariamente a los perros
(tos de la caseta del perro), y a algunos otros animales, y puede causar, aunqu
e raramente, una enfermedad parecida a la tos ferina en huspedes humanos inmunoco
mprometidos. 8. parapertussis, especie que infecta tanto al hombre como a los co
rderos, es un patgeno humano poco comn. La infeccin por este microorganismo puede s
er asintomtica o provocar una enfermedad semejante a la tos ferina o. con mayor f
recuencia, bronquitis. 8. pertussis, el agente causal de la tos ferina, slo provo
ca enfermedad en el hombre. 8. pertussis. B. parapertussis y 8. bronchiseptica p
roducen varios factores de virulencia. Entre ellos se encuentran una adenilato cc
lasa que ejerce el papel de toxina (TAC), ya que inhibe diversas funciones celul
ares al provocar un aumento de los niveles intracelulares de adenosina 3', 5'-fo
sfato en las clulas afectadas. La citotoxina traqueal (CTT) causa la detencin del
movimiento de los cilios y la m u e r t e celular. En la adhesin de las bacterias
a los tejidos estn implicadas una hemaglulinina filamentosa (HAF). la pertactina
y las fimbrias. 8. pertussis produce, con carcter exclusivo, toxina diftrica (TD)
. que acta inhibiendo los factores responsables de la transduccin de seal a nivel i
ntracelular, catalizando la transferencia de ADP a las protenas G celulares. Se c
ree que durante la infeccin por 8. pertussis el microorganismo se fija inicialmen
te al epitelio ciliado de las vas respiratorias y a las clulas efectoras del siste
ma inmune, por medio de diferentes molculas y estructuras que actan como adhesinas
(fimbrias, HAF, TD y pertactina). La TD y la TAC trabajan juntas para inhibir l
a respuesta del sistema inmune del hospedador, mientras que la CTT daa el epiteli
o respiratorio. Como resultado se produce una respuesta inflamatoria y necrosis
celular, leucocitosis y linfocitosis, acumulacin de secreciones, tos y, finalment
e, bronconeumonia, episodios de hipoxia y encefalopata. 8. pertussis posee un antg
eno protector que al combinarse con el anticuerpo especfico frente al mismo anula
el carcter infectivo de la bacteria. Parece, sin embargo, que para lograr la err
adicacin del microorganismo son necesarias tanto la inmunidad humoral como la cel
ular. Diagnstico de laboratorio. La tasa de aislamiento de B. pertussis a partir
de los pacientes disminuye con la duracin de la enlermedad. El espcimen ms adecuado
es el material recogido de la nasofannge con un hisopo: en cualquier caso, los

aspirados nasofarngeos obtenidos mediante un catter blando de goma tambin han permi
tido lograr, en las manos de algunos analistas, buenos porcentajes de aislamient
o. Tambin pueden utilizarse para el cultivo muestras obtenidas por mtodos ms agresi
vos, como es el caso del lquido de lavado broncoalveolar. En general, el material
recogido con hisopo o los aspirados deben inocularse en un medio apropiado, com
o el agar Regan-Lowe, directam e n t e en la cabecera de la cama del enfermo. En
el caso de que sea necesario su envo al laboratorio de referencia, los medios in
oculados deben incubarse durante al m e n o s 24 horas antes de ser transportado
s, con objeto de permitir un cierto nivel de crecimiento inicial del microorgani
smo.
El examen directo de los frotis teidos con anticuerpos mono o policlonales frente
a 8. pertussis. conjugados con fluoresceina. puede permitir un diagnstic o rpido.
Debido a que la inmunofluorescencia (DFA) tiene un bajo grado de sensibilidad,
debe realizarse en paralelo el aislamiento y la identificacin del microorganismo
mediante cultivo. Tambin pueden aparecer resultados falsamente positivos con la tc
nica DFA, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los cultivo
s deben incubarse en una atmsfera con un nivel elevado de humedad, pero sin CO ,
a 35'C. 8. pertussis es una bacteria de crecimiento lento y las colonias que for
ma pueden tardar entre tres y cuatro das en ser apreciables a simple vista. La in
cubacin debe prolongarse hasta los 7-12 das antes de que los cultivos se descarten
como negativos.
; ?
Las colonias de 8. pertussis son pequeas, redondas y brillantes y pueden tener el
aspecto de gotas de mercurio. Los microorganismos presentes en u n a colonia co
n la morfologa tpica y que tengan el aspecto caracterstico bajo tincin de Gram deben
subcullivarse en agar sangre, para verificar su incapacidad de crecer en dicho
medio. La identificacin presuntiva de 8. pertussis se lleva a cabo determinando e
l carcter catalasa y oxidasa positivo y ureasa negativo del aislamiento en cuestin
. 8. parapertussis crece ms rpidamente que 8. pertussis. y adems es capaz de hacerl
o en agar sangre e incluso en agar MacConkey. Esta especie da negativa la prueba
de la oxidasa negativa y positivas la catalasa y ureasa. 8. bronchiseptica crec
e bien tanto en agar sangre c o m o en MacConkey, es bioqumicamente la ms activa d
e las tres especies, da positiva las tres pruebas (catalasa, ureasa y oxidasa) y
es capaz de reducir los nitratos. Sensibilidad a los antimicrobianos. Los agent
es antimicrobianos no desempean, probablemente, ningn papel en el tratamiento de l
a tos ferina, pero negativizan los cultivos nasofarngeos en uno o dos das, lo que
ayuda a impedir la aparicin de complicaciones en los enfermos, as como la disemina
cin de la infeccin a individuos no inmunizados. En cualquier caso, no est indicada
la realizacin de las pruebas de sensibilidad en el caso de 8. pertussis. La eritr
omicina es el antibitico de eleccin tanto para el tratamiento como para la profila
xis; alternativamente, tambin se puede utilizar trimetoprim-sulfametoxazol.
Brucella
Caractersticas. Las brcelas son cocobacilos pequeos (0.5 um-0.7 pm de ancho por 0.6
pm-1,5 pm de largo), gramnegativos, que en las extensiones teidas aparecen indiv
idualmente, en parejas o formando cadenas cortas. Estas bacterias son inmviles, a
erobias estrictas, catalasa positivas y, casi siempre oxidasa positivas. Su crec
imiento se ve favorecido por la presencia de CO (5%-10%) en la atmsfera de incubac
in, y necesitan medios de cultivo complejos que contengan sangre o suero. Entre l
as especies conocidas, son patgenas para el hombre 8. melitensis. B. abortus. B.
suis y B. canis. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Brucella so
n parsitos intracelulares capaces de infectar a una gran variedad de especies ani
males (incluyendo al hombre); han sido encontradas tambin en algunos insectos y g
arrapatas. Son patgenos importantes para el hombre y los animales. Los huspedes pr
eferidos son las cabras y las ovejas para 8. melitensis. el ganado ovino para 8.
abortus los cerdos para 8. suis y los perros para 8. canis, aunque cada una de
estas bacterias puede infectar ocasionalmente a otras especies animales. El homb
re se infecta por inhalacin, al entrar en contacto directo con material infectado

, incluyendo cadveres d e animales, membranas fetales, exudados vaginales, fetos,

piel o membranas mucosas, o por ingestin de leche no pasteurizada procedente de
animales infectados o de productos lcteos derivados de aqulla. En los EE.UU. se de
claran unos 1 0 0 casos de brucelosis al ao. Un factor de riesgo muy comn es el co
nsumo de queso importado hecho a base de leche de cabra sin pasteurizar. A menud
o se produce una linfadenopatia local con diseminacin y localizacin secundaria del
microorganismo en sistema reticuloendotelial, con formacin de granulomas en el h
igado, bazo, huesos, sistema genitourinario, pulmones y tejidos blandos. Es posi
ble observar a las bacterias en el interior de las clulas fagociticas. Con frecue
ncia, los signos y sntomas son variables e inespeclicos, con escalofros, fiebre, su
doracin y anorexia. Una caracterstica de la fiebre es que aparece durante el da (fi
ebre ondulante). Diagnstico de laboratorio. Las brcelas se recuperan con m a y o r
frecuencia a partir de sangre y mdula sea y con m e n o r de muestras procedentes
del bazo y de abscesos hepticos. Estas bacterias crecen en medios estndar de labo
ratorio, incluyendo el agar Brucella, sangre, chocolate y tripticasa de soja. Al
gunas cepas pueden crecer en agar MacConkey. En general, estas bac-

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1115
terias crecen en los medios utilizados para los hemocultivos. Muchos autores rec
omiendan incubar los hemocultivos durante 21 das, llevando a cabo subcultrvos a c
iegas tanto al principio como al final del periodo de incubacin. Sin embargo, ya
no es preciso seguir estas recomendaciones con los nuevos sistemas automatizados
para hemocultivo. algunos de los cuales han permitido la recuperacin de Brucella
spp. en cinco das o incluso menos, sin necesidad de realizar subcultivos a ciega
s (Bannatyne, 1997: Yagupsky, 1997). Los medios slidos deben incubarse en una atms
fera que contenga entre un 5% y un 10% de CO . Las brcelas crecen lentamente, e i
ncluso tras 48 horas de incubacin las colonias son difciles de ver. Los microorgan
ismos pueden ser identificados presuntivamente como especies del gnero Brucella e
n base a su aspecto caracterstico bajo tincin de Gram y a unos resultados positivo
s para las pruebas de la catalasa. oxidasa y ureasa. La actividad uresica se mani
fiesta rpidamente (alrededor de 15 minutos) en el caso de B. suis y ms lentamente
(entre 2 y 24 horas) en el de B melitens'is y B. abortus. Debido a que la brucel
osis puede adquirirse en el laboratono. el personal del m i s m o debe ser adver
tido si se sospecha la presencia de Brucella spp. en el espcimen, debiendo realiz
arse todas las manipulaciones en una cabina de biosegundad.
?
para bacterias gramnegativas. como son el agar EMB o MacConkey El hallazgo de un
bacilo gramnegativo que slo crece en agar sangre, que es oxidasa e indol positiv
o, y que da negativa la prueba del ONPG. constituye una slida evidencia presuntiv
a del aislamiento de P. multocida. la especie que se aisla con mayor frecuencia.
Sensibilidad a los antimicrobianos. Raramente se observa resistencia a los agen
tes antimicrobianos en los aislamientos de origen humano. Las pasteurelas son ge
neralmente susceptibles a la penicilina y la tetraciclina. La penicilina es el a
ntibitico de eleccin.
Francisella
Caractersticas. Francisella tularensis es una bacteria gramnegativa muy pequea, ae
robia estricta, que exhibe diferentes morfologas (desde cocos hasta bacilos pleomr
ficos) y que necesita cstina o cisteina para poder crecer. Cuando se tie con color
antes derivados de la anilina muestra una tincin bipolar dbil. Manifestaciones clni
cas y patogenia. F. tularensis se encuentra en animales tanto salvajes como domst
icos, pjaros, artrpodos, agua, barro y heces. El reservono principal de esta bacte
ria es el conejo de cola de algodn. La transmisin al ser humano tiene lugar por la
picadura de garrapatas, por inoculacin directa a travs de la piel o de la conjunt
iva por contacto con un animal infectado, por inhalacin o por ingestin de carne co
ntaminada poco cocida o de agua contaminada. La enfermedad se manifiesta de varas
formas, como son la ulceroglandular, glandular, oculoglandular. orofarngea. inte
stinal, neumnica y tifoidea. Cada ao se detectan entre 100 y 200 casos aproximadam
ente de tularemia en los EE.UU. La tularemia se manifiesta de varias formas tras
un perodo de incubacin que oscila entre 1 y 10 das. Algunos sntomas como cefalea, f
iebre, escalofros, vmitos y mialgias se presentan caractersticamente al principio.
En la forma ulceroglandular aparecen linfadenitis y linfadenopatias en la zona d
e drenaje de la lesin primaria. La lesin es papular inicialmente y ms tarde ulcerat
iva. La forma oculoglandular de la enfermedad se caracteriza por la inflamacin de
la conjuntiva y, generalmente, por la aparicin de una ppula en el prpado inferior,
con linfadenitis de los ganglios preauriculares, parotideos, submaxilares y cer
vicales anteriores. La forma intestinal de la tularemia se caracteriza por la pr
esencia de lesiones ulcerosas en la boca, garganta y tracto gastrointestinal sup
erior. La virulencia parece estar relacionada con la morfologa lisa de las coloni

as. El subcultivo repetido conlleva una transicin de la morfologa colonial lisa a

otra rugosa, concomitantemente con una prdida de la virulencia. Las cepas fuertem
ente virulentas para el hombre presentan actividad citrulin-ureidasa y fermentan
el glicerol, estando asociadas con la enfermedad en conejos transmitida por las
garrapatas. No se ha detectado la produccin de toxinas en esta bacteria. Puede s
ospecharse la existencia de tularemia en cualquiera que haya estado en un rea don
de la enfermedad tiene carcter endmico, haya entrado en contacto con animales silv
estres o ganado, tenga un historial de picaduras por garrapatas, haya estado imp
licado en labores agrarias, haya bebido agua contaminada o haya estado expuesto
a cultivos bacterianos o a animales de laboratorio infectados. Los tramperos, ca
zadores, trabajadores de la industria peletera y alimentaria, los agricultores y
el personal de laboratorio estn en situacin de alto riesgo para contraer la enfer
medad. Debido a sus manifestaciones tan diversas, la tularemia puede confundirse
fcilmente con muchas otras enfermedades como la brucelosis, el ntrax, la esporotr
icosis. las fiebres tifoideas, la tuberculosis, la histoplasmosis y la sfilis. Di
agnstico de laboratorio. El tipo de muestra adecuado para el e x a m e n incluye
los lquidos o legrados recogidos a partir de la lesin primara, los aspirados de gan
glios linfticos regionales aumentados de tamao, el esputo, los lavados farngeos y l
os aspirados gstricos. El aislamiento de la bacteria es difcil porque tiene requer
imientos nutricionales especiales y crece lentamente, lo que permite que otros m
icroorganismos de crecimiento ms rpido que puedan estar presentes en el espcimen en
mascaren o dificulten su desarrollo. Los cultivos pueden realizarse en agar con
glucosa y cisteina. enriquecido con un 5% de sangre de conejo desfibnnada, en ag
ar chocolate con IsoVitaleX o en agar BCYE. Algunas cepas pueden crecer incluso
en agar sangre estndar o en agar tripticasa de soja. Si la muestra clnica est conta
minada por otros microorganismos (incluidos los hongos), debe aadirse al medio an
tibiticos, c o m o penicilina, polimixina B y cicloheximida, para inhibir el crec
imiento de stos. Se debe
La identificacin a nivel de especie implica la realizacin de pruebas adicionales,
como son los requerimientos adicionales de CO la produccin de H S, la hidrlisis de
la urea, la sensibilidad a algunos colranles y la sensibilidad a determinados la
gos. La mayor parte de laboratorios hospitalarios solicitan a los departamentos
estatales de salud o a los laboratorios de referencia la realizacin de estas prue
bas complementarias.
; ?
Tambin es posible llevar a cabo el diagnstico de la brucelosis mediante tcnicas ser
olgicas. Un ttulo mnimo de 1:160 en la prueba estndar de aglutinacin en tubo hace sos
pechar un diagnstico positivo. Sin embargo, la evidencia de una brucelosis recien
te slo puede ser aceptada cuando se detecta un incremento de cuatro veces o super
ior en el ttulo de anticuerpos especficos durante el primer o segundo mes de la en
fermedad. En los pacientes con titulo elevados (1:640) de anticuerpos puede mani
festarse un fenmeno de zona que inhiba la reaccin de aglutinacin, por lo que todas
las muestras de suero de los pacientes en los que se sospeche la existencia de l
a enfermedad deben diluirse hasta un valor de 1:1.280 al menos. A veces se detec
ta una reactividad cruzada con Francisella lularensls y con Vibrio cholerae. inc
luyendo a las personas que han recibido la vacuna contra el clera. Sensibilidad a
los anlimicrobianos. El tratamiento consiste en la administracin de combinacione
s de antibiticos como tetraciclma. aminoglucsidos, nfampicina y trimetoprim-sulfam
etoxazol durante perodos prolongados. Aunque en ocasiones el tratamiento antimicr
obiano falla, ello no es debido a fenmenos de resistencia, por lo que no es neces
ario llevar a cabo pruebas de sensibilidad para los aislamientos recuperados de
los enfermos.
Pasteurella
Caractersticas. Las especies del gnero Pasteurella son bacterias gramnegativas con
morfologas muy variadas que van desde cocobacilos pequeos hasta bacilos largos y
filamentosos, anaerobias facultativas, catalasa y oxidasa positivas e inmviles. D
e las ocho especies conocidas con capacidad para infectar al hombre (P multocida

. P. bettyae. P. cams. P. dagmatis. P. stomatis. P. pneumotropica. P. haemolytic

a y P. aerogenes). P. multocida es el patgeno humano ms importante. Las especies d
e Pasteurella son lenolpicamente muy semejantes a las del gnero Actinobacillus. ha
biendo demostrado los estudios de hibridacin ADN-ADN y la comparacin de los rARN d
e 16S que las especies P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes estn ms rel
acionadas con el gnero Actinobacillus que con el genero Pasteurella. Manifestacio
nes clnicas y patogenia. Las especies de Pasteurella. especialmente P. multocida.
se encuentran formando parte de la microbiota comensal de las vas respiratorias
superiores de mamferos y aves de corral, aislndose frecuentemente de las heridas c
ausadas por mordeduras o araazos de animales. L a s mordeduras de gatos resultan
infectadas con mayor frecuencia que las de perros. Las infecciones localizadas p
ueden hacerse sistmicas. habindose registrado casos de septicemia, osteomielitis y
meningitis. Estas bactenas se han asociado con infecciones de las vas respirator
ias, incluyendo sinusitis, abscesos periamigdalares. neumona, empiema. bronquitis
y bronquiectasias. generalmente en pacientes con afecciones pulmonares crnicas.
Diagnstico de laboratorio. Las pasteurelas crecen bien en agar sangre y slo muy ra
ramente son capaces de crecer en medios de cu.tivos selectivos

1116
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
tener un cuidado especial con la manipulacin del material infectado para evitar l
a formacin de aerosoles o el contacto directo con la piel Los clnicos deben inform
ar siempre al personal del laboratorio si sospechan de la existencia de F. tular
ensis en las muestras con objeto de que se adopten las medidas de seguridad apro
piadas para evitar una exposicin accidental al microorganismo. Los cultivos se in
cuban a 35"C en una atmsfera que puede contener o no CO,. Las colonias aparecen g
eneralmente entre 2 y 4 das, y tienen un color que va de azul-grisceo a blanco, so
n redondas, lisas y ligeramente mucosas. En un medio que contenga sangre, puede
apreciarse una zona estrecha de (/-hemolisis alrededor de las colonias. Debido a
que el trabajo con este microorganismo en el laboratorio es peligroso, cualquie
r aislamiento sospechoso debe enviarse a un laboratorio de referencia, como el C
DC de Allanta, para su confirmacin mediante una prueba de aglutinacin en portaobje
tos o de mmunofluorescencia directa. El diagnstico de la tularemia tambin puede es
tablecerse por tcnicas serolgicas. Un ttulo de 1:40 en una reaccin de aglutinacin en
ausencia de una infeccin previa tiene valor diagnstico, y puede aumentar durante l
as tres primeras semanas hasta alcanzar un valor de 1:640 o incluso superior. La
s aglutininas frente a Brucella spp. tambin aumentan de forma inespecfica. pero su
titulo nunca alcanza valores tan altos. Sensibilidad a los antimicrobianos. Par
a F. tularensis la estreptomicina es bactericida, mientras que las tetraciclinas
y el cloranfenicol son bactenostticos. Puesto que no son infrecuentes las recidi
vas despus de un tratamiento con estos dos ltimos, el antibitico de eleccin es la es
treptomicina.
endocarditis. El examen histopatolgico es mespecifico y revela la existencia de u
na reaccin inflamatoria crnica. Diagnstico de laboratorio. Esla bactena crece en ag
ar con infusin de corazn enriquecido con suero de caballo inactivado por calor y e
xtracto de levadura. Una vez inoculados, los medios deben incubarse a 35'C en u
n a atmsfera hmeda que contenga un 10% de CCy Las colonias que aparecen en medio l
iquido tienen aspecto de bolas esponjosas, mientras que las que se forman en aga
r son pequeas y ligeramente translcidas u opacas. Los variantes en lase L pueden a
parecer eventualmente en los medios solidos. Debido a que es una bactena relativ
amente con poca actividad fisiolgica, la identificacin de S. monilitormis es compl
ea. Las pruebas bioqumicas deben realizarse utilizando como medio base caldo o aga
r con infusin de corazn enriquecido con suero de caballo y extracto de levadura. S
ensibilidad a los antimicrobianos. S monililormis es sensible a la penicilina. T
ambin pueden utilizarse los aminoglucsidos o la tetraciclina para tratar las lorma
s L. Prevencin y control. Puesto que entre un 10% y un 65% de las ratas estn infec
tadas por el microorganismo, el control de estos animales y las precauciones par
a evitar sus mordeduras representan las nicas estrategias eficaces para el contro
l y prevencin de la enlermedad.
Bacterias anaerobias
Es importante recalcar que las bacterias anaerobias representan el componente pr
incipal de la microbiota autctona de la piel y de las membranas mucosas (vase Tabl
a 50-1). Por tanto, el aislamiento e identificacin de estos microorganismos depen
den en gran medida de la correcta seleccin y recogida de las muestras, asi como d
el transporte de stas hasta el laboratorio en condiciones adecuadas. Las infeccio
nes por anaerobios son con frecuencia polimicrobianas, ya que en las mismas pued
en estar implicadas, simultneamente, vanas especies de bacterias anaerobias, o bi
en de anaerobias con anaerobias facultativas. En consecuencia, la primera tarea
a la hora de examinar un cultivo incubado en condiciones de anaerobiosis es pode
r diferenciar los microorganismos anaerobios estrictos de los facultativos, ya q

ue todos ellos habrn crecido en esas condiciones. El analista experto puede recon
ocer las especies anaerbicas que se aislan con mayor frecuencia, en base a las ca
ractersticas morfolgicas de las colonias y de los microorganismos observados bajo
tincin, y llevar a cabo una identificacin presuntiva mediante unas pocas pruebas a
dicionales. La identilicacin definitiva se basa en la realizacin de pruebas bioqumi
cas adicionales, en la determinacin de caractersticas genticas y fisiolgicas y en en
sayos de patogenicidad y neutralizacin de toxinas. El grado de identificacin de lo
s microorganismos anaerobios varia de acuerdo con el equipo disponible y la expe
riencia, el inters del personal de laboratorio y del equipo mdico y la utilidad cln
ica de la informacin disponible del laboratorio. Definiciones y caractersticas. Un
a bacteria anaerobia necesita u n a atmslera con una baja tensin de oxigeno para p
oder crecer, y es incapaz de desarrollarse en la superficie de un medio slido en
una atmsfera ambiental normal enriquecida con un 10% de CO.. Un anaerobio faculta
tivo es capaz de crecer en ambas situaciones. El trmino microaertilo. que no tiene
una definicin estncta. se aplica a ciertas bactenas. normalmente las especies de
los gneros Campylobactery Streptococcus, que slo se desarrollan en una atmsfera co
n un bajo contenido en oxgeno y una concentracin de dixido de carbono aumentada.
Calymmatobacterium
Caractersticas. C. granulomatis es un bacilo pleomrtico gramnegativo. inmvil y caps
ulado que puede cultivarse en el saco vitelino de los huevos o en medios de cult
ivo artificiales que contengan yema de huevo fresca. Esta bacteria posee determi
nantes de virulencia semejantes a los que exhiben las especies de Klebsiella, lo
que ha inducido a algunos expertos a clasificarla dentro de la familia Enteroba
cteriaceae. Manifestaciones clnicas y patogenia. Esta bacteria no provoca enferme
dades en los animales. En el hombre causa el granuloma inguinal, que se caracter
iza por la aparicin de lesiones ulcerogranulomatosas en la piel y las mucosas del
rea genital e inguinal. Diagnstico de laboratorio. Un fragmento de tejido extrado
del borde de una lesin ulcerosa se apneta y restnega sobre un portaobjetos de vid
rio para obtener un frotis que se tje por el mtodo de Giemsa o de Wnght. La detecc
in de bacilos pequeos, pleomrficos, rectos o curvados, con los extremos redondeados
, y granulos polares caractersticos en el interior de las clulas mononucleares es
la manera ms efectiva para llevar a cabo el diagnstico. Sensibilidad a los antmcrobi
anos. Los antibiticos eficaces frente a C. granulomatis son las tetraciclinas. la
eritromicina, la ampicilina y el cloranfenicol. La bacteria puede desarrollar r
esistencia a la estreptomicina.
Streptobacillus
Caractersticas. Streptobacillus moniliformis es una bactena gramnegativa de morfo
loga bacilar, anaerobia facultativa, inmvil y no capsulada, que aparece frecuentem
ente formando cadenas o largos filamentos, y que a menudo presenta una serie de
engrasamientos ovales o alargados que confieren al conjunto un aspecto de rosari
o. La morfologa varia con el tiempo, ya que en los cultivos jvenes los microorgani
smos presentan un aspecto filamentoso bastante uniforme, mientras que a medida q
ue el cultivo envejece aumenta la tendencia a la Patogenia y factores de virulen
cia. Excepto en el caso de los closlrifragmentacin para dar lugar a lormas cocoba
cilares irregulares. Esta bacteria dios, se sabe poco sobre los factores que det
erminan la virulencia y la patoforma colonias L en agar. que tienen un aspecto q
ue recuerda a un "huevo frito" genicidad de la mayora de los microorganismos anae
robios En el caso de y pueden estabilizarse si se aade penicilina al medio de cul
tivo. los miembros de la familia Bacteroidaceae se han identificado diferentes a
ctividades biolgicas (endotoxina, proteasas. hepannasa) que podrian jugar un Mani
festaciones clnicas y patogenia. S monililormis forma parte de papel en este cont
exto. El polisacrido capsular de Bacteroides Iragilis favola microbiota autctona d
el tracto respiratorio superior de los roedores silvesrece la formacin de absceso
s. Por otro lado, las especies del gnero Ctostres y de laboratorio. La enfermedad
que produce en el hombre (fiebre de la tridium producen exotoxinas m u y potent
es que incluyen factores letales y mordedura de la rala o enfermedad de Haverhil
l) es consecuencia de la mornecrotizantes. hemolisinas. lecitinasas, gelatinasas

y hialuronidasas. dedura de roedores, de la ingestin de alimentos contaminados o

de lesiones traumticas. En un perodo de tiempo de unas tres semanas pueden apareM
ientras que las infecciones e intoxicaciones por clostridios pueden lener un cer
una serie de manifestaciones clnicas como linfoangitis local y linfadeniongen ta
nto exgeno como endgeno, las causadas por otros microorganismos tis, seguidas por
fiebre, escalofros, malestar general y. ms tarde, por un anaerobios se originan en
dgenamente, a partir de la propia microbiota anaeexantema morbidforme generalizado
, maculopapular o petequial Algunos robia normal presente en una membrana mucosa
contigua, cuya integridad ha pacientes desarrollan poliartritis migratoria Tamb
in se han descrito casos de sido daada por una intervencin quirrgica, traumatismos,
utilizacin de m s -

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA
1117
Irumental medico o por un lumor. Para que se inicie el proceso infeccioso causad
o por anaerobios es esencial que el potencial de oxidorreduccin disminuya en el t
e|ido afectado, lo que puede ser consecuencia de la interrupcin del aporte sangune
o o de la multiplicacin de otras bactenas en la zona. Sin lugar a dudas, las infe
cciones e intoxicaciones por clostridios son de la mayor importancia, aunque rec
ientemente se ha reconocido el papel que juegan otros microorganismos anaerobios
como agentes causales de celulitis y mionecrosis. La mayora de aislamientos de C
lostridium pertringens efectuados en el entorno hospitalario son consecuencia de
simples contaminaciones de heridas. En estos casos, las bacterias se multiplica
n en los restos celulares, en un hematoma o en tejido necrtico sin que se observe
sintomatologa clnica alguna. La celulitis anaerobia es una patologa que produce ne
crosis en los tejidos blandos. Su inicio es gradual, pero puede extenderse rpidam
ente. Aunque se forma gas. la infeccin no afecta al tejido muscular. Adems de clos
tndios, o en su lugar, en la celulitis anaerobia pueden estar implicados tambin c
ocos anaerobios y bacilos gramnegativos anaerobios. En contraste con la celuliti
s anaerobia, la gangrena gaseosa o mionecrosis clostridial es un proceso invasiv
o agudo y de rpida progresin que provoca grandes alteraciones en el msculo. Es de l
a mayor trascendencia el distinguir entre celulitis anaerobia y gangrena gaseosa
para evitar la realizacin de intervenciones teraputicas quirrgicas agresivas y mut
ilantes, innecesarias en el primer caso. Los clostridios histotxicos asociados co
n la gangrena gaseosa incluyen C. perlnngens. C. novyi. C. septicum, C. histolyt
icum. C. sporogenes y C. bifermentans. Mientras que C. pertringens es la especie
que est implicada con mayor frecuencia como agente causal de gangrena gaseosa, l
a prevalencia de las otras variedades en el proceso vara ampliamente. El ttanos y
el botulismo son intoxicaciones ms que infecciones, debido a que las manifestacio
nes clnicas de ambas enfermedades estn relacionadas con la elaboracin de potentes n
eurotoxinas por parte de los microorganismos implicados en las mismas. El botuli
smo est relacionado muy a menudo con la ingestin de alimentos elaborados en casa q
ue han sido preparados o envasados inadecuadamente; de todos modos, tambin se han
detectado brotes espordicos de la enfermedad asociados con la ingestin de aliment
os preparados comercialmente o con la infeccin de heridas por el microorganismo (
C botulinum). El perodo de incubacin del botulismo es corto; los sntomas y signos c
lnicos aparecen entre 18 y 36 horas despus de la ingestin del alimento contaminado.
De los siete tipos de toxina botulnica conocidos, el tipo A es el ms comn, seguido
por los tipos B, E y F en los casos de intoxicacin alimentaria en EE.UU. La toxi
na es absorbida a nivel del tubo digestivo, y ms raramente a partir de la herida
infectada, fijndose en ltimo trmino a las terminales nerviosas motoras, impidiendo
la liberacin de acetilcolina y la transmisin del impulso nervioso. El ttanos se pre
senta tpicamente en personas no inmunizadas dentro de las dos primeras semanas si
guientes al momento de haber sufrido heridas, pinchazos o abrasiones de origen t
raumtico, aunque tambin se han descrito casos tras intervenciones quirrgicas y dent
ales, despus de un parto o un aborto, o en situaciones de estasis y lceras de decbi
to. La toxina, denominada tetanoespasmina, es transportada hasta los ganglisidos
en el SNC por medio de los torrentes linftico y circulatorio, y por migracin a tra
vs de los espacios penneurales de los nervios perifricos. Clostridium difficile es
la causa principal de diarrea de origen nosocomial y el responsable primario de
la colitis seudomembranosa. Tambin provoca, aunque m u c h o ms raramente, absces
os, infecciones de las hendas, osteomielitis, pleuritis, peritonitis, septicemia
e intecciones de las vias urinarias. El porcentaje de portadores de C. difficil
e (y de las toxinas que produce) es elevado (50% o ms) en neonatos, aunque los ca
sos de enfermedad son raros (Bartlett, 1997). La colonizacin, con o sin produccin
de toxina, puede mantenerse durante varios meses, pero cuando la microbiota inte

stinal adulta se ha establecido entre los 6 y 12 meses de edad, los porcentajes

de colonizacin caen drsticamente y slo un 3% de los adultos sanos se encuentran col
onizados por el microorganismo. Las personas hospitalizadas que estn recibiendo t
ratamiento con antibiticos y resultan infectadas por C. difficile adquieren casi
siempre el microorganismo tras una exposicin directa o indirecta con algn reservor
io humano o inanimado del mismo. Aunque las penicilinas y las cefalosporinas son
los antibiticos que aparecen asociados ms frecuentemente con esta situacin, cualqu
ier antibitico puede, en potencia, desencadenar la
patologa asociada con C. difficile. Raramente la enfermedad aparece sin que haya
existido un tratamiento previo con antibiticos, aunque se han descrito casos asoc
iados con tratamientos con agentes antineoplscos que poseen tambin actividad antimi
crobiana. La colitis seudomembranosa es una enfermedad mediada por la accin de to
xinas y en la que no parece existir invasin de la mucosa intestinal por el microo
rganismo. C. difficile produce dos toxinas diferentes. La toxina A, una toxina db
ilmente citoptica, es responsable de la actividad enterotxica de la bacteria. La t
oxina B. una potente cilotoxina. parece jugar un papel poco relevante en la enfe
rmedad humana, aunque a partir de pacientes sintomticos se han aislado cepas de C
. difficile incapaces de sintetizar toxina A, pero que producen toxina B (Johnso
n, 1998). Como ya se ha mencionado previamente, otras bacterias anaerobias, part
icularmente los cocos anaerobios y los bacilos gramnegativos. se han asociado co
n la celulitis anaerobia adems o en lugar de las especies histotoxicas de Clostri
dium. Estas bacterias forman parte de la microbiota autctona de las membranas muc
osas de la cavidad oral y de los tractos gastrointestinal y genitourinario. Como
tales se encuentran en neumonas por aspiracin, abscesos pulmonares, empiemas, abs
cesos e infecciones intraabdominales, abscesos plvicos y cerebrales y bacteriemia
s. Las infecciones intraabdominales por anaerobios suelen aparecer como consecue
ncia de intervenciones quirrgicas en abdomen y colon y se asocian con el grupo de
Bacteroides fragilis. Las bacteriemias por anaerobios, clnicamente significativa
s, tambin son causadas frecuentemente por esta bacteria. Diagnstico de laboratorio
. La identificacin de las bacterias anaerobias hasta el nivel de especie puede se
r una tarea bastante compleja; sin embargo, el grado hasta el que debe caracteri
zarse un aislamiento de un microorganismo anaerobio varia ampliamente y puede li
mitarse a obtener tan slo aquella informacin bsica que sea de utilidad clnica. Por e
jemplo, la microbiota mixta presente en una lesin como una lcera de decbito, una fst
ula perirrectal o un absceso intrabdominal puede caracterizarse simplemente como
microbiota fecal mixta, sin necesidad de tener que identificar a c a d a uno de
sus integrantes individuales. La identificacin de un aislamiento hasta el nivel
de especie puede circunscribirse exclusivamente a aquellos microorganismos que s
e obtienen en cultivo puro a partir de muestras y fluidos orgnicos procedentes de
localizaciones del cuerpo habitualmente estriles, y puede llevarse a cabo con ba
stante facilidad mediante diversos sistemas comerciales de pruebas bioqumicas o u
tilizando la cromatografa de gasliquido. Hay que entender que el valor clnico de c
ualquier informe sobre la deteccin de bacterias anaerobias est directamente relaci
onado con la rapidez con la que dicho informe es remitido desde el laboratorio.
Aquellos protocolos de identificacin que necesitan una o dos semanas para complet
arse tienen, por lo general, un inters acadmico o bsico solamente. Debido a la rapi
dez con la que progresan y a su considerable morbilidad y mortalidad, el diagnsti
co inicial y tratamiento de las enfermedades causadas por las especies de Clostr
idium deben basarse en las manifestaciones y sntomas clnicos. En algunos pacientes
de ttanos no es posible d e t e c t a r la existencia de una herida primaria. Cu
ando existe una herida, raramente se observan microorganismos con la morfologa tpi
ca de C. tetanien frotis teidos, aun cuando la bacteria pueda recuperarse por cul
tivo. Adems, debido a que este microorganismo est ampliamente distribuido en la na
turaleza, su aislamiento a partir de una herida no implica necesariamente un dia
gnstico positivo de ttanos. La confirmacin del botulismo en el laboratorio requiere
la deteccin de la toxina en el suero, las heridas, el contenido gstrico, las hece
s o el alimento sospechoso de haber causado la enfermedad. Los mtodos para llevar
a cabo la extraccin de la toxina, as como las pruebas de neutralizacin en ratones,
son tcnicamente complejos: por tanto, es aconsejable que los especmenes apropiado

s sean enviados al CDCde Atlanta para su examen y anlisis. En este caso debe hace
rse una consulta telefnica previa para asegurarse de que las muestras han sido ob
tenidas y transportadas correctamente y que las autoridades sanitarias pertinent
es han sido alertadas. En los casos en los que existe sospecha de una celulitis
anaerobia o una gangrena gaseosa, el laboratorio puede ser una ayuda valiosa par
a el diagnstico mediante el examen microscpico de las muestras de exudados o tejid
os. El hallazgo de bacilos grampositivos grandes, en nmero elevado, con la tpica m
orfologa "boxear" (Lmina 50-6), permite una confirmacin presuntiva del diagnostico.
Los frotis teidos pueden proporcionar tambin el diagnstico d eu n a miositis estre
ptoccica anaerobia. Tambin deben realizarse cultivos a partir de

1118
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

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de exudados, tejidos y sangre. Una vez ms, el grado de identificacin vara considera
blemente entre los distintos laboratorios: de todas formas, C. perfrngens puede i
dentificarse fcilmente p o r su morfologa bajo tincin de Gram. por la formacin de un
a zona doble de hemolisis en agar sangre y por dar una reaccin de N a g l e r pos
itiva en agar con y e m a de huevo. El diagnstico de laboratorio de la diarrea ca
usada por C. difficile puede llevarse a cabo fcilmente, d e t e c t a n d o la pr
esencia de toxina directamente en la muestra de heces m e d i a n t e enzimoinmu
noensayo o bien p o ru n a prueba en cultivo de clulas. Alternativamente, puede c
omprobarse la capacidad del microorganismo aislado a partir de las h e c e s par
a producir toxina.

CAPTULO
51
Pruebas de sensibilidad in vitro BiSr m a los antimicrobianos
Michael B. Smith, M.D. Gail L. Woods, M.D. DEFINICIONES INDICACIONES PARA LAS PR
UEBAS DE SENSIBILIDAD SELECCIN DE LOS ANTIMICROBIANOS MTODOS Mtodo de dilucin Mtodo d
e difusin en disco E-test Consideraciones tcnicas Sistemas de anlisis PRUEBAS BACTE
RICIDAS Concentracin mnima bactericida o letal Estudios de la tasa de muertes Estu
dios bactericidas del suero
1125 1119
ANLISIS DE ANTIMICROBIANOS Indicaciones Recogida de muestras Mtodos Interpretacin B
IBLIOGRAFA
1127
1120 1120 1123
1129
La seleccin de un antimicrobiano depende de numerosos factores, entre los que se
incluyen el lugar de la infeccin: diversos factores del husped, como el estado de
los mecanismos de defensa inmunolgica, el estado de la funcin renal y/o heptica y l
a historia de reacciones alrgicas: las caractersticas de absorcin del antimicrobian
o y su va de excrecin: las propiedades farmacocinticas y la posologia del antimicro
biano: la experiencia personal con respecto al antimicrobiano; la sensibilidad l
ocal y los patrones de resistencia; los costes de adquisicin y la administracin de
l antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo (rente al antimicrobiano.
A pesar de que la seleccin del tratamiento inicial para una infeccin se efecta a me
nudo de una manera emprica, la disponibilidad de pruebas de sensibilidad contribu
ye de modo adecuado al ajuste de la dosis inicial administrada o bien a la modif
icacin del tratamiento existente por las siguientes razones: 1) el microorganismo
infectante es resistente al antimicrobiano que se est administrando. 2) la dosis
del antimicrobiano administrada inicialmente puede ser modificada y 3) el antim
icrobiano puede ser reemplazado por otro igualmente eficaz pero de ms bajo coste.
DEFINICIONES
Existen diversas categoras de pruebas utilizadas para determinar la actividad ant
imicrobiana. La primera categora est representada por la prueba de dilucin y la pru
eba de difusin con disco, que valoran la actividad inhibidora de un antimicrobian
o frente a un microorganismo determinado. En la segunda categora se encuentran la
s pruebas que determinan la actividad letal de un antimicrobiano (bactericida o
fungicida) frente a un determinado microorganismo. Una tercera categora de prueba
s se refiere a la determinacin de la actividad (5-lactamasa en un determinado mic
roorganismo, como elemento
pronstico de su sensibilidad frente a algunos antibiticos |5-lactmicos. En la cuart
a categora se encuentran las pruebas para determinar directa o indirectamente la
cantidad de antimicrobiano en un lquido biolgico, habitualmente el suero. En esta
categora se incluyen las pruebas bactericidas sricas y los estudios especficos de a
ntimicrobanos. Las bacterias suelen describirse como sensibles, de sensibilidad i
ntermedia o resistentes a los antimicrobianos. Las definiciones de estas categora
s interpretativas han sido proporcionadas por los procedimientos recomendados pa
ra las pruebas de difusin con disco y de dilucin, publicadas por el National Commi
ttee for Clinical Laboratory Standards {NCCLS M2-A6.1997; NCCLS M7-A4.1997). La
sensibilidad implica que la infeccin producida por un microorganismo puede tratar
se adecuadamente con la dosis del anlimicrobiano recomendado para este tipo de i
nfeccin y de microorganismo infectante, excepto en aquellos casos en los que est c
ontraindicado por otras razones. Una sensibilidad intermedia supone que la infec

cin debida a u n microorganismo puede ser tratada mediante concentraciones alcanz

ables de determinados antimicrobianos cuando se administran stos en dosis ms altas
o cuando las infecciones se encuentran en regiones del organismo donde se conce
ntran los antimicrobianos (p. ej.. la orina). La categora intermedia proporciona
una "zona tampn" para impedir que se produzcan discrepancias importantes en la in
terpretacin debidas a pequeos factores tcnicos no controlados. La resistencia supon
e que la infeccin producida por un microorganismo no responder o responder de forma
inadecuada al antimicrobano. Hay que tener en cuenta que la actividad antimicrob
iana m vivo depende de muchos factores, entre los que se incluyen la dosis, la va
de administracin, los sistemas defensivos del husped, el volumen de distribucin de
l antimicrobiano. las caractersticas de absorcin y de excrecin del antimicrobiano,
la existencia de una insuficiencia renal o heptica establecida o en desarrollo y
las reacciones adversas al anlimicrobiano. Por consiguien-

1120
SECCIN VI

MICROBIOLOGIA MEDICA
te, las categoras de interpretacin slo proporcionan estimaciones de la actividad an
timicrobiana in vivo.
A pesar de que se han descrito procedimientos para la valoracin de la anfotericin
a B. la flucitosma y los azoles. no se han establecido los puntos de corte. Tamp
oco se ha establecido la utilidad clinica del estudio de la sensibilidad de leva
duras y hongos filamentosos.
INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
Las indicaciones para la realizacin de las pruebas de sensibilidad varan en funcin
del microorganismo. Por ejemplo, el estudio de sensibilidad est indicado en las b
acterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rpido, clnicamente sign
ificativas y con una sensibilidad imprevisible a los antimicrobianos de eleccin.
En general, la prueba de sensibilidad no es necesaria cuando se sabe que el micr
oorganismo es sensible al antmicrobiano de primera eleccin. En EE.UU., esto sucede
con los aislamientos de Streplococcus pyogenes. que hasta la fecha son universa
lmente sensibles a la penicilina. Sin embargo, si el paciente es alrgico al antim
icrobiano de eleccin, es razonable que se estudie su sensibilidad a antimicrobian
os alternativos, como la eritromicina en el caso del S. pyogenes. El estudio de
aislamientos que de modo caracterstico son considerados "contaminantes" o "flora
normal" es caro, conlleva mucho tiempo y puede dar lugar a una administracin inne
cesaria de antimicrobanos (Bates, 1991); por ello no se recomienda. De forma ocas
ional, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos, estos "contaminantes" son verda
deros patgenos, siendo importante que el clnico comunique estas circunstancias esp
eciales al personal del laboratorio para que se estudien apropiadamente. Otras s
ituaciones en las que los estudios de sensibilidad son tiles son los estudios epi
demiolgicos y las evaluaciones de nuevos antimicrobanos. Debido a los patrones var
iables de sensibilidad de las bacterias anaerobias, el Working Group on Anaerobi
o Anlimicrobial Susceptibility Teslmg ol Ihe NCCLS ha recomendado que se estudie
la sensibilidad de las bacterias anaerobias aisladas de los siguientes tipos de
infecciones: abscesos cerebrales, endocarditis, osteomielitis, infecciones arti
culares, infecciones de prtesis implantadas e injertos vasculares y en las bacter
iemias refractarias o recurrentes (NCCLS M11-A4, 1997). Tambin deben estudiarse e
species resistentes o especialmente virulentas, como Bacleroidesde\ grupo Iragil
is, PrevotelialPorphyromonas sp.. algunas especies de fusobacterias y clostridio
s. Bilophilia wadsworthia y Bacteroides del grupo gracilis (NCCLS M11-A4. 1997).
Por otra parte, el estudio de sensibilidad de las bacterias anaerobias debe rea
lizarse peridicamente para monitorizar los patrones de sensibilidad en diversos c
entros y hospitales de EE.UU. y dems pases, tambin para determinar la sensibilidad
a nuevos antimicrobianos. Las indicaciones para el estudio de sensibilidad de My
cobacterium tuberculosis han cambiado debido al resurgimiento de la tuberculosis
en EE.UU. y a la aparicin de cepas multirresistentes. Actualmente se recomienda
que los aislamientos iniciales de lodos los pacientes sean valorados y que el es
tudio se repita si la muestra de esputo contina presentando un cultivo positivo t
ras tres meses de terapia (Tenover, 1993a). No existen pautas slidas respecto al
estudio de sensibilidad de micobacterias atpicas. Durante los ltimos aos se ha incr
ementado la prevalencia de las infecciones fngicas sistmicas. sobre todo en inmuno
deprimidos, y se han desarrollado nuevos antifngicos. Por otra parte, se ha descr
ito la resistencia de ciertos hongos a la terapia tradicional (como Candida lusi
lanae, resistente a la anfotencma B): debido a un aumento en la utilizacin de los
azoles. especialmente el fluconazol. han aparecido levaduras resistentes a esto
s antimicrobianos (sobre todo especies de Candida). Como resultado se ha increme

ntado el inters en el estudio de sensibilidad de los antifngicos. Se cre el NCCLS S

ubcommitlee on Antiungal Susceplibility Testing para evaluar la necesidad de una
seleccin de paulas en la terapia antifngica que ayude al laboratorio. Reuniendo da
tos se estableci una necesidad, ante la cual el subcomit desarroll un mtodo de refer
encia de macrodilucin en caldo y una adaptacin de microdilucin para el estudio de l
evaduras (especies de Candida y Cryplococcus neoiormans) que producen infeccione
s sistmicas (NCCLS M27-A, 1997). De modo similar, para evaluar la sensibilidad a
los antifngicos se ha desarrollado un procedimiento de macrodilucin en caldo y una
adaptacin de microdilucin utilizando conidias o esporangiosporas de hongos filame
ntosos, como especies de Aspergillus. especies de Fusarium. especies de Rhizopus
. Pseudoalleschea boydi y la forma micelar de Sporothrix schenckii (NCCLS M38-P. 1
998).
SELECCIN DE LOS ANTIMICROBIANOS
La seleccin de anlimicrobianos para estudios de sensibilidad (Tabla 511) se ha co
mplicado debido a la ampliacin de su espectro de actividad y del nmero de compuest
os dentro de las clases de antimicrobanos del mismo espectro. |unto a las nuevas
clases de antimicrobanos (NCCLS M100-S9. 1999). El estudio de todos los compuesto
s disponibles no es necesario ni prctico. El proceso de seleccin comienza en el Ph
armacy and Therapeulics Commitlee. que selecciona los antimicrobanos para la guia
de frmacos de uso hospitalario. El objetivo ser coordinar los antimicrobianos de
la gua que deben estudiarse o informarse. Esta coordinacin tiene hoy en da una gran
importancia por diversas razones. En primer lugar, la mayora de los laboratorios
utilizan paneles de microdilucin preparados comercialmente para el estudio de la
sensibilidad antibacteriana. Los fabricantes ofrecen una diversidad de paneles
que se disean para corresponderse tanto como sea posible con los antibacterianos
de las guas hospitalarias A pesar de la variedad de paneles disponibles, existe c
on frecuencia disparidad entre los antimicrobianos de los paneles y los de la gua
hospitalaria, por lo que el laboratorio debe enfrentarse la tarea de estudiar ms
de un panel para un microorganismo determinado o pagar un precio suplementario
para disponer de un panel, de acuerdo con las especificaciones del hospital. Sin
embargo, en muchos casos se estudian ms antimicrobianos de los disponibles en la
gua del hospital, por lo que el laboratorio debe suprimir los resultados de los
antimicrobanos que no se encuentran en sta. En segundo lugar, generalmente no es n
ecesario informar los resultados de los estudios de sensibilidad de muchos compu
estos que presentan el mismo espectro (p. ej., cefotaxima, ceftizoxima y ceftria
xona), incluso aunque exista ms de uno en la guia. En tercer lugar, existe con fr
ecuencia un retraso entre la aprobacin del agente para su utilizacin clnica y su in
corporacin en el producto comercializado de la prueba de sensibilidad, debido a q
ue los fabricantes de sistemas de pruebas de sensibilidad antimicrobiana prepara
dos comercialmente deben presentar los datos a la Food and Drug Adminislration (
FDA). validando la exactitud de sus equipos frente a cualquier antmicrobiano apro
bado recientemente. En consecuencia, puede ser aprobado un nuevo antimicrobiano
para la guia del hospital antes de que el laboratorio tenga capacidad para estud
iar su actividad in vilro. En las normas del NCCLS para el estudio de la sensibi
lidad por dilucin y difusin en disco se enumeran antimicrobianos que deben conside
rarse para la valoracin frente a enterobacterias, Pseudomonas. estafilococos, ent
erococos, estreptococos no enterococos y Haemophilus (NCCLS M2A6, 1997; NCCLS M7
-A4, 1997): sin embargo, el nmero de compuestos enumerados en la agrupacin primari
a (grupo A) y en la agrupacin secundaria (grupos B y C), que deben considerarse p
ara las pruebas, sobrepasa a menudo el nmero de los que deben estudiarse en un la
boratorio determinado. Los documentos del NCCLS enumeran la piperacilina. la mez
locilina y la ticarcilna en las agrupaciones primarias que deben estudiarse frent
e a Pseudomonas. Puesto que se recomienda que las penicilinas activas frente a P
seudomonas no deben utilizarse individualmente (Grible. 1983) y dado que ningn est
udio clnico de pacientes con enfermedades graves (p. ej neutropenia febril) ha dem
ostrado diferencias significativas en los resultados entre regmenes teraputicos co
mbinados de diversas penicilinas ms un aminoglucsido, las diferencias en los grado
s de actividad in vilro de las penicilinas activas frente a Pseudomonas no son c
lnicamente importantes y la seleccin de una penicilina activa frente a Pseudomonas

para la guia (y, por tanto, para el estudio de la sensibilidad in vilro) puede
basarse en la lista de las indicaciones aprobadas para la utilizacin de un compue
sto del mismo espectro y sus costes de adquisicin y administracin, relativos a cua
lquier otro miembro de la misma clase de espectro. El cido clavulnico incrementa e
l espectro de la ticarcilna frente a enterobacterias y estafilococos productores
de (Mactamasa mediada

CAPTULO 51

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN varo A LOS ANTIMICROBANOS

1121
por plsmidos. pero poco aade a la actividad antipseudomonas de la ticarcilna; no ob
stante, existen pocas diferencias entre las actividades antipseudomonas de la pi
peracilina y de la ticarcilna (con o sin cido clavulnico) con respecto a la concent
racin mnima inhibitoria (CMI) recomendada por el NCCLS para definir la sensibilida
d de Pseudomonas, es decir, menor o igual a 64 ug/ml (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M
7-A4,1997). Una posible consideracin es que a pesar de que los costes de adquisic
in por gramo de ticarcilina-clavulnico pueden ser ms elevados que los de una penici
lina antipseudomonas. los costes de la administracin de ticarcilinaclavulnico ms un aminoglucsido pueden ser menores que los de una penicilina antipse
udomonas ms un aminoglucsido ms oxacilina. Asi pues, los costes de la administracin
pueden pesar significativamente ms que los costes de adquisicin de un agente antib
acteriano determinado. La farmacocintica de cualquier antimicrobiano afecta de ma
nera evidente los costes de la administracin, ya que un antmicrobiano con una vida
media prolongada puede administrarse en un rgimen de dosificacin menos frecuente
que otro antimicrobiano del mismo espectro antibactenano de actividad pero con u
na vida meda mas corta.

1122
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Aunque en general existe consenso para estudiar la sensibilidad de estafilococos
y estreptococos a penicilina, de enterococos y enterobacterias a ampicilina y d
e los estafilococos a oxacilina. hay menos acuerdo en lo que se refiere a las ce
falosporinas que deben estudiarse frente a las bacterias grampostivas y gramnegaf
ivas. L a cefalotina puede utilizarse como representante de las cefalosporinas d
e primera generacin, incluyendo la cefazolina; sin embargo, se recomienda que la
cefazolina no se utilice como representante de clase para la cefalotina y otras
cefalosporinas de primera generacin, debido a la inaceptable tasa de falsas sensi
bilidades para otras cefalosporinas, en especial por lo que se refiere a Escheti
chia coli (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Por tanto, la cefazolina slo deb
e estudiarse si es la clase representativa de la guia. Existe bastante controver
sia respecto a la necesidad de estudiar las cefalosporinas de segunda generacin y
, en caso de hacerlo, cules deben ensayarse frente a las enterobacterias. El cefo
tetn. la cefoxitina y el cefamandol. el cefonicid o la cefuroxima se enumeran com
o antimicrobianos primarios que hay que considerar para las pruebas en las insti
tuciones en las que existe resistencia endmica o epidmica frente a antimicrobianos
primarios (es decir, cefazolina o cefalotina) estudiados en la misma clase. Una
vez ms, la seleccin depende de la existencia en la gua y de las indicaciones que h
an sido especificadas por el Pharmacy and Therapeutics Commillee en cuanto a su
utilizacin. Por ejemplo, el cefotetn o la cefoxitina pueden estar disponibles en e
l hospital para el tratamiento de infecciones por bacterias anaerobias y, en est
e caso, puede ser til estudiarlas frente a cualquier enterobacteria que pueda est
ar presente en una infeccin mixta aeroba-anaeroba. Por otra parte, es posible que e
n el hospital se disponga de una o ms cefalosporinas de segunda generacin nicamente
como profilaxis perioperatoria; en este caso, tal vez sea innecesario estudiarl
as de forma sistemtica. La seleccin de cefalosporinas de tercera generacin para est
udiar su sensibilidad no slo se basa en las cefalosporinas que se encuentren en l
a gua, sino tambin en la equivalencia de actividad in vitro. Por ejemplo, entre ce
foperazona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona y ceftazidima existen slo pequeas
variaciones de actividad con respecto a las enterobacterias. Por consiguiente,
incluso en el caso de que en la gua existan ms de uno de estos compuestos, es posi
ble estudiar slo uno como representante de los dems frente a las enterobacterias.
La nica excepcin posible a esta norma se refiere a las |5-lactamasas de espectro a
mpliado (ESBL) de Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias. Estas |$-lactam
asas mediadas por plsmidos onginan resistencia a las cefalosporinas, aunque no a
cefamicinas ni a imipenem (CTX-1 o TEM-3), o bien presentan actividad preferenci
al frente a la ceftazidima (CAZ-1 o TEM-5 y CAZ o TEM-6) (Jarlier, 1988; Sirot.
1988; Sougakoff, 1988). La resistencia cruzada entre cefalosporinas de tercera g
eneracin se observa tambin en mulantes gramnegativos desreprimidos de (J-lactamasa
de clase I, dado que el inoculo se ha ajustado aproximadamente a 5 x 10" unidad
es formadoras de colonias (UFC)/ml y la prueba se incuba durante un mnimo de 6 ho
ras (Washington, 1988). En muchos casos, en la guia del hospital se encontrar bie
n cefoperazona o bien ceftazidima para el tratamiento de Pseudomonas. Por tanto,
la principal cuestin reside en s ambos antimicrobianos deben ser estudiados en el
laboratorio frente a las enterobacterias. con el fin de fomentar la limitacin de
l uso de cualquiera de ambos en el tratamiento de las infecciones por Pseudomona
s y reducir el riesgo de la aparicin de resistencia. La aparicin de |i-lactamasas
mediadas por plsmidos con actividad preferencial frente a ceftazidima, as como las
|i-lactamasas mediadas por plsmidos preexistentes con actividad frente a cefoper
azona entre las enterobacterias, conducir a una poltica de limitacin de las pruebas
de sensibilidad de cefoperazona o ceftazidima frente a Pseudomonas. Los laborat
orios deberan considerar el estudio de sensibilidad de todos los aislamientos de

enterococos (rente a vancomicina, dada la aparicin de cepas resistentes (Livornes

e. 1992; HICPAC, 1995). No obstante, no todos los sistemas automticos detectan co
n fiabilidad la resistencia de los enterococos frente a vancomicina: si se emple
a uno de estos sistemas menos fiables, se recomienda la inclusin de un mtodo alter
nativo (difusin en disco, estudio en agar o E-test) para asegurar unos resultados
exactos (Sahm, 1991; Tenover, 1993b; Woods, 1993; Kohner, 1997; Endtz, 1998). S
e deben
realizar estudios de resistencia elevada a gentamicina y a estreptomicina en tod
os los aislamientos de enterococos procedentes de zonas estriles del organismo, y
debe informarse al clnico (quizs a travs de un comentario adjunto a los resultados
de las pruebas de sensibilidad) de que est indicada la terapia de combinacin entr
e penicilina o ampicilina ms un aminoglucsido en las infecciones graves por entero
cocos. como la endocarditis. Como sucede con la vancomicina, no todos los sistem
as automticos detectan con habilidad la resistencia elevada a los aminoglucsidos.
pudiendo ser necesario investigar un mtodo alternativo que se conozca que proporc
iona resultados exactos (Wiley, 1992). El NCCLS aconseja estudiar la produccin de
[i-lactamasa en los enterococos aislados de sangre y liquido cefalorraqudeo (LCR
). Los antimicrobianos a considerar en el estudio de los aislamientos urinarios
de enterococos son ciprofloxacna (o bien levofloxacina o norfloxacina), nitrofura
ntona y tetracichna. Los resultados de las pruebas de sensibilidad de los enteroc
ocos frente a cefalosporinas. aminoglucsidos (excepto los estudios de resistencia
elevada), clindamicma y Irimetoprim-sulfametoxazol pueden despistar y no deben
informarse. El estudiar o no e informar de la actividad del aztreonam. la ciprof
loxacna y el imipenem de forma peridica habitualmente reflejar su presencia en la g
ua del hospital y, en caso de encontrarse, cualquier restriccin en su uso (p. ej.,
slo mediante consulta de enfermedad infecciosa). En cuanto a Haemophilus influen
zae, el grupo primario de antimicrobianos que hay que considerar en las pruebas
de sensibilidad de los aislamientos de sangre y LCR est formado por ampicilina. u
na cefalosporina de tercera generacin (cefotaxima. ceftazidima. ceftizoxima o cef
triaxona) y cloranfenicol. Si la muestra procede de una infeccin localizada, que
no supone un riesgo para la vida, los antimicrobanos a considerar incluyen ampici
lina, trimetoprim-sulfametoxazol. amoxicilina-clavulnico (o ampicilina-sulbactam)
, cefaclor y tetraciclina. Los resultados de las pruebas de sensibilidad frente
a ampicilina predicen la actividad de la amoxicihna. La resistencia a ampicilina
puede delectarse en la mayora de casos por el estudio de la produccin de |5-lacta
masa; sin embargo, existen cepas |5-lactamasa negativas con resistencia cromosmic
a a ampicilina (BLNAR) (Mendelman, 1984). Por tanto, si la prueba de la |3-lacta
masa es negativa, la sensibilidad a ampicilina puede confirmarse mediante la pru
eba de dilucin o difusin en disco si la incidencia de BLNAR es alta en la regin del
servicio de anlisis. Debe estudiarse la resistencia a penicilina de todos los ai
slamientos de Streptococcus pneumoniae procedentes de zonas estriles del organism
o. Si se realiza mediante la prueba del disco de oxacilina, los aislamientos con
un dimetro de halo menor o igual a 19 mm deben evaluarse adicionalmente por un mt
odo de dilucin para distinguir las cepas resistentes de las de sensibilidad inter
media. La consideracin de otros antimicrobianos en el estudio de aislamientos pro
cedentes de zonas estriles del organismo vara en funcin del mtodo de prueba utilizad
o. En pacientes con infecciones que suponen un riesgo para la vida, como meningi
tis o bacteremias, el NCCLS recomienda el estudio de penicilina, cefotaxima, ceft
riaxona. meropenem y vancomicina. Se han proporcionado normas interpretativas so
bre mtodos de dilucin para estos antimicrobianos: sin embargo, sobre mtodos de difu
sin en disco slo existen normas interpretativas para penicilina y vancomicina; por
tanto, los mtodos de difusin en disco slo pueden utilizarse para estos dos ltimos a
ntimicrobanos (NCCLS M100-S9,1999). Los antimicrobanos que hay que considerar en e
l estudio de aislamientos procedentes de infecciones que no representan una amen
aza para la vida incluyen penicilina (mediante la prueba del disco de oxacilina)
, eritromicina y trimetoprim-sullametoxazol. Con respecto a los estreptococos de
l grupo viridans. se debe analizar la sensibilidad frente a penicilina de cualqu
ier aislamiento implicado en endocarditis bacteriana o, con menor frecuencia, en
meningitis (Goldfarb. 1984; Oumn. 1988). Est justificado el estudio de sensibili

dad de los estreptococos del grupo viridans frente a las cefalosponnas considera
das para la terapia, ya que pueden presentar resistencia relativa a las cefalosp
orinas de tercera generacin (Wilcox. 1993). La vancomicina es la alternativa reco
mendada a los frmacos p-lactmicos, aunque no es necesario su estudio sistemtico, da
do que no se ha informado de resistencia a vancomicina en este grupo de microorg
anismos. Sin embargo, la valoracin de la sensibilidad a vancomicina es til para pr
opsitos de identificacin, pues la resistencia indicara que el

CAPTULO 51

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBANOS

1123
microorganismo no es un estreptococo del grupo viridans, sino ms probablemente un
miembro de los gneros intrnsicamente resistentes a vancomicina. como Leuconosloc
o Pediococcus. Las pruebas habituales de sensibilidad de los aislamientos de Nei
ssena gonorrhoeae no son necesarias. El estudio de la produccin de |l-lactamasa e
n todos los aislamientos le importante en el pasado, pero no es m u y recomendado
, dado que ni la penicilina ni la ampicilina estn incluidas en los regmenes teraput
icos recomendados para las infecciones gonoccicas por el Centers for Disease Cont
rol and Prevention (CDC. 1993). Sin embargo, la determinacin de la resistencia a
penicilina puede ser til para propsitos epidemiolgicos. La prueba de la |i-lactamas
a detecta la mayora de aislamientos resistentes a penicilina, aunque no determina
algunas cepas con resistencia cromosmica; por ello, la sensibilidad a penicilina
de los aislamientos IWactamasa negativos se debe confirmar mediante una prueba
adicional, como el mtodo de difusin en disco. Se ha incrementado la resistencia de
las bacterias anaerobias a los antimicrobanos. Ejemplos de esto incluyen, entre
otros, el aumento de resistencia de Bacteroides spp. frente a clndamicina y a (Ma
ctmicos. Las bacterias anaerobias todava muestran un alto porcentaje de sensibilid
ad a metronidazol, cloranfenicol, imipenem. ampicilina-sulbactam y ticarcilinacl
avulnico; no obstante, la decisin de estudiar una bacteria anaerobia frente a un d
eterminado antimicrobiano debe hacerse en funcin de la especie bacteriana y de la
situacin clnica (NCCLS M11-A4.1997). No existe un acuerdo sobre la eficacia clnica
de cieas cefalosporinas nuevas ni sobre la posibilidad de evaluar in vitro la re
spuesta clnica (NCCLS M11-A4,1997). La prueba de la |J-lactamasa (cefalosporina c
romognica) se ha empleado para predecir la resistencia a penicilina y ampicilina.
sin embargo, la resistencia frente a |i-lactmicos de algunas especies no est medi
ada por [ilactamasas. lo cual limita su utilidad para anaerobios. Los estudios c
on el propsito de establecer los patrones de sensibilidad local deben limitarse a
los antimicrobianos de la gua. Los antituberculosos primarios que se deben estud
iar en los aislamientos de Mycobacterium tuberculosis son isoniacida. rifampicin
a. etambutol y pirazmamida. Si se sospecha la resistencia a uno o ms de estos frma
cos, deben realizarse pruebas adicionales de sensibilidad frente a antimicrobian
os, incluyendo estreptomicina, etionamida, canamicina. capreomicina, rifabutina,
ofloxacina y cicloserina (Tenover, 1993a). Se recomienda el estudio de resisten
cia a macrlidos de los aislamientos clnicamente signilicativos de Mycobacterium av
ium-intracellulare (MAI), sobre todo si el paciente ha recibido previamente tera
pia con macrlidos para una infeccin por MAI o no se conoce su terapia previa (Wall
ace, 1997). En cuanto a las levaduras, las normas del NCCLS incluyen informacin s
obre el estudio de ciertos antifngicos. aunque slo se dispone de puntos de corte i
nterpretativos en las pruebas de sensibilidad de especies de Candida frente a fl
uconazol y flucitosma (NCCLS M27-A, 1997).
placas de microdilucin preparadas comercialmente slo contienen una nica concentracin
de antimicrobiano, que se utiliza para distinguir entre las categoras sensible y
resistente. La mayora de las cepas de referencia utilizadas para el control de c
alidad de las pruebas de sensibilidad son m u y sensibles a los antimicrobianos
adecuados, por lo que la limitacin de las concentraciones de los antimicrobianos
plantea problemas extraordinarios en el control de calidad. En otras palabras, l
os intervalos aceptables de CMI para una cepa determinada de referencia frente a
un antimicrobiano determinado pueden estar varias log de diluciones por debajo
de la concentracin ms baja presente para ese antimicrobiano del sistema de la prue
ba de sensibilidad. Este problema aumenta la responsabilidad del fabricante en e
l control de calidad del sistema de la prueba de sensibilidad.

Mtodo de difusin en disco

En la prueba de difusin en disco, cuya utilizacin esl en gran parte limitada a bact
erias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rpido, se aplica un disco
de papel que contiene una cantidad especificada (no concentracin) del antimicrob
iano en una superficie de agar que ha sido recientemente inoculada con un microo
rganismo El antimicrobiano difunde en el medio a partir del disco, originando un
halo de inhibicin hasta el punto en el cual una concentracin crtica del antimicrob
iano inhibe el crecimiento del microorganismo en un tiempo determinado (habitual
mente de 18 a 24 horas). Se mide el dimetro del halo de inhibicin y se relaciona d
e manera inversa con la CMI (es decir, cuanto ms grande es el dimetro del halo de
inhibicin, ms baja es la CMI y viceversa). En condiciones ideales, la relacin entre
las dos pruebas puede ser expresada mediante una lnea de regresin: los equivalent
es de sensibilidad y resistencia del dimetro del halo para un antimicrobiano dete
rminado pueden extrapolarse a partir de sus intercesiones en la lnea de regresin c
on las correspondientes CMI utilizadas para definir la sensibilidad y la resiste
ncia.
E-test
El E-test es un mtodo de dilucin basado en la difusin de un gradiente continuo de c
oncentracin de un antimicrobiano a partir de una tira de plstico en un medio de ag
ar. La tira de plstico, que tiene una concentracin predefinida de frmaco seco y est
abilizado en una cara y una escala de CMI interpretativa en la otra, se coloca e
n la superficie del medio de agar inoculado con el microorganismo a estudiar. La
placa se incuba segn la atmsfera y el tiempo requeridos por el microorganismo en
cuestin. Tras la incubacin, se forma una elipse de inhibicin del crecimiento alrede
dor de la tira: la CMI se lee en el punto de la escala donde la elipse cruza la
tira Dado el coste de estas tiras, puede no ser prctica la seleccin del E-test com
o mtodo pnmano para el estudio de sensibilidad. Sin embargo, el E-lest es una alt
ernativa valiosa para el estudio de sensibilidad de bacterias de difcil crecimien
to, como S. pneumoniae o Haemophilus influenzae, tambin de algunos antimicrobiano
s clave frente a anaerobios (Jorgensen. 1994; Sanchez. 1992).
MTODOS
Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana pueden clasificarse de acuerdo al res
ultado final que hay que determinar. El resultado final de la mayora de pruebas r
ealizadas en el laboratorio clnico es la inhibicin. Existen indicaciones limitadas
para la determinacin de actividad bactericida in vitro. La actividad inhibitoria
normalmente se determina mediante una tcnica de dilucin o de difusin en disco.
Consideraciones tcnicas
Se lleven a cabo pruebas de dilucin o de difusin, la estandarizacin de la tcnica y e
l medio utilizado en sta son de mxima importancia para obtener resultados exactos
y reproducibles. En EE.UU., las organizaciones profesionales, la industria y el
gobierno han trabajado de forma consensuada dentro del NCCLS con el fin de elabo
rar una serie de documentos que describen procedimientos estandarizados para est
udiar la sensibilidad de bacterias aerobias y anaerobias facultativas (NCCLS M2A6. 1997; NCCLS M7-A4,1997), bacterias anaerobias (NCCLS M11-A4,1997). micobacte
rias ( NCCLS M24-T, 1995) y hongos (NCCLS M27-A, 1997), Estas tcnicas deben estar
disponibles en los laboratorios clnicos de referencia y proporcionar los detalle
s tcnicos concernientes a la realizacin de las pruebas de sensibilidad. El Subcomm
ittee on Antimicrobial Susceptibility Testing revisa y modifica las tablas de lo
s documentos cada ao y los textos de los documentos cada tres aos. Por tanto, los
laboratorios deben asegurarse de que estn empleando las tablas y los textos ms act
uales y de que las revisiones se incorporen a la prctica de laboratorio.
Mtodo de dilucin
En la prueba de dilucin, el microorganismo es inoculado en una serie de tubos o p
ocilios que contienen una serie de concentraciones que suelen comenzar con una p
otencia de 2 (p. ej., 128 ug/ml) y disminuye en una base log., (p. ej., 64. 32.

16. 8, 4) hasta la concentracin ms baja estudiada. La concentracin ms baja que inhib

e el crecimiento visible se denomina concentracin mnima inhibitoria o CMI. Por con
veniencia y economa, se ha hecho cada vez ms frecuente limitar los intervalos de l
as concentraciones de cada antimicrobiano estudiado a aquellas concentraciones q
ue comprenden las equivalentes a las categoras sensible y resistente En algunos c
asos, las

1124 Medio
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Una variable importante de los estudios de sensibilidad es la composicin del medi
o. En la actualidad, el NCCLS recomienda el medio Mueller-Hinton para el estudio
de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, ya que presenta una buena repr
oducibilidad entre distintos lotes: tiene una concentracin baja de inhibidores de
sulfonamida, trimetoprim y tetraciclina y permite el crecimiento de la mayora de
patgenos bacterianos que no son de difcil crecimiento. Algunas bacterias, sobre t
odo estreptococos, no crecen bien en medios de Mueller-Hinton no suplementados,
un problema que se supera mediante la suplementacin con sangre desfibrinada de co
rdero, caballo u otro animal a una concentracin final del 5% (v/V). Varios compon
entes o suplementos del medio Mueller-Hinton pueden afectar a los resultados de
la prueba de sensibilidad. En los mtodos de dilucin y de difusin en disco, las vari
aciones en la concentracin de cationes divalentes, sobre todo calcio y magnesio,
afectan a los resultados del estudio de Pseudomonas aerugmosa frente a aminoglucs
idos y colistna, as como de otras bacterias frente a tetraciclina. Una concentracin
catinica elevada causa falsas resistencias, mientras que un contenido catinico ba
jo presenta el efecto contrario (Barry. 1987, 1992: NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7A4,1997). El pH del medio debe estar entre 7,2 y 7,4. Un pH por debajo de este i
ntervalo origina la prdida de potencia de frmacos como los aminoglucsidos y los mac
rlidos, mientras que otros (p, ej., las penicilinas) aparentan tener una mayor ac
tividad. Si el pH es demasiado alto se produce el efecto contrario. En los mtodos
de dilucin en caldo, se recomienda el suplemento del caldo Mueller-Hinton con Na
CI al 2% para mejorar la deteccin de estafilococos resistentes a oxacilina (NCCLS
M7-A3. 1993b). La deteccin de resistencia heterognea en la que menos del 0,01% de
las bacterias expresan el rasgo de resistencia se incrementa con la adicin de sa
l al medio. Un mtodo alternativo para la deteccin de resistencia a oxacilina de lo
s estafilococos consiste en la utilizacin de agar Mueller-Hinton suplementado con
NaCI al 4% y la incorporacin de 6 ug de oxacilina por mililitro (Chambers. 1988)
. Otras cuestiones referentes a los medios estn relacionadas con las pruebas de s
ensibilidad de H. influenzae. para el cual se recomienda el medio para pruebas c
on Haemophilus (HTM) (NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4, 1997), y las pruebas de N.
gonorrhoeae. para el que se recomienda una base de agar GC. El medio Mueller-Hin
ton. tan desprovisto de timidina como sea posible, es importante para la determi
nacin exacta de la sensibilidad bacteriana a trimetoprim/sulfametoxazol. Algunas
especies pueden utilizar la timina o timidina del medio para evitar el mecanismo
de accin del trimetoprim y las sulfonamidas, dando lugar a falsas resistencias.
Se puede incorporar al medio timidina tosforilasa o sangre lisada de caballo par
a mejorar la fiabilidad del estudio de trimetoprim y sulfametoxazol. Con un medi
o libre de timidina se obtienen resultados exactos de las pruebas de sensibilida
d con microorganismos distintos de los enterococos. Para anaerobios, la dilucin e
n agar empleando agar Brucelia suplementado con sangre lacada y vitamina K (mtodo
Wadsworth) es el mtodo de referencia (NCCLS. M11-A4,1997). Se h a seleccionado l
a sangre Brucelia en lugar del agar Wilkins-Chalgren empleado en el pasado, debi
do a su capacidad superior para permitir el crecimiento de anaerobios de dilcil c
recimiento. Para el estudio de sensibilidad de anaerobios, no se recomiendan ni
el mtodo de difusin disco-placa ni los mtodos de elucin disco-caldo, ya que presenta
n una pobre correlacin con el mtodo de dilucin en agar de referencia. El mtodo de mi
crodilucin utilizando caldo de Schaedler, Brucelia, West-Wilkins, inlusn cerebro-co
razn o un caldo con la misma formulacin que el agar Wilkins-Chalgren, pero sin aga
r. es ms prctico para su empleo en el laboratorio clnico que el mtodo de referencia
(NCCLS, M11-A4.1997). Tambin puede utilizarse el E-test. Existen otros factores r
elacionados con el medio que influyen sobre la difusin en disco. Por ejemplo, el
grosor del agar debe ser de 4 mm. Si el agar es demasiado ancho puede originar f

alsas resistencias, mientras que si no lo es bstanle pueden aparecer falsos resul

tados sensibles. Las concentraciones de ciertos cationes divalentes pueden afect
ar los resultados de las pruebas de sensibilidad, como el magnesio y el calcio e
n el estudio de Pseudomonas aeruginosa frente a tetraciclina y aminoglucsidos. Cu
ando el agar MuellerHinton se suplementa con sangre, los dimetros de halo para ox
acilina y meticilina pueden ser de 2 mm a 3 mm inferiores a los obtenidos sin el
suplemento. La sangre de cordero puede causar dimetros de halo imprecisos alrededor de
los discos de trimetoprim y sulfonamida o una pelcula de crecimiento dentro del
halo de inhibicin.
Inoculo
Las variaciones del tamao del inoculo son responsables de las mayores variaciones
diarias en los resultados de las pruebas de sensibilidad. La utilizacin del inoc
ulo adecuado es especialmente importante en la deleccin exacta de resistencia a p
enicilina y oxacilina en los estafilococos, asi c o m oa penicilinas de amplo esp
ectro y cefalosporinas en mulantes gramnegativos con (Vlactamasa de clase I desr
eprimida (p. ej., Enlerobacter, Cilrobacter. Pseudomonas). El NCCLS recomienda u
na suspensin 0,5 de McFarland (18 2x10* UFC/ml) para la dilusin disco-placa y la d
ilucin de una suspensin 0,5 de McFarland hasta una concentracin linal de 5 x 10 UFC
/ml para la dilucin en caldo (NCCLS M2-A6.1997: NCCLS M7-A4,1997). En los laborat
orios que utilizan sistemas de microdilucin se observa a menudo una elevada tasa
(del 20% al 40%) de sensibilidad de Enterobacter cloacae a ampicilina. Esta obse
rvacin siempre se debe al empleo de una cantidad demasiado pequea de inoculo. En c
onsecuencia, es necesario que los usuarios de sistemas de microdilucin incluyan e
ntre sus mtodos de control de calidad la cuantificacin de su inoculo de una manera
regular. La sensibilidad de Enterobacter cloacae a la ampicilina no debe ser en
general superior al 5%. Un segundo factor relacionado con el inoculo es el mtodo
de preparacin. Para muchas bacterias no es importante, pero para estafilococos (
con el fin de garantizar la deteccin de resistencia a oxacilina) y para bacterias
de difcil crecimiento, como S. pneumoniae, H. influenzae y N. gonorrhoeae, el in
oculo debe prepararse a partir del crecimiento durante una noche (18 a 20 horas)
en un medio de agar (Chambers. 1988; NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4,1997).
S
Incubacin
Las condiciones de incubacin tambin afectan a los resultados de la prueba de sensi
bilidad. Las recomendaciones generales son la incubacin durante una noche (16 a 2
0 horas) en atmsfera aerobia a 35C: no obstante, existen excepciones. Los aislami
entos de S. pneumoniae. H. influenzae y N. gonorrhoeae requieren incubacin en atms
fera con un 5%-7% de C0 , adems S. pneumoniae y N. gonorrhoeae deben incubarse ha
sta 2024 horas ms. Los estafilococos y enterococos tambin deben incubarse durante
24 horas para garantizar la deteccin de resistencia a oxacilina y vancomicina, re
spectivamente. Los anaerobios y levaduras requieren 48 horas de incubacin, aunque
se recomiendan 72 horas para los aislamientos de Cryptococcus neoformans. Para
ms detalles sobre mtodos de sensibilidad se recomienda consultar los documentos ad
ecuados del NCCLS.
2
Sistemas de anlisis
De acuerdo con los resultados de los recientes programas de competencia del Coll
ege of American Pathologists, la mayora de los laboratorios de este pas utilizan e
n la actualidad sistemas de microdilucin. Una razn para pasar de la tecnologa de di
fusin a la de dilucin es la mayor eficacia de la inoculacin replicada en sistemas c
ombinados de identificacin y pruebas de sensibilidad y a la gestin de datos median
te paquetes de software caractersticos de estos sistemas. Otras razones son a men
udo inconsistentes y se basan en la falsa idea de que las CMI son ms exactas y co
nstituyen los datos que los mdicos desean conocer. Dado que los resultados de las
pruebas de dilucin y difusin se correlacionan notablemente desde un punto de vist

a estadstico y puesto que la mayora de los mdicos que no son especialistas en enfer
medades infecciosas tienen dificultades para interpretar las CMI, se requiere qu
e los laboratorios informen de categoras interpretativas junto a las CMI; la elec
cin entre las pruebas de difusin y las de dilucin se realiza por motivos puramente
econmicos en casi todos los casos. Hoy en da, se dispone de numerosos sistemas com
ercializados entre los que se puede escoger. Antes de llevar a cabo la eleccin, e
l director del laboratorio debe considerar si las ventajas de la inoculacin repli
cada y los sistemas de gestin de datos superan los costes aadidos de estos equipos
, cuando se comparan con la simplicidad, la conveniencia y la economa

CAPTUIO 51

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBANOS

1125
proporcionada por la prueba de difusin en disco. Existe entre el personal de labo
ratono una desafortunada tendencia a considerar la prueba de dilusin en disco ant
icuada y demasiado poco sofisticada para la prctica actual. Esta prueba todava des
empea su papel de forma exacta y adecuada, ademas de ser econmica Los resultados o
btenidos son comprensibles para el mdico y suficientes en casi todas las situacio
nes donde se aplica un tratamiento antimicrobiano. La difusin en disco tambin prop
orciona flexibilidad, ya que se pueden estudiar prcticamente todos los antimicrob
ianos simplemente seleccionando el disco adecuado. La seleccin de un sistema meca
nizado o semiautomatizado debe basarse en numerosas consideraciones. Entre stas s
e encuentran el nmero de muestras, la experiencia tcnica, la necesidad de gestin de
los datos, la utilizacin de un sistema comn de identificacin bacteriana y de prueb
as de sensibilidad, la compatibilidad con los sistemas de informacin del laborato
rio, los costes de adquisicin o de arrendamiento del equipo, el coste de los sumi
nistros y reactivos fungiles, el coste de los contratos de servicios y la disponi
bilidad de espacio. En el sistema VITEK (bioMrieux, Hazelwood. MO). los antimicro
banos se encuentran en pocilios dentro de una placa de plstico. Este sistema const
a de un mdulo llenador/sellador, un lector/incubador, un mdulo informtico, una term
inal de datos y una impresora. Las placas se incuban en el mdulo lector/incubador
y los pocilios se monitorizan por densidad ptica. Los resultados se obtienen en
cuatro horas: sin embargo, el tiempo medio de incubacin para las pruebas de sensi
bilidad es aproximadamente de siete horas. Este tiempo de incubacin es suficiente
para proporcionar una deteccin exacta de mutantes desreprimidos para |i-lactamas
as de clase I, estafilococos productores de penicilinasa y estafilococos resiste
ntes a oxacilina. Existen ciertos sistemas de microdilucin en los que los antimic
robanos se proporcionan en estado congelado o liofilizado La seleccin entre estos
sistemas no slo se basa en la disponibilidad de espacio de congelacin para el alma
cenamiento de las placas, sino tambin en la disponibilidad del tiempo que requier
e cada sistema. La seleccin tambin puede basarse en la disponibilidad y la sofisti
cacin de los sistemas de gestin de datos. En algunos casos, los resultados finales
se leen de modo visual y se introducen manualmente con propsitos de informe y al
macenamiento (p. ej., Pasco. Becton-Dickmson Diagnostic Systems. Sparks. MD). En
otros casos, los resultados son ledos por el sistema fotomtricamente (p. ej McroSca
n WalkAway, Dade Behring. Inc; Aris. Trek Diagnostic Systems. Westlake. OH). Tan
to el sistema McroScan como el Ans poseen capacidad para estudiar la sensibilidad
aproximadamente a las 5 horas de incubacin o bien tras 18 horas de incubacin De l
os sistemas disponibles actualmente, VITEK, McroScan WalkAway y Aris ofrecen capa
cidades "walkaway". Debido a la escasez actual de londos para el equipamiento, c
ada vez ms laboratorios utilizan sistemas de alquiler de equipos financiados a tr
avs del consumo de reactivos. Con el obieto de mantener el equipo y el software,
suele ser necesario disponer de un contrato de servicio, cuyo coste bsico es apro
ximadamente el 10% del valor de adquisicin del equipo. Los fabricantes de sistema
s fomentan la rapidez de las pruebas de sensibilidad, proporcionando las CMI en
tres o cinco horas Sin embargo, estos sistemas no detectan con fiabilidad los es
tafilococos resistentes a penicilina o a meticilina. tampoco los bacilos gramneg
ativos desreprimidos para li-lactamasas de clase I, y parecen necesitar un mnimo
de 6 horas para la deteccin de su resistencia a la mayora de los antibiticos |i-lac
lmicos (Lampe. 1979; Washington, 1988) Incluso en el caso de que las pruebas sean
exactas, supone alguna ventaja el hecho de que sean ms rpidas? En un estudio no al
eatorizado. Matsen (1985) ha descrito los resultados tanto de un sistema rpido de
3 a 5 horas como de una prueba de difusin en disco, preguntando posteriormente a
los clnicos hasta qu punto el hecho de recibir antes el resultado influa en su ele
ccin del tratamiento antimicrobiano, En el 31,7% de los casos los mdicos indicaron

que, basndose en el resultado rpido, iniciaban el tratamiento con un antibitico di

stinto del que habran utilizado en otras circunstancias; en otro 17% los mdicos sea
laron que "probablemente" habria influido. La mayora de pacientes que participaro
n en el estudio tenan bactenuna. En un estudio prospectivo aleatorizado de 794 pa
cientes de ciruga general, Vmcent (1985) proporcion resultados rpidos para la milad
de los pacientes y resultados convencionales para la otra mitad. Observ que el t
ratamiento antimicrobiano se modific en el 14.5% de ios casos en el grupo de paci
entes para quienes se obtuvieron resultados rpidos y en el 8,8% de los casos en el
grupo de pacientes para quienes se obtuvieron resultados convencionales (p <0,00
1); no obstante, no hubo diferencias estadsticamente significativas entre ambos g
rupos con respecto a la duracin de la estancia de los pacientes en el hospital. D
oem y cois. (1994) evaluaron el impacto clnico de pruebas rpidas de identificacin b
acteriana y de sensibilidad frente a antimicrobanos en pacientes hospitalizados e
n un centro mdico de cuidados terciarios. Los tiempos medios de informacin de los
resultados de identificacin y sensibilidad fueron, respectivamente, de 9.6 y 11.3
horas en el grupo de pruebas rpidas y de 19.6 y 25,9 horas en el grupo convencio
nal (p <0,0005) No hubo diferencias significativas entre los dos grupos con resp
ecto a los descriptores demogrficos, con excepcin del tiempo de informacin de los r
esultados Los tiempos medios de hospitalizacin fueron los mismos para ambos grupo
s, aunque la tasa de mortalidad fue inferior en el grupo de pruebas rpidas (8.8%
frente a 15.3%). Por otra parte, en los pacientes del grupo de pruebas rpidas hub
o significativamente menos estudios de laboratorio, menos estudios de imagen, me
nos das de intubacin y menos das de permanencia en una unidad de cuidados intensivo
s: el tiempo transcurrido previo a la modificacin del tratamiento antimicrobiano
fue ms corto y el coste global de hospitalizacin de los pacientes fue significativ
amente ms bajo. En un estudio similar. Barenfanger (1999) no encontr diferencias d
e mortalidad entre grupos donde estuvieron disponibles resultados rpidos de las o
ruebas de sensibilidad, cuando se compararon con pacientes a quienes se informar
on los resultados de modo ordinario (diferencia media de 5,2 horas). No obstante
, ellos observaron una disminucin significativa en el tiempo de permanencia hospi
talaria (diferencia media de 2,0 das, p - 0.0006) y en el coste total de la estan
cia en el hospital (diferencia media de 2.395 dlares. p = 0,04) en los pacientes
donde estuvieron disponibles resultados rpidos de las prueas de sensibilidad.
PRUEBAS BACTERICIDAS
Existen tres categorias principales de pruebas bactericidas: 1) determinacin de l
a concentracin mnima requerida para que un antimicrobiano destruya un microorganis
mo, conocida como concentracin mnima bactericida o letal (CMB o CML): 2) determina
cin de la tasa de muertes (tasa de muertestiempo o curva de letalidad) y 3) deter
minacin de la dilucin ms alta del suero del paciente requerida para destruir un mic
roorganismo, conocida como titulo bactericida o letal del suero (TBS o TLS). La
utilizacin de cualquiera de estas categorias de pruebas depende de cuestiones rel
acionadas con las indicaciones, mtodos e interpretacin.
Concentracin mnima bactericida o letal
Con respecto a la CMB o CML, existe un acuerdo general en que esta determinacin d
ebe formar parte de la investigacin inicial de un nuevo antimcrobiano. No obstante
, la unanimidad es menor en lo que se refiere a la posibilidad de que la prueba
est indicada para aislamientos de estreptococos en pacientes con endocarditis, de
estafilococos en pacientes con endocarditis u osteomielitis y de enterobacteria
s o Pseudomonas en pacientes con meningitis. La controversia se suscita en parte
por las variables biolgicas y tcnicas que afectan a los resultados de las determi
naciones de la CMB (NCCLS M26-A. 1999). Para determinar la CMB o CML se inocula
el antimicrobiano en caldo, diluido de forma seriada (en una base logj con u n a
suspensin estandarizada del microorganismo en estudio, segn lo descrito para la d
eterminacin de la CMI. Tras su incubacin a 35 C durante 24 horas, los tubos con ca
ldo que no muestran crecimiento visible son subcultivados en un medio de agar li
bre de antibiticos. La CMB o CML se define como la menor concentracin del antimicr

obiano que es bactericida o letal para al menos el 99.9% del inoculo original. E
ntre las variables biolgicas de la prueba se encuentran: 1) el fenmeno de persiste
ncia, en el que un pequeo nmero de bacterias "persistentes" (habitualmenle <0,1%)
del inoculo bacteriano sobreviven a la exposicin del antibitico, pero siguen siend
o sensibles si se vuelven a estudiar frente al antibitico, habtualmente un antimic
robiano activo frente a la pared celular: 2) el efecto paradjico, en

1126
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
el cual la proporcin de supervivientes se incrementa con la concentracin de antibit
ico, de nuevo con mayor frecuencia en los antibiticos activos frente a la pared c
elular y 3) tolerancia, un lenmeno mucho menos comprendido. Se piensa que tanto l
a "persistencia" como el efecto paradjico estn relacionados con el enlentecimiento
de la tasa de crecimiento de las bacterias por el antibitico, lo que da lugar a
una disminucin del efecto de destruccin (NCCLS M26-A, 1999). Definidos estrictamen
te, los microorganismos tolerantes son aquellos en los que la viabilidad se pier
de lentamente y aquellos en los que la respuesta bacteriosttica-bacteriolitica fr
ente a los antibiticos se modifica en la direccin de la bacteriostasia (Handwerger
, 1985). Sin embargo, la tolerancia se ha definido tambin como una proporcin CMB/C
MI mayor o igual a 32, a pesar de los numerosos problemas tcnicos que influyen en
los resultados de la CMB y de las variaciones metodolgicas en la determinacin de
las CMB (Sherris, 1986). Como ha sealado Sherris (1986). la CMB se define como la
concentracin menor de antibitico que produce una supervivencia <0,1% en la zona d
e menor exactitud de la curva de letalidad (es decir, de 18 a 24 horas). El nmero
de supervivientes tras una noche de incubacin con un antibitico activo frente a l
a pared celular es invariablemente mayor si el inoculo se encuentra en la fase e
stacionaria en lugar de en la fase logartmica (Handwerger, 1985; Sherris, 1986).
El problema tcnico ms frecuente que origina una mayor proporcin de bacterias en la
fase estacionaria es la utilizacin de cultivos que han estado creciendo ms de ocho
horas (NCCLS M26-A. 1999). Otros problemas tcnicos adicionales incluyen la super
vivencia de las bacterias en el condensado por encima del menisco del caldo que
contiene el antibitico, el volumen del subcullivo, el efecto remanente de antibiti
co en los subcultivos y la reproducibilidad de la prueba. Asumiendo que sea posi
ble conseguir el control de estos problemas tcnicos, la determinacin de un resulta
do definitivo (CMB) puede basarse en los criterios de rechazo publicados por Pea
rson (1980). La tolerancia se define por una tasa de muertes retrasada, por lo q
ue el mtodo ms fiable para su deteccin consiste en un estudio simplificado de las m
uertes de los microorganismos en funcin del tiempo, comparando la cantidad de bac
terias que permanecen viables tras cinco o seis horas de incubacin en presencia d
e una concentracin de antibitico de cuatro a ocho veces su CMI, con la cantidad pr
esente en las lecturas a las dos horas o en el tiempo cero (Handwerger, 1985; Sh
erris. 1986). Considerando todos los problemas biolgicos y tcnicos asociados con l
as pruebas bactericidas y la definicin de tolerancia, no es sorprendente que la i
nterprelacin de los esludios clnicos publicados sobre infecciones causadas por mic
roorganismos supuestamente "tolerantes" est llena de dificultades, en especial re
specto a los estafilococos, para los que las variables tcnicas tienen consecuenci
as importantes (Handwerger, 1985). Por estos motivos, nuestra norma consiste en
no determinar la CMB de los antibiticos activos frente a la pared celular para es
tafilococos. Existen datos procedentes de estudios de endocarditis producidas po
r estreptococos del grupo viridans en animales de experimentacin que sugieren que
la penicilina puede ser menos eficaz frente a la infeccin por cepas tolerantes q
ue frente a la debida a cepas no tolerantes (Handwerger, 1985; Wilson, 1985): si
n embargo, apenas existe informacin sobre el significado clnico de estas cepas (Wi
lson, 1985). Handwerger y Tomasz (1985) postularon que las bacterias no tolerant
es podran manifestar una respuesta fenotpicamente tolerante en una lesin endocrdica
a causa de su elevada densidad, su disminuida actividad metablica y su lenta velo
cidad de crecimiento en las vegetaciones. Dado que algunas cepas de estreptococo
s del grupo viridans son resistentes a penicilina (CMI >4 pg/ml). sin duda es ne
cesario determinar la CMI de los aislamientos de estreptococos del grupo viridan
s de pacientes con endocarditis u otras infecciones que suponen un riesgo para l
a vida. Puesto que los pacientes con endocarditis causada por estreptococos del

grupo viridans tolerantes pueden presentar un riesgo mayor de recidivas y requer

ir de 4 a 6 semanas de tratamiento con penicilina y un aminoglucsido (Wilson, 198
5), tal vez sea aconsejable determinar la CMB de dichas cepas.
gonismo entre dos o ms antibiticos. Adems, la actividad bactericida, ms que la bacle
riosltica, parece ser un requisito para el tratamiento de la meningitis bacterian
a (Sande. 1981). En la meningitis por bacilos gramnegativos (de etiologa distinta
a H. influenzae). las CMB de las cefalosporinas pueden tener poca correlacin con
el resultado, en contraste con los resultados de los estudios de 6 horas de la
tasa de muerte-tiempo (Eng, 1987). Por tanto, cuando se necesita un tratamiento
bactericida para la curacin, los estudios de muerte-tiempo de los antimicrobianos
, ya sea en administracin nica o en combinacin, podran tener mayor valor predictivo
de los resultados que las CMB (Bayer. 1985: Drake, 1985; Eng, 1987). Los resulta
dos de los estudios de combinacin mediante el mtodo muerte-tiempo tambin se correla
cionan mejor con los resultados de los estudios de combinacin en modelos de infec
cin con animales de experimentacin que los resultados de estos estudios obtenidos
mediante el mtodo del tablero (Bayer, 1985), quizs, una vez ms, debido a que los re
sultados definitivos del mtodo del tablero se determinan a las 18-24 horas, que r
epresenta la fase menos exacta de la curva de letalidad (Sherris, 1986). En los
estudios de la tasa de muertes se realizan cultivos cuantitativos en diversos in
tervalos (p. ej., 0, 4. 8, 12 y 24 horas) tras la inoculacin del medio que contie
ne el antibitico. La actividad bactericida se delme como el 99,9% de muertes del
inoculo final, determinado mediante la observacin de una disminucin >3-log de UFC/
ml en la curva de muerte-tiempo trazada (NCCLS M26-A, 1999). Cuando se estudia u
na combinacin de antimicrobianos, la sinergia suele definirse como una reduccin >2
-log,<, de UFC/ml entre la combinacin y su constituyente ms activo cuando se utili
za individualmente, suponiendo que al menos uno de los constituyentes no afecte
a la curva de crecimiento del microorganismo estudiado. En el caso de enterococo
s, este requisito no supone dificultades, porque las concentraciones de penicili
nas o aminoglucsidos alcanzables desde un punto de vista clnico no son bactericida
s; sin embargo, puede suponer un problema en el estudio de otros microorganismos
que pueden ser sensibles a cada uno de los antimicrobianos empleados en combina
cin. En este ltimo caso, la sinergia slo es definible cuando existe una reduccin >2log, de UFC/ml entre la combinacin de ambos, presentes en concentraciones que rep
resentan una cuarta parte de sus respectivas CMB. en comparacin con el constituye
nte individual ms activo en una concentracin de la mitad de su CMB (Hallander. 198
2). Como ocurre con las determinaciones de CMB. el efecto remanente de los antim
icrobianos en los subcultivos cuantitativos es problemtico y requiere inactivar c
ualquier antimicrobiano presente o diluir las muestras para el subcultivo lo suf
iciente para eliminar, si es posible, los efectos remanentes del frmaco. Siempre
que se produzca un efecto remanente, especialmente en concentraciones de la prue
ba mayores o iguales a 16 veces la CMI, puede corroborarse marcando una alcuota d
e 10 pl a 100 pl de una dilucin de un subcultivo a travs de una superficie de agar
, permitiendo un tiempo de absorcin de 20 minutos, marcando posteriormente toda l
a superficie de agar con el microorganismo de estudio y observando la inhibicin d
el crecimiento en el sitio de la marca inicial tras su incubacin durante 24 horas
(NCCLS M26-A, 1999). Otro problema en la interpretacin de los estudios cinticos d
e letalidad es la aparicin de recrecimiento entre las 6 u 8 horas y las 24 horas
de incubacin de la prueba. En estos casos, conviene determinar si se ha producido
inactivacin antimicrobiana o si la prolongada incubacin ha seleccionado una subpo
blacin resistente. Mediante la determinacin de la CMI a las 0 y a las 24 horas Ire
nte a una cepa de relerencia de la American Type Culture Collection (ATCC), se p
uede deducir la inactivacin del antibitico si la CMI es marcadamente superior a la
s 0 que a las 24 horas (NCCLS M26-A. 1999).
10
Estudios bactericidas del suero
El principal objetivo de la prueba bactericida del suero consiste en determinar
la actividad de uno o ms antimicrobianos presentes en el suero frente a un microo
rganismo que ha sido aislado del paciente. Empleando distintas modificaciones, s

e puede determinar la actividad bactericida relativa a la C M B (ttulo bactericid

a del suero), la tasa de muertes en un determinado tiempo (tasa bactericida del
suero) o la magnitud de la actividad bactericida y su duracin (NCCLS M21-A, 1999)
. En la prctica, los ttulos bactericidas del
Estudios de la tasa de muertes
La determinacin de la tasa de muertes de un antibitico es el mejor mtodo para detec
tar no slo la tolerancia, sino tambin la sinergia o anta-

CAPTULO 5 1

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBANOS

1127
suero cuando la concenlracin de antibitico es mxima (pico) y cuando es mnima (valle)
son los que se determinan ms fcilmente. Esto se lleva a cabo obteniendo una muest
ra de suero del paciente durante los niveles previstos de pico y/o valle de los
antimicrobanos que est recibiendo el enfermo. Con posterioridad, la muestra de sue
ro se diluye en caldo, en una mezcla de sueros humanos o en una mezcla de caldo
y sueros humanos suplementados con cationes (cuando se estudian aminoglucsidos o
fluoroqumolonas frente a Pseudomonas aerugmosa). Se aade luego una suspensin estan
darizada del microorganismo al suero diluido senadamente y se incuban los tubos
durante una noche a 35 C. El titulo inhibitorio del suero es la dilucin ms alta de
l suero que inhibe de manera visible el crecimiento del microorganismo. Se puede
n realizar subcullivos de los tubos que contienen diluciones de suero sin crecim
iento visible, con el fin de determinar la dilucin ms alta de suero que ha sido ba
ctericida para el microorganismo estudiado. A pesar de que existe una fuerte con
troversia acerca del valor clnico de la prueba bactericida del suero, es evidente
que todas las cuestiones tcnicas implicadas en las pruebas bactericidas tambin af
ectan a esta prueba. Adems, la prueba bactericida srica implica dos variables adic
ionales: 1) el tiempo de recogida de la sangre y 2) el tipo de diluyente (es dec
ir, caldo, suero o una combinacin de ambos). Es difcil establecer una correlacin en
tre los ttulos bactericidas especficos y los resultados del tratamiento antimicrob
iano, dadas las variaciones en el mtodo y las variables tcnicas que afectan a dich
as pruebas.
Recogida de muestras
Debido a la corta vida media de la mayora de los antimicrobanos, la recogida de la
muestra es esencial para una monitorzacion teraputica adecuada. El suero es la mu
estra ms apropiada para el anlisis; sin embargo, el plasma es tambin satisfactorio
en la mayora de casos. Si se utiliza plasma para la determinacin de aminoglucsidos.
debe anticoagularse con cido elilendiaminotetraactco (EDTA). ya que la heparina in
activa los aminoglucsidos. Los anlisis de antimicrobanos en orina rara vez estn indi
cados, excepto con finalidades de investigacin. Aunque para el anlisis se prefiere
la venopuncin, se puede obtener sangre a partir de un catter mtravascular. despus
de haber dejado fluir sta y desechar la muestra sangunea inicial. En general, para
determinar la concenlracin sangunea mxima, las muestras deben recogerse a los 30 m
inutos de haber completado la perfusin intravenosa, a los 60 minutos Iras una dos
is intramuscular y a los 60-120 minutos tras una dosis oral. Los niveles mximos v
aran de acuerdo con el antimicrobiano administrado, la va de administracin, la velo
cidad de administracin, las caractersticas de absorcin y el estado clnico del pacien
te. Los niveles mimmos de antimicrobiano son indicadores ms sensibles de la dismi
nucin de su aclaramiento y de su acumulacin hasta niveles potencialmente txicos. Po
r consiguiente, a menudo se recomienda que los aminoglucsidos se monitoricen tant
o en niveles previos al pico como en niveles previos al valle, en el primer caso
para establecer que se est consiguiendo un nivel teraputico y en el segundo para
comprobar que no se produce acumulacin a causa de una disminucin del aclaramiento.
Slo se garantiza una recogida exacta de la muestra cuando la misma persona que a
dministra el antibitico es la que extrae la muestra. De otra forma puede existir
una considerable disparidad entre los tiempos registrados y reales de la adminis
tracin del antimicrobiano. Asi pues, s la sangre se recoge mediante un equipo de f
lebotoma que confia en el tiempo registrado de administracin del antimicrobiano, l
os niveles determinados y posteriormente informados pueden interpretarse de form
a incorrecta. Bajo estas condiciones de escaso control de la recogida de muestra
s, es posible recibir informes en los que el supuesto nivel minimo sea ms elevado
que el nivel mximo. En el peor de los casos, un supuesto pico puede parecer insu

ficiente para propsitos teraputicos, incrementndose de forma inadecuada la dosis de

un antimicrobiano con estrecho margen teraputico, dando lugar a toxicidad provoc
ada por niveles excesivos del antimicrobiano. Las muestras deben estudiarse inme
diatamente o almacenarse a -20 C durante un periodo mximo de 2 das. Algunas amino o
ureidopenicilinas inactivan los aminoglucsidos durante un almacenamiento prolong
ado, por lo que debe aadirse |}-lactamasa al suero si se mantienen almacenadas du
rante largo tiempo. La interaccin entre penicilinas y aminoglucsidos disminuye en
el almacenamiento a -70X.
ANLISIS DE ANTIMICROBIANOS
El nivel de antimicrobiano en el suero u otros lquidos biolgicos se puede determin
ar directamente mediante bioanlisis, inmunoanlisis o anlisis cromatogrfico. Al contr
ario del titulo bactericida srico, los anlisis proporcionan una determinacin de la
concentracin de cada antimicrobiano que el paciente est recibiendo.
Indicaciones
L a determinacin de la concentracin de antimicrobiano est indicada cuando el agente
a administrar posee un estrecho margen teraputico (Tabla 51-2) y cuando determin
ados factores subyacentes del husped alteran la farmacocintica del antimicrobiano.
Los antimicrobianos con un estrecho margen teraputico incluyen aminoglucsidos, va
ncomicina. cloranlenicol y flucitosina. Con estos antimicrobanos existe un estrec
ho cociente txico/teraputico. Debido a sus amplios mrgenes teraputicos, no se requie
re el anlisis de penicilinas y cefalosporinas, excepto: 1) cuando su va de adminis
tracin o la enfermedad subyacente pueden producir niveles sricos que difieran nota
blemente del intervalo habitual o 2) cuando la infeccin se encuentre en un espaci
o o lquido donde la penetracin del antmicrobiano sea variable o dudosa. Los anlisis
de antimicrobanos estn indicados en pacientes con tratamiento antimicrobiano prolo
ngado (ms de 5 das), en enfermos que no responden al tratamiento y en pacientes qu
e desarrollan signos o sntomas de toxicidad, como por ejemplo ototoxicidad o nefr
otoxicidad durante la administracin de aminoglucsidos. La determinacin de antimicro
banos est indicada especialmente en pacientes con deterioro o cambios rpidos de la
funcin renal y en pacientes sometidos a dilisis. Otras indicaciones adicionales de
los anlisis de antimicrobanos comprenden pacientes ancianos: pacientes con fibros
is qustica, quemaduras, neumona por gramnegativos. obesidad y con expansin del volu
men del liquido extracelular; asi como pacientes que no cumplen las dosis prescr
itas por va oral. Es importante comprender que los anlisis de antimicrobianos con
mrgenes teraputicos estrechos no slo son necesarios para confirmar que estos antimi
crobianos no se encuentran en concentraciones potencialmente txicas, sino tambin p
ara comprobar que se hallan dentro del intervalo teraputico. Por ejemplo, se ha o
bservado que existe un efecto dosis-respuesta graduado entre un cociente crecien
te concentracin mxima del pico/CMI de aminoglucsidos y la respuesta clnica (Moore, 1
987).

Mtodos
Histricamente, los anlisis microbiolgicos constituan los mtodos ms utilizados y repre
entaban la mejor opcin para la determinacin sistemtica de las concentraciones de an
timicrobianos en los lquidos biolgicos. Con la introduccin de la gentamicina alrede
dor de la dcada de los setenta, se desarrollaron una serie de procedimientos de a
nlisis que no dependan de una dosis-respuesta microbiolgca in vilro. Estos mtodos pro
porcionan una exactitud y especificidad mayores que las que haban sido posibles c
on las pruebas microbiolgicas. Los anlisis microbiolgicos se basan en una comparacin
de la respuesta de un microorganismo sensible a una concentracin desconocida de
antibitico, con la respuesta de este microorganismo bajo condiciones idnticas de a
nlisis con concentraciones conocidas del antimicrobiano. La prueba suele basarse
en tcnicas de difusin en agar, en las que el agar se siembra con una suspensin esta
ndarizada del microorganismo a estudiar; en esta suspensin, los lquidos contienen
concentraciones desconocidas de antibiticos y los patrones contienen concentracio
nes conocidas de antibiticos, repartidas en pocilios o en discos de papel en blan
co. Despus, las placas se incuban durante una noche y se realiza una curva de

CAPTULO 51

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS

1129

dosis-respuesta, determinando el dimetro del halo de inhibicin correspondiente a c

ada concentracin conocida del antibitico utilizado en los patrones. Debe entenders
e que el ensayo microbiolgico mide los efectos de todos y cada uno de los antimic
robianos que pueden encontrarse presentes en el lquido biolgico en estudio. Por ta
nto, si el paciente est recibiendo otros antimicrobianos adems del que es ob|eto d
e la prueba, el dimetro del halo de inhibicin reflejar los efectos combinados de to
dos los antimicrobianos presentes. En algunos casos, es posible determinar la co
ncentracin de un antimicrobiano en presencia de otro mediante la seleccin adecuada
de un microorganismo de prueba sensible al antimicrobiano a determinar y resist
ente al que potencialmente interfiere con el antimicrobiano. En otros casos, es
posible suplementar el medio de la prueba con sustancias que pueden neutralizar
los efectos del antimicrobiano que interfiere. Por ejemplo, en el estudio de ant
ibiticos |i-lactmicos. se pueden aadir cationes o polianetolsullonato sdico al medio
de ensayo con el fin de neutralizar la actividad de los aminoglucsidos. En otras
ocasiones simplemente no es posible determinar la concentracin de un antimicrobi
ano en presencia de otro. Pese a estas limitaciones, las pruebas microbiolgicas s
iguen siendo el "mtodo de referencia" frente al cual se evalan los anlisis no micro
biolgicos; el motivo estriba en que la prueba microbiolgica determina la actividad
antimicrobiana total de un antimicrobiano, mientras que el anlisis no microbiolgi
co determina slo un componente de un antimicrobiano estructuralmente complejo. An
halt (1985) y Edberg (1986) proporcionaron descripciones detalladas de las prueb
as microbiolgicas. La cromatografa liquida, proceso para separar una mezcla comple
ja de sustancias y basado en la distribucin diferencial de stas entre una fase lqui
da mvil y una fase slida estacionaria, ha demostrado ser una tcnica sensible y espe
cfica para medir casi todos los antimicrobianos de muestras clnicas. La tcnica conl
leva la extraccin del antimicrobiano a partir de la muestra o una precipitacin de
protenas seguida de cromatografa del lquido extrado o libre de protenas en una column
a de fase inversa (Anhalt, 1985). Anhalt (1985) public detalles respecto a los anl
isis mediante cromatografa lquida. Los factores que afectan a la utilizacin actual
de la cromatografa lquida son la disponibilidad de equipamiento para el anlisis de
frmacos distintos de los antibiticos, la falta de disponibilidad de equipos de rea
ctivos para determinados antimicrobianos, el pequeo volumen de pruebas para algun
os antimicrobianos y la necesidad de cuantificar los metabolitos e ismeros de los
antimicrobianos. Los anlisis mediante cromatografa lquida tienen la ventaia sobre
otros mtodos de poder mezclar un patrn con la muestra antes de la prueba, proporci
onando un patrn interno. Las ventajas de la cromatografa liquida incluyen su versa
tilidad, el coste relativamente bajo del reactivo, el coste moderado del equipo
y la no necesidad de derivacin, la capacidad para manejar peticiones "estadsticas"
y un consumo de tiempo mnimo. Las desventajas de la cromatografa liquida son el t
amao de la muestra relativamente voluminoso (500 pl), la necesidad de muestras pr
etratamiento, la necesidad de una diversidad de detectores, la extraccin constant
e de muestras y el tiempo de entrenamiento requerido para el procesamiento exact
o de las muestras. Los mtodos de cromatografa lquida para el estudio de antimicrobi
anos se han sustituido en los laboratorios clnicos por los de inmunoanlisis. El ra
diommunoanlisis (RA) fue uno de los primeros inmunoanlisis disponibles para el estu
dio de aminoglucsidos. Los RA requeran slo un pequeo volumen de muestra y podan manej
r peticiones "estadsticas", eran especialmente capaces de realizar mltiples anlisis
por lote, proporcionaron automatizacin y eran sensibles y especficos. Las desvent
ajas del RA consistan en la fecha de caducidad limitada de los reactivos radiactiv
os, los problemas de tratar con malerial radiactivo, el coste elevado de equipo
y reactivos y la falta de versatilidad para el estudio de otros agentes antimicr
obianos. En consecuencia, los RA han sido sustituidos casi por completo por inmun

oanlisis no isotpicos, entre los que se incluyen la polarizacin, los sustratos marc
ados, la multiplicacin enzimtica y el fluoroanlisis de polarizacin (Edberg, 1986). L
a ventaja de estos inmunoanlisis homogneos es el pequeo volumen de muestra requerid
o (aproximadamente 50 pl), no necesitar preparacin de las muestras, el coste mode
rado del equipo, un tiempo de adiestramiento mnimo, la capacidad de los sistemas
para manejar peticiones estadsticas y la disponibilidad de automatizacin. Sus desv
entajas incluyen el hecho de que a menudo slo existe una fuente de reactivo y que
stos sue-

len ser caros. No obstante, dada su comodidad y el poco tiempo que consumen, est
os sistemas de inmunoanlisis son bastante utilizados. Edberg (1986) public una des
cripcin detallada de los inmunoanlisis. Se han realizado una serie de estudios sob
re aspectos tcnicos y de exactitud de las pruebas microbiolgicas, los radioinmunoa
nlisis, los inmunoanlisis no isotpicos y la cromatografa lquida de alta resolucin. En
general, los coeficientes de variacin son comparables (del 7% al 9%). Las sensibi
lidades suelen ser tambin comparables (de 0.1 ugvml a 1 po/ml). La correlacin de r
esultados entre los mtodos es alta Los resultados de los inmunoanlisis no isotpicos
y de la cromatografa lquida de alta resolucin pueden estar disponibles en 1 hora,
mientras que en 3 a 4 horas se dispone de los resultados de los RIA. Aunque la m
ayora de las pruebas microbiolgicas requieren una noche de incubacin, se dispone de
una serie de anlisis microbiolgicos rpidos (de 4 a 6 horas) para aminoglucsidos y v
ancomicina.
Interpretacin
La interpretacin de los resultados de anlisis de antimicrobianos requiere conocimi
entos acerca de las dosis de antimicrobiano administrado, el intervalo de tiempo
entre la administracin de las dosis y la recogida de la muestra de sangre, la se
nsibilidad del microorganismo infectante, la tolerabihdad de los niveles sricos a
lcanzables de antibitico, el volumen de distnbucion y la via de eliminacin del ant
ibitico, las caractersticas de absorcin de ste y la experiencia clnica en el tratamie
nto de infecciones similares. Considerados estos requisitos, en la Tabla 51-2 se
han enumerado los factores que afectan la monitorizacin de los antimicrobianos c
on estrechos mrgenes teraputicos (Anhalt, 1989).
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SECCIN VI

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C A P T U L O
52
Infecciones por espiroquetas
Michael Smith, M.D. Randall T. Hayden, M.D. David H. Persing, M.D., Ph.D. Gail L
. Woods, M.D.
TREPONEMA Treponema Pinta Diagnstico de laboratorio de las treponematosis Tratami
ento de las treponematosis GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRNICA LEPTOSPIR
OSIS 1135 1135 pallidum 1131 FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA ANAEROBIOSPIRILLUMSUCC
INICIPRODUCENS ESPIROQUETOSIS INTESTINAL DIAGNSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES
POR BORRELIAS Enfermedad de Lyme Fiebre recurrente BIBLIOGRAFA 1141 1137 1136 113
6 1136
Las espiroquetas son bacterias finas con forma espiral que presentan una o ms vue
ltas de hlice completas en el soma bacteriano. Son gramnegativas. pero slo pueden
visualizarse en preparaciones en fresco, mediante microscopa ptica de campo oscuro
o contraste de fases, o por medio de tinciones por impregnacin argntica en seccio
nes de muestras de tejidos. Unos orgnulos semejantes a los flagelos, denominados
fibrillas periplsmicas o filamentos axiales, que surgen cerca de los polos de la
bacteria, son responsables del movimiento caracterstico de estos microorganismos,
semejante al desplazamiento de un sacacorchos. Si bien existe un gran nmero de e
species comensales, no patgenas, las especies de los gneros Treponema y Borrelia,
as como Leptospira interrogans, y Spirillum minor causan enfermedades en el ser h
umano. Por otro lado, se han asociado algunas especies de los gneros Serpulina y
Brachyspira con sndromes gastrointestinales, aunque no est universalmente aceptado
que exista una relacin inequvoca entre estas bacterias y la enfermedad.
ja es aproximadamente de un 30% a un 50% (Larsen, 1995: Tramont, 1995). Aunque c
on una frecuencia mucho menor, la infeccin puede transmitirse sin que exista cont
acto sexual con una lesin infecciosa, mediante una transfusin de sangre fresca (o
de hemoderivados de la misma) procedente de una persona infectada (los microorga
nismos pueden sobrevivir de 24 a 48 horas, e incluso ms, en las condiciones de al
macenamiento que existen en los bancos de sangre), por una puncin accidental con
una aguja infectada o durante la manipulacin de los especmenes de laboratorio. La
incidencia de la sfilis venrea en EE.UU. descendi drsticamente con el advenimiento d
e la penicilina tras la segunda guerra mundial, y permaneci estable hasta 1980. m
omento en el que la prevalencia de la enfermedad aument, debido probablemente a l
a asociacin entre el incremento en el uso de drogas y la promiscuidad sexual en d
eterminados grupos de la poblacin. Esta asociacin ha tenido el desafortunado efect
o adicional de provocar un incremento en la prevalencia de la sfilis congnita en l
os recin nacidos (CDC. 1989). Patogenia y patologa. T. pallidum subesp. pallidum e
s capaz de penetrar por las membranas mucosas intactas o acceder a los tejidos a
travs de abrasiones o excoriaciones de la piel, tras lo cual se multiplica en el
m i s m o punto en donde tuvo lugar la inoculacin, teniendo lugar, a continuacin,
la diseminacin del microorganismo por los sistemas circulatorio y linftico de la
persona infectada. En los animales de laboratorio se ha logrado producir la infe
ccin con una dosis infectante tan baja como cuatro espiroquetas (Cumberland, 1949
). Las lesiones clnicas aparecen cuando se alcanza localmente una masa crtica de m
icroorganismos (aproximadamente 10' espiroquetas): por tanto, el perodo de incuba
cin est directamente relacionado con el tamao del inoculo inicial y varia entre tre
s das y tres meses (Magnuson, 1956), La respuesta inmune del hospedador frente a
T. pallidum subesp. pallidum est influida por la propia estructura de la bacteria
. La membrana externa d e la envoltura celular bacteriana es una bicapa lipdica e
n la que existen pocos antigenos proteicos expuestos. Los antgenos ms importantes
en el contexto de la respuesta inmune del hospedador parecen ser los proteolipid
os que se encuentran por debajo de la superficie celular del microorganismo (Cha
mberlain, 1989; Cox, 1992). Adems, la bacteria parece ser capaz de recubrirse con
protenas del husped. El resultado final es retrasar la respuesta inmune de tipo h
umoral, reduciendo la eficacia de la misma, debido a que las espiroquetas se loc

alizan fuera de los vasos sanguneos cuando se estn produciendo los anticuerpos. Es
ms. se ha demostrado en modelos animales que hay una escasa estimulacin de la res
puesta inmune celular en el caso de la sfilis, a pesar de la ineficaz respuesta d
e tipo humoral (Fitzgerald, 1992).
TREPONEMA
El gnero Treponema incluye dos especies que causan enfermedad en el hombre. La es
pecie Treponema pallidum est subdivdida en tres subespecies. cada una de las cuale
s es el agente etiolgico de una entidad clnica diferente: las subespecies pallidum
, pertenuey endemicum causan, respectivamente, sifilis venrea, frambesia y sfilis
endmica (bejel). La enfermedad denominada pinta est provocada por la otra especie
patgena. T. carateum.
Treponema Sfilis
pallidum
Descripcin. T. pallidum subesp. pallidum, el agente etiolgico de la sfilis venrea, e
s una espiroqueta muy delgada (0.2 um) y larga (de 6 itm a 20 um) que presenta e
ntre 10 y 13 vueltas de hlice completas. Esta espiroqueta tiene la movilidad de s
acacorchos caracterstica, con una flexin ondulante de la parle central del cuerpo
de la bacteria, y es rpidamente inactivada por el calor, el fro, la desecacin, los
desinfectantes y los cambios en la presin osmtica del medio exocelular. Epidemiolo
ga. El hombre es el nico hospedador natural de T. pallidum subesp. pallidum. La tr
ansmisin se produce al entrar en contacto directo con lesiones infecciosas, princ
ipalmente a travs de una relacin sexual. La probabilidad de que una persona infect
ada le transmita la enfermedad a su pare-

1132
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA contrario, debido a que los antibiticos se administran en dosis

insuficientes para atravesar la barrera hematoenceflica y alcanzar concentracione
s bactericidas, la neurosifilis todava aparece con cierta frecuencia (Mohr, 1976;
Green. 1980) De esta forma de sfilis se han definido dos variantes, meningovascu
lar o parenquimatosa, aunque es comn que exista una solapacin entre ambas. La sfili
s meningovascular aparece entre los 5 y 1 0 aos siguientes a la infeccin inicial y
se manifiesta clinicamente en forma de ataques, derrames cerebrales y afasia. L
a causa principal son los microinfartos mltiples debidos a la endoartertis caracte
rstica a nivel del SNC. La neurosifilis parenquimatosa, que aparece entre los 15
y 30 aos despus de la primera infeccin, es un proceso degenerativo con prdida de neu
ronas y segmentos mielmizados (desmielmizacin segmentaria) que provoca manifestac
iones neurlogos y psiquitricas complejas, incluyendo paresia generalizada y tabes
dorsal. Algunos pacientes no muestran signos o sntomas clnicos, pero un anlisis de
su lquido celalorraquideo (LCR) revela anomalas tales como pleocitosis. incremento
en la concentracin de protena y presencia de anticuerpos frente a T. pallidum. si
endo posible que la prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) d positiva
, lo que indica la existencia de infeccin a nivel del SNC. Esta forma se ha denom
inado "neurosfilis asintomtica" (Tramont. 1995). Tambin existen dos formas clnicas d
e la sfilis congnita: una forma temprana o infantil y otra tarda, que se maniliesta
tras un perodo de latencia que oscila entre 5 y 30 aos. Aunque la idea tradiciona
l de que la infeccin del feto slo tiene lugar durante el segundo trimestre de gest
acin ha dejado de ser aceptada, la sfilis congnita causa con mayor frecuencia abort
os en las etapas iniciales del embarazo que en las fases tardas del mismo (Blanc.
1981: Harter, 1976). La inflamacin del cordn umbilical (lunisilis necrotizante) e
s caracterstica de la sfilis congnita. En la forma infantil, son caractersticas una
erupcin difusa con desprendimiento de la piel y osteocondntis y periostitis: sin
embargo, los recin nacidos afectados tambin pueden ser asintomtcos (Ikeda, 1990; Dor
fman, 1990). Asimismo, se h a observado fibrosis difusa en el hgado (hepar lobalu
m) y el pulmn (neumona alba) Tras un periodo de latencia. la lorma tarda se present
a en la niez o en la edad adulta con una amplia variedad de signos o sntomas, aunq
ue es clsica la trada formada por la queratitis intersticial, los dientes de Hutch
inson (dientes en tonel) y la parlisis del octavo par de nervios craneales (sorde
ra). Tambin se observa con frecuencia periostitis, arqueamiento de las tibias (ti
bia en sable) y deformidad de la nariz, que adquiere un aspecto de silla de mont
ar
Esta respuesta inmune retardada y atenuada permite a 7! pallidum subesp. pallidu
m diseminarse y producir una infeccin crnica. El curso de la sfilis puede dividirse
en tres fases predecibles. La fase primaria, con el desarrollo del chancro, se
manifiesta por trmino medio a las tres semanas, aunque no todos los pacientes des
arrollan una lesin primaria (el chancro). En algunos casos, debido a su carcter in
doloro, la lesin desaparece sin el que paciente llegue a darse cuenta. La cicatri
zacin completa del chancro entre dos y ocho semanas despus da paso a la fase secun
daria, que se manifiesta por trmino medio unas seis semanas (con un rango de entr
e 2 y 12 semanas) despus de la inoculacin. Esta fase se caracteriza por una extens
a diseminacin de la bacteria por el torrente circulatorio, con afectacin mucocutnea
y a nivel de rganos y la aparicin de sntomas constitucionales. La lase secundaria
se resuelve y la infeccin entra, seguidamente, en un perodo de latericia durante e
l cual el paciente no muestra sntoma alguno de la infeccin. Los cuatro primeros aos
de esta fase se denominan perodo de latencia temprano, y es durante este tiempo
cuando tienen lugar las recadas, principalmente dentro del pnmer ao Esta fase es s
eguida por el perodo de latencia tardo, durante el cual no se producen recadas. En
algn momento entre los 1 0 y 25 aos despus de la fase primaria, un tercio de los pa
cientes no tratados desarrolla la lase terciaria de la enfermedad, en la que tie

nen lugar graves manifestaciones clnicas a nivel de los sistemas cardiovascular y

nervioso central (SNC). Sea cual sea el rgano afectado o la fase en la que se en
cuentra la enfermedad, la caracterstica histolgica distintiva de la sfilis es la en
doarterilis oblilerativa, una proliferacin endotelial y fibroblstica concntrica con
un infiltrado asociado de clulas mononucleares rico en clulas plasmticas. L a endo
artertis es consecuencia de la unin de las espiroquetas a las clulas endoteliales a
travs de molculas de fibronectina que se han pegado a la superficie de las bacter
ias (Thomas. 1986). Los treponemas pueden visualizarse en las muestras de tejido
s mediante tcnicas de tincin por impregnacin argntica. A medida que la enfermedad pr
ogresa disminuye la intensidad de los infiltrados de clulas plasmticas y la concen
tracin de treponemas.
Manifestaciones clnicas. La sfilis es una infeccin crnica con mltiples manifestacione
s relacionadas, pnmariamente, con la fase en la que se encuentra la enfermedad.
El chancro primario aparece caractersticamente ulcerado, con los bordes elevados
y duros, la base lisa, destacando la ausencia de exudado y dolor en el mismo. Au
nque habitualmente es nico, pueden aparecer mltiples chancros hasta en un tercio d
e los individuos infectados. Los pacientes con infeccin previa pueden presentar l
esiones atipicas, c o m o una ppula pequea, La sfilis y la infeccin por el virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH) e incluso pueden no desarrollar lesin alguna. E
n algunos pacientes puede apreaparecen frecuentemente en el mismo paciente, pues
to que ambas enfermeciarse la existencia de linfadenopata regional, con ganglios
linfticos moderadadades comparten factores de riesgo comunes. Los estudios efectu
ados sobre mente aumentados de tamao, de consistencia gomosa y no supurativos. es
ta asociacin no han revelado diferencias en la fase de presentacin clnica entre los
pacientes con sfilis y sida concomitantes y aquellos que no estn La diseminacin ti
ene lugar en la fase secundana, y los pacientes presentan afectados por el VIH (
Hutchinson. 1991; Gourevitch, 1993) Existe controverlos signos y sntomas de una e
nfermedad sistmica. Ms del 90% de los missia sobre el hecho de si el sida concomit
ante puede afectar el curso clnico de m o s desarrollan una erupcin que aparece in
icialmente en el tronco y las extremidades (aunque cualquier parte del cuerpo pu
ede verse alectada) en forma de las fases primaria y secundaria de la sfilis. Alg
unos expertos indican que existe una tendencia a que aparezca una erupcin ms grave
y atipica, a que los mculas de pequeo tamao que evolucionan hasta convertirse en pp
ulas, y sntomas constitucionales sean ms intensos y, en general, a que la enfermee
n algunos pacientes en pstulas, durante un periodo de varias semanas. El dad siga
un curso ms maligno en los pacientes con sida (Tramont. 1995) Sin aspecto de la
erupcin en la palma de la mano y la planta del pie es caracteembargo, otros autor
es han encontrado pocas diferencias en estas dos fases rstico, y el agrandamiento
y la coalescencia de las ppulas da lugar a las plade la enfermedad entre los pac
ientes afectados y no afectados por el VIH (Hutcas blanquecinas del condiloma la
ta. Aproximadamente el mismo nmero chinson, 1991: Musher, 1990). Sobre lo que no
existe duda alguna, en cual(90%) de pacientes manifiesta una linfadenopatia gene
ralizada, y un 75% puequier caso, es sobre el hecho de que los pacientes con sid
a enfermos tambin de padecer fiebre, malestar, anorexia, artralgia, faringitis y
prdida de peso. En de sfilis tienen una mayor predisposicin a desarrollar neurosili
lis, y a desun tercio de los casos pueden observarse placas mucosas. Alrededor d
e un arrollarla de manera ms rpida que los sifilticos que no estn afectados por 40%
de pacientes manifiestan sntomas de afectacin del SNC. aunque tan el sida (Tramont
. 1995; Musher, 1990: Johns. 1987) En este caso, se ha puesslo entre un 1% y un 2
% desarrollan una meningitis aguda asptica (Lukehart. to de manifiesto que existe
una relacin con el tratamiento con penicilina a 1988). El resto tiene dolor de c
abeza y meningismo. uveitis. prdida neurounas concentraciones insuficientes para
atravesar la barrera hematica y accesensonal de la audicin y afectacin de los nerv
ios craneales. der al lugar de la infeccin, el SNC (Berry, 1987). Adems, en los pa
cientes con La destruccin de los tejidos en la sfilis terciaria se hace evidente e
ntre los 10 sida hay una elevada incidencia de afectacin ocular, siendo la uveiti
s anterior y los 25 aos despus de la infeccin primaria. La sfilis cardiovascular apa
rece la manifestacin ms comn de la infeccin (Tramont, 1995). c o m o consecuencia de
l debilitamiento de la tnica media, que produce un aneurisma en la aorta ascenden

te con insuficiencia de las vlvulas articas y estrePian chamiento de la luz de las

arterias coronaras. Los gomas sifilticas (es decir, reas de necrosis granulomatos
a). cuyo tamao puede variar desde dimensiones El pian (tambin denominado frambesia
, parangi, paru. buba o bouba) es una microscpicas hasta tumores de gran tamao, af
ectan frecuentemente a la piel enfermedad crnica causada por T. pallidum subesp.
pertenue. Esta enfermeal sistema esqueltico y a los tejidos mucocutneos. aunque pu
eden aparecer dad, que ha afligido desde antiguo a las personas que viven en zon
as tropicaen cualquier rgano. T a n t o la sfilis cardiovascular como las gomas so
n mucho les, tiene una prevalencia significativa en reas rurales de paises tropic
ales con menos frecuentes tras el advenimiento del tratamiento con antibiticos. P
or el lluvias intensas. Tras un descenso alrededor de 1 9 5 0 debido a las grand
es

CAPTULO 52

INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

1133
campaas emprendidas para el control de las treponematosis. la incidencia de la fr
ambesia ha vuelto a aumentar en algunas zonas (Engelkens, 1991). La frambesia se
contrae durante la niez, antes de los 15 aos, por contacto directo, a travs de des
garros en la piel que permiten la entrada de los treponemas. Las lesiones inicia
les aparecen, generalmente, unas tres semanas despus de la inoculacin, por trmino m
edio. Pueden aparecer ppulas en nmero variable (entre una y varias), con mayor fre
cuencia en las extremidades inferiores, que seguidamente se ulceran o evoluciona
n hasta convertirse en lesiones papilomatosas. En estas lesiones existen numeros
os treponemas, Es normal que estas lesiones se resuelvan espontneamente; sin emba
rgo, tambin son frecuentes las recadas que esln precedidas por malestar, fiebre y u
na linfadenopata generalizada seguida de lesiones diseminadas en la piel. Muchos
pacientes entran en un periodo de latencia durante el que no hay signos o sntomas
clnicos evidentes. En la mayor parte de ellos, la enfermedad no da manifestacion
es de ningn tipo; sin embargo, un 10- de los afectados desarrolla frambesia tarda, e
n la que son patentes las lesiones destructivas e irreversibles en los huesos, c
artlagos, tejidos blandos y piel (Engelkens. 1991). Tambin se han descrito lesione
s cardiovasculares y en el SNC semejantes a las que se observan en los casos de
sfilis (Romn, 1986).
Diagnstico de laboratorio de las treponematosis
Debido a que los agentes etiolgicos de las treponematosis humanas no pueden aisla
rse por las tcnicas habituales de cultivo microbiolgico. su deteccin se lleva a cab
o mediante visualizacin directa de los microorganismos en los especmenes procedent
es de las lesiones o de forma indirecta por mtodos inmunolgicos. Cada fase de las
treponematosis requiere una modalidad particular de prueba. En las fases tempran
as, cuando las lesiones estn presentes, se utiliza la microscopa directamente. En
las fases tardas, se emplean las tcnicas serolgicas. Para el escrutinio preliminar
se utilizan pruebas no especficas basadas en la deteccin de anticuerpos no treponmi
cos, mientras que la confirmacin del diagnstico se lleva a cabo con mtodos que dete
dan anticuerpos treponmicos especficos. Es importante tener presente que ninguna d
e estas pruebas de laboratorio comnmente utilizadas es capaz de distinguir entre
especies que estn intimamente relacionadas y las subespecies de los Ireponemas pa
tgenos, por lo que la diferenciacin debe establecerse basndose en las evidencias cln
icas y epidemiolgicas. Microscopa de campo oscuro. Cuando es posible obtener una m
uestra directamente de las lesiones, como sucede en las fases pnmaria y secundar
ia de la sfilis, asi como en la fase temprana de la sfilis congmta (chancros, placa
s mucosas, condiloma lata), la lesin debe limpiarse primero con agua estril (sin j
abn o antispticos) y a continuacin debe realizarse sobre la m i s m a una suave abr
asin. Seguidamente se aplica presin en la base de la lesin para oblener un exudado
seroso que se acumula en sta. Una gota de ese exudado se coloca en un portaobjeto
s y se deposita encima un cubreobjetos. La muestra debe examinarse inmediatament
e, puesto que la visualizacin de la movilidad caracterstica de los treponemas es u
n requisito necesano para la identificacin definitiva. Debido a su extrema delgad
ez, los treponemas no pueden observarse mediante la microscopa ptica convencional.
Es necesario utilizar la microscopa de campo oscuro, que emplea un condensador q
ue hace que los rayos de luz incidan sobre los Ireponemas en ngulo oblicuo, provo
cando que la luz salga reflejada de stos, con lo que las bacterias aparecen c o m
o objetos brillantes sobre un fondo oscuro. El examen en campo oscuro puede arr
ojar resultados positivos incluso muchas semanas antes de que una prueba de lipo
serolgico sea positiva, y tiene una sensibilidad del 80% para el diagnstico de la
sfilis (Larsen. 1995). Debido a que puede haber una posible confusin con los trep
onemas comensales que existen en la boca, la observacin en c a m p o oscuro no es

t recomendada en el caso de muestras que se obtengan a partir de lesiones orales.

Ademas, existen tres especies de Treponema. son habitantes normales de la regin
genital (T. phagedensis. T. refrngeos y T. mmutum). que potencialmente pueden con
fundirse con I pallidum en un examen con microscopa de campo oscuro. Una limpieza
cuidadosa de la zona es importante para reducir las posibilidades de que se pro
duzca esta confusin Microscopa de fluorescencia. Los anticuerpos especficos frente
a T. pallidum marcados con FITC (isotiocianato de fluorescena) pueden utilizarse
para la deteccin directa de treponemas en las muestras obtenidas de las lesiones,
y evitan la necesidad de tener que observar la movilidad de las bacterias. La p
rueba puede realizarse sobre extensiones secas y lijadas de fluidos lisulares re
alizadas en un portaobjetos (fluorescencia directa con anticuerpos [DFA-TP]) o s
obre secciones de muestras de tejidos incluidas en parafina (fluorescencia direc
ta con anticuerpos sobre tejidos [DFAT-TPJ). Existen anticuerpos monoclonales di
sponibles comerciaimente, que pueden utilizarse en estas pruebas en lugar de los
anticuerpos policlonales procedentes de conejos y seres humanos sifilticos adsor
bidos sobre la cepa Reiler de T. pallidum. que han sido empleados hasta ahora y
son menos especficos. Cuando se utilizan para examinar exudados y fluidos procede
ntes de lesiones frescas, ambas tcnicas (DFA-TP y DFAT-TP) tienen una sensibilida
d de casi el 100%, comparadas con la tincin de impregnacin argntica de Stiener para
la sfilis congmta (Larsen, 1995). Debido a que estas pruebas son especificas para
los treponemas patgenos, deben utilizarse para el examen de muestras obtenidas a
partir de lesiones en la boca. Mtodos serolgicos no treponmicos. Los ensayos no tr
eponmicos detedan la presencia de anticuerpos que se generan frente a material de
naturaleza lipoproteica liberado por las clulas daadas y la cardiolipina de los t
reponemas (es decir, anticuerpos producidos c o m o consecuencia de la respuesta
del sistema inmune del husped frente a lpidos tanto de l m i s m o como de las esp
iroquetas), y en consecuencia no son especficos de Treponema. De f o r m a
Sfilis endmica
La sfilis endmica (bejel) es una enfermedad crnica no venrea, consecuencia de la inf
eccin por T. pallidum subesp. endemicum. La enfermedad es antigua y, aunque ya no
est tan extendida como lo estuvo en un momento, todava se dan casos en zonas con
clima clido y seco de Oriente Medio y frica. La prevalencia de la enfermedad ha ex
perimentado un aumento en la regin africana del Sahel (Engelkens, 1991). La enfer
medad se transmite por contado directo con lesiones activas, dedos contaminados
y utensilios de comida y bebida. Las condiciones de hacinamiento e higiene escas
a son tpicas entre las personas afectadas. La infeccin primara tiene lugar en nios c
on edades comprendidas entre los 2 y los 15 aos, aunque la enfermedad tambin puede
darse en los individuos adultos de la misma familia, y tambin los adultos que no
han sufrido la enfermedad durante la niez pueden ser infectados por sus nios. El
tamao del inoculo (dosis infectante) es pequeo y las lesiones primarias de la sfili
s endmica temprana, que aparecen principalmente en la m u c o s a orofarngea, son,
a menudo, inaparentes. Frecuentemente, las manifestaciones clnicas iniciales de
la enfermedad aparecen en una segunda fase y consisten en la aparicin de placas m
ucosas, condiloma lata, estomatitis angular, linfadenopata generalizada y osteope
riostitis dolorosa. Estos sntomas son seguidos por un periodo de latencia de dura
cin variable. La fase tarda se caraderiza por la destruccin de tejidos en la piel,
huesos y cartlagos, de manera preferente en la nariz y el paladar, con afectacin d
e la laringe en algunas ocasiones.
Pinta
La pinta (carate, mal de pinto, azul) es causada por T. carateum. La enfermedad
es endmica en zonas rurales de reas tropicales de Amrica Central y del Sur y ha rea
parecido, recientemente, en Mxico y Colombia, dos pases en los que haba sido erradi
cada desde 1950 (Engelkens, 1991). Los individuos afectados primariamente son lo
s nios con edades por debajo de los cinco aos. Se cree que la inoculacin tiene luga
r por contacto no venreo con la piel o mucosas. Es difcil caracterizar la patogeni
a de la enfermedad, ya que, a diferencia de otras treponematosis que afectan al
hombre, no hay modelos animales disponibles y el treponema responsable no puede
ser cultivado de forma continua. Como sucede en el caso de otras infecciones por

treponemas, tambin existen en la pinta fases temprana y tarda, aunque en esta enf
ermedad es frecuente que exista un solapamiento entre ellas. Unos dos meses desp
us de la inoculacin, aparece una ppula primaria o placa en el lugar por donde penet
r el microorganismo, que puede ir acompaada o no por una Imladenopatia localizada
Esta lesin pnmaria se resuelve y, unos meses o aos ms tarde, aparecen las lesiones
secundarias diseminadas, o "pintides", que persisten durante largos periodos o b
ien se resuelven para volver a reaparecer. En la pinta tarda, las lesiones, que p
ueden permanecer de por vida, muestran hipopigmentacin, atrofia de la piel, e hip
erqueratosis. La piel parece ser el nico rgano afectado por esta enfermedad.

1134
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
colectiva, estas pruebas se conocen con el nombre de pruebas reagnicas. aunque el
trmino reagina, aplicado al diagnstico serolgico de la sfilis, parece p o c o afort
unado, ya que se puede confundir con los anticuerpos de la clase E (IgE), que ta
mbin reciben el nombre de reaginas. Entre estas pruebas se encuentran el mtodo VDR
L (prueba de la reagina en portaobjetos), RPR (prueba rpida de la reagina en plas
ma con tarjeta circular), USR (prueba de la reagina en suero sin calentar) y TRU
ST (prueba de la reagina en suero sin calentar con roio de toluidina). Todos est
os mtodos utilizan un antigeno fosfolipdico (cardiolipina) reforzado con lecitina
y colesterol en partculas coloidales. En todos los casos, la aglutinacin de esas p
artculas se considera resultado positivo. Puesto que la aglutinacin es el criterio
utilizado para determinar la positividad de las pruebas, es prelerible utilizar
en todas ellas suero en lugar de plasma; en el caso del mtodo VDRL. el suero deb
e ser tratado con calor para eliminar reacciones inespecfcas. Para las pruebas RPR
y USR. no es necesario someter a la muestra a calentamiento si se aade a la m i
s m a cloruro de colina. En el caso de las pruebas VDRL y USR. la reaccin de aglu
tinacin debe visualizarse microscpic a m e n t e (xlOO aumentos), mientras que la
presencia de carbn y de cobrante en los mtodos RPR y TRUST, respectivamente, hacen
que la reaccin sea macroscpicamente visible. Los anticuerpos detectados mediante
todas estas pruebas aparecen generalmente enlre la primera y cuarta semanas desp
us de la formacin del chancro primario. Por tanto, el momento en el que la muestra
es tomada en la lase primaria puede afectar a la sensibilidad del mtodo. El titu
lo aumenta, se mantiene elevado durante el primer ao. y luego comienza a disminui
r. Las pruebas se negativizan espontneamente en el 25% de los pacientes. Pueden d
arse resultados tanto falsos negativos como falsos positivos. Los falsos negativ
os son consecuencia de un ttulo elevado de anticuerpos en el suero (debido al fenm
eno de zona) y se dan especialmente en el caso de la sfilis secundaria. Este prob
lema puede solucionarse llevando a cabo una dilucin de la muestra antes de realiz
ar el ensayo. Los resultados falsos positivos pueden darse ocasionalmente en pac
ientes alectados por ciertas enfermedades agudas como la hepatitis, ciertas infe
cciones vricas y en mujeres embarazadas o con carcter crnico en el caso de individu
os aquejados por enfermedades del tejido conectivo (Larsen 1995). Las pruebas po
sitivas se titulan repitindolas con diluciones dobles senadas de la muestra. Los
ttulos se utilizan para determinar la eficacia del tratamiento. Un descenso de cu
atro veces en el titulo de anticuerpos al cabo de 12 m e s e s en el caso de la
sfilis temprana, as como una disminucin de cuatro veces a los seis meses y de ocho
a los 12 en la sfilis tarda, es evidencia de que el tratamiento es adecuado (Roman
owski, 1991). Aquellos pacientes tratados durante la fase temprana de la enferme
dad tienen ms posibilidades de revertir a negativo que los que son tratados en la
sfilis tarda (Brown, 1985; Rumara. 1980). El rastreo de ciertos grupos de poblacin
para la deteccin de sfilis implica el empleo de muestras o procedimientos particu
lares. Por ejemplo, en el caso de la sfilis congenita, el suero de la madre es un
espcimen mejor que la sangre del cordn umbilical o del propio neonato, muestras q
ue han sido utilizadas en el pasado (USPHS, 1968). Otro ejemplo lo encontramos e
n el diagnstico de la neurosfilis. que requiere resultados positivos tanto con las
pruebas que detectan anticuerpos treponmicos especficos como con el mtodo VDRL. a
partir del liquido cefalorraqudeo. El test VDRL es muy especfico, aunque poco sens
ible, para el diagnstico de la neurosfilis. Puede dar resultados negativos en un 2
2% a un 69% de pacientes con neurosfilis activa, y su sensibilidad en el caso de
neurosfilis inactiva puede ser tan baja como un 1 0 % (Schmidt, 1980; MacLean, 19
96). A pesar de esto, ninguno de los restantes mtodos de tipo no treponmicos tiene
n utilidad para llevar a cabo la deteccin de esta complicacin tarda de la sfilis y,
por otro lado, las pruebas treponmicas adolecen de prdida de sensibilidad, y dan f

alsos positivos debido al paso de anticuerpos a travs de la barrera hemtica en el

cerebro. Se han descrito resultados aberrantes obtenidos con varias tcnicas de ti
po no treponmico en el caso de pacientes sifilticos coinfectados con el VIH. inclu
yendo retrasos en la seroconversion: sin embargo, no es frecuente que en pacient
es de sida se observe seronegatividad frente a la sfilis, en el caso de coinfeccin
(Flores, 1995). La lasa de resultados falsamente positivos aumenta ligeramente
en el caso de pacientes con sida (un 4% frente al 1% en individuos sin sida); si
n embargo, al menos un estudio ha asociado el incremento en la tasa de resultado
s positivos con la adiccin a las drogas por va intravenosa, ms que con la propia in
feccin por el VIH (Larsen. 1995; Flores. 1995:
Hernndez-Aguado, 1998). Los falsos negativos tambin aparecen en los pacientes con
sida que tienen sfilis concomitante, debido a la respuesta exacerbada de anticuer
pos no treponmicos que se produce en algunos sujetos, con el consiguiente efecto
de zona (Gourevitch, 1993). Adems, el ttulo d e anticuerpos no treponmicos no dismi
nuye en algunos pacientes de sida con sfilis a pesar del tratamiento, aunque algu
nos autores piensan que esto est ms relacionado con la fase de la enfermedad en la
que se inici el tratamiento que con la infeccin por el VIH, puesto que un comport
amiento parecido se ha observado tambin en enfermos sin sida (Larsen. 1995). Mtodo
s serolgicos treponmicos. Estos mtodos detectan la presencia de anticuerpos frente
a antgenos treponmicos y se utilizan para ratificar los resultados positivos obten
idos mediante las pruebas de tipo no treponmico, o para confirmar la infeccin en e
l supuesto de un resultado negativo con estas ltimas en las fases tarda o de laten
cia de la enfermedad, lo que puede suceder en un 30% de pacientes con sfilis terc
iaria (Larsen, 1995). El test de absorcin con anticuerpos treponmicos fluorescente
s (FTA-ABS). una de las dos tcnicas estndar treponmicas especificas, es una prueba
d e inmunofluorescencia indirecta. Se lleva a cabo con suero del paciente calent
ado y absorbido sobre antigenos de la cepa Reiter no patgena para eliminar los an
ticuerpos que produzcan reactividad cruzada, que se deposita sobre un portaobjet
os sobre el que previamente se han fijado clulas de la cepa Nichols de T. pallidu
m subesp. pallidum, aadindose linalmente anticuerpos trente a inmunoglobulinas hum
anas marcados con isotiocianato de fluoresceina (FITC). L a observacin de trepone
mas visibles bajo microscopa de fluorescencia indica la existencia de anticuerpos
frente a los treponemas patgenos en el suero del paciente. El segundo mtodo, que
es preferido en m u c h o s laboratorios debido a su relativa sencillez de ejecu
cin, es el de la microhemoaglulinacin con Treponema pallidum (MHA-TP). En este cas
o, el suero absorbido se mezcla con eritrocitos de oveja sensibilizados con 7! p
allidum (cepa Nichols), mediante sonicacin en una placa de microtitulacin. Si el s
uero contiene anticuerpos se observar la aglutinacin de los glbulos rojos. En gener
al, ambos procedimientos (FTA-ABS y MHA-TP) son equivalentes excepto en la lase
pnmana de la sfilis, en la que la prueba FTA-ABS muestra una mayor sensibilidad (
Augenbraun. 1998: Han, 1980). En la Tabla 52-1 se muestran los valores de sensib
ilidad y especificidad de las diferentes tcnicas de tipo no treponmico y treponmico
(Larsen, 1995). Los anticuerpos treponmicos especficos aparecen durante la sfilis
primaria y pueden seguir detectndose durante toda la vida del individuo con indep
endencia del tratamiento, aunque hay excepciones. Los pacientes con sida muestra
n una mayor tendencia a convertirse en seronegativos tras la terapia antimicrobi
ana (Haas, 1990). La prueba FTA-ABS es la primera en dar resultados positivos, s
eguida por la MHA-TP y. linalmente. por los mtodos no treponmicos, un poco despus.
Los mtodos treponmicos no se utilizan para el escrutinio en el entorno clnico, pues
to que aproximadamente un 1% de la poblacin puede dar resultados lalsamente posit
ivos con los mismos. Los falsos positivos con la tcnica FTA-ABS se detectan entre
los ancianos, las personas con enfermedades del tejido conectivo y en individuo
s intectados con bacterias relacionadas con los treponemas, como las especies de
l gnero Borrelia (Larsen, 1995). La frecuencia de falsos positivos con el mtodo MH
ATabla 52-1 Sensibilidad d e los m t o d o s serolgicos para el diagnstico de la sf
ilis en las diferentes fases de la e n f e r m e d a d ' Fase de la sfilis Prueba
VDRI RPR FTA-ABS MHA-TP Primaria 78(74-87) 86(77-100) 84(70-100) 76(69-90) Secu
ndaria 100 100 100 100 Latente 95 (88-100) 98(95-100) 100 97(97-100) Tarda 71(3794) 73 96 94

* Valores de sensibilidad expiesados como porcentajes. Los nmeros entro parntesis

representan los rangos de los valores de sensibilidad en los esludios llevados a
cabo en el Center loi Diseasc Control and Prevention VORI = Vcncreal Disease Re
search Laboralory. RPR = prueba rpida de la reagina; FTA-ABS = test de absorcin co
n anticuerpos treponmicos lluorescenles; MHA-TP ensayo de microhemoaglutinacion p
ara anticuerpos frente a Treponema pallidum. Datos lomados de Larson SA, y cois
Laboralory diagnosis and inrerprealion ol tests lor syphilis Clin Microbio! Rev 1
995; 8:1

CAPTULO 52

INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

1135
TP es menor que la que se encuentra cuando se emplea la inmunofluorescencia indi
recta (FTA-ABS) (Larsen, 1995). Los ensayos de inmunoadsorcin acoplados a enzimas
(ELISA), que utilizan antigenos treponmicos especficos, han comenzado a estar dis
ponibles para su empleo en los labratenos clnicos. Ofrecen las ventajas de tener u
n formato que facilita la manipulacin de un gran numero de muestras y una interpr
etacin objetiva de los resultados. La sensibilidad y la especificidad de los mtodo
s comerciales actualmente disponibles son comparables a las tcnicas FTA-ABS y MHA
TP (Norgard, 1993: Lefevre. 1990). Estos mtodos han sido utilizados para el escru
tinio en situaciones especificas, como las de los donantes de sangre, y, junto c
on los mtodos de tipo no treponmico, en los laboratorios que procesan un gran volu
men de muestras en reas donde existe poblacin con una alta prevalencia (Aberle-Gra
sse. 1999: Reisner, 1997). Los enzimommunoensayos (EIA) que utilizan antigenos n
o treponmicos y los procedimientos especficos para la deteccin de IgM tambin estn dis
ponibles para el rastreo y el diagnstico de la sfilis congnita, respectivamente (Hc
oper. 1994: Stoll. 1993). Los mtodos moleculares, como la transferencia o Western
btot (WB) y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). estn disponibles en algu
nos laboratorios de referencia. El WB est recomendado para el diagnstico de la sfil
is congnita (Larsen, 1995). El uso de la PCR ha sido apoyado en el caso del diagns
tico de la neuroslilis, en especial en los pacientes con sida, aunque los esludio
s realizados no han demostrado que existan ventajas sustanciales sobre los mtodos
utilizados habitualmenle (Marra, 1995).
gnero pueden cultivarse utilizando un medio especifico para el aislamiento de las
mismas que contenga antibiticos y condiciones de incubacin d e anaerobiosis estri
cta (Smibert. 1993) Las PROS no han podido cultivarse m vilro. L a deteccin se ll
eva a cabo con anticuerpos monoclonales contra T. pallidum. frente a los cuales
estas bacterias exhiben reactividad cruzada.
LEPTOSPIROSIS
Descripcin. El gnero Leptospira incluye 11 genoespecies. siete de las cuales son p
atgenas, y ms de 250 serovares (Gravekamp, 1993; de Caballero. 1994). Anteriorment
e, el gnero estaba formado por tres especies: L, interrogans (patgena), con 23 ser
ogrupos y ms de 200 serotipos, L. bitlexa y L. parva (ambas no patgenas). Las lept
ospiras son espiroquetas con las vueltas de hlice muy apretadas y con los extremo
s curvados, que tienen un grosor de 0.1 jim y entre 6 um y 20 um de longitud y q
ue exhiben movilidad giratoria. Pueden sobrevivir en aguas dulces con pH alcalin
o, pero mueren en aguas saladas o con pH cido y como consecuencia de la desecacin.
Epidemiologa. La leptospirosis es una zoonosis con dislnbucin mundial. Algunos se
rotipos se encuentran preferentemente en determinadas zonas geogrficas. Muchos ro
edores, asi c o m o otros animales tanto salvajes c o m o domsticos, son portador
es de estos microorganismos: en cualquier caso, las ratas son el reservorio ms fr
ecuente, representando una importante fuente de infeccin para el hombre. La forma
ms frecuente de infeccin es por contacto con a g u a contaminada con orina, lo qu
e permite la entrada del microorganismo a travs de heridas en la piel o directame
nte por las membranas mucosas. Algunas personas tienen un mayor nesgo de infeccin
debido a su profesin (mineros, granjeros y agricultores, veterinarios, trabajado
res de piscifactoras, empleados de plantas de depuracin de aguas residuales) o a l
a prctica de ciertas actividades de recreo (por acampar en zonas prximas a cursos
de agua infectados o p o r baarse en los mismos). En EE.UU. se declaran entre 40
y 120 casos al ao, aunque muy probablemente el nmero sea superior (Farr. 1995). Pa
tologa y patogenia. Tras penetrar en el torrente circulatorio, las bacterias se d
iseminan por localizaciones muy diversas del cuerpo, incluyendo el SNC y los ojo

s. Como consecuencia de las lesiones en el endotelio de los tejidos infectados s

e produce isquemia local y hemorragias. Tambin pueden observarse daos hepatocelula
res y en los tbulos renales. El hgado puede tener un color amarillo-verdoso caract
erstico, aunque los cambios histolgicos detectados son inespecificos. incluyendo d
egeneracin (redondeamiento o "balonizacin"). cuerpos de inclusin acidlilos. regenera
cin y colestasis. pudiendo encontrarse las leptospiras en aproximadamente un 25%
de los casos (Dooley, 1976). El rion muestra nefritis crnica intersticial, necrosi
s de los tbulos proximales y cilindros granulares o hialinos, con leptospiras mtr
atubulares en un 65% de los casos (Arean, 1962). Tambin se han observado casos de
miocarditis, meningitis/encefalitis y miositis (Arean, 1962). Los mecanismos re
sponsables de los daos endoteliales. hepticos y renales son desconocidos, aunque p
odran tener una base inmunolgica. Clnica. Tpicamente, la infeccin por leptospiras se
manifiesta c o m o una enfermedad suave parecida a la gripe (forma anictrica); un
a minora de afectados sufre una forma ms grave de la enfermedad con ictericia, que
tiene u n a tasa de mortalidad del 5% al 10% (forma ictrica o enfermedad de Weil
). La leptospirosis es una enfermedad bifsica, que comienza tras un periodo de in
cubacin variable (entre 2 y 20 das), con la aparicin brusca de escalofros, fiebre, d
olor de cabeza, mialgias, dolor en la espalda y el abdomen, anorexia. nauseas y
vmitos. Durante esta fase, denominada fase bacterimica, tiene lugar una extensa di
seminacin de la bacteria por el cuerpo. La fase bacterimica dura entre cuatro y si
ete das y es seguida por un corto periodo (varios das) durante el que los sntomas r
emiten, tras el que viene la fase de respuesta inmunolgica caracterizada por la a
paricin de anticuerpos frente al microorganismo, meningitis, uvetis, sarpullido y
dao heptico y renal. La erupcin pretibial se ha asociado con la infeccin por el sero
var autumnalis (fiebre de Fort Bragg). En muchos casos, la fase inmunolgica es su
ave y dura entre uno y tres das solamente. Alrededor de la mitad de los pacientes
muestran sntomas clnicos de meningitis y pleocitosis en el lquido cefalonaqudeo dur
ante la segunda semana de la enfermedad. En el pequeo porcentaje de pacientes con
enfermedad de Weil, las dos fases se fusionan, teniendo los afectados fiebre el
evada persistente, ictericia y hemorragias, a lo que sigue fallo renal oligrico,
shock y miocarditis. (Arean. 1962; Edwards. 1960).
Tratamiento de las treponematosis
Las subespecies de T. pallidum y 7! carateum son uniformemente susceptibles a la
penicilina y otros antibiticos [i-lactmicos. El tratamiento de la sfilis primaria,
secundaria y de la sfilis latente temprana consiste en una nica inyeccin intramusc
ular de penicilina G-benzatina. La frambesia, la pinta y la sfilis endmica se trat
an con el mismo antibitico, aunque con una dosis ms baja (Engelkens, 1991). Los co
ntactos en el mbito familiar con pacientes afectados por estas tres ltimas enferme
dades se tratan de igual forma. En el caso de personas alrgicas a la penicilina,
se puede utilizar doxiciclina o tetracilina. Los macrlidos ya no estn recomendados
para el tratamiento, puesto que se ha observado que su eficacia es inferior al
90% (Schroeler, 1972). Para la sfilis latente tarda o sfilis de duracin desconocida
se administran dosis mltiples de penicilina G-benzatina. En el caso de la frambes
ia, la pinta o la sfilis endmica, la fase en la que se encuentra la enfermedad no
afecta al tratamiento (Engelkens. 1991). Para el tratamiento de la neuroslihs y l
a sfilis congnita se administran por via intravenosa dosis elevadas de penicilina
G en solucin acuosa. El CDC de Atlanta no recomienda cambio alguno en las pautas
de tratamiento establecidas en los pacientes con sida y sfilis concomitantes: sin
embargo, otros autores sugieren que estos pacientes deberan ser tratados con dos
is elevadas de penicilina, incluso para el tratamiento de la sfilis en fase prima
ria, dada la propensin que tienen los mismos para desarrollar neurosfilis (Tramonl
. 1995; Musher, 1991).
GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRNICA
Descripcin. Un cierto nmero de espiroquetas no caracterizadas (espiroquetas relaci
onadas con patologa oral [PROS]) y algunas especies del gnero Treponema (entre ell
as, como ms comunes. T denticola y T. socranskr) han sido aisladas cada vez con m
ayor frecuencia y en nmero elevado de las encas de los pacientes con gingivitis ul
cerativa y periodontitis crnica, en comparacin con lo que se observa en el caso de

individuos con las encas sanas (Riviere, 1991,1995,1996). Patogenia. No ha podid

o establecerse una relacin causa-efecto definitiva entre las espiroquetas y estas
enfermedades; sin embargo, su presencia en nmero significativo solamente en el t
ejido enfermo sugiere que estas bacterias pueden jugar un papel como agentes res
ponsables de la gingivitis/periodontitis Adems, las PROS han mostrado reactividad
cruzada con anticuerpos monoclonales frente a T. pallidum y. al igual que esta
especie, tienen la capacidad de invadir las encias y el tejido de la pared perit
oneal en ratones in vitro (Riviere, 1991,1996). Otras espiroquetas orales no pos
een estas caractersticas Diagnstico. Del mismo modo que las especies comensales de
l gnero Treponema que se encuentran en la zona genital, las especies orales de es
te

1136
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Diagnstico de laboratorio. Las leptospiras pueden aislarse a partir de LCR. sangr
e y tejidos al principio de la fase bacterimica (primeros 10 das), y de la orina d
urante la fase inmunolgica (segunda semana y hasta los 30 dias). Para el cultivo
es necesario un medio semislido (medio de Fletcher o medio de Ellmghausen, McCull
ough, Johnson, Harris [EMJH]). que se incuba en la oscuridad a 25C-30"C entre cua
tro y seis semanas. La orina debe ser alcalinizada si no va a ser procesada inme
diatamente. Las leptospiras crecen entre 1 cm y 3 cm por debajo de la superficie
del medio, y pueden producir una zona de crecimiento en forma de disco lineal.
Las muestras recogidas con periodicidad semanal de esa localizacin de los medios
de cultivo deben examinarse mediante microscopa de campo oscuro para detectar las
leptospiras con su movimiento giratorio y los extremos curvados. Los anticuerpo
s aglutinantes aparecen durante la primera semana de la enfermedad, alcanzan un
mximo entre la tercera y cuarta semana y pueden persistir durante aos. Los anticue
rpos pueden detectarse por medio de aglutinacin en tubo, microaglutinacin en porta
objetos, hemoaglutinacin o enzimoinmunoensayo (EIA), con antigenos bacterianos. L
a tcnica de la microaglutinacin utiliza bacterias vivas como suspensin antignica, em
plendose fundamentalmente en la investigacin bsica. La PCR se ha usado para detecta
r el ADN de las leptospiras en pacientes infectados (Vinetz, 1996). Recientement
e se ha utilizado con xito un test de EIA modificado (en forma de bastoncillo que
se sumerge en la muestra de suero) que detecta anticuerpos especficos frente a L
eptospira en situaciones en las que existe una infraestructura de laboratorio mi
nima (Yersin, 1999: Gussenhoven, 1997). Tratamiento. La torma grave de la enferm
edad necesita tratamiento por va intravenosa con penicilina G o ampicilina en sol
ucin acuosa, mientras que la forma menos grave puede tratarse por va oral con ampi
cilina. amoxicilma o doxicilina. La profilaxis con doxicilina suministra protecc
in a las personas que se encuentran en ambientes en los que hay riesgo elevado de
exposicin a las bacterias (Farr, 1995). L a vacunacin de los animales domsticos y
mascotas ha reducido el riesgo de infeccin a partir de estos animales en los indi
viduos pertenecientes a los grupos de riesgo, como veterinarios y granjeros. De
todas lormas, el riesgo no se elimina totalmente, ya que se han detectado casos
de infeccin en animales inmunizados a partir de los que se ha transmitido la inte
ccin a humanos (Feign. 1973).
nefritis (Washburn. 1995). La mortalidad antes del advenimiento de los antibitico
s oscilaba entre el 6% y el 10% (Washburn, 1995). Diagnstico de laboratorio. S mi
nus slo puede cultivarse en animales (ratones o cobayas) mediante inoculacin intra
peritoneal de los mismos. La presencia de los microorganismos puede ponerse de m
anifiesto mediante tincin de extensiones de los exudados procedentes de las lesio
nes o los ganglios linfticos, por el mtodo de Wright-Giemsa o mediante observacin e
n fresco bajo microscopa de campo oscuro. No existen mtodos serolgicos para el diag
nstico, aunque hasta un 50% de los pacientes pueden dar un falso positivo con los
mtodos no treponmicos para el diagnstico de la sfilis (Taber. 1979). Tratamiento. L
a penicilina G en solucin acuosa, administrada por va intravenosa, es el antibitic
o de eleccin. La tetraciclina es la alternativa en el caso de pacientes con alerg
ia a la penicilina.
ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS
Descripcin. Anaerobiospihllum succiniciproducens es una bacteria gramnegativa, es
piriforme, que tiene un grosor de entre 0,6 pm y 0,8 pm y entre 4 pm y 8 um de l
ongitud. Exhibe una movilidad semejante a la de un sacacorchos al penetrar en el
tapn y posee flagelos multitricos en ambos polos del soma bacteriano. Epidemiolo
ga. Esta bacteria anaerobia puede lormar parte de la microbiota comensal normal d

e gatos y perros sanos, habindose sugerido (aunque no se ha podido demostrar de f

orma definitiva) una asociacin entre la enfermedad en humanos y el contacto con e
stas mascotas (Goddard, 1998; Malnick, 1990). A. succiniciproducens se h a asoci
ado con una enfermedad diarreica en pacientes normales y con septicemia en indiv
iduos con u n a enfermedad de base que predisponga. Se piensa que el microorgani
smo penetra en el torrente circulatorio a partir del tracto gastrointestinal de
estas personas (Tee. 1998; McNeil. 1987). La incidencia de la infeccin es ba|a. a
unque se ha ido incrementando en los ltimos aos, debido probablemente a la mejora
de las tcnicas de deteccin mediante cultivo (Goddard, 1998). Clnica. Los pacientes
con gastroenteritis sufren dolor abdominal, vmitos, y diarrea durante un tiempo q
ue oscila entre tres y siete das; aquellos que no tienen enlermedad subyacente al
guna se recuperan sin mayor problema (Malnick. 1990). Los casos de septicemia se
dan entre individuos con patologas subyacentes, tales como alcoholismo, ateroesc
lerosis. tumores, diabetes mellitus y gingivitis (Goddard, 1998). Hasta un terci
o de los afectados por la septicemia fallecen. Diagnstico de laboratorio. A. succ
iniciproducens crece bien en los sistemas automatizados para hemocultivo (Tee, 1
998). Tras el subcultivo en agar chocolate o agar sangre aparecen las colonias a
l cabo de 2-3 das, que tienen un aspecto hmedo y miden entre 1 m my2m m de dimetro.
Algunas caractersticas bioqumicas de utilidad para la identificacin son la ausenci
a de catalasa, indol y oxidasa, la produccin de cido succinico y cido actico a parti
r de la glucosa (puesta de manifiesto mediante cromatografa de gas-liquido) y la
ausencia de crecimiento a 25'C o 42"C. Existe un medio selectivo para esta bacte
ria desarrollado por Malnick y sus colaboradores (Malnick, 1990). Tratamiento. D
ebido a la naturaleza poco comn de esta infeccin, an no se ha establecido una terap
ia ptima para el tratamiento de la septicemia. In vilro. la mayor parte de los ai
slamientos estudiados son sensibles a la carbenicilina, cefoxitina. cloranfenico
l y metronidazol y resistentes a la vancomicina y clindamicina; sin embargo, los
ensayos han tenido carcter limitado y no han sido estandarizados (Sales, 1982; M
cNeil, 1987).
FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA
Descripcin. Spihllum minus es una bacteria gramnegativa, con las vueltas de espir
a m u y juntas, que tienen un grosor de 0,5 um y entre 2 pm y 5 pm de longitud,
y que posee penachos de flagelos bipolares. Epidemiologa. L a infeccin por S. minu
s en el hombre causa una fiebre recurrente denominada sodoku. muchos de cuyos ca
sos se han descnlo en Japn, aunque tambin se han detectado en otras partes del mun
do, con una distribucin muy amplia. Esta bacteria forma parte de la microbiota de
l tracto respiratorio de las ratas y se transmite por una mordedura. La ingestin
no parece ser una causa de infeccin en el ser humano La enfermedad es muy rara en
EE.UU. Las personas que trabajan en los laboratonos de investigacin son uno de l
os grupos de riesgo para contraer la infeccin (Anderson. 1983). Patogenia y patol
oga. La patogenia de S. minus es poco conocida L a diseminacin de las bacterias ti
ene lugar muy poco tiempo despus de la inoculacin. Las pocas autopsias realizadas
de los casos mortales han descrito necrosis epitelial y un infiltrado mononuclea
r en la dermis en el lugar de la mordedura original, un infiltrado mononuclear p
erivascular en la dermis en la zona de la erupcin cutnea, hiperplasia de los gangl
ios linfticos y necrosis en el hgado, bazo, rion, miocardio y meninges (Washburn. 1
995). Clnica. La herida de la mordedura cicatriza micialmente. pero entre una y c
uatro semanas ms tarde aparece una lesin indurada, que puede ulcerarse eventualmen
te, en el mismo lugar. El paciente sufre perodos febriles recurrentes separados p
or fases no febriles que duran entre tres y siete das. La fiebre puede estar acom
paada de mialgia. dolor de cabeza y vmitos. La mitad de los pacientes tienen una e
rupcin macular que puede formar grandes placas (Taber, 1979). Los sntomas desapare
cen, generalmente, en un tiempo que oscila entre tres y ocho semanas, aunque pue
den producirse recadas y complicaciones como endocarditis, meningitis, micocardit
is y
ESPIROQUETOSIS INTESTINAL
Descripcin. Se han encontrado dos especies de espiroquetas en el colon de los ser
es humanos: Serpulma pilosicoliy Brachyspira aalborgi. Estos microorganismos son

gramnegativos, con unas dimensiones que oscilan entre 0,2 pm y 0.4 pm (dimetro)
y 4 pm y 8 pm (longitud). Cerca de cada polo de las bacterias, en posicin subterm
inal. hay entre 4 y 6 flagelos. Epidemiologa y clnica. S. pilosicoli provoca la es
piroquetosis intestinal porcina, una enlermedad de tipo diarreico que aleda a lo
s cerdos jvenes, y tambin se han recuperado cepas relacionadas con esta especie a
partir de

CAPTULO 52

INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

1137
perros y otros animales (Trott, 1996). No se sabe si los animales actan como rese
rvnos en el caso de la infeccin en humanos. 8. aalborgi est peor caracterizada. El
gnero contiene esta nica especie, que fue denominada tras su aislamiento del colon
de un paciente humano (Hovmd-Hougen. 1982). La asociacin de las espiroquetas int
estinales con la infeccin no est totalmente establecida, ya que las bacterias han
sido identificadas en individuos tanto sintomticos como asintomticos. Parece que e
xiste una mayor prevalencia en varones homosexuales que en otros grupos de pobla
cin (Teglbjaerg, 1990). Los sntomas atribuidos a la espiroquetosis intestinal son
diarrea, dolor abdominal y sangrado y descargas rectales (Teglb|aerg, 1990). Ade
ms. S. pilosicolise ha aislado de la sangre de pacientes crticos, aunque el signif
icado de este hallazgo no est claro (Trott, 1997). Patologa y patogenia. Las espir
oquetas se pueden observar fcilmente en los especmenes obtenidos mediante biopsia,
ya que torman una franja de color azul oscuro en la superficie de las clulas epi
teliales del colon, sin afectar a las clulas en copa o globosas. Los mtodos de imp
regnacin argntica tambin permiten una perfecta vsualizacin de los microorganismos. La
s clulas epiteliales aparecen normales y no se detecta un incremento de la inflam
acin en la lmina propia. La microscopa electrnica revela que las bacterias se adhier
en a la superficie del extremo superior de las clulas epiteliales del colon, qued
ando orientadas perpendicularmente hacia el lumen intestinal (Teglbjaerg, 1990).
Se ha demostrado la invasin de los macrfagos epiteliales y de la mucosa en indivi
duos tanto sintomticos como asintomticos (Teglbjaerg, 1990). No se ha establecido
la patogenia. Diagnstico de laboratorio. Las espiroquetas pueden detectarse en la
s heces mediante microscopa de campo oscuro y cultivarse a partir de las muestras
de heces o de tejidos (obtenidas por biopsia) en agar tripticasa de soja con un
5%-10% de sangre de caballo o de ternero. La adicin de espectinomicina y polimix
ina B confieren carcter selectivo al medio (Teglbjaerg, 1990). En los medios incu
bados anaerbicamente las colonias son puntiformes y dbilmente [{-hemoliticas, y ap
arecen en un perodo de tiempo que va desde los tres das hasta las cuatro semanas,
dependiendo de la cepa. Tratamiento. Aunque se han publicado los datos relativos
a la sensibilidad a los antimicrobianos para la especie tipo de S. pilosicoli,
no se han descrito ensayos estandarizados para un nmero elevado de aislamientos (
Trott, 1996). Los pacientes con sntomas de padecer espiroquetosis intestinal resp
onden al tratamiento con metronidazol (Teglbjaerg, 1990).
dad clnica diferente, localizando su origen en u n a garrapata intimamente empare
ntada, /. dammini, que ahora se denomina /. scapularis (Steere, 1978). En 1982,
Burgdorfer y sus colaboradores aislaron la espiroqueta que lleva su nombre (Borr
elia burgdorferi) a partir de Ixodes dammini. recogida en Shelter Island (estado
de Nueva York), asocindola con la enfermedad de L y m e en base a las evidencias
de tipo inmunolgico (Burgdorfer. 1986: Steere. 1983). En el periodo siguiente, e
ste microorganismo fue aislado a partir de sangre (Steere, 1983: Benach, 1983: B
erger, 1994; Nadelman, 1990), piel (Berger, 1992), liquido sinovial (Schmidli. 1
998), iris (Preac-Mursic, 1993), miocardio (Stanek, 1990) y LCR (Steere. 1983; S
chmidli. 1998 de pacientes detectndose respuesta inmune mediada por anticuerpos ta
nto del tipo igM como IgG. Hoy da. la enfermedad de Lyme esla reconocida como la
infeccin transmitida por vector ms frecuente en EE.UU.. siendo detectados ms de 16.
000 casos de la misma en el ao 1996 (CDC, 1997).
Epidemiologa y patogenia
El agente causal de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi. h a sido caract
erizado minuciosamente y subdividido desde el punto de vista filogentico en difer
entes genoespecies. Actualmente, tres de estas especies estn asociadas a la enfer

medad de Lyme: 8. burgdorferi en sentido estncto (de distnbucin mundial). 8. gari

niiy B. atzelii (ambas asociadas con la infeccin en el continente euroasitico). Ca
da una de estas especies se ha relacionado, asimismo, con determinadas manifesta
ciones clnicas de la enfermedad de L y m e (vase al final de esta seccin bajo el epg
rafe Manifestaciones clnicas), aunque no est claro si estas diferencias se deben a
las propias espiroquetas o a otros factores (Berglund. 1995; Postic. 1996; van
Dam. 1993) L a presencia de 8. burgdorfenen Amrica del Norte est documentada, al m
enos en los ltimos 100 aos, mediante la tcnica de la PCR aplicada al estudio de esp
ecmenes de museo de garrapatas del gnero Ixodes y de ratones de pala blanca (Persi
ng. 1990: Marshall. 1994), Algunos estudios que han puesto de manifiesto la hete
rogeneidad gentica de los aislamientos de 8. burgdorfenen EE.UU. (Mathiesen. 1997
), apuntan tambin hacia la presencia de este microorganismo en la zona desde muy
antiguo. Se han aislado espiroquetas identificadas c o m o 8. burgdorferi a part
ir de roedores y garrapatas en muchas reas no endmicas de EE.UU. Estos aislamiento
s muestran, a menudo, un nivel sustancial de heterogeneidad gentica, y algunos de
ellos parecen ser genoespecies nicas de 8. burgdorferi sensu lato. El ciclo enzot
ico vital de Borrelia va en paralelo con el ciclo vital del insecto vector, que
son los miembros del compleio Ixodes ricinus. Las garrapatas adquieren las espir
oquetas tpicamente durante la fase larvaria de desarrollo, mientras se alimentan
de un animal infectado que acta como reservorio de la bacteria. Las espiroquetas
se encuentran en el intestino medio de la garrapata y son transmitidas a travs de
la saliva de sta mientras se alimenta en las sucesivas fases de desarrollo, esta
ndo implicada la lase de ninfa en la mayor parte de casos de transmisin a humanos
a partir de las garrapatas. En el este, medio oeste y sur de EE.UU.. 8. burgdor
feri es transmitida al hombre principalmente por la mordedura de la garrapata de
l ciervo, que es responsable de la mayor parte de los casos que se detectan entr
e mayo y agosto. Ixodes paciticus es el insecto vector a lo largo de la costa oe
ste de EE.UU. (Dennis, 1998). Otras garrapatas pertenecientes al complejo /. ric
inus son las que transmiten la bacteria en Europa, mientras que en China /. pers
ulcatus es la garrapata que est implicada en el proceso (Anderson, 1993). Adems de
la transmisin por la mordedura de la garrapata, las espiroquetas adquiridas dura
nte el embarazo pueden atravesar la placenta causando, aparentemente, infeccin co
ngnita (MacDonald, 1989). En la naturaleza, la infeccin por 8. burgdorferi se mant
iene por transmisin honzontal desde las ninfas infectadas de la garrapata hasta e
l vertebrado hospedador. Aunque el reservorio animal primario de 8 burgdorfen en
Norteamrica es el ratn de patas blancas, Peromyscus leucopus, m u c h o s otros m
amferos y pjaros pueden albergar, y en consecuencia transmitir estas espiroquetas
mediante una garrapata vector (Anderson, 1993: Gern, 1998) Diferentes animales,
incluyendo varias especies de pjaros, mamferos y reptiles, pueden actuar c o m o h
uspedes para las especies de Ixodes. Muchas de estas especies anmales no son compe
tentes para servir como reservorio de las espiroquetas del gnero Borrelia: sin em
bargo, un aumento en la poblacin de aqullas puede ocasionar, subsiguientemente, un
aumento en la prevalencia de las garrapatas, lo que indirectamente puede ocasio
nar un incremento en la incidencia en la transmisin de la enfermedad. Se cree que
este ltimo escenario explicara, al
DIAGNSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES POR BORRELIAS
Las especies del gnero Borrelia son bacterias helicoidales, microaerfilas, con una
s dimensiones que oscilan entre 0,2 um y 0,5 um (dimetro) y 5 um y 25 um (longitu
d), y que presentan entre 4 y 30 vueltas de hlice. Poseen una envoltura externa o
membrana que rodea el cilindro protoplsmico en espiral, formado por la capa de p
eptidoglucano y la membrana plasmtica que engloba al contenido citoplasmtico de la
clula. Entre 7 y 22 filamentos axiales (flagelos periplsmicos) son responsables d
e la movilidad de estas bacterias. Estos microorganismos se multiplican por esci
sin binaria y necesitan cidos grasos de cadena larga para poder crecer. En esta se
ccin se describe a Borrelia burgdorferi, el agente etiolgico de la enfermedad de L
yme, asi como otras especies de Borrelia relacionadas con la fiebre recurrente.
Enfermedad de Lyme
La enfermedad de Lyme es una enfermedad inflamatoria multisistmica que se transmi

te por las garrapatas y que puede aparecer a cualquier edad en ambos sexos (Stee
re, 1997,1989). Su manifestacin clnica ms distintiva es una lesin expansiva de la pi
el, el eritema migrans (EM), que puede ser seguido, semanas o meses ms tarde, por
la aparicin de problemas neurolgicos, cardacos o en las articulaciones. Las lesion
es del tipo EM lueron ya descritas en Europa en 1910 por Arvid Afzelius (Afzeliu
s, 1910). que asoci su aparicin con la mordedura de la garrapata Ixodes reduvius.
La mordedura de esta garrapata (o la de la especie relacionada, /. ricinus) fue
asociada ms tarde con la meningopolineuritis transmitida por garrapatas (sndrome d
e Garin-Bujadoux y Bannwarth). Sin embargo, no fue hasta mediados de la dcada de
los 70 cuando Steere y sus colaboradores identificaron la enfermedad como una en
ti-

1138
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
menos en parle, el aumento de casos registrados de la enfermedad de L y m e en e
l nordeste de EE.UU., donde el ciervo de cola blanca parece ser el husped primari
o de /. scapularis. Durante los ltimos aos se han hecho avances significativos en
el conocimiento del ciclo de transmisin de la espiroqueta, que ha sido reconocida
como un importante problema de salud pblica. Aunque muchos aspectos de la enlerm
edad son todava confusos, se han puesto de manifiesto aspectos clave sobre su pat
ogenicidad. Tal como se ha descrito en recientes revisiones (Sigal, 1997a, 1997;
Hu, 1997b; Garca-Moneo, 1997), la patogenia de la enfermedad de L y m e podra est
ar relacionada tanto con los efectos directos causados por el microorganismo com
o con efectos indirectos derivados de la respuesta del sistema inmunitario del h
ospedador. Las bacterias son inoculadas en la dermis por la mordedura de la garr
apata y se diseminan hematgenamente a continuacin, unindose a diferentes tipos de cl
ulas a travs de distintas clases de receptores de la superficie celular. Aunque t
odava quedan muchos aspectos por elucidar, parece que durante la fase inicial de
la infeccin existe tanto una respuesta ineficaz de los fagocitos como una respues
ta inmunoblstica en la que estn implicados componentes humorales y celulares (Hu,
1997). La liberacin de citocinas durante esta respuesta puede ser responsable, al
menos en parte, de algunas de las manifestaciones clnicas de la forma aguda de l
a enlermedad de Lyme. Tambin es posible que se activen respuestas autoinmunes que
podran dar lugar a la forma crnica de la enfermedad, que es menos frecuente y no
responde al tratamiento con antibiticos.
miento con antibiticos (Steere, 1987,1995). Las manifestaciones neurolgicas crnicas
como la encefalopata, la polineuropata o la leucoencefalitis pueden aparecer al c
abo de meses o incluso aos despus de la infeccin inicial (Logigian, 1990). La acrod
ermatitis crnica atrfica (AC), una lesin cutnea atrfica que contiene espiroquetas de
. burgdorteri (Steere. 1989), ha sido detectada en pacientes al cabo de 10 aos de
spus del inicio de la enfermedad. Al igual que el linfocitoma por borrelia anteri
ormente comentado, la AC parece afectar exclusivamente a pacientes europeos (Asbr
ink, 1986). Varios autores han indicado la existencia de diferencias geogrficas e
n lo que respecta al espectro clnico tpico de la borreliosis de L y m e (Nadelman,
1998). En concreto, los sntomas sistmicos agudos, as como la evidencia tarda de art
ritis, se observan con mayor frecuencia en los casos de Norteamrica. Los sntomas n
eurolgicos y las lesiones cutneas tardas descritas en el prrafo precedente se detect
an ms frecuentemente en pacientes europeos. Estas diferencias en las manifestacio
nes clnicas se han correlacionado con las diferentes especies de Borrelia que tie
nen prevalencia en los continentes de Amrica del Norte y Eurasia (van Dam. 1993;
Balmelli, 1995). Sin embargo, la localizacin anatmica de la mordedura de la garrap
ata puede tener tambin consecuencias en la afectacin de rganos especficos; as, por ej
emplo, la mordedura en zonas alrededor de la cabeza y del cuello se asocia frecu
entemente con enfermedad a nivel del SNC (Berglund, 1995). Una complicacin adicio
nal del cuadro clnico est representada por los recientes informes sobre coinfeccin
en los pacientes con borreliosis de L y m e por los agentes etiolgicos de la ehri
ichosis granuloclica humana y la babesiosis (Telford, 1996: Tang, 1997: Krause, 19
96: Nadelman, 1997). Estas enfermedades comparten el mismo vector, y la coinfecc
in de los pacientes en zonas donde las tres son endmicas puede dar lugar tanto a m
anifestaciones clnicas atpicas como a una enfermedad potencialmente ms grave. El co
nocimiento de una posible reinfeccin es necesario a la hora de establecer el prot
ocolo de laboratorio ms apropiado, as como para el establecimiento de un tratamien
to antimicrobiano eficaz en tales casos.
Manifestaciones

clnicas
Mtodos serolgicos. Los avances en el diagnstico de laboratorio de la enfermedad de
L y m e han retrasado la percepcin del pblico sobre la gravedad y prevalencia de e
sta enfermedad. Utilizados inicialmente para confirmar tan slo una opinin clnica, e
l aumento en la utilizacin, cada vez ms generalizada, de los mtodos disponibles com
ercalmente para las pruebas serolgicas de la enfermedad de Lyme ha conducido, cuan
do menos, a una situacin de confusin en el diagnstico (Luger, 1990). La mayor parte
de la incertidumbre diagSin tratamiento, las lesiones en la piel desaparecen en
tres o cuatro semanas nstica que rodea a la enfermedad de Lyme es debida a que l
os sntomas son inespecficos y, al margen de la lesin caracterstica de la piel, el er
itema (con un rango de tiempo que puede ir desde un da hasta 14 meses), aunque mi
grans (que aparece en muchos, pero no en todos, de los pacientes con la pueden a
parecer subsiguientemente daos en uno o en varios sistemas princienfermedad de Ly
me), hay muy pocas otras caractersticas con valor patognopales de rganos. En el 10
% al 20% de pacientes no tratados en EE.UU., puemnico. En la dcada de 1980, las tcn
icas serolgicas para B. burgdorteri se de producirse una afectacin neurolgica aguda
(Nadelman, 1998), que normalm e n t e se manifiesta dentro de las primeras cuat
ro a seis semanas del comienzo utilizaron primariamente en pacientes procedentes
de reas fuertemente endmicas del noreste de EE.UU. Sin embargo, la proliferacin de
tcnicas serolde la enfermedad. La parlisis de Bell (sptimo nervio) es la manifestac
in neugicas disponibles en el mercado, junto con un aumento en la sensibilidad y
rolgica ms comn; otras manifestaciones que tambin pueden producirse son conocimiento
del pblico sobre la enfermedad, ha conducido a un notable increlas neuropatas per
ifricas, la meningitis linfoctica o la meningoencefalitis (Bermento en la frecuenc
ia de utilizacin de estos ensayos. En muchos casos, las ger, 1997; Halpenn. 1998)
. La encefalomielilis se observa mucho menos fretcnicas de diagnstico serolgico se
aplican como consecuencia de que detercuentemente, pero puede tener graves secue
las (Halpenn. 1998). La mayor parminados pacientes con ciertos sntomas, como cans
ancio inespecfco y moleste de personas con manifestaciones de tipo neurolgico muest
ran pleocitosis tias de tipo neurolgico y/o reumatolgico, exigen un diagnstico conc
reto de linfoctica (alrededor de 100 clulas por mm) y una elevada concentracin de s
us dolencias. Dado que esos sntomas pueden ser debidos a causas m u y protenas en
el LCR (Tumani, 1995; Pohl, 1987). Hasta en un 8% de los casos diversas, la prev
alencia global de la enlermedad de L y m e en este grupo de perpuede haber afect
acin cardiaca aguda (Steere, 1989), que se manifiesta en sonas es, a menudo, m e
n o r que la tasa de falsos positivos que producen estos forma de diversos grado
s de bloqueo atriovenlricular, miocarditis o pericarditis. ensayos, lo que condu
ce a un nmero absoluto ms elevado de resultados falTambin se ha observado una manif
estacin cutnea adicional de la enfermesos positivos en relacin con los verdaderos p
ositivos lAmerican Collage ol dad, el linfociloma por borrelia, pero slo en pacie
ntes en Europa. Physicians, 1997; Tugwell, 1997). Por otro lado, muchos de los mt
odos dispoLa fase crnica de la enfermedad de Lyme comienza a partir del momento n
ibles en la actualidad no son capaces de detectar la respuesta humoral m u y en
que aparece la respuesta inmunolgica en el husped y comienza a distemprana frente
a B. burgdorteri (Agero-Rosenfeld. 1993: Dressler, 1993); por minuir el nmero de e
spiroquetas. Los pacientes pueden entrar en una fase lo tanto, el diagnstico de u
n paciente sin eritema migrans sospechoso de padede latencia; algunos de ellos p
ueden tener, ms tarde, manifestaciones dercer enfermedad de L y m e en una fase m
uy temprana puede llegar a ser difcil. matolgicas, reumticas, cardiacas o neurolgica
s, mientras que otros pueden permanecer asintomticos. Alrededor de la mitad de pe
rsonas que no Como sucede con muchos mtodos serolgicos para el diagnstico de recibe
n tratamiento en EE.UU. pueden experimentar episodios de artritis infecciones ba
cterianas, los resultados falsos positivos para anticuerpos frendurante dos o ms
aos, y en el 10% de los casos la artritis se vuelve crnite a 8. burgdorteri pueden
deberse a anticuerpos frente a otras bacterias, tales ca (Steere, 1987); en muc
hos casos, la artritis parece responder al tratacomo las espiroquetas que se enc
uentran formando parte de la microbiota or3

El primer y ms fcilmente reconocible sntoma de la enfermedad de Lyme es el eritema

migrans (EM), que se manifiesta en un porcentaje elevado (entre el 63% y el 90%)
de los individuos afectados, entre dos das y cuatro semanas despus de la mordedur
a de la garrapata (Nadelman, 1995; Gerber, 1996). En el lugar de la mordedura ap
arece una mcula o ppula rojiza, indolora, que se extiende en crculo, dando lugar a
una tpica lesin plana con un dimetro que puede oscilar entre 3 y 70 cm (el tamao med
io es de 15 cm). con el borde de color rojo brillante y la parte central ms clara
. El aspecto de la lesin puede, sin embargo, variar; un eritema confluente o con
aspecto de una diana suele ser bastante frecuente, y tambin pueden aparecer vescul
as en el centro, as como necrosis. La diseminacin hematgena del microorganismo tien
e lugar muy pronto, produciendo fiebre, cansancio, dolor de cabeza, rigidez en e
l cuello, malestar, dolor musculoesqueltico migratorio, lesiones del tipo EM secu
ndarias y linfadenopata generalizada, entre otros sntomas (Nadelman, 1996; Steere,
1997,1987; Berger, 1997).
Diagnstico de laboratorio

CAPTULO 52

INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

1139
mal de la boca, as como Treponema pallidum y Leptospira. que exhiben reactividad
cruzada. Adems, los pacientes con trastornos del tejido conectivo, como artritis
reumatoide, lupus eritematoso sistmico y espondiloartrtis pueden dar tambin un resu
ltado serolgico falsamente positivo (Saulsbury, 1990; Magnarelli, 1990; Lovece, 1
991; Fawcett, 1992). Los falsos negalivos pueden presentarse al principio de la
infeccin, antes de que se produzcan anticuerpos en cantidades detectables (que pu
eden tardar hasta dos meses en aparecer), o en pacientes con inmunosupresin. A pe
sar de estas limitaciones, es un error asumir que las pruebas de tipo serolgico e
xistentes para el diagnstico de la enfermedad de L y m e sean completamente irrel
evantes. Si los pacientes que estn siendo analizados son seleccionados cuidadosam
ente en funcin de los sntomas que presentan (siempre que sean compatibles con la e
nfermedad de Lyme), y se tienen en cuenta aspectos y consideraciones de ndole epi
demiolgica para realizar el diagnstico, el valor predictvo positivo de los mtodos se
rolgicos puede ser bastante aceptable, especialmente si los resultados positivos
de la serologa se confirman mediante la tcnica del Western blol (WB; inmunotransfe
rencia) (Tugwell. 1997). Muchos de los problemas actuales en relacin con las prue
bas serolgicas para la enfermedad de Lyme se deben, probablemente, a las diferenc
ias entre laboratorios en lo que respecta a su capacidad para ejecutar estos ens
ayos con precisin (Bakken. 1997.1992). Ello puede estar relacionado con diversos
factores, incluyendo los tipos de preparaciones antignicas empleadas como sustrat
o y las diferencias en los mtodos utilizados para la preparacin de antgenos y otros
procedimientos experimentales, as c o m o en los criterios de interpretacin Actua
lmente, varias instituciones (Centers lor Disease Control and Prevention, Associ
ation of State and Territorial Public Health Laboratory Directors. United States
Food and Drug Administration [FDAj) recomiendan que se analicen las muestras de
suero de pacientes con sntomas de la enfermedad de L y m e medante un procedimien
to en dos pasos (CDC, 1995). Este procedimiento debera comprender en primer lugar
un test de escrutinio sensible para la deteccin de anticuerpos totales o especfic
os de clase frente a B. burgdorferi, lo que puede llevarse a cabo tanto por mmun
ofluorescencia (IFA) como por enzimoinmunoensayo (EIA). Aquellas muestras dudosa
s o positivas en el rastreo inicial deben analizarse complementariamente mediant
e inmunotransferencia (WB). utilizando una cepa de B. burgdorferi con bajo nmero
de pases en laboratorio (p. ej.. la B31) que exprese cantidades adecuadas de pro
tenas con valor diagnstico (enumeradas en los prrafos siguientes). L a inmunotransf
erencia debe llevarse a cabo tanto para IgG como para IgM a partir de muestras d
e suero de los casos sospechosos que se presenten dentro de las primeras cuatro
semanas desde el inicio de la enfermedad. En el caso de pacientes que se encuent
ren ms all de ese tiempo, slo debe realizarse la nmunotransferencia para IgG. puesto
que el patrn de bandas reactivas frente a IgM que se detecta despus de las primer
as cuatro semanas del comienzo de la enfermedad es menos fiable. En el caso de p
acientes con sntomas de la enfermedad de Lyme en fase temprana y que han dado res
ultados negativos en el anlisis inicial, se recomienda realizar las pruebas serolg
icas a partir de una muestra de suero tomada durante la fase de convalecencia, e
ntre dos y cuatro semanas despus de obtenerse la primera muestra. Los critenos ut
ilizados para interpretar los patrones de inmunorreactividad frente a IgM obteni
dos mediante nmunotransferencia (WB) son los propuestos por Engstrom y sus colabo
radores. En este contexto, un resultado positivo de existencia de enfermedad de
L y m e implica que al m e n o s dos de las siguientes bandas polipeptdicas, reac
tivas frente a las IgM del husped, han de ser delectadas: antgenos de 24 (OspC). 3
9 y 41 (flagelma) kilodaltons (kDa) (Engstrom, 1995). En el caso de los patrones
de inmunorreactividad frente a IgG, los criterios empleados para la interpretac
in han sido propuestos por Dressler y sus colaboradores. En este caso, un transie

ndo es positivo cuando en el mismo se detectan cinco de las siguientes bandas co

rrespondientes a antigenos de 18.21 (OspC), 28.30.39,41 (flagelma), 45.58.66 y 9
3 kDa (Dressler, 1993). La existencia de sntomas clnicos que sugieren una posible
enfermedad de L y m e en pacientes en los que no existe una respuesta humoral de
tectable frente a B. burgdorferi (la denominada enfermedad de L y m e seronegati
va) representa una situacin problemtica. En algunos pacientes seronegativos con snt
omas crnicos es posible demostrar la presencia de una respuesta blastognica especi
fica por clulas T frente a B. burgdorferi. y este trastorno ha sido atribuido a l
a erradicacin incompleta de las espiroquetas por el tratamiento antibitico (Dattwy
ler, 1989). Sin embargo, en un estudio prospectivo
con pacientes afectados por la borreliosis de Lyme, con historiales de un pronto
tratamiento bien caracterizado, no se apreciaron diferencias en el estado serolg
ico a largo plazo entre los pacientes en los que se supona que haban sido tratados
adecuadamente de sus sntomas tempranos y los que no (Plorer, 1993). Otros autore
s han observado que la seroconversion no se ve afectada por la eleccin del antibit
ico utilizado. La ausencia de seropositividad en estos casos puede reflejar dife
rencias en la respuesta inmunolgica de ios pacientes individuales, puestas de rel
ieve por la composicin antigenica empleada en los ensayos serolgicos comnmente util
izados (Agero-Ftosenfeid. 1993; Ledue. 1996). La liberacin y deteccin de anticuerpo
s especficos frente a B. burgdorferi a partir de inmunocomplejos obtenidos del su
ero de pacientes con enfermedad de L y m e seronegativos demuestra que el secues
tro de los anticuerpos especficos en algunos pacientes infectados puede contribui
r a la ausencia de anticuerpos detectables frente a la bacteria (Schutzer, 1990)
. Finalmente, la ausencia de una respuesta humoral especfica frente a S. burgdorf
eri en algunos pacientes con aparente enfermedad de L y m e puede deberse a un d
iagnstico equivocado de otras enfermedades (algunas de las cuales tambin pueden se
r transmitidas por las garrapatas) que tengan una forma de presentacin similar (P
ersing. 1995.1992: Bakken. 1994). El diagnstico serolgico de la enfermedad de Lyme
se ha complicado en los ltimos aos debido a la introduccin de la vacuna para la mi
sma. Las vacunas aprobadas en la actualidad, y las que se encuentran en lases av
anzadas de desarrollo, se basan en la proteina A (OspA) de la membrana externa d
e B. burgdorferi obtenida mediante tcnicas de ADN recombinante Tras la vacunacin,
el aumento en el titulo de anticuerpos frente a la OspA es responsable de la ser
opositvidad que se detecta mediante los mtodos convencionales basados en la tcnica
de ELISA (Zhang, 1997), Aunque la interpretacin de los resultados de la inmunotra
nsferencia (WB) puede servir de ayuda para distinguir entre infeccin verdadera y
una respuesta inmunolgica inducida por la vacunacin (Gauthier. 1999). la variabili
dad de estos ensayos, asi como su coste, son argumentos en contra de su utilizac
in como mtodos de escrutinio o rastreo primarios (Zhang, 1997: Golightly, 1997). E
sto significa que los inmunoensayos de primera instancia recomendados habitualme
nte para el rastreo de la enfermedad de Lyme deben de ser cambiados. Por ejemplo
, pueden reemplazarse con pruebas basadas en cepas de Borrelia que carecen de la
protena OspA (Zhang, 1997) Alternativamente, se podran desarrollar enzimonmunoensa
yos con protenas recombinantes con el fin de poder detectar las variaciones de la
s respuestas inmunolgicas entre los individuos vacunados y los que han sufrido un
a infeccin natural. Cultivo de B. burgdorferi. La mejoras introducidas en los med
ios artificiales para el cultivo de B. burgdorferi ofrecen actualmente la posibi
lidad de detectar directamente a este microorganismo. Ahora puede recomendarse e
l cultivo en el medio Barber-Stoenner-Kelly (BSK) (Barbour. 1984) c o m o mtodo h
abitual para el aislamiento a partir de muestras de piel de pacientes con lesion
es cutneas compatibles con el eritema migrans, ya que rinde una tasa de aislamien
to superior al 80% (Berger. 1992). Las lesiones cutneas no tienen, a menudo, el a
specto caracterstico denominado "ojo de toro", ya que pueden ser alipicas o encon
trarse en las etapas iniciales de su evolucin. Diversos estudios han mostrado que
una mayora significativa de pacientes en areas endmicas que presentan un eritema
migrans definido dan positivo en los cultivos si la muestra es obtenida antes de
que haya comenzado a administrarse el tratamiento con antibiticos (Berger, 1992)
. En la Clnica Mayo. B. burgdorlenna sido recuperada en muchas ocasiones mediante
cultivo a partir de las lesiones del eritema migrans. asi como de un paciente e

stadounidense con acrodermatitis crnica atrofica (AC), que m u y proablemente se en

contraba infectado haca ms de diez aos. Estas observaciones han sido confirmadas po
r otros autores (Asbrink. 1985). El hemocultivo o el cultivo a partir de LCR y lq
uido sinovial dan resultados positivos con m e n o r frecuencia, aunque pueden s
er ocasionalmente alternativas tiles (Schmidi. 1988; Karlsson. 1990: Wormser. 1998
; Benach. 1983). Reaccin en cadena de la polimerasa. Las nuevas tecnologas diagnos
ticas, c o m o la PCR, tienen tambin utilidad para detectar directamente el ADN e
specfico de B. burgdorferi en las muestras clnicas. Algunos estudios han puesto de
maniliesto que la PCR es la tcnica ms sensible y especifica para la deteccin de B.
burgdorferi en muestras de lquido sinovial d e pacientes c o n artritis de L y m
e (Nocton. 1994). En un estudio retrospectivo ciego con cerca de 150 pacientes
aquejados de artritis, la PCR tuvo una sensibilidad del 9 6 %yu n a especificida
d del 100% en la deteccin de B. burgdorferi en pacientes no trata-

1140
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
dos (Nocton, 1994). La m a y o r parte de enfermos que recibieron tratamiento an
tibitico con las pautas recomendadas dieron resultados negativos con la tcnica de
la PCR y sus sntomas desaparecieron, lo que sugiere que dicha tcnica puede tener u
tilidad para monitorzar la eficacia de la terapia y predecir el resultado de la m
isma. El estudio de las muestras de LCR obtenidas de pacientes con sntomas neurolg
icos ha revelado que el comportamiento de la PCR en el diagnstico de la enfermeda
d de L y m e puede variar; la sensibilidad ha oscilado entre valores que van cas
i desde el 0 % hasta el 100%, dependiendo de la metodologa y del paciente selecci
onado (Schmidt. 1997). Sin embargo, puesto que el cultivo a partir del LCR casi
siempre es negativo, un resultado positivo por PCR se considera, generalmente, u
n indicador bastante preciso de la existencia de una infeccin activa (Luft, 1992)
. Adems, teniendo en cuenta que puede haber una relacin inversa entre un resultado
positivo mediante PCR y la produccin intratecal de anticuerpos (Keller, 1992), u
na prueba de PCR negativa junto con la ausencia de esos anticuerpos puede ser de
utilidad a la hora de excluir la posibilidad de enfermedad de L y m e a nivel d
el SNC en la mayora de los casos. Otros estudios han demostrado que la PCR ofrece
una sensibilidad superior a la que posee la tcnica de aislamiento por cultivo a
partir de muestras de piel obtenidas por biopsia (Schwartz, 1992; Brettschneider
, 1998). Adems, esta tcnica ha sido empleada para poner de manifiesto la presencia
de material genmico de 8. burgdorferi en la orina de algunos pacientes que prese
ntaban lesiones en la piel (Schmidt, 1996,1995). La deteccin del ADN de Borrelia
en muestras de sangre y plasma de pacientes con EM ha tenido menos xito (Wallach,
1993; Guy. 1991; Goodman, 1995). Las pruebas moleculares pueden ser especialmen
te tiles para el diagnstico de pacientes seronegativos y para supervisar la eficac
ia del tratamiento con antibiticos (Schmidt, 1997). Se ha llevado a cabo la detec
cin cuantitativa en tiempo real de 8. burgdorferi en modelos animales, habindose e
stablecido una correlacin aparente entre la carga bacteriana y la sintomatologa cln
ica (Pahl, 1999). La PCR tambin ha sido utilizada para detectar y tipificar las b
orrelias presentes en las garrapatas aisladas a partir de la piel humana (Liebis
ch, 1998). En consecuencia, el uso de las tcnicas moleculares promete no slo aumen
tar nuestro conocimiento sobre la biologa y epidemiologa de la borreliosis de Lyme
, sino que parece ser simplemente una cuestin de tiempo que estas tcnicas ocupen u
n lugar en el diagnstico ordinario, en especial a partir de muestras de lquido sin
ovial de pacientes con artritis.
tejidos en una o dos semanas de tratamiento (Malawista, 1994). Ensayos ms recient
es con seres humanos han corroborado estos resultados, evidenciando una respuest
a clnica efectiva en la gran mayora de pacientes afectados tanto de la enfermedad
de Lyme en fase temprana como de neuroborreliosis. Aun cuando la mayor parte de
pacientes con artritis de L y m e muestran mejora con el tratamiento antimicrobia
no (Steere, 1995,1994), en algunos de ellos los sntomas persisten. El aparente fr
acaso del tratamiento en estos casos se piensa que es debido a varios factores.
Por ejemplo, las espiroquetas pueden resistir la terapia debido a una pobre dist
ribucin del antimicrobiano en el lquido sinovial. Otros pueden deberse a mecanismo
s de autoinmunidad, sobre los que muchos autores opinan que pueden tener un pape
l en el origen de la artritis de Lyme, particularmente de aquellos casos crnicos
resistentes al tratamiento (Hu, 1997). Otra rea de investigacin se centra en la fr
ecuencia de cotransmisin de otras infecciones de tipo zoontico junto con 8. burgdo
rferi en zonas endmicas. Como se indic anteriormente, el piroplasma Babesia microt
i y el agente de la ehrlichiosis granuloctica humana son transmitidos al ser huma
no por la m i s m a garrapata (/. dammini) que acta como vector en el caso la enl
ermedad de L y m e causada por 8. burgdorferi. Aproximadamente entre un 10% y un

1 5 % de pacientes con enfermedad de L y m e de algunas del noreste de EE.UU. m

uestran evidencias serolgicas de haber estado expuestos a 8. microti. Los estudio
s preliminares de seroprevalencia en pacientes de la parte superior del medio oe
ste sugieren una exposicin frecuente, tanto a las especies de Babesia c o m od e
Ehriichia. entre aquellos que han mostrado seropositividad frente a 8. burgdorfe
ri (Telford, 1996; Pancholi. 1995; Krause. 1996: Schwartz, 1997). Los estudios e
n pacientes que manifiestan una fatiga persistente tras ser sometidos a un trata
miento adecuado para la enfermedad de L y m e muestran que algunos de ellos estn
de hecho coinfectados con 8. microti (Krause, 1996). El tratamiento de la enferm
edad de L y m e no tiene efecto sobre la infeccin subyacente por 8. mlcrotr. por
tanto, sntomas c o m o fatiga, mialgias, artralgias y similares que continan manif
estndose bastante tiempo despus de un tratamiento contra la enfermedad de L y m e
pueden ser debidos a otras causas, que deberan s e r tenidas en cuenta en la eval
uacin clnica de los pacientes con tales sntomas. La infeccin por 8. microti se diagn
ostica preferentemente por mtodos serolgicos y por PCR, puesto que los frotis real
izados a partir de sangre suelen dar resultado negativo en los pacientes que tie
nen el bazo normal. El riesgo de exposicin a estas zoonosis puede reducirse evita
ndo el contacto con garrapatas, lo que se consigue utilizando camisas de m a n g
a larga y pantalones largos, aplicando repelentes para insectos y controlando a
las garrapatas a continuacin de una posible mordedura o exposicin. Las garrapatas
adheridas deben ser inmediatamente retiradas y la zona de la mordedura ha de de
sinfectarse a fondo (Fish, 1995). Los estudios iniciales no han apoyado el emple
o profilctico de antibiticos para la prevencin de la enfermedad de Lyme tras la mor
dedura de una garrapata (Shapiro, 1992; Warshafsky, 1996). La posibilidad de con
traer la enfermedad de Lyme depende de la tasa de infeccin en las garrapatas (Sha
piro, 1992) y del tiempo durante el cual el insecto est adherido a la piel (Piesm
an. 1987). Adems, parece que el riesgo de reacciones adversas frente a los antimi
crobianos puede pesar ms que los beneficios potenciales, debido a que es muy bajo
el nmero de casos de enfermedad de Lyme que pueden prevenirse de esta forma. Es
concebible que el examen de las garrapatas pueda ser de utilidad algn da para pred
ecir el riesgo de infeccin por 8. burgdorferi y otros agentes causantes de zoonos
is. lo que permitira, en consecuencia, un tratamiento profilctico ms selectivo. Rec
ientemente se ha me|orado el potencial de prevencin de la enlermedad de Lyme con
el lanzamiento de la primera vacuna aprobada por la FDA para su empleo en seres
humanos (CDC. 1999). Es una vacuna subunitaria, constituida por la protena OspAde
8. burgdorferi, obtenida por tcnicas de recombinacin. La investigacin sobre vacuna
s para el hombre se ha centrado en esta y otras protenas de la superficie extema,
tales como OspB y OspC. El calendario para la vacuna actual contempla la admini
stracin de tres dosis, que tiene una eficacia de entre el 60% y el 90% (Steere, 1
998: Sigal. 1998). La duracin de la proteccin que confiere la vacuna an no ha sido
establecida, y t a m p o c o se conoce mucho sobre su seguridad o eficacia en nio
s menores de 1 5 aos. La vacuna es. generalmente, bien tolerada; aunque se han ob
servado reacciones locales y sistmicas suaves, no existe evidencia de que pueda p
rovocar efectos a largo plazo, tales como afectacin neurolgica o musculoesqueltica.
Tratamiento y prevencin
La valoracin de los regmenes teraputicos utilizados para el tratamiento de la enfer
medad de Lyme ha dependido, en general, de los signos y sntomas clnicos, as como de
la informacin emanada de las tcnicas de diagnstico serolgico, tanto para la definic
in de un caso como para evaluar la respuesta a la terapia. La sensibilidad de los
mtodos serolgicos ha mejorado con el tiempo, aunque stos continan teniendo una baja
especificidad. Confiar en los mismos para el diagnstico puede implicar la instau
racin de un tratamiento innecesario. Adems, las tcnicas serolgicas no proporcionan u
n indicador fiable de la respuesta a la terapia, ya que una reduccin significativ
a en el titulo de anticuerpos puede preceder por muchos meses a la eliminacin de
los microorganismos. Como se ha indicado en los prrafos anteriores, los mtodos de
deteccin directa como la PCR pueden resultar tiles para determinar el resultado de
i tratamiento en enfermos con artritis y, posiblemente, en pacientes neurolgicos
con la enfermedad de Lyme. En general, el empleo de estos mtodos puede reforzar l
os estudios sobre la terapia de la enfermedad, al permitir la identificacin de la

bacteria en aquellos sujetos que tienen infeccin activa, y proporcionar una indi
cacin del final de la terapia por su capacidad para valorar la erradicacin de los
microorganismos. Las terapias recomendadas para el tratamiento de la enfermedad
de L y m e incluyen la administracin de doxiciclina o amoxicilina por va oral, en
los casos tempranos y sin complicaciones, y ceftriasona intravenosa para las inf
ecciones ms consolidadas con afectacin sistmica. Otras terapias que tambin han sido
utilizadas son la eritromicina por va oral (en el caso de mujeres embarazadas): f
ormulaciones de acitromicina y cefalosponna oral para la enfermedad temprana; y
penicilina intravenosa, particularmente para la neuroborreliosis. La evaluacin in
icial de la eficiencia del tratamiento con ceftriasona, utilizando modelos anima
les de la enfermedad de Lyme, ha puesto de manifiesto la desaparicin de 8. burgdo
rferi. tanto por cultivo como por PCR, de casi todos los

CAPTULO 52

INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

1141
Esta vacuna est actualmente recomendada para aquellas personas que estn expuestas
con frecuencia o durante mucho tiempo a las garrapatas en zonas donde la enferme
dad de Lyme tiene carcter endmico (Hayes. 1998). Como se mencion antes, el empleo e
xtendido de la vacuna puede tener un efecto drstico sobre la utilidad de los mtodo
s disponibles en la actualidad para el diagnstico serolgico de la enfermedad de Ly
me.
(Southern, 1969). Las tcnicas serolgicas estn poco disponibles y tienen un valor di
agnstico limitado debido a la variacin antignica que experimentan estos microorgani
smos, as como a la reactividad cruzada con muchas otras especies bacterianas, inc
luyendo 8. burgdorferi(Dworkin, 1998). Los antibiticos de eleccin para el tratamie
nto de la fiebre recurrente son la tetraciclma o la eritromicma. El tratamiento
se complica a menudo por la aparicin de una reaccin de Jarisch-Herxheimer, caracte
rizada por una sene de sntomas como fiebre, escalofros, leucopenia e hipotensin. No
existe vacuna contra la fiebre recurrente. La prevencin se lleva a cabo evitando
el contacto con los artrpodos vectores y que los roedores aniden en los albergue
s humanos, sobre todo en las reas donde la fiebre recurrente transmitida por garr
apatas es endmica. Se deben utilizar insecticidas en las casas y aplicar repelent
es para insectos a la ropa de vestir. La mejor lorma de prevenir la enfermedad t
ransmitida por piojos es mantener una higiene personal adecuada y, cuando sea ne
cesario, aplicar tcnicas para despiojar.
Fiebre recurrente
La fiebre recurrente es una enfermedad con distnbucin mundial en zonas de climas
clidos y templados, con la excepcin de unas pocas zonas en el sudoeste asitico, com
o Nueva Zelanda y Australia (Burgdorfer, 1986). La enfermedad, causada por Borre
lia recurrenlis, se transmite por el piojo del hombre. Pediculus humanus. La enf
ermedad afecta predominantemente a las personas que viven en condiciones higinica
s deficientes que provocan un aumento en el nmero de piojos y favorecen la disemi
nacin de los mismos. La enfermedad ya no existe en EE.UU., pero sigue siendo endmi
ca en los altiplanos del centro y este de frica y en el sur de la Cordillera de l
os Andes. La fiebre recurrente transmitida por garrapatas, una enfermedad con di
stribucin mundial pero que se detecta muy espordicamente, se transmite a los seres
humanos que penetran en el habitat de las garrapatas del gnero Ornithodoros. rep
resentado por ambientes clidos y hmedos como cuevas, madera en descomposicin, madri
gueras de roedores y refugios de animales que se encuentren en altitudes compren
didas entre 500 y 2.000 metros, aproximadamente. En EE.UU., las especies 8. herm
sii. B. luricataey B. parkeri son los patgenos ms comunes. Las garrapatas se infec
tan al alimentarse de los roedores con borreliosis o de otros animales de pequeo
tamao que actan como reservorio natural de las espiroquetas. Los seres humanos con
traen la infeccin a travs de la mordedura de la garrapata o por contaminacin de abr
asiones de la piel con la hemolinfa de los piojos aplastados (Dworkin, 1998). Tr
as entrar en la corriente sangunea, los microorganismos se multiplican, causando
los sntomas y signos clnicos de la fiebre recurrente Las bacterias quedan acantona
das en rganos internos durante los periodos no febriles, en los que las espiroque
tas circulantes son destruidas por los fagocitos en presencia de anticuerpos esp
ecficos. Las recadas se producen cuando las bacterias acantonadas en los rganos y q
ue han experimentado cambios en su composicin antignica superficial son liberadas
de nuevo al tonente circulatorio (Barbour, 1990). Las manifestaciones clnicas de
la fiebre recurrente transmitida por los pilos o por las garrapatas son semejante
s, aunque en el primer caso la enfermedad es generalmente ms grave (Dworkin, 1998
; Bryceson, 1970; Horton, 1985; Rahlenbeck, 1995; Southern, 1969). La enfermedad

primaria comienza, caractersticamente, tras un perodo de incubacin de 4 a 18 das co

n fiebre, rigidez, dolor de cabeza, mialgias. artralgias, letargo, fotofobia, to
s y dolor abdominal. Puede desarrollarse una hepatoesplenomegalia con ictericia,
especialmente en el caso de la enfermedad transmitida por piojos, pudiendo exis
tir afectacin neurolgica hasta en un 30% de los afectados en este supuesto, valor
que desciende hasta el 10% en los casos causados por la mordedura de garrapatas.
Tambin se ha apreciado afectacin respiratoria o cardaca, linfadenopata. daos oculare
s y otitis media. Durante la infeccin temprana puede producirse shock por hipoten
sin que puede ser mortal. Al final de la fase febril primaria de la enfermedad ap
arece con mucha frecuencia una erupcin papular, macular o petequial en el tronco
que dura uno o dos das. La fase primaria termina de forma brusca al cabo de unos
tres a seis das. Por lo general las muertes se deben a arritmias cardacas, hemorra
gias cerebrales y fracaso heptico. Normalmente, el individuo sobrevive y los sntom
as reaparecen sbitamente entre 7 y 10 das despus. En el caso de la enfermedad trans
mitida por las garrapatas son caractersticas las recadas mltiples, cuya duracin y si
ntomatologa van disminuyendo a medida que se suceden las mismas. En la enfermedad
transmitida por piojos slo se dan una o dos recidivas. El diagnstico de la fiebre
recurrente se lleva a cabo demoslrando la presencia de las espiroquetas en sang
re perifrica mediante microscopa de campo oscuro. Alternativamente, se pueden real
izar extensiones gruesas o finas que se tien por los mtodos de Giemsa o de Wright
y se observan con microscopia de campo claro, o mediante microscopa de fluorescen
cia despus de teir con naranja de acridna Estos mtodos tienen una sensibilidad del 7
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C A P T U L O
53
Micobacterias
Gail L. Woods, M.D.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovi
s Mycobacterium africanum PRUEBAS CUTNEAS MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS Mycobacte
rium avium-Mycobacterium 1146 DIAGNSTICO DE LABORATORIO Muestras Tinciones microb
iolgicas Mtodos de cultivo Test para la identificacin de micobacterias Test de sens
ibilidad TRATAMIENTO PREVENCIN Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium com
plex BIBLIOGRAFA 1155 1154 1155 1149 1149 1144 Mycobacterium genavense Mycobacter
ium ulceraos MYCOBACTERIUM LEPRAE 1148
intracellulare complex Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium kansasii Mycobac
terium fortuitum-Mycobacterium chelonae-abscessus complex Mycobacterium xenopi M
ycobacterium szulgai Mycobacterium malmoense Mycobacterium simiae Mycobacterium
marinum Mycobacterium haemophilum
Las micobacterias son bacilos aerobios, inmviles, cido alcohol resistentes, rectos
o ligeramente curvos. Los organismos contienen en sus paredes cidos miclicos de a
lto peso molecular (con 60 a 80 carbonos) que durante la pirlisis liberan cadenas
rectas de cidos saturados C- a C^ de cadena larga. La proporcin de guanina-citosi
na en su ADN es de 62 mol a 70 mol%. Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium b
ovis y Mycobacterium africanum son los patgenos humanos que componen el trmino Myc
obacterium tuberculosis complex (MTBC). Estos organismos, 'bacilos de la tubercu
losis", son los agentes etiolgicos de la tuberculosis humana. Otras micobacterias
diferentes de la MTBC son las denominadas "atipicas". porque difieren de los ba
cilos de la tuberculosis. Los trminos "micobacterias no tuberculosas" y otras mic
obacterias diferentes del bacilo de la tuberculosis" son preferidos porque estos
organismos no son atipicos. sino que simplemente tienen caractersticas diferente
s de Mycobacterium tuberculosis.
:
micobacterias no tuberculosas basada en su patogenicidad en humanos ipotencialme
nte patgenos y raramente patgenos) (Woods, 1993). Mycobacterium leprae, que es nica
entre las micobacterias por su cualidad de no haber sido an cultivada in vitro,
se comenta separadamente.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX Mycobacterum tuberculosis
En 1957, Runyon propuso que las micobacterias no tuberculosas fueran divididas e
n cuatro grupos segn la pigmentacin de las colonias y la velocidad de crecimiento
en un medio slido (Tabla 53-1) (Runyon, 1959). Este sistema de clasificacin tiene,
no obstante, limitaciones Por ejemplo, Mycobacterium kansasii es un fotocromgeno
. pero en alguna ocasin es no lotocromgeno o escotocromgeno. Mientras que miembros
de Mycobacterium avium intraceIlutare complex (MAC) son no fotocromgenos en el es
quema de Runyon, pero algunos aisladamente producen colonias dbilmente pigmentada
s, pudiendo causar errnea clasificacin como escotocromgena. Mycobacterium szulgai e
s escotocromgena a 37 C y fotocromgena a 25 C. Ms an, cuando se usa un medio liquido
para cultivo de micobacterias como est recomendado (vase ms adelante), la tasa de
crecimiento como factor de la clasificacin usado por Runyon no es vlida. Aqu se usa
una clasificacin de utHidad clnica de las
Hoy da la tuberculosis es un problema global. Se estima que en todo el mundo exis
ten entre 8 y 10 millones de nuevos casos de tuberculosis al ao y de 2 a 3 millon
es de muertes son a causa de esta enfermedad cada ao. En gran parte del mundo, la
tuberculosis es el origen infeccioso ms frecuente de muerte, siendo directamente
responsable de aproximadamente el 7% de todas las muertes y del 26% de todas la
s muertes prevenibles en todo el mundo (Murray. 1990; Snider. 1994). En EE.UU..

la tuberculosis estaba a la cabeza de la causa de muerte al comienzo del siglo X

X. La mortalidad decreci micialmente por el esfuerzo de la sanidad pblica de aloja
r a los pacientes con tuberculosis en sanatorios para mejorar las nutricin y vent
ilacin, y posteriormente gracias a los frmacos antituberculosos. Entre 1953 (cuand
o la tuberculosis empez a registrarse en una base nacional) y 1984 la incidencia
fue cayendo regularmente en torno a un 5%-6% cada ao (Rieder. 1989). La proporcin
de descenso se fren drsticamente entre 1984 y 1985, y despus esta tendencia se invi
rti. Desde 1985 a 1992 el nmero de casos de tuberculosis referidos a los centros p
ara la prevencin y control de enfermedades (CDC) increment en aproximadamente un 2
0%. es decir, se refirieron cerca de 51.000 casos ms de

CAPTULO 53

MlCOBACTERIAS
1145
Tabla 53-1
Clasificacin d e R u n y o n d e las micobacterias no t u b e r c u l o s a s
D e s c r i p c i n de colonias No pigmentadas a menos que sean expuestas a la l
uz (ptimamente durante su crecimiento temprano y con buena ventilacin de la superf
icie) Pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y a la luz No pigmentadas cuando
crecen en la oscuridad y a la luz Crecimiento en medio slido en siete das o menos
j
Clasificacin Folocromgena
Escotocromgena No folocromgena De rpido crecimiento
sin de lisosomas con fagosomas que contienen bacilos dentro del macrfago, favoreci
endo posiblemente la supervivencia del organismo dentro de la clula. La respuesta
usual del husped a la infeccin por M. tuberculosis es la activacin de la inmunidad
celular. Durante la infeccin primaria (inicial) los bacilos inhalados viajan a l
os espacios alveolares, donde son ingeridos por los macrfagos locales. Dichos mac
rfagos son incapaces de matar a las micobacterias, que se multiplican dentro de l
a clula durante los siguientes das tras la infeccin. Los macrfagos infectados con la
s micobacterias emigran a los ganglios linfticos regionales y presentan los antig
enos sensibilizantes a las clulas inmunocompetent.es. o bien pasan a la linfa o a
l torrente sanguneo regresando a los pulmones (principalmente a las zonas apicale
s) y rganos a distancia, como son los ganglios linfticos, los rones, la epfisis de lo
s huesos largos, los cuerpos vertebrales y las meninges, donde los bacilos conti
nan multiplicndose hasta que se adquiere la respuesta inmune celular. Las clulas T
inmunocompetentes migran desde los ganglios linfticos locales al punto de infeccin
en el pulmn. Alli liberan atocinas quimiotctcas. inhibidores de la migracin y atoci
nas mitogenticas que estimulan el reclutamiento de monocitos y linfocitos sanguneo
s, la divisin ce macrfagos y de los linfocitos y la activacin de los macrfagos. Los
macrfagos archivados tienen una marcada actividad microbicida, produciendo atocin
as como la mterleucina-1 (IL-1), el interfern-y (IFN-y) y el factor de necrosis t
umoral (TNF) que estimulan o regulan otros componentes del sistema inmune, propi
edades que ayudan en el control de la infeccin. Las citocinas y enzimas lticas lib
eradas por los macrfagos tambin contribuyen a la destruccin tisular local concomita
nte. Con el paso del tiempo, la poblacin de clulas T activada va declinando y es r
eemplazada por clulas T de memoria que protegen contra las reinfeccin por M. tuber
culosis y dan cierta proteccin cruzada contra infeccin por otras micobacterias. A
pesar de frenar nuevas multiplicaciones de micobacterias en el foco primario y e
n los metastsicos gracias a la actividad de los macrfagos y de los linfocitos T de
memoria, un foco de infeccin permanece en el pulmn indefinidamente (ms frecuente e
n los vrtices donde la presin de oxgeno es alta) y menos frecuente en los focos a d
istancia. Por tanto, la capacidad de reactivacin de la enfermedad de ese foco lat
ente existe durante perodos de mmunosupresin. El foco primario de infeccin pulmonar
, llamado lesin de Gohn. suele ser subpleural en la pade inferior de los lbulos su
periores o en la parte superior de los lbulos inferiores, correspondiendo a reas d
e pulmn que reciben la mayor parte del flujo del aire inspirado. Las lesiones (tu
brculos) son bien delimitadas, siendo reas de consolidacin blanco-grisceo, de 1 cm a
2 cm de dimetro con centro necrtico. Una apariencia similar a los tubrculos lueron
tpicamente encontrados en los nodulos linfticos regionales, los cuales, junto con
la lesin pulmonar primaria, se denominan complejo de Gohn. Microscpicamente los t
ubrculos estn formados por granulomas caseosos y no caseosos bien de limitados: lo

s organismos pueden ser vistos en cortes teidos con tincin cido resistente. Con el
tiempo esas lesiones son reemplazadas por fibrosis hialina y ocasionalmente se c
alcifican. Las lesiones de la tuberculosis miliar son pequeas reas de consolidacin
(de 1 m m a varios milimetros de dimetro) de color blanco amarillentas sin caseum
que recuerdan a los tubrculos. La capacidad de formar un granuloma est en funcin d
e la inmunocompetencia de los huspedes. Las personas infectadas con VIH, por ejem
plo, pueden tener gran necrosis sin formar granulomas con algunos neutrofilos. m
icroabscesos y numerosos bacilos cido resistentes (BAAR). En EE.UU., la tuberculo
sis activa afecta al pulmn en el 85% de los casos. Las manifestaciones clnicas pue
den variar. La presentacin clnica puede ser insidiosa, con unos sntomas constitucio
nales progresivos de meses de evolucin, cuadro catarral con tos productiva frecue
ntemente atribuible a un m a l resfriado o bronquitis persistente, neumona o cuad
ro seudogripal. liebre alta, dolores y tos. Tambin puede aparecer esputo hemoptoi
co y dolor pleurtico. Tambin puede localizarse extrapulmonarmente, pero lo ms comn e
s que afecte a mltiples rganos con o sin infeccin pulmonar concomitante. La tubercu
losis multiorgnica, antiguamente una enfermedad de nios y jvenes, predomina actualm
ente entre los ms ancianos e individuos inmunocomprometidos, especialmente aquell
os infectados con VIH y M. tuberculosis (Chaisson, 1987; Kim. 1990).
los esperables (CDC. 1993). En las reas metropolitanas, el mayor incremento se di
o en la ciudad de Nueva York. Los factores contribuyentes a este excesivo nmero d
e casos incluyen la extensin epidmica del virus de la inmunodeficiencia humana (VI
H), un deterioro en una infraestructura de los cuidados de salud y un incremento
en el nmero de casos de personas sin hogar, trabajadores emigrantes, inmigrantes
y pacientes que requeran cuidados crnicos, como en los centros disciplinarios y s
anatorios (Ellner. 1993). Desde 1992, la incidencia de la tuberculosis declin cad
a ao (CDC. 1998). Adems del resurgimiento de la tuberculosis en los EE.UU., otro a
contecimiento reciente es la aparicin de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB
), definida como la enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis que es res
istente a 2 o ms antimicobacterianos de primera linea utilizados en los EE.UU. pa
ra tratar tuberculosis (vase ms adelante, en Tratamiento). Desde 1988, el CDC inve
stigo 7 epidemias de MDR-TB que afectaron a cerca 200 personas (predominantement
e personas infectadas por el VIH) en hospitales y centros penitenciarios en Nuev
a Y o r k y Florida (Jacob. 1994). Slo cuatro de estas epidemias fueron notificad
as desde 1976 a 1987 y las personas afectadas eran personas sin infeccin por VIH.
La mortalidad en las recientes epidemias tue alta (del 72% al 89%), con rpida ev
olucin desde el diagnstico hasta la muerte (con una media de 1 a 4 meses). Tambin s
e produjo la transmisin de MDR-TB a trabajadores de salud o guardias de las crcele
s y al menos 9 desarrollaron enfermedad activa y 5 murieron. M. fuberculosis se
transmite principalmente por va respiratoria al inhalar residuos secos en pequeas
gotitas infectadas (de 1 pm a 10 um de dimetro), pero tambin por inoculacin directa
a travs de la piel lesionada, lo que es ms posible que se produzca cuando los patl
ogos u otros trabajadores del laboratorio manejen muestras infectadas. El foco d
e infeccin ms importante son las personas con tuberculosis pulmonar cavilada sin d
iagnosticar (con esputo positivo). Las dosis mnimas infectivas en humanos permane
cen desconocidas, pero existen datos que sugieren que la infeccin puede producirs
e tras inhalar tan slo unos pocos organismos viables (Haas. 1994). El riesgo de p
adecer enfermedad pulmonar activa es bajo tras una exposicin aislada, pero el rie
sgo aumenta bajo situaciones de estrs o en ambiente de conlinamiento, donde puede
darse una repetida exposicin al organismo. La mayora de las personas que se inlec
tan con M. tuberculosis no llega a desarrollar la enfermedad activa. El riesgo d
e desarrollarla en personas inmunocompetentes es del 5% al 10%. Para personas in
fectadas por VIH, este riesgo asciende a 7%-10% al ao. Las estructuras especifica
s, antgenos y mecanismos responsables de la virulencia de M. tuberculosis son an d
esconocidos, pero el factor cordal y las sulfatidas han sido asociadas con la ca
pacidad de las cepas virulentas de producir la enfermedad. In vitro. el factor c
ordal es el responsable del aspecto morfolgico con el que M. tuberculosis aparece
en la clula, como un manojo de cuerdas serpenteantes puestas en paralelo. Este p
atrn de crecimiento se correlaciona con la presencia de trihalosa 6,6 -dimicolato
en el bacilo. Cuando este glucolipido se inyecta en ratones, inhibe la migracin

de neutrofilos y favorece la formacin de granulomas y estimula la proteccin contra

infecciones virales. Su papel especfico en la patogenia de la tuberculosis human
a permanece, no obstante, desconocido. Las sulfatidas son unos glucolpidos situad
os perifricamente que inhiben la fu-

1146 Mycobacterium bovis

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Mycobacterium intracellular
avium-Mycobacterium complex
ractersticas d ec r e c i m i e n t oyd ec o m p o r t a m i e n t o bioqumico q u
ef r e c u e n t e m e n t eh a c e n difcil su diferenciacin en el laboratorio d
e microbiologa, p o r lo que e l aislamiento d ea m b a s especies s e informa c
o m oM A C .E lM A Cc o n tiene 28 serotipos. identificados p o r seroaglutinacin
segn los antgenos localizados en la superficie celular o bien p o r cromatografa.
A n t e sd e la epidemia del sndrome de m m u n o d e f i c i e n c i a adquirida
h u m a na (sida), el M A C era la s e g u n d am i c o b a c t e n a ms f r e c
u e n t e m e n t ea i s l a d a en EE.UU. tras M. tuberculosis. Entonces, el p
o r c e n t a j ed eM A Ca i s l a d o increment, igualando e incluso s o b r e
p a s a n d o el nmero de M. tuberculosis aislados en m u c h a sp a r t e s del
pais. Los bacilos M A C estn presentes en cualquier sitio del a m b i e n t e . S
e han aislado en el agua, el suelo, el alimento, el polvo domstico y en mltiples a
nimales, p e r o la fuente a m b i e n t a l especifica r e s p o n s a b l e de
la infeccin al s e r h u m a n op e r m a n e c e an d e s c o n o c i d a (Inder
lied. 1993). La p u e r t a de e n t r a d a ms probable es el tracto de gastroin
testinal, pero la transmisin p o r va respiratoria tambin es posible. D e s d e las
zonas de colonizacin, los o r g a n i s m o s p a s a n a la s a n g r e e infec
tan m u c h o s rganos, e s p e c i a l m e n t e aquellos del sist e m a mielomo
noctico. Mycobacterium africanum Durante m u c h o s aos la enfermedad p u l m o n
a r causada p o rM A C se dab a con m a y o r frecuenci a en a n c i a n o s de
raza bl a nca que padecan e n f e r Mycobacterium africanum. el bacilo del tubrcu
lo "africano", fue el que prim e d a d e s pulmonares crnicas o en gastrectomizad
os. pero en los p a s a d o s m e r o se aisl en personas del oeste de frica (Cast
ets, 1968). A u n q u e ha sido 10-15 aos h a legado a s e r comn en personas sin
t a c t o r e s predisponenaislado principalmente en individuos de frica, la prev
alencia de la infeccin tes, e s p e c i a l m e n t em u j e r e sa n c i a n a s
(Prince, 1989; Dhillon. 2000). La enferc o n M. africanum a lo largo del p l a
n e t a es difcil de determinar, p o r q u ep u e d e m e d a d diseminada p o rM
A Cs ed ad eu nm o d o casi exclusivo e nm m u n o s u n os e rc o r r e c t a
m e n t e identificado e nm u c h o s laboratorios. L o sm e c a n i s m o s pri
m i d os. especi a l m ente en personas c o n si d a avanzado. En EE.UU.. el de
transmisin y las manifestaciones clnicas de la enfermedad producida por M A C fue
la c a u s a ms comn de infeccin bacteriana sistmica en p a c i e n M. africanum so
n las m i s m a s que las producidas por M. tuberculosis. t e s con sida a final
es de los aos 80 y en los inicios de los 90 (Horsburg, 1991). L a incidencia d e
tales casos, sin embargo, descendi d e s d e la existenci a de l a terapi a antir
retroviral (CDC.1999). El pri n ci p al f a c t o r de r i e s g o MICOBACTERIAS
NO TUBERCULOSAS para l ae n f e r m e d a d diseminada M A Ce n pacientes c o n
sida e se lg r a d od e inmunosupresin, i n di c ado por el r e c u e n t o d e
l i n foci t os CD4+; tanto es as, En general p o c o se s a b e acerca de los an
tgenos responsables de la viruque l a enfermedad e s infrecuente e n individuos c
o n linfocitos CD4* p o r encilencia d e las m i c o b a c t e r i a sn o tuber
culosas: sin embargo, tales antgenos m a de 50. son. presumiblemente, los respons
ables de la persistencia de los organisEn EE.UU.. los serotipos 4 y 8 de M. aviu
m son los ms f r e c u e n t e m e n t e m o sd e n t r o del s i s t e m a mielo
monoctico del husped. L a respuesta i n m u n e aislados en la s a n g r e de p e
r s o n a s con sida. L o s serotipos d e M. intracellulaa la infeccin c o n esta
s micobacterias es tambin t o r p e m e n t e entendida. Los re son un pequeo porc

entaje de los M A C aislados en p e r s o n a sc o ns i d ays e patgenos potencia

les se revisan en las siguientes secciones. Las m i c o b a c aislan p r e f e r
e n t e m e n t e en los e s p u t o syc o nm e n o sf r e c u e n c i a en la
sangre, terias r a r a m e n t e patognicas y las infecciones con las que han sid
o a s o c i a d a s oq u e sugiere q u er a r a m e n t ep r o d u c e ne n f e
r m e d a dd i s e m i n a d ae ne s t o s se r e c o g e n en la T a b l a 53-2
(Weinberger, 1992; Weitzman, 1981; Neely, 1989; l individuos (Yacrus, 1990; Gut
hertz, 1989). DeChairo. 1973; Edwards, 1978; Cianciulli. 1974; Blacklock, 1983:
T s u k a mura, 1975,1983: Casimir. 1982; Wallace. 1988: Smilh, 2000; Davison, 1
988; L a s manifestaciones d el ae n f e r m e d a d producida p o rM A Cd e p e
n d e n del Butler. 1 9 9 4 : Chiodini. 1989). sitio y la extensin d e la infecc
in. L a infeccin p u l m o n a rp u e d es e r asinloMycobacterium bovis p u e d e ser transmilido a los h u m a n o sd e s d e el ga
nado vacuno, b e b i e n d ol e c h e cruda c o n t a m i n a d aop o r exposicin
respiratoria al ganado infectado o a sus cadveres. Tambin p u e d e ser transmiti
do de pers o n a a persona por via respiratoria, d eh u m a n o sag a n a d op o
r exposicin a la orina d ep e r s o n a s con infeccin del tracto urinario y de g
anado a g a n a d o p r o b a b l e m e n t ep o rs e c r e c i o n e s bronquia
les. M. bovis tambin p u e d e transmitirse a ganado d e s d e los animales salva
jes, por ejemplo, el tejn en Suiza y Gran Bretaa (Grange. 1987). Entre 1900 y 1930
. M. bovis le el responsable del 6 % al 30% de los cas o s de tuberculosis en EE.
UU. y en el Reino Unido (Grange, 1987: Karlson, 1970), L a tasa d e tuberculosis
h u m a n a causada p o r M. bovis descendi debido a la pasteurizacin de la leche
y a los programas de inspeccin de ganado. D e s d e 1950, M. bovis ha producido
m e n o s del 1 % de los casos de tuberculosis h u m a n a en Norteamrica. La may
ora de las infecciones son extrapulmonares. afectando a los ganglios linfticos cer
vicales y mesenlricos, el intestino, los huesos y los riones. Infrecuentemente, la
infeccin fue c o n s e c u e n c i a de la instilacin intravesical del bacilo de
Calmette-Gunn (BCG) para tratamiento del carcinoma superficial de vejiga (Kristja
nsson. 1993)
Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellular t i e n e n s i m i l a r e s
c a Tabla 53-2
Micobacterias raramente p a t o g n i c a s e infecciones a s o c i a d a s
Infecciones asociadas Comentarios
Mycobacterium spp. M. gordonae
M M M M M M M M M M
thermoresistible terrae-triviale complex asiaticiim nonchromogenicum tlavescens
shimoidei smegmalis neoaurum chelatum paratuberculosis
Meningitis en pacientes con shunt, e n f e r m e d a d h e p a t o r e n a l , p
eritonitis, endocarditis sobre vlvula protsica, infeccin cutnea, enfermedad disemina
da, enfermedad pulmonar (?) Infeccin pulmonar, infeccin cutnea Artritis sptica, oste
omielitis, enfermedad diseminada ( ) Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enf
ermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Bacteriemia en inmunosu
primidos con catter intravascular Enfermedad diseminada en pacientes con sida Enf
ermedad de Crohn (?)
9
Aislada en el suelo y en el agua ( b a c i l o del grifo") y contaminante habitu
al del laboratorio
Aislada de suelo M. terrae = bacilo del rbano

Enfermedad similar a la del MAC diseminado

Sia sndrome de inmunodeficiencia adquirida; MAC: Mycobacterium avium complex.

CAPTULO 53

MICOBACTERIAS
1147
mtica o imitar a la tuberculosis. La enfermedad diseminada en personas sin sida s
e manifiesta con liebre, prdida de peso, dolor de huesos, adenopatas. hepatoesplen
omegalia y lesiones cutneas. En aquellos con sida es ms comn la fiebre persistente,
perdida de peso y diarreas. Tambin se puede dar anorexia, debilidad, adenopatas o
esplenomegalia (Inderlied, 1993). Los hallazgos del laboratorio son anemia y el
evacin de la loslatasa alcalina. Las adenopatias cervicales causadas por MAC suel
en afectar a los nios, aunque tambin pueden darse en adultos. Otras manifestacione
s de la infeccin por MAC son sinovitis, enfermedad del tracto genitourinario, les
iones cutneas, infeccin de los tejidos profundos de la mano, osteomielitis, mening
itis, ulceracin del colon y peritonitis (Inderlied, 1993; Wolinsky. 1979; Woods,
1987). Los hallazgos histolgico de las lesiones por MAC son variados. Granulomas
caseosos con bacilos cido resistentes indistinguibles de la tuberculosis, fibrosi
s pulmonar con neumona organizada, vasculitis granulomatosa necrotizante similar
a la granulomatosis de Wegener y especialmente en personas con sida, pueden vers
e agregados de macrfagos espumosos que contienen bacilos cido resistentes en su in
terior.
Mycobacterium chelonae-abscesus
fortuitum-Mycobacterium complex
Los miembros del grupo Mycobacterium fortuitum han sido aislados en el suelo, ag
ua y polvo, y los de Mycobacterium chelonae-abscesus en el suelo, agua y aguas r
esiduales. L a mayora de las personas infectadas con estos organismos han sufrido
un dao penetrante (traumatismo o ciruga) con posible contaminacin por tierra o agu
a. El comienzo de la infeccin con M. chelonae se ha asociado con la administracin
de la vacuna de la difteria-pertusis-ttanos-polio, inyecciones de histamina. admi
nistracin de lidocaina con un inyector a presin, en hemodializadores contaminados
y en el reemplazo de vlvulas porcinas contaminadas (Wallace, 1983). La lesin cutnea
principal causada por M. tortuitum o por M. chelonaeabscesus se manifiesta por
celulitis local, abscesos o nodulos mnimamente dolorosos. Tpicamente las lesiones
se desarrollan entre tres semanas y doce meses (con mayor frecuencia entre 4 y 6
semanas) tras el dao penetrante en personas con el sistema inmune intacto. La os
teomielitis es una complicacin ocasional, especialmente tras heridas punzantes en
los pies. Las infecciones posquirrgicas se han caracterizado por heridas que no
cicatrizaban o por dehiscencia de heridas cicatrizadas con drenaje seroso y con
minimos sntomas sistmicos. Generalmente se desarrolla entre tres semanas y tres me
ses tras la intervencin, especialmente tras esternotomia media, ciruga de aumento
mamario o tras la insercin de catteres percutneos. La enfermedad diseminada que sue
le producirse en inmunodeprimidos (especialmente secundaria a terapia con cortic
oides) se manifiesta con abscesos cutneos recurrentes y de los tejidos blandos. L
a principal fuente de infeccin sigue sin ser evidente. Es infrecuente una enferme
dad pulmonar crnica similar a la producida por M. kansasii o por el MAC. a excepc
in de la cavilacin. L a endocarditis sobre una vlvula protsica suele producirse tras
cuatro a d o c e semanas despus de la ciruga. Raramente el M. fortuitum o el M. c
helonaeabscesus produce queratitis y ulceracin de la crnea postraumtica o adenopatas
cervicales. Las lesiones producidas por M. fortuitum o por M. chelonae-abscesus
, se caracterizan histolgicamente por necrosis con una mnima caseificacin y un infi
ltrado mixto inflamatorio compuesto por neutrofilos y granulomas de cuerpo extrao
o de clulas de Langhans. Pueden verse de modo ocasional macrfagos cargados de lip
idos. Se pueden encontrar grupos de bacilos cido resistentes dentro de agregados
de neutrofilos en menos de un tercio de los casos. En el tejido pulmonar son fre

cuentes los macrfagos espumosos, con un patrn similar a la neumona lipoidea

Mycobacterium
scrofulaceum
Mycobacterium scrofulaceum fue el primer causante conocido de adenopatas cervical
es en nios (Prissick, 1956). Desde el punto de vista antignico es similar al MAC.
y debido a su ocasional identificacin como MAC mediante test bioqumicos, y vicever
sa. M. scrofulaceum se clasifica junto con el MAC como Mycobacterium avium-intra
cellulare-scrofulaceum complex. M. scrofulaceum se ha aislado en la leche cruda
y en otros productos de consumo habitual, como ostras y agua. Se ha hallado tamb
in en el suelo. Habitualmente produce adenopatias cervicales en nios de 1 a 5 aos,
penetrando presumiblemente en el cuerpo a travs de pequeas heridas cutneas o a travs
de la mucosa de la cavidad oral. La enfermedad suele ser unilateral, afectando
a ganglios linfticos altos del cuello o del ngulo de la mandbula. Los nios infectado
s generalmente estn con buen estado general, sin fiebre, y tienen mnimos dolores o
molestias. Con la progresin, estos nodulos se reblandecen y se abren, pudiendo p
osteriormente cicatrizarse, librosarse y calcificarse. Las manifestaciones extra
ganglionares de la infeccin por M. scrofulaceum incluyen afectacin pulmonar, enfer
medad diseminada y. ms raramente, conjuntivitis, osteomielitis, meningitis y hepa
titis granulomatosa. Las lesiones por M. scrofulaceum son histolgicamente indisti
nguibles de las producidas por M. tuberculosis.
Mycobacterium Mycobacterium kansasii
xenopi
Mycobacterium kansasii. inicialmenle descrito como el "bacilo amarillo", represe
ntaba el 3% de las micobacterias aisladas en EE.UU. en 1979 y 1980; las mayores
cifras fueron descritas en Calilornia, Texas, Louisiana, Illinois y Florida (Buh
ler, 1953; Goods. 1982). El reservorio natural de M. kansasii es desconocido, pe
ro se ha aislado partir de muestras de agua. La enfermedad pulmonar es ms frecuen
te en varones entre 50 y 60 aos que habitan en zonas urbanas y entre ciertos grup
os laborales (mineros, soldadores, marineros y pintores) y entre individuos con
neumoconiosis y enfermedad pulmonar obstructiva crnica. La enfermedad diseminada
suele afectar a personas con la alteracin de la inmunidad celular. Las manifestac
iones ms frecuentes de la enfermedad producida por M. kansasii son lesiones crnica
s pulmonares cavitadas que suelen afectar a los lbulos superiores. Las manifestac
iones extrapulmonares incluyen adenopatas cervicales en nios, enfermedades cutneas,
afectacin msculo esqueltica (sndrome del tnel del carpo, sinovitis, artritis, lendin
itis, fascitis u osteomielitis), enfermedad diseminada, enfermedad aislada del t
racto genitourinario y peritonitis. Los hallazgos histolgicos de las lesiones pro
ducidas por M. kansasii son variables e incluyen granulomas caseosos y no caseos
os y lesiones cutneas, necrosis o locos de inflamacin aguda y crnica sin formacin de
granulomas. Los bacilos cido resistentes son frecuentes en los pulmones y en los
ganglios linfticos, pero menos en el resto de tejidos.
Mycobacterium xenopi se aisl por primera vez en un sapo en 1957 y fue reconocido
como patgeno humano en 1965 (Costrinia, 1981). Se ha cultivado a partir de aguas
residuales clidas y trias, calderas de hospitales y tanques de almacenamiento y o
tras fuentes ambientales. En Gran Bretaa. M. xenopi se encuentra ms frecuentemente
en zonas costeras que en las del interior y los pjaros son un posible reservorio
natural. La mayora de las infecciones pulmonares causadas M. xenopi se han descrit
o en Europa y Gran Bretaa. Por el contrario, esta micobacteria es poco frecuente
en EE.UU. La enfermedad se da slo en adultos y ms frecuentemente en varones que en
mujeres La mayora de las personas padecen enfermedad pulmonar preexistente u otr
o factor predisponente, como neoplasias extrapulmonares malignas, alcoholismo, d
iabetes mellitus o terapias inmunosupresoras. La enfermedad pulmonar puede ser c
rnica, subaguda o aguda. Los sntomas son indistinguibles de los asociados a la pat

ologa causada por M. kansasii. La infeccin local extrapulmonar (osteomielitis, art

ritis, adenopatas) y la enfermedad diseminada son infrecuentes, aunque se han des
crito en pacientes con sida (Tecson-Tumang. 1984).
Mycobacterium
szulgai
Mycobacterium szulgai es un patgeno humano infrecuente localizado en cualquier pa
rte del mundo, pero su reservorio natural es an desconocido. La manifestacin ms fre
cuente de la infeccin es la enfermedad pulmonar er-

1148
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
ruca, siendo esto ms frecuente en varones de mediana edad. La afectacin extrapulmo
nar es infrecuente, habindose descrito una bursitis de olecranon asociada a traum
atismos de repeticin o tras inyecciones de corticodes, afectacin cutnea extensa en p
ersonas en tratamientos con corticoides. osteomielitis, tenosinovitis con sndrome
de tnel del carpo, adenopatias cervicales y enfermedad diseminada (Woods, 1987).
Mycobacterium
genavense
Mycobacterium
malmoense
Mycobacterium malmoense se describi como una nueva especie en 1977, aunque su res
ervorio natural es an desconocido (Schroder. 1977). La mayora de las infecciones h
umanas se han descrito en Inglaterra. Gales y Suiza, mientras que en EE.UU. es i
nfrecuente. La enfermedad pulmonar crnica es la manifestacin ms comn de la infeccin p
or M. malmoense. afectando tpicamente a hombres de mediana edad con neumoconiosis
. Tambin se han descrito adenopatias cervicales en nios y enfermedad diseminada en
pacientes con sida (Henriques, 1993).
Mycobacterium genavense es una nueva especie propuesta de micobactena que se ha
obtenido en cultivos de sangre por primera vez y tambin en bazo o mdula sea de paci
entes con sida (Coyle. 1992; Wald, 1992). Casi todos los pacientes tuvieron fieb
re y malestar general, y algunos incluso sntomas abdominales. Algunos de los paci
entes fueron coinfectados con otro patgeno, como el MAC. por lo que ha sido difcil
determinar el papel de M. genavense en la patologa. Desde el punto de vista hist
olgico, las lesiones estn formadas por agregados de macrfagos espumosos llenos de b
acilos cido resistentes (al igual que el MAC diseminado) (Maschek. 1994).
Mycobacterium
ulcerans
Mycobacterium
simiae
Mycobacterium simiae se aisl por primera vez en los monos de la India en 1965 (Ka
rassova, 1965). Se encuentra en los monos y se ha aislado tambin en las aguas res
iduales de hospitales. Es un patgeno humano anecdtico, aunque se ha asociado con p
atologa pulmonar crnica y enfermedad diseminada.
Mycobacterium ulcerans es endmico de las reas de Zaire. Uganda. Nigeria, Ghana. Ca
mern, Malasia, Nueva Guinea, Guyana. Mxico y Australia, quedando localizado entre
los 25 grados de latitud norte y los 38 grados de latitud sur. Los nios de entre
cinco y ocho aos son los ms frecuentemente afectados, aunque en un estudio de Aust
ralia la media de edad de personas afectadas fue de aproximadamente treinta aos y
un tercio de personas fueron mayores de 40 aos (Wolinsky, 1979). En las zonas en
dmicas, la enfermedad es ligeramente ms comn en varones. El reservorio de M. ulcera
ns y la va habitual de transmisin a los humanos permanece an desconocida. Otros nom

bres con los que se conoce a la enfermedad son la ulcera de Bairnsdale. por el re
a de Australia, donde le reconocida por primera vez. y lcera o enfermedad de Buruh
. debido al rea de Uganda que refiere la m a y o r parte de los casos. La enferme
dad debuta c o m o uno o. ms raramente, mltiples fornculos indoloros o nodulos subc
utneos en un rea expuesta, c o m o las piernas, donde posiblemente existi un trauma
tismo previo. Tras vanas semanas, los nodulos se ulceran y pueden surgir nodulos
y lceras satlites. Tpicamente, los ganglios linfticos suelen respetarse y los indiv
iduos afectados permanecen afebnles y sin sntomas sistmicos. salvo que se sobremfe
cten las lesiones por bacterias.
Mycobacterium
marinum
Mycobacterium marinum se reconoci como patgeno humano en 1951 (Norden, 1951). La i
nfeccin humana suele adquirirse a travs de la piel daada en contacto con aguas no c
loradas contaminadas, tanto dulces como saladas, aunque tambin puede transmitirse
a travs de va traumtica sin contacto con agua o bien por contacto con agua sin tra
umatismo precedente. Aparece una lesin nica papulonodular a las 2-3 semanas tras l
a inoculacin, siendo ms frecuente en codo, rodilla, pie o dedos del pie o de la ma
no, y suele evolucionar a lesin verrugosa o ulcerada. Ocasionalmente se forma un
absceso en el punto de inoculacin y mltiples nodulos secundarios pueden aparecer y
progresar centralmente a travs de los linfticos, simulando una esporotricosis (vas
e Cap. 54). Las lesiones cutneas en inmunodeprimidos pueden ser diseminadas. Las
manifestaciones extracutneas son infrecuentes: destacan: smovitis. osteomielitis
y lesiones oculares y larngeas (Woods. 1987). La histologa de las lesiones cutneas
varia segn el estadio de la infeccin. En fases tempranas existe un agregado de neu
trfilos rodeado por histiocitos. Ms tarde se ven linfocitos. histocilos y clulas de
Langhs con focos de necrosis fibnnoide. En las lesiones de ms de seis meses de ev
olucin se pueden encontrar linfocitos en la dermis. Las tinciones para bacilos cid
o resistentes suelen ser negativas, pero se pueden hallar los organismos en el i
nterior de los histiocitos.
MYCOBACTERIUM LEPRAE
Mycobacterium leprae es el causante de la lepra (tambin lamada enfermedad de Hans
en). Aunque no pertenece a las MTBC. y por tanto puede considerarse una "micobac
teria no tuberculosa", se estudia aparte, ya que es la nica micobacteria que no s
e ha podido cultivar por el momento. Los animales tiles como modelos de infeccin s
on el ratn de pie almohadillado y el armadillo de nueve bandas. M. leprae se ha l
ocalizado en casi la totalidad del mundo en algn m o m e n t o de la historia. Se
estima que entre 10 y 15 millones de personas en todo el mundo padece lepra, y
aproximadamente el 62% est en Asia y el 3 4 % en frica (Binford. 1982). Cerca de 6
.000 personas en EE.UU. padecen lepra, la mayora inmigrantes, y en algunos de los
casos afecta a individuos de los estados de las costas del golfo de California
y Hawai (Neill. 1985). L a lepra afecta predominantemente a humanos, pero tambin
es una infeccin natural de los armadillos salvajes en Lousiana y Texas, y se han
descrito casos espordicos en unos monos (Hastmgs. 1988). El mecanismo de transmis
in es desconocido, pero se acepta la teora de la transmisin de persona a persona a
travs de la aerosolizacin del organismo a partir de la nariz de la persona con lep
ra activa (vase ms adelante) que contacta con la mucosa nasal de otro individuo. L
a transmisin tambin puede producirse a travs de piel sana o por heridas penetrantes
, c o m o las producidas por espinas o picaduras de artrpodos. La leche de mujere
s lactantes con la enfermedad lepromatosa contiene bacilos que pueden transmitir
se a los nios, y tambin es posible una transmisin transplacentaria. Tambin se han de
scrito casos de lepra en humanos que han tenido contacto con armadillos (Lumpkin
, 1983). Adems, el hallazgo de una enfermedad similar a la lepra en armadillos y
el hecho de la aparicin de casos espordicos de lepra en personas sin contacto con
afectados sugiere la existencia de fuentes de M. leprae attenles a la humana (Bla
ke. 1987).

Mycobacterium
haemophilum
Mycobacterium haemophilum se describi por primera vez en 1978, pero probablemente
fue el bacilo cido resistente incultivable que se reconoci en lceras cutneas en 197
2 y 1974 (Sompolinsky. 1978' Lomvardas. 1972: Feldman, 1974). Esta es la nica de l
as micobacterias que requiere hemoglobina o hemina para su crecimiento. Las infe
cciones humanas por M. haemophilum son raras y suelen verse en personas con una
inmunosupresin subyacente, como inmunosupresin tras trasplantes o sida, pero se ha
n descrito algunos casos de adenopatias en nios sanos (CDC. 1991). L a enfermedad
se manifiesta ms frecuentemente como mltiples nodulos cutneos, lceras o edemas acom
paados de dolor que suelen afectar a las extremidades, pudiendo llegar a formar a
bscesos y fistulas abiertas que drenan un material purulento. Desde el punto de
vista microscpico, se ven focos de necrosis sin caseificacin rodeados por un infil
trado inflamatorio polimorfo con aparicin ocasional de clulas de Langhans en la de
rmis profunda. Se pueden ver los bacilos cido resistentes de un modo aislado o bi
en formando pequeos grupos dentro de las clulas.

CAPITULO 53

MICOBACTERIAS
1149
La mayora de las personas resisten de un modo efectivo la infeccin por M. leprae.
La resistencia depende de una correcta inmunidad celular contra los antigenos de
M. leprae. como sucede en la lepra tuberculoide. En personas en las que falla e
sa respuesta celular inmune especfica a dichos antgenos, los bacilos se multiplica
n dentro de los macrfagos. pudiendo producir una rpida lepra lepromatosa diseminad
a. Los defectos de la inmunidad celular que pueden afectar a los linfocitos T o
su interaccin con los macrtagos son la causa que facilita la enfermedad. Las lesio
nes de lepra se desarrollan tras un perodo de incubacin de 2 a 5 aos, variando la p
resentacin segn la respuesta inmune del husped. La lepra siempre afecta a los nervi
os perifricos, casi siempre a la piel y frecuentemente a las mucosas. Los tres si
gnos cardinales de la enfermedad son lesiones cutneas, reas cutneas de anestesia y
una afectacin de los nervios perifricos. El sistema desarrollado por Ridey y Jopli
ng (presentado ms adelante) se usa frecuentemente para clasificar el espectro clni
co e histolgico de las formas de lepra (Ridley, 1964). La lepra indeterminada, en
las etapas tempranas, se caracteriza por una o ms mculas hipopigmentadas en la pi
el con ligera prdida de sensibilidad. En cerca del 75% de los casos la patologa se
cura espontneamente, mientras que en el resto progresa frecuentemente tras un pe
riodo largo. Los tipos extremos de lepra lepromatosa, la forma diseminada anrgica
de la enfermedad y la tuberculoide o forma localizada, son formas clnicamente es
tables La lepra lepromatosa se caracteriza por distintas lesiones cutneas que van
desde una afectacin cutnea generalizada hasta unos nodulos difusos y de distribuc
in simtrica (llamados lepromas) repletos de organismos. Las lesiones afectan gener
almente a las partes ms fras de la superficie corporal, como el tercio anterior de
l ojo. la mucosa nasal y los troncos de los nervios perifricos superficiales. En
la enlermedad avanzada las lesiones se acompaan de prdidas sensitivas debido a la
afectacin de las fibras nerviosas drmicas. Desde el punto de vista microscpico, las
lesiones muestran histiocitos espumosos que contienen muchos bacilos cido resist
entes, ausencia o escaso nmero de linfocitos, mnima inflamacin inlraneural y mltiple
s bacilos cido resistentes en los nervios, perineuro, pared vascular y msculos. En
la lepra tuberculoide se desarrollan una o varias mculas o placas anestsicas bien
definidas, a veces acompaadas por un engrasamiento del nervio perifrico cerca de
la lesin cutnea. Desde el punto de vista histolgico, las lesiones muestran granulom
as no caseosos en los nervios y en la dermis que afectan a las capas bsales de la
epidermis, mientras que. si los hubiese, los bacilos cido resistentes estaran en
bajo nmero. La lepra bimorfa es una condicin clnica inestable que comparte caracters
ticas de ambas formas extremas. Puede desarrollar caractersticas ms cercanas a la
tuberculoide, que denominaramos progresin, o bien acercarse a la lepromatosa, deno
minndose entonces regresin.
las minoras tnicas o raciales, residencias de cuidados crnicos y personas que tiene
n condiciones mdicas asociadas a riesgo de tuberculosis (p. ej., silicosis, gastr
ectomizados. puentes yeyuno-ileales. personas por debajo del 10% de su peso idea
l, insuficiencia renal crnica, diabetes mellitus. tratamiento con altas dosis de
corticoides u otros frmacos inmunosupresores y neoplasias). Una reaccin de 15 m m
o mayor se considera positivo en el resto de las personas. Pueden existir falsos
positivos en la reaccin de PPD por infeccin con micobacterias no tuberculosas. Lo
s falsos negativos se pueden deber a una mala tcnica o a una mala conservacin del
derivado. Si se administra apropiadamente, los falsos negativos son raros en per
sonas relativamente sanas, pero pueden producirse en aproximadamente el 20% de l
os individuos con tuberculosis conocida cuando se les realiz por primera vez. La
mayoria de estos falsos negativos son debidos a una enfermedad y se convierten e
n positivos tras dos o tres semanas de tratamiento. Los factores causantes de un

estado generalizado de anergia, como malnutnon proteica, infeccin viral concomita

nte, sarcoidosis, neoplasias (como el linfoma). terapia con corticoides o nmunosu
presin e infeccin por VIH pueden ser responsables de un falso test negativo. El te
st de Mantoux suele permanecer positivo tanto tiempo como persista el acantonami
ento del bacilo en un loco quiescente. No obstante, la reaccin puede ir disminuye
ndo con el paso de los aos, lo que ocurre con mayor frecuencia en aquellos que so
brepasan los 55 aos. En estos individuos la reaccin puede ser estimulada (o llegar
a positivizarse) si se repite el test a la semana de realizarlo, reaccin que se
denomina efecto booster. Los compuestos preparados para test cutneos para micobac
terias n o tuberculosas incluyen el PPD-A (Mycobacterium avium). PPD-B (Mycobact
erium intracellulare). PPD-F (Mycobacterium fortuitum). PPD-G {Mycobacterium scr
ofulaceum) y PPD-Y {Mycobacterium kansasii). En EE.UU. estos compuestos se podia
n conseguir en el CDC, pero se interrumpi su administracin, ya que esos antgenos no
estaban estandarizados y las reacciones cutneas eran de dificil interpretacin.
DIAGNSTICO DE LABORATORIO Muestras
Las muestras recomendadas para el diagnstico de infeccin por micobacterias se reco
gen en la Tabla 53-3. Las muestras tomadas de sitios contaminados como esputo, o
tras secreciones respiratorias, secreciones gstricas, orina y las heces se deben
descontaminar antes de su inoculacin en el medio para prevenir un sobrecrecimient
o de la llora normal que enmascare la presencia de las micobacterias. La concent
racin de las muestras tras su descontaminacin aumenta la sensibilidad de las exten
siones y cultivos. Las muestras tomadas de zonas de cuerpo normalmente estriles n
o precisan descontaminacin previa al cultivo, como la sangre, el lquido cefalorra
qudeo, el lquido pleural o peritoneal y los tejidos. El procesamiento e inoculacin
de las muestras para su cultivo deberan realizarse en una cabina biolgica de segun
dad. El procesamiento con A/-acetil-L-cistena (NALC)-hidrxido sdico (Fig. 53-1) es
el mtodo ms comnmente utilizado en el laboratorio clnico para licuar, descontaminar
y concentrar muestras para la deteccin de micobacterias. Las muestras contaminada
s deberan ser refrigeradas si no se pudiesen procesar inmediatamente. Antes de pr
oceder al paso comentado en la Figura 53-1. se necesita un manejo adicional para
algunas muestras. Las muestras de lavado gstrico se deberan procesar inmediatamen
te, pero si no se puede evitar una demora, se debera aadir hidrxido sdico al 10% has
ta que el pH de la muestra (medido con papel de pH) sea neutro. Si se recogen ms
de 10 mi de secreciones gstricas, habra que centrifugar la muestra de 3.000 g a 3.
600 g durante 20 a 30 minutos, desechndose el sobrenadante y progresando el sedim
ento como se indica en la Figura 53-1. Para las heces. 1 2 g de muestra slida o b
ien 5 mi de muestra liquida se colocan en un tubo de 50 mi y se aade agua estril d
estilada hasta alcanzar un volumen de 1 0 mi. La suspensin se agita en un mezclad
or, se filtra a travs de una gasa y se procesa como se indica. Las muestras de or
ina se dividen en dos a cuatro
PRUEBAS CUTNEAS
Las pruebas cutneas de la tuberculosis son de utilidad para identificar a persona
s infectadas con el MTBC. pero no diferencian enfermedad activa de infeccin. Las
personas infectadas con MTBC desarrollan una reaccin de hipersensbilidad a las pro
tenas de los bacilos, en lo que toma su base el test cutneo con un derivado protei
co purificado (PPD). El mtodo preferido de test cutneo es el test de Mantoux. que
se lleva a cabo mediante la inyeccin intracutnea de 0,1 mi de PPD-S de fuerza inte
rmedia (5 unidades de tuberculina). La reaccin se interpreta a las 48-72 horas mi
diendo el dimetro de induracin en milmetros (Huebner. 1993). Una induracin de 5 mm o
mayor se considera como positivo en personas con VIH, en aquellos con reciente
contacto ntimo con personas con tuberculosis contagiosa y en aquellos con hallazg
os radiolgicos de lesiones residuales tuberculosas. Un resultado de 10 mm o mayor
, es positivo en aquellos que no cumplen esos criterios pero que tienen otros fa
ctores de riesgo para tuberculosis. Se incluyen en este grupo los extranjeros de
pases con alta prevalencia de tuberculosis (como frica, Asia o Amrica latina), los
adictos a drogas por va parenteral, poblaciones mdicamente desatendidas o en decl
ive, como

1150
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 53-3 Enfermedades causadas por micobacterias y muestras para el diagnstico
Enfermedad
Pulmonar
Especie de Mycobacterium' tuberculosis, kansasu. MAC, malmoense. simiae xenopi.
szuigai,
Muestras
Esputo (a primera hora de la maana, tos profunda. durante tres das seguidos). BAL,
contenido gastrico, tejido pulmonar, lquido pleural Sangre, mdula osea, tejidos a
fectados Aspirado o biopsia de las adenopatias Aspirado o biopsias de la lesin (s
e deberan desechar los tapones) extensin de las secreciones nasales y corles cutneo
s, biopsia de la lesin Lquido y vaina sinovial, hueso LCR. le|ido cerebral, biopsi
a de nervios perifricos Orina (a primera hora de la maana durante tres das consecut
ivos), tejidos afectados (rion, endometrio. trompa de Falopio, prstata, vesculas se
minales, epididimo) Tejido, heces Biopsia penloneal. lquido ascitico Hgado Pericar
dio, liquido pencrdico
Diseminada Adenopatias Piel, tejidos blandos
tuberculosis. MAC tuberculosis. MAC, scrolulaceum ulceraos, lortuitum-chelonae.
marinum, leprae
haemophilum.
Msculo esqueltico Sistema nervioso Genitourinario
tuberculosis, tuberculosis, tuberculosis
lortuitum-chelonae, leprae
marinum
Gastrointestinal Peritonitis Hepatitis Pericarditis
tuberculosis. tuberculosis tuberculosis. tuberculosis
MAC MAC
Las especies enumeradas son patgenos potenciales MAC Mycobacterium avium complex:
BAL lavado broncoalveolar: LCR: liquido cefalorraqudeo Modilicada de Woods GL: M
ycobacteria En Woods GL. Gutierrez Y (eds.): Diagnostic Pathology of Infections
Diseases. Filadellia. Lea 8 Febiger. 1993. p 378. con autorizacin.
tubos de 50 mi y se centrifugan a 3.000 g-3.500 g durante 30 minutos. Se decanta
el sobrenadante dejando unos 2 mi de sedimento en cada tubo. Los tubos se mezcl
an con un mezclador y los sedimentos se combinan, y si fuese necesario se aade ag
ua destilada hasta un volumen de 10 mi y entonces se descontamina como se muestr
a en la Figura 53-1.
Tinciones microbiolgicas
En extensiones teidas con la tincin de Gram la mayora de las micobacterias aparecen

como unos bacilos grampositivos escasamente teidos, pero a veces los bacilos no
captan el violeta y aparecen como "gram neutro" o como "gram fantasma" (Lmina 531). Imgenes similares de fantasmas pueden encontrarse en los macrfagos obtenidos c
on las tinciones de Wnght o Papanicolau. En general, para mejorar la eficiencia,
todas las muestras (menos la sangre) recogidas de personas con sospecha de infe
ccin por micobacterias se deberan examinar microscpicamente. Sin embargo, muchos la
boratorios no preparan extensiones de muestras en las que los bacilos cido resist
entes raramente sean vistos, tales como lquido cefalorraqudeo, orina y mdula sea. Pa
ra preparar la extensin se extienden dos o tres gotas del sedimento concentrado d
e un modo uniforme en un portaobjetos y se fija a 80 C durante 15 minutos o bien
de una a dos horas a 65 C-70 C en un calefactor elctrico. Hay dos tipos de tincin
que detectan los bacilos cido resistentes: carbol-fucsina (la clsica tincin de Zie
hl-Neelsen. que requiere calefacc en. y la tincin de Kinyoun) y las tinciones flu
orocromas preferidas (auramina-rodamina y auramina-O), que son ms sensibles. Las
extensiones teidas con la tincin de carbol-fucsina se examinan con un aumento de 8
00x a LOOOx (con aceite de inversin). Las extensiones teidas con tincin fluorocroma
se examinan con aumentos ms bajos (250x y 400x) que permiten visualizar ms campos
en menos tiempo. Las clulas de M. lortuitumchelonae complex se tien escasamente c
on la tincin lluorocroma y pueden pasar desapercibidas, por lo que cuando se sosp
echasen (p. ej.. en infecciones de heridas quirrgicas) las extensiones que result
en negativas sera conveniente teirlas con carbol-fucsina. Los resultados se comuni
can tras ver 100 campos y debera ser incluido un informe indicando si la extensin
se prepar directamente de la muestra o tras descontaminacin y concentracin. Las dir
ectrices para informar los resultados de las tinciones de muestras para bacilos c
ido resistentes se muestran en la Tabla 53-4 (Kent. 1985). En las extensiones tei
das con carbol-fucsina, los bacilos cido resistentes aparecen como unas varas lig
eramente curvas de color prpura-rojo (de 1 um a 10 jtm de largo y de 0,2 um-0,6 u
m de ancho) que frecuentemente son de forma arrosariadas y con bandas (Lmina 53-2
), pero tambin pueden tener forma de coco o filamentosas. En general, el aspecto
del bacilo cido resistente no facilita la identificacin de las especies, pero sin
embargo las clulas de cieas especies tienen caractersticas tiles para el diagnstico.
Por ejemplo, las clulas de M. kansasu Irecuenlemente aparecen c o m o un bacilo r
ayado (Lmina 53-3) ms largo que M. tuberculosis y similar a un cayado. Las cluPoner 10 mi (mximo) de esputo, orina u otros Huidos en un luho do centrifugado es
tril de plstico de 50 mi
I
Aadir el mismo volumen de NALt-2".. NaOll (preparado cada da) y tapar hermticamente
l
Me/clar en el mezclador durante 15 a 30 segundos
Dejar reposar la me/ela a temperatura ambiente durante 15 mininos (45 minutos pa
ra muestra! fecales)
l
Aadir 3(1 mi de lampn fosfato (pll ft.X): tapar los tubos y mc/clar i Centrifugar
a 3.000-3.600 x % durante 15 minutos (o 2.500 x g . I . I I . I I I I , - 20 min
inos)
.
Decantar el sobrenadante; resuspender el sedimento en 1.5 ml-2 mi de agua estril
o lampn i Preparar extensin para leir 1 Inocular en medio de cultivo
Figura 53-1. Protocolo para la descontaminacin mediante el uso de hidrxido sdico rV
-acelil-L-cisleina al 2%. y concentracin de muestras para la determinacin de micob
acterias por extensin y cultivo.

CAPTULO 53

MICOBACTERIAS
1151

dos son ms sensibles que los slidos y aportan una ms rpida deleccin del crecimiento m
icobacteriano (Stager. 1991. Anargyros, 1990; Abe. 1992). Los sistemas lquidos ac
tualmente disponibles sobre el s i s t e m a radiomtrico N." de B A A R c o n N."
de B A A R c o n son B A C T E C 460TB (BD Biosciences). SEPTI-CHECK A F B( B D
Biosciencarbol-fucsina (1.000x) f l u o r o c r o m o (450x) Informe ces), t u
b o s indicadores d e crecimiento d e micobacterias B B L (MGIT: B D BioNo se ve
n BAAR 0 0 sciences), el s i s t e m a de cultivo ESP II (sistemas de diagnstico
T r e k ) y el 1-2 en 70 campos Dudoso, repetir 1 2 en 300 campos BacT/Alert MB
(Organon Teknika). El C D C tambin r e c o m i e n d aq u e los sis(un barrido y
medio) (3 barridos) l e m a sd e cultivos u s a d o s detecten e lc r e c i m i
e n t od em i c o b a c t e r i a sd e n t r od e 2-18 en 50 11 1-9 en 100 campo
s campos (un barrido) una m e d i a de 1 4 das. 1 9 en 10 campos 4-36 en 10 campo
s 2+ La composicin de los m e d i o s slidos habitualmente utilizados se describe
3+ 1 -9 por campo 4-36 por campo en l a T a b l a 53-5. Estos m e d i o s estn di
sponibles en t u b o s de tapn de r o s c a 4+ >36 por campo >9 por campo y botel
las de prescripcin de 29,57 cm, el m e d i o de b a s e de a g a r tambin BAAR bac
ilos acido resistentes; Bamdo revision de loda la extension est disponible en las
p l a c a s de Petri. Las botellas de prescripcin s e prefieModilicada de Kent P
T. Kubica GP Public Health Mycobacteriology A Guide ren a los t u b o s con tapn
de r o s c a por r a z o n e s de seguridad y p o r q u ep r o v e for the Level
III Laboratory Atlanta, Department ol Health and Human Servi ces. 1985 con auto
'i-racin e n una m a y o r superficie p a r ae lc r e c i m i e n t od e las m i
c o b a c t e r i a s .L a sm u e s tras cutneas deberan inocularse en un m e d i
o de h u e v o o de agar, y p a r a a s e g u r a r la obtencin de M. haemophilum
(vase arriba) tambin debera depositarse e nu nm e d i od ea g a r chocolate, agarsangre d eo v e j ad eC o l o m las de M A Cs u e l e n ser pleomrficas, o c a s
i o n a l m e n t ec o c o b a c i l a r e s y se lien bia al 5 % ,a g a r Muelle
r-Hinton c o ns u p l e m e n t o de Fildes o L o w e n s t e m J e n con el cido
perydico de S c h i f f (PAS). Las clulas de M. marnum son tpisen con citralo a m o
n i o frrico al 2%. T o d o s los cultivos deberan ser i n c u b a c a m e n t e
ms largas y ms a n c h a s que las de M. tuberculosis y suelen m o s dos a 37'C en
una atmsfera con el 5 % 1 0 % de CO y los m e d i o s de t u b o t r a r rayas. L
as clulas de M. leprae se tien ms dbilmente que la mayora deberan i n c u b a r s e e
una posicin i n c l i n a d a con los t a p o n e s flojos d u r a n t e de l a
s otras micobacterias. al m e n o s una s e m a n ap a r aa s e g u r a r una c
o r r e c t a distribucin del i n o c u l o La especificidad de las tinciones par
a bacilos cido resistentes es del sobre la superficie. P a r am u e s t r a s cutn
eas, se d e b eh a c e r un s e g u n d o gru9 9 %om a y o r , y la sensibilidad
es a p r o x i m a d a m e n t e del 2 5 % 7 5 % (Murray, po de cultivos i n o
c u l a n d o e incubndolos a 30C. ya que ciertas m i c o b a c t e 1980: Rickman
. 1980; Strumpf. 1979). Los falsos positivos (tincin positiva rias c r e c e nm e
j o rat e m p e r a t u r a s ms bajas (M. marinum. M. haemophilum. c o n cultiv
o negativo) p u e d e n deberse a m i c r o o r g a n i s m o s no viables, c o
m o M. chelonae. M. ulcerans). T o d o s los cultivos deben s e re x a m i n a d
o ss e m a p u e d ep a s a r en pacientes que estn t o m a n d o el tratamiento
antituberculon a l m e n t e al m e n o s durante seis s e m a n a s . so, a un
a prolongada descontaminacin que destruya t a n t o a las bacterias L am a y o r
ventaja d e los cultivos c o n v e n c i o n a l e se sq u ep e r m i t e nl a v
isuac o n t a m i n a n t e sc o m o a las micobacterias o bien a una contaminac
in duranlizacin de la morfologa y la pigmentacin de l a s col o ni a s, lo que es til
para te el p r o c e s o de teido. Los factores que influyen en la sensibilidad
de los el diagnstico, e s p e c i a l m e n t ep a r a diferenciar las colonias d

e M. tuberculoresultados son: 1) poblacin de pacientes (las personas con lesiones

cavii c o b a c t e r i a s no tuberculosas. El a s p e c t o y las caracterstit
adas tienen ms probabilidad de que tengan un esputo positivo que las que sis de a
quellas m c a sd e crecimiento d e las colonias d e las m i c o b a c t e r i a
sh a b i t u a l m e n t e hallano las tienen). 2) tipo de m u e s t r a s (las
respiratorias es ms probable que d a s se recogen en la T a b l a 53-6. L a s des
ventajas de los m e d i o s slidos s o n sean positivas que otras muestras), 3) e
l nmero de m u e s t r a s examinadas, el prol o ngado t i e m p o de c r e c i m
i e n t o de l a s m i c o b a c t e r i a s (las col o ni a s no 4) el nmero de
bacilos cido resistentes presentes en las m u e s t r a s (son son visibles g e
n e r a l m e n t e en un m e d i o slido antes de 3-4 s e m a n a s ) y su neces
arios de 5.000 a 10.000 microorganismos/ml de m u e s t r ap a r a un reb a j a
sensibilidad. La inoculacin en discos de a g a r Middlebrook, examinnsultado posit
ivo), 5) las especies presentes (las m u e s t r a s con M. tuberculodose con el
microscopio, permite una ms rpida deteccin de colonias, p e r o sis o M. kansasii
pueden ser ms positivas que las que contienen otras s up r o c e s oe sm u y labo
rioso, n o estando disponible e nm u c h o s laboratorios micobacterias), 6) la
experiencia del observador. 7) la tincin usada. Las tinclnicos (Welch, 1993). cion
es fluorocromas son ms sensibles y fciles de l e e r que las tinciones El s i s t
e m a radiomtrico s e m i a u t o m a t i z a d oB A C T E CT B 4 6 0 utiliza u n
con carbol-fucsina y se r e c o m i e n d a np o r los expertos del C D C (Teno
ver, e d i o lquido (uno p a r a sangre [13 A.) y otro p a r a el r e s t o de m
u e s t r a s [12 B]) 1993). Para p o d e r detectar el resurgimiento de la tube
rculosis en EE.UU. el m que c o n t i e n e un sustrato de cido palmitico m a r c
a d o con C, C a d am u e s t r a CDC tambin sugiere que. para las m u e s t r a
s respiratorias, los resultados de e z c l a de antibiticos, e x c e p t oa l a
s tinciones s e a n informados dentro de las 24 primeras h o r a s de la recepes inoculada en un vial y se le aade una m la de sangre. Se incuban a m e d i oa
m b i e n t e a 37 C durante 5 6s e m a n a s . cin de la muestra, lo que signifi
ca tener que p r o c e s a r las m u e s t r a s todos Para asegurarse el aislam
iento de M. genavense. los cultivos de s a n g r e los das de la semana. (especia
lmente los q u e provienen d e pacientes c o n sida) d e b e ni n c u b a r s ed
e 8a1 0 semanas. La multiplicacin de los bacilos en un m e d i o lquido y el uso
Mtodos de cultivo de sustrato m a r c a d o libera CO al e s p a c i o que q u e
d ae n c i m a del medio. L a s botel l a s s o n m a n u a l m e n t e cargadas
en el B A C T E C TB460, q u em i d e la P a r a un ptimo aislamiento de las m i
c o b a c t e r i a s a partir de las m u e s t r a s cantidad de '"CO, y c a l
c u l a el ndice de c r e c i m i e n t o (Gl). Un Gl m a y o r de 1 0 clnicas, l
os e x p e r t o s del CDC r e c o m i e n d a n la inoculacin de las m i s m a s
a sugiere que h a y micobacterias, y c u a n d o el Gl a l c a n z ae n t r e 50
y 1 0 0 se un m e d i o lquido y otro slido (Tenover. 1993). En general, los m e
d i o s lquiTabla 53-4 Directrices para informar las e x t e n s i o n e s para b
acilos cido resistentes
1 : l4 s
Tabla 53-5 Medio
M e d i o s habitualmente utilizados para el aislamiento de micobacterias Compon
entes Huevos coagulados, sales, glicerol. harina de patata Sales, vitaminas, cof
actores, cido oleico, albmina, catalasa, glicerol, dextrosa Sales, vitaminas, cofa
ctores, cido oleico, albmina, catalasa, glicerol, hidroxilato de casena al 0,1% Sal
es, vitaminas, cofactores. cido oleico, albmina, catalasa. glicerol, dextrosa e hi
droxilato de casena Agente(s) inhibidores 0.025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl
verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 50 pg/ml
carbenicilma 10 (ig/ml anfoteriema B 200 unidades/ml polimixma B 20 pg/ml trime
troprim-laclato
Lowenstein-Jensen Middlebrook 7H10 Midrllobrook 7H11 Selectivo 7H11 (medio de Mi
tchison)

^
_
j

1152
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 53-6
Morfologa de las colonias y caractersticas del crecimiento de las diferentes micob
acterias halladas en el laboratorio clnico Colonias Morfologa Rugosa Rugosa, fina
o Iransparente Lisa pequea, fina, Iransparente o larga, opaca, abovedada rugosa Pi
gmentacin N (amarillento) N (incoloro) N Tasa de crecimento (semanas)' 4-6 4-6 46 Comntanos
Especie d e Mycobacterium M. tuberculosis M. bovis M. avium complex
M. M. M. M M. M. M. M. M M M
scrotulaceum kansasu lortuitum-chelonae xenop szulgai malmoense simiae marmum hae
mophilum gordonae Ihermoresislible
Lisa, globulosa Rugosa, cristales de p-caroteno Lisa o rugosa Lisa, extensiones
filamentosas ("nido de pjaros) Lisa o rugosa Lisa Lisa Arrugada, brillante, lisa,
hemiesfnca (raro) rugosa, seca Rugosa. lisa Lisa Lisa o rugosa
S P II s S a 37C. P a 2SC Incoloros P" P N S P
4-6 4-6
1
El crecimiento requiere 8 semanas algunas colonias se vuelven levemente pigmenta
das con la incubacin prolongada El pigmento varia de amarillo claro a naranja osc
uro Raras veces son N o S Crece a 42T
4-6 4-6 2-3 4-6 2-3 4-6 4-6
<1
Crecimiento ptimo a 31-33C Crecimiento ptimo a 20-32C Crecimiento ptimo a 37-45C, El
igmento es amarillo-naranja, llegando hasta marrn
M M M M
terrae-triviale nonchromogenicum flavescens smegmatis
Lisa (M. terrae) o rugosa (M. triviale) Rugosidad intermedia Lisa Rugosa. lisa
N N S N (amarillento)
4-6 4-6 2-3
<1
Promedio en un medio slido " La produccin de pigmento suele requerir una exposicin
prolongada a la luz N: no lotocromgena, S escolocromgena; P: fotocromOgena (vase Ta
bla 53-1); : ciertas especies tienen ocasionalmente la morfologa indicada.
hace una extensin del medio para teir bacilos cido resistentes. Los viales que cont
ienen bacilos cido resistentes se subcultivan a su vez en un medio slido y se hace
n test directos para su identificacin (se comenta en la siguiente seccin). Para cu

ltivos positivos para micobacterias en sangre de pacientes con sida, se debera ha

cer un subcultivo en agar Middlebrook 7H11 que contenga micobactm J, para obtene
r M. genavense si los subcultivos iniciales del medio liquido son negativos, o b
ien, si el medio liquido es positivo, se deberan mandar al laboratorio de referen
cia para hacer los test oportunos. El SEPTI-CHEK AFB es un medio de cultivo bifsi
co para micobacterias que consiste en un medio lquido y un medio agar en un canal
cerrado, similar al cultivo bifsico de sangre descrito en el Capitulo 57. El med
io se inocula con la mueslra, el canal se sujeta a la parte superior de la botel
la y el sistema se invierte para permitir que el liquido H u y a por el medio de
l agar. El sistema se incuba de 6 a 8 semanas de 35 C a 37 C con un 5% a 7% de C
O . y a intervalos regulares el lquido se subcultiva en el medio slido por el cana
l al invertir el sistema. La sensibilidad de este sistema es similar al de BACTE
C TB460 (Abe. 1992; D'Amato, 1991: Isenberg. 1991). El tiempo de deteccin de crec
imiento es, sin embargo, ms largo que en el BACTEC TB460, aunque ms rpido que en un
medio slido convencional. El BBL-MGIT consiste en 4 mi de caldo 7H9 modificado y
un indicador fluorescente metido en silicona en la ase de un tubo de vidrio de 1
6 x 100 mm. Los tubos se inoculan con la muestra, se aade una mezcla de antibitico
s, para frenar el crecimiento de las acterias contaminantes, y un enriquecedor de
l crecimiento de micobacterias, y los tubos se tapan y se incuban a 37C durante
ms de ocho semanas. Para detectar el crecimiento de las micobacterias, los tubos
se colocan encima de un transiluminador de rayos ultravioletas de 365 nm o enfre
nte de una lmpara de Wood. La aparicin de una fuerte fluorescencia en el sensor (u
n brillo de color naranja en la base del tubo) indica crecimiento De modo altern
ativo, los tubos se pueden incuban en el instrumento totalmente automatizado BAC
TEC 960. que monitoriza de un modo continuo la florescencia y las seales de aquel
los que son positivos. El MGIT es lan sensible como el BACTEC 460 para la detecc
in de micobacterias, pero el tiempo medio de crecimiento es algunos das mayor con el MGIT (
Hanna. 1999; Pfyffer, 1997; Cornfield, 1997). Adems del BACTEC MGIT 960, hay otro
s tres sistemas totalmente automatizados de monitorizacin continua disponibles pa
ra el cultivo y deteccin de micobacterias: el sistema BACTEC 900MB (BD Bioscience
s) (Zanetti, 1 9 9 7 : Pfyffer, 1997), el sistema BacT/MB (Organon Teknika) (Bru
nello. 1999: Rohner. 1997) y el sistema de cultivo ESP II (sistemas de diagnstico
Trek) (Tholken.1997. Woods.1997). Con cada sistema, las botellas se cultivan en
el respectivo instrumento, donde se monitorizan los cambios de produccin y consu
mo de diferentes gases, lo que indica el crecimiento de micobacterias u otros mi
croorganismos. En general, estos sistemas son comparables al BACTEC 460TB y tien
en las ventajas de ser totalmente automatizados y m e n o s laboriosos.
Test para ia identificacin de micobacterias
La identificacin de micobacterias se h a basado tradicionalmente en la tasa de cr
ecimiento en medios slidos, la morfologa de la colonia, la pigmentacin de la coloni
a con y sin luz y los resultados de los test bioqumicos. Los protocolos de identi
ficacin de micobacterias mediante estos factores en el laboratorio de microbiologa
se ilustran en las Figuras 53-2 a 53-3. Los lest bioqumicos especficos se describ
en con detalle en otros apartados (Kent. 1985). Aunque la mayora de las especies
se pueden identificar de este modo, los resultados no suelen estar disponibles h
asta vanas semanas o meses tras el crecimiento de colonias en un medio slido. Se
recomiendan mtodos ms rpidos de identificacin que permitan la identificacin de MTBC a
ntes de 21 das tras la recogida de las muestras (Tenover, 1993). Actualmente el mt
odo de diagnstico de tuberculosis pulmonar ms rpido es el uso de amplificacin de cido
s nucleicos para la deteccin directa de M tuberculosis en muestras clnicas (Dalovi
si, 1996: Ichiyama. 1996. Wobeser. 1996). En la actualidad, dos de estos test (t
est directo de Mycobacterium tuberculosis amplificado [GEN-PROBE Inc.) y test de
Mycobacterium tuberculosis AMPLICOR [sistemas diagnsticos Roche Inc.]) estn dispo
nibles en

CAPITULO 53

MICOBACTERIAS
1153
Figura 53-2. rbol de decisin para la identificacin de micobacterias no fotocromgenas
. Obsrvese que aunque Mycobactenum simiae suele ser fotocromgeno. este hecho es in
estable y puede resultar aparente nicamente tras la exposicin a la luz durante un
periodo largo. Algunas de las c e p a s de Mycobacterium bovis dan un positivo e
n la reaccin con niacina. (De Woods GL. Gutirrez Y: Diagnostic Pathology o! Infect
ions Diseases. Filadelfia, Lea & Febiger. 1993, con autorizacin.)
todo el mundo y hay otro ms que est en estudio (BDProbeTec ET System, B D Bioscien
ces). El test amplicor est aceptado por la Food and Drug Administration para el a
nlisis de muestras respiratorias BAAR positivas. El test Gen-Probe es aceptado pa
ra su uso con muestras respiratorias positivas y negativas para bacilos cido resi
stentes. Datos recientes sugieren que los test podan ser de utilidad en muestras
negativas para bacilos cido resistentes en pacientes con alto riesgo de tuberculo
sis (p. ej., personas inlectadas con VIH y para personas encarceladas en centros
penitenciarios), lo que permitira un diagnstico precoz y un rpido inicio del trata
miento (Gamboa, 1998; Bergmann, 1999). Los test aparecen para poder comparar las
muestras de otros focos diferentes del respiratorio y. ms an. pueden ser tiles par
a el diagnstico de tuberculosis extrapulmonar (Pfyffer. 1996; Gamboa. 1997).
El test BACTEC TB NAP (para-nitro-<x-acetil-amno-|l-hidroxipropiofenonai diferenc
ia a los MTBC de las micobacterias no tuberculosas en tan slo cuatro o cinco das t
ras haber detectado bacilos cido resistentes en un vial BACTEC 1 2 B (Gross, 1985
). Una cantidad de caldo del vial 1 2 B que sea positivo se inyecta en dos botel
las del medio 12B. una con NAP y otra sin NAP. Un incremento en el Gl en la bote
lla sin NAP y sin producirse un incremento en la que lo contiene indica que se h
a aislado un MTBC y que esas especies son susceptibles al NAP y, por tanto, inhi
bidos por el. Sin embargo, este test no diferencia las especies de MTBC. La prue
ba del ADN quimioluminiscente permite idenlificar algunas especies de micobacter
ias en tan slo una o dos horas tras el crecimiento (tanto en medio liquido como e
n slido) (Evans. 1992: Lebrun. 1992; Goto. 1992; Reisner, 1994). Las pruebas come
rciales especificas para MTBC, MAC, M. avium.
M. s c r o / u l a c e i i n i
M. x e n o p i
vi. marnum
Figura 53-3. rbol de decisin para la identificacin de micobacterias fotocromgenas. (
De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: Laboratory P
rocedures in Clinical Microbiology, 2.'' edicin. Nueva York. SpringerVerlag, 1985
. con autorizacin. )
Figura 53-4. rbol de decisin para la identificacin de las micobacterias escotocromge
nas habituales. Obsrvese que Mycobactenum szulgai es fotocromgeno a 25' C y escoto
cromgeno a 35 C y que Mycobacterium xenopi c r e c e bien a 42C. (De Robert GD: M
ycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: Laboratory Procedures in Cl
inical Microbiology. 2.- edicin. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorizac
in.)
:

1154
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Test de sensibilidad
Actualmente se ha desarrollado una normativa estandarizada de sensibilidades de
micobacterias nicamente para M. tuberculosis aislado. El estudio puede realizarse
con colonias aisladas o en los viales positivos BACTEC 1 2 B (test indirecto) o
de muestras de esputo con baciloscopia positiva (test directo). Tradicionalment
e el mtodo de proporcin, un test modificado de dilucin de agar. se ha utilizado par
a evaluar la sensibilidad de M. tuberculosis al tratamiento. Con este mtodo los gr
menes aislados que muestren alguna resistencia mayor del 1% se consideran resist
entes a esa concentracin de frmaco. Los resultados estn disponibles en un minimo de
21 das. El sistema BACTEC TB460 tambin puede ser utilizado para estudiar la sensi
bilidad de las MTBC. estando disponibles los resultados en 5-7 das. Una descripcin
ms detallada de estos procedimientos se puede encontrar en otros textos (Hawkins
, 1991). Acerca de la posibilidad de la multirresistencia de M. tuberculosis, ex
pertos del CDC recomiendan que se informe del resultado de la sensibilidad en me
nos de 28 das tras la recepcin de las muestras, un plazo que en la actualidad slo p
uede ser logrado por el BACTEC TB (Tenover, 1993). Tambin se puede estudiar la se
nsibilidad de las micobacterias no tuberculosas que tengan importancia clnica (Wa
llace. 1997): sin embargo, para algunas especies puede existir cierta correlacin
entre los test de sensibilidad y la respuesta clnica al tratamiento. Adems, no hay
mtodos de referencia estandarizados para estudio de sensibilidad de algunos de e
sos organismos. Los mtodos usados son el mtodo de proporcin, ensayos radiomtncos y m
icrodilucin del caldo de cultivo. Para M. lortuitum-chelonae complex aislado se r
ecomienda hacer la microdilucin y test con amicacina. celoxitma. ciprotloxacino,
clarilromicina, doxiciclina, imipenem (slo para M. lortuitum). sulfametoxazol y t
obramicna (slo para M. chelonae) (Woods, 1999). La dilucin del caldo (tanto macrodi
lucin como microdilucin) debera ser usada nicamente para estudiar la sensibilidad de
M. aviuma los macrlidos (clarilromicina yo acitromicina) (Inderlied. 1997: Walla
ce. 1997).
M. chelonae
subespecie abscessus
V/. chelonae subespecie borstelense
Figura 53-5. rbol de decisin para la identificacin de micobacterias con un rapi do
crecimiento con importancia clnica. Los asteriscos indican que se necesitan tesi
bioqumicos adicionales para su diferenciacin. (De Robert GD: Mycobacteria and Noca
rdia En Washington JA II [ed.]: Labotatory Procedures in Clinical Microbiology.
2. ed. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorizacin.)
1
M. intracellulare. M. gordonaey M. kansasii estn actualmente disponibles. Estos e
studios requieren un equipamiento mnimo (p. ej.. luminmetro, estufa, etc.). Las de
sventajas de las pruebas incluyen errores en la identificacin de un pequeo porcent
aje de los MAC aislados (3%-5%) y resultados talsos positivos con la prueba de M
TBC (Butler, 1994; Lebrun, 1992; Bull, 1992). La cromatograla con gas lquido, la c
romatografa con lquidos de alto rendimiento y la cromatografa de capa fina permiten
identificar colonias de micobacterias en un medio slido en 2-4 horas. Estas tcnic
as, dado que son complejas y requieren un equipamiento caro, suelen realizarse p
referentemente en laboratorios de referencia o de investigacin. Rara vez puede re
sultar imposible identificar una micobacteria por los mtodos previos. Un ejemplo
es M. genavense. cuya identificacin requiere la determinacin de las regiones hiper

variables de los genes ARN ribosomales 16S. Estas pruebas altamente sofisticadas
slo se llevan a cabo en laboratorios de referencia o de investigacin.
TRATAMIENTO
Los aislamientos iniciales de Mycobacterium tuberculosis en todos los pacientes
con tuberculosis deberan obligar a estudiar la sensibilidad a los tuberculostticos
de primera lnea como isoniacida. rifampicina, piracinamida y elambutol. La sensi
bilidad deberia repetirse si el paciente continuase con esputo positivo tras tre
s meses de tratamiento (Tenover, 1993). Si el bacilo aislado es resistente slo a
rifampicina o a dos o ms agentes de primera lnea, tambin se debera evaluar la sensib
ilidad a los frmacos de segunda lnea (estreptomicina, etionamda, kanamicna. capreomi
cina. ofloxacino y n fabutina). El rgimen quimioteraputico actualmente recomendado
para el tratamiento de tuberculosis (Tabla 53-7) se debe iniciar antes de los r
esultados de sensibilidad, pero se debe alterar en funcin de los resultados si se
demostrasen resistencias. La medicacin se deberia administrar mediante observacin
directa. Los regmenes habitualmente empleados para el tratamiento de

CAPTULO 53

MICOBACTERIAS
1155
la infeccin por micobacterias se recogen en la Tabla 53-7 (Inderlied. 1993; Wolin
sky. 1979; Wallace, 1983, 1994, 1997; Horowictz, 1994). Para muchas micobacteria
s no tuberculosas la duracin ptima del tratamiento se desconoce, pero los interval
os indicados en la Tabla 53-7 han sido exitosos en algunos casos.
la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) recomienda el uso de la vacuna BCG en lo
s nios infectados por VIH al nacimiento o al poco tiempo del nacimiento. Est contr
aindicado su uso en nios con infeccin VIH asintomtica o en poblaciones donde el rie
sgo de tuberculosis es bap y en personas conocidas o con sospecha de estar infec
tadas por VIH (WHO. 1987).
Mycobacterium avium complex PREVENCIN Mycobacterium tuberculosis
La enfermedad diseminada por MAC en pacientes con sida se asocia con gran morbil
idad y una disminucin de la supervivencia (Horsburgh. 1991: Nightingale, 1992). Ms
an, lo ms deseable seria la prevencin de la entermedad. Dado que el MAC es ubicuo
en el ambiente, la medida ms razonable para la prevencin es la inmunoregulacin o la
quimioprofilaxis. Actualmente, el Servicio de Salud Pblica de EE.UU. y la Socied
ad Americana de Enfermedades Infecciosas recomiendan claritromicina o acitromici
na de profilaxis en pacientes con sida con CD4- por debajo de 50 pl (CDC. 1997).
La rifabutina es la alternativa para la profilaxis de la enfermedad por M. aviu
m complex si ninguna de las previas fuese tolerable.
Se describen cuatro estrategias generales para el control de la tuberculosis (CD
C. 1988). La ms importante es la identiticacin precoz y el adecuado tratamiento de
personas con la infeccin tuberculosa. Esta medida hace que las personas infectad
as dejen de ser contagiosas en pocas semanas y eventualmenle logra su curacin. La
segunda estrategia consiste en identificar y tratar a los individuos con tuberc
ulosis no contagiosa: enfermedad extrapulmonar. enfermedad pulmonar primaria en
nios, enfermedad pulmonar sin confirmacin bacteriolgica e infeccin por M. tuberculos
is sin enfermedad (p. ej asintomticos con test cutneo positivo y radiografa de trax n
ormal). La tercera estrategia consiste en la creacin de un ambiente de segundad e
n las situaciones en las que existe un alto riesgo de transmisin: salas de autops
ias, habitaciones para recogida de esputo inducido, reas de espera de pacientes r
espiratorios, centros penitenciarios, algunos refugiados sin hogar y los laborat
orios de microbiologa. Para llevar a cabo esto, se deben documentar muchos asunto
s (Segal-Maurer, 1994). Las habitaciones de los pacientes infecciosos, o en las
que las muestras infecciosas sean manejadas, deben estar a presin negativa y el a
ire que pueda contaminarse con microgotas infecciosas debe ser eliminado al exte
rior. Un sistema de ventilacin de un solo paso (mejor mediante la colocacin de una
s salidas supletorias de aire en el techo y la entrada de aire cerca del suelo)
es lo recomendable, con un mnimo de 6 recambios de aire por hora (12 recambios po
r hora en cuartos de autopsias). Deben seguirse estas precauciones universales c
uando se manejan todas las muestras, y tanto las muestras como los cultivos se d
eben manipular en una cabina certificada de seguridad clase II. Adems debe emplea
rse un respirador de partculas que filtre partculas entre 1 pm-5 pm de dimetro y se
debe entrenar al personal dentro de un programa respiratorio. Las mascarillas q
uirrgicas estndar no son adecuadas. La cuarta estrategia consiste en la vacuna del
BCG, una vacuna atenuada derivada de una cepa de M. bovis de las francesas Calm
ette y Gurin. Su eficacia en la prevencin de la tuberculosis es controvertida, per
o un reciente metaanlisis de la bibliografa sugiere que reduce el riesgo de tuberc
ulosis en un 50% (Colditz. 1994). En EE.UU. la vacuna BCG se recomienda slo en nio
s con test cutneo negativo y que pertenezcan a alguno de los siguientes grupos (C

DC. 1988): 1) aquellos en contacto ntimo y prolongado con personas tratadas sin xi
to o reticentes al tratamiento, con tuberculosis pulmonar contagiosa y que no se
puede separar de la fuente de exposicin y para los que el tratamiento preventivo
a largo plazo no es posible, 2) aquellos expuestos continuamente a personas con
tuberculosis por cepas resistentes a isoniacida y rifampicina. 3) aquellos grup
os con una tasa de infeccin superior al 1% por ao. y para los que los programas ha
bituales de vigilancia y tratamiento han sido intentados pero no han sido viable
s. La vacuna BCG no se recomienda en los trabajadores de salud de EE.UU. La reco
mendacin actual para la proteccin de los profesionales de la salud es una adecuada
vigilancia que incluye perodos sistemticos con test cutneos (al menos anualmente,
o ms frecuentemente para los grupos de alto riesgo) y profilaxis con isoniacida p
ara conversiones recientes del test de la tuberculina y para personas con test c
utneo positivo y que estn en contacto intimo con tuberculosos o que tengan patologa
mdica como diabetes, insuficiencia renal o inmunosupresin patolgica o teraputica (C
DC. 1988). La vacuna BCG no debe emplearse en inmunosuprimidos y debe darse con
cuidado en aquellos con riesgo de infeccin por VIH. Se ha descrito enfermedad dis
eminada por M. bovis en pacientes con sida y adenopatas por M. bovis en nios infec
tados por VIH (CDC. 1985: Blanche, 1986). Sin embargo, la enfermedad diseminada
por M. bovis no se ha descrito en pacientes con VIH asintomtico. En poblaciones d
onde el riesgo de tuberculosis es alto.
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Washington C. Winn, JR., M.D. M.B.A. Fred W. Westenfeld, MT(ASCP)SM
NOMENCLATURA, TAXONOMA Y TCNICAS DE IDENTIFICACIN Colonia de hongos Estructura de l
evaduras e hitas Pigmento de hifas Estructuras reproductoras asexuales Estructur
as reproductoras sexuales Tasa de crecimiento Inhibicin por cicloheximida Tempera
tura ptima para el crecimiento Pruebas bioqumicas Dimorfismo Pruebas inmunologas TCN
ICAS DE DIAGNSTICO Recogida de muestras Examen directo de muestras Aislamiento de
hongos en cultivo Seguridad en el laboratorio Tcnicas para el estudio morfolgico
de aislamientos fngicos Test de sensibilidad de aislamientos fngicos LEVADURAS E I
NFECCIONES POR LEVADURAS Gnero Candida Gnero Cryptococcus Gnero Malassezia Otras le
vaduras y patgenos semejantes a levaduras y saprofitos HONGOS DIMRFICOS Histoplasm
a capsulatum Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Sporothrix schenckii
Otros hongos dimrficos
DERMATOFITOS 1159 Enfermedad clnica Diagnstico de laboratorio y otras investigacio
nes Especies de Microsporum Especies de Trichophyton Epidermophyton floccosum MO
HOS DEMATIACENOS Enfermedad clnica CIGOMICETOS Factores de nesgo y enfermedad clni
ca Patologa de la infeccin por cigomicetos Diagnstico de laboratorio y otras invest
igaciones Especies de Rhizopus Otros cigomicetos 1166 MOHOS HIALINOS SEPTADOS (H
IPOMICETOS) Factores de riesgo Enfermedad clnica Patologa de la infeccin por hipomi
cetos Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones Aspergillus fumigatus Asp
ergillus ftavus Aspergillus niger Otras especies de Aspergillus Especies de Fusa
rium Pseudallescheria boydii/Scedosporium apiospermum Especies de Penicillium Ot
ros mohos hialinos INFECCIONEES CAUSADAS POR ALGAS ACLORFILAS 1176 PNEUMOCYSTIS C
ARINII Factores de riesgo Enfermedad clnica Patogenia de las infecciones por Pneu
mocystis Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones BIBLIOGRAFA
1181
1185
1184
1186
1171
1190 1191
1192
La micologia mdica se encuentra entre las diversas reas de la microbiologia y enfe
rmedades infecciosas que abarcan levaduras unicelulares y mohos filamentosos, ag
entes que causan infecciones superficiales de la piel y enfermedades sistmicas de
localizacin profunda, patgenos histricos establecidos y hongos saprofitos que han
alcanzado el estatus de patgeno por las enfermedades y tratamientos modernos. Par
a los patlogos que se han formado en patologa quirrgica, la micologia mdica debera se
r una adaptacin natural. La identificacin de hongos se logra en su mayoria por la
destreza humana en su observacin mejor que con mquinas. El estudio macroscpico de l
a muestra quirrgica se detiene en la morfologa de las colonias de los hongos aisla
dos en medio agar; mientras que en anatoma patolgica, el anlisis definitivo del pro
blema debe esperar hasta que se observe al microscopio. La caracterizacin de la e
structura molecular de las clulas para el uso de anticuerpos monoclonales no se h
a desarrollado mucho en micologa, pero se ha hecho una aproximacin y el diagnstico

molecular ser indudablemente de una gran importancia en el futuro.

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1159
El objetivo de este captulo es presentar los lundamentos de la micologia mdica, po
niendo ntasis en los usos prcticos y los patgenos fngicos que encontramos regularmen
te en el laboratorio. Llamamos la atencin al lector de la existencia de algunos gr
menes potencialmente patgenos aislados con menor frecuencia. Hay varios textos de
referencia excelentes que sirven de recurso para informarnos de hongos saprofit
os no usuales que, cada vez ms, estn implicados en pacientes inmunodeprimidos como
agentes causales (Kwon-Chung, 1992: Larone, 1995; Murray, 1999; Rippon, 1988; S
utton. 1998). Con el uso creciente de los protocolos inmunosupresores para trasp
lantes y quimioterapia de las enfermedades neoplsicas, todo hongo aislado debe co
nsiderarse como patgeno potencial. Hay que recordar que la infeccin invasiva puede
producirse en personas que no estn inmunodepnmidas, o incluso en aquellos que no
tienen la enfermedad manifiesta. Los anatomopatlogos, miclogos mdicos y los clnicos
deben trabajar en equipo para proporcionar al paciente los mejores cuidados (Wa
lker. 1982). Se produce una gran satisfaccin en el equipo mdico cuando se resuelve
un problema clnico con un gran esfuerzo conjunto, pero el que ms se beneficia de
que exista una buena comunicacin entre expertos es el paciente. El objetivo de es
te captulo est en el laboratorio de micologia. Chandler y Watts (1987) han hecho u
n atlas de histopatologia de la infeccin fngica que es excelente y comprensible. L
as especies Prototheca son algas aclorfilas ms que hongos. Se explican en este capt
ulo porque las caractersticas de las algas y las enfermedades que producen recuer
dan ms a los hongos que a cualquier otro agente infeccioso. El Pneumocystis canni
i tiene caractersticas de protozoos y hongos. Aunque siempre se le ha englobado d
entro de las enfermedades parasitarias, los estudios moleculares sugieren una re
lacin ms cercana a los hongos, por eso se le ha incluido en este captulo.
riticas que se reproducen de un modo tanto sexual como asexual. Se clasifican en
funcin de la naturaleza de las estructuras reproductoras. Los estados sexuales de
muchos hongos son desconocidos: estos organismos, conocidos como hongos imperfe
ctos, se clasifican por sus estructuras reproductivas asexuales. Estos estados a
sexuales son, por supuesto, slo imperfectos para los taxonomistas, la mayora de lo
s miclogos y. sin dudarlo, los hongos mismos son perfectamente felices con su est
ado incompleto. U n a vez que la fase sexual, llamada teleomorfa, de los hongos
se conoce, se reclasifica al organismo, aunque en la actualidad el nombre que an
tes se daba a la lase asexual imperfecta, llamada anamorfa. an se conserva Por ei
emplo. poca gente conoce Histoplasma capsulalum. Blaslomyces dermatitidisy Cript
ococcus neoformans por sus respectivos nombres teleomrficos, A/ellomyees capsulat
us. Ajellomyces dermatitidis y Filobasidiella neoformans respectivamente. Por el
contrario, la fase sexual Pseudatlescheria boydii y su fase asexual Scedosporiu
m apiospermum s que se reconocen en la prctica comn. La mayor parle de la taxonoma d
e los hongos se debe a los detalles estructurales, porque la clasificacin y la id
entificacin en el laboratono dependen mucho de la morfologa. En la Tabla 54-1 hay
un resumen donde se explican los trminos ms importantes. En este capitulo nosotros
rechazamos los complicados esquemas taxonmicos en favor de un concepto ms simple
de los patgenos que se encuentran habitualmente en el laboratorio. Para determina
ciones prcticas, unas pocas caractersticas generales sirven como base para identif
icar los hongos en el laboratorio (Tabla 54-2). Como los miclogos estn aprendiendo
, da a da. ms de hongos, la reclasificacin de los organismos se produce de modo regu
lar. McGinms (1999) ha resumido algunos de los cambios en la taxonoma y nomenclat
ura de los hongos importantes en el mbito mdico. La influencia de las tcnicas molec
ulares sin duda ir creciendo de modo importante en la taxonoma de los hongos, como
tambin lo har el diagnstico en un futuro cercano.

NOMENCLATURA, TAXONOMA Y TCNICAS DE IDENTIFICACIN

El primer obstculo para los miclogos principiantes es la nomenclatura y la taxonoma
manual. Los miembros del remo de los hongos son clulas eucaColonia de hongos
La caracterstica ms simple es la naturaleza de la colonia de hongos. Las levaduras
son organismos unicelulares que por lo general se reproduTabla 54-1 Trmino Micelio areo Anamorla Ascoma Ascospora Ascos
G l o s a r i o d e t r m i n o s habituales e n micologia mdica Definicin Hila pr
oducida sobre la superficie del medio agar La forma asexual de un hongo La estru
ctura que contiene un asco Hay muchos tipos de ascomas Espora sexual que contien
e dentro un asco Estructura con forma de saco que contiene esporas sexuales Tamb
in puede estar desnudo o contenido dentro de otra estructura Eslruclura supervivi
ente Ascoma completamente encerrado, compuesto de capas de hitas Las ascosporas
se libran por ruptura Extensin de esporangioforas en la base del esporangio La clu
la que produce conidias La estructura de la hifa especializada que lleva las con
idias: es diferente de las clulas conidiognicas Estructura reproductiva asexual fo
rmada de cualquier modo que no implica divisin Suave, referente a la morfologa de
las colonias La unidad vegetativa de moho; posee paredes paralelas Nacido dentro
de una hifa La ms larga de los dos lipos de conidias producida por el mismo modo
La ms pequea de los dos tipos de conidias producida por el mismo modo Hongo filam
entoso que se reproduce sexual o asexualmente Masa de hifas que adorna a un moho
Ascoma cerrado con un poro en la parte superior, a travs del cual las ascosporas
son liberadas Serie de clulas levadunformes conectadas (blastoconidias) que recu
erda a una hifa pero contiene reas de estrechamiento entre clulas adyacentes Pared
transversal en la hila Estructura de la hifa especializada que transporta el es
porangio Espora asexual producida dentro de un esporangio Estructura con forma d
e saco en la que se desarrollan las esporangiosporas asexuales La forma sexual d
e un hongo Nacido en el final de una hifa Hifa que se ha producido en la superfi
cie de un medio agar Clula alargada o hinchada, habitualmente en el final de una
conidiofora o esporangiofora, pero puede hallarse dentro de una hifa Hongo de clu
la nica que se reproduce por gemacin o por fisin
Clamidiospora Cleistoiecio Columela Clula conidiognica Conidiofora Conidias Glabro
sa Hifa Intercalara Macroconidias Microconidias Moho Micelio Perilecio Pseudohifa
s Septo Esporangioforas Esporangiosporas Esporangios Telemorfa Terminal Micelio
vegetativo Vescula Levadura

1160
Tabla 54-2
SECCIN VI
MICROBIOLOGA MDICA

Caractersticas d e utilidad para la identificacin d e h o n g o s Ejemplos Colonia

s de organismos unicelulares (levaduras) Colonias de organismos filamentosos (mo
hos) Gemacin Gemacin con pseudohifas Levadura redonda con capsula Levadura en gema
cin con collaretes Hitas verdaderas: septadas Hilas verdaderas no septadas o de s
epto escaso Pseudohifas No dematiaceno o hialino (ligero o moho pigmentado) Dema
tiaceno (oscuro) Conidias Esporas Ascos poras Cleistoteco Peritecio Lento (ms de 1
0 das) Medio (de 5 a 10 das) Rpido (menos de 4 das) Muchos de los hongos saprofitos
De 25"C a 30'C De 35C a 37C De 40C a 42X De 5CTC a 58C Asimilacin Fermentacin Degrada
in enzimlica (p. ej. ureasa) Aumento de crecimiento Feno-oxidasa (melanina) Sustil
uida por mmunolusin o prueba de ADN en la mayora de laboratorios Cryptococcus. His
toplasma. Coccidioides. Blaslomyces Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces
Caracterstica Tipo de crecimiento microscpico Morfologa de la levadura
Morfologa de estructuras filamentosas
Pigmento de la hifa Morfologa de las estructuras reproductivas asexuales Morfologa
de las estructuras reproductivas sexuales (demostrable slo excepcionalmente) Tas
a de crecimiento
Inhibicin por cicloheximida Temperatura de crecimiento ptimo (ocasionalmente de in
ters)
Pruebas qumicas
Conversin de fase moho a levadura Deteccin inmunologa de antigenos o anticuerpos Ca
racterstica molecular del ADN
cen de manera asexual por gemacin para producir una clula hija. Como resultado, la
masa de colonias de una levadura es una coleccin de organismos individuales dist
intos que, sin ser sorprendente, se parece a una colonia de bacterias en la supe
rficie agar. Las colonias de levaduras por lo general son enteras (bordes regula
res) y lisas. Cuando estn amontonadas y apagadas, como es el caso de la Candida a
ibicans, las colonias pueden parecer de estafilococos. Las levaduras producen ca
talasa, por eso el microbilogo imprudente que no haga una tincin de Gram o una pre
paracin en fresco podra confundir una colonia de levaduras con una de bacterias y
hacer un informe totalmente equivocado. Las levaduras encapsuladas. como el Crip
tococcus, pueden parecerse a bacterias encapsuladas. tal como Klebsiella pneumon
iae. aunque equivocarse al identificadas en este caso es menos probable. Las pse
udohifas de las levaduras por lo general son visibles al microscopio como extens
iones filamentosas en los bordes de la colonia, y se conocen coloquialmente como
"pies", como si la colonia fuera un ciempis (Fig. 54-1). Al contrario que las le
vaduras, los mohos son hongos filamentosos y multicelulares. La naturaleza filam
entosa del moho da a las colonias una apariencia lanuda, de pelusa o aterciopela
da, alguna vez puntual con un aspecto granular o de polvo, que se produce por la
formacin de estructuras reproductoras asexuales (Lmina 54-1). En otras ocasiones
la colonia puede tener una apariencia glabrosa (lisa). La lnea de diferenciacin en
tre mohos y levaduras no est totalmente definida. Algunas levaduras tambin desarro
llan un componente filamentoso que en algunos casos podra verse macroscpicamente.
Y a se han mencionado antes las extensiones filamentosas de las colonias de C. a
ibicans. Otras levaduras desarrollan extensiones filamentosas desde la superfici
e de la colonia, siendo semejante al crecimiento de pelo de la cabeza de un cien
tfico loco. Las especies Trichosporon son levaduras que desarrollan extensiones f

ilamentosas, mientras que la Exophiala eanselmei es una levadura dematiacena que

desarrolla un micelio segn madura. Lo ltimo en camuflaje se ejemplariza por el hongo dimrfico. que exhibe una forma de moho bajo alguna
s condiciones y una forma diferente de moho en otras circunstancias. Los hongos
dimrficos ms importantes son patgenos sislmicos que se comportan como mohos en el am
biente y en el medio agar a 25"C-30C. Por el contrario, en el tejido humano es un
a levadura o. en el caso del Coccidioides immilis, una esfrula. Cuando se cultiva
a 37 C, la forma del tejido se reproduce. Aunque estos patgenos clsicos es lo que
por lo general entendemos por hongos dimrficos, otros agentes menos comunes tamb
in muestran dimorfismo. Por ejemplo, el Penicillium mametfei, un miembro distingu
ido de ese gnero tan extendido, crece como un moho en un medio de
Figura 54-1. Extensiones filamentosas desde la periferia de las colonias de Cand
ida albicans que se c o n o c e n coloquialmente c o m o pies

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1161
Figura 54-2. Hilas con ramificaciones septadas de Aspergillus lumigatus. L a s F
igura 54-4. Cadenas de u n a levadura alargada d e Candida albicans q u e produr
a m a s de las hilas tienen ngulos agudos. Esputo expectorado (tincin de Gram). c
en pseudohifas. L a unin d e las levaduras individuales es an evidente en e s t a
preparacin. Advirtase q u e las paredes celulares d e estas pseudohifas n o son pa
ralelas. (Tincin de Gram.)
laboratorio a 25"C-30"C, pero en los tejidos humanos lo encontramos como forma d
e levadura. Los cuerpos esclerticos que encontramos en los tejidos de los pacient
es con cromoblastomicosis son una forma vegetativa detenida entre una forma moho
/levadura de los hongos dematiacenos. que aparecen como mohos cuando crecen en u
n medio slido a temperatura ambiente. El Cokeromyces recurvatus es un patgeno huma
no raro que tiene mortologia de levadura en infecciones humanas in vitro a 37 C,
pero crece como moho a 25C-30C (McGough, 1990). La Malassezia frfures un ejemplo d
e dimorfismo reversible, que produce tanto clulas levaduras como hilas en las les
iones cutneas de la pitinasis versicolor. En el laboratorio es raro encontrar la
forma de hifa. salvo que haya unas condiciones de cultivo especiales (Marcon,199
2).
Estructura de levaduras e hitas
L a mortologia (o ausencia) de formas filamentosas es una caracterstica important
e para la identificacin de las levaduras y mohos. La estructura filamentosa de lo
s mohos se relaciona con una hifa. Un conjunto de hilas se conoce como micelio.
El micelio que crece en la superficie del agar o en el agar se conoce como micel
io vegetativo, mientras que las extensiones filamentosas por encima de la coloni
a se llaman micelios areos. Las hifas verdaderas pueden tener paredes perpendicul
ares que contienen poros para la comunicacin a travs de las hifas o paredes perpen
diculares completas que dividen a la hifa en mltiples clulas. Las hifas que tienen
paredes perpendiculares estn septadas (Fig. 54-2), mientras que aquellas sin paredes perpendicula
res estn sin septar (Fig. 54-3). Una vez ms. la situacin es una sombra gris ms que b
lanca y negra. Algunos hongos que tienen hifas septadas tambin tienen hifas espec
iales septadas o sin septar (conidioforas) que tienen estructuras reproductivas
asexuales. A la inversa, algunos hongos llamados hongos no septados tienen en oc
asiones paredes cruzadas, y quiz debera llamrseles de septo escaso. Es importante,
por tanto, evaluar el micelio integramente. La anchura de la hifa y el ngulo de l
as ramas son pistas importantes para identificar la cepa. Entre dos de los mohos
patgenos no invasivos clsicos, los cigomicetos, como el Rhizopus spp., tienen hif
as anchas con forma de cinta y sus ramas en ngulos rectos (vase Fig. 54-3), mientr
as que el Aspergillus spp. y la mayora de los otros mohos hialinos tienen hifas ms
estrechas y ramas en ngulos agudos (dicotmicamente) (vase Fig. 54-2). Adems, el inc
remento en el uso de terapias inmunosupresivas y la aparicin de enfermedades inmu
nosupresivas, como el VIH, han aumentado la frecuencia con que los hongos saproft
icos comunes producen enfermedades invasivas (Ftinaldi. 1991). Determinar a un h
ongo como Aspergillus en funcin de la morfologa de la hifa en una extensin o en una
muestra de tejido es en realidad slo una afirmacin de las rarezas a pnori para es
te grupo de patgenos. Es mejor describir simplemente las caractersticas de la hifa
. Cuando las levaduras se reproducen asexualmente por gemacin, la clula hija por l
o general aparece al final de una clula levadura y con el tiempo se extiende hast
a formar una nueva clula levaduriforme Si una serie de las clulas hijas no se sepa
ra enteramente de la clula original, se produce una pseudohila. Las pseudohifas s

e distinguen de las hifas verdaderas por la presencia de una estenosis en la unin

de las clulas adyacentes, por la localizacin uniforme del septo en un punto de la
rama del micelio y porque la talla de la clula hija llega a la de la madre o men
os (Fig. 54-4). Por el contrario, las paredes de las hilas verdaderas son parale
las sin estenosis (vase Fig. 54-2). C. albicans y algunas cadenas de Candida trop
icalis pueden producir tanto hifas verdaderas como pseudohifas, dependiendo de l
as condiciones de crecimiento, y diferenciar la Candida del Aspergillus en una m
uestra de tejido en ocasiones puede ser problemtico. Por el contrario, el Cryptoc
occus spp. produce slo levaduras gemadas y en raras ocasiones pseudohifas primiti
vas o rudimentarias, pero no forma verdaderas hifas.
Pigmento de hifas
Las hifas del hongo dematiaceno contienen un pigmento de melanina que da colorac
in marrn a las hifas en las preparaciones microscpicas y hace que las colonias de l
os hongos parezcan verde oscuro, marrn o negro (Lmina 54-2). Los tintes que se uti
lizan para teir las extensiones.
Figura 54-3. Hifas anchas, no septadas, de un ogomiceto en tejido cerebral En la
hila hay una rama en ngulo recto. (Hematoxilina-eosina.)

1162
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
las preparaciones frescas o las secciones histolgicas pueden oscurecer el color p
arcialmente, lo cual puede demostrarse en preparaciones sin teir. L a apariencia
macroscpica de los hongos dematiacenos vara desde el verde oscuro hasta el negro,
pasando por gris. Estos hongos que carecen de pigmento hifal oscuro se llaman co
mnmente hialinos (claros o incoloros). Algunas autoridades prefieren no utilizar
este trmino, porque una pigmentacin clara puede producir colonias de colores. Adems
, las estructuras reproductivas asexuales de algunos mohos hialinos pueden tener
pigmentos verdes, marrones o negros que dan color a la superficie de la colonia
una vez que se han formado las estructuras reproductoras, La apariencia real de
estos mohos, por lo general, puede comprenderse al observar la parte de atrs de
la colonia, que mantiene una coloracin clara. Por el contrario, tanto la parte de
delante (anverso) como la parte de atrs (reverso) de las colonias de dematiaceno
s suelen mostrar el pigmento oscuro. Aunque el C. neolormans no se considera un
hongo dematiaceno. el que esta levadura produzca melanina nos da una pista para
identificarlo. Las clulas de la levadura del C. neolormans no estn pigmentadas, pe
ro podemos encontrar melanina en la levadura y en las hifas pigmentadas de los h
ongos dematiacenos por el mtodo de tincin Fontana-Masson para pigmentar melanina (
Ro, 1987). En ocasiones, el pigmento marrn no lo encontramos en los hongos que co
nsideramos dematiacenos. Es importante aclarar que, sin embargo, en ocasiones lo
s hongos no dematiacenos pueden teirse con el tinte Fontana-Masson, por eso es mu
y importante considerar otras caractersticas diagnsticas, incluyendo la morfologa d
e las hifas (Kimura. 1998).
Figura 54-6. Levaduras en gemacin y sin gemar de Candida albicans (tincin de Gram)
.
Estructuras reproductoras asexuales
El primer punto para identificar los mohos es la caracterizacin de las estructura
s reproductoras asexuales. En las levaduras, estas estructuras sirven como pista
s auxiliares en la identificacin. Las dos principales estructuras asexuales son l
as esporas y las conidias. Las esporas de modo natural pueden ser sexuales o ase
xuales, mientras que las conidias son siempre asexuales. Estrictamente hablando,
las esporas asexuales siempre se producen por divisin dentro de una estructura q
ue abarca que se llama esporangio y las esporas se llaman esporangiosporas (Fig.
54-5). Las conidias, que son mucho ms diversas, se forman por la diferenciacin de
la punta o el lado de una hifa frtil, como la conidiolora. o por la diferenciacin
de la hifa misma. Desgraciadamente, el uso adecuado de los trminos conidia y esp
ora en la bibliografa, es muy pobre, y la coherencia es peor. Los trminos espora y
esporulacin se usan como trminos para reproduccin asexual, y el trmino espora se us
a algunas veces cuando hubiera sido ms preciso usar conidia. Kwon-Chung y Bennet
(1992) han sealado que el modo en que se produce la esporulacin puede ser tan impo
rtante como la
morfologa de la conidia, y ponen como ejemplo la diferencia entre hongos dematiac
enos, como Drechslera spp. y Helmlnihosporlum spp., que no son patgenos humanos,
y Bipolaris spp., que en ocasiones es un patgeno humano. El principal mecanismo d
e reproduccin asexual de las levaduras es la gemacin. El proceso comienza como una
suavizacin de la pared celular de la clula madre, seguida por una expansin de la p
ared celular (reventn). Un tabique cierra el lmite entre la clula hija y la madre (
Fig. 54-6). Si n o hay separacin, el resultado, como se dijo anteriormente, es un
a pseudohifa. Esta gemacin clsica da como resultado una blastoconidia segn Rippon,
o u n a blastoespora segn Kwon-Chung y Bennet. Menos corriente es la divisin trans

versa que se produce en P. marneffei. Los trozos de micelio vegetativo que se di

ferencian en conidias se llaman clulas conidognicas. Las hifas especializadas que s
ostienen las conidias se llaman conidioforas. que pueden ser tanto una clula coni
diogmca que crece del micelio vegetativo como una hifa de soporte. En el caso del
Aspergillus spp. la conidiofora. que est sin septar. alarga la cola hasta formar
una vescula hinchada (Fig. 54-7). De esa vescula, las clulas conidognicas. que se ll
aman fildes. crecen para sujetar las cadenas de conidias. Algunas especies de Aspe
rgillus producen una fila de fildes, que se produce en una hilera de clulas estriles
, con las conidias que crecen de las fildes distales. Los cigomicetos producen est
ructuras de soporte llamadas esporangioforas, en las cuales los esporangios y la
s esporangiosporas se
Figura 54-5. Las esporangioforas de Rhizopus s p p soportan esporangios, que con
tienen esporangiosporas. Los rizoides surgen de las hilas cercanas al origen de
las esporangioforas (lactofenol algodn azul). (Fotografa cortesa del Centers lor Di
sease Control and Prevention.)
Figura 54-7. Cabezas de Aspergillus lumigatus. Las conidioforas estn a u m e n t
a das en el extremo formando una vescula. Las fildes surgen de la m i t a d superio
r de la vescula, y las cadenas de conidias se colocan paralelas al eje longitudin
al de la conidiofora. (Lactofenol anilina azul.)

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1163
Figura 54-8. L a s porciones d e los micelios de Coccidioides immitis se n a n dt
eFigura 54-10. Microconidias alargadas d e Trichophyton tonsurans alineadas a lo
rendado en artroconidias. Por olro lado, las artroconidias con lorma de barril
estn largo de la superficie de la hitas (lactofenol anilina azul), separadas por
unas clulas vacias de pared fina (lactofenol anilina azul).
desarrollan en las colas (vase Fig. 54-5). Una extensin del pex de la esporangiospo
ra en el esporangio se denomina columela. La conidiognesis llica es un proceso en
el que la conidia no se desarrolla hasta que se forma un tabique entre sta y la cl
ula madre. La conidia se origina de toda la clula madre. Los patgenos humanos ms im
portantes que tienen una conidiognesis tlica son los dermatofitos y los hongos dimr
licos C. immitis. Segn progresa la conidiognesis. la artroconidia producida por Co
ccidioides se rompe fcilmente, liberando un gran nmero de conidias en forma de bar
ril que se diseminan fcilmente y que termina con un alto grado de infectividad qu
e demuestra este importante patgeno humano (Fig. 54-8). La conidia tlica de los de
rmatofitos se divide en dos tipos segn el tamao: macroconidias grandes, que tienen
septaciones (Fig. 54-9), y microconidias unicelulares, que son estructuras ms si
mples (Fig. 54-10). El olro tipo de conidiognesis es la blstica, en la que el prot
oplasma de la clula conidiognica se rompe dentro de la conidia. La forma ms simple
de la conidiognesis blstica es el mtodo de gemacin, por el cual se desarrollan mucha
s levaduras, incluida la Candida. Como con las conidias tlicas, dividimos las bla
stoconidias en dos tipos, dependiendo de si toda la pared se incluye en el proce
so. Habra que hacer una divisin adicional entre las especies en las que la pared c
elular externa no participe en la conidiognesis (enteroblstica). Las filides son clu
las conidiognicas
que tienen un collarete en los pices, que se produce cuando la cola libera la pri
mera conidia. El collarete puede ser una estructura con lorma de termo visible,
como en la Phialophora spp., o una estructura invisible, como en el Aspergillus
spp. Por el contrario, los anlidos son clulas conidiognicas que se rompen para libe
rar un anillo de material celular en la base de la conidia cuando se separa de l
a anlida. La formacin de conidias secuenciales en la base empuja a la clula mas vie
ja a la cola de la cadena, y as deja una sene de anillos o anelaciones en el pex d
e la anlida. registrando sucesos anteriores, como anillos en un rbol. Es difcil ver
algunos de estos pequeos detalles con la luz del microscopio. La diferenciacin de
varias estructuras de conidias es la clave para la adecuada identificacin de las
muestras aisladas. En algunos casos, las caractersticas morfolgicas se comprenden
fcilmente. Como en la patologia quirrgica, reconocer el patrn es una herramienta i
mportante para identificar la mayora de los patgenos saprofitos. Es importante apr
eciar las caractersticas de la morfologa de la totalidad de la preparacin sin local
izar en estructuras aisladas o aberrantes, lo mismo que es importante para el pa
tlogo dedicarse al tejido patrn sin distraerse por clulas atpicas ocasionales. Las e
structuras conidiales en desarrollo del Aspergillus o Paecilomyces. pot ejemplo,
pueden parecerse a las estructuras del Penicillium. y el observador puede confu
ndirse al pensar que hay dos mohos presentes. Tambin hay que recordar la posibili
dad de un cultivo mixto. Un miclogo con grandes conocimientos debe usar un objeti
vo de bajo aumento para la observacin inicial. En todas las disciplinas morfolgica
s, sin embargo, el hallazgo de detalles celulares con el bajo aumento obliga a u
n anlisis ms detallado con mayor aumento. El excelente arte del diagnstico micolgico
descansa en la apreciacin y diferenciacin de los detalles celulares y. en algunos
casos, la tarea requiere una experiencia considerable. Algunas veces el aislado
debe ser incitado a producir las estructuras necesarias para el diagnstico por l

a seleccin del medio adecuado (Tabla 54-3). En general, el medio enriquecido favo
rece la preparacin del micelio vegetativo, mientras que las estructuras reproduct
oras asexuales se fomentan en el medio basal. El subcultivo en agar agua o agar
patata es una tcnica usual para fomentar el desarrollo de las estructuras de las
conidias. El agar zumo V-8 se ha usado para el estudio de estructuras de conidia
s en hongos dematiacenos y para el tomento de la formacin de ascosporas en Saccha
romyces. El color de las colonias de Aspergillus se estudia mejor en agar Czapek
-Dox. mientras que el Trichophyton rubrum lo fomentamos para producir un pigment
o rojo en agar patata o agar cornea con glucosa al 1%. Quiz lo ltimo en un medio e
special es agar de estircol de pjaro filtrado, desarrollado por Staib y Blisse (19
82) para estudio del C. neolormans. La experiencia tambin es importante para dete
rminar si un subcultivo se ha incubado el tiempo suficiente para que se formen l
as estructuras diagnsticas. Las estructuras semejantes raices (rizoides) que se d
esarrollan
Figura 54-9. Mltiples m a c r o conidias cortas, con f o r m a de porra de Epider
mophyton lloccosum. Alguna de las comdioforas estn ramificadas, y las microconidi
as estn ausentes. (Lactofenol algodn azul.) (Fotografas cortesa del Centers for Dise
ase Control and Prevenlion.)

1164
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 54-3 Medios suplementarios para la identificacin de hongos Medio Agar crnea
con Tween 80 Medio de ascosporas. agar V-8 Agar dextrosa patata con glucosa al 1
% Agar patata Agar C/apek-Dox Agares de Trichophyton Agar de semilla de pjaro (ne
gro) Infusin de corazncerebro con sangre Agar urea Christensen Cullivo con diferen
tes agares Funcin Visualizar la morfologia de la levadura Desarrollo de las ascos
poras Desarrollo del pigmento do Trichophyton rubrum Desarrollo del pigmento de
Trichophyton rubrum: morfologa del moho Identificacin de especies de Aspergillus D
iferenciacin de las especies de Trichophyton Demostrar la melanina en Cryptococcu
s neolormans Puede aumentar el aislamiento de hongos dimrficos Diferenciacin de Tr
ichophyton rubrum del Trichophyton mentagrophytes Estudio de la estructura micro
scpica y su origen
para que aparezcan las colonias. El significado de las colonias de hongos de cre
cimiento rpido, que aparecen despus de una incubacin prolongada en el medio micolgic
o. debe cuestionarse como posibles contaminantes. Sin embargo, hay excepciones p
ara esta generalizacin. C. immilis, que es un patgeno clsico, crece relativamente rp
ido y podra incluso recuperarse en las placas de agar en el laboralorio bacteriolg
ico si la incubacin es grande. Aspergillus spp.. Scedosporium apiospermum, los ci
gomicetos y muchas levaduras crecen rpido. Entre los dermatofilos, el porcentaje
de crecimiento es una caracterstica importante y podra ayudarnos a identificarlos.
Inhibicin por cicloheximida
La falta de inhibicin por la cicloheximida tambin es una pista til para ver la pres
encia de patgenos, especialmente entre los hongos dimrficos y dermatofitos. El aga
r micosel y micobitico. que se utilizan normalmente como medio para aislar, conti
enen 0,04%-0,05% de cicloheximida. Un hongo que tiene un crecimiento lento en un
medio que contiene cicloheximida debera alertar al miclogo de la posibilidad de q
ue est presente un hongo dimrico, o que, con una clnica compatible, se haya aislado
un dermatofito. Una vez ms, hay excepciones importantes para esta regla. Los cigo
micetos y C. neolormans se inhiben completamente por la cicloheximida. Las espec
ies de Aspergillus y algunas especies de Candida se inhiben parcial o totalmente
.
a partir de la hifa de algunos cigomicetos son caractersticas diferenciadoras imp
ortantes, pero no pueden detectarse si se hace una observacin precoz. Debe admiti
rse que algunas de las tcnicas para una diferenciacin completa son difciles, o estn
incluso por debajo de lo que la mayora de los laboratorios alcanza. Por ejemplo,
el patgeno dematiaceno Exophiala (Wangiella) dermatitidis produce conidias blstica
s con filides y anlidas. Sin embargo, no se reconoci la presencia de anlidas cuando
lo miraron con un microscopio de luz ptica, y este organismo ha sido alguna vez c
lasificado como Phialophora dermatitidis. El reconocer que las anlidas eran forma
das por la muestra aislada condujo a asignar un nuevo gnero, Wangiella dermatitid
is, que contena filides y anlidas. Hay un desacuerdo entre si estas especies deberan
estar en el gnero Exophiala o Wangiella (McGinnis, 1999). A pesar de lodos los e
sfuerzos, algunas cepas no producen estructuras reproductivas asexuales. En las
colonias queda pelusa, y consiste slo en hifas areas y vegetativas morfolgicamente.
Estas hifas se describen como hifas estriles o micelios estriles.
Temperatura ptima para el crecimiento
El crecimiento a temperatura elevada es en ocasiones una herramienta diferencial
para identificar los hongos (Kwon-Chung, 1992). La mayoria de los hongos y leva
duras crecen a 25C-30C. El patgeno ms importante en el gnero Cryptococcus es el C. ne

olormans, que es, y no por coincidencia, el nico que crece bien a 37 C. Como crec
e rpido, con frecuencia tiene que ser el primer patgeno en aislarse en las placas
agar incubadas a 35"C-37"C en el laboratorio bacteriolgico. El Trichophyton verru
cosum produce distintas cadenas de clamidosporas cuando se incuba a 37 C. El cre
cimiento del Cladosporium trichoides (bantianum) a 42C-43C es un modo fiable para
diferenciar estas especies de otros miembros del gnero. Asimismo, m u c h a s Exi
ophiala dermatitidis aisladas crecen a 40' C, mientras que el E. jeanselmei, con
una morfologa similar, no crece a temperaturas por encima de 37C. Determinar el r
ango de temperatura al que crecen es una medida til para diferenciar entre alguno
s miembros de los cigomicetos (Kwon-Chung, 1992).
Estructuras reproductoras sexuales
Las estructuras reproductoras sexuales en ocasiones son de valor en el laborator
io de micologa para identificar patgenos comunes y saprofitos. Se pueden producir
una gran variedad de estructuras sexuales, pero la mayora de ellas no suelen enco
ntrarse. Las dos estructuras ms frecuentemente documentadas son ascis desnudos de
Saccharomyces cerevisiae y el cleistotecio de Pseudallescheria boydii (la fase
sexual de Scedosporium apiospermum). Aspergillus nidulans, o el grupo de Aspergi
llus glaucus. Los ascis desnudos del Saccharomyces recuerdan a clulas ovaladas de
la levadura en las que hay de una a cuatro ascosporas individuales haploides (Lm
ina 54-3). La formacin de ascosporas en Saccharomyces spp. puede fomentarse al in
cubarlo en cierto medio agar, como agar zumo V-8, pero este esfuerzo por lo gene
ral no es necesario, porque con los sistemas comerciales de identificacin de leva
duras pueden identificarse bioqumicamente. Las ascosporas pueden visualizarse en
preparaciones frescas, pero se detectan de un modo ms fiable con un tinte resiste
nte al cido. Un cleistotecio es un cuerpo sexual en forma de fruta en el que estn
las ascosporas totalmente encerradas y slo pueden liberarse por la ruptura de la
pared del cleistotecio (Fig. 54-11). La pared se compone de una o varias capas d
e hifas especializadas. Un peritecio es similar a un cleistotecio. pero tiene un
a abertura en el pex de la estructura en forma de pera.
Pruebas bioqumicas
Las pruebas bioqumicas son las ideales para identificar las levaduras, y en ocasi
ones son tiles para identificar los mohos. La caracterizacin bioqumica puede acompaa
rse por un estudio de fermentacin o asimilacin de
Tasa de crecimiento
La tasa de crecimiento de los hongos aislados proporciona una pista til para posi
bilidades diagnsticas. En general, los hongos patgenos dimrficos y los dematiacenos
crecen despacio, necesitando une. semana o ms Figura 54-11. Se pueden ver ascosp
oras dentro de un cleistotecio del grupo de Aspergillus glaucus (lactofenol anil
ina azul).

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS Tabla 54-4

1165
patrones, de los cuales la asimilacin de patrones se usa exclusivamente en la may
ora de los laboratorios. La fermentacin de los carbohidratos es el uso anaerbico de
los carbohidratos con la produccin de gas. Esta tcnica es vlida para identificar l
as especies de Candida, pero no para las especies de Cryplococcus. La asimilacin,
que por lo general es un mtodo que se aplica mucho, comprueba la capacidad de un
a muestra aislada para utilizar, como nica fuente de carbn necesario para crecer,
un carbohidrato o un nitrato, como la nica fuente de nitrgeno. El mtodo auxanogrfico
Wickerham utiliza un medio basal en el que un nitrato o un carbohidrato determi
nado sirven de nutrientes. El crecimiento de las levaduras es el punto final de
un test positivo. Este mtodo de referencia tan enrevesado no se explicar, porque e
n la mayoria de los laboratorios se ha sustituido por uno de los cinco sistemas
de identificacin comerciales: API 20C (BioMrieux. Hazelwood, MO), Sistemas V i t e
k (BioMrieux. Hazelwood. MO), MicroScan (Baxter Sistemas de Salud. Sacramento. C
A). el Sistema UniYeastTek (Laboratorios Remel, Lenexa, KS) y el RapID Yeast Plu
s System (Sistemas de Diagnsticos Novedosos, Norcross, GA). Los cinco sistemas fu
ncionan bien, segn la bibliografa y los test de inspeccin profesional del College o
l American Pathologists (Buesching. 1979: Fenn, 1994: Riddle, 1994: ElZaatari. 1
990). El API 20C se ha visto que se puede comparar con los sistemas bioqumicos co
nvencionales (Buesching. 1979). y ahora est considerado el de referencia entre lo
s sistemas comerciales. Una evaluacin de unos datos recientes para el sistema Vit
ek mostr una actuacin idntica para el API 20C (ElZaatari, 1990). El sistema Vitek t
iene un pequeo margen, segn han juzgado unas empresas profesionales, y ser particul
armente atractivo para laboratorios que usan esta metodologa en su seccin bacterio
lgica. El sistema RapID lo identifica en aproximadamente 4 horas (Kitch, 1996; Sm
ith. 1999). Independientemente del sistema elegdo. es importante estudiar la mort
ologia de las levaduras. Adems de la fermentacin y de los estudios de asimilacin, h
ay un test secundario por el cual se estimula el crecimiento de unos componentes
qumicos para asi diferenciar ciertos Trichophyton spp. Incluir mositol y tiamina
en varias combinaciones de medio agar (agar Trichophyton) permite hacer una val
oracin de las propiedades de estimulacin del crecimiento. El punto final del test,
crecimiento relativo en comparacin con un medio basal. es subjetivo y se deben i
ncluir tanto los controles positivos como los negativos. Tradicionalmente. la id
entificacin de la fenol oxidasa era un test diagnstico importante. La fenol oxidas
a en el C. neoformans oxida los componentes difenlicos para producir un pigmento
marrn. El sustrato original que se usaba para identificar esta caracterstica era ci
do cafeico en clulas de semillas negras (test Staib), aunque despus se aadieron otr
os componentes, como la L-dopa y L - dopamina. El test de la oxidacin del fenol n
o es suficiente l solo para identificar el C. neoformans, y con la introduccin de
sistemas de identificacin comerciales, que son eficientes, se ha disminuido su us
o en los laboratorios clnicos. Por el contrario, el test de produccin de ureasa en
los criptococos es de gran utilidad en el laboratorio clnico para diferenciar lo
s Criptococcus de Candida spp.. particularmente en muestras respiratorias. El C.
neoformans es un patgeno pulmonar sistmico. mientras que Candida spp. son habitan
tes frecuentes de las vas areas altas, pero no es causa comn de neumonas primarias.
La ureasa puede ser producida por otras especies no patgenas de criptococos, por
especies de Rhodotorula y por algunos aislamientos de Trichosporon beigeliiy Can
dida krusei. La produccin de ureasa puede comprobarse por la inyeccin de levaduras
aisladas en una preparacin con agar urea de Christensen o en caldo de urea. La a
lcalinizacin del medio despus de la produccin de NH, por parte de los organismos qu
e producen la rotura de la urea se detecta al meter en el sistema un indicador d
e pH. Zimmer y Roberts describieron un mtodo rpido que proporciona resultados fiab
les y tiles en 15 minutos para ir eliminando levaduras de un estudio ms a fondo (Z

immer, 1979) (Tabla 54-4). Hay que tener mucho cuidado para no incluir las bacte
rias que rompen la urea en lo inyectado, como las de la especie Klebsiella. que
encontramos ocasionalmente en muestras respiratorias. Las colonias que tienen ps
eudohifas vistas macroscpicamente (pies) o que crecen en un agar que tiene cicloh
eximina no necesitan analizarse, porque el criptococo no produce pseudohifas in
vitroy no crece con la cicloheximida. Hay un lest de asimilacin especial para el
KN0 que es el que se utiliza en primer lugar para diferenciar entre las especies
de los gneros dematiacenos. Exophiala (Sutton. 1998).
3
Prueba rpida de la ureasa para el screening de las levaduras aisladas de m u e s
t r a s respiratorias
1 Colocar un tapn estril en un caldo de ureasa. Apretar el tapn contra el lado del
contenedor del caldo de ureasa antes de removerlo para eliminar el exceso de cal
do El tapn debe saturarse, no motarse. 2 Tocar ligeramente todas colonias aislada
s que se van a estudiar con el tapn saturado i 3 Colocar el tapn saturado en un tu
bo estril etiquetado j 4 Colocar el tubo con el tapn en un bao de agua a 56C durante
15 minutos j 5 Retirarlo del bao de agua y examinar la existencia de pigmento ro
sa, que indicarla que es positivo Se deben realizar controles positivos (especie
s de Cryplococcus) y negativos (Candida albicans) al mismo tiempo.
Los test bioqumicos tienen un papel auxiliar en la identificacin de los mohos derm
atofticos. La produccin de ureasa dentro de los cuatro primeros das ayuda a diferen
ciar el Trichophyton mentagrophytes (positivo para la ureasa) del 7! rubrum (ure
asa negativo). El aislamiento debera ser subcultivado en una preparacin agar ureic
o de Christensen e incubarse a 25 C-30 C durante al menos tres das. Una reaccin po
sitiva es una gran produccin de ureasa, que se evidencia por una alcalinizacin del
medio. Si los test bioqumicos son el corazn de los sistemas de identificacin de la
s levaduras, la confirmacin de la identificacin a travs del anlisis de la mortologia
de la levadura en un medio agar es el alma. Utilizar la observacin morfolgica com
o comprobante puede evitar grandes errores que se cometeran si se confiara entera
mente en los sistemas automatizados.
Dimorfismo
La demostracin del dimorfismo es el acercamiento tradicional para identificar def
initivamente un grupo de patgenos sistmaos. En la mayora de los laboratorios el ais
lamiento inicial es la fase moho, porque las placas, por lo general, se incuban
a 25C-30C. La conversin a fase tejido se acompaa por una incubacin a 37'C de un subcu
ltivo. L a transicin de la morfologa moho a la de levadura puede producirse equivo
cadamente, y las formas de hifa generalmente se mezclan con las clulas de levadur
as. Algunos aislamientos puede que nunca logren convertirse. Un medio rico, como
agar infusin cerebro-corazn con suplemento sanguneo, tendra que ser incluido, sobre
todo cuando se trabaja con H. capsulatum. El agar infusin cerebrocorazn o agar al
godn estn recomendados para la conversin del B dermatitidis. Los medios para la con
versin del C. immilis se han descrito, pero por lo general no se utilizan. De mod
o similar, la inoculacin en animales es infrecuente que se utilice en laboratorio
s clnicos. L a introduccin del test inmunolgico para exoantigenos lngicos en cultivo
, o caracterizacin molecular de cidos nucleicos, ha simplificado considerablemente
la tarea d e la identificacin definitiva y ha eliminado la necesidad de mostrar
ambas fases en los hongos dimrficos. El test de exoantigenos para C. immitis. H.
capsulatum y B. dermatitidis est disponible comercialmente. Los test de hibridacin
de cidos nucleicos para estos tres patgenos dimrficos y para C. neoformans estn com
ercializados por Gen-Probe, Inc (San Diego, CA). Estos test han sustituido la fa
se de conversin en muchos laboratorios. El sistema GenProbe se utiliza para detec
tar la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, o para la identificacin de
ciertos patgenos bacterianos, incluida la micobactena. En los laboratorios que ut
ilizan la tecnologa Gen-Probe, el acercamiento molecular podra proporcionar una al
ternativa atractiva a la inmunodilusin para identificar los aislamientos. Si la f
ase de levadura del patgeno se ha demostrado anteriormente o recientemente en ext

ensiones directas, o en el laboratorio de patologa quirrgica, la conversin de la fa

se moho correspondiente en el laboratorio de micologia es superflua.
Pruebas inmunolgicas
Las pruebas inmunolgicas son vlidas para detectar antgenos y anticuerpos o para sel
eccionar patgenos fngicos. Las pruebas serolgicas clsicas han sido unos test de fija
cin del complemento contra los principales patgenos dimrficos. H. capsulatum. B. de
r-

1166
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
matitidis y C. immitis. Posteriormente se desarrollan test de inmunodifusin contr
a varios antigenos del H. capsulatum. El acercamiento serolgico funciona mejor pa
ra el diagnstico y pronstico de la coccidioidomicosis. Las extensas reacciones cru
zadas entre H. capsulatum y B. dermatitidts comprometen la efectividad de los te
st. La deteccin de anticuerpos para Aspergillus spp. en el suero ayuda en el diag
nstico de aspergillosis broncopulmonar alrgica, pero es de poca utilidad en el dia
gnstico de enfermedad invasiva (Kurup, 1991). Los anticuerpos que ms comnmente prec
ipitan se han detectado con la tcnica de inmunodifusin. pero tambin se utilizan mtod
os ms modernos, como el ensayo inmunosorbenle de la unin de enzimas (ELISA). Algun
as autoridades han cuestionado la confianza de los reactivos disponibles comerci
almente (Kwon-Chung, 1992). La deteccin de antgenos fungicos es el desarrollo ms re
ciente. La aplicacin ms importante con diferencia ha sido detectar el antigeno del
criptococo en el suero y en el lquido cefalorraqudeo (LCR). Tenemos que considera
r este test como una herramienta de diagnstico principal junto con el cultivo, y
ha sustituido al test de tinta china, que es menos sensible para el examen direc
to del LCR. Los inmunoensayos para los antgenos de Aspergillus han sido descritos
pero no desarrollados comercialmente (Kurup, 1991). Un radioinmunoensayo para l
os antigenos H. capsulatum en orina es posible hacerte a travs de un laboratorio
de referencia (Laboratorio de Referencia Histoplasma. Indianapolis, IN), y est bi
en considerado, particularmente en pacientes con enfermedades sistmicas (Williams
. 1994). Se detect al antgeno en el 92o de 108 pacientes con infeccin diseminada, pe
ro slo en el 39% de 70 pacientes con enfermedad autosuficiente. Los test cutneos s
e han usado para estudios epidemiolgicos de algunas infecciones, pero tienen una
utilidad limitada para fines diagnsticos. En algunos casos, como histoplasmosis,
los test cutneos podran complicar el diagnstico del laboratorio al provocar una res
puesta de los anticuerpos (Campbell, 1964). Por desgracia, ninguno de los test q
ue existen para el diagnstico de la infeccin por Candida tienen suficiente sensibi
lidad y especificidad para ser diagnsticamente tiles (de Repentigny. 1992).
Un resumen practico de hongos mdicamente importantes es el que se representa en l
a Figura 54-12. Este esquema se presenta c o m o un esqueleto organizador en el
cual un miclogo principiante puede acercarse al diagnstico etiolgico de las infecci
ones por hongos.
TCNICAS DE DIAGNSTICO Recogida de muestras
La muestra correcta para llevar al laboratorio de micologa depende de la presenta
cin clnica y del rgano del sistema afectado. En la Tabla 54-5 encontramos un resume
n de las principales categoras de enfermedades producidas por hongos y la muestra
que se recomienda La nomenclatura de las infecciones por hongos importantes se
ha resumido en un cuadro (Odds. 1992). Las levaduras, en particular Candida spp.
, pueden recuperarse en alguna ocasin de muestras recogidas con una torunda, sobr
e lodo de las lesiones purulentas. Las torundas deben usarse para recoger lesion
es orales o vaginales sugestivas de candidiasis. y tienen que ser adecuadas para
recoger muestras en pacientes con otitis exlerna crnica, donde solemos encontrar
un gran nmero de conidias Aspergillus. Las torundas son. sin embargo, las peores
herramientas para recoger muestras en la mayora de las zonas de enfermedades inf
ecciosas. Para el diagnstico de inlecciones fngicas en las que el tejido responsab
le es con frecuencia granulomatoso. son intiles, e incluso pueden crear confusin y
el mdico interpretar un resultado negativo como la ausencia de infeccin. Una polti
ca firme de rechazar muestras de torundas debe acompaarse de esfuerzos educaciona
les persistentes. Las mejores muestras para el diagnstico micolgico son raspados,
curetajes, aspiraciones y biopsia de las lesiones. Los pelos infectados con algu

nos hongos dermatofitos comunes (p. ej.. Microsporum canis) son fluorescentes ba
jo una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lmpara de Wood).
Figura 54-12. Esquema de organizacin para los patgenos fungios humanos importantes.

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1167
Tabla 54-5
S n d r o m e s clnicos m a y o r e s y p a t g e n o s habitualmente asociados"
G r u p o d e pacientes Todos los pacientes P a t g e n o probable Dermatofilos
Candida Malassezia 1 Trichosporon\ \Scopulanopsis) 1 Fusarium] Coccidioides immi
lis Blastomyces dermattidis Sporolhrix schenckii Pseudallescheria boydii Nocardia
Streptomyces Actinomadura Histopiasma capsulatum Blastomyces dermatitdis C neofo
rmans Aspergillus Cigomicetos Pseudallescheria boydii Pneumocystis carinii Candi
da Aspergillus Cigomicetos Candida Candida (mohos y hongos dimrficos) Cryptococcu
s neoformans Candida Cigomicetos Aspergillus Nocardia asteroides Ciadosponutn [X
ylohypha] banltanum Otros hongos Coccidioides immitis Blastomyces dermatitdis Cry
ptococcus neoformans Moho Aspergillus Fusarium Aspergillus (lumigatus y niger) A
spergillus (lumigatus y niger) Fusarium Mohos demaliacenos Curvularia Bipolaris
Aspergillus Cigomicetos Fusarium Pseudallescheria/Scedosporium Candida Candida M
alassezia (recin nacidos) Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitdis Coccidioi
des immitis Candida Cigomicetos Aspergillus Fusarium Pseudallescheria/Scedospori
um Cryptococcus neoformans Potencialmente algunos hongos Muestras Raspado cutneo
Pelo Urta Recortes
Presentacin clnica o sistema Piel, pelo o uas
Piel, dermis y tejido subcutneo
Todos los pacientes
Biopsia
Pacientes con micetoma
Biopsia
Neumona primaria
Todos los pacientes
Esputo Lavado bronquioalveolar Biopsia transbronquial Biopsia pulmonar abierta
Inmunodeficientes
Infeccin gastrointestinal
Inmunodeficientes
Infeccin del tracto urinario Endocarditis Meningitis Encefalitis y absceso cerebr
al
Todos los pacientes Todos los pacientes Todos los pacientes Inmunodeprimidos
Raspado Curetaje Biopsias Orma Sangre Lquido cefalorraqudeo Biopsia
Osteomielitis

Todos los pacientes

Biopsia
Queratitis Otitis externa Sinusitis
Todos los pacientes Todos los pacientes Todos los pacientes
Raspado Raspado Tapn Biopsia Curetaje
Quemaduras
Biopsia
Vaginitis Infeccin de catteres intravenosos Inteccin diseminada Todos los pacientes
Tapn secreciones aspiradas Punta del catter Sangre Sangre Biopsia Sangre Biopsia
Pacientes inmunodepnmidos
" Pueden darse otias combinaciones y posibilidades j | menos comn

1168
SECCIN VI
MICROBIOLOGA MDICA
;
y pueden ser seleccionados especficamente para ser analizados. Las lesiones cutnea
s de los dermatofitos ("lombriz en anillo") se caracterizan por un borde activo
que avanza, con una cicatriz central, por eso los raspados tienen que recogerse
del borde de la lesin. Las muestras deben enviarse al laboratorio en un contenedo
r seco y limpio. Los pelos, uas y raspados de piel tienen que guardarse en un sit
io seco para evitar el crecimienlo bacteriano. Algunos mdicos, como dermatlogos y
oftalmlogos, prefieren inocular las muestras directamente en la superficie agar e
n el quirfano. Es importante desarrollar un mtodo para monitorizar el medio en lug
ares fuera del laboratorio, porque las placas Petri con alguna muestra de agar s
eca aparecern en el laboratorio sin un sistema fiable.
Tabla 54-7
Preparacin de tir
1. Centrilugar la muestra de liquido durante un mnimo de diez minutos. 2. Colocar
una gota de tinta china en un porta de cristal limpio. 3. Mezclarlo con una got
a del sedimento del centrifugado. 4 Buscar levaduras encapsuladas mediante el us
o de un objetivo de 40x. 5. Las colonias que crecen en agar pueden tambin mezclar
se directamente con tinta china en un porta para confirmar la presencia de capsu
las.
Examen directo de muestras
Los raspados, curetajes y los pelos pueden examinarse directamente por un micros
copio de luz. Las aspiraciones de pus o fluidos tambin pueden examinarse directam
ente; si el material es demasiado grueso para una observacin sencilla, puede ser
extendido en portas de cristal. Las extensiones impresas y las preparaciones tie
nen que hacerse de muestras de tejidos. Es til preparar extensiones adicionales s
in teir, porque los anlisis despus pueden mostrar agentes infecciosos que inicialme
nte no se sospechaban. Preparacin en fresco. El mtodo ms sencillo para el examen di
recto es la observacin de una suspensin de la muestra en una solucin salina estril b
ajo un cubreportas. Para muestras que contienen tejido de desbridacin y clulas, co
mo secreciones vaginales, uas y raspados de piel, debe usarse una solucin de hidrxi
do de potasio (KOH) (Tabla 54-6). Tincin de Gram. Este tinte microbiolgico usado c
omnmente es til particularmente para detectar levaduras. La mayora de las levaduras
, en especial las de Candida spp.. len parcial o complelamente grampositivos; pued
e apreciarse la presencia de bacterias contaminantes y puede valorarse la natura
leza de cualquier clula inflamatoria. Las hitas de los mohos aparecen grampositiv
as o gramnegativas por este tinte, pero la tincin es menos fiable que la de las cl
ulas levaduriformes. Tinte de Giemsa o Wright. Si se sospecha histoplasmosis, es
tos tintes hematolgicos son tiles para apreciar las clulas de las levaduras dentro
de los macrfagos. Preparacin con tinta china. Las cpsulas polisacridas del C. neolor
mans pueden demostrarse por una tincin negativa de partculas de tinta china (Tabla
54-7). Algunos miclogos prefieren nigrosina porque las partculas son ms homogneas y
es menos frecuente que artefacten. Cuando se examina con el microscopio de luz,
la cpsula se queda en el exterior como un espacio en blanco alrededor de la clula
fngica, con partculas de tinta que salen despedidas del borde con un movimiento e
xplorador (Fig. 54-13). Es importante diferenciar las seudocpsulas producidas por
focos imperfectos alrededor del borde de los leucocitos o artefactos. Si se enc
uentran las clulas en gemacin, nos aseguramos la especificidad del diagnstico. Otro
s hongos potencialmente encapsulados. como las especies de Rhodotoruia y otras e
species de criptococos. son patgenos tan infrecuentes que se puede eliminar la po
sibilidad de considerarlos. En muestras clnicas, las cpsulas son por lo general gr

andes, pero despus de aislarlas en un medio agar, pueden hacerse ms pequeas y puede
n ser ms difciles de demostrar. Por desgracia, algunas cadenas tienen una encapsul
acin pobre. La sensibilidad del test de tinta china es aproximadamente del 50% en
pacientes que no estn infectados por VIH (Diamond, 1974), mientras que la deteccin directa del antgeno en el
LCR o suero tiene una sensibilidad del 90%-100%. La deteccin de polisacridos cript
ococos por aglutinacin de ltex o por tcnicas inmunoensayos de enzimas ha sustituido
a la observacin de cpsulas de uso habitual. La tcnica de tinta china puede reserva
rse para usarla por la tarde y por la noche, cuando el test de antigenos no est i
nmediatamente disponible, y para examinar las cpsulas de colonias aisladas que su
gieren C. neoormans. Parece que el test de tinta china tiene mayor sensibilidad e
n pacientes infectados por VIH, quiz porque hay un gran nmero de clulas levaduras p
resentes (Chuck, 1989; Kovacs, 1985: Zuger. 1986). Tintes histioqumcos. El mtodo cid
o peridico de Schiff tie la pared de las clulas fngicas y se utiliza en algunos labo
ratorios de micologa. L a tcnica de la plata metenamlna se usa por lo general en l
aboratorios de histologa para detectar hongos. Cuando este mtodo se combina con eo
sinahematoxilina, puede estudiarse la morfologa detallada tanto de los tejidos co
mo de los hongos (Swisher, 1982). Estas dos tcnicas ten tambin las bacterias, especi
almente si el tiempo de tincin en el mtodo de impregnacin con plata es prolongado.
Estas herramientas se han reemplazado por el simple y ms rpido tinte de calcoflor b
lanco. Calcoflor blanco. Este componente es un blanqueador que se utiliza en las
industrias de papel y textiles se une a las paredes de las clulas fngicas y emite
una fluorescencia blanca (Fig. 54-14) o verde manzana (dependiendo de las combin
aciones de filtros que se usen) cuando se expone a una luz ultravioleta de longi
tud de onda corta (Tabla 54-8) (Hageage. 1984). Es necesario un microscopio de f
luorescencia, pero esta herramienta tan importante para el diagnstico tambin sirve
para otras tareas, como para tincin con auramina-0 de micobacterias y para inmun
ofluorescencia. Recuperar los hongos de la sangre puede acompaarse por una inocul
acin de medio de caldo, utilizando un sistema bifsico caldo-agar o por la tcnica de
la lisis por centrifugacin (Isolator, Wampole, Cranbury, NJ). El sistema Isolato
r consiste en un tubo que contiene una solucin que produce la lisis de eritrocito
s y leucocitos. Despus de sacar la sangre por vaco del tubo, los contenidos Uticos
, incluido cualquier microbio, se centrifugan y se depositan
Tabla 54-6
Preparacin KOH
1. Colocar una gota de KOH (hidrxido potsico con o sin calcoflor) en un porta de cr
istal limpio. 2. Meter la muestra en la gota de KOH preparada en el porta. 3. Cu
brirlo y calentar la mezcla de muestra/KOH pasando el porta a travs de una llama
de un mechero de Bunsen varias veces. No debe hervir. 4. Examinarlo con 10x y 40
x. Las muestras excesivamente tenaces pueden requerir un calentamiento adicional
5. Tambin puede utilizarse el KOH como medio simple, sin calentar.
Figura 54-13. La cpsula de polisacridos alrededor de la levadura en gemacin de Cryp
tococcus neoormans se tie negativamente con partculas de tinta. Advirt a n s e la re
dondez y uniformidad de las clulas levaduriformes (preparaciones c o n tinta chin
a).

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1169
Figura 54-14. El calcoflor blanco emite una fluorescencia blanca en las paredes d
el hongo c u a n d o se visualiza con microscopio de fluorescencia. L a s hilas
septadas y las ramificaciones de Aspergillus lumigalus se muestran de un m o d o
ptimo
ficacin simplificada del agar dextrosa patata que utiliza una preparacin de copos
de patata que se encuentra en las tiendas de comestibles Es mucho ms fcil de prepa
rar que el mtodo tradicional basado en patata y funciona igual. Estos medios estn
disponibles comercialmente y nos dan un balance razonable de, por una parte, la
inhibicin de bacterias contaminantes y, por la otra, de un estimulo de la morfolo
ga y color tpico de las colonias. El agar copos de patata tiene ventajas para los
hongos mohos, porque las estructuras reproductoras asexuales tiles para el diagnst
ico se desarrollan mejor en este agar que en el medio dextrosa Sabouraud. Si la
muestra es de una zona no estril, o es probable que se contamine, es importante i
nyectar en una placa selectiva y en una no selectiva a la vez. Las placas select
ivas que con ms frecuencia se utilizan usan cicloheximida para inhibir los hongos
saprofitos y agentes antibacterianos (por lo general cloranfenicol y gentamicin
a) para inhibir las bacterias. Para muestras de tejidos, especialmente cuando lo
s hongos dimrficos pudieran ser los agentes etiolgicos. debera aadirse antibitico a u
n agar enriquecido, como un agar infusin cerebro-corazn con sangre. El medio agar
puede echarse en tubos de tapa ancha o en placas Petn. L o s IUOOS proporcionan
un margen oe segunaaa para prevenir la mreccion oei personal y la contaminacin de
otros cultivos, pero los aislamientos son mucho ms difciles de manipular, y es prc
ticamente imposible crear colonias aisladas en situaciones donde est presente una
mezcla de hongos y mohos en la muestra. Adems, el factor extremadamente importan
te c o m o es el rea de superficie se disminuye con los tubos. Los tubos deberan d
estaparse y dejarlos airear antes de incubarlos. Las placas Petri proporcionan u
na sensibilidad mayor y una superficie mejor, pero deben cerrarse y manejarse co
n cuidado. El agar que se echa en las placas debera doblar la profundidad normal
(de 7 mm a 8 m m est bien) para que ste se deseque durante periodos de incubacin la
rgos. Las tapaderas deberan tener algo que permitiera pasar el aire. Inoculacin e
incubacin. En algunas situaciones, slo las colas que crecen de la hifa son vales y
el resfo de la hifa vegetativa est enferma. Las muestras ordinarias en un homogen
izador. al igual que se hace para el cultivo de bacterias, es muy desorganizado,
y los aislamientos viables pueden perderse. Es mejor inyectar raspados o cureta
jes por encima y dentro del agar en varios puntos de la superficie agar. Los tej
idos deben cortarse, despus los fragmentos son inoculados de un modo similar. Hem
os tenido la experiencia de no observar crecimiento en las placas cuando se agit
aba el cepillo de las broncoscopias en el caldo, dejando caer un trozo en el med
io agar. mientras que vimos el crecimiento de A. tumigatus en el cepillo origina
l que se haba dejado en el resto del Huido que se transportaba. Ahora inyectamos
estas muestras colocando la aguja o el cepillo directamente encima de la superfi
cie del agar principal aislado. Las placas o tubos deberan incubarse en el aire a
25C-30 C. La incubacin o inoculacin de muestras en una sala no es adecuada por la
variabilidad de la temperatura en el ambiente. Es necesario un controlador de l
a temperatura de la incubacin. No es necesario incubar placas paralelas o tubos a
37"C para recuperar la fase de levadura de los hongos dimrficos. porque los resu
ltados nos proporcionan poco rendimiento. La mayora de los hongos crecen en un pe
riodo de incubacin de dos semanas: entre los hongos que aislamos con ms frecuencia
, slo los hongos dimrficos, como Histoplasma capsulalum y Blaslomyces dermatitidis
. son con frecuencia detectados despus de un periodo de incubacin de 1 4 das (Morri
s, 1996; Hove, 1997). Las recomendaciones de estos autores son muy parecidas, po

demos resumirlas en:

en la superficie de las placas agar. Un porcentaje alto de las funguemias causad
as por levaduras pueden detectarse con uno de los sistemas de cultivo, como BACT
EC (Becton, Dickinson. Sparks. MD) o BacT-Alert (Organon Teknika, Durham. NC). L
as levaduras son organismos aerbicos, por lo que deben emplearse botes para culti
vo de aerobios. Se ha sugerido que los hemocultivos deben incluir de modo habitu
al dos frascos para aerobios por la importancia de la Pseudomonas aeruginosa y l
a Candida spp.. ambos son microbios aerobios, y que el frasco de los anaerobios
sea inoculado slo en determinadas situaciones, tales como enfermedades abdominale
s, donde la probabilidad de que existan patgenos bacterianos anaerbicos es mayor (
Morris. 1993). (Vase Cap. 57 para una explicacin ms detallada.) El mtodo mas sensibl
e para detectar la funguemia es el sistema Isolator (Jones, 1990). que es tambin
el ms susceptible para contaminarse, bien por el manejo del sistema durante el pr
oceso, o bien por esporas que son transportadas por el aire y se colocan encima
de las placas agar. Algunos informes ms recientes documentan una representacin equ
ivalente para recuperar las levaduras entre sistemas de hemocultivos continuamen
te monitorizados, que primero fueron destinados para recuperar las bacterias, y
el sistema Isolator de 10 mi (Wilson, 1993). En nios, un sistema de monitonzacin c
ontinua se compar favorablemente con el tubo Isolator 1 . 5 mi (peditrico) para re
cuperar las levaduras de la sangre (Petti. 1996). Con esto es posible detectar l
as causas ms comunes de infecciones sistmicas por hongos, sin utilizar ms sangre o
recursos de laboratorio que se requieren para detectar bacteriemia. Los mohos di
mrticos y hongos filamentosos, sin embargo, se recuperan mejor con el sistema Iso
lator.
Aislamiento de hongos en cultivo
Seleccin del medio. Todas las muestras deberan ser inyectadas en un medio elegido.
El mtodo tradicional es el agar dextrosa Sabouraud, que tiene un pH entre 5,5 y
5,6 y fue elegido para aislar los hongos dermatlicos. La modificacin de Emmons del
medio agar dextrosa Sabouraud contiene menos glucosa y un pH entre 6.8 y 7,0, y
generalmente proporciona un agar ms til. Algunas autoridades prefieren el agar qu
e inhibe los mohos o el agar dextrosa patata. Rinaldi (1982) ha descrito una mod
iTipo de muestra Tabla 54-8 Tincin c o n calcoflor blanco
Tiempo de incubacin
1. Colocar la muestra en un porta de cristal limpio. 2. Mezclarlo con calcoflor b
lanco. 3. Examinar la preparacin mediante el uso de un microscopio de fluorescenc
ia 4 El calcollor blanco se debe sustituir por lactofenol anilina algodn azul cuan
do se estudia la morlologia microscpica de los cultivos.
Dirigida a confirmar la infeccin por levadura 7 das (p. ej, boca, garganta, vagina
) Orma 7-14 das Tejidos y fluidos corporales estriles diferentes de sangre 21 das R
espiratorias, mdula Osea y muestras de sangre 28 das Muestras donde se sospecha qu
e hay un moho dimrfico 28 dias Resto de muestras 14 dias

1170
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Las placas deben examinarse al menos dos veces durante la primera semana, cuando
puede aparecer el crecimiento rpido, y al menos semanalmente despus. Afortunadame
nte, es fcil conservar aislamientos fngicos para futuros estudios o como control d
e calidad. Los mohos sobreviven un mximo de 12 aos despus de almacenarlos en agua d
estilada a temperatura ambiente (Qiangqiang, 1998). El aislamiento de levaduras
puede mantenerse por congelacin, como para las bacterias. Un mtodo simple es corta
r un pequeo bloque de agar que contenga colonias de levaduras y despus colocar el
bloque en un contenedor estril y congelarlo a -20 C o menos. Los cultivos no nece
sitan ninguna condicin especial para congelarse.
probamos la informacin recibida de la mquina entre la morfologa de las colonias y l
a morfologa microscpica, al igual que las condiciones clnicas que conocemos, estamo
s haciendo un buen trabajo. Morfologa de las levaduras. El test del tubo germinal
es un paso inicial importante para identificar el aislamiento de levaduras. Los
tubos germinales son alargados, con extensiones en forma de dedo de una clula de
levadura; son el comienzo de una hifa verdadera (Fig. 54-15). Pueden diferencia
rse de las pseudohifas por carecer de una constriccin en la unin del tubo germinal
y la clula levadura y por las paredes celulares paralelas en el tubo germinal. L
os tubos germinales verdaderos son formados por C. albicans y Candida stellatoid
ea bajo las condiciones recomendadas, permitiendo una identificacin temprana de l
as levaduras patgenas ms comunes e importantes. Candida tropicalis puede producir
hifas verdaderas y tubos germinales bajo condiciones especiales, pero generalmen
te no dentro del periodo de incubacin abreviado que se dice en el test del tubo g
erminal estndar. Es necesario limitar la incubacin del test del tubo germinal de d
os a cuatro horas, porque si la incubacin se prolonga, otras especies pueden empe
zar a formar estructuras que se parezcan al tubo germinal (Dolan, 1971). En real
idad, estos son los comienzos de una seudohifa. y una observacin cercana revelar l
a constriccin entre el llamado tubo germinal y la clula levadura La identificacin p
uede confirmarse por la documentacin de clamidosporas. Las clamidosporas son estr
ucturas que tienen una pared gruesa, que. ms que desempear un papel reproductivo,
sirve como reserva alimentaria (Fig. 54-16). Pueden estar terminales, como en C.
albicans. dentro de la hila (intercaladas), como en los dermatofitos. Hablando
de manera estricta, no son esporas, pero la larga tradicin probablemente asegure
que el nombre permanezca. Los tubos germinales verdaderos y las clamidosporas se
producen por C. albicans y C. stellatoidea. una especie poco frecuente que much
os miclogos creen que es una variante sucrosa negativa de C. albicans. El test de
l tubo germinal tradicional incluye la inoculacin de un tubo de suero (Tabla 54-9
). Se ha descrito un test para la formacin del tubo germinal en la superficie de
una infusin agar de crema de arroz con T w e e n 80 y oxgall (Beheshti. 1975). De
spus de observar el aislamiento de los tubos germinales a 37C. se contina la incuba
cin para posterior estudio de la morfologa de las hifas y la formacin de clamidospo
ras a 25 C-30 C. De este modo, toda la informacin necesaria se puede recoger de u
na vez. El agar cornea puede sustituirse, pero, a pesar del medio usado, las con
diciones de incubacin tienen que ser controladas cuidadosamente, y el test monito
rizado con controles para obtener buenos resultados. La tpica tcnica de Dalmau par
a demostrar las clamidosporas en el agar cornea se detalla en la Tabla 54-10 (Mc
Ginnis, 1980). Morfologa de los mohos. El mtodo ms simple para analizar los mohos e
s la tcnica de la cinta de celofn. Es importante que la cinta sea
Seguridad en el laboratorio
La inoculacin de muestras y todas las manipulaciones de colonias de mohos deben r
ealizarse en una cabina de seguridad de flujo laminar. Tanto el tcnico como las p

lacas de cultivo deben protegerse de la alta diseminacin de conidias fngicas mviles

. Un experimento simple en el que tapemos un poco una placa que contenga una sol
a colonia de A. lumigatus en el laboratorio convencer al observador escptico del p
roblema cuando aparezcan mltiples colonias de Aspergillus alrededor de la superfi
cie de la placa. Para disminuir la dispersin de las conidias, se ha sugerido que
los subcultivos de colonias que estn muy cargadas de conidias, como el Aspergillu
s. se realicen inundando la placa con agua estril, y despus de esto, las conidias
que hemos sacado se aspiran y se colocan en la superficie de las placas agar rec
ientes (McGinnis, 1980). No es obligatorio hacer esta maniobra, pero se debe ten
er gran cuidado para minimizar la manipulacin de cultivos y la exposicin de las pl
acas al aire libre, incluso en la cabina de seguridad. Debera realizarse una aten
cin y limpieza escrupulosas de las superficies, tanto de la cabina de seguridad c
omo de la incubacin. Separar las cabinas de seguridad para inoculacin de muestras
y estudio de mohos aislados puede reducir la contaminacin de las muestras. El may
or riesgo para el personal del laboratorio viene del manejo de los cultivos de m
ohos de los patgenos dimrficos. particularmente C. immitis. Kwon-Chung y Bennet (1
992) recomiendan inyectar en tubos sin rosca si se sospecha este patgeno, pero en
la mayor parle del pas el diagnstico no se hace antes de aislar al patgeno. Podemo
s inundar la placa con un 4% de solucin de formaldehdo (10% formalma) y dejar a te
mperatura ambiente varias horas o toda la noche antes del examen microscpico. Com
o esto es obviamente irreversible, es mejor dejar otras colonias creciendo en pl
acas y tubos de reserva. Es importante saber que la fase tejido de patgenos dimrfi
cos no es infecciosa por va area, por eso el riesgo biolgico es poco o nulo al mane
jar muestras de tejidos de pacientes con histoplasmosis o blaslomicosis. Una exc
epcin para esta regla seria C. immitis. que crece en su tase moho dentro de una c
avidad pulmonar conectada con el rbol bronquial. Adems, hay lesiones locales de Hi
stoplasma o Blastomyces que han aparecido en zonas de inoculaciones accidentales
.
Tcnicas para el estudio morfolgico de aislamientos fngicos
Algunos de los estudios morfolgicos necesarios para identificar los aislamientos
fngicos pueden lograrse con colonias de las placas de aislamientos originales, pe
ro con frecuencia es necesario transferir porciones de colonias a medios nuevos
o diferentes (subcultivos) para identificar las estructuras diagnsticas (vase Tabl
a 54-3). El agar cornea junto con Tween 80 para analizar los aislamientos de lev
aduras y el agar copos de patata para mohos son unas opciones excelentes. Estos
medios pueden prepararse en el laboratorio o comprarse en los comercios (Laborat
orios Remel. Lenexa. KS; BBL. Cockeysville. MD). La frecuencia de los subcultivo
s se reduce si utilizamos como medio principal los copos de patata. Las pruebas
bioqumicas son importantes para la informacin bioqumica, especialmente si se ha uti
lizado un sistema de identificacin comercial. Un trabajador del laboratorio que c
oloca el aislamiento en un aparato y. sin revisarlo, se cree el resultado est rea
lizando una mala tarea. Cuando comFigura 54-15. Los tubos germinales se han exte
ndido d e s d e las clulas levaduriformes de Candida albicans. No hay estrechez e
n la unin de las clulas levadunformes con el tubo germinal. L a s paredes del t u
b o germinal son paralelas. El suero h u m a n o fue incubado durante dos horas
a 37 0

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1171
Tabla 54-10 Test d e la morfologa d e las levaduras Morfologa de las levaduras en
agar 1. Extender un inoculo de levadura en una seccin de agai crnea/Tween 80 2. Cu
brir el rea inoculada. 3. Incubarlo de 25C a 30C. 4. Observar la morfologa microscpic
a a las 24-72 horas.
medir el inoculo de conidias de Aspergillus o de las cadenas de Candida blastoco
nidia en una seudohila? Los estudios de correlacin entre los resultados in vitro
e in vivo son difciles. El desarrollo de muchos antifngicos nuevos (Fromtlin. 1988
) y el posterior desarrollo de resistencia entre las levaduras patgenas han aadido
nuevos impulsos para el desarrollo y estandarizacin de los test para que se guen
los laboratorios de la quimioterapia antilngica (Terrell, 1992; Rex. 1993). El Fi
gura 54-16. Las clamidosporas producidas por Candida albicans son estructuras Co
mit Nacional de Estndares para Laboratorios Clnicos (1992) ha prode pared gruesa qu
e habitualmenle aparecen en los extremos de las hitas. L a s cla- puesto un mtodo
de referencia para los test de sensibilidad antimicrobiana midosporas son consi
derablemente ms alargadas que el dimetro de la hila (lacde las levaduras patgenas u
sando caldo diluido o una variedad de microditofenol algodn azul). lucin. Existen
mtodos ms modernos para determinar concentraciones inhibitorias mnimas de antibitico
s para patgenos bacterianos, como el Etest (AB Biodisk, Piscataway. NJ). que estn
siendo estudiados pero que requieren ms evaluaciones antes de que sean adoptados
como un medio estndar clara. Las preparaciones deben cerrarse con esmalte de uas p
ara retardar (Colombo, 1995; Sewell, 1994). Ahora es posible para los laboratori
os que tieque se sequen, y es esencial examinar pronto la muestra. Si no se obse
rnen que hacer un nmero elevado de test para aislar levaduras realizar pruevan la
s estructuras diagnsticas, se puede alargar la incubacin y repetir el bas de sensi
bilidad. Si slo tenemos que analizar aislamientos de manera proceso. El mtodo trad
icional para observar la morfologa de los mohos es ocasional, lo mejor es enviarl
o a un laboratorio de referencia. separar el micelio con agujas y examinar la hi
ta que hemos separado en El test de sensibilidad de mohos est peor estandarizado.
Estos test se salino, calcollor blanco o lactofenol, con o sin anilina azul. Se
prefiere la realizan mejor en laboratorios de referencia. anilina azul mejor que
el algodn azul, porque es menos txico. En ocasiones es necesario realizar un cult
ivo para evitar que las estructuras de las conidias se rompan fcilmente en su for
ma original. El acercamiento clsico incluye cortar cuadrados en un medio agar apr
opiado, LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS que se colocan en un plano inclina
do que se sujeta con las varillas de cristal en una placa Petri, donde aadimos ag
ua estril para mantener la humedad Otra alternativa puede ser utilizar una placa
agar que se comerGnero Candida cialice y que se haya diseado para cultivos inclina
dos (Laboratorios Las especies de Candida son las levaduras patgenas ms importante
s. Renet, Lenexa. KS). Como la terapia inmunosupresiva ha llegado a ser muy comn
y los antibitiSi sospechamos que un aislamiento de mohos puede tener hongos dimrfi
cos de amplio espectro, como las celalospormas de tercera generacin, se cos (p. e
j.. crecimiento en un medio que contenga cicloheximida), no debera usan con mucha
frecuencia, las levaduras ocupan un gran lugar entre los realizarse el cultivo
de este modo, y el test de la tira de celofn debe analizarpatgenos nosocomiales. E
n 1994, slo los estafilococos, E coli. Klebsiella se slo despus de puesta la prepar
acin en una cabina de seguridad de flujo spp. y los enterococos superaban a Candi
da como causa de infeccin sanlaminar. El lactofenol azul anilina es fungicida, po
r lo que proteger la muestra gunea en la universidad de Hermont. con esmalte de ua
s antes de observarlo nos da mayor proteccin. Tambin se puede cubrir el cultivo co
n formalina al 10% (4% solucin formaldehdo) e incubar a temperatura ambiente toda
la noche antes de manipular el moho. Factores de riesgo Las infecciones por Cand

ida tienen una extensin y una gravedad limitadas si el husped es normal. La terapi
a antibitica de amplio espectro trastorna el balance de la llora colonizante en l
as membranas mucosas de la cavidad oral y del tracto gastrointestinal al elimina
r la flora bacteriana predominante. En algunos lugares, como el aparato genital
femenino, la causa de una interrupcin en el balance normal en la flora puede no s
er obvia. En zonas cutneas, tales como las ingles y los pliegues inframamarios. u
na humedad excesiva predispone a una infeccin por Candida. La gravedad y la invas
in de la enfermedad aumenta cuando el husped tiene menos defensas (Fraser, 1992).
La diabetes, las enfermedades o terapias inmunosupresivas y la neutropenia son f
actores de riesgo comunes. Las infecciones sanguneas, incluida la endocarditis fng
ica, se fomentan por inyeccin de drogas ilegales por via parenteral (Bisbe. 1992:
Weems. 1992) y por usar vas intramusculares, como generalmente requieren los pac
ientes hospitalizados (Curry. 1971).
Test de sensibilidad de aislamientos fngicos
Durante muchos aos haba muy pocos agentes antifngicos quimioterpicos que fueran tiles
: la anfotericina B era el nico agente efectivo contra la mayora de los patgenos si
stmicos. Este potente agente antifngico era con frecuencia txico, pero por fortuna
era rara la resistencia. El desarrollo de los test de sensibilidad para los anti
biticos m vilro fue interrumpido por dificultades para estandarizar las condicion
es de inoculacin y crecimiento. Cmo
Tabla 54-9
Test d e l t u b o g e r m i n a l - s u e r o
1. Colocar de un modo asptico varias colonias de levaduras a un tubo de test de 1
? x 75 mm que contenga aproximadamente 0,5 mi de suero (humano feto de ternero,
de oveja o conejo) 2 Incubar el tubo a 37 C. 3. Despus de 2 a 4 horas, colocar un
a gota de la mezcla en un porta de cristal limpio. 4 Buscar tubos germinales med
iante el uso de un objetivo de 40x.
Q
Manifestaciones
clnicas
El patgeno ms comn con diferencia en el gnero Candida es C. albicans. La frecuencia
con que se aislan otras especies vara en funcin de la

1172
SECCIN VI

MICROBIOIOGA MDICA
institucin. Candida (Torulopsis) glabrata. parapsilosis tropicalis son los siguie
ntes patgenos ms frecuentes (Pfaller, 1998) Iropicalis se encuentra en pacientes i
nmunodepnmidos que tienen enfermedad diseminada. C. parapsilosis puede producir
tambin enfermedad diseminada, particularmente cuando el paciente h a abusado de l
as drogas o ha tenido catteres intravenosos (Weems. 1992). C. glabrata (formalmen
te Torulopsis glabrata) tambin causa funguemias (Harn. 1993; Marks. 1970). Se ha a
sociado con infecciones del tracto urinario y vaginal (Kauffman, 1974; Sobel, 19
86). C. kruse/'es una causante menos comn de infeccin diseminada que se parece a l
a producida por C. Iropicalis (Goldman, 1993). Continan asocindose muchas especies
con las infecciones humanas, como C. zeylanoides (Levenson. 1991). demostrando
una vez ms que la capacidad de los hongos para producir infecciones humanas es in
exhaustible si las condiciones clnicas son adecuadas. La resistencia a los antibit
icos imidazlicos (p. ej., cetoconazol. fluconazol o ilraconazol) desafortunadamen
te est aumentando en los aislamientos de especies de Candida. glabrata y C. kruse
i en particular son intrnsecamente ms resistentes a estos antifngicos que C. albica
ns (Pfaller. 1988). Candida lusitaniae. un patgeno aislado con poca frecuencia, e
s propensa a desarrollar resistencia a la anfotericina in vivo (Blinkhorn. 1989;
Hadfield, 1987). La frecuencia con que se aislan varias especies varia de una i
nstitucin a otra. La enfermedad cutnea como ms frecuentemente se ve es como lesione
s erilematosas de la piel, algunas veces acompaadas de un exudado blanco cremoso
o escamas. La humedad es una precursora de la infeccin, por ejemplo, eritema del
paal en nios o infeccin de los pliegues cutneos (intertrigo) en adultos. Las zonas c
omunes son las ingles (en forma de picor), entre los dedos de las manos y pies,
debajo del pecho en las mujeres y en las axilas. Los trabajadores que tienen que
meter las manos en el agua durante periodos de tiempo largos tienen un gran rie
sgo de infeccin de la piel de las manos, uas (onicomicosis) o paroniquia. Tambin po
demos encontrar las lesiones en la piel de los muslos y nalgas, aunque son zonas
donde no es corriente la infeccin. Una enfermedad cutnea crnica es una manifestacin
poco comn de infeccin por Candida en pacientes con una inmunidad celular defectuo
sa (Kirkpatrick. 1971). La candidiasis oral por lo general se manifiesta como un
as placas blancas por encima de la mucosa oral entematosa. Los sntomas son mnimos,
pero puede haber una disfagia importante si la infeccin es grave. Es comn que apa
rezcan fisuras en las comisuras de la boca (queilitis angular) y esto suele ser
la primera manifestacin. La candidiasis oral es una infeccin inicial comn en pacien
tes infectados por VIH (Gottlieb. 1981; Klein. 1984). La candidiasis oral y la i
nfeccin por Pneumocystis y eran las dos pistas iniciales para identificar la pres
encia del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). La candidiasis gastroint
estinal se produce ms comnmente como esofagilis (Haulk, 1991) y menos comnmente com
o gastritis (Katzenstein. 1979). Las erosiones del esfago distal y del estmago pro
vocan un dolor retroestemal. que empeora al tragar. A veces, por endoscopia, vem
os unas placas blancas cubriendo la lesin. El diagnstico diferencial incluye la in
feccin por el virus del herpes simple, y los des procesos pueden coexistir. Las e
species de Candida son flora frecuente del tracto gastrointestinal bajo (Cohn, 19
69), haciendo complicada la valoracin del significado de las levaduras en las mue
stras de heces. Una infeccin invasiva verdadera del tracto intestinal bajo es muc
ho menos comn que la enfermedad del tracto alto, aunque el crecimiento de Candida
spp. en las heces debe acompaarse de tratamiento antibitico. Se h a descrito ente
ritis por Candida, carece de documentacin histolgica (Kane. 1976; Kozinn, 1962). La
vulvovaginitis afecta a las mujeres pospuberales. La diabetes, el tratamiento an
timicrobiano, los embarazos y la actividad sexual son condiciones predisponentes
. Una quemazn vaginal, picor, dispareunia y una secrecin de color crudo se asocian
con una infeccin que puede ser aguda o crnica y difcil de erradicar (Sobel, 1986).

La infeccin del tracto urinario es difcil de diagnosticar, porque es frecuente qu

e encontremos especies de Candida en la orina por una contaminacin vaginal o colo
nizacin de la vejiga en pacientes con catteres intravasculares. especialmente cuan
do se han administrado antibiticos por va sistmica (Goldberg, 1979). La infeccin gra
ve del tracto urinario alto, incluida la necrosis de la papila renal, es una complicacin seria de las infecciones del tracto ba
jo, y se produce generalmente en pacientes que tienen una uropata obstructiva. Lo
s cultivos no son tiles para valorar el significado de las especies de Candida en
el tracto urinario (Goldberg, 1979). L a candidiasis diseminada es una enfermed
ad nosocomial seria, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos que estn neutropnico
s (Fishman, 1972: Klein. 1979). Del 10% al 15% de las infecciones del torrente s
anguneo las causan las levaduras. Las lesiones focales en cualquier rgano pueden s
er el resultado de una diseminacin hematgena. Es raro que se produzca endocarditis
(Johnston, 1991) en pacientes que abusan de drogas (Bisbe, 1992: Weems, 1992).
Desafortunadamente, muchos hemocultivos con frecuencia son negativos en las cand
idiasis diseminadas (Jones, 1990). Es importante retirar los catteres infectados
(Edwards. 1992). Muchos especialistas de enfermedades infecciosas recomiendan un
a terapia emprica para la infeccin hongos si el tratamiento que hemos utilizado pa
ra los patgenos bacterianos no ha funcionado, sobre todo en pacientes inmunodepri
midos con neutropenia (Pizzo. 1989: Walsh. 1999). La mayora de las infecciones pu
lmonares se presentan como parte de una infeccin diseminada. La neumona primaria p
or Candida puede producirse, pero no es lo habitual (Harn, 1993; Ramrez, 1967). El
valor predictivo para la neumona por levaduras identificadas o especies de Candi
da aisladas de muestras respiratorias es m u y bajo, porque pueden estar contami
nadas con secreciones del tracto respiratorio alto. Un acercamiento razonable de
costebeneficio para las levaduras del tracto respiratorio es informar de su pre
sencia como formas levaduriformes despus de eliminar la posibilidad de que sea un
criptococo con un rpido test de ureasa (Murray, 1977). Las infecciones del siste
ma nervioso por Candida son poco corrientes (Bayer. 1976; Parker, 1981), Pueden
producirse como una parte de una infeccin diseminada o pueden resultar de una ino
culacin directa.
Patologenia de la infeccin por Candida
La reaccin histolgica a la infeccin por Candida es por lo general purulenta, asemejn
dose a las lesiones de las infecciones bacterianas. Encontramos generalmente abs
cesos. En ocasiones, la reaccin a la infeccin por Candida es granulomatosa. En tej
idos, podemos encontrar levaduras gemando, pseudohilas e hitas verdaderas. El af
orismo que tanto se repite de que las pseudohifas en una superficie mucosa indic
an un infeccin invasiva deriva de los estudios clnicos de enfermedad gastrointesti
nal (Kozinn, 1992). pero esta teora ya se ha rechazado en el momento actual (Odds
, 1994). Cuando predominan las pseudohifas o las hilas verdaderas, hay que difer
enciar las levaduras de los mohos patgenos invasivos, como el Aspergillus. La inv
asin vascular no es comn en infecciones por levaduras, como sucede con el Aspergil
lus o los cigomicetos. Con frecuencia se muestran levaduras en las partes teidas
con hematoxilina-eosina, pero tambin hay que utilizar la tincin de Gram de tejidos
, el tinte de metenamina plata y la tcnica del cido peridico de Schiff.
Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones
Las muestras para cultivo deben tomarse de los rganos afectados y de lesiones don
de puedan visualizarse. Como se ha explicado antes, el sistem a Isolator es el mt
odo ms sensible para detectar bacteriemia (Jones. 1990). pero los sistemas modern
os de monitorizacin continua de hemocultivos, que en principio se usaban principa
lmente para detectar la bacteriemia, detectan la mayora de los aislamientos de le
vaduras clnicamente significativos (Wilson, 1993; Petti, 1996). Las muestras de t
ejidos, raspados o exudados de boca o vagina tienen que inocularse en un medio d
e aislamiento primario con y sin cicloheximida. Si en presencia de la ocloheximi
da hay buen crecimiento, es una pista preliminar de la presencia de Candida albi
cans, aunque C. guilliermondii. C. kefyr (formalmente pseudotropicalis) y alguna
s cepas de C. iropicalis pueden encontrarse tambin en este medio. La presencia de

extensiones filamentosas de los bordes de la colonia (pies) es una indicacin mac

roscpica de que se estn produciendo pseudohifas (Fig. 54-1). C. glabrata (formalme
nte Torulopsis glabrata) y Cryptococcus spp. in vitro no forman pseudohifas, y o
tras especies de Can-

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1173
dida. como C. lusilamae y C. guilliermondii, puede que no formen muchas pseudohi
fas. La extensin de la evaluacin micolgica depende del marco clnico y del tipo de mu
estra. Los tractos urinario y respiratorio son dos sistemas orgnicos impodantes d
onde aislar Candida frecuentemente, pero es difcil de interpretar, como ya se ha
explicado. La identificacin completa de aislamientos de estos sitios slo debera ter
minarse despus de consultarse con el mdico responsable. Aunque la prctica clnica nor
malmente no se altera por identificar especies de Candida aisladas, pensamos que
los aislamientos de sangre u otros tepdos y fluidos estriles deberan examinarse e
nteros cuando las levaduras son el patgeno predominante o el nico. Del mismo modo,
identificamos los aislamientos cuando se ha pedido analizar los hongos en un ma
rco donde se espera encontrar Candida, como vaginitis o muguet oral. La importan
cia puede ser til para el epidemilogo del hospital para el estudio de las infeccio
nes nosocomiales. Un grupo de investigadores ha sugerido que el porcentaje de re
currencia y cronicidad de la vulvovaginitis son mayores cuando el patgeno es C. I
ropicalis que cuando es C. albicans (Horowitz, 1985), pero se necesitan ms estudi
os. Cuando aislamos una levadura en el laboratorio bacteriolgico, o est presente e
n una infeccin polimicrobiana, informamos de su presencia, y antes de hacer ms est
udios pediremos una consulta. Es muy poco frecuente que tengamos estas peticione
s. Tenemos que expedir un informe preliminar de C. albicans si el test del tubo
germinal es positivo (Fig. 54-15). Si hacemos el estudio de la morfologa de las l
evaduras utilizando un agar crnea para confirmar la presencia de clamidosporas. l
a identificacin por lo general puede terminarse en una sola placa de agar en 24-4
8 horas; en ocasiones, a las 72 horas para que el cultivo se complete (Fig. 54-1
6). Si no se demuestra el tubo germinal ni las clamidosporas. la identificacin pr
imaria o presuntiva de las especies de Candida puede hacerse si las pseudohifas
estn presentes o no hay artroconidias. Una pequea fraccin de Candida aisladas no pr
oducen pseudohifas. tubos germinales o clamidiosporas. Una identificacin completa
necesita un test de asimilacin, pero las observaciones morfolgicas auxiliares son
necesarias (Tabla 54-11). Algunos laboratorios usan los lest de fermentacin para
ayudar a identificar las especies de Candida, pero no se piden. En el momento a
ctual no se recomiendan los test nmunolgicos para diagnosticar candidiasis (de Rep
entigny. 1992). Continua la investigacin de los mtodos para detectar antgenos. que
podran proporcionar un test til y rpido para la infeccin invasiva.
ciones que definen el VIH que ha llegado a ser el factor de nesgo ms importante E
s animoso que la incidencia de esta infeccin oportunista parece disminuir entre p
acientes con sida en algunas ciudades (Hajjeh. 1999).
Enfermedad
clnica
Neumona. La puerta de entrada de todas las infecciones criptoccicas es el pulmn, au
nque la enfermedad pulmonar sintomtica puede no estar presente en el momento que
se reconozca la enfermedad extrapulmonar (White. 1994). La neumona criptoccica nue
stra una amplia variedad de presentaciones. Los pacientes inmunocompetentes pued
en no mostrar sntomas, a pesar de la presencia de los criptococos en el Irado res
piratono bajo (Randhawa, 1977). La neumona puede ser lenta y prolongada, tardando
mucho en resolverse. La infeccin puede ser difusa o localizada, incluida la pres
encia de lesiones nodulares que no suelen calcificar. La infeccin es ms grave en p
acientes inmunocomprometdos. y con frecuencia se acompaa por otros agentes infecci
osos, en particular Pneumocystis cannii y citomegalovirus. La enfermedad extrapu

lmonar puede aparecer semanas despus de haber encontrado una infeccin pulmonar (Ke
rkering, 19811 Infeccin cutnea. Las lesiones cutneas por lo general son el resultad
o de la diseminacin hematgena desde el tracto respiratorio (Pema, 1994). Se presen
tan como ppulas simples o mltiples, que aumentan y se ulceran, produciendo un pequ
eo exudado que contiene las levaduras. Infeccin articular y sea. Una vez ms el foco
primario de infeccin es el tracto respiratorio, desde donde se disemina el cnptoc
oco: lo ms comn es a la columna vertebral (Behrman. 1990). Se producen lesiones os
teolticas. Los abscesos llamados fros en el tejido suave adyacente producen un exu
dado fino que contiene gran nmero de criptococos. Con menos frecuencia incluye lo
s espacios articulares. Infeccin del sistema nervioso central. Los focos ms frecue
ntes y peligrosos de infeccin criptoccica diseminada son las meninges y el parnquim
a cerebral (Chuck, 1989; Kovacs. 1985; Lewis. 1972; Zuger. 1986). El comienzo de
la enfermedad suele ser agudo, pero la presentacin puede ser insidiosa y la prog
resin lenta. Las cefaleas y cambios en el estado mental y de personalidad con fre
cuencia dominan el cuadro clnico. L a meningitis basilar, afectacin de los nervios
craneales, y la invasin de la parte de debajo del crtex. producen una hidrocefali
a y disminuyen la agudeza visual. Si hay fiebre, es febrcula, y los signos tpicos
de irritacin menngea, como rigidez de nuca y los signos de Kernig y Brudzmski, estn
ausentes.
Gnero
cryptococcus
El patgeno principal dentro de este gnero es el Cryptococcus neoormans. Existen dos
variedades: C. neotormans variante neotormans y C. neotormans variante gattii.
La ltima variante se encuentra predominantemente en los trpicos y subtrpicos, y es
raro aislarla en los laboratorios clnicos en EE.UU. (Levitz, 1992). Ambas variant
es tienen dos serotipos. pero la determinacin serolgica slo es de inters epidemiolgic
o. El estado sexual del C. neotormans es un basidiomiceto, Filobasidiella neotor
mans. pero el teleomorto no se aisla en laboratorios clnicos. Otros criptococos y
Rhodotorula spp. en ocasiones se aislan en zonas no estriles, pero es raro que e
stn implicados en enfermedades humanas, si se encontrasen alguna vez (Horowitz, 1
993; Kiehn, 1992; Sinnott, 1989). La fuente ambiental primaria del C. neotormans
son los excrementos de palomas o. menos comnmente, de otras aves. El suelo conta
minado tambin puede esconder los hongos.
Patologa de la infeccin por Cryptococcus
La respuesta histolgica depende del grado de encapsulacin de la cadena infectada.
Lo ms comn es que no haya respuesta inflamatoria o que sea pequea, correspondiendo
al exudado fino visto clnicamente. Meior dicho, las clulas del tejido normal estn s
eparadas por un gran nmero de criptococos encapsulados. Cuando examinamos el LCR,
las nicas clulas presentes pueden ser las levaduras, que podan malinterpretarse co
mo clulas huspedes mononucleares si por la clnica no sospechamos la infeccin. En las
tinciones de tinta china positivas encontramos cpsulas grandes. En los tejidos s
eccionados es raro que encontremos pseudohifas cortas y rudimentarias de C. neot
ormans (Freed, 1971). Las cadenas del C. neotormans pobremente encapsuladas prod
ucen una respuesta granulomatosa inflamatoria, y las levaduras las encontramos p
redominantemente en el citoplasma de los macrfagos (Farmer. 1973) Pueden confundi
rse con las clulas del Blastomyces dermatitidis o incluso con esprulas inmaduras d
el C. immitis. Se han descrito confusiones entre levaduras pequeas criptoccicas co
n el H. capsulatum, pero la diferenciacin por lo general no es difcil (Gutirrez, 19
75). La dilerenciacin en los Irozos de tejido puede terminarse al teir los mucopol
isacridos de criptococo con tintes de mucina, o al demostrar el pigmento de melan
ina con el tinte de Fontana-Masson. El tinte de melanina es ventajoso cuando la
cadena infectada tiene poco material capsular (Ro, 1987) Las combinaciones del t
inte Fontana-Masson y varios tintes para mucopolisacndos, como mucicarmma o azul
alcin se han utilizado para
Factores de riesgo

El tratamiento inmunosupresor o la enfermedad es un factor de riesgo para la cri

ptococosis (Williams, 1976). Antes de que apareciera la infeccin por VIH. del 30%
al 50% de los pacientes con infeccin por Cryptococcus eran inmunolgicamente norma
les, medidos con parmetros adecuados. Entre los factores de riesgo para los pacie
ntes que no estn infectados por VIH se incluyen neoplasia, diabetes, terapia inmu
nosupresiva o enfermedades inmunolgicas (Hajjeh, 1999). La criptococosis es una d
e las infec-

Tabla 54-11
Detalles auxiliares tiles para la Identificacin de levaduras Crecimiento con ciclo
heximida + -(+) Tubos . ... _. germinales Pseudohifas P.gmento ro,o + + + + + +
+ (-) _ _ _ _
+ H +
Organismo Candida albicans Candida tropicalis
Ureasa
Artroconidias _
.. Crecimiento Clarmdosporas
c o n | i p d o s
Ascosporas _
Comentarios
+
Candida parapsilosis Candida krusei Candida kelyr (pseudotropicalis) Candida gui
lliermondii Candida (Torulopsis) glabrala Candida lusitaniae Cryptococcus neofor
mans Especies de Rhodotorula Malassezia frfur Malassezia pachydermatis Especies d
e Trichosporon Geolrichum candidum Saccharomyces cerevisiae
i
+ + _ _ _

+

+ + _ _

+
+ (->
+ + Pseudohifas bien desarrolladas, rara produccin de tubos germinales Pseudohifas en

cepillo Colonia plana y seca Pseudohifas en "tronco en arroyo"; verde brillante

en agar EMB Las pseudohitas pueden estar ausentes o en poco nmero; colonia vitre
a Levaduras pequeas (de 2uma5 pm) Las pseudohilas pueden estar en el escaso nmero
Capsula polisacrida presente, clulas levaduriformes redondas La cpsula polisacrida p
uede estar presente Levaduras pequeas con lorma de termo Levaduras pequeas con for
ma de termo No blastoconidias, artroconidias germinales a partir del ngulo de la
clula Las pseudohilas pueden ser raras
-(+)
+
(): Reaccin menos frecuente. EMB eosina azul de metiieno.

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1175
avanzar, pero no suelen ser necesarios (Lazcano. 1993). Blastomyces dermatitidis
se tie muy poco con los linles de mucina en raras ocasiones. El Rhinosporidium s
eeberies positivo para la mucina. no se ve en climas templados y se diferencia fc
ilmente de los criptococos en cuanto a la morfologa. Las clulas que vemos en la cr
omoblastomicosis contienen melanina. pero se diferencian en la morfologa y no rea
ccionan con tintes de mucina. El tamao variable (3 pm-10 pm) y la naturaleza redo
nda de la levadura in vivo y son pistas para identificarlas correctamente, a pes
ar del grado de encapsulacin y respuesta histolgica. Un complejo primario de granu
lomas en la periferia del pulmn y en nodulos linfticos regionales, que recuerda a
los que nos encontramos en tuberculosis e histoplasmosis. probablemente se produ
ce con ms frecuencia de la que lo reconocemos (Salyer. 1974).
te indio, se ha encontrado en muchos animales, especialmente en las orejas de lo
s perros, y en ocasiones de los humanos. El nombre formal del M. turtur es Pityr
osporum ovale o P. omiculare. dependiendo de la morfologa de la levadura.
Factores de riesgo
M. frfur se encuentra en la piel de ms del 90% de los individuos (Roberls. 1969b.
1969c), y la enfermedad cutnea se produce en huspedes normales. Puede haber un aum
ento de sensibilidad a la enfermedad en pacientes que suden mucho (Roberls, 1969
a) o en pacientes que tienen un nivel de corticoesteroides elevado debido al tra
tamiento (Boardman, 1962) o una produccin endgena, como en la enfermedad de Cushin
g (Caizares. 1959). La infeccin sistmica se produce principalmente en neonatos y se
asocia con una hiperalimentacin intravenosa con soluciones lipidicas (Powell. 19
86). Aunque M. frfur no suele estar presente en la piel de los neonatos sanos, se
ha encontrado la levadura en la piel del 37% de los nios que estuvieron en la un
idad de cuidados intensivos (Powell, 1987). Los factores de nesgo para la infecc
in por M. pachydermatis en humanos son similares (Mickelsen, 1988).
Identificacin en el laboratorio y otras investigaciones
Los posibles criptococos siempre deben identificarse como especies para determin
ar si el C. neotormans est o no presente. Las pistas para ver la presencia de est
e hongo son un buen crecimiento en placas de agar de sangre incubados en el labo
ratorio bacteriolgico a 35'C-37 C. las colonias tienen apariencia mucoide (Lmina 5
4-4), apariencia redonda de las clulas de levadura en las preparaciones en fresco
o preparaciones teidas y ausencia de crecimiento en un medio que contiene cicloh
eximida (Tabla 54-11). Podemos obtener una supuesta identificacin de un modo rpido
examinando una preparacin de tinta china para las cpsulas (Fig. 54-13) (Tabla 547) o realizando un test rpido de ureasa (Tabla 54-4). o ambos. Las cpsulas pueden
diseminarse incluso en cadenas fuertemente encapsuladas una vez que se han aisla
do en medio agar. Hemos encontrado varios aislamientos de C. neotormans del trac
to respiratorio que eran no mucoides y que se parecan a Candida spp. en la morfol
oga de las colonias. El subcultivo de los aislamientos puede restaurar la cpsula m
ucoide. La identificacin definitiva se lleva a cabo por un test bioqumico. La dete
rminacin de la actividad de la fenol oxidasa puede incluirse, pero no es necesari
o si se utiliza uno de los sistemas de identificacin de levaduras que se comercia
lizan. El antgeno polisacrido del C. neotormans puede encontrarse en el LCR y el s
uero: lo ms comn es por una aglutinacin de ltex. La sensibilidad del test supera el
90%. pero los equipos comerciales varan considerablemente en sensibilidad y espec
ificidad. El factor reumatoide puede dar falsos positivos (Dolan. 1972). y deben
incluirse controles para la antiglobulina en los test (Bennett. 1971). Las infe
cciones grupo DF-2 (Capnocytophaga canimorsus). los bacilos gramnegativos no fer

mentativos (Westerink, 1987) y T. beigehi pueden causar falsos positivos, pero st

as son infecciones poco comunes. Otras causas ocasionales de falsos positivos so
n poco comprensibles. La frecuencia de resultados errneos puede disminuir tratand
o las muestras de suero con pronasa (Hamilton, 1991; Stockman, 1982). Los falsos
positivos parece que son menos comunes en pacientes infectados por VIH. quiz por
que hay presente un gran nmero de organismos (Berln, 1989). La titulacin de los res
ultados positivos se ha hecho de modo adicional para valorar el pronstico y como
una base para seguir los efectos del tratamiento. Un gran nmero de antigenos y la
persistencia del antigeno siguiendo tratamiento son pequeos signos de pronstico e
n pacientes que no estn infectados por VIH (Diamond, 1974). Por el contrario, no
se ha demostrado que estos parmetros sean tiles de manera uniforme en pacientes co
n VIH, que en la actualidad son el grupo de mayor nesgo (Chuck. 1989; Kovacs, 19
85; Zuger. 1986). La medida del antgeno en el suero parece ser el test ms sensible
en pacientes inlectados por VIH, ms que el anlisis de LCR. Tanto el suero como el
L C R deben analizarse para una buena sensibilidad. En algunos informes, aislar
el C. neotormans de un sitio de fuera del SNC se ha asociado con un pronstico po
bre en pacientes infectados con VIH. Un test negativo para la tinta china en el
LCR es un signo de buen pronstico en pacientes no VIH, pero no tiene la misma imp
licacin en pacientes con sida.
Enfermedad
clnica
Pitiriasis (tina) versicolor. Esta infeccin comn de la epidermis termina en una hi
perpigmentacin o hipopigmentacin de la piel, sobre todo en el tronco y parte alta
de los brazos (Powell. 1986). Las mculas marrones es la presentacin ms comn, pero la
s lesiones despigmentadas son ms obvias en personas de piel oscura, y pueden util
izarse sustancias para acentuarlas en individuos de piel clara. Los efectos de l
a enfermedad son puramente cosmticos, pero pueden ser considerablemente problemtic
os. Las lesiones hipopigmentadas deben diferenciarse del vitligo. El tratamiento
consiste en una aplicacin tpica de cremas fungicidas o enjuagues. Infeccin sistmica.
La infeccin sistmica se produce en casi todos los nios que han recibido infusiones
intravasculares de lpidos. Aunque las soluciones lipidicas por s solas no apoyan
el crecimiento de las levaduras, las soluciones lipidicas diluidas apoyan el cre
cimiento de M. frfur abasteciendo la cadena larga de cidos grasos que tambin se enc
uentran en la piel, y deben abastecerse en laboratorio para aislarlas (Powell, 1
986). Los nios infectados por lo general estn asintomlicos. pero la fiebre, la leuc
ocitosis y la trombocitopenia pueden estar presentes. La neumona es la manilestac
in sistmica ms importante de la enfermedad, probablemente a causa de una embolia de
catteres intravenosos infectados. El tratamiento es quitar el catter infectado.
Patologa de la infeccin por Malassezia frfur
El diagnstico de pitiriasis versicolor por lo general se hace clnicamente o demost
rando levaduras o formas cortas de hifas (parecidas a los espagueti) en preparac
iones de KOH de raspados de piel. Aadir calcoflor blanco u otros tintes fngicos aum
enta la deteccin porque las clulas fngicas son pequeas y es difcil verlas cuando no e
stn teidas (Fig. 54-17). Cuando se hace la biopsia puede verse hiperqueratosis. ac
antosis y unos infiltrados drmicos mononucleares. Se sabe poco de la patologa de l
a infeccin sistmica de M. luriur, porque es raro hacer biopsias y la infeccin letal
no es comn. En casos extremos, las lesiones se han descrito en muchos rganos, inc
luidos pulmn, hgado y rion (Shek, 1989). Tambin se observaron vasculitis. endocardit
is, infartos spticos e inflamacin granulomatosa.
Identificacin del laboratorio y otras investigaciones
En enfermedades cutneas es raro que se pida un cultivo para M. luriur, y la obser
vacin directa de las levaduras en preparados de KOH por lo general se hace en el
despacho del mdico. Esta levadura debera verse en cultivos de sangre y en la punta
de catteres intravenosos en neonatos. Antes de inocularla, se aade una gota estril
de aceite de oliva a la superficie de un medio agar vlido, como el agar Sabourau

d dextrosa o el agar
Gnero Malassezia
Las dos especies ms importantes dentro del gnero Malassezia son M. furtury M. pach
ydermatis (Marcon, 1992). M. frfures con diferencia el patgeno humano ms comn. M. pa
chydermatis, micialmente aislado de un rinoceron-

1176
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
sangre de oveja. En nuestro laboratorio utilizamos aceite de cacahuete, que tamb
in funciona bien. Dentro de los dos o tres primeros das, las colonias aparecen en
marrn claro y por lo general tienen una apariencia muy seca en el aceite subyacen
te (Lmina 54-5). Una pista inicial es la taita de crecimiento por la presencia de
un aceite. Debera haber suficiente lipido en la sangre o en la punta de catter, s
in embargo, para mantener el crecimiento inicial en las placas que no contienen
aceite. M. pachydermatis no es dependiente de la cadena larga de cidos grasos par
a crecer. La identificacin del aislamiento puede confirmarse por un examen micros
cpico de las clulas de levadura, que miden de 3 pm a 7 pm. El proceso de gemacin en
la Malassezia es inusual, porque se produce como un proceso enteroblstico con la
formacin de flides. La gemacin tiene una amplia base y los collaretes de las filides
podran observarse con el microscopio de luz como un anillo oscuro distinto que s
epara la clula madre de la hija (Fig. 54-18).
Otras levaduras y patgenos semejantes a levaduras y saprofitos
7! beigelii produce una infeccin del pelo conocida como piedra blanca y puede pro
ducir infeccin sistmica (Hoy. 1986: Ogata, 1990). El Blastoschizomyces capitatus (
formalmente Trichosporon capitalum) ha causado casos raros de infeccin diseminada
semejante a la candidiasis (Liu, 1990). Un hongo morfolgicamente similar, Geotri
chum candidum, es tambin una causa rara de enfermedad pulmonar o diseminada (Fish
bach, 1973; Jagirdar. 1981). Geotrichum y Trichosporon producen colonias lisas y
parecidas a las levaduras que despus desarrollan micelios areos, como un pelo que
nace de una cabeza calva (Lmina 54-6). Ambas especies producen artroconidias que
rompen las clulas disyuntoras vistas en el C. immitis (Fig. 54-19). Saccharomyce
s cerevisiae (Clemons. 1994; Sobel. 1993), especies de Rhodotorula (Pen. 1980) y
las especies de Hansenuta son levaduras saprofticas que en raras ocasiones pueden
producir infeccin. Encontrar levaduras en los tejidos o aislarlas en mltiples mue
stras, incluso de zonas estriles, es necesario para informar del papel de las lev
aduras en un proceso infeccioso. Saccharomyces cerevisiae es la levadura de los
panaderos y a lo mejor es ms conocida por los estudiantes de micologa por sus efec
tos saludables en malta y lpulos.
Figura 54-18. Clulas levadurilormes en gemacin de Malassezia luriur que dan la clsi
ca forma de termo.
Sporothrix schenckii. El Sporothrix se distribuye a travs de lodo el mundo. Los or
os organismos se encuentran predominantemente en Amrica del Norte, donde tienen d
istintas distribuciones geogrficas (Fig. 54-20). La enfermedad epidrmica es ms comn
con Histoplasma y Coccidioides y menos comn con Sporothrix y Blastomyces. La fase
de tejido de Coccidioides es la esfrula. El otro gnero produce una fase levadura
in vivo y puede tambin crecer como una levadura si se incuba a 37'C m vitro.
Histoplasma
capsulatum
Factores de riesgo
El principal tactor de riesgo para adquirir la infeccin es vivir en una de las re
giones endmicas de EE.UU.. en una zona que se localice en el curso de los ros Ohio
y Missssppi. as como en los valles de las montaas Appalachian. En algunas zonas, ms
del 90% de la poblacin tiene un resultado positivo en los test de piel de histopl
asmina. El crecimiento de H. capsulatum se estimula por el pjaro guano, aunque lo

s hongos no crecen en los mismos pjaros. Una tpica historia de una histoplamosis a
guda est representada por el paciente que ha limpiado recientemente un gallinero.
Las enfermedades epidmicas se han producido despus de hurgar en los nidos de los
pjaros durante proyectos de construccin (Tosh. 1966). De
HONGOS DIMRFICOS
Los hongos dimrficos son los organismos patgenos ms importantes encontrados en un l
aboratorio de micologa clnica. En EE.UU.. los patgenos ms importantes son H. capsula
tum. Blastomyces dermatitidis. C. immitis y
Figura 54-17. Raspado cutneo de una lesin de tina versicolor. Son caractersticas la
s formas levadurilormes e hifas cortas de la Malassezia uriur. Estas formas Figur
a 54-19. Las artroconidias y la especie Trichosporon no estn separadas p o r s e
han descrito c o m o "espagueti y albndigas" (mtodo PAS). clulas disyuntoras (lacto
fenol algodn azul).

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1177
suelve completamente. Si ha habido una inflamacin granulomatosa local, la calcifi
cacin del foco puede deiar una lesin nodular perfectamente definida que puede vers
e en la radiografa de trax. Las lesiones cutneas del eritema nodoso y del eritema m
ultiforme pueden acompaarse de una infeccin pulmonar aguda (Medeiros. 1966). Peric
arditis y mediastinitis. La inflamacin granulomatosa del pericardio y la mediasti
nitis se han atribuido al H. capsulatum. con ms frecuencia en terreno serolgico (L
oyd, 1988; Schowengerdt. 1969). La inflamacin crnica puede terminar en fibrosis y
pericarditis constrictiva. Es raro ver levaduras en las lesiones y es raro encon
trarlas en el cultivo. H i s t o p l a s m o s i s crnica pulmonar. Esta enfermed
ad debilitante se produce principalmente en pacientes con enfermedad pulmonar ob
structiva crnica. La mayora de ellos suelen ser hombres de mediana edad (Goodwin,
1995). Puede calcificarse y producirse una cavitacin. El diagnstico diferencial in
cluye tuberculosis pulmonar crnica y neoplasia pulmonar. H i s t o p l a s m o s
i s d i s e m i n a d a . La diseminacin de las levaduras a travs del sistema reti
culoendotelial puede ser como una parte de u n a histoplasmosis pulmonar aguda,
terminando en granulomas cicatrizados que con frecuencia se calcifican, especial
mente en el bazo (Johnson. 1988; Kauffman, 1978; Nightingale, 1990; Reddy, 1970)
. La enfermedad diseminada clnicamente se produce en dos clases de pacientes. El
primer grupo son individuos en edades extremas que no tienen una condicin inmunos
upresiva reconocida, pero pueden tener el sistema inmune que no est completamente
desarrollado, o que ha disminuido por la edad de un modo que no se entiende. El
segundo grupo son pacientes con una enfermedad o tratamiento inmunosupresivo qu
e est reconocido. Antes de 1980, las enfermedades eran predominantes en neoplasia
s hematolgicas; en la actualidad, la infeccin por VIH es el factor de nesgo ms impo
rtante (Johnson, 1988; Wheat, 1990). El avance de la enfermedad puede ser rpido o
insidioso. L a infeccin del sistema reticuloendotelial puede terminar en linfade
nopatia, hepatoesplenomegalia o trombocitopenia. La destruccin de la corteza supr
arrenal por el proceso granolumatoso puede ser suficientemente extensa como para
causar una insuficiencia hormonal. La infeccin del SNC puede manifestarse como m
eningitis crnica, granulomas intracerebrales o ambos. La infeccin endovascular inc
luye la endocarditis con unas vegetaciones grandes y voluminosas. Puede afectars
e cualquier parte del tracto gastrointestinal, y macroscpicamente las lesiones ul
ceradas pueden sugerir una neoplasia. La afectacin de la piel es menos comn que co
n otros hongos dimrficos (Studdard, 1976). En pacientes infectados con VIH. los sn
tomas de la histoplasmosis diseminada pueden parecerse a esos producidos por el
virus, incluyendo fiebre, linfadenopatia, anemia, leucopenia. trombocitopenia, pr
dida de peso y fatiga. Las lesiones cutneas solitarias son raras; pueden seguir a
la introduccin directa de hongos.
Coccidioidomicosis
Figura 54-20. Distribucin geogrfica de las infecciones fngicas dimrficas en Estados
Unidos. Se ilustran las reas de mayor endemicidad (sombra oscura) y las de m e n
o r endemicidad (sombra clara). Pueden producirse casos espordicos en otras reas f
uera de las endmicas. La histoplasmosis y la blastomicosis se extienden en el sur
de Canad, mientras que la coccidiomicosis se da en Centroamrica y Sudamnca.
modo irnico, el comienzo de una histoplasmosis se produjo en el 40% de los estudi
antes y facultativos que participaron en un da de limpieza en el colegio (Brodsky
. 1973). La histoplasmosis pulmonar crnica es una enfermedad particular con enfer
medad pulmonar obstructiva crnica (EPOC). La infeccin diseminada normalmente se as
ocia con deficiencias inmunolgicas, especialmente del sistema inmune celular. La
infeccin por VIH se ha convertido en el factor de riesgo ms importante para la dis

eminacin de la enfermedad (Johnson, 1988).

Patologa de histoplasmosis
Como un patgeno facultativo intracelular, H. capsulatum se asocia particularmente
con macrfagos. Las lesiones patolgicas consisten en recogidas de macrfagos infecta
dos, granulomas no caseosos o granulomas caseosos. Las lesiones histopatolgicas s
on muy parecidas a esas que se producen por Mycobacterium tuberculosis, y debera
pensarse en estos dos patgenos a la vez. Las levaduras intracelulares por lo gene
ral se muestran bien por una tincin de hematoxilna-eosina (Fig. 54-21). Las tcnicas
de cido peridico de Schilf y de plata metenamina son ms frecuentes, y el tinte de
plata es necesario para demostrar las clulas de levaduras en granulomas cicatriza
dos. Estas levaduras, que presumiblemente no son viables ms tiempo, pueden alarga
rse y retorcerse. El diagnstico diferencial de las formas de levaduras es con for
mas pequeas de B. dermatitidis. En el marco clnico adecuado, debemos considerar P.
marnettei y las especies de Leishmania o Candida spp., en especial C. glabrata
L a talla mayor de las clulas de levadura de Candida (distinta de C. glabrata) o
la presentacin clnica por lo general sugiere el diagnstico adecuado.
Enfermedad
clnica
Infeccin pulmonar aguda. L a mayora de los individuos inmunocompetentes desarrolla
n una infeccin asintomtica o subclnica acompaada de una respuesta inmunolgica (Goodwi
n. 1973,1978). Los pacientes sintomticos desarrollan un sndrome parecido a la grip
e que puede acompaarse de dolor pleurtico o retroesternal. Los pacientes ms graveme
nte afectados pueden estar enfermos durante varias semanas, pero por lo general
se re-

1178
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
nologas o moleculares. El agar de sangre cistena glucosa o el agar infusin de cereb
ro-corazn con sangre de oveja se incuban a 37 C. Si se ha demostrado la fase leva
dura en muestras de tejidos, la conversin del m o h o in vitro es acadmica. El dia
gnstico serolgico de la histoplasmosis tiene un papel secundario en el diagnstico y
no debe sustituir los intentos para cultivar los hongos (Walter, 1969). La fija
cin del complemento y las tcnicas de inmunodilusin es lo que se utiliza ms frecuente
mente. La sensibilidad del serodiagnslico no es mayor del 50% al 85% en enfermeda
d pulmonar crnica, y desafortunadamente es mucho menor cuando la enfermedad disem
inada se produce en pacientes inmunocomprometidos. Una seroconversin retardada y
unas reacciones cruzadas numerosas adems comprometen este acercamiento diagnstico
(Terry. 1978). Cuando se trabaja en un rea endmica, la observacin de uno de nosotro
s (WW) de que aumentaba la fijacin del complemento al B. dermatltidis era indicac
in de que el paciente probablemente tuviera toxoplasmosis. Figura 54-21. Clulas le
vaduriformes de Histoplasma capsulalum dentro de los macrfagos. Los ncleos son nico
s. Las clulas estn separadas de las dems por un espacio que es un artefacto de la f
ijacin con formalina. Los hongos se consideraron originalmente como unos protozoo
s tisulares, y el espacio claro se consider como una cpsula (tincin de nematoxilmaeosina). El test cutneo de histoplasmina ha sido muy lil para estudios epidemiolgic
os, pero no debera usarse nunca para diagnstico. La alta frecuencia de test positi
vos en zonas endmicas no slo entorpece la interpretacin, sino que el test cutneo pue
de producir seroconversin, confundiendo adems el tema (Campbell. 1964). Se ha desa
rrollado un radiommunoensayo urinario para el anligeno del Histoplasma y est disp
onible desde un laboratorio de referencia sencillo (Laboratorio de Referencia de
l Histoplasma. Indianpolis. IN). Como ya se coment anteriormente, este test parece
ser de gran uso en el diagnstico en pacientes con enfermedad diseminada (William
s. 1994).
Las levaduras de H. capsulatum en granulomas caseosos son lo suficientemente dis
tintas para proporcionar un diagnstico posible, pero tienen que diferenciarse de
las presentaciones granulomatosas inusuales del Pneumocystis carinii.
Blastomyces
dermatltidis
Factores de riesgo Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones
Cualquier consideracin de este patgeno fngico principal debe llevarse hasta el fina
l. La forma de levadura en el tejido puede demostrarse histolgicamente o en prepa
raciones de secreciones respiratorias, fluidos, sangre perifrica, mdula sea o tejid
os impresos. Tienen que usarse preparaciones frescas y calcoflor blanco, pero la
morfologa del tejido y las clulas levaduriformes se ven mejor con la tincin de Giem
sa, porque se pueden valorar los detalles de la morfologa nuclear. La medida de l
as clulas es de 3 pm a 5 pm. tienen un ncleo sencillo y un brote con un cuello est
recho. Si se sospecha una infeccin diseminada, en particular en pacientes infecta
dos VIH, deben realizarse hemocullivos para Histoplasma. La tcnica Isolator parec
e ser la ms sensible para recuperar la fase levadura de la sangre (Paya, 1987). S
i se sospecha H. capsulatum, debera inyectarse un agar enriquecido tal como un ag
ar de infusin cerebro-corazn con suplemento de sangre de oveja. Las placas tienen
que incubarse a 30"C; la incubacin del primer aislamiento en placas a 37'C no es
necesaria. Las colonias de H. capsulatum que se aislan a 25C-30C son vellosas y va
ran de color blanco a marrn (Lmina 54-7). Algunas cadenas crecen ms despacio y neces
itan varias semanas para desarrollar las colonias. Las formas de diagnstico asexu

al incluyen microconidias y macroconidias. Las microconidias. que se producen pr

imero, son muy parecidas a las estructuras producidas por B. dermatltidis. Las m
acroconidias ms caractersticas han incrementado la aspereza de los salientes de la
periferia de la conidia, una configuracin parecida a un tubrculo (Fig. 54-22). La
s macroconidias de una saprofita. Sepedonium. deben diferenciarse del Histoplasm
a. La apariencia macroscpica de las colonias, el porcentaje de crecimiento, el cr
ecimiento del H. capsulatum en un medio que contenga cicloheximida, la presencia
de formas de levadura en los tejidos y la historia clnica generalmente son sufic
ientes para diferenciar hongos. La configuracin final de la identificacin se reali
za cuando se produce la conversin de la fase moho a la fase levadura a 37 C. para
el test del exoantigeno. o por la hibridacin de cidos nucleicos La conversin a fas
e levadura algunas veces es excesivamente difcil y se ha cambiado en muchos labor
atorios per tcnicas inmuLa mayora de los casos de blastomicosis son espordicos, y n
o suele encontrarse una fuente ambiental Se producen pequeas epidemias y se ha ll
evado a cabo el aislamiento de hongos del suelo en las zonas de brote (Klein. 19
86). N o hay factores de riesgo especficos reconocidos para l a blastomicosis. au
nque se ha descrito una infeccin grave y diseminada en pacientes infectados por V
IH (Harding, 1991). La blastomicosis pulmonar primaria se ha descrito en un trab
ajador de laboratorio que ha estado expuesto en la fase moho (Baum, 1970).
Enfermedad
clnica
La puerta de entrada es a travs del tracto respiratorio, donde la infeccin puede s
er asintomtica. transitoria (Sarosi. 1974; Witorsch, 1968) o avanzar
Figura 54-22. L a s macroconidias luberculadas d e Histoplasma capsulatum son ca
ractersticas. Tambin suelen estar presentes las microconidias en las c o m d i o l
o ras cortas (lactofenol algodn azul).

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1179
insidiosamente. La blastomicosis pulmonar crnica con febrcula, prdida de peso infil
trados pulmonares localizados puede sugerir enfermedad neoplasia, para la que ti
enen que llevarse a cabo estudios diagnsticos, incluido lavado alveolar. PAAF del
pulmn o una biopsia pulmonar. La diseminacin de las levaduras desde el pulmn casi
siempre termina en una infeccin cutnea u sea El SNC y el sistema genitourinario es
menos frecuente que se incluyan. Las lesiones cutneas son con frecuencia hipertrfi
cas, fngicas o ulcerativas, y pueden ser localmente destructivas. Las lesiones pu
eden confundirse con clulas escamosas del carcinoma de piel. Tambin hay un comprom
iso secundario de la piel por encima de las lesiones seas.
Patologa de la blastomicosis
La respuesta histolgica caracterstica de B. ermatittdis es una mezcla de inflamacin
aguda, incluidos microabscesos. inflamacin granulomatosa. En lesiones cutneas, es
caracterstico una hiperplasia seudoepitehomatosa de la epidermis por encima de la
inflamacin. Las clulas de las levaduras las encontramos ms frecuentemente en los m
icroabcesos o dentro de las clulas gigantes mullinucleadas. Podemos encontrarlas
frecuentemente con el tinte hematoxilina-eosina, pero el cido peridico de Schiff o
la metenamina plata deben emplearse si no encontramos los hongos en las seccion
es realizadas. Las clulas levaduriformes de pared gruesa miden de 8 pm a 1 5p m y
mantienen la base ancha durante el proceso de gemacin. Una separacin, debida a un
artefacto, del citoplasma de la pared celular en preparaciones fijadas con lorm
alma puede dar la apariencia errnea de una pared doble. Pueden verse ncleos mltiple
s en algunas clulas de levaduras con la tincin hematoxilina-eosina. Se deben disti
nguir las clulas de levaduras no geminadas de las de C. neolormans y de las esfrul
as en desarrollo de C. immitis. Las tinciones de mucina pueden teir la pared celu
lar de Blastomyces ligeramente de manera ocasional, pero la diferenciacin con res
pecto a C. neoformans debera ser posible empleando criterios morfolgicos.
Figura 54-23. Las clulas levadurilormes en gemacin de Blastomyces dermatitidis tie
nen una pared gruesa y una b a s ea n c h a entre las clulas m a d r e y la hija.
Cuando se utilizan tinciones nucleares c o m o la hematoxilina-eosma. se p u e
d e n demostrar mltiples ncleos en los clulas levadurilormes (lactofenol algodn azul
).
ejemplo clsico de coccidioidomicosis epidmica se produjo en un grupo de estudiante
s de arqueologa en una cueva en el norte de California. Al menos 61 estudiantes l
ueron infectados por artroconidias en el suelo de la zona de la excavacin, y el 7
7% de los individuos estaban sintomticos (Werner, 1972). En EE.UU., los hongos se
concentran en el suroeste. Se ha llamado fiebre del valle o liebre del valle de
San Joaqun. La incidencia de la coccidioidomicosis ha aumentado considerablement
e en California durante el comienzo de los 90 (Pappagians. 1994). Una de las posi
bles explicaciones de este aumento es la sequa prolongada seguida de periodos de
lluvia, la construccin de nuevos edificios y el aumento del nmero de individuos su
sceptibles a esta infeccin (Pappagians. 1994) Sin embargo, los pacientes con cocci
dioidomicosis pueden encontrase por todo el pas, por la frecuencia de viaje y la
alta mfectividad de la artrocomdia para los individuos que entran en reas endmicas
(Pappagians, 1993). Se han descrito casos en los que la infeccin se ha originado
por material importado del suroeste de EE.UU. En una ocasin recuperamos el C. imm
itis de un perro que haba nacido en Arizona y despus se haba llevado a Vermont La i
nleccin de laboratorio es un riesgo serio, y este patgeno debera tratarse con gran
respeto. Se han descrito ejemplos ocasionales en los que el desarrollo de la las
e moho in vitro ha producido despus infeccin.

Identificacin de laboratorio y otras investigaciones

La demostracin directa de las clulas de levadura puede llevarse a cabo en seccione
s de tejido o preparaciones en fresco o fluidos aspirados y muestras de tejidos
(Fig. 54-23). La tincin con calcoflor blanco aumenta la deteccin de levaduras. El c
recimiento es algo ms rpido que el del Hlstoptasma, de aspecto desde blanco vellos
o a colonias de color que con frecuencia no pueden distinguirse de H. capsulatum
. y por lo general aparecen dentro de la primera o segunda semana. Las microconi
dias se parecen a las del H. capsulatum (Fig. 54-24), pero no se forman macrocon
idias. Un hongo saproftico, Chrysosporium, se parece al Blastomyces, pero no desa
rrolla una fase levadura y no crece en un medio que contenga cicloheximida. La c
onversin a la fase de levadura puede producirse en un medio ordinario incubado a
37 C, pero para este propsito se han utilizado especficamente agar de sangre gluco
sa cisleina o agar de semilla de algodn. Una vez ms. demostrar la forma levadura e
n los tejidos sirve como un sustituto razonable para la demostracin del dimorfism
o en el laboratorio. El test del exoantgeno y la hibridacin de cidos nucleicos, son
los mtodos preferidos para confirmar los aislamientos en muchos laboratorios.
n
El test de fijacin del complemento es el test serolgico ms comnmente utilizado para
el diagnstico de blastomicosis. Como se ha mencionado con la histoplasmosis, este
test tiene limitaciones considerables y slo debera usarse adjunto al cultivo de h
ongos.
Coccidioides
immitis
Factores de riesgo
Residir en una zona endmica es el principal factor de riesgo para desarrollar la
infeccin, porque la artroconidia de la fase moho se disemina fcilmente por el aire
(Ampel. 1989: Pappagianis. 1993: Stevens. 1995). Un
Figura 54-24. Conidias caractersticas en una conidiofora de Blastomyces dermatiti
dis (lactofenol algodn azul).

1180
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Hay sugerencias de que los factores genticos influyen en la frecuencia de la dise
minacin y de la gravedad de la infeccin, pero la naturaleza de la asociacin no se c
onoce completamente. La infeccin diseminada es ms comn en individuos filipinos y de
raza negra que en los de raza blanca. Los asiticos, americanos nativos y mexican
os pueden tener tambin mayor riesgo. Las mujeres adultas desarrollan un eritema n
odoso ms comnmente que los hombres, en respuesta a una infeccin primaria de Cocadio
ides, pero la infeccin diseminada se produce con ms frecuencia en hombres adultos
que en mujeres. La infeccin inmunosupresiva o la enfermedad es un factor de riesg
o importante para la infeccin diseminada. Los pacientes infectados con VIH tienen
un riesgo particular para infeccin diseminada (Bronnimann, 1987: Fish, 1990; Gal
gani, 1990).
Enfermedad clnica
La coccidioidomicosis primaria es con frecuencia asintomlica, como se indica por
la alta prevalencia de resultados positivos de los test cutneos para los antgenos
fngicos en zonas endmicas. La enfermedad sintomtica, por lo general, se manifiesta
como fiebre con tos o dolor torcico, o ambos, y podra imitar clnicamente a una neum
ona bacteriana (Lpez, 1993). El eritema nodoso y el eritema multiforme, que pueden
acompaar a la infeccin primaria, son signos de buen pronstico. Los nodulos pulmona
res solitarios pueden persistir como consecuencia de la infeccin pulmonar primari
a. La infeccin diseminada afecta ms frecuentemente a la piel, al sistema esqueltico
y a las meninges. Las lesiones cutneas incluyen ppulas, lceras, senos drenantes y
abscesos subcutneos. La artritis, por lo general, resulta del compromiso de hueso
s adyacentes. La meningitis puede ser aguda, pera es ms comn que sea lenta y crnica
.
Figura 54-26. Las colonias blancas y vellosas lijadas con tormalina del Coccidio
ides immitis pueden tener reas de coloracin gris (agar Sabouraud con cicloheximida
incubada a 30C).
Patologa de la coccidioidomicosis
La respuesta del tejido a C. mmitis es granulomatosa, con o sin caseificacin. Las
esfrulas desarrolladas es tpico encontrarlas en macrfagos y clulas gigantes multinuc
leadas. Las endoesporas dentro de las esfrulas miden de 2 pm a 5 um. Las esfrulas
miden de 10 pm a 80 um, y las esfrulas desarrolladas tienen un gran rango de tall
as. El diagnstico diferencial de las esfrulas desarrolladas primariamente incluye
formas no gemadas de B. dermatitidis o C. neolormans. Las esfrulas deben diferenc
iarse de las formas fngcas en adiaspromicosis y rinosporidiosis; ambas son infeccio
nes muy poco comunes en EE.UU.
o. ms comnmente, en lavados broncoalveolares (Fig. 54-25), pero la sensibilidad de
los mtodos citolgicos es slo aproximadamente del 50% (DiTomasso, 1994). Se utiliza
n las preparaciones frescas y el tinte calcoflor blanco. La digestin con 10%-30% d
e KOH puede ser necesaria para eliminar elementos que sobran de tejido. Si est pr
esente la enfermedad cavitaria, las hifas pueden estar presentes en las muestras
clnicas. Al contrario que otros patgenos dimrficos, existe la posibilidad de comun
icacin de la artroconidia directamente de la muestra. C. immitis crece relativame
nte rpido (en menos de una semana) y puede incluso aparecer en las placas agar sa
ngre en el laboratorio bacteriolgico. La infeccin de los trabajadores del laborato
rio es la preocupacin principal, por eso los cultivos inoculados deben manejarse
con gran cuidado en una cabina de seguridad de flujo laminar. Las sugerencias de
l manejo de estas muestras se explic antes. Todo el trabajo debe llevarse a cabo

en una cabina de seguridad biolgica de flujo laminar. Si se han inoculado placas

de Petri, deben taparse con cuidado para evitar que la tapadera se salga acciden
talmente. Las colonias de C. immitis son extremadamente variables en la aparienc
ia, variando desde aterciopeladas o algodonosas a granulosas o polvo (Fig. 54-26
). La morfologa de la colonia puede cambiar segn la colonia y el desarrollo de la
artroconidia. La mayora de los aislamientos son blancos, pero puede observarse un
a gran variedad de colores, y puede producirse un pigmento difuso por algunas ca
denas. Los cultivos con frecuencia se convierten en ms grises con el tiempo. En p
articular, debe considerarse la posibilidad de que este riesgo biolgico pudiera h
aber sido aislado, cuando en un medio que contenga clicloheximida encontremos un
hongo de rpido crecimiento. Si se sospecha C. immitis, algunos miclogos prefieren
esterilizar el cultivo antes de examinar las colonias, llevando el contenedor c
on formalina al 10%, seguido por una incubacin durante toda la noche. Las artroco
nidias en forma de barril con clulas de unin vacas son distintivas (Fig. 54-8). per
o deben diferenciarse de otros organismos que producen artroconidias, como Trich
osporon (vase Fig. 54-19), Geotrichum y algunos miembros de la familia Gymnoascac
eae, por el test del exoanlgeno o por la hibridacin de cidos nucleicos, Al contrari
o que la histoplasmosis y la blastomicosis. el anlisis serolgico con el test de fi
jacin del complemento es til para valorar la extensin y el pronstico de la coccidioi
domicosis (Pappagianis, 1990). Se han utilizado varias tcnicas serolgicas, de las
cuales se ha estudiado de un modo ms extenso la lijacin del complemento. Los antic
uerpos se detectan aproximadamente en 2 a 6 semanas despus de la infeccin. La cuan
tificacin de ttulo es indicador de la enfermedad diseminada y un ttulo creciente es
poco esperanzados al contrario que la situacin normal, en la que la aparicin de a
nticuerpos refleja el control de la infeccin. El test de piel no confunde el diag
nstico por producir una seroconversin, como en la histoplasmosis, pero
Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones
Como con otros hongos dimrficos, la posibilidad de esta infeccin debe seguirse has
ta el final. Las esfrulas pueden demostrarse en los esputos
Figura 54-25. Dos esfrulas de Coccidioides immilis en la m u e s t r a de e s p u
t o Preparacin sin teir (fotografa cortesa de Centers for Disease Control and Preve
ntion)

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
81
la alta prevalencia de una positividad del test cutneo disminuye la utilidad del
test. Los pacientes con enfermedad diseminada pueden mostrar anergia al antigeno
del test cutneo.
Sporothrix
schenckii
Factores de riesgo
S. schenckii se encuentra normalmente en la vegetacin alrededor de todo el mundo,
aunque no parece que sea un patgeno de plantas. Las epidemias se han causado por
una exposicin a productos de plantas, como el musgo sphagnum utilizado en jardin
era (D'Alessio, 1965; Grotte, 1981). Los patgenos lngicos de plantas y ambientales
en ocasiones cruzan los caminos. Asi como H. capsulatum estuvo implicado en el da
de la limpieza de tierra, el S. schenckii caus infecciones en el da de la celebra
cin de Arbor (Cote. 1988). Hubo una epidemia inusual entre miembros de un colegio
de fraternidad en Florida, que estaban haciendo un muro con ladrillos empaqueta
dos en paja contaminada mientras beban gran cantidad de cerveza (Sanders, 1971).
El nico factor predisponente que se ha identificado con frecuencia es el consumo
de alcohol. Tambin se ha informado de la transmisin del S. schenckii de gatos infe
ctados a humanos (Reed, 1993). Se ha observado infeccin diseminada en pacientes i
nmunodeprimidos (Lynch. 1970). La puerta de entrada por lo general es una entrad
a traumtica por la que los hongos pasan a travs de la piel, como ocurri con los est
udiantes, que tenian las manos daadas por coger ladrillos contaminados. El estere
otipo de paciente con riesgo de esporotncosis es un jardinero de rosas alcohlico.
conidias de pared ancha, oscuras, que son las responsables del color oscuro que
vemos macroscpicamente, que estn sujetas directamente a las hifas (Sutton, 1998).
Las microconidias de pared fina nacen de las conidioforas que crecen de los ngulo
s rectos de las hifas; pueden organizarse alrededor de una vescula expandida en l
a punta de la conidiofora formando una estructura que ha sido denominada racimo
(Fig. 54-27). Las especies de Acremonium producen estructuras similares, que rar
amente se han descrito como una causa de enfermedad humana, y tambin son producid
as por un saprofito que rara vez es aislado. Ophiosloma stenoceras. Estos mohos
se diferencian del Sporothrix por la ausencia de crecimiento en un medio agar co
n cicloheximida y por la ausencia de fase levadura. La conversion de la fase moh
o a levadura se finaliza por la incubacin del aislamiento a 37 en un medio rico,
como el agar de infusin cerebro-corazn o el agar sangre glucosa cistena. Los test c
utneos y ensayos serolgicos para el diagnstico de la esporotricosis han sido descri
tos pero an no estn disponibles.
Otros hongos dimrficos
El H. capsulatum variante duboissi causa enfermedades cutneas y sistmicas en frica.
Las levaduras son ms grandes que las del H. capsulatum variante capsulatum. y la
s paredes son ms gruesas, recordando a las clulas del B. dermatitidis. pero sin lo
s bordes de base ancha. El Paracoccidioide brasiliensis produce infecciones cutne
as, diseminadas y pulmonares en Amrica Central y del Sur (Londero. 1972: Restrepo
, 1970). Hay pocos casos importados de paracoccdioidomicosis, que se producen oca
sionalmente en EE.UU. (Murray, 1974). Las clulas levaduriformes caractersticas del
Paracoccidioides tienen mltiples brotes perifricos, dando una apariencia que se h
a comparado con una rueda marina. La infeccin por P. mametlei se caracteriza por
clulas intracelulares parecidas a las levaduras que recuerdan al H capsulatum en

macrfagos. Esta infeccin es endmica en el sureste asitico, pero se han descrito caso
s importados en pacientes inmunocomprometidos que regresaron a EE.UU.
Enfermedad clnica
La lorma clnica que sin duda predomina de esporotricosis es la cutnea o linfocutnea
. Una ppula en la puerta de entrada puede ulcerarse. La rapidez del patgeno a travs
de los linfticos regionales puede terminar en una serie de lesiones que avanzan
en el miembro afectado. La esporotricosis sistmica. que no es comn, podra ser por l
a inhalacin de esporas en el tracto respiratorio bajo (Pluss, 1986). El sistema e
squeltico, que incluye huesos (Lynch. 1970) y articulaciones (Crout. 1977), es el
ms afectado.
DERMATOFITOS
Los hongos dermatofitos son causas comunes e importantes de morbilidad humana, p
ero no producen infecciones que pongan en peligro la vida (Hay. 1992; Midgley, 1
994; Odom. 1994: Weitzman, 1995). Se reconocen tres gneros: Microsporum. Trichoph
yton y Epidermophyton. Las especies de Acremonium, especies de Fusarium. Scytali
dium spp. y las especies de Scopulanopsis en ocasiones han estado implicadas en
enfermedades de las uas (onicomicosis). Los hechos ocasionales de un papel etiolgi
co para otros honPatogenia de la esporotricosis
Las respuestas histolgicas al Sporothrix y Blastomyces son similares (Lurie. 1963
). La inflamacin granulomatosa puede acompaarse de pequeas colecciones de neutrfilos
polimorfonucleares. En la piel, es comn la hiperplasia seudoepiteliomatosa. Las
clulas levaduras del S. schenckii son pleomrficas. redondas o alargadas, y se han
comparado con cigarros, pero rara vez se ven en el tejido. Una reaccin del tejido
al hongo puede terminar en radiar material eosinfilo de un grosor mayor de 10 pm
alrededor de la clula levadura; este fenmeno se conoce como Esplendor Hoepph. Des
afortunadamente, esta reaccin tan distintiva del tejido no puede verse y no es es
pecfica para la esporotricosis. El diagnstico diferencial de las lesiones culneas e
s, en primer lugar, una infeccin micobacteriana, especialmente Mycobacterium mari
num (granuloma de las piscinas), en EE.UU., y una leishmaniosis cutnea en los trpi
cos.
Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones
L a muestra preferida es una aspiracin, un curetaje o una biopsia de la lesin cutne
a. S. schenckii crece bien en un medio de aislamiento primario incubado a 25C-30
C. Es resistente a la cicloheximida. Las colonias, que pueden ser lisas o hmedas
(glabrosas), al principio son por lo general de color banco (Lmina 54-8), y pued
en volverse ms oscuras con el tiempo. El S. schenckii. produce dos tipos de conid
ias: conidias hialinas de pared lina, que se organizan como una roseta alrededor
del pex de la conidiofora. y las
Figura 54-27. Las conidias de Sporothnx schenckii nacen en grupos en los extrem
o s de las conidioforas laterales (lactofenol anilina azul).

1182
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
gos saprofticos son difciles de evaluar por la existencia comn de estos mohos como
colonizantes o contaminantes de la flora. Como un grupo, los hongos dermatofitos
se distribuyen alrededor del mundo, pero las especies individuales pueden tener
una distribucin geogrfica ms restringida (Aly, 1994). Los dermatofitos pueden enco
ntrarse asociados con humanos (antropoflicos), con animales (zooflicos) o con tier
ra (geofilicos). Los factores de riesgo incluyen el contacto con la fuente de in
feccin, que nos puede dar una pista para el diagnstico. Por ejemplo, la infeccin de
la cara en granjeros que se apoyan en las vacas mientras las ordean es caracterst
icamente causada por el T. verrucosum. un dermatofito zooflico que se encuentra e
n el ganado. La importancia de la variacin geogrfica en los patgenos dermatofticos s
e ilustra en un estudio de una epidemia de infeccin cutneo fngica entre tropas amer
icanas durante la guerra de Vietnam (Alien. 1973). La mayora de las infecciones f
ueron causadas por una variante con gran esporulacin del T. mentagrophytes, que n
o se haba reconocido en EE.UU. Las tropas americanas tuvieron mucho mayor nesgo d
e infeccin que los vietnamitas. Epidemiolgicamente, las foliculitis y lesiones anu
lares se asociaban con el tiempo de servicio en Vietnam y el tiempo pasado en un
a patrulla. La infeccin se produca de modo predominante en la estacin de lluvias, y
la nica fuente que no fuera humana de los hongos eran las ratas. Las asociacione
s medioambientales de los hongos dermatofticos aislados con mayor frecuencia se r
esumen en la Tabla 54-12.
las lesiones. La terminologa clnica utiliza el nombre latino linea seguido de la p
arte del cuerpo afectada, como linea capitis (cabello), linea barbae (barba), li
nea corporis (tronco y miembros), linea pedis (pie de atleta) o linea cruris (In
guinal). En ocasiones excepcionales, el Epidermophyton floccosum infecta slo la p
iel. Microsporum spp. y Trichophyton spp. afectan al cabello, as como a la piel f
ina. El Trichophyton spp. produce infeccin de las uas (onicomicosis), as como del c
abello y la piel. I tonsurans es la causa ms comn de infeccin del pelo en EE. UU. M
. canis es una causa comn de infeccin del cuero cabelludo, sobre todo en nios. Cuan
do hay una infeccin profunda del folculo del pelo, se produce un proceso inflamato
rio llamado querin. El T. mentagrophytes y el T. verrucosum se asocian particular
mente con querin. T. mentagrophytes, T. rubrum y M. canis se encuentran normalmen
te en la linea corporis y linea pedis. Las lesiones producidas por T. rubrum por
lo general son crnicas e intratables. El E. floccosum es una causa comn de linea
cruns y tinea peds. Las enfermedades dermatofiticas se limitan a la epidermis. Slo
raras veces hay una invasin ms profunda por los mohos. La diseminacin de la infecc
in es poco corriente y, por lo general, se produce cuando la inmunosupresin es gra
ve (Porro, 1997).
Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones
El tratamiento de las infecciones dermatofiticas no se dirige por la identificac
in especfica del aislamiento, por eso la demostracin de hfas en los raspados de piel
es importante para el inicio del tratamiento (Fig. 54-28), La talla y morfologa
de las hitas sugiere la inclusin de los dermatofitos en la infeccin. La confirmacin
de la identificacin especfica generalmente no es necesaria, pero es til para confi
rmar que las hitas, en realidad, pertenecen a los hongos dermatofticos, para valo
rar la fuente probable de infeccin y
Enfermedad clnica
Los dermatofitos producen infeccin de la epidermis, del pelo y de las uas (Hay. 19
92). La infeccin de la dermis y tejido subcutneo se produce rara vez. La infeccin d
el pelo y la piel por lo general se refieren como una imagen en lombriz anular,

un nombre derivado del avance serpginoso de

Tabla 54-12
Caractersticas de los m o h o s dermatofticos Ecologa Antropollico Zooflico Tasa de c
recimiento Lento Moderado (6-10 das) Estructuras d i a g n s t i c a s Raramente
observadas Rugosa o espinosa, de pared gruesa, macroconidias de contorno espinos
o: 2-14 septos; microconidias con forma de porra Suave o finamente rugosa, macro
conidias de pared gruesa. 4-6 septos, microconidias con forma de porra Microconi
dias tpicamente redondas y agrupadas en ramas de conidioforas (racimos de uvas):
puede tener forma de lgrima: macroconidias de pared fina y lorma de cigarrillo Mi
croconidias con lorma de lgrima ("pjaros en una verja"). Puede formarse en macroco
nidias; macroconidias ms largas y estrechas que las del Trichophyton mentagrophyt
es Microconidias pequeas y delicadas; ocasionales macroconidias finas (en cola de
rata) Microconidias con forma de lgrima o de porra con un tamao muy variable, rar
as macroconidias Macroconidias caracteristicas. no microconidias Test auxiliares
Lmpara de Wood del pelo Lmpara de Wood del pelo: pigmento brillante amarillo limn
Z o n a s ms frecuentes Cuero cabelludo Cuero cabelludo, piel
Dermatofito Microsporum audouinii Microsporum canis
Microsporum gypseum
Geofilico
Moderado
Colonia en estallido de estrella; color desde marrn a canela
Cuero cabelludo, piel
Trichophyton mentagrophytes
Zooflico, antropofilico
Moderado
Penetracin del pelo positivo; ureasa positiva; a veces puede producir pigmento ro
jo
Piel, cuero cabelludo, barba
Trichophyton rubrum
Antropofilico
Lento (hasta 1 4 das)
Trichophyton verrucosum
Zooflico
Lento
Trichophyton tonsurans
Antropofilico
Lento

Pigmento rojo intenso que puede ser incrementado en medios especiales, como el a
gar patata; ureasa negativa; penetracin del pelo negativa Cadenas de conidias a 3
7C; mejor crecimiento en agar T3 o en agar T3 yT4 Mejor crecimiento en agar T3 y
T4
Piel, uas
Barba, cuero cabelludo, piel
Cuero cabelludo, piel
Epidermophyton floccosum
Antropofilico
Moderado
Ninguno
Pie

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1183
macroconidias, que diagnsticamente no son tiles. M. audouinii, un agente antropoli
lico clsico de forma anular, produce pocas, o ninguna, estructuras diagnsticas. Af
ortunadamente, en la actualidad no se aisla con frecuencia, quiz porque hay mayor
higiene. Las caractersticas de las estructuras diagnsticas producidas por los patg
enos ms comunes se resumen en la Tabla 54-12. M. canis. las especies que con mas
frecuencia se aislan, produce un pigmento amarillo limn caracterstico (Lamina 54-9
) que se intensifica por el crecimiento en agar copos de patata. Las macroconidi
as de estas especies se muestran en la Figura 54-29. Las macroconidias del M. gy
pseum. las especies geoflicas mas comnmente aisladas, se muestran en la Figura 5430.
Especies de Trichophyton
El gnero Trichophyton incluye los hongos dermatofticos importantes: 7! tonsurans (
Fig. 54-10 y Lmina 54-10). T. rubrum (Lmina 54-11), T. verrucosum y I mentagrophyt
es (Lmina 54-12 y Fig. 54-31). Las colonias pueden tener apariencia de pelusa, gr
anular o, menos comnmente glabrosa. Las macroconidias, que son extremadamente tile
s para la identificacin, pueden ser producidas por este gnero, en especial en cade
nas que producen colonias en polvo, pero desafortunadamente suelen estar ausente
s. Las microconidias se forman con ms frecuencia. Las microconidias tiene pared f
ina, lisa, y tienen un nmero variable de septos. La apariencia clsica de las estru
cturas diagnsticas en las especies que se aislan ms comnmente se resumen en la Tabl
a 54-12. En el mundo real, la interpretacin de la morfologa microscpica en algunos
aislamientos puede ser muy difcil, porque con frecuencia se forma un solapamiento
. Afortunadamente, los test adicionales son tiles para hacer diferenciaciones esp
ecificas dentro del gnero (Tabla 54-12). En particular, los agares Trichophyton s
on tiles para la caracterizacin de los requerimientos nutricionales entre los miem
bros del gnero (Fig. 54-32). Se han descrito siete medios, de los cuales hemos en
contrado los cuatro primeros medios a base de cido casamino como los ms tiles. En c
ombinacin, estos medios permiten la valoracin de la dependencia en inositol, liami
na o ambos componentes juntos. La diferenciacin de T. mentagrophytes y 7! rubrum
se facilita por varios test no morfolgicos (Tabla 54-12). Un pigmento difusible p
uede ser producido por ambas especies, pero el pigmento rojo intenso del T. rubr
um se fomenta por el cultivo en agar copos de patata o agar crnea con dextrosa al
1%. La produccin de ureasa dentro de los tres o cinco das por T. mentagrophytes.
pero no por T. rubrum, ayuda a diterenciar estas dos especies. Por ultimo el tes
t de penetracin del pelo puede utilizarse como un test diferencial. T. mentagroph
ytes produce defectos en forma de cua en los pelos in vitro (Fig. 54-33), mientra
s tanto T. rubrum crece fuera del pelo sin peneFigura 54-28. Las hifas de un dermatolilo se demuestran en un raspado de u n a l
esin d e lia. L a presencia d e estas hifas finamente segmentadas establece el dia
gnostico de dermatomicosis. aunque no define la especie etiolgica (preparacin con
KOH). (Fotografa cortesa de Centers for Disease Control and Prevention.)
para valorar el incremento de parecido para infecciones crnicas y recadas cuando a
islamos T. rubrum. Los raspados de piel, uas y pelos pueden examinarse en prepara
ciones de KOH, que puede incorporar calcoflor blanco para facilitar la deteccin de
hifas. Los fragmentos de tejidos, fibras y los cristales de colesterol pueden s
er confundidos con hifas por un observador inexperto. Los pelos infectados deben
seleccionarse para analizarlos. Cuando el hongo que infecta es H. audouinii. M.
canls o M. ferrugineum. el pelo floresce con una luz ultravioleta de longitud de
onda larga (lmpara de Wood). M. canis es el nico miembro de este trio de patgenos

que se aisla normalmente en EE.UU. El examen microscpico de la relacin de los hong

os con el pelo infectado puede usarse para estrechar el diagnstico diferencial de
l agente etiolgico: esporas en el exterior del pelo (entothrix), esporas dentro d
el pelo (ecdolhrix), hifas sin esporas dentro del pelo, o que no haya invasin del
pelo. El anlisis de los pelos infectados requiere una experiencia considerable y
una prctica regular. Los pelos infectados, raspados de uas o raspados de los bord
es de las lesiones cutneas deben llevarse al laboratorio en un recipiente limpio
y seco o ser colocados en la superficie de un medio de aislamiento primario sumi
nistrado por el laboratorio. Se ha sugerido picar los recortes de uas en un homog
eneizador como un aumento de las levaduras de los dermatolilos. El agar de dexlr
osa Sabouraud (ue elegido para recuperar los hongos dermatofticos, y tambin es efe
ctivo para aislar Candida spp., especialmente C. albicans, la cual puede produci
r infecciones similares de la piel y uas. La cicloheximida no inhibe los dermatof
itos, pero si inhibe muchos hongos saprofticos. El medio del test dermatofito, qu
e produce un pigmento rojo en la alcalinizacin, es utilizado normalmente por los
dermatlogos para demostrar la presencia de un dermatofito, que por lo general no
se estudia ms. Desafortunadamente, el medio del test de dermatofitos no es especfi
co para dermatofitos. Otros organismos, incluido H. capsulatum, pueden alcaliniz
ar este medio, y no es el medio de aislamiento preferido por los laboratorios cln
icos. Todos los hongos dermatofticos tienen septos, hifas hialinas. Producen macr
o y microconidas de vanas combinaciones. Tambin pueden producirse artroconidias y
clamidiosporas. pero la morfologa de las macroconidias y especialmente, la de las
microconidias es ms importante para la identificacin. Se ha identificado el estad
o sexual de muchos dermatofitos, pero no se han encontrado en el laboratorio clni
co.
Especies de
Microsporum
Las especies de Microsporum producen macroconidias caractersticas. Figura 54-29.
Macroconidias de pared gruesa, rugosas y afiladas d e Microsporum que son las es
tructuras diagnsticas clave. En algunos casos se producen canis e hifas finas seg
mentadas (lactofenol anilina azul).

1184
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Figura 54-30. Macroconidias lisas de pared gruesa del Microsporum gypseum (laclo
lenol algodn azul).
Figura 54-32. Agares de Trichophyton. El crecimiento del Trichophyton verrucosum
se a u m e n t a b a en agar T (contiene t i a m m a e inositol) en comparacin c
on los agaresT. yT,
s
trar en l. El uso de ambos acercamientos, morfolgico y no morfolgico, proporciona l
a identificacin ms exacta de los aislamientos suficientes para proporcionar experi
encia continua con las caractersticas diagnsticas de estos mohos.
Epidermophyton
floccosum
colonias, que en principio son marrones amarillentas, grises o marrn caqui, a med
ida que maduran se vuelven aterciopeladas y se pliegan. E. lloccosum no produce
microconidias. pero unas macroconidias distintivas proporcionan las pistas para
la identificacin (Fig. 54-11). Estas estructuras tienen paredes externas lisas, ms
de cuatro paredes cruzadas y forma de palo.
El nico patgeno dentro del gnero Epidermophyton es un hongo antropofilico. que es u
na causa importante de Tinea cruris y linea pedis. Las
MOHOS DEMATIACENOS
Los mohos dematiacenos son un grupo fascinante y complejo de hongos que producen
enfermedad debilitante de la piel y del tejido subcutneo y pueden invadir profun
damente. Las infecciones se encuentran ms comnmente en los trpicos y subtrpicos, aun
que la infeccin diseminada puede raramente encontrarse en EE.UU.. especialmente e
ntre pacientes gravemente inmunocomprometidos. La clasificacin de estos mohos ha
registrado cambios segn se ha ido refinando el entendimiento de la conidiognesis (
Larone, 1989). Se muestra un resumen breve de las formas clnicas de enfermedad pr
oducidas por especies patognicas, pero la descripcin detallada de la micologa est ms
all del propsito de este captulo. La morMedio
Constituyentes Medio basal Inositol Inositol + liamina
Interpretacin del Crecimiento estimulado Agar con el que se comparan otras formul
aciones Estimulado con mositol solo Estimulado solo cuando estn presentes los dos
compuestos Estimulado con tiamina sola
T1 T2 T3
T4
Tiamina
Figura 54-31. Gaipos d e microconidias y macroconidias d e pared fina de 7richop
hyton mentagrophytes (laclofenol algodn azul) (Fotografas cortesa de Centers lor Di

sease Control and Prevention.)

Figura 54-33. Penetracin del pelo por Trichophyton mentagrophytes El pelo e s pen
etrado por las hilas por los lados (Fotografia cortesia de Centers for Disease C
ontrol and Prevention)

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1185
en la que las hilas pueden estar dentro de los senos o. menos comnmente, extender
se a travs de las paredes oseas para invadir el tejido adyacente. Entre las espec
ies que producen esta infeccin, se encuentran S/polaris spp., Curvularia spp. y A
lternara spp. Los hongos dematiacenos son causas raras de queratomicosis. La cara
cterstica diagnstica de la feohilomicosis. es una pigmentacin marrn de la melanina d
e las hifas. El color generalmente puede percibirse en trozos sin teir. Las caden
as poco pigmentadas pueden reconocerse al aplicar un tinte para la melanina. com
o la tcnica Fontana-Masson.
CIGOMICETOS
Los cigomicetos son causas importantes de infecciones fungicas en huspedes compro
metidos (Williams, 1976). El patgeno ms comn es el Rhizopus. Otros mohos que han es
tado implicados en la enfermedad humana son Absidia. Rhizomucor, Mucor y Cunnmgh
amella (Bergman. 1969). La enfermedad invasiva causada por estos hongos se ha ll
amado histricamente mucormicosis. En vista de que las especies Mucor son causas p
oco comunes de infecciones, un trmino clnico mejor, es cigomicosis.
Figura 54-34. Cadenas de conidias producidas por especies de Cladosporium, un g
e r m e n aislado en el medio ambiente de los laboratorios clnicos. Las hilas son
septadas Tanlo las hitas c o m o las conidias estn pigmentadas d e color oscuro
(lactolenol anilina azul).
Factores de riesgo y enfermedad clnica
fologia de las especies de Cladosporium. mohos saprofticos comunes que frecuentem
ente encontramos en laboratorios clnicos, se muestra en la Lmina 54-2 y en la Figu
ra 54-34. El crecimiento lento y el crecimiento en presencia de cicloheximida. e
l aislamiento del tejido y los hallazgos histolgicos compatibles y/o historias cln
icas son pistas que pueden encontrarse en las especies patgenas. Es importante co
mentar con los mdicos las caractersticas clnicas del caso antes de catalogar estos
mohos como insignificantes. Hay dos presentaciones clnicas comunes de la cigomcosi
s. y los factores de riesgo son algo diferentes entre ambas (Straatsma. 1962). U
na infeccin invasiva que empieza en los senos paranasales se conoce como cigomcosi
s rinocerebral o craneofacial. La infeccin comienza como una sinusitis indiferenc
iada. pero las hifas rpidamente atraviesan las paredes finas del seno y se extien
den por la rbita, avanzando hasta la piel de la cara e introducindose en la cavida
d craneal. El factor de riesgo para este tipo de infeccin es predominantemente la
diabetes mellitus, y la mayora de los pacientes presentan cetoacidosis en el mom
ento en que la infeccin se desarrolla (McNulty, 1982). La enfermedad rinocerebral
puede avanzar rpidamente y. por lo general, suele terminar en la muerte. Puede p
roducirse una trombosis de la arteria cartida o del seno cavernoso. La segunda pr
esentacin principal de la cigomcosis es la enfermedad pulmonar, que puede seguirse
de una diseminacin hematgena. La infeccin comienza con una neumona no diferenciada
que puede complicarse con hemoptisis y cavitacin. La diseminacin de la infeccin es
comn y el
Enfermedad clnica
El Micetoma es una infeccin crnica indolente de la piel y del tejido blando que se
desarrolla en el lugar de la inoculacin de una variedad de hongos o bacterias. L
a infeccin puede extenderse profundamente, incluso llegar al hueso, y por lo gene
ral se desarrollan senos drenantes. La infeccin la encontramos ms frecuentemente e
n los trpicos y subtrpicos, pero pueden encontrarse en el sur de EE.UU. Madurella
mycetomatis es el patgeno demataceno ms comn. Hay lesiones parecidas que pueden prod

ucirse por otros hongos (p. ej., Acremonium. Pseudallescheria boydti. Fusanum).
por actinomicetos aerbicos (Nocardia. Slreptomyces. Actinomadura) y ocasionalment
e por bacterias (botriomicosis). La cromoblastomicosis es una infeccin crnica, de
avance lento, de la piel y del tejido subcutneo que se produce principalmente en
pacientes que viven en los trpicos. Se producen algunos casos aislados ocasionalm
ente en el sur de EE. UU. Las lesiones pueden ser nicas o mltiples, y pueden parec
erse a las lesiones cutneas de blaslomicoss. La caracterstica que la distingue es l
a presencia de clulas redondas, no htales y marrones (cuerpos muriformes) en los t
ejidos (Fig. 54-35). Estas estructuras, que se dividen por seplacin, son diagnstic
as, aunque no proporcionan una pista para identificar el moho. Los agentes etiolg
icos de la cromoblastomicosis son Phialophora verrucosa. Fonsecaea pedrosoi, Fon
secaea compacta. Rhinocladiella aquaspersa. Cladosporium carnonii. E. jeanselmei
y E spinilera. Feohilomicosis es un trmino utilizado para describir la infeccin d
el tejido cutneo y subcutneo, y de los rganos sistmicos, particularmente el sistema
nervioso central. Estas infecciones oscilan entre lesiones subcutneas indolentes,
probablemente como resultado de la inoculacin directa de hongos de la zona, y un
a infeccin devastadora y destructiva que casi siempre es mortal. Los aislamientos
ms frecuentes han sido E. jeanselmei. E. dermalitidis. Cladosporium bantianum (t
richoides). especies de Fonsecaea y especies de Bipolaris. Una entidad clnica dis
tintiva es la sinusitis crnica.
Figura 54-35. Cuerpos muriformes de un hongo demataceno en una lesin de cromoblast
omicosis. L a s clulas oscuramente pigmentadas estn s u t n e n d o seplacin. En la
lesin estn presentes macrfagos y clulas gigantes m u l t m u c l e a d a s (tincin h
ematoxilina-eosma).

1186
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
desenlace casi siempre latal. Los factores de riesgo para la infeccin pulmonar so
n neutropena e inmunosupresin. particularmente por malignidad hematolgica (Meyer. 1
972). Otros factores de riesgo que se han observado son una sobrecarga de hierro
, abuso de drogas intravenosas y uremia (Kwon-Chung, 1992). La diabetes con ceto
acidosis est presente en algunos pacientes. Una presentacin menos comn de la cigomi
cosis es la infeccin de la piel y de los tejidos blandos (Meyer, 1973a). Las hifa
s pueden alcanzar la piel por va hematgena, por una extensin directa de un foco pro
fundo o por introduccin del exterior. Un comienzo drstico de enfermedad del tejido
blando se produjo en pacientes que estaban contaminados con esporas Rhizopus (G
artenberg, 1978). Antes de que se hiciera el potencial de infeccin, los fabricant
es no siguieron los pasos para la esterilidad de los vendajes. Las heridas por a
rma blanca y otro tipo de heridas traumticas tambin son zonas de entrada de estos
hongos comunes en el ambiente (Cocanour. 1992). La enfermedad pulmonar limitada
con cavitacin es una presentacin poco usual de la cigomicosis en individuos inmuno
lgicamente competentes (Record, 1976). Figura 54-36. Una c o l o m a gris vellosa
de Rhizopus llena el espacio de la placa de Petri (lid lifters) (fotografia cor
tesia de Centers for Disease Control and Prevention).
Patologa de la infeccin por cigomicetos
La histopatologia est dominada por la necrosis del tejido, sin reparar en la zona
de infeccin (Straatsma. 1962). La propensin de estos mohos para invadir a travs de
las paredes de las arterias y venas, produciendo trombosis agudas, conducen a n
ecrosis coagulativa extensa. Las hifas aparecen como cintas de hifas anchas que
por lo general estn torcidas y plegadas (Fig. 54-3). Los septos estn esparcidos y
por lo general no se observan en el tejido, pero un londo compuesto de las pared
es exteriores de las hifas plegadas puede confundirse con septos. Los segmentos
hinchados de las hifas y las hifas cortadas en perpendicular pueden ser malinter
pretadas por clulas levaduriformes. Las ramificaciones tienen tendencia a produci
rse en ngulos rectos. Las hitas de estos mohos con frecuencia se tien mejor con he
matoxilina-eosina que con la tcnica de cido peridico de Schiff o incluso el mtodo de
plata metenamina.
ovales o romboidales y pueden tener un pigmento marrn (Fig. 54-5). Una caractersti
ca diagnostica importante es la presencia de estructuras hialinas parecidas de r
aiz marrn (rizoides), que se desarrollan en el punto donde crecen las esporangios
poras (Fig. 54-5). Se ha inlormado de que el 60% de los casos de cigomicosis y e
l 90% de los casos de enfermedad rinocerebral son causadas por el Rhizopus arrhi
zus (citado en KnownChung, 1992)
Otros cigomicetos
A diferencia de Rhizopus. los rizoides de las especies de Absidia surgen de los
estolones de las conidioforas. Las esporangiosporas de Absidia tienen forma de p
era ms que redondas, y se ve un collarete alrededor de la columela cuando los esp
orangios se desintegran. Las especies Mucor no producen rizoides. Las conidiofor
as generalmente estn ms ramificadas que otros cigomicetos, y no hay crecimiento po
r encima de 37 C. El Rhizomucor. que es morfolgicamente intermedio entre Rhizopus
y Mucor. tiene rizoides rudimentarios y conidioforas ramificadas, y crece a tem
peraturas de hasta 58 C. Uno de los patgenos principales en el gnero Mucor (Mucor
pusillus) se ha translerido al gnero Rhizomucor. Cunninghamella produce vesculas h
inchadas en la punta de las conidioforas. Desde las vesculas, mltiples esporangiol
as unicelulares crecen en tallos pequeos.

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

Los cigomicetos con frecuencia estn considerados como contaminantes comunes (Kwon
-Chung. 1992). Las implicaciones clnicas potenciales de los aislamientos deberan i
nvestigarse cuidadosamente antes de que sean tachadas de saprofitos. La demostra
cin de hifas en el tejido nos proporciona una evidencia importante de que un moho
aislado estuvo presente in vivo y no es un contaminante medioambiental. Las hif
as anchas y con septos esparcidos pueden demostrarse en trozos de tejidos o en e
xtensiones impresas de tejido usando el tinte de calcoflor blanco. El tejido debe
ser corlado, mejor que sea homogeneizado. despus de lo que se inyecta en la supe
rficie de un aislamiento agar primario. Los cigomicetos se inhiben por la cicloh
eximida. Los aislamientos crecen rpido y producen abundantes hifas areas que rpidam
ente alcanzan la tapg de las placas Petri "lid lifters". Los cigomicetos produce
n cigosporas sexuales in vilro. pero las estructuras reproductivas asexuales son
ms tiles para la identificacin. La identificacin de especies es difcil, y para la ma
yora de los propsitos clnicos no es necesaria.
MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS)
Este gran grupo de hongos saprofitos se encuentra con frecuencia en el laborator
io clnico y contiene algunos de los mohos patgenos ms importantes. En esta seccin co
nsideramos Aspergillus, Fusanum. Penicillium. Paecilomyces y Pseudalieschezria.
Pseudallescheria boydii. el patgeno ms comn en este gnero, tiene una fase asexual ll
amada Scedosporium apiospermum, y el moho puede encontrarse de cualquier forma.
Este moho se considera generalmente como un organismo hialino (Sutton, 1998). au
nque algunas autoridades lo han colocado en el grupo de dematiacenos (Larone, 19
92). Cualquiera de los miembros de este grupo puede ser patognico bajo las condic
iones clnicas adecuadas. Debera intentarse una correlacin clnica cuidadosa antes de
descartar aislamientos de tejidos y fluidos como contaminantes. Por otro lado, e
s un error aceptar sin criticar el aislamiento de un patgeno no comn como evidenci
a de que no se ha determinado la etiologa de la infeccin. Son de utilidad mltiples
aislamientos de mohos, y una documentacin de patogenicidad requiere una correlacin
patolgica.
Especies de Rhizopus
Los Rhizopus crecen rpidamente, llenando las placas de Petri dentro de las 48-72
horas con hifas blancas y como de lana, pasando de gris a negro segn se desarroll
an las esporas (Fig. 54-36). Los esporangios diagnsticos se encuentran mejor en l
os bordes o en el centro del cultivo, donde pueden verse como puntos negros. Las
hifas son anchas (de 6 pm a 15 pm de dimetro), raramente septadas e hialinas. La
s esporangiosporas no tienen ramificaciones y sostienen esporangiosporas redonda
s (de 60 pm a 350 LIm) con una columela elipsoidal. Las esporangiosporas (5 ppm)
son

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICOTICAS
1187
Factores de riesgo
Los hipomicetos son hongos ubicuos a los que todos nosotros estamos expuestos de
manera regular. Residen en todo tipo de vegetacin. Aspergillus fumigatus est pres
ente en hojas de vegetales y se ha descrito la enfermedad alrgica en pacientes qu
e estuvieron expuestos a excrementos de abonos (Kramer. 1989). A. fumigatus y A.
Nigerse aislaron en una planta en la habitacin de un paciente con aspergillosis
(cita de Know-Chung, 1992). y los comienzos han coincidido con la construccin del
hospital (Amow. 1978; Sherertz, 1987). Ser prudente, por tanto, evitar la exposi
cin de los pacientes ms gravemente inmunocomprometidos. En un estudio epidemiolgico
, no hubo ningn caso de aspergillosis invasiva en 39 pacientes que residan en habi
taciones con un filtro de aire HEPA. mientras que hubo 1 4 infecciones invasivas
en 74 pacientes similares que estaban en habitaciones convencionales (Sherertz.
1987). Los factores de riesgo ms importantes para la infeccin invasiva por hipomi
cetos son enfermedad inmunosupresiva o quimioterapia (Scherr, 1992: Walker, 1978
: Williams. 1976). La neutropenia tambin es un factor predisponente importante (Y
oung. 1989). Es importante reconocer, sin embargo, que puede haber una enfermeda
d invasiva grave en pacientes que no estn inmunodeprimidos por la quimioterapia o
por enfermedad maligna (Rosenberg, 1982; Smith. 1982). Es rara, sin embargo, la
enfermedad invasiva en individuos totalmente normales. Las infecciones locales
superficiales, que pueden extenderse a estructuras ms profundas o diseminarse a o
tros rganos, pueden terminar en quirfano (Stern, 1986) o habr que usar medicaciones
, especialmente corticoesteroides, por una infeccin local o una aplicacin tpica. La
s infecciones de las heridas han sido un problema en pacientes con quemaduras ex
tensas y en individuos expuestos a materiales contaminados con conidias, una sit
uacin tpica de los cigomicetos (McCarty. 1986). Las bolas de hongos en los pulmone
s se producen en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crnica, bronquiect
asias y con cavidades antiguas causadas por tuberculosis. En los senos paranasal
es tambin existen bolas de hongos causadas tanto por especies hialinas como por d
ematiacenos.
(Conlan. 1987). La invasin a travs de las paredes de los senos paranasales es la c
omplicacin ms seria de la enfermedad de va area alta, y es de gran importancia en lo
s pacientes infectados por VIH (Meyer. 1994). La colonizacin endobronquial tambin
se produce en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crnica y en pacientes
con fibrosis quistica que puedan tener bronquiectasias (Gilligan, 1991; Nelson,
1979). A. fumigatus es el moho ms comn aislado en pacientes con fibrosis quistica
. pero hemos encontrado otros mohos, como las especies de Penicillium. las espec
ies de Paecilomyces y S. apiospermum. El curso clnico de la mayora de los paciente
s con fibrosis quistica no parece modificarse por la presencia de Aspergillus en
los pulmones, pero se h a descrito una aspergillosis alrgica broncopulmonar en p
arte de estos individuos, que desarrollan hipersensibilidad a los antigenos fngic
os (Nelson, 1979). A. fumigatus y A. niger son mohos comunes encontrados en las
bolas fungicas pulmonares. A fumigatus. A. flavus y Fusarium spp.. al igual que
los hongos dematiacenos. se encuentran normalmente en los senos paranasales. La
aspergillosis broncopulmonar alrgica es una complicacin en pacientes que tienen un
a ditesis alrgica (Ahmad, 1984; Golbert, 1970). Las hifas colonizan el tracto resp
iratorio bajo, pero no invaden el tejido. La deteccin de anticuerpos precipitante
s en el suero es til, pero algunos investigadores no consideran que los reactante
s disponibles comercialmenle sean validos (Kwon-Chung. 1992). Las manifestacione
s clnicas incluyen asma, infiltrados pulmonares y, al final, fibrosis pulmonar en
algunos pacientes. Las especies de Aspergillus son los agentes incitanles ms com
unes. Un proceso similar puede incluir los senos paranasales (Katzenstem, 1983).

Infeccin pulmonar y enfermedad invasiva

La neumona puede ser difcil diferenciarla de un proceso bacteriano, pero la tos y
la produccin de esputo son con frecuencia menos marcados que en la mayora de las n
eumonas bacterianas (Mehta, 1984). L a progresin hasta la cavitacin y la falta de r
espuesta a los antibiticos son pistas que deberan considerarse en la infeccin fngica
. Un aislamiento repetitivo del mismo moho de muestras clnicas aumenta la probabi
lidad de que el hongo sea un colonizador o patgeno invasivo ms que un contaminante
de laboratorio. La demostracin de hifas en muestras clnicas indica que el moho es
t presente in vivo. La caracterizacin definitiva del proceso infeccioso puede prec
isar una correlacin clnica cuidadosa y con frecuencia un estudio morfolgico de las
muestras de tejido. La diseminacin desde el pulmn u otras zonas puede incluir cual
quier rgano (Meyer, 1973b). La propensin de las hifas para invadir las estructuras
vasculares y causar trombosis conduce a infartos y abscesos en mltiples rganos. A
. fumigatus y A. flavus son las especies que con ms frecuencia se aislan, pero ot
ras especies de Aspergillus. como A. terreus. tambin producen neumona e infeccin di
seminada (Tritz. 1993). A. niger rata vez lo encontramos en enfermedad invasiva,
pero virtualmenfe cualquier hongo puede producir infeccin diseminada si las cond
iciones clnicas y medioambientales son adecuadas.
Enfermedad clnica Infecciones tica y ocular
La queratomicosis por lo general es consecuencia de un traumatismo del ojo, espe
cialmente en pacientes que han sido tratados con esteroides tpicos. El dolor y la
visin borrosa siguen al traumatismo, y si no se trata adecuadamente, la infeccin
puede extenderse a la cmara anterior. Si el proceso no se comprueba, puede ser ne
cesaria una enucleacin. A. fumigatus (Gingrich, 1962) y Fusarium sotan son agentes
etiolgicos comunes (Liesegang, 1980). La otomicosis es una infeccin del odo extemo
, causada generalmente por A. niger o A. fumigatus. Dolor, prdida de audicin y dis
funcin se acompaan de un crecimiento de una pelusa verde o negra en el canal de la
oreja. La extensin ms all del odo externo es rara (Phillips. 1990), pero puede prod
ucirse en pacientes inmunodeprimidos.
Infeccin
cutnea
Patologa de la infeccin por hipomicetos
La respuesta histolgica a estos agentes puede ser granulomatosa. pero normalmente
est ms dominada por los neutrfilos polimorfonucleares, a menos que el paciente est
gravemente neutropnico. La invasin vascular, la trombosis y el infarto con frecuen
cia son caractersticas importantes. Las hifas son delgadas (de 2 jim a 5 un), sept
adas y ramificadas en ngulos agudos (dicotomos) (Fig. 54-2). El tinte hematoxilin
a-eosina con frecuencia colorea bien las hifas. pero, para avanzar, puede verse
la morfologa con las tcnicas del cido peridico de Schiff o la tcnica de plata metenam
ma. Es importante darse cuenta de que es imposible identificar el m o h o por la
morfologa de las hifas. Ramificacin dicotmica, hifas delgadas y septadas no siempre
es igual a Aspergillus.' Cuando el proceso patolgico es una bola de hongos, las
hilas que presumiblemente estn muertas pueden teirse pobremente con todos los tint
es. Cuando la cavidad est en contacto con el aire, como en el pulmn o en los senos
, pueden desarrollarse unas cabezas afrutadas, un suceso que
Las especies de Aspergillus pueden infectar la piel despus de la diseminacin desde
otra zona, por lo general pulmonar, tanto en pacientes infectados por VIH como
en pacientes no infectados. Es menos comn que haya una infeccin cutnea primaria en
cualquier grupo. Entre los factores de riesgo reconocidos est la inmunosupresin. p
ero tambin son importantes los factores de riesgo que disminuyen los mecanismos d
e defensa de la piel. Los ejemplos incluyen quemaduras y heridas quirrgicas, espe
cialmente si estn presentes vendajes oclusivos (van Burik, 1998).
Bolas de hongos

Las dos zonas ms comunes para esta infeccin son los senos paranasales y las cavida
des pulmonares (Dar. 1984: Meyer. 1994). En los senos, los signos y sntomas son l
os de la sinusitis crnica. Las bolas de hongos pulmonares con frecuencia son asin
tomticas, pero pueden producir hemoptisis

1188
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
permite la asignacin de un gnero especifico, tal como Aspergillus (Fig. 54-37). La
s conidioforas, que no estn septadas y que pueden ser ms anchas que las hitas vege
tales, no deben contundirse con los cigomicetos. Las clulas Hlle de pared gruesa y
los cleistotecios se han descrito In vivo. Los cristales de oxalate demostrable
s con filtros polarizantes, pueden encontrarse en las bolas de hongos producidas
por A. niger (Louthrenoo, 1990: Staib, 1979). Cuando el paciente es inmunocompe
tente y la respuesta histolgica es granulomatosa, las hifas pueden fragmentarse y
reducirse a citoplasma de macrfagos y clulas gigantes mullinucleadas (Ahmad. 1981
). La respuesta granulomatosa al Aspergillus en el pulmn puede confundirse con un
a granulomatosis broncocntnca (Bosken, 1988; Nagata, 1990), por lo general en pac
ientes que tienen enfermedad alrgica. En las aspergillosis alrgicas son comunes la
mucosidad impactada con eosinfilos y los cristales Charcot-Leyden (Bosken. 1988)
. La infeccin alrgica por Aspergillus en los senos paranasals se parece a la enfer
medad broncopulmonar (Katzenstein, 1983).
Nmero de filides Morfologa de las colonias, incluido el tamao Presencia y forma de l
as clulas Hlle Presencia de cleistotecios El color y morfologa de las especies de A
spergillus se estudian correctamente en el agar Czapek-Dox. El reverso de las co
lonias de hipomicetos es de color claro, pero puede tener pigmentacin amarilla, m
arrn o roja. Las hifas vegetales son delgadas, septadas y ramificadas. Las coloni
as de muchos de estos mohos rebosan de conidias. Para evitar la contaminacin del
trabajador y de otros cultivos, debe manipularse con cuidado en una cabina de se
guridad de flujo laminar, y despus las superficies de las cabinas tienen que limp
iarse con una solucin fungicida. Mantener los mohos aislados en bolsas de plstico
mientras contina la incubacin tambin reduce la probabilidad de contaminar otros cul
tivos. Como ya se dijo antes, delectar los anticuerpos de las especies de Asperg
illus puede ser diagnsticamente til, especialmente para aspergillosis alrgica bronc
opulmonar (Kurup, 1991).
Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones
Estos mohos son hongos saprofitos, algunos de los cuales se aislan comnmente en l
os laboratorios clnicos. Sin embargo, nunca deberan ser descartados de contaminant
es sin determinar la situacin clnica. El aislamiento de una zona estril o varios ai
slamientos obliga a llamar al mdico. Las hifas tienen que ser demostradas directa
mente en las muestras clnicas, en las preparaciones fijadas o preparaciones en fr
esco. Una vez ms, el calcoflor blanco es til para demostrar los mohos. La presencia
de hifas en una muestra siempre es ms significativa que aislar los mohos solos.
Sin embargo, en las secreciones respiratorias, incluso aunque encontremos hifas,
no se define la naturaleza de la interaccin entre hongos y huspedes. Una correlac
in clnica detallada y, algunas veces una biopsia son necesarias para la determinac
in final. Es importante obtener tejidos, raspados, fluidos o curetajes para anali
zar, con la excepcin de la otomicosis por Aspergillus. El tejido tiene que ser pr
eparado e inoculado directamente en la superficie de un medio de aislamiento. Es
tos mohos crecen rpidamente, pero la mayora se inhiben parcial o totalm e n t e po
r la cicloheximida. La identificacin especfica de las especies la hacemos por el e
studio de: Clulas pie Color de la colonia Morfologa de la cabeza colonial
Aspergillus
fumigatus
A. fumigatus es uno de los ms comunes, si no el ms comn, aislado en los laboratorio

s de micologa. Las colonias crecen m u y rpidamente, produciendo una apariencia de

pelusa. El desarrollo de cabezas afrutadas concede una apariencia azul-verdosa
a la colonia (Lmina 54-1). Examinar la colonia con un microscopio de diseccin nos
muestra las conidioforas con sus vesculas expandidas como globos pequeos protegien
do por arriba el micelio vegetativo. La conodiolora es lisa, relativamente corta
(de 300 um a 500 um). y se extiende en una vescula en forma de frasco. Las filide
s se desarrollan en una hilera nica (uniseriada), y lo ms comn es que se desarrolle
n slo en los dos tercios superiores de las vesculas paralelas al eje de la conidio
fora (Fig. 54-7). Las conidias son rugosas (equinuladas) y de forma redonda u ov
al.
Aspergillus
flavus
El segundo patgeno ms importante en el gnero Aspergillus es A. flavus. Las colonias
crecen rpidamente y, una vez que las cabezas afruladas se desarrollan, tienen un
a apariencia aterciopelada de amarillo a verde (Lmina 54-13). Las conidioforas so
n largas (de 400 pm a 700 pm), terminando en una vescula que puede ser elptica o r
edonda. La conidiofora es rugosa o achaparrada. Una hilera sencilla o doble (bis
eriada) de las filides se produce sobre toda la vescula o los tres cuartos superio
res (Fig. 54-38). Las conidias de redondas a ovales parecen amarillas verdosas e
n masse y miden de 3 um a 4,5 pm. Las estructuras de descanso (esclerotia) se en
cuentran en las hifas vegetales de algunos aislamientos.
Aspergillus
niger
Este saprofito comn se aisla con frecuencia del canal auditivo externo. Tiene una
apariencia colonial espectacular, con cabezas afrutadas negras contra un fondo
de micelios vegetales blancos como la nieve (producen una apariencia de sal y pi
mienta) (Lmina 54-14 y Fig. 54-39). Las conidioforas son lisas y largas (de 1,5 p
m a 3,0 pm). sosteniendo una vescula redonda con filides biseriadas, que se irradi
an fuera desde la vescula entera. Las conidias marrones y rugosas son redondas y
miden 4 pm. Puede estar presente esclerotia.
Figura 54-37. Se demuestra la cabeza de Aspergillus niger dentro de un micetom a
pulmonar (bola de hongos). Se observan bien las tilides y las conidias. Aunque l
as hifas de Aspergillus no son diagnsticas, la demostracin de dicha cabeza demuest
ra la presencia de este gnero (hematoxilina-eosina).
Otras especies de Aspergillus
El grupo A. glaucus consiste en mohos de color verde con manchas amarillas que c
recen rpidamente. Las conidioforas son lisas y las filides unise-

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICOTICAS
1189
Figura 54-38. La cabeza de Aspergillus tlavus es unsenada y biseriada. Las IiliFig
ura 54-40. Conidias de la especie Fusarium con lorma de piragua L a s conidias d
es s e extienden alrededor d em u c h a s de las vesculas. Puede verse la aparien
cia generalmente son septadas. (Lactofenol algodn azul.) r u g o s a de las conid
ioforas. (Lactofenol anilina azul.)
nadas. Normalmente estn presentes cleistotecios (Fig. 54-11). Aspergillus terreus
produce una colonia marrn canela, conidioforas cortas (<250 um) y filides biseria
das. A nidulans produce colonias entre verde y verde oliva oscuro, conidioforas
onduladas cortas (<150 um) y filides biseriadas. L a formacin de cleistotecios de
la etapa sexual se realza por el cultivo en agar Czapek-Dox. Los cleistotecios,
que miden de 100 um a 300 um, son redondos y marrn rojizo Estn rodeados por una ca
pa marrn-amarillenta de hifas que contienen clulas Hlle redondas. Ocasionalmente se
encuentran otras especies.
una macroconidia con forma de canoa o semicrculo que puede tener uno o ms septos.
Pseudallescheria
boydii/Scedosporium
apiospermum
Especies de Fusarium
Este gnero est altamente implicado en la queratomicosis, en quemaduras y en la enf
ermedad diseminada en pacientes inmunocomprometidos (Anaissie, 1992; Nelson, 199
5; Wheeler, 1981). Las colonias se desarrollan rpidamente, produciendo un micelio
areo como pelusa, que con frecuencia es de color rosa, lavanda o salmn. Unos pigm
entos difusos pueden verse en los alrededores del agar. Las filides simples o ram
ificadas se desarrollan directamente de la hila sin una conidiofora que las sepa
re. Pueden producirse macroconidias cortas ovaladas, pero la estructura distinti
va es
P boydii es la fase sexual de esle patgeno, mientras que S. apiospermum es la fas
e imperfecta, asexual. El moho crece rpidamente en un medio de aislamiento, produ
ciendo una colonia vellosa que evoluciona de color marrn grisceo a gris oscuro ("r
atn") despus de incubarlo durante varios das. El cultivo se oscurece ms an con una in
cubacin continuada (Lmina 54-15). Este moho puede crecer en un medio que contenga
ms de 8 mg/ml de cicloheximida. La fase asexual se caracteriza por agrupaciones s
imples o pequeas de anelocondias en una conidiofora recta o ramificada que puede c
recer terminal o lateralmente de la hifa vegetativa Las conidias son de marrn cla
ro y tienen una morfologa oval parecida al esperma (Fig. 54-41). En la fase sexua
l, los cleistotecios marrones contienen ascosporas (Fig. 54-42). Los cleistoteci
os, que se encuentran ms preparados en los bordes de la colonia, se desarrollan m
ejor en un medio nutricional deliciente. como el agar cornea. Estrictamente habl
ando, la cepa debe referirse como P. boydn si se demuestran cleistotecios. y com
o
Figura 54-41. Las microconidias de Scedosponum apiospermum c o nf o r m a d e Fi
gura 54-39. L a s cabezas de Aspergillus niger se demuestran con un microsco- re
nacuajo o d e espermatozoide dan al organismo su nombre. (Lactofenol algodn po de
diseccin (Preparacin sin teir.) azul.)

1190
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Figura 54-42. U na s c o de la lorma sexual Pseudallescheria boydiivene un exter
ior rugoso causado p o r hitas especializadas.
Figura 54-44. La septacin de las clulas algiformes de Prototheca wickerhamn produc
e m u c h o s cuerpos mtracelulares y estructuras conocidas c o m o mrulas (hemat
oxilina-eosina).
S. apiospermum si las conidias asexuales son las nicas estructuras diagnsticas obs
ervadas.
Otros mohos hialinos
Hay una gran lista de mohos hialinos que son saprofitos del ambiente, o de virul
encia baia. y por lo general no se asocian con enfermedad clnica cuando se aislan
en el laboratorio de micologia. Como ya se ha dicho antes, cualquiera de estos
mohos puede ser patognico ba)0 condiciones adecuadas. En la mayoria de los casos,
las defensas del husped estn deprimidas de algn modo, o el hongo se introduce en e
l cuerpo por un traumatismo o manipulaciones mdicas. Como ejemplo. Paecilomyces l
ilacinus es un moho hialino que se parece morfolgicamente a las especies Penicill
ium (Westenleld, 1996). Este moho fue considerado hasta hace poco como un contam
inante de laboratorio. Un gran nmero de documentos cuentan la capacidad de los ll
amados contaminantes para producir infecciones del tejido profundo y de los rgano
s sistmicos. La demostracin de hifas en el tejido es extremadamente importante par
a averiguar la patogenicidad del aislamiento.
Especies de
Penicillium
Este hongo saprofito se aisla comnmente en el laboratorio de micologia. por lo ge
neral sin ninguna enfermedad clnica asociada. Las especies comnmente aisladas crec
en bien en un medio de aislamiento fungico, pero se inhiben por la cicloheximida
. La colonia es aterciopelada, y se desarrolla una apariencia verde, en ocasione
s con un borde blanco (Lmina 54-16). La estructura diagnstica es el penicilo, que
recuerda la mano de un esqueleto con cadenas de conidias creciendo desde la punt
a de los dedos (Fig. 54-43). Las especies de Penicillium tienen que dilerenciars
e de las Paecilomyces spp. que son morfolgicamente similares. P. mameflei es un m
iembro poco normal del gnero que es dimrfico y regularmente produce enfermedad hum
ana sistmica (KwonChung. 1992). Esta especie es endmica en el sureste asitico, y la
mayoria de los casos en EE.UU. se han producido en pacientes inmunodeprimidos q
ue han viajado a Asia (Phiehl, 1988) La infeccin por P. mame/Ye/puede parecerse c
lnicamente a la tuberculosis, moluscos contagiosos, histoplasmosis o cnptococoss (
Cooper. 1997). A 25 C-30 C. las colonias de mohos son grises con un pigmento roj
o soluble; segn maduran las conidioforas, el color de las colonias se vuelve verd
e. Las clulas de levadura se producen a 37"C o en los tejidos, pero la divisin es
por septacin o fisin ms que por gemacin.
INFECCIONES CAUSADAS POR ALGAS ACLORFILAS
Prototheca wickerhamii y P. zopfii son dos especies de algas que no producen clo
rofila. Producen en ocasiones infecciones humanas, y se consideran en este capit
ulo porque se parecen a las infecciones de enfermedades fngicas (Sudman, 1974; Ti
ndall, 1971). Los Prototheca se encuentran en aguas frescas y marinas, y probabl
emente entran en el cuerpo a travs de heridas superficiales. Algunos pacientes so

n inmunocompetenles, pero algunas enfermedades subyacentes, como diabetes mellit

us, o terapias inmunosupresivas con frecuencia predisponen a los pacientes a la
infeccin por este patgeno. Otros pacientes han recibido inyecciones de corticoeste
roides en la zona de infeccin o han tenido infeccin musculoesqueltica. sobre todo c
on afectacin de los tendones. Las infecciones normalmente afectan a la piel y al
tejido subcutneo, y despus afectan a los tendones y las articulaciones (Holcomb, 1
981; Nosanchuk. 1973). Son crnicas e intratables, y puede ser difcil eliminarlas s
in daar las estructuras que estn debajo, particularmente en la mano (Lee. 1975). L
a diseminacin de la infeccin es rara (Cox, 1974). Las algas crecen en medios fngico
s de aislamientos preparados que no contienen cicloheximida. y las colonias se p
arecen a las de las especies Candida (Lmina 54-17). Las clulas de las algas tienen
una apariencia caracterstica, en la que mltiples clulas hijas (esporangiosporas) s
e desarrollan dentro de la clula madre (esporangio), recordando a una esfrula (Ch
andler, 1978; ElAni. 1967). Tambin podemos encontrar estas estructuras en seccion
es histolgicas, donde deben ser diferenciadas de hongos dimrficos (Fig. 54-44). Pu
eden verse en las preparaciones de hematoxilina-eosina y se tien bien con el cido
peridico de Schiff o mtodos de plata matenamma. Las especies de Prototheca se incl
uyen en la base de datos
Figura 54-43. El penicilo de las especies de Pnicillium est compuesto de cadenas d
e conidias nacidas de filides que han sido comparadas con los huesos del esquelet
o de la m a n o El gnero Paecilomyces. que posee ms filides. puede ser confundido c
on el Penicillium (lactofenol algodn azul).

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS
1191
de los sistemas de identificacin de levaduras comerciales, tales como API 20C (Bi
oMerieux. Hazelwood. MO) y sistemas Vitek (BioMneux, Hazelwood, MO).
se produce por los hongos, ms que por una reaccin del tejido especifico para el pu
lmn.
Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones PNEUMOCYSTIS CARINII
Hace pocos aos, este importante patgeno hubiera sido incluido en el captulo de para
sitologa. El organismo tiene caractersticas peptnicas. tanto de protozoos como de h
ongos, pero los estudios moleculares han establecido su relacin con los hongos as
comicetos (Edman, 1988). Pneumocystis carinii ha sido cultivado en cultivos celu
lares, pero no se ha acompaado de un mantenimiento senado de los subcultivos (Lat
orre. 1977; Pifer. 1977). Por tanto, el diagnstico es morfolgico y. ms recientement
e, inmunolgco. El ciclo vital del Pneumocystis carinii afecta al desarrollo de los
esporozoitos dentro de quistes, despus de lo cual los esporozoitos se liberan. E
l lavado broncoalveolar nos proporciona la fuente ms fiable para material diagnsti
co (Kelley. 1978), y la biopsia pulmonar rara vez tiene que realizarse. En pacie
ntes con VIH se produce un nmero de microorganismos suficientes para que con un e
sputo inducido con salino pueda proporcionarnos el diagnstico. La experiencia con
los esputos ha variado, sin embargo, en diferentes centros y el rendimiento es
muy bajo en pacientes que tienen otras infecciones aparte del VIH (Lau. 1976). L
a tincin con Giemsa nos muestra bien los esporozoitos. pero las estructuras pequea
s son ms difciles de detectar que los quistes. El tinte comercial Diff-Quik (Corpo
racin de Salud Baxter. McGaw Park, IL) es el que se utiliza normalmente. El tinte
de plata metenamina, modificado para Pneumocystis, se utiliza normalmente en la
boratorios de patologa quirrgica (Fig. 54-45). El azul de toluidma 0 ha sido emple
ado en muchos laboratorios de microbiologa (Gosey, 1985). El calcofiUor blanco ta
mbin tie los quistes y se ha utilizado con xito en algunos laboratorios (Baselski.
1990). Los quistes, que miden 5 um son redondos, pero las formas plegadas son co
munes. Los quistes plegados con forma de casco y los engrasamientos de las pared
es del quiste que recuerdan a las comillas en preparaciones teidas con plata, son
caractersticos, pero no diagnsticos. Los quistes deben diferenciarse de otros hon
gos, en particular de H. capsuiatum. El uso de tintes para quistes y trolozoitos
, separados o combinados, nos da una gran sensibilidad (Bartlett, 1991; Blumenfe
ld. 1988). La llegada de anticuerpos monoclonales combinados con fluorescena para
P. carinii nos ha proporcionado un mtodo especfico para identificarlo. La tcnica d
e la inmunolluorescencia. segn algunos artculos, ha sido ms sensible en tintes hist
oqumicos (Baughman. 1989; Kovacs, 1988). pero la destreza y el cuidado de los obs
ervadores sin duda tienen un papel importante al comparar la sensibilidad de las
tcnicas (Bartlett, 1991; Cregan. 1990). El Pneumocystis encontrado en las ratas
no se tie con el monoclonal para quistes humanos (Bauer, 1993). pero la especific
idad de estas especies es un problema slo en la competencia de los test de las mu
estras. Debe decirse que los quistes del P. carinii en ocasiones pueden encontra
rse en las preparaciones teidas con Gram (Fig. 54-46). aunque esta tcnica no es un
mtodo sensible para detectarlos. La deteccin
Factores de riesgo
Pneumocystis cariniies un patgeno de humanos (Bartlett, 1991: Masur. 1989; Walzer
. 1974: Watts, 1991). Organismos morfolgicamente similares causan infecciones en
especies de roedores. Primero se reconoci en los comienzos de la enfermedad pulmo
nar entre nios malnutridos en el este de Europa durante y despus de la Segunda Gue
rra Mundial. No se conoce ninguna fuente en el medio ambiente conocida para los

hongos. Podemos comprobar que la mayora de los individuos se infectaron asintomtic

amente en la infancia por anlisis serolgicos (Maddison. 1982: Peglow, 1990). Tambin
se han encontrado infecciones asintomticas o ligeramente sintomticas en adultos (
Sheldon. 1959). Hay una evidencia sugerente de que los hongos pueden colonizar e
l tracto respiratorio bajo, produciendo una infeccin activa cuando interviene un
tratamiento o enfermedad inmunosupresiva. La neumocistosis es una enfermedad de
individuos comprometidos inmunolgicamente (Walzer, 1974). El tratamiento con cort
icoesteroides y malignidad hemalolgica fueron los principales factores de riesgo
antes de que apareciera el VIH, que se ha convertido en el principal factor de r
iesgo (Phar, 1990). El sida se descubri por la apariencia de esta enfermedad en ho
mbres jvenes que previamente estaban sanos en Los ngeles y Nueva York (Gottlieb. 1
981: Masur, 1981). y la infeccin por Pneumocystis carinii ha sido una de las infe
cciones que se encuentran en los comienzos del sndrome. La incidencia ha descendi
do en estos aos, quiz por la introduccin de un tratamiento retroviral efectivo y el
uso extensivo de antibiticos profilcticos que son activos contra los hongos (Kova
cs, 1992; Sehonanda. 1996).
Enfermedad clnica
La neumona es la manifestacin ms comn de la enfermedad y el pulmn era el nico rgano
ctado antes de la aparicin del VIH. El comienzo puede ser agudo o insidioso y pre
domina la disnea. Con frecuencia los infiltrados son mucho ms extensos de lo que
se pensara por el grado de los sntomas (Dee, 1979) Es normal que haya infeccin conc
urrente con otros agentes, sobre todo con citomegalovirus y C. neoformans. La in
feccin con frecuencia es mortal en pacientes no tratados, inmunodeprimidos que mu
eren de un fallo respiratorio progresivo. La diseminacin de los hongos ms all del p
ulmn es comn en pacientes infectados por VIH. pero no es comn en pacientes con otro
s factores de nesgo (Telzak, 1990).
Patogenia de infecciones por Pneumocystis
La presentacin patolgica inicial en nios malnutridos fue una neumona intersticial gr
ave con un infiltrado molecular que tenia un gran componente de clulas plasmticas
(neumona de clulas del plasma). El patrn histolgico clsico es un exudado alveolar esp
umoso que puede calcificarse (Weber. 1997). Un dao alveolar difuso con membranas
hialinas es una presentacin menos especfica pero comn (Askin. 1981). Se han descrit
o, aunque son menos comunes, enfermedad granulomatosa, enfermedad cavitaria y ne
crosis coagulativa que se parece a los infartos. Las lesiones extrapulmonares so
n mnimamente inflamatorias, y consisten en cmulos focales de exudado espumoso en e
l que se encuentran clulas fngicas. Los estudios ultraestructurales de los organis
mos cultivados (Murphy, 1977) y la histologa extrapulmonar apoyan la evidencia ul
traeslructural de que el exudado espumoso
Figura 54-45. Los quistes de Pneumocystis carinii pulmonar son redondos o colaps
ados y lienen un engrasamiento focal en la pared del quiste que le da u n a apar
iencia de parntesis (tincin con plata metenamina).

1192
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
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CAPiTuio 54

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Parasitologa mdica
Thomas R. Fritsche, M.D., Ph.D. James W. Smith, M.D.
MTODOS DE LABORATORIO Examen de sangre Examen de muestras fecales Examen de muest
ras urogenitales y otras muestras (expustos, aspirados y biopsias) Tcnicas de cul
tivo parasitario Mtodos de inmunodiagnstico Mtodos de diagnstico molecular Control d
e calidad, de mejora y seguridad PROTOZOOS SANGUNEOS Y TISULARES Malaria Babesios
is Hemoflagelados Toxoplasma gondii Amebas oportunistas de vida libre PROTOZOOS
INTESTINALES Y UROGENITALES Amebas y Blastocystis hominis Flagelados Ciliados Co
ccidios Microsporidios
1198
HELMINTOS INTESTINALES Nematodos Cestodos Tremtodos HELMINTOS TISULARES Nematodos
Cestodos Tremtodos ARTRPODOS DE IMPORTANCIA MDICA
1221
1228
1231
1204
Caractersticas biolgicas Mecanismos de lesin Aproximacin de laboratorio a la identif
icacin de artrpodos Insectos Arcnidos Clases de menor importancia mdica
1211
INFECCIONES PARASITARIAS Y HUSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS BIBLIOGRAFA
1237 1237
El estudio de la parasitologa ha ganado renovada importancia en un mundo cada vez
ms pequeo debido al rpido desplazamiento de la gente, especialmente viajeros y emi
grantes de reas endmicas para enfermedades parasitarias, y por la aparicin de patgen
os que surgen y resurgen en individuos inmunodeprimidos por diferentes razones.
Las enfermedades parasitarias de los humanos y animales domsticos tienen un gran
peso en las reas de recursos de salud limitados, y afectan de un modo adverso al
desarrollo social y econmico de muchos pases en todo el mundo. Mientras que los or
ganismos clasificados como parsitos constituyen un gran grupo, los que afectan a
los humanos son ms limitados en nmero y estn compuestos mayoritariamente por protoz
oos, helmintos y artrpodos (Tabla 55-1). Mdicos de EE.UU. y otros lugares se estn e
ncontrando con un creciente nmero de problemas en el diagnstico de las enfermedade
s parasitarias. Tambin los laboratorios han cambiado con el desarrollo de nuevas
tecnologas para diagnosticar, rpidamente y con precisin, parsitos como Cryptosporidi
um parvum, Cyclospora cayelanensis, Toxoptasma gondii y
microsporidios tanto en inmunocompetentes como en immunosuprimidos. El resurgimi
ento mundial de la malaria y otras enfermedades parasitarias ha requerido tambin
un mayor esfuerzo de los laboratorios para detectar protozoos y helmintos sangune
os, intestinales y tistulares. Una vez diagnosticados, pueden surgir problemas a
dicionales en su tratamiento debido a la falta de terapias efectivas o al increm
ento de las resistencias a las terapias tradicionales. Muchos parsitos precisan d
e un vector artrpodo para su transmisin, y el uso irregular de los esfuerzos errad
icadores de los vectores ha producido, en muchas ocasiones, una aparicin de resis
tencias a los insecticidas. La malaria est resurgiendo en muchas reas debido a un
descuido en las medidas de control, as como por la aparicin de parsitos resistentes
a los frmacos y mosquitos resistentes a los insecticidas. La esquistosomiasis se
ha extendido a nuevas zonas debido a un aumento de la irrigacin a causa del crec

imiento de la poblacin, que necesita una expansin de la agricultura. Debido a la n

aturaleza crnica de muchas enfermedades parasitarias, asi como a los largos perodo
s de incubacin (tiempo entre la infeccin y la aparicin de estadios diagnsticos), los
mdicos pueden no considerarlas en el

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1197
Tabla 55-1
R e s u m e n d e los parsitos m s f r e c u e n t e m e n t e hallados e n h u m
a n o s y s u principal zona d e infeccin S u b r e i n o de los protozoos Filo
Sarcomarligophorea Sublilo Sarcodina (amebas)
. histolytica (I)' hartmanni (I)
S u b r e i n o d e los m e t a z o o s Filo Platelmintos (gusano plano) Clase c
eslodos (lenias) Diphyllobothrium spp. (I)' Dipylidium caninum (I)* Echinococcus
granulosus (H)" multilocularis (H)' Hymenolepis nana (I)' H. diminuta (I)' Taen
/a saginata (1)" 7 solium (I. T)" Clase Tremtodos (lombrices) Clonorchis sinensis
(H) Fasciola heptica (H)* Fasciolopsis buski(i) Heterophyes heterophyes (I) Meta
gonimus yokagawai(I) Nanophyetus salmincola (1)" Opistorchis viverinni (H) Parag
onimus spp (L)* Schistosoma haematobium (B) S japonicum (B) S. mekongi (B) S. ma
nson/(B) Filo Nematodos (gusanos redondos) Clase Adenophoros (aplasmidios) Trich
inella spiralis (T. 1)" Trichuris trichiura (I) Capillaria philippinensis (I) Cl
ase Secernentia (plasmidios) Enterobius vermicularis (I) Ascaris lumbhcoides (I)
' Ancylostoma duodenale (I) Necator amencanus (I)* Strongyloses stercoral (I) Tr
ichostrongylus spp. (I)' Amsaki spp. (1)" Wucfiereria bancrotli (T, B) Brugia ma
layi (T. B) Loa toa (T, B) Onchocerca volvulus (T) Mansonella perstans (TB) M. o
zzardi (T. B) M streptocerca (T) Dracunculus medinensis (T) Angiostrongylus cant
onensis (T) A costaricencis (T)
d/spar(l) coft'(l) lodamoeba butschlii (I) Endo/imex nana (I) Nacglcria fowleri(
T. C)* Acanthamoeba spp (T. C, E)" Balamulhia mandrillaris (T, C)* Blastocystis
hominis (I) Subfilo Mastigophora (flagelados) Giardia lamblia (I)* Dienlamoeba f
ragihs (I)' Chilomasyix mesniii (I) Relor amonas intestinalis (I) Enteromonas hom
inis (I) Trychomonas hominis (I) Ttychomonas vaginalis (V)" Leishmania tropica (
T) L. major (T) L aethiopica (T) .. mexicana (T)" /.. braziliensis (T) L. donovan
/(T) Trypanosoma gambiense (B, 7" rhodesiense (B. C)
7" CY/;>7(B. T)'
C)
Filo Ciliophora (ciliados) Balanlidium coli (I)* Filo apicomplexa (apicomplejos)
Clase Sporozoea Subclase Piroplasmea Babesia spp. (B) Subclase coccidios Plasmod
ium falciparum (B) P malariae (B) P ova/e (B) P wvax (B) Cryptosporidium parvum
(I)" Cyclospora cayetanensis ( I ) Isospora belli (I)* Toxoplasma gondii (T)' Fi
lo Microspora (microsporidios) Encephalilozoon spp. (E, H, T)* intestinalis (I.
T)' Enterocytozoon bieneusi (I)'
* Parsitos patgenos naturales de Estados Unidos B sangre. C liquido cefalorraqudeo:
E 0|0: H: hgado: I: intestino L pulmn T : tejidos; V: vagina Adaptada de Murray P
R Barron EJ Pfaller M. y cois. Manual of Clinical Microbiology, 6a ed Washington
DC A S M Press. 1 9 9 5
diagnstico diferencial a menos que el paciente aporte informacin voluntariamente o
se le interrogue especficamente sobre la historia de viajes u otras exposiciones
. La malaria es una de las patologas parasitarias que cursa con un cuadro febril
agudo, que puede tener consecuencias letales a menos que se la considere en el d

iagnstico diferencial y se recoja una historia de viajes a una zona endmica. Se ha

n hecho varias estimaciones de la prevalenca y mortalidad de las infecciones para
sitarias en todo el mundo (Tabla 55-2). Se desconoce la incidencia actual de las
infecciones por parsitos en los EE.UU. porque la mayora no se declaran a las oicma
s de salud pblica. Giardia lamblia.
otros protozoos intestinales y los gusanos redondos intestinales son los ms frecu
entemente declarados (7,2%. 10% y 3.5%, respectivamente) por los laboratorios, p
ero probablemente son ms comunes otros parsitos, entre los que se incluyen Cryptos
poridium. Cyclospora y los microsporidios, aunque estn infradiagnosticados (Kappu
s, 1994). Este captulo hace una revisin del abordaje general de los laboratorios p
ara la deteccin y el reconocimiento de los protozoos y helmintos en las muestras
humanas. Se necesita una descripcin de las distintas especies de parsitos para ten
er una informacin clnica y biolgica esencial para el diagnstico y tratamiento. Para
una mayor descripcin de los parsitos.

1198
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
N
Tabla 55-2 Prevalencia mundial e s t i m a d a para las infecciones parasitarias
Poblacin estimada N. anual afectada de muertes Enfermedad Protozoos Amebiasis Tr
ipanosomiasis africana Tripanosomiasis americana Giardiasis Leishmaniasis Malari
a Helmintos Ascariasis Ceslodos ClonorquiasisOpistorquiasis Dracunculosis Fascio
lopsiasis Filaras linfticas Uncinanas Oncocercosis Paragonimiasis Esquistosomiasis
milln Estrongiloidiasis Tricoeslrongiliasis Tncunasis Aprox. 10% de la poblacin 1
00.000 nuevos casos al ao 24 millones 200 millones 1.2 millones 400-490 millones
1.3 billones 65 millones 13.5 millones < 100.000 10 millones 128 millones 1,3 bi
llones 17.7 millones 2.1 millones 150 millones 35 millones 5,5 millones 900 mill
ones 40.000-110.000 5.000 60.000
2.2-2.5 millones
1 550
cuencia de muestras necesarias para el diagnstico. Tambin son tiles en muchas ocasi
ones los mtodos de diagnstico inmunolgico y molecular, y a veces pueden ser los nico
s mtodos de diagnstico disponibles. Se puede encontrar una descripcin completa de l
os procedimientos de laboratorio general para la deleccin e identificacin de los p
arsitos en distintas fuentes a las que nos remitimos (Ash. 1987; Balows, 1 9 8 8
: Beaver. 1984; Garcia. 1997.1999: Isenberg. 1992; Murray. 1999: Price. 1994). L
a familarizacin con la calibracin y el uso de un micrmetro ocular es necesaria para
llevar a cabo cualquier examen parasitolgico en cualquier laboratorio. La medicin
del tamao de los trolozotos de los protozoos y los quistes, as como de los huevos d
e los helmintos y las larvas, es algo m u y necesario para una rpida identificacin
. Diferenciar entre amebas patgenas y no patgenas (concretamente entre Entamoeba h
istolytica y E. hartmanni) slo puede realizarse con seguridad a travs de la cuidad
osa medicin del tamao. Igualmente, los huevos de Diphyllobothrium spp., Paragonimu
s westermani y Fasciola>Fasciolopsis pueden distinguirse segn su tamao (Smith, 197
9).
Examen de sangre
Los parsitos que se pueden detectar en muestras de sangre son los agentes de la m
alaria (Plasmodium spp.). babesiosis (Babesia spp.), tripanosomiasis (Trypanosom
a spp.) y leishmaniasis (Leishmania donovam) y filanasis (Wuchereria bancrofti,
Brugia malayi. Loa loa y Mansonella spp.). Las tcnicas ms importantes que debe rea
lizar el laboratorio para el diagnstico de los parsitos sanguneos son la preparacin,
la tincin y el examen de las extensiones gruesa y fina de sangre. Otras tcnicas m
enos frecuentes son aquellas de concentracin reservadas para la deteccin de microf
ilarias (National Committee tor Clinical Laboratory Standards [NCCLSj, 2000).
500 000-1
Adaplada de Marken EK. John DT Krotoski WA Marken and Voge's Medical Pa rasilolo
gy 8 ed Filadelha. WEt Saunders Company. 1 9 9 9
Frotis sanguneos gruesos y finos
nos remitimos a un gran nmero de textos disponibles (Beaver. 1984; Cook. 1996: Ga
rcia. 1997. 1999; Goldsmith. 1989: Kettle, 1995; Lae. 1993; Markell. 1999: Strick
land, 2000; Warren. 1990: entre otros) Una importante fuente de informacin la ten
emos tambin en los atlas de parasitologa para todo laboratorio que trabaja con pars
itos, y que debe estar disponible para consulta (Ash, 1987. 1997; Brooke, 1984;

Isenberg, 1992: Murray, 1999; Peters, 1989: Spencer, 1982; Sun, 1988). En otros
textos se documentan aspectos especficamente patolgicos de la inleccin parasitaria
(Binford, 1976; Connor, 1997; Gutirrez, 2000; Orihel, 1995; Marcial Rojas, 1971;
Sun, 1982; Von Lichtenberg, 1991; Woods, 1993). Las infecciones parasitarias en
los mmunodeprimidos tambin han sido objeto de revisin (Walzer. 1989) Es necesario
el examen de frotis sanguneos teidos para la identificacin de la mayora de los parsit
os sanguneos. Los frotis finos se preparan igual que los usados en el diagnstico d
iferencial hematolgico: la sangre se extiende sobre un portaobjetos en una fina c
apa evitando la superposicin de los elementos celulares. Es importante la integri
dad de las membranas celulares para determinar la naturaleza mtracelular o exlra
celular de la inleccin. En el frotis grueso, la sangre se concentra en un rea pequ
ea en la que muchas clulas yacen en el fondo. Durante la tincin, los eritrocitos pi
erden la hemoglobina, de modo que slo son visibles los ncleos leucootarios. las pl
aquetas y los parsitos (si estuviesen). Se prefiere el uso del frotis grueso para
el diagnstico, ya que posee entre diecisis y treinta veces ms sangre por campo que
el frotis fino, incrementndose asi la posibilidad de detectar parsitos reduciendo
el tiempo necesario de examen. La cantidad de sangre estudiada en un frolis gru
eso en cinco minutos, usando un objetivo de aceite de inversin (100 x), requerira
al menos treinta minutos si se examinase la misma cantidad en un frotis fino. Mi
entras que la probabilidad de deteccin de una infeccin aumenta con el frotis grues
o, la identificacin de la especie se realiza mediante examen del frotis fino, ya
que as la morfologa es ms definida, especialmente para la malaria Para el examen or
dinario, se deberan preparar ambos tipos de frotis. Preparacin de las extensiones,
La sangre para examen puede obtenerse por puncin en el dedo, en el lbulo de la or
eja o por puncin venosa. La sangre de la puncin del dedo debe dejarse salir librem
ente para evitar su dilucin con los lquidos titulares y no debe ser contaminada co
n alcohol desinfectante, sino que primero se debe dejar que sta se seque. Si se o
btiene por puncin venosa, se usar la primera gota de sangre (sin anticoagulante) p
ara preparar el frotis a la cabecera del paciente. El uso de anticoagulantes est
contraindicado en la sospecha de malaria porque pueden distorsionar la morfologa
de los parsitos e interferir en su tincin. En la prctica, no obstante, la sangre su
ele remitirse al laboratorio con anticoagulante, ya que puede ser el nico modo de
asegurar que s e puedan preparar las extensiones. El anticoagulante ms utilizado
, en tales
MTODOS DE LABORATORIO
Se han descrito numerosos mtodos para la deteccin e identificacin de parsitos en las
muestras clnicas, algunas de las cuales son tiles para detectar distintas especie
s, mientras que otras detectan una nica especie en particular. Es preferible para
el laboratorio ofrecer un nmero limitado, pero competente, de procedimientos a l
levar a cabo, en vez de proporcionar una gran variedad de pruebas poco empleadas
que puedan resultar problemticas. Los anlisis de sangre y heces comprenden la may
ora de los requerimientos clnicos para un estudio parasitolgico. Otras muestras son
de uso menos frecuente, como las urogenitales, el esputo, los aspirados y las b
iopsias. Como cada vez hay nueva informacin disponible de algunos de los llamados
parsitos emergentes, los laboratorios pueden necesitar desarrollar y usar mtodos
adicionales altamente especficos o encontrar laboratorios de referencia competent
es donde llevar a cabo las pruebas. Las muestras recogidas para la valoracin del
laboratorio dependen de la especie y del estudio del parsito sospechado. El conoc
imiento del ciclo de vida del parsito da informacin de la determinacin del tipo, nme
ro y fre-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1199
casos, es el cido etilendiaminoletraactico (EDTA). pero debe ser llevado al labora
torio en menos de una hora para evitar el deterioro de la morfologa de los organi
smos. Los anticoagulantes no interfieren en la tincin de las microfilarias. Tanto
el frotis fino como el grueso se deben preparar en un porta limpio y sin grasa.
Los frotis gruesos se preparan poniendo unas cuantas gotas de sangre en una zon
a de 1,5 cm de dimetro y dejndolos secar a temperatura ambiente, casi siempre por
la noche. Un frotis grueso debe ser lo suficientemente fino para que se pueda le
er un peridico a su travs; si fuese demasiado grueso, el frotis puede escurrirse p
or el portaobjetos. El exceso de calor podra fijar los eritrocitos y evitar su de
shemoglobinizacin. Tinciones. La sangre empieza a perder su afinidad por las tinc
iones en unos tres dias y los Irolis gruesos ms antiguos no pierden bien la hemog
lobina. Los mejores resultados de la tincin se logran con el uso de la tincin de G
iemsa. ya que la cromatina de las clulas y la del parsito se tie con viveza, mientr
as que la hemoglobina de los eritrocitos queda de color rojo plido. Es la nica tin
cin que permite ver el punteado entrocitario que se produce en la infeccin por alg
unos parsitos de la malaria. La tincin de Wright puede usarse para frotis finos, p
ero tie los parsitos peor que el Giemsa y tie los eritrocitos, dejando un fondo poc
o ntido. Debido a que la tincin de Wright lleva alcohol como fijador, los frotis g
ruesos se deben lisar con agua antes de ser teidos. El proceso de tincin con Giems
a requiere mayor atencin a la hora de preparar los activos y de realizar el proto
colo de tincin, mientras que en el caso de la tincin de Wright suele estar todo au
tomatizado. Generalmente, el colorante de Giemsa fresco se debe hacer cada da, us
ando una solucin diluyeme con agua tamponada con fosfato. Para lograr una adecuad
a tincin, incluyendo la aparicin del punteado de Shflner, el agua tamponada se debe
mantener con un pH entre 6,8 y 7.2. Se debe revisar cada lote de Giemsa para de
terminar el tiempo de tincin ptimo y su dilucin, ya que hay algunas variaciones de
lote a lote (NCCLS. 2000). Examen de las extensiones. Tanto los frotis gruesos c
omo los linos se examinan en su totalidad bajo un objetivo de bajo aumento (10x)
para detectar microfilarias, que no suelen estar en gran nmero. Particularmente
se deben examinar los bordes del frotis fino, ya que las microfilarias se despla
zan all frecuentemente durante la preparacin del frotis. El examen con aumento de
50x en aceite de inversin puede usarse para la bsqueda de protozoos en frotis sang
uneos, aunque es an necesario el examen en objetivo de aceite de inversin 100x para
detectar los parsitos ms pequeos, como Plasmodium spp.. Babesia spp.. y Leishmania
spp. Nuevamente, el examen de los bordes es importante, puesto que los eritroci
tos son desplazados a una capa de clulas, permitiendo la evaluacin de su morfologa
y la existencia de protozoos mtracelulares. Un experimentado microscopisla antes
de dar un resultado negativo debe examinar como poco cien campos con aceite de
inversin en frotis gruesos (dedicando cerca de cinco minutos) y doscientos campos
en un frotis fino (dedicando al menos quince minutos) usando un objetivo de cen
aumentos (Ash, 1987).
gulada se lisa con formalma al 2% y se centrifuga para concentrar las microfilar
ias en el sedimento, que puede ser posteriormente examinado como una preparacin e
n fresco, o bien se tie con Giemsa o hemaloxilina. En el proceso de filtracin de m
embrana la sangre es lisada y pasada a travs de un filtro de membrana de 5 pm, qu
e posteriormente es teida con hematoxilina para detectar alguna microfilaria (Ash
, 1987; NCCLS, 2000). El uso de naranja de acridina-fluorocromo en un formato de
microhematcrito (OBC. mtodo de deteccin de parsitos sanguneos. Becton Dickinson, Fra
nklin Lakes. NJ) permite la deleccin de parsitos sanguneos y parece ser ms sensible
que los tradicionales frotis grueso y fino. Los laboratorios que detectan malari
a infrecuentemente pueden tener dificultades para la interpretacin de los resulta

dos con este mtodo, pero sin embargo se les anima a conservar la experiencia en l
a realizacin de las tcnicas con los tradicionales frotis sanguneos (NCCLS. 2000).
Examen de muestras fecales
La identificacin de parsitos intestinales se realiza a travs del examen directo de
la deposicin usando heces acuosas, tcnicas de concentracin, tinciones permanentes y
, menos frecuentemente, cultivos. Se han hecho populares los nuevos mtodos de inm
unoensayo mediante anticuerpos especficos para detectar antgenos de Giardia lambli
a. Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica. Los estadios de helmintos ms f
recuentemente vistos son los huevos y larvas, aunque ocasionalmente pueden verse
gusanos enteros o porciones. La infeccin por protozoos intestinales se diagnosti
ca por la deteccin de trofozotos. quistes u ooquistes. Los mtodos habituales para l
a identificacin de huevos y parsitos (examen O/P) deberan incluir procedimientos qu
e permitiesen detectar tanto protozoos como helmintos, dejando el uso de tcnicas
especiales slo para solicitudes especificas. Como existen pocos laboratorios dedi
cados al examen parasitolgico, deben estar capacitados para realizar un examen di
recto de heces frescas acuosas, tcnicas de concentracin y tcnicas de tincin. Muchas
infecciones por protozoos pueden no detectarse a menos que se realicen exmenes co
n tincin permanentes (Garca, 1979,1997; NCCLS. 1997; Price, 1994: Smith, 1996).
Recogida, manejo y conservacin de muestras
Una correcta deteccin e identificacin de los parsitos de las muestras fecales requi
ere una adecuada recogida y manejo de las mismas. Las muestras antiguas, mal con
servadas o contaminadas son de escaso valor. Las muestras no se pueden recoger e
n la semana que sigue a la ingestin de sustancias que dejen residuos cristalinos,
como componentes antidiarreicos no absorbibles, anticidos, bismuto, bario o agen
tes antimalricos. Los laxantes oleosos, como el aceite mineral, tambin pueden inte
rferir en el examen. El uso de antibiticos o los medios de contraste pueden dismi
nuir el nmero de organismos en el tracto digestivo, especialmente protozoos, dura
nte varias semanas (Ash. 1987). Las muestras se deben remitir al laboratorio mie
ntras estn frescas o con los conservantes apropiados. Todas las muestras frescas
se deben examinar en la primera hora tras ser remitidas, y las muestras lquidas d
eben examinarse en menos de treinta minutos o ser puestas en conservantes para m
antener el mximo rendimiento. Estas estrategias aseguran que los frgiles protozoos
y trofozotos no sean destruidos inadvertidamente. La muestra que no se procese i
nmediatamente se debe dejar en una habitacin a temperatura ambiente o refrigerada
y nunca colocada en una incubadora, ya que peligrara la integridad de los parsito
s. Las muestras deben ser pasadas directamente a un cartn seco y limpio o que el
paciente defeque sobre un papel encerado y se transfiera u n a parte a un recipi
ente. Las muestras liquidas pueden tambin ser recogidas en u n a cua limpia. Los c
ontenedores deben tener una tapa hermtica y se deben colocaren una bolsa de plstic
o antes de llevar al laboratorio. La mezcla inadvertida de orina o de agua del i
nodoro con la muestra puede destruir los protozoos y trofozoitos, por lo que se
debe evitar. Tambin la contaminacin con
Tcnicas de concentracin
Se han descrito una variedad de tcnicas especiales para la concenlracin de parsitos
sanguneos, especialmente para leishmanias. tripanosomas y microfilarias. Los det
alles se pueden encontrar en otros textos (Ash, 1987; Beaver. 1984; Garcia, 1997
.1999: Isenberg. 1992; NCCLS, 2000). La preparacin de extensiones tamponadas, que
puede realizarse con los recursos existentes en la mayoria de los laboratorios,
es til para deteccin de Leishmania donovani, tripanosomas y microfilarias. Tras l
a centrifugacin de una muestra de sangre con anticoagulante, la capa de clulas que
queda entre el plasma y los eritrocitos es recogida y usada para preparar froti
s sanguneos para teir o para hacer una preparacin en fresco para detectar organismo
s mviles (Ash. 1987; Strickland. 2000). Para la deteccin de microfilarias, es til l
a concentracin de Knott o la filtracin de membrana, especialmente cuando la densid
ad de microfilarias en sangre perifrica es baja. En la tcnica de Knott, la sangre
anticoa-

I 200
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 55 -3 Fijadores de muestras fecales y tcnicas de examen Tcnica de examen Fij
adores Ninguno (heces Irescas) Formatina al 10% Fluido de Schaudinn Alcohol poli
vinilo (PVA)' P V A modificado' Mertiolato-yodo-formalina (MIF) Acetato sdico-lor
malina (SAF)
d j r e c
,
0
Concentraron Si Si No No" No' Si Si
p
e
r
m
a
n
e
n
t
e
Si Si No No No S S
Si No Si S Si No' S
la muestra, aunque algunos huevos (especialmente esquistosomas) pueden pasar al
torrente fecal en el colon descendente y el recto y distribuirse irregularmente,
como puede ocurrirle a los huevos de Taenia spp. Los trofozolos de los protozoos
pueden ser ms numerosos en la parte final de la deposicin y deberan ser buscados e
specficamente en la mucosidad (Smith, 1996).
Examen
microscpico
" Aunque las tcnicas de concentracin con PVA se ha descrito, no son totalmente usa
das debido al problema de reconocimiento de algunos organismos. ' El sulfato de
cobre o el sulfato de cinc sustituyen al cloruro de mercurio. Las extensiones pr
eservadas con MIF se deben teir con policromo IV.
:

Las muestras se deben examinar microscpicamente por examen directo de material fr

esco o conservado, por examen de los concentrados o con tincin permanente. Cada p
rocedimiento tiene sus ventajas e inconvenientes. La humidificacin de las heces f
rescas con suero salino permite la deteccin y observacin de trofozotos mviles de pro
tozoos y larvas de helmintos, El estudio de heces conservadas puede permitir la
deteccin de parsitos que no se concentren bien. Los procesos de concentracin son de
mayor rentabilidad para la deteccin de quistes de protozoos y huevos de helminto
s, as como de larvas, pero no es satisfactorio para la deteccin de trofozotos de pr
otozoos. Las tinciones son tiles para la deleccin y el examen morfolgico de los tro
fozotos de los protozoos y los quistes. Las circunstancias para llevar a cabo cad
a procedimiento dependen del tipo de muestra (formada, blanda, descompuesta, acu
osa). Generalmente, las muestras frescas blandas, descompuestas o acuosas deben
tener los tres procedimientos de manejo (Smith, 1996). Las muestras acuosas se d
eben concentrar por centrifugacin simple mejor que por flotacin o concentracin con
formalina-etil actico. El estudio directo se puede omitir si la muestra llega con
conservantes (NCCLS, 1997). Como mnimo, las muestras tomadas se deben estudiar p
or un proceso de concentracin, aunque se ha demostrado un gran rendimiento cuando
se emplea una tincin (Garca, 1979,1997). Estudio directo en fresco. El estudio di
recto es uno de los ms fciles de realizar entre los estudios parasitolgicos, aunque
la correcta interpretacin requiere un examen cuidadoso y gran experiencia en el
uso del microscopio. Es ms til cuando las muestras frescas se examinan para trofoz
otos mviles o larvas de helmintos (especialmente residuos lquidos o aspirados duode
nales). Una pequea cantidad de muestras se mezcla con una gota de suero salino al
0,85% y se cubre con un cubreobjetos. La preparacin ha de ser lo suficientemente
densa para permitir leer un peridico a su travs. El examen de la totalidad del po
rtaobjetos se ha de hacer sistemticamente con el objetivo de bajo aumento (10x),
con el diafragma del microscopio cerrado para aumentar el contraste. Los objetos
sospechosos y aqullos retrctiles, como los quistes de los protozoos, se deben exa
minar con el objetivo de gran aumento (40x). La deteccin del movimiento de amebas
de movimiento lento requiere un examen durante al menos 15 segundos. En ausenci
a de imgenes sospechosas, por lo menos se ha de examinar un tercio de la preparac
in con el objetivo de 40x. El uso del objetivo de aceite de inversin no se suele u
tilizar a menos que el cubreobjetos se haya sellado con esmalte de uas o vaspar (
una mezcla al 50:50 de jalea de petrleo y parafina). Se debe hacer una segunda pr
eparacin igual salvo que se aada una gota de yodo Lugol al 1:5, o una preparacin eq
uivalente, en vez del salino, El uso de yodo Lugol o yodo Gram produce la agrupa
cin del material, por lo que se desaconsejan. El yodo es til para incrementar la v
isibilidad de las estructuras nucleares en los quistes de protozoos y para la de
teccin de inclusiones de glucgeno. Entre sus limitaciones se incluye una prdida de
la motilidad de los trofozotos y de la refractilidad de los quistes, as como la di
ficultad para reconocer los cuerpos cromatoides. Tcnicas de concentracin. Las tcnic
as de concentracin, que se pueden realizar con material fresco conservado (Tabla
55-3), son ms sensibles que el estudio directo para detectar quistes de protozoos
y huevos de helmintos y sus larvas, debido a que disminuye el material de desec
ho en las preparaciones y, en la mayora de las ocasiones, se concentran los organ
ismos. Aunque se han descrito gran variedad de mtodos y modificaciones, algunos s
on tiles slo para parsitos especficos (Ash,
agua o tierra puede introducir accidentalmente organismos de vida libre que se p
ueden confundir con los parsitos. Hay equipos que contienen viales de conservacin
apropiados para el examen de extensiones teidas que estn disponibles en el mercado
a bajo precio. Se debe poner inmediatamente una parte de la muestra fresca en e
stos viales y mezclarlos completamente. Estos equipos son especialmente tiles par
a aquellos pacientes a los que es imposible extraer una muestra fresca en el pla
zo requerido o para los que han de recoger varias muestras en das consecutivos. C
on la tcnica de los dos viales, una parte se fija en tres porciones de formalina
tamponadas al 5%-10% y otra parte en otras tres porciones de alcohol polivinilo
fijador (PVA). Otros sistemas de conservacin disponibles son: mertiolato-yodo-for
malina (MIF) y acetato sdico-formalina (SAF) (Tabla 55-3). El SAF tiene la ventaj
a de que puede usarse para tinciones permanentes, para el estudio en fresco y pa

ra procedimientos de concentracin y adems no contiene mercurio, que s est presente e

n los fijadores de Schaudinn y PVA. Adems de ser venenoso, el mercurio puede pres
entar problemas de eliminacin en muchos estados. Sin embargo, la calidad de las t
inciones permanentes con el SAF no es tan buena como con los fijadores de Schaud
inn y del PVA. El PVA con base de sulfato de cinc y otros nuevos productos comer
ciales van ganando popularidad y su uso est indicado cuando los componentes con m
ercurio no se puedan utilizar (Garca. 1993, 1997: NCCLS, 1997). El examen de tres
muestras recogidas en das alternos es el mnimo necesario para realizar una adecua
da evaluacin E/P (NCCLS, 1997: Smith. 1996). Este procedimiento asegura un interv
alo ptimo de recogida de aquellos parsitos que poseen una eliminacin cclica, especia
lmente Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis. El uso de purgantes puede da
r una sensibilidad adicional para deteccin de parsitos como E. histolytica. El lab
oratorio debe ser avisado antes del comienzo de la purga para tener personal dis
ponible para el proceso. Las muestras han de recogerse en contenedores diferente
s y ser remitidas al laboratorio en pocos minutos. Se recomiendan purgantes como
el sulfato sdico o el fosfato sdico tamponado.
Examen
macroscpico
Se debe examinar de un modo general la consistencia de las heces (formadas, blan
das, acuosas, descompuestas) y si hay presencia de moco, sangre, larvas o gusano
s adultos y progltides. Los protozoos y trofozotos se encuentran fcilmente en muest
ras acuosas o descompuestas, mientras que los quistes predominan en las muestras
blandas o formadas. Los helmintos o sus huevos se pueden encontrar en cualquier
tipo de heces. La mayora de los parsitos se distribuyen de modo uniforme en

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1201

1987: Barnes, 1984; Garca, 1997, 1999; Melvin. 1982: NCCLS, 1997) Para el uso sis
temtico, se debe seleccionar un mtodo que permita la deteccin de quistes de protozo
os y huevos de helmintos. Los mtodos de concentracin se basan en los principios de
sedimentacin y flotacin. En la sedimentacin, los parsitos ms pesados emigran al fond
o debido a la gravedad o por centrifugacin. En la flotacin, los quistes y huevos ms
ligeros suben a la superficie de una solucin de alta densidad. Los dos procesos
de concentracin ms usados en los EE.UU. son las tcnicas de flotacin centrfuga con sul
fato de cinc (tcnica de Faust) y la sedimentacin con ter-formalina (tcnica de Ritchi
e o modificaciones). En la prctica, el etil actico ha sustituido al ter en el ltimo
mtodo debido al peligro de su uso y a unos resultados superpombles (Truant. 1981)
. La concentracin con formalina-etil actico es una tcnica de sedimentacin bsica que e
s eficiente en la recuperacin de la mayora de los quistes de protozoos, larvas y h
uevos de helmintos, incluyendo los huevos con oprculo, y tiene una moderada efect
ividad para los huevos de esquistosomas. Con esta tcnica se consigue menos distor
sin de los quistes que con la flotacin con sulfato de cinc. Sin embargo, los huevo
s de Hymenolepis nana se pueden perder y la concentracin de G. lamblia y de los q
uistes de lodamoeba btschlii puede ser defectuosa. Para una correcta concentracin
de ooquistes de coccidios y esporas de microsporidios se debe prestar atencin a l
a velocidad y tiempo recomendado de centrifugacin (Isenberg, 1992; NCCLS. 1997).
A pesar de estos problemas, la tcnica es comnmente empleada por su simplicidad y s
u disponibilidad en la mayora de los laboratorios. Con la tcnica de flotacin de sul
fato de cinc, la muestra fresca se procesa usando sulfato de cinc con una densid
ad especfica de 1,18, y la muestra lormalinizada se procesa con una solucin de una
densidad de 1.20. Los elementos parasitarios se recuperan de la capa superficia
l de la solucin Iras la centrifugacin. Esto produce una preparacin ms limpia que la
de formalina-etil actico, pero es intil para la deteccin de larvas de nematodos, hu
evos inlrtiles de Ascaris y huevos de la mayora de los tremtodos y de las tenias. T
ambin puede haber problemas con las muestras que contienen gran cantidad de grasa
s. El uso de material formalinizado en vez de fresco ayuda a limpiar los muestra
s y previene la apertura de los que oprculos y la distorsin de los parsitos (Bartle
tt, 1978). Tinciones permanentes. El uso de preparaciones teidas permite guardar
permanentemente las muestras y su revisin por distintos mdicos cuando aparezcan di
ficultades de identificacin. De todos los mtodos descritos para el estudio de las
muestras fecales, nicamente la tincin permanente es la diseada para el uso del obje
tivo de aceite de inversin (100x). La tincin es ms til para la deteccin de trofozotos
y quistes de protozoos, que pueden reconocerse cuando la preparacin en fresco y l
os concentrados sean negativos. Aunque no suele ser lil para la deteccin de huevos
o larvas de helmintos, las tinciones son ms sensibles para detectar inleccin por
protozoos y se recomienda su uso para todas las muestras remitidas para estudio
de O/P (NCCLS, 1997). Se han descrito una gran variedad de tcnicas de tincin y sus
modificaciones con todas sus ventajas y desventajas. La tincin de tncromo de Whe
atley y la tincin de hierro-hematoxilina son mtodos que permiten detectar amebas y
flagelados. Desafortunadamente, la deteccin de la mayora de las infecciones human
as por coccidios y microsporidios requieren tinciones especiales. Pueden aparece
r muchos problemas tcnicos a la hora de realizar la tincin. La mayora dependen del
tiempo transcurrido tras la toma de la muestra, de la extensin y de la fijacin, as
i como de la calidad de los reactivos. Se deben realizar controles positivos de
extensiones conocidas con cada batera de extensin. Esto es especialmente cierto pa
ra la realizacin de tinciones ms especificas para coccidios y microsporidios. Otro
s tintes menos comnmente usados, como la tincin policroma IV, usados con muestras
preservadas con MIF y la tincin de negro clorazol E para muestras en fresco no se
revisan aqu y los detalles se pueden encontrar en otros textos (Garca, 1997). Tin

cin de tricomo de Wheatley. En los EE.UU. la modificacin de Wheatley del mtodo de t

ricromo sigue teniendo gran aceptacin por su simplicidad, fiabilidad y su bajo coste. Los detalles de su realizacin se pueden enc
ontrar en muchos textos (Isenberg, 1992; Melvin, 1982: NCCLS, 1997; Price, 1994)
. Con tricromo se pueden teir muestras que se han lijado con el fijador de Schaud
inn o P V A o muestras conservadas con SAF o MIF, pero los resultados son menos
satisfactorios. Tincin de hierro-hematoxilina. Esta tcnica es mas difcil de llevar
a cabo que el tricromo. pero tiene mejores resultados debido a que incrementa la
definicin del ncleo y las caractersticas del citoplasma (Price, 1994). Una tincin m
odificada del hierro-hematoxilina que puede ser til es la que incorpora carbol-fu
csina, permitiendo la tincin de organismos cido resistentes, como Cryptosporidium.
Cyclospora e Isospora (NCCLS. 1997; Palmer. 1991). Las muestras fijadas con SAF
. Schaudinn y P V A pueden teirse con hierro-hematoxilina (tincin preferida para e
l SAF). Tinciones cido-resistentes modificadas. Los ooquistes de Cryptosporidium.
Cyclospora e Isospora son difciles de reconocer en extensiones teidas con tricrom
o o hierro-hematoxilina. pero se pueden detectar con la tcnica de tincin acido-res
istente. como la modificada Kinyoun. la modificada de cido-resistente dimetil-sul
fxido (DMSO) o la auramina-0 (Bronsdon, 1984; Current, 1991: Ma, 1983: NCCLS, 199
7). Las tinciones cido-resistentes son sensibles y eficientes para la deteccin de
estos protozoos, pero pierden especificidad. Se debe prestar especial atencin a l
os criterios morfolgicos cuando se usan estas tinciones y es obligatorio el uso d
e controles positivos Para aquellos laboratorios en los que Cryptosporidium se a
isla, rara vez se recomienda el uso de reactivos de alta especificidad y sensibi
lidad. Las muestras biliares, los esputos, las heces en fresco o fijadas con for
malina o SAF se deben teir con tinciones cido-resistentes. Tinciones para microspo
ridios. Los microsporidios (especficamente Enterocytozoon bieneusi y Encephalitoz
oon intestmalis. junto con un gran nmero de otras especies) se han implicado como
agentes comunes de procesos diarreicos, especialmente en inmunosuprimidos, aunq
ue su deteccin ha sido problemtica. Aunque la biopsia y la microscopa electrnica han
sido una clave de sus diagnsticos, se han descrito procedimientos de tincin para
ser llevados a cabo en el laboratorio. Una tincin del tricromo modificada con una
concentracin aumentada (diez veces) y 2F cromotropo con un incremento en el tiemp
o de tincin ha ganado aceptacin como estudio para la identificacin de esporas de mi
crosporidios (Weber, 1994). Las tcnicas de tincin fluorescente mediante el uso de
agentes blanqueantes pticos como el Uvitek-2B y el calcoflor blanco tambin son tiles
para el screening rpido y sensible de heces y otras muestras (DeGirolami. 1995:
Didier. 1995: Luna. 1995; van Gool. 1993). El pequeo tamao (1,5 pm-3 pm) de estos
organismos hace su deteccin difcil, y estos estudios no deberan realizarse sin una
adecuada comparacin con el control.
Tcnicas adicionales para el examen de parsitos entricos
Tcnica de papel de celofn para oxiuros. La hembra del oxiuro, Enterobius vermicula
ris. emigra desde el colon a la piel penanal, donde deposita sus tpicos huevos fe
cundados. Los huevos, y a veces los gusanos adultos, se pueden detectar por el e
xamen de un trozo de adhesivo de celofn o con los equipos comerciales de recolecc
in de pegado en la piel perianal. Los huevos o los adultos no suelen encontrarse
en las heces, por lo que se considera una muestra inapropiada para la deteccin de
este parsito. Las muestras se deben tomar por la noche, cuando los gusanos son a
ctivos, o a primera hora de la maana, antes de la ducha o de la deposicin. Se debe
n examinar vanas muestras de diferentes das antes de descartar infeccin. Estudio d
e los huevos. L a estimacin de la carga de gusanos es a veces necesaria para eval
uar la eficacia teraputica o la tasa de reinfeccin por nematodos intestinales (Asc
aris. Trichuris y uncinarias) y. ocasionalmente, esquistosomas. Los procedimient
os incluyen el mtodo de extensin

1202
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
directa de Beaver. recuento de huevos con la dilucin de Stoll, frolis grueso de K
ato y diversas modificaciones (Ash. 1984; Beaver. 1984: Garca, 1997). Hay grandes
variaciones en los resultados con estos estudios, y la significacin clnica del ni
vel de recuento de huevos varia segn la especie infectante, la edad de la persona
y el estado nutricional (Beaver, 1984). Los mtodos de incubacin de huevos se usan
para detectar la presencia de esquistosomiasis en infecciones leves y para dete
rminar su viabilidad. Los huevos fecundados de esquistosomas contienen un miraci
dio que se incuba en varias horas tras ser colocados en agua sin cloro. En la prc
tica, la orina o las heces se mezclan con diez partes de agua y se colocan en un
matraz de Erlenmeyer. La parte superior del vaso se tapa con papel de plata y s
e coloca bajo una lmpara de mesa. Los miracidia incubados son muy fototrpicos y se
acumulan cerca de la luz. Los huevos, si los hay. pueden ser examinados por su
viabilidad, mediante el estudio de los movimientos ciliares dentro de las clulas
llama (excretoras). Cultivo de nematodos y tcnicas de deteccin. Se usan muchas tcni
cas de cultivo (coprocullivos) para la deteccin e identificacin de los distintos n
ematodos infectantes, entre los que se cuentan el cultivo con filtro de papel Ha
rada-Mori, el cultivo en filtro de papel inclinado y el cultivo en carbn vegetal
(Ash, 1984; Beaver 1984: Garcia, 1997). La diferenciacin entre lombrices y tricos
trongiles segn la morfologa de los huevos es difcil, mientras que la larva en fase
infectiva es mas fcilmente identificable. Tales tcnicas de cultivo pueden tambin se
r tiles para la deteccin de larvas de Strongyloides. que pueden estar en escaso nme
ro, y para diferenciarlas de las lombrices uncinarias. Con todos los mtodos de cu
ltivo, las heces son incubadas en un ambiente hmedo que permite lograr la incubac
in de los huevos. En las tcnicas de arada-Mori y del filtro de papel inclinado, la
s larvas emigran desde las heces a la fase acuosa, donde se pueden detectar con
ms facilidad. En el cultivo del carbn vegetal las larvas migran primero a una gasa
hmeda que se coloca en agua, permitiendo su colonizacin. La tcnica de Baermann es
una tcnica sensible y fiable para la deleccin de Strongyloides y otras larvas de n
ematodos a partir de muestras fecales. En esta tcnica, las heces se colocan en va
rias capas de gasas en la parte superior de una pantalla de alambre que se suspe
nde en un embudo. El extremo del embudo est cerrado con una abrazadera y se aade a
gua hasta el nivel de la gasa. Las larvas emigran activamente a travs de
las gasas y se depositan en la base del embudo, donde se pueden recoger para su
examen. La recuperacin de larvas puede ser superior a la tcnica de cultivo, ya que
examina una gran cantidad de heces. En las infecciones latentes por Strongyloid
es. en las que hay pocas larvas, pueden requerirse varios exmenes a lo largo de u
na semana para demostrar la infeccin (Ash. 1987).
Objetos semejantes a parsitos entricos
Hay una gran variedad de objetos que pueden parecerse a diferentes parsitos y que
se pueden ver en las heces y en otras muestras enviadas para examen. Es necesar
ia una cuidadosa diferenciacin de estos objetos para evitar un innecesario o inad
ecuado tratamiento. Los leucocitos, los macrfagos y las clulas epiteliales, escamo
sas y columnares s e pueden asemejar a las amebas; la levadura y los granulos de
fcula pueden parecerse a quistes de protozoos; las conidias fngicas y plenes puede
n confundirse con huevos helmintos: las fibras o la piel de las plantas pueden s
imular larvas de nematodos, y los trozos de vegetales parecerse a gusanos adulto
s o progltides. (Tabla 55-4). Los ejemplos de artefactos y seudoparsitos se pueden
revisar en otros textos (Ash, 1997; Garcia. 1997; Isenberg, 1992; NCCLS, 1997).
Examen de muestras urogenitales y otras muestras (esputos, aspirados y biopsias)

Los productos vaginales y uretrales, secreciones prostticas u orina se pueden rem

itir a laboratorio para la deteccin de Trichomonas vaginalis. El mtodo ms rpido y ef
ectivo es la preparacin de varias extensiones con una gota de muestra (se debe ce
ntrifugar la orina) diluida con una gota de suero salino y cubriendo con un cubr
eobjetos. Se examina con un objetivo de bajo aumento (10x) en condiciones de poc
a luz para ver los trofozotos mviles, que poseen un movimiento espasmdico. Los exmen
es con gran aumento pueden revelar el movimiento de los flagelos y las caracterst
icas ondulantes de las membranas. El uso de cultivo, anticuerpos fluorescentes,
o tcnicas de cido desoxirribonucleico (ADN) aumenta la sensibilidad si es necesari
o (Briselden, 1994). Se precisan cultivos de los organismos para demostrar las r
esistencias a los frmacos imidazlicos (Meri, 2000). En el esputo se pueden hallar
un gran nmero de protozoos y helmintos, y la tcnica a usar depende del organismo s
ospechado. Generalmente la tcnica requerida para detectar un parsito en su sitio h
abitual se aplica al esputo. Cuando se sospechan amebas, se deben hacer tincione
s permanentes. Son apropiadas las tinciones cido-resistentes o anticuerpos especfi
cos para Cryptosporidium. mientras que las tinciones tricromo o lluorocromo se d
eben emplear para detectar esporas de microsporidios. Las tcnicas de identificacin
para Pneumocystis carinii se describen en otro apartado. Para el examen de aspi
rados se necesita el empleo de las tinciones adecuadas para el germen implicado.
Adems de los mtodos utilizados para espulo, la tincin de Giemsa es habitualmente a
propiada para el examen de protozoos, especialmente los hemoflagelados. Los biop
sias se deben remitir para estudio histolgico tras haberse hecho extensiones y tr
as ser preparadas para la tincin con Giemsa u otros tintes permanentes. El cultiv
o para leishmanias y tripanosomas tambin puede hacerse en tejidos y puede ser imp
ortante para demostrar estas infecciones. Las biopsias cutneas mandadas para Onch
ocerca o Mansonella deben separarse en salino y ser examinadas a los 30 y 60 min
utos para microfilarias. La biopsia muscular para las larvas de Trichmella spira
lis se debe examinar mediante la colocacin de las muestras frescas en dos portas
de cristal o para estudio histolgico habitual. Las biopsias de recto o vejiga se
pueden examinar para buscar huevos de esquistosomas.
Tabla 55-4
O b j e t o s e n c o n t r a d o s e n las m u e s t r a s fecales q u e p u e
d e simular parsitos entricos Semejanza Quisles de Entamoeba histolytica Trofozoil
os de Entamoeba histolytica Trofozoilos de amebas Trofozolos de amebas Quistes de
protozoos (especialmente Endolimax nana) Huevos de helmintos Huevos de helminto
s Quistes de protozoos, huevos de helmintos Larvas nematodos Huevos de helmintos
(Ascaris o huevos de tenia) Huevos de helmintos Quistes de protozoos
Tipo de artefacto Neutrfilos Macrfagos Clulas del epitelio columnar Clulas del epite
lio escamoso Levaduras Conidias do hongos Esporas de champin Clulas de plantas Hebr
as de plantas Polen Ditomos Granulos do fcula, gotas de grasa, burbujas de aire, m
oco Huevos de caros ingeridos Huevos ingeridos de nematodos de las plantas Larvas
ingeridas de nematodos de las plantas
Huevos de helmintos Huevos de helmintos Larvas de nematodos
Tcnicas de cultivo parasitario
Se han descrito mtodos de cultivo para una gran variedad de protozoos, pero pocos
laboratorios qumicos se toman el esfuerzo debido a su
Adaptada de Isenberg HE (ed): Clinical Microbiology Procedures Handbcok. vols t
y 2. Washington. DC. American Society for Microbkxgy, 1992

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1203
Tabla 55-5
P r u e b a s de anticuerpos, antigenos y A D N para el diagnstico de e n f e r m
e d a d e s parasitarias* Mtodos serolgicos Mtodo de deteccin de antigenos o A D N
EIA
Enfermedad parasitaria Protozoos Amebiasis Babesiasis Enfermedad de Chagas Cript
osporidosis Giardiasis Leishmaniasis Malaria Toxoplasmosis Trichomoniasis Helmin
tos Triquinisosis Toxocariasis Estrongiloidiasis Filariasis Cisticercosis Equino
cocosis Esquistosomiasis Paragonimiasis
DD, EIA, IHA IFA CF, EIA, IFA, IHA
mosis o la toxocariasis no se pueden diagnosticar fcilmente por criterios morfolgi
cos, y los estudios invasivos no se recomiendan en primera medida. Las diarias,
los esquistosomas y Strongyloses pueden permanecer subclinicas debido a infeccio
nes leves o al estadio de la latencia clnica. En esas circunstancias, la evaluacin
serologica puede resultar til, especialmente en individuos que han viajado a zon
as endmicas sin residir en ellas. Ya que los test serolgicos se piden rara vez, la
s muestras se remiten a laboratorios de referencia (centros para el control y pr
evencin de enfermedades [CDC]). Algunos de los tesl ms comnmente usados pueden esta
r disponibles en centros locales, entre los que se incluyen toxoplasmosis, amebi
asis y triquinosis. Los criterios de interpretacin vienen establecidos por los fa
bricantes, y los reactivos pueden variar en los diterentes centros. Las peticion
es individuales de estos test deben cuestionarse acerca de las caractersticas de
realizacin, incluyendo sensibilidad y especificidad, y deben estar sobre aviso de
que pueden producirse reacciones cruzadas. Adems, las serologas de las enfermedad
es parasitarias no diferencian entre infeccin activa e infeccin pasada, punto impo
dante cuando se estudia a alguien que ha residido en reas endmicas. Hay mtodos de d
eteccin antgena disponibles para muchas enfermedades parasitarias que incluyen ame
biasis, criptosporidiosis, giardiasis, malaria, y tricomoniasis (Tabla 55-5) y p
ueden ser tiles en aquellos casos en que los test tradicionales son negativos y p
ersiste una alta sospecha clnica Estos estudios tienen la ventaja de detectar la
infeccin actual y pueden ser realizados por personas sin demasiada experiencia (W
ilson, 1995).
EIA. DFA. IFA EIA. DFA, IFA CF IFA IFA EIA. IFA, IHA IC DFA. IP EIA, DFA. prueba
de ADN
EIA. BF, IHA EIA EIA IHA EIA, IHA EIA, IHA. IB IHA. IEP. DD (arcS), IB EIA. IB E
IA. IB
" Equipos disponibles en comercios o en laboratorios de referencia o de salud
publica. BF lloculacion do benlonila. CF fijacin de complemento. DA aglutinacin di
recta; DD difusin doble: DFA: anticuerpos de fluorescencia directa; EIA: enziomoi
nmunoensayo; IB mmunoblotl, IC inmunocaplura: IHA hemaglutinacion indirecta; IFA
: anticuerpos de fluorescencia indirecta, IP inmunoperoxidasa: IEP: inmunoeleclr
oloresis Adaptada de Wilson M, y Schantz P. Pieniazek, N Diagnosis ol parasitic
infections: Inmunologic and molecular methods En Murray PR. Barron EJ. Pfaller y
cois (eds ) Manual of Clinical Microbiology, 6 ' ed Washington, DC. ASM Press.
MA. 1995. p 1.159.

Mtodos de diagnstico molecular

El uso de mtodos diagnsticos mediante la amplificacin de ADN y cidos nucleicos se ha
descrito para la mayora de las enfermedades parasitarias ms frecuentes y tiene un
a gran sensibilidad y especificidad (Persing, 1993; Weiss, 1995; Wilson, 1995).
Sin embargo, la mayoria de estas tcnicas han permanecido para un uso de investiga
cin y no estn disponibles para uso habitual (Bendall. 1993). Como dato, el equipo
y otros materiales necesarios, incluido el personal entrenado en biologa molecula
r, han permanecido fuera del alcance de la mayora de los laboratorios de diagnstic
o debido a limitaciones fiscales. Aunque hay gran variedad de equipos disponible
s para el diagnstico de bacterias y virus, slo un equipo ha recibido la aprobacin p
ara un parsito como es Trychomonas vaginalis (Briselden. 1994). Los mtodos molecul
ares pueden tener una gran importancia en la identificacin de los vectores de los
parsitos y contribuir a la prevencin mediante programas de control contra dichos
vectores (Weiss. 1995).
escaso empleo y a la pobre familiaridad con dichos mtodos. Cuando se hace una pet
icin de cultivo suele ser para Trichomonas vaginalis. Leishmania spp., Trypanosom
a cruzy, Enlamoeba histolytica. Acanlhamoeba spp o Naeglena lowlen. Adems, ocasio
nalmente se pide a los laboratorios cultivos para Toxoplasma gondii. Una revisin
de los mtodos se puede encontrar en otros textos (Ash. 1987; Fritsche, 1989a: Gar
cia. 1997: Isenberg. 1992; Murray. 1999: NCCLS. 1997).
Mtodos de inmunodiagnstico Control de calidad, de mejora y seguridad
Los mtodos de inmunodiagnstico para la deteccin de anticuerpos o antigenos en las e
nfermedades parasitarias son muchos, pero tienen gran variabilidad de sensibilid
ad y especificidad, as como de disponibilidad. El tema est ms all del propsito de est
e captulo, pero se puede encontrar una revisin asequible (Wilson, 1995). Los test
disponibles para uso sanitario, hospitalario o comercial se resumen en la Tabla
55-5. Histricamente, los procedimientos serolgicos para enfermedades parasitarias
eran desestimados por su baja sensibilidad y especificidad, debido principalment
e a la compleja naturaleza antignica de los parsitos y la posibilidad de reaccione
s cruzadas entre las especies descritas. La introduccin de nuevos test, combinado
s con el uso de componentes altamente antignicos. est dando mejores resultados con
grandes valores predictivos. La mayora de los nuevos test utilizan el enzimoinmu
noensayo (EIA) o el inmunoblot (Western blot), aunque an son populares la inmunof
luorescencia indirecta (IFA), la hemaglutinacin indirecta (IHA). la fijacin de com
plemento (CF) y la lloculacion de bentonita (BF). El uso de test serolgicos en el
diagnstico de enfermedades parasitarias es un suplemento a los mtodos habituales
de diagnstico que intentan detectar el parsito de un modo directo en las heces, la
sangre, los tejidos o los Huidos corporales. Ciertas infecciones como la toxopl
asEl programa de segundad para la seccin de parasitologa del laboratorio es semeja
nte al de otras secciones del laboratorio, cubriendo todos los aspectos esencial
es del trabajo, incluidos, entre otros, un manual del proceso completo que debe
ser revisado anualmente, guias de mantenimiento de todas las muestras y de recog
ida de datos, as como de los resultados, programa completo de control de calidad
con la apropiada supervisin tcnica y revisin, y la participacin en programas de comp
etencia. Los laboratorios tambin necesitan centrarse en la satisfaccin del cliente
, mediante la participacin en el equipo de trabajo con cuestionarios de opinin, en
la identificacin de problemas y en la generacin de soluciones para la mejora de c
alidad. Para el rendimiento de la seccin de parasitologa, se deben monitorizar per
idicamente muestras desconocidas, tanto internas como extemas, y se debe actualiz
ar la competencia, especialmente en aquellos laboratorios con escaso volumen de
muestras. Debe existir un material de referencia disponible para el uso del labo
ratorio que incluya muestras positivas, atlas impresos y atlas de preparaciones.
Se deben considerar potencialmente infecciosas las muestras sin preservar. Toda
la sangre y fluidos corporales se deben manejar de acuerdo

1204
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
con las normas universales de precaucin realizadas por la administracin de salud y
seguridad laboral (Federal Register, 1991). Adems de los virus de transmisin sang
unea, los parsitos de la malaria y los hemoflagelados tambin pueden ser infecciosos
. Una gran cantidad de parsitos pueden seguir siendo infectivos en muestras de he
ces frescas, como los quistes de protozoos entricos, los huevos de Taenia sotium.
Enterobius vermiculars H. nana, y las larvas de Strongyloides stercoralis. Trich
uris trichiura, Ascaris lumbricoides y las uncinadas pueden persistir infectivas
en muestras antiguas, y los huevos de Ascaris pueden sobrevivir en formalina al
5%. Las muestras fecales tambin pueden contener patgenos como Salmoneiia, Shigell
a o virus, Es esencial una observacin cuidadosa del manejo de las muestras. Tambin
es necesaria una especial atencin al lavado de las manos. En uso de etil actico e
n vez de ter en las tcnicas de concentracin es recomendable para evitar la posibili
dad de explosin (Truant, 1981).
zontes y merozotos (Fig. 55-1). En el torrente sanguneo algunos merozotos se difere
ncian en gametocitos (gametogonias), que. cuando son digeridos por un mosquito h
embra de Anopheles, maduran a microgametos masculinos y macrogametos femeninos.
La lusin de un microgameto y un macrogameto da lugar a un oocineto mvil que emigra
a travs de la pared de estmago y forma un ooquiste. Dentro del ooquiste se forman
numerosos esporozotos mviles. La ruptura del ooquiste maduro en la cavidad corpor
al libera esporozotos que emigran a travs de los tejidos de las glndulas salivares,
desde donde pasan a huspedes vertebrados cuando el mosquito se alimenta. El tiem
po requerido para el desarrollo en el mosquito es de 8-21 das. Los esporozotos en
los vertebrados alcanzan las clulas hepticas en pocos minutos e inician una fase d
e proliferacin conocida como esquzogonia exoeritrocitaria. La liberacin de merozotos
tras la ruptura de los esquizontes hepticos o la ruptura de esquizogonias eritro
citaras produce la infeccin del torrente circulatorio, causando la clnica de la mal
aria. P. vivax y P. ovlese diferencian de P. lalciparum y de P. malariae en que l
as recadas por especies antiguas pueden producirse semanas o meses despus tras el
primer brote. Esto es consecuencia de la renovacin de las esquizogonias exoeritro
cilarias, y a veces eritrocitaras. a partir de esporozotos hepticos latentes que se
conocen como hipnozoitos (Krotoski, 1982). Las recurrencias debidas a P. lalcip
arum o P. malariae, llamadas recrudescencias, se deben a un incremento en el nmer
o de formas sanguneas hasta niveles clnicamente detectable, no a formas hepticas pe
rsistentes. Los hepatocitos se infectan slo por esporozotos a travs del mosquito, d
e este modo la infeccin por P. vivax o P. ovale adquiridas por transfusin no recid
ivan. Los merozotos liberados de los hepatocitos afectados infectan a los eritroc
itos. La consiguiente amplificacin del parsito en el torrente sanguneo durante un t
iempo y su aparicin sincrnica desata las crisis de malaria. Los parsitos de P. viva
x y P. ovale infectan a los eritrocitos jvenes, mientras que P. malariae infecta
a los viejos y P. falciparum a los eritrocitos de cualquier edad. Los estadios m
orfolgicos observados en los eritrocitos incluyen trofozoitos (formas en crecimie
nto), esquizontes (formas en divisin) y gametocitos (formas sexuales) (Lminas 55-1
a 55-4). Los trofozotos ms jvenes tienen un contorno globuloso o con una vacuola c
entral, una masa de cromatina roja y un citoplasma azul. En frotis teidos, los tr
ofozotos se asemejan a anillos de sello y se describen como anillos o con forma a
nular. Los trofozotos en crecimiento tras la fase de anillo mantienen una nica mas
a de cromatina, pero tienen un citoplasma abundante que puede ser compacto o ame
boide (irregular). Los trofozotos maduros an poseen una nica m a s a de cromatina y
un grandsimo citoplasma que rellena parcialmente el eritrocito. El pigmento hemo
zona (hematina), un derivado de la hemoglobina, e s caracterstico de todos los eri
trocitos que contienen formas maduras de la malaria, pero no se detecta en las f

ormas anulares. Los esquizontes inmaduros tienen dos o ms masas de cromatina y un

citoplasma sin dividir, mientras que los maduros poseen tanto el citoplasma com
o la cromatina divididos, de tal modo que los merozotos son evidentes. Los esquiz
ontes maduros rompen el eritrocito, liberando merozotos e iniciando un nuevo cicl
o de infeccin. El ciclo eritrocitario se realiza en 48 horas aproximadamente (per
iodicidad terciana) para P. falciparum. P. ovale y P. vivax, y en 72 horas (peri
odicidad cuartana) para P. malariae. En algunos momentos de la infeccin una subpo
blacin de merozotos se transforma en gametocitos. Los de P. vivax, P. malariae y P
. ovale son redondeados, mientras que los de P. falciparum son alargados (forma
de salchichas). Caractersticamente, los macrogametocitos (femeninos) poseen una m
asa compacta de cromatina, mientras que los microgametocitos (masculinos) la tie
nen ms dispersa. Los gametocitos en desarrollo son ms compactos que los trofozotos
en crecimiento. Epidemiologa. L a transmisin endmica de la malaria requiere un rese
rvorio, un mosquito vector y un husped susceptible. El control de la malaria se d
irige a la eliminacin del mosquito, al tratamiento de los casos activos y a la pr
ofilaxis de personas susceptibles. Sin embargo, la aparicin de resistencias a los
insecticidas por parte de los mosquitos y de la resistencia al tratamiento y pr
ofilaxis por parte de P. falciparum. y recientemente por P. vivax (Murphy, 1993)
, y la falta de recursos hacen difcil el control en muchas zonas.
PROTOZOOS SANGUNEOS Y TISULARES Malaria
La malaria (del italiano malaria, que significa mal aire) es una infeccin aguda y
a veces crnica del torrente sanguneo que se caracteriza por fiebre, anemia y espl
enomegalia, y es provocada por parsitos apicomplejos del gnero Piasmodium. Los hal
lazgos clnicos defimloros de un ataque de malaria consisten en escalofros, fiebre (
mayor de 40 C), diaforesis generalizada, seguidos por el cese de la fiebre. Las
crisis se producen cada 610 horas y se desatan por la ruptura sincrnica de eritro
citos, de los que se libera una nueva forma infecciosa conocida como merozoito.
La enfermedad se produce generalmente entre los 45" norte y 40 sur de latitud (WH
O, 1987) y se transmite nicamente por mosquitos Anopheles hembra. Las cuatro espe
cies de Piasmodium que producen la malaria humana son P. vivax. P. lalciparum. P
. malariae y P. ovale. La infeccin por P. falciparum se da principalmente en zona
s tropicales de todo el mundo, mientras que las infecciones por P. vivax se prod
ucen tanto en zonas tropicales como templadas. P. malariae tambin se da en todo e
l mundo, pero mucho menos extendido que P. lalciparum o P. vivax. P. ovale es el
menos frecuente de la malaria, siendo la mayora de los casos en el oeste de frica
, India y Sudamrica.
1
Dado que la infeccin de la malaria es potencialmente tratable, se debe considerar
en el diagnstico diferencial de la fiebre de origen desconocido y en historia de
viajes a zonas endmicas. En una era de creciente empleo de los viajes por todo e
l mundo, el riesgo de contraer malaria no es insignificante, y la rpida extensin d
e las resistencias a los frmacos se debe considerar a la hora de valorar una prof
ilaxis o un tratamiento. La evaluacin del laboratorio ante la sospecha de la mala
ria sigue basndose en el examen de los frotis grueso y fino de la sangre, para ob
jetivar los parsitos intraeritrocitarios. Aunque su aproximacin diagnstica es senci
lla, la realizacin de estas tcnicas puede ser problemtica. La identificacin de este
organismo requiere un entrenamiento continuo para mantener la experiencia, por l
o que los laboratorios que no suelen ver muchos casos pueden optar por mandar la
s muestras a laboratorios de referencia. Otros mtodos ms avanzados de laboratorio,
incluidas la tincin naranjaacridna (vase Mtodos de laboratorio) o la deteccin del AD
N especfico (Lanar, 1989; Persing. 1993; Weiss, 1995), dan una mayor sensibilidad
y especificidad pero no suelen estar disponibles en laboratorios pequeos. El rec
iente desarrollo de los ensayos inmunolgicos para la deteccin de lactato deshidrog
enasa especfica de Piasmodium parece dar una alta sensibilidad y especificidad en
el diagnstico de la malaria. Uno de estos test, realizado con una tira de reacti
vo, es especialmente prometedor en aquellas situaciones donde la facilidad de la
realizacin de los estudios es crtica y hay escasez de medios (Piper, 1999; Palmer
. 1998). Ciclo vital. Los parsitos de la malaria tienen una fase sexual (esporogo

nia) en el mosquito Anopheles. que produce esporozotos infecciosos, y un estado a

sexual (esquzogonia) en los humanos que deriva en esqui-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1205
Figura 55-1. Ciclo de vida del parsito de la malaria (Cortesa del CDC. Parasitolog
y Training Branch. Atlanta. GA.)
Los negros con anemia falcilorme son menos susceptibles a la malaria por P. falc
iparvm. y las personas que carecen del grupo sanguneo Duffy estn protegidas contra
la infeccin por P. vivax (Miller. 1976). El dficit de glucosae-fosfato deshidroge
nasa (G6PD) se ha asociado a una proteccin contra la malaria, pero la evidencia e
st menos demostrada que con las otras anomalas hereditarias. La malaria secundaria
a transfusin puede producirse cuando el donante padece una malaria subclnica. y p
uede resultar mortal para el receptor. Del mismo modo, puede darse una malaria c
ongnita en nios nacidos de madres de zonas endmicas. Los nios la adquieren durante e
l nacimiento a causa de la rotura de los vasos placenlarios en una transfusin mal
erno-fetal. Ni en
la malaria congnita ni en la secundaria a transfusin se esperaba que existieran re
cadas, ya que no se forman esquizogonias exoeritrocitarias El nmero de casos de ma
laria en EE.UU. aument de 151 en 1970 a 1.838 en 1980, pero descendi a 1.411 en 19
93 (CDC. 1988,1993). Las especies causantes de la infeccin en 1987 fueron P. viva
x (44%), P. falctparum (43%), P. malariae (4%). P. ovale (3%) y un 6% indetermin
ado. El intervalo entre la llegada a EE.UU. y el desarrollo de la enfermedad fue
menos de un mes para el 25% de los casos de P vivax y del 80% de los casos por
P. lalciparum. Slo un 3% de los pacientes desarrollaban la enfermedad tras un ao.
Los ciudadanos de EE.UU. adquirieron la infeccin en frica (63%), Asia (18%). hemis
ferio occidental (14%) Oceana (4%).

1206
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Enfermedad clnica. La mayora de los pacientes con infeccin por P. lalciparum desarr
oll los sntomas en menos de un mes tras la exposicin, mientras que esto poda ser may
or de seis meses con otras especies de Plasmodium. Los sntomas comunes de malaria
incluyen escalofros y fiebre, que suele asociarse a esplenomegalia. En los estad
ios precoces, los episodios febriles son irregulares, pero luego se van haciendo
ms sincrnicos, tomando la periodicidad terciana (P. vivax. P. falciparum y P. ova
le) o cuartana (P. malaria). Los pacientes pueden tener anemia y otras manifesta
ciones como diarrea, dolor abdominal, cefalea y mialgias. La malaria por P. falc
iparum puede producir mucha parasitemia (50%). llegando a producir hemolisis gra
ve, hemoglobinuria y gran anemia. Los eritrocitos infectados por trofozotos en cr
ecimiento y esquizontes de P. falciparum tienden a ser secuestrados en capilares
, pudiendo llegar a ocluirlos, causando clnica asociada y anoxia tisular. La afec
tacin cerebral se conoce como malaria cerebral, produciendo desorientacin, delirio
, coma y. frecuentemente, la muerte. En las infecciones graves por P. falciparum
las transfusiones pueden salvar la vida (Nielson. 1979; Organizacin Mundial de l
a Salud [OMS], 1987). La evolucin de la malaria sin tratamiento depende de la esp
ecie causal. La mayoria de los casos fatales se deben a P. falciparum. En los re
stantes casos, las crisis febriles pueden ir siendo progresivamente menos graves
y desaparecer gradualmente. Los pacientes con infeccin por P. vivax o P. ovale p
ueden sufrir recada tras meses o incluso tras aos. Los pacientes con infeccin por P
falciparum y P. malariae pueden tener perodos asintomticos y sufrir recada debido
a la presencia de parasitemia de bajo grado. Las recadas y reagudizaciones se pue
den asociar con cambios en la inmunidad del husped o con cambios antgnicos en los p
arsitos. Las extensiones perifricas pueden mostrar leucocitos con pigmento malrico.
Un aumento del nmero de reticulocitos se debe al rpido recambio eritrocitario. Se
puede detectar la presencia de grandes plaquetas alargadas en la sangre perifric
a debido a un rpido recambio, secundario a un secuestro esplnico, La infeccin por m
alaria puede interferir con otros test serolgicos, produciendo falsos positivos,
especialmente con los de la sfilis. El tratamiento y profilaxis de la malaria pue
de ser difcil debido a aparicin de resistencias a la cloroquina por P lalciparum.
as como otros antipaldicos, y a la menos extendida resistencia a la cloroquina por
P. vivax. Tambin, personas que han adquirido P. vivax o P. ovale, o que han pasa
do mucho tiempo en zonas muy endmicas para estos parsitos, requieren tratamiento c
on primaquna para erradicar los hipnozotos y prevenir as las recadas. El uso de prim
aquna puede ser peligroso en los dficit de G6PD y se debe realizar un screening pr
evio antes de empezar el tratamiento. Diagnstico. Se debe incluir a la malaria en
el diagnstico diferencial de fiebre en pacientes que han viajado o residen en zo
nas endmicas, drogadictos o gente que ha recibido transfusiones. El diagnstico sue
le hacerse por la deteccin de parsitos en frotis de sangre finos y gruesos. Las mu
estras de sangre se deben tomar preferiblemente justo antes del pico febril o tr
as el pico febril. A veces es necesaria la toma de muestras separadas varias hor
as para detectar la infeccin e incluso la especie, ya que el nmero y fase de los p
arsitos varan segn el ciclo. Un cuidadoso examen de los frotis gruesos revelara la p
resencia de parsitos en casi todos los pacientes con clnica de malaria. La identif
icacin de parsitos de la malaria en los frotis finos requiere un abordaje sistemtic
o. Hay tres factores principales a tener en cuenta: la aparicin de eritrocitos in
fectados, la aparicin de parsitos y los estadios hallados. En la Tabla 55-6 se res
umen las caractersticas diagnsticas de las especies que se ilustran en las Lminas 5
5-1 a 55-4. Los eritrocitos infectados por P vivax o P ovale suelen estar aument
ados de tamao en comparacin con los que les rodean, mientras que los parsitos P. ma
lariae y P. falciparum suelen encontrarse en eritrocitos de un tamao normal. Ms de
l 20% de los eritrocitos con P. ovale pueden ser ovales o con fimbrias (proyecci

ones irregulares en los mrgenes de la clula), mientras que menos del 6% de los eri
trocitos infectados por P vivax son ovales. Pueden verse numerosos granulos rosa
s uniformes dentro del eritrocito (granulos
de Schffner) en las clulas infectados con P vivax y P. ovale, aunque pueden no ser
evidentes en las clulas infectadas con formas tempranas o en extensiones que no
se han teido al pH apropiado (vase previamente en Mtodos de laboratorio). La presen
cia de granulos de Schffner es til, ya que no se ven en P malariae y P falciparum.
Mientras los trofozotos crecen en las clulas infectadas, la cantidad de hemoglobi
na en el eritrocito disminuye y se acumula pigmento de hemozona. La cantidad y as
pecto del pigmento varan segn la especie. Las formas anulares de todos los parsitos
pueden ser similares si solo se encuentran formas anulares, impidiendo diferenc
iar las especies. Los anillos jvenes de P. falciparum son ms pequeos que los de las
otras especies (un sexto del dimetro de la clula roja, en comparacin con un tercio
del dimetro de la clula roja de las otras especies). Los anillos de P. falciparum
que han crecido son similares en tamao a los de oirs especies. Los trofozotos que
yacen en la superficie del eritrocito o que protruyen se denominan formas apliqu
o accol. y se ven ms frecuentemente en infecciones por P. falciparum. La presencia
de clulas doblemente infectadas y doble punteado de cromatina en los trofozotos e
n anillo es ms frecuente en P falciparum. pero puede producirse en las dems especi
es. Los trofozotos en crecimiento de P vivax tienen una forma irregular y se deno
minan ameboideas. Los de P. malariae y P. ovale permanecen compactos. Los trofoz
otos y esquizontes maduros de P. falciparum suelen ser secuestrados en el lecho c
apilar por adherencia a las clulas endoteliales. por lo que no se ven en sangre p
erifrica excepto en infecciones graves. Cuando se detectan esquizontes en la sang
re perifrica, la determinacin del nmero de merozotos puede ser til para dilerenciar l
as especies. Los gametocitos de P. falciparum son fcilmente identificables por su
forma caracterstica en salchicha. Los gametocitos de P. vivax, P. malariae y P.
ovale son similares y difciles diferenciar, aunque las caractersticas de la clula r
oja infectada pueden ayudar. La variedad de los estadios en la sangre penfrica pu
ede ser til. En la deteccin de infecciones por P. falciparum predominan las formas
en anillo, y el hallazgo de numerosas formas en anillo sin otras formas maduras
es u n a evidencia de infeccin por P falciparum. En las infecciones por P. vivax
. P. malariae y P ovale se encuentran diferentes estadios de parsitos con algn pre
dominio, dependiendo de la fase del ciclo. Para la deteccin de la malaria se pref
ieren frotis gruesos, ya que se examina mayor cantidad de sangre (vase previament
e en Mtodos laboratorio). Las formas en anillo suelen tener la apariencia de sign
os de puntuacin ms que de anillos completos, y debe buscarse la presencia de croma
tina roja y citoplasma azul para identificarlos como parsitos. Los granulos de Sc
hffner pueden ser tiles para la identificacin y se deben reconocer alrededor de los
trofozotos en crecimiento como un halo rosa. El carcter ameboide de los trofozotos
de P vivax no es tan evidente en los frotis gruesos, pero es til el nmero de mero
zotos en los esquizontes maduros. Los macro y microgametocitos pueden no ser dife
renciabas. La forma distintiva en salchicha de los gametocitos de P falciparum e
s an evidente, sin embargo puede ser ms estirado que en los frotis finos. Los game
tocitos de otras especies se pueden detectar y diferenciar fcilmente de los ncleos
celulares por la presencia de pigmento de hemozoina de refraccin. Pueden producr
ise infeccin m i x t a (en aproximadamente el 5 % de las veces), pero se debe ser
prudente a la hora de hacer el diagnstico, a menos que exista evidencia de dos p
oblaciones claramente separadas de parsitos. La mezcla ms comn es la infeccin por P
falciparum y P. vivax. El hallazgo de gametocitos de P falciparum en una persona
claramente infectada con P. vivax es diagnstico. Hay mltiples artefactos que pued
en simular parsitos en el frotis. Los ms frecuentes en los frotis finos son las pl
aquetas superpuestas a los glbulos rojos. Estas plaquetas se pueden identificar fc
ilmente porque no tienen una autntica forman anillo y no muestran diferencia de l
a cromatina y de citoplasma y, adems, no contienen pigmento. Se pueden confundir
grupos de bacterias o plaquetas con esquizontes. A veces, masas de plaquetas pue
den asemejarse a gametocitos de P. lalciparum, pero no muestran el colorante dif
erencial o el pigmento. Tambin se pueden confundir con parsitos los grumos de colo
rante, las bacterias contaminantes o las esporas.

Tabla 55-6 Comparacin de las especies de Plasmodium que afectan a los humanos Apa
riencia del eritrocito Especies Plasmodium vivax Tamao Granulos del eritrocito En
todos los estadios excepto en las formas precoces de anillo (Rara vez se ven lo
s puntos de Ziemann) Citoplasma Irregular, ameboide en los trofozotos. Tiene apar
iencia "extendida" Redondo, trofozotos compactos con citoplasma denso. Trofozotos
con forma de banda ocasionalmente Apariencia del parsito Pigmento Marrn dorado, po
co llamativo Nmero de merozoitos 12-24, la media es 16 Estadios hallados en sangr
e perifrica Todos los estadios La mayora de los estadios pueden verse en el mismo
frots
Plasmodium malariae
Aumentado. La talla mxima alcanzada por los trofozotos y esquizontes puede ser 1-2
veces el dimetro normal Normal
n >
c
rMarrn oscuro, basto, llamativo
6-12, promedio Todos los estadios. La gran de 8: a veces variedad de los estadio
s se ven esquizontes no suele verse. Relativamente pocos anillos en "roseta o ga
metocitos presentes 6-14, promedio de 8 Todos los estadios
o
en
C7!
Plasmodium ovale
Plasmodium falciparum
Aumentado. Tamao mximo + V*-V veces el dimetro En todos los estadios excepto del er
itrocito. en las formas de anillo Aproximadamente el 20% o ms tempranas de los er
itrocitos infectados son ovalados y/o fimbriados el borde tiene proyecciones irr
egulares Normal. Los eritrocitos infectados son normales (Ocasionalmente se ven
puntos de Maurer)
>
Redondo, trofozotos compactos Marrn oscuro. A veces levemente ameboide. llamativo
Los trofozotos en crecimiento tienen grandes masas de cromatina
9
O
Los anillos jvenes son pequeos, delicados y frecuentemente con doble punteado de c
romatina Los gametocitos estn alargados
Negro. 6-32. Basto y llamativo promedio 20-24 en los gametocitos
Anillos y/o gametocitos. Otros estadios se desarrollan en los vasos sanguneos u rg
anos internos, pero no en la sangre perifrica, excepto en infecciones graves
>
De Smith JW Melvm DM. Onhel TC. y cols.: Diagnostic Parasitology-Blood and Tissu
e Parasites Chicago. American Society of Clinical Pathologists. 1976. con autori
zaciOn

K5
O
-4

1208
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Los test serologicos para malaria son especficamente tiles para estudios epidemiolg
icos y para la deteccin de donantes de sangre infectados. No obstante, estos test
no estn capacitados para diferenciar entre infeccin actual o pasada. Hay test sen
sibles y especficos disponibles en el CDC de IFA que utilizan antgenos para las cu
atro especies humanas (Wilson. 1995).
Babesiosis
Como el parsito de la malaria, los agenles de la babesiosis o piroplasmosis son p
rotozoos apicomplejos extendidos por todo el mundo que infectan eritrocitos, pro
duciendo enfermedades febriles de gravedad variable. A diferencia de la malaria,
se transmite por garrapatas y hay una gran variedad de animales que actan como r
eservorio. La infeccin en EE.UU. se produce principalmente en estados del noreste
y del medio oeste, donde el parsito de los roedores Babesia microli es el respon
sable de la infeccin (Herwaldt. 1995). /. capulahs es la garrapata vector. Estudi
os recientes han implicado a otra especie de Babesia, aun sin nombre (por el mom
ento conocida como WA1), como causante de la enfermedad en el oeste de EE.UU. Se
cree que este parsito, asociado con la enfermedad en Washington y California, se
transmite por la garrapata de patas negras. Ixodes paciticus (Persing, 1995: Qu
ick. 1993). En Europa, es el parsito canino Babesia divergens. transmitida por Ix
odes ricinus. el que infecta a los humanos. El espectro clnico vara desde enfermed
ad latente y subclnica a hemolisis fulminante. Se han descrito fatalidades, espec
ialmente en espleneclomizados o inmunosuprimidos. Las personas mmunocompetentes
pueden tener sintomas similares a la malaria, como fiebre, escalofros, malestar g
eneral y anemia, aunque sin la caracterstica periodicidad. La investigacin de un b
rote por Babesia microli en la isla de Nantucket, en Nueva Inglaterra, mostr que
algunos pacientes sinlomlicos portaron el parsito durante meses,
y otros mostraron evidencia serolgica de infeccin s m historia de enfermedad clnica
(Ruebush, 1980). Otra evidencia es que la infeccin crnica subclnica puede ser infr
ecuente (Persing, 1995). El parsito se multiplica en los eritrocitos como esquizo
gonias, pero no produce gametocitos. Aunque los trofozoitos de muchas especies t
ienen forma de pera, en algn momento de su desarrollo los de S. microli suelen pa
recerse a delicadas formas anulares que pueden confundirse con las de la malaria
, especialmente P. falciparum (Lmina 55-5A) (Healy, 1980). Los trofozoitos de Bab
esia se pueden diferenciar de los de la malaria por la presencia de mltiples anil
los en una clula que pueden formar una tetrada (cruz de Malta) y por la ausencia
de trofozoitos grandes en crecimiento y de los gametocitos. Tambin, las clulas de
los infectados por Babesia carecen de pigmento de hemozoina, que est presente en
las clulas infectadas por Plasmodium. La historia de residencia o viaje en zonas
endmicas, o picadura reciente por garrapatas, puede sugerir infeccin por Babesia.
Hay disponibles test serolgicos (IFA) para Babesia microtiy WA1 en el CDC con ref
erencia a los departamentos de salud estatal. Los test serolgicos de malaria son
negativos en la babesiosis. aunque pacientes con malaria pueden tener actividad
cruzada con las serologas de Babesia (Wilson. 1995).
Hemoflagelados
Los hemoflagelados de humanos y animales son miembros del orden de los Kinetopla
stida y se caracterizan por la presencia de un gran mitocondrin conocido como cin
etoplasto, que contiene suficiente ADN para ser visto por microscopio de luz cua
ndo se tien con Giemsa. Los dos gneros importantes en la patologa humana son Trypan
osoma y Leishmania. Ambos se transmiten por artrpodos y tienen huspedes animales c
omo reservnos.

Figura 55-2. Morfologa de los hemoflagelados.

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1209
Los cnetoplstdos tienen diferente morfologa dependiendo de su presencia en huspedes v
ertebrados, incluidos los humanos, o en sus vectores (Fig. 55-2). El estadio ama
stigote es esfrico, de 2 urn a 5 pm de dimetro, y posee un ncleo y cinetoplasto. Po
r definicin le falta un flagelo externo, aunque a nivel ultraestructural es apare
nte un axonema (parte inlracelular del flagelo) Los amastigotes se pueden encont
rar en huspedes humanos o animales infectados con T. cruzo Leishmania spp.. donde
se multiplican nicamente dentro de las clulas. El promastigote es un organismo ala
rgado y delgado con un ncleo central, un cinetoplasto anterior y un axonema. y un
flagelo libre que va desde el extremo anterior. Esta fase se da en el insecto v
ector de Leishmania y es la que se detecta en los cultivos. El epimastigote es s
imilar al promastigote. pero el cinetoplasto est ms cerca del ncleo y posee una peq
uea membrana ondulada que acaba en un flagelo libre. Todas las especies de Trypan
osoma que infectan a humanos toman la forma de epimastigote en el vector o en el
cultivo. En el tripomasligote, el cinetoplasto est en el extremo posterior y el
flagelo forma una membrana ondulada que se extiende a lo largo de la clula, acaba
ndo como un flagelo libre en el extremo anterior. La forma de tripomastigote se
da preferentemente en el torrente sanguneo en el husped de mamferos infectados con
Trypanosoma spp. Las fases infecciosas encontradas en los vectores formados a pa
rtir de epimascigotos se conocen como tnpomastigotes metacclicos
vida domstica, donde infectan a casas de pobre construccin, especialmente en zonas
rurales. A la hora de alimentarse, las chinches defecan. Las heces contienen tr
ipomastigotes infectivos que tras el rascado entran en el cuerpo por el punto de
la picadura a travs de la mucosa intacta de la boca o la conjuntiva. La forma in
fectiva entra activamente cerca de las clulas tisulares, donde se transforman en
amastigotes en divisin. Cuando las clulas infectadas se llenan de amastigotes, se
transforman en tripomastigotes, seguido de la rotura celular. Los tnpomastigotes
se liberan en la sangre perifrica alcanzando los tejidos distantes, donde comien
za el ciclo reproductivo de novo. La enfermedad de Chagas puede causar infeccin a
guda o crnica. La aguda es ms frecuente en nios menores de cinco aos y se caracteriz
a por malestar, escalofros, fiebre, hepatoesplenomegalia y miocarditis. El edema
palpebral (signo de Romana) puede presentarse si la inoculacin se produce en la c
ara. El edema tisular en otras partes, tras la picadura de las chinches infectad
as, se llama chagoma. En personas ancianas, el curso agudo es leve o frecuenteme
nte asintomtico. En ambos casos, el paciente estar afectado de por vida Las manife
staciones crnicas de la infeccin, incluido el megaesfago, el megacolon y las altera
ciones de la conduccin miocrdica. son debidas a la destruccin de las clulas efectora
s del sistema parasimptico por autoanticuerpos. La infeccin s e puede transmitir p
or transfusiones, y las infecciones latentes pueden exacerbarse por nmunosupresin.
El diagnstico en el estadio agudo se hace demostrando el parsito en frotis grueso
s o finos de sangre, extensiones o en aspirados de los chagomas o de las adenopa
tias. Estas muestras tambin se pueden cultivar con el uso del medio Novy-MacNealNicolle (Ash, 1987; Garcia, 1997; Vsvesvara, 1992c). En las reas endmicas se puede
usar el xenodiagnstico (examen de contenido gstrico de chinches a las que se les h
a permitido picar a un paciente). En los estudios en los estadios crnicos, el dia
gnostico serolgico es el mtodo de eleccin. El EIA. IFA y el test de CF estn disponib
les, aunque no permiten diferenciar entre enfermedad aguda o crnica y pueden tene
r reaccin cruzada con pacientes con leishmaniasis.
Trypanosoma
Las infecciones por Trypanosoma incluyen las causadas por T. brucei (tripanosomi
asis africana o del Viejo Mundo) y T. cruzi (tripanosomiasis americana o del nue

vo mundo o enfermedad de Chagas). Ambas son de gran importancia en zonas endmicas

, pero rara vez pueden verse en EE.UU. Una tercera especie. T. rangeti, se ha de
scrito en humanos en Amrica, pero no produce de enfermedad clnica. El tripomastigo
te del torrente sanguneo del grupo T. brucei (Lmina 55-5B) es mayor de 30 um de lo
ngitud, con unas curvas graciosas y un pequeo cinetoplasto. Los del T. cruzi son
ms pequeos (20 um), tomando formas de S y C en los frotis teidos, y poseen un cinet
oplasto ms largo. En frica ecuatorial, los parsitos del grupo T. brucei infectan ta
nto a humanos como a animales y se transmiten por la picadura de la mosca tsetse
, del gnero Glossina. La proliferacin de los organismos en el punto de puncin produ
ce un chancro transitorio. En el este de frica, la tripanosomiasis es causada por
I brucei rhodesiense, que tiene un gran nmero de huspedes animales como reservnos.
La enfermedad se caracteriza por un cuadro febril agudo rpidamente progresivo y
adenopatias. La muerte del paciente se da tras la afectacin del sistema nervioso
central. La infeccin en frica occidental es debida a T. brucei gambiense, que es e
l causante de la clsica enfermedad del sueo africana. L a enfermedad posee un curs
o crnico que empieza con fiebre intermitente, sudoracin nocturna y malestar. Puede
n ser llamativas las adenopatias, especialmente las cervicales (signo de Winterb
ottom). Con el tiempo, acaba afectando al sistema nervioso central: somnolencia,
confusion, fatiga y estupor progresivo, coma e incluso muerte. Los humanos son
el principal reservono ante esta enfermedad (OMS. 1986). El diagnstico se debe so
spechar con la historia geogrfica y los hallazgos clnicos. Se observa un aumento e
n la IgM total en sangre y el lquido cefalorraqudeo (LCR). Existe pleocitosis con
50-500 clulas mononucleadas/microlitro en el liquido cefalorraqudeo. El diagnstico
se confirma por la demostracin de los parsitos en frotis sanguneos, tanto gruesos c
omo finos, extensiones, aspiraciones de adenopatias o de la mdula sea, o en el cen
trifugado de lquido cefalorraqudeo teido con Giemsa (Cattand, 1988; Van Meirvenne,
1985). Los cultivos o la inoculacin en animales tambin pueden ser tiles si estuvies
en disponibles. La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas est causada p
or T. cruzi. En su forma selvtica, se da en EE.UU., Centroamrica y. sobre todo, en
Sudamrica. La infeccin humana es comn en zonas de Mxico, Centroamrica y Sudamrica, d
nde se transmite por chinches de la familia de los Reduviidae. Los gneros y espec
ies implicadas en la transmisin varian de un pas a otro y segn los diferentes nicho
s ecolgicos. Algunas de las chinches son responsables de mantener el ciclos selvti
co en los reservnos animales, mientras que otras estn acostumbradas a la
Leishmania
La leishmaniasis es una enfermedad del sistema reticuloendotelial producida por
protozoos cinetoplstidos del gnero Leishmania. Todas las especies que infectan a h
umanos tienen reservnos anmales y se transmiten por moscas que pertenecen a gnero P
hlebolomus en el Viejo Mundo y Lulzomyia en el Nuevo Mundo. Los parsitos toman la
forma de amastigotes en los mamferos y la forma de promastigotes en los insectos
vectores. Las especies de Leishmania no se pueden diferenciar por examen de otr
os amastigotes o promastigotes. La leishmaniasis puede lomar diferentes formas c
lnicas: la forma cutnea, mucocutnea y visceral son las ms conocidas. La forma y grav
edad varan segn la especie infectante, el estado inmune del husped y la exposicin pr
evia (Peters. 1987: Strickland, 1999). Leishmaniasis cutnea. La leishmaniasis cutn
ea del Viejo Mundo (llaga oriental) se produce en el sur de Europa, norte y este
de frica, Oriente Medio. Irn, Afganistn y el sur de Rusia. Las infecciones estn pro
ducidas por L tropica. L. major y L. aethiopica. aunque L. donovam y L. infantum
tambin pueden producir lesiones cutneas. L. tropica causa la lcera urbana o seca,
que es ms duradera que la rural o la lcera hmeda de L. major. Estas lceras suelen pr
oducirse en una zona expuesta del cuerpo y s e cura espontneamente. La infeccin de
ja inmunidad duradera. L. tropica puede llegar a ser viscerotrpica. tal como se d
emostr recientemente en personal militar que particip en la operacin Tormenta del D
esierto (Magill, 1993). L. aethiopica produce una infeccin cutnea ms agresiva, que
en algunos casos puede producir lesiones mucosas a distancia o leishmaniasis cutn
ea difusa, cuyo extremo se caracteriza por mltiples mdulos cutneos que se asemejan
a la lepra lepramatosa. La leishmaniasis cutnea del Nuevo Mundo es causada por mu
chas especies, incluidos L. mexicana. L. braziliensis. L. amazonensis. L vene-

1210
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
zuelensis. L. garnhami, L. pifanoi. L. peruviana. L. panamensis y L. guyanensis.
Las lesiones causadas por L. mexicana pueden afectar al lbulo de las orejas (lcer
a del chiclero), siendo autolimitada, y se desconoce su afectacin a distancia de
las mucosas. Sin embargo, L. mexicana y L. amazonensis pueden causar lesiones cu
tneas difusas similares a las de L aethiopica. Existe un foco de leishmaniasis cu
tnea en el sur de Texas, donde las infecciones estn causadas por una o ms especies
(Gustafson, 1985). L. peruviana, hallada en las pendientes occidentales de los A
ndes peruanos, causa una infeccin llamada uta. una lesin cutnea benigna que se da p
referentemente en nios. L. peruviana se adquiere en las casas, donde los principa
les reservorios son los perros domsticos. Esta situacin epidemiolgica contrasta con
otras leishmaniasis cutneas que suelen adquirirse en los bosques y tienen animal
es salvajes como reservnos. Leishmaniasis mucocutnea. La Leishmaniasis mucoculnea (
espundia) es provocada por L. braziliensis y rara vez por otras especies causant
es de lesiones cutneas ms agresivas, y a veces se disemina a membranas mucosas, es
pecialmente la nasal, la oral y la farngea. En estas zonas puede producir lesione
s desfigurantes por erosin de las partes blandas y de los cartlagos. L. braziliens
is se distribuye en Mxico, Amrica central y Sudamnca. Leishmaniasis visceral. La le
ishmaniasis visceral del Viejo Mundo se produce espordicamente a lo largo de toda
la geografa y es causada bien por L. onovanio por L. infantum. L. donovanies pred
ominante en frica. Asia y la India y L. infantum predomina en las regiones medite
rrneas y en el Oriente Medio, aunque existen superposiciones. La leishmaniasis vi
sceral del Nuevo Mundo est producida por L. chagasiyse produce espordicamente en A
mrica central y Sudamrica. Algunas especies que producen enfermedad cutnea tambin pu
eden ser responsables, en ocasiones, de enfermedad visceral, como se demostr reci
entemente en algunos grupos que participaron en la operacin Tormenta del Desierto
(Magill. 1993). En algunas reas los humanos pueden servir de reservorios. aunque
suelen ser diversos animales, incluidos perros y gatos, los que toman este pape
l. La infeccin suele ser benigna y a veces subclnica, aunque algunos individuos, e
specialmente chicos |venes e individuos mal nutridos, tienen marcada afectacin vis
ceral, especialmente hgado, bazo, mdula sea y ganglios linfticos. En algunos casos l
a muerte se produce tras meses o aos, a menos que se les trate adecuadamente. La
infeccin se llama Kala-azar en la India, por el oscurecimiento que toma la piel L
a leishmaniasis visceral es tambin una infeccin oportunista en individuos inmunosu
primidos (VIH), como mala respuesta a tratamiento (Medrano, 1992). Diagnstico de
leishmaniasis. El diagnstico se realiza habitualmente por la visualizacin de los a
mastigotes en las extensiones o en las biopsias, o por el crecimiento de los pro
mastigotes en cultivos. En la leishmaniasis tegumentaria, el borde de la lesin (q
ue es ms activo) debe ser biopsiado y se debe emplear en fresco para hacer muestr
as. Tambin se debe preparar una extension haciendo una incisin de 2 mm a 3 mm en e
l borde de la ulcera y cogiendo pequea cantidad de tejido de la superficie tras c
ortar la superficie con la hoja del bistur. Tanto la extensin como la muestra de l
a biopsia se deben tratar con Giemsa. Las muestras que se deben tomar cuando se
sospecha leishmaniasis visceral incluyen preparaciones teidas, aspirados de adeno
patas o de mdula sea y biopsias de bazo o hgado. El cultivo es deseable, ya que es ms
sensible y permite determinar las especies y subespecies. prctica que puede ayud
ar al tratamiento clnico del paciente. Las biopsias y aspirados recogidos aspticam
ente se cultivan en el medio de Novy-MacNeal-Nicolle o en el medio de Drosophila
de Schneider suplementado con suero fetal de carnero (Visvesvara, 1992c). Los c
ultivos suelen empezar a mostrar promastigotes de 2 a 5 das, pero se debe esperar
al menos cuatro semanas. Los amastigotes hallados en las biopsias, extensiones
y secciones tislares se reconocen por su tamao (de 2 pm a 4 pm), por su citoplasma
, por el ncleo y un cmetoplasto (Lmina 55-5C). En las secciones tisulares pueden p

arecer mas pequeos debido a su reduccin de tamao durante la fijacin. Los amastigotes
deben diferenciarse de otros organismos mtracelulares. incluidos clulas levaduriformes de Histoplasma capsulatum y los trofozoitos
de Toxoplasma gondii. Leishmama spp. tiene un cmetoplasto y no posee pared celul
ar. En contraste, Histoplasma pierde el cinetoplasto. y la pared celular se tie c
on cido peridico de Shifl (PAS) y con plata metenamina. De acuerdo con un estudio
(Weigle, 1987), la sensibilidad de las secciones histolgicas teidas con hematoxili
na-eosina es del 14%. las impresiones del 19%. de los cultivos del 58%. y de tod
os los mtodos combinados del 67%.
Toxoplasma
gondii
Toxoplasma gondii es un parsito protozoo del filo Apcomplexa con una distribucin mu
ndial en el ser humano y en los animales tanto domsticos como salvajes, especialm
ente carnvoros. L a infeccin en inmunocompetentes suele ser asintomtica o leve, per
o en los mmunocomprometidos puede traer serias complicaciones. La infeccin in tero
puede producir una infeccin congnita grave con secuelas o causar la muerte letal
(Remington, 1990). El estadio sexual del ciclo vital de este parsito coccidio se
completa en el epitelio intestinal de los gatos y otros felinos, que le sirven e
xclusivamente como huspedes definitivos. Durante este ciclo, pueden formar esquiz
ogonias asexuales y gametocitos sexuales, dirigidos al desarrollo de los ooquist
es inmaduros que pasan a las heces. Los ooquistes maduran a una fase infectiva (
que contiene dos esporoquistes y cuatro esporozotos cada uno) en el plazo de 2 a
21 das. La ingestin de estos ooquistes puede conducir a la infeccin de una gran var
iedad de vertebrados susceptibles en los que los trofozoitos en crecimiento (taq
uizoitos) pueden infectar activamente cualquier clula nucleada. La proliferacin de
los taquizoitos produce la muerte celular. Una vez que se desarrolla la inmunid
ad, los organismos forman quistes tisulares que pueden contener cientos o miles
de bradizotos de crecimiento lento. La presencia de quistes tisulares es caracters
tica de las infecciones crnicas. Todos los estadios del ciclo vital se producen e
n los felinos, pero slo los estadios de trofozoitos y quistes se producen en huma
nos y otros huspedes intermediarios. Los humanos adquieren la infeccin por Toxopla
sma gondii por la ingesta de carne mal cocinada, especialmente cordero o cerdo,
que contiene quistes tisulares, o por la ingesta de ooquistes inactivos de mater
ial contaminado por heces de gato. Los brotes pueden producirse por la inhalacin
de polvo contaminado en el interior de establos (Teutch, 1979) y por beber agua
contaminada o leche sin pasteurizar (Benenson. 1982: Sacks. 1982). Tambin puede p
roducirse por la transmisin por transfusin o por trasplantes La mayora de las infec
ciones agudas son asintomticas o similares a otras enfermedades en las que destac
an la fiebre y las adenopatas. La infeccin congnita puede producirse cuando la madr
e tiene infeccin aguda durante la gestacin. El riesgo de inleccin en neonatos no se
relaciona con la presencia o ausencia de sntomas en la madre, sino que la graved
ad de la infeccin depende del estadio de la gestacin. Si se contrae en la primera
mitad del embarazo, puede aparecer muerte intrauterina, microcefalia o hidrocefa
lia con calcificaciones intracraneales. Si se da la infeccin en la segunda mitad
del embarazo, suelen ser asintomticos al nacimiento, aunque puede aparecer fiebre
, hepatoesplenomegaha e ictericia. La coriorretmitis, el retraso psicomotor y la
s convulsiones pueden aparecer meses o aos despus. En inmunosuprimidos, especialme
nte aquellos con sida, las infecciones por Toxoplasma gondiiduelen presentarse c
on afectacin de lquido cefalorraqudeo (Luft. 1988). Otras posibles manifestaciones
clnicas y patolgicas son neumonitis. miocarditis, retinitis, pancreatitis y orquit
is (Luft, 1989; Schnapp, 1992). La toxoplasmosis puede ser difcil de diagnosticar
clnicamente y a veces se descubre en las autopsias (Gutirrez, 2000). Estas infecc
iones suelen ser resultado de la reactivacin de infecciones latentes, adquiridas
meses o aos antes, pero ocasionalmente pueden ser infeccin primaria. El diagnstico
de toxoplasmosis se puede establecer por el examen de tejidos, sangre o fluidos
corporales. El hallazgo de taquizoitos o quistes tisulares es definitivo, pero p

uede existir dificultad para demostrarlo en las tin-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1211
clones con hematoxilina-eosina; las tinciones fluorescente o con inmunoperoxidas
a suelen ser tiles. El Giemsa es bueno para la tincin de extensiones de fluidos co
rporales y tejidos. Los organismos se pueden demostrar inoculando material adecu
ado en cultivo de tejido o en un ratn. La recuperacin en cultivos virales tambin se
ha descrito, pero requiere una incubacin prolongada (Shepp, 1985). El aislamient
o de los organismos a partir de la sangre o fluidos corporales es evidencia de i
nfeccin aguda, mientras que su obtencin en tejidos puede significar infeccin crnica.
En las extensiones, los taquizotos son ovalados o en forma de media luna, midien
do aproximadamente 3x7 um; los quistes miden ms de 30 urn de dimetro y suelen ser
esfricos, excepto en las fibras musculares, donde estn alargados (Lminas 55-50. E y
F). El uso de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es de alta sensibilida
d y especificidad para su deteccin en la encefalitis por Toxoplasma, enfermedad d
iseminada e infeccin intrauterina (Cazenave. 1991; Grover, 1990. Parmley. 1992; W
eiss. 1995). Estos procedimientos no estn completamente disponibles, sin embargo
requieren un control de calidad cuidadoso para evitar resultados falsos positivo
s. La serologia permanece en primera linea para el diagnstico por Toxoplasma (Wil
son. 1995). El test de Sabin-Feldman y el test de IFA son los estndares con los q
ue se comparan los otros mtodos, aunque el primero es llevado a cabo slo en alguno
s centros. Muchos de los test EIA estn disponibles a la venta y generalmente dan
un resultado similar al del IFA Los anticuerpos aparecen en una o dos semanas y
los titulos pico entre la sexta y octava semanas. Los test para los anticuerpos
IgM especficos son especialmente tiles para diagnstico de infeccin aguda e infeccin c
ongenita, pero el conocimiento de las limitaciones (especialmente de los falsos
positivos) es de gran importancia. La persistencia de anticuerpos IgM en ocasion
es durante un ao o ms, es tambin problemtico y se debe interpretar en conjunto con l
os resultados de la IgG. Debido a que muchas personas han tenido infecciones asi
ntomticas, los titulos bajos de IgG tienen poco significado. Los ttulos en pacient
es con infeccin crnica ocular tambin pueden ser bajos. Los inmunosuprimidos, como l
os pacientes con sida que tienen infecciones activas por Toxoplasma, casi siempr
e tienen anticuerpos IgG existentes, aunque los ttulos pueden ser bajos y la acti
vidad de IgM rara vez es detectada. La interpretacin de los titulos de IgG e IgM
vara segn el mtodo usado y quien lo haya llevado a cabo. El laboratorio que lo hace
debe dar los criterios necesarios para su interpretacin.
brado con un tapiz de E. col! viva o muerta con calor (Visvesvara. 1999). Las am
ebas digieren las bacterias, dejando huellas en el tapiz de bacterias, que puede
n ser vistas con bajo aumento utilizando poca luz (Lmina 55-60). La meningoencefa
litis amebiana granulomatosa (GAE) puede ser causada por varias especies de Acan
thamoeba. incluidas A. castellao!. A. culbertsoni. A. polyphaga y A. astrnyxis e
ntre otras Suele ser una infeccin oportunista subaguda o crnica de pacientes con e
nfermedades crnicas debilitantes e inmunosuprimidos. causando la muerte en semana
s o meses tras el inicio de los sntomas. Se cree que la infeccin se extiende por va
hematgena a partir de un foco primario de la piel, la faringe o de tracto respir
atorio. Pueden producirse infecciones sistmicas en personas con sida y presentars
e como lesiones cutneas o ulcerativas, abscesos subcutneos o nodulos eritematosos
(Lmina 55-6C) (Tan, 1993). No es necesaria la exposicin al agua, ya que los quiste
s de Acanthamoeba son llevados fcilmente por el aire y pueden hallarse en la nari
z y la garganta (Lawande, 1979; Wang. 1967). La reaccin tisular consiste en granu
lomas con trofozotos en los tejidos viables y quistes en las reas de necrosis. El
diagnstico se suele hacer en autopsias, pero se pueden ver organismos en las biop
sias cerebrales mediante tcnicas de cultivo descritas para Naegleria. Los trofozot
os de Acanthamoeba son algo ms grandes que los de Naegleria, midiendo entre 15 pm

y 45 pm, y poseen unas proyecciones filamentosas similares a agujas, conocidas

como acanlopodios. Los quistes miden de 10 pm a 25 pm y tienen doble pared: una
externa rugosa (ectoquistes) y otra interna poligonal estrellada o redondeada (e
ndoquistes) (Lmina 55-60). La identificacin de las especies es problemtica y reflej
a la incertidumbre a la hora de reconocer las dieciocho o mas especies descritas
. El uso de tcnicas de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa puede resultar til p
ara diferenciar especies y estn disponibles por el CDC (Visvesvara, 1999). La GAE
puede ser causada por amebas leptomyxldes, especialmente Balamuthia mandrillari
s (Visvesvara. 1993). Morfolgicamente. Balamuthia no se puede diferenciar de Acan
thamoeba por la histologa habitual, aunque se pueden detectar diferencias a nivel
ultraeslructural. Estos organismos son antignicamente diferentes y se pueden ide
ntificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales en ensayos c
on inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (Visvesvara, 1999). Balamuthia no crec
e en las placas de agar usadas para Naegleria y Acanthamoeba, pero se puede hall
ar en cultivos de tejido usando lineas celulares de mamferos. La queratitis por A
canthamoeba es una dolorosa infeccin de la crnea cada vez ms frecuente y que es ms h
abitual que se produzca en personas que usan lentes de contacto blandas o que su
fren un traumatismo en la crnea (Anuran. 1987: Kilvington, 1994). La desinfeccin i
ncompleta o infrecuente y el uso de suero salino casero son factores de riesgo c
onocidos para sufrir la infeccin (Stehr-Green, 1990). La enfermedad se caracteriz
a por el desarrollo de un infiltrado en anillo en el estroma corneal que progres
a a ulceracin y riesgo de perforacin con prdida del ojo. La infeccin se puede confun
dir con una queratitis fngica. bacteriana o herptica que caractersticamente es refr
actaria a los antimicrobianos ms habituales. Se ha empleado la queratoplastia en
el tratamiento de esta enfermedad, aunque se han descrito avances recientes en l
a terapia mdica (Varga, 1993). El diagnstico se establece por la demostracin de tro
fozotos amebianos o quistes en los raspados o biopsias corneales (Lmina 55-6E). Se
pueden usar un gran nmero de tinciones, incluidos el Giemsa, el PAS y el tricrom
o. El uso de fluorocromo-calcoflor blanco es especialmente til en la deteccin de qu
istes de amebas (Lamina 55-6F) (Marines. 1987). Los cultivos (descritos previame
nte) aumentan la sensibilidad.
Amebas oportunistas de vida libre
Las amebas de gneros Naegleria. Acanthamoeba y Balamuthia habitan en la tierra, e
l agua y otros substratos ambientales, donde se alimenta de otros organismos mic
roscpicos, especialmenle bacterias y levaduras. Los tres gneros se han asociado co
n infecciones oportunistas del sistema nervioso central, y la infeccin por Acanth
amoeba causa queratitis (Kilvmgton. 1994: Marciano-Cabral. 1988; Martnez. 1985: U
belaker. 1991; Visvesvara. 1999). La memngoencefalitis causada por el ameboflage
lado Naegleria lowleri suele afectar tpicamente a nios y jvenes adultos que han est
ado nadando o buceando en lagos o piscinas de aguas dulces calientes. Los amebof
lagelados entran en el cerebro a travs de la lmina cribiforme y del bulbo olfatori
o, alcanzando los lbulos frontales, donde produce una meningoencefalitis aguda he
morrgica que suele ser latal en el plazo de una semana Iras el comienzo de los snt
omas. Tiene un malsimo pronstico a pesar del tratamiento vigoroso. El diagnstico su
ele establecerse por autopsias al encontrar trofozotos (los quistes no se suelen
ver) en los cortes histolgicos (Lmina 55-6/1). El diagnstico en vida se hace ocasio
nalmente al ver trofozotos tpicos en el lquido cefalorraqudeo, bien sea en examen di
recto o en preparaciones teidas o en cultivo. Los trofozotos miden de 10 pm a 35 p
m, y tienen cariosomas largos, redondeados y centrales: si se ponen en agua dest
ilada templada, se convierten en formas flageladas en una o dos horas. Los quist
es son esfricos y miden de 7pm a 15 pm de dimetro. El cultivo se suele hacer en pl
acas de agar no nutriente (1,5% agar, 0,5% cloruro sdico. pH 6.6-7,0) semPROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES
Los grupos de protozoos que habitan el tracto intestinal en humanos incluyen las
amebas, flagelados, ciliados, coccidios y microsporidios, sin ser todos ellos p
atgenos. En una revisin de muestras fecales enviadas a los laboratorios del depart
amento estatal de salud, Giardia lamblia estaba presente en

1212
II
SECCIN VI
0

MICROBIOLOGA MDICA
20
RetOrttmOfUU inlestinalis
I nlcToiiHuus h o m i n i s
I ni a m o e b a ha r i m a n i l i I nclionumas homniis Indohmax nana
I rofozotoi
( hilomaslix nKsnili (nanita lamblia
D i e n l i i m o c b a tVagilis lodaniocha hischlii r-nlamocba coli l.iiiamocba
histoMica
lialaniitlium coli
Itosponi
J 40 L
20
IK-II
Ooqu
XI)
20
40
(.0
M
M
Figura 55-3. Rangos de los tamaos de los protozoos intestinales. (Los trofozoitos
de B. cot pueden medir hasta 200 pm.)
un 7,2%, histolytica en un 0,9%, Dientamoeba tragilis en un 0.5% y Cryptosporidi
um spp. en un 0.2% de las muestras. Los protozoos no patgenos se encuentran en ap
roximadamente el 10,7% de las muestras (Kappus, 1994). La mayora de las infeccion
es intestinales son adquiridas por va fecal-oral, tanto directamente, desde manip
uladores de alimentos, como indirectamente, a travs del agua contaminada. Para la
mayora de los laboratorios, la identificacin de los protozoos intestinales es uno
de los aspectos ms difciles de la parasitologa. Los protozoos son pequeos y las esp
ecies patgenas se deben diferenciar de las no patgenas y de las clulas inflamatoria
s, de las clulas de endoteliales, de las levaduras, de los plenes y de otros objet
os. Hay un nmero de caractersticas que ayudan para la identificacin de los protozoo
s intestinales. El tamao es til (Fig. 55-3) y un adecuado micrmelro ocular debe est
ar disponible. La diferenciacin de amebas de los flagelados en muestras hmedas o m

aterial fresco es relativamente fcil por los seudpodos tpicos de las amebas, mientr
as que los flagelados se mueven ms rpidamente, de un modo que se asemeia a una hoj
a cayendo. El nmero y el tamao de los ncleos y el patrn de la cromatina. visto en pr
eparaciones con tincin permanente, son tambin tiles. Las caractersticas del citoplas
ma incluyen fibrillas y otras estructuras tpicas de los flagelados, material inge
rido en los trofozoitos amebianos y la masa de glucgeno y cuerpos de cromatina en
quistes de amebas. Los flagelados suelen estar agrandados y con forma de huso,
con uno o varios ncleos en un extremo. Cuando se examina por cualquier mtodo, las
caractersticas nucleares y citoplasmticas se deben determinar a partir de un nmero
de organismos para completar la identificacin. Cuando se informa de la presencia
de dos o ms especies en una muestra, el observador debe ser capaz de definir las
diferentes poblaciones para evitar confundir algn organismo con apariencia atpica.
Los trofozoitos predominan en las heces lquidas, pero degeneran en menos de una
hora a menos que se pongan conservantes. Los quistes predominan en las heces for
madas y son ms resistentes a la degeneracin. Ambas formas se pueden ver en el exam
en directo a partir de heces frescas. La formalina no conserva bien los trofozoi
tos, y se pueden perder a menos que se preparen extensiones con tinciones perman
entes. Para la
identificacin definitiva se debe hacer un examen de muestras con tincin permanente
.
Amebas
y
Blastocystis hominis
Los tres gneros de amebas que pueden habitar el tracto intestinal humano son: Ent
amoeba. Endolimax y lodamoeba. Los quistes se digieren y se exquistan en el inte
stino delgado. El resultado es la proliferacin de trofozoitos por fisin binana en
la luz del colon. Tanto los quistes como los trofozoitos pueden salir con las he
ces, pero slo los quistes maduros son infectivos. Entamoeba histolytica es la nica
especie de ameba capaz de invadir tejidos y producir enfermedad. El gnero Entamo
eba, caracterizado por la presencia de cromatina de la membrana nuclear, incluye
E. histolytica, el agente de la amebiasis; E. dispar, una especie no patgena idnt
ica a E. histolytica; E. hartmanni y coli. que se encuentran habitualmente como
especies comensales: y polecki que se encuentra a veces en personas que tienen c
ontacto con cerdos (Fig. 55-4) (Gay, 1985: Levin, 1970). gingivaiis. que no tien
e un estadio quistico conocido, puede habitar en la boca de individuos con pobre
higiene bucal (Dao, 1983). polecki y gmgivalis se ven rara vez y no se describe
n ms adelante. Endohmax nana e /. btschlii son especies no patgenas. Dientamoeba fr
agilis se reconoce actualmente como flagelada, aunque pierde su flagelo externo
y se explica en el texto dentro de los flagelados, pero puede ser encontrada con
las amebas en las tablas y figuras debido a sus similitudes morfolgicas. Entamoe
ba histolytica. Esta ameba puede producir diversas enfermedades, siendo las ms co
munes la disentera amebiana, la colitis amebiana y a abscesos hepticos (Beaver, 19
84; Ravdin, 1988: Strickland, 1999). Los mecanismos de defensa del husped, el con
tacto previo con el parsito, la alimentacin y la cepa de Entamoeba histolytica son
los responsables de la gravedad de la infeccin. Los anlisis de los patrones de is
oenzimas han mostrado que slo ciertas cepas son invasivas y que la mayora de las i
nfecciones no se detectan (Bruckner. 1992; Murray 1999). Las diferencias genticas
y bioqumicas entre las cepas invasivas y no invasivas se han identifica-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MEDICA
1213
do, y se ha propuesto que se denomine a la cepa no patgena Entamoeba dispar (Diam
ond, 1993). La disenteria amebiana, que es rara en EE.UU.. es una enfermedad agu
da que se caracteriza por diarrea sanguinolenta con calambres abdominales. Se pr
oduce una invasin de la mucosa intestinal, causando ulceracin que puede conducir a
perforacin y peritonitis. La forma ms comn de la enfermedad vista en este pas es la
colitis amebiana, que puede simular una colitis ulcerosa y otra forma de enferm
edad inflamatoria intestinal. Los sntomas suelen ser menos graves que en la disen
tera amebiana, pero pueden incluir diarrea no sanguinolenta, estreimiento, dolor a
bdominal y prdida de peso. Se pueden formar pequeas ulceraciones de la mucosa y ex
tenderse dentro de la submucosa formando lceras. Se puede afectar todo el colon o
una parte, ms frecuentemente el ciego, el recto-sigma o el colon ascendente. Los
abscesos hepticos por amebas son la forma extraintestinal ms frecuente de amebias
is, dndose aproximadamente en el 5% de los pacientes que presentan amebiasis inte
stinal. Se caracteriza por fiebre y dolor en el hipocondrio derecho. Estos absce
sos hepticos se suelen diagnosticar por escner, ecografa y test serolgicos. Las ameb
as estn presentes en las heces en menos de la mitad de los pacientes en el moment
o de la deteccin del absceso heptico. La hepatitis amebiana. caracterizada por un
aumento doloroso del hgado en personas con amebiasis intestinal, tambin puede prod
ucirse. Su patognesis es an poco conocida. Rara vez pueden aparecer abscesos amebi
anos en otros rganos como pulmn, cerebro o piel, bien por diseminacin hematgena desd
e el intestino o bien por continuidad desde abscesos hepticos. Se pueden formar m
asas de tejido granulomatoso (amebomas) como respuesta a la presencia de amebas,
pudiendo causar en el intestino una lesin en servilletero que podra simular un ca
rcinoma. Epidemiologa. La mayora de las infecciones por E. histolytica se adquiere
n por ingesta de agua o alimentos contaminados, aunque un brote se produjo por u
na irrigacin colnica contaminada (Istre, 1982). Se pueden ver seudoepidemias a cau
sa de la confusin en el laboratorio de las
clulas inflamatorias, otras amebas o restos fecales como si fuesen E. histolytica
(CDC. 1985; Krogstad, 1978). Aunque histolytica es un parsito endmico de Estados
Unidos, muchas personas lo adquieren durante viales o viviendo en pases extranjer
os. Diagnstico. El examen de una serie de muestras fecales puede ser suficiente p
ara el diagnstico de amebiasis intestinal en la mayora de los casos. Si se han adm
inistrado antibiticos o medios de contraste, la infeccin puede ser enmascarada dur
ante una temporada. El material aspirado de un absceso heptico puede mostrar trof
ozotos al microscopio. La ltima porcin del aspirado es la que ms trofozotos suele con
tener y puede usarse para el examen microscpico directo o para tincin permanenle.
Si hubiese tejido disponible, la seccin puede mostrar organismos que se tien mucho
con PAS (Lmina 55-7C) Los cultivos (Diamond, 1988; Visvesvara. 1992a) no tienen
un empleo muy extendido para diagnstico, pero son tiles para la investigacin y esen
ciales para determinar la patogenicidad basndose en las soenzimas Los test de dete
ccin de antigenos por EIA son especficos, sensibles y capaces de diferenciar a Ent
amoeba histolytica de Entamoeba dispar y estn disponibles en el mercado (Wilson,
1995; Murray, 1999; Rosenblatt, 1995). En uso de las tcnicas de PCR y de ADN tamb
in es til para diferenciar Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar (Bendall, 199
3; Samuelson, 1989; Weiss, 1995), pero no estn comercializadas. Los test serolgico
s (Tabla 55-5) son los ms tiles para el diagnstico de infeccin extraintestinal, ya q
ue aproximadamente el 95% de los pacientes con abscesos hepticos son seropositive
s. Esto disminuye al 70% para la infeccin intestinal y al 10% para los portadores
asintomtcos. Los titulos detectables pueden durar meses o aos tras el tratamiento
correcto (Wilson, 1995). Los trofozotos de Entamoeba histolytica miden de 10 pm a
60 pm de dimetro; la forma comensal suele medir de 15 pm a 20 pm y las formas in

vasivas unas 20 pm (Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5; Lmina 55-7), En el examen dire
cto, los trofozotos muestran una movilidad progresiva gracias a la rpida formacin d
e un pseudpodo hialino que tiene una clara dife* inrrt-cuentc. prohuhli'im'ntt- diu n g e n aniiKil.
Figura 55-4. A m e b a s halladas en las muestras fecales humanas. {Dientamoeba
Iragilis es un flagelado.)

to
Tabla 55-7 Morfologa de los trofozotos de las amebas intestinales Tamao (dimetro o l
ongitud) Ncleo Motilidad Nmero
:
Citoplasma Cromatina cariosmica Pequeo, discreto Habitualmente central pero a vece
s excntrico Apariencia Finamente granular Inclusiones A veces eritrocitos en las
formas invasivas Las no invasivas contienen bacterias Bacterias
Especies Entamoeba histolytica/ E. dispar
Cromatina perifrica Granulos finos Habitualmente distribucin y tamao regular
10-60 um; talla habitual, Progresiva, con 15-20 (im en la forma pseudpodos hialin
os comensal', en torno a como dedos 20 pm para las formas invasivas' 5-12 pm; ha
bitualmente Habitualmente no progresiva. de 8-10 (im pero a veces puede s e r pr
ogresiva 15-50 um; Como una babosa, no progresiva, lo habitual 20-25 um pseudpodo
s abruptos
1 No visible sin teir
Entamoeba hartmanni Entamoeba coli
Endoiimax nana lodamoeba btschiii
6-12 pm; lo habitual 8-10 (tm 8-20 pm; habitualmente 12-15 pm
C o m o una babosa habitualmente no progresivo, pseudpodos abruptos C o m o una b
abosa, habitualmente no progresiva
1 No visible sin teir 1 Frecuentemente visibles en preparacin sin teir 1 A veces vi
sible en preparaciones sin teir 1 No suele ser visibie sin teir
Similar a la Entamoeba Pequeo, discreto. histolytica Irecuentemente excntrico Gran
ulos bastos de tamao Grande, discreto, y distribucin irregular habitualmente excntr
ico
Finamente granular
Basto, frecuentemente Bacterias, vacuolado levaduras y otros materiales Granular
, vacuolado Bacterias
Ninguno
Grande irregular
Ninguno
Grande, habitualmente central. B a s t a m e n t e granular, Rodeado por granulo
s refrctiles vacuolado y acromticos. Estos granulos no suelen verse en las prepara
ciones teidas Grandes acmulos de 4-8 granulos Finamente granular, vacuolado
Bacterias, levaduras u otro material
Dientamoeba fragilis*
5-15 pm. habitualmente 9-12 pm
Los pseudpodos son angulares, aserrados o lobulados y alineados, casi transparent

es
2 (En el 20% slo hay un ncleo.) Son invisibles en preparaciones sin teir
Ninguno
Bacterias
'Habitualmente hallado en casos asniomticos o crnicos, puede contener bacterias. 'U
suaimente hallado en casos agudos; con frecuencia contienen glbulos rojos. 'Visib
le en material sin (jar Los ncleos se pueden ver a veces en material lijado 'Flagel
ado (vase texto) Adaptada de B r o o k eM MM e l v m DM: Morphology o f Diagnosti
c Stages Of Intestinal Parasites o f Man. U S D H E W PHS. Publicacin n.- 1.966.
1969

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MEDICA
1215
I nuiiiwbjvu.il
bniumijcbu Insilili Ltv'j
Figura 55-5. Ncleos de amebas. Este dibujo m u e s t r a algunas de las distintas
apariencias de los ncleos de las amebas en las preparaciones teidas. (Dientamoeba
Iragilises un flagelado: vase texto.)
renciacin entre el endoplasma y el ectoplasma: el ncleo no es visible. En la enfer
medad invasiva algunos trofozotos contienen eritrocitos sin digerir (Lmina 55-7C),
una caracterstica de la infeccin por E. histolytica. En las preparaciones teidas,
la cromatina nuclear perifrica suele distribuirse a lo largo de la membrana nucle
ar como finos granulos. El cariosoma es pequeo y a veces centralmente emplazado,
con finas fibrillas que no suelen ser visibles y que lo sujetan a la membrana nu
clear. Pueden existir variaciones en la estructura nuclear, pudiendo estar algun
os cariosomas localizados excntricamente y la cromatina perifrica distribuida irre
gularmente. La nica caracterstica que es patognomnica de E. histolytica es la fagoc
itosis de eritrocitos, que rarsima vez se produce en otras especies, El citoplasm
a es finamente granular y en los organismos invasivos no hay inclusiones, o bien
nicamente inclusiones de eritrocitos. En los organismos no invasivos pueden vers
e bacterias ingeridas. En los organismos en degeneracin, el citoplasma puede ser
vacuolado y el ncleo puede tener cromatina anormalmente agrupada. Los quistes de
E. histolytica son esfricos y miden de 10 pm a 20 pm (habitualmente de 12 pm a 15
Jim) de dimetro (Tabla 55-8; vanse Figs. 55-3 a 55-5: Lmina 55-7). La fase de preq
uiste tiene un ncleo nico y carece de pared refrctil. Cuando madura, desarrolla otr
os ncleos, siendo cada uno aproximadamente 1/6 del dimetro del quiste. Los ncleos s
on similares a los de los trofozotos, pero su tamao menor les hace menos Utiles co
mo caracterstica dlerenciadora. El citoplasma puede contener vacuolas de glucgeno y
cuerpos cromaloides de extremos romos o agudos. El numero y el tamao de los ncleo
s, as como el aspecto de los cuerpos cromatoides, son criterios importantes para
la identificacin de los quistes. En los laboratorios que no usan alguno de los mto
dos inmunolgicos o moleculares para diferenciar E. histolytica de E. dispar y que
cuentan nicamente con anlisis morfolgicos, se deben usar formatos de informes que
tengan en consideracin las tecnologas de diferenciacin. Asi, un informe de E. histo
lytica/E. dispar sera lo ms apropiado en ltima instancia. Amebas no patgenas. El mic
robilogo debe estar capacitado para diferenciar las amebas no patgenas o comensale
s de la histolytica/ E. dispar y de D. Iragilis (un flagelado), que son potencia
lmente patgenos. Las caractersticas de identificacin, que se ven mejor en cortes tei
dos permanentemente, se resumen en las Tablas 55-7 y 55-8 y en las Figuras 55-3
a 55-5. La identificacin de trofozotos se basa en el tamao y las caractersticas del
ncleo y del citoplasma: la identificacin de quistes se basa en el tamao, numero y c
aractersticas del ncleo y en la presencia de los cuerpos de cromatina. as como en s
us caractersticas, sin olvidar las masas de glucgeno. hartmanni tiene caracterstica
s morfolgicas similares a las de histolytica, excepto en que los trofozotos tienen
un dimetro mximo de 12 pm,
y los quistes de 10 pm. teniendo los quistes a veces un ncleo nico. Histricamente.
E. hartmanni tue llamada la raza pequea de histolytica. Su diferenciacin requiere
cuidadosas mediciones con un micrmetro ocular bien calibrado. Entamoeba coli. una
habitante habitual del lumen, puede ser difcil de diferenciar de E. histolytica.
El citoplasma se tie algo ms oscuro que el de E. histolytica y es ms vacuolado. co
nteniendo numerosas bacterias ingeridas, levaduras y otros materiales. Aunque la

s caractersticas nucleares difieren de las de Entamoeba histolytica (Fig. 55-5).

puede existir una superposicin significativa, especialmente en muestras que no se
han conservado debidamente. Los quistes maduros de coli contienen ocho ncleos, a
unque pueden llegar a tener 16 o ms. Los quistes inmaduros, que son poco comunes,
tienen cuatro ncleos (un cuarto del dimetro del quiste) mayores que los de E. his
tolytica (un sexto de dimetro del quiste) y pueden contener glucgeno. La distribuc
in de la cromatina perifrica y los cariosomas no tiene gran importancia en la iden
tificacin de los quistes de Entamoeba. Los cuerpos cromatoides, cuando se present
an, son irregulares, con extremo desflecado, mientras que los extremos romos se
ven en histolytica. Entamoeba nana es la ameba ms pequea que inlecta a los humanos
. Los trofozotos con frecuencia tienen un ncleo atpico que contiene una masa de cro
matina triangular, una banda de cromatina que atraviesa el ncleo o dos masas disc
retas de cromatina en los lados opuestos de la membrana nuclear (Fig. 55-5). Un
halo claro o espacio cariolinfoide rodea el cariosoma y se extiende a la membran
a nuclear. La forma nuclear atipica puede ser til en la diferenciacin de nana de /
. btschlii que es de una apariencia similar pero ms larga. Los quistes de Endolima
x suelen contener cuatro ncleos, aunque se pueden ver con menos ncleos. El glucgeno
, cuando est presente, se dispone difusamente por el citoplasma en vez de en masa
s. Los quistes se diferencian fcilmente de las otras amebas, pero se pueden confu
ndir con Blastocystis hominis. El ncleo del Blastocystis hominis pierde el halo q
ue se vea en los quistes de nana. El ncleo de los trofozotos de /. btschlii y sus qu
istes tienen un cariosoma grande y central frecuentemente rodeado por granulos a
cromticos que pueden no ser diferentes, pero aparecen slo como un halo o espacio c
ariolinfoide. En algunos ncleos, el halo es claro sin granulos acromticos, haciend
o al organismo indistinguible de nana. Los quistes de /. blschliicontienen un ncle
o nico en el que el cariosoma suele ser excntrico, con unos granulos acromticos en
media luna (vanse Figs. 55-3 a 55-5). Los quistes se caracterizan por una vacuola
prominente de glucgeno que se tie de marrn rojizo en las muestras frescas teidas co
n yodo, de ah el nombre del organismo. El glucgeno se disuelve con los fijadores a
cuosos y puede no ser visible en el material almacenado.

Tabla 55-8 Morfologa de los quistes de a m e b a s intestinales Especies Entamoeb

a histolytica/ E. dispar Tamao 10-20 urn; habitualmente 12-15 pm Contorno Habitua
lmente esfrico Ncleo Nmero 4 en los quistes maduros. 1 2 en los quistes inmaduros C
romatina perifrica Cromatina perifrica. Granulos uniformes. finos y homogneos Croma
iina cariosmica Pequea, discreta y habitualmente central Citoplasma Cuerpos cromat
oldes Presente. Barras alargadas con extremos desflecados Glucgeno Habitualmente
difuso. Frecuentes masas concentradas en los quistes jvenes Se tien de marrn rojizo
con el yodo Similar a Enthamoeba histolylica
Entamoeba hartmanni Entamoeba colt
5-10 urn riabitualmente 6-8 pm
Habitualmente esfrico
4 en ios quistes maduros Similar a Entamoeba 1 2 en los quistes inmaduros histol
ytica
Similar a Entamoeba histolytica
Presente. Barras alargadas con extremos desflecados
10-35 urn; Habitualmente esfrico. 8 en los quistes maduros habitualmente 15-25 u
r n Ocasionalmente ovaiado. Ocasionalmente quistes m u y triangular u otro conto
rno nucleados con 16 o ms L o s quistes inmaduros tienen 2 o ms
Endolimax nana
5-10 pm; habitualmente 6-8 u r n
Esfrico, ovalado o elptico
4 en los quistes maduros. A veces se ven quistes inmaduros con menos de 4 ncleos
lodamoeba biitschlii
5-20 pm; Ovalado, elptico, triangular 1 en los quistes maduros habitualmente 10-1
2 urn u otro contorno
Cromatina perifrica. Grande, discreto. Presente. Habitualmente Habitualmente difu
so, Bastos granulos habitualmente excntrico. con extremos castigados pero a veces
masas irregulares en tamao y pero a veces central bien definidas en los distribu
cin, pero quistes inmaduros. frecuentemente son ms Se lie de marrn uniformes que los
que se rojizo con el yodo encuentran en los trofozoitos Ninguno Grande, habitua
lmente Ocasionalmente, granulos Habitualmente dituso. central pequeos o masas ova
ladas Frecuentes masas pero no estn presentes en concentradas en los los cuerpos
vistos en quistes |venes. Entamoeba Se tie de marrn rojizo con el yodo Ninguno Gran
de, habitualmente Granulos a veces presentes. Masas compactas excntrico. Granulos
pero los cuerpos vistos en bien definidas. 'elrctiles. acromticos Enlamoeba no es
tn Se tien de marrn en uno de los lados del presentes oscuro con el yodo cariosoma
Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages of Intestinal Pa
rasites of Man. USDHEW PHS. PuDlicacion n " 1 966 1969.

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1217
Figura 55-6. A. Ciliados, coccidios y Blaslocyslis spp. hallados en muestras tec
ales humanas. B, Flagelados hallados en muestras tecales h u m a nas. (Adaptada
de Brooke MM. Melvin DM: Morphology ol Diagnostic Stages of Intestinal Parasites
o fM a n (Publicacin n. [CDC] 848116.) Washington, DL, Departamento de Salud y R
ecursos H u m a n o s de los Estados Unidos, 1984.
?
Blastocystis hominis. Blastocystis hominis es un protozoo similar a la ameba que
habita en el intestino y se encuentra frecuentemente en muestras fecales de ind
ividuos asintomticos. Algunos estudios han relacionado la enfermedad intestinal s
intomtica con infeccin grave, aunque esto es controvertido (Markell, 1986; Miller
1988: Sheehan, 1986; Stenzel, 1996: Zierdt, 1991). Los quistes pueden tomar una
de las siguientes tres formas: vacuolada, que es la ms comn, ameboide o granular.
La vacuolada tambin se conoce como forma vacuolada central, que suele ser esfrica
y de tamao variable (de 5 pm a 20 pm), con un rea central clara y de dos a cuatro
ncleos perifricos (Fig, 55-6A; Lmina 55-8G). Las formas ameboides de contornos atpic
os pueden predominan en infecciones graves. La presencia de Blastocystis se debe
informar, especialmente cuando son numerosos (cinco o ms por campo de 400x) (She
ehan. 1986; Stenzel. 1996).
Flagelados
Dientamoeba fragilis. Dientamoeba tragilis es un patgeno ameboide que infecta el
colon y se asocia a diarrea, especialmente en nios jvenes
(Preiss. 1991: Spencer, 1979; Tumer, 1985: Yang, 1977). Aunque es parecido a las
amebas. Dientamoeba se ha reclasificado como un flagelado basndose en los detall
es ultraestructurales y la similitud antignica. N o se le conoce un estadio de qu
iste. Debido a la similitud de Dientamoeba a las amebas en el microscopio de luz
ptica, estas especies se han incluido tradicionalmente en las tablas y figuras d
e las amebas (vanse Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5: Lmina 55-7H). Los sntomas incluy
en diarrea y distensin abdominal Recientes investigaciones sugieren que la dienta
mebiasis es una causa de diarrea ms frecuente de lo que se pensaba; el 4,3% de lo
s pacientes en un estudio podaban este organismo (Spencer, 1979: Murray, 1999).
Aproximadamente el 25% de las personas infectadas presentaban sntomas. En contras
te con la amebiasis, esta infeccin no suele asociarse con otros protozoos fecales
, pero muestra una asociacin entre diez y veinte veces mayor de lo esperado con e
nterobiasis (infeccin por oxiuros, analizado ms adelante). Esta asociacin sugiere q
ue la infeccin por D. tragilis puede estar difundida por la ingesta de huevos de
lombrices infectadas con D. tragilis (Burrows. 1956). La infeccin por D. tragilis
pasar desapercibida a menos que se examinen preparaciones con tincin permanente.
Pueden necesi-

1218
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
tarse muchas muestras, ya que la eliminacin varia da a da. Cuando se preparan exten
siones, la ltima parte de las muestras fecales debe ser la examinada, ya que es d
onde mayor nmero de parsitos se pueden encontrar. De 2/3 a 4/5 de los organismos c
ontienen dos ncleos que constan de un grupo de cuatro a ocho granulos cariosmicos
que pueden formar un cariosoma grande e irregular (Fig. 55-5), Se puede confundi
r con trofozotos de Enlamoeba nana o de /. btschlii. El citoplasma es finamente gr
anular y suele contener bacterias ingeridas. Los trofozotos son delicados y puede
n pasarse por alto fcilmente, de modo que la preparacin teida se debe examinar cuid
adosamente. Se ha descrito un mtodo de inmunofluorescencia que puede ayudar a su
deteccin pero que no est comercializado (Chan, 1993). Giardia lamblia. G. lamblia
es un protozoo patgeno intestinal que produce endemias y epidemias por todo el mu
ndo, y en EE.UU. es especialmente problemtica para los viajeros, campistas y homo
sexuales (Wolfe, 1992), Frecuentemente produce enfermedad en personas que beben
agua contaminada, y se ha descrito un gran nmero de epidemias a partir del agua e
n lugares como Aspen, Colorado. Leningrado. Rusia, Roma y Nueva Y o r k (Craun,
1986). Los protozoos patgenos no mueren por las concentraciones habituales de clo
ro de las aguas municipales, y as, salvo que se filtre, puede actuar de fuente de
infeccin, como ya sucedi en las epidemias de Roma y Nueva York. Los trofozotos de
G. lamblia se multiplican en el intestino delgado y atacan la mucosa mediante un
a ventosa ventral cncava. Puede ser asntomtica o producir patologa que va desde diar
rea leve con vagas molestias abdominales hasta un sndrome de malabsorcin con diarr
ea y esteatorrea, parecido a espre. La patogenia no est totalmente comprendida, au
nque puede darse una interrupcin de la integridad del borde en cepillo de la muco
sa, produciendo dficit de disacaridasas debido al efecto directo o indirecto del
parsito (Wolfe, 1992). La giardiasis se debe considerar en todo paciente con diar
rea de ms de diez das de duracin. El diagnstico se hace demostrando los trofozotos o
quistes de Giardia en las muestras fecales. Los trofozotos suelen estar en las he
ces darreicas, mientras que los quistes estn en las heces formadas. La eliminacin d
e los organismos vara de da en da, por lo que puede ser necesario el examen de dife
rentes muestras en diferentes das. El examen directo suele ser especialmente til p
ara el hallazgo de los trofozotos con su motilidad en "cada de hoja". Los quistes
se pueden ver tanto en examen directo como en concentraciones, y tanto quistes c
omo trofozotos se pueden ver en tinciones permanentes. En algunos casos no se pue
den hallar en muestras fecales y son necesarios pequeos aspirados intestinales o
muestras del test de la cuerda. El laboratorio debe ser avisado de antemano para
que el personal est disponible para la realizacin de un examen directo nada ms rec
ibir la muestra. Muchos mtodos de deteccin de antgenos por inmunofluorescencia o po
r EIA estn comercializados (Wilson, 1995; Wolfe, 1992; Garca, 1997). Parecen tener
buena sensibilidad y especificidad y pueden detectar algunas infecciones no det
ectadas por el examen de las heces. Tambin pueden ser especialmente tiles en inves
tigacin epidemiolgica, pero no reemplazan la necesidad de los tradicionales estudi
os morfolgicos para detectar otros parsitos. Los trofozotos de Giardia mirados desd
e el exterior tienen una torma de pera con extremo posterior en forma de huso y
poseen dos ncleos que les da el aspecto de una cara sonriendo con ojos prominente
s (Tabla 55-9: vanse Fig. 55-68 y Lmina 55-8C a E). Cuando se ven desde un lado, e
l extremo anterior es ms grueso y ahusado posteriormente: la mitad anterior const
a de una ventosa en la cara ventral. Los cuatro flagelos laterales, los dos vent
rales y los dos caudales no suelen ser evidentes en las muestras frescas o en la
s preparaciones teidas. Los quistes son ovales y suelen ser tener cuatro ncleos. B
ajo el ncleo, los cuerpos medios oscuros con fibrillas se cruzan longitudinalment
e, dando unas caractersticas internas distintivas. El citoplasma suele estar apar
tado de la pared de los quistes. Chilomatix mesnili. C. mesnili (Tabla 55-9; Fig

. 55-68; Lmina 55-8F) es un flagelado habitual del lumen no patgeno, que se debe d
istinguir de los trofozotos de las amebas y de Giardia en las preparaciones. La localizacin del nico ncl
eo en uno de los extremos y la forma de huso del otro extremo es til. Si se exami
nan varios organismos, serian visibles el citoplasma y el surco espiral en algun
os de ellos. Los tres flagelos externos no suelen ser visibles en preparaciones
teidas o fijadas con formalina. Los quistes con forma d e limn contienen varias fi
bras citosomales curvas con un aspecto parecido a un imperdible. Pentatrichomona
s hominis. P. hominis. conocida antiguamente como Trichomonas hominis (Tabla 559; Fig. 55-68) es un raro flagelado intestinal no patgeno que se puede confundir
con Entamoeba hartmanni o los pequeos trofozotos de Entamoeba histolytica. No se ten
especialmente bien y frecuentemente se distorsionan en las preparaciones. Hay q
ue examinar muchos de ellos en las preparaciones teidas para lograr ver el ncleo ni
co similar al de Entamoeba. la membrana ondulada y los flagelos. Un objeto promi
nente similar a una vara, el axostilo, atraviesa el organismo y protruye en el e
xtremo posterior. No se han descrito estadios quisticos. Trichomonas vaginalis.
Trichomonas vaginalis es una causa frecuente de vaginitis, caracterizada por inf
lamacin, prurito, flujo vaginal y. a veces, disuria. Se suele transmitir por rela
cin sexual, frecuentemente por varones que tienen una infeccin asntomtica. A veces l
os hombres pueden padecer una prostatitis o una uretritis. Trichomonas vaginalis
se suele diagnosticar en el mismo despacho del mdico mediante un examen directo
del flujo vaginal o del prosttico, o bien del sedimento de orina. Morfolgicamente,
Trichomonas vaginalis se asemeja al P. hominis. pero es ms grande (cerca de 23 p
m) y la membrana ondulante se extiende slo hasta la mitad del cuerpo. Debido a la
diferencia en el habitat, no suele ser necesario diferenciar estas Trichomonas
morfolgicamente. El examen directo puede ser insensible y el uso de cultivo o las
tcnicas de inmunoensayo se recomiendan cuando el diagnstico no es fcil (Garca, 1997
; Visvesvara, 1992b; Wilson, 1995). Los cultivos tienen una sensibilidad de apro
ximadamente el 90% (Beal, 1992; Krieger, 1988; Schmid. 1989), as como las tcnicas
inmunofluorescentes y el EIA que usan anticuerpos monoclonales (Kreiger, 1988; L
isi, 1988; Wilson, 1995). La tincin de Papanicolaou puede revelar T. vaginalis en
ocasiones, pero tiene baja sensibilidad y especificidad. Otros flagelados. Ente
romonas hominis y Retortamonas intestinalis son flagelados intestinales pequeos,
no patgenos, que se ven rara vez y que cuando estn presentes pueden darse en gran
nmero. Las caractersticas morfolgicas se revisan en la Tabla 55-9 (vase tambin la Fig
. 55-68). Trichomonas tenax son unas tricomonas que veces se aislan en la cavida
d oral, pero no causan enfermedad.
Ciliados
Balantidium coli. B. coli (Fig. 55-6A; Lmina 55-8H) puede causar un sndrome simila
r a la disentera con lceras en el colon similares a las de las amebas, pero no pro
duce abscesos hepticos u otras lesiones sistmicas. La inleccin humana, rara en EE.U
U., se puede adquirir de los cerdos, que son los habitualmente infectados. 8. co
li es el protozoo ms grande que infecta a los humanos. Los trofozotos van desde 40
pm hasta cerca de 200 pm en su mayor tamao (la mayora son de 50 pm a 100 pm) y es
tn cubiertos uniformemente con cilios que son ligeramente ms largos en el extremo
anterior, adyacente al citostoma. Hay un gran ncleo que se ve tcilmente en las pre
paraciones, y un microncleo ms pequeo que rara vez es visible. En el citoplasma hay
numerosas vacuolas alimenticias y vacuolas contrctiles. Los quistes son redondos
, midiendo de 50 pm a 70 pm de longitud. En los quistes ms jvenes se pueden ver ci
lios y las caractersticas nucleares son similares a las de los trofozotos. Las mue
stras fecales contaminadas con agua estancada pueden contener ciliados de vida l
ibre que pueden diferenciarse de 8. coli por el patrn ciliar.

Tabla 55-9 Morfologa de los flagelados intestinales Especies Trofozotos Pentatrich

omonas lodo hominis' Chilomastix mesnih Giarda lamblia Enteromonas hominis Relor
lamonas intestinalis Especies Quistes Chilomastix mesnih Giardia lamblia habitua
lmente 6-7 (jrn 6-10 jim; habilualmente 8-9 um Tamao 8-13 ym; habilualmente il-i2
u.m Enteromonas Retortamonas hominis intestinalis 4-10 um; habitualmente 6-8 ym
4-9 um. habitualmente 4-7 um Alargado u oval Forma de pera o similar a un limn Ta
mao
8-20 L U T I ;
Forma Forma de pera
Motilidad Rpida, en sacudidas
U.- de ncleos
N de flagelos' 3-5 anterior.
Otras caractersticas Membrana ondulada que se extiende a lo largo de el cuerpo Ci
tostoma prominente que se extiende un tercio o la mitad Surco espiral a lo largo
de la superficie ventral Ventosa que ocupa la mitad o tres cuartos de la superf
icie ventral Un lado del cuerpo es plano. Flagelo posterior que se extiende libr
emente hacia el posterior o el lateral Citostoma prominente que se extiende apro
ximadamente hasta la mitad del cuerpo Otras caractersticas Citostoma con fibrilla
s de soporte. Habitualmente visible en preparaciones teidas Fibrillas o flagelos
longitudinales en el quiste Citoplasma frecuentemente apartado a una porcin de la
pared del celular Se asemea al quiste de E. nana. Los flagelos o fibrillas no su
elen verse Se parece al quiste de Chilomastix. Sombra exterior al citoplasma con
fibrillas de soporte que se extienden sobre el ncleo
habilualmente 11-12 um 6-24 urn habitualmente 10-15 um Forma de pera 10-20 (im;
habilualmente 12-15 u . m 4-10 um; Forma de pera u oval En sacudidas habilualmen
te 8-9 um 4-9 um, Forma Forma de limn con unos botones hialinos anteriores o "pezn
' Oval o elptico Oval En sacudidas Cada de hoia F o r m a de pera Rotatoria, rgida
No visible en preparaciones sin teir 1 No visible en preparaciones sin teir 2 No v
isible en preparaciones sin teir 1 No visible en preparaciones sin teir 1 No visib
le en preparaciones sin teir N. de ncleos
?
1 posterior 3 anterior, 1 en el citostoma 4 lateral 2 ventral. 3 caudal. 3 anter
ior. 1 posterior 1 anterior, 1 posterior
1 No visible en preparaciones sin teir Habitualmente 4 No diferenciabies en prepa
raciones sin teir Habitualmente localizados en un extremo 1 -4 habitualmente 2 en
el extremo opuesto del quiste, no visible en preparaciones sin teir

No visible en preparaciones sin teir

'No es practico para la identificacin de especies en el examen ordinario 'Pentatr
ichomonas hormnis no tiene forma guistica. Adaplada de Brooke MM Melvm MD Morpno
logy of Diagnostic Stages of Intestir
is of Mai USDHEWPHS Publicacin n.1.966 1969
No ~o

1220
Coccidios
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Los coccidios comprenden un gran grupo de parsitos apcomplejos que tienen una lase
sexual en el intestino de los vertebrados e invertebrados. Algunas especies pue
den tambin desarrollarse asexualmente en zonas extraintestinales en los tejidos d
el husped. Los gneros infectantes del intestino humano, como Isospora. Sarcocystis
. Cryptosporidium y Cyclospora suelen producir una diarrea autolimitada en perso
nas inmunocompetentes. Se puede desarrollar una diarrea grave en inmunosuprimido
s tras la infeccin de Isospora. Cryptosporidium y Cyclospora. Isospora belli. Iso
spora belli sufre un desarrollo sexual y asexual en el citoplasma de las clulas e
piteliales del intestino delegado (Lmina 55-9/4). El desarrollo sexual produce oo
quistes. que pasan a las heces y maduran a fase infectiva en el medio ambiente.
La infeccin humana causa diarrea y malabsorcin. que suele ser autolimitada. En pac
ientes con sida u otra inmunosupresin, la enfermedad puede durar meses o aos y pod
ra causar la muerte (DeHovitz, 1986; Mannheimer. 1994). El diagnstico se hace hall
ando ooquistes no esporulados de 12 x 30 pm en las heces, habitualmente en exame
n directo o en preparaciones concentradas (Lmina 55-9S). Si la muestra sin fijar
se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas, se produce la esporulacin.
Los ooquistes infectivos contienen dos esporoqustes, cada uno de los cuales tiene
cuatro esporozoitos (Fig. 55-6/4) Los ooquistes. como los de Cryptosporidium, s
e tien con tincin cido resistente. Sarcocystis spp. Las especies de Sarcocystis son
coccidios de doble husped en los que la lase sexual se da en el intestino de car
nvoros y la asexual o extraintestinal se da en los msculos y tejidos de huspedes in
termediarios. Los humanos pueden servir como huspedes intermedios o como huspedes
definitivos, dependiendo de la especie de Sarcocystis. La infeccin intestinal con
S. hominis y S. suihominis se adquiere por ingesta de carne poco hecha (vaca o
cerdo) respectivamente, que contiene los quistes tisulares (sarcoquisles), La in
feccin suele ser asmtomtica, pero algunos pacientes desarrollan diarrea pasajera,
dolor abdominal o anorexia. La infeccin intestinal es autolimitada, ya que la mul
tiplicacin asexual se produce en el husped intermediario y no se repite en el huspe
d definitivo. La produccin de ooquistes se limita por el nmero de organismos inger
idos como sarcoquistes. El diagnstico se hace al detectar los esporoquistes espor
ulados de 25 x 33 pm en las heces (Fig. 55-6A). Cada esporoquiste maduro contien
e cuatro esporozoitos. La pared de los ooquistes es fina y no suele verse o se r
ompe liberando dos esporoquistes. Estas formas, que se ven mejor en examen direc
to o en tinciones cido resistentes, parecen ms grandes que los ooquistes de Crypto
sporidium, y la tincin de tricromo es de poco valor en la deteccin de estos parsito
s. Los hombres tambin puede servir de husped intermediario en muchas especies inno
minadas de Sarcocystis (conocidos colectivamente como S. lindemannt), en cuyo ca
so los quistes se encuentran en los msculos esquelticos y cardacos (Beaver. 1979: S
trickland, 1999). Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum utiliza un nico
husped en su ciclo vital, pero puede infectar a humanos y a una gran variedad de
animales, incluidos los de ganado vacuno y ovino. Los parsitos se desarrollan en
el borde en cepillo de las clulas endotelales del intestino y a veces se extienden
a otras zonas como la vescula biliar, el pncreas o el tracto respiratorio (vanse F
ig. 55-6A y Lmina 55-9Cy 0). Cryptosporidium es una causa frecuente de diarrea ag
uda autolimitada en personas sanas, especialmente en nios. La epidemiologa es simi
lar a la de Giardia. Uno de los mayores brotes conocidos transmitido por agua se
produjo en Milwaukee y Wisconsin en el ao 1993. En este brote, ms de 400.000 pers
onas cayeron enfermas por beber agua contaminada con vertidos de granjas tras un
as fuertes lluvias (McKenze, 1994). Como los quistes de Giardia y los ooquistes d
e Cryptosporidium son resistentes a la cloracn habitual del agua potable, y a meno
s que el agua comunitaria se filtre, pueden darse epidemias. En pacientes con si

da, Cryptosporidium puede producir diarrea secretora crnica que puede durar meses
o aos y puede acarrear la muerte. El perodo de
incuacin es aproximadamente de ocho das, y en personas previamente sanas puede dura
r de 9 a 23 das. Los pacientes pueden tener malestar, liebre, anorexia, calambres
abdominales y diarrea (Current, 1991; Mannheimer, 1994). El diagnstico se suele
hacer examinando las heces. Existen varios mtodos de concentracin que son buenos,
incluidas la sedimentacin con formalina-etil actico y la flotacin en azcar de Sheath
er (Garca, 1983). La disponibilidad del mtodo de formalina-etil actico hace a esta
tcnica muy atractiva, aunque se deben incrementar al mximo el tiempo y la velocida
d de centrifugacin para maximizar el rendimiento (NCCLS, 1997; Isenberg. 1992), S
e prepara una extensin con el sedimento y se tie con tinte cido resistente o reacti
vos inmunolluorescentes. Se han evaluado muchos mtodos de tincin cido resistente, i
ncluida la auramina-O, pero el que tiene un uso ms extendido es el mtodo de Kinyou
n modificado. Los ooquistes esfricos miden de 4 pm a 6 pm de dimetro y cuando se t
ien de este modo se tornan a un fucsia profundo, aunque hay algunas irregularidad
es en la intensidad de la tincin y puede variar el porcentaje de los quistes que
se tien. Se debe usar un control positivo en cada preparacin. Son especialmente bu
enos los reactivos de inmunofluorescencia y de EIA, con alta sensibilidad y espe
cificidad (Arrowood. 1989; Murray. 1999; Rosenblatt, 1993; Rusnack, 1989), para
los laboratorios donde es poco habitual el hallazgo de Cryptosporidium y donde h
ay dificultad para la interpretacin de las tinciones cido resistentes. La necesida
d de examinar heces para Cryptosporidium depende de la poblacin a cubrir, de los
objetivos, de los intereses y de la habilidad del personal del laboratorio. Algu
nos laboratorios realizan exmenes para Cryptosporidium slo si se pide especficament
e y otros examinan todas las muestras de los inmunosuprimidos. Cyclospora cayeta
nensis. Cyclospora cayetanensis es un parsito coccidio de reciente descripcin resp
onsable de enfermedad diarreica en inmunocompetentes e inmunosuprimidos (Ortega,
1994: Murray. 1999). Se ha deteclado en pacientes de diferentes pases, incluido
Estados Unidos, y fue inicialmente descrito como un alga verde-azulada, similar
a un cuerpo parecido a una cianobacteria, o como un coccidio (Ortega. 1993). La
infeccin produce un cuadro seudogripal, con nuseas, vmitos, prdida de peso y diarrea
acuosa explosiva que dura de una a tres semanas. Los ooquistes no esporulados s
on esferas no retrctiles de 8 pm a 10 pm que contienen un acumulo de glbulos refrct
iles englobados dentro de una membrana cuando son vistos al microscopio de luz pt
ica. Se requieren de una a dos semanas para su esporulacin, despus los ooquistes m
aduros contienen dos esporoquistes, cada uno con dos esporozoitos. En las tincio
nes de tricromo los ooquistes aparecen como objetos claros, redondos y algo arru
gados. Los ooquistes autofluorecen desde un verde brillante a un azul intenso ba
jo la epifluorescencia ultravioleta y las tcnicas de tincin con colorante cido resi
stente modificado o auramina-O. Se deben diferenciar de los ooquistes de Cryptos
poridium, que se tien de igual forma pero son ms pequeos (de 4 pm a 6 pm) (Lmina 559E).
Microsporidios
Los microsporidios son unos parsitos protozoos lormadores de esporas, intracelula
res estrictos, del filo Microspore que infectan a variedad de animales, incluido
s los humanos (Franzen. 1999: Shadduck. 1989). Hay importantes patgenos en los hus
pedes inmunosuprimidos, especialmente en aquellos con sida, siendo responsable e
n ellos de un gran porcentaje de diarreas inexplicables por otra causa (ms del 30
% en algunos estudios) (Curry, 1993). Enterocytozoon bieneusiy Encephalitozoon i
ntestinalis, las dos especies ms frecuentemente implicadas en la infeccin intestin
al humana, pueden producir diarrea y prdida de peso en los pacientes con sida, si
milares a las causadas por Cryptosporidium. E. intestinalis tambin puede producir
enfermedad diseminada (Cali, 1993; Willson, 1995). Los organismos se multiplica
n mtracelularmente (merogonia) y forman esporas resistentes (esporogonia) que ro
mpen ocasionalmente la clula

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1221
Figura 55-7. Tamaos relalivos de los huevos de helmintos. (Del CDC. R a m a de En
trenamiento Parasitolgico, Atlanta. GA.)
husped e infectan las clulas adyacentes o se eliminan al exterior. La esporas cont
ienen un tbulo enrollado que se refuerza por el apropiado estimulo ambiental y pe
netra la membrana de las clulas receptoras. El esporoplasma del parsito se inyecta
a travs del tbulo al citoplasma de la clula husped, donde se multiplica. Los reservn
os no se han identificado. A veces ha habido pacientes que han sido infectados p
or otros gneros de microsporidios, incluidos Encephalitozoon (hepatitis, infeccin
ocular, enfermedad del sistema nervioso central). Nosema (infeccin diseminada) y
Pleistophora (miosis) (Curry. 1993: Shadduck. 1989). entre otras (Franzen. 1999).
Hasta hace poco, el diagnstico requera el examen de los tejidos al microscopio de
luz ptica (Lmina 55-9Fy G) y al microscopio electrnico. El desarrollo de una tincin
de tricromo modificada para el examen de muestras fecales para esporas ha resul
tado un importante avance en el diagnstico (Weber. 1992). Con este mtodo, las pequ
eas esporas elpticas (de 1,5 pm a 3 pm) se tien de rojo sobre un fondo dbilmente ver
de, y algunas poseen una caracterstica banda cruzada (Lmina 55-9H). Tambin se han d
escrito modificaciones de este mtodo. Las tinciones fluorocromas, as como la Uvite
x 2B y la calcotlor blanco, parecen ser ms sensibles en la deteccin de esporas y pu
eden ser tiles en el screening inicial de la muestra (DeGirolami, 1995: Luna, 199
5: van Gool, 1993). El pequeo tamao de las esporas hacen de su deteccin todo un ret
o.
hasta cerca de 10 m de longitud, y para los huevos de 25 pm a 150 pm (Fig. 55-7)
. Es importante una comprensin de los ciclos vitales de los helmintos y de su dis
tribucin geogrfica para el conocimiento de las fases parasitarias que pueden encon
trarse ante una sospecha, qu rganos o tejidos pueden afectarse y cundo se puede esp
erar que aparezcan los diferentes estadios tras la exposicin. Aunque el diagnstico
suele depender del hallazgo e identificacin de un estadio del desarrollo (huevo,
larva o adulto), algunas infecciones se puede diagnosticar principalmente por l
a clnica o los datos serolgicos, o ambos. Ciertas especies tienen ciclos de desarr
ollo donde los estadios infecciosos se pueden transmitir directamente de persona
a persona (Enterobius y H. nana). En otros (Trichuris. Ascaris y Trichostrogylu
s) se requiere un periodo extra de maduracin en el extenor del husped antes de que
el huevo o la larva sean infecciosos. La ingesta de los estadios infecciosos pu
ede ser accidental por el parsito vector iDipylidium. Hymenolepis). plantas (Fasc
iolopsis. Fasciola) o tejidos animales (Trichinella, Taenia. Diphyllobolhrium. C
lonorchis. Opisthorchis. Paragonimus. Heterophyes. Melagonimus y Nanophyelus). E
n algunos casos las larvas pueden penetrar directamente la piel (uncinarias. Str
ongyloides y esquistosomas). La deteccin e identificacin de los huevos y larvas en
heces, orina o esputo requieren una sistemtica aproximacin y el entrenamiento ade
cuado del personal. El tamao de los huevos y de las larvas es una caracterstica es
pecialmente importante, y con frecuencia se requiere el uso de un micrmetro ocula
r calibrado. Se debe prestar atencin a las caractersticas externas d e los huevos,
incluida la forma, el grosor de la pared, la presencia o ausencia de cubierta m
amelonada. oprculos, hombros operculares. botn, tapn polar o espinas. Tambin se debe
observar el desarrollo de los huevos (embrionados o sin embrionar) la presencia
o ausencia de ganchos, que caracterizan a los cestodos. El examinador tambin nec
esita conocer la gran variedad de artefactos que se detectan en las heces y que
pueden simular huevos o larvas (Tabla 55-4).
HELMINTOS INTESTINALES

Los helmintos intestinales aqu tratados incluyen nematodos (gusanos redondos), ce

stodos (tenias) y tremtodos (lombrices), que residen como adultos en el tracto de
gastrointestinal o en otras localizaciones (hgado, pulmn o sangre) y que producen
huevos que salen dei cuerpo humano por va intestinal. Los tamaos para los helmint
os adultos van desde 1 m m

1222
Nematodos
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
un grueso caparazn con estras radiales y tapones mucosos que son poco llamativos.
Ascaris lumbricoides. Este es el nematodo ms largo que afecta al tubo digestivo h
umano y probablemente el gusano intestinal redondo ms frecuente, puesto que infec
ta a aproximadamente 1 , 3 billones de personas en todo el mundo (Markell, 1999)
. Afecta principalmente a regiones con pobre higiene y, como el Trichuris, es ms
comn en nios, siendo, a su vez, los ms predispuestos a las infecciones graves. Asca
ris adulto vive principalmente en el duodeno y en el yeyuno proximal. Las hembra
s miden ms de 35 cm de largo por 6 m m de dimetro. El m a c h o es algo ms pequeo y
tiene un extremo curvado ventralmente, a diferencia de la hembra (Lmina 55-10F).
Tanto los inmaduros como los adultos se pueden identificar por la presencia de t
res labios prominentes en su porcin anterior. Las hembras producen unos 2.000 hue
vos al da, que estn sin embrionar y requieren de 4 a 6 semanas en un ambiente ptimo
para que sean infectivas. Posteriormente, al ingerirlos alcanzan el intestino y
las larvas penetran en la mucosa llegando al torrente circulatorio. De ah son tr
ansportados a los pulmones, donde maduran rpidamente en el lecho capilar alveolar
y luego pasan al alvolo. Los mecanismos de aclaramiento mucociliar los arrastran
hasta la epiglotis y nuevamente son ingeridos y se hacen adultos en el intestin
o. Desde que son huevos hasta que alcanzan el estadio adulto pasan aproximadamen
te dos meses. La clnica de la ascariasis va desde la infeccin asintomtica a la enfe
rmedad grave. El paso de las larvas por los pulmones puede causar u n a neumonit
is por Ascaris o un sndrome de Lffler, caracterizado por infiltrados pulmonares di
fusos bilaterales y bronquitis con eosinoflia asociada. Este sndrome es infrecuent
e y habitualmente se produce en individuos previamente expuestos a los antgenos d
e los Ascaris.
Enterobius vermicularis. La infeccin por Enterobius u oxiuros es la infeccin helmnt
ica ms frecuente en nios de todos los estratos sociales en EE.UU. Aunque es princi
palmente tpica de los nios, la rpida maduracin de los huevos permite que sea fcilment
e transmitida de nio a nio y a adultos tanto en familias como en instituciones. Lo
s gusanos machos o hembras viven principalmente en el ciego y en las reas adyacen
tes. Las hembras miden ms de 13 mm y tienen un extremo posterior puntiagudo que d
a pie a su nombre, oxiuro. Ambos sexos tienen prominentes alas laterales que se
ven en una seccin axial y un bulbo esofgico prominente (Lmina 55-1OA a C). Aunque l
os machos rara vez son vistos, las hembras se pueden encontrar en la superficie
de las heces o en la piel perianal, especialmente por la noche, donde deposita s
us huevos; stos son incoloros y ovoidales con un lado aplanado y miden entre 20 p
m y 40 pm de ancho y de 50 pm a 60 pm de largo (Lmina 55-106). Se hacen infectivo
s en horas y Iras ser ingeridos completan el desarrollo hasta adultos grvidos en
un mes (perodo de latencia). Aunque la infeccin puede ser asintomtica. los nios frec
uentemente tienen prurito anal, irritabilidad e insomnio. La infeccin por Enterob
ius debe ser descartada en todo estudio de enuresis. Los gusanos adultos pueden
migrar a zonas inusuales, como la vagina, la trompa de Falopio o la cavidad peri
toneal. Su muerte en estas localizaciones puede producir una reaccin inflamatoria
granulomatosa (Symmers. 1950). La deteccin de los huevos y. a veces, de los gusa
nos adultos en la piel perianal se hace mediante la tcnica de papel de celofn dura
nte el sueo o a primera hora de la maana (Ash, 1987; Garca, 1997). En el examen hab
itual de las heces slo se detecta del 5% al 10% de los casos. Se requiere un exam
en de muestras tomadas en diferentes das para poder detectar los huevos (Sadun, 1
956).
La presencia de escaso nmero de gusanos en el intestino no suele advertirse, mien

tras que la infeccin grave produce diferentes grados de diarrea y dolor abdominal
. Tambin puede producirse una obstruccin Trichuris thchiura. La infeccin por Trichu
ris es tpica de las zonas trointestinal con una masa de gusanos, especialmente en
nios. Incluso con picales y subtropicales. Los gusanos adultos se hallan en el i
ntestino y espepoco nmero de gusanos, hay que estar alerta, ya que tienen facilid
ad para cialmente en el ciego, pero las infecciones graves se pueden ver en el c
olon invadir sitios ectpicos, como la va biliar y el hgado, el apndice y el y en el
recto. Los machos y hembras miden ms de 50 mm de longitud y perestmago. La fiebre
y el tratamiento pueden favorecer su migracin. En las manecen en la mucosa por el
extremo anterior, que es fino, mientras que el zonas endmicas con frecuencia se
usan antihelmnticos antes del uso de otro extremo, ms grueso, cuelga libremente en
la luz. La hembra es alargaanestesia en la ciruga. da, mientras que la cola de l
os machos es enrollada (Lmina 55-10D). TriEl diagnstico se realiza al visualizar l
os huevos en las heces o por la churis tiene un ciclo vital en el que los huevos
salen con las heces sin deteccin de un gusano adulto en el vmito o en las heces.
Un recuento embrionar y tarda varias semanas, en las adecuadas condiciones de la
tiemenor de 20 huevos por extensin (2 mg de heces) indica infeccin leve, y rra, e
n madurar a un estadio infectivo. Cuando se digieren huevos embriosi es mayor de
100 huevos, por extensin, indica infeccin grave. nados, se liberan larvas y madur
an en el colon, donde se fijan y viven ms Los huevos frtiles de Ascaris pueden ser
redondos o ligeramente ovales, de diez aos. con una cubierta irregular externa,
mamelonada, amarilla-marrn y con un Las infecciones leves suelen ser asintomticas,
pero cuando hay muchos caparazn grueso. Los huevos que pierden su cubierta se ll
aman decorticaparsitos (ms de 300 gusanos) pueden aparecer diarrea o sntomas de dos
y pueden asemejarse a los de las uncinarias. Se eliminan sin embrionar disentera
junto con deshidratacn y anemia (Beaver, 1984; Strickland, 1999). y miden aproxim
adamente de 55 pm a 75 pm de largo por 35 pm a 50 pm de Una posible complicacin e
n nios con infecciones graves es el prolapso recancho (Lmina 55-10G y H). Las hemb
ras pueden producir huevos sin fertilital (Cooper, 1988). zar, que son ms largos
y ms alargados (ms de 90 pm de longitud) y tienen El diagnstico se hace al hallar l
os huevos en las muestras fecales o una cubierta ms fina y con mamelones irregula
res. Estos huevos estn llecon tcnicas de conservacin. Los huevos son como barriles,
con unos nos de gotas de grasa irregulares. tapones refrctiles en ambos extremos
, y suelen medir de 50 pm a 55 p m Trichostrongylus spp. La enfermedad humana ca
usada por Trichosde largo por 22 pm a 24 pm de ancho (Lmina 55-10E). A veces, los
trongylus spp. representa una infeccin zoontica, ya que infecta principalhumanos
se pueden infectar por el gusano del perro, T. vulpis, que posee mente a herbvoro
s como la oveja, la vaca o las cabras. Hay distintas espeunos huevos ms grandes y
anchos que los de Trichuris trichiura. A veces cies que pueden infectar a human
os como, T. colubriformis. T. orientalis. T. pueden ser necesarias tcnicas de cua
ntificacin de los huevos para valoaxei y T. brevis, que se encuentran en muchas p
artes del mundo. Los gusarar la intensidad de la infeccin, la eficacia del tratam
iento y la tasa de nos adultos habitan en el intestino y producen huevos que mad
uran en el reinfeccin. exterior. Las larvas salen y se colocan entre la tierra y
la vegetacin, donde pueden ser ingeridos por sus huspedes definitivos. A diferenci
a de las unciCapillaria philippinensis. Este parsito, que normalmente se narias.
no invaden la piel directamente ni poseen una fase migratoria por los encuentra
en pjaros que se alimentan de peces, afecta a humanos que pulmones. Las infeccion
es suelen ser leves y asintomticas, pero las graves comen pescado crudo y que con
tiene larvas. Aunque se describi en pueden dar diarrea y dolor abdominal, habitua
lmente con eosinoflia. Los huepersonas de Filipinas, y luego en Tailandia, a vece
s se ven casos en vos son semejantes a los de las uncinarias pero ms largos y est
rechos, de otras partes de Asia. Oriente Medio y Sudamrica (Cross, 1992). Puede 7
8 pm a 98 pm por 40 pm a 50 pm y ligeramente ahusados en un extremo. producir di
arrea crnica y los infectados pueden eliminar huevos, larvas y gusanos adultos en
las heces. Los huevos son similares a los de TriUncinarias. Las uncinarias, que
estn entre los helmintos que con ms churis, aunque miden de 36 pm a 45 pm de larg
o y 21 pm de ancho, con frecuencia afectan a los humanos, se dan en regiones tro
picales y subtropi-

CAPTUIO 55

PARASITOLOGA MDICA
1223
secundaria. Por cada adulto de A. duodenale se pueden perder entre 0.15 I y 0.25
mi de sangre al da. comparado con los 0,03 mi de cada N. americanus. El crecimie
nto del nio puede verse afectado con la infeccin crnica. La prdida de sangre y el nme
ro de uncinarias se correlacionan con el numero de huevos por gramo de heces, lo
que puede a ayudar a determinar cundo empezar el tratamiento en pacientes en reas
endmicas (Layrisse, 1964a, 1964b). El diagnstico se realiza por el hallazgo de hu
evos de cubierta fina en las heces. stos son parcialmente embrionados cuando se e
liminan y miden de 58 um a 76 pm de longitud por 36 pm a 40 pm de ancho (Lmina 55
-11/4). Los huevos embrionados o de larvas rabdiformes libres pueden encontrarse
en muestras sin conservar que no se examinan en su momento. Las uncinarias rabd
iformes pueden distinguirse de las de Strongyloides slercolans. ya que las prime
ras tienen una cmara bucal ms grande y un primordio genital que no llama la atencin
(Fig. 55-8). La maduracin de las larvas tiene como consecuencia la aparicin de fi
laras infectivas, que tienen un extremo puntiagudo y un esfago que mide aproximada
mente un cuarto de su longitud. Los huevos de uncinarias se deben diferenciar de
los de Trichostrongylus spp. (que son ms largos y ms picudos) y de los de los nem
atodos de las plantas, especialmente Heterodera spp. (que son ms largos, con el e
xtremo romo, que pueden ser asimtricos) (Lmina 55-116). Aunque los adultos se pued
en diferenciar segn las partes de la boca y la bolsa copulatoria de los machos, l
os huevos de las uncinarias humanas son indistinguibles. En el examen directo, u
n recuento de menos de cinco huevos por portaobjetos denota infeccin leve, que ra
ramente puede producir anemia, mientras que ms de 25 indica infeccin grave y que fc
ilmente puede asociarse a sntomas. Figura 55-8. Larvas de uncinarias y de Strongy
loides slercolans A. Larva rabdiloiStrongyloides stercolaris. La infeccin por Str
ongyloides se da en de de S. slercolans en heces humanas. Obsrvese el corto tamao
de la cavidad muchas zonas de los trpicos y subtrpicos, pero la infeccin tambin se b
ucal y el gran primordio genital (GP). 6, Larva rabditoide de uncinarias vista e
n las produce en zonas templadas y que histricamente fueron reas endmicas heces dej
adas 24 horas a temperatura ambiente. La cavidad bucal es ms larga y del sureste
de los Estados Unidos. Las hembras adultas miden de 2 mm a el primordio es ms cor
to 3 mm y viven unidas a la mucosa del duodeno, donde se reproducen por padenogne
sis (Lmina 55-11C), Los machos no se dan en los vertebrados. Los huevos se abren
en el intestino, liberando la lase inicial o larvas rabditoides que salen en las
heces (los huevos casi nunca se hallan). En este ciclo directo las larvas rabdi
toides se transforman en diarias infectivas de tercer estadio en el suelo. Estas
larvas infectivas penetran con facilidad la piel de los individuos y migran a l
os pulmones por va circulatoria, y de ah al rbol bronquial, siendo nuevamente deglu
tidas. Es entonces cuando se completa el desarrollo a estadio adulto. Bajo unas
condiciones de suelo adecuadas con gran humedad, se puede dar un ciclo indirecto
transitorio cales y en algunas zonas templadas. Necaloramericanus se halla en E
E.UU. en el que las nuevas larvas evolucionan a una generacin de vida libre y en
otras partes del mundo, superponindose su distribucin con la de consistente en mac
hos y hembras reproductivas. Los huevos asi formados Ancylostoma duodenale. que
no se da en EE.UU. desarrollan larvas filariformes que infectan de nuevo a los h
umanos. Una Las hembras adultas miden ms de 12 mm y los machos un poco metercera
variante del ciclo de vida de Strongyloides consiste en autoinfecnos. Los machos
se diferencian por la bolsa copulatoria con forma de abacin. en la que la madura
cin del estadio filariforme se completa en el tracnico en su extremo posterior. E
n el extremo anterior tienen una cpsula to intestinal, con la consiguiente reinva
sin de la mucosa intestinal o de la bucal que contiene dientes o lminas cortantes.
Ambos sexos se fijan a la piel perianal. mucosa intestinal, donde pueden vivir
ms de dieciocho aos (Beaver, 1988). Los huevos se eliminan por las heces y se desa

rrollan rpidamente segn las condiciones. Las larvas rabdiformes se liberan y se ha

cen infectivas en su estadio de filaras en unos siete dias. Cuando contactan con
el husped apropiado, las larvas penetran la piel y posteriormente acceden a la ci
rculacin llegando a los pulmones, desde donde suben por el rbol bronquial hasta se
r nuevamente deglutidas. Cuando maduran en el intestino, comienzan a poner huevo
s. Aunque poseen ciclos de vida similares, Ancylostoma puede madurar directament
e en el intestino si se ingiere la larva infectiva. Las uncinarias pueden causar
patologa cutnea en el sitio de entrada de la larva. Esto se caracteriza por infla
macin, eritema y ampollas con gran picor. Su paso por el pulmn puede causar sndrome
de Lffler, como se describi para Ascaris. Dependiendo de la carga de gusanos, la
infeccin intestinal puede dar gastroenteritis con dolor abdominal, diarrea y naus
eas. Sin embargo, las uncinarias son ms conocidas por su capacidad para causar prd
ida crnica de sangre con anemia ferropnica La clnica es variable y depende de la ce
pa adquirida (Genta, 1989). L a migracin de las larvas de tilarias puede causar i
rritacin, eritema y prurito en el punto de entrada, mientras que una emigracin tar
da por los pulmones puede producir sndrome de Lffler (Purtilo. 1974). La clnica inte
stinal se asocia a la intensidad de la infeccin, pudindose producir sntomas de ulce
ra pptica, dolor abdominal y diarrea. Se han descrito una infeccin crnica con un snd
rome de malabsorcion. La capacidad del parsito para autoinfectar puede perpetuar
la infeccin durante dcadas, como se observ en tropas aliadas que estuvieron prision
eras en la guerra del sudeste de Asia durante la Segunda Guerra Mundial (Gil, 197
9). Por otra parte, en pacientes sanos, la autoinfeccin puede causar larva curren
s (lesiones urticariformes lineales). En pacientes inmunosuprimidos, alcohlicos o
desnutridos la autoinfeccin puede acabar en una hiperinfeccin con riesgo vital po
r una reproduccin rpida del parsito (Genta. 1992; Maaen, 1987). A veces, una forma
de presentacin de la hiperinfeccin es una neumonitis grave, seguida de diarrea, en
teritis y septicemia. En los pacientes de las reas endmicas se

1224
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
debe descartar Strongyloides antes de terapias inmunosupresoras (Stickland. 1999
). El diagnstico se hace por el hallazgo e identificacin de las tpicas larvas rabdi
formes en las heces, aunque el examen O/P no siempre logra revelarlas (Lmina 55-1
10) (Genta. 1989; Pelletier, 1988). Las larvas rabdiformes de Strongyloides se d
eben diferenciar de las de las uncinarias. y se caracterizan por una cavidad buc
al corta y un primordio genital prominente (Fig. 55-8). Las larvas filariformes
de Strongyloides tienen una cola con una muesca y un esfago que mide aproximadame
nte la mitad de su cuerpo. Ambos estadios larvales pueden verse con lacilidad en
muestras frescas con bajo aumento. Si se detectan larvas filariformes infectiva
s en una muestra reciente, es diagnstico de superinfeccin (Eveland. 1975). El exam
en del aspirado duodenal o de las muestras del test de la cuerda puede ser til en
las sospechas con un examen de ordinario negativo. El mtodo de concentracin del e
mbudo de Baermann o una de las tcnicas de coprocultivos (vase previamente en Mtodos
de laboratorio) pueden demostrar tambin la infeccin (Ash, 1987; Garca, 1999; Genta
, 1989). Las larvas pueden hallarse en el espulo o en otras muestras pulmonares,
especialmente en los sndromes de hiperinfeccin. Los test serolgicos son tiles cuand
o se sospecha la infeccin, pero no se logra demostrar por otros mtodos. El EIA y o
tros test poseen buena sensibilidad y especificidad aunque pueden existir reacci
ones cruzadas con las filaras y otras infecciones por nematodos. Estos test no su
elen distinguir entre infeccin pasada y actual, pero son tiles para ver la respues
ta al tratamiento (Wilson, 1995). Anisakiasis. Vase ms adelante en Helmintos tisul
ares.
Las larvas de cestodos se hacen infectivas tanto en los cuerpos de los huspedes v
ertebrados como de los invertebrados, segn las especies, y completan su ciclo vit
al cuando son digeridos por un husped definitivo. Las larvas de muchas especies p
ueden infectar a humanos, produciendo cisticercosis. hidatidosis. esparganosis y
cenurosis. Estos cuadros se explican ms adelante bajo el epgrafe de Helmintos tis
ulares Taenia saginata. Los humanos son los nicos huspedes definitivos de Taenia s
aginata, el gusano plano de la vaca. Aunque su distribucin es mundial, son especi
almente comunes en Oriente Medio, frica. Europa. Asia y Amrica latina. En EE.UU. e
s espordico. Los cisticercos larvales (Cysticercus bovis) se desarrollan en los t
ejidos del ganado que pasta en tierras contaminadas con desechos humanos. Cuando
los humanos comen carne de vaca cruda o poco hecha, los cisticercos se transfor
man en un adulto frtil dentro del intestino en un plazo de dos a tres meses. Los
sntomas son infrecuentes, pero pueden incluir malestar abdominal y diarrea. A dif
erencia de 7! solium. los huevos de I saginata no son infectivos para los hombre
s y su ingesta no provoca cisticercosis. El diagnstico se realiza al encontrar lo
s huevos en las heces con tcnicas directas o de concentracin, o en los pliegues pe
rianales mediante la tcnica de papel celofn. Los huevos son esfricos y miden de 31
pm a 43 pm de dimetro (Lmina 55-12A). La cubierta es gruesa y radialmente estriada
, con embriones con seis garfios. Los gusanos de la especie Taenia son indisting
uibles y deben informarse nicamente como huevos de Taenia. La identificacin de las
especies se debe hacer recuperando las progltides o, a veces, los esclex. Las pro
gltides tienen una caracterstica protuberancia lateral conocida como poro genital.
La inyeccin de tinta china por dicho poro usando una aguja fina puede lograr def
inir el tero. El tero grvido de 7aen/'a saginata tiene de 1 5 a 20 corchetes latera
les, mientras que el de T. solium tiene de 7 a 1 3 (Fig. 55-9: Lmina 55-126). Las
progltides tambin pueden ser aclaradas por la noche en glicerol o teidas con carmn
o hematoxilina mediante las tcnicas descritas (Ash. 1987). Si se aisla, el esclex
de T. saginata se puede identificar por la presencia de cuatro ventosas y la aus
encia de garfios en la corona o rstelo. Taenia solium. Taenia solium. el gusano p

lano del cerdo, es ms frecuente en Europa, especialmente en Europa del este, Amric
a latina, China, Pakistn y la India. Ocasionalmente puede verse en los Estados Un
idos, principalmente en inmigrantes. La infeccin con el gusano adulto se adquiere
por la ingesta de cerdo poco hecho o crudo que contiene cisticercos (C. cellulo
sae). Cuando hay sntomas, stos son idnticos a los de la infeccin por T. saginata. Un
dato importante es que la ingesta de huevos de T. solium, bien a partir de un g
usano adulto o bien por comida contaminada, puede acabar en cisticercosis (Schan
tz, 1992). Se pueden encontrar ms detalles en Helmintos tisulares. Los procedimie
ntos para el diagnstico de infeccin intestinal por T. solium son los mismos que lo
s usados para T. saginata, aunque son aparentes ciertas diferencias morfolgicas.
En el esclex de T. solium existen
Cestodos
Los cestodos o gusanos planos son platelmintos similares a cintas que viven en e
l tracto intestinal de los vertebrados como adultos, y en los tejidos o cavidade
s corporales de diferentes huspedes intermediarios, como larvas. Se unen a la muc
osa intestinal por un esclex. o un rgano de sujecin, en el extremo anterior, que pu
ede tener ventosa, surcos (botrios) o un rstelo con garfios segn las especies. El
cuerpo del gusano, o estrbilo, se compone de una regin cervical de crecimiento act
ivo y una serie de progltides que se desarrollan secuencialmente a lo largo de lo
s estadios inmaduro, maduro y, finalmente, grvido en el extremo posterior. Cada p
rogltide posee tanto gnadas femeninas como masculinas, y est capacitada para produc
ir huevos frtiles. Los huevos de la mayora de los cestodos son infecciosos (except
o los de Diphyllobothrium) y pueden diferenciarse fcilmente de los de otros helmi
ntos por la existencia de un embrin con seis ganchos. Segn las especies, los huevo
s se eliminan con las heces o se liberan como progltides. No es infrecuente para
algunas especies con gran longitud de estrbilos que stas se eliminen intactas o qu
e las progltides migren activamente por el ano. Las especies largas de Taenia y D
iphyllobothrium pueden llegar a medir ms de 762 cm y vivir unos 20 aos.
Figura 55-9. Progltides grvidas de distintos g u s a n o s planos humanos. 1, Taen
ia saginata. 2, Taenia solium. 3. Dipylidium caninum. 4, Diphyllobothrium latum.
5. Hymenolepis spp.

CAPITULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1225
cuatro ventosas y, a diferencia de T. saginata. el rstelo tiene dos filas de garf
ios. Las progltides grvidas tienen de 7 a 13 corchetes uterinos laterales (Fig. 55
-9). Hymenolepis nana. H. nana, conocida como el gusano plano enano, tiene una d
istribucin mundial y es la especie de cestodos ms frecuentemente hallada en EE.UU.
Es un parsito comn en ratones y el ms pequeo que infecta a los humanos, midiendo ha
sta 4 c m de largo. El esclex tiene un rstelo armado, y las progltides tienen dos p
olos genitales localizados en el mismo lado del estrbilo (Fig. 55-9; Lmina 55-12F)
. El ciclo vital puede ser tanto directo, a travs de la ingesta de los huevos, co
mo indirecto, a travs de la ingesta de huspedes intermediarios (habitualmente por
el escarabajo del grano), que contienen larvas cisticercoides. En primera instan
cia, los huevos se pueden pasar directamente de persona a persona, habitualmente
entre nios, o ser ingeridos en la alimentacin, especialmente productos de grano c
ontaminados con excrementos de roedores. Los huevos se anclan en el intestino y
el embrin penetra la mucosa, en donde pasa la larva cisticercoide. Posteriormente
emergen y se vuelven a anclar en la pared intestinal, donde completan su desarr
ollo a adultos en dos a tres semanas. La ingesta de escarabajos con lanzas es mu
cho menos (recuente. La autoinfeccin interna puede producirse en algunos individu
os en los que los huevos se anclan rpidamente tras ser puestos por el adulto e in
vaden rpidamente la pared intestinal sin abandonar el cuerpo. Tal mecanismo es el
responsable de los casos espordicos de infecciones masivas. La infeccin sintomtica
, caracterizada por dolor abdominal, diarrea, anorexia e irritabilidad, se da en
pacientes con gran nmero de gusanos. El diagnstico se hace por el aislamiento en
las heces de los huevos ovales de pared fina e incoloros, que miden de 30 um a 4
7 pm de dimetro (Lmina 55-12D). Contienen un embrin con seis garfios (oncosfera) ce
ntralmente localizados separados de la pared por un espacio claro. El embrin pose
e dos engrasamientos polares de los que surgen finos filamentos que se extienden
en el espacio claro hasta alcanzar la pared. A veces se pueden detectar estrbilo
s intactos si se examinan las heces detenidamente. Hymenolepis diminuta. El gusa
no plano de la vaca. H. diminuta, tiene una distribucin cosmopolita y. a veces, i
nfecta a los humanos. La infeccin, sin embargo, es infrecuente, ya que necesita u
n husped artrpodo intermediario en el que las larvas cisticercoideas se desarrolle
n. La infeccin humana suele producirse por ingesta accidental de escarabajos infe
ctados, que contaminan los productos de grano o cereales. Los gusanos adultos se
desarrollan en el intestino, donde pueden crecer hasta 60 cm. Al igual que los
de H. nana, las progltides tienen poros genitales en un nico lado, pero se diferen
cian de estas especies en que el esclex carece de rstelo armado. Las infecciones s
uelen ser asintomticas debido al pequeo nmero de gusanos que suelen infectar a una
persona, aunque se han descrito sntomas intestinales. El diagnstico se obtiene por
el hallazgo en las heces de huevos de pared gruesa, ligeramente ovoides, de col
or amarillo-marrn, que miden de 70 pm a 85 pm por 60 pm a 80 pm (Lmina 55-12E). Lo
s huevos son los que ms fcilmente se confunden con los de H. nana pero se diferenc
ian porque no poseen filamentos polares. Diphyllobothrium spp. Los humanos se pu
eden infectar por una de las variadas especies de gusanos planos del pescado lla
mado Diphyllobothrium. que suelen infectar a mamferos que se alimentan de peces y
. posiblemente, a pjaros (Connor, 1997; Curts, 1991). Estos parsitos se dan en las
zonas templadas, especialmente en el norte de Europa, Escandinavia, la antigua U
RSS y Japn, La infeccin tambin se produce en Canad y en los estados centrales del no
rte de la costa pacifica y en Alaska. Aunque Diphyllobothrium latum es la especi
e conocida que con ms frecuencia infecta a humanos, su diferenciacin no se puede b
asar en la morfologa de los huevos. El parsito habita en el intestino, donde puede
llegar a medir 10 m y persistir durante aos. Los huevos se eliminan por las hece
s sin embrionar y deben alcanzar un arroyo o un lago para desarrollarse. En las

siguientes semanas surge una forma de larva ciliada, el coracidio de los seis ga
rfios, y
es ingerido por un tipo de zooplancton. El coracidio se desarrollar en una larva
procercoide. que es infectiva para el segundo husped intermediario, un pez. En ste
, el procercoide migra a los tejidos y se transforma en larva de pleurocercoide.
Los pleurocercoides pueden escalar la cadena alimenticia y afectar a peces ms gr
andes. Los humanos lo adquieren a travs de la ingesta de pescado poco hecho o cru
do que ha pasado al menos parte de su vida en agua dulce. Los gusanos adultos ma
duran y se inician en la produccin de huevos en un mes. La infeccin puede ser asin
tomtica. con la eliminacin de trozos de estrbilos como manifestacin inicial. En otro
s, puede presentarse un grado variable de molestias abdominales y diarrea. Raras
veces puede producirse una obstruccin intestinal. En las reas endmicas del norte d
e Europa, un pequeo porcentaje de pacientes desarrolla un dficit de vitamina B,, c
on anemia megaloblstica. El diagnstico se hace al hallar los tpicos huevos marrones
, ovalados y operculados en las heces mediante las tcnicas habituales. stos miden
de 58 pm a 76 pm por 40 pm a 51 pm y, adems del oprculo, poseen una proyeccin aboto
nada pequea y redondeada en el extremo (Lmina 55-12F). L a presencia del oprculo es
la nica entre los cestodos que infecta a humanos y se debe tener cuidado para no
confundir los huevos con los de los tremtodos, especialmente con el Paragommus o
Nanophyetus. La identificacin del gnero es posible cuando una porcin de estrbilo o
un gusano intacto es eliminado. El esclex es alargado y posee un par de surcos lo
ngitudinales conocidos como botrios, que suplen a las habituales ventosas. Las p
rogltides grvidas son ms anchas que largas y tienen sus poros genitales colocados e
n mitad de la cara ventral, adyacentes al tero con forma de roseta que se halla e
n el centro (Fig. 55-9; Lmina 55-12G). Dipylidium caninum. D. caninum es un gusan
o liso frecuente de perros y gatos en la mayor parte del mundo y no es raro que
afecte a humanos, especialmente a nios. En su habitual ciclo de vida, los huevos
se ingieren por las larvas de pulga, que infestan las reas frecuentadas por perro
s o gatos. Las larvas cisticercoideas persisten hasta que la pulga pasa al estad
o adulto. La ingestin accidental de pulgas adultas que contienen el cisticercoide
produce la infeccin. Los nios tienen el mayor riesgo de infeccin, ya que estn en gr
an contacto con animales. Los gusanos maduran en el intestino y crecen hasta 70
cm de largo. La infeccin tiene pocos sntomas, generalmente causados por las proglti
des que se mueven activamente. L a deteccin se basa en el hallazgo de los huevos
tpicos, paquetes de huevos o progltides en las heces. Los huevos son esfricos y con
tienen un embrin con seis garfios. Miden de 24 pm a 40 pm de dimetro y aparecen ai
slados o formando paquetes (Lmina 55-12H). El esclex es alargado, con cuatro vento
sas y un rstelo retrctil y pequeo. Las progltides tienen forma de barril y dos poros
genitales, uno en cada lado, lo que le da el nombre comn de gusano plano de dobl
e poro (Fig. 55-9).
Tremtodos
Los tremtodos, o lombrices, son helmintos dorso-ventralmente aplanados (platelmin
tos) que incluyen tanto formas hermafroditas (lombrices intestinales, hepticas y
pulmonares) como otras con diferenciacin de sexos (lombrices sanguneas o esquislos
omas). Todas las especies de los humanos se caracterizan por una ventosa oral, p
or la que se abre al tracto digestivo, y otra ventosa para su fijacin. Los adulto
s miden desde 1 m m (Metagonimus) a 70 m m (Fasciola gigantica). Los huevos lleg
an al exterior eliminados por las heces, el esputo o la orina, segn las especies.
Los hermafroditas producen huevos operculados que no estn embrionados (Clonorchi
s y Opisthorchis son excepciones). Los huevos de esquistosomas no son operculado
s y cada uno contiene una larva madura cuando se elimina. La larva trematodo. o
miracidia. es ciliada y capaz de penetrar los tejidos de un molusco. Cada especi
e de trematodo usa algn tipo de caracol como primer husped intermediario. Un proce
so de multiplicacin asexual compleja dentro de caracoles produce un gran nmero de
larvas que nadan libremente y se llaman cercaras.

1226
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MEDICA

Las cercaras de esquistosomas son capaces de penetrar la piel humana directamente

, produciendo esquistosomiasis. Las lombrices hermafroditas enquistan en la vege
tacin acutica o invaden los tejidos de un segundo husped, como un pez o un cangrejo
, segn las especies. La ingesta de estas larvas enquistadas, llamadas metacercari
as, produce infeccin humana. La infeccin se produce en muchas zonas tropicales y s
ubtropicales. Su presencia depende de la ausencia de tratamiento de las aguas re
siduales, de la disponibilidad de los huspedes intermediarios apropiados y, en el
caso de las especies hermafroditas. de las costumbres dietticas asociadas a la i
ngesta de metacercarias. Alguna de estas enfermedades, especialmente la esquisto
somiasis, se estn extendiendo debido al incremento del uso de irrigaciones en las
reas endmicas. La clnica vara segn el nmero de gusanos parasitarios, los rganos afe
dos y la respuesta del husped. Muchas infecciones son asintomticas. El diagnstico s
e hace identificando los huevos tpicos en heces, esputo, orina y, a veces, tejido
s. Los mtodos directos y los de concentracin con lormalma-etil actico son ms tiles pa
ra el aislamiento de estos huevos, mientras que los mtodos de flotacin con sulfato
de cinc son menos satisfactorios. Fasciolopsis buski. Es el trematodo intestina
l ms largo que infecta a humanos, variando de 20 mm a 75 mm de largo y de 8 mm a
20 mm de ancho. Se da en China, sudeste de Asia y la India, hallndose con frecuen
cia en cerdos como reservorio natural. Se adquiere por la ingesta de metacercari
as de las plantas acuticas, como el castao de aguas. Los gusanos se unen a la pare
d del duodeno y del yeyuno, donde maduran a adultos en tres meses. Los sntomas in
cluyen diarrea, dolor epigstrico y nuseas, si hubiese suficientes gusanos como par
a producir ulceracin de la mucosa. Puede existir eosinolilia incluso en los asint
omticos. El diagnstico se hace al ver los huevos largos (de 130 pm a 140 um por 80
pm a 85 pm), marrones, ovales y de pared delgada (Lmina 55-13/4). El oprculo pued
e pasar desapercibido y los huevos ser eliminados sin embrionar. La diferencia c
on los huevos de Fasciola no suele ser posible, aunque las infecciones pueden di
ferenciarse basndose en la historia geogrfica y en la clnica. Los huevos de tremtodo
s equinostomas. cuando afectan a humanos, son similares pero ms pequeos (Beaver. 1
984). Heterophyes y Metagonimus. Estos dos gneros incluyen un nmero de especies de
minsculos gusanos intestinales (de 1 m ma3m m de longitud) que infecta a humanos
. Heterophyes heterophyes y Metagonimus yokogawai son parsitos comunes en Asia, p
ero, (unto con otras especies, se encuentran tambin en otras partes del mundo. La
infeccin se adquiere por la ingesta de metacercarias en pescado de agua dulce po
co hecho. Aunque son de poca importancia mdica, pueden producir diarrea y dolor a
bdominal. La infeccin es autolimitada, ya que los gusanos tienen una vida de tan
slo unos pocos meses. El diagnstico se realiza por el hallazgo de huevos embrionad
os y operculados que miden de 20 pm a 30 pm de largo por 15 pm a 27 pm de ancho
(Lmina 55-138). La diferenciacin de estos huevos de los de Clonorchis y Opisthorch
is es difcil, aunque el oprculo es ms profundo en Opisthorchis. No obstante, tal di
stincin puede ser importante por razones mdicas. Nanophyetus salmincola. Nanophyet
us salmincola es un pequeo gusano intestinal (de 0,8 mm a 1.1 mm) descrito en el
este de Siberia y en el noroeste de la costa pacfica de EE.UU. (Eastburn, 1987: F
ristche. 1989b). Estos gusanos se adquieren por la ingesta de salmn crudo o poco
cocinado o bien ahumado, o por truchas con metacercarias infecciosas. Los sintom
as estn en funcin del nmero de gusanos y puede incluir dolor abdominal, diarrea y,
a veces, eosinofilia. Los huevos, de 60 pm a 80 pm por 34 um a 50 pm son ovoidal
es. operculados y de un color marrn amarillento (Eastburn, 1987). Hay un engrosam
iento en el extremo de la pared que lo diferencia de botn visto en los huevos de
Diphyllobothrium. Fasciola heptica. Las vacas, las ovejas y las cabras de muchas
partes del mundo estn infectadas con la lombriz heptica Fasciola heptica y, menos I
recuentemente, con especies de Fasciola giganiica. Los parsitos adultos habitan e

n el rbol biliar y de|an huevos que se eliminan por las

heces. Las cercaras eliminadas a partir de los caracoles huspedes se enquistan en
la vegetacin acutica, donde las metacercarias quedan a merced de los huspedes herbvo
ros. Los humanos lo adquieren al comer berros. Una vez ingeridas, las larvas pas
an la pared intestinal y migran por el peritoneo hasta el higado. Atraviesan la
cpsula heptica y el parnquima, llegando a alojarse en el interior de los conductos
biliares, donde la puesta de huevos comienza en aproximadamente dos meses. La mi
gracin a travs de higado provoca una reaccin inflamatoria dolorosa en el parnquima y
. posteriormente, en los conductos biliares, pudiendo acabar en fibrosis. Las ma
nifestaciones clnicas incluyen clico, ictericia obstructiva, dolor abdominal, cole
litiasis y eosinolilia. El diagnstico se realiza al hallar los huevos en las hece
s. Los huevos operculados. sin embrionar. son de un color marrn amarillento, de 1
30 pm a 150 um por 63 pm a 90 pm, pudiendo ser difciles de distinguir de los de F
asciolopsis (Lmina 55-13A). Falsas infecciones, como la producida por la ingesta
de higado de vaca u oveja infectados, se diagnostican mediante una buena anamnes
is y realizando un seguimiento del examen de las heces para buscar la eliminacin
de los huevos. Clonorchis sinensis y opisthorchis viverrini. Clonorchis sinensis
. la lombriz heptica oriental, y una especie cercana. Opisthorchis viverrini. hab
itan el sistema biliar de los humanos y de otros piscvoros, incluidos gatos y per
ros. C. sinensis se da principalmente en China, Taiwan, Corea, Japn y Vietnam, mi
entras que Opisthorchis viverrini se halla en el sureste de Asia, especialmente
en el norte de Tailandia. Tambin se conoce la infeccin humana por O. lelineus en E
uropa y por Amphimerus pseudolelineus en Ecuador (la misma que O. guayaquilensis
). Todos estos parsitos se adquieren al ingerir las metacercarias en pescado crud
o o poco cocinado. Las lanzas emigran a la via biliar, donde viven ms de 20 aos y
crecen hasta 25 m m (Lmina 55-13C). Producen huevos que se eliminan en la bilis y
posteriormente en las heces. Con frecuencia las infecciones son asintomticas, au
nque gran nmero de lombrices e infecciones de repeticin pueden producir inflamacin
biliar y posterior hiperplasia fibrosa y cirrosis heptica. Se ha descrito el desa
rrollo de un colangiocarcinoma en las infecciones mantenidas. El diagnstico se re
aliza al aislar los huevos operculados en las heces. Estos huevos son pequeos, ma
rrones y embrionados (Lmina 55-13D) Los huevos de Clonorchis no pueden ser difere
nciados fcilmente de los de Opisthorchis. Ambos miden de 25 pm a 35 um por 1 2 pm
a 20 pm y tienen un oprculo prominente y un pequeo botn en el extremo. stos son difc
iles de diferenciar de los del grupo de Heterophyes'Metagommus. aunque estos ltim
os carecen de oprculo y del botn del extremo. Cuando no se logra una identificacin,
en el laboratorio deber reflejarse (p. ej.. catalogndolos como huevos de Clonorch
is/Opisthorchis/Heterophyes/ Metagonimus). Paragonimus spp. Muchas especies de P
aragonimus pueden parasitr los pulmones de gatos, perros y otros carnvoros, inclui
dos los hombres. P westermani es problemtica en muchas reas de Asia, mientras que
en Amrica del Sur y Amrica Central se han implicado diferentes especies, incluidas
P. mexicanus. P. caliensis y P. ecuadoriensis. P. kellicotti se ha implicado en
ocasiones en casos en Norteamrica, y se han descrito otras especies en frica (Mar
iano, 1986; Pachucki, 1984; Strickland, 1999). Los gusanos adultos miden hasta 1
2 mm por 6 mm y Irecuentemente se hallan por parejas en el parnquima pulmonar, do
nde residen en una cpsula librtica causada por el husped (Lmina 55-13E). La cpsula co
munica con los bronquios, pudiendo eliminar los huevos en el espulo o en las hec
es. Aunque es un caracol el que sirve de primer husped intermediario, los cangrej
os de agua dulce sirven como segundos intermediarios para las metacercarias. La
ingesta de crustceos crudos o marinados puede causar la infeccin. Las larvas se li
beran en el estmago y migran a travs de la pared intestinal al peritoneo, alcanzan
do, a veces, los pulmones a travs del diafragma. La maduracin tarda aproximadament
e de cinco a seis semanas y los gusanos pueden vivir durante aos. Los sntomas, cua
ndo existen, se pueden deber a la migracin de las larvas a travs de los tejidos o
ser causados por los adultos asentados en el pulmn. No es infrecuente que los gus
anos se desarrollen en zonas ect-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1227
picas como el peritoneo, tejido subcutneo o el cerebro. La afectacin de los pulmon
es suele asociarse con fiebre, escalofros y eosinoflia. Una vez estabilizado, los
sntomas incluyen tos crnica con abundante expectoracin y episodios de hemoptisis. L
a radiografa puede mostrar infiltrados nodulares, calificaciones o infiltrados pa
rcheados. Los huevos que permanecen en los pulmones o en sitios ectpicos pueden p
roducir reaccin granulomatosa extensa. El diagnstico se hace al encontrar los tpico
s huevos en las heces, en el esputo o en los tejidos. Los huevos de las diferent
es especies de Paragonimus no se pueden distinguir fcilmente y se deben deducir s
egn el rea de origen. Los huevos, operculados y sin embrionar, miden de 80 pm a 12
0 pm por 45 pm a 70 pm y poseen una capa externa moderadamente gruesa de color m
arrn amarillenta (Lmina 55-13F). El oprculo es aplanado y suele sobresalir del rest
o de la pared por unos prominentes hombros. El extremo operculado est algo endosa
do pero carece de botn. Los huevos de Paragonimus se pueden diferenciar de los de
Diphyllobothrium y Fasciola/Fasciolopsis por el tamao. Schistosoma spp. La esqui
stosomiass, o bilharziasis, est entre las ms importantes enfermedades parasitarias
del mundo, afectando entre 200 y 300 millones de individuos. Los machos adultos
y hembras habitan en las venas mesentricas o de la vejiga. Las especies ms importa
ntes para los humanos son S. imansoni, S. japonicum, S. mekongi. S. intercalatum
y S. haematobium. Las otras especies infectantes de humanos son menos frecuente
s. Los esquistosomas adultos y hembras son ms finos y miden cerca de 26 mm por 0,
5 mm. Los machos, que son algo ms cortos, se abrazan a la hembra con unos mrgenes
laterales del cuerpo (el canal ginecforo) para fecundarla. Cuando se examinan in
situ, los esquistosomas son encontrados frecuentemente copulando. En este sitio
de asiento producen poca o ninguna respuesta inflamatoria. Los huevos se deposit
an en las vnulas, donde pueden causar una gran respuesta inflamatoria que resulta
en una expulsin de los huevos a la luz intestinal o a la luz de la vejiga. La pa
togenia est en funcin del sitio, el nmero de huevos y la respuesta de los husped a l
os antgenos de los huevos. Los huevos estn totalmente embrionados cuando se elimin
an y listos para eclosionar cuando se depositan en agua dulce. El miracidio pene
tra en un caracol apropiado, donde sufre una transformacin y una extensa divisin a
sexual. Tras cuatro semanas, un gran nmero de cercaras de cola bfida emergen del mo
lusco. stas nadan durante horas y penetran fcilmente en la piel del husped suscepti
ble, incluidos los humanos. Tras la penetracin, las cercaras, llamadas ahora esqui
stosomulas, pasan a la circulacin atravesando los pulmones antes de llegar a los
vasos mesentricos-porta. La clnica se produce en primer lugar por la penetracin de
la cercara (dermatitis cercarial). por el inicio de la puesta de huevos (esquisto
somiasis aguda o fiebre de Katayama) y como una complicacin tarda de la proliferac
in tisular y reparacin (esquistosomiasis crnica). Tras la penetracin de la cercara, p
uede aparecer un exantema papular con prurito en cuestin de horas. Este es un fenm
eno de sensibilizacin producido por una exposicin previa a los antgenos de cercara.
La forma ms grave de dermatitis se da en individuos que tienen una exposicin repet
ida a esquistosomas de cercaras. La dermatitis por cercaras o picor del nadador se
produce en todo el mundo y es una entidad bien conocida en EE.UU. (Hoeffler, 19
74). El comienzo de la puesta de huevos por adultos entre las cinco y siete sema
nas puede producir una esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama, un sndrome si
milar a la enfermedad del suero que se da en las infecciones primarias graves, e
specialmente en las del S. japonicum. La respuesta al antgeno es a travs de la pro
duccin de inmunocomplejos (Boros, 1989). La infeccin crnica produce puesta continua
de huevos, pudiendo permanecer algunos en el cuerpo. Alrededor de esos huevos s
e producen granulomas en el intestino y en la vejiga y se van sustituyendo por c
olgeno pudiendo causar fibrosis y cicatrizacin. Los huevos atrapados en el hgado pu
eden causar fibrosis con obstruccin del flujo portal. A veces, los huevos se depo

sitan en lugares ectpicos, como la mdula espinal, los pulmones o el cerebro.

El diagnstico se hace viendo los huevos en las heces u orina por e x a m e n dire
cto o mtodos de concentracin con formalina-etil actico. La concentracin con sulfato
de cinc no es satisfactoria para deteccin de los huevos pesados de esquistosomas.
Los huevos tambin pueden detectarse en las biopsas de recto, vejiga y, a veces, d
el hgado (Lmina 55-14). El uso de mtodos de eclosin de huevos puede emplearse a vece
s para determinar su viabilidad o, menos frecuentemente, para detectar la enferm
edad leve. La mezcla de heces con agua destilada se coloca en un frasco cubierto
por papel de aluminio para protegerlo de la luz, exponiendo a una luz brillante
slo el cuello o un lateral. Los miracidios, si estuviesen presentes, nadaran haci
a la luz y se podran detectar con una lupa. Los test serolgicos pueden ser tiles pa
ra el screening en personas que han viajado a zonas endmicas y que. aun teniendo
orina o heces negativas, tienen el riesgo de infeccin, o para monitorzar la respue
sta al tratamiento. Aunque no est totalmente disponible, hay laboratorios de refe
rencia y el CDC puede realizarlo. Generalmente, los test serolgicos varan segn el a
ntgeno empleado y la metodologa usada. El CDC usa el test del screening de Falcon.
una tcnica inmunoabsorbente con enzima fijadora (FAST-ELISA). Aquellos que son p
ositivos en el screening se evaluarn posteriormente por inmunoblot para aumentar
la especiticidad (Wilson, 1995). Schistosoma mansoni. S. mansoni se da en frica,
especialmente en reas tropicales y en el delta del Nilo, Sudfrica y Madagascar, Br
asil, Venezuela, Surinam y algunas islas del Caribe, incluido Puerto Rico. Los a
dultos de S. mansoni viven principalmente en la vena porta y en la mesentrica inf
erior. La puesta de huevos en el intestino produce dolor abdominal y disentera, c
on abundante aparicin de sangre y moco en las heces. En este momento se pueden de
tectar huevos en las heces. La infeccin crnica puede acabar produciendo fibrosis h
eptica e hipertensin portal, segn el nmero de gusanos. Los huevos son ms difciles de
ncontrar en esta fase. Los huevos, que miden de 1 1 6 pm a 180 pm por 45 pm a 58
pm, son ovalados, con una espina lateral larga que sale del huevo cerca del ext
remo (Lmina 55-14A y S). Si la espina no se viese, el huevo podra estar rotado en
el cubreobjetos. En el caso de que la larva sea viable, puede ser evidente el mo
vimiento del miracidio dentro de los huevos en las muestras sin fijar. Se pueden
necesitar tcnicas de concentracin para detectar huevos, ya que los individuos con
exposicin limitada o con infeccin crnica pueden eliminar pocos. Schistosoma japoni
cum. Schistosoma japonicum. que se da en China, sureste de Asia y Filipinas, pro
duce una patologa que es similar a la de S. mansoni. pero frecuentemente ms grave
porque se producen ms huevos (aproximadamente diez veces ms). Esta enfermedad ha s
ido erradicada en Japn, aunque an existen reservnos animales. Los gusanos adultos v
iven en el territorio de la vena mesentrica superior y los huevos alcanzan fcilmen
te el hgado, causando fibrosis e hipertensin portal, siendo la complicacin ms frecue
nte de la infeccin crnica. El menor tamao de los huevos predispone a su diseminacin,
especialmente al cerebro y la mdula espinal. Los huevos suelen ser ovalados, de
entre 75 pm y 90 pm por 60 pm a 68 pm, con una espina lateral que pasa desaperci
bida, por lo que es difcil de demostrar (Lmina 55-14C y D). Schistosoma mekongi. E
sta especie se da en reservnos humanos y en animales de pases a lo largo del ro fvl
ekong, especialmente Camboya y Laos (Bruce, 1980). Es similar al S. japonicum, p
ero se diferencia por varias caractersticas biolgicas y por los huevos ms pequeos (d
e 60 pm a 70 pm por 52 pm a 62 pm), que de otro modo seran indistinguibles de los
de S. japonicum. Schistosoma haematobium. La esquistosomiasis urinaria se da en
muchas partes de frica. Oriente Medio y Madagascar. Los parsitos emigran por va he
morroidal al plexo venoso de la vejiga, la prstata, el tero y la vagina. Uno de lo
s sntomas ms comunes y tempranos es la hematuria, especialmente al final de la mic
cin. La enfermedad crnica puede causar dolor plvico y clico vesical con tenesmo vesi
cal. El acumulo de huevos en los tejidos puede producir hipertrofia del urotelio
, metaplasia escamosa y fibrosis, que puede progresar a obstruccin y, finalmente,
fracaso renal. La

1228
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
esqustosomass urinaria se ha asociado tambin a carcinoma escamoso de vejiga (Badawi.
1992). Los huevos se aislan de la orina mediante el examen del sedimento. stos s
on alargados, de 1 1 2 pm a 1 8 0 iim por 40 pm a 70 pm con una caracterstica esp
ina terminal (Lmina 55-14). A veces se detectan en las heces o en la biopsia del r
ecto. Schistosoma intercalatum. Esta especie se da en muchas partes de lrica cent
ral y en frica occidental y produce esquistosomiasis intestinal. Los huevos tiene
n una espina terminal similar a la del S. haematobium, pero se dan principalment
e en las heces y son ms largos (de 140 pm a 240 pm por 50 pm a 85 pm).
do evolucionar a linfedema y fibrosis obstructiva (Lmina 55-15A). La afectacin gra
ve de los miembros inferiores y de los genitales produce elefantiasis. En la may
ora de las reas, las microfilarias circulan por la sangre perifrica con una periodi
cidad nocturna que corresponde con las actividades alimenticias de los vectores
habituales (mosquitos Culex. Aedes y Anopheles). La infeccin del pacfico Sur suele
ser sin periodicidad. Los microfilarias estn envainadas, aunque esto puede no se
r evidente con la tincin de Giemsa. La cola es punteada y no hay ncleos en la punt
a. El espacio ceflico no es tan largo como ancho y los ncleos de la columna nuclea
r son diferenciales (Fig. 55-10; Lmina 55-15S). Pueden ser necesarias tcnicas de c
oncentracin para su aislamiento, ya que las microfilarias suelen estar en pequeo nm
ero. Brugia malayi. Esta especie produce una enfermedad similar a la de W. bancr
ofti. aunque suele ser ms moderada y con mayor frecuencia afecta a los linfticos d
e los miembros superiores. Se da principalmente en la India, sudeste de Asia, Co
rea, Filipinas y Japn. La infeccin humana por especies zoonticas se encuentran perid
icamente en EE.UU. La microfilaria circula por la sangre de un modo peridico. Sus
vainas se tien bien con Giemsa. La punta tiene un ensanchamiento con dos ncleos s
olitarios al final de la columna nucleada (llamados ncleos subterminal y terminal
). El espacio ceflico puede ser ms largo que ancho (Fig. 55-10; Lmina 55-15C). B. t
imones otra especie que se da en el este del archipilago indonesio, especialmente
en las islas de Timor y Flores. Sus microfilarias son muy similares a las de la
B. malayi, aunque algo ms largas.
HELMINTOS TISULARES Nematodos Filaras
Los nematodos filariales son parsitos comunes de los vertebrados transmitidos por
artrpodos. Los adultos son largos y finos, midiendo cerca de 100 mm. y es sabido
que afectan distintos tejidos, como el subcutneo, linfticos, vasos sanguneos, espa
cio pleural y peritoneal, corazn y cerebro. Todos producen larvas denominadas mic
rofilarias, que pueden detectarse en la sangre o en la piel, segn las especies. L
as microfilarias de algunas especies circulan por la sangre con una periodicidad
bien definida (tanto diurna como nocturna), mientras que otras no. Las microfil
arias siguen su desarrollo slo en el apropiado artrpodo vector, usualmente un mosq
uito o una mosca, donde maduran a la fase infectiva. Cada larva es entonces depo
sitada en los tejidos de un husped definitivo cuando el vector se alimenta de san
gre. El diagnstico se hace por el hallazgo de microfilarias en la sangre o en la
piel, ya que los estadios adultos son habitualmente secuestrados en los tejidos.
El uso del Irotis sanguneo grueso teido con Giemsa o hematoxilina es la tcnica hab
itual, aunque suelen requerirse otros procedimientos ms sensibles, como un filtro
de membrana, la concentracin de Knott o anlisis por saponificacin (Garca, 1997). La
s microfilarias pueden verse movindose en el examen directo de la sangre o de los
fluidos tisulares. La identificacin de las especies es importante debido a su di
ferente patogenicidad. La caracterstica principal usada para la identificacin de m
icrofilarias incluye la presencia o ausencia de vaina, as como sus caractersticas
de tincin, la morfologa de la cola y la distribucin de los ncleos celulares en su in

terior, y el tamao del espacio ceflico, asi como la apariencia de su columna nucle
ar. Ya que las microfilarias de Wuchereha y Brugia suelen poseer una periodicida
d nocturna, la sangre de los pacientes en los que se sospecha debe recogerse ent
re las 10 de la tarde y las 2 de la madrugada. Loa loa posee un periodo diurno,
por lo que la sangre debe recogerse en torno al medioda. M. ozzardiy M. Persians
carecen de periodicidad. Las microfilarias de M. streptocerca y Onchocerca volvu
lus estn presentes en la piel y se detectan por examen de biopsias. Los test sero
lgicos para el diagnstico de filaras linfticas pueden ser tiles en pacientes seleccio
nados, especialmente en los no nativos de reas endmicas. Tales mtodos son limitados
en su capacidad para diferenciar entre exposicin pasada o actual y adems pueden e
xistir reacciones cruzadas con otras especies de nematodos. Los test de deteccin
de antigenos tambin pueden ser tiles para la filariasis linftica, pero no suelen es
tar disponibles (Wilson, 1995). Wuchereria bancrofti. Esta especie, responsable
de la filariasis bancroftiana, es la filara que ms frecuentemente infecta a los hu
manos. Las zonas endmicas son frica central. frica del Norte, la India, sureste de
Asia y ciertas islas del Pacifico Sur, as como partes de Centroamrica y Sudamrica y
las Indias occidentales. Los gusanos adultos residen en el sistema linftico, don
de producen adenopatias y linfangitis crnica, pudienFigura 55-10. Exiremos anterior y posterior de las microfilarias ms frecuentement
e encontradas en humanos. , Wuchereria bancrofti. 2. Brugia malayi. 3. Onchocerca
volvulus. 4. Loa loa. 5. Mansonetla perstans. 6. Mansonella ozzardi.

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1229
Loa loa. Conocido como el gusano del ojo. Loa loa vive en el tejido subcutneo. Lo
s nematodos estn migrando continuamente produciendo una reaccin inflamatoria local
transitoria (de 2 a 3 dias) conocida como Calabar. La aparicin ocasional en la c
onjuntiva permite su extirpacin. La loasis se da principalmente en frica occidenta
l y central, donde las moscas ciervo del gnero Chrysops sirven como vector. El pa
rsito provoca una gran eosinofilia y se le ha visto a veces en EE.UU. en gente qu
e viaj a frica. La microfilaria, que circula por la sangre con una periodicidad di
urna, est envainada, pero esta vaina no es visible con Giemsa. Los ncleos de la co
la llegan hasta la punta redondeada. La columna nuclear es distintiva y el espac
io ceflico es ms corlo (Fig. 55-10: Lmina 55-150). Onchocerca volvulus. La infeccin
por Onchocerca es una de las primeras causas de ceguera en las zonas endmicas, co
mo frica central. Amrica central (Mxico y Guatemala) y el norte de Sudamnca. Los vec
tores son las moscas negras del gnero SimuHum. Los gusanos adultos viven en nodul
os subcutneos fibrosos y en el tejido ms profundo, pudiendo crecer hasta 40 m m de
dimetro (Lmina 55-15f). Los nodulos suelen darse en la mitad superior del cuerpo
de las personas infectadas en Centroamrica y en la mitad inferior del cuerpo en l
as personas afectadas de frica. Los gusanos adultos producen microfilarias que em
igran por la piel. Las complicaciones son secundarias a dicha migracin, causando
mltiples formas de dermatitis. Los movimientos de las microfilarias por la superf
icie del ojo pueden causar queratitis, opacidad corneal y daos en las cmaras del i
ris causando asi ceguera por infecciones repetidas. El diagnstico se hace al hall
ar las tpicas microtilarias en los raspados cutneos o biopsias cutneas, preferiblem
ente de la regin escapular o de la cresta iliaca. Como alternativa se puede exami
nar el exudado de la piel cicatricial o el aspirado de los nodulos (Beaver. 1984
). Las microfilarias en las preparaciones teidas pierden tanto la vaina como los
ncleos de la cola (Fig. 55-10). Mansonella spp. Hay muchas especies de Mansonella
que infecta a los humanos, pero se las considera como mnimamente patgenas. Sin em
bargo, las microfilarias se deben diferenciar de las autnticas filarias patgenas.
M. ozzardi se halla en el centro de Amrica y Sudamrica y en algunas zonas del Cari
be. Los parsitos adultos residen en los tejidos subcutneos. M. perstans se da en re
as de frica tropical y. a veces, en Sudamrica. Se cree que los adultos residen pri
ncipalmente en las cavidades corporales y mesentncas. Los microfilarias carecen d
e vaina y circulan por la sangre sin evidencia de periodicidad. La microfilaria
de M. ozzardi tiene una cola fina, afilada, sin ncleos, mientras que la cola de M
. Persians es ancha y abrupta, con ncleos que llegan hasta la punta (Fig. 55-10;
Lmina 55-15F). M. streptocerca, que se halla en frica tropical, se puede confundir
con O. volvulus, ya que tanto los adultos como las microfilarias se localizan e
n la piel y en los tejidos subcutneos. Tambin pueden causar dermatitis. Las microf
ilarias que se encuentran en las muestras cutneas carecen de vaina y poseen un pl
iegue en la cola con ncleos hasta la punta. Todas las especies de Mansonella se t
ransmiten por mosquitos del gnero Cuhcotdes. Filarias zoonticas. Ciertos nematodos
filanales de los gneros Dirolilaria y Brugia, que habitualmente parasitan a mamfe
ros salvajes y domsticos, pueden afectar a humanos. Dirofilaria immitis est muy ex
tendida y la infeccin humana est bien documentada. La larva transmitida por mosqui
to migra hasta el lado derecho del corazn. Cuando el gusano muere, se transporta
hasta una arteriola pulmonar, causando un nodulo granulomatoso que puede verse c
omo una lesin con forma de moneda en la radiografa de trax. El diagnstico suele hace
rse por histologa de dicho nodulo. Otras especies de Dirofilaria como D. tenuis.
D. repens y D. ursi suelen producir nodulos subcutneos. Estos nodulos se han desc
rito en mltiples sitios del cuerpo, como la cara, la conjuntiva y la mama y se su
elen quitar con ciruga. El examen histolgico muestra una gran reaccin inflamatoria
mixta rodeando a un gusano muerto. Los criterios para identificar las filaras zoo

nticas en la histologa se pueden encontrar en otros textos (Connor, 1997; Ohnel, 1

995: Gutirrez, 2000).
Otros
Dracunculus medinensis. Los gusanos adultos viven en el tejido subcutneo y se hac
en clnicamente evidentes cuando la hembra migra a la superficie cutnea y produce a
mpollas, habitualmente en los miembros inferiores. Cuando las extremidades se me
ten en el agua, las ampollas se rompen y liberan mltiples larvas mviles. El zoopla
nclon ingiere las larvas, que despus maduran a estadios infectivos y se transmite
n nuevamente a humanos al tragar accidentalmente el zooplancton del agua. Es endm
ico de reas de frica, Oriente Medio y Asia y puede causar cicatrices cutneas desfig
urantes con riesgo de sobreinfeccin bacteriana grave posterior. Se han hecho gran
des esfuerzos de control en los ltimos aos para erradicar este parsito (CDC, 1992).
El diagnstico se hace al ver a la hembra en la superficie cutnea y las larvas en
el Huido de las ampollas. El gusano puede ser cuidadosamente extrado en varios das
, pero procurando no daarlo. L a muerte de un gusano in situ produce gran reaccin
inflamatoria y posterior sobreinfeccin bacteriana. Angiostrongylus cantonensis y
Angiostrongylus costaricencis. La menmgoencefalitis eosinoflica humana producida
por A. cantonensis se produce tanto en epidemias como espordicamente en reas del s
ur del Pacfico, sudeste de Asia y Taiwan. Los parsitos maduros se suelen encontrar
en las arterias pulmonares de las ratas. Las larvas migran hasta la traquea, do
nde se eliminan con las heces. Se transforman en infectivas dentro de babosas o
caracoles terrestres y. cuando son comidas por un husped roedor, emigran por el c
erebro antes de madurar en las arterias pulmonares. Los humanos lo adquieren al
comer caracoles o cangrejos o camarones crudos, que pueden actuar de huspedes tra
nsportadores, as como vegetales contaminados con moluscos infectados. En los huma
nos, las larvas de A. cantonensis migran al sistema nervioso central, causando u
na meningitis con gran eosinofilia en el lquido cefalorraqudeo (Alicata. 1991). El
diagnstico se hace tanto por la clnica como por la anamnesis, aunque la larva se
ha aislado ocasionalmente en el liquido cefalorraqudeo (Kubersky, 1979). A. costa
ricencis se da en Amrica central y Sudamrica (LonaCortez. 1980). El parsito, respon
sable de la forma intestinal de la angiostrongiliasis. suele residir en las arte
rias mesentricas del leon y del ciego de los roedores. La infeccin humana se da en
esas mismas localizaciones, causando inflamacin granulomalosa y abdomen agudo. El
diagnstico se hace por el examen histolgico de la pieza quirrgica y el hallazgo de
huevos en los tejidos (Strickland. 1999). Trichinella spiralis. La infeccin por
Trichinella humana se da en todo el mundo, aunque su incidencia en EE.UU. est act
ualmente descendiendo, con menos de cien casos al ao. Los humanos adquieren la in
feccin por la ingesta de carne de cerdo cruda o, a veces, con la carne de oso, qu
e posee larvas infectivas. Los gusanos ingeridos maduran en el intestino y produ
cen nuevas larvas en dos a tres semanas. Durante esta fase aparecen sntomas gastr
ointestinales que duran varios dias. Posteriormente las larvas pasan a los linfti
cos y vnulas, alcanzando as la circulacin sistmica. Invade principalmente los msculos
esquelticos, donde sufre el desarrollo y se encapsula. Durante la fase de migrac
in y encapsulacin puede aparecer fiebre, dolor muscular, dificultad respiratoria,
edema periorbital y eosinofilia. dependiendo de la cantidad inoculada. Tras enqu
istarse, los sntomas son mnimos. Asi, pueden persistir viables durante aos, aunque
a veces se calcifican. El diagnstico se hace con la anamnesis y la clnica, y se co
nfirma mediante la biopsia del msculo esqueltico, especialmente del gastrocnemio o
del deltoides (Lmina 55-11E y 11F). Los test indirectos incluyen la medicin de la
creatina fosfocinasa, que suele estar elevada, y la deteccin de anticuerpos por
floculacin con bentonita o con EIA. De stos, el ms especfico es la creatina fosfocin
asa y el EIA es el ms sensible (Wilson, 1995). Larva migratoria. La larva migrato
ria se produce por la migracin de larvas de ciertas uncinarias, ascridos y especie
s de Strongyloides a travs de los tejidos. El sndrome varia segn la especie causant
e, el nmero de gusanos y los tejidos afectados.

1230
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
L a larva migratoria cutnea (CLM), o picor del suelo, se produce por la migracin c
utnea de uncinarias de perros o gatos del gnero Ancylostoma, que penetra la piel p
ero no puede tener el habitual patrn de maduracin. Aparecen en la piel tractos ser
piginosos, eritematosos y pruriginosos en zonas expuestas al contacto con el sue
lo. Especial problemtica surge en los climas hmedos y clidos, donde los huevos y la
rvas de estas uncinarias viven ms tiempo. Algunas especies de Strongyloides que p
arasitan animales salvajes pueden causar una dermatitis similar. La larva viscer
al migrans (VLM) suele estar causada por el scaris canino Toxocara canis y, en me
nor grado, por Toxocara cali, del gato domstico. Los nios suelen infectarse por la
ingesta accidental o intencional de tierra contaminada con heces de perros o ga
tos. Tras la eclosin de la larva, sta es incapaz de completar su ciclo vital y com
ienza una migracin prolongada a travs de diferentes rganos y tejidos. Los nios puede
n debutar con retraso del crecimiento y aparicin de fiebre, hepatomegalia, neumon
ilis, eosinofilia e hipergammaglobulinemia. Una reaccin inflamatoria en la retina
puede simular un retinoblastoma, un tumor maligno con el que se debe hacer el d
iagnstico diferencial. El diagnstico de VLM se suele realizar mediante los hallazg
os clnicos, ya que el parsito raramente se consigue aislar. Los test serolgicos pue
den ser tiles para confirmar la sospecha y actualmente se recomienda el EIA, que
usa los antgenos de la fase larval (Wilson, 1995). Un sndrome similar al VLM puede
ser causado por especies de Gnathostoma. que inlectan el estmago de mamferos. La
infeccin humana es ms frecuente en el sudeste de Asia, pero tambin se han descrito
casos en Mxico y Ecuador. Este parsito utiliza un cefalpodo como prim e r husped int
ermediario y peces y anfibios como huspedes secundarios. Tambin pueden servir como
huspedes diferentes clases de reptiles, pjaros y mamferos. Las larvas pueden migra
r a travs del tejido subcutneo, produciendo inflamacin transitoria y, ocasionalment
e, invasin del sistema nervioso central. La existencia de lesiones migratorias y
una historia de ingesta de pescado crudo pueden ayudar para el diagnstico clnico.
Capillaria heptica. Aunque suele parasilar roedores, a veces causa enfermedad en
humanos, especialmente en nios, en los que puede simular una VLM, hepatitis, absc
eso amebiano heptico u otras enfermedades patolgicas. En el husped roedor, los huev
os se digieren y producen una larva migratoria que llega al higado, donde madura
y pone huevos en el parnquima. Cuando el hgado es ingerido por un depredador, los
huevos se eliminan en las heces y contaminan el suelo. Los nios estn en riesgo pa
ra adquirirlos si ingieren la suciedad. En las reas endmicas el diagnstico se hace
por el examen de biopsia heptica o por autopsias. Los huevos son fcilmente reconoc
ibles en la biopsia al tener paredes estriadas gruesas. Anisakis. Pseudoterranov
a y Eustrongyloides spp. La ingesta de pescado crudo, aunque se considere una ex
quisitez en algunas partes del mundo, tiene como resultado un incremento en el nm
ero de casos de inlecciones por nematodos del pescado. Anisakiasis y Pseudoterra
nova son parsitos comunes gastrointestinales de mamferos marinos, y las fases infe
ctivas se encuentran en diferentes peces de agua salada, salmn y calamares como h
uspedes intermediarios. Los pequeos crustceos similares al camarn sirven como primer
husped. Cuando se digieren, esta larva penetra la pared gstrica o del intestino,
produciendo dolor abdominal agudo. La infeccin por Anisakis se puede diagnosticar
por presuncin basndose en una anamnesis y hallazgos clnicos, y se puede confirmar
mediante el aislamiento de un gusano en la endoscopia o por la presencia de un g
ranuloma eosinlilo que contenga un nematodo en una de las piezas quirrgicas. Las e
species de Anisakis tienden a ser ms productoras de enfermedad invasiva, mientras
que Pseudoterranova spp. tienden a ser tosidas o vomitadas intactas (Lmina 55-11
7 y 11H) (Sakanari. 1989). La larva de Anisakis es difcil de identificar (Binford
, 1976). Se han descrito escaso nmero de infecciones por Eustrongyloides spp. en
personas que ha comido sushi casero. Estos parsitos suelen infectar pjaros que se

alimentan de pescado, pero en humanos la larva rojo brillante invade la cavidad

abdominal, precisando tratamiento quirrgico (Wittner. 1989).

Cestodos
Son muchas las especies de cestodos que afectan a humanos en sus estadios de lar
va y pueden causar seria enfermedad. Las ms habituales son fcilmente distinguibles
de las otras y tienen patrones de transmisin nicos Cuando se ven en secciones tis
ulares, las larvas y adultos contienen cuerpos laminados basofilos conocidos com
o corpsculos calcreos, importantes para su identificacin. Cisticercosis. La infeccin
humana con la (ase larval del gusano plano del cerdo, Taenia solium. se da en t
odo el mundo tras la ingesta accidental de huevos de un adulto. Es especialmente
prevalente en Mxico y el resto de Amrica latina, Europa, la India y Asia. La mayo
ra de los casos en EE.UU. se originan en zonas endmicas, aunque en los ltimos aos el
nmero de casos de origen local ha aumentado (Richards, 1985). Los huevos se pued
en ingerir accidentalmente con comida contaminada o con agua; posteriormente ecl
osionan en el tracto gastrointestinal penetrando los embriones en la mucosa inte
stinal, que diseminan posteriormente por el torrente sanguneo a sitios a distanci
a, especialmente el msculo esqueltico y tambin al corazn, cerebro u ojos, donde la c
lnica inflamatoria puede ser muy evidente. Una complicacin frecuente en reas endmica
s son las crisis y frecuentemente es el sntoma de presentacin (Lmina 55-16/1). El d
iagnstico suele hacerse con los hallazgos clnicos en las zonas endmicas, pero puede
ser ms difcil en reas no endmicas. El uso de la tomografa computanzada (TC) es m u y
til, pero no suele estar disponible en la mayora de las reas endmicas. La radiografa
es til para ver la existencia de quistes calcificados, pero no para el diagnstico
de infeccin reciente. El aislamiento de cisticercos intactos mediante ciruga conf
irma el diagnstico. El cisticerco, o gusano vesiculado, es un saco lleno de lquido
translcido, oval que contiene un nico esclex que mide 5 m m o ms de dimetro (Lmina 5
-16S). Entre los test serolgicos, el inmunoensayo con glucoproteinas disponible p
or el CDC tiene alta sensibilidad y especificidad, superando al EIA (Daz. 1992).
Desafortunadamente, estos test no diferencian entre infeccin activa e inactiva, p
or lo que no son tiles para monitorizar la respuesta al tratamiento. La existenci
a de cisticercosis en personas de un rea no endmica y sin clara historia de viaje
obliga a la investigacin de la exposicin de los manipuladores de alimentos relacio
nados con el paciente, o de la posibilidad de infeccin con una especie diferente
de Taenia (Schanz, 1992). Hidatidosis. La infeccin humana con estadios larvales d
e gusanos planos del gnero Echinococcus puede tomar una de estas tres formas: hid
atidosis unilocular causada por E. granulosus. hidatidosis multilocular o alveol
ai causada por E. multilocularis e hidatidosis poliqustica causada por E. vogeli
(Thompsom. 1995). Los huspedes definitivos de estos minsculos gusanos son los perr
os. Lo que pierden de tamao, lo ganan en nmero de individuos, con varios cientos o
miles de gusanos que ponen gran nmero de huevos en un solo husped. Los huevos se
eliminan por las heces y se digieren por huspedes intermediarios, como la oveja,
la vaca, el cerdo, los roedores y otros herbvoros. Los humanos, especialmente los
nios, se infectan tras la ingesta accidental de huevos. Los huevos se rompen en
el intestino y el embrin penetra la pared intestinal y pasa a la sangre. Aunque l
a mayora de las hidtides se desarrollan en el higado, algunas se diseminan a otros
sitios. El desarrollo de los quistes es lento y puede durar aos para lograr un t
amao de 10 c mo1 5c m de dimetro. En el husped secundario, los quistes contienen nu
merosos protoesclex, que proliferan a partir de la membrana germinal. E. granulos
us es el ms importante causante de patologa humana, especialmente en reas de cuidad
ores de ovejas o vacas, incluidos los EE.UU. donde los perros son los huspedes de
finitivos. La hidatidosis unilocular se desarrolla como un quiste nico en el higa
do y, posteriormente, en el pulmn u otro sitio. Los quistes estn llenos de un liqu
ido claro que contiene capsulas germinales y numerosos protoesclex pudiendo llega
r a ser miles (Lmina 55-16C y D). La clnica es la derivada del lento crecimiento d
e la masa, aunque la infeccin en el sistema nervioso central s eh a c e aparente
antes que en otras zonas. El diagnstico se basa en la presentacin clnica y la his-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1231
tora junto con el uso de radiografa o TC y la ecografa. Los test serolgicos son muy t
iles para confirmar el diagnstico y constan de un test de screening como EIA o el
IHA seguido, si fuese positivo, de un test de confirmacin como el inmunoblott o
el gel de difusin (Wilson. 1995). La sensibilidad va desde el 60% al 90% segn cada
caso. Los falsos positivos se pueden dar en la cisticercosis, aunque la present
acin clnica debera evitar la confusin. La aspiracin de contenido de los quistes es po
tencialmente peligrosa, ya que el vertido de su contenido puede producir disemin
acin o riesgo de shock anafilctico, pero si se realiza, revelara una mezcla de prot
oesclex, cpsula germinal, garfios y corpsculos calcreos. E. multiloculans causa hida
tidosis multilocular o alveolar en las regiones del norte de Europa y Rusia, y e
n Alaska. Canad y el norte de EE.UU. Los huspedes miermediarios incluyen una varie
dad de pequeos roedores; los zorros, los lobos y los perros son los huspedes defin
itivos. La infeccin humana se da en el hgado, donde las hidtides se desarrollan com
o un quiste invasivo que se introduce en el tejido con un patrn alveolar. Aunque
la membrana germinal prolifere en el hgado, los protoesclex carecen de desarrollo,
La imagen puede asemejarse a la de un hepatocarcinoma. Los test serolgicos que u
san los antgenos de E. granulosus son tiles para el diagnstico. El uso diferencial
de antigenos de ambos parsitos parece tener un gran potencial para la diferenciac
in entre estas dos enfermedades (Wilson, 1995). vogeli produce un quiste hidatidi
co poliquslico que es invasivo, pero se diferencia de multilocularis en que vogel
i produce tanto membrana germinal como protoesclex. La enfermedad est limitada a L
atinoamrica, donde los roedores completan el ciclo vital (D'Alessandro. 1979). La
hidatidosis poliquslica en Sudamrica puede tambin ser causada por E. oligarlhus, u
n parsito de felinos y roedores. Esta especie es morfolgicamente similar a vogeli
y en el pasado se confundieron casos (D'Alessandro. 1995). Esparganosis. La espa
rganosis est causada por la larva del gnero Spiromelra. emparentada con Diphyllobo
thrium spp. Habitualmente parsita perros y gatos y estn en Asia (Spirometra manson
i) y Norteamrica Spirometra mansonoides). Los ciclos vitales son similares a los d
e Diphyllobothrium. los cefalpodos sirven como primer husped intermediario para la
larva procercoide y el pescado como segundo huspedes para la larva pleurocercoid
e. Los humanos se infectan con estos estadios larvales a travs de la ingesta de c
efalpodos en el agua o con el pescado crudo o poco cocinado. El uso de ranas o se
rpientes como cataplasmas tambin puede transferir larvas. La esparganosis se suel
e presentar como un edema local o migratorio a nivel subcutneo junto con eritema
y dolor; a veces se da una infeccin cerebral. La exploracin quirrgica puede revelar
un delicado gusano, delgado y de color marfil y de escasos centmetros de largo.
Los cortes axiales demuestran un grueso tegumento con profundos pliegues y un pa
rnquima con marcadas fibras musculares. No se han visto cavidades corporales en l
os nematodos y los corpsculos calcreos son numerosos (Lmina 55-16F) (Orihel, 1995;
Gutirrez, 2000). Coenurosis. La tenia intestinal de perros y gatos (principalment
e T. muticeps y T. serialis) produce una larva en los huspedes intermediarios cono
cida como coenuro. Este estadio consta de un largo saco transparente (de unos 1
0 cm) que contiene muchos esclex que surgen de una membrana germinal que se invag
ina en quistes llenos de lquido (Lmina 55-16E). Las ovejas son los huspedes interme
diarios de T. multiceps. y los roedores, liebres y conejos lo son para T. serial
is. aunque los humanos juegan este papel por la ingesta accidental de huevos pro
ducidos por gatos y perros domsticos. Como un cisticerco. el coenuro puede desarr
ollarse en cualquier rgano causando una enfermedad similar. El diagnstico se suele
hacer por el examen de quistes extirpados o en secciones tisulares. La presenci
a de mltiples esclex invaginados en una sola vescula lo diferencian del resto de lo
s cestodos larvales.

por las heces, la orina o el esputo. Dada su localizacin extraintestinal, estas l

ombrices y sus huevos se pueden encontrar en los tejidos, c o m o hallazgo o aso
ciados a clnica. Los adultos de F. heptica. C sinensis y O. vivernm se pueden hall
ar en el hgado y en las vas biliares y. a veces, en sitios ectpicos. La presencia d
e los tpicos huevos, tanto libres en los tejidos como dentro del tero de los helmi
ntos, frecuentemente facilita la identificacin definitiva. El adulto de Paragonim
us spp. es el que reside principalmente en el pulmn, pero puede hallarse en sitio
s ectpicos como el cerebro y el tejido subcutneo, produciendo abscesos frecuenteme
nte asociados con una gran produccin de huevos. Los esquistosomas adultos viven e
n los vasos sanguneos, principalmente en el territorio de la vena mesentrica inter
ior (S. mansoni). vena mesentrica superior (S. japonicum y S. mekongi) y en el pl
exo vesical (S. haematobium). Aunque los adultos no suelen encontrarse en las bi
opsias tisulares. los huevos pueden encontrarse en gran nmero de tejidos del inte
stino, del hgado y de la vejiga (Lmina 55-14 B, Dy F). Los huevos pueden diseminar
se por la sangre a otros locos, incluidos el cerebro, la mdula espinal, los pulmo
nes, el corazn, los rones y el bazo. Los huevos de S. japonicum tienen tendencia es
pecial a diseminarse debido a su pequeo tamao y al gran nmero de huevos producido.
La identificacin de los huevos depende del reconocimiento de su tamao tpico y de su
morfologa en los tejidos adecuados.
ARTRPODOS DE IMPORTANCIA MDICA
Los artrpodos comprenden un gran y diverso grupo de organismos, algunos de los cu
ales tienen una gran importancia clnica o econmica. Esto es debido a que son una i
mportante causa de morbimortalidad en los humanos y para sus animales domsticos,
con serias prdidas econmicas para la agricultura. Aunque quiz los artrpodos son ms co
nocidos entre los clnicos por su capacidad para transmitir agentes infecciosos, c
omo son virus, bacterias (Rickettsia, espiroquetas y otros), protozoos y algunos
helmintos, stos tambin pueden causar patologa directamente por invasin tisular. env
enenamiento, formacin de vesculas, prdida de sangre y reacciones alrgicas. El miedo
exagerado a artrpodos (entomofobia) y los delirios de infestacin (delirio de paras
itosis) son neurosis no infrecuentes que pueden afectar a algunos individuos. La
s especies que directa o indirectamente causan enfermedad humana son representat
ivas de todas las clases de artrpodos (Tabla 55-10). En esta seccin, se presenta u
na aproximacin que se puede usar en el laboratorio clnico cuando se evalan muestras
con artrpodos, seguida por una breve descripcin de cada grupo de artrpodo con rele
vancia mdica. Existe una variedad de textos generales y especializados disponible
s para una completa cobertura del campo de la entomologa (Beaver. 1984; Garca. 199
7: Goddard. 1996: Harwood. 1979; Kettle. 1993; Lane, 1993; Centro Nacional de De
claracin de Enfermedades, 1969; Strickland, 1999).
Caractersticas biolgicas
Los artrpodos se caracterizan por una simetra bilateral y un cuerpo segmentado, va
rios pares de apndices articulados y un caparazn rgido que se va modificando durant
e el crecimiento. El desarrollo va desde huevos hasta adultos a travs de una meta
morfosis gradual (huevo, ninfa y adulto) o completa (huevo, larva, pupa y adulto
). Las chinches, los revviros, los piojos y las cucarachas son ejemplos de insect
os que sufren una metamorfosis gradual. La mosca, el mosquito, las pulgas, las h
ormigas, las abejas y las avispas, asi como los escarabajos, sufren una metamorf
osis completa. Las formas larvales similares a los gusanos se hacen pupa y luego
adultos. Los arcnidos sufren cambios de desarrollo muy similares al proceso grad
ual de metamorfosis. Las larvas de estos artrpodos, que con frecuencia, sufren un
a metamorfosis completa, suelen ser los ms difciles para identificar y se deben en
viar a un especialista.
Tremtodos
Todos los tremtodos que habitan en el hgado, el pulmn y la sangre y que maduran en
humanos producen huevos que generalmente salen del cuerpo

1232
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 55-10 Clasificacin de los artrpodos de importancia mdica
Clase Insecia (insectos) Orden Anopleura (piojos) Orden Siphonaplera (pulga) Ord
en Diclyoplera (cucarachas) Orden Hemiptera (chinches, revviros) Orden Hymenopler
a (hormigas, avispas, abejas) Orden Coleptera (escarabajo) Orden Lepidoptera (oru
gas, mariposas, polillas) Orden Dptera (moscas, caros. mosquitos) Clase Aracnida (
arcnidos) Subclase Scorpiones (escorpiones) Subclase Araneao (araas) Subclase Acar
i (garrapatas, caros, ninguas) Clase Diplopoda (milpis) Clase Chilopoda (ciempis) C
lase Crustcea (crustceos) Orden Copepoda ( c e f a l p o d o s ) Orden Decapoda (c
angrejos) Clase Pentastomida (gusanos de la lengua)
biana, giardiasis y gusanos. Los mecanismos que intervienen en la transmisin biolg
ica varan desde la simple amplificacin en el artrpodo vector hasta cambios ms comple
jos del ciclo vital del parsito. Tanto garrapatas como caros intervienen en la tra
nsmisin de ciertas bacterias (Rickellsia. Ehrlichia. espiroquetas y otras), proto
zoos (Babesial y virus. Entre los insectos, los piojos transmiten bacterias {Ric
kettsia, Bartonella y Borrelia): los revviros transmiten Trypanosoma: las pulgas
transmiten agentes de peste, tifus y gusanos planos caninos; y los dpteros transm
iten arbovirus. malaria. Trypanosoma, Leishmania. filaras y bacterias. Reacciones
de hipersensibilidad. La mayora de las reacciones graves de las picaduras suelen
ser producidas por hipersensibilidad alrgica. Las picaduras de heminpteros son la
s responsables de la mayora de las muertes por artrpodo y suelen ser por hipersens
ibilidad tras una exposicin repetida al veneno (Reisman. 1994). La alergia tambin
puede exacerbarse tras la exposicin a la saliva, excrementos o partes del cuerpo
de los caros. garrapatas, piojos, chinches, orugas, polillas y mariposas. Se pued
e producir asma y fiebre elevada como respuesta a estos alrgenos en el ambiente (
Frazier, 1980). Manifestaciones psicolgicas. La entomofobia se define como un irr
azonable o excesivo miedo a la vista o al contacto con artrpodos Aunque esto pued
e causar alteraciones en las actividades habituales de una persona, rara vez es
incapacitante. El delirio de parasitosis es un trastorno emocional ms serio por e
l que una persona est convencida de que estaba infectada con parsitos o artrpodos a
pesar de la evidencia objetiva de lo contrario. Si esto progresase, podra result
ar en una prdida de empleo, divorcio, abuso de pesticidas y mudanzas repetidas. L
as visitas a los servicios de salud suelen ser numerosas, aunque insatislactoas.
El problema puede empezar tanto en el hogar como en el trabajo y se puede transf
erir del uno al otro. El delirio puede ser tan convincente que puede ser credo po
r otros miembros de la familia o amigos o tomarse como propio. El paciente puede
remitir muchas muestras, como piel, pelo, mocos o pelusa al laboratorio. Es obl
igacin del laboratorio examinar dicho material para descartar una autntica infesta
cin. El misterio de la irritacin y el picor puede deberse a picaduras de caros, pio
jos, pulgas o chinches no reconocidas o bien a insectos y caros trados por un roed
or o pjaros en el rea habitada por el paciente. Antes de descartar tales causas, s
e deben buscar y excluir su presencia (Lynch. 1993).
Mecanismos de lesin
Invasin tisular directa. La invasin de la superficie de tisular (conocida como inl
estacin) se produce con gran variedad de artrpodos, de los que los caros, la pulga
y algunas larvas de dpteros son los ms comunes. La invasin de tejidos profundos y l
as cavidades (referidos como infeccin) se da principalmente con los gusanos y. ra
ra vez. con las larvas de pentastmidos. La invasin por larvas de dpteros, llamada m
iasis. puede darse en tejidos vivos o desvitahzados segn las especies. Envenenami
ento. Muchos artrpodos pueden inyectar saliva o veneno con sus mordiscos o picadu
ras. Para la mayora de las personas produce slo una reaccin local tisular. pero pue

de producir serias reacciones, como anafilaxia debido a una previa sensibilizacin

a la toxina en cuestin. Las picaduras de heminpteros (hormigas, abejas y avispas)
y las de escorpiones son las ms agresivas (Reisman, 1994). Las mordeduras de cie
rtos artrpodos, especialmente los ciempis, los mosquitos, las moscas, las chinches
, los revviros, las chinches asesinas, los piojos, las pulgas, las garrapatas y l
os caros, tambin pueden ser txicas, causando reacciones locales o sistmicas. Casi to
das las araas son venenosas, pero slo un pequeo grupo (araas viudas, araas violn y al
unas tarntulas) pueden causar peligro para la salud humana. Causas de envenenamie
nto menos (recuentes pero tambin descritas son motivadas por la exposicin a los pe
los urticantes de ciertas orugas o larvas de escarabajos. Vesiculacin. Algunos de
los milpis ms largos son capaces de rociar o lanzar una sustancia qumica vesicante
(productoras de ampollas) desde unas glndulas localizadas en cada segmento del c
uerpo. Esto es especialmente irritante si alcanza la conjuntiva. Los escarabajos
vejiga son llamados as por su capacidad de descargar fluidos vesicantes (cantari
dina. el ingrediente aclivo de la mosca afrodisaca espaola) cuando se les manipula
. Prdida de sangre. Los artrpodos responsables de causar prdidas de sangre a los ho
mbres o animales domsticos incluyen chinches, revviros. pioios. pulgas, moscas, mo
squitos, garrapatas y caros. Aunque no suele suponer un nesgo para la vida, tiene
el riesgo de transmisin de agentes infecciosos. Transmisin de agentes infecciosos
. Muchos artrpodos juegan un papel m u y importante en la transmisin mecnica o biolg
ica de agentes infecciosos. La mosca domstica puede ser responsable de la transmi
sin del agente de disenteria bacilar, clera, tifus, diarrea viral, disentera ameAproximacin de laboratorio a la identificacin de artrpodos
Las muestras de artrpodos son frecuentemente dirigidas al laboratorio clnico tanto
por mdicos como por pacientes con la esperanza de que sean identificados, pero p
ocos trabajadores de los laboratorios reciben algo ms que un entrenamiento superf
icial en entomologa. Sin embargo, los especialistas pueden tener acceso a textos
y claves que permiten una identificacin de los grupos encontrados con ms frecuenci
a, especialmente los ectoparsilos (pulgas, caros. piojos y garrapatas). De mayor i
mportancia es la capacidad del personal del laboratorio para reconocer las raras
situaciones en las que se debe buscar la opinin de un experto. Esto es de especi
al relevancia en las ocasiones en las que se estn lomando importantes decisiones
teraputicas y de pronstico. Los laboratorios de salud pblica local o estatal suelen
tener expertos disponibles o conocen a personas entrenadas en entomologa mdica en
institutos educacionales, o museos u oirs agencias, incluido el CDC. Las muestra
s recibidas en el laboratorio suelen ser organismos intactos, raspados cutneos, t
ejidos, esputos, orina o heces. Tambin se pueden remitir objetos personales como
plantillas, agua, ropa, ropa de c a m a y alfombras, entre otras. No es raro que
se remitan artrpodos hallados en el inodoro tras la miccin o la deposicin. En la m
ayora de los casos, la presencia de estos organismos es coincidencia y no implica
infeccin. L a correcta muerte y conservacin de los artrpodos es importante para pr
eservar sus caractersticas, que luego sern necesarias para su identificacin. Los ar
trpodos pequeos, sin alas, especialmente los ectoparsitos (piojos, pulga, garrapata
s y caros). larvas (gusanos, orugas, larvas), araas

CAPTUIO 55

PARASITOLOGA MEDICA
1233
y escorpiones se deben colocar directamente en alcohol etlico al 70%-80%. Las gra
ndes formas larvales se matan mejor en agua caliente (sin hervir), para que sus
cuerpos se extiendan sin contraerse antes de meterlos en alcohol. Los tejidos af
ectados u otros escombros se deben manipular con delicadeza o lavar antes de con
servarlos. Las formas ms pequeas (acaras, pequeas garrapatas, pulgas, moscas de are
na) se deben preparar como muestras permanentes. Los insectos alados, especialme
nte los mosquitos adultos y moscas, se deben matar exponindolos a humos de etil a
ctico o cloroformo y preservarlos en seco para mantener la informacin taxonmica rec
ogida en las escalas corporales y de las alas. Tales artrpodos suelen pinchar y s
ecar, seguido por un almacenamiento en cajas hermticas protegidas con naftalina o
diclorobenceno. Ms detalles de la recoleccin, preservacin y preparacin de las muest
ras artrpodos se pueden encontrar en otros textos (Beaver. 1984; Garca. 1993; Lae,
1993; Steyskal, 1987).
nos de D. caninum y, menos frecuentemente, de H. diminuta y H. nana. Y a que las
larvas de estas especies frecuentemente se dan en los lechos de los animales, a
lfombras y muebles, su erradicacin puede requerir la fumigacin y su limpieza. La p
ulga de la rata oriental. Xenopsyila cheopis. es una especie muy importante, ya
que transmite el bacilo de la peste y el agente del tifus murino. Aunque parsita
en muchas especies de ratas, estas pulgas atacan con facilidad a humanos. La pul
ga ningua o de las arenas (Junga penelrans) se halla en Amrica central y Sudamrica
y regiones de frica tropical. La pulga hembra se une a la piel especialmente ent
re los dedos del pie y bajo las uas, donde crecen hasta el tamao de un pequeo guisa
nte. Tras la puesta de huevos, la pulga muere, produciendo una respuesta inflama
toria con el riesgo de una sobreinfeccin bacteriana. La tungiasis se diagnostica
al identificar la porcin oscura del abdomen de la pulga saliendo de la piel en un
a lesin alargada (Beaver, 1984; Goddard, 1996: Lae, 1993). Cucarachas. Las cucarac
has se han adaptado rpidamente a la vida d e los humanos compartiendo nuestra com
ida, cobijo y nuestro calor. Aunque son unos compaeros algo pesados, stos son pote
ncialmente transportadores de patgenos lecales debido a su capacidad de moverse rp
idamente desde los desages a las cocinas o despensas. Adems de transmitir bacteria
s, pueden extender poliovirus. virus de la hepatitis, protozoos intestinales, in
cluida Entamoeba histolytica. y muchas especies de nematodos entricos. Tambin se p
ueden dar alergias y asma en algunos individuos tras la exposicin a excrementos,
caparazones o partes del cuerpo de las cucarachas (Goddard, 1996). Chinches y re
vviros. Las chinches (familia Cimidiae) y los revviros (familia Reduviidae) son in
sectos chupadores de sangre con probscides largas y estrechas que las doblan bajo
el cuerpo cuando no las usan. Las chinches (Cimex lectulanus y Cimex hemipterus
) son marrones rojizas, aplanadas dorso-ventralmente, sin alas, de unos 5 m m de
longitud (Lmina 55-17). Tienen una distribucin cosmopolita y atacan a la mayora de
los mamferos, alimentndose principalmente por las noches. Durante las horas del da
se esconden ba|o los colchones, el papel de las paredes las tablas del suelo. Au
nque no se les conocen como transmisores de enfermedades, sus mordiscos pueden s
er dolorosos, con ampollas, segn la sensibilidad del individuo a su saliva. Los r
evviros (Tnatoma. Rhodnius. Panstrongyius) tienen una cabeza con forma de cono co
n un cuello estrecho y un abdomen que se ensancha en su mitad. Estos son negros
o marrones y algunos tienen marcas naranjas o negras en el abdomen. Suelen medir
de 1 cm a 3 cm y, a diferencia de las chinches, tienen unas alas bien formadas
para volar. Al igual que las chinches, se alimentan en vertebrados y causan simi
lares reacciones cutneas. En Mxico y Amrica central y Sudamrica transmiten el agente
de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruz. en las heces, que posteriormente s
e introducen en la piel mediante el rascado (Goddard, 1996; Lae, 1993). Abejas, a

vispas y hormigas. Los heminpteros son insectos sociales que hbilmente defienden s
us nidos cuando se les molesta. En las hembras no reproductoras, el rgano ponedor
de huevos se modifica como un aguijn capaz de inyectar veneno para capturar pres
as o para defenderse. El veneno de la abejas, avispas y avispones causa slo una i
nflamacin dolorosa temporal en la mayora de las personas, pero pueden causar a vec
es reacciones sistmicas, como anafilaxia en personas sensibilizadas (Reisman. 199
4). Cerca de cien personas mueren cada ao en EE.UU. por este motivo. La abeja de
la miel africana se encuentra ahora en Norteamrica tras su introduccin en Brasil e
n 1956. Estas abejas, que son fcilmente ms provocadas por otras abejas, muestran u
n masivo comportamiento a la hora de picar. Muchas especies de hormigas son prob
lemticas para los humanos por su capacidad de morder, y algunos grupos, como las
hormigas segadoras y las hormigas del fuego, son capaces de producir picaduras d
olorosas. Escarabajo. Aunque quiza son con frecuencia conocidos como provocadore
s de plagas en los campos de agricultura, algunos tienen unas mordeduras doloros
as y otros, especialmente los escarabajos vejiga, pueden exudar un lquido vesican
te (cantaridina) que produce dermatitis o ampollas.
Insectos
Los insectos comprenden ms del 90% de todas especies de artrpodos descritos, aunqu
e slo algunas especies son responsables de patologa humana. Los miembros de esta c
lase se diferencian de los dems artrpodos por poseer el cuerpo dividido en tres pa
rtes (cabeza, trax y abdomen), un par de antenas, tres pares de patas y uno, dos
o ningn par de alas. Es la nica clase de artrpodos en los que se ha desarrollado el
vuelo. Piojos. Los piojos estn aplanados dorso-ventralmente, sin alas, con unas
caractersticas pinzas en el final de cada pata que les permite fijarse a los pelo
s o a la ropa (Lmina 55-17/1 y S). Todas las especies se alimentan de sangre inte
rmitentemente y pueden causar una dermatitis poco explicada. Los huevos, conocid
os como liendres, se depositan en los pelos o en la ropa, segn la especie. Aunque
se les nombra segn su principal localizacin, no siempre estn confinados a esa loca
lizacin. El piojo de la cabeza, Pediculus capitis. y el de cuerpo, Pediculus huma
nus. son indistinguibles por personal no especialista. Son ms largos que anchos y
miden hasta 3 mm. La dilerencias biolgicas son aparentes. P. humanus es el nico q
ue transmite el agente del tifus, la fiebre de las trincheras y la fiebre recurr
ente (Kim. 1986). La infestacin por ambos tipos se da en gente acinada y con poca
higiene. Los nios en edad escolar tienen mayor riesgo para adquirir el piojo de
la cabeza, al compartir gorros, ropa y peines (Orkin, 1985). Las liendres de pio
jo de la cabeza se colocan principalmente en el eje del pelo, y las del corporal
se colocan en la ropa. Los productos de cuidado del pelo, las micosis del pelo,
as como otros objetos, pueden simular liendres y su diferenciacin es importante.
Las liendres miden 1 mm y, cuando an no han eclosionado, poseen un oprculo intacto
(Lmina 55-17C). La transmisin se da principalmente al compartir ropa infestada, a
s como ropas de cama, ya que el piojo corporal tiende a poner los huevos en racim
os especialmente a lo largo de las costuras o dobleces de la ropa. El piojo del
pubis. Phlhirus pubis, es diferente de los otros. Es ms redondeado (mide hasta 2
m m de dimetro), y el abdomen es ms parecido al de un cangrejo. Su primer par de p
atas es mayor y ms largo que las dems patas (Lmina 55-17S). Estos piojos y sus lien
dres se hallan principalmente en el vello pbico. pero pueden extenderse al trax, l
as axilas y a la cara. La transmisin suele producirse durante el acto sexual. Pul
gas. Las pulgas son pequeos ectoparsitos (de 1 mm a 2 mm). sin alas y lateralmente
aplanados que se alimentan de sangre (Lmina 5517D). Sus largas y musculosas pata
s estn adaptadas para saltar de grandes distancias. Todas las pulgas que alectan
a humanos son parsitos de otros mamferos o aves de corral. La infestacin se produce
por la exposicin a animales domsticos y mascotas. Las especies ms nocivas son la p
ulga del perro (Ctenocephalides canis). la del gato (C. Felis), y la humana (Pul
ex irrilans). Algunas personas crean alta sensibilizacin a las mordeduras de las
pulgas, mientras que a otras casi no les afecta. Las pulgas de gatos y perros ta
mbin son huspedes intermediarios de gusanos pla-

1234
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Las larvas de ciertos escarabajos poseen pelos urticantes que producen dermatiti
s o, si se ingieren, irritacin del tracto gastrointestinal. Las larvas y los adul
tos de los escarabajos del grano pueden actuar como huspedes intermediarios para
los gusanos planos H. diminuta y H. nana de los roedores y humanos. Polillas y m
ariposas. Algunas larvas (orugas) de lepidpteros poseen pelos urticantes o espina
s que inyectan veneno al manipularlas. Aunque la mayora de los efectos de estas t
oxinas pueden quedar en la piel, se han descrito efectos sistemticos, incluidos s
hock y parlisis (Goddard, 1996). Los adultos de la polilla gitana y de montecillo
de hierba poseen pelos urticantes que pueden causar dermatitis, conjuntivitis o
irritacin de la va area, especialmente en trabajadores forestales (Shama. 1982). M
oscas y mosquitos. Los dpteros se caracterizan por poseer un par de alas membrano
sas. Entre todos los artrpodos, son los responsables de la mayor parte de las enf
ermedades humanas producidas al alimentarse de sangre, transmisin de agentes infe
cciosos y la invasin directa de tejidos por sus larvas (miasis). Las picaduras su
elen causar irritacin local debido a la sensibilidad a la saliva y, en algunos in
dividuos, reacciones sistmicas. Adems de su accin de sangre, los repetidos ataques
pueden producir daos fsicos y psicolgicos. Ciertas especies chupadoras de sangre so
n tambin responsables de la transmisin de patgenos: malaria, filariasis y arbovirus
por mosquitos; las oncocercosis por la mosca negra; loiasis por la mosca ciervo
; leishmaniasis y bartonellosis por la mosca de la arena; tripanosomiasis africa
na por la mosca tse-ts. Otros agentes virales, bacterianos o parasitarios se tran
smiten con facilidad de modo mecnico por las moscas no picadoras, como la mosca d
omstica o la mosca de la carne que pueden contaminar fcilmente el alimento. La mia
sis puede producirse de un modo accidental, facultativo u obligatorio. La mosca
domstica no tiene la necesidad de desarrollarse en los tejidos de mamferos, aunque
puede hallarse a veces en tejidos muertos. Este tipo de miasis accidental no es
infrecuente, pero no suele tener relevancia clnica. La miasis facultativa es cau
sada ms frecuentemente por la mosca de la carne, que suele alimentarse de tejidos
muertos pero puede ir a los tejidos viables adyacentes. La miasis obligatoria s
e produce por especies que se desarrollan slo en tejidos vivos. Estas especies ti
enen un origen zoontico. La mosca humana. Dermatobia hominis. se desarrolla en le
siones subcutneas como fornculos, con el extremo posterior apareciendo por la supe
rficie cutnea (Lmina 55-17F). Estas especies se encuentran ms frecuentemente en per
sonas que ha estado algn tiempo en Amrica Central o Sudamrica, o con menos frecuenc
ia en frica. Es raro que los huevos sean transportados al husped por otros insecto
s, habitualmente mosquitos. La mosca Cordyiobia anthropophaga. hallada en frica s
ubsahariana, tambin causa una miasis foruncular. Sus huevos se suelen poner en el
suelo o en las ropas tendidas y la larva penetra rpidamente al contacto con la p
iel. La miasis obligatoria grave es la causada por Chrysomya bezziana y por Coch
limyia hominivorax. Estas especies ponen sus huevos en el ganado vacuno, habitua
lmente en las heridas o cerca de la nariz. Las larvas se mueven y se alimentan a
ctivamente a travs de los tejidos vivos. Las infecciones humanas pueden ser espec
ialmente destructivas y afectar al 0|0, a la nariz o a la boca. Otras especies t
ambin pueden ser causantes de miasis obligatorias en los humanos (Lane. 1993).
grejo, y una cola segmentada con un aguijn globuloso en el extremo (Lmina 55-18A).
Tienen una naturaleza depredadora, paralizando a sus vctimas con su veneno del a
guijn, aunque tambin puede usarlo para fines defensivos. La toxicidad humana vara s
egn las especies. Pueden no producir ms dao que la picadura de una abeja, pero algu
nos son mortales, causando cerca de mil muertes al ao. Las especies venenosas se
dan en el hemisferio oeste, Europa, frica y Oriente Medio (Beaver, 1984; Goddard,
1996). Araas. Las araas carecen de cola con aguijn, pero a cambio poseen quelceros

parecidos a colmillos en su zona bucal, a travs de los cuales pueden inyectar ven
eno. Aunque la mayora son venenosas, tan slo unas pocas tienen quelceros capaces de
penetrar la piel humana. La mayora de las picaduras producen slo irritacin y dolor
temporal. Las araas viudas (gnero Lactrodectus) son uno de los grupos responsable
s de sntomas sistmicos gracias a la accin de una potente neurotoxina capaz de produ
cir somnolencia, dolor muscular, parlisis, convulsiones y, a veces, la muerte. La
tasa de mortalidad publicada vara del 1% al 6%. Se han descrito cinco especies e
n EE.UU., siendo la viuda negra (Lactrodectus mactans) la ms extendida. Las hembr
as de la viuda negra poseen un color negro brillante con una caracterstica marca
rojo-naranja en la parte inferior del abdomen y tienen una envergadura de 3 cm o
4 cm. Viven en localidades protegidas, como cobertizos, bosques y stanos (Strick
land, 1999). Las araas violin (gnero Loxosceles) son causantes del aracnidismo nec
rtico. En EE.UU., el recluso marrn (Loxosceles reclusa) es el que ms frecuentemente
afecta, aunque hay otras especies. Esta especie mide de 1 cm a 2 cm, con un col
or entre canela y marrn oscuro, con una marca oscura en forma de violin orientada
hacia la parte delantera en el dorso del cefalotrax. Cuando se halla en los hoga
res est recluida en su guarida, prefiriendo zonas tranquilas como armarios, stanos
o porches. Su picadura es indolora y con frecuencia no se descubre hasta horas
despus, cuando se forma eritema, edema y dolor. El veneno es dermonecrotizante y
hemoltico, causando necrosis cutnea durante varios das. La lesin puede tener dificul
tad para cicatrizar y puede sobreinfectarse. Son raras las reacciones sostenidas
, como la hemolisis y el fallo renal agudo. Otros gneros tambin se han implicado e
n aracnidismo necrotizante (Fisher, 1994). Garrapatas. A diferencia de las araas
y escorpiones, las garrapatas tienen un cefalotrax fusionado con el abdomen y un
caracterstico hipostoma para alimentarse. Se desarrolla en cuatro fases: huevo, l
arva, ninfa y adulto. Tras anclarse, necesita alimentarse de sangre para su desa
rrollo. Los humanos la adquieren en las reas de arbustos o de hierba en las cerca
nas de los huspedes animales. Son ectoparsitos que necesitan alimentarse de sangre
y son importantes vectores de patgenos virales, bacterianos y protozoos, tanto pa
ra hombres como para animales domsticos. Su alimentacin tambin causa dao local y prdi
da de sangre, especialmente al ganado y a la fauna, o la parlisis de la garrapata
que es un sndrome causado por una neurotoxina secretada por las glndulas salivare
s que causa parlisis flcida ascendente y toxemia. La clnica puede asemejarse al sndr
ome de Guillain-Barr, a la poliomielitis o al botulismo. L a resolucin de los sntom
as se da en tan slo unas horas o das tras quitar la garrapata. Las especies que af
ectan a humanos son los miembros de la familia Ixodidae (garrapatas duras) y Arg
asidae (garrapatas blandas). Las duras tienen el aparato bucal dirigido hacia de
lante y un caparazn escleroso en el dorso llamado scutum. Este caparazn cubre la t
otalidad del dorso del macho, pero slo la porcin anterior de la hembra, permitiend
o que se hinche cuando engorda (Lmina 55-186 y C). Las garrapatas Argasidae tiene
n un cuerpo blando que carece de caparazn y el aparato bucal est dirigido ventralm
ente, siendo invisible cuando se la observa desde arriba (Lmina 55-180). Las garr
apatas sin engordar miden de 2 mm a 5 mm pero crecen varias veces tras engordar.
Las garrapatas duras engordadas pueden asemejarse a las blandas, por lo que se
debe tener cuidado a la hora de su identificacin (Sonenshine, 1991,1993). La mayo
ra de garrapatas observadas libres o unidas a la piel son duras. Las blandas suel
en alimentarse brevemente por la noche. Las especies de
Arcnidos
Los arcnidos de importancia mdica son los escorpiones, las araas, las garrapatas y
los caros. Los escorpiones y las araas poseen dos segmentos corporales, el cefalotr
ax y el abdomen, mientras que las garrapatas y los caros slo tienen uno. Poseen cu
atro pares de patas, tanto de ninfas como de adultos. La larva de garrapata y de
caros tiene tres pares de patas. Todos carecen de antenas, mandbulas y alas. Los
escorpiones y las araas son ms conocidos por su capacidad de inyectar veneno, mien
tras que las garrapatas y los caros son conocidos por actuar como vectores de patg
enos virales, bacterianos y protozoos. Escorpiones. A diferencia de otros arcnido
s, los escorpiones slo tienen un par de pinzas delanteras, que les da un aspecto
similar a un can-

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MEDICA
1235
garrapatas duras importantes en Amrica del Norte son Dermacentor variabais (garra
pata canina americana). D. andersoni (garrapata de la madera de las Montaas Rocos
as). Amblyomma americanum. Rhipicephalus sanguineus (garrapata canina marrn). Ixo
des escapularis (garrapata de palas negras) e /. pacificus (garrapata de patas n
egras del oeste). A Dermacentor y Amblyomma se les llama tambin garrapatas adorna
das por las marcas blancas en sus caparazones. Las otras carecen de adorno. Las
garrapatas Dermacentor transmiten la liebre manchada de las Montaas Rocosas y pos
iblemente la tularemia y liebre Q. Ixodes son vectores de la enfermedad de Lyme.
babesiosis y ehrlichiosis, y en otras partes del mundo transmiten ciertos arbov
irus. Amblyomma es capaz de transmitir la fiebre manchada de las Montaas Rocosas
y tambin una tularemia y la enfermedad de Lyme. Todos estos gneros pueden causar l
a parlisis de la garrapata. Rhipicephalus se ha implicado en la transmisin de la f
iebre manchada de las Montaas Rocosas y en ehrlichiosis del norte de Amrica, y la
fiebre botonosa en el rea mediterrnea. Las garrapatas blandas del gnero Ornithodoro
s se dan en muchas zonas del mundo, incluido EE.UU. y son importantes vectores d
e fiebres recurrentes por espiroquetas (Borrelia recurrentis y las formas relata
das) (Spach. 1993; Murray, 1999). caros. Los caros son arcnidos microscpicos (menore
s de 1 mm) ampliamente distribuidos en el ambiente. Las especies con importancia
mdica pueden afectar a los hombres, actuar de vectores o causar alergias al polv
o. Los hombres son con frecuencia infestados tanto por Demodex tolliculorum como
por Demodex brevis. caros de los fornculos, y Sarcoptes scabei. el acaro de la sa
rna. Los caros del folculo son minsculos (0,1 mm a 0,4 mm) y alargados, con patas a
chaparradas con las que se pueden asir de los folculos del pelo y de las glndulas
sebceas (Lmina 55-18F). Suelen ser hallazgos incidentales en las preparaciones his
tolgicas cutneas. Aunque su presencia se ha asociado a varias condiciones cutneas,
son frecuentemente hallados en individuos sanos, lo que hace su trascendencia in
cierta (Burns, 1992). Sarcoptes scabieies el acaro de mayor importancia mdica dad
a su capacidad para crear tneles serpigmosos por la capa superior de la epidermis
. Se transmite por contacto personal y se puede encontrar principalmente en los
espacios interdigitales, la cara flexora de las muecas y los antebrazos y, menos
frecuentemente, en otras zonas como las mamas, las nalgas y los genitales extern
os. La inflamacin y el prurito intenso son secundarios a la creacin de los tneles y
la produccin de excrementos y huevos. La clnica vara segn la sensibilizacin a los pa
rsitos y a sus productos. Las lesiones se sobreinlectan con frecuencia. La aparic
in de una dermatitis generalizada debida a la existencia de miles de caros en anci
anos o inmunosuprimidos se conoce con el nombre de sarna noruega. El diagnstico s
e hace colocando los raspados cutneos de reas afectadas en hidroxido potsico al 20%
o en aceite mineral para su aclaramiento y su examen al microscopio. La deteccin
de huevos, larvas de seis patas o ninfas de ocho patas o adultos es diagnstico,
pero a veces puede resultar difcil (Fig. 55-11: Lmina 55-18E). El diagnstico de sar
na en una institucin o en una escuela puede causar seudoepidemias, en las que muc
hos desarrollan picores sin evidencia de enfermedad. Se debe tener cuidado para
diagnosticarlos adecuadamente, para diferenciar los casos reales de las parasito
sis psicgenas o ilusorias (Lynch. 1993; Orkin. 1985). Un nmero de caros animales pu
eden afectar a humanos para alimentarse de sangre, tanto como larvas como por ad
ultos, cuando no tienen otros mamferos o pjaros disponibles. Las larvas de las nin
guas (familia Trombiculidae) son un problema en muchas partes del mundo, ya que
sus salivas pueden causar grandes reacciones inflamatorias con gran prurito. Est
as larvas de seis patas, frecuentemente de color rojo, se unen a la piel en zona
s donde la ropa aprieta, como es en los tobillos, caderas y muecas o axilas. En re
as de Asia y Australia los caros Trombiculidae son vectores del agente del tifus
de la maleza (Lae. 1993). Ciertos caros no mordedores juegan un papel en la riniti

s alrgica, asma y ciertas lesiones cutneas. Las secreciones, excrementos y partes

del cuerpo de Dermatophagoides larinae y de D. pteronyssinus son potentes alrgeno
s que se dan en el ambiente domstico (Frazier, 1980). Los test ordinarios realiza
dos por un alerglogo pueden identificarles.
Clases de menor importancia mdica
Milpis. Los milpis son artrpodos similares a los gusanos con numerosos segmentos, c
ada uno de los cuales posee dos pares de patas que pueden encontrarse en y bajo
la vegetacin. Aunque carecen de aparato bucal mordedor, algunas especies producen
secreciones vesicantes desde las glndulas colocadas en los segmentos. Cuando se
les agrede, las largas especies tropicales pueden lanzar un liquido a una distan
cia de varios centmetros. La exposicin de la piel o mucosas a estos lquidos causa q
uemazn y ampollas. Ciempis. Estos animales son ms planos que los milpis y tienen slo
un par de patas por segmento; poseen largas antenas. Tienen un movimiento rpido y
pueden causar picor con un par de pinzas frontales que estn modificadas a partir
del primer par de patas. Aunque no suelen causar serios daos, las especies ms gra
ndes (26 c m a 45 cm) del sur de EE.UU. y de las regiones tropicales son capaces
de penetrar la piel al locarla, produciendo un picor urente y doloroso con infl
amacin local. Aunque podran existir reacciones sstmicas en personas sensibilizadas,
esto es raro (Goddard. 1996). Crustceos. Los crustceos de importancia mdica son pri
ncipalmente los que sirven de huspedes a larvas de diferentes helmintos. Muchos gn
eros de cangrejos son huspedes intermedianos de diferentes especies de lombrices
{Paragommus spp.) en todo el mundo. Los cefalpodos son zooplancton microscpicos qu
e a veces sirven como husped intermediario para los nematodos D. medinensis y Gna
thostoma spinigerum y para los cestodos Diphyllobothrium y Spirometra.
Figura 55-11. Sarcoptes scabiei. Diagrama de un surco subcutneo. (Ad = h e m b r
a adulta; E = huevos; e = huevos embrionados; Ex = excrementos; Es = cascara de n
uevo: So orificio de entrada.) (Atter Railliet fn Brumpt.)

1236
Tabla 55-11
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Infecciones parasitarias en huspedes comprometidos Anomalas predisponentes Sida (e
specialmente CD4 + < 200/u.l). trasplantes y quimioterapia Sida, trasplantes y q
uimioterapia Sida, probablemente otra inmunosupresin Sida, probablemente otra inm
unosupresin grave Comentarios Referencias
Infeccin Protozoos intestinales Criptosporidiosis
Isosporiasis Ciclospondiasis Microsporidiosis
Giardiasis Protozoos sanguneos y tisulares Encefalitis granulomatosa amebiana
Inmunodefciencia comn variable, agammaglobulimemia ligada al cromosoma X
Diarrea grave (mayor 17 litros/dia). Puede tener afectacin extraintestinal inclui
dos pncreas, tracto biliar y pulmones Terapia limitada, no curativa Diarrea grave
, afectacin extraintestinal (adenopatas). existe tratamiento disponible Diarrea gr
ave similar a la criptospondioso e isosporiasis. Respuesta al Trimetroprima sulf
ametoxazol Varios sndromes: 1. Enfermedad mullisistmica 2 Enteritis con diarrea gr
ave (ms frecuente) 3 Infeccin ocular 4. Sndrome hepatobiliar con granulomas, necros
is heptica, colangilis 5. Enfermedad del msculo esqueltico El examen de sedimentos
de orina con una correla tincin permite el diagnstico de sndrome extraintestinal y a
lgunos casos de enfermedad intestinal Diarrea crnica, malabsorcin. Sida no es una
condicin predisponente
Winner y cois. (1993). Thielman yGuerranl(1998) Wittner y cois. (1993), Thielman
y Guerran (1998) Wittner y cois (1993), Thielman yGuerrant(l998) Wittner y cois.
(1993), Thielman yGuerrant(1998)
Thielman y Guerran (1998)
Sida y otros estados de inmunosupresin
Toxoplasmosis
Sida con CD4+ habitualmente < 100/(jl y otros estados de inmunosupresin, trasplan
tes cardiacos, donante seroposilivo y receptor seronegativo
Leishmaniasis
Sida, otra inmunosupresin
Habilualmente causada por el gnero de la Martinez y Visvesvara (1997) Acanthamoeb
a o Balamuthia. Causa infeccin subaguda o crnica del sistema nervioso central, per
o puede ser aguda en los huspedes inmunodeprimidos con diseminacin Habitualmente e
species o reactivacin de McCabe y Chirurgi (1993) quistes de infecciones previas.
Con frecuencia enfermedad diseminada con afectacin multiorgnica o lesiones del si
stema nervioso central multifocal. Puede causar neumonitis similar a la del Pneu
mocystis carinii. Puede dar coriorretinitis. Puede producirse tras trasplantes d
e mdula sea. El trasplante cardaco de donante seropositivo y receptor seronegativo
puede dar una toxoplasmosis fatal Limitada influencia de la leishmaniasis cutnea
Herwaldt (1999) Susceptibilidad a leishmaniasis visceral, pero no aumenta la gra

vedad. Mayor lacilidad de recada tras el tratamiento En sida, frecuentemente se a

fecta el sistema nervioso central, el miocardio y la piel Markell y cois. 1999).
Mileno (1998)
Tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas) Babesiosis
Sida, linfoma linfoblstico, trasplantes cardacos, otras inmunosupresiones Esplenec
tomia
Helmintos Estrongiloidiasis
Inmunosuprimidos por trasplantes o quimioterapia, corticodes o linloma, El sida n
oes el mayor factor predisponente
Artrpodos Sarna
Habilualmente hay infeccin subclinica en los inmunocompetentes. Los esplenectomiz
ados suelen desarrollar enfermedad clnica que puede ser latal Por automfeccin endge
na; puede darse hipennfeccin o inleccin diseminada y presentarse como neumona o enf
ermedad iniestinal grave. Puede aparecer sepsis por gramnegalivo o meningitis co
n gramnegalivo por la translocacin bacteriana causadas por la larva invasora. Se
debe descartar esta inleccin antes del tratamiento inmunosupresor en las reas alta
mente endmicas Deriva a una sarna noruega con afectacin general de la piel. A vece
s tiene gran prurito. Los pacientes tienen muchos caros y son muy contagiosos. Po
bre respuesta al tratamiento
Markell y cois. 1999). Mileno (1998) Markell y cois. (1999). Mileno (1998)
Neoplasias, inmunodeprimidos por trasplantes, quimioterapia, sida
Markell y cois 1999). Mileno (1998)

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA
1237
Pentastmidos. Los pentastmidos. o gusanos de la lengua, son artrpodos que pierden l
as caractersticas morfolgicas tpicas. Los adultos son como gusanos que viven en las
fosas nasales de ciertos reptiles, pjaros y mamferos. Las larvas se parecen a caro
s y residen en roedores, herbvoros y peces de agua dulce. Se han descrito inlecci
ones hepticas y pulmonares en el hombre tanto en Asia como en frica. Se han hallad
o adultos en la nasofaringe de personas en Oriente Medio y frica, donde causan un
a rinopata obstructiva conocida como halzn (Beaver. 1984: Strickland, 1999).
INFECCIONES PARASITARIAS Y HUSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS
Los huspedes inmunosuprimidos padecen anomalas en su sistema inmune humoral o celu
lar secundario a enfermedad, tratamiento o causa congenita. La malnutricin grave
tambin puede comprometer a las defensas. En la mayora de los casos suelen deberse
a alteraciones celulares (clulas T) secundarias a sida, neoplasias, quimioterapia
, trasplantes, corticoides o a la combinacin de varias de ellas. Para la giardias
is, el factor predisponente es el defecto inmune humoral, y para la babesiosis e
s la esplenectomia. Con la pandemia del VIH y el sida especialmente grave, en pas
es subdesarrollados con alta incidencia de parsitos como la malaria, esquistosomi
asis, ascariasis. amebiasis y filariasis, es una suerte que estas infecciones no
causen especial gravedad en pacientes con sida. Algunas enfermedades parasitari
as, como las causadas por Cryptosporidium. Toxoplasma y Slrongyloides. son ms gra
ves en inmunosuprimidos, pero hay diferencias. Por ejemplo, mientras que la infe
ccin por Cryptosporidium y por Toxoplasma son particularmente problemticas en pers
onas con sida, la infeccin por Slrongyloides no lo es, pero es un problema en los
receptores de trasplantes y en los que reciben quimioterapia, La Tabla 55-11 re
coge las infecciones parasitarias ms graves y/o ms frecuentes en los inmunosuprimi
dos. Las manifestaciones clnicas pueden ser distintas de las de la poblacin normal
, como se cita en dicha seccin.
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1240
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
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CAPTULO
56
Patologa molecular de enfermedades infecciosas
Martin G. Cormican, M.D., Ph.D. Michael A. Pfaller, M.D
APLICACIONES DE MTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGA CLNICA Deteccin de patgenos sin am
plificacin de diana Pruebas de ADN para identificacin de cultivos Amplificacin del
ADN para diagnstico Epidemiologa molecular
1241
ESTANDARIZACIN, CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIN DE LA COMPETENCIA DE MTODOS DE DIAGNS
TICO MOLECULAR BIBLIOGRAFA
1250 1251

En la pasada dcada, las tcnicas de biologa molecular han contribuido enormemente pa

ra que podamos entender la patogenia y epidemiologa de las enfermedades infeccios
as. Como las tcnicas se han vuelto ms accesibles y refinadas, las que se ocupan de
l diagnstico y tratamiento de la infeccin humana han buscado dirigir el desafo de a
daptar estos mtodos para resolver los problemas clnicos habituales, esto es, para
el diagnstico de la enfermedad, para orientar el tratamiento y para el control in
feccioso y epidemiolgico hospitalario La patologa molecular representa, cada vez ms
, una parte del servicio diagnstico que una diversin esotrica para entusiastas. Com
o las tcnicas moleculares se han vuelto sistemticas, las preguntas del coste y pot
encial para contribuir al cuidado del paciente necesitan ser dirigidas en cada c
aso. En cuanto al valor del mtodo, est en funcin del grado en que facilita el trato
con los problemas clnicos, no de la elegancia de la tcnica. Por tanto, el diagnsti
co molecular es el ms apropiado para agentes infecciosos que son difciles de detec
tar, o para identificar o determinar la sensibilidad antimicrobiana en un tiempo
rpido, comparado con mtodos convencionales. Los principios de la biologa molecular
relacionados con el diagnstico de laboratorio se comentan con detalle en los Capt
ulos 58, 59. 63. 66 y 68. El diagnstico molecular de enfermedades infecciosas tie
ne una gran base de cidos nucleicos y necesita el aislamiento de cidos nucleicos d
e los microorganismos y material clnico, y el uso de enzimas endonucleasas de res
triccin, electroforesis en gel y tcnicas de hibridacin de cidos nucleicos. Cada vez
ms se estn utilizando tcnicas ms modernas para amplificacin de cidos nucleicos para m
terial clnico. El anlisis de la secuencia de cido desoxirribonucleico (ADN) se ha i
do automatizando. Aunque por el momento no es de uso general en el laboratorio,
el anlisis secuencial proporciona el ltimo resultado de los organismos caracteriza
dos, y cuando se acompaa con tcnicas de amplificacin, nos ha dado las directrices c
on las que hemos podido identificar a los microorganismos que no han podido cult
ivarse y que antes eran desconocidos en enfermedades infecciosas (Amann, 1994; W
ilson, 1994). La tecnologa del trozo del gen tambin parece ofrecer un potencial co
nsiderable en el futuro para la caracterizacin de microorganismos en el laborator
io clnico. Una consideracin importante en la aplicacin general de las tcnicas molecu
lares es el coste. En el rea de diagnstico de enfermedades infecciosas, la mejora d
el paciente y la reduccin del coste de los antibiticos pueden hacer pesar ms que el
aumento de los costes del laboratorio. En la actualidad no se han demostrado es
os ahorros en muchas aplicaciones diagnsticas de mtodos moleculares. En el caso de
enfermedades transmisibles.
el coste puede estar justificado por una mejora de las medidas de control para la
infeccin para proteger a los pacientes y cuidar la salud de los trabajadores. La
epidemiologa molecular puede hacer una verdadera contribucin a la deteccin y contr
ol de la extensin de la infeccin, con capacidad para reducir los porcentajes de in
feccin nosocomial y la peticin de antibiticos caros utilizados para tratar organism
os resistentes En este punto, sin embargo, la mayora de la justificacin del gasto

en diagnstico molecular y epidemiologa es especulativo: sin embargo, los costes de

l equipamiento, reactivos y expertos son sustanciales, y el director del laborat
orio debe tambin considerar las cuestiones econmicas (Kant, 1995). El nivel de inv
ersin justificada debe determinarse en una institucin dada, y en algunos casos usa
r el servicio de laboratorio de referencia puede presentarse como la opcin ms efic
az.
APLICACIONES DE MTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGA CLNICA
El uso de mtodos moleculares para la identificacin y deteccin directa de los microo
rganismos en la microbiologa clnica se est desarrollando gradualmente y ya hay vari
os productos disponibles comercialmente (Tablas 56-1 a 56-3). Los usos prcticos i
ncluyen el uso de pruebas de cidos nucleicos para una deteccin directa de organism
os en el material clnico o para la identificacin de organismos previamente aislado
s. Adems, las tcnicas basadas en la amplificacin pueden utilizarse para la deteccin
e identificacin y para definir caractersticas selectas (p. ej., genes resistentes
a los antibiticos) de organismos. Finalmente, los mtodos moleculares proporcionan
un gran significado de caracterizacin de organismos, asi como a nivel de subespec
ies. en investigaciones epidemiolgicas.
Deteccin de patgenos sin amplificacin de diana
La deteccin de microorganismos patognicos por la prueba del ADN, directamente a pa
rtir de muestras, ha sido ampliamente investigado usando una variedad de formato
s de hibridacin y generadores de seales. El desarrollo de productos comerciales se
ha focalizado en el diagnstico directo de enfermedades transmitidas por va sexual
y patgenos respiratorios utilizando pruebas de hibridacin fase solucin y pruebas e
tiquetadas con ster acridina (Tabla 56-1).

1242 Tabla 56-1

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
P r u e b a s d e A D N para la deteccin de p a t g e n o s *
Formato de h i b r i d a c i n Fase solucin Fase solucin Fase solucin Fase slida Pla
ca microtiter Fase solucin Fase solucin Fase slida Placa microtiter Fase slida Placa
microtiter Sistema informador Hibridacin ADN/ARN y quimioluminiscencia Slot blot
con digoxigenina Hibridacin Hibridacin Cadena ramificada de ADN Ester acridina Es
ter acridina Cadena ramificada de ADN Cadena ramificada de ADN Estado Comercial'
Comunicado Comercial' Comercial Comercial''
1
Organismo Virus del papiloma humano Virus del herpes simple Citomegalovirus Viru
s de la hepalitis B
Chlamydia Neisseria
VIH
trachomatis gonnorrhoea
Comercial*' Comercial" Comercial'' Comercial'
1
Virus de la hepatitis C
'La tabla contiene ejemplos de mtodos disponibles y no pretende ser exhaustiva. L
as pginas web de los principales labricantes son una fuente til paia una mloimacio
n actualizada Oigene. Silver Spring. MD Murex/Abbol. Abbott Park, IL. ''Chiron.
Emeryville, CA "Gen-Probe, Irte., San Diego. CA.
:
Un diagnstico directo por una prueba de hibridacin es rpido y est libre de los probl
emas de contaminacin asociados con la amplificacin de dianas y es menos susceptibl
e a la inhibicin que otros muchos procedimientos de amplificacin. Una limitacin de
la prueba de hibridacin estndar es el requerimiento para detectar 10' o ms copias.
Para algunas aplicaciones, se debe valorar un mtodo rpido, conveniente, y que no s
e base en el cultivo con este nivel de sensibilidad, y las estrategias de seales
de amplificacin pueden detectar nmeros tan bajos como 500 genes/ul (Shan, 1994; Mu
rphy, 1999). Incluso los formatos de amplificacin de seales ms sofisticados no pare
cen mejorar la sensibilidad analtica de los mtodos basados en la amplificacin de di
anas, que pueden detectar menos de 50 copias de genes/ml (Erali. 1999). La gran
sensibilidad de los ensayos de amplificacin parece ser la venlaja en ensayos de c
alidad; sin embargo, la tecnologa de pruebas sensibles se est utilizando para much
os ensayos. En enfermedades infecciosas, la prueba de hibridacin basada en la mem
brana (Southern blot, ranura/punto blot) parece improbable que sea una herramien
ta significativa en el diagnstico del laboratorio en un futuro. El formato basado
en la membrana es quizs el ms aplicable para el anlisis de un gran nmero de muestra
s asi como para buscar aplicaciones. L a clasificacin del virus del papiloma huma
no (HPV) y la deteccin segura del HPV
en pruebas diagnsticas fue posible al principio por pruebas de ADN. Una variedad
de todas las pruebas genmicas y pruebas de oligonucleotides para los tipos ms comu
nes de HPV (p. ej.. tipos 16 y 18 comnmente asociados con carcinoma uterino cervi
cal y los tipos 6 y 11 asociados con enfermedad benigna) han sido descritas y se
han utilizado tanto el titulaje isotpico c o m o el no isotpico (Faulkner-Jones,

1993; Lorinez, 1992; ngel, 1992). Los formatos Southern blot y ranura/punto blot
tambin se han investigado para el diagnstico de toxoplasmosis cerebral y malaria f
alciparum entre otros, pero an no han sido utilizados en los laboratorios diagnsti
cos. Los sistemas comerciales han utilizado la hibndacin de fase solucin con un ti
tulaie no isotpico. Aquellos que no utilizan seal de amplificacin sern considerados
en primer lugar. Los productos titulados con ster acridina PACE 2 (Gen-Probe) con
una deteccin quimioluminiscente son quiz los ms utilizados. Otras tcnicas para la a
proximacin diagnstica son los sistemas de ensayo de captura de hbridos (HCA) (Digen
e y Murex). Tanto el Gen- Probe c o m o los ensayos de captura de hbridos usan un
titulaje con prueba no radiactiva que permite una larga vida. Adems, el formato
es relativamente sencillo y puede utilizarse para un nmero pequeo o grande de mues
tras. Las pruebas Gen-Probe (titulacin con ster acridina) para la deteccin de la Ch
lamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae estn disponibles comercialmente. Se p
uede utilizar una muestra clnica para detectar ambos patgenos. El proceso entero s
e realiza en un nico tubo, y la seal quimioluminiscenle se lee en un luminmetro y s
e interpreta relativamente para un control positivo o negativo. L a liabilidad d
el equipo Gen-Probe para detectar C. trachomatis en muestras clnicas se ha evalua
do en luncion del cultivo celular y mtodos inmunolgicos. Al igual que los mtodos in
munolgicos, pero a diferencia del cultivo, el mtodo no depende de la viabilidad de
los patgenos. En un estudio comparativo reciente, el mtodo Gen-Probe era ms sensib
le que el enzimoinmunoensayo Chlamydiazima (EIA). pero menos sensible que un ens
ayo comercial de amplificacin de dianas (AMP-CT, Gen-Probe) (Wylie. 1998). El ens
ayo GenProbe para N. gonorrhoeae se ha evaluado en un nmero de estudios que recie
ntemente han sido revisados con exhaustividad (Koumans. 1998). Los supervisores
dicen que el ensayo puede ser ms til en situaciones donde la optimizacin del cultiv
o es difcil. Un punto significativo adicional es el requerimiento continuo de cul
tivo para propsitos mdico-legales. Los HCA para detectar el HPV. el virus del herp
es simple (VHS) y el citomegalovirus (CMV) ya han sido descritos. Los ensayos HC
A se han descrito c o m o ms sensibles que los cultivos para detectar tanto el V
H Sc o m o el CMV. Unas modificaciones recientes del ensayo HPV estn dirigidas a
mejorar la sensibilidad. El sistema HC es. sin embargo, menos sensible que la am
plificacin de cidos nucleicos (Barret-Muir. 1958: Cope. 1997: Cullen. 1997: Poljia
k. 1999). Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas (Chiron) y Q|3 replicasa (Ge
ne-Trak) (Shan, 1994) representan test de estrategias diagnsticas que incorporan
una amplificacin de seal. Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas se han desarro
llado para la deteccin y cuantificacin del virus de la

Tabla 56-2 P r u e b a s c o m e r c i a l e s d e A D N para la identificacin de

cultivos*
Organismo Formato de h i b r i d a c i n En solucin En solucin En solucin En solucin
En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En sol
En solucin En solucin En solucin Sistema informador Ester acridina sler acridina Es
ter acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina sler acridina Ester acr
idina Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina Ester acridina
Ester acridma Ester acridina
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium-intracellulare Mycobacterium gord
onae Mycobacterium kansasii Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Blastomy
ces dermatitidis Cryptococcus neoformans Neisseria gonnorrhoeae Staphylococcus a
ureus Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Haemophilus influenzae Especies
de Enterococcus Streptococcus agalactiae
'Las pruebas recogidas han sido desarrolladas por Gen-Probe Inc . San Die- | go.
CA La tabla contiene ejemplos de las pruebas descrilas sin pretender sei exhaus
tiva. Las pginas web de los principales fabricantes son una fuente til para una in
formacin actualizada. J

CAPTULO 56

PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1243
Tabla 56-3
S i s t e m a s diagnsticos comerciales d e amplificacin de cidos nucleicos*
Tcnica de a m p l i f i c a c i n Transcnplasa inversa y PCR NASBA Deteccin de la
a m p l i f i c a c i n Prueba de captura microtltulo' Prueba del oligonucletido
suieto al abalorio magntico Prueba de captura microtltulo
1
Organismo Virus de la hepatitis C
1
VIH
PCR y transcriptasa inversa NASBA
tivo por hibridacin no depende de la capacidad para detectar cantidades pequeas de
cidos nucleicos. La ventaja de la identificacin basada en la prueba sobre mtodos n
o moleculares es mejor para organismos de crecimiento lento, como las micobacteas
u organismos para los que no hay sistemas de identificacin disponibles en el mer
cado. En este punto, la identificacin por hibridacin es relativamente cara, porque
en muchos sitios los aislamientos para identificarlos se hacen de manera indivi
dual y hay que hacer un gran nmero de controles para cada aislamiento clnico. En e
ste captulo se comentarn algunas de las pruebas descritas o disponibles en el merc
ado. La identificacin de las micobacteas cultivadas por un mtodo convencional es le
nta, tarda mucho tiempo. Las pruebas de titulacin con ster acridina para el comple
jo Mycobacterium tuberculosis complex. Mycobacterium avium-intracellulare. M. go
rdonae y M. kansasii estn comercialmente disponibles (Gen-Probe. San Diego, CA).
El uso de estas pruebas permite la identificacin del cultivo en un da de trabajo,
y la especificidad y sensibilidad son excelentes (99% y 95,5%, respectivamente)
(Goto. 1991: Walton, 1991; Richter. 1999). En algunas ocasiones, alguna variedad
de M. tuberculosis puede no reaccionar con la prueba del complejo M. tuberculos
is, y parece que hay subespecies de M. kansasii que no reaccionan con la prueba
M. kansasii(Badak, 1999; Niemann, 1999). Los mtodos de identificacin del cultivo d
e Histoplasma capsulatum. Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Crypt
ococcus neolormans tambin estn disponibles (Stockman. 1993). Las evaluaciones indi
can que la especificidad es del 100% y la sensibilidad del 97% o ms para todas la
s especies excepto para B. dermatitidis (87.8%) Al repetir el test, la sensibili
dad aument al 97.3% para B. dermatitidis y el 100% para otras especies. El sistem
a Gen-Probe N. gonorrhoeae se ha utilizado para la identificacin de cultivos N. g
onorrhoeae, adems del uso para su aplicacin directa en especmenes clnicos (AccuProbe
) se compara favorablemente con un sistema comercial de utilizacin rpida de carboh
idratos (Quadferm. bioMrieux) y un sistema de coaglutinacin (Phadeback Monoclone G
C test) para identificacin de N. gonorrhoeae cultivadas. Las pruebas de ADN titul
adas con ster acridina son vlidas para la identificacin de cultivos de Staphylococc
us aureus. Streptococcus pneumoniae. Escherichia coli. Haemophilus influenzae, E
nterococus spp., Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes. Estas prueba
s se han utilizado para identificar organismos cosechados en los botes de hemocu
ltivo que hayan sido positivos por centrifugacin (Davis, 1991). La identificacin s
e realiza en treinta minutos y es sencilla.
Prueba del oligonucletido sujeto ai abalorio magntico Prueba de captura microtitul

o' Prueba del oligonucletido suieto al abalorio magntico Prueba de captura microtl
tulo' Prueba de captura microwell'
1
Cilomegalovirus
PCR NASBA
1
Mycobacterium tuberculosis
PCR SDA TMA LCR
Prueba do ster acridina"' Captura de anticuerpos del producto etiquetado Prueba d
e captura microtltulo' Captura de anticuerpos de producto etiquetado
1 1
Chlamydia trachomatis
PCR LCR NASBA
Prueba del oligonucletido suieto al abalorio magntico
1
TMA Neisscria gonnorrhoeae PCR LCR
Prueba del ster acridina" Prueba de captura microtitulo' Captura de anticuerpos d
e producto etiquetado |
1
"La tabla contiene eiemplos de las pruebas descritas, sin pretender ser exhausti
va Las paginas web de los principales fabricantes son una luente til para una inf
ormacin actualizada 'Roche. Indianapolis. IN 'Organon Teknika. Durham NC ^Becton
Dickinson Cockeysville. MD "Gen-Probe, Inc.. San Diego. CA "Abbott. Abbotl Park.
IL PCR: Reaccin en cadena de la pohmerasa: NASSA amplificacin basada en I la hebr
a de cido nucleico. SAD amplificacin por desplazamiento de hebra: ! TMA amplificac
in mediada por transcripcin; LCR: reaccin en cadena de la | ligasa.
Amplificacin del ADN para diagnstico
La amplificacin de cidos nucleicos tiene el potencial para superar la principal li
mitacin de la hibridacin ampliando selectivamente las dianas especficas que estn pre
sentes en concentraciones bajas para niveles detectables. La reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR, Sistemas Moleculares Roche) fue la primera tcnica de amplifi
cacin desarrollada y permanece c o m o el mtodo ms conocido y empleado. Nuevas tecn
ologas de amplificacin, la reaccin en cadena de la ligasa (LCR. Laboratorios Abbott
), la amplificacin de hebras de cidos nucleicos (NASBA, Organon Teknika), la ampli
ficacin por desplazamiento de la hebra (SDA. Becton y Dickinson) y la amplificacin
mediada por transcripcin (TMA. Gen-Probe) forman las bases de los sistemas de di
agnstico adicionales que estn disponibles en la actualidad. El desarrollo de los p
roductos comercializados se ha centrado principalmente en sistemas para detectar
infecciones virales especificas (virus de la hepatitis C. virus de la hepatitis
B, CMV, VIH), en los agentes principales de las enfermedades de transmisin sexua
l (N. gonorrhoeae y C. trachomatis) y en el complejo M. tuberculosis. Los produc
tos comerciales se disean con vista a que el usuario los acepte, prevenir la cont
aminacin, estandarizacin de reactivos y potenciales condiciones de reconversin. No
est claro a qu nivel las diferencias son significativas entre los niveles de delec
cin logrados utilizando diferentes estrategias de amplificacin. Se ha informado de
un nmero de estudios comparando dos o ms mtodos de amplificacin para patgenos partic

ulares (Brown. 1999; Griffith. 1997; Schepetiuk, 1997: Slary. 1998) y. en genera
l, ninguno de los nuevos mtodos ha demostrado un nivel de sensibilidad mayor que
la PCR. Los factores para elegir entre los sistemas pueden incluir el porcentaje
de productos disponibles, el coste y la conveniencia de
hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB) (Urdea. 1991; Heerman, 1999
). el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Murphy 1999) y para la deteccin
del gen mecA. asociado con resistencia a la oxacilina en estafilococos (Kolbert
, 1998). Este ensayo de hibridacin se presenta en un formato similar al del inmun
oensayo de enzimas. La prueba para hibridacin de dianas se da en una solucin, y de
spus se captura el hbrido para el microttulo por una prueba adicional unido al micr
otitulo. El lmite de deteccin de cidos nucleicos diana no es tan bajo como el conse
guido con la amplificacin de la diana (Lunel, 1999; Yen-eberman, 1996; Zaaijer, 19
94). Los resultados cuantitativos en un rango alto de concentraciones de dianas
pueden ser tiles para detectar la carga viral, el pronstico y monitorizar la respu
esta al tratamiento en muchas infecciones virales (Heerman, 1999; Yen-Lieberman.
1996; Lunel, 1999).
Pruebas de ADN para identificacin de cultivos
Las pruebas de ADN tienen unas reglas establecidas para la identificacin de culti
vos de microorganismos (Tabla 56-2). La identificacin del cul-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
que pueda hacer en laboratorios individuales. Probablemente es ms prctico para un
laboratorio elegir un sistema de amplificacin sencillo que les pueda proporcionar
todos los test que ellos piden. En la Tabla 56-3 se resumen algunos de los patge
nos que han recibido mayor atencin, y los mtodos de amplificacin que se han utiliza
do. El nmero de sistemas diagnsticos disponibles est constantemente aumentando, y l
as pginas web de algunos de los principales fabricantes dan informacin til y actual
izada de los productos disponibles o en desarrollo. En la actualidad, los mtodos
moleculares tienen una regla establecida para el diagnstico clnico y la direccin de
un nmero de nlecciones virales, y puede volverse tambin valioso en el screening de
donaciones de sangre (Roth, 1999). En el caso de algunos patgenos bacterianos, l
a evaluacin de la regla de los mtodos moleculares relacionados con el cultivo o mto
dos inmunolgicos puede ser difcil de valorar. En la mayora de los estudios hay un n
umero de muestras que son positivas para los test de ensayos basados en la ampli
ficacin, pero negativas por mtodos inmunolgicos o de cultivo. La clasificacin de los
resultados de estos test son falsos positivos por amplificacin o falsos negativo
s por cultivo/deteccin de antgeno, tienen implicaciones importantes para los propsi
tos de calcular la sensibilidad y especificidad de los ensayos basados en la amp
lificacin y en juzgar los mritos relacionados con las diferentes actitudes para el
diagnstico de laboratorio. Muchos investigadores han intentado tratar el problem
a utilizando la tcnica de anlisis diferentes. El valor y limitaciones de los anlisi
s diferentes crea controversias: los que la proponen la consideran como la actit
ud disponible ms prctica (Schachter. 1998). mientras que los que se oponen creen q
ue el proceso tiende a predisponer resultados a favor de los ensayos basados en
la amplificacin (Hadgu, 1996; Miller, 1998). Una dificultad adicional en la toma
de decisiones concerniente al papel de ciertos ensayos, basados en la amplificac
in, en el laboratorio clnico debe expresar las reservas en una revisin, considerand
o la calidad de muchos estudios publicados (Koumans, 1998).
La PCR tambin ha sido ampliamente estudiada para el diagnstico de la infeccin por C
MV en pacientes trasplantados, y se ha descrito un sistema comercial para la del
eccin de CMV por PCR (Long. 1998). Los problemas del diagnstico de enfermedad por
CMV difieren del VHC y del VIH en que el virus es ubicuo, y por tanto su deteccin
en sangre por cualquier mtodo no confirma la enfermedad clnica per se. El desafio
en el diagnstico de CMV ha sido distinguir a los pacientes inmunocomprometidos q
ue tienen o van a desarrollar la enfermedad relacionada con el CMV de aquellos e
n los que la infeccin por CMV no es clnicamente signilicativa. Por estas razones,
el CMV estaba entre los primeros virus en los que la cuantificacin del virus por
la PCR fue investigada (Gema, 1994). Ms recientemente, la deteccin del ARN-mensaje
ro CMV. que representa la evidencia de una transcripcin activa del genoma viral,
ha sido utilizada para detectar la enfermedad por C M Vy valorar las respuestas
al tratamiento con informes micialmente favorables (Aono. 1998). La cuantificacin
de los virus por mtodos moleculares ha sido reconocida ahora como de importancia
significativa en relacin con VHC, VIH y VHB y, posiblemente, tambin con aquellos
como el virus Epstein-Barr asociado con enfermedad linfoproliferativa En test de
PCR cuantitativos, una cantidad conocida de una diana alterada por PCR o unas s
eries de concentraciones conocidas de dianas alteradas se aaden a las reacciones
de PCR que contienen dianas de ADN nativo a partir de una muestra de un paciente
. Las cantidades relativas generadas a partir del nativo y una diana alterada o
un patrn interno reflejan las cantidades relativas generadas en el sustrato de am
plificacin, y esto permite su cuantificacin. El sistema de deteccin del generado se
debe diferenciar de los originados del nativo y de la secuencia alterada del pa
trn estndar. Esto puede acompaarse por el uso del microtitulo wells que contengan t

anto una prueba especifica para el tipo nativo c o m o una prueba especifica de
diana modificada. Una aproximacin ms actual de la PCR cuantitativa es la tecnologa
Taqman. que explota la actividad de la exonucleasa 3 -5 de la enzima polimerasa
(Kimura. 1999). En adicin a los primeros, la mezcla de la reaccin contiene una pru
eba interna que se degrada durante el primer paso de extensin de cada ciclo de PC
R La degradacin de la prueba interna causa un aumento de la seal fluorescente en l
a mezcla amplificada. L a seal fluorescente puede monilonzarse continuamente a tr
avs del proceso de amplificacin, y la intensidad de la seal en relacin con el nmero d
e ciclos de amplificacin realizados es en funcin del nivel de templados presentes
al principio. Esta aproximacin puede proporcionar una cuantificacin ms exacta sobre
un rango ms amplio de concentracin inicial de dianas que la PCR cuantitativa conv
encional, en la que la concentracin del generado se determina en un punto del tie
mpo determinado en un nmero definido de ciclos. La cuantificacin del VHC puede ser
importante en el pronstico y monitorizacin del tratamiento, y una vanedad de sist
emas para la cuantificacin del VHC estn disponibles o han sido descritos. Los ms es
tudiados han sido quiz los mtodos RT-PCR (Roche, Monitor) y el ADN-ramilicado (Chi
ron, Quantiplex) (Hawkins, 1997; Jacob, 1997: Lu, 1998); sin embargo, el N A S B
A (Organon) y la tecnologa PCR cuantitativa nueva (Roche Taqman) se han descrito
ms recientemente (Lunel. 1999; Martel. 1999). La variedad de sistemas y el desar
rollo crean los estatus definitivos acerca de los valores de la dificultad de lo
s diferentes sistemas. Algunos asuntos importantes para tener en consideracin son
el registro dinmico de los sistemas disponibles (el registro de concentraciones
de genomas virales dentro del cual el mtodo es ms e x a c t oy reproducible). la v
ariacin en la capacidad para detectar y cuantificar los diferentes genotipos vira
les VHC y las dificultades del desarrollo de un patrn adecuado para la calibracin.
La cuantificacin del virus VIH se utiliza mucho para el pronstico y evaluacin de l
a respuesta al tratamiento de la elevada actividad antirretroviral (HAART) (Lede
rgerber. 1999). Los acercamientos tcnicos y los problemas asociados con la cuanti
ficacin de ARN-VIH son por o general parecidos a esos que hemos comentado antes pa
ra el VHC (Erali. 1999; Triques. 1999). Tambin se ha publicado una aproximacin alt
ernativa interesante para la cuantilicacin del VIH basada en la medicin de la acti
vidad enzimtica de la transcriptasa inversa en el plasma (Garca-Lerma. 1998). La P
CR ha sido estudiada y/o utilizada para el diagnstico de una variedad de otras in
fecciones virales, incluidas la infeccin por enterovirus (Pozo, 1998:
Diagnstico de infeccin viral
La identilicacin del VHC ha sido posible gracias a las tcnicas de biologa molecular
: por tanto, no es sorprendente que la PCR y otros mtodos moleculares tengan un p
apel importante en su diagnstico. La serologia nos permite detectar una infeccin p
revia por VHC, pero no permite diferenciar entre la infeccin actual y una curacin
espontnea. Como el VHC es un ARN-virus, la transcripcin inversa en cADN es un paso
preliminar necesario para la amplilicacin por PCR. Y a se han descrito una varie
dad de reacciones PCR utilizando la transcnptasa inversa y la ADN-polimerasa. El
mercado de Roche Diagnostic comercializa un producto (Amplicor RT-PCR) en el qu
e la transcriptasa inversa y la amplilicacin se realizan por la misma enzima, la
de Tth del Thermus thermophilus. y este proceso ha sido automatizado (COBAS Ampl
icor System) (Poljak. 1997). La deteccin del virus por mtodos moleculares confirma
la infeccin reciente y tiene establecida una regla en el diagnstico clnico de la i
nfeccin por VHC y en una respuesta monitorizada para el tratamiento. Para el diag
nstico de infeccin por VIH se detectan anticuerpos especficos para el virus con un
test serolgico, y como la acreditacin espontnea del VIH no es anticipada, generalme
nte se acepta la deteccin de estos anticuerpos inequvocamente como una evidencia d
e infeccin actual. En el caso de recin nacidos, la deteccin de anticuerpos puede re
flejar una transferencia transplacentaria de anticuerpos maternos, y se requiere
un perodo prolongado de seguimiento (mas de 18 meses) para confirmar la infeccin
slo por mtodos serologicos. La deteccin de virus por mtodos moleculares tiene una re
gla para resolver el estado de esos nios y tambin para dirigir a esos pacientes de
quienes el suero es, en repetidas ocasiones, indeterminado en los test serologi
cos. El VIH existe en la sangre como ARN-virus y como ADN-proviral incorporado e
n el genoma de clulas mononucleares de sangre perifrica. La transcriptasa inversa

no es necesaria para detectar el ADN-proviral, pero se necesita para la deteccin

o cuantificacin de ARN-VIH libre. Se ha publicado que el ensayo Amplicor Monitor
es ms sensible que el A DNramificado o el NASBA para la deteccin del VIH (Bootman.
1999). y niveles de deteccin tan bajos como 20 copias de ARN-VIH/ml de plasma pu
eden conseguirse mediante el uso de protocolos de extraccin especficos para el ARN
(Fischer, 1999).

CAPTULO 56

PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Rotbart. 1994). VHS (Tremblay. 1997), virus JC (Garca de Viedma. 1999) y parvovir
us (Jordn. 1998). Los mlodos basados en la amplificacin pueden llegar a aumentar su
importancia en el diagnstico y tratamiento de la infeccin viral, como parece que
aumenta el nmero de infecciones virales inlluidas por agentes antivirales especfic
os y, particularmente, en situaciones criticas, como en la infeccin del sistema n
ervioso central (Read. 1997).

Deteccin de patgenos bacterianos

En estos ltimos aos se han evaluado un gran nmero de ensayos de amplificacin para la
deteccin del M tuberculosis complex (MTBC) en muestras respiratorias y no respir
atorias. En general, la sensibilidad de estos ensayos es excelente (del 95% al 1
00%) para muestras en las que la extensin para bacilos cido-resistentes (BAAR) es
positiva, pero es ms baja para muestras donde la extensin es negativa (con frecuen
cia del 50% al 80%) (leven, 1997; Piersimoni, 1998; Pfyfler, 1999; Tortoli, 1999
), En mtodos de PCR que utilizan varios mtodos para la preparacin de las muestras y
dianas para amplificacin, se asocian con falta de estandarizacin, como lo ilustra
Noordhoek (1994), que encontr grandes variaciones en la capacidad de los laborat
orios para detectar MTCB en muestras ciegas y para informar las muestras negativ
as correctamente. Para los laboratorios clinicos, los problemas de una estandari
zacin pobre parecen reducirse por el uso de ensayos comerciales con un control ce
ntral de la calidad de los reactivos y los procedimientos operantes. En general,
los ensayos de amplificacin de cidos nucleicos para la deteccin de MTBC son ms sens
ibles que las extensiones BAAR, pero menos sensibles que el cultivo. En la actua
lidad, los ensayos comerciales estn aprobados por la Food and Drug Administration
(FDA) slo para los test de las extensiones BAAR positivas en muestras respirator
ias. Aunque un nmero de estudios han comparado dos o ms mtodos basados en la amplif
icacin (Brown, 1999; Piersimoni. 1998; Tortoli. 1998). ninguno de los estudios ha
sta el momento ha sido lo suficientemente exhaustivo como para lograr sacar una
conclusin firme. El cultivo conserva su papel central en el diagnstico de la tuber
culosis porque los ensayos de amplificacin existentes no detectan todas las muest
ras positivas para cultivo, y es necesario aislar el organismo para un test de s
ensibilidad (y su tipificacin epidemiolgica, si estuviese indicada). Los mtodos de
amplificacin son altamente especficos en distinguir MTBC de otras micobacteas que M
TBC (MOTT) en muestras BAAR de extensiones positivas, esto nos permite iniciar u
n tratamiento adecuado y un control de la infeccin. En la actualidad, los test de
amplificacin no pueden sustituir la extensin BAAR, porque el ltimo se utiliza para
determinar el nivel de mfectividad de los pacientes (los pacientes con una exte
nsin positiva son mucho ms infecciosos que los de extensin negativa) y para juzgar
la respuesta inicial al tratamiento. No hay un contexto similar en el que interp
retar los mtodos basados en la amplificacin. Adems, los mtodos de amplificacin respon
den una pregunta mucho ms especfica (est el MTBC presente'') que la extensin (estn p
entes BAAR?). En la actualidad, el papel de los ensayos de amplificacin se comple
menta con los de microscopio y cultivo. La amplificacin de cidos nucleicos tambin s
e ha aplicado para otros patgenos bacterianos del tracto respiratorio. Legionella
pneumophila es un patgeno enrevesado para el que un diagnstico rpido puede ser de
una gran importancia. El sistema Legionella EnviroAmp (Perkin Elmer) puede tener
aplicaciones para una deteccin rpida de Legionella es muestras roncoalveolares (We
ir. 1998). De modo similar. Bordetella perlussis, Chlamydia pneumoniae y Mycopla
sma pneumomae presentan dificultades particulares para el diagnostico de laborat
ono, que tiene que ser dirigido por PCR (Farrell. 1999; Grondahl. 1999: leven, 1
997). Pueden ser prometedores para el futuro mltiples ensayos de PCR capaces de d
etectar y discriminar entre un gran nmero de patgenos respiratorios potenciales (v

irales y bacterianos) (Grondahl, 1999). El diagnstico de las enfermedades de tran

smisin sexual tambin ha sido un rea importante para el desarrollo de los ensayos de
amplificacin. N. gonorrhoeae crece rpidamente en una agar convencional apropiado,
y el cultivo tiene una alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones ptimas
(Koumans. 1998). N. gonorrhoeae es difcil de detectar, sin embargo, una adecuada
recogida y transporte y condiciones de cultivo son criticas y puede que no sea
fcil realizarlas en cualquier lugar. El cultivo de C. trachomalis
tambin es exigente, ya que requiere facilidades para el cultivo de tejidos, por t
anto, los mtodos que no son de cultivo para la deteccin del anlgeno de Chlamydia ha
n sido muy utilizados durante vanos aos. Casi lodos los mtodos de amplificacin se h
an descrito o desarrollado para la deteccin de C. trachomatis (Morre, 1998: Paste
rnack, 1999: Schepetiuk, 1997, Stary, 1998; Vincelette. 1999), En general, las e
valuaciones publicadas indican que los mtodos basados en la amplificacin son especf
icos y ms sensibles que el cultivo celular o los mtodos inmunolgicos (Schepetiuk. 1
997: Stary. 1998; Vincelette. 1999; Wyiie. 1998). En un estudio multicntrico reci
ente del automatizado test COBAS Amplicor CT/NG (Roche), la sensibilidad y espec
ificidad variaban con el tipo de muestra (Vincelette. 1999). Para muestras uretr
ales de hombres, se public una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,5
%: para muestras endocervicales la sensibilidad era del 96.5% y la especificidad
del 99,4%. y para la orina, la sensibilidad variaba del 94,4% al 95,1% y la esp
ecificidad del 99.8% al 100%. La realizacin de ensayos de amplificacin de las mues
tras de orina puede facilitar el screening para la infeccin del C. trachomatis. L
a remisin de muestras de orina parecen ser ms aceptables que los mtodos de recogida
de muestras ms invasivos. Se han publicado comparaciones de diferentes mtodos de
amplitcacin (Pasternack. 1999: Schepetiuk, 1997; Stary, 1998), pero en la actualid
ad no hay suficientes datos para determinar los mritos de cada uno de los diferen
tes sistemas. Ambos, tanto la PCR como el LCR. pueden tambin utilizarse para dete
ctar N. gonorrhoeae: hay que examinar una sola muestra para ambos patgenos, y est
disponible un ensayo PCR mltiple para la deteccin, tanto del patgeno N. gonorrhoeae
como de C. trachomatis (Vincelette. 1999). El LCR ha sido publicado como ms sens
ible que el cultivo (Kehl. 1998). y puede tener posibilidades para ser aplicado
en muestras de orina en el screening para N. gonorrhoeae en poblaciones de bajo
riesgo (Kacena, 1998). Las limitaciones de algunos estudios de ensayos de amplif
icacin para la deteccin de N. gonorrhoeae se han resumido (Koumans. 1998). y esto,
junto con la posibilidad de resultados falsos positivos con el Amplicor PCR con
Neisseria subflava, enfaliza la necesidad del refinamiento de estas nuevas tecn
ologas (Farrel, 1999). Aunque los patgenos especficos que causan infeccin de los tra
ctos respiratorio y urogenital han recibido mucha atencin, los ensayos de PCR tie
nen tambin su utilidad. Se han descrito ensayos de PCR que son tambin capaces de a
mplificar los genes ribosomales rARN de prcticamente cualquier bacteria y de un g
ran nmero de muestras clnicas U n a rpida secuencia de los productos amplificados y
la comparacin de la secuencia de datos con las secuencias en una base de dalos A
DN puede permitir la identificacin de una amplia variedad de organismos (Goldenbe
rger, 1997: Tang, 1998). Esta aproximacin tambin ha sido til en buscar publicacione
s para la deteccin e identificacin de patgenos que antes eran desconocidos o incult
ivables (Fredericks, 1996). El desarrollo de la tecnologa de trozo de gen puede a
umentar el potencial de esta aproximacin a la amplificacin de un gen diana present
e en todos los patgenos potenciales, seguido de una caracterizacin rpida del produc
to amplificado por hibridacin entre un margen amplio de pruebas especficas de las
especies (Belgrader, 1998: Marshall, 1998).
Deteccin de hongos
La infeccin fngica invasiva es un problema creciente en muchos pases (Pfaller, 1994
). Candida spp. estn entre las causas que encabezan la infeccin nosocomial del tor
rente sanguneo en EE.UU., y la aspergillosis es una causa significativa de mortal
idad en pacientes trasplantados y otros pacientes inmunocomprometidos La infeccin
fungica sislmica es diticil de diagnosticar a tiempo y puede que esto contribuya
a una mortalidad elevada. La PCR ha sido estudiada para su posible uso en el di
agnstico de candidemia (Bougnoux. 1999) y aspergillosis invasiva (Latge, 1999), y

recientemente se ha descrito un test de PCR con una amplia especificidad para u

na variedad de patgenos fngicos (Van Burik, 1998). La aplicacin clnica de la PCR par
a el diagnstico de aspergillosis pulmonar invasiva es complicada por una alta fre
cuencia de muestras de lavados broncoalveolares positivos (BAL) de sujetos sanos
, debido a la presencia transitoria de conidias en el tracto respiratorio. Es pr
eferible utilizar el suero del plasma, dado que es menos probable la contaminacin
con conidias. Se ha publicado recientemente que un test de PCR progresivo puede
ser ms sensible que la deleccin de galactosa por el

1246
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA 527-bp de la regin 16S rARN con anlisis de ordenador pueden servi
r para identificar bacilos gramnegativos aerbicos inusuales, y pueden tener tambin
ms aplicaciones (Tang. 1998). Se ha hecho nfasis en la necesidad critica de gener
ar y completar bases de datos genticas para asegurar la asignacin apropiada de las
especies basada en la secuencia del gen 1 6 S rARN, (Fredericks, 1996; Tang. 19
98). El potencial para la identificacin de organismos mediante el uso de textos u
niversales para obtener un generado seguido por un uso rpido de una extensa serie
de especies, o incluso pruebas especificas de subespecies para definir las espe
cies'subespecies. puede aumentar m u c h o mediante el desarrollo de la tecnologa
de los genes (Troesch, 1999).
anlisis de immunoabsorcin enzimlica (ELISA) para el diagnstico precoz de la Aspergil
losis invasiva (Kawamura, 1999). Como las bacterias, la combinacin de un amplio e
spectro de PCR para amplificar un producto de todos o de la mayor parte de los h
ongos asociados con infeccin humana es una estrategia potencialmente importante (
Van Burik, 1998). La amplilicacin podra seguirse de una hibridacin del producto amp
lificado para una serie de especies. En la actualidad, aunque parece que se van
a publicar artculos promeledores. la PCR para el diagnstico de infeccin lngica invas
iva no se ha utilizado mucho y no ha sido convincente que pueda compensar las li
mitaciones del cultivo en un diagnstico rpido de infeccin fngica invasiva en huspedes
inmunocomprometidos.
Deteccin de resistencia antibitica Deteccin de parsitos
En los laboratorios clnicos, el diagnstico de infecciones con muchos parsitos proto
zoos depende de las heces vistas al microscopio, de una extensin de sangre o de md
ula osea, o de tejido. La deteccin del antigeno en las heces en el caso de la Gia
rdia lamblia y Cryptosporidium parvum es una alternativa. El examen microscpico d
e las muestras implica dedicarle mucho tiempo, requiere una gran habilidad y tie
ne una sensibilidad limitada para muestras que tengan pocos microorganismos. Por
estas razones, la PCR puede mejorar la deteccin de parsitos protozoos en los labo
ratorios clnicos. En un estudio, el ensayo PCR amplificando la subunidad pequea rA
RN de Plasmodium fue ms sensible que el examen microscpico de un frotis grueso de
sangre durante veinte minutos realizado por microscopistas entrenados en diagnos
ticar la malaria falciparum y para monitorizar la respuesta al tratamiento (Cice
rn. 1999). Se han obtenido resultados alentadores tambin para la deleccin de Babesi
a spp. en sangre y parsitos de Leishmania en sangre y mdula sea (Katakura. 1998; Kr
ause, 1996). La deteccin en el lquido amnitico del ADN de Toxoplasma gondii puede f
acilitar un diagnstico rpido para la toxoplasmosis congenita (Gratzl. 1998). y se
ha usado en el lquido cefalorraqudeo (LCR) para el diagnstico de toxoplasmosis cere
bral. Tambin se ha descrito su uso para detectar Entamoeba histolytica. Cryptospo
ridium parvum y Microsporidium (Haque, 1998; Morgan, 1998). Los sistemas de ampl
ificacin comerciales para detectar protozoos an no estn disponibles, as como otros p
atgenos han superado la calidad de la PCR para la deteccin de 7! gondii (Pelloux,
1998). La resistencia a los agentes microbianos es uno de los principales proble
mas de salud en esta dcada. Los mtodos moleculares han contribuido sustancialmente
para que podamos entender la gentica de la resistencia antimicrobiana y la expan
sin de determinantes de la resistencia. Tambin tienen la posibilidad de contribuir
a detectar pronto la resistencia en el marco clnico (Tabla 56-4) (Bergeron. 1998
). Los test convencionales estandarizados de sensibilidad antibitica dependen del
crecimiento Inicialmente. se necesita un cultivo puro del patgeno y, un da ms como
mnimo para el test de susceptibilidad. Con mtodos de test de sensibilidad automat
izados, como Vitek, los resultados pueden estar disponibles en unas horas para c
iertos organismos. Los mtodos rpidos que dependen del crecimiento pueden ser menos
aplicables para la deteccin de mecanismos de resistencia, en los que es necesari

o un perodo de induccin en presencia de antibiticos antes de que s e manifieste la

resistencia. En el caso de resistencia meticilina/oxacilina en estafilococos, la
resistencia puede expresarse de varias maneras, particularmente en el estafiloc
oco coagulasa negativo (CNS), de modo que la resistencia antibilica clnicamente re
levante puede ser difcil de detectar por los test de sensibilidad estandarizados,
incluso despus de 48 horas de incubacin. Por todas estas dificultades, la deteccin
molecular del gen mecA est siendo cada vez ms aceptada como mtodo de referencia en
tre los mtodos fenotpicos que han sido comparados. La PCR y, ms recientemente, las
pruebas de ADN ramificado han sido ampliamente investigadas para la aplicacin par
a una deteccin rpida del estafilococo resistente a la meticilina (Kolbert, 1998; M
arshall, 1997: Ramotar. 1998; Vannuffel, 1995). En el caso de los patgenos de cre
cimiento lento, especialmente MTBC. pueden pasar semanas entre el envo de las mue
stras y el informe final de la sensibilidad microbiana. Este retraso no fue cons
iderado un gran problema durante aos porque haba disminuido la incidencia de tuber
culosis y la resistencia antibitica era infrecuente. Los test de sensibilidad era
n realizados principalmente para confirmar la sensibilidad y para monitorizar la
potencial aparicin de resistencias. Desde finales de los aos 80, los consejos del
tiempo de laboratorio en relacin al tratamiento de tuberculosis se han vuelto ms
esenciales por una sene de razones. stas incluyen el resurgimiento global de la t
uberculosis (incluso en pases desarrollados), el surgimiento y la expansin de la r
esistencia antibitica para MTBC y la aparicin de una poblacin no despreciable con e
l sndrome de mmunodeficienaa adquirida (sida), en la que la tuberculosis puede pr
ogresar rpidamente hasta producir la muerte si no se pone el tratamiento adecuado
. La amplificacin de PCR de las secuencias de ADN del rpoB (resistente a la rifam
picina) y los genes katG. mhA y ahpC (resistente a isoniacida), seguidas por la
deteccin de mutaciones asociadas con resistencia mediante el polimorfismo conform
acional de la hebra simple (SSCP). tiene una sensibilidad alta para la deteccin d
e resistencia a la rifampicina (>96%) y la isoniacida (87%) (Telenti. 1997). Ha
sido recientemente publicado el uso de pruebas de ADN de alia densidad en combin
acin con PCR para detectar mutaciones en el gen rpoB. Este mtodo tiene la posibili
dad de detectar la resistencia a la rifampicina en pocas horas (Troesch, 1999) y
podra, en principio, ser aplicado directamente a las muestras sin cultivo previo
. Un reconocimiento rpido de las cadenas de MTBC resistentes a los antibiticos es
importante para prevenir la expansin de la infeccin con esas cadenas en pacientes
susceptibles y personal sanitario. Los mtodos moleculares tienen tambin aplicacion
es para la deteccin de la resistencia a las medicinas en un gran espectro de orga
nismos. Se ha publicado la deteccin de resistencia a la vancomicina en enterneceo
s, neumococos resistentes a la penicilina y en el gen b/a , |5-lactamasa del Hae
;u
Identificacin de cultivos
La sensibilidad de mtodos basados en la amplificacin facilita su aplicacin para una
deteccin directa de genomas de patgenos especficos en material clnico, pero tambin s
on valiosos para la identificacin de microbios cultivados. Una reaccin de amplific
acin especfica para las especies puede identificar especies sencillas de particula
r importancia, como MTBC. De modo alternativo, una reaccin de amplificacin puede d
estinarse a una diana de un gnero especifico o una diana 'universal" y restringir
la digestin mediante endonucleasa o hibridacin con mltiples pruebas, o puede utili
zarse una determinacin secuencial del generado para identificar y discriminar ent
re una variedad de especies. Inicialmente se utilizaba la identificacin de cultiv
os por amplificacin para micobacterias de crecimiento lento, pero tambin tiene apl
icaciones para otros patgenos inusuales. Es lgico y conveniente para un laboratori
o utilizar la amplificacin para una deteccin directa para usar la misma tecnologa p
ara la identificacin de cultivos donde sea posible. La amplificacin de especies es
pecificas se ha utilizado para una identificacin rpida de M. tuberculosis. M. aviu
m y M. intracellular cultivados (Ninet, 1999: Tortoli, 1998). La aplicacin de est
a aproximacin a viales BACTEC positivos con un ndice de crecimiento bajo puede red
ucir dos o tres das el tiempo para la confirmacin de una diana de todos los miembr
os del gnero Mycobacterium, y la generacin de patrones especficos para las especies
mediante la digestin del generado con endonucleasas de restriccin es un mtodo alte

rnativo que puede discriminar entre ms de 30 especies de micobacterias (Devallois

, 1997). Recientemente se han publicado mltiples pruebas de PCR para una diferenc
iacin entre MTBC. M. avium y otras micobacterias (Cormican, 1995; Kulski, 1995).
Tambin se han utilizado mltiples PCR para una confirmacin rpida de toxigenicidad en
los hallazgos de E. coli citotxico (Patn, 1988). L a amplificacin y la determinacin
secuencial de una regin

CAPTULO 56
PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
1247
Tabla 56-4 Deteccin d e los p r o b l e m a s d e resistencia a los antibiticos po
r m t o d o s moleculares Agente Meticilina Oxacilina Vancomicma Bela-lactmicos v
anA. B. C. D' mecA" Gen Mtodo de deteccin Prueba de ADN estndar Prueba de ADN ramil
icada PCR Prueba de ADN estndar PCR Prueba estndar PCR y RFLP PCR y secuencia PCR
y secuenciamiento PCR y SSCP PCR y secuencia trozo de ADN PCR y PCR y SSCP PCR y
secuencia PCR y RFLP PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y secuenci
amiento PCR y LIPA PCR y secuenciamiento Organismos Estafilococos
Enterococos Haemophilus influenzae Enterobacteriaceae N gonorrhoeae Enterobacter
iaceae y cocos grampositivos Mycobacterium tuberculosis'
Ouinolonas Rifampicina
Mutaciones en gyrA. gyrB. parC y parE Mutaciones puntuales en rpoB
Isoniacida Etambutol Estreptomicina Aciclovir/lrmacos relacionados Foscarnet inhi
bidores transcriptasa inversa Inhibidores proteasa
Mutaciones puntuales en katG, inhA, ahpC Mutaciones puntuales en embB Mutaciones
puntuales en rpsL y rrs Mutacin/delecin en el gen TK" Mutaciones puntuales en gen
ADN-polimerasa Mutaciones puntuales en el gel RT* Mutaciones puntuales en el ge
n PROT"
M tuberculosis^ M tuberculosisM tuberculosis'* Herpes virus" Herpes virus" VIH V
IH'
"El mecA codifica la proteina PBP2a' ligada a penicilina alterada, los mtodos fen
otipicos pueden requerir 48 horas de incubacin o mas para detectar las resisten c
ias y poseen una sensibilidad menor del 100%. La deteccin de mecA tiene una poten
cial aplicacin clnica para circunstancias especificas 'La resistencia a vancomicin
a en enterococos puede ser descrita en uno de cada cualro genotipos de resistenc
ia, de los cuales vanA y vanB son los de mayor importancia. La detecin genotipica
de la resistencia es til en la validacin de los mtodos lenotipicos. La base gentica
de la resistencia a |i-lactmicos es extremadamente compleja. El bla y el bla son
los dos grupos mas comunes de plsmidos codificados que codifican la resistencia
a las celalosporinas de tercera generacin y a los monopenmicos. 'Mycobacterium tube
rculosis es un organismo de crecimiento muy lento Pueden ser necesarias cuatro o
ms semanas para lograr los resultados del test de susceptibilidad fenotpica La de
teccin de los genes de resistencia en M. tuberculosis tiene potencial aplicacin cl
inica a corlo plazo. "TK: timidina cinasa 'No hay mtodos fenolipicos suficienteme
nte prcticos para la deleccin clinica sistemtica de la resistencia a los antivirale
s. Los mtodos genolipicos representan un mtodo prctico habitual para deteccin de res
istencias antivirales 'RT transcriptasa inversa "PROT proteasa. PCR reaccin en cad
ena de la polimerasa; RFLP: polimorlismo en el Iragmento de restriccin. SSCP: pol
imorfismo en la conlormacion de la hebra simple LIPA: ensayo de la prueba lineal
! nu tN
mophilus inlluenzaeen el lquido cefalorraqudeo (Bergeron. 1998; Cockerill. 1999; J
ones. 1997: O'Neill. 1999; Tenover. 1994). Tambin est cobrando importancia la dete
ccin de resistencia en los agentes antivirales desde que la resistencia a los med
icamentos se ha reconocido como una barrera significativa para una quimioterapia
efectiva de un nmero de infecciones virales. La deteccin fenotpica de resistencia
a medicamentos en el VIH es compleja, requiere una gran dedicacin de tiempo y, po

r tanto, es poco prctica para propsitos clnicos. Las mutaciones especificas en el g

en transcriptasa inversa VIH-1 y el gen polimerasa se asocian con resistencia a
los agentes antirretrovirales y pueden detectarse por una gran variedad de mtodos
moleculares. La deteccin de mulaciones en el genoma del VIH se relaciona con la
deteccin de resistencia por test lenotpicos (Tedder, 1998). Un ensayo comercial, e
nsayo de la prueba lineal (LIPA), diseado para detectar mutaciones en seis codone
s importantes en el gen transcriptasa inversa, asociadas con resistencia a los fr
macos, se ha desarrollado en un intento de facilitar una deteccin ms rpida; sin emb
argo, su realizacin puede no ser la adecuada para todas las mutaciones significat
ivas (PuchhammaerStockl, 1999). Como en muchas otras circunstancias, donde se ne
cesita hacer el screening de un gran nmero de mutaciones posible en el producto a
mplificado, el conjunto de pruebas de alta densidad (trozos de gen) puede ser til
en el futuro (Gunthard. 1998). Los mtodos moleculares no parecen ser los sustitu
tos para una deteccin fenotpica de resistencia en la mayora de las situaciones clnic
as en un futuro previsible. Estos mtodos pueden aplicarse directamente para muest
ras clnicas, y pueden, por tanto, ser apropiados para bacterias de crecimiento le
nto, sobre lodo en situaciones clnicas urgentes, y para la deteccin de
resistencia en virus. Adems, son aplicables a organismos no viables y pueden redu
cir los riesgos biolgicos asociados con la manipulacin de patgenos viables, como M.
tuberculosis. Los mtodos moleculares tambin pueden tener ventajas particulares en
relacin con los mecanismos de resistencia que se expresan slo despus de un perodo d
e incubacin largo, desde que los mtodos fenotpicos pueden no ser lo sulicientemente
fiables a que no estn a tiempo en tales casos. Los mtodos moleculares para la det
eccin de resistencia antimicrobiana estn limitados en muchos aspectos (Bergeron, 1
998). Primero, la ausencia de un gen de resistencia conocido no excluye la posib
ilidad de resistencia por otro mecanismo. En trminos prcticos, la deteccin molecula
r se basa en la deteccin de genes individuales bien caracterizados en especies o
generos en los que se espera que se produzca. Los mtodos moleculares no detectan
los mecanismos de aparicin de nuevas resistencias, y no es probable que se apliqu
en para la deteccin de la expresin de genes resistentes en especies en las que no
se ha observado previamente. Una segunda limitacin es que la presencia de un gen
para resistencia antimicrobiana no obliga la expresin del fenotipo resistente. Po
r ejemplo. E. coli tiene un gen cromosmico para una |i-lactamasa similar a AmpC.
pero, casi nunca se expresa. En principio esta limitacin no es insalvable s se uti
lizan preferentemente los ensayos para detectar mARN mejor que para detectar el
gen cromosmico. Dadas estas limitaciones, parece probable que por el momento los
mtodos moleculares para detectar la resistencia antimicrobiana se vayan a quedar
como herramientas de laboratorios de referencia, tiles en la monitorizacin a gran
escala de los mecanismos de resistencia, y como estudios de la realizacin de los
mtodos fenotpicos.

1248
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
Tabla 56-5 Mtodos de epidemiologa molecular* Mtodo Polimorfismo de los fragmentos d
e restriccin Enzimas cortantes frecuentes Ejemplos Mycobacterium tuberculosis Ent
erococcus faecium Staphylococcus aureus Clostridium difficile Staphylococcus aur
eus Stenotrophomonas mallophilia Candida albicans Enterobacter cloacae Serratia
marcescens Klebsiella pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Candida albicans Ent
erobacter cloacae Acinetobacter baumanii Mycobacterium tuberculosis Mycobacteriu
m tuberculosis Virus de la hepatitis C Staphylococcus aureus Virus de la hepatit
is C Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis B Clostridium difficile Staph
ylococcus aureus Neisseria meningitidis Entamoeba histolytica Comentario Gran nme
ro de bandas Ahora poco empleado Escasas bandas Electroforesis de pulso de campo
Aplicacin muy amplia Escasas bandas Automatizado Escasas bandas Perfil basado en
secuencias especficas RAPD y otros Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto c
rudo Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequea cantidad de ADN Pue
de bastar extracto crudo Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Permi
te una deteccin de cambios de la secuencia menor en un rea especilica Ahora poco e
mpleado til para la amplia definicin de las relaciones dentro de una especie
Enzimas cortantes infrecuentes
Riboescritura
Prueba de hibridacin de elementos repetitivos PCR y productos de electroforesis
PCR y productos de prueba de hibridacin PCR, digestin de productos y electroforesi
s PCR y productos de secuenciamiento PCR y polimorfismo conformacional de la heb
ra simple Electroforesis de proteina en gel de poliacrilamida Electroforesis de
enzima multilocus
La labia contiene eiemplos de mtodos disponibles y aplicaciones y no pretende ser
exhaustiva. __

Epidemiologa molecular
La variedad de herramientas disponibles en la aclualidad de epidemiologa molecula
r es considerable (Tabla 56-5), y en particular ha existido una proliferacin de mt
odos basados en la amplificacin. Un anlisis exhaustivo de los mritos relativos de e
stos mtodos de aproximacin diagnstica est ms all del propsito de este captulo. Es i
ante destacar que no hay una tcnica universalmente aplicable y que la opcin de un
uso particular depende de las especies estudiadas, de aquello a lo que la peticin
hace referencia y de la conveniencia de la tcnica. Las tcnicas moleculares son til
es para responder preguntas de una clnica presente y para el control de infeccion
es, y no estn limitadas para usos de investigacin. Los ejemplos incluyen clarifica
r el significado de mltiples aislamientos de Staphylococcus epidermidis de un pac
iente particular y predecir una respuesta para el interferon en la infeccin por e
l virus de la hepatitis O La evidencia molecular de identificacin del S. epidermi
dis realizada en diferentes momentos sugiere que el hallazgo es clnicamente signi
ficativo, y los genotipos VHC 1 a y 1b parece menos probable que respondan al in
terferon que otros genotipos (MartinotPeignoux. 1998; Vandelli. 1999). Las tcnica
s moleculares tambin sirven de ayuda para detectar la emergencia y extensin de las
cepas de un organismo con resistencias poco usuales a los frmacos usados, asi co
mo la patogenicidad para determinar la eficacia de los procedimientos de control
de la infeccin, y en la definicin de la fuente de epidemias o infeccin debida a la
comida o productos teraputicos.

Mtodos de tipificacin molecular ADN-dependientes

La bibliografa relativa a la tipificacin molecular ADN-dependiente, y en particula
r a la tipificacin por amplificacin, se ha convertido en un laberinto de acrnimos y
variaciones sutiles. Para poner algn orden en esta rea, es til considerar dos aspe
ctos de cada mtodo: el mtodo tcnico (amplificacin, restriccin de enzimas, prueba o un
a mezcla de todas eHas) y el principio (una imagen del cromosoma o foco en secuencias que evolucionan rpidamente). L
os mtodos de tipificacin basados en el ADN. se basan en la divergencia progresiva
que se produce en la secuencia de clulas bacterianas idnticas sobre un gran nmero d
e generaciones de divisin celular. Cuanto ms parecida es la secuencia entre dos or
ganismos aislados en pacientes distintos, ms probable es que lo se origin fuera de
una fuente comn en el pasado. El grado de divergencia entre organismos puede adv
ertirse en la secuencia entera de los cromosomas. El grado de resolucin ms alto pa
ra el mtodo requerira la secuencia de todos los cromosomas, pero esto no es prctico
. Por tanto, la mayora de los mtodos desarrollados intentan identificar la variacin
de la secuencia en puntos distribuidos de m a n e r a aleatoria por todo el cro
mosoma. Esta imagen es la base para el polimorfismo en el fragmento de restriccin
(RFLP), electroforesis en gel por c a m p o pulsado (PFGE), y la tipificacin usa
ndo textos arbitrarios. La divergencia de la secuencia no se produce igual en to
dos los puntos del cromosoma. Algunos elementos especficos del cromosoma se alter
an ms rpidamente con respecto a otra secuencia de nucletidos, o con respecto al nmer
o de copias del elemento y la distribucin de las copias por lodo el cromosoma. Lo
s ejemplos de secuencias de rpido desarrollo, incluidas las secuencias de insercin
(IS), transposones (Tn), secuencias tndem repetidas e integrones (In). Un grupo
de mtodos de tipificacin ha empleado estas secuencias altamente variables para est
udiar la relacin entre los microbios. Algunos mtodos utilizan una combinacin de la
digestin total del cromosoma seguida de una bsqueda de secuencias repetidas. Algun
as variables a tener en consideracin para elegir un mtodo de tipificacin para una a
plicacin particular son su reproducibilidad (tanto en el propio laboratorio como
en otros laboratorios), capacidad disenminativa, rapidez y relacin beneficio-cost
e. Cada vez ms, la inspeccin visual y la evaluacin cualitativa de los patrones de u
nin logrados por muchos de estos mtodos de tipificacin estn siendo complementadas po
r el uso de anlisis cuantitativos monitorizados. y estn apareciendo estudios de lo
s mtodos de anlisis disponibles (Gener-Smidt, 1998; Olive, 1999). La

CAPTULO 56

PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1249
capacidad para Transferir rpidamente las imgenes dgitalizadas de patrones de unin a
un laboratorio central con la posibilidad de una comparacin rpida de cadenas, y la
adaptacin de consensos a la asignacin de los tipos, es lo deseable para aumentar
la capacidad de estas tcnicas para seguir la pista de la evolucin y expansin de cad
enas especficas a nivel nacional e internacional. Las dificultades que hay que su
perar en los mtodos de tipificacin moleculares son considerables (Van Belkum, 1997
). El anlisis estndar RFLP con enzimas cortantes frecuentes puede generar un gran
nmero de bandas en el gel de electroforesis. El mtodo ha sido til en la tipificacin
de una gran variedad de organismos. Por ejemplo, Bingen (1991) utilizaba RFLP pa
ra demostrar que el Enterococcus faecium resistente a la vancomicna aislado de un
hospital francs no presentaba la extensin de una cadena sencilla resistente. Por
la complejidad de los patrones de unin que hacen difcil el anlisis, este mtodo ha si
do suplantado. Una solucin para la complejidad de los patrones es identificar y a
nalizar slo un grupo que tenga una secuencia especfica en mltiples copias en el gen
oma. Esto se consigue por una trasferencia de bandas de ADN del gel de electrofo
resis a una membrana (Southern blot) y la consiguiente aplicacin de pruebas de AD
N a la membrana. La secuencia multicopia que generalmente usamos es el gen ARN r
ibosmico. Este proceso, conocido como nbotipificacin, ha sido utilizado para estud
iar las relaciones entre cadenas de muchas especies, y se han publicado estudios
comparativos del valor del ribotipificacin en relacin con los mtodos de tipificacin
tradicionales para algunas especies. Un sistema totalmente automatizado y un si
stema rpido para la realizacin de la ribotipilicacin con una interpretacin asistida
por ordenador (Ribopnnter. Quahcon. Wilmington. DE) est ahora comercialmente disp
onible. El Ribopnnter ha sido presentado para ser ms discriminatorio que la PCR p
ara Salmonella entrica (Hilton, 1998); sin embargo, comparando el Rboprinter con l
a PFGE para la tipificacin de E. coli y Pseudomonas aeruginosa. ste era menos disc
riminatorio que la PFGE (Pfaller. 1996). Se h a sugerido que el Ribopnnter puede
ser til como una herramienta de tipificacin de primera linea, pero que las cadena
s que aparecen indistinguibles en la ribotipificacin pueden ser distinguidas en d
iferentes grupos en la PFGE. De un modo similar se utilizan las pruebas que hibr
idan las secuencias multicopias diferentes de 16S rARN. Entre las aplicaciones m
ejor estudiadas est el uso de una prueba para la secuencia de insercin IS6110 para
el tipo MTBC. Este mtodo es relativamente lento y tiene un poder discriminatorio
limitado para las cadenas de MTBC con pocas copias de la secuencia IS6110 (Yuen
, 1993). Est bien estandarizado y ha sido muy informativo para definir la epidemi
ologa de la tuberculosis (Bradford. 1998; van Embden, 1993). Ms recientemente se h
an descrito un nmero de diferentes mtodos de tipificacin para MTBC para suplementar
o sustituir el IS6110. La comprobacin de las partes digeridas por RLPF con las s
ecuencias ricas en GC polimrficas multicopia (PGRS) puede ser utilizada para supl
ementar la tipificacin IS6110 para cadenas con un nmero bajo de copias IS6110 (Bra
dford, 1998). Un nmero adecuado de bandas para el anlisis de la mayora de los organ
ismos (de 10 a 20 bandas) tambin puede conseguirse por PFGE (Allardet-Servent, 19
89). PFGE utiliza la restriccin de enzimas para cortar el ADN en secuencias, lo q
ue ocurre poco frecuentemente, produciendo un nmero limitado de fragmentos de ADN
grandes. Este mtodo requiere que las fuerzas que causan las roturas aleatorias e
n el cromosoma bacteriano se eviten durante la preparacin del ADN para la digestin
. Esto se acompaa de la inmersin de la bacteria en tapones de agar antes de la dig
estin de la pared celular. Tambin se debe emplear un sistema de electroforesis cap
az de separar los grandes fragmentos de ADN. La separacin de los fragmentos grand
es es posible gracias a una alteracin peridica de la direccin del campo elctrico uti
lizado en la cmara de electroforesis. La PFGE permite la separacin de cromosomas e
nteros, por lo que para las levaduras, que son eucariticas, debe generarse un car

iotipo sin la digestin de la enzima de restriccin. La PFGE est considerada por algu
nos como el mtodo ms aplicable y el ms aceptado para la tipificacin molecular. Los p
rincipios para la interpretacin de los geles de PFGE han sido propuestos, y para
muchos organismos es el estndar de fado pata la tipificacin molecular entre otros
mtodos que han sido comparados (Tenover, 1993). Las limitaciones principales de P
FGE son que es un mtodo relativamente lento y costoso; sin embargo, se ha avanzad
o al desarrollar protocolos rpidos de PFGE (Matushek. 1996). La PFGE es aplicable
al estudio de la epidemiologa de
muchos patgenos, incluido S. ureos resistente a la meticilina (van Belkum, 1997),
E faecium resistente a la vancomicna (Fridkin, 1998), Streptococcus pneumoniae pe
nicilin resistente a la penicilina (Rudolph, 1998). Klebsiella pneumoniae produc
tora de | lactamasa de amplio espectro (Lin. 1998). E. CO//0157 (Grif. 1998). Ste
notrophomonas maltophilia (Sader. 1994) y especies Candida para las que se puede
utilizar tanto el cariotipo como el anlisis RFLP (Cotmican. 1996). La amplificac
in ADN por PCR se aplica para la tipificacin molecular en una variedad de modos. U
na ventaja de las estrategias de tipificacin utilizando PCR es que slo se necesita
n cantidades de ADN pequeas. De modo adicional, el ADN templado puede ser una pre
paracin bastante ordinaria, que generalmente no es el caso de los sistemas digest
ivos de enzimas de restriccin. De modo ms sencillo, las tipificaciones basadas en
PCR incluyen el uso de uno o varios principios genricos que terminan en la amplif
icacin de varios fragmentos de varios tamaos. El nmero y tamao de los fragmentos amp
lificados depende de la secuencia del genoma microbiano, y se revela un patrn de
unin especifico para el tipo de electroforesis en gel (NiRiain, 1994). Este mtodo
de variaciones, con una titulacin aleatoria de la amplificacin del ADN polimorfo (
RAPD) o amplificacin de la huella dactilar de ADN (DAF). tiene una gran aplicacin
para una variedad de patgenos actuales, incluidos Enterobacter cloacae y Neisseri
ae meningitidis (NiRiain, 1994; Bar. 1998; Woods, 1994). La reproducibilidad de l
os patrones de unin utilizando textos genricos puede ser problemtica. Las uniones db
iles pueden aparecer y desaparecer fcilmente; sin embargo, parece que algunos gru
pos han superado estas dificultades (Bar. 1998). Por lo general, estas tcnicas pue
de que sean ms aplicables a una caracterizacin rpida y preliminar de un nmero pequeo
de cadenas dentro de una institucin sencilla. Tambin est surgiendo una variedad de
aplicaciones de PCR para la tipificacin de bacterias que usan la diversidad de se
cuencias repetitivas, c o m o el consenso intergnico repetitivo de enterobacteria
s (ERIC-PCR) y las secuencias repetidas extragnicas palindrmicas (REPS). Estos emp
leos han sido vlidos para tipilicar Acinetobacter spp. y otras muchas especies gr
amnegativas (Vila, 1996). La PCR tambin se ha utilizado en combinacin con la diges
tin de la endonucleasa de restriccin de todo el ADN cromosmico como polimorfismo am
plificado de la longitud de los fragmentos (AFLP) tipificados. En esta tcnica, se
amplifica un subgrupo de los fragmentos generados por una digestin de ADN cromosm
ico con frecuentes enzimas cortadoras. En el caso de E. coli, la utilizacin de ce
badores con titulaciones fluorescentes necesita conocer el tamao de lodos los fra
gmentos en un secuenciador automatizado de ADN. y la disponibilidad de la secuen
cia completa del genoma E. coli K-12 ha resultado ser un mtodo m u y sofisticado
(Arnold. 1999). El conocimiento de la secuencia del genoma del Haemophilus influ
enzae cadena Rd ha sido explotado de un modo similar para desarrollar un mtodo de
tipificacin de PCR basado en el nmero variable de secuencias en tndem repetidas (V
NTR) (van Belkum, 1997). El test de tipificacin de MTBC es otro mtodo que se aseme
ja bastante a la PCR. basada en la amplificacin de las secuencias espadadoras no
repetidas situadas entre las pequeas unidades repetidoras (Sola. 1998). La PCR ta
mbin se utiliza para amplificar zonas del genoma microbiano que evolucionan rpidam
ente, de modo que la conexin puede valorarse por una evaluacin de los producios pa
ra una variacin de la secuencia. Las zonas diana incluyen las regiones de espacio
entre genes para ARN ribosmico en Aspergillus fumigatus y el gen coagulasa de S.
aureus (Hookey. 1998: Radford. 1998). La variacin de la secuencia puede verse po
r la evaluacin de los patrones de unin producidos en la digestin del producto ampli
ficado con enzimas de restriccin o secuenciacin del producto de PCR. Mtodos de tipi
ficacin similares han servido para clasificar virus. La tipificacin del VHC es de
particular inters, asi como un genotipo viral es significativo para predecir una

respuesta parecida al tratamienlo con interlern-. La realizacin del genotipo del VH

C se basa Irecuentemenle en la deteccin de la variacin de la secuencia en la regin
5 conservada sin traducir del genoma por RFLP. hibridacin para pruebas especficas
del genotipo (Line Prob Assay. Innogenetics). por secuenciacin o por polimorfismo
de la longitud de los fragmentos (Davidson, 1995; Murphy. 1994; Seme, 1997: Sree
vatsan, 1998: Stuyver, 1996). Se ha reconocido la posibilidad de una clasificacin
errnea de algunas cadenas donde la distincin se basa

1250
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA PCR (Pelloux. 1998). y lo mismo pasaba con la deteccin de entero
virus (Muir, 1999). El potencial de incrementar la concordancia entre los labora
torios gracias a la estandarizacin de los reactantes y a los protocolos se enfati
za en un informe para lograr una realizacin satisfactoria de la PCR para Chlamydi
a trachomatis (Mahony, 1994) y el mayor empleo de los sistemas comerciales con r
eactivos estandarizados, asi como de los anlisis automatizados, pudiendo. en un f
uturo, reducir estos problemas. La preparacin de las muestras es un asunto critic
o en el que se busca un equilibrio entre la simplicidad de la preparacin (para lo
grar ser prcticos y disminuir los riesgos de contaminacin) y la profundidad (para
asegurar la liberacin de los cidos nucleicos y la eliminacin de las sustancias inhi
bidores). Los controles se deben hacer para detectar la contaminacin (p. ej.; el
examen por duplicado, controles negativos mltiples) y para monitorizar la degrada
cin de la diana o la existencia de inhibidores (control positivo en los lmites de
deteccin, estndar interno para la amplificacin). El nmero adecuado de controles nega
tivos es esencial y se deben llevar a cabo durante el proceso de preparacin de la
s muestras. Tan slo una parte de una muestra negativa es adecuada para este fin.
La seleccin de controles y normas es muy problemtica cuando el agente infeccioso d
iana es m u y diverso (VIH y VHC) y cuando se requieren m u c h o s resultados.
La complejidad de estos asuntos es evidente en publicaciones de sistemas comerci
ales para la cuantilicacion de VHC en que pueden no detectar los genotipos 2 y 3
de un modo tan eficiente como el genotipo 1 (Hawkins, 1997) y en las diferencia
s en la eficiencia de la hibridacin de clones de viriones derivados de ADN en ens
ayos para la cuantificacin de ADN VHB (Heerman, 1999). Una evaluacin detallada de
parmetros que afectan el resultado de los ensayos para la cuantificacin ARN VIH es
t disponibles, y muchos de los principios identificados son por lo general aplica
bles (Lew. 1998). Para asegurarse de que ios reactivos son de una gran calidad y
estn libres de contaminacin, es conveniente comprar lampones preparados en otro l
ugar. En este caso, el fabricante es el responsable de proporcionar los datos de
la calidad analtica de los reactivos. Una valoracin de la calidad funcional relat
iva a los lotes previos puede ser adecuada. La contaminacin es un problema consid
erable para los laboratorios que utilizan PCR diagnsticas. Los estudios entre lab
oratorios han mostrado que las muestras negativas pueden dar resultados positivo
s en algunos laboratorios, y la explicacin ms probable es el sobrediagnstico de res
ultado. Claramente, las consecuencias sobre el cuidado de un paciente con un res
ultado falso positivo para VHC. VIH o MTBC son importantes. El fundamento de la
prevencin de este sobrediagnstico en la mayora de los laboratorios en este punto es
la separacin fsica de la reaccin PCR establecida y las zonas de anlisis del product
o PCR con un flujo de trabajo estrictamente unidireccional. L a automatizacin de
PCR puede tambin ayudar en la prevencin d e este fenmeno (Wilke, 1995), y la mayora
de los fabricantes de equipos comerciales de diagnstico molecular han desarrollad
o, o estn en proceso de desarrollo, sistemas automatizados o semiautomatizados pa
ra minimizar la posibilidad de un error humano. Los resultados falsos positivos
parecen ser poco frecuentes con el uso de sistemas de test comerciales automatiz
ados (Vncelette, 1999). Adems de la prevencin del sobrediagnstico, los mtodos para pr
evenir la amplificacin de productos que contaminan la PCR estn disponibles. Los do
s mtodos principales son aquellos que utilizan isopsoralen para modificar los res
ultados a un estado no amplificable, y la ADN uracilo-glucosilasa, para degradar
lo generado antes de la amplificacin (Rys, 1993). En cualquiera de los sistemas
que se utilicen, debera determinarse el impacto de la tcnica en el lmite de la dete
ccin de PCR. Tambin es importante para demostrar la electividad de la medida dar e
l coste aadido al procedimiento. La comprobacin funcional en cada uno de los lotes
nuevos de enzimas es una comprobacin adecuada en la produccin y el procedimiento
de reparto. Para la ADN pohmerasa, puede ser adecuada la comparacin con un lote p
revio de enzimas utilizando pruebas en el lmite de deteccin. Para la endonucleasa

de restriccin se recomienda la digestin de ADN lambda. La reproducibilidad en much

as tcnicas moleculares es muy dependiente de un control preciso de la temperatura
y del uso de un reactivo exacto. Lo primero y esencial para asegurar la calidad
es la adquisicin de un instrumento de alta calidad. Dos veces al ao, o con ms frec
uencia, se recomienda la monitorizacin de la temperatura y su correcta realizacin
(Kopp, 1994). Las pipetas deben calibrarse dos veces al ao.
en una sola diferencia de los nuclelidos. y puede que sea necesaria la determinac
in de la secuencia en la regin central para algunos subtipos (Seme, 1998). La secu
enciacin directa del producto PCR obtenido con el equipo Roche Amplicor ha sido p
ublicada y puede ser un acercamiento coste-beneficio para la determinacin del gen
otipo VHC (Holland, 1998). Unos mtodos similares han entrado en vigor para tipifi
car VIH y otros virus (Peltola. 1998). Los perfiles del plsmido se utilizan hoy da
mucho menos que antes para la tipificacin molecular, aunque el estudio del resto
del ADN del plasmado es importante para definir la epidemiologa de la difusin de
los mecanismos de resistencia antimicrobiana. El estudio de los perfiles del plsm
ido conjuntamente con la tipificacin basada en el ADN cromosmico ha revelado que e
n algunos casos la propagacin nosocomial de las resistencias antimicrobianas pued
e reflejar la propagacin simultnea de las resistencias ocultas en un plsmido y su f
acilidad de difusin (Liu, 1998).
Tipificaciones moleculares no ADN-dependientes
Se han utilizado varios mtodos de tipificacin no basados en cidos nucleicos para es
tudios epidemiolgicos. La electroforesis de protenas en gel de poliacrilamida (PAG
E) se ha utilizado para muchas bacterias, pero ya no se utiliza (Mulligan. 1988)
. La electroforesis enzimtica multilocus (MLEE) se basa en la movilidad electroto
rtica de un nmero de enzimas informativas. Las variaciones en la movilidad de las
enzimas es la base de la tipificacin. La MLEE es demandada tcnicamente y puede ver
se como un modo de examinar las relaciones entre organismos en una escala de tie
mpo de evolucin ms larga que la que se proporciona por una inspeccin visual de los
patrones de unin en muchos de los mtodos de tipilicacin basados en ADN. El estudio
de la motilidad electrotortica de las enzimas informativas puede sustituirse por
la determinacin de la secuencia de los fragmentos amplificados de los genes codif
icando las respectivas enzimas, una tcnica conocida como una secuencia tipificada
multilocus (Vogel, 1998). Con el uso de los anlisis asistidos por ordenador de l
os patrones de unin obtenidos por mtodos de tipificacin basados en el ADN o de una
secuencia de datos de ADN. se pueden definir los grados de relacin durante una es
cala de un periodo de evolucin grande de modo similar a MLEE (Arnold, 1999: Bart,
1998).
ESTANDARIZACIN. CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIN DE LA COMPETENCIA DE MTODOS DE DIAGNS
TICO MOLECULAR
Como para todo diagnstico, la calidad de los resultados comienza con el acierto d
e la peticin de la prueba y la calidad de la recogida de las muestras y su transp
orte. El laboratorio deber dar al mdico las directrices para saber qu muestras se p
ueden permitir, cmo recogerlas y cmo conservarlas, as como el tiempo necesario para
ser remitida al laboratorio (vanse Caps. 1 y 57). En el laboratorio, el primer e
scaln en la valoracin de la calidad es la adecuada validacin de un test particular
antes de su uso diagnstico y. cuando se emplee, se debe prestar mucha atencin para
mantener los estndares de calidad. Estas directrices se han estipulado en recien
tes publicaciones de la Association for Molecular Pathology (1999) y del Nationa
l Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1995). Pueden surgir proble
mas a diferentes niveles. El diseo de los test puede no ser capaz de distinguir t
oda la diversidad gentica de los taxones (clasificacin errnea del VHC subtipo 2c co
mo 2b [Seme, 1987]) o bien solapar las caractersticas con taxones conocidos (fals
os positivos de MTBC en pacientes con infeccin pulmonar por M. kansasiiy M. avium
[Jorgensen. 1999]). Los problemas en el diseo pueden no ser reconocidos y su rea
lizacin puede ser sobrestimada en las evaluaciones que no empleen adecuados test
de referencia (Koumans. 1998). Un reciente informe de la pobre concordancia entr
e los laboratorios es el estudio de muestras ciegas para MTBC y para VHC mediant

e PCR (Noordhoek. 1994; Zaaijerr. 1993). donde se sugieren problemas operacional

es en el diagnstico de laboratorio. En un estudio ms reciente. 4 de cada 15 labora
torios informaron de uno o ms falsos positivos en el diagnstico de toxoplasmosis m
ed'ante prueba de

CAPTULO 56

PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1251
El servicio de calidad del laboratorio no termina con la generacin del resultado.
El t i e m p oq u e tarda e n darlo es u n elemento esencial. Las guas para la i
nterpretacin del resultado son particularmente importantes en relacin a los mtodos
nuevos, ya que los mdicos pueden no estar familiarizados con las limitaciones de
estos mtodos. Las guias para la limitacin apropiada del empleo de los test son imp
ortantes por razones financieras, estando implicados los asuntos de reembolso. Sl
o recientemente la Health Care Financing Administration (HCFA) ha asignado cdigos
de pago para la deteccin e identificacin d e un nmero limitado de patgenos especfico
s [Health Care Financing Administration. 1999) Adems, no se sabe con certeza los
test que sern reembolsados. Dada una realizacin previa, es improbable que el nivel
de reembolso cubra completamente los costes de los test en todas las circunstan
cias. La participacin en programas de test de competencia es. obviamente, un aspe
cto importante y necesario para mantener la calidad de los servicios de diagnstic
o en el laboratorio de microbiologa. Los test de competencia para los mtodos molec
ulares utilizados en la deteccin e identificacin de agentes infecciosos estn solame
nte disponibles para unos pocos organismos. El College of American Pathologists
(CAP) proporciona modelos de test para la prueba basada en cidos nucleicos para l
a deteccin e identificacin de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (CAP Inspeccin HC5):
identificacin de cultivos de micobacterias; y amplificacin basada en la deteccin de
una variedad de organismos, incluidos VIH, VHC, CMV. MTBC y Borrelia burgdorfer
i (CAP Inspeccin ID). La seguridad de la calidad en el diagnstico molecular no es
esencialmente diferente de los principios aplicados en otras reas de patologa clnic
a. La atencin a los detalles, los controles adecuados y un conocimiento de los pr
oblemas potenciales, junto con una cuidadosa conservacin, son esenciales.
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CAPTULO 56

PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1253
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C A P T U L O
57
Manejo y recogida de muestras para el diagnstico de las enfermedades infecciosas
Goil L. Woods, M.D.
SANGRE FLUIDOS CORPORALES TEJIDOS OJO TRACTO RESPIRATORIO 1255 1257 1260 1260 12
60 TRACTO URINARIO TRACTO GENITAL HECES PIEL Y LESIONES SUBCUTNEAS BIBLIOGRAFA 126
2 1264 1266 1268 1269
Las claves para el diagnstico de las enfermedades infecciosas son una adecuada re
cogida y un adecuado manejo de las muestras. Las guias para la recogida y transp
orte de muestras y el procedimiento se explican en este captulo. Los principios g
enerales se revisarn primero, seguidos de la explicacin de los tipos ms comunes de
ejemplares encontrados en el laboratorio de microbiologa. Para una deteccin ptima d
e los patgenos responsables de la enfermedad infecciosa, las muestras deberan toma
rse cuando la probabilidad de recoger el agente sospechoso sea mayor. Por ejempl
o, la probabilidad de recoger la mayora de los virus es en la fase aguda de la en
fermedad. Las muestras para bacterias se deberan recoger antes de la toma de anti
biticos. El volumen de muestras recogido debe ser adecuado para el estudio microbo
lgico solicitado. Si el volumen recibido es insuficiente, el mdico o enfermera de
la sala deben informar, y se deber sacar una muestra adicional o el mdico debe pri
orizar las peticiones solicitadas. Si la muestra se recoge con una torunda, la p
unta de polister vale para todos los microorganismos. El alginato calcico debera e
vitarse para recoger muestras para el cultivo de virus, porque podria inactivar
el herpes simple, el algodn podra ser txico para Neisseria gonorrhoeae y los depres
ores de madera deberan evitarse porque la madera podra ser txica para Chlamydia tra
chomatis. Las torundas no son adecuadas para la deteccin de anaerobios, micobacte
rias u hongos, y su uso no debera permitirse cuando se sospechan estos microorgan
ismos. Las muestras deberan obtenerse del sitio de la infeccin sin que se contamin
aran con otros tejidos adyacentes ni secreciones. Todas las muestras, excepto la
s heces, deberan recogerse en un recipiente estril y ser etiquetadas con el nombre
y el nmero de identificacin de la persona a la que pertenece la muestra, la fuent
e de la muestra y la hora a la que fue recogida. Despus de recogidas, las muestra
s deben ponerse en una bolsa de residuos biolgicos y ser transportadas al laborat
orio tan pronto como sea posible. Si el retraso es inevitable, la orina, el espu
to y otras muestras respiratorias, heces y muestras para la deteccin de Chlamydia
trachomatis o virus deben ser puestas en el frigorfico para prevenir un crecimie
nto de la flora normal. El lquido cefalorraqudeo (LCR) y otros fluidos corporales,
la sangre y muestras recogidas para determinar Neisseria gonorrohoeae deben dej
arse a temperatura ambiente, porque el fro afecta adversamente a la determinacin d
e patgenos potenciales en estas fuentes.
Cada director de laboratorio debe establecer unos criterios para rechazar muestr
as Inadecuadas para cultivo. La mayora de los microbilogos coinciden en que las si
guientes muestras deberan ser rechazadas. Cualquier muestra recibida en formol. E
sputos recogidos hace 24 horas. Muestras de contenedores en los que se ha derram
ado la muestra. Muestras que han sido inyectadas en placas de agar que se han se
cado o estn caducadas. Muestras contaminadas con bario, tintes qumicos o agentes g
rasos. Muestras de sondas Foley. Muestras duplicadas (excepto hemocultivos) reci
bidas en un perodo de 24 horas. Las siguientes muestras deberan ser rechazadas par
a el cultivo de anaerobios: lavados gstricos, la orina de la mitad de la miccin, h
eces (excepto para determinar Clostridium difficile) para estudios epidemiolgicos
o para el diagnstico de la bacteria asociada a la intoxicacin alimentaria (se exp
licar posteriormente), muestras orofarngeas. excepto las muestras obtenidas de tej
idos profundos durante un procedimiento quirrgico, esputos, muestras de colostoma
o ileostoma obtenidas con torunda y muestras superficiales de piel. Adems, deberan
establecerse unas normas para el manejo de muestras que no estn etiquetadas o mal
etiquetadas; dichas muestras no deberan ser analizadas hasta que se hubieran res
uelto las diferencias. Con el manejo de todas las mueslras deben seguirse unas p

recauciones universales. Esto significa que hay que usar barreras adecuadas para
prevenir la exposicin de piel y mucosas a las muestras. En todo momento deben ll
evarse guantes, mascarillas y gafas (o trabajar detrs de una proteccin de plstico),
y deben llevarse trajes o delantales impermeables en situaciones que haya riesg
o de que se derrame el contenido. Lo deseable sera que todos los recipientes para
muestras, como minimo esos que contienen secreciones respiratorias y los que se
someten especialmente para la deteccin de una micobacteria u hongo, se abrieran
en una cabina de seguridad. Las muestras recogidas para aislar un virus deberan s
er manejadas en una cabina de seguridad biolgica para evitar la contaminacin de lo
s cultivos celulares. Cuando las muestras o cultivos tienen que ser transportado
s a travs del servicio postal de EE.UU. a un laboratorio de referencia, deben ser
empaquetados de acuerdo al cdigo interestatal de transporte de agentes biolgicos.

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1255
Las muestras deben estar limitadas a no ms de 40 mi. Los cultivos de bacterias y
hongos deberan crecer en unos tubos en un medio slido. El cierre del recipiente pr
imario (tubo o vial) debera ser sellado con una cinta resistente al agua e introd
ucido en un segundo contenedor (preferiblemente metal) rodeado por una cantidad
de material suficiente para absorber el volumen total de la muestra por si el pr
imer contenedor se rompiera o saliera. El segundo contenedor debe ser cerrado y
puesto en un recipiente para transportar (hecho de cartn, fibra mecanizada o poli
estireno), y etiquetado con una etiqueta oficial de agentes etiolgicos (disponibl
e en los centros para la prevencin y control de enfermedades). Si una muestra deb
e ser transportada en hielo seco (que est considerado como material de riesgo), d
ebe decir "Hielo seco, muestra clnica congelada". El hielo seco debera ponerse lue
ra del segundo recipiente con el material empaquetado, de manera que el material
no se pierda dentro del recipiente extemo si el hielo seco se evapora.
celulitis), instrumentacin de una superficie mucosa infectada (como ocurre en pro
cesos dentales, cistoscopas, sondaje vesical, aborto provocado o sigmoidoscopia)
o un procedimiento quirrgico de una zona contaminada (como reseccin transuretral d
e la prstata (RTU), histerectoma, reseccin de colon y desbridamiento de quemaduras
infectadas). La bacteriemia transitoria tambin aparece al principio de muchas inf
ecciones sistmicas y locales, c o m o meningitis, neumona, artritis pigena y osteom
ielitis. L a mayor parte d e las bacteriemas intermitentes se asocian con absceso
s que n o se han drenado, mientras que una bactenemia continua es evidencia de u
na infeccin intravascular, como endocarditis bacteriana, aneurisma fngico. o un ca
tter intravascular infectado. Una bacteriemia continua tambin se produce durante l
as primeras semanas de una fiebre tifoidea y brucelosis. Dos hemocultivos separa
dos son casi siempre los adecuados para descubrir los patgenos responsables de la
s infecciones intravasculares (Werner, 1967). En un estudio de personas con infe
ccin intravascular, los porcentajes de positividad del primero, de los dos primer
os y tres primeros hemocultivos por episodio sptico eran del 80%. 90%. 99%. respe
ctivamente (Washington, 1975). Los datos de otro estudio mostraron que el 91% de
los episodios spticos eran detectados en el primero hemocullivo, porcentaje que
aumentaba hasta el 99% con el segundo hemocultivo (Weinstein. 1983). Por tanto,
tres hemocultivos en un perodo de 24 horas deberan ser suficientes para detectar c
asi todas las bacterias potencialmente patgenas. El intervalo adecuado entre hemo
cultivos es desconocido, pero se ha sugerido que es de 30 a 60 minutos. Sin emba
rgo, si es urgente el comienzo del tratamiento con antibitico, los hemocultivos d
eberan recogerse de sitios diferentes con un intervalo de pocos minutos antes de
empezar el tratamiento. Los organismos como el estafilococo coagulasa negativo.
Streptococcus viridans. Corinebactenum. Bacillus spp. y Propiontbacterium son co
ntaminantes frecuentes de los hemocultivos, pero tambin podran ser verdaderos patge
nos. Recoger dos grupos de hemocultivos por episodio febril ayuda a distinguir p
robables patgenos de contaminantes. Los ltimos, generalmente, estn presentes en un
solo frasco del cultivo, mientras que los patgenos se recogen en ms de un frasco.
Como puede haber ms de un episodio febril en un perodo de 24 horas y deben sacarse
dos muestras de hemocultivo por episodio, debera estar permitido un mximo de 4 mu
estras. La mayora de las muestras sanguneas son extradas por venopuncin perifrica. La
recogida de muestra arterial no parece que muestre mejor los microorganismos, y
el hemocultivo recogido a travs de un catter intravascular se asocia con un aumen
to de supuestos contaminantes. Como con este ltimo mtodo con frecuencia se necesit
an ms cultivos y tratamiento antibitico innecesario, no se recomienda hacer la rec
ogida de sangre para cultivos de un catter intravascular, excepto para catteres um
bilicales arteriales en nios (Reller. 1982: Cowett. 1976). Sin embargo, varios cu

ltivos recogidos de un catter intravascular podran ser tiles para determinar si el

catter es el foco de infeccin (Wmg. 1979). Los factores del husped tales como antic
uerpos, complemento, clulas blancas fagocticas y agentes antimicrobianos podran imp
edir el crecimiento de los microorganismos en la sangre; por tanto, se han usado
varios modos de contrarrestar estos factores. Diluir la sangre en un medio en u
na proporcin 1:10 produce una adecuada neutralizacin de la actividad bactericida e
n el suero (Washington, 1986). Incorpora de 0,025% a 0,05% de sodio pohanetolsul
fonato en el medio del cultivo inhibe la coagulacin, la fagocitosis y la activacin
del complemento e inactiva los aminoglucsidos. Entre los mtodos que contrarrestan
la presencia de agentes antimicrobianos se incluye aadir penicilinasas al caldo
para inactivar las penicilinas: usar resinas que se adsorban a los antibiticos o
usar el sistema de centrifugacin para la lisis, por el cual se produce la N s i s
de las clulas blancas y rojas, los microorganismos se concentran por medio de la
centrifugacin y la concentracin se cultiva en un medio libre de antibiticos. Exist
en varios sistemas para analizar la sangre, cada uno con sus ventajas y desventa
jas (Wilson, 1996; Reimer, 1997). En los sistemas convencionales para analizar l
os cultivos, que usan un medio liquido enriquecido con nutrientes, se pueden cul
tivar la mayora de las bacterias. Para recuperar aerobios y anaerobios facultativ
os se utiliza soja triplica, peptona suplementada. infusin de cerebro-corazn. Colu
mbia o caldo de brcela y lioglucato (THIOl o caldo de infusin de corazn anaerobio s
e usa para aislar anaeroSANGRE
La deteccin de patgenos en la sangre es una de las (unciones ms importantes del lab
oratorio de microbiologa. El hemocultivo es imprescindible para identificar la ba
cteria responsable de la bacteriemia, la sepsis, las infecciones de vlvulas nativ
as y protsicas, la tromboflebitis infecciosa, los aneurismas fngicos y las infecci
ones de injertos vasculares. Los hemocultivos tambin son tiles en el diagnstico de
algunas infecciones vricas e infecciones invasivas o diseminadas causadas por cie
rtos hongos, especialmente especies de Candida. Cryptococcus neolormans. especie
s de Fusarium e Histoplasma capsutalum. Los parsitos son detectados en la sangre
por un examen microscpico de frotis de sangre perifrica. En general, la sangre deb
eria ser recogida para cultivo antes de empezar el tratamiento con antibiticos o
cuando est presente uno o una combinacin de los siguientes sntomas: fiebre (38"C o
ms), hipotermia (36"C o menos), leucocitosis (especialmente con desviacin a la izq
uierda), granulocitopenia o hipotensin. El tiempo de deteccin y la identificacin ex
acta de los organismos en la sangre depende de una adecuada recogida, del transp
orte y del proceso de la muestra. La tcnica para detectar todos los microorganism
os en la sangre es la flebotoma. Para minimizar la contaminacin de la muestra sang
unea con la flora de la piel, el lugar de la venopuncin deberia prepararse con un
agente bactericida (el 70% de isopropanol o alcohol etlico) y despus con 1 % 2 % d
e solucin yodada o clorhexidina. Para una asepsia mayor, el lugar debera estar sec
o 1 2 minutos antes de la venopuncin Otros aspectos de la recogida de muestras va
ran para bacterias, virus y parsitos. Deteccin de bacterias y hongos. El momento pti
mo para sacar los hemocultivos cuando se sospecha una bacteriemia o funguemia es
antes del resfriado, pero como eso no se puede predecir, la mayora de los hemocu
ltivos se recogen despus de comenzar con fiebre o catarro. La sangre se extrae co
n una aguja y una jeringa y, sin cambiar la aguja, se inyecta directamente en lo
s frascos de hemocultivo o en otro sistema de hemocultivo (Krumholz. 1990). Los
frascos o tubos inyectados deben invertirse inmediatamente varias veces para ase
gurar la mezcla, y sta deber transportarse al laboratorio a temperatura ambiente l
o antes posible despus de haber sido recogida. Los hemocultivos nunca deben poner
se en el frigorfico. En adultos con bacteriemia, el nmero de unidades formadoras d
e colonias (CFU) por mi de sangre generalmente es bajo. En un estudio, por ejemp
lo, el 25% de los pacientes con Staphilococcus aureus y ms del 50% con Escherichi
a coli o Pseudomonas aeruginosa tienen menos de una colonia por mililitro de san
gre (Henry. 1986). Dado este bajo nivel de bacteriemias en adultos, es recomenda
ble recoger de 20 mi a 30 mi de sangre para el hemocultivo (Washington, 1986; ll
strup, 1983). En recin nacidos y nios, la concentracin de microorganismos en la san
gre es mayor, por lo que con recoger de 1 mi a 5 mi es suficiente (Dietzman, 197

4). Las recomendaciones relacionadas con el nmero de muestras que hay que tomar e
stn basadas en la naturaleza de la bacteriemia. dependiendo de si es transitona,
intermitente o continua. La bacteriemia transitoria sigue a un proceso de manipu
lacin de un foco de infeccin (un absceso, un fornculo o

1256
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA cada vial que es impermeable para los iones, los componentes de
l medio y la sangre, pero permeable para el C0 . Si hay organismos presentes, li
beran CO, en el medio, se difunde por la matriz del sensor y genera iones hidrgen
o. El consiguiente descenso del pH aumenta la fluorescencia del sensor cambiando
la seal transmitida a los componentes pticos y electrnicos del aparato. El ordenad
or genera curvas de crecimiento y los datos se analizan de acuerdo con unos algo
ritmos crecientes. Las botellas que han sido inoculadas se ponen en celdas indiv
iduales del aparato, donde los frascos de aerobios y anaerobios estn continuament
e en movimiento. Los medios aerobios y anaerobios de poco volumen (de 5 mi a 7 m
i de sangre) y de gran volumen (8 mi o 10 mi de sangre), el medio Peds-Plus (de
0,5 mi a 5 mi de sangre) y el medio Myco F Lytic son vlidos para hallar hongos y
micobacterias (Waite. 1998).
2 :
bios. Por lo general se inoculan dos frascos, y uno de ellos se abre para asegur
ar el crecimiento de los aerobios. Dada la disminucin de las bacteriemias produci
das por anaerobios, se est cuestionando la tcnica de usar un Irasco para aerobios
y otro para anaerobios (Murray, 1992: Sharp, 1991), La inoculacin sistemtica en do
s frascos para aerobios y hacer cultivos selectivos de anaerobios podra permitir
la deteccin de ms bacteriemias y funguemias. Los frascos de cultivo se revisan dia
riamente durante 7 das para ver si hay crecimiento, indicado bien por turbidez, h
emolisis, produccin de gas, un nmero discreto de colonias o por la combinacin de sto
s. Cuando el crecimiento es aparente, una extensin del cultivo se tie con una tinc
in de Gram y se examina al microscopio, y el caldo es subcultivado en un medio ag
ar apropiado. Un subcultivo habitual de las muestras macroscpicamente negativas d
ebera ser realizado del frasco abierto, y de 6 a 18 horas despus de haber inyectad
o. Hacer un subcultivo del Irasco de anaerobios es innecesario. Las ventajas de
los cultivos convencionales son un coste ms bajo de material y un porcentaje meno
r de contaminacin. El principal inconveniente es el tiempo que se utiliza en los
subcultivos peridicos. Un mtodo menos laborioso consiste en una botella con medio
de cultivo al que se le aade una cmara que contiene un medio agar. Para subcultiva
r este sistema bilsico hay que dar la vuelta al frasco varias veces, permitiendo
que la sangre y el medio agar se mezclen. Las colonias en el medio agar se usan
para identificar y hacer test de sensibilidad. Para cultivar aerobios, bacterias
resistentes y levaduras, este sistema es comparable a otros sistemas, siendo ig
ual o mejor que ellos (Murray, 1991). Sin embargo, la rentabilidad para anaerobi
os podra ser mayor que en los medios de cultivo convencionales. El sistema de lis
is por centrilugacin consiste en un tubo que contiene reactantes que inhiben la c
oagulacin y la cascada del complemento, produce la lisis de las clulas sanguneas y
tampona los microorganismos durante la centrifugacin. Se aade la sangre al tubo, q
ue se invierte varias veces para evitar la coagulacin, y se transporta al laborat
orio lo antes posible. Lo ideal es que la muestra se procese inmediatamente, per
o puede ser retrasada 8 horas sin efectos adversos para la recuperacin de los mic
roorganismos. Para realizar el cultivo, el tubo es centrifugado durante 30 minut
os a 3.000 x g, el sobrenadante se desecha y el sedimento se mezcla en una mezcl
adora colocndose en medio agar. Tambin se puede hacer lo mismo con los tubos ms peq
ueos de menor volumen de muestras de recin nacidos y nios. Las ventajas de la lisis
por centrifugacin incluyen una recuperacin mayor de Staphylococcus aureus, alguna
s enterobactenas y hongos (es el mejor sistema para recolectar mohos, como el Hi
stoplasma capsulatum), la disponibilidad directa de colonias para la identificac
in y el test de sensibilidad y la capacidad de llevar a cabo varios cultivos. Ade
ms, este sistema es flexible porque se pueden inyectar medios de cultivo especial
es para recuperar organismos con unos requerimientos especficos de crecimiento, t
ales como especies para Legionelta y micobacterias. Sin embargo, el sistema es m

uy laborioso y es menos probable encontrar Streptococcus pneumonieae. Haemophilu

s influenzae o anaerobios y el riesgo de contaminacin aumenta. Estn disponibles en
el mercado varios sistemas automticos para tener la sangre continuamente monitor
izada (Wilson, 1996). La ventaja de estos sistemas es que eliminan la necesidad
de hacer un subcultivo y acortan el perodo de incubacin habitual de 7 a 5 das (Wood
s. 1994; Reisner, 1999). Uno de estos sistemas est basado en el cambio de color a
nte la deteccin de CO, (Thorpe, 1990), gracias a una membrana que es impermeable
para la mayora de los iones y componentes del medio y de la sangre, pero permeabl
e al CO . Los frascos de aerobios y anaerobios con el inoculo se colocan en celd
as en el aparato, proporcionndoles un movimiento continuo. Si hay bacterias, stas
generan C0 que se libera en el medio; el pH entonces disminuye haciendo que el s
ensor cambie de verde a amarillo. Los cambios de color se monitorizan una vez ca
da 10 minutos por un detector del cambio de color. Los medios disponibles para u
tilizar con este sistema incluyen los medios habituales de aerobios y anaerobios
que necesitan de 5 mi a 10 mi de sangre, el Pedi-BacT, que necesita 4 mi de san
gre o menos, y FAN (neutralizacin cuidadosa de antibiticos), que intensifica el cr
ecimiento de hongos y bacterias en pacientes con tratamiento antibitico.
? 2
Un tercer sistema detecta el crecimiento de los organismos en el caldo midiendo
el consumo y/o produccin de gas (Zwadyx. 1994). Cada vial inoculado se ajusta con
un conector desechable que contiene una aguja hueca. La aguja penetra en el tapn
de la botella y conecta el cuello de la botella con el sensor. Los monitores de
l sensor cambian dentro del cuello de la botella por el consumo y/o produccin de
gases (CO H y H,) producidos por el crecimiento de organismos y crea unos datos
dentro del ordenador. Hay dos medios bsicos disponibles (medio aerbico y anaerbico)
que contienen 80 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 10 mi de sangre, y frascos ae
rbicos y anaerbicos EZ Draw que contienen 40 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 5 mi
de sangre.
r }
El hallazgo de algunas bacterias requiere un medio especial o una incubacin larga
. Por ejemplo, cuando se sospecha brucelosis, la sangre debera sacarse al princip
io de la enfermedad y los hemocultivos deberan incubarse durante 3 4 semanas, aun
que con los sistemas automticos la Brucella con frecuencia crece en menos de una
semana (Bannatyne. 1997). Las infecciones producidas por Borrelia, excepto Borre
lia burgdorferi (causante de la enfermedad de Lyme, ms frecuentemente diagnostica
da serolgicamente), se diagnostican por la deteccin de espiroquetas en sangre peri
frica durante un periodo febril. Los organismos se visualizan al microscopio de c
ampo claro u oscuro en preparaciones en fresco mezclando una gota de sangre con
una gota de citrato sdico, o bien en frotis grueso o fino teidos con Giemsa o tint
e de Wright examinados por un microscopio de luz. Para aislar la Leptospira mter
rogans en sangre, se debe aadir unas gotas de sangre fresca o anticoagulada, reco
gida durante la primera semana de la enfermedad, a cada uno de los 3 4 tubos de
medio de cultivo semislido de leptospiras (el medio de Fletcher o el de Ellinghau
sen-McColloughJohnson-Harris). Podemos utilizar diferentes mtodos para aislar las
micobacterias en las muestras de sangre. Un modo es mediante la lisis por centr
ifugacin, colocando el sedimento en un medio slido y/o lquido y, posteriormente, lo
s cultivos se incuban durante ocho o ms semanas. Otra posibilidad, y quizs un mtodo
ms rpido, es la inoculacin directa del medio Myco-F Lytic (momtorizado para el cre
cimiento por el apralo BACTEC 9000) o el medio 1 3A (monitorizado por el BACTEC 4
60TB). Deteccin de virus. Las muestras de sangre son tiles en el diagnstico tan slo
en un nmero limitado de infecciones por virus (Tabla 57-1). La viremia generalmen
te se produce durante el periodo de incubacin o los dos primeros das despus de que
los sntomas comiencen, por lo que la muestra de sangre debe tomarse al comienzo d
e la enfermedad. Una excepcin es la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), que se detecta con facilidad en sangre perifrica, clulas mononuclear
es y plasma de la mayora de las personas seropositivas y, adems, en casi cualquier
fase de la enfermedad. Una muestra de sangre recogida de una vena perifrica o de
un catter intravascular es adecuada para detectar el virus. Los requisitos de la

muestra dependen de cada virus (Tabla 57-1). Todas las muestras de sangre debera
n ser llevadas al laboratorio lo antes posible. Si es inevitable un retraso en e
l anlisis, las muestras deberan estar toda la noche a 4C, excepto las muestras de p
lasma para la deteccin del ARN del VIH, que debe ser analizado dentro de las 6 pr
imeras horas de la recogida de la muestra. Aqu vamos a hacer hincapi en la tcnica d
e deteccin del CMV y de los enterovirus empleados en la mayora de los laboratorios
. Para la deteccin de otros virus, los de la Tabla 57-1, por lo general las muest
ras se mandan a un laboratorio de referencia.
Un segundo sistema de monitorzacin continua se basa en una tecnologa de lluorescenc
ia (Nolte, 1993). Hay un sensor de CO en la base de
?

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1257
Tabla 57-1 R e q u e r i m i e n t o s d e las m u e s t r a s para u n a ptima d
eteccin d e los virus hallados e n sangre Requerimientos de las muestras de sangr
e Virus Citomeqalovirus Enlorovirus Virus de la inmunodehciencia humana' Virus d
el herpes humano-6 Parvovirus B 1 9 Virus transmitidos por artrpodos' Modo de rec
oleccin Con anticoagulante' Con o sin anticoagulante' EDTA Heparinizado Sin antic
oagulante Con o sin anlicoagulante Parte empleada para la deteccin Leucocitos Sue
ro o leucocitos Clulas mononuclearcs o plasma Clulas mononucleadas Suero Leucocito
s o cogulo homogeneizado Vo lumen (mi)
5 - 1 0 5 - 1 0 2 - 5 5 - 1 0 5 - 1 0 5 - 1 0
"Se puede utilizar hepanna o E D T A para ciloinegalovirus: para los enterovirus
se puede usar heparina. citrato o E D T A 'Para monilorizar la carga viral de V
IH en pacientes en tratamiento con terapia anlirretroviral Incluye a los v i r u
s del este, oesle y la encefalitis equina venezolana, encefalitis de San Luis y
California, fiebre amarilla, dengue y liebre de la garrapa la de Colorado EDTA:
acido etileriediarninoletraactico, VIH: virus de la mmunodeficiencia humana.
Para la deteccin de CMV y enterovirus en sangre, se debe separar el componente sa
nguneo que tenga ms probabilidad de contener el virus y su inoculacin en un cultivo
de clulas en monocapa que aguanten la replicacin viral o preparar una extensin par
a teir con anticuerpos monoclonales. El CMV se detecta con ms frecuencia en los ne
utrfilos, pero podra estar presente en las clulas mononucleares de la sangre perifri
ca; de este modo, para una deteccin adecuada, los neutrfilos y clulas mononucleares
debehan ser cultivados o teidos (Howell, 1979). Los enterovirus se pueden obtene
r con igual probabilidad tanto de los leucocitos o clulas mononucleares como a pa
rtir del suero (Prather, 1984). Para separar los leucocitos hay que recoger sang
re con anticoagulante, siendo el citrato o la hepanna sdica los anticoagulantes p
ermitidos (Woods. 1987; Storch, 1994). Para separar el suero, la sangre se recog
e en un tubo sin anticoagulante y se coagula a 4 C. Cuando se forma un cogulo, la
sangre se centrifuga a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 C y el suero se separa
de un modo asptico. El tipo de cultivo celular para aislar el virus se debe selec
cionar en funcin del virus que esperemos encontrar. Para aislar el CMV se recomie
nda emplear dos tubos de MRC-5 u otras clulas fibroblsticas humanas para cultivo.
La incubacin celular en un medio que contenga 10 M dexametasona. durante un mnimo
de 24 horas antes de la inoculacin, aumenta el porcentaje de deteccin de CMV y dis
minuye el tiempo para la aparicin del efecto citoptico (Thiele. 1988). Para aislar
enterovirus. debera inyectarse MRC-5 y clulas primarias de rion de mono, y el porc
entaje de aislamiento podria aumentar tambin mediante el empleo de clulas de rion d
e bfalo y clulas humanas de rabdomiosarcoma (Dagan. 1986). Las muestras de suero i
ncubadas deben ser posteriormente examinadas para el efecto citoptico especifico
del virus. Para las muestras de leucocitos, la capa celular de cultivo debe ser
inoculada con 0,5 mi de muestra, aadiendo 1 mi de medio de mantenimiento y dejand
o en incubacin toda la noche. Posteriormente, la suspensin celular se coge y se la
va con salmo estril amortiguado con fosfato, aadindose 1,5 mi de medio de mantenimi
ento, y se vuelve a colocar a cultivar.
5
parsitos son las mismas y se van a exponer aqu, desde la ms simple a la ms compleja.
La tcnica ms sencilla para detectar parsitos en la sangre es el examen directo. Pa
ra prepararlo se coloca una gota de sangre en un porta de cristal, se tapa con u
n cubre portas y se analiza inmediatamente. L a observacin directa es excelente p
ara el diagnstico de tripanosomiasis, ya que los tripomasligotes y las microfilar

ias pueden, con frecuencia, verse en movimiento con un bajo o mediano aumento. E
l diagnstico definitivo se hace por la tincin de las muestras. La extensin usada en
hematologa, teida de un modo similar, es una preparacin habitual para determinar l
as especies de Plasmodium. Babesia. Trypanosoma y microfilarias. Las extensiones
para la bsqueda de parsitos se deben fijar y despus teirse manualmente con Giemsa.
aunque la tincin hematolgica automtica es tambin vlida. Las muestras se deben observa
r inicialmente a bajo aumento para detectar microfilarias, que son objetos grand
es (entre 100 pm y 200 pm) y que por lo general se ven con facilidad en los bord
es de la extensin. Despus de localizadas, las microfilarias deberan estudiarse bajo
una lente de aceite de inmersin para su correcta identificacin (vase Cap. 55). Des
pus de observarla con bajo aumento, la extensin se examina con un objetivo de gran
aumento para buscar tripanosomas, y finalmente con el uso de aceite de inmersin
para buscar e identificar Plasmodium, Babesia y Trypanosoma. Las extensiones ms g
randes son tiles para detectar todos los parsitos antes mencionados y son parte de
los requisitos minimos para su diagnstico. Se coloca una gota de sangre en un po
rta y con la esquina de otro porta se separa cuidadosamente para que ocupe 1 cm. La preparacin se deja secar y sin fijarla se tie con Giemsa, permitiendo su desh
emoglobinizacin.
FLUIDOS CORPORALES
Lquido cefalorraqudeo (LCR). El LCR se recoge para el diagnstico de meningitis y. m
enos frecuentemente, de encefalitis vricas. Una meningitis infecciosa es una emer
gencia mdica que requiere tratamiento urgente para evitar la muerte o secuelas ne
urolgicas serias; se divide en aguda, subaguda y crnica en funcin de la duracin de l
os sntomas (Tabla 57-2). Una presentacin aguda se produce en el 10% de los casos y
la causa ms frecuente es infeccin bacteriana. Casi todas las personas con meningi
tis viral y el 75% de los que tienen meningitis bacteriana tienen un cuadro suba
gudo. mientras que el resto presentan meningitis crnica (los patgenos responsables
estn recogidos en la Tabla 57-2). Los enterovirus son los causantes ms comunes de
la meningitis y deberan ser los primeros en ser considerados en el diagnstico dif
erencial de meningitis en un nio o adolescente al linal d e
Adems de un cultivo convencional de las clulas debera realizarse un cultivo del cen
trifugado cuando se solicite CMV (Woods. 1987). Un mtodo ms sensible para detectar
CMV en sangre es el test de la antigenemia, que se realiza tiendo la preparacin d
el citocenlrifugado de leucocitos con anticuerpos monoclonales contra protenas vi
rales (pp 65) (Van Der Bij, 1988; Brumback, 1997), Deteccin de parsitos. Las muest
ras de sangre son tiles para el diagnstico de malaria, babesiosis. tripanosomiasis
y algunas diarias. Las muestras deberan ser recogidas en tubos con anticoagulant
e y transportadas rpidamente al laboratorio. Si las extensiones deben ser enviada
s a un laboratorio de referencia, deben fijarse con alcohol inmediatamente tras
su preparacin. Las tcnicas utilizadas en el laboratorio para detectar esos

1258
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA Tabla 57-4 Parmetros d e l liquido cefalorraqudeo normal y c a m

b i o s en la meningitis infecciosa
- ~ ~ ^ ~ ~
Tabla 57-2 Pruebas c o m e r c i a l e s de A D N para la identificacin de cultiv
os* Sndrome Agudo ; Subagudo Crnico Duracin <24 horas t a 7 dias Al menos 4 semanas
Probables patgenos Bacterias pigenas Enterovirus, bacterias pigenas Mycobacterium
tuberculosis Treponema pallidum Brucella sp Leptospira interrogans Borrelia burg
dorferi Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Cand
ida spp.
cwwu Normal Meningitis Aguda/subaguda bacteriana Crnica bacteriana tuberculosas,
hongos Enterovirus
GB (clsAil)5 (linlocitos)
Protenas (mg/dl) 14-45
Glucosa (mg/dl) 45-100 (2/3 serum) baio ba|o
500-200 000 (PMN) 200-2 000 (linfocitos)
elevado elevado
200-2 000 elevado (al principio PMN; despus linfocilos) GB clulas blancas; PMN: le
ucocitos polimorfo nucleares. "Se citan las clulas habitualmente predominantes
normal

verano y principio de otoo. La bacteria productora de pus responsable de la menin

gitis vara segn la edad del paciente (Tabla 57-3). El LCR por lo general se obtien
e mediante puncin lumbar, pero algunas veces se aspira de ventrculos directamente
o se recoge de un cortocircuito. Al igual que para cultivo de sangre, tambin la a
sepsia de la piel es fundamental para extraccin y recogida del LCR, que se enva no
rmalmente al laboratorio en tres tubos. Las sugerencias para realizar los test e
n cada tubo son: tubo 1. recuento celular; tubo 2, preparacin de extensiones para
teir con la tincin Gram u otros tintes para cultivo; tubo 3. protenas y glucosa y.
si est indicado, test especiales, como el del antigeno criptoccico, test serolgico
para la sfilis, otros estudios serolgicos y citologa. Los parmetros normales de LCR
y los cambios que se producen durante la meningitis en funcin del organismo caus
al se recogen en la Tabla 57-4, El LCR debe llevarse rpidamente al laboratorio y
tiene que analizarse lo antes posible. Si el retraso es pequeo, la muestra debe d
ejarse a temperatura ambiente, salvo que se pida un cultivo viral, en cuyo caso
habra que meter en el frigorfico una muestra (preferiblemente 1 mi, pero nunca men
os de 0,5 mi) durante un breve espacio de tiempo. El proceso de analizar la mues
tra es diferente para bacterias, hongos, virus y parsitos y se expone de modo sep
arado para cada grupo de microorganismos. Procesar LCR para un cultivo habitual
bacteriolgico incluye su concentracin (si se recibe 1 mi o ms de muestra), preparac
in de una extensin pequea para teir con tincin Gram y cultivo. La concentracin se con
igue mediante la centrifugacin del lquido durante 1 5 minutos al menos a 1.500 x g
. El sobrenadante se deja en un tubo estril, dejando como 0,5 mi de sedimento y l
iquido, que son completamente mezclados en una mezcladora o con la ayuda de una
pipeta estril. Como alternativa, si se reciben 2 o ms mililitros, el fluido podra s
er concentrado filtrndolo a travs

de un filtro estril desechable de 0,45 pm y usar el filtro para su cultivo (se ex

plica ms adelante). Sin embargo, antes de filtrar la muestra, se ponen 0.5 mi en
un tubo estril y se centrifuga para preparar las extensiones para teir con la tinc
in Gram (como ya se ha descrito) o. preferiblemente, se hace una preparacin citoce
ntrifugada (Shanholtzer, 1982), Despus de preparar la extensin, el medio se inyect
a como se explica en el Capitulo 50. Las muestras filtradas se colocan hacia aba
jo en la superficie de agar chocolate, y tras 24 y 48 horas de incubacin, se desp
laza con una pinza estril a otro lugar para detectar las colonias formadas debajo
de l. Adems de la tincin de Gram para las muestras y cultivo, los test de aglutina
cin de ltex para la deteccin de antigenos de Streptococcus del grupo B. Streptococc
us pneumoniae, algn serotipo de Neisseria meningitidis. E. coli (el antigeno caps
ular K1 hace una reaccin cruzada con el tipo B de Neisseria meningitidis) y Hemop
hilus inlluenzae tipo B. se debera realizar la tcnica del sobrenadante de una mues
tra centrifugada, la filtracin de una muestra previamente filtrada o de un muestr
a original. Estos test de ltex son ms tiles para diagnosticar las meningitis tratad
as incompletamente (Maxson, 1994; Bhisitkul. 1994) y para confirmar una extensin
positiva para la tincin con Gram. La realizacin sistemtica de los test de ltex debera
descartarse porque, en comparacin con las muestras teidas con Gram, su sensibilid
ad no es significativamente mayor y son mucho ms caros (Perkins, 1995; Kiska, 199
5). El diagnstico de la meningitis bacteriana crnica requiere u n a peticin especia
l, ya que el LCR se maneja de modo diferente para cada entidad. Para diagnostica
r la brucelosis. el LCR se procesa como se ha descrito anteriormente para un cul
tivo bacteriano ordinario, pero los medios se incuban dos o tres semanas. Para l
eptospirosis. Leptospira interrogans, debera cultivarse el LCR de las primeras se
manas de la enfermedad. Los medios especiales (mencionados antes) se inyectan co
n unas pocas gotas de LCR y se incuban como se ha explicado en el Captulo 50 El d
iagnstico de neurosfilis se basa en encontrar en el LCR los siguientes hallazgos:
pleocitosis. concentracin de protenas aumentada, un test de laboratorio de investi
gacin de enfermedad venrea positivo (VRDL, LCR VRDL), que de momento es el nico mtod
o til para la deteccin de anticuerpos para Treponema pallidum en el LCR (vase Cap.
52). El test de enfermedades venreas en el LCR se indica slo si la persona tiene e
l suero positivo para la sfilis (Albright, 1991). La muestra debera conservarse en
el frigorfico hasta que se haya examinado. La afectacin del SNC por Borrelia burg
doferi (enfermedad de Lyme) tambin se diagnostica serolgicamente mediante la detec
cin de IgM e IgG especificas en el suero y LCR. El anlisis del LCR para la deteccin
de micobacterias slo est indicado en muestras con pleocitosis, elevacin de glucosa
o protenas (Albright, 1991). Para una adecuada recuperacin del germen se recomien
da el cultivo de al
Tabla 57-3 C a u s a s bacterianas m s habituales de meningitis aguda s e g n la
e d a d Edad Neonalos-3 meses Organismos Streptococcus del grupo B Escherichia
coli Listeria monocytogenes' Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae N
eisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Streptococ
cus del grupo B
4 meses-6 aos' Seis aos-45 aos >45 aos
"Puede producir meningitis en inmunosuprimidos en rodos los grupos de edad. 'La
incidencia en EE.UU. de meningitis debida al Haemophilus inlluenzae tipo 0 ha di
sminuido drsticamente gracias a l a vai unacin

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1259
menos 5 mi. El fluido se cenlrifuga a 3.000-3.600 x g durante 30 minutos, se sac
a el sobrenadante, el sedimento se mezcla completamente en una mezcladora y se u
sa para preparar muestras para teir e inocular en medio apropiado (vase Cap. 53).
El anlisis del LCR para la deteccin de hongos es el mismo que el descrito para la
deteccin de bacterias en un cultivo habitual. Los organismos se concentran por ce
ntrifugacin o filtracin. Una preparacin obtenida por citocentrifugacin o una extensin
del sedimento teido con Gram se examina, y se coloca en el medio adecuado para c
ultivo (infusin de cerebrocorazn o el agar de Shabi sin antibiticos). Para muestras
filtradas, el filtro se corta con unas tijeras estriles en dos partes, cultivand
o una para bacterias y la otra para hongos. El cultivo de las muestras centrifug
adas se hace colocando una parte del sedimento en diferentes lugares de la super
ficie del agar. Adems de los cultivos de LCR y las tinciones con Gram, hay dispon
ibles unos test rpidos para el diagnstico de meningitis causada por Chptococcus ne
oformans: preparacin de tinta china, aglutinacin con ltex y ensayo mediante unin enz
imtica inmunoadsorbente (ELISA), Los dos ltimos son especficos para el antigeno cap
sular. Las clulas encapsuladas del C. neoformans son visibles en el LCR mezclado
con tinta china (una gota de sedimento de LCR con una gota de tinta china, dispo
nible en tiendas de arte) en un cristal y examinadas bajo un gran aumento (Fig.
57-1). La sensibilidad de la tinta china es baja excepto en personas infectadas
por VIH, por lo que el test de aglutinacin con ltex para el criptococo o la ELISA
(que son altamente especficos y que tienen ms del 90% de sensibilidad) son los rec
omendados para el diagnstico. Estos dos ltimos test pueden ser hechos en un filtro
de LCR (si la muestra fue concentrada por filtracin), en el sobrenadante de una
muestra centrifugada o en LCR sin centrifugar. Un falso positivo en los resultad
os de la aglutinacin con ltex se debe a la presencia de Trichosporon beigelii en e
l fluido del test o a la aparicin de condensacin del agar en dicho fluido. Para ev
itar este ltimo problema, el test de ltex debera hacerse antes del cultivo o mejor
en una muestra separada (Heelan, 1991). El anlisis del LCR para el diagnstico de i
nfecciones virales consta de un cultivo convencional celular (principalmente par
a la deteccin de enterovirus), cultivo para virus causantes de encefalitis (equin
a occidental, equina oriental, equina venezolana, San Luis, japons y La Crosse) y
test serolgicos. Adems, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) est siendo inve
stigada como una herramienta para la deteccin de enterovirus, virus del herpes si
mple y para el anlisis del cido nucleico del CMV en LCR, pero en la actualidad no
hay equipos disponibles en el comercio. Las lneas celulares para aislar enterovir
us son las ya expuestas previamente para las muestras hemticas.
El LCR es en ocasiones enviado al laboratorio para el diagnstico de tripanosomias
is africana ( Trypanosoma gambiense o Trypanosoma rhodesiense) o infeccin con ame
bas libres (Naegleria fowlery y especies de Acanthamoeba). Una vez que se recibe
la muestra en el laboratorio, debera analizarse inmediatamente. Las preparacione
s frescas se preparan directamente de la muestra y del sedimento, agitando prime
ro suavemente el tubo para prepararlo (paso necesario, porque los parsitos con fr
ecuencia se quedan en la pared del tubo) y despus centrifugando la muestra a 250
x g durante 10 minutos. Las preparaciones se examinan en el microscopio con el c
ondensador a baja potencia para permitir la visualizacin de trofozoitos o, prefer
iblemente, en un microscopio de contraste. Los cultivos de amebas de vida libre
del LCR se hacen en unas placas de agar no nutriente cubiertas con una suspensin
de E. coli o Enferobacler aerogenes. El fluido se centrifuga a 250 x g durante 1
0 minutos, el sobrenadante se mueve con una pipeta estril y el sedimento se mezcl
a con 0,5 mi de solucin salina y se coloca en el centro de la placa. El cultivo s
e incuba a 37C y se examina diariamente durante 10 das bajo el microscopio con un

objetivo 10x (Martnez, 1991). Otros fluidos corporales. Se recogen del pericardio
, de la cavidad torcica o de la peritoneal aspirando con una aguja y jeringa. El
volumen adecuado para aislar la mayora de las bacterias es de 1 mi a 5 mi, pero l
o ideal para recoger bacterias y hongos es de 10 mi a 15 mi, que por lo general
estn presentes en pequeas cantidades. Por otra parte, para diagnosticar una perito
nitis asociada a dilisis peritoneal ambulatoria crnica, la recogida de hasta 50 mi
podria mejorar el aislamiento del patgeno causal (Dawson, 1985). Para transporta
r el fluido, se debe aspirar en un contenedor estril y debe ser llevado al labora
torio sin demora. Alternativamente, la muestra puede ser inyectada en ese moment
o directamente a los botes de cultivo; parece ser especialmente til una aproximac
in para detectar bacterias en el liquido peritoneal (Luce, 1988). Los enterovirus
, principalmente los Coxsackievirus A y B, estn entre las causas ms comunes de per
icarditis infecciosa. Estos virus podran detectarse en el fluido pericrdico por un
cultivo celular convencional, pero como no se detectan en todos los casos, la r
ecogida de un exudado farngeo y de heces (que es donde ms probablemente se produzc
a el virus), adems del fluido pericrdico, es altamente recomendada para aislar el
virus en personas en las que se sospecha una pericarditis enteroviral. Otros vir
us (herpes simple, varicela zster, CMV, Epstein-Barr, hepatitis B. virus parotidi
tis, virus influenza) son agentes infrecuentes de la pericarditis y. por general
, no se detectan en el lquido pericrdico. El anlisis del lquido de las cavidades cor
porales para la deteccin de bacterias incluye la preparacin de una extensin para la
tincin con Gram e inyectar el medio adecuado para cultivo. Como se ha mencionado
antes, las muestras pueden inyectarse en ese momento o en el laboratorio. En el
laboratorio, el fluido se centrifuga a 1.500-2.500 x g durante 20-30 minutos y
el sobrenadante se separa dejando 0,5 mi donde se mezcla el sedimento y despus se
usa para preparar las extensiones e inyectar el medio. Alternativamente se pued
e separar un volumen pequeo (0,5 mi) de fluido antes de la centrifugacin, y se usa
para preparar una extensin para citocentrifugar. El lquido sin centrifugar tambin
podra ser inyectado directamente para un sistema de hemocultivo en el laboratorio
, dejando de 0,5 mi a 1 mi para preparar una extensin para hacer una tincin de Gra
m. Las muestras de fluido usadas para la deteccin de micobacterias se analizan co
mo se ha descrito antes para el LCR. Los fluidos para el cultivo de hongos debera
n estar concentrados mediante centrifugacin, como se ha descrito antes para las b
acterias. El sobrenadante se separa dejando de 1 , 5 mi a 2,0 mi. donde el sedim
ento entero es mezclado. Una muestra de sedimento se aparta para la tincin con Gr
am, calcoflor blanco, rojo congo o tincin de plata. Lo ideal es que se inyecten de
0.5 mi a 1 mi de sedimento en un medio de cultivo de hongos (como para LCR), pe
ro tambin es posible con menos volumen. Los fluidos corporales raramente se recog
en para la deteccin de parsitos; sin embargo Enlamoeba histolylica podra encontrars
e en el pericardio, cavidad pleural o peritoneal, debido a la rotura de un absce
so en el hgado (en las cavidades peritoneal, pleural o pericrdica) o en los pulmon
es (cavidad pleural o pericrdica) o a la perforacin de lceras amebianas (en cavidad
peritoneal). Los quistes hidatdicos no son frecuentemente diagFigura 57-1. Preparacin de tinta india de lquido cefalorraqudeo que nos muestra las
formas de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans. (x 400.)

1260
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA hielo hmedo. Se podra obtener un diagnstico rpido por una inmunofl
orescencia directa o indirecta de las extensiones de clulas conjuntivas con antic
uerpos especficos para virus, pero el cultivo celular es el mtodo ms sensible para
detectar patgenos virales potenciales, por lo que siempre debera hacerse. Para det
ectar Chlamydia trachomatis, se debera teir con Giemsa una extensin preparada direc
tamente de raspados conjuntivales y debe examinarse para clulas epiteliales con i
nclusiones intracitoplasmticas basofilicas diagnsticas de C trachomatis o. preferi
blemente, con anticuerpos monoclonales. que son ms sensibles y especficos que la G
iemsa. Para obtener buenos resultados con el test de fluorescencia directa de an
ticuerpos debera usarse el equipo que haya sido proporcionado por el fabricante (
vase Cap. 49). Pasamos la torunda directamenle por la superficie del cristal, fij
amos el material y el porta se lleva directamente al laboratorio y se deja a tem
peratura ambiente, o se mete un rato en el frigorfico. Los portas se tien de acuer
do a las instrucciones del fabricante, y se ven al microscopio fluorescente para
cuerpos elementales (vase Cap. 49). Se considerarn inadecuadas las muestras que t
engan menos de 10 clulas columnares o escamosas metaplsicas. y los resultados debe
ran ser remitidos sin conclusin, dando una explicacin, y debera pedirse otra muestra
. El cultivo es el mtodo de referencia para la deteccin de C. trachomatis y debera
hacerse cuando hay una alta sospecha de diagnstico de conjuntivitis por Chlamydia
y el test de fluorescencia directa de anticuerpos es negativo. Muestras corneal
es. Los raspados corneales y las biopsas son tiles para determinar el agente etiolg
ico de la queratitis, una infeccin que puede potencialmente producir prdida de vis
in y que requiere atencin inmediata. Se encuentran bacterias del 65% al 90% de los
casos de queratitis, y Sfreptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus, Pseudom
onas aeruginosa y especies de Moraxella son los que encontramos con mayor frecue
ncia en EE.UU. Las muestras corneales se recogen con una esptula de platino estril
y se usa para preparar las extensiones ponindolas directamente en los portas par
a teirlas e inocularlas en el medio de cultivo adecuado. Si solicitan un cultivo
viral, los raspados deben colocarse directamenle en un medio de transporte viral
y se llevan rpidamente al laboratorio o se dejan en el frigorfico un rato y luego
se llevan con hielo hmedo. Por lo general, la conjuntiva y los prpados del ojo in
fectado y del no infectado se cultivan concomitanlemente para determinar la flor
a normal, que es til para valorar los resultados del cultivo de cornea. Cuando el
cultivo de una Ulcera corneal se sospecha que va a ser negativo, el oftalmlogo d
ebera hacer una queratectoma superficial o una biopsia corneal, que es muy til para
la deteccin de hongos y Acanthamoeba.
nosticados por el anlisis de los lquidos de las cavidades corporales, tambin debido
a que el quiste se rompe en un lugar contiguo a la cavidad El Huido recogido es
generalmente claro y contiene "arena" hidatdica (vase Cap. 55]. pero alguna vez p
uede ser turbio debido a sobreinteccin bacteriana. En individuos con infeccin por
filaras es raro que el anlisis de una preparacin en fresco de un fluido de una cavi
dad corporal pueda demostrar las microfilias, y en pacientes con hiperinfeccin po
r Strongyloides. las larvas podrian detectarse en los fluidos de las cavidades c
orporales.
TEJIDOS
La toma de muestras de tejidos mediante ciruga posee un riesgo considerable para
el paciente y supone un gran gasto; por tanto, le corresponde al cirujano tomar
una muestra suficiente para el estudio histopatolgico y microbiologico. Las torun
das por lo general son poco adecuadas para este propsito. La histopatologia de la
lesin sirve no slo para diferenciar entre infeccin y malignidad, sino tambin para d
istinguir entre un proceso supurativo y granulomatoso. En algunos casos los tint
es especiales son tiles para establecer la etiologa del proceso. En lesiones crnica

s el diagnstico diferencial incluye enfermedad debida a Aclinomyces. Brucella. mi

cobacterias y hongos, y cualquiera de stos debera estar presente slo en un nmero peq
ueo; de nuevo queremos recalcar la necesidad de obtener muestras adecuadas para c
ultivo y anlisis. Las muestras obtenidas quirrgicamente para cultivo deben colocar
se en un recipiente estril de boca ancha y. como regla general, el cirujano debera
separar aspticamente el tejido en el quirfano y remitirlo a anlisis histopatolgico
y microbiolgico. Es importante que exista una buena relacin entre histopatlogo y mi
crobilogo, especialmente en casos de fiebre de origen desconocido, para lo que se
realiza una laparotoma exploratoria y se toman varias biopsas. Los tejidos recibi
dos en el laboratorio deberan ser examinados, describiendo sus caractersticas ante
s de analizarlos. Debe ser entonces cuando se corta muy fino con las tijeras estr
iles y se deja en un mortero, donde se mezcla con un abrasivo estril en el caldo
para hacer una suspensin al 20%. Esta suspensin se usa para inyectar todo el medio
de cultivo necesario y despus se deja refrigerar durante por lo menos dos semana
s antes de tirarlo.
OJO
Muestras conjuntivales. Los raspados conjunlivales o las muestras recogidas con
torunda se recogen para determinar el agente etiolgico de la conjuntivitis. Las b
acterias son los agentes etiolgicos ms comunes de las conjuntivitis inlecciosas, y
los que con mayor frecuencia encontramos son: Streptococcus pneumoniae. Staphyl
ococcus aureus y Staphylococcus epidermidis en adultos, y Haemophilus influenza.
Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus en nios. El tracoma, que es cau
sada por Chlamydia trachomatis, es la principal causa de ceguera en el mundo. C.
trachomatis puede causar conjuntivitis de inclusin en recin nacidos y menos comnme
nte en adultos. Los virus son responsables del 15%-20% de los casos de conjuntiv
itis inlecciosas agudas y, en EE.UU., la mayora de las epidemias de conjuntivitis
vricas las causan los adenovirus. Raramente los parsitos son los causantes de la
conjuntivitis. Las clulas conjuntivas se obtienen de la parte superior e inferior
de la conjuntiva tarsal usando una torunda humedecida en caldo de cultivo o una
esptula estril de platino. Lo ideal es que las muestras se preparen y, si se sosp
echa una infeccin bacteriana o fngica, el que recoge la muestra debe inocularla di
rectamente en el medio de cultivo. Si la preparacin directa de la muestra o la in
yeccin del medio no fuese posible, se deberan recoger muestras con torunda. Las mu
estras deberan secarse al aire y rpidamente transportarse al laboratorio junto con
el medio inyectado. Si se pide un cultivo viral, hay que recoger una segunda mu
estra (un raspado o con torunda), colocarla en un medio de transporte viral y ll
evarla pronto al laboratorio, o bien dejarla en el frigorfico durante un rato y d
espus transportarla en
TRACTO RESPIRATORIO
Muestras nasofarngeas. Las muestras de aspirados nasofarngeos, lavados y frotis se
recogen sobre todo para el diagnstico de infecciones respiratorias virales, pero
tambin para sarampin. Chlamydia trachomatis, neumona en nios, difteria y pertussis.
Los frotis nasales tambin se usan para identificar los portadores del Staphyloco
ccus aureus. Las aspirados nasofarngeos y los lavados son mejores que los Irots pa
ra determinacin viral, pero por lo general el frotis es ms conveniente. Los lavado
s o frotis se recogen para la deteccin de Bordetella pertussis: el frotis es la m
uestra preferida para detectar Chlamydia trachomatis y Corynebacterium difteriae
. El aspirado se recoge con un tubo de plstico (como el que se utiliza para alime
ntar a los nios) junto con una jeringa de 10 mi o un catter para succionar. El lav
ado se obtiene con una pera de goma, metiendo y sacando de 3 ml a 7 mi de salino
tamponado con fosfato. Para recoger muestras nasofarngeas con una torunda se tie
nen que sacar los m o c o s de la cavidad nasal, entonces se inserta una torunda
pequea y flexible nasofarngea a travs del septo nasal a la faringe posterior y se
mueve varias veces por la mucosa. Para detectar virus, las muestras nasofarngeas
se colocan en un medio de transporte adecuado, con o sin antibitico (tales como i
nfusin de ternera con 0,5% de gelatina, solucin salina de Hank o caldo sucrosa-fos
fato), y se lie-

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1261
van rpidamente al laboratorio o se dejan un rato en el frigorfico y se ponen con h
ielo lo antes posible. Los mtodos de deteccin de virus se explican con ms detalle e
n el Captulo 48. Para detectar Chlamydia trachomatis se recoge una muestra nasofa
rngea con una torunda con la punta de polister. que puede utilizarse para cultivo,
para preparar una extensin para tincin directa con anticuerpos fluorescentes o po
siblemente para ELISA (si el sistema es adecuado para muestras nasofarngeas). Los
mtodos de deteccin se explican en el Captulo 49. Para cultivo de Chlamydia trachom
atis, la torunda deberia colocarse en un medio 2-sucrosa fosfato que contenga ag
entes antimicrobianos y ser transportada al laboratorio lo antes posible, o bien
ponerla en el frigorfico un poco tiempo. Para detectar Bordetella pertussis nos
basta con inyectar el lavado o el frotis en el mismo lugar. Si esto no es posibl
e, colocamos la muestra en un cultivo de casamino estril, llevamos la muestra rpid
o al laboratorio y se analiza dentro de la primera hora o segunda despus de recog
er el cultivo, que es el mtodo ms sensible para detectar B. pertussis: se realiza
la tincin directa de anticuerpos fluorescentes, que da unos resultados diagnsticos
rpidos pero se asocian con muchos resultados falsos positivos y falsos negativos
(Friedman. 1988). En la actualidad el medio recomendado para el cultivo es el a
gar Regan-Lowe (compuesto de agar carbn oxidado. 10% de sangre de caballo y que c
ontiene cefalexina), mejor que el tradicional agar Bordet-Gengou (infusin de agar
patata con el 20% de sangre de oveja). Las muestras que deben transportarse a u
n laboratorio de referencia para cultivarse deberan de inyectarse en un medio de
transporte para Regan-Lowe. Para detectar a los portadores de Staphylococcus aur
eus, las secreciones nasales se recogen de la nariz con una torunda de polister q
ue se coloca en un tubo para transportarla rpidamente al laboratorio. La muestra
se coloca en un agar con el 5% de sangre de oveja, un medio selectivo para organ
ismos grampositivos (agar colistina-cido nalidxico o agar alcohol fenil-etlico), o
agar sal de manitol, un medio selectivo para Staphylococcus aureus y que ayuda a
diferenciar las especies coagulasa positivo de las coagulasa negativo. Muestras
de garganta. Los frotis farngeos que se hacen por lo general se recogen para dia
gnosticar las faringitis por Streptococcus del grupo A, y las muestras que se re
ciben en el laboratorio para cultivo ordinario slo deberan buscar este agente. Los
lavados de garganta o frotis son tiles para detectar virus que se encuentran en
la cavidad oral sin causar faringitis (virus del herpes simple, CMV o enteroviru
s), y los frotis deberan ser tiles para determinar el agente causante de la epiglo
titis, una celulitis que progresa con el riesgo potencial de causar obstruccin de
la va area (casi siempre debido a Haemophilus influenzae tipo B, aunque en ocasio
nes a Staphylococcus aureus o Streptococcus pneumoniae) y en el diagnstico de gon
orrea, neumona por Mycoplasma pneumoniae, difteria y angina de Vincent. Los froti
s de garganta se recogen sujetando la lengua con un depresor, introduciendo la t
orunda entre las amgdalas y detrs de la vula sin tocar las paredes laterales de la
cavidad bucal y moviendo en todas las direcciones por la faringe posterior. Los
frotis recogidos para detectar virus deberan colocarse en un medio de transporte
para virus y, los que sean para detectar bacterias, en un tubo para transportar
que contenga medio Stuart modificado. Los lavados de garganta para el diagnstico
de infecciones virales se obtienen haciendo grgaras con 5 mi de medio de transpor
te viral que contenga antibiticos. Los lavados y frotis deberan llevarse pronto al
laboratorio o dejarlos un rato en el frigorfico, si es inevitable un retraso. Pa
ra el diagnstico de faringitis por Streptococcus del grupo A, el cultivo es el ms
sensible. Utilizar un medio selectivo aumenta la recuperacin de Streptococcus pyo
genes, y si inhibimos la flora normal, disminuye el tiempo requerido para leer l
as placas y la interpretacin de colonias |i-hemolticas (Bellon. 1991). Cuando se s
olicita urgente un test directo para Streptococcus grupo A (hay varios disponibl

es comercialmente) se deben recoger dos muestras. Si el test directo es positivo

, la segunda muestra debe desecharse; pero si el test directo es negativo, hay q
ue cultivar la segunda muestra, porque la sensibilidad del test es slo del 70% (B
isno, 1991). Para determinar el agente causante de la epiglotitis, el mdico debera
recoger un frotis en un lugar donde se pudiera intubar al paciente en caso de
ser necesario. Para detectar la Neisseria gonorrhoeae en la garganta, la muestra
debera inocularse en ese mismo lugar, o tendra que ser transportada al laboratori
o lo antes posible y ser inoculada tan pronto como sea posible en un medio selec
tivo, como el agar Thayer-Martin modificado. Si el retraso es inevitable, la mue
stra tiene que estar a temperatura ambiente. El frotis de faringe es la muestra
para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae, aunque para el diagnstico de la neumona
por M. pneumoniae por lo general es suficiente con la clnica o un test serolgico.
La muestra debe dejarse en el frigorfico hasta que se inyecte en un medio de cult
ivo adecuado (vase Cap. 49). Para el diagnstico de difteria se recoge una muestra
nasofarngea y una (o mejor dos) de garganta y se llevan al laboratorio inmediatam
ente. Si el personal del laboratorio no tiene experiencia en la identificacin y r
ecuperacin de Corynebacterium diphteriae, tienen que remitir las muestras secas e
n paquetes o tubos que contengan gel de silica u otro secante a un laboratorio d
e referencia. Para analizar las muestras de los individuos de los que se sospech
a difteria, se preparan dos extensiones de una de las muestras de garganta; una
se tie con Giemsa, para diferenciar la difteria de la angina de Vicent, y la otra
con azul de metileno Loftier, para visualizar los granulos metacromticos profund
os teidos de azul de las especies de Corynebacterium. diphteriae no puede identif
icarse por la morfologa de las clulas, por lo que deben realizarse cultivos. Las m
uestras nasofarngeas y de garganta deberan colocarse en un medio de suero de Lffler
y en un medio que contenga telurito potsico. Adems tiene que inyectarse y analiza
rse una placa de agar de sangre de oveja para Streptococcus del grupo A. La angi
na de Vincent es una amigdalitis aguda, ulcerativa y necrotizante que puede ser
causada por Fusobacterium necrophorum y otros anaerobios. Una enfermedad con est
a clnica debera llamarse angina de Vincent si en las extensiones preparadas de una
muestra farngea o la muestra de la lesin ulcerada encontramos gramnegativos, baci
los fusiformes y espiroquetas al teirlas con Gram. El cultivo del rea de alrededor
no suele ser til porque existen muchas especies de anaerobios que estn presentes
en la cavidad oral; sin embargo, deben realizarse cultivos de sangre porque la e
nfermedad suele acompaarse de sepsis. Esputo y aspirado traqueal. Los estudios mi
crobiolgicos de los esputos (expectorado e inducido) y de las muestras de aspirac
in traqueal son lo primero que se hace para determinar los agentes etiolgicos de l
a neumona. Lo mejor es que el esputo se recoja a primera hora de la maana antes de
comer. El individuo deberia enjuagarse la boca con agua y despus recoger la mues
tra, preferiblemente de 5 ml a 10 ml, que resultar de una tos profunda. Para las
personas que no tienen tos productiva se debera inducir, poniendo al individuo ae
rosoles de una solucin de cloruro sdico al 15% y glicerina al 10% durante aproxima
damente 10 minutos o hasta que se inicie el reflejo de la tos. La aspiracin traqu
eal obtiene secreciones respiratorias bajas de pacientes con traqueostoma recogid
as en un recipiente de Lukens. Los pacientes con traqueostoma enseguida se coloni
zan con gramnegativos y otros patgenos nosocomiales, y como la bacteria que colon
iza el aparato respiratorio no puede ser diferenciada de la bacteria que causa l
a enfermedad invasiva por el cultivo de aspiracin traqueal, la interpretacin de lo
s cultivos es muy difcil. Las muestras de esputo y de aspiracin traqueal deben lle
varse al laboratorio o, si el retraso es inevitable, se dejan un rato en el frig
orfico. Ambos tipos de muestras se deben someter a screening antes de colocarlas
en las placas para hacer el cultivo, para determinar si lo que tienen son pocas
secreciones o saliva (Morris, 1993). Una extensin obtenida de una parte de la mue
stra que consiste en material purulento se tie con Gram. Por lo general, las mues
tras que encontramos con ms de 10 clulas epiteliales por campo de bajo aumento estn
significativamente contaminadas con saliva, por lo que deberan rechazarse. Las m
uestras con menos de 25 clulas epiteliales y ms de 25 neutrfilos por campo de bajo
aumento probablemente se acepten (Murray, 1975). El nmero de neutrfilos no se suel
e tener en cuenta cuando se determina la calidad de la muestra, porque el indivi

duo del que la hemos recogido puede estar neutropnico. Por lo general no se pide
un screening en las muestras de esputo inducido y esputos no inducidos para la d
eteccin de Mycoplasma neumoniae, especies de Legionella y mcobacteria para valorar
la calidad (Ingram, 1994; Havlik. 1995). Sin em-

1262
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA se meten en la cnula externa para evitar la contaminacin del cepi
llo cuando se retira el catter. Despus se coloca el cepillo en una solucin estril co
n 1 mi de suero salino. La muestra debe llevarse inmediatamente al laboratorio y
analizarse lo antes posible. Si el retraso es inevitable, tiene que guardarse e
n el frigorfico. Para analizar la muestra, hay que agitarlo en la mezcladora dond
e se deja el cepillo. Las preparaciones del centrifugado se tien con una tincin Gr
am y con el asa de inoculacin calibrado de 0,01 mi, y se deja el cultivo en un me
dio apropiado Las colonias de ms de 1.000 organismos/ml en el cultivo (que corres
ponde a 10' organismos/ml de la muestra original) parece que corresponden con un
a infeccin (Baselski, 1994). Lavado broncoalveolar. Las muestras de lavado bronco
alveolar son tiles para el diagnstico de neumona en pacientes ventilados que no han
recibido tratamiento antibitico, y para detectar patgenos oportunistas en pacient
es con neumona e inmunocomprometidos (Baselski. 1994). Sin embargo, para el culti
vo de las especies de Legionella son preferibles las muestras de esputo, porque
las muestras broncoalveolares se diluyen en salino y podran contener pequeas canti
dades de anestsico local, que inhibe los organismos. Para recoger el fluido, la p
unta del broncoscopio se introduce cuidadosamente en la luz de la va area. A travs
de la luz, se inyecta un volumen de salino (por lo general > 140 mi) en 3 4 alcuo
tas lavando 1 milln de alvolos. El volumen total que se saca varia en funcin del vo
lumen metido, pero por lo general es de 10 ml a 100 mi. El tiempo que tarde en l
levarse al laboratorio tiene que ser mnimo (<30 minutos), y una vez que est en el
laboratorio debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse un retraso, e
l liquido debera conservarse en el frigorfico. El anlisis de las muestras de lavado
broncoalveolar para detectar virus incluye un examen microscpico directo y un cu
ltivo celular. El anlisis de las preparaciones centrifugadas teidas con la tincin d
e Papanicolau permite detectar los cambios citopticos, tiles en especial para el d
iagnstico de neumona por CMV (Fig. 57-2) (Woods. 1990). Se recomienda teir las prep
araciones centrifugadas del fluido con Gram: visualizar una o ms bacterias sin clu
las escamosas epiteliales por campo de aceite de inmersin es altamente sugerente
de una neumona bacteriana aguda (Baselski. 1994; Kahn, 1987). Las preparaciones c
entrifugadas tambin pueden teirse con tincin acido-resistenle. con anticuerpos espe
cficos, como aquellos para delectar las especies de Legionella o Pneumocystis carn
ii. o con tintes no especficos para detectar Pneumocystis carinii u otros hongos
(como tinte de plata, calcoflor blanco o Giemsa). Los datos indican que un cultiv
o cuantitativo de muestras de lavado alveolar es til para el diagnstico de neumona
bacteriana aguda (Baselski. 1994). La muestra se inyecta en un medio agar usando
un asa de inoculacin calibrado de 0,001 mi (como se vera despus para los cultivos
de orina) La presencia de ms de 10.000 colonias/ml corresponde con la enfermedad
. Para detectar micobacterias, las muestras deben ser descontaminadas y manejada
s como se describe en el Captulo 53. Para detectar virus, debe hacerse un cultivo
convencional y un cultivo centrifugado para CMV. Para recuperar los hongos, se
debe inyectar el sedimento de una muestra centrifugada en un medio de cultivo pr
imario.
bargo. los dalos de un estudio sugieren que la presencia de neutrflos en un screen
ing de las muestras de esputo es un mtodo efectivo para evaluar la aceptacin del e
sputo para el cultivo y muestra micobacteriana. (McCarler, 1996). Las extensione
s teidas con Gram que se han preparado de una muestra adecuada para cultivo se ex
aminan con inmersin en aceite para determinar los diferentes organismos. La canti
dad de organismos (raros, pocos, moderados o muchos) se estima para cada tipo de
bacterias (p. ej.. cocos grampositivos en parejas, cadenas o racimos; bacilos g
rampositivos. diplococos gramnegativos y gramnegativos en varillas), diferencian
do si son o no intracelulares. Las muestras de secreciones traqueales teidas con
Gram en las que no se observan organismos deberan rechazarse (Gilligan, 1999). Lo

s trozos de muestras aceptadas que contengan material purulento se inyectan como

se describe en el Captulo 50: para muestras de individuos con fibrosis qustica. t
ambin se recomienda inyectar en un medio selectivo para Burkholderia (Pseudomonas
) cepacia. Hay algunos organismos que no encontramos en un cultivo ordinario, y
para aseguramos de que se detectan hay que pedir unos test especficos. Por ejempl
o, cuando se sospecha enfermedad por Legionella, se recomienda un cultivo de Leg
ionella y un test directo rpido (anticuerpos fluorescentes). El cultivo es el mtod
o ms sensible y debera realizarse siempre. Las muestras de esputo y aspiraciones t
raqueales que vayan a ser sometidas a un cultivo para Legionella deberan diluirse
1:10 en un tubo con caldo tnpticasa que contenga pedas de cristal estriles, y se
agita en una mezcladora o se trata lavndolo con una solucin acida para evitar el
crecimiento de la llora bacteriana normal. Habra que inocular algunas gotas de la
muestra de cada una de las dos placas de agar extracto de levaduras carbn tampon
ado con u-cetoglutarato, una con agentes microbianos y otra sin ellos. La tincin
con fluorescencia directa de los anticuerpos, que puede darnos resultados en una
s horas frente a los 57 das que tardan los cultivos, debera usarse para suplementa
r. pero no para sustituir el cultivo. Para una deteccin adecuada de micobacterias
en los esputos, se recomienda recoger las muestras en tres das diferentes. El es
puto y otras secreciones respiratorias deben descontaminarse para evitar el sobr
ecrecimiento bacteriano rpido de la flora respiratoria saprofita sobre las micoba
cterias de crecimiento. Este proceso y los mtodos para detectarlo se comentan en
el Captulo 53. Todas las muestras destinadas para el cultivo de hongos se deben m
anejar en una cabina de seguridad biolgica. La calidad de las muestras debera dete
rminarse con un screening de las extensiones teidas con Gram (como se ha descrito
para las bacterias). Para el cultivo de hongos se deberan inyectar en el medio d
e cultivo muestras adecuadas de esputo no inducido, esputo inducido y aspiracion
es traqueales. Por lo general, para el cultivo de hongos se recomiendan los sigu
ientes principios generales: debera usarse un medio con y sin enriquecimiento de
sangre con y sin cicloheximina; todos los medios deberan contener agentes antimic
robianos. Sin embargo, cuando se haga la seleccin, el director del laboratorio ta
mbin debera considerar el coste y los tipos de hongos que se suelen encontrar en l
a poblacin. Las muestras de esputo inducido son tiles para el diagnstico de neumona
por Pneumocystis carnii en personas con el sndrome de inmunodeficencia adquirida (s
ida) (Wolfson, 1990). Primero se analiza una extensin teida con Gram para ver si e
s representativa de secreciones del tracto respiratorio bajo. Las muestras acept
adas se tratan son un agente mucoltico (como W-acetil-L-cistena), y las extensione
s se preparan y se tien para detectar P. carnii (vase Cap. 54). Muestras por cepill
o telescopado. El cepillado es til para el diagnstico de neumona bacteriana en paci
entes ventilados que no han recibido tratamiento antibitico, y probablemente es ti
l para el cultivo de aerobios y anaerobios (Baselski. 1994). La muestra se recog
e con un cepillo pequeo que obtiene de 0.01 ml a 0,001 mi de secreciones, colocad
o en un catter, dentro de una cnula doble. La cnula de luera tiene en la punta un t
apn desplazable de polielileno glicol. Para obtener la muestra, se inserta la cnul
a, mediante broncoscopia, en el sitio deseado, la cnula de dentro se saca quitand
o el tapn (hidrosoluble) y se extiende el cepillado ms all de la cnula interna. Una
vez que se ha tomado la muestra, el cepillo se mete en la cnula interna y ambos,
el cepillo y la cnula interna,
TRACTO URINARIO
Los mtodos aceptados para recoger la orina incluyen recogida de la mitad de la mi
ccin (preferiblemente la primera de la maana), sondaje y aspiracin suprapbica. Por l
o general, las muestras de orina de 24 horas deberan desecharse, excepto cuando s
e pida especficamente detectar Schistosoma haematobium. Lo ms comn es que se recoja
la miccin de la mitad de un modo limpio. Para mujeres, primero se limpia la zona
periuretral y penneanal con unas gasas estriles, con jabn de delante hacia atrs, y
se enjuaga con una gasa estril mojada y se seca con una gasa estril. Para hombres
, limpiar el rea genital no va a mejorar la deteccin de bactenuria de modo signifi
cativo, por lo que no es necesario (Lipsky, 1984). Durante la miccin, las mujeres
deben separar los labios, los hombres no circundados deben retirarse el prepuci
o. Los primeros mililitros de orina se desechan para limpiar las bacterias que n

ormalmente colonizan la uretra, y la miccin central se recoge en un contenedor es

tril de boca ancha y se cierra fuertemente la tapa.

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1263
aureus) (Pezzlo. 1988; Barn. 1990). Por consiguiente, para una correcta interpret
acin del cultivo, se necesita comunicacin entre el mdico y el personal del laborato
rio. Los cultivos de orina para bacterias se hacen inyectando el medio adecuado
(vase Cap. 50) en una determinada cantidad de orina con un asa calibrado de plstic
o o alambre, diseado para repartir un volumen conocido. Un asa de 0,001 mi se uti
liza para inyectar todas las muestras de orina, excepto las que se recogen en mu
jeres con sospecha de sndrome uretral agudo y aspiraciones suprapbicas. Las dos lti
mas se inyectan con un asa de 0,01 mi. El asa adecuado se mete verticalmente en
la muestra de orina bien mezclada, y el asa repleto de orina se saca y se extien
de sobre una superficie de placa agar como se indica en la Figura 57-3. Sin remo
ver el asa, se mete verticalmente otra vez en la muestra de orina y la muestra q
ue sacamos se inyecta en una segunda placa. Para determinar el nmero de microrgan
ismos por mililitro de la muestra original, se cuenta el nmero de colonias en la
placa agar y se multiplica por 1.000 (s se ha usado un asa de 0,001) o por 100 (s
i se ha usado un asa de 0.01 mi). El crecimiento de 3 o ms especies en una recogi
da limpia de la mitad de la miccin por lo general indica contaminacin. En ese caso
, los organismos se enumeran y se caracterizan mnimamente (p. ej.. Staphylococcus
coagulasa negativa o bacilo gramnegativos lactosa positiva) y no se hace el tes
t de sensibilidad. Uno o dos aislados presentes en un nmero mayor de 10.000 en un
a mitad de miccin limpia deberan identificarse y deberia hacerse un test de sensib
ilidad antibitica. Los organismos en un nmero menor de 10.000 se dejan, con las si
guientes excepciones: un cultivo puro de Staphylococcus aureus es considerado si
gnificativo independientemente del nmero y debera hacerse un test de sensibilidad.
Un crecimiento de 10 a 10 CFU/ml podra ser significativo en infecciones que tien
en que ver con la sonda. En hombres con sintomatologa, un crecimiento de 10 CFU/m
l o ms se considera infeccin, y se debera identificar el organismo, pero el test de
sensibilidad se har slo si lo piden especficamente. Para todos los organismos aisl
ados de una puncin suprapbica. se identifican y se hace el test de sensibilidad. U
n crecimiento nico en un nmero de 100 o mayor de una mujer con sospecha de sndrome
uretral agudo debera identificarse si hay piuria, y el test de sensibilidad debe
hacerse slo si se pide especficamente.
J 4 3
Figura 57-2. Preparacin cite-lgica de fluido del lavado broncoalveolar que nos mue
stra una clula alargada con inclusiones intranucleares e intracitoplasmticas. que
se corresponden con el citomegalovirus. (Tincin de Papanicolau, 250x.) (Cortesa de
Vicki J. Schnadig, M.D., Departamento de Patologa, Universidad de Texas, Rama Mdi
ca, Galveston, TX.)
El sondaje se asocia con el riesgo de inducir una infeccin nosocomial y, por tant
o, deberia estar restringido a personas que no pueden recoger la mitad de la mic
cin; por ejemplo, personas con una alteracin sensitiva o aquellos que no pueden mi
ccionar por razones urolgicas o neurolgicas. Utilizando una tcnica estrictamente asp
tica, se introduce la sonda en la uretra, se desechan los primeros mililitros pa
ra limpiar los organismos que pueden haberse introducido por la punta de la sond
a mientras se colocaba y la mitad de la miccin se recoge para cultivo. La orina p
uede recogerse de una sonda aspirando con una jeringa y una aguja del 28 a travs
del conector de goma, teniendo cuidado de limpiar el punto de puncin. La orina no
debe recogerse de la bolsa de orina, y las puntas de la sonda Foley no deberan s
er aceptadas para cultivo, porque casi siempre estn contaminadas con organismos d
e la uretra. La aspiracin suprapbica se usa principalmente en neonatos. El procedi
miento requiere que la vejiga est llena; la piel se desinfecta, se pincha la veji

ga por encima de la snfisis del pubis, y con una aguja del 22 y una jeringa aspir
amos aproximadamente 10 mi de orina. Todas las muestras deberan llevarse al labor
atorio nada ms recogerse, y se deberan analizar dentro de las dos primeras horas d
espus de haber sido recogidas. Si el retraso es inevitable, deben meterse en el f
rigorfico un mnimo de 24 horas. Hay equipos que se comercializan que contienen con
servantes para mantener las bacterias durante 24 horas a temperatura ambiente, p
ero no ofrecen ninguna ventaja con respecto a meterla en el frigorfico. El tracto
urinario por encima de la uretra en personas sanas es estril, pero la uretra est
normalmente colonizada con muchas bacterias, por lo que las muestras recogidas p
or mtodos no invasivos (media miccin, recogida limpia) son contaminadas durante su
trnsito. Las bacterias comensales se diferencian de los patgenos por varios culti
vos de orina, proceso nicialmente promovido por Kass (Kass, 1956). Al principio,
un crecimiento de 10 o ms CFU de bacterias por mililitro de orina era altamente i
ndicativo de infeccin, pero este criterio se ha modificado para las diferentes si
tuaciones. Por ejemplo, en mujeres jvenes sexualmente activas con sintomatologa ur
etral aguda (disuria, frecuencia y urgencia), 10 CFU/ml se considera significati
vo en presencia de piuria concomitante (Stamm, 1982). Infecciones de orina reale
s asociadas con menos de 10 CFU/ml pueden producirse en bebs y nios, en hombres y
en personas que estn sondadas, que se han tratado recientemente con antibiticos, c
on ingesta hdrica abundante (para diluir la orina), tienen sntomas y piuria concom
itante. Obstruccin urinaria o pielonelritis adquirida por una diseminacin hematgena
(especialmente infecciones debidas a levaduras y Stalilococcus
5 ? 5
Ms de la mitad de las muestras de orina que se llevan al laboratorio para cultivo
no tienen crecimiento, o tienen niveles bacterianos por debajo de lo que se con
sidera clnicamente significativo; por tanto, los test de screening que identifica
n de un modo rpido las muestras como "negativas" para el cultivo se han desarroll
ado en un intento de proporcionar resultados rpidos, eliminar las muestras negati
vas y permitir tener ms tiempo para las muestras positivas, mejorando la eficienc
ia y el coste. La comprobacin de la orina y los cultivos se corresponden cuando l
a referencia es 10 CFU/ml o ms, pero son menos adecuadas para un nmero menor de co
lonias (Pezzlo, 1988). Otras razones para considerar adecuado el screening de la
bactenuria son la capacidad de detectar piuria y el coste. Este ltimo es especia
lmente importante cuando consideramos la automatizacin.
s
Comprobar las muestras de orina con una tincin Gram es rpido y econmico. Encontrar
uno o ms organismos por campo con aceite de inmersin en una extensin preparada de u
na muestra centrifugada se corresponde con bacteriuria con 10' o ms CFU/ml. La se
nsibilidad del tinte Gram. sin embargo, disminuye cuando se trata de un nmero men
or de colonias, y continuar con el anlisis es una prdida de tiempo. Comercialmente
hay disponibles tiras de reactivos que combinan la nitrato reductasa (una enzim
a presente en la mayora de los bacilos gramnegativos que causa infecciones del tr
acto urinario) y la esterasa leucocitaria (una enzima producida por neutrfilos),
son mtodos baratos y fciles de manejar, pero su sensibilidad es demasiado baja par
a comprobar las infecciones del tracto urinario (Pezzlo. 1988).
r
Hay sistemas de screening para la orina disponibles comercialmente. Un sistema d
e filtracin de colores proporciona resultados rpidos y detecta ms del 90% de las mu
estras positivas (incluidas las que contienen neutrfilos y slo ^0 CFU/ml), pero pu
eden dar falsos negativos para enterococos y Pseudomonas aeruginosa (Pezzlo. 198
8; Shaw, 1997). La orina se pasa a travs de un filtro de papel que retiene las clu
las y despus se pasa el tin-

1264
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
TRACTO GENITAL
Secreciones vaginales. Las secreciones vaginales son tiles para determinar el age
nte etiolgico de la vulvovaginitis y la vaginosis bacteriana (as llamada porque no
es invasiva). En mujeres pospuberales, los patgenos ms comunes son Gardnerella va
ginalis (asociada con anaerobios como especies de Mobiluncus), especies de Candi
da y Trichomonas vaginalis. Una preparacin en fresco es el test ms adecuado para e
l diagnstico, y puede ser realizado por el mdico all presente: los cullivos no son
necesarios para el diagnstico, Para preparar la muestra fresca, se coloca la toru
nda de la muestra en un tubo que contiene cerca de 1 mi de salino y se agita con
cuidado: una gota de esa suspensin se coloca en un porta de cristal. De modo alt
ernativo, colocamos una gota de salino en el porta y la mezclamos con una muestr
a de material vaginal. Ponemos un cubreportas y calentamos la muestra pasndolo a
travs de una llama o mantenindolo sobre una bombilla incandescente. Se examina el
porta a bajo y gran aumento, buscando "clulas clave" (clulas epiteliales cubiertas
con pequeas bacterias cocobacilos) (Fig. 57-4) compatibles con el diagnstico de v
aginosis mespecfica, pseudohifas, sugestivo de candidiasis vaginal, y Trichomonas
mviles. Adems de la muestra en fresco, tambin son tiles para el diagnstico determina
r el pH vaginal y el test del olfato, que se realiza aadiendo KOH al 10% a una go
ta de muestra vaginal situada en el porta o en el espculo. El pH vaginal es de ce
rca de 4,5 en mujeres con candidiasis vulvovaginal, pero est por encima de 4,5 en
aquellas con vaginosis o tricomoniasis. Un lest del olfato positivo (es decir,
hay un olor acre como a pescado) se asocia por lo general con vaginosis bacteria
na, pero en ocasiones con tricomoniasis. Muestras endocervicales y uretrales. La
s muestras endocervicales se recogen para determinar el agente etiolgico de las c
ervicitis y para identificar las personas asintomticas con un organismo que causa
enfermedad de transmisin sexual. Las muestras endocervicales se obtienen con la
ayuda de un espculo humedecido slo en agua caliente, porque los lubricantes pueden
contener agentes antibacterianos. Si se indica una muestra Papanicolau, e s a m
uestra debera recogerse primero. Las muestras para estudios microbiolgicos por lo
general se recogen con una torunda, aunque en mujeres no embarazadas el uso de u
n cepillo endocervical podra aumentar la sensibilidad de los test de cultivo y no
cultivo para Chlamydia trachomatis (Linder, 1987). Como se ha dicho anteriormen
te, en este capitulo se recomienda usar una torunda con la punta de polister y un
recipiente de plstico. Si se utiliza un equipo para test que no sea para cultivo
para detectar organismos, la muestra tiene que recogerse con la torunda que vie
ne en el equipo o con lo que el fabricante diga. La muestra para detectar Neisse
ria gonorrhoeae hay que recogerla antes que la de Chlamydia trachomatis o la del
virus del herpes simple (VHS). Antes de recoger las muestras para estos dos ltim
os organismos, hay que sacar todas las secreciones de la cavidad cervical. La to
runda o el cepillo se insertan 1 cm o 2 cm en el canal cervical (pasada la unin e
scamocolumnar), se frota firmemente contra la pared durante 10-30 segundos, con
cuidado de no tocar la pared de la vagina, y se coloca en un medio de transporte
adecuado o un sistema de tubo, que se utiliza para preparar un porta de cristal
para la tincin directa con anticuerpos fluorescentes (para Chlamydia trachomatis
) o para inyectar inmediatamente un medio agar para recuperar Neisseria gonorrho
eae. El manejo de las muestras vara en funcin del organismo que busquemos. Para ai
slar N. gonorrhoeae, est indicada la inyeccin directa de un medio agar, como Thaye
r-Martin modificado, dentro de un recipiente al que se haya aadido una pastilla p
ara generar CO. . De otro modo, la muestra de la torunda puede colocarse en un s
istema de transporte de lubo y se lleva al laboratorio lo antes posible. Si el r
etraso es inevitable, hay que dejar la muestra a temperatura ambiente, nunca en
el frigorfico. Si utilizamos una muestra de ADN o amplificacin de cidos nucleicos p

ara detectar Neisseria gonorrhoeae, tendremos que utilizar un equipo y seguir la

s instrucciones del fabricante para el almacenaje y transporte.

Figura 57-3. Tcnica para inocular orina en placas agar. (De Woods GL Gutierrez Y:
Diagnostic Pathology of Infectious Diseases. Filadelfia, L e a 8 Febiger, 1993,
c o n permise.)
te a travs del filtro. La intensidad del color del resultado, que se lee manualme
nte o con un fotmetro, se corresponde con el nmero de partculas adheridas al filtro
. Un sistema bioluminiscente se basa en la reaccin de ATP (presente en todas las
clulas vivas) con lucferina y luciferasa, que producen luz que se mide con un lumi
nmetro. Se puede estimar el nmero de CFU en una muestra de orina por el ATP libera
do selectivamente por las bacterias solas. Esta tcnica se compara favorablemente
con el cultivo a nivel de 10 CFU/ml o ms. pero como necesita un tiempo de incubac
in, los resultados tardan unas pocas horas. Un sistema de fotometra automatizada d
etecta la bactenuria midiendo los cambios de transmisin de la luz a travs de un me
dio de caldo inyectado con la muestra de orina. El crecimiento bacteriano hace q
ue el medio se ponga turbio en 2 3 horas generalmente, pero los resultados negat
ivos no pueden darse hasta pasadas 5-13 horas. Este sistema se compara favorable
mente con un cultivo a nivel de 10 CFU o ms y tiene la capacidad de identificar e
l organismo y hacer el test de sensibilidad anlimicrobiana.
5 5
Algunas bacterias no se detectan en un cultivo ordinario de orina, y cuando se s
ospecha de estos patgenos, se debe pedir un test especfico. Por ejemplo, una muest
ra de orina es vlida para detectar Neisseria gonorrboeae y Chlamydia trachomatis
pata la amplificacin de cidos nucleicos. Las instrucciones del fabricante deben se
guirse tanto para la recogida como para el anlisis. Leplospira interrogans puede
detectarse en la orina despus de la primera semana de la enfermedad y hasta vario
s meses despus. La orina debera ser analizada lo antes posible, porque la acidez p
odra daar los organismos. Inyectamos una o dos gotas de orina sin diluir y de orin
a diluida 1:10 en 5 mi de medio Fletcher o de medio EllinghausenMcCullough-Johns
on-Harris. que contienen 5-fluoracilo. El urocultivo para micobacterias se ve en
el Captulo 53. Las levaduras deberan recuperarse de la orina en el medio que util
izamos para un cultivo bacteriano habitual, pero si se pide especficamente un cul
tivo para hongos, debe colocarse el sedimento de una muestra de orina centrifuga
da en un medio que contenga agentes antimicrobanos. como un inhibidor de mohos o
el agar Shabi. Cuando las muestras de orina se cultivan para virus, deberan aadirs
e antibiticos (p. ej penicilina, gentamicina y anfotericina B) para minimizar la c
ontaminacin bacteriana de los cultivos celulares. Las lineas celulares se selecci
onan para la inoculacin basada en los virus que encontramos con ms frecuencia aisl
ados: CMV, adenovirus y virus del herpes simple.
Para detectar Chlamydia trachomatis podran usarse mtodos de cultivo u otros (vase C
ap. 49). Para el cultivo de clulas de Chlamydia, utilizamos

CAPTUIO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EI DIAGNSTICO DE IAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1265
normalmente como medio de transporte 2-sucrosa fosfato o sucrosa-glutamato-fosfa
to, y aadimos antibiticos (como gentamicina, vancomicina y nistatina o anfotericin
a B) para impedir el sobrecrecimiento de hongos y bacterias Para mantener con vi
da las clamidias. la muestra debe transportarse inmediatamente al laboratorio, o
se deja almacenada en el frigorfico si el transporte no puede ser inmediato. En
el laboratorio la muestra debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse
el retraso, las muestras deben dejarse en el frigorfico si pueden ser analizadas
dentro de las siguientes 48 horas. Si se sabe de antemano que el retraso va a s
er mayor, las muestras deben dejarse a - 7 0 C o ms fro, aunque el proceso de cong
elacin puede disminuir el porcentaje de aislamiento de C. Irachomatis en un 2 0 %
(Mahoney, 1985). Para detectar los cuerpos elementales de Chtamydia por una tin
cin de fluorescencia directa de anticuerpos, se debe utilizar el equipo de recogi
do y seguir las instrucciones del fabricante. La torunda se da una vuelta en el
porta que se va a observar al microscopio, se deja secar y se aplica un producto
para fijar. Para el inmunoensayo enzimtico, las pruebas de cido desoxirribonuclei
co (ADN) y la amplificacin de cidos nucleicos, el equipo de recogida y transporte
que deja el fabricante es el que hay que usar, salvo que el fabricante diga que
vale olro sistema de transporte especifico. Tambin deben seguirse las instruccion
es del fabricante para las condiciones de transporte, los requisitos de almacena
miento y el tiempo para analizarlo. Para detectar adecuadamente el VHS es necesa
rio hacer un cultivo celular. El exudado se coloca en un medio de transporte vir
al y se lleva lo antes posible al laboratorio. Si el transporte inmediato no es
posible, la muestra debe almacenarse en el frigorfico. Para pacientes que tengan
una lesin visible en el crvix, los cambios virales citopticos pueden verse en las e
xtensiones preparadas de raspados de la lesin base Las extensiones se lijan inmed
iatamente y se lien con el tinte Wright o Giemsa (preparacin Tzanck) o con anticue
rpos monoclonales. Para diagnosticar las mismas enfermedades de transmisin sexual
en varones, se deberia coger un exudado uretral o una muestra de la primera mic
cin, dependiendo del mtodo que se use para detectarlo. Lo ideal es que los exudado
s uretrales se recojan por lo menos dos horas despus de que el paciente haya micc
ionado. Las muestras para Neisseria gonorrhoeae son las primeras que se obtienen
. Las condiciones en funcin del tipo de torunda y transporte son las mismas que l
as descritas para muestras endocervicales, aunque se usan torundas genitales que
son ms pequeas. La torunda se inserta en la uretra 2 cm-4 cm, se rota en un senti
do durante 5 segundos, se retira y se coloca en un medio de transporte adecuado,
o se usa
para preparar extensiones para una tincin fluorescente directa de anticuerpos par
a detectar Chlamydia trachomatis o con tincin Gram para diagnosticar gonorrea (la
deteccin de diplococos gramnegativos mtracelulares en una extensin uretral de hom
bres sintomticos nos proporciona un diagnstico de presuncin). Vesculas. Las muestras
de lesiones vesiculares en los genitales se recogen para confirmar la infeccin p
or VHS. El lquido de la vescula se aspira con una aguja de pequeo calibre en una je
ringa de tuberculina. Si slo hay presente una vescula pequea, se corta y la base se
raspa con una torunda Dracon o un depresor para asegurarse de que recogemos las
clulas. El liquido de la vescula o el exudado debe llevarse en un medio de transp
orte adecuado y analizado para cultivo convencional El VHS tambin se puede detect
ar directamente en la muestra por tincin directa de las extensiones, pero es meno
s sensible que los cultivos, y si es negativo, deberia hacerse un cultivo. Para
hacer una extensin, las clulas recogidas con el depresor o torunda Dracon se extie
nden en el porta de cristal y se fija el material con acetona. Hay que teir la mu
estra con el tinte Papanicolau, Wright o Giemsa para detectar los cambios citopti

cos tpicos (Fig. 57-5). tintes que no distinguirn entre VHS o el virus varicela zst
er. o con anticuerpos monoclonales. lceras. El material de las lceras genitales se
recoge para identilicar el patgeno responsable; VHS. Haemophilus ducrey. Treponem
a pallidum. Chlamydia trachomatis (serogrupos L,, L,, L ) y Calymmatobacterium g
ranulomalis deberan ser considerados en el diagnstico diferencial. El protocolo de
recogida, transporte y anlisis de las lesiones ulcerativas para detectar el VHS
es el mismo que para las vesculas. En general, la sensibilidad de los test direct
os descritos antes y la recuperacin de virus son ms bajas en lesiones ulcerativas.
3
Si hay sospecha de infeccin por Haemophilus ducrey, el material de la base de la lc
era se recoge con dos torundas Dracon o algodn, se lleva en un medio de Stuart mo
dificado al laboratorio y se deja en una habitacin a temperatura ambiente hasta q
ue se analice. Una muestra se utiliza para preparar una extensin para teir con Gra
m. Si observamos muchos bacilos gramnegativos pleomrficos y cocobacilos organizad
os en grupos o cadenas, es sugerente de H. ducrey. Sin embargo, el cultivo es ms s
ensible y es necesario para confirmar. El segundo exudado se inyecta en un medio
especial. Las espiroquetas de Treponema pallidum pueden detectarse en los genit
ales u otras lesiones, pero la sfilis por lo general se diagnostica serolgicamente
. Deberan llevarse guantes cuando se manejen muestras obtenidas de estas lesiones
. Para recoger las muestras, se limpia la superficie de la lesin (si hay varias l
esiones, se debe recoger la ms reciente) con suero salino y se deja secar, y se q
uitan las costras si las hubiera. Raspamos la lesin superficialmente hasta que sa
ngre un poco y aplicamos una presin pequea en la base. El exudado se recoge de la
superlicie tocando el liquido con un porta de cristal o usando una pipeta capila
r y pasando el liquido a un porta de cristal. Se pone un cubreportas y la muestr
a se examina inmediatamente al microscopio de campo oscuro. Otro modo es aspirar
el material con una aguja de un calibre de 26 de la base, y despus se mete una g
ota de salino en la aguja. El material se extiende en un porta de cristal, se cu
bre con un cubreportas y se examina inmediatamente al microscopio de campo oscur
o. Las espiroquetas de T pallidum tienen de 10 pm a 13 pm de longitud y 0,15 pm
de ancho, tienen una cola ancha y regular y son puntiagudas al final. Los serogr
upos L,, L^, L, de Chlamydia trachomatis pueden detectarse por cultivo de clulas
en una biopsia de la lesin ulcerada o del material celular recogido de quitar pri
mero cualquier exudado de la lesin y despus girando la torunda (en un palo de plsti
co) contra la base. El transporte y anlisis de las muestras son iguales que para
los exudados endocervicales. Para una deteccin ideal de Calymmatobacterium granul
omatis. se biopsia un tejido de una zona de granulacin activa e inmediatamente se
transporta al laboratorio en un recipiente estril y seco, o en uno que contenga
una pequea cantidad de salino sin conservantes. Las extensiones se preparan de un
trozo de tejido aplastado y se tien con Giemsa o tinte de Dieterle. El diagnstico
se basa en encontrar C. granulomatis caractersticos encapsulados dentro de los m
acrfagos.
Figura 57-4. Clulas clave" en una extensin de una muestra vaginal. (Tincin Papanico
lau. 400x.) (Por cortesia de Vicki J. Schnadig. M.D., Departamento de Patologa, U
niversidad de Texas. R a m a Mdica. Galveston. TX.)

1266
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA que llevar la muestra a un laboratorio de referencia, se recomi

enda aadir un conservante, como fosfato tamponador 0.03M. mezclado con un volumen
igual de glicerol. El anlisis de las muestras de heces, o los exudados rectales
para bacterias, se basa en el organismo o grupo de organismos que esperamos que
estn presentes. Las muestras que se reciben para un cultivo bacteriano ordinario
deben analizarse de modo que se pueda encontrar Shigella, Salmonella y Campyloba
cter jejuni/coli. En las instituciones peditricas, tambin sera razonable de modo si
stemtico buscar Aeromonas. Las muestras se colocan directamente en un medio adecu
ado (vase Cap. 50); de manera alternativa, para detectar C. ejuni/coli. la muestra
se puede filtrar utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,65 pm. y deja
r el filtro en un agar sangre de oveja brcela o agar chocolate. Las especies de A
eromonas crecen en el medio utilizado habitualmente para el cultivo de bacterias
de las heces, o de los exudados rectales, pero utilizar un medio selectivo (cef
sulodina-irgasn-novobiocina [CIN] que contenga 4 mg/l de cefsulodina mejor que el
tpico agar sangre de oveja con 10 mg/l de ampicilina) incubado a 25 C-30"C puede
aumentar la eficiencia del screening.
C
Figura 57-5. Clula giganle mullinucleada con inclusiones inlranucleares por virus
herpes simple en una extensin de clulas endocervicales. (Tincin de Papanicolau, 40
0x.) (Cortesa de Vcki J. Schnadig, M.D. Departamento de Patologa. Universidad de Te
xas, R a m a Mdica. Galveston. TX.)
HECES
Las heces y, en algunos casos, los exudados rectales son tiles para determinar el
agente etiolgico de la diarrea infecciosa o intoxicacin alimentaria, confirmando
el diagnstico de botulismo, diagnosticando infecciones causadas por adenovirus, e
nterovirus, algunos patgenos de transmisin sexual, protozoos intestinales y helmin
tos y, en algunos casos, helmintos de los tractos respiratorio y biliar. La reco
gida, el transporte y el anlisis de estas muestras son diferentes para virus, bac
terias y parsitos, y se explican ms adelante para cada grupo. Se prefieren las hec
es para detectar adenovirus, enterovirus y los virus responsables de la gastroen
teritis. Las muestras se recogen en un recipiente limpio de tapa ancha. Si no pu
ede obtenerse una muestra de heces, se inserta una torunda a travs del esfnter ana
l, se gira, se saca y se coloca en un medio de transporte viral que contenga age
ntes microbianos. Cualquiera de las muestras debe llevarse pronto al laboratorio
, si no se pudiera, tiene que meterse un rato en el frigorfico y debe llevarse en
hielo hmedo. Si hay que enviar la muestra a un laboratorio de referencia, debe a
lmacenarse a -70C y tiene que transportarse en hielo seco. Se recomienda el culti
vo celular para detectar adenovirus y enterovirus, aunque el test de ELISA es vli
do para detectar adenovirus. Los rotavirus son los responsables de la mayora de l
as gastroenteritis virales y los nicos virus que se asocian con gastroenteritis,
y que se detectan en muchos laboratorios virales. Lo ms corriente es que los rota
virus se detecten por ELISA; los equipos de aglutinacin de ltex tambin son vlidos, p
ero parece que son menos sensibles (Christensen, 1989). Las muestras se analizan
segn las indicaciones del fabricante. El examen directo de las muestras de heces
en el microscopio electrnico es el mtodo de referencia para detectar los rotaviru
s y es el que ms se usa para detectar calicivirus, astrovirus. el virus Norwalk y
los virus similares al de Norwalk. Las heces tambin se prefieren para detectar l
as bacterias responsables de la diarrea infecciosa, aunque un exudado rectal es
una alternativa vlida. Las muestras de heces tienen que recogerse en un contenedo
r limpio y de tapa ancha, y la muestra no tiene que contaminarse con orina, bari
o o papel higinico, Los exudados rectales, que se obtienen como se ha descrito an
tes para los virus, se colocan en un sistema de transporte de tubo que contenga

medio Stuart modificado. Ambos tipos de muestras deben transportarse rpido al lab
oratorio y ser analizadas lo antes posible, porque la bajada del pH que se produ
ce cuando las heces se enfran puede inhibir el crecimiento de algunos patgenos, es
pecialmente Shigella. Si el retraso es inevitable, o hay
La prevalencia de la gastroenteritis causada por la shiga productora de toxinas
(enterohemorrgica) Escherichia Coli (STEC), Yersinia enterocolilica, Vibrium chol
erae u otras especies de Vibrio o Plesiomonas shigelloides es baja en la mayor p
arte de EE.UU.; por tanto, las peticiones especficas para detectarlo son ms eficie
ntes. Como mnimo, las muestras de heces sanguinolentas deben analizarse para dete
ctar la STEC, Para detectar la STEC, la muestra de heces podra inyectarse en agar
sorbitol-MacConkey (que contiene un 1% o-sorbitol en lugar de lactosa), que es
un medio que diferencia las STEC de manera aislada, las que no fermentan en sorb
itol, de casi todas las coli. que son sorbitol-positivas. Un mtodo ms sensible que
el cultivo para delectar STEC es la deteccin de toxina en las heces o en las hec
es filtradas (Kehl, 1997). Cuando se pide aislar Yersinia enterocolilica. el aga
r CIN se inyecta y se incuba a una temperatura ambiente. El organismo tambin pued
e recuperarse inyectando un medio tpico para el cultivo bacteriano ordinario (vase
Cap. 50). La placa MacConkey se incuba a 35'C las primeras 24 horas y despus a t
emperatura ambiente durante otras 24 horas; las colonias de Y. enterocolilica so
n moradas y del tamao de una cabeza de alfiler. Las especies de Vibrio con frecue
ncia crecen en el medio que se utiliza habitualmente. pero para recuperarlas mej
or se inyecta agar citrato tiosulfato sales biliares sucrosa (TCBS) y agua alcal
ina (para enriquecer). Plesiomonas shigelloides tambin crecen en los medios usado
s para cultivos ordinarios, pero como ms del 30% de P. shigelloides se aislan en
lactosa fermentada, las colonias no se diferencian lo suficiente para reconocerl
as en este medio, y hacer un screening de todas las colonias no es rentable. Por
esta razn, el cultivo de heces o exudados rectales para P. shigelloides debe sol
icitarse de manera especfica. El uso de un medio selectivo-diferencial agar inosi
tol sales biliares verdes brillantes es recomendable, pero no es imprescindible.
Los exudados rectales que vayan dirigidos a detectar Chlamydia trachomatis se c
olocan en un medio de transporte y se llevan rpido al laboratorio, o se dejan un
rato en el frigorfico. Los exudados recogidos para diagnosticar gonorrea se trata
n como se ha dicho antes para las muestras endocervicales. Las muestras de heces
o el contenido gstrico recogido de personas con un perodo de incubacin corto de un
a intoxicacin alimentaria deberan analizarse para Staphylococcus aureus y Bacillus
cereus. El anlisis incluye la preparacin y examen de las extensiones teidas con Gr
am y cultivadas. Como los dos organismos pueden estar presentes normalmente en l
a comida, hay que hacer varios cultivos. Se hacen una serie de diluciones de la
muestra (10 , 10' , 10' , 10* y 10' ) y se preparan en diluyente de gelatina tam
ponada, y 0,1 mi de la muestra sin diluir y cada una de las muestras diluidas se
colocan en colistina cido naldixico o agar sangre alcohol feniletilico (selectivo
para organismos grampositivos). Adems, para mostrar la produccin de endoesporas d
e B. cereus, se mezcla 1 mi de la muestra original con 1 mi de etanol puro, y la
mezcla se deja una hora a temperatura ambiente. Las diluciones de la muestra se
preparan como se ha dicho antes, y 0,1 mi de cada una, de la muestra diluida y
de la de sin
1 2 3 5

CAPTUIO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EI DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1267
diluir, se colocan en agar sangre de oveja. Todas las placas se incuban a 35"C-3
7"C durante 18-24 horas y se cuentan las colonias. La presencia de 10'' CFU ms de
S. aureus o B. cereus por gramo de muestra es significativa, especialmente si s
e encuentra en la mayoria de los individuos afectados. El diagnstico clnico de bot
ulismo alimentario y botulismo infantil tiene que confirmarse detectando Closridi
um botulinum. la toxina botulinica o ambos en las heces. Lo ideal sera recoger 25
ml-50 mi de heces. 15 ml-20 mi de suero y una muestra del alimento sospechoso.
La mayoria de los laboratorios no estn equipados para analizar las muestras de pe
rsonas con sospecha de botulismo. En EE.UU., cuando se sospecha un caso de botul
ismo se debe notificar a los investigadores del CDC. asegurar el diagnstico, el t
ratamiento e investigar una epidemia potencial. Las enfermedades asociadas con C
losridium dillicile. tales como colitis seudomembranosa y diarrea por antibiticos,
estn producidas por las toxinas que produce el organismo y se diagnostican detec
tando la toxina A y B o ambas en heces. Ei mtodo de referencia para detectar la c
itotox m a es el ensayo de cultivo celular. Deben recogerse 25 g (25 ml-50 mi) d
e heces lquidas en un recipiente limpio de tapa ancha, y tiene que llevarse inmed
iatamente al laboratorio. La muestra debera analizarse dentro de las dos horas de
la recogida o dejarla almacenada en el frigorfico. Para extraer la toxina, aclar
amos la muestra de heces por centrifugacin a 2.000 x g durante 20 minutos o a 10.
000 x g durante 10 minutos, y se filtra a travs de una membrana de 0,45 pm. Se pr
eparan varias diluciones y se inyectan a una monocapa de clulas, que se incuban d
urante 24-48 horas. Por otra parte, la toxina A o ambas toxinas, la A y la B, de
ben detectarse en las muestras de heces por ELISA. Esta tcnica parece ser tan sen
sible como el cultivo celular y nos proporciona resultados en pocas horas (Merz,
1993; Whittier, 1993). La sensibilidad de los diferentes test de ELISA comercia
lizados sin embargo vara (Lyerty, 1998; Fedorko, 1999). Un test de aglutinacin de
ltex es vlido, pero no da resultados fiables (Lyerly. 1988). Para estudios epidemi
olgicos, C. dillicile tiene que aislarse en las heces o exudados rectales ponindol
o en un sistema de transporte anaerbico. Como hay muchas bacterias en las heces,
hay que utilizar procedimientos selectivos para C. dillicile. La muestra de hece
s se diluye en gelatina tamponada (se recomienda 1:200). y ambas muestras, la di
luida y la no diluida, se inyectan en un medio selectivo para C. dillicile. como
el agar cicloserina cefoxitina fructosa yema de huevo (CCFA), y se incuban anae
rbicamente 48 horas. C. dillicile tambin puede aislarse de otras formas, por ejemp
lo, con el mtodo de seleccin del alcohol, como se describe para Bacillus cereus. e
xcepto que las muestras se ponen en un medio selectivo como el CCFA y se incuban
anaerbicamente. Closridium pedringens es una de las causas de una intoxicacin alim
entaria de larga incubacin (7-15 horas despus de tomar la comida contaminada); tam
bin puede causar la diarrea asociada a antibiticos, que es tpica en pacientes ancia
nos hospitalizados, y enteritis necrotizante. Para diagnosticar una intoxicacin a
limentaria causada por C. pedringens tienen que hacerse varios cultivos de heces
y transportarse en un medio anaerbico El material fecal, tanto el que est tratado
con etanol como el que no est tratado, se diluye como se ha dicho antes para det
ectar las bacterias asociadas a una intoxicacin alimentaria de periodo de incubac
in corto. Las placas de agar de alcohol leniletlico se inyectan y se incuban anaerb
icamente durante 48 horas. Un recuento de esporas de 10 o ms por gramo de heces p
uede ser significativo, sobre todo si se encuentran en las muestras de la mayori
a de los individuos. La toxina tiene que detectarse en la muestra de heces origi
nal, pero este test por lo general se realiza en los laboratorios de referencia.
Un criterio similar se utiliza para diagnosticar la diarrea producida por C. pe
dringens durante el tratamiento antibitico.
5

Lo ideal para el diagnstico de parsitos en el laboratorio es el examen de las mues

tras de heces para protozoos, parsitos y huevos de helmintos o larvas. Los labora
torios que realicen esos test deberan tener las condiciones adecuadas para maneja
r las muestras fecales y un buen microscopio con una escala para medir los organ
ismos encontrados. Para identificar los protozoos intestinales, tambin se requier
e teir las extensiones fecales. La muestra (que por lo general la recoge el pacie
nte) puede recogerse sin tenerla que fijar, y se llevar al laboratorio si se pide
n estudios bacterianos y de parsitos. La muestra de heces reciente debe colocarse
en un contenedor limpio, seco y de tapa ancha. No debe recogerse de la taza del
bao y no debe contaminarse con orina, aceites, componentes antdarreicos o contrast
e radiolgico. Una vez recogida, la muestra tiene que llevarse inmediatamente al l
aboratorio. Primero se hacen los estudios bacteriolgicos, despus la muestra se pas
a al personal que hace los test parasitolgicos, preferiblemente dentro de los 3060 minutos despus de recoger la muestra. Los retrasos en el anlisis dan como resul
tado la degeneracin de trotozoitos de Entamoeba histolytica, que es el nico parsito
por el que se requiere que la muestra sea reciente. Como es posible adquirir un
a infeccin en el laboratorio, se ha cuestionado el uso de muestras frescas para e
l examen parasitolgico. Si la muestra fecal se ha recogido slo para detectar parsit
os, puede fijarse a la vez que se recoge. La muestra se lleva al laboratorio cua
ndo la persona pueda, y el anlisis se hace segn la rutina del laboratorio. Hay var
ios equipos disponibles comercialmente para la recogida y transporte de las mues
tras fecales; la mayora tienen dos viales, uno con fijador (formalina) para trofo
zoitos y quistes, y otro con un fijador (solucin de Schaudinn) ms alcohol pohvinil
o (PVA) para preparar las extensiones para teir. La pregunta de cuntas muestras so
n necesarias para identificar a todos los individuos con protozoos intestinales
y helmintos an no tiene respuesta. Para el diagnstico de amebas, se recomienda que
se recojan como mnimo tres muestras en tres das diferentes y que se analicen (Pro
ctor, 1991). Para disminuir el coste, los mdicos deben pedir el anlisis de u n a m
uestra slo, porque cerca del 90% de las infecciones se diagnostican en la primera
muestra (Montessori. 1987). Si no se encuentra ningUn parsito en la primera mues
tra, se debe pedir una segunda o tercera. Si se reciben dos o ms muestras al mism
o tiempo recogidas en das diferentes, deben evaluarse como una sola (Peters, 1988
). Los exmenes de heces de pacientes que han estado ingresados ms de tres das no so
n tiles (Siegel, 1990). El anlisis de las muestras lecales para parsitos incluye pr
eparar una solucin salina y de yodo (Lugol) y teir las muestras frescas que se han
recogido recientes (p. ej., aquellas que pueden analizarse dentro de las pocas
horas de su recogida). A esto le sigue la concentracin de quistes y huevos de hel
mintos y. al final, la preparacin de extensiones para teir con el tinte tncromo. L
as preparaciones frescas, de realizarse, deberan analizarse y prepararse antes de
hacer la concentracin y el tinte tricromo. Si el diagnstico est claro con el anlisi
s de la muestra fresca (p. ej el diagnstico de giardiasis cuando encontramos Giard
ia en la muestra fresca), no es necesario hacer las otras pruebas. Sin embargo,
en muchos laboratorios no se analizan las muestras frescas, porque cuando las re
ciben ya no estn frescas. La extensin fecal estndar, que tiene cerca de 2 mg de hec
es, se hace de una muestra fecal reciente del siguiente modo: se coloca una gota
de salmo en un porta de cristal limpio: con un depresor se coge un poco de las
heces y se mezcla con el suero salino con movimientos circulares (hasta que haya
bastante muestra disuelta), y la mezcla se tapa con un cubreportas cuadrado de
22 mm. Una muestra est bien preparada si la dejamos encima de un pequeo papel escr
ito y podemos leer a travs de la extensin lo que hay escrito. La extensin que teimos
con yodo la preparamos de la misma manera. Las dos preparaciones frescas, la de
la solucin salina y la de la solucin yodada, pueden hacerse en el mismo porta de
cristal, a la vez. mezclando las heces primero con suero salino y despus con yodo
. La extensin de solucin salina nos mostrar protozoos y quistes de protozoos, adems
de los huevos de helmintos y larvas. En la extensin teida con yodo no encontraremo
s Irofozoitos, porque el yodo los destruye, salvo que la muestra se haya fijado
primero. La principal ventaja de la
En relacin con el cultivo bacteriano, las muestras de heces, por lo general, se d

estinan para aislar Mycobaclerium avium complex (principalmente de pacientes con

sida), pero tambin se pueden aislar Mycobaclerium tuberculosis y otras especies
de Mycobactehum. Analizar la muestra (de 1 g a 2 g de heces formadas o 5 mi de h
eces liquidas) incluye la descontaminacin y concentracin, preparacin de extensiones
y la inoculacin de medio como se coment en el Captulo 53.

1268
SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA ser primarias (p. ej., las causadas por virus. Bacillus anthrac
is. Corynebacterium diphtheriae, Francisella lularensis, Pseudomonas aeruginosa,
micobacterias u hongos) o lceras por decbito, que pueden ser colonizadas o infect
adas con bacterias aerbicas y anaerbicas. La recogida, el anlisis y el transporte d
e los exudados de lceras cutneas para detectar virus son idnticos a los descritos a
nteriormente para vejigas y pstulas. El manejo de las muestras de lceras cutneas es
diferente para hongos y bacterias, y se explica de modo separado para cada uno
de los organismos que causa lesiones primarias y para las bacterias asociadas co
n lceras crnicas. Bacillus anthracis causa ntrax, una enfermedad rara en EE.UU.: se
limita a personas que trabajan con lana importada bruta y otros productos anima
les contaminados con esporas de B. anthracis. El ntrax cutneo comienza con una ppul
a y un dolor, que se convierte en vesicular, despus hemorragia, necrtica, y se cub
re con una escara. Para un diagnstico adecuado, se recogen dos exudados: uno para
cultivos y el otro para preparar extensiones para teir con Gram y anticuerpos fl
uorescentes (esto ltimo debe hacerse en un laboratorio de referencia). Debido a l
a naturaleza peligrosa de B. anthracis. debe considerarse si se mandan las muest
ras de una persona sospechosa al laboratorio. Si las muestras se analizan en el
laboratorio, tienen que manejarse en una cabina de seguridad. El exudado que se
va a cultivar se inyecta en un agar sangre de oveja y se deja incubndose a temper
atura ambiente. Corynebacterum diphtheriae es el causante de la difteria cutnea, q
ue es una lesin ulcerativa que se cubre con una capa de tejido necrlico que semeja
a una membrana. Para hacer un diagnstico real, se prepara una extensin con materi
al del borde de la membrana, se tie con azul de metileno y se recogen dos exudado
s de la membrana. Una muestra se utiliza para cultivo ordinario y la otra para i
nyectar en un medio de cultivo adecuado para C. diphtheriae (expuesto anteriorme
nte en muestras de la garganta). El ectima gangrenoso es una lesin cutnea ulcerati
va que casi siempre se produce cuando hay acteriemia por Pseudomonas aeruginosa,
pero rara vez se desarrolla cuando existe bacteriemia por otros bacilos gramnega
tivos. Lo ideal es recoger dos muestras de la base de la lcera: una se utiliza pa
ra preparar una extensin con tincin Gram y la otra para inyectar en medio de culti
vo. Para hacer el diagnstico de la forma lcero-glandular de tularemia es necesario
recoger dos exudados de material de la base de la lcera. Uno para cultivo ordina
rio y el otro para detectar Francisella lularensis, o para enviarlo a un laborat
orio de referencia. Las micobacterias que podemos aislar son: Mycobacterium tube
rculosis. Mycobacterium avium complex. Mycobacterium kansasii. Mycobacterium lor
tuitum-cheionae. Mycobacterium marinum, Mycobacterium haemophilum y Mycobacteriu
m ulceraos. El exudado recogido con aguja y jeringa es vlido para recuperar las m
icobacterias. Para transportar el material, se mete dentro de un tubo estril, que
se cierre bien, y se lleva pronto al laboratorio. No es recomendable recoger el
exudado con una torunda de algodn, porque las micobacterias se quedan atrapadas
en las fibras y es difcil sacarlas. Las muestras tienen que guardarse en el frigo
rficopoco tiempo hasta que sean analizadas (vase Cap. 53). Muchas bacterias aerbica
s, facultativas, y anaerbicas colonizan las lceras cutneas crnicas, Para identilicar
el organismo responsable, el cultivo de los tejidos profundos o una aspiracin pr
ofunda de material purulento recogido con aguja y jeringa nos proporciona la inf
ormacin bacteriolgica ms til. Para transportar el pus aspirado, lo colocamos en un t
ubo estril, lo tapamos bien y se lleva inmediatamente al laboratorio. El proceso
de la muestra incluye preparar una extensin para teir con Gram e inyectar en el me
dio adecuado para cultivo de aerobios y anaerobios. Para detectar hongos, basta
con un exudado del margen activo de la lcera (el transporte es como para las bact
erias). El exudado con torunda de algodn es vlido, aunque debera descartarse esta p
rctica. Analizar las muestras para detectar hongos incluye preparar una extensin p
ara examen microscpico directo (preparacin de hidrxido de potasio o los lintes seala
dos para las muestras de vesculas y pstulas) y la inyeccin en un medio de cultivo a

decuado, tal como infusin cerebro-corazn, inhibidor de moho o agar Shabi, que cont
iene antibiticos y cicloheximna.
extensin teida con yodo es que permite visualizar mejor algunas caractersticas de l
os quistes. La solucin salina permite ver el movimiento de los trofozoitos. que e
s til para identificarlos. Para preparar las muestras frescas del material fijado
con formalina, los contenidos se mezclan bien y se coloca una gota directamente
en el porta y en una gota de solucin yodada. El examen de la extensin hecha con s
almo se hace con un aumento medio (objetivo de 10x) al principio. Empezando por
el vrtice superior izquierdo, movemos el porta horizontalmente. de derecha a izqu
ierda. Repetiremos esta operacin hasta que terminemos de ver los 22 mm del porta.
Debemos ver todos los huevos de helmintos, larvas y quistes de protozoos. El ex
amen con el objetivo de gran aumento se har despus para detectar e identificar los
protozoos, mirando aleatoriamente durante unos 5-10 minutos para cada preparacin
. La tcnica para la concentracin, que puede hacerse tanto en muestras frescas como
fijadas, es muy til porque permite el enriquecimiento de muestras con un nmero ba
jo de organismos. El mtodo ideal para un examen ordinario es la concentracin con te
r-formaiina, que se ha hecho ms segura por el uso de etil-actico que con el ter-die
til. El tinte permanente de la extensin fecal para el diagnstico de infeccin por pr
otozoos intestinales se considera el patrn de buena prctica en los laboratorios de
Amrica del Norte. Los tintes se hacen en las extensiones preparadas con un pequeo
cepillo mojado suavemente en solucin salina y se fijan en solucin Schaudinn antes
de secarse. Las extensiones se hacen tambin de muestras recibidas fijadas en PVA
: utilizando un depresor de madera, colocamos unas gotas de muestra en el porta,
asegurndonos de que la pelcula toca los bordes del porta, para evitar que se caig
a mientras se tie. y ocupa la mitad del porta. Despus de que la pelcula se seca com
pletamente a temperatura ambiente, se tie. Ciertos parsitos intestinales, como Cry
ptosporidium, Microsporidium y Cyctospora, requieren tintes especiales para dete
ctarlos, como se ha visto en el Capitulo 55.
PIEL Y LESIONES SUBCUTNEAS
Vejigas, bullas y pstulas. El liquido de una vejiga o una bulla puede extraerse c
on una aguja y una jeringa, y puede inyectarse este lquido a un tubo estril. Tambin
se puede recoger una muestra de las vesculas y las bullas cortando la bulla y fr
otando la base con una torunda. Las muestras de las pstulas se recogen de modo si
milar, con una torunda quitando las costras que haya. Como mnimo hay que recoger
dos exudados para preparar las extensiones para teir. Sin embargo, si lo que pide
n es buscar ms de un grupo de organismos (p. ej., virus y bacterias, o bacterias
y hongos), lo ideal es recoger al menos tres exudados. Ante una sospecha de infe
ccin viral, la persona que recoge la muestra debe preparar una extensin en ese mis
mo lugar, pasando la torunda por todo el porta y dejndolo secar al aire. Todas la
s muestras tienen que colocarse en unos tubos para el transporte que contengan m
edio Stuart modificado. Sin embargo, si se pide una anlisis para virus, se recomi
enda colocar una torunda en un medio de transporte viral; y si se pide un cultiv
o anaerobio, la torunda debe colocarse en un medio de transporte anaerobio. Los
exudados y extensiones tienen que llevarse inmediatamente al laboratorio. El anli
sis de las muestras de vejigas o pstulas para detectar virus incluye un cultivo c
elular, y para el virus varicela zster, y posible VHS. ayuda tambin el examen de l
as extensiones teidas. Las muestras para cultivo se dejan en el frigorfico hasta q
ue vayan a analizarse. El lquido que sacamos con la jeringa de una vejiga, que se
recibe en medio de transporte viral, y los exudados, que se reciben en medio de
transporte viral, se agitan en la mezcladora y se saca la torunda. El anlisis de
las muestras para detectar bacterias y/u hongos incluye preparar una extensin pa
ra teir con Gram (para bacterias) o tinte de plata, calcoflor blanco o rojo Congo
(para hongos) e inyectar en un medio de cultivo adecuado, como se explica en los
Captulos 50 y 54. lceras cutneas. Las muestras que se recogen de las lceras cutneas,
exudado o aspirado, son para estudios microbiolgicos. Las lesiones pueden

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1269
Heridas infectadas y abscesos. Lo ideal es aspirar el material purulento con agu
ja y jeringa y transportarlo como se ha dicho para las lesiones ulcerativas. Si
no se puede aspirar de la herida, es vlido un exudado recogido de la parte prolun
da de la lesin. Para el cultivo ordinario, nos valen dos muestras; una para prepa
rar una extensin y teir con Gram y otra para cultivo. Para encontrar anaerobios, d
ebe recogerse un exudado ms y ser colocado en un sistema de transporte anaerobio.
Todas las muestras tienen que llevarse pronto al laboratorio y ser analizadas l
o antes posible. Si el retraso es inevitable, hay que poner las muestras en el f
rigorfico- excepto las de anaerobios, que hay que dejarlas a temperatura ambiente
.
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S E C C I N
V I
Patologa molecular
Chester J. Herman, M.D., Ph.D. John Bernard Henry, M.D.

CAPTULO
58
Introduccin a la patologa molecular
Chester J. Herman, M.D., Ph.D. John Bernard Henry, M.D.
REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD FARMACOGENMICA Y TERAPIA GNICA ANLISIS DE DATOS
1273 1273 1274
GARANTA DE CALIDAD BIBLIOGRAFA
1274 1274

Hace algunos aos, la revista Time public un reportaje con una ilustracin en portada
del viejo simboto de la profesin mdica, el caduceo, transformndose en una doble hli
ce de ADN. y encima el titulo "El Futuro de la Medicina'. Articulos como este, e
n la prensa de informacin general, son un ejemplo de cmo el pblico no profesional r
econoce lo que la profesin mdica sabe desde hace algn tiempo que los avances de la
biologa molecular y de la gentica estn transformando todas la reas de la medicina, y
que estos avances aumentarn y se comedirn en el paradigma predominante de la cien
cia mdica en el siglo xxi. La patologa se encuentra ahora a la vanguardia de esta
transfonvacin. Las tcnicas moleculares ya han revolucionado, en muchas reas, los di
agnsticos de laboratorio y han ampliado enormemente los horizontes para ejercer l
a patologa social y la acadmica. La revolucin es tan global y tan profunda como lo
es el ltimo gran avance de la patologa, la inmunobiologia. ya que las tcnicas molec
ulares se aplican a todas las secciones del laboratorio. Y lo que es ms impoante.
prometen liberar a la anatoma patolgica de su dependencia de los anlisis morfolgicos
. El advenimiento de esta nueva tecnologa, aunque quizs intimide a algunos patlogos
de formacin clsica, debera ser bienvenida por su conmocin cientfica intrnseca, por s
promesa de rejuvenecer la prctica de la patologa tradicional y de lanzarla hacia
nuevas direcciones, y por su autntico potencial para hacer que la patologa sea la
especialidad mdica preeminente en la nueva era de la medicina molecular, segn avan
zamos en el nuevo milenio. /Adaptado con el permiso de Wayne W. Grody. M.D.. Ph.
D.) La patologa molecular se aplica a los anlisis de los cidos nucleicos para diagn
osticar enfermedades, para predecir el pronstico de la enfermedad, conducir la te
rapia y para evaluar la susceptibilidad a la enfermedad antes de que sta se haga
evidente. A pesar del poder de las tcnicas patolgicas moleculares y del hecho de q
ue proporcionan nuevos puntos de vista, que antes eran imposibles, stas son compl
ementarias a los anlisis tradicionales del laboratorio, no una sustitucin en la ma
yoria de las aplicaciones. Las aplicaciones significativas y las interpretacione
s seguras de la mayora de las tcnicas moleculares requieren que stas se establezcan
sobre una base firme de aplicacin de las determinaciones bien establecidas del l
aboratorio. Quiz, el mejor ejemplo de que estas lcnicas son complementarias es el
hecho de que se deben emplear las tcnicas morfolgicas, la histopatologia y la cito
patologia para garantizar que los lejidos y las clulas apropiadas se analizan mol
ecularmente. De otro modo, el anlisis de lo que no sean tejidos o clulas diana pue
de conducir y conducir a resultados errneos y, a veces, a engaos peligrosos, a pesa
r de los mtodos tcnicos de alta calidad, que se interpretan con pericia y experien
cia.
REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD
La disponibilidad de la secuencia del genoma humano y la identificacin de todos l
os genes humanos han cambiado rpidamente nuestra forma de entender la salud, la s
usceptibilidad a la enfermedad y los precursores, y la enfermedad (Pandey, 2000)
La capacidad para identificar el patrn de expresin gnica que hace nica la entidad d
e una enfermedad permite luego al patlogo definir especialmente enfermedades clnic
amente diferentes, que pueden ser difciles o imposibles de distinguir, basndose slo
en la morfologa o en otros datos del laboratorio (Heller, 1997; Golub, 1999). Ta

mbin se delmen, ms claramente, las relaciones entre las enfermedades, y a veces ca

mbian radicalmente, comparando los perfiles de expresin gnica de las enfermedades
(Anbazhagan. 1999). En la direccin opuesta, la secuenciacion de los genes causant
es de una enfermad y los anlisis de las mutaciones demuestran que las enfermedade
s tienen formes rustes no reconocidos previamente y que pueden incluir complejos
de sntomas leves que no se han reconocido previamente de lorma aislada como sntoma
s de la enfermedad. Un ejemplo convincente de este aumento tan acusado de los snt
omas de los que se compone la enfermedad es la fibrosis quistica (Friedman. 1999
). Adems de las disfunciones pulmonares y pancreticas, leves y agudas, que estn ace
ptadas desde hace mucho tiempo como fibrosis quistica, se han asociado ejemplos
aislados de la ausencia congenita bilateral de los vasos deferentes, la pancreat
itis crnica y las dolencias sinopulmonares a las mutaciones del gen de la fibrosi
s quistica (FCRT). Estas son mutaciones frecuentes no asociadas a la forma clsica
y aguda de la enfermedad. Reconocer que los complejos de sntomas expanden la def
inicin de las enfermedades sobre la base de las mutaciones de los genes, enfocar e
l tratamiento apropiado del paciente, en las formas ms leves o alpicas de la enfer
medad, y definir la patobiologia, no slo de los genes enteros sino tambin de los ex
ones y de los intrones especficos afectados.
FARMACOGENMICA Y TERAPIA GNICA
Los genes y las regiones no codificantes de los genomas tienen tales polimorfism
os que en el genoma humano 1 de cada 1.000 pares de bases (pb) aproximadamente e
s distinto entre individuos diferentes. La secuenciacin de partes del genoma demu
estra que algunos de estos polimorfismos estn en genes cuyas funciones son import
antes en la respuesta a la terapia de algunos pacientes individuales (Evans, 199
9). Los genes de las enzimas metabolizadoras de frmacos, activadores o mactivador
es. y los genes de ligandos y receptores pueden mostrar poliformismos que dismin
uyen o aumentan los efectos teraputicos o la toxicidad de los frmacos que ya son a
mpliamente

1274
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
de garanta de calidad son la estandarizacin de los mtodos y la comparacin de los res
ultados de los anlisis entre laboratorios. El National Committee for Clinical Lab
oratory Standards (NCCLS) ha publicado los mtodos estandarizados para realizar lo
s anlisis clnicos de patologa molecular ms comunes. La utilizacin de las directrices
del NCCLS garantiza que los datos generados en los laboratorios de patologa molec
ular son el estndar de una prctica excelente. La comparacin entre laboratorios de l
a realizacin de los anlisis la proporciona el College of American Pathologists (CA
P) (www.cap.org). Los exmenes de las comparaciones entre laboratorios del CAP inc
luyen las aplicaciones de la microbiologa molecular, de la gentica, de la hematolo
ga, de paternidad e identidad y de las forenses en general. Si el patlogo aplica l
os estndares de garanta de calidad y utiliza las tcnicas patolgicas conociendo a fon
do su fuerza y su debilidad, respectivamente, como se detalla en los siguientes
captulos, seguir capitalizando las oportunidades que ofrecen estas tcnicas para mej
orar la atencin al paciente y para comprender la patobiologia bsica. En resumen, l
a patologa molecular est penetrando e impregnando el laboratorio clnico en su conju
nto, igual que lo hizo la inmunopatologia hace dos dcadas. Se seguirn rompiendo y
disolviendo las barreras y los lmites sectoriales en esta transformacin de la medi
cina de laboratorio a travs del impacto de la nueva biologa de la medicina, "la bi
ologa celular y molecular".
utilizados; esto explica algunas respuestas de hipersensibilidad que no se conoca
n o que no eran previsibles con anterioridad. Segn se correlacionan e identifican
ms polimorfismos con la respuesta individual de los pacientes al tratamiento, el
patlogo necesitar perfilar los polimorfismos corrientes en los pacientes que empi
ezan una terapia para enfermedades frecuentes, como la diabetes, la hipertensin,
el cncer y las infecciones. La definicin del laboratorio de cada genotipo/fenotipo
individual de los pacientes determinar los frmacos especficos y las dosis adecuada
s para ese paciente. Esta evolucin sita al patlogo en una posicin ms definitiva para
determinar la terapia apropiada que el pronstico tradicional de la evolucin de la
enfermedad, basado en la morfologa de las lesiones o en las caractersticas del cul
tivo de los organismos infecciosos. Ms all de las alteraciones en genes individual
es, los patrones de sobre e infraexpresin de muchos genes definen un perfil relac
ionado, en algunas enfermedades, para responder o resistirse a las terapias espe
cificas. Adems, los genes afectados pueden no estar directamente relacionados con
las rutas metablicas involucradas en la terapia afectada (Bubendorf, 1999). Del
mismo modo, el laboratorio de patologa verifica el xito de la terapia gnica. Despus
de que se introduce un gen, el tejido en el que el gen debe ser activo tiene que
ser monitorizado para la expresin normal del gen introducido y para la (uncin y e
structura normales del producto gnico. Es muy importante sealar que el laboratorio
de patologa debe monitorizar tambin la integracin correcta de los genes transfecta
dos, de modo que la integracin permita la expresin normal del gen y no produzca un
a funcin y estructura anormales en los otros genes del paciente.
BIBLIOGRAFA
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ANLISIS DE DATOS
Para capitalizar al mximo el poder de la patologa molecular, se estn desarrollando
propuestas, completamente nuevas, para el anlisis de datos y para los datos relat
ivos a los tratamientos de las enfermedades. La investigacin patolgica de la enfer
medad y la biologa bsica han relacionado y analizado, tradicionalmente, slo uno o u
nos pocos marcadores, como los antgenos, las enzimas, las protenas estructurales y
cosas por el estilo. Las tcnicas moleculares producen datos de muchos miles de g
enes, tanto de sus expresiones como de sus secuencias. El procesamiento de todos
estos datos, organizarlos en perfiles de enfermedades o de pacientes, y el rela
cionar los diferentes perfiles exige nuevas propuestas de la bioinformtica. Estas
propuestas requieren tambin que el patlogo trabaje ms estrechamente con los matemti
cos y que aprenda a utilizar herramientas analticas ms sofisticadas que las utiliz
adas tradicionalmente (Bitner, 1999).
GARANTA DE CALIDAD
Como con todos los mtodos del laboratorio, es necesario contar con programas de g
aranta de calidad para asegurar que los resultados de la patologa molecular son ex
actos y tiles. Dos componentes esenciales de los programas

CAPTULO
59
Diagnsticos moleculares: tcnicas y principios bsicos
Elizabeth R. Unger Ph.D., M.D. Margaret A. Piper, Ph.D., M.P.H. BIOLOGA Y BIOQUMIC
A DE LOS CIDOS NUCLEICOS Estructura y composicin molecular Enzimas asociadas a los
cidos nucleicos Replicacin del ADN Transcripcin del ADN a ARN Modificacin postransc
ripcional Traduccin de ARN a protenas Control transcripconal Mecanismos de reparacin
del ADN Mutaciones del ADN ANLISIS DE LOS CIDOS NUCLEICOS Separacin electrofortica
Hibridacin del cido nucleico 1280 BIBLIOGRAFA 1286 Ensayos basados en los polimorfi
smos de la longitud de los fragmentos de restriccin RELACIN DE LA ENFERMEDAD CON L
A EVALUACIN DEL LABORATORIO Diagnstico molecular Ms all del diagnstico 1286 1275
Ensayos de hibridacin: componentes bsicos Formatos de ensayos de hibridacin Mtodos d
e amplificacin
Los cidos nucleicos son las molculas clave de la vida. El cido desoxirribonucleico
(ADN) reside en las clulas eucariotas y conserva toda la informacin necesaria para
la conservacin del organismo, y transfiere esa informacin a las generaciones suce
sivas. El cido ribonucleico (ARN) lleva la informacin del ADN al citoplasma de una
clula y dirige la sntesis de las protenas que se necesita para la funcin del organi
smo. De la estabilidad del ADN y de la duplicacin exacta del ADN y su traduccin a
proteina depende el estado de salud normal. La biologa celular moderna busca dete
rminar los mecanismos bsicos de la funcin y de la estructura de la clula, y los est
udios se enfocan cada vez ms a nivel del gen, las unidades del ADN que codifican
protenas. Como consecuencia de esto, los mtodos de diagnstico se dirigen tambin haci
a la evaluacin de los cidos nucleicos. El objetivo de esle capitulo es el de propo
rcionar la estructura conceptual para las aplicaciones diagnsticas de los anlisis
de los cidos nucleicos.
Estructura y composicin molecular
El ADN es una molcula polimrica de doble hebra (dsDNA). larga, que existe predomin
antemente en forma de doble hlice dextrgira. Cada molcula de ADN de una hebra (ssDN
A) est compuesta de un nmero pequeo de monmeros. El esqueleto del polmero del ssDNA e
s el azcar desoxirribosa. que est unida por grupos fosfato (Fig. 59-1A). Los enlac
es fosfodister entre el carbono 3' de un residuo de azcar y el carbono 5' del sigu
iente le dan al esqueleto su estructura invariable y su direccionalidad 5' a 3'.
Unida al carbono 1' de cada azcar est una de las cuatro bases posibles: la timina
(T) y la citosina (C) (pirimidinas); la adenina (A) y la guanina (G) (purinas).
Las bases pueden aparecer en cualquier orden secuencial y por eso forman la por
cin variable del ssDNA. Los monmeros del polmero de una hebra son los cuatro deoxir
ribonucletidos trifosfato (dTTP. dCTP dATP, dGTP). cada uno se compone de una bas
e, un trifosfato y una molcula de azcar. Durante la sntesis del ADN los nuclelidos s
e desprenden primero de dos grupos fosfato y luego se unen enzimticamente por dos
enlaces fosfodister para formar una cadena. El ADN es una molcula extraordinariam
ente estable que slo pierde su conformacin normal por altas temperaturas, por el p
H o en presencia de agentes desestabilizadores. La hlice de doble hebra es el est
ado ms energticamente favorable para el ADN. y el examen de los componentes del AD
N explica este hecho. El azcar y los grupos fosfato son hidroflicos, en solucin for
man enlaces de hidrgeno estables con las molculas de agua circundantes. Sin embarg
o, las bases son hidrofbicas y no son solubles en agua a un pH normal. Una molcula
estable de ADN debe asegurarse que las bases no entran en contacto con el agua.
Esto es posible cuando dos polmeros ssDNA antiparalelos (uno va en direccin 3 a 5
y el otro en direccin 5' a 3) giran alrededor del mismo eje. Esta ordenacin permi
te la formacin de los enlaces de hidrgeno planares entre la adenina y la timina y
entre la guanina y la citosina (Fig. 59-18). Mientras que las dos cadenas tienen
secuencias de bases en orden complementario, las
BIOLOGA Y BIOQUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS

La bioqumica de cidos nucleicos es muy importante para la biologa celular moderna y

dicta muchos aspectos de las aplicaciones diagnsticas. Muchas de las enzimas aso
ciadas con la reparacin, la degradacin y con la sntesis de cidos nucleicos in vivo s
e han convertido en herramientas bsicas del laboratorio para la manipulacin y el a
nlisis del ADN y del ARN. Los mecanismos celulares que actan para dirigir y contro
lar la traduccin, la transcripcin y la replicacin del ADN dirigen la biologa bsica de
la clula en la salud y en la enfermedad. La investigacin, el diagnstico y la terap
ia se dirigen, cada vez ms, al nivel molecular de la (uncin de la clula. Para compr
ender las aplicaciones diagnsticas actuales de la biologa molecular se necesita un
a visin general de los aspectos de la biologa y la bioqumica del cido nucleico, que
se describen en esta primera seccin. Hay ms detalles disponibles en los libros de
texto de biologa celular (Alberts, 1994).

1276
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
l'IKIMIIMWs
I'LKINAS
Citosina
Guanina
Figura 59-1. Estructura repetida de ADN y pares de bases complementarios. A. Una
cadena de ADN de una sola hebra. Las unidades de nucletidos reoetidas son unidas
por enlaces toslodister que unen al 5 -carbono de un azcar al 3 -carbono de la si
guiente. ('En el ARN el azcar es nbosa. que tiene un 2 -hidroxilo aadido a la deso
xirribosa). S. Bases de purina y de pirimidina y la lormacin de pares de bases co
mplementarios Las rayas sombreadas indican la formacin de enlaces de hidrgeno. ("E
n el ARN la timina es reemplazada por uracilo. que se diferencia de la timina en
que le falta el grupo metilo) (Adaptada y por cortesa de Piper MA, U n g e r ER:
N u c l e i c Acid Probes: A Primer lor Pathologists. Chicago, ASCP Press. 1989
.)
hebras de la hlice tienen una estructura parecida a una escalera con peldaos (pare
s de bases [pb]) de tamao consistente. La flexibilidad de los enlaces entre molcul
as de oxigeno y carbono en el enlace fosfodister permite que la escalera se enrol
le, formando una hlice regular, de modo que los pares de bases planares se quedan
apilados uno encima de otro y no dejan sitio intermedio para las molculas de agu
a. Las series polimricas de enlaces de hidrgeno en los pares de bases mantienen la
s cadenas de ssDNA fuertemente unidas, y la conformacin helicoidal protege a los
pares de bases del agua, quedando expuestos slo los esqueletos hidroflicos. El dsD
NA es estable sobre un lmite de pH de 4-9 aproximadamente. Las soluciones con pH
fuera de estos limites son capaces de romper los enlaces entre pares de bases y
pueden ser la causa de que la hlice de ADN se desnaturalice o se desenrolle en do
s rizos separados al azar. Tambin tienen el mismo efecto las altas temperaturas y
los disruptores de los enlaces de hidrgeno, como la formamida. La transicin de la
forma hlice a la form a rizo puede ser seguida espectrofotomtricamente a A (Fig.
59-2). A esa longitud de onda las bases absorben al mximo la luz ultravioleta, pe
ro a una absorbancia molar menor en el dsDNA: cuando el dsDNA se convierte en ss
DNA, la absorbancia aumenta de un 20% a un 30%. Debido a que a menudo se utiliza
la temperatura para efectuar esta transicin, a este proceso se le denomina fusin,
y a la temperatura a la cual se convierte el 50% del dsDNA en ssDNA se le llama
punto de fusin o T. del ADN. La T de las molculas de ADN depende del contenido de
pares de bases G-C frente a A-T relativo, ya que los tres enlaces de hidrgeno de
los pares de bases G-C precisan ms energa para romperse que los dos enlaces de hid
rgeno de los pares de bases A-T. Se puede revertir el proceso de tusin bajando la
temperatura, as las dos hebras complementarias pueden rehacer la hlice original si
se reforman los pares de bases en la conformacin lineal correcta.
26
matina) de forma altamente estructurada. La estructura del cromosoma incluye var
ios niveles jerrquicos de cromatina empaquetada, de un nucleosoma "como cuentas e
n un collar" (146 pares nucletidos enrollados alrededor de un ncleo de histona) a
asas altamente condensadas. cada una de las cules contiene alrededor de 100.000 p
b de ADN. Cada ncleo de clula humana contiene 23 cromosomas de longitud caractersti
ca y secuencia de pares de bases nica. Estos cromosomas juntos constituyen el gen

oma humano.
La longitud de una molcula de ADN eucaritica es mucho ms larga que la clula misma. E
l ADN purificado y no degradado forma una solucin viscosa astringente que refleja
la enorme longitud del ADN genmico (Fig. 59-3). Sin embargo, In vivo, el ADN se
organiza en unidades regulares, altamente compactas, que se llaman cromosomas. U
n cromosoma se compone de su hebra de ADN enrollada alrededor de protenas asociad
as al ADN (cro'Icmperaliira I (.')
Figura 59-2. Curva de anillamienlo y fusin del cido nucleico helicoidal de d o b l
e hlice. (Adaptada de Pioer MA. Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer lor Path
ologists. Chicago. ASCP Press, 1989, con autonzacion.)

CAPTULO 59

DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

1277
Tabla 59-2 E n z i m a s de cido nucleico y funciones asociadas Enzima F u n c i
n in vivo
Las polimerasas mantienen unidos a los Polimerasas Polimerasas de ADN nucletidos
de ADN o ARN para formar Polimerasas de ARN una molcula hija de una sola hebra, u
tilizando como molde el estiramiento de una molcula padre de una sola hebra Estas
enzimas ejecutan la sntesis de acuerdo a las reglas de los pares de bases y actan
en la direccin 5 a 3 La transcriptasa inversa, que se encuentra Transcnptasa inv
ersa slo en los virus, cataliza la sntesis del ADN. tanto de un molde de ARN como
de uno de ADN Unen los fragmentos de ADN formados por ADN ligasas las sntesis dis
continuas en la replicacin del ADN o por las vas de reparacin del ADN. Nucleasas La
s nucleasas "digieren" las molculas de DNasas, RNasas cido nucleico por medio de l
a rolura de los enlaces foslodister Endonucleasas Las endonucleasas digieren los c
idos Exonucleasas nucleicos del centro de la molcula mientras que las exonucleasa
s empiezan en un extremo libre y pueden necesitar un extremo 3 o uno 5 Las nucle
asas pueden tener la especificidad de una sola hebra, de doble hebra de ADN o de
ARN Algunas polimerasas tienen actividad nuclear. Figura 59-3. Fologralia de AD
N purificado que demuestra la naturaleza viscosa astringente del ADN genmico reco
rtado mnimamente. Endonucleasas de restriccin Son endonucleasas bacterianas que re
conocen secuencias de pares de bases de ADN cortas especficas y rompen la molcula
de ADN slo en el sitio de reconocimiento.
El ARN difiere del ADN en su funcin, en estructura y en composicin qum i c a (Tabla
59-1). En el ARN. el azcar es ribosa. que contiene un grupo hidroxilo en la posi
cin 2' y se sustituye la timna por uracilo metilado (U). El ARN slo existe como una
molcula monohebra y de longitud mucho ms corta que el ADN. La estructura del ARN
es mucho ms irregular, por la naturaleza monohebra de la molcula, pero puede conte
ner algunas secciones helicoidales. Las molculas de ARN con la misma secuencia de
bases, sin embargo, formarn la misma estructura tridimensional como resultado de
adoptar la conformacin ms favorable energticamente. El ARN es mucho menos estable
que el ADN. debido no slo a la estructura monohebra, ms azarosa, sino tambin a su s
usceptibilidad a la hidrlisis alcalina va el grupo de hidroxilo 2 de la ribosa. El
ARN tambin se degrada rpidamente por enzimas especficas de ARN que son ubicuas.
Enzimas asociadas a los cidos nucleicos
El ADN se debe duplicar antes de la divisin celular para que las clulas hija reten
gan una copia exacta de la informacin gentica contenida en los cromosomas paternos
. El ARN debe ser sintetizado por todas las clulas en Tabla 59-1 C o m p a r a c
i n de las caractersticas clave del ADN y del ARN Caracterstica Azcar Pares de base
s Estructura Estabilidad ADN Desoxirribosa Timina-adenma Citosina-guanina Doble
hebra Hlice-a Estable ARN Ribosa Uiacilo-adenma Citosina-guanina Una sola hebra A
l azar (vase texto) Expuesto a hidrlisis de base Se degrada con DNasa Se degrada c
on RNasa Mantiene la informacin Lleva la informacin gentica en el ncleo gentica al ci
toplasma
funcionamiento para dirigir la sntesis de las protenas necesarias. El ADN se debe
degradar durante la reparacin de los segmentos daados y el ARN se est degradando y
resmtetizndose continuamente. Estas y otras funciones se ven afectadas por las en
zimas que actan sobre los cidos nucleicos. La Tabla 59-2 enumera las principales c
ategoras de enzimas especficas de los cidos nucleicos y sus funciones in vivo. Para
el bilogo molecular, las enzimas purificadas in vitro se han convertido en herra
mientas de laboratorio, haciendo posible la ingeniera gentica y muchos ensayos de c

idos nucleicos. Las enzimas especificas de cido nucleico incluyen a las polimeras
as. que catalizan la formacin de enlaces fosfodister durante la sntesis: y las nucl
easas. que hidrolizan estos enlaces. Las nucleasas especificas de ARN (RNasas) e
stn virtualmente presentes en todos los sitios, lo que hace mucho ms difcil trabaja
r in vilro con ARN que con ADN. Las endonucleasas de restriccin son una categora e
special de nucleasas y se encuentran slo en bacterias, donde su funcin es destruir
el ADN extrao. Las dianas de reconocimiento de las enzimas de restriccin estn situ
adas dentro de las molculas del ADN. no en uno u otro extremo, son de secuencia e
specifica y su longitud puede variar, aproximadamente, de 4 pb a 12 pb. Las enzi
mas de restriccin generan cortes especficos asimtricos o romos en la secuencia de r
econocimiento (Fig. 59-4). En las siguientes secciones se vern las funciones n viv
o y la utilidad in vitro de muchas de estas enzimas.
Replicacin del ADN
El proceso de duplicacin del ADN, conocido como replicacin semiconservativa. utili
za cada hebra de la molcula progenitora para dirigir la sntesis de una hebra hija
(Virshup. 1990). Ya que la secuencia base de la hebra progenitora ordena la secu
encia de la hebra hija, la replicacin es exacta y el producto de la replicacin son
dos molculas de dsDNA. compuestas cada una de una hebra progenitora y una hebra
hija con la misma y exacta secuencia de pares de bases. Aunque el concepto es si
mple, el proceso es complicado e involucra a un nmero de enzimas y protenas acceso
rias.
Funcin

1278
SECCIN VII

PATOLOGIA MOLECULAR la secuencia de ssDNA ordenando la secuencia ARNm que utiliz

a las mismas reglas de complementariedad de pares de bases (pares de bases de ur
acilo con adenina). Cuando se alcanza el fin del gen, se termina la sntesis de AR
Nm.
Modificacin postranscripcional
La molcula de ARNm se modifica de varas formas antes de enviarla al citoplasma (Ro
senthal. 1994). El ARN mensajero contiene secuencias codificadoras de aminocidos
(exones) y secuencias no codificadoras (intrones); los intrones son cortados de
la molcula de ARNm antes de la sntesis de protenas. Un complejo molecular denominad
o maquinaria de procesamiento (Sharpe, 1988), que est compuesto de ARN de bajo pe
so molecular y de proteina. reconoce las secuencias del ARNm que identifican los
lmites de un intrn. une a los exones flanqueantes y libera al intrn. El procesamie
nto debe ser exacto, ya que la suma o la resta de un solo nucletido en la unin de
procesamiento podra cambiar el marco de lectura de 3 nucletidos en las siguientes
secuencias de nucletidos. Otras modificaciones de la molcula de ARNm incluyen la s
uma de residuos de 7-melil-guanosina al extremo 5' en un nico enlace 5-5' fosfodis
ter. A esto se le llama un cap. que ayuda a unir el ribosoma a la molcula de ARNm
para iniciar la sntesis de protenas. Al extremo 3' se le aade una cola de poli-A,
que puede ser necesaria para la estabilidad y el transporte al citoplasma. La sea
l de poliadenilacin es especificada, en parte, por la secuencia AAUAAA, que est, p
or lo general, en la regin 3' no traducida de la transcripcin del ARN. En este pun
to, la molcula de ARNm est preparada para dirigir la sntesis de su protena correspon
diente.
Figura 59-4. Ejemplos de enzimas de restriccin de ADN y sus especificidades. A la
s enzimas se las denomina c o m o a las bacterias de las que son aisladas (donde
N es cualquier base y N' es su pareja).
Para que la sntesis comience, primero hay que producir una pequea regin de una hebr
a. Esto no es favorable energticamente y se debe efectuar con protenas que desenro
llen y separen las hebras de la hlice. A continuacin se sintetiza un oligonucletido
corto de ARN complementario a la secuencia de una hebra. La polimerasa III de A
DN acta con la sntesis del ADN y ms tarde el oligonucletido se corta y se sustituye
con ADN por la polimerasa I de ADN. El ADN del cromosoma contiene muchos sitios
de inicio para la replicacin y este proceso se produce simultneamente a travs del c
romosoma. La polimerasa III de ADN es una enzima direccional y slo puede sintetiz
ar ADN en direccin 5' a 3', ya que requiere una terminacin libre. Esto significa que
puede ser sintetizada continuamente slo una hebra hija, denominada hebra lider.
La otra hebra, denominada hebra recesiva, es cebada por primasa de ARN, que no r
equiere una terminacin libre. Se sintetiza discontinuamente en fragmentos cortos (f
ragmentos Okazaki) segn se abre la burbuja de replicacin. Entonces, estos fragment
os son unidos por la ligasa de ADN. La polimerasa III de ADN es tambin nica, porqu
e tiene actividad exonucleasa y es a prueba de fallos de lectura. Si se aade un n
ucletido incorrecto a la cadena en crecimiento, es detectado y cortado por la por
cin nucleasa de la enzima y entonces se aade el nucletido correcto. Esto ayuda a ex
plicar la fidelidad extraordinaria del proceso de replicacin del ADN. Los mecanis
mos de reparacin postsntesis tambin contribuyen a la exactitud de la replicacin (vase
ms adelante en Mecanismos de reparacin del ADN).
Traduccin de ARN a protenas
La sntesis de protenas necesita traducir el lenguaje de los nucletidos al de los am
inocidos. Se utilizan 21 aminocidos diferentes en la sntesis de protenas; cada aminoc
ido es especificado por uno o ms tripletes de nucletidos del ARNm. denominados cod

ones. Debido a que un aminocido puede ser codificado por ms de un codn. al cdigo se
le conoce c o m o cdigo degenerado. Por ejemplo, AAG es el codn para lisina y UCG
es el triplete para serina. Por tanto, la secuencia que codifica un aminocido se
lee en grupos de tres nucletidos que van en direccin 5' a 3': este es el marco de
lectura de una secuencia que codifica protenas. Tres codones especficos no codific
an para aminocidos, sino que sealan el extremo de un gen (codones de parada). La t
raduccin del cdigo de nucletidos de ARNm a protenas es mediada por ribosomas en el c
itoplasma de la clula. Un ribosoma se une al extremo 5' del ARNm y proporciona un
ambiente qumico estable para todas las molculas involucradas en la sntesis de prot
enas. Los aminocidos son unidos en la secuencia correcta por la accin de pequeas molc
ulas de ARN adaptadoras. denominadas ARNs de transferencia (ARNt). Cada molcula A
RNt contiene una regin que es complementaria de un codn ARNm especial: el anticodn.
El aminocido que corresponde al codn ARNm complementario del ARNt est unido a un e
xtremo del ARNt. Un ARNt con el anlicodn complementario correcto se une al primer
codn en la secuencia de ARNm. que siempre es AUG. Cuando otro ARNt especfico se u
ne al codn siguiente, las enzimas ribosmicas catalizan la formacin de un enlace pep
tidico entre los dos aminocidos unidos al ARNt, eliminando la unin entre el primer
aminocido y su molcula ARNt. El primer ARNt se desprende del hbosoma y un ARNt nu
evo se une al codn siguiente. Mientras este proceso contina, el ribosoma se mueve
a lo largo de la molcula de ARNm, completando la sntesis de la cadena de aminocidos
. Cuando se llega al codn de parada (UAG, UGA o UAA), el ribosoma se desprende de
l ARNm. En realidad, a lo largo de la misma molcula de ARNm se pueden mover vario
s ribosomas, cada uno de ellos traduce el cdigo de ARNm dentro de una nueva molcul
a de protenas.
Transcripcin del ADN a ARN
A las secciones de ADN que especifican secuencias de aminocidos de protenas se las
denomina genes; un gen contiene el cdigo de la secuencia de aminocidos para una p
rotena, as como las secuencias de ADN necesarias para regular la produccin de esa p
rotena. Aunque las secuencias codificadoras de genes son de suma importancia para
la clula y para la funcin del organismo, como un todo, la gran mayora del genoma h
umano no est compuesto por genes. Sin embargo, no son bien conocidas las funcione
s de las regiones no codificadoras del ADN. A veces a estas secuencias se las de
nomina ADN basura, pero es ms que probable que desempeen funciones estructurales u
otras, como permitir que se produzca la recombinacin, que an no han sido descubie
rtas. L a sntesis de la proteina comienza con la activacin del gen apropiado. Una
copia del gen est hecha de ADN en forma de ARN. Debido a que la copia ARN lleva e
l cdigo del ADN en el ncleo de la clula al citoplasma donde se produce la sntesis de
los aminocidos, este tipo de ARN recibe el nombre de ARN mensajero (ARNm). El AR
N mensajero se sintetiza solamente de una hebra del gen del ADN; no se utiliza l
a hebra del ADN complementaria. Esto se realiza por medio de un proceso que se d
enomina transcripcin. La sntesis de ARNm se hace de idntica forma que la replicacin
de ADN, con
Control transcripcional
Son necesarios los mecanismos de control del repertorio de la transcripcin gnica y
de la traduccin de las protenas para permitir la diferenciacin

CAPTULO 59

DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

1279
celular y para la respuesta al estmulo ambiental. Algunos de estos mecanismos acta
n a nivel del ADN y controlan la transcripcin del ARNm (Rosenthal, 1994). Por eje
mplo, los promotores son secuencias de ADN importantes para el inicio de la tran
scripcin del ARNm. Los promotores se encuentran secuencia arriba, como aguas arri
ba de un ro, (hacia el extremo 5) a una distancia relativamente invariable del in
icio de la secuencia codificadora de protenas. Hay varias clases diferentes de se
cuencias consenso de los promotores (secuencias de nucletdos que estn en muchos eje
mplos). Los promotores ms comentes son ricos en adenina y timina y son denominado
s cajas TATA. Al repetir las secuencias A-T, el ADN se desenrolla con ms facilida
d, debido a que los enlaces de pares de bases A-T son ms dbiles que los enlaces de
pares de bases G-C. Hay otras secuencias de promotores reconocidas, las cajas G
C y el motivo CA. Despus de la activacin transcrpcional y por la unin de la polimeras
a de ARN con sus cofactores. se produce y estabiliza una regin de ssDNA local. El
ARN mensajero es sintetizado desde la regin local de ssDNA. y el ARNm es despren
dido rpidamente a la vez que el ADN vuelve a su estado, ms favorable energticamente
, de doble hebra helicoidal. Los amplificadores son secuencias de ADN que pueden
aumentar la transcripcin del ARNm y se pueden encontrar en localizaciones difere
ntes relativas al gen que afecten. Los factores de transcripcin son protenas que s
e unen a los amplificadores y a los promotores y estimulan o inhiben, selectivam
ente, la transcripcin del ARNm (Papavassiliou. 1995). A su vez, los factores de t
ranscripcin son controlados por acontecimientos celulares, como la fosforilacin, o
por otras protenas, como las hormonas y los factores del crecimiento. Una red de
comunicaciones qumicas intra y extracelulares puede asi seleccionar y controlar
la sntesis de protenas necesaria. Debido a que el ARNm es mucho menos estable que
el ADN, la vida media del ARNm es muy corta. Nuevas molculas del ARNm se estn tran
scribiendo continuamente a partir del ADN. A la vez que la clula responde a los c
ambios en las seales de transcripcin, los genes que estn transcritos en ARNm pueden
cambiar rpidamente y dar como resultado la sntesis inmediata de nuevas protenas. P
or tanto, la clula tiene la capacidad de ajustar su produccin proteica en respuest
a a su ambiente.

sintetizada y cortan la regin que incluye el fallo. La polimerasa III del ADN y l
a ligasa restablecen la secuencia correcta y la integridad de la hebra hija. La
importancia de este mecanismo en la estabilizacin del genoma se ha evidenciado po
r estudios recientes que asocian el cncer colorrectal no polipsico hereditario con
defectos en las protenas reparadoras de errores. La escisin de bases repara las d
ianas pequeas, los aductores que no deforman la doble hlice, como los producidos p
or metilacn. oxidacin, reduccin o fragmentacin de bases por radiacin ionizante. La es
isin de bases deja huecos de 34 nucletdos que luego se sellan con los nucletdos repar
ados: los cortes se sellan con ligasa. Los aductores de bulto ms grandes o los di
meros que distorsionan la hlice de ADN pueden ser causados, entre otros agentes,
por la radiacin UV, los carcingenos y por los frmacos teraputicos. Estas lesiones se
eliminan por la va de reparacin de escisin nucleotidica (REN), que utiliza un sist
ema de enzimas, compuesto de muchas protenas, para cortar un oligonucleotide de u
na hebra que contiene la lesin (Sanear, 1994). Luego el hueco se sella con la pol
imerasa ADN y se liga. Hay dos vas de reparacin de escisin nucleotidica: una, en la
que las lesiones que bloquean la transenpcin son eliminadas rpidamente (reparacin
acoplada a la transcripcin; Hanawalt. 1994), y dos, una va global que repara el AD
N basura, incluyendo la hebra no transcrita de los genes activos. Algunas de las
consecuencias posibles originadas por la prdida de actividad REN tienen como eje
mplo la enfermedad xeroderma pigmentosa (XP). cuya causa son las mutaciones de R
EN. La XP acusa u n a extrem a sensibilidad a los rayos solares y. como consecue

ncia, aparecen cnceres de piel a una edad m u y temprana (Weeda, 1998). Los corte
s no (recuentes de la doble hebra o los que se producen por la radiacin ionizante
o por el dao oxidativo presentan problemas importantes. Si no se resuelven, se b
loquearn la transcripcin y la replicacin de las secuencias involucradas. Para mante
ner la integridad genmica, local y total, se reparan los cortes de la doble hebra
por mecanismos de reparacin de recombinacin no homologa o allica. Ahora queda clar
o que la reparacin de ADN juega un papel importante en la vida de la clula. Hay ev
idencias recientes que indican que varias protenas, que son protenas de reparacin p
rimaria, tambin funcionan en la regulacin y en la transcripcin del ciclo de la clula
. Por tanto, el proceso que concierne al ADN parece estar altamente integrado y
se estudiar, cada vez ms. como un todo y en relacin a las enfermedades humanas.
Mecanismos de reparacin del ADN
Se deben minimizar los errores en la replicacin del ADN y los daos al ADN durante
la vida celular normal para preservar la salud de todo el organismo. Hay varios
mecanismos que actan para mantener normal la secuencia del ADN. Primero estn los m
ecanismos para anular los errores, que actan durante la replicacin del ADN. La pol
imerasa del ADN, que sintetiza nuevos polmeros de ADN. selecciona cada monmero de
nucletdos sucesivo basndose en su complementariedad al nuclelido siguiente en la heb
ra molde. La fidelidad a este nivel es grande y en esta etapa se anulan la mayora
de los errores en la sntesis. Sin embargo, a la hebra en crecimiento se le puede
aadir, ocasional e incorrectamente, una base. Para corregirlo, la actividad a pr
ueba de errores de lectura de la polimerasa reconoce el error, elimina la base i
ncorrecta y contina de nuevo con la sntesis. Los mecanismos para anular errores re
ducen los fallos en los pares de bases en aproximadamente 1 entre 10 millones (R
adman. 1988). Esto representa un aumento de 100.000 veces en eficacia, comparndol
o con el ndice de error de 1 en 100 bases para la sntesis de oligonucletidos en fas
e slida in vitro. A pesar de la extraordinaria anulacin de errores en la replicacin
del ADN, se producen equivocaciones ocasionales. An ms. el ADN puede ser daado por
reacciones bioqumicas normales y por agentes no fisiolgicos, como la luz ultravio
leta y los carcingenos ambientales. Hay varios mecanismos de reparacin que reparan
el ADN daado (Yu, 1999) (Tabla 59-3). Los mecanismos de reparacin directos repara
n los daos a travs de una reaccin en un solo paso. Por ejemplo, la O - metil-guanin
a ADN metiltransferasa repara los daos por alquilacn, transfiriendo el grupo alquil
o desde la lesin al sitio activo de la enzima. Otro mecanismo de reparacin directo
, caracterizado en Escherichia coli, puede existir, tambin, en las clulas humanas
(Yu, 1999).
e
Mutaciones del ADN
A pesar de los extensos mecanismos de reparacin, se producen alteraciones de las
secuencias de bases en el ADN (mutaciones), y en alguna medida deben producirse,
para que contine el proceso de evolucin. Incluso para un organismo individual, al
gunas mutaciones son claramente dainas y pueden estar asociadas al cncer y a las e
nfermedades genticas hereditarias. Los estudios de estas enfermedades han conduci
do a la caracterizacin de varios tipos de mutaciones que se producen el genoma hu
mano (Weatherall, 1987). stas pueden ser agrupadas, conceptualmente, en varias ca
tegoras principales (Tabla 59-4). Una mutacin puntual se encuentra en el gen de la
(J-globina en
Tabla 59-3 Vas de reparacin del ADN Reparacin directa Reparacin de errores Repara ci
ertos tipos de lesiones del ADN en una reaccin de un solo paso Comprueba los erro
res cometidos cuando el ADN se ha replicado Elimina a cualquiera de las bases ma
l emparejadas y las reemplaza por las correctas. Repara los pequeos aductores que
no deforman la hlice, como los originados por la metilacn. la oxidacin, la reduccin
o la fragmentacin de la base mediante radiacin ionizante
Reparacin de la escisin de la base
La reparacin de errores (RDE) funciona inmediatamente despus de la replicacin del A

DN para reemplazar las bases errneas por las correctas (Modrich, 1994). Algunas p
rotenas RDE reconocen el erraren la hebra hija recin
Elimina los aductores de bulto del ADN. como los dimeros de timina y ciertos fot
oproductos, asi como a los aductores qumicos y a los enlaces cruzados. Reparacin d
e la rotura Repara las roturas de la doble hebra de la doble hebra originadas po
r procesos fisiolgicos o por la radiacin ionizante y las agresiones oxidativas
Reparacin de la escisin del nucletido

1280
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Tabla 59-4 Tipos de m u t a c i o n e s de A D N y e j e m p l o s de las e n f
e r m e d a d e s Mutacin Punto Delecin o insercin Delecin o insercin con frameshilt
Descripcin Sustitucin de un solo par de bases. Sustraccin o adicin de codones de ami
nocido en mltiplos de tres Se conserva el marco de lectura Sustraccin o adicin de co
dones en no mltiplos de tres. El resultado es un desplazamiento del marco de lect
ura y una secuencia que codifica aminocidos completamente diferente a partir de l
a mutacin. Aumenta el nmero de secuencias en el ADN microsatlite. Origina la disrup
cin de la expresin del gen Cambio intercromosOmico de segmentos largos de cromosom
a Origina una nueva proteina con una funcin diferente. Enfermedad Anemia drepanoc
itica Distrofia muscular de Becker Distrofia muscular de Duchenn<
Amplilicacin o repeticin de los Irinucletidos Translocacin
Cromosoma X frgil Leucemia mielgena crnica

la anemia de clulas enfermas (Kan. 1992). Una base de timina reemplaza a una base
de adenina y origina un cambio grave en la estructura de la hemoglobina. La del
ecin en el gen de la protena muscular distrfica es la causa de la distrofia muscula
r. En la variedad Becker de la enfermedad, las deleciones no interrumpen el marc
o de lectura, pero en la mayora de los casos de la variedad Duchenne, mucho ms gra
ve, las deleciones s cambian el marco de lectura, eliminando eficientemente la fu
ncin de las protenas (LiechtiGallati. 1989). El ADN humano contiene muchas secuenc
ias cortas de nucletidos (ADN microsatlile) que algunas veces se agrupan en repeti
ciones en tndem y que se repiten muchas veces por todo el genoma humano. El nmero
de repeticiones en tndem en lugares especiales es un carcter hereditario. Se ha ob
servado que algunas repeticiones de trinuclelidos aumentan en nmero en asociacin co
n la enfermedad (Sutherland, 1994). En el sndrome del cromosoma X frgil, la expres
in de la enfermedad est asociada a la amplificacin, ms all de un cierto limite, del n
ero de una secuencia de repeticin trinucletida intragnica. La expansin de las repeti
ciones trinucletidas, ms all de un nmero crtico, rompe la expresin del gen. No siempr
se pueden detectar las translocaciones por el anlisis del cariotipo cromosmico. A
nivel del gen, una translocacin puede crear un gen de fusin, la combinacin de dos
genes diferentes unidos de forma anormal en el sitio de la translocacin. Esto no
slo puede crear una transcripcin del gen alterada, sino que tambin puede producir u
n gen bajo el control transcripcional de otro. Por ejemplo, el cromosoma Filadel
fia. que se encuentra en la mayora de los casos de leucemia mielgena crnica, es el
resultado de una translocacin recproca entre el gen c-abl. en el cromosoma 9, y un
a regin denominada regin de agolpamientos de puntos de sutura (raps), en el cromos
oma 22. El gen de fusin producido por este reordenamiento cromosmico se compone de
la mayor parte del gen c-abl y de una raps truncada, codilica una protena c-abl,
que es ms grande que el producto normal, tiene una actividad enzimtica incrementa
da y se cree que interfiere con las vias de transduccin de seales que, normalmente
, estn involucradas en el control de proliferacin y muerte de las clulas. Lo que de
termina el efecto ltimo en el producto proteico es el tipo de mutacin, asi como su
localizacin en relacin al gen. Las mutaciones pueden no tener efecto sobre la exp
resin de la proteina o su actividad funcional: existen muchas protenas humanas, en
variantes perceptibles, que no estn asociadas con la enfermedad. Las mutaciones
que se producen en las regiones intrnicas se supone que no tienen ningn efecto. Si
n embargo, incluso las pequeas mutaciones en regiones que codifican para dominios
funcionales clave (exones) pueden alterar o eliminar funciones drsticamente. Las
"mutaciones sin sentido" son mutaciones que transforman un codn de aminocido en u
n codn de parada, o viceversa, y dan como resultado productos proteicos anormalme

nte cortos o largos, respectivamente. Las mutaciones de sentido errneo son aquell
as que cambian el cdigo de un aminocido a otro y que pueden alterar o no la funcin
de la proteina dependiendo del cambio y de la funcin del aminocido. De igual forma
, las mutaciones dentro de las secuencias que sealan los sitios de unin pueden eli
minar exones e introducir intrones en el ARNm transcrito. Las mutaciones pueden
producirse tambin en las secuencias reguladoras, como las promotoras y las amplif
icadoras, que producen efectos drsticos en los niveles de transcripcin,
ANLISIS DE LOS CIDOS NUCLEICOS
Las propiedades bioqumicas nicas de los cidos nucleicos han sido el detonante para
proporcionar informacin de la biologa o bioqumica de un sistema. Mientras que algun
os ensayos, como la electroforesis. se aplican a otras unidades bsicas, como las
protenas y los lpidos, la gran mayora son especficos para los cidos nucleicos En las
siguientes secciones se describen brevemente los principios de las categoras de a
nlisis bsicas utilizados para caracterizar el ADN y el ARN. las separaciones elect
roforticas. los ensayos de hibridacin, las tcnicas de amplificacin y los polimorfism
os de la longitud de los fragmentos de restriccin. En la prctica, las categoras, a
menudo, se combinan para producir nuevas variaciones del mismo tema. Por ejemplo
, un ensayo completo puede involucrar a la amplificacin, la electroforesis y la h
ibridacin.
Separacin electrofortica
El esqueleto de azcar-fosfato repetitivo de los cidos nucleicos da c o m o resulta
do una carga neta negativa distribuida ligeramente sobre estas molculas lineales.
Por tanto, el movimiento del ADN o del ARN en respuesta a un campo elctrico ser p
roporcional al peso molecular o a la longitud de la molcula. Esta propiedad se ut
iliza para caracterizar el tamao de los fragmentos de cido nucleico por separacin e
lectrofortica. El formato es similar al que se utiliza para la separacin de protena
s segn su tamao. Se ponen mltiples muestras en pocilios separados, en un extremo de
un medio de separacin slido pero poroso. Cuando se aplica el voltaje, la muestra
se mueve hacia el electrodo positivo de manera lineal, formando cada muestra u n
a linea de migracin. Se conoce como ge/al medio electrofortico slido y a la repeti
cin de pocilios de muestra. Los tamaos estndar, a los que nos referimos como escale
ras de ADN o ARN, son mezclas de cidos nucleicos de longitud de fragmento conocid
a que son analizados en una o ms lneas del gel. L a determinacin del tamao se hace c
omparando la distancia de migracin de una muestra desconocida con la escalera, bi
en ~a ojo" o por mediciones asistidas por ordenador. La composicin y la concentra
cin del medio de separacin determina el tamao de los fragmentos, los cuales se pued
en separar en bandas diferentes. Otras variables que contribuyen a la resolucin s
on el grosor del gel, la longitud de la va de electroforesis, la duracin de la ele
ctroforesis y el voltaje aplicado. En la prctica, estos factores se gustan empiri
camenle y se controlan tan cuidadosamente como es posible para asegurar la capac
idad de reproduccin de da en da. La agarosa es el medio de separacin que se utiliza
con ms frecuencia y. por lo general, conjuntamente con u n a cubeta de electrofor
esis horizontal, en la que se sumerge el gel en tampn. el gel sumergido. Las mues
tras se espesan con sacarosa o Ficoll y son cargadas en los pocilios del gel por
medio del tampn (Fig. 59-5). Se obtiene un poder mayor de resolucin con acrilamid
a, utilizada normalmente en un lormato vertical, que permite la diferenciacin en
longitud de un solo par de bases. El mtodo ms simple para visualizar las bandas se
paradas por electroforesis es la tincin con colorantes intercalados (p. ej.. el b
romuro de etidio), que se insertan

CAPTULO 59

DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

1281
entre las bases emparejadas, y visualizando con transiluminadores de luz UV. La
visualizacn directa requiere que la banda consiga un concentracin significativa. En
algunas aplicaciones se pueden delectar los fragmentos de cido nucleico por fluo
rescencia o por radiactividad, marca que puede aumentar la sensibilidad. Las molc
ulas en el ADN genmico son reducidas a fragmentos que se pueden resolver por elec
troforesis por medio de la digestin con enzimas de restriccin. Las enzimas de rest
riccin con una secuencia de reconocimiento relativamente simple producen fragment
os de menos de 50 kilopares de bases (kpb) de longitud. Los fragmentos de ADN ex
tremadamente largos, medidos en megapares de bases (Mpb). se producen por la dig
estin con enzimas con una secuencia de reconocimiento compleja, y deben ser separ
ados en sistemas electroforticos especiales utilizando un campo elctrico pulsado.
La mayora de las aplicaciones de la electroforess de ADN utilizan condiciones no d
esnaturalizantes (es decir, los fragmentos que se resuelven en bandas son de dob
le hebra). Por el contrario, la mayora de las separaciones del ARN utilizan condi
ciones desnaturalizantes (bien fornamida o glioxal) para eliminar la estructura
secundaria de las molculas monohebra. Las molculas de ARN, que son transcritas de
ADN. son "premedidas" y relativamente pequeas, por lo que no se requiere digestin
antes de la electroforess.

Figura 59-6. Ilustracin de la astringencia. Segn aumenta la astringencia de la hib
ridacin se toleran menos errores en un hibndo dplex Con la astringencia muy alta,
incluso un error en un solo par de bases interrumpir el dplex.
Hibridacin del cido nucleico
La hibridacin es un concepto fundamental en la bioqumica del cido nucleico: se le d
efine como la interaccin entre dos molculas monohebra de cido nucleico para formar
una molcula dplex (de doble hebra), basada en el emparejamiento de bases complemen
tarias de sus respectivas secuencias. La hibridacin es consecuencia directa de la
estructura estable de doble hebra del ADN bajo condiciones fisiolgicas. Como se
ha visto antes, la hlice est formada por dos hebras antiparalelas de ADN sujetas p
or la fuerza combinada de muchos enlaces especficos de hidrgeno entre pares de bas
es complementarios, asi como por una carcasa hidrofbica de bases de un ambiente a
cuoso. Lo importante de la reaccin de hibridacin es el hecho de que las uniones en
tre molculas complementaras separadas (hebras) sea reversible y especifica de secu
encia de bases. Al proceso de reforma de la estructura de la doble hebra estable
, cuando ninguna de las hebras est marcada, se le denomina amllamiento. Si una he
bra est marcada (es decir, si tiene un marcador que puede ser detectado de alguna
manera), a esa hebra marcada se la denomina sonda, y al proceso se le conoce co
mo hibridacin, debido a que se forma una molcula hbrida entre una hebra marcada y o
tra sin marcar. Las molculas de ARN tambin pueden participar en el proceso de hibr
idacin. El emparejamiento de bases puede producirse entre hebras de ADN complemen
tarias, entre el ADN y el ARN y entre hebras de ARN complementarias, dando como
resultado estructuras dplex de ADN-ADN. ADN-ARN y ARN-ARN. Las estructuras ms
estables las forman las molculas dplex, con complementariedad exacta en la secuenc
ia de bases, pero pueden formarse estructuras con diversos grados de error de io
s pares de bases dependiendo de las condiciones. La inestabilidad relativa de es
tos dplex errneos se reflejar en la baja temperatura de su disociacin (por debajo de
la T,,). Se pueden manipular las condiciones ambientales para controlar el grad
o de errores de los pares de bases que se tolerarn en una estructura dplex (es dec

ir, la astringencia de la coincidencia de la secuencia) (Fig. 59-6). Una baja as

tringencia tiene que ver con las condiciones, como sal elevada, baja temperatura
, ausencia de fornamida. que favorecen a la carcasa de bases hidrofbicas de un am
biente acuoso, incluso sin un alineamiento perfecto; la coincidencia no necesita
ser perfecta. Las condiciones de alta astringencia -alta temperatura (cerca de
T,). baja sal y fornamida alta- slo permitirn estructuras dplex perfectamente alinea
das para permanecer en una conformacin helicoidal estable.
Ensayo de hibridacin: componentes bsicos
El proceso conocido como ensayo de hibridacin es el que utiliza la reaccin de hibr
idacin para analizar el contenido del cido nucleico de una muestra no conocida. La
propiedad del emparejamiento de bases complementarias permite a los fragmentos
de una composicin conocida (la sonda) interrogar a una desconocida por la presenc
ia de secuencias (complementanas) de comparacin. Por tanto, todos los ensayos de
hibridacin requieren varios elementos bsicos: una sonda, una muestra, condiciones
controladas permisivas para el emparejamiento de bases complementarias y un mtodo
para el descubrimiento de hbridos especficos de sonda-muestra. A continuacin se ve
rn brevemente cada uno de estos elementos, as como las variaciones en los formatos
que se han desarrollado para permitir la ejecucin y la interpretacin de los ensay
os de hibridacin
Sonda
La sonda determina la especificidad de la reaccin de hibridacin. Por eso la sonda
es capital para un ensayo de hibridacin, de la misma manera que el anticuerpo pri
mario es capital para un inmunoensayo. Una sonda es un fragmento bien caracteriz
ado de cido nucleico, bien de ADN o bien de ARN. En la mayora de los ensayos, y au
nque se producen variaciones, la sonda es la que porta al grupo reportero para d
electar molculas hibridadas dentro de la reaccin. Los grupos reporteros pueden ser
radiactivos o no radiactivos (es decir, mareaje por afinidad). Figura 59-5. Fot
ografa de la carga de una muestra y su tincin mediante lampn en un pocilio de gel d
e agarosa en un apralo de electroforesis de gel sumergido. La mayora de las sondas
son producidas por la tecnologa de cidos nucleicos recombinantes, como se ilustra
en la Figura 59-7. Los plsmidos, segmentos de doble hebra cortos y circulares de
ADN, son utilizados para pro-

1282
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 59-7. Produccin de sondas clonadas. La insercin de un s e g m e n t o extrao
conocido de ADN en un v e c t o r de plsmido p r o d u c eu n plsmido recombinant
e Los pismidos de este tipo son pequeos trozos circulares de ADN que se propagan m
ediante su cultivo en un husped bacteriano. El ADN plsmido se separa fcilmente del
c r o m o s o m a bacteriano en base al tamao. El plsmido recombinante purificado
puede s e r utilizado c o m o sonda. Esto produce una sonda de ADN de hebra dobl
e c o n secuencias del inserto y del vector De forma alternativa, se p u e d e n
purificar las secuencias del inserto del vector del plsmido y utilizarlas solas
c o m o la sonda. Si el plsmido contiene una regin de ARN promotor, se pueden prod
ucir sondas de ARN utilizando u n a polimerasa de A R N para transcribir las sec
uencias del inserto. Como solamente se transcribe u n a hebra, las sondas de ARN
que se producen son de una sola hebra. (Por cortesa y adaptada de U n g e r ER:
In situ hybndization. Principies and praclice Clin I m m u nol Newslett 1990:10:
120-126, copyright 1990 Elsevier Science.)
pagar las secuencias deseadas en las bacterias. El segmento que interesa se intr
oduce en el plsmido, utilizando la digestin de enzimas de restriccin y ligacin, lo q
ue da como resultado una nueva molcula "recombinada" que mantiene la capacidad de
propagarse en la bacteria y que incluye a la secuencia de ADN que interesa. Las
bacterias que contienen el plsmido recombinante pueden ser crecidas en cultivo y
los pismidos pequeos y circulares pueden ser fcilmente separados del genoma bacter
iano en base al tamao. As se obtienen muchas copias idnticas y por eso nos referimo
s al ADN como clonado. El plsmido purificado puede ser utilizado en ensayos donde
las secuencias de vectores no interfieren con la especificidad de la reaccin. En
muchas aplicaciones, la secuencia de ADN insertada es separada de la secuencia
de vectores por medio de la digestin del plsmido aislado con la misma enzima de re
striccin, utilizada originalmente en la construccin de la molcula recombinante. La
sonda resultanle, por cualquiera de esos mtodos, es una molcula de ADN de doble he
bra. Antes de utilizarlas, las sondas de doble hebra deben ser desnaturalizadas,
y el reanillamiento de la sonda limita la extensin de la hibridacin de la sonda c
on una diana. El vector del plsmido que no contiene ADN clonado es un control neg
ativo utilizado corrientemente para este tipo de sonda. Los vectores de los pismi
dos han sido construidos para incluir a las regiones promotoras de ARN adyacente
s a la secuencia de ADN insertada. Estos pismidos recombinantes se usan para prod
ucir transcritos de ARN a partir del ADN insertado. El resultado es una sonda de
ARN monohebra que no experimentar autohibndacin. El control de la orientacin del A
DN insertado con respecto al promotor de ARN permite la produccin de transcritos
en la direccin sentido (igual que el ARNm) o antisentido (complementaria al ARNm)
. En muchas aplicaciones, los transcritos de sentido forman sondas de control ne
gativas, ideales para las reacciones de hibridacin con sondas antisentido. Una so
nda de ARN enlazada no especiticamenle (es decir, el ARN no es una estructura dpl
ex estable) puede ser eliminada utilizando RNasa especfica de ARN monohebra. Como
el ARN es muy delicado, es necesario que las sondas sean manejadas con un cuida
do extrem o para prevenir su degradacin (tcnicas estriles, agua tratada y material
de cristal). Las sondas recombinantes. sean de ADN o de ARN. son genticamente com
plejas, lo que significa que pueden incluir muchas kilobases de informacin gentica
, al contrario que las sondas producidas por mtodos sintticos, que son segmentos d
e ADN relativamente cortos. Las sondas de oligonucletidos producidas por reacciones qumicas automatizadas son, normalmente, de 15 a 4
5 bases de longitud, sintetizadas para producir una secuencia de bases especfica.
Se pueden disear sondas con una especificidad de hibridacin muy alta, en base a l

a informacin de secuencias disponible en los bancos de datos. Se pueden generar e

n direccin sentido o antisentido, con costes relativamente baios. Estas sondas co
rtas son monohebra. esparcidas en la diana y de hibridacin rpida, debido a su pequ
eo tamao, y extremadamente sensibles incluso a un solo error en los pares de bases
. Debido a su limitada complejidad gentica, la susceptibilidad ltima que se consig
ue con las sondas de oligonucletidos es ms baja que la que consigue con las sondas
recombinantes. Las mltiples sondas de oligonucletidos dirigidas a diferentes reas
de la misma diana han sido utilizadas, en algunos casos, para aumentar la suscep
tibilidad, incrementando la representacin de la secuencia diana en la mezcla de l
a sonda. Este mtodo es anlogo a la ulilizacin de una mezcla de anticuerpos monoclon
ales que reaccionan frente a epitopos diferentes del mismo antigeno complejo. Se
pueden generar sondas ms largas que las obtenidas por la sntesis qumica directa co
n la reaccin en cadena de la polimerasa o con otra tecnologa de amplificacin. Estas
sondas pueden ser monohebra o de doble hebra, dependiendo de las condiciones em
pleadas, y pueden ser tan largas como el producto de la reaccin de amplificacin; e
n la mayora de los casos de 100 pb a 1 kben longitud.
Muestra
Mientras que la seleccin y la preparacin de las sondas es esencial para determinar
la susceptibilidad y la especificidad del ensayo de hibridacin, no se debe olvid
ar que la preparacin de la muestra contribuye al xilo del ensayo. Para aplicacione
s clnicas, las muestras de inters deben ser bastante diversas. Por ejemplo, un lab
oratorio de microbiologa podra contar con muestras de anlisis de sangre, de orina,
de heces y de esputos. Puede ser difcil mantener la integridad de las dianas de A
RN bajo en tales condiciones, e incluso el ADN puede ser degradado si no se mane
ja adecuadamente. El objetivo de la preparacin de la muestra es mantener la integ
ridad del cido nucleico y hacer asequible la informacin gentica de la diana para la
interaccin con la sonda. Para algunas aplicaciones, la necesidad de integridad d
e la diana aconsejar una congelacin inmediata o aadir lampones de lisina que conten
gan inhibidores de RNasa o de DNasa potentes. En otras aplica-

CAPTUIO 59

DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

1283
ciones, la utilizacin de mtodos de recogida de muestras ms habituales permitir una p
reservacin adecuada de la diana. Las similitudes fisicas y qumicas de los cidos nuc
leicos, sea cual sea la fuente, permiten mtodos uniformes de purificacin y extracc
in. En muchos ensayos, para eliminar inhibidores de enzimas que son aadidos al ens
ayo (como una enzima de restriccin o una polimerasa) y para maximizar la accesibi
lidad de la diana a la sonda, es preferible purificar extensivamente el ADN o el
ARN. Sin embargo, los sistemas de purificacin completos consumen mucho tiempo y
requieren una cantidad relativamente grande de muestras de partida. En muchas ap
licaciones se pueden utilizar purificaciones de muestras relativamente abreviada
s. Normalmente para las purificaciones se utiliza la lisis de la clula (mecnica, q
uimica o ambas), tratamiento de proteasa y extracciones orgnicas o inorgnicas.
recta de los anticuerpos. El primer mareaje por afinidad introducido en los cidos
nucleicos fue la biotina, un mareaje por afinidad utilizado corrientemente en l
os inmunoensayos (Langer, 1981). La biotina por s m i s m a no genera seales, pero
es delectada por la interaccin de alta afinidad con una molcula de avdina o estrep
tavidina. que a su vez se combina o conjuga con una enzima generadora de seales o
fluorocromo. Muchos otros grupos funcionales se han desarrollado como marcas mo
noisolnicas. como la bromodesoxiundina. la digoxigenina y la sullona. En estos ca
sos, la deteccin se consigue con anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra el
grupo funcional. Estos anticuerpos estn, por lo general, directamente enlazados
a una enzima generadora de seales o fluorocromo que acta como un anticuerpo secund
ario marcado en una reaccin inmunoquimica. La biotina tambin puede ser detectada c
on un anticuerpo antibiotina ms que con una molcula de avdina o estreptavidina. Deb
ido a que las marcas de afinidad son detectadas con protenas grandes, como la avi
dma o los anticuerpos, la disponibilidad de la marca al reactivo de deteccin es u
n factor crucial en la determinacin de la sensibilidad. El aumentar el nmero de ma
rcas de afinidad no incrementar necesariamente el nmero de molculas detectaras que
sern unidas al cido nucleico. Adems, y debido a que las marcas de afinidad son gran
des, su sobremeorporacin en la molcula de cido nucleico puede conducir a un bloqueo
espacial de la reaccin de hibridacin. Por estas razones, la actividad especifica
de la marca de afinidad no controla directamente la sensibilidad de la deteccin.
Una ventaja de la deteccin indirecta de las marcas de afinidad es que para la mis
ma marca se pueden utilizar varios mtodos de deteccin (Fig. 59-8). Por ejemplo, la
biotina puede ser detectada con avidina unida a una enzima con color subsiguien
te o con una deteccin quimioluminiscente o con avidina con marca fluorescente. Pa
ra todos los mtodos no radiactivos, la parte de deteccin del ensayo es crucial par
a obtener una sensibilidad ptima. Una reaccin de hibridacin eficaz se puede frustra
r por reactivos de deteccin con poco fondo y una generacin de seal subptima Para con
seguir resultados ptimos, lo ms importante es elegir los marcadores de enzimas (pe
roxidasa frente a fosfatasa alcalina), el sustrato de la enzima (colorimtnco tren
te a quimioluminiscente) e incluso la procedencia de los reactivos.
Condiciones controladas permisivas para el emparejamiento de bases complementari
as
La susceptibilidad y la especificidad de las reacciones de hibridacin son influen
ciadas, en gran medida, por el ambiente lisico-quimico durante la reaccin y la co
nsecutiva deteccin/recogida de las molculas hbridas. En la prctica, el medio utiliza
do para controlar el ambiente de la reaccin de hibridacin es el cctel de hibridacin.
Diseado empricamente, el cctel de hibridacin es una mezcla de reactivos seleccionad
os para favorecer la interaccin de los cidos nucleicos a travs de enlaces de hidrgen
o especficos de secuencia, ms que en base a la carga. Sus componentes varan mucho,

pero incluyen tampones, sales, desnaturalizantes como la formamida. polmeros de a

lto peso molecular, ADN o ARN portador y varios componentes ms que se le aaden par
a reducir el fondo (como detergentes, suero de bovino, albmina y Ficoll). A esta
mezcla tan compleja se la denomina, con toda propiedad, un ccfe La luerza inica del
cctel de hibridacin, y los lavados subsiguientes, es modulada, muy frecuentemente
, por la concentracin de un tampn citrato sdico salmo (SSC). compuesto de 0.15 mol/
I de cloruro de sodio. 0.015 mol/l de citrato de trisodio y un pH 7.0. La abrevi
atura de estas condiciones hace referencia a la fuerza del SSC. esto es. 2 x SSC
. 0,1 x SSC. La astringencia final de la reaccin de hibridacin est controlada por l
a formamida y por la concentracin salina del cctel de hibridacin, por la temperatur
a de la reaccin de hibridacin y por la temperatura y la concentracin salina de los
pasos de lavado.
Formatos de ensayos de hibridacin
Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de ensayos de hibridacin, cada
uno de ellos diseado para resolver los problemas metodolgicos del ensayo de hibri
dacin: las condiciones que permiten el emparejamiento de las bases complementaria
s especficas, un mtodo para detectar hbridos y una interpretacin del resultado. Cada
mtodo tiene su punto dbil y su punto fuerte, y la seleccin del formato la dicta el
marco clnico y la preDeteccin de hbridos
Se ha aplicado una amplia variedad de tcnicas para la recogida y el anlisis de hbri
dos especficos, que se vern brevemente ms adelante bajo el titulo de Formatos de en
sayos de hibridacin. Una vez que se han recogido los hbridos especficos, los mtodos
de deteccin van unidos, obviamente, a los mtodos de mareaje. Se han utilizado marc
as radiactivas, como el lsloro-32 (*P), el yodo 125 ("'-I), el azufre-35 ( S), el
carbono-14 ( C) y el tritio ( H). que se detectan por medio de la autorradiogra
fa o por el contador de centelleo en muchas aplicaciones de investigacin y en las
primeras aplicaciones clnicas. La actividad especifica de la marca influye direct
amente en la sensibilidad de la deteccin. Se han buscado, para las aplicaciones c
lnicas, alternativas al mareaje radioisotpico. Las sondas radiactivas tienen una v
ida media, relativamente corta, haciendo que uno de los reactivos claves en el e
nsayo de hibridacin sea inestable. Tambin han contribuido a la necesidad de encont
rar mtodos no radiactivos el peligro que corre el personal del laboratorio y los
costes de la eliminacin de los desechos radiactivos. Las sondas marcadas no isotpi
camente son reactivos estables, facilitan enormemente la produccin industrial y l
a estandarizacin, lo que es crucial para la capacidad de reproduccin de los ensayo
s.
iS M ]
El mareaje no isotpico y los mtodos de deteccin de los cidos nucleicos tienen muchas
similitudes con los ensayos mmunoquimicos desarrollados por la deteccin de proten
as no isotpicas. En algunas aplicaciones, los cidos nucleicos son enlazados direct
amente a un compuesto emisor de seal, normalmente a un fluorocromo. aunque ocasio
nalmente a una enzima. Esta situacin es igual para los inmunoensayos, en los cual
es es marcado el anticuerpo primario. Los cidos nucleicos son detectados, ms corne
ntemente, en un ensayo de mltiples pasos, cuyo concepto es similar a la reaccin in
diO
Suslralo (colormclrico o quimioluminisccntc)
Figura 59-8. Sistemas de deleccin de sondas de marcaje por afimdad. (Por cortesia
de Unger ER. Piper MA: Nucleic acid biochemistry and diagnostic applications En
Burlis CA. Ashwood ER led.]: Tietz Textbook ol Clinical Chemistry. 2" ed. Filad
elfia. WB Saunders Company, 1 9 9 4)

1284
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR reaccin de hibridacin. Estas desventajas se compensan, frecuente

mente, por la conveniencia de disponer de un medio slido que nos lleve a travs de
los mltiples pasos del ensayo. Hibridacin de punto o transferencia. En este format
o de ensayo, mltiples muestras estn inmovilizadas en una repeticin geomtrica sobre u
na membrana de nailon o de nitrocelulosa. El nombre del ensayo deriva de la form
a de cada muestra sobre la membrana. Cuando se aplican las muestras a mano, la f
orma es ms fortuita (mancha). Con la utilizacin de instrumentos de vaco, disponible
s comercialmente. las muestras se aplican utilizando la succin, la forma de la mu
estra es ms regular, redonda (punto) o alargada (muesca). La matriz slida permite
que mltiples muestras sean procesadas simultneamente a travs de todos los pasos del
ensayo. El hecho de que estn expuestos todos los controles y muestras a exactame
nte los mismos reactivos y condiciones aumenta la estandarizacin del ensayo. La p
rolongacin de la preparacin de la muestra varia desde la purificacin completa de lo
s cidos nucleicos, antes de su aplicacin al filtro, a la aplicacin directa de una m
uestra no purificada. El ensayo tolera algn grado de degradacin de la muestra. Los
cidos nucleicos purificados tienen la ventala de que estn muy dispuestos a la int
eraccin con la sonda y no tienen apenas problemas con el fondo. Sin embargo, la p
urificacin individual de la prueba consume mucho tiempo y el trabajo es intensivo
. Los mtodos que utilizan la aplicacin directa de la muestra no purificada llevan
el experimento a travs de un procedimiento abreviado de purificacin que incluye, n
ormalmente, la lisis y la desnaturalizacin, la digestin de la proteina y el lavado
con detergente. Las ventajas de este mtodo son que se aplica a pequeas cantidades
de material de partida y reduce el tiempo de preparacin de muestras. Sin embargo
, la susceptibilidad final de la reaccin es ms baja y el fondo de las interaccione
s no especificas de las sondas puede hacer que el ensayo no sea fiable. L a inte
rpretacin de los resultados de un ensayo de hibridacin mancha/punto es relativamen
te directa. Si ha tenido lugar la hibridacin se genera una seal en el punto especi
fico. Los resultados se pueden cuantificar. dependiendo de la marca utilizada pa
ra generar las seales, aunque normalmente se da una interpretacin simple de si o n
o (es decir, la muestra tiene ms o menos seal que las muestras contiguas y reconoc
en controles positivos y negativos). Suelen provocar errores de interpretacin las
seales dbiles, que pueden ser el resultado de una cantidad muy pequea de dianas es
pecficas o de una gran cantidad de dianas de reaccin cruzada dbiles. No hay informa
cin disponible sobre el tamao de los fragmentos que se hibridan. Se conoce como en
sayo inverso de mancha/lineas de puntos a una variacin interesante del ensayo de
mancha/punto. En este formato, que se aplica en situaciones en las que una muest
ra tiene que ser analizada con m u c h a s sondas diferentes y donde la muestra
puede estar limitada, es la muestra la que porta la marca. Las sondas no marcada
s o las dianas son fijadas a un soporte slido en repeticiones lineales o de matri
z. Se identifican e interpretan las reas de formacin de hbridos especficos igual que
en el ensayo estndar de mancha punto. Este lormato de ensayo es u n a forma til p
ara identificar el producto de un ensayo de amplificacin (vide intra y Cap. 60),
como en HLA (Bugawan, 1994) o para tipificar el papilomavitus humano (Gravitt, 1
998), Hibridaciones Southern y Northern. Ambas hibridizaciones. Southern y North
ern, combinan la separacin por electroforesis del cido nucleico a analizar, con su
transferencia a un soporte slido y la hibridacin subsiguiente. Por tanto, este en
sayo no slo da informacin sobre la presencia de hibridacin, sino que permite determ
inar el peso molecular de las especies hibridadas. Se dio el nombre de hibridacin
de mancha Southern o manchas de Southern al procedimiento original en honor a s
u inventor, E M. Southern (Southern. 1975). En este ensayo, el cido nucleico a an
alizar es ADN, A la tcnica que utiliza ARN como cido nucleico a analizar se le dio
, por analoga, el nombre de manchas Northern. (Y yendo an ms lejos con la analoga, l
as manchas western son un proceso similar en el que las protenas estn expuestas a
la electroforesis y a la transferencia: a una mancha south-western se la ha desc

rito como una tcnica que mancha y separa al

gunla diagnstica especfica. No hay un ensayo perfecto, y a continuacin se describen
, brevemente, varios de los formatos bsicos, con sus puntos fuertes y sus puntos
dbiles especiales. Cada ensayo de hibridacin requiere controles positivos y negati
vos para su verificacin. Un control de muestras positivo es aquel que se sabe que
contiene secuencias complementarias de la sonda. Se utiliza para establecer que
la preparacin de la muestra es la adecuada para liberar la diana para el ensayo
de hibridacin, y para garantizar que la sonda se hibridar con la diana especifica
bajo las condiciones del ensayo. El control de muestras tambin se puede utilizar
para montorizar la susceptibilidad del ensayo, si el control positivo se elige ce
rca de los lmites de deteccin ms bajos. Un control de muestras negativo (es decir,
del que se sabe que no contiene secuencias complementarias de la sonda) se utili
za para montorizar la especificidad de las interacciones de la sonda diana. Los c
ontroles de la sonda incluyen secuencias de vectores o sondas marcadas no relaci
onadas, hibridadas y detectadas bajo las mismas condiciones del ensayo. Estos lti
mos controles permiten la monitorizacin del fondo de la seal generada por la local
izacin de la sonda a travs de interacciones no hibridadas, como carga o atrapamien
to. En la prctica clnica se pueden emplear controles adicionales para montorizar ca
da paso del ensayo de hibridacin.
Hibridacin de fase lquida o solucin
En los ensayos de hibridacin lquida tanto la muestra como la sonda actan reciprocam
ente en solucin, lo que maximiza la cintica de la reaccin. Los cidos nucleicos de la
muestra se purifican, generalmente, de protenas contaminadoras y de lpidos, que p
odran interferir en la obtencin de hbridos al final del ensayo, aunque el ensayo to
lera alguna degradacin de la muestra. La muestra se desnaturaliza y se trocea al
azar antes de aadirte la sonda de una hebra que no tiene capacidad de autohibrida
cin. Se puede detectar la hibridacin por la unin especfica de los hbridos a una matri
z como la hidroxiapatita. que slo une estructuras dplex. Una vez que los hbridos es
tn unidos, la sonda no hibridada se puede eliminar eficientemente lavndola. La det
eccin de la marca en la sonda ya unida permite la cuantificacin de la reaccin de hi
bridacin. En una variante de esta propuesta, un ensayo comercial (captura de hbrid
os) utiliza un anticuerpo especfico de ADN y ARN hbridos para unir especficamente e
structuras dplex formadas de la diana de ADN y la sonda de ARN, Un anlisis alterna
tivo incluye la digestin de la mezcla de reaccin de hibridacin con la nucleasa S1,
que es una enzima que slo acta en el cido nucleico monohebra. Las estructuras dplex
que son resistentes a la digestin pueden ser precipitadas por un tratamiento de ci
do tricloroactico. En el ensayo de proleccin por la hibridacin, la marca de la sond
a est protegida de la degradacin qumica solamente cuando la sonda est insertada en u
na estructura dplex. En la actualidad se utilizan muchas otras variaciones del en
sayo de hibridacin de fase de solucin. Lo que hace que este ensayo se adapte a las
aplicaciones clnicas es la ptima cintica, la tolerancia a los pasos de purificacin
abreviados y alguna degradacin de la muestra. Se puede conseguir la cuantificacin
del producto de la reaccin, dependiendo del sistema de deteccin. El lormato de las
e de solucin no permite la identificacin del tamao del producto hibridado. Las reac
ciones positivas bajas son difciles de interpretar, ya que los bajos niveles de l
as dianas especficas y los altos niveles de las dianas de reaccin cruzada dbiles da
rn resultados similares. La hibndacin en lase de solucin se puede adaptar al format
o de 96 pocilios con un lector tipo del empleado en un ensayo mmunosorbente unid
o a enzima (ELISA), lo que permite anticipar un aumento de la automatizacin del e
nsayo.
Hibridacin de soporte slido
Las variaciones de los ensayos de hibridacin de soporte slido incluyen la hibridac
in en puntos o por transferencia, la hibridacin Southern y Northern y la hibridacin
m situ. En estos ensayos la hibridacin se produce en un ambiente bifsico, una fas
e slida (generalmente la muestra) y una fase lquida (generalmente la sonda). La ci
ntica de la hibridacin de un cido nucleico unido a un soporte slido se retrasa enorm
emente y limita la extensin de la

CAPTULO 59

DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

1285

ADN seguida por la incubacin con soluciones de protenas, lo que permite la evaluac
in de las protenas especficas de unin a ADN.) En estas dos ltimas tcnicas, la prepara
in de muestras lleva mucho tiempo y el trabajo es intensivo. El ensayo no tolera
la degradacin del cido nucleico de la muestra y requiere una cantidad relativament
e grande de material de partida. En la hibridacin Southern, el ADN debe ser purif
icado con cortes mnimos. Esto se debe a que el tamao de los fragmentos se consigue
a travs de la digestin con una o ms enzimas de restriccin. La degradacin y los corte
s presentan roturas aleatorias en la muestra, lo que reduce la cantidad disponib
le para ser cortada especficamente en las secuencias de reconocimiento adecuadas.
Las impurezas de la muestra pueden interferir con la actividad y la susceptibil
idad de la secuencia de la enzima de restriccin. Las muestras digeridas parcial o
inadecuadamente pueden producir tamaos de bandas espreos o dar como resultado una
concentracin reducida de la banda especifica que ya no ser detectada durante la h
ibridacin. El material de partida para las hibndizaciones Northern es el ARN. y h
ay que tener un cuidado excesivo para evitar la degradacin durante la recogida y
preparacin de las muestras, debido a la naturaleza ubicua de las RNasas. El ARN e
sta compuesto de fragmentos de tamaos determinados por la transcripcin y el proces
amiento del ARN mensajero y ribosmico. No se digiere antes de la electroforesis,
pero se separa bajo condiciones desnaturalizantes para eliminar la estructura se
cundaria. Los fragmentos separados por tamao en el gel de agarosa son luego trans
feridos a un filtro de nailon o de nitrocelulosa. La transferencia se produce de
forma pasiva por la accin capilar, como se dise originalmente. En la mayora de las
aplicaciones actuales se utiliza el vacio o la presin para acelerar la transferen
cia. Despus de ser transferidos, los cidos nucleicos estn inmovilizados por hornead
o o por uniones cruzadas generadas por luz UV y toda la membrana hibridada con s
ondas marcadas. A la hibridacin le sigue la deteccin por autorradiografia, colorim
etria o quimioluminiscencia de bandas que contienen secuencias complementarias d
e la sonda. La interpretacin incluye la deteccin de las especies hibndadas y la de
terminacin del peso molecular de la molcula. Estos ensayos, tcnicamente muy exigent
es, necesitan varios das para ser ejecutados, aunque pueden ser necesarios para a
plicaciones clnicas en las que no se pueda obtener la informacin por medio de ningn
otro formato. La presencia de bandas de pesos moleculares diferentes de muestra
s normales o de linea germinal (no alteradas por el desarrollo experimental) pue
de indicar un cambio en el material gentico. Hibridacin in sito. La hibridacin in s
itu es, simplemente, la deteccin de informacin gentica en un contexto morfolgico. Es
te tipo especializado de ensayo de soporte slido incluye el tomar tejidos morfolgi
camente intactos, clulas o cromosomas adheridos a un portaobjetos de cristal de m
icroscopio a travs del proceso de hibridacin. Se han aplicado mtodos de deteccin aut
orradiogrficos, colonmtricos y lluorescentes. La evaluacin del producto final es mu
y similar a la evaluacin de inmunoqumica, y es necesario tener experiencia en hist
opalologa. La fuerza de este mtodo recae en la unin de la evaluacin morfolgica micros
cpica con la deteccin de la hibridacin. Este mtodo tiene tambin aplicaciones en los a
nlisis citogenticos de cromosomas metalsicos esparcidos o de ncleos en mterfaz. La d
eteccin, en este contexto, se hace normalmente por fluorescencia, y a la tcnica se
la denomina hibridacin in situ fluorescente (HISF). Se puede conseguir, rpidament
e, la deteccin de aberraciones numricas o la translocacin de cromosomas utilizando
sondas para dianas especificas. La HISF evita algunas de las dificultades de la
citogentica convencional y puede tener una mayor susceptibilidad hacia algunas di
anas. Aunque la HISF no puede reemplazar completamente a los canotipos, puede co
mplementar y reducir la necesidad de la frecuencia de los anlisis citogenticos. La
s nuevas variaciones de la HISF (Luke. 1998) explotan las posibilidades de autom
atizacin (HISF-rpida). y difusin de la informacin que se puede obtener de un solo en

sayo. La FICTION (inmunofenotipado fluorescente y la citogentica de interfaz como

una herramienta para la investigacin de neoplasmas) combina el inmunofenotipado
con la HISF; la HISF de fibra hace posible el detectar y hacer un mapa de los pu
ntos de rotura cromosmicos simultneamente. La HISF se explica con ms detalle en el
Capitulo 62. La hibridacin in situ puede ser tediosa y de trabajo intensivo. Las
recientes mejoras han dado como
resultado el procesamiento automatizado de portaobjetos durante el ensayo y son
muy prometedoras en cuanto a que esta tcnica se adopte ms ampliamente. Tecnologa de
los chips de ADN. Se ha desarrollado una nueva variacin de hibridacin de soporte
slido (Pease. 1994) Utilizando chips de alcona miniaturizados y sntesis de fase sli
da generada por luz. se han construido repeticiones densamente empaquetadas de o
ligonuclelidos unidos. Los chips, que contienen todas las combinaciones de oligon
ucletidos relativamente cortos (p. ej.. 65.536 combinaciones para un octmero). se
pueden hibridizar a una muestra marcada por fluorescencia (un formato de ensayo
inverso de hibridacin de puntos). La fluorescencia localizada ndica la presencia d
e una secuencia complementaria, y por el alineamiento de secuencias superpuestas
se puede ejecutar un anlisis rpido de secuencias. Hay muchas variaciones sobre es
te tema, incluidos los portaobjetos de cristal (microrrepeticiones) o los filtro
s (repeticiones de filtros de alta densidad) con las dianas de ADNc inmovilizada
s. Este tema se expone con ms detalle en el Capitulo 61.
Mtodos de amplificacin
Es prcticamente imposible leer cualquier revista mdica sin encontrarse con. al men
os, una aplicacin de la tecnologa de la reaccin en cadena de la pohmerasa (PCR). La
PCR ha cambiado para siempre el mbito de los problemas de investigacin, que puede
n ser solucionados eliminando prcticamente el problema del tamao limitado de las m
uestras. Se ha reconocido la importancia y elegancia de este concepto concedindol
e el Premio Nobel de Quimica a su inventor. Kary Mulls, menos de 10 aos despus de l
a publicacin de la primera aplicacin prctica de la PCR (Saiki. 1985). Ahora hay otr
as metodologas que han dado como resultado la multiplicacin de las dianas, las son
das y las seales. Todas ellas se pueden agrupar bajo el epgrafe de tecnologas de am
plificacin y se exponen en el Capitulo 60
Ensayos basados en los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restric
cin
Los ensayos de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (
PLFR) son conocidos como los ensayos que utilizan la propiedad de las secuencias
de reconocimiento de las enzimas de restriccin para demostrar las variaciones de
los polimorfismos en la secuencia de ADN de dos muestras. El ADN genmico o el AD
N producido por la PCR. es digerido por una enzima de restriccin y los fragmentos
son analizados por la electroforesis en gel. seguido de la visualizaron de la b
anda o del anlisis de manchas Southern con una sonda especfica de sitio. Los cambi
os en la secuencia del ADN pueden dar como resultado la alteracin de la secuencia
de reconocimiento de la enzima. Esta alteracin puede introducir sitios de enzima
s de restriccin adicionales, eliminar sitios de restriccin o insertar o eliminar s
ecuencias entre los sitios de restriccin. Estos cambios se vern reflejados en el c
ambio del tamao de la banda visualizada en un gel o hibndizando a la sonda especfi
ca de sitio. No todos los cambios, por supuesto, se vern reflejados en una secuen
cia de reconocimiento alterada, por eso el tamao de la banda inalterado tiene que
ser interpretado en el contexto de los marcadores y de las frecuencias conocida
s de los polimorfismos en la regin En algunos ensayos, en cada muestra se produce
la digestin de una o varias enzimas de restriccin antes del anlisis de manchas Sou
thern. Esta propuesta es m u y til para los estudios de familia, c o m o se ve en
la Figura 59-9. Se pueden utilizar los polimorfismos en el ADN estrechamente en
lazados a un gen de la enfermedad para predecir la herencia del alelo alterado.
Muchos marcadores son especficos de locus y existen mapas cromosmicos de estos mar
cadores. Para establecer marcadores allicos. estas regiones que tienen el mximo de
vanaciones y el mximo de polimorfismos son las de ms fcil utilizacin. Las reas de se
cuencias repetitivas dentro del cromosoma, conocidas como nmeros variables de rep

eticiones en tndem, son algunos de los marcadores ms polimrficos, y pueden dar luga
r a un patrn complejo de bandas o 'huella gentica". En los estudios de familias co
n enfermedades hereditanas (gentica clsica) y para identificar regiones del genoma

1286
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR gentica molecular. Se denomina clonacin posicional y es un proce

so que utiliza el anlisis de enlaces PLFR de familias que portan y expresan la en
fermedad, para localizar marcadores polimrficos que se acercan cada vez ms y ms al
gen de la enfermedad, hasta que ste es localizado al fin. Los marcadores polimrfic
os, fuertemente unidos, que tienden a segregarse con la enfermedad, se pueden ut
ilizar en los anlisis diagnsticos, clnicamente tiles, antes incluso de que el gen es
t completamente caracterizado y de que la protena producto est finalmente idenlific
ada. En esta lnea, primero se desarrollan y utilizan los anlisis moleculares de di
agnstico, que luego se sustituyen por mtodos ms simples y econmicamente ms efectivos,
dirigidos al nivel del producto gnico, cuando se ha entendido por completo el re
sultado de la mutacin.
Ms all del diagnstico
Los anlisis moleculares tienen el potencial para desarrollar al mximo el papel del
laboratorio en reas que van ms all del diagnstico de la enfermedad. El anlisis molec
ular de las mutaciones somticas del cncer tiene la posibilidad de proporcionar inf
ormacin sobre el pronstico, de aconsejar la eleccin de una terapia ptima y de montori
zar la respuesta a la terapia. Ahora se estn examinando en varios tipos de malign
idades las implicaciones del uso de marcadores moleculares para detectar clulas n
eoplsicas, en ausencia de evidencia clnica o morfolgica de la enfermedad, conocida
como enfermedad mnima residual (vase Cap. 65). Esta propuesta de utilizar marcador
es moleculares para detectar la enfermedad puede anticipar las consecuencias de
los mtodos secundarios de la prevencin del cncer (seleccin) y la valoracin de suficie
ncia de la reseccin quirrgica (evaluacin de mrgenes). La terapia gnica para las enfer
medades genticas hereditarias, as c o m o para el cncer, se est llevando a la prctica
y est basada en el conocimiento detallado de la enfermedad subyacente. La monito
rizacin de estos pacientes para conocer la presencia y la actividad del gen terapu
tico introducido aadir otro aspecto a la evaluacin de la enfermedad del laboratorio
.
Figura 59-9. Ejemplo del anlisis de los polimorfismos de la longitud de los fragm
e n t o s de restriccin (PLFR). (M = madre; P = padre; H = hijo.) (Por cortesa y
adaptada de Piper MA, Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer for Pathologists.
Chicago, ASCP Press, 1989.)
BIBLIOGRAFIA
alteradas durante la neoplasia (mutaciones somticas), el PLFR es muy til para esta
blecer el vnculo de una regin del genoma con la enfermedad. Alberts B, B r a y D,
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RELACIN DE LA ENFERMEDAD CON LA EVALUACIN EN LABORATORIO
Los captulos siguientes describen las aplicaciones actuales de los diagnsticos mol
eculares. Est claro que esta nueva tecnologa ha mpactado en todas la reas de diagnsti
cos del laboratorio. Los mtodos moleculares tienen tambin el potencial de redefini
r la evaluacin de la enfermedad por el laboratorio, para incluir resultados ms all
del diagnstico de la enfermedad.
Diagnstico molecular
Las ventajas del enfoque molecular para los diagnsticos se expondrn detallando cad
a aspecto de las aplicaciones actuales. Sin embargo, es m u y importante recorda
r que estos nuevos anlisis moleculares probablemente no sustituirn a los anlisis tr
adicionales en un futuro inmediato. El coste y la complejidad de esta tecnologa t
ienden a restringir sus primeras aplicaciones para situaciones diagnsticas especi
ales, donde la informacin obtenida no se poda proporcionar por ningn otro mtodo. El
aumento de la automatizacin y los mtodos diseados comercialmente rebajarn los costes
, reducirn el nivel de los tcnicos especializados que se precisan para realizar lo
s anlisis y el resultado ser la integracin de la tecnologa molecular en la lnea centr
al de los anlisis del laboratorio. En el centro de la explosin de informacin actual
de la ciencia mdica est la deteccin de las mutaciones y su asociacin con la enferme
dad y en muchas de las aplicaciones de los diagnsticos moleculares. La capacidad
de localizar un gen responsable de una enfermedad sin conocer la protena producto
es una de las consecuencias ms importantes de la revolucin de la

C A P T U L O
60
Reaccin en cadena de la polimerasa y otras tecnologas de amp ificacin
James C. Zimring, M.D., Ph.D. Frederick S. Nolte, Ph.D. MTODOS DE AMPLIFICACIN DE
LAS DIANAS Reaccin en cadena de la polimerasa Amplificacin mediada por transcripcin
/amplificacin del cido nucleico basada en secuencias Amplificacin del desplazamient
o de la hebra MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SONDA Reaccin en cadena de la ligasa Tecnol
oga invasora/enzima de rotura 1291 1287 MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SEALES ADN ramific
ado Ensayo de captura de hbridos CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA 1294 1294 1294
El desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) por Mulls y otros col
aboradores (Saiki. 1988) tue un hito en la biotecnologa y anunci el comienzo de lo
s diagnsticos moleculares. Aunque la PCR es la estrategia de amplificacin del cido
nucleico ms ampliamente utilizada, se han desarrollado otras estrategias, y algun
as de ellas tienen propiedades y ventajas nicas en su gnero. Estas estrategias estn
basadas en la amplificacin de las dianas, de las sondas y de las seales. En las s
ecciones siguientes se exponen los ejemplos de cada una de ellas. Estas tcnicas t
ienen una sensibilidad sin igual en la medicina de laboratorio y han originado n
uevas oportunidades para que el laboratorio clnico sea efectivo en el tratamiento
de los pacientes, en las reas de las enfermedades infecciosas, en el cncer y en l
os desrdenes genticos.
MTODOS DE AMPLIFICACIN DE LAS DIANAS
Todos los sistemas de amplificacin de las dianas comparten ciertas caractersticas
fundamentales. Son procesos mediados por enzimas en los que una sola enzima o mlt
iples enzimas sintetizan copias de un cido nucleico diana. En todas las tcnicas, l
os productos de la amplificacin estn especificados por 2 oligonucletidos cebadores
que se unen a las secuencias complementarias en las hebras opuestas de las diana
s de doble hebra. Todo el resultado de la produccin de millones a billones de cop
ias de la secuencia a amplificar es cuestin de horas y, en cada caso, los product
os de la amplificacin pueden servir como moldes para las rondas de amplificacin su
bsiguientes Debido a esto, todas estas tcnicas son sensibles a la contaminacin con
productos moleculares de anteriores amplificaciones y pueden originar reaccione
s de falsos positivos. Sin embargo, se han desarrollado diseos de laboratorio esp
eciales, prcticas y flujos de trabajo para reducir, a niveles aceptables, la posi
bilidad de reacciones de falsos positivos.
equimolar de desoxirribonucletidos trifosfato (dATP. dCTP. dGTP y dTTP). de MgCI
, KCI y un tampn de Tns-HCI. Los dos cebadores flanquean a la secuencia que va a
ser amplificada, suelen ser de menos de 100 bases y son complementarios a las he
bras opuestas de la diana. Para iniciar una PCR se calienta la mezcla de la reac
cin, para separar las dos hebras del ADN diana, luego se enfra para permitir a los
cebadores que se anillen al ADN diana de forma secuencia-especifica. Despus, la
ADN polimerasa inicia la extensin de cada cebador desde sus extremos 3 en direcci
ones opuestas. Los productos de la extensin de los cebadores se disocian de la di
ana de ADN mediante calor. Cada producto de la extensin, lo mismo que la diana or
iginal, puede servir como un molde para las rondas subsiguientes de anillamienlo
y extensin del cebador. Un ciclo de PCR consta de tres etapas: desnaturalizacin,
anillamiento y extensin. Los productos de la PCR se duplican, tericamente, despus d
e cada ciclo. Por eso, despus de n ciclos de PCR la secuencia de la diana se pue
de amplificar 2" veces. Todo el procedimiento se lleva a cabo en un termociclado
r programable que controla con exactitud la temperatura a la que se producen las
etapas, la cantidad de tiempo en el que se mantiene la reaccin a las diferentes
temperaturas y el nmero de ciclos. Lo ideal es que despus de 20 ciclos de PCR. se
consiga una amplificacin del orden de millones de veces y despus de 30 ciclos, una
del orden de billones de veces. En la prctica, la amplificacin puede que no sea c
ompletamente eficiente, debido a errores en la optimizacin de las condiciones de
la reaccin o a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa. En estos casos,

la amplificacin total est mejor descrita por la expresin (1 + e)", donde e equivale
a la eficiencia de la amplificacin (0<e<1) y n es el nmero total de ciclos
?
PCR transcriptasa inversa
La PCR, como se la describi originalmente, tue una tcnica para la amplificacin del
ADN. La PCR transcriptasa inversa (PCR-TI) se desarroll para amplificar las diana
s de ARN. En este proceso, primero se produce el ADN complementario (ADNc). a pa
rtir de dianas de ARN. por transcripcin inversa, y ms tarde se amplifica el ADNc p
or PCR. De acuerdo a la descripcin original, la PCR-TI emplea dos enzimas: una TI
termolbil, como la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviario (VM
A-TI). y una ADN polimerasa termoestable. La sntesis del ADNc debe producirse a t
emperaturas ms bajas, debido a los requisitos de temperatura de la enzima termolbi
l. Esto presentaba problemas en cuanto al anillamiento de cebadores no especficos
Reaccin en cadena de la polimerasa
La PCR es una sencilla reaccin qumica, in vitro. que permite la sntesis de cantidad
es esencialmente ilimitadas de una secuencia de un cido nucleico diana. Esto se h
ace a travs de la accin de una polimerasa de ADN que, bajo las condiciones adecuad
as, puede copiar una hebra de ADN. En su forma ms simple, la PCR consiste en ADN
diana, un exceso molar de 2 oligonucletidos cebadores, una polimerasa de ADN term
oestable, una mezcla

1288
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR El concepto bsico detrs de la PCRc es la coamplifcacin en el mismo

tubo de reaccin de dos moldes diferentes de longitud igual o similar y con las m
ismas secuencias de unin de cebadores. La garanta de la eficiencia de la ampliacin
y la idntica termodinmica se debe a que ambos moldes se amplifican con el mismo pa
r de cebadores. Se debe conocer la cantidad de uno de los moldes y. despus de la
amplificacin, se tienen que poder distinguir los productos de ambos. En la PCRc s
e han utilizado diferentes tipos de competidores, pero, en general, aquellos que
actan de una manera ms eficiente son los que tienen un tamao similar y una composi
cin de bases igual a la diana. Para acometer el problema de la eficiencia variabl
e de la TI, en las PCR-TI cuantitativas se deberan utilizar competidores de ARN.
El rendimiento del producto de la PCR est descrito por la ecuacin Y = /(1+e)\ dond
e Y es la cantidad de producto PCR, / es la cantidad de molde al principio de la
reaccin, e es la eficiencia de la reaccin y n es el nmero de ciclos. Esta ecuacin,
para la PCRc, est escrita para ambas muestras y es como sigue: competidor. Y = 4(
1 + e) ; y diana, V, = f,(1 + e) . Dado que e y n son iguales para el competidor
y la diana, el ndice relativo del producto Y,IY, depende directamente de su ndice
de concentracin inicial l ll. y la funcin. V /y, = l U es lineal.
n n c c c c r
y a la extensin ineficaz del cebador a causa de la formacin de estructuras secunda
rias de ARN. Estos problemas se han superado con creces por el desarrollo de una
ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus thermophilus. que b
ajo las condiciones adecuadas puede funcionar eficientemente como una TI y como
una ADN polimerasa (Myers. 1991). Las PCR-TI que utilizan esta enzima son ms efic
ientes y especficas que los protocolos anteriores que utilizan enzimas de TI term
olbil convencionales. Se pueden obtener equipos comerciales (Roche) que emplean P
CR-TI de una sola enzima para la deteccin del ARN del virus de la hepatitis C (VH
C) y para determinar la cantidad del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1
(VIH-11 y de ARN-VHC en muestras clnicas.
PCR anidada
La PCR anidada se desarroll para aumentar tanto la sensibilidad como la especific
idad de la PCR (Haqqi, 1988). Emplea dos pares de cebadores de amplificacin y dos
rondas de PCR. Por lo general se utiliza un par de cebadores en la primera rond
a de PCR de 15 a 30 ciclos. Los productos de la primera ronda de amplificacin estn
sujetos, despus, a una segunda ronda de amplificacin utilizando la segunda serie
de cebadores, que anillan en una secuencia interna a la secuencia amplilicada po
r la primera serie de cebadores. El aumento de la sensibilidad proviene del alto
nmero total de ciclos y el aumento de la especificidad proviene del anillamiento
de la segunda serie de cebadores a las secuencias que slo se hallan en los produ
ctos de la primera ronda. El alto ndice de contaminacin, que puede darse durante l
a transferencia de los productos de la primera ronda al segundo tubo para la seg
unda ronda de amplificacin, es la mayor desventaja de la PCR anidada. Esto se pue
de evitar bien por la separacin fsica de las muestras de la primera y de la segund
a ronda, con una lmina de cera o de aceite, o bien diseando protocolos de amplific
acin de un solo tubo. En la prctica, raramente se requiere para las aplicaciones c
lnicas el aumento de la sensibilidad que proporcionan los protocolos de la PCR an
idada, y generalmente se confirma la identidad de un producto de amplificacin, hi
bridndolo con una sonda de cido nucleico.
En teora, para cuantificar una cantidad desconocida de dianas sin tener que utili
zar una curva patrn es suficiente una sola concentracin de competidor. Sin embargo
, generalmente se ejecuta la PCRc que utiliza vanas concentraciones de competido
res dentro de la esperada y amplia concentracin de la diana, ya que el anlisis de

dos especies de moldes presentes en una muestra, en cantidades enormemente difer

entes, puede ser difcil e impreciso en la prctica. Por otro lado, este mtodo no pro
porciona resultados ms exactos que la utilizacin de una sola concentracin de compet
idores, segn recientes estudios de diferentes mtodos para la estandarizacin de la P
CRc (Haberhausen, 1998). Los ensayos de la PCR cuantitativa para el citomegalovi
rus (CMV), el VIH-1 y el VHC (Sistemas Moleculares Roche), comercialmente dispon
ibles, utilizan todos ellos una sola concentracin de un competidor para determina
r la concentracin inicial de la diana.
PCR en tiempo real PCR mltiple
En la PCR mltiple estn incluidas en la misma mezcla de reaccin dos series, o ms, de
cebadores, diseados para la amplificacin de diferentes dianas (Chamberiain, 1988).
Con esta tcnica se puede co-amplificar en un solo tubo ms de una secuencia diana
en una muestra clnica. Los cebadores que se utilizan en las reacciones mltiples de
ben ser cuidadosamente seleccionados para que tengan temperaturas de anillamient
o similares y carezcan de complementariedad. Las PCR mltiples son ms complicadas d
e desarrollar y tienen menos sensibilidad que las reacciones de la PCR donde se
usa una sola pareja de cebadores, pero permiten detectar mltiples dianas en una s
ola muestra en una reaccin. La PCR en tiempo real describe los mtodos por los que
la deteccin y la amplificacin de la diana se producen simultneamente en el mismo tu
bo. Estos mtodos precisan de termocicladores especiales de precisin ptica, que son
capaces de montorizar la emisin de fluorescencia de los pocilios de muestras. El s
oftware del ordenador que da soporte a los termocicladores monitoriza los datos,
durante toda la PCR, de cada ciclo y genera un campo de amplificacin en cada rea
ccin. En su formato ms simple, el producto de la PCR es detectado al mismo tiempo
que se produce, utilizando colorantes fluorescentes que se unen, preferentemente
, al ADN de doble hebra. Uno de los colorantes que se utilizan en esta aplicacin
es el SYBR Green I (Morrison, 1998). La fluorescencia es relativamente baja en e
l estado de no ligado, pero cuando se u n e al ADN de doble hebra, la fluorescen
cia se amplifica enormemente. El colorante unir a los productos especficos y no es
pecficos de la PCR. Se puede incrementar la especificidad de la deteccin mediante
un anlisis de la curva de separacin. El producto especfico amplificado tendr un pico
de separacin caracterstico en su temperatura de separacin prevista (TJ, mientras q
ue los dmeros cebadores y otros productos no especficos tendrn una T, diferente o da
rn unos picos ms amplios (Ririe, 1997). Tambin se puede incrementar la especificida
d de la PCR en tiempo real incluyendo sondas de hibridacin en las mezclas de las
reacciones. Estas sondas estn marcadas con colorantes fluorescentes o con combina
ciones de fluorescencia y un colorante aplacador. En el ensayo de la PCR de nucl
easa 5' (Taqman). la actividad 5' a 3' exonucleasa de la ADN polimerasa Taq se u
tiliza para cortar una sonda de hibridacin que es incapaz de alargarse durante la
primera fase de alargamiento de la PCR (Holland, 1991). Este mtodo utiliza sonda
s de hibridacin fluorognicas de mareaje dual. U n colorante fluorescente sirve com
o reportero y su espectro de emisin es aplacado por el segundo colorante fluoresc
ente. La degradacin de la sonda de hibridacin por la nucleasa libera al colorante
reportero, y el resultado es un aumento del pico de emisin de fluorescencia. El a
umento de la
PCR y PCR-TI cuantitativas
Puede existir una relacin lineal entre la cantidad de molde inicial y la cantidad
de producto de la amplificacin. Sin embargo, ya que la cantidad final de product
o de la PCR depende de la amplificacin exponencial de la cantidad inicial de mold
e, pequeas diferencias en la eficiencia de la ampliacin pueden conducir a enormes
diferencias imposibles de predecir en el rendimiento del producto final (Clement
i, 1993). Las diferencias tubo-a-tubo pueden depender de la preparacin de la mues
tra y de los procedimientos de purificacin del cido nucleico, de la presencia de i
nhibidores y de la actuacin del termociclador. Por estas razones, la simple cuant
ificacin del producto amplificado y la utilizacin de curvas de referencia de patro
nes externos no proporcionan una cuantificacin exacta del molde que estaba inicia
lmente presente en la muestra. Se han desarrollado varias estrategias basadas en
la PCR para cuantificar exactamente las dianas de ADN y de ARN en muestras clnic

as. Est generalmente aceptado que un mtodo de PCR competitivo (PCRc) es el ms fiabl
e y robusto.

CAPTULO 60

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGAS DE AMPLIFICACIN

1289
emisin fluorescente indica que se ha obtenido el producto de la PCR especifico y
que la intensidad de la fluorescencia es relativa a la magnitud del producto (He
id, 1996) La base de otro mtodo de PCR en tiempo real es la transferencia de ener
ga por resonancia de fluorescencia (TERF) (Lay, 1997). Este mtodo necesita dos son
das de oligonucletidos especficos de secuencia especialmente diseadas. Estas sondas
de hibridacin estn diseadas para hibridarse. una al lado de la otra, en la molcula
del producto. El extremo 3' de una sonda est marcado con un colorante donador y e
l extremo 5' de la otra sonda est marcado con un colorante aceptador mediante un
proceso denominado TERF. El colorante aceptar excitado emite luz en una longitud
de onda ms larga que el colorante donador no unido, y la intensidad de emisin de
luz del colorante aceptador es proporcional a la magnitud del producto de la PCR
. Tambin se puede realizar la deteccin y la cuantificacin en tiempo real del produc
to de la PCR, utilizando guas moleculares (Tyagi, 1998). Las guas moleculares son
sondas de oligonucletidos en forma de horquilla con un fluorforo aplacado internam
ente cuya fluorescencia se restablece cuando se unen a un cido nucleico diana. Es
tn diseadas de tal manera que la porcin del asa de la molcula de la sonda es complem
entaria a la secuencia de la diana. El tallo se forma por el anillamiento de sec
uencias de brazos complementarias en los extremos de la sonda. Un colorante fluo
rescente est insertado en un extremo de un brazo y una molcula aplacadora est inser
tada en el extremo del otro brazo. El tallo mantiene en contacto al fluorforo y a
l aplacador, de modo que no se produce ninguna emisin de luz. Cuando la sonda enc
uentra una molcula diana, forma un hbrido ms largo y ms estable que el tallo y sufre
un cambio de conformacin que obliga al tallo a abrirse, lo que hace que el fluorf
oro y el aplacador se alejen el uno del otro, restablecindose la fluorescencia. L
os mtodos de la PCR en tiempo real disminuyen el tiempo que se requiere para los
ensayos de cido nucleico, debido a que no existen etapas de procesamiento post-PC
R. Adems, y dado que la deteccin y la amplificacin tienen lugar en el mismo tubo ce
rrado, estos mtodos eliminan las manipulaciones postamplificacin, que pueden dar l
ugar a la contaminacin del laboratorio con el producto de amplificacin. Ms an, los mt
odos de la PCR en tiempo real se prestan a las aplicaciones cuantitativas, porque el anlisis se ejecuta en la fase temprana del registro de acumulacin d
el producto.
Amplificacin mediada por transcripcin/ amplificacin del cido nucleico basada en secu
encias
La amplificacin mediada por transcripcin (AMT) y la amplificacin del cido nucleico b
asada en secuencias (AANBS) son dos tcnicas isotrmicas de amplificacin del cido nucl
eico, aunque en la prctica son ligeramente distintas, cuyo concepto es exactament
e igual, por lo que se describen juntas (Kwoh, 1989; Compton. 1991). Esencialmen
te, estas tcnicas resumen el ciclo de vida del retrovirus n vilro convirtiendo el
ARN en ADN y utilizando luego el ADN como molde para la transcripcin de copias mlt
iples de ARN. El proceso comienza cuando una diana de ARN. que en la mayora de lo
s casos existir como una entidad de una sola hebra (Fig. 60-1, etapa 1), elimina
la necesidad de desnaturalizacin termal del molde antes de la amplificacin. Un ceb
ador de ADN especfico de secuencia se une a la diana de ARN (Fig. 60-1. etapa 2).
Luego la transcriptasa inversa prolonga el cebador, creando un heterodplex de AD
N-ARN (Fig. 60-1. etapa 3). El extremo 5' del cebador especifico de secuencia no
es complementario a la diana; ms bien contiene al promotor de una T7 polimerasa
bacterilaga. La presencia de este promotor T7 en el extremo 5' del cebador da com
o resultado la sntesis de una hebra de ADN complementaria a la diana inicial de A
RN que contiene al promotor T7 en su extremo 5'. En el caso de la AMT, la enzima

transcriptasa inversa degrada el molde inicial de ARN al mismo tiempo que sinte
tiza su ADN complementario. En la AANBS. una enzima separada. ARNsa H. degrada a
l molde inicial de ARN. La ARNsa H rompe selectivamente el ARN, que forma estruc
turas heterodplex con el ADN. pero no al ARN solo (Fig. 60-1, etapa 4). En ambos
casos, el T7 que contiene ADN complementario es liberado de su ARN asociado, lib
erndolo para unirse a un segundo molde, que se une al extremo 3' de la molcula de
ADN (Fig. 60-1, etapa 5). La ADN polimerasa se prolonga desde este segundo molde
, dando como resultado la sntesis de una molcula de ADN de doble hebra que contien
e un promotor T7 intacto. (Fig. 60-1, etapa 6).

1290
SECCIN Vil

PATOLOGA MOLECULAR tas endonucleasas de restriccin, que precisan, en su sitio de r

econocimiento, de un dATP autntico. El cebador est diseado para contener, justament
e, este sitio de reconocimiento, en este caso un sitio de Hinc II. La digestin de
l sitio de restriccin da como resultado una muesca en el cebador, pero deja al dA
TP[a-S] que contiene la hebra intacto (Fig. 60-2, paso 5). La muesca en el extre
mo 5' del cebador que contiene la hebra permite que la ADN polimerasa se alargue
desde el sitio de la muesca en direccin 3 . desplazando al ADN, previamente sint
etizado, segn se va alargando (Fig. 60-2, paso 6) En esta etapa, se utiliza el fr
agmento Klenow mutado de la ADN polimerasa I, que est perdiendo su actividad 5' a
3' exonucleasa. para que la hebra desplazada contine intacta. A la vez que el al
argamiento desde el sitio de la muesca desplaza a la hebra existente, regenera u
n sitio de restriccin intacto. La presencia de dATP[i/.-S] en posicin 5 del sitio
de restriccin restablecido no inhibe las digestiones subsiguientes por Hinc II. P
or tanto, se puede producir una segunda digestin que regenere una muesca, y de es
ta manera se produce un sustrato para un segundo desplazamiento de la ADN polime
rasa. Este proceso contina de forma cclica y da como resultado la amplificacin de l
a ADN diana. Para obtener una amplificacin exponencial, se utilizan dos cebadores
, uno para cada hebra. En este caso, el producto del desplazamiento del cebador
1 hbrida al cebador 2 y genera un nuevo ADN de doble hebra con hemifosforotioato,
que puede generar sus propios productos de desplazamiento, los cuales a su vez
rehibridan al cebador 1, dando lugar a una amplificacin exponencial (Fig. 60-3).
La metodologa inicial de la ADH tiene bastantes limitaciones, incluyendo la neces
idad de la digestin de restriccin de la muestra, antes de la amplificacin de la dia
na, y que el producto de la amplificacin no contenga el m i s m o sitio de restri
ccin que el se ha utilizado para la digestin del cebador. Para superar la primera
de estas limitaciones, se desarroll un sistema inteligente que utiliza cuatro ceb
adores para definir una regin diana. Para hacer ms fcil la explicacin, se expondr por
etapas amplias, enfocndolo primero hacia una sola hebra. Claro que. en realidad,
el resultado de este sistema es un proceso dinmico, con muchos procesos que suce
den simultneamente. En este procedimiento, el ADN no digerido es separado (Fig. 6
0-4, paso 1), y un cebador igual al que se describe en la Figura 60-2 hbrida a su
regin diana en el ADN (Fig. 60-4, paso 2). El extremo 3 del cebador que hibnda a
l molde es alargado, luego, a lo largo del molde por la ADN polimerasa, c o m o
se ha descrito previamente (Figura 60-4, paso 3). En este caso, y dado que el AD
N no ha sido digerido el extremo 5' del cebador no es un extremo saliente, sino
que est simplemente no hibndado. Por esta causa, el extremo 5 del cebador no est s
ellado por la ADN polimerasa. En este punto, el segundo cebador hbrida hacia arri
ba (como las aguas de un ro) al primer cebador, lo que permite a la ADN polimeras
a alargarse desde l en direccin 3 y desplazar a la hebra que contiene al primer ce
bador (Fig. 60-4, pasos 4 y 5). Tambin estn presentes otro par de cebadores, disead
os para ejecutar la m i s m a tarea en la hebra opuesta. La amplificacin exponenc
ial se produce a lo largo de las lneas, como se muestra en la Figura 60-3. debido
a que los productos de un par de cebadores sirven como molde para el segundo pa
r de cebadores. En realidad, lo que ocurre en el tubo de ensayo es ms complicado
que todo esto, en l se forman vanos subproductos tericos a lo largo del proceso; s
in embargo, aqu se describen los productos mas importantes del sistema. Las aplic
aciones clnicas de la ADS incluyen la deteccin directa en muestras clnicas de M. tu
berculosis, C. trachomatis y N. gonorrhoeae. La ADH ha demostrado tener una susc
eptibilidad lo suficientemente alta como para delectar slo de 10 a 50 copias de u
na molcula diana (Walker, 1992a). Utilizando una serie de cebadores diseados para
amplificar una secuencia repetitiva, con 10 copias en el genoma de M. tuberculos
is, el ensayo es tan susceptible que es capaz de detectar de una a cinco copias
del genoma de la bacteria. La ADH ha sido adaptada, recientemente, para cuantifi
car ARN, aadindole una etapa de transcriptasa inversa (TI-ADH). En este caso, un c

ebador hbrida a la ARN diana y una transcriptasa inversa sintetiza a un ADNc. Est
e ADNc sirve luego como molde para la incorporacin del cebador y el desplazamient
o de la hebra. Los productos del desplazamiento de esta hebra se alimentan despus
en el lugar de la amplificacin descrito anteriormente. Se ha utilizado la TI-ADH
para la determinacin de la carga viral del VIH (Nycz. 1998).
Esta molcula de ADN puede servir ahora como sustrato para la polimerasa T7. una e
nzima bacterifaga que reconoce especficamente al promotor 17 y que sintetiza copia
s mltiples de ARN (Fig. 60-1, etapa 7). Cada una de estas molculas de ARN, recient
emente sintetizadas, es antisentido a la diana inicial, lo que les permite hibri
dar al segundo molde. Luego, la transcriptasa inversa, el segundo cebador, la AR
Nsa H y la ADN polimerasa utilizan esta molcula de ARN antisentido como un molde
para sintetizar nuevos cebadores de ADN de doble hebra, quienes a su vez expresa
n ms molde de ARN. Asi, de esta lorma se produce una amplificacin exponencial. La
A M T y la AANBS tienen algunas ventajas que las diferencian de otras tcnicas de
amplificacin del ARN. Quiz la ms significativa de estas ventajas es que no se neces
ita la desnaturalizacin inicial para que se produzca la amplificacin. Por tanto, l
as secuencias de ADN de doble hebra no se separan nunca y por eso no son capaces
de unirse a los cebadores en la reaccin. La contaminacin del ADN puede ser esenci
almente problemtica cuando se utilizan tcnicas, como la PCR, para los ensayos de l
os transcritos del ARN de los genes retrovirales o de los genes eucariotas sin i
ntrones. La AMT y la AANBS eliminan el problema de la contaminacin del ADN dando
una determinacin falsamente elevada de ARN. Una segunda ventaja es que esta tecno
loga utiliza procesos isotrmicos, lo que hace innecesario el uso de termocicladore
s muy sofisticados. Combinando esta tecnologa con guias moleculares o con otras s
ondas especificas de secuencia, que se pueden aadir directamente a la mezcla de l
a amplificacin, se crea un sistema de tubo cerrado que ayuda a prevenir la contam
inacin cruzada con productos de amplificacin en el laboratorio. La AMT y la AANBS
se han aplicado con xito en una amplia gama de sistemas de ensayo. Se han utiliza
do para detectar varios patgenos, incluyendo a virus, como el VIH, el VHC, el de
la varicela, el virus zster, los citomegalovirus (CMV), el rinovirus, el del sara
mpin y el papilomavirus. y a bacterias, como Mycobacterium tuberculosis, Mycoplas
ma pneumoniae y Campylobacter ejuni. Adems, esta tecnologa ha cuantificado la carga
viral del VIH y del VHC. Tambin se han realizado anlisis de genes, como la tipifi
cacin del HLA y la mutacin del factor V de Leiden. En resumen, la AMT y la AANBS s
on tcnicas de amplificacin de ARN isotrmicas, con amplias aplicaciones y ventajas ni
cas sobre otros mtodos de amplificacin, en especial para la eliminacin de los probl
emas de contaminacin y, en particular, para aquellos relacionados con los genes s
in intrones y los retrovirales. La combinacin de estas tcnicas con sondas fluoresc
entes permite la amplificacin en tiempo real, en tubo cerrado y en una etapa, sin
necesidad de termocicladores.
Amplificacin del desplazamiento de la hebra
La amplificacin del desplazamiento de la hebra (ADH) es una tcnica isotrmica de amp
lificacin del molde que puede ser utilizada para detectar los rastros de ADN o de
ARN en una secuencia especfica. La ADH, segn se la describi al principio, era un p
roceso de amplificacin conceptualmente directo y con algunas limitaciones tcnicas
(Walker, 1992a. 1992b). Sin embargo, desde entonces ha evolucionado, y se ha con
vertido en una herramienta muy verstil que es tcnicamente simple, aunque conceptua
lmente compleja. Para explicar la ADH. primero hay que hablar de las metodologas
iniciales y despus rastrear el desarrollo de la tecnologa ADH actual. El proceso d
e la ADH. segn se describi al principio, empieza con una digestin de restriccin de l
a muestra de ADN para generar un fragmento de ADN que ha reconocido los extremos
3' y 5' (Fig. 60-2. paso 1). Este ADN digerido es separado luego (Fig. 60-2, pa
so 2) por la presencia de un cebador cuyo extremo 3' hbrida al extremo 5' del ADN
diana (Fig. 60-2. paso 3). El resultado es un fragmento de ADN con un extremo s
aliente 5' a ambos extremos. Luego, la ADN polimerasa se alarga desde el cebador
, para sellar el fragmento de una sola hebra de la diana, y se alarga desde el m
olde, para sellar el Iragmento de una sola hebra del cebador (Fig. 60-2, paso 4)
. Esta sntesis del ADN se produce en presencia de dCTP. dGTP, dTTP y de desoxiade

nosina 5-[t/.-thio) trifosfato (dATP[u-S]). La incorporacin de dATP (a-S) da como

resultado una nueva hebra de ADN sintetizada (representada por lineas pespuntea
das) que no puede servir como sustrato para cier-

CAPTULO 60
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGAS DE AMPLIFICACIN
1291
Digestion de restriccin Paso I Paso 2 p 3 S G-T-T-G-A-C '' La mayor ventaja de la
ADH es que es un proceso isotrmico que, a dife3' rencia de la PCR. se puede ejec
utar5 a' una mis ma|temperatura e; [ , \ (- despus de la desnaturalizacin inicial
de la sonda. proceso elimina aso4 r Este __( \ \ < l . la necesidad de utilizar
termocicladores caros. Otra de las ventajas s es s que las muestras se pueden so
meter a la ADH en un solo tubo, con tiempos de amplificacin que varan de 30 minuto
s a dos horas, La mayor desventaja de la ADH es el hecho lime II I de que, al co
ntrario que la PCR, por la temperatura relativamente baja a la . 5' i i i i ii \
r que se realiza la ADH Maso* el resultado puede V _ _ ser la\ hibridacin \ , i
, del cebador no S S especfico a secuencias que se hallan en las mezclas compleja
s, como el ?dianas, en ADN genmico. Es por eso que cuando hay poca abundancia de
comparacin ai ADN de fondo, los productos 5' lde l a I amplificacin K i A I - no e
specfi6 r - - C\- \ - t -1 -G de esta tcnicos pueden anegarPaso el sistema, dismin
uyendo la susceptibilidad s ca Sin embargo, este problema se ha mitigado s mucho
por la utilizacin de o solventes orgnicos que aumentan la astringencia a bajas te
mperaturas, y por la reciente introduccin de polimerasas ms termoestables capaces
del desplazamiento de la hebra.
a s o
(
; ^ Molde desnaturalizado 5I
5' Reaccin en cadena de la ligasa '
p
(
(
En una reaccin en cadena 5' de la ligasa estndar (RCL), las sondas de 2oligonucleti
do se hibridan una junto a la otra en cada una de las hebras de ADN desnaturaliz
adas de dianas, de forma que se produce una "muesca". Una ADN ligasa termoestabl
e sella la "muesca" uniendo el extremo 3' de una ^ sonda al extremo 5' de la otr
a. Cada producto ligado, as como la diana origi^' nal, sin/en de molde en yrondas
subsiguientes de desnaturalizacin, anillamiento y el ligado, y el resultado es u
na acumulacin de productos exponencial +(Wu. 1989; Barany. 1991).
Una modificacin de esta tcnica, denominada espaciada RCL (G-RCL), y en que despus d
el anillamiento de las sondas al difiere de la RCL estndar molde se forma un pequ
eo hueco. Este hueco es rellenado por una ADN polimerasa termoestable y la muesca
que se produce es ligada por una ADN ligasa + (Birkenmeyer. 1991). Aunque la RC
L es til y se automatiza con facilidad, puede resultar difcil controlar la contami
nacin por los productos del 5' G-T-T-G-A -C ligado. Hay en el mercado un equipo d
e combinacin G-RCL (Abbol) para Paso 7 r - - C-A-A-C-T-G 5' detectar en las muest
ras clnicas C. Irachomalis y N. gonorrhoeae. Figura 60-2. Representacin por medio
de un di agrama de la ADH de una hebra. (Por cortesa y adaptada de Walker GT, Lit
tle MC. Nadeau JG: Isothermal m vitro ampliMTODOS DE AMPLIFICACIN DE SONDA ficatio
n ol DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA.
1992b: 89:392-396.) (Vase texto para ms detalles.)
s y

Tecnologa invasora/enzima de rotura

Los mtodos de amplificacin de sonda difieren de los mtodos de amplificacin de diana
en que los productos de la amplificacin contienen slo una secuencia presente en la
s sondas iniciales Los ejemplos de mtodos de amplificacin de sonda, con potencial
comercial, son la reaccin en cadena de la ligasa (Wu, 1989), replicasa Qbeta (Kra
mer, 1989) y la tecnologa de enzima de rotura/invasora (Lyamichev, 1999). Sin emb
argo, slo se desarrolla comercialmente la tecnologa enzima de rotura/invasora y la
reaccin en cadena de la ligasa. Los ensayos invasores son un mtodo de amplificacin
de la sonda que se basan en el reconocimiento especfico y en la ruptura de estru
cturas de ADN particulares por miembros de la familia FEN-1 de las ADN polimeras
as. Estas polimerasas rompern el extremo 5' saliente de una sola hebra de un dplex
de pares de bases en forma de racimo (Fig. 60-5). Esta actividad enzimtica juega
, probablemente, un papel esencial en la eliminacin de estructuras de cido nucleic
o complejas que afloran durante la replicacin y la reparacin del

1292
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
5'Figura 60-3. Representacin por medio de un diagrama de la amplilicacin exponencial
de la ADH de las dos hebras. (Vase texto para ms detal les.)
ADN. Dado que estas estructuras pueden darse en cualquier sitio del genoma repli
cante, la enzima reconoce la estructura molecular del sustrato sin tener en cuen
ta a la secuencia de los cidos nucleicos que construyen el complejo de ADN (Liebe
r, 1996). Esta actividad enzimtica ha demostrado ser una
herramienta muy til en los anlisis de ADN y es la base de los ensayos invasores. E
l ensayo invasor se basa en el hecho de que sintetizando sondas de A D N de una
sola hebra superpuestas que pueden hibridar a una diana especfica,
Figura 60-4. Representacin mediante un diagrama de la reaccin de la ADH de un ceba
dor dual. (Vase t e x t o para ms detalles.)

CAPTULO 60

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGAS DE AMPLIFICACIN

1293
ductos de ruptura de una sola molcula diana. Por esle motivo, se puede efectuar e
l ensayo invasor bajo condiciones isotrmicas, eliminando la necesidad de utilizar
cualquier termociclador. La lectura del ensayo de ruptura depende de la capacid
ad para cuantificar y detectar especficamente al producto de la ruptura. Se puede
n utilizar varios mtodos de deteccin. Third Wave Technologies ha desarrollado esta
tecnologa, que comercializa un sistema para generar una lectura lluorescente de
productos de ruptura especficos. Se han desarrollado varios ensayos invasores, in
cluyendo la mutacin del factor V Leiden, la cuantificacin del ARNm de citocmas y l
a deteccin del Slaphylococcus aureus resistente a meticilina. de la hepatitis B,
del CMV y de puntos de mutaciones en genes humanos, como el ApoE (Rossetti, 1997
: Ryan. 1999). El ensayo invasor tiene varias ventajas aadidas. Esta tecnologa se
puede adaptar fcilmente para detectar puntos de mutacin de inters, diseando una regin
solapante que rodee a la mutacin que ha de ser detectada, debido a que el solapa
miento de la sonda mvasora slo necesita ser de un par de bases. La deteccin de est
os puntos de mutacin no requieren de digestin de restriccin postreaccin, dado que lo
s cebadores se rompern de forma diferencial en base a la presencia o ausencia de
la mutacin en cuestin. Esto hace posible la localizacin de alelos mutantes asociado
s a las enfermedades hereditarias y mutaciones en patgenos asociadas a la resiste
ncia, o la virulencia de los frmacos. Adems, y al contrario que las tcnicas de ampl
ificacin, c o m o la PCR. la ADH y la AMT. en las que la secuencia diana se ampli
fica por ella misma, el ensayo invasor no aumenta el nivel de la secuencia de la
diana. Por esta causa, el ensayo invasor es menos propenso a los problemas de f
alsos positivos ocasionados por la contaminacin cruzada del producto de amplifica
cin. Adems del ensayo invasor, tambin se puede utilizar el mtodo de ruptura para fab
ricar polimorfismos de la longitud de los fragmentos (de manera similar al polim
orfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin). Desnaturalizando el ADN
genmico y enfrindolo rpidamente, se producen en el ADN estructuras secundarias de a
sas en lorma de horquilla que se reproducen velozmente y que pueden servir como
sustrato para la ruptura. La digestin del ADN da como resultado un patrn preciso,
que se ha utilizado con xito para el anlisis de la hepatitis C resistente al inter
fern-o. (Sreevatsan, 1998) y para detectar mutaciones especficas en los genes huma
nos (Rossetti, 1997). Esto ofrece un anlisis verstil del patrn de fragmentacin, debi
do al hecho de que las asas en forma de horquilla se producen con mucha mayor di
versidad que la mayora de los sitios de reconocimiento de enzimas de restriccin.
Figura 60-5. Representacin grfica del complejo ternario reconocido mediante segmen
lacin y los productos de la digestin producidos por la actividad de segmentacin.
creando la estructura reconocida por la ruptura, un miembro de la familia FEN-1
puede generar un producto de ruptura en respuesta a una diana especifica. Se dis
ean dos cebadores que hibndan a la secuencia de la diana de manera superpuesta (F
ig. 60-6). Bajo las condiciones adecuadas de anillamiento, el cebador 1 se puede
fijar en la secuencia de la diana (Fig. 60-6. paso 1). El cebador 2 est diseado d
e tal forma que hbrida 3' al cebador 1 con una regin solapante entre el extremo 3
del cebador 2 y el extremo 5' del cebador 1. Bajo las condiciones adecuadas, el
cebador 2 "invade" el sitio de unin del cebador 1, dando como resultado el despla
zamiento equilibrado entre los cebadores (Fig. 60-6. paso 2). La ruptura slo romp
er los extremos salientes 5', por eso el extremo 5' del cebador 1 se rompe y se e
limina (Fig. 60-6, paso 3). De esta manera, la secuencia de la diana acta como un
andamio sobre el que se puede formar la estructura de ADN apropiada. La generac
in de productos de ruptura indica la presencia de la diana, debido a que la estru
ctura de ADN que se necesita para servir como sustrato de ruptura slo tendr lugar

en presencia de la secuencia de la diana. La utilizacin de una enzima de ruptura

termoestable permite que las reacciones transcurran a temperaturas suficientemen
te altas, de modo que, para poder existir, el cebador intercambie el equilibrio.
Esto hace posible que se lormen mltiples proFigura 60-6. Representacin mediante un diagrama del ensayo invasor. (Vase lexto pa
ra ms detalles.)

1294
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR de 50 copias/ml. Hay, comercialmente disponibles, ensayos de A

DNb para la cuantificacin del ADN del VHB, del ARN del VHC y del ARN del VIH-1 (B
ayer). El Sistema 340, plataforma para el ensayo de ADNb. automatiza la incubacin
, el lavado, la lectura y el procesamiento de datos.
Por eso se pueden utilizar nucleasas especificas de estructura para detectar dia
nas de cido nucleico en una secuencia especifica, que se emplean en los ensayos d
e puntos mulantes y que se aplican para generar diversos patrones de fragmentacin
, que son capaces de distinguir genotipos complejos. Todas juntas, estas tecnolo
gas aaden herramientas m u y poderosas a los anlisis de cidos nucleicos.
Ensayo de captura de hbridos
El sistema de captura de hbridos es un ensayo de captura de anticuerpos de hibrid
acin en solucin que utiliza la deteccin quimioluminiscente. El ADN diana en la mues
tra se desnaturaliza y se hbrida con una sonda de ARN especfica. Los hbridos de ADN
-ARN son capturados por anticuerpos especficos de hbridos de ADN-ARN. con los que
se recubre la superficie de un tubo. Los anticuerpos antihbridos acoplados a la f
osfatasa alcalina unen a los hbridos inmovilizados. El anticuerpo de unin acoplado
es detectado con un sustrato quimioluminiscente, y la luz que emite se mide en
un luminmetro. La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de A
DN diana en la muestra. El ensayo de captura de hbridos para la deteccin de VPH (C
ope, 1997) y del CMV (Mazzulli, 1999), en muestras clnicas, est disponible comerci
almente (Digene).
MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SEALES
En los mtodos de amplificacin de seales no se aumenta la concenlracin de sondas o de
dianas. El aumento de la susceptibilidad analtica procede del aumento de la conc
entracin de molculas marcadas adheridas al cido nucleico de la sonda. Para amplific
ar la deteccin de la sonda, se han utilizado mltiples enzimas, mltiples sondas, mlti
ples capas de sondas y se han reducido los ruidos del entorno (Kricka, 1999). Lo
s sistemas de amplificacin de las dianas tienen, generalmente, una mayor suscepti
bilidad analtica que los mtodos de amplificacin de seales, pero el desarrollo tecnolg
ico, especialmente en los ensayos de ADN ramificado, ha rebajado los limites de
deteccin, en algunas aplicaciones, a niveles que pueden rivalizar con los ensayos
de amplificacin de las dianas (Kern, 1996). Los ensayos de amplificacin de la seal
tienen diversas ventajas sobre los ensayos de amplificacin de la diana. En los s
istemas de amplificacin de la seal no se altera el nmero de las molculas diana, y el
resultado es que la seal es directamente proporcional a la magnitud de secuencia
s de la diana, presentes en la muestra clnica. Esto reduce la preocupacin por los
falsos positivos, debidos a la contaminacin cruzada, y simplifica el desarrollo d
e los ensayos cuantitativos. Puesto que los sistemas de amplificacin de la seal no
dependen de procesos enzimticos para amplificar las secuencias de la diana, no s
e ven afectados por la presencia de inhibidores de enzimas en las muestras clnica
s. Por consiguiente, se pueden utilizar menos mtodos difciles de extraccin del cido
nucleico. Clsicamente, los sistemas de amplificacin de la seal utilizan sondas ms gr
andes o mayor cantidad de sondas que los sistemas de amplificacin de la diana y.
en consecuencia, son menos susceptibles a los errores producidos por la heteroge
neidad de la secuencia de la diana. Finalmente, el ARN puede ser medido directam
ente sin la sntesis de un ADNc intermediario.
CONCLUSIONES
En este captulo hemos proporcionado las bases para comprender los principios que
subyacen en los mtodos de amplificacin de los varios cidos nucleicos y su fuerza y
sus limitaciones relativas. La tecnologa ya ha tenido un tremendo impacto en el d

iagnstico de las enfermedades infecciosas y en los desrdenes genticos, y promete re

volucionar la atencin y los diagnsticos de los pacientes con cncer. El poder real d
e la tecnologa se basa en su capacidad para derribar las disciplinas tradicionale
s de la medicina de laboratorio. La compresin, por medio de los principios bsicos
de la tecnologa de amplificacin del cido nucleico, es importante para todos los que
estn involucrados en el ejercicio de la medicina de laboratorio, dado que es la
tecnologa que representa el futuro de los laboratorios clnicos.
BIBLIOGRAFIA
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ycle PCR. Clin Chem 1997; 43:2262-2267.
ADN ramificado
El sistema de la amplificacin de la seal del ADN ramificado (ADNb) es un ensayo de
hibridacin en sandwich de fase slida que incorpora series mltiples de sondas de ol
igonucletidos sintticos (Nolte, 1998). La molcula amplificadora es la base de esta
tecnologa; es una molcula de ADNb con quince ramas idnticas, cada una de las cuales
puede unir tres sondas marcadas. Se utilizan varias sondas especificas de secue
ncia para capturar al cido nucleico diana sobre la superficie de un pocilio de mi
croltulo. Una segunda serie de sondas especficas de diana tambin se une a la diana.
Las molculas pre-amplificadoras se unen a la segunda serie de sondas dianas y ha
sta a ocho amplificadoras de ADNb. Tres sondas marcadas de fosfatasa alcalina hi
bridan a cada una de las ramas de la amplificadora. Se consigue la deteccin de la
s sondas marcadas unidas incubando el conjunto con un sustrato activable por una
enzima, dioxetano, y midiendo la emisin de luz con un luminmetro. La seal que se p
roduce es directamente proporcional a la cantidad de sondas en la muestra. La ca
ntidad de sondas en la muestra est determinada en una curva estndar externa. La hi
bridacin no especfica de cualquiera de las sondas de amplificacin y los cidos nuclei
cos no dianas conduce a la amplificacin de la seal del entorno. En los ensayos de
ADNb de tercera generacin se introdujeron isocitidina (isoC) e isoguanosina (isoG
) en las sondas de amplificacin para reducir la hibridacin potencial de todas las
bases no diana y no naturales (Collins, 1995). Los pares de bases isoC e isoG mu
tuamente, pero no con cualquiera de las cuatro bases, se producen naturalmente (

Piccirilli, 1990). En los ensayos de ADNb, la utilizacin de sondas de isoC y de i

soG aumenta la amplificacin especifica de la sonda sin un aumento concomitante en
el entorno, con lo cual se amplifican enormemente los limites de la deteccin. El
lmite de deteccin del ensayo de ADNb de tercera generacin de' ARN VIH-1 es

CAPTULO 60

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGAS DE AMPLIFICACIN

1295
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C A P T U L O
61
Tecnologas de la hibridacin en serie
Jacques Schrenzel, M.D. Jonathan R. Hibbs, M.D. David H. Persing, M.D., Ph.D.
TECNOLOGAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIN EN SERIE Macroseries Microseries Sustratos d
e microseries Fabricacin de microseries Microseries de oligonucletidos Microseries
de ADNc Bioinformtica 1296 APLICACIONES CLNICAS DE LA TECNOLOGA DE LAS MICROSERIES
Secuenciacin de las series Series de expresin BIBLIOGRAFA 1302 1299
TECNOLOGAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIN EN SERIE
Desde hace muy pocos aos, la tecnologa de la hibridacin en serie, que hace posible
la ejecucin de miles de reacciones de hibridacin simultneas en un sustrato slido sin
un solo proceso analtico, ha pasado de ser una teora a ser una realidad prctica. E
stas determinaciones, masivamente paralelas, ofrecen oportunidades, antes inimag
inables, de aplicaciones diagnsticas, que van de la secuenciacin del gen y la dete
ccin de polimorfismos genticos a la medicin de los perfiles de expresin del gen en l
as clulas cancergenas. Las sondas moleculares estn unidas a una superficie slida, en
las series definidas, para permitir la discriminacin espacial de las numerosas r
eacciones que se producen simultneamente. La hibridacin en serie es el equivalente
molecular de una hoja de extensin, donde cada clula o direccin revela un dato espe
cfico, que normalmente se deducen del enlace de un ligando a su diana especfica. L
os primeros mtodos basados en las series fueron aprovechados en los ensayos de in
munidad (Ekins, 1987, 1999). Las series tambin han sido propuestas para estudios
paralelos sobre diferentes molculas, como las protenas, los lpidos, los carbohidrat
os y las molculas pequeas (Fodor, 1991; Guschin, 1997: Pirrung. 1992: Schena. 1998
; Southern, 1996a). Al igual que las interacciones antgeno-anticuerpo en las inmu
noseries, el principio fundamental de las series de cidos nucleicos se basa en la
deleccin de interacciones intermoleculares especficas. En las series de cidos nucl
eicos, esta complementariedad se deriva del apareamiento de bases de nucletidos d
e las dos hebras (hibridacin). Los estudios anteriores sobre la desnaturalizacin y
reformacin del dplex, realizados en soluciones de cido desoxirribonucleico (ADN),
han hecho posible vaticinar la cintica de la hibridacin y el punto de fusin de los
productos, como una funcin de la composicin del cido nucleico y de la concentracin d
e sal, Muchos de los primeros trabajos en este campo estn ligados al uso de membr
anas de nilrocelulosa (Gllepsie, 1965) en puntos/manchas (Kafatos. 1979). en sond
as de linea y en manchas de Southern (Southern, 1975). Los rpidos cambios experim
entados en este campo en los ltimos aos han sido liderados, en parte, por una conv
ergencia tecnolgica sin igual de microfabricacin, robtica y bioinformtica, fomentado
s por las demandas de altas cantidades de anlisis genticos asociados al proyecto d
el genoma humano.
Muchos investigadores especulan ahora con que esta tecnologa puede sustituir, fin
almente, a la microscopa de luz para la clasificacin de lipos de tumores, para la
determinacin de la sensibilidad cromoteraputica, para la caracterizacin de respuest
as inflamatorias y para determinar la identidad de un patgeno infeccioso, debido
a la capacidad que tiene la tecnologa de hibridacin de la matriz para impactar en
los procedimientos diagnsticos de muchos tipos. En la actualidad, muchos fabrican
tes de EE.UU. y del extranjero afirman que estn desarrollando matrices para la hi
bridacin. El propsito de este captulo es revisar las bases tericas de varios program
as de hibridacin de la matriz y proporcionar una perspectiva sobre su utilizacin e
n el laboratorio clnico, tanto ahora como en el futuro.
Macroseries
El trmino macroseries se aplica a la fabricacin de series de hibridacin genticas en
matrices macroscpicas, como las membranas de nailon o nitrocelulosa. La densidad
de las macroseries va desde unas pocas docenas de sondas (tambin llamadas rasgos,
en ingls features) hasta cientos e incluso miles de sondas depositadas sobre la
membrana por impresin o por manchas de puntos, que luego se secan y se almacenan

para su uso futuro. La membrana de nitrocelulosa es de inters histrico, ya que fue

la primera matriz slida que se utiliz ampliamente en la hibridacin de cidos nucleic
os. Este material ha dejado de ser popular debido a su fragilidad y a que es muy
inflamable. El nailon y el cristal (sello de silicio) son los soportes estndar p
ara hacer microseries. El nailon tiene varias desventajas si se le compara con e
l silicio, que ahora se ha convertido en la matriz preferida para las series de
la hibridacin fvide infra). Adems de su naturaleza porosa, el nailon muestra una a
utofluorescencia alta, limitando la sensibilidad de la deteccin basada en la fluo
rescencia, debido a los altos valores de fondo. Esto ltim o evita, tambin, la posi
bilidad de desarrollar ensayos para medir relaciones. Esta propuesta utiliza dos
dianas distintas, cada u n a marcada con un flor diferente (p. ej., las muestras
que se toman antes y despus de la administracin de un frmaco recetado). Utilizando
un control constante, como una de las sondas, y expresando una relacin de las do
s seales fluorescentes emitidas, uno puede minimizar las variaciones sonda a sond
a al igual que las diferencias interexperimentales (Brown. 1999; Duggan, 1999).
Actualmente, el uso de las macroseries de nailon est limitado a aplicaciones espe
cficas, por las cuales las sondas de inters parecen existir en los ensayos prefabr
icados. Por ejemplo, existen algunas series comerciales que con-

CAPITULO 61

TECNOLOGAS DE LA HIBRIDACIN EN SERIE

1297
tienen todos los genes de citosma conocidos y genes identificados dentro de las
vas de transduccin de la seal que se activan durante los procesos infecciosos e inf
lamatorios. Estas series han sido tiles para el estudio de las respuestas del husp
ed a los procesos infecciosos. Otras series, que incluyen todo sobre los oncogen
es conocidos, han sido utilizadas en la investigacin del cncer (p. ej., Series del
Atlas Humano Clontech, Palo Alto. Ca; o Genefilters Research Genetics, Huntsvil
le, AL). El uso de las macroseries prefabricadas est limitado a los genes conocid
os, y la capacidad limitada de las series de membranas limita su utilizacin como
objetivo para descubrir genes. Algunos grupos han tenido xito produciendo series
de nailon de alta densidad, a peticin de clientes, con el propsito de descubrir ge
nes (Clark. 1999; Granjeaud. 1996: Gress, 1992; Pietu, 1996; Takahashi. 1995) La
mayor desventaja de las series de nailon, por lo que a esto se retiere, ha sido
el tamao de la membrana, que representa, prcticamente, una limitacin con respecto
al volumen de la sonda que se debe utilizar, en especial cuando slo se dispone de
pequeas cantidades de tejido. Debido a que se espera que las microseries. en vez
de las macroseries, representen la plataform a elegida, el grueso de este captul
o se centra en las microseries.
Microseries
Los ensayos de miniaturizacin ahorran tiempo, a la vez que reducen los costes en
las aplicaciones de diagnsticos biomdicos y en la investigacin. El trabajo con volme
nes ms pequeos reduce el consumo de reactivos y aumenta la concentracin de la muest
ra, por lo que mejora la reaccin cintica. Estas mejoras le permiten al investigado
r determinar cientos o miles de resultados en el tiempo que antes se necesitaba
para un solo experimento. Ahora se pueden conseguir microseries de varios distri
buidores comerciales, junto con la lectura y la fabricacin de equipos, a gusto de
l cliente, de series dedicadas a la investigacin especfica o a las aplicaciones di
agnsticas (vide intra).
superficies (Beattie, 1 9 9 5 : Beier. 1999; Maskos, 1992; Matson, 1995). Hay un
a alternativa interesante que consiste en la declaracin de parches pequeos de poli
acrilamina a los que los oligonucletidos presintetizados son unidos por microinye
ccin (Guschin. 1997; Khrapko. 1991: Yershov. 1996). La densidad de empaquetamient
o de las sondas unidas a las superficies slidas influir enormemente en el rendimie
nto de las matrices de hibridacin. La poca eficiencia del emparejamiento, que se
encuentra, a menudo, en las matrices de cristal, puede dar como resultado una ba
ja densidad de la sonda y bajos ndices de seal/ruido. Por otra parte, el empaqueta
miento demasiado denso de los oligonucletidos sobre una superficie slida ongma un
impedimento espacial. Este obstculo puede ser incluso ms impresionante con bio molc
ulas ms largas, como los ADNc. Se puede aumentar el rendimiento de la hibridacin p
or hasta dos rdenes de magnitud introduciendo espaciadores entre la superficie y
los oligonucletidos (Southern. 1999). Cuanto ms largo sea el espaciador, mejor ser
la hibridacin, pero es interesante saber que hay una longitud del espaciador ptima
, ms all de la cual desciende el rendimiento de la hibridacin (Duggan, 1999: Shchep
inov, 1997). Por ejemplo, un espaciador de 40 tomos de carbono proporciona un aum
ento de la hibridacin de 150 veces, ya descrito (Shchepinov. 1997). Aproximadamen
te, la densidad de los oligonucletidos es de 0.1 pmol'mm en superficie de cristal
, dos rdenes de magnitud menos que en el polipropileno aminado. Por eso, en la ac
tualidad, la ventaja potencial de las matrices de cristal sobre las de plstico es
una densidad ohgonucletida ptima asociada a un impedimento espacial ms bajo (South
ern, 1999). Si se mejora la calidad de las superficies qumicas, algn da se podrn fab
ricar series sobre pelcula o sobre hojas de plstico, lo que reducir enormemente los

costes de produccin,

Sustratos de microseries
La distincin principal entre las microseries y las macroseries consiste en la ele
ccin de un soporte slido y no poroso. Impidiendo la difusin de los cidos nucleicos d
iana, las superficies no porosas (sustratos de plstico, de cristal o de silicio)
permiten una hibridacin cintica ms rpida y unos pasos de lavado ms fciles. La declara
in de las sondas sobre un sustrato slido es tambin ms receptiva para la automatizacin
y posibilita densidades de serie ms altas con una definicin de la imagen ptima. Es
tos rasgos se aplican a cualquier tipo de microseries, desde los productos de ol
igonucletidos sintticos a los de los ADNc clonados o los de la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) (Southern. 1999). Actualmente, la mayora de las microseries
se desarrollan sobre cristal. Al contrario que en los derivados del plstico, la t
ransparencia del cristal y la falta de autolluorescencia permiten la deteccin bas
ada en la fluorescencia de bajo fondo. Sin embargo, ya que la ciencia de los mat
eriales empieza a estar ms comprometida con las tecnologas de sene, puede que en e
l futuro inmediato, estn disponibles sustratos alternativos, incluidos el cristal
baado y los sustratos de plstico.
La composicin terminal (extremo-5) de los oligonucletidos influencia su rendimient
o. Como se esperaba, los extremos 5' ricos en G:C llevan a un rendimiento mejor
que sus homlogos (la m i s m a composicin pero secuencias diferentes) (Maskos, 199
3b). Por tanto, para minimizar esta contribucin, s e pueden considerar las propue
stas para modificar el extremo 5' de los oligonucletidos (p. ej.. la adicin covale
nte de un nexo degenerado). Por otra parte, el saber que los errores en los extr
emos son menos desestabilizadores y. por tanto, ms difciles de discriminar por la
hibridacin (Southern, 1999) ha llevado a introducir mejoras inteligentes para la
deteccin de los acontecimientos de la hibridacin. Se han desarrollado mtodos enzimti
cos con una deteccin de astringencia mejorada (minisecuenciacin de fase slida [Past
inen. 1997. 1998; Syvanen. 1999]. anlisis de unidades de informacin gentica [Nikilo
rov, 1994] o ensayos de ligacin [Landgren, 1988: Nickerson. 1990], ya que las pol
imerasas y las ligasas son ms sensibles a los errores terminales ( c o m o oposic
in a los internos). Marshall (1998) ha analizado las series que hay en el mercado
. La fabricacin de microseries comprenden dos amplias categoras: las que se hacen
depositando la sonda directamente sobre la superficie slida y las que se hacen po
r sntesis in situ. Hay un tercer mtodo, desarrollado por Nanogen (San Diego. CA),
que se compone de oligonucletidos prefabricados caplurados sobre manchas electroa
ctivas en chips de silicio (Cheng. 1998: Edman, 1997; Heller, 1998; Sosnowski. 1
997). La modificacin del campo elctnco por electrodos independientes dirigibles es
pacialmente puede acelerar la hibridacin, y cuando la polaridad es invertida, pro
porciona un lavado astringente (Edman, 1997).
Fabricacin de microseries
Para obtener la inmovilizacin covalente sobre cualquiera de estas dos superficies
, de cristal o de polipropileno, se requiere la funcionalizacin del extremo 3 (es
to es, la modificacin qumica) de los oligonucletidos de cido nucleico, de los produc
tos de la PCR, de los ADNc o de los oligmeros de pptidos y cidos nucleicos (Beier,
1999: Matson, 1995), Por ejemplo, el tratamiento de lminas de cristal con silano
permite al cristal amino tratado unir sondas ligadas a grupos amino utilizando m
olculas bifuncionales, como una dialdehdo o una disotiacina (Case-Green, 1994; Guo
, 1994). De forma alternativa, el cristal baado con un policatin (p. ej.. polilisi
na) permite la unin acoplada a la carga directa de las sondas de ADN polianinico (
Maskos. 1993a), un paso de entrecruzamiento por ultravioleta aade enlaces covalen
tes a la interaccin inica. El enlace covalente es esencial para permitir los lavad
os astringentes y, por tanto, la discriminacin exacta de las especies hibridadas.
Se han publicado varios protocolos para dirigir la activacin de las
Tecnologas de liberacin
Pat Brown y otros colaboradores fueron los que iniciaron la declaracin de molculas

presintetizadas (Schena. 1995; Shalon. 1996). Se preparan las sustancias bioqumi

cas (p. ej.. las protenas, los pptidos. los oligonucletidos, los ADNc), se purifica
n y se almacenan en placas de microtitulos. Mecnicamente se depositan pequeas cant
idades de molculas en las localizaciones exactamente definidas sobre una superfic
ie slida, utilizando diversos sistemas robticos de precisin. Este mtodo es muy flexi
ble en cuanto a la composicin bioqumica, a la topologa de la microserie (p. ej.. el
tamao y la densidad de las manchas, las manchas de rplica para cada molcula) y a s
u facilidad para hacer prototipos. Los mtodos mecnicos permiten la sntesis de micro
series de elevada a moderada densidad (hasta cerca de 16.000 sondas por cm- [Gra
ves. 1999]). Es el mtodo elegido cuando se necesita gran nmero de microseries con
la misma composicin, as como para secuencias largas que utilizan productos de la P
CR. En la actualidad, varias compaas

1298
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR contacto fsico con las superficies de las series; esta ltima pro
piedad puede ser relevante para el desarrollo de las series baadas con finas lmina
s de metales y que utilizan diferentes mtodos de deteccin (Heyse, 1998; Schmid, 19
98). Se puede detectar una leve dispersin de las micropartculas que esln marcando a
las secuencias dianas cuando, de inmediato, aflora en la superficie del cristal
una ola evanescente. Este mtodo permite la medicin de afinidad en t i e m p o rea
l con un poso m u y bajo (Stimpson. 1996).
estn fabricando y vendiendo senes prefabricadas (p. ej Micromax. NEN Life Science,
Boston, MA) o repetidores basados en la deposicin (Cheung, 1999) como alternativ
a a la construccin de un repetidor (Brown, 2000). Los procedimientos de liberacin
se componen de diferentes sistemas de microimpresin y han sido recientemente revi
sados (Bowtell. 1999). La mayora de los repetidores utilizan puntas microdispensa
doras parecidas a una pluma estilogrfica (p. ej.. Cartesian Tecnologies. Irvine,
CA), aunque se han desarrollado algunos sistemas originales, como la tcnica de pi
ncho y anillo (Genetic MicroSystems. Woburn, MA). En general, y debido a la tens
in superficial, a la electricidad esttica y a otros electos, la reproduccin de las
senes impresas es ms baja que la sntesis in situ. y debe ser corregida por medio d
e experimentos separados (repetidos), por las rplicas de las manchas (en la misma
plancha), por la deteccin de la lluorescencia multicolor y por otros algoritmos
de deteccin especficos o por ambos (Chen. 1997). Debido a su flexibilidad y a su d
isponibilidad, la tecnologa de las senes impresas tendr, probablemente, el mayor i
mpacto en los laboratorios clnicos y de investigacin en el curso de los prximos aos.
Microseries de oligonucletidos
Se ha estudiado ampliamente la termodinmica, la cintica de la hibridacin y los aspe
ctos cuantitativos de la hibndacin de los oligonucletidos (revisado por Hoheisel,
1996; Wetmur. 1991). La utilizacin de los oligonucletidos en las series tiene vent
ajas y desventajas potenciales. Las desventajas potenciales son: una susceptibil
idad ms baja que las series de ADNc, para la deteccin de mensajeros poco comunes o
para la de dianas de hibndacin, y su poca capacidad, desde el potencial de la hi
bridacin, para predecir las caractersticas de la hibridacin y, por tanto, la intens
idad esperada de la seal no parece correlacionarse bien con el contenido de G:C o
con la temperatura de fusin (Graves, 1999; Lockhart, 1996), Basndose en estos con
ocimientos, las series de oligonucletidos se pueden hacer por la deposicin de olig
onucletidos sintticos o por la sntesis in situ. Esle mtodo ofrece numerosas ventajas
sobre la liberacin de los productos de ADNc o de la PCR. Las condiciones de la h
ibridacin pueden ser ms homogneas que en la serie del ADNc, con tal de que sta est di
seada con oligonucletidos de tamaos equivalentes. Las series de oligonucletidos no r
equieren, necesariamente, del conocimiento anterior de las secuencias dianas. Se
pueden dividir en dos campos: las series genncas (que representan a una matnz de
oligonucletidos azarosa) o las series especializadas (por vanaciones moleculares
de u n a diana prederminada). Las series genricas han sido propuestas c o m o un
a alternativa barata a la secuenciacin. Es posible "pasearse" por todas las posic
iones a lo largo de una secuencia de nuclelidos si se utilizan todas las combinac
iones posibles de un n-mer. Hyseq (Sunnyvale, CA) reclama una posicin de liderazg
o en el campo de la secuenciacin por hibridacin. Esta propuesta inteligente est, ac
tualmente, limitada por la complejidad del algontmo que se necesita para generar
grupos (la conversin de una lista de n-mers hibridados en una secuencia signific
ativa). Adems, si la secuencia que se est analizando contiene una regin repetida (l
a m i s m a secuencia aparece ms de una vez sin la molcula diana), el diagrama de
reconstruccin tendr que desplegar un nmero correspondiente de puntos de ramificacin
que derivarn a una secuencia ambigua. Una propuesta de este tipo depende del acce
so azaroso de la sntesis. E s t e tipo de serie es el nico capaz de detectar las s

ecuencias que faltan en las grandes bibliotecas electrnicas. Como contraste, las
senes especializadas se utilizan para las secuenciaciones repetitivas (resecuenc
iacin) de la m i s m a diana para la deteccin de polimorfismos de nucletidos o de m
utaciones funcionales. Esto implica el conocimiento de las dianas y sus variante
s ms frecuentes, para incorporar grupos predeterminados de nucletidos en las serie
s diagnsticas. Este mtodo se ha utilizado para la deteccin de polimorfismos genticos
asociados a la resistencia a los frmacos del virus de inmunodeficiencia humana (
VIH), as c o m o para otros polimorfismos (vide inra). Las series de oligonucletido
s tambin se pueden utilizar para definir los polimorfismos de un solo nucletido (G
uo, 1994). incluso comparando dos muestras con fluorescencia multicolor (Chee, 1
996). Ms adelante se describen otros ejemplos de este mtodo. La bsqueda de oligmeros
de afinidad ms elevada ha abierto el camino para las modificaciones qumicas de la
s sondas y de los moldes de oligonucletidos para mejorar la cintica y la termodinmi
ca de los enlaces. Las sondas de pptidos de cido nucleico (PAN) hacen que la hibri
dacin se efecte en una astringencia ms elevada, debido a la alta estabilidad de las
PAN-ADN dplex (Corey. 1997). Las sondas mediadas de ARN (Corey, 1998) muestran a
finidades similares relativas. Sin embargo, las P A N muestran condiciones de hi
bridacin ms rpidas que sus cidos nucleicos equivalentes, debido, fundamentalmente, a
su estructura neutral de columna vertebral (Freeman, 1999). Por regla general,
se puede decir que, a pesar de que sera una clara ventaja la reduccin de los tiemp
os de hibridacin de horas a minutos, se debe superar el problema que hay de no po
der predecir los puntos de fusin de estos oligmeros de alta afinidad antes de su a
plicacin en las microseries (Weiler.
Sntesis in situ
La sntesis in situ permite producciones ms altas, variaciones de chip a chip ms baj
as, asi como densidades de sondas ms altas. Estos mtodos tambin permiten la fabrica
cin de series de "acceso al azar" genuinas. esto quiere decir que cada oligonuclet
ido. en cualquier posicin, puede tener cualquier secuencia elegida (Southern, 199
9). Las estrategias de combinacin se refieren a mtodos que han sido desarrollados
para hacer microseries que contienen todas las secuencias de una longitud dada (
tambin se las conoce como "senes genricas"). Las series de combinacin se han foment
ado, principalmente, para estudiar el comportamiento de las hibndaciones a gran
escala (Southern. 1994), o para la secuenciacin de los cidos nucleicos en estado sl
ido (Drmanac, 1993a, 1993b, 1999. 1998: Lipshutz, 1993: Macevicz. 1991; Strezosk
a. 1991), Las tcnicas de fabricacin incluyen a las mscaras fotolitogrficas para cont
rolar la activacin qumica por medio de pasos de fotodesproteccin (Fodor, 1991). de
declaraciones por inyeccin de tinta (Stimpson, 1998), as como de barreras fsicas pa
ra la inundacin secuencial de los precursores (Maskos. 1993c). Affymetrix ha empa
rejado la desproteccin fotoqumica con la sntesis del ADN en fase slida adaptando las
tcnicas de la industria de los semiconductores (Lipshutz, 1999; Lockhart. 1996:
Pease, 1994). Los nexos sintticos modificados con grupos protectores transportabl
es por medio de la fotoqumica son unidos a los chips de silicio. La fotodesprotec
cin localizada se produce por medio de rayos U V brillantes a travs de una mscara f
otolitogrfica y deja que las unidades bsicas (desoxinuclesidos protegidos de hidrox
ilos) reaccionen con los grupos desprotegidos (Fodor. 1991). Los ciclos alternos
de fotodesproteccin e incubacin con distintas unidades bsicas qumicas permiten la sn
tesis dirigida por rayos de los polidesoxinucletidos. Los ohgonucletidos sintetiza
dos tienen una longitud prctica mxima debido a la eficiencia limitada de la fotode
sproteccin (del 80% al 95% en cada ciclo) (Forman, 1999). Por tanto, la proporcin
de 20-mers que muestra la secuencia predefinida est entre el 1% y el 36% (0.8E20
a 0.95E20) (Fodor. 1991). Las mscaras o barreras mecnicas permiten la limitacin de
las reas de la superficie antes de ser inundadas por los precursores definidos. L
as mscaras fsicas de formas diferentes (en forma de rombo, de circulo) permiten la
sntesis in situ de un precursor dado en localizaciones conocidas. El desplazamie
nto secuencial de las mscaras, seguido por la inundacin de otro precursor, permite
la sntesis de las series de combinacin extensas de desoxinucletidos (Maskos, 1993c
; Southern 1992,1996b). A fecha de hoy, Affymetrix es capaz de sintetizar hasta
400.000 polidesoxinucletidos diferentes en un rea de 1,6 cm(Fodor, 1991). A pesar
de su alto coste, este es el mtodo elegido para los estudios de la expresin gnica d

iferencial a gran escala, debido a su susceptibilidad, su capacidad de reproducc

in y a la redundancia de informacin. Las tecnologas de inyeccin de tinta deben su de
sarrollo a la industria impresora y actualmente estn siendo desarrolladas por var
ias compaas Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA), Protogene (Palo Alto, CA) y Ro
setta Inpharmatics (Kirkland, WA) (Blanchard, 1996). Esta tecnologa tambin est disp
onible en el mercado (Ink-Jet. Packard Instruments. Meriden, CT: Piezoelectric p
ump. GeSiM. Grosserkmannsdorf, Alemania). Esta propuesta ofrece versatilidad en
las biomolculas que estn siendo liberadas y elimina la necesidad del

CAPTULO 61

TECNOLOGAS DE LA HIBRIDACIN EN SERIE

1299
1997). Adems de las sondas, tambin las dianas pueden ser modificadas qumicamente pa
ra localizar las seales amplificadas. Las regiones dianas ricas en pirimidina pue
den generar seales ms altas de hibridacin aadiendo 5-metiluridina durante la transcr
ipcin in vilro (Hacia. 1998).
Microseries de ADNc
Las microseries de las secuencias de ADNc permiten la monitorizacin basada en la
hibridacin de genes similares. Por tanto, esta estrategia implica el acceso a los
clones o la posibilidad de generar productos de la PCR. Hasta la fecha, las mej
ores estrategias utilizan la deteccin fluorescente de dos colores para discrimina
r entre una muestra y su control y para comprobar el nivel diferencial de la exp
resin. Pat Brown y sus colaboradores en la Universidad de Stanford fueron los pio
neros y verificaron este mtodo (Schena. 1995,1996; Shalon. 1996). Las ventajas de
este mtodo se basan en calcular una relacin en cada sonda, en controlar la calida
d de la sonda, en las propiedades especficas de hibridacin de cada par de dianas o
sondas y en la eficacia en el mareaje. Synteni (una compaa subsidiaria de Incyte.
Palo Alto. CA) ha desarrollado para este propsito su microserie de expresin gnica
(Schena. 1998). La compaa NEN Life Science vende ahora portas de cristal con 2.400
genes humanos conocidos (MicroMax). A pesar de que parecen intrnsecamente menos
reproducibles, en la actualidad las microseries de ADNc ofrecen la mayor versati
lidad en cuanto a la deposicin de las sondas se refiere, y a la accesibilidad de
la tecnologa. Varias compaas estn ahora ofertando equipos para la fabricacin de senes
y para la lectura de las matnces hibridadas. Las series de ADNc y las series de
oligonucletidos de densidad elevada probablemente tendrn papeles complementarios
relevantes, en los prximos aos, en los laboratorios de investigacin: las senes de d
ensidad elevada se usarn, primordialmente, para el descubrimiento de locus de rel
evancia diagnstica, y las series dedicadas se utilizarn, cada vez ms. para los anlis
is de densidad media a baja de los locus de relevancia diagnostica descubiertos
por los anlisis de sene de densidad elevada.
cantidad de grupos de datos (generalmente una imagen utiliza de 10 a 50 megabite
s) que se tienen que almacenar en formatos estndar (BMP, GIF. JPG). El software p
rocesador de imgenes mostrar una creciente automatizacin. Este software debe garant
izar el ajuste apropiado de la gradilla y la deteccin de restos, as como identific
ar las caractersticas para obtener informacin significativa. El aspecto de las mic
roseries que ms desafios encara empieza aqu, cuando las grandes cantidades de grup
os de datos se han reunido y purgado de restos y esperan para el anlisis (Vingron
, 1999). Se pueden utilizar dos estrategias. La hiptesis clsica del anlisis consist
e en la agrupacin (utilizando vanas herramientas estadsticas) de genes que se comp
ortan de forma similar. Entonces, se pueden deducir los genes potencialmente coregulados o detectar la expresin diferencial. Sin embargo, estos datos son. slo, f
ortuitos. La otra estrategia asume que. despus de ejecutar un proceso estadstico o
de visualizacin, los datos "hablan por si mismos" (Bassett, 1999; Brown. 1999).
El software que est disponible comercialmente permite hacer estos anlisis, pero co
n frecuencia los investigadores tendrn que personalizar estos programas, e inclus
o puede que tengan que escribir sus propios algoritmos. U n o de los problemas l
ogsticos que han surgido y que entraan ms desafios para las tecnologas de las micros
eries son las extensas bases de datos capaces de ser tratadas por la red. Y a es
t muy claro que probablemente la informacin significativa provenga de la comparacin
entre experimentos mltiples, ms que de las deducciones de un experimento basado e
n un solo fragmento, siendo esto tan complejo. Por eso, debido a la imperiosa ne
cesidad del reconocimiento del patrn, de la interpretacin multidimensional de los

datos y de la comparacin cruzada del programa, las tecnologas de las microseries v

an a tener una ntima relacin con la bioinformtica, y la evolucin conjunta del hardwa
re y del software parece ser inevitable (vase Cap. 6).
APLICACIONES CLNICAS DE LA TECNOLOGA DE LAS MICROSERIES
En los ltimos aos se han propuesto numerosas aplicaciones de la tecnologa de las mi
croseries, que van de la clasificacin molecular de tumores a la identificacin y ca
racterizacin de agentes microbianos. Esto ha llevado a muchos a especular con que
la tecnologa de las senes representa la "nueva ola" de los avances tecnolgicos, q
ue va a tener un impacto prctico en los diagnsticos de las enfermedades humanas, p
recedida slo por la PCR, como tecnologa central en los laboratorios clnicos de diag
nsticos moleculares. Esta seccin se centra en las aplicaciones, actuales y futuras
, de la tecnologa de las series.
Problemas de la propiedad industrial
La tecnologa de las microseries es un campo que avanza rpidamente y en el que exis
te una competencia feroz. Por eso es importante enfatJzar el hecho de que se han
registrado muchas patentes y de que algunas de ellas son directamente relevante
s en los diagnsticos clnicos. Por ejemplo, Affymetrix (Santa Clara, CA) posee dere
chos sobre las patentes que son esenciales para las series de oligonucletidos de
densidad elevada (Chee. 1998; Holmes. 1998), sin tener en cuenta los propsitos pa
ra los que fueron hechas. Si un laboratorio, presuntamente, decide desarrollar s
eries de densidad moderada para anlisis de tumores y cobra por este servicio, est
e ensayo puede infringir los derechos de las patentes de Affymetrix si exceden l
as 400 unidades/cm. sin tener en cuenta de qu tipo es el mtodo de la sntesis (Fodor
, 1998). Las tecnologas de las series que utilizan micromatnces de tampones de ge
l de poliacrilamida (elementos de gel tndimensionales), representan un mtodo nuev
o que puede que no infrinja los derechos de Affymetrix (Guschin, 1997; Khrapko.
1991 Yershov, 1996). Esperemos que. como ocurri con las tecnologas de amplificacin
de los cidos nucleicos, la competencia entre fabricantes rebaje los costes y perm
ita la democratizacin de esta tecnologa tan poderosa.
2
Secuenciacin de las series
Los datos de las secuencias de los cidos nucleicos son fundamentales para la biol
oga molecular moderna. Los mtodos convencionales (Maxam, 1977: Sanger, 1977) lleva
n tiempo, el trabajo es intensivo y son caros. Los mtodos de secuenciacin alternat
ivos que utilizan la hibridacin en fase slida se propusieron en base a una teora (B
ains. 1988; Khrapko, 1989) a menos de 1 5 aos del descubrimiento de estos mtodos (
Southern. 1975). A los artculos tericos les siguieron despus los datos, que confirm
aban los principios de la secuenciacin basada en la serie, de moldes cortos artif
iciales (Pannov, 1996: Pease, 1994; Southern, 1992). En 1999 se publico un artcul
o, muy bien escrito, sobre los mtodos de secuenciacin de las microseries (Hacia. 1
999). Sin embargo, el lector puede advertir que muchos de los trabajos publicado
s y citados en esta rea provienen de investigadores con intereses financieros en
uno o varios dispositivos patentados, y que estas publicaciones evalan, Ms que res
paldar a un mtodo o dispositivo especial, este captulo trata de familiarizar al le
ctor con los principios bsicos de las senes, En teora, cualquier secuencia de cido
nucleico se puede romper en subgrupos de longitud n. Despus, todos esos oligonucl
etidos posibles, de longitud n (n-mers) se pueden situar en localizaciones establ
es sobre u n a superficie slida. El cido nucleico que va a ser secuenciado (el mol
de) se amplifica, si es necesario, se marca con una molcula fluorescente, luminis
cente o radiactiva y se le permite que hibride a las series de unin de n-mers. La
deteccin de la marca permite, al que est haciendo la secuencia, verificar un resu
ltado con un n-mer en un locus particular en la superficie slida. L a
Bioinformtica
La bioinformtica es un componente esencial en las microsenes, desde que se empiez
a a disear la serie hasta los sofisticados anlisis de datos. Utilizando robots con
trolados por ordenador, las biomolculas pueden ser distribuidas, exacta y precisa

mente, en cualquier configuracin de gradilla deseada. Este paso es relativamente

trivial y parece que se adapta bien a la capacidad de los instrum e n t o s que
hay en el mercado (Bowtell. 1999). Sin embargo, se debe seguir con atencin el vin
culo secuencia arriba entre cada punto y el pocilio (y la placa) de donde proced
e la biomolcula. El nuevo software (p. ej CloneTracker, BioDiscovery, Inc. Los Ang
eles, CA) garantiza la identificacin correcta de cada sonda durante la fabricacin
de las microseries y el tratamiento de los datos para correlacionar rpidamente un
a seal con una sonda especfica. En los lugares donde se llevan a cabo las senes de
tamao medio a grande, lo ms sensato es la utilizacin de un sistema de cdigo de barr
as. La obtencin de datos genera gran

1300
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR interpretada, el instrumento de recogida de datos sigue siendo

una "caja negra", sin las seales visuales que relacionan directamente a un nuclet
ido especfico de la secuencia mencionada. Algunas veces, una imagen del cromatogr
ama (de un secuenciador capilar) o del gel (de una secuenciacin de gel) puede res
olver las ambigedades o las inconsistencias de los datos de la secuenciacin. Sin e
mbargo, los usuarios de los secuenciadores actuales de microseries quiz tengan qu
e aceptar que los datos primarios de los cuales se deduce su secuencia no pueden
ser interpretados directamente, bien porque es demasiado complejo o bien porque
la composicin y la localizacin en el chip de los oligonucletidos especficos sigue s
iendo un secreto industrial de los fabricantes, o por ambas cosas. Esto no tiene
que ser, necesariamente, una desventaja para los laboratorios clnicos, aunque se
a frustrante para los investigadores, ya que, en ellos, es cada vez ms corriente
el uso de sistemas automatizados y de la interpretacin guiada por el ordenador. P
ara las aplicaciones clnicas, en general, una limitacin ms seria es intrnseca a la s
ecuenciacin como una estrategia diagnstica. Debido al potencial de velocidad y de
automatizacin, la secuenciacin de microseries resulta atrayenle como alternativa a
los mtodos fenotipcos clsicos y. m u y notablemente, a la seleccin de resistencias
a los frmacos. Como todas las estrategias de secuenciacin, las microseries tienen
una sensibilidad limitada para los alelos minoritarios. Particularmente instruct
ivo es el ejemplo de la identificacin de la resistencia a los frmacos en el VIH ba
sada en la secuencia. La secuenciacin de microseries de aislados clnicos puede pro
nosticar correctamente algunos casos de resistencia a los frmacos basndose en muta
ciones especficas (Race, 1998), y ya se est convirtiendo en una prctica estndar (Per
ez-Olmeda, 1999). Incluso suponiendo que la secuenciacin pueda detectar un alelo
resistente cuando est representado en ms de o igual a un 1% de la poblacin vrica, ha
y razones, sin embargo, para dudar del valor proftico de una prueba negativa de r
esistencia. Pocos virlogos argumentaran que el 0,5% de prevalencia de la resistenc
ia a los frmacos no sea importante en un virus que genera ms de un billn de copias
al da.
intensidad de la seal en ese locus debera ser directamente proporcional al nmero de
dominios en el molde correspondiente al n-mer en ese locus. De los mtodos para t
odos estos pasos, se ha dado una idea general en las secciones precedentes de es
te captulo. Para las aplicaciones de la secuenciacin, los n-mers que se ajustan al
molde se agrupan, luego, en un orden definido por el anlisis de los n-mers con l
a secuencia solapante, que en principio es igual al ordenamiento de grupos por l
os programas de secuenciacin a gran escala. Piensen en un molde nonanuclelido que
bajo condiciones astringentes es unido solamente a los locus que contienen cuatr
o tetrmeros en una serie con todos los 256 tetrmeros posibles: Tetrmero 5ACTG 5'CTG
A 5'TGAC 5'GACT Intensidad 2 2 1 1
Desde las reas replegadas, no es muy til razonar que el molde nonanucletido fuera 5
'ACTGACTGA. Este tipo de anlisis se hace directamente por ordenador. Desde el ord
enador se puede automatizar el escner de la serie para detectar la marca, el mare
aje mismo y, en alguna medida, incluso la extraccin y la amplificacin del ADN: es
estupendo imaginar que una "caja negra" puede realizar todo esto en una tarde. S
in embargo, pensemos en un nonanucletido que une a los locus que contienen los si
guientes tetrmeros: Tetrmero 5'TCTA 5'CTAC 5T A C T 5'ACTT 5'CTTC 5TTCT Intensidad
1 1 i 1
1
1
Series de expresin

La expresin diferencial del gen es el problema fundamental de la biologa molecular

. Generalmente, la pregunta que nos hacemos es" La expresin de qu gen est asociada c
on este resultado en particular?". Desde los viejos malos tiempos de sustraccin d
e bibliotecas y de manchas de Northern a los mtodos ms modernos de seleccin, como l
a demostracin de la diferencia (Liang, 1992) o la amplificacin de la diferencia (L
isitsyn, 1993), los mtodos siguen siendo caros, el trabajo intensivo y se emplea
mucho tiempo. Las microseries son prometedoras en cuanto a afrontar este problem
a de una manera no solamente menos cara, con menos trabajo y ms rpida que con los
mtodos antiguos, sino que permitirn los anlisis mucho ms complejos del problema en c
uestin. Los mtodos ms antiguos se basan en la identificacin de uno o, a lo sumo, de
un puado de secuencias para comparar entre muestras de control y experimentales.
Los sistemas basados en las microseries ofrecen un programa para cuantificar la
expresin de miles de genes al mismo liempo (Brown, 1999). Esto permite el anlisis
de cassettes enteras de genes, o patrones de expresin del gen. nada menos que de
uno, dos o tres genes al mismo tiempo. El mtodo que permite el estudio de los aco
ntecimientos de la transcripcin puede estar anticuado, debido a que en la ciencia
biomdica la mayora de los problemas de inters general involucran a varios genes qu
e actan todos de acuerdo. Por lo general existen dos tipos de series para hacer l
os anlisis de expresin. En uno se pueden utilizar series de porciones enteras o su
stanciales de ADNc o de exones. utilizando en la microserie secuencias largas de
cientos de bases en locus individuales. Aunque la sntesis comercial se encuentra
en el mercado, estas series se pueden preparar en cualquier laboratorio utiliza
ndo mecanismos hechos con componentes caseros (Brown, 2000: Schena. 1995). Esto
permite hacer anlisis de la expresin personalizados a un precio razonablemente baj
o y dando un rodeo a las patentes de fotolitografa. Por otra parte, estas series
representan una pequea o ninguna variedad de alelos para cada gen, con poca disti
ncin en la representacin entre las regiones variables y constantes del gen expresa
do. Alternativamente, se pueden utilizar series hechas de oligonucletidos solapan
tes, que incluyen las regiones d e diferenciacin de varios genes. Estas series se
preparan por medio de la fotoEsto podra representar 5' TCTACTTCT o 5' TTCTACTTC, y no hay manera de resolverlo
por ordenador. Donde n es menos que la mitad de la longitud del molde, repetir
la misma longitud como n/2 puede dar resultados ambiguos. El ordenador empieza a
tener cada vez ms dificultades, ya que la longitud del molde llega a ser un mltip
lo de n cada vez ms alto; en consecuencia, es deseable tener un n tan largo como
sea posible para la secuenciacin de los dominios no conocidos. En la prctica, la l
ongitud de n sigue limitada por la tecnologa, sin embargo, desde entonces 4" (el
nmero de locus que se precisan para la representacin universal) excede a 1 milln po
r n = 10. Esto limita los mtodos actuales del nmero de oligonucletidos diferentes q
ue pueden ser diferenciados sobre un chip fotolitogrfico (Lipshutz, 1999). Y una
vez descritas estas limitaciones intrnsecas, en la actualidad es mejor reservar l
a secuenciacin basada en las microseries para los sitios ampliamente conservados,
donde el conocimiento de la secuencia esperada es mucho mayor. Aqu, el nmero de l
ocus que se precisan no necesita aproximarse a 4". ya que hay un nmero limitado d
e secuencias posibles para ser identificadas. La deteccin de polimorfismos de un
solo nucletido de un gen fenotpicamente definido (Cronin. 1996; Hacia, 1996) es un
a estrategia arquetipica apropiada para la secuenciacin basada en las microseries
. Sus aplicaciones especificas incluyen la deteccin de alelos de resistencia anti
mcrobianos (Kozal. 1996; Troesch, 1999), las mutaciones de puntos asociados con e
l cncer (Ahrendt, 1999), las secuencias especficas de especies en un sitio ampliam
ente conservado (Gingeras, 1998) y la identificacin de mutaciones en genes conoci
dos para determinar su papel en una enfermedad de origen desconocido (Halushka,
1999). A pesar de que los costes de esta tecnologa siguen siendo altos, es posibl
e que bajen segn vaya aumentando la produccin. Suponiendo que los costes bajen, lo
s mtodos de secuenciacin a travs de microseries sern, probablemente, los preferidos
en las aplicaciones clnicas donde se requiera la secuenciacin repetitiva de la mis
ma diana. Adems de los costes, la secuenciacin de microseries tiene algunas limita
ciones tcnicas, incluso para sitios ampliamente conservados. En la mayora de los c
asos, mientras que al investigador se le proporciona la secuencia

CAPTULO 61

TECNOLOGAS DE LA HIBRIDACIN EN SERIE

1301
litografa, utilizando mtodos propios y mscaras complejas. Debido a esto son caros,
y para los pequeos laboratorios su disponibilidad es limitada (Fox, 1999). No obs
tante, permiten que miles de genes a la vez detecten a todos los alelos conocido
s y proporcionen informacin cuantitativa y detallada de cualquiera de las secuenc
ias (incluidos los alelos patgenos) que estn representadas en la transcripcin. Incl
uso se puede detectar, rpidamente, la expresin de bajo nivel del gen con un alcanc
e de ms de 1.000 (Lockhart. 1996). Las series de ADNc y las de oligonucletidos se
han utilizado con xito para afrontar los eternos problemas de la biologa de la exp
resin. En 1999 se publicaron los aspectos prcticos y los mritos relativos de varios
sistemas (Bowtell, 1999). La investigacin publicada en 1995. por Schena y cois,
del laboratorio de Pat Brown, fue la de un resultado seminal en la utilizacin de
senes de ADNc de alta densidad sobre cristal para el anlisis de la expresin (Schen
a, 1995). Los autores marcaron el ADNc de la Arabidopsis. cuyo genoma est entre l
os ms pequeos de cualquier eucariota. En un prototipo de los experimentos subsigui
entes se marc a los ADNc de la hoja y de la raz de la planta con diferentes fluoro
cromos. Utilizando series de productos amplificados por PCR de clones selecciona
dos al azar de una biblioteca del ADNc de la Arabidopsis, los autores identifica
ron 26 genes, cuyo ndice de transcripcin era diferente en cinco veces o ms entre la
hoja y la raz. Esta diferencia ambiental no era especialmente sutil, pero esta i
nvestigacin represent una desviacin notable de las publicaciones anteriores de la e
xpresin diferencial, en las que el descubrimiento de cinco o menos genes expresad
os diferencialmente podra haber sido considerado un triunfo colosal. Las acciones
subsiguientes efectuadas por el mismo laboratorio encontraron en las clulas huma
nas once genes regulados hacia arriba y seis regulados hacia abajo dos veces o ms
por medio de un choque de calor de 43" C, as como tambin seis genes regulados hac
ia arriba dos veces o ms por exposicin a esteres de lorbol (Schena. 1996). En esto
s experimentos hibndaron el material del molde sobre, aproximadamente. 1.000 sec
uencias de genes a la vez. aumentando por dos rdenes de magnitud el nmero de acont
ecimientos de la transcripcin que podran ser asociados con un estmulo delinido en u
n bloque de experimentos. Desde estas primeras publicaciones, otros laboratorios
han utilizado mtodos similares para descubrir 30 genes regulados hacia arriba po
r radiacin ionizante (Amundson. 1999), 62 genes expresados diferencialmente en ne
uronas afectadas de esclerosis mltiple (Whitney. 1999) y 89 genes expresados dife
rencialmente entre las clulas del carcinoma de las clulas renales y las clulas deri
vadas de un rion humano normal (Moch, 1999). Se han hecho progresos similares con
programas de oligonucletidos fotolitografiados. stos se han utilizado para identi
ficar 23 transcritos que median la respuesta a un gen asociado al cncer de m a m
a (Harkmg, 1999). 94. 268 y 129 genes cuyos niveles de transcripcin cambiaron dos
veces o ms despus de la exposicin a interfern (IFN) -a, y -y, respectivamente, de cl
ulas derivadas de un librosarcoma (Der, 1998); y 258 transcritos cuyo nivel camb
i cuatro veces o ms despus de la exposicin a otomegalovirus de fibroblastos humanos
(Zhu, 1998). Las ltimas publicaciones citadas, que slo son unos pocos ejemplos de
toda una gran y creciente documentacin, analizan aproximadamente 5.000 ADNc al mi
smo tiempo, en comparacin con los aproximadamente 1.000 de las primeras investiga
ciones de las microseries de ADNc. El nmero ms amplio se aproxima al nmero de secue
ncias codificantes de protenas en los genomas procariticos. La proporcin en aumento
de estos anlisis de expresin de las microseries hace que estos mtodos sean especia
lmente atractivos para los estudios in vilro de las procariotas (de Saizieu. 199
8). de las cuales ms de 20 se han secuenciado en su totalidad. Si bien la extracc
in de ARN de las procariotas es menos precisa, desde que se debe utilizar ARN ent
ero, en vez de ARN poliadenilado, como molde para la transcripcin inversa, la glo
balidad de este anlisis es una gran ventaja. Se puede capturar una imagen complet

a de genes de procariotas codificantes de protenas en una sola membrana de nailon

(Tao. 1999). Tambin es posible una propuesta similar del genoma completo con euc
ariotas simples. El bloque Ye6100 de cuatro chips de oligonucletidos fotolitogral
iados contiene informacin secuencial acerca de ms de 6.000 marcos de lectura abier
tos, lo que posibilita una evaluacin detallada de la respuesta Iranscripcional a
travs del genoma completo de la levadura Saccaharomyces cerevisiae (Holslege. 199
8: Jelinsky, 1999; Wodicka, 1997).
Adems de incrementar el numero total de las secuencias analizadas, las nuevas est
rategias analticas de los datos de las microseries tambin estn mejorando los anlisis
de la expresin de los genes. Estos mtodos hacen evidentes los lmites para analizar
uno o varios genes a la vez, los cuales demuestran amplios grupos de genes que
responden a estmulos individuales. Y lo que es peor, los genes cuyos niveles de t
ranscripcin responden a un estmulo a menudo tambin responden a otros estmulos (Fambr
ough. 1999). En vez de analizar cada transcnptor como un pronosticador de result
ados, los datos paralelos masivos que proporcionan las microseries permiten iden
tificar familias enteras de genes implicados en acontecimientos biolgicos complej
os (Eisen. 1998). El ao pasado se public un xito paradigmtico de esta propuesta, que
fue la clasilicacin de las leucemias mediante el perfil de la expresin gnica (Golu
b. 1999). En este artculo los autores explican que empezaron por extraer cido ribo
nucleico (ARN) de las muestras de mdula sea de 38 pacientes con leucemias linfoblst
icas y mielgenas. Los transcritos biotinlados del ADN derivados de esas muestras f
ueron hibridados por series de Affymetrix HU6800 con oligonucletidos representant
es de ms de 6.800 genes humanos, luego marcaron los chips con ficoeritrina-estrep
tavidina para su cuantificacin en un escner confocal. Los autores identificaron 50
genes cuya expresin estaba asociada con una de las dos clases de leucemia por me
dio de la utilizacin de mtodos matemticos, desarrollados por este proyecto (Lander,
2000), y de procedimientos de verilicacin repetitiva. Despus probaron el modelo d
iagnstico verificado en clulas derivadas de la sangre y de la mdula sea de 34 pacien
tes adicionales con leucemia. El funcionamiento del modelo no fue perfecto en es
ta segunda verificacin, ya que no se pudieron hacer predicciones precisas sobre c
inco pacientes. Por otra parte, el modelo s hizo predicciones diagnsticas seguras
de 29 (85%) de estas muestras, todas las cuales eran correctas. Yendo an ms lejos
con la ampliacin de estas tcnicas, los autores utilizaron su software GENECLUSTER
para configurar un mapa de auto-organizacin (Tamayo, 1999) de los datos de la exp
resin de los 38 pacientes iniciales. Estos mapas identifican grupos de genes cuyo
s patrones de expresin estn asociados unos con otros. Los patrones de expresin que
surgieron del mapa no slo identificaron a las leucemias linfoblsticas y mielgenas,
sino que incluso pudieron distinguir entre la leucemia linfoide derivada de clula
s T y la derivada de clulas B. Y lo ms importante es que, al contrario que en los
anlisis iniciales, estos grupos de patrones de la expresin no estaban basados en e
l conocimiento previo de las bases para hacer diagnsticos. Lo que esto sugiere es
que estos mtodos podran conformar una nueva y amplia base para la clasificacin de
enfermedades poco clasificadas hasta ahora y para otros procesos biomdicos. Una d
e las aplicaciones clnicas obvias de esta estrategia es la identificacin del pronst
ico de las enfermedades con resultados variables. Esto ilustra la reciente ident
ificacin de los perfiles de la expresin gnica asociados con la supervivencia, corta
y larga, en el linfoma (Alizadeh, 2000). En este artculo los autores explican qu
e extrajeron ARN poliadenilado de lineas d e clulas de leucemia y de linfoma, as c
omo tejido linfoide humano normal Los ADNc marcados con fluorescencia de esos ex
tractos fueron unidos a las series que contenan secuencias de 17.856 clones molec
ulares representantes de clulas B del medio germinal, de clulas de leucemia y de l
infoma y de una coleccin de genes de respuesta a mitgenos o citocinas. Cada ADNc e
xperimental fue hibridado a la serie en la presencia del ADNc de control m a r c
ado con un fluorocromo de contraste. Este ADNc control se hizo con u n a gran ca
ntidad de ARN linfoide, cuyas alcuotas fueron utilizadas en c a d a experimento.
Esto hizo posible la comparacin de los niveles relativos de la expresin entre toda
s las muestras experimentales. Los resultados se representaron y se analizaron c
on software disponible libremente (Eisen, 2000). Como ya se ha anticipado, los a
nlisis revelaron perfiles de la expresin caractersticos de la proliferacin y del est

ado de los restantes, as c o m o perfiles asociados a localizaciones anatmicas esp

ecficas, como el medio germinal, y perfiles asociados a los tipos de malignidad e
stablecidos. No obstante, se hizo un avance significativo al identificar un nuev
o perfil de la expresin gnica que podra pronosticar la supervivencia tan bien o mej
or que los criterios clnicos existentes. En particular, el nuevo perfil identific
correctamente a un subgrupo de pacientes con alto nesgo de mortandad prematura,
incluso entre pacientes clasificados previamente por criterios clnicos de ser de
bajo riesgo. Futuros avances en el diagnostico, la clasificacin y el pronostico

1302
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
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esperan a que los mtodos basados en las microseries los descubran en un futuro ce
rcano. Como se ha enfatizado antes, el lector debera tomar buena nota de que lo q
ue hace que esto sea posible no es el mero perfeccionamiento de los equipos, sin
o el desarrollo de ms estrategias analticas sofisticadas, para estar al da con los
datos ms complejos generados por esos equipos (Bassett. 1999).
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CAPiTUlO 6 1

T E C N O L O G I A S D E LA H I B R I D A C I N E N SERIE
1303
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C A P T U L O
62

Aplicaciones de la citogentica en la patologa moderna

Constance K. Stein, Ph.D. DEFINICIONES CITOGENTICA Cromosomas Anomalas cromosmicas
CLNICA Aplicaciones clnicas Desrdenes citogenticos Otros fenmenos citogenticos 1304 1
05 RESUMEN BIBLIOGRAFA 1331 1331
1321
Cariotipo: Es la constitucin del cromosoma de un individuo. Tambin es una figura q
ue muestra la disposicin de los cromosomas emparejados de una clula en una secuenc
ia estndar. DEFINICIONES Diploide: Es la presencia de dos copias de cada cromosom
a nico por cada clula. En el hombre los cromosomas estn dispuestos en pares y el nme
Como en todas las reas de la medicina, la gentica, para su comunicaro diploide (2N
) es 46. cin, depende del uso apropiado de los trminos especficos. Las siguientes H
aploide: Es una copia de cada cromosoma nico. En el hombre los gamedefiniciones p
roporcionan el vocabulario bsico para este campo. tos son haploides (N = 23). Gen
: Es una secuencia de nucletidos que representan una unidad funcional Homocigoto:
Ambos alelos estn en un locus al mismo tiempo. (En el sistema ABO, un complement
o AA representa la homocigosidad). de la herencia; una regin de ADN que codifica
para un producto, bien un Heterocigoto: Los dos alelos en un locus son diferente
s. (En el sistema ARN o bien una protena. ABO, un complemento AO representa la he
terocigosidad.) Cromosoma: Es una estructura altamente ordenada compuesta de ADN
y Hemicigoto: La presencia de un cromosoma solamente o de un segmento protenas q
ue porta la informacin gentica. En el hombre hay 46 cromodel cromosoma en vez de l
os dos normales; se aplica a los varones y somas ordenados en pares. machos con
un cromosoma X solo. Autosoma: Son todos los cromosomas excepto los cromosomas X
e Y, a los Genotipo: Es la constitucin gentica de un individuo o de un organismo
(es que se les denomina cromosomas sexuales. decir, qu alelos estn presentes). (En
el sistema ABO, AA, AO. BB. BO, Cromosomas homlogos: Son los cromosomas hermanos
, miembros de AB y 00 son genotipos.) un par de cromosomas en el que uno es here
dado de la madre y el otro del Fenotipo: Es la apariencia de un individuo como r
esultado de la interaccin padre. del genotipo y del medio ambiente. (En el sistem
a ABO. los tipos de sanLocus: Es la posicin de un gen en un cromosoma. gre A, B y
0 representan la expresin genotpica de los alelos de un indiviAlelo: Es una forma
alternativa de un gen que ocupa el mismo locus. Un alelo duo determinado.) pued
e ser el resultado de una mutacin. Hay un mximo de dos alelos por Alelo dominante:
Es un alelo que es expresado cuando est presente en una cada complemento del cro
mosoma diploide (un alelo por cromosoma), pero sola dosis (esto es, que "domina"
a los otros alelos presentes). (En el sistedentro de una poblacin pueden existir
mltiples alelos.
L a gentica, en la medicina actual, es uno de los campos que progresa ms rpidamente
. La investigacin est identificando continuamente nuevos genes y mutaciones asocia
dos con las enfermedades. Las nuevas tcnicas de laboratorio en gentica molecular y
citogentica proporcionan mtodos mejores para el diagnstico y el tratamiento de los
pacientes. Las perspectivas de la terapia gnica y las posibilidades de curar alg
unas enfermedades genticas son prometedoras. A la gentica se la define, en general
, como el estudio cientfico de la herencia, pero en la medicina de los laboratori
os clnicos el inters se centra en dos subespecialdades en este campo: 1 ) la gentica
humana, el estudio de la herencia en el hombre, y 2) la gentica mdica, el estudio
de las variaciones genticas humanas significativas para la medicina. La gentica md
ica se puede subdividr en cinco grupos, dos campos especialmente clnicos (gentica c
lnica y gentica consultiva) y tres ciencias de laboratorio (citogentica, gentica mol
ecular y gentica bioqumica). Este captulo desarrolla con mayor intensidad la citoge
ntica, y en el Capitulo 66 se exponen los diagnsticos moleculares.
Mutacin: Es un cambio hereditario permanente en la secuencia del ADN genmico. ste s

e puede manifestar tanto en los niveles citognicos c o m o en los moleculares. No

todas las mutaciones son sucesos negativos, Muchas de ellas son benignas (p. ej
.. el color de ojos azul) y algunas tienen efectos positivos (p. ej., el carcter
de clula falciforme en pases con un riesgo significativo de malaria). Un individuo
que tenga una mutacin constitucional (es decir, una mutacin presente en cada clula
del cuerpo) puede transmitir la mutacin a toda su progenie por la transmisin de ln
ea germinal. En algunos casos, de manera notable en el cncer, puede surgir una mu
tacin adquirida en una sola clula somtica. Esta mutacin estar limitada al clon compue
sto de productos mitticos de la clula original mulante y no ser trasmitida a la pro
genie del individuo. En casos raros de mosaicismo gonadal puede aparecer en las
gnadas una mutacin adquirida de novo, dando como resultado una poblacin mixta de ga
metos normales y mutantes. La progenie que recibe la nueva mutacin puede presenta
r un fenotipo que no est presente en ninguno de los progenitores.

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1305
ma ABO, A es domname sobre 0, igual que un genotipo AO tiene como resultado a un
fenotipo con el tipo de sangre A. De forma similar, la presencia de pigmento [T]
es dominante de la ausencia de pigmento [t] [esto es. el albinismo], de manera
que Tt tiene como resultado la pigmentacin.) Alelo recesivo: Es un alelo que est e
xpresado solamente cuando es homocigoto en un organismo diplode. (En el sistema A
BO, el grupo de sangre O slo se ve con un genotipo 00: O es recesivo de A y de B.
Igualmente, el albinismo [t] es recesivo de la pigmentacin [T], y un fenotipo al
bino slo aparece con un genotipo tt.) Alelos codominantes: Son los alelos que mue
stran no dominacin o que no son recesivos el uno al otro en un organismo diploide
, pero que cuando estn presentes juntos, ambos estn expresados completamente. (En
el sistema ABO. A y B son codominantes, igual que un genotipo AB expresa antgenos
A y B.) Clasificacin independiente: Es la clasificacin azarosa de los cromosomas
(paternos y matemos) en los gametos: la oportunidad de heredar un cromosoma dete
rminado de uno de los progenitores es del 50%. Enlace: Es la presencia de dos o
ms genes en el mismo cromosoma que tienden a ser heredados juntos. Sobrecruzamien
to: Es el intercambio fsico de material gentico entre los cromosomas homlogos. Reco
mbinacin: Es la generacin de combinaciones allicas nuevas en los cromosomas, normal
mente por entrecruzamiento. Mitoss: Es la divisin somtica de la clula en la que se r
eplica el ADN y se distribuye, uniformemente, a dos clulas hijas iguales. Meiosis
: Es la divisin celular en las gnadas que produce los gametos. Una sola replicacin
del ADN es seguida de dos divisiones celulares, lo que reduce el contenido total
de ADN de una clula de 2N a N. La recombinacin se produce para incrementar la div
ersidad gentica dentro de una poblacin. No disyuncin: Es el error de los cromosomas
o de las cromtidas para separarse hacia los polos opuestos en la divisin celular.
Normalmente da como resultado un cromosoma de ms o uno de menos en una clula.
no incluye 46 cromosomas ordenados en 23 pares (Fig. 62-1). Uno de los miembros
de cada par se hereda de la madre y el otro del padre. Se sabe que 22 pares son
autosomas y se presentan como homlogos los unos de los otros (es decir, que no se
pueden distinguir unos de otros). El par 23. incluye a los cromosomas sexuales,
que son homlogos en las mujeres o hembras que tienen dos cromosomas X y no homlog
os (estructuralmente diferentes) en los hombres o machos que tienen un cromosoma
X y uno Y (Fig. 62-1). Los genes son codificados en el ADN y estn ordenados a lo
largo de la longitud de los cromosomas. La longitud absoluta de los cromosomas
variar durante el ciclo celular, pero su mayor condensacin se alcanza en la metafa
se, que es cuando se puede observar a los cromosomas con ms facilidad. Debido a e
sto, los cromosomas de la metafase son la base de la mayoria de los estudios cit
ogenticos.
e
Estructura
del cromosoma
Un solo cromosoma en metafase est compuesto de dos dobles hlices de ADN. A cada do
ble hlice se la denomina cromtida: las dos cromtidas se mantienen unidas por una re
gin hasta ahora no replicada de ADN que se conoce como centrmero o constriccin prim
aria. El centrmero acta como una seal y divide al cromosoma en dos regiones diferen
tes conocidas como brazos (Fig. 62-2A). Al brazo ms corto se le designa brazo p y
al ms largo brazo q. Cuando el centrmero est casi equidistante de ambos extremos,
se dice que el cromosoma es metacntrico, pero si est ms cerca de un extremo que del
otro, el cromosoma es submetacntrico (Fig. 62-26). Cmco pares de cromosomas acro

cntricos modifican los brazos cortos con tallos que slo contienen copias mltiples d
e genes de ARNr cubiertos por una caperuza producida por un telmero modificado, d
enominado satlite (Fig. 62-2A). El extremo de un cromosoma es el telmero. Se sabe
que estas regiones estn compuestas de ADN repetido en tndem con la secuencia (TTAG
GG) que funciona para estabilizar a los cromosomas. Los mecanismos de la replicac
in del ADN son de tal forma que no todo el ADN telmero se puede replicar en cada d
ivisin, por lo que con el paso del tiempo se produce un acortamiento de los telmer
os. Se da por sentado que la prdida total de los telmeros lleva a un aumento de la
s aberraciones cromosmicas, que, en parte, pueden ser las responsables del proces
o de enveiecimiento humano (Harley. 1990; Wright, 1992: de Lange. 1998).
CITOGENTICA
A la citogentica se la define como la ciencia que combina los mtodos y los hallazg
os de la citologa y de la gentica para investigar la herencia a nivel celular. Est
o incluye la evaluacin cuidadosa de los cromosomas, estructuras compuestas de cido
desoxirribonucleico (ADN) de doble hlice que estn unidas con protenas histonas y n
o histonas. Slo 16 aos despus de que Mendel estableciera que la gentica era un nuevo
campo de la ciencia, Walther Fleming, en 1882. le el primero en observar cromoso
mas en clulas tumorales, haciendo de la citogentica uno de los campos ms antiguos d
e la gentica. Poco despus de comenzar el siglo xx se estableci la importancia de lo
s cromosomas sexuales, y en 1959 se utilizaron por primera vez los estudios cito
genticos en las investigaciones de los laboratorios clnicos. La capacidad para det
ectar cambios en la estructura de los cromosomas, y de correlacionarlos directam
ente con la enfermedad, y las anomalas fenotipicas en los individuos demostr que e
ra un gran avance para los diagnsticos clnicos. Pasado el tiempo, se han acrecenta
do el nmero y los tipos de los estudios, y muchos de los anlisis que se han hecho
se han convertido en el "estndar oro" para los diagnsticos. En la actualidad, cuan
do cada vez se clonan mayor nmero de genes de enfermedades, el nfasis en el desarr
ollo de anlisis moleculares de mutacin directa es cada vez mayor (vase Cap. 66). To
dos estos estudios funcionan bien cuando el diagnstico se sabe o se sospecha, per
o en ausencia de un desorden conocido, la citogentica an conserva su posicin como e
l nico anlisis de laboratorio clnico que es capaz, con un solo anlisis, de examinar
la constitucin celular gentica de un individuo. En consecuencia, las aplicaciones
clnicas de los anlisis citognicos se pueden encontrar en todos los campos y en toda
s las edades, desde el diagnstico prenatal a la evaluacin del cncer.
Cultivo
celular
Para hacer un anlisis cromosmico, las clulas de un paciente se deben cultivar in vi
troa fin de obtener clulas en metafase. Como promedio, las clulas humanas se divid
en una vez cada 24 horas, de forma que slo un 1% de la poblacin celular se divide
en un tiempo determinado. Sin embargo, algunas clulas, como los linfocitos en un
individuo sano y normal, no se dividen en absoluto, por lo que se han desarrolla
do tcnicas especiales de cultivo para estimular la divisin de las clulas y as aument
ar la produccin de clulas en metafase. Especmenes. Se puede utilizar, prcticamente,
cualquier muestra de clulas, siempre que contenga clulas viables y nucleadas. Sin
embargo, se puede favorecer a ciertos tipos de clulas, que son fciles de obtener y
de cultivar, por medio de preparaciones cromosmicas. La muestra preferida para h
acer estudios citognicos sistemticos de nios y de adultos es la sangre perifrica hep
arinizada. Dado que muchos otros anlisis de laboratorio dependen de estas muestra
s, el obtener una alcuota para los estudios citognicos en general es fcil de organi
zar y no resulta doloroso para el paciente. En los desrdenes hematolgicos, las mue
stras de mdula sea son las que proporcionan mejores resultados, ya que son el foco
del proceso de la enfermedad. Una fuente adecuada de clulas en metafase la propo
rcionan los cultivos de fibroblastos obtenidos de una biopsia de piel o de piel
extrada con un sacabocados. No se utilizan, habitualmente. los tejidos del hgado,
del rion, de los pulmones y de los msculos, debido a la naturaleza invasora de los
mtodos utilizados para la extraccin de estas muestras; sin embargo, estos tejidos

proporcionan, con frecuencia, una fuente excelente de material si se obtienen c

omo resultado de una prdida fetal o poco despus de la muerte, durante la autopsia.
Las muestras de productos de la concepcin pueden conCromosomas
Para comprender las anomalas lo primero es comprender en qu consiste una serie de
cromosomas "normales". El complemento del cromosoma huma-

1306
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 62-1. Cariotipo del complemento de c r o m o s o m a humano de un hombre:
los 46 cromosomas estn ordenados en pares. Obsrvese el par no homlogo de los cromo
somas sexuales con un cromosoma X y un cromosoma Y.
Figura 62-2. A, Esquema de la anatoma del c r o m o s o m ad e metalase que muest
ra marcas importantes. Se contrasta la forma del metacntrico con la del acrocntric
o, que tiene la estructura del brazo corto modificada y est integrada por tallos
y satlites. En todos los casos, el brazo corto, o brazo p, est orientado hacia arr
iba y el brazo largo, o brazo q, est orientado hacia abajo. 8, La posicin relativa
del centrmero puede variar, originando c r o m o s o m a s metacntricos. submetacn
tricos y acrocntricos.

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1307
tener una mezcla de tejidos fetales y maternales, y por esta causa se requiere u
n cuidado extra al establecer el cultivo (De Martinville. 1984). Para los anlisis
prenatales, la muestra ms corriente es el lquido amnitico. que se consigue por med
io de una amniocentesis. Este procedimiento se ejecuta con una gua ecogrfica para
evitar al feto cuando el mdico introduce una aguja, a travs del abdomen y del tero
de la madre, en la bolsa amnitica. Esto se hace, generalmente, a las 16 18 semana
s de gestacin, en ese momento se pueden extraer entre 20 mi y 30 mi de fluido amn
itico (orina fetal) sin riesgo para el feto. Las clulas presentes en la muestra so
n derivadas del feto y proporcionan material tanto para el anlisis citogentico com
o para el anlisis gentico molecular. El liquido contiene o-letoproteina (AFP), as c
omo otras protenas y enzimas que forman el sustrato para otros anlisis prenatales
(vase Cap. 22). El riesgo de prdida fetal debido a la ammocentesis es de aproximad
amente un 0,5%. Otro procedimiento prenatal es utilizar una muestra de vellosida
d connica (CVS), que proporciona el tejido de la placenta en desanollo (vellosida
des cortnicas) (Blakemore, 1988; Rhoads. 1989) El procedimiento transabdominal tr
ansvagmal se efecta a las 10 14 semanas de gestacin y tiene un riesgo de prdida fet
al de, aproximadamente, 1 entre 100. Si no se extrae lquido amnitico. no se pueden
hacer anlisis relacionados o de AFP, aunque es posible hacer anlisis estndar citogn
icos. bioqumicos y moleculares. El resultado de una muestra de sangre umbilical p
ercutnea (MSUP) o cordocentesis se convierte en un espcimen de sangre fetal que pu
ede ser utilizado para hacer un rpido cariotipo o para estudios moleculares. Este
procedimiento se efecta en fases de gestacin ms tardas (>20 semanas) y conlleva un
riesgo mayor de prdida fetal (del 2% al 5%). Todas las muestras clnicas para los a
nlisis citognicos se deben recoger de la forma ms estril posible. La presencia de ho
ngos o bacterias harn peligrar, muy gravemente, el estudio, debido a que las clula
s procarilicas crecern demasiado y dejarn fuera de combate a cualquier clula humana
presente. Para maximizar el nmero de clulas viables, las muestras deben ser llevad
as al laboratorio tan pronto como sea posible despus de ser recogidas. La sangre,
la mdula sea, el liquido amnitico y la vellosidad corinica se deben mantener a la t
emperatura del lugar donde se vayan a analizar, mientras que el tejido slido se t
ransporta sobre hielo hmedo. Esta diferencia de temperatura en el transporte se d
ebe a las condiciones innatas de la muestra. Las clulas de la sangre, de la mdula s
ea y del lquido amnitico se comportan como clulas individuales en un sustrato liqui
do, y la integridad de la muestra no se pone en peligro siempre que se mantenga
esta relacin a una temperatura cercana a la corporal. Sin embargo, la obtencin de
tejidos necesita clulas para ser extradas del cuerpo, dejando a las clulas rotas o
agonizantes en la periferia de la muestra. L a liberacin de enzimas lisosmicas fac
ilita la degradacin de las clulas muertas y bajo condiciones adecuadas atacarn a la
s clulas vivas contiguas. Si la temperatura se baja a unos 4"C, se inhibir la acti
vidad de las enzimas y as se mantiene la viabilidad de la muestra. Tcnicas de cult
ivo celular. Dependiendo del tipo de clula, se pueden utilizar tcnicas de cultivo,
bien de suspensin (dotando) o bien de monocapa (fijadas a una superficie). Las cl
ulas sanguneas y las de mdula sea se cultivan en suspensin y se alicuotan directamen
te dentro de un medio de cultivo apropiado. Las de mdula sea se cultivan, normalme
nte, durante 24 a 48 horas, mientras que los linfocitos. para obtener un resulta
do mximo, necesitan estar en cultivo tres o cuatro das. Adems, dado que normalmente
los linfocitos no se dividen en cultivo, tienen que ser inducidos mediante la u
tilizacin de un mitgeno. normalmente la fitohemaglutinina (PHA). de esta manera se
pueden recoger despus las clulas de la metafase resultantes por medio de un inhib
idor mittico, como colcemida. Las clulas del lquido amnitico y el tejido slido se cul
tivan in silu como una monocapa. Primero se disgregan los tejidos y VC utilizand
o un tratamiento de colagenasa suave y a continuacin se esparcen las clulas indivi

duales sobre cubres de cristal y se cubren con medios de cultivo. En las muestra
s de lquido amnitico, las clulas, antes de ser colocadas en placas, deben ser disoc
iadas del lquido por medio de la centrifugacin, y se las deja para que formen colo
nias in silu. Los tiempos normales de cultivo son de 5 a 10 das para el VC y los
amniocitos y hasta de dos semanas para los cultivos de tejidos slidos. Una vez qu
e se ha conseguido el mximo crecimiento, se recolectan todos los tipos de clulas u
tilizando tcnicas similares. Las clulas son agrandadas
Figura 62-3. Diseminacin cromosmica de melafase. Los cromosomas de una sola clula s
egn se ven en un portaobjelos de microscopio.
hpotnicamente (hasta el punto de que la membrana de la clula se eslire, pero no se
rompe) y luego son fijadas. Al soplar suavemente el cubre que contiene clulas lij
adas de los cultivos in silu. se rompe la membrana de la clula y los cromosomas d
e la melafase se dispersan. Aunque en la mayora de los laboratorios todava se efec
tan estos pasos manualmente, se ha desarrollado un recolector robtico automatizado
que puede procesar gran cantidad de cultivos con bastante eficiencia. En los cu
ltivos de suspensin, las clulas fijadas se deben colocar, mediante un goteo, sobre
una placa de microscopio limpia, la cual, mecnicamente, rompe las membranas y de
ja a los cromosomas ligeramente separados los unos de los otros, pero en u n a r
egin diferente ocupada por una sola clula (Fig. 62-3). Las placas, despus de secarl
as con un secador, estn listas para la coloracin. En algunos casos se mejora la ca
lidad de la coloracin envejeciendo las clulas a 65 C durante 30 a 60 minutos.
Coloracin
Los cromosomas se tien habitualmente utilizando Giemsa, un tinte de carga positiv
a que se une a una molcula de ADN de carga negativa. La tripsinizacin suave de los
cromosomas antes de la tincin aparentemente debilita las interacciones de la pro
teina con el ADN, lo que da como resultado un patrn definido de regiones alternat
ivamente claras y oscuras, al que se le denomina patrn de bandas (bandeo G para b
andeo Giemsa) (Yunis. 1973: Burkholder. 1977; Holmqust. 1982). Cada par de cromos
omas tiene un patrn de bandas nico que est representado esquemticamente como un ideo
grama (ISCN. 1995) (Fig. 62-4), y que se utiliza para identificar a cada cromoso
ma y a las sub-regiones cromosmicas. Si bien el bandeo G es el adecuado en la may
ora de las situaciones, se puede obtener informacin adicional de la estructura del
cromosoma utilizando otras tecnologas especiales de tincin. Las coloraciones espe
ciales ms corrientes son el bandeo Q. el bandeo C y el bandeo R. En un principio
se utiliz el bandeo Q. o tincin de fluorescencia de guinacrina, para hacer carioti
pos ordinarios (Comings. 1975). Sin embargo, y debido a que la fluorescencia es
transitoria, ahora ha sido reemplazado por el bandeo G, que admite u n a prepara
cin de coloracin permanente. En la actualidad el bandeo O se aplica principalmente
para lograr una identificacin rpida del cromosoma Y . El extremo distal del brazo
largo del cromosoma Y esta compuesto de heterocromatina y es la regin fluorescen
te ms brillante en una metalase humana (Fig. 62-5A). En los casos de genitales am
biguos, una preparacin rpida de bandeo Q puede, normalmente, contestar a la pregun
ta de si hay presencia o ausencia

1308
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
l>
q
1
7
14
Y
Figura 62-4. Ejemplos de ideogramas de los c r o m o s o m a s 1.7,14 e Y que mu
estran el patrn estndar de las bandas claras y de las bandas oscuras.
del cromosoma Y en el paciente. El bandeo C, constitutivo o bandeo de centrmero.
se utiliza para evaluar la heterocromatina constitutiva o para determinar si un
cromosoma tiene dos centrmeros (dicntrico). Normalmente el centrmero aparece como u
n solo punto oscuro en un cromosoma teido en su totalidad con una coloracin clara
(Holmquist, 1979) En el caso de un cromosoma dicntrico, la presencia de dos regio
nes oscuras permitir identificar con claridad a los dos centrmeros (Fig. 62-5S). E
l bandeo R, o bandeo inverso, presenta a los cromosomas con el mismo patrn de ban
deo que el que hemos visto en el bandeo G, pero las bandas claras y las oscuras
estn invertidas, de ah su nombre. Debido a que los telmeros de los cromosomas tiene
n tendencia a ser pequeos, bandas de tincin claras, si se utiliza un bandeo G estnd
ar puede que no sea fcil detectar una delecin. Sin embargo, en el bandeo R los telm
eros se colorearan como bandas oscuras y su ausencia, como resultado de una delec
in, es ms obvia.
ra del cromosoma. Para cumplir con los objetivos diagnsticos clnicos, en casi toda
s las circunstancias es suficiente el bandeo G de los cromosomas metafsicos. Sin
embargo, quiz no se puedan resolver algunos desrdenes que estn asociados con deleci
ones muy pequeas del material cromosmico a este nivel. En estas situaciones se uti
lizan anlisis de alta resolucin. Las clulas se cultivan de manera que se puedan rec
olectar en una etapa ligeramente ms temprana de la divisin celular, la prometafase
. En este m o m e n t o de la divisin celular, los cromosomas estn menos condensad
os. haciendo que sea ms fcil detectar la presencia de pequeas anomalas. El anlisis lo
ejecuta un leenlogo examinando las clulas a travs del microscopio, y una vez que s
e ha completado el estudio se h a c e una determinacin de si el complemento de cr
omosomas es "normal" o "anormal". Para la documentacin se fotografan las clulas de
la metafase utilizando una cmara de 35 m m montada en un microscopio. Luego se re
vela la pelcula, se hacen las copias, se recortan los cromosomas y se pegan en u
n a hoja de papel con cinta adhesiva o con pegamento. Los pares homlogos estn orga
nizados, de mayor a menor, en siete grupos a los que se les designan letras de l
a A la G. ms el par de cromosomas sexuales. Siguiendo la costumbre, el brazo ms co
rto, denominado brazo p, est orientado hacia arriba y el brazo ms largo, o brazo q
, est orientado hacia abajo. El producto final es una ilustracin de los cromosomas
de una clula especifica y se la conoce c o m o cariotipo (Fig. 62-1).
Anlisis del carie-tipo
Para efectuar un anlisis citogentico es esencial poder identilicar cada cromosoma,
rpida y exactamente, y determinar cundo se presentan anomalas cromosmicas. El prime

r paso que hay que dar es contar el nmero de cromosomas presentes en la clula que
se est evaluando. El nmero de centrmeros activos define el nmero total de cromosomas
, que sern 46 en una clula diploide humana normal. El que haya cromosomas de ms o d
e menos indica una anomala numrica potencial. El cultivo in vitro puede dar como r
esultado artefactos de cultivo, por eso no se utiliza una sola clula para definir
el complemento de cromosomas de un paciente, asi que para un estudio clinico tpi
co se necesitan analizar de 15 a 20 clulas: en los casos de mosaicismo o para otr
as situaciones especiales tal vez haya que evaluar de 10 a 30 clulas adicionales.
Los cromosomas individuales se identifican basndose en el tamao total de cada cro
mosoma, en la posicin de su centrmero y en el patrn de bandeo. En este momento se d
ebera detectar cualquier variacin en la estructuImagen asistida por ordenador
Los cariotipos que proceden de fotografas dan una imagen de alta resolucin, pero r
equieren tiempo y esfuerzos significativos. En los ltimos aos los ordenadores han
tenido un gran impacto en los laboratorios clnicos, ya que permiten la automatiza
cin de muchas tareas tediosas y s e han hecho un hueco en los laboratorios de cit
ogentica bajo el formato de sistemas para hacer cariotipos asistidos por ordenado
r. En lugar de una cmara de 35 mm, se monta en el microscopio una videocmara DCA (
dispositivo de carga ac-

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1309
piada). Utilizando un software especialmente diseado, se capta la imagen de una cl
ula en metafase usando un captador de imgenes estndar, se dgitaliza y aparece en el
monitor del ordenador. Llegados a este punto, el software permite modificar la
imagen, aclarndola, oscurecindola o cambiando el contraste, de modo que se pueden
hacer mltiples modificaciones de los cromosomas, incluso enderezarlos e importar
cromosomas de otros campos. Despus se puede hacer un cariotipo, utilizando una su
b-rutina de reconocimiento del patrn que reconocer los cromosomas, automticamente,
y los emplazar en sus lugares adecuados, en forma de cariotipo. La precisin de est
e procedimiento puede variar entre un 10% y un 85%, dependiendo del software y d
e la calidad de la imagen. Despus de que el ordenador haya capturado a su "mejor
husped", las correcciones adecuadas las debe hacer un tecnlogo citogentico especial
izado. Una vez que los cromosomas estn correctamente posicionados se pueden hacer
las amplificaciones cosmticas adicionales para eliminar los bordes rasgados o re
siduos de posos. Luego se imprime la versin final del cariotipo en una impresora
de alta resolucin. Aunque la calidad total no es tan alta como la de una presenta
cin fotogrfica, la utilizacin del sistema por ordenador conlleva un enorme ahorro d
e tiempo. Un tecnlogo especializado puede tardar en hacer un cariotipo ordinario,
desde la captura hasta la impresin, de 15 a 20 minutos por trmino medio. Otra gra
n ventaja de los sistemas asistidos por ordenador se encuentra en la microscopa d
e fluorescencia.

Hibridacin in situ fluorescente

Los tipos clsicos de coloracin citogentica que se han descrito son el resultado de
los tintes que se unen al ADN o a las protenas de un cromosoma y que permiten su
visualizacin por medio de la microscopa ptica. La hibridacin in situ. que es la comb
inacin de la biologa molecular y de la citogentica, abri otra puerta que hizo posibl
e las investigaciones de las anomalas cromosmicas posteriores. En stas, en lugar de
un tinte, es una sonda molecular (esto es, un fragmento de ADN) la que se une a
l cromosoma. En los primeros estudios se marc a la sonda con una mezcla radiactiv
a (normalmente tritio), de manera que, despus de su exposicin a un pelcula de rayos
X durante un tiempo de 5 a 1 0 das, se pudo detectar un patrn de granos de plata
que identificaban la localizacin cromosmica de la sonda. Esta tcnica facilit el pode
r hacer el mapa gnico por medio de la identificacin de los locus del gen (Trask. 1
991). La autorradiografa tuvo su utilidad, pero slo se poda utilizar una sonda cada
vez. necesitaba una cantidad de tiempo significativa y haba un grado de dispersin
de los granos de plata que requera un anlisis estadstico de los datos obtenidos. A
mediados de los aos 80 (del siglo xx), se desarroll una variante de esta tcnica qu
e ha demostrado ser extremadamente til en las aplicaciones clnicas. Esta nueva tec
nologa, la hibridacin in situ fluorescente (HISF), es ms rpida, ms especfica y permit
la utilizacin de mltiples sondas en un solo procedimiento de hibridacin. Adems, en
vez de sondas marcadas con radiactividad, se utiliza una tincin fluorescente que
se visualiza a travs de la microscopa de fluorescencia (Ledbetter, 1989). A pesar
de que la HISF se puede utilizar para hacer mapas de genes, la meta, en las apli
caciones clnicas, es determinar si hay un gen o una mutacin especfica, por eso la s
onda molecular tiene que estar bien caracterizada y tiene que ser especfica para
el locus en cuestin. Hay tres tipos bsicos de sondas. La sonda de secuencia nica ai
slada de un gen causante de la enfermedad clonado y que se utiliza para identifi
car la presencia o ausencia de ese gen (Cherf, 1989; Lindsay, 1993). Las sondas d
e coloracin del cromosoma son, en realidad, un cctel de muchos fragmentos de ADN ni
cos recogidos a lo largo de toda la longitud de un cromosoma, de modo que en la
hibridacin siguiente todo el cromosoma emite luz fluorescente (Fig. 62-6A). Las s
ondas de secuencias repetitivas son aisladas de las regiones de telmeros o de cen

trmeros. Las sondas de centrmeros se utilizan, generalmente, para la enumeracin de

los cromosomas (es decir, para detectar el aumento o la prdida de cromosomas espe
cficos) (Figs. 62-66 y C) (Lichter, 1990). Las sondas de telmeros se utilizan, a m
enudo, para caracterizar los reordenamientos crpticos (esto es, para determinar s
i ambos telmeros de un cromosoma estn presentes y localizados en el cromosoma corr
ecto o si se ha producido una delecin o reordenamiento). Tcnica HISF. La HISF comb
ina los mtodos de la biologa molecular y de la citogentica, como en la hibridacin in
situ original. Las clulas se cultivan y se recolectan, y se preparan las placas
exactamente igual que para un estudio citogentico clsico. Luego se desnaturaliza e
l ADN de las placas y se deja que una sonda molecular de una sola hebra marcada
con fluorescencia hibride al ADN cromosmico. utilizando una temperatura de anilla
miento que favorece la hibridacin de las regiones homologas del ADN (Fig. 62-7A).
Despus de un periodo de hibridacin adecuado, se eliminan los restos de la sonda p
or medio del lavado y al ADN no hibridado se le aplica una contracoloracin con ot
ro fluorocromo para poder visualizar el complemento de cromosoma en su totalidad
. La evaluacin de la clula se hace utilizando un microscopio fluorescente con la l
uz de una bombilla de mercurio de 100 W combinado con juegos de filtros excitado
res apropiados. En un microscopio fluorescente tpico slo se pueden visualizar tres
colores como mximo, debido a las limitaciones pticas de los filtros de cristal. S
e puede utilizar una cmara de 35 m m unida al microscopio para la documentacin del
estudio. Sin embargo, si se utiliza un sistema asistido por ordenador para obte
ner las imgenes fluorescentes, se obtienen resultados m u y superiores. Adems, los
paquetes de software adecuados permiten la amplificacin de las seales dbiles y la
nitidez de la imagen. Uno de los elementos de la HISF ms crticos es la eleccin de u
na sonda o sondas especficas, ya que ayudarn a dar respuesta a las preguntas clnica
s. Por ejemplo, una de las aplicaciones clnicas de la HISF ms tiles es la deteccin d
e microdeleciones que son demasiado pequeas para poder ser vistas utilizando la c
itogentica clsica (Figs. 62-76 a D). El gen debe ser conocido y la sonda utilizada
debe ser homologa a la regin del gen que es eliFigura 62-5. A. Metalase de bandeo-0 que muestra la fluorescencia brillante del
c r o m o s o m a Y (flecha). 6, Cromosomas de bandeo-C que muestran a los centrm
eros teidos de oscuro. Se detect un cromosoma dicntrico con dos bandas oscuras (dos
flechas).

1310
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR dor para los cromosomas de inters (Fig. 62-70). Se puede hacer
el estudio en clulas en metalase, asi como en las de mterfaz. si se utiliza un si
stema de color dual. Las sondas de coloracin de cromosomas son muy tiles para iden
tificar reordenamientos complejos o cromosomas marcadores. Si un paciente tiene
un cromosoma anormal con material extra de origen desconocido, se podra utilizar
la tincin del cromosoma para identificar la fuente del ADN extra. Esto puede ayud
ar en el diagnstico o en el pronstico del individuo. En el caso de un paciente con
46 cromosomas, incluyendo un cromosoma X y un cromosoma marcador no identificad
o pequeo, ser importante determinar si el origen del marcador es un cromosoma X o
uno Y. Esto se puede hacer utilizando tintes de cromosomas en los cromosomas X y
en los Y marcados con lluorocromos diferentes. Las sondas HISF proporcionan muc
ha informacin cuando se evalan en las clulas en metalase, donde es posible identifi
car al cromosoma especifico al que hbrida la sonda. Sin embargo, en algunas prepa
raciones celulares quizs estn presentes muy pocas clulas en metalase, y en estos ca
sos se puede obtener informacin con sondas de secuencia nica o de secuencia repeti
da en los ncleos de inlerfaz. Pero aqu aumentan los problemas tcnicos, debidos a la
prdida azarosa de la seal, a las seales extra y a las seales solapadas en las clulas
, asi que se deben contar clulas adicionales (un total de 50 a 200) para obtener
un resultado estadstico significativo. HISF multicolor. Una de las ventajas que t
iene la HISF sobre la vieja hibridacin in silu es su capacidad de hibridar mltiple
s sondas a una sola
minado, la regin critica. La hibridacin con la sonda deberia aparecer como una seal
fluorescente slo en el locus diana. Si aparece una seal, es que est presente el AD
N complementario a la sonda, por tanto no hay delecin. Sin embargo, la ausencia d
e la seal indica que existe la delecin (esto es, no hay secuencia de ADN presente
en el cromosoma que es complementario a la sonda, por tanto la hibridacin no pued
e producirse). Un individuo no afectado deberia tener dos seales por clula en cada
gen autosmico, una seal en cada cromosoma del par (Fig. 62-8A). Un individuo afec
tado por una delecin deberia tener una sola seal por clula, mostrando un cromosoma
normal y otro delecionado (Fig. 62-86). Uno de los problemas de los anlisis de de
lecin es que lee la ausencia de seal como una indicacin positiva de la delecin. El f
racaso de la hibridacin tambin puede tener como resultado la ausencia de la seal. P
ara eliminar esto como fuente de errores, se deben evaluar 20 clulas como minimo
y todas las clulas deben concordar en el cmputo de la seal. Si se sospecha de que e
xiste mosaicismo, se deben examinar clulas adicionales. Adems, las sondas de secue
ncia nica se utilizan actualmente en combinacin con una sonda control (Fig. 62-7C)
. La segunda sonda se localiza en el mismo brazo del cromosoma que el locus de d
elecin. Se puede marcar con el mismo lluorocromo que a la sonda de locus de delec
in, pero se ha visto que resulta ms fcil interpretar los resultados de la hibridacin
si se marca a la sonda de control del sitio con un luorocromo de color diferente
. Se deben ver dos seales de control claras en todas las clulas evaluadas y luego
se pueden registrar las seales que se corresponden con el locus de enfermedad. Es
to proporciona un control de hibridacin, asi como un marcaFigura 62-6. A. Sonda de tincin del c r o m o s o m a completo que hace resaltar
a los dos c r o m o s o m a s X en una clula de m u j e r B y C. Sonda de centrmer
o de secuencia repetida para el c r o m o s o m a 21. B. A la izquierda se ve la
tnsoma 21 en un ncleo de mterfaz y a la d e r e c h a en u n a metalase. C, Compl
emento normal de dos copas del c r o m o s o m a 21 visto en mterfaz (derecha e
izquierda) y en u n a melafase (centro).

CAPTUIO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1311
Figura 62-7. A. Esquema de la tecnologa HISF. El ADN derivado de un gen conocido
se separa quedando una sola hebra, se m a r c a con una seal fluorescente y luego
se le hbrida de vuelta a los cromosomas de una clula en metafase. B.CyD. Dibujos
de cromosomas metalsicos fluorescentes con sondas marcadas que hibridan a las dia
nas (flechas) 6. Seales duales que indican la hibndacin de ambos alelos del gen di
ana. C. El gen diana est sealado en rojo y la sonda de control en verde. Hibridacin
completa de todos los alelos. D, Hibridacin de ambos controles (verde), pero la
presencia de un nico gen diana solamente indica la delecin de un alelo.
Figura 62-8. Deteccin medame HISF de una microdelecin del cromosoma 22 asociada al
sndrome DiGeorge y al sndrome velocardiotacial. A. Un individuo "normal" con no de
lecin muestra la presencia de una seal roja (locus de gen) y de una seal verde (loc
us de control) en c a d a cromosoma 22 B. Paciente con una delecin que se visuali
za en un c r o m o s o m a con una nica seal verde solamente. El cromosoma 22 homlo
go es "normal", con una seal roa y una seal verde.

1312
rojo:amanllo
13 21 IX Y 100:0 75:25 25:75 5(1:50
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
13
21 IX
rojo
verde rosa
Y
X
blanco
amando
\
(l:l(K)
Figura 62-9. HISF multicolor A. Diagrama de tincin real de cinco sondas de combin
acin. La tabla de la derecha muestra las proporciones de colores relativas para c
a d a sonda utilizada. 8, Diagrama de la imagen obtenida de un ordenador de la
m i s m a clula que muestra el color artificial q u e se le ha asignado (la clave
se nuestra en el recuadro a la izquierda de la imagen).
placa y obtener un conocimiento mejor de los reordenamientos de cromosomas (Schr
ock. 1996; Speicher. 1996). Sin embargo, incluso aqui existen lmites. Una imagen
fluorescente se produce por la luz de una bombilla de mercurio que pasa a travs d
el filtro estimulador, da en el fluorocromo de la placa y transmite la imagen de
l color adecuado a la lente del microscopio para su visionado. Cada fluorocromo
requiere su propio filtro, por eso. para cada color adicional que se desee conse
guir, la luz debe pasar a travs de diferentes grosores del cristal. Por tanto, la
s propiedades pticas de la luz y del cristal limitan a tres el nmero de colores qu
e pueden verse. Sin embargo, con el advenimiento de los sistemas asistidos por o
rdenador, ya es posible distinguir mltiples colores en una sola hibridacin El orde
nador no "ve" realmente ms colores, pero puede detectar, meior que el OJO humano,
diferencias sutiles en las tonalidades. Para hacer un examen relativamente senc
illo, se utilizan dos fluorocromos, que, mezclados en proporciones variables, da
n una gama de colores (Fig. 62-9A). El ordenador registra cada color como una to
nalidad diferente de gris y luego asigna un color nico a esa tonalidad para su pr
esentacin en el monitor (Fig. 62-98). Esa imagen multicolor se puede imprimir des
pus, aunque los colores de la impresin son completamente diferentes a los que en r
ealidad haba visto el sistema. A partir de la asignacin de un color nico por ordena
dor, se han desarrollado combinaciones de fluorocromos que permiten la deteccin d
e cada uno de los 24 cromosomas diferentes (Red. 1992a. 1992b; Divane. 1994).
patibles con la vida y que se detectan, principalmente, en tejidos procedentes d
e abortos espontneos. La triploida (Fig 62-1OA) puede estar causada p o r un error
en la gametognesis de una de las divisiones meiticas que da origen a un gameto 2N
. el cual, al ser fertilizado por un gameto haploide del otro progenitor, produc
e un zigoto triploide. Por otro lado, un complemento 3N puede estar derivado de
la dispermia (fertilizacin de un huevo haploide por dos espermatozoides), y esto,
generalmente, da como resultado una masa parcial hidatidiforme (vase Cap. 20) La

tetraploida es un acontecimiento posmeitico y se presenta como una duplicacin de u

n complemento diploide (XXXX o XXYY). que seguramente se debe al error de una es
cisin de la divisin mittica temprana en el zigoto. Aneuploidia. Los errores de no s
eparacin que dan como resultado la aneuploidia son ms corrientes. En estos casos u
n solo par de cromosomas no logra separarse correctamente en la divisin, originan
do un cromosoma extra o perdiendo un cromosoma por clula. Algunas veces pueden ve
rse involucrados ms de un par de cromosomas, pero estos casos son extremadamente
raros. Los errores de la no disociacin pueden producirse tanto en la meioss como e
n la mitosis. La no disociacin mittica temprana en el zigoto puede dar lugar a un
individuo con el complemento de cromosoma aberrante en todas las clulas del cuerp
o, pero un error en la divisin ms tardo produce un mosaico (un individuo con dos li
neas de clulas que nicamente se diferencian en un solo cromosoma). Los errores meis
icos producen gametos, bien con un cromosoma extra o bien con uno de menos (Fig.
62-11) (Angel. 1994). Una vez fertilizados, el primero dar una concepcin trismica a
l cromosoma no disociado (Fig. 62-1 Ofi) y el ultimo dar una monosoma. Tanto la tr
isomia como la monosoma pueden producirse en cualquier cromosoma, pero la mayora d
e slas son incompatibles con la vida y se eliminarn de forma espontnea. Por ejemplo
, la trisomia 16 es la trisomia que se detecta, ms frecuentemente, en los tejidos
procedentes de abortos espontneos, pero no se ha informado de ningn caso en seres
nacidos vivos. Las trisomias autosmicas de seres nacidos vivos incluyen los crom
osomas 13.18 y 21. Muy raramente se identifican pacientes con un complemento de
cromosoma mosaico de trisomas 8. 9 22. Las tnsomas de los cromosomas sexuales son
viables y estn bien documentadas (vide mira). La nica monosomia viable es la del c
romosoma X (45,X). Ms adelante, en este capitulo se describirn las aneuploidas clnic
amente significativas. En los ltimos aos se ha detectado un efecto secundario de l
as concepciones aneuploides. Dado que las trisomias y las monosomias son, en gra
n parte, incompatibles con la vida, se asumi que podran dar lugar a la prdida del f
eto. Pero ahora se sabe que un pequeo fragmento de estas concepciones aneuploides
es "rescatado" y sigue adelante para originar nios nacidos vivos. En caso de una
monosoma. el rescate se produce por la duplicacin del nico cromosoma existente, qu
e da como resultado un complemento de c r o m o s o m a con isodisomia uniparent
al para ese cromosoma (dos copias del m i s m o cromosoma heredado de un progeni
tor) (Fig. 62-12) (Ledbetter. 1995). Esto est desento en vanos casos publicados,
en los que se demuestra que un nio afectado de fibrosis cistica (FC) es homocigot
o a la mutacin AF508, aunque los anlisis moleculares de ambos progenitores revelar
on que slo uno de ellos era el portador de AF508 (Spence, 1988; Voss, 1989). Esto
se interpreta c o m o que la
Anomalas cromosmicas
Los anlisis citogenticos clnicos se han convertido en una parte importante de la me
dicina clnica, ya que el descubrimiento de una anomala cromosmica especfica puede ex
plicar un problema fsico o una anomala fenotpica en el paciente y se la puede asoci
ar directamente con el diagnstico de la enfermedad. El propsito del ensayo clnico e
s determinar si un individuo tiene un complemento de cromosoma diferente del pat
rn estndar de 23 pares de cromosomas de morfologa conocida. Hay dos categoras bsicas
de vanaciones detectables a travs de la citogentica; 1) numrica y 2) de cambio estr
uctural.
Anomalas
numricas
En el hombre y en otros mamferos los cromosomas se producen en pares, por lo que
de los 46 cromosomas slo hay 23 especialmente diferentes. Un conjunto de 23 inclu
ye el nmero haploide (N) de cromosomas, que es el nmero de cromosomas en un gameto
. En el momento de la fertilizacin, se unen dos complementos haploides para forma
r un zigoto con 46 cromosomas, que es el complemento diploide (2N). Los errores
en la divisin pueden dar lugar a complementos de cromosoma que tengan ms de 46 cro
mosomas o menos de esta cantidad. A los mltiplos exactos del conjunto haploide de
l cromosoma se le denomina euploidia. Y aneuploidia al aumento o a la prdida de u

no o unos cuantos cromosomas Euploidia. La diploida, que es el estado normal de l

as clulas humanas, es una lorma de euploidia. Las euploidas anormales incluyen la
triploida (3N = 69 cromosomas) y a la tetraploida (4N = 92 cromosomas), que no son
com-

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1313
concepcin fue una monosomia 7 no viable rescatada por la duplicacin del crom o s o
m a 7 existente, que por casualidad era el portador de la FC. En el caso de una
trisoma tambin es posible una situacin similar. Volvemos a repetir que la mayora de
las tnsomas no son viables, pero si se pierde uno de los tres cromosomas, se res
tablece una disoma para ese par de cromosomas. En un conjunto de tres cromosomas
la prdida de un solo cromosoma originar, dos de cada tres veces, un complemento co
n un cromosoma paterno y uno materno Iheterodisomia biparental). La tercera vez.
los dos cromosomas restantes son de un solo progenitor (esto es, disoma uniparen
tal). En esta situacin, la diferencia est en cul de las divisiones meiticas se produ
jo el error. Una disociacin en la primera divisin tendr como consecuencia una heter
odisoma, es decir, dos cromosomas homlogos pero heterocigotos (uno de la abuela y
otro del abuelo): sin embargo, un error en la segunda divisin originar copias dupl
icadas de un solo cromosoma, esto es, la isodisomia (Figs. 62-11 y 62-13). Podri
a pensarse que mientras que estn presentes un par de cromosomas no debera importar
su origen especfico, pero los datos indican, firmemente, que la evidencia es otr
a. Los problemas de disoma uniparental frente a biparental y de isodisoma frente a
heterodisoma tienen una enorme importancia para comprender los fenmenos de impron
ta, un t e m a descrito con detalle en el Capitulo 66 (Nichols. 1998; Hall. 1990
; Cassidy. 1992: Petersen, 1992).
1) equilibradas, si todo el material cromosmico est presente y es funcional, pero
est ordenado en una conformacin diferente, o 2) desequilibradas, si hay prdida y/o
adicin de material cromosmico. Las reordenaciones equilibradas son, en general, cln
icamente benignas y tienen tendencia a ser trasmitidas de forma estable, aunque
pueden aumentar el riego de errores en la meiosis. que originarn desequilibrios c
romosmicos en los letos o en los nios nacidos vivos. Los complementos de cromosoma
desequilibrados estn, generalmente, asociados a un fenotipo clnico anormal que a
menudo incluye el retraso en el desarrollo y el retraso mental. La delecin es la
prdida de una parte de un cromosoma y produce la monosomia parcial del cromosoma
involucrado (Fig. 62-14). Las deleciones varan en tamao, desde bastante grandes a
m u y pequeas, y pueden ser terminales (Fig. 62-15A). la prdida de un fragmento de
l cromosoma que contiene al telmero, o intersticiales (Fig. 62-156), la prdida de
un trozo interno del cromosoma. Las roturas de los cromosomas, sobrecruzamientos
desiguales, o los errores de no separacin comprendidos en las reordenaciones cro
mosmicas pueden dar como resultado una delecin. En general, las deleciones mayores
originarn anomalas clnicas ms graves, debido a que faltan un mayor nmero de locus ge
nticos. La duplicacin es la presencia de una copia adicional de un segmento del cr
omosoma, que origina una trisoma parcial en ese cromosoma (Fig. 62-14). Esta anom
ala puede ser tambin terminal o intersticial. Las duplicaciones autnticas parecen s
er bastante raras y son, normalmente, espordicas. Las duplicaciones estn generadas
por los mismos mecanismos que las deleciones y quiz sean la consecuencia recproca
de estos procesos. Al igual que en las deleciones. cuanto mayor sea el fragment
o duplicado del cromosoma, las anomalas clnicas tendern a ser ms graves. La inversin
es el cambio de un segmento cromosmico respecto al ordenamiento gnico normal y nec
esita un mnimo de dos roturas en un cromosom a (Fig. 62-14). Las inversiones estn
clasificadas como 1) paracntricas,
Anomalas estructurales del cromosoma
Los cromosomas no son estructuras estticas, sino que experimentan recombinaciones
tanto en la meiosis como en la mitosis. Este es un proceso natural que es vital
para generar variaciones en las especies, por eso est altamente regulado y rara
vez se producen errores. Sin embargo, es posible que se produzcan reordenamiento

s cromosmicos que cambien la estructura de uno o de varios cromosomas. Estas anom

alas son bastante variadas y con frecuencia son especificas del paciente. Las reo
rdenaciones pueden ser
A
19
20
21
22
X
T
Figura 62-10. Anomalas cromosmicas numricas. A. Complemento de cromosoma triploide
(3N) con tres copias de cada c r o m o s o m a |69,XXY). Esta ilustracin contina e
n la pgina siguiente.

1314
SECCIN VII
PATOLOGA MOLECULAR
dos roturas que tienen lugar en el mismo lado del cenlrmero (esto es, en el mismo
brazo), o 2) pericntricas, las roturas se producen en lados opuestos del centrmer
o y la inversin involucra a ambos brazos (Fig. 62-16/4). L a mayora de las inversi
ones son equilibradas, pero se pueden detectar anomalas clnicas si el cromosoma se
rompe dentro de un gen e interrumpe la produccin normal de un producto gnico nece
sario. Existe un aumento del riesgo de error meitico y los portadores de la inver
sin muestran, frecuentemente, infertilidad o prdida fetal espontnea temprana debido
a los productos cromosmicos desequilibrados. En la meiosis I, los cromosomas homl
ogos se emparejan y se origina la recombinacin. Para que un cromosoma invertido s
e empareje con su homlogo, se debe formar una estructura conocida como asa de inv
ersin (Fig. 62166). Los gametos no sern impactados negativamente si no se produce
la recombinacin y los cromosomas se separan normalmente. Sin embargo, el sobrecru
zamiento dentro del asa de inversin puede originar producios meiticos desequilibra
dos. En la inversin paracntrica, los resultados de la recombinacin son, normalmente
, no viables, por lo que hay una supresin de la recombinacin aparente (es decir, l
os nicos gametos viables producidos
proceden de cromosomas no recombmados) (Fig, 62-168). En las inversiones pericntr
icas es posible que los gametos con duplicacin cromosmica y delecin, o ambas, pueda
n ser derivados. En general, las inversiones pericntricas mayores pueden originar
deficiencias en las duplicaciones ms pequeas y aumentan las probabilidades de que
un nio nazca vivo, a pesar de que el desequilibrio cromosmico puede generar anoma
las en ese nio. Una vez que se ha identificado al portador de la inversin, se puede
utilizar el diagnstico prenatal para valorar los cromosomas del feto. Las transl
ocaciones son las reordenaciones de dos o ms cromosomas no homlogos. Cada cromosom
a se rompe una vez y los fragmentos se intercambian de lugar, originando dos (o
ms) cromosomas derivados (Fig. 6214). Al igual que en las inversiones, la mayora d
e las translocaciones son equilibradas, y slo tienen ramificaciones clnicas cuando
se elimina un gen estructural importante. Por otra parte, el peligro principal
de una translocacin equilibrada es el de que el portador tiene un mayor riesgo de
tener hijos vivos con anomalas cromosmicas. En la primera divisin meitica los cromo
somas translocados adoptan una estructura en forma de cruz para que todos los al
elos se empa-

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA No separacin - Meiosis II

1315
No s e p a r a c i n - M e i o s i s I
A
Figura 62-11. Los errores de la no separacin en la meiosis generan gamelos aneupl
oides. A, La no separacin en la meiosis I produce u n a copia extra del cromosoma
A (heterodisoma) en dos gametos, pero tambin la falta de cualquier cromosoma A en
los dos gametos restantes S. La no separacin en la meiosis II origina dos gameto
s con un complemento de cromosoma normal (abajo a a derecha), la falla de un gam
eto en el c r o m o s o m a A y un gameto con un c r o m o s o m a extra duplica
do (dos copias del c r o m o s o m a A1 producen isodisomia en el crom o s o m a
Al)
No separacin
Figura 62-12. Generacin de disoma
la izquierda del diagrama se puede
in de una trisomia a u n a disoma
por el rescate de la monosoma (la
Heterdsomfa uniparental
Heterdsomfa hiparcntal
Isodisomia uniparental

uniparental por los errores de la no separacin. A

ver la heterodisomia originada por la reducc
A l a derecha se observa la isodisomia producida
duplicacin del nico cromosoma que existe).

1316
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Isodisomia uniparental
Heterodisomia uniparental
Heterodisomia biparental
Figura 62-13. Isodisoma Irente a heterodisomia. La conformacin nalural de una clula
es la heterodisomia biparental: un cromosoma de cada padre. Los errores en la d
ivisin pueden originar una distribucin aberrante de los cromosomas de a m b o s pa
dres, de forma que se pueden producir dos copias de un cromosoma de uno de los p
adres (isodisoma uniparental) o dos cromosomas diferentes del mismo padre (hetero
disomia uniparental).
El cromosoma que es el resultado de la divisin errnea del centrmero durante la divi
sin celular que produce dos copias de uno de los brazos del cromosoma pero al que
le falta el otro brazo es un isocromosoma (Fig. 6214). Por tanto, el portador d
e esta reordenacin tiene una trisomia en el brazo duplicado y una monosomia en el
otro brazo. El ejemplo mejor conocido es el isocromosoma del brazo largo del X.
Esta configuracin produce una trisomia en el brazo largo y una monosoma en el bra
zo corto del X, y dado que se necesitan dos copias funcionales del brazo corto d
el X para que se desarrolle un ser del sexo femenino, esta anomala cromosmica es c
oherente con el sndrome de Turner (vase ms adelante en Aneuploidias cromosmicas sexu
ales). Los cromosomas acrocntricos tambin pueden formar isocromosomas (duplicacin i
nversa del brazo largo), pero esto produce la homocigosidad de todos los locus p
resentes, lo que puede llevar a expresar desrdenes recesivos que de otra manera n
o habran sido evidentes. Un cromosoma de anillo se produce cuando se pierden los
dos telmeros de un cromosoma y el fragmento del cromosoma que queda se hace un ci
rculo para restablecer la estabilidad cromosmica (Figs. 62-14 y 62-19). Desafortu
nadamente, estas construcciones son, por lo general, inestables, ya que la repli
cacin puede producir crculos entrelazados que llevan a la rotura del cromosoma y a
su prdida cuando los homlogos intentan separarse en la anafase. Sin embargo, bajo
ciertas circunstancias, los anillos pueden ser transmitidos de forma estable en
lineas celulares. Esto se produce cuando el anillo contiene material gentico, qu
e es esencial para la funcin celular normal. El cromosoma marcador es un cromosom
a con un centrmero que s e transmite de forma estable a las clulas hijas, pero no
puede ser claramente identificado debido a que es demasiado pequeo o a que el pat
rn de bandeo es demasiado ambiguo. La HISF ha sido de gran ayuda para determinar
el origen de los marcadores. Conclusiones. Las anomalas cromosmicas, tanto las numr
icas como las estructurales, que producen un complemento de cromosoma desequilib
rado estn asociadas a algn tipo de descubrimiento clnico anormal, y el tamao del des
equilibrio es proporcional a la gravedad del problema. L a mayora de los individu
os a los que les han diagnosticado una anomala cromosmica constitucional slo tienen
un nico defecto cromosmico. Sin embargo, hay casos raros de personas que tienen d
os o ms errores cromosmicos. Las anomalas cromosmicas adquiridas (vistas en clulas ca
ncergenas) pueden ser ms complejas y pueden tener mltiples cambios, numricos y estru
cturales, en una sola linea celular.
rejen adecuadamente (Fig. 62-17). En la anafase los cromosomas altemos se deben
segregar juntos para generar gametos equilibrados. Una de cada tres veces los cr
omosomas no se segregarn de esta manera y producirn gametos desequilibrados. A los
errores ms corrientes se les denomina segregacin adyacente 1 y segregacin adyacent
e 2. A pesar de que ambos patrones producen deficiencias en la duplicacin del mat

erial cromosmico, la segregacin adyacente 2 es ms deletrea, ya que est caracterizada

por la presencia de centrmeros homlogos en una sola clula. La viabilidad de un feto
que recibe un gameto desequilibrado depende de los cromosomas y de los genes in
volucrados en la translocacin y del tamao de la duplicacin o de la delecin. Los crom
osomas tambin pueden seguir un patrn de segregacin 3:1, en el cual tres cromosomas
se separan en una clula y el resto de los cromosomas en una segunda clula. Esto pr
oduce desequilibrios totales del material cromosmico y por lo general es letal in
tero. El diagnstico prenatal es posible una vez que se ha identificado al portado
r de la translocacin. Las translocaciones Robertsonian son una variacin de la tran
slocacin clsica. Se producen, solamente, entre dos cromosomas acrocntricos y se pre
sentan como una fusin de los brazos largos al centrmero, cuyo resultado es la prdid
a de los dos brazos cortos (Fig. 62-14). La prdida de los brazos cortos no es del
etrea, dado que se localizan mltiples copias de los genes de ARNr en todos los cro
mosomas acrocntricos. Una persona portadora de la translocacin Robertsonian tiene
45 cromosomas, ya que dos cromosomas se han convertido en uno que es funcional.
Estas personas estn ms expuestas a los errores de la no separacin meitica, cuyo resu
ltado son hijos con una trisomia en uno de los cromosomas reordenados. El ejempl
o ms corriente de esto es el de una persona con una translocacin Robertsonian en l
os cromosomas 13 y 14 que tiene hijos vivos con trisomia 13 (Fig. 6218). El hijo
afectado tendr 46 cromosomas con dos copias libres de cromosomas 13 y la translo
cacin Robertsonian. Otra reordenacin corriente es la translocacin Robertsonian 14;2
1. que podria dar lugar a que su progenie tuviera una trisomia 21. Aunque las tr
anslocaciones robertsonianas ms corrientes se producen entre cromosomas acrocntric
os no homlogos, es posible que se produzcan estas reordenaciones entre cromosomas
homlogos. Por ejemplo, un individuo con una translocacin robertsoniana 21;21 tend
r un total de 45 cromosomas, incluida la translocacin en la que los dos 21 estn uni
dos al centrmero. Este tipo de reordenacin es siempre virtualmente de novo, ya que
los portadores de esta anomala, no es probable que tengan una progenie normal. L
os gametos viables incluyen 1) una clula con la translocacin Robertsonian (dos cop
ias del cromosoma 21), que si es fertilizada dar lugar a un nio con sndrome de Down
, o 2) una clula sin copias del cromosoma 21, que si es fertilizada dar como resul
tado una monosoma 21, que es incompatible con la vida.
Nomenclatura
Con un campo tan amplio de variaciones cromosmicas. se hizo necesario desarrollar
un sistema de clasificacin que hiciera posible que el complemento de cromosoma d
e cada individuo fuera descrito sucintamente y comprendido por todo el mundo. La
primera nomenclatura citogentica proporcion una lnea de trabajo y desde entonces s
e ha ido desarrollando el "idioma". Actualmente, el estndar reconocido es el Sist
ema Internacional de Nomenclatura Citogentica (SINC). y la ltima revisin ha sido en
1995. La nomenclatura que describe a un complemento de cromosoma se divide en t
res partes bsicas: 1) el nmero total de cromosomas, 2) el complemento de cromosoma
sexual y 3) cualquier anomala cromosmica. Estas unidades estn enumeradas por orden
y separadas por comas. As, una mujer o hembra aparentemente normal se debe codif
icar como 46.XX y un hombre o macho ser 46.XY. Si hay dos o ms lneas presentes, se
enumeran secuencialmente separadas por una barra inclinada, y si est presente un
clon diploide normal, siempre se le enumera al final (45,X/46,XX). A otros clone
s se les ordena por tamao, poniendo primero al clon ms grande. El nmero de clulas en
cada clon se indica por un nmero encerrado en un parntesis angular (45,X[15]/47.X
XX[3J/46,XX[12]. Para las anomalas numricas, el nmero de cromosomas se aumenta o se
disminuye para indicar el cambio total, y el cromosoma especifico adquirido o p
erdido se anota al final. Por ejemplo, la trisomia 13 en una mujer o en una hemb
ra se debe escribir 47,XX,+13 y la monosoma 8 en un hombre o en un macho se debe
escribir 45.XY.-8. Sin embargo, para una variacin cromosmica sexual que se sabe qu
e es constitucional, no es necesario utilizar el smbolo + o el -, ya que se puede
notar directamente el cambio en el complemento de cromosoma. La monosoma X

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1317
Figura 62-14. Represeniacin esquemlica d e las diferentes anomalas cromosmicas estru
cturales, descritas en el texto, asociadas c o n ejemplos de cada anomala. El pri
mer panel muestra la conliguracin normal de un c r o m o s o m a generalizado, do
nde las letras A. B. C. D y E indican a los diferentes locus de genes y el centrm
ero est indicado por un punto entre los locus B y C Deleaon L a delacin c r o m o
s b m i c a m u e s t r a las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo:
la delecin terminal del brazo codo del c r o m o s o m a 4. Duplicacin: La duplica
cin cromosmica muestra las conliguraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la du
plicacin terminal del brazo corto del c r o m o s o m a 5 (las dos flechas indica
n la banda duplicada). El isocromosoma est originado por una divisin errnea del cen
trmero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del
c r o m o s o m a original. Ejemplo: el i s o c r o m o s o m a del brazo largo
del c r o m o s o m a X Inversin: L a inversin cromosmica muestra las formas paracn
tnca y pencntrica. Ejemplo: la inversin pericntrica del cromosoma 9 (las flechas in
dican los centrmeros) Translocacin: Translocacin reciproca frente a Iranslocacin Rob
ertsonian. Ejemplo: la transiocactn Robertsonian d e los c r o m o s o m a s1 4 y
21. Cromosoma anillo. Ejemplo: el anillo 18.
La ilustracin continua en el pagina siguiente.

8
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
1 8
a(18)
Figura 62-14. Continuacin. Representacin esquemtica de las diferentes anomalas cromo
smicas, descritas en el texto, asociadas c o n ejemplos de cada anomala. El primer
panel muestra la configuracin normal de un cromosoma generalizado, donde las let
ras A. B, C, D y E indican a los diferentes locus de genes y donde el cenlrmero e
st indicado p o r un punto entre los locus B y C. Delacin: La delecin cromosmica mue
stra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la delecin terminal de
l brazo corto del c r o m o s o m a 4. Duplicacin: La duplicacin cromosmica muestra
las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicacin terminal del
brazo corto del c r o m o s o m a 5 (las dos flechas indican la banda duplicada
). El isocromosoma est originado por una divisin errnea del centrmero que produce du
plicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del c r o m o s o m a o
riginal. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del c r o m o s o m a X. Inver
sin: La inversin cromosmica muestra las formas paracnlrica y pericntrica. Ejemplo: la
inversin pericntrica del c r o m o s o m a 9 (las flechas indican los centrmeros).
Translocacin: translocacin recproca frente a translocacin Robertsonian. Ejemplo: la
Iranslocacin Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo:
anillo 18.

CAPTULO 6 2

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1319
Figura 62-15. Ejemplos de deleciones cromosmicas A. Delecin del brazo largo disial
del c r o m o s o m a 4 El cromosoma de la derecha es significativamente ms cono
(Hecha) que el cromosoma normal de la izquierda, fl. Delecin intersticial del br
azo largo del cromosoma 11. El ideograma de la izquierda muestra la regin de ADN
que falta en el cromosoma que ha sufrido la delecin. A la derecha estn los cromoso
mas bandeados reales con el cromosoma 1 1 que ha sufrido la delecin a su derecha
(las H e c h a s indican la delecin).
Figura 62-16. Inversin cromosmica. A. Diagrama de la inversin pericntrica del cromos
oma 9 que utiliza los ideogramas para indicar los mecanismos de inversin. A la de
recha se ven los cromosomas bandeados que demuestran esta inversin. 8 . Asa d e i
nversin que indica el emparejamiento de homlogos en la meiosis de un c r o m o s o
m a normal y uno con una inversin paracntrica. Si la recombinacin se produce en el
punto indicado por el crom o s o m a X en el asa, se generarn cromosomas recombi
nantes como se muestra abajo. En el caso de una recombinacin paracntrica. los crom
osomas que se producen son dicnlncos o acntncos.

1320
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 62-17. Translocacin cromosmica. En el diagrama se m u e s t r a la generacin
de gametos procedentes de una translocacin hipottica durante la meiosis. Los c r
o m o s o m a s se emparejan, en la meiosis 1. con una configuracin en lorma de c
ruz. La segregacin alterna generar gametos equilibrados. La segregacin adyacente 1.
la adyacente 2 o la adyacente 3:1 producirn g a m e t o s desequilibrados, los c
uales pueden originar un nio nacido con vida anormal. (Slo se muestra una de las d
istintas segregaciones 3:1 posibles.)
se pone 45.X y la adquisicin de un cromosoma sexual ser 47.XXY.47.XXX o 47.XYY. Po
r otro lado, si el cambio cromosmico sexual es adquirido, como en algunas lneas ce
lulares cancergenas, se necesita un + o un - para indicarlo (es decir, 45.X-Y par
a un hombre o macho que haya perdido su cromosoma Y como resultado de su enferme
dad). Los cambios estructurales en los cromosomas no afectan a los cromosom a s
presentes, pero se deben anotar al final para clarificar el estatus del o de
los cromosomas reordenados. Para no alargar la nomenclatura, se han generado una
serie de abreviaciones para las anomalas estructurales corrientes que acortan el
total de la misma (Tabla 62-1). Una anomala estructural se indica con la abrevia
tura de la anomala seguida del cromosoma implicado y el punto de ruptura en el mi
smo. Para las reordenaciones en las que hay dos cromosomas implicados, los cromo
somas se dan en un primer conjunto de parntesis (primero el nmero ms bajo o el crom
osema sexual), seguido de
Figura 62-18. Los c r o m o s o m a s bandeados y los de a s c e n d e n c i am
u e s t r a n la herencia de una translocacin Robertsonian de los c r o m o s o m
a s 13 y 14. L a madre es la portadora de la translocacin (tlecha larga) en una
lorma equilibrada, pero un error mektico origina la transmisin, de la m a d r e al
hijo, de un c r o m o s o m ac o n la translocacin Robertsonian y d e otro c r o
m o s o m a 13. El nio tiene trisomia 13 (las flechas cortas indican el 13S norm
al, la H e c h a larga indica la translocacin Robertsonian). Nota: la segunda cop
ia del c r o m o s o m a 14 no falta, sino que est unida al centrmero del t e r c
e rc r o m o s o m a 13.

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENETICA EN LA PATOLOGA MODERNA Tabla 62-2

1321
A
y
7
0

n o m a l a s c r o m o s m i c a s en las prdidas fetales e s p o n t n e a s

en nios nacidos con vida Prdidas fetales espontneas % 18 17 6,0 16 5.7 4,7 4,2 3.
3.0 2.0 3.0 4,0 Incidencia en los nacidos vivos 1/10.000 1/60 000 0 0 0 1/700
0 1/8.000 1/10.000 1/2.100 2/1.000

Anomalas 45.X Triploidia Tetraploida Tnsomias 16 22 21 15 1 4 18 13 Translocacin de

sequilibrada Reordenamiento equilibrado
Figura 62-19. Cromosoma anillo. El c r o m o s o m a 18 normal est a la izquierda
. A la derecha se indica el c r o m o s o m a de un solo anillo y el c r o m o s
o m a de doble anillo. Los dalos proceden de Hook (1977). Jacobs ( 1992) y Muel
ler ( 1998) El c r o m o s o m a anillo de la parte superior es de un solo anill
o, c o m o confirma la imagen de banda-C de la derecha (un solo centrmero oscuro)
. El c r o m o s o m a anillo de la parte inferior es m u c h o ms grande y la ti
ncin de banda-C indica dos cenCitogentica prenatal trmeros oscuros, lo que lo confi
rma c o m o un c r o m o s o m a de doble anillo.
los puntos de ruptura de la reordenacin en el mismo orden relativo; esto es, t(4;
9)(q21,2;p22) es una translocacin entre los cromosomas 4 y 9 con los puntos de ru
ptura 4q21,2 y 9p22. Los siguientes ejemplos incluyen a: Delecin: 46,XX.del(4)(p1
5) Duplicacin: Translocacin: Inversin: 46,XX,dup(11)(q23) 46.XY,t(4:9)(q21,2;p22) 4
6.XY,mv(9)(p11q21.1) Delecin terminal del brazo corto del 4 en la banda 15 Duplic
acin terminal del brazo largo del 11 en la banda 23 Translocacin entre el 4 y el 9
Inversin pericntrica entre las bandas p11 yq21.1

Los estudios han demostrado que 1 de cada 13 productos de la concepcin tiene una
anomala cromosmica, pero de stos, slo 6 de cada 1 . 0 0 0 nacen vivos, lo cual indic
a que son reconocidos y eliminados la mayora de los errores. Por ejemplo, de toda
s las concepciones 45.X, el 95% acabar espontneamente. La misma frecuencia en el f
in del embarazo se registra en las trisomas de los nacidos vivos (no llegarn a trmi
no el 90% de las concepciones con trisoma 13. el 80% de las concepciones con tris
oma 18 y el 65% de las concepciones con trisoma 21). Por trmino medio, el 15% d e t
odos los embarazos reconocidos termina con la prdida fetal de manera espontnea, y
el 80% de stos se producen durante los tres primeros meses. De todos los abortos
espontneos, el 60% se deben a anomalas cromosmicas (Tabla 62-2), y de stos el 52% se
deben a trisomas autosmcas. La tnsomia ms comente que se ve en material procedente
de un aborto, es la tnsomia 16. pero el tipo ms frecuente de error cromosomico en
las prdidas espontneas es el 45,X. El diagnstico prenatal se ha convertido en el re
a ms importante de los esludios citogenticos clnicos, debido a esta clase de inform
acin y a los conocimientos, cada vez ms amplios, de la gentica. Los datos de refere
ncia ms corrientes deben contar con una historia familiar del o de los hijos ante
riores con una anomala cromosmica. de niveles anormales de AFP en un anlisis (vase C
ap. 22), de una anomala detectada por ecografia y de la edad de la madre. La razn
exacta de este fenmeno no est clara, aunque los estudios sobre la poblacin han demo
strado que en las mujeres de ms de 35 aos est aumentando la frecuencia de hijos nac
idos con anomalas cromosmicas, especialmente trisomas (Hassold. 1985) El anlisis est
adstico s eh a realizado, debido a la frecuencia relativamente alta de nacimiento
s con sndrome de Down, y muestra, claramente, la correlacin entre los nios afectado
s y la mayor edad de la madre (Fig, 62-20). Esto se est convirtiendo en un proble
ma para una sociedad en la que las mujeres estn dejando los embarazos para edades
ms tardas. Las anomalas cromosmicas ms comentes detectadas en los anlisis prenatales
son las trisomas en los nacidos vivos y las aneuploidas d e los cromosomas sexuale

s. Pero debido a que stas son, normalmente, el resultado de un error de la no sep

aracin meitica, el nesgo de reincidencia es m u y bajo. Ocasionalmente se identifi
ca a un nio con una anomala cromosmica estructural equilibrada o desequilibrada. En
estas circunstancias, se hace un anlisis del cariotipo de los dos progenitores b
iolgicos para diferenciar si el nio tiene una reordenacin heredada o una anomala de
novo. Por ejemplo, en un nio con una translocacin equilibrada heredada, el nesgo d
e que la reordenacin cromosmica plantee cualquier problema es menor de un 1%. Sm e
mbargo, si la translocacin aparentemente equilibrada que se ha visto en el feto n
o es detectada en ninguno de los padres biolgicos, se ha tenido que originar de n
ovo en el nio y hay de un 5% a un 10% de nesgo de perjuicio para el nio. Desafortu
nadamente, encontrar una translocacin no equilibrada en un feto, a pesar del esta
tus portador de los padres, es u n a situacin grave y casi siempre origina algn ti
po de defecto gentico en el
CLINICA Aplicaciones clnicas
Las anomalas citogenticas se pueden encontrar en individuos aparentemente normales
, asi como en pacientes con anomalas fenotipicas o con desrdenes genticos diagnosti
cados. El diagnstico se puede producir en cualquier etapa de la vida. Se puede es
tablecer la existencia de un sndrome cuando se observa que varios individuos, no
emparentados, tienen un conjunto de rasgos iguales. Ya se sabe que las caracterst
icas asociadas a un sndrome tienen una base comn, las cuales son, con frecuencia,
una anomala cromosmica especifica. Sin embargo, aunque un sndrome est definido por u
n conjunto de caracteres, los individuos afectados pueden ser viables y no todos
mostrarn un fenotipo idntico.
Tabla 62-1
Abreviaturas c o m u n e s de a n o m a l a s cromosmicas Signiticado Centrmero De
lecin Duplicacin Insercin Inversin Isocromosoma Mar Anillo TranslocacOn Robertsonian
TranslocaciOn
Abreviatura cen del dup ins mv i marcador a rob l

1322
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 62-20. Aumento del riesgo de una concepcin con s i n d r o m e de D o w n
relacionado con el a u m e n t o de la edad materna. El nmero de nios nacidos con
vida de madres con ms edad es m e n o r , debido a la intervencin de los diagnstico
s prenatales, seguido de la interrupcin de embarazos anormales.
nio. Sin embargo, en esta situacin, el determinar si uno de los padres es el porta
dor de la translocacin equilibrada proporcionar informacin sobre el riesgo de reinc
idencia en embarazos futuros.
Posnatal
Aproximadamente el 0,6% de los recin nacidos tienen una anomala cromosmica. Estos n
ios pueden presentar seales o sntomas de un sndrome definido o pueden tener anomalas
clnicas no relacionadas con un desorden especfico, pero de las que, sin embargo, s
e puede sospechar que se deben a una anomala cromosmica. Los genitales ambiguos so
n un sntoma para examinar el complemento de cromosoma sexual de un recin nacido. S
i un nio muere poco despus de su nacimiento, el anlisis citogentico puede proporcion
ar la informacin necesaria para comprender el porqu de esa muerte. Los hallazgos ct
ognicos para establecer el diagnstico debern estar correlacionados, siempre que sea
posible, con los resultados de la autopsia.
Infancia y edad adulta
Un malentendido corriente sobre los desrdenes genticos es que porque son heredados
el diagnstico ser obvio al nacer. De hecho, la presencia clnica de muchos desrdenes
tarda en manifestarse y puede no ser expresada completamente hasta ms tarde en l
a vida. En consecuencia, algunos de los problemas diagnsticos ms difciles se dan en
nios y adultos. Adems, para considerar el amplio alcance de las posibilidades cit
ogenticas, tambin se deben tomar en consideracin las opciones bioqumicas y molecular
es.

Gentica del cncer

Otra rea de la medicina en la que la citogentica est siendo cada vez ms importante e
s la oncologa. A pesar de que la amplitud de variabilidad en los hallazgos cariotp
icos de la mayora de los tumores slidos hace que las decisiones sobre los tratamie
ntos sean difciles, existen datos clnicos excelentes, de las leucemias y de los li
nfomas, que incluyen a reordenaciones cromosmicas especficas que estn directamente
asociadas a la tumorignesis (Tabla 62-3; vase Cap. 65; Block, 1998). Al identifica
r estas anomalas se podr hacer un diagnstico a nivel citogentico, aunque en la prctic
a la citogentica es, generalmente, slo una parte de los datos que se utilizan para
hacer un diagnstico. Una vez que se ha detectado una anomala cromosmica, se puede
monitorizar el progreso de la enfermedad del paciente. Si el tratamiento tiene xi
to, la mayora de las anomalas cromosmicas ya no sern evidentes en la mdula sea y se d
r que el paciente est en remisin, mientras el cariotipo sea aparentemente "normal".
Sin embargo, si el tratamiento no elimina completamente la lnea celular aberrant
e, la remisin puede ser slo un intervalo, en el cual las clulas causantes de la enf
ermedad pueden estar detenidas a unos niveles tan bajos que no son detectables a
travs de los anlisis de cariotipo rutinarios. Despus, en la recada, reaparecern las
mismas anomalas cromosmicas, que pueden ir acompaadas de anomalas adicionales y/o de lneas celulares ms complejas, resultados acordes con progr
esin de la enfermedad. Un aumento en la complejidad de la recuperacin es lo que se
conoce como la evolucin del cariotipo y. por lo general, el nmero y el tipo de la
s anomalas cromosmicas vistas estn correlacionados con un mal pronstico y con la gra

vedad de la enfermedad. La HISF de interfaz ha sido un elemento valioso para los

estudios oncolgicos clnicos (Cremer, 1988: Anastasi, 1991). Muchas de las anomalas
citogenticas importantes que se han visto en las leucemias son translocaciones,
y se han desarrollado sondas HISF de combinacin que hibridan a los lados opuestos
de los puntos de ruptura de la translocacin. Por ejemplo, la leucemia mielgena crn
ica (LMC) est caracterizada por una translocacin entre el proto-oncogen ABL en el
cromosoma 9 (9q22.3) y el gen BCR en el cromosoma 22 (22q11.2). La reordenacin or
igina un gen quimrico en el cromosoma 22 derivativo. Para detectar la translocacin
se utilizan un par de sondas: 1) se localiza al lado distal del locus ABL en el
cromosoma 9 (rojo) y 2) situada en el lado proximal del locus BCR en el cromoso
ma 22 (verde). Cuando hay no translocacin presente, deberan estar presentes en cad
a clula dos seales verdes (que detectan cada alelo AS.) y dos seales rojas (que dete
ctan cada alelo BCR) (Fig. 62-21 A). La presencia de una translocacin da una seal
verde y una seal roja contiguas la una a la otra, y con la resolucin del microscop
io de luz, las dos seales se unen, dando una sola seal amarilla. Por tanto, una clu
la con una translocacin tendr slo tres seales, una verde, una roja y una amarilla (F
ig. 62-216). Aunque se puede hacer este estudio en clulas en metafase, la utiliza
cin de clulas de interfaz proporciona una muestra mucho ms grande con la que se pue
de h a c e r el ensayo ms rpidamente (Werner, 1997). De la misma manera se pueden
comprobar otras translocaciones leucmicas. Otras aplicaciones de la HISF en oncol
oga incluyen 1) la utilizacin de una sonda de centrmero especfica del cromosoma 12 p
ara anlisis de una poblacin de clulas de interfaz para las clulas de trisomia 12 ind
icativas de LLC. 2) la utilizacin de una sonda de cromosoma 7 para detectar la mo
nosoma 7 en el sndrome mielodisplsico (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA) y 3)
la utilizacin de una sonda de cromosoma 8 para identificar la trisomia 8 en los
desrdenes agudos y en los crnicos. Tambin ha tenido mucho xito la utilizacin de sonda
s de X e Y de diferentes colores, para evaluar el xito de un trasplante de mdula se
a en el que el donante y el receptor eran de sexos diferenles. Despus del traspla
nte, el hombre que ha recibido clulas de un donante femenino debera tener un compl
emento XX, pero si se encuentra un nmero significativo de clulas XY, indicara un pr
oblema potencial o posiblemente el fallo del injerto, La HISF se puede repetir,
a intervalos regulares, para monitorizar el progreso y para advertir de que empi
eza a proliferar la poblacin de clulas leucmicas del paciente. La HISF multicolor t
ambin se ha utilizado para evaluar las lneas celulares leucmicas. Es interesante ha
cer notar la discrepancia que hay, a menudo, entre lo que se detecta a travs de l
a citogentica habitual y lo que se ve utilizando la HISF (Veldman, 1997). Se ha s
ugerido que las clulas cancerige-

CAPTUIO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1323
Tabla 62-3 R e o r d e n a m i e n t o s cltogenticos c o m u n e s e n la leucem
ia y en el linfoma Desorden LMC (leucemia mielgena crnica) Reordenamiento cromosom
ico t(9;22)(q34 1q11 2) +8 'd 7q) segundo Ph' + 19 t(9;22)(q34 1;q11 2) + 11 t(8
:21)(q22:q22) t(9.22)(q34.1;q11.2) I(6.9)(p23q34) t(7.11)(p15;p15) +8 t(15;17Kq2
2;q11-22) t(11;17Kq23:q21) mv(16)(p12q22) t(16:16)(p13:q22) del(16)(q22) mv(3)(q
21q26). I(11;19)(q23:p13) +8 +22 I(8;16)(p11;p13) I(9;11)(p21-22:q23) t(11;19)(q
23;p13) t/del(11q23) t(3.5)(q21-25:q31-35) inv(3)(q21q26). t(1.22)(p13;q13) +8 7

Desrdenes citogenticos Sndromes de aneuploidas cromosmicas

Aneuploidas autosmicas. La causa ms comn del retraso mental es la trisoma 21 o sndrom
de Down. La incidencia de este desorden es de 1 de cada 700 nacimientos y est ca
racterizado por hipotonia. caras aplanadas, cisuras palpebrales oblicuas, orejas
pequeas, lengua protuberante, pliegue palmar transversal, defectos del corazn e h
ipogonadismo. Aproximadamente el 92.5% de todos los individuos con sndrome de Dow
n tienen 47 cromosomas, incluidas tres copias del cromosoma 21 originadas por un
error de no separacin en la meiosis (Tabla 62-4). Sin embargo, slo menos del 3% d
e los pacientes tienden a expresar un fenotipo menos severo y se manifiestan com
o mosaicos con dos lneas celulares que pueden incluir una lnea 46.XX o una 46.XY.
Adems, alrededor de un 5% de los pacientes con sndrome de Down slo tienen 46 cromos
omas, dado que el 21 extra es parte de una translocacin Robertsonian o de otras t
ranslocaciones. Con frecuencia, un nio con una translocacin indica la presencia de
un padre portador de una translocacin, por lo que en estos casos es recomendable
hacer un anlisis de cariotipo a ambos padres, para determinar si la pareja tiene
un riesgo mayor de tener ms hijos con sndrome de Down en futuros embarazos. Los e
studios citogenticos de los individuos con reordenaciones del cromosoma 21 han re
velado que no es necesario que se triplique el cromosoma 21 en su totalidad para
que est presente el fenotipo del sndrome de Down. A menudo, tres copias del brazo
largo proximal producen presentaciones clnicas distintas de las del sndrome de Do
wn. A la inversa, la triplicacin del brazo largo distal est directamente correlaci
onada con un claro fenotipo del sndrome de Down. Los anlisis de pacientes con reor
denaciones citogenticas diferentes han identificado una regin conocida c o m o la
regin crtica del sndrome de Down. la cual incluye bandas de la 21q22.12 a la 21q22.
3 (Fig. 62-22). La presencia de tres copias de este fragmento del 21 es suficien
te para establecer un diagnstico claro del sndrome de Down (Korenberg. 1990; Delab
ar, 1993). A pesar de que al hacer el mapa cromosmico se ha estrechado la regin crt
ica del sndrome de Down, los esludios comparativos entre pacientes con sndrome de
Down e individuos con otros desrdenes asociados a genes localizados en el cromoso
ma 21 (Fig. 62-22) han dado correlaciones interesantes. Los anlisis de la estruct
ura cerebral de pacientes con sndrome de Down o con Alzheimer, en particular, han
revelado una anomala arquitectnica similar, lo que sugiere que la triplicacin y la
mutacin del locus del gen de la proteina |3-precursora amiloide (PPA) pueden pro
ducir resultados negativos similares. Las otras dos trisomas de los nacidos vivos
son la trisoma 13 y la tnsomia 18. La trisoma 13, el sndrome de Patau, con una fre
cuencia de 1 de cada 4.000 a 1 de cada 10.000 nacimientos, est caracterizado por
cabeza pequea, labio leporino o paladar hendido, o ambos, ciclopa. pliegue palmar
transversal, polidactilia de las manos, de los pies, o ambas, taln prominente, de
fecto septal ventricular y cuero cabelludo puntiagudo. Aproximadamente se diagno
stica de trisoma 18 o sndrome de Edwards (Fig. 62-23A) a uno de cada 8.000 recin na
cidos, que tienen poco peso al nacer, boca y mandbulas pequeas, delecto septal ven
tricular, hipoplasia de los msculos, un occipucio prominente, orejas malformadas
y bajas, pies de base basculante y dedos cruzados. Por lo general, el sndrome de

Down es bastante manejable, a pesar de que tiene, frecuentemente, consecuencias

clnicas graves y los pacientes llegan a vivir veinte o treinta aos. La trisoma 13 y
la trisoma 18 son mucho menos compatibles con la vida y los pacientes suelen mor
ir durante el primer mes de vida. Si un individuo sobrevive al primer ao, el porv
enir es sombro, ya que esos pacientes no aprenden a hablar, a caminar o a cuidar
de s mismos. Por este motivo, la opcin de la interrupcin del embarazo, est entre los
consejos para los casos con diagnstico prenatal de trisoma 13 y trisoma 18. Aneupl
oidas cromosmicas sexuales. Las aneuploidas cromosmicas sexuales son relativamente c
omentes (su Irecuencia, por lo general, es de 1 de cada 500 nacimientos) y son f
enotipicamente ms leves que las aneuploidas autosmicas, debido al efecto de la inac
tivacin del cromosoma X y al nmero limitado de genes presentes en el cromosoma Y.
L a
LMA (leucemia mieloide aguda) MI M2
M3 (APL) M4 (AMMoL)
I(3;3)(q21;q26)
M5 (AMoL)
M6 t(3;3)(q2l;q26) M7 Cualquier subtipo
Y
20q9q K17q) LLA (leucemia linfoblstica aguda) hiperdiploida L1 L I , L2
L3
I(1;19)(q23;p13) del/t(12p) 1(4:11)(q21;q23) del(6q) I(9:22)(q34.1;q11.2) I(11:1
9)(q23:p13) +21 hiperdiploide, mn 50-56 I(8;14)(q24;q32) 1(8;22)(q24;q11) I(2:8)
(p12:q23)
LLC (desrdenes imloproliferativos crnicos) Clula B Clula T Sndromes mielodisplsicos
+ 12 14q+ 14q+ 14q 11 reordenamientos 5q del(5)(q13q33) -7, del(7q) +8 + 19 dcl(
20q)
as experimentan, realmente, un grado significativamente mayor de reordenaciones c
romosmicas de las que se haban apreciado previamente y que algunas de las nuevas r
eordenaciones que se han detectado pueden evidenciar nuevos genes relacionados c
on el cncer. Sin embargo, llevar algn tiempo antes de que se pueda recoger un conju
nto de datos significativos que proporcionen las correlaciones clnicas de estas n
uevas reordenaciones.

1324
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 62-21. Deteccin mediante la HISF de la translocacin 9:22 en la LMC. A. No h
ay translocacin presente, c o m o se ve por dos copias de c a d a sonda del c r o
m o s o m a 9 (en rojo) y del c r o m o s o m a 22 (en verde) en la clula en met
alase (a la derecha) y en la de interfaz (a la izquierda). 8. Translocacin en un
paciente que ha sido detectada mediante la seal amarilla (Hecha) ms una seal verde
y una roja (en clulas de interfaz).
causa, en la mayoria de los casos, es debida a cuatro desrdenes, tres trisomas y u
na monosoma. Todos son originados por errores de no separacin durante la meiosis y
excepto el XYY. que es exclusivamente paterno, los otros desrdenes pueden ser or
iginados tanto por el error materno como por el paterno. Los cariotipos aberrant
es de los individuos con tres cromosomas X [47,XXX mujeres] o con un cromosoma X
y dos cromosomas Y [47.XYY homTabla 62-4 Errores d e n o s e p a r a c i n q u
e p r o d u c e n trisomia 21 detectados mediante tecnologa citogentica y molecula
r Citogenticos Meiosis materna I Meiosis materna II Meiosis paterna I Meiosis pat
erna II 70% 10% 10% 10% Moleculares 75% 20,6% 1,2% 3,2%
Dalos de Sherman (1991. 1994) Anlonarakls 1 1 9 9 2 )
bres] a menudo no son detectados en toda la vida. La incidencia de los nacimient
os es relativamente alta. 1 de cada 1.000, pero salvo que son algo ms altos que l
a mayora, no tienen rasgos chocantes que pudieran indicar una anomala cromosmica. A
lgunas de estas personas tienen dificultades de aprendizaje generalizadas, por l
o que pueden ser identificadas mediante los programas de rendimiento escolar. Ta
mbin se puede detectar a las mujeres XXX y a los hombres XYY en las clnicas de inf
ertilidad, aunque la anomala citogentica no est, generalmente, relacionada con el m
otivo de referencia, ya que las evaluaciones globales muestran que estas persona
s son completamente frtiles y que, por lo general, tienen hijos cromosmicamente no
rmales. Los hombres X Y Y tienen ms riesgo de padecer problemas de conducta, y lo
s primeros estudios sugirieron que tambin tienen tendencias criminales debido a l
a incidencia, ms alta de lo que se esperaba, de X Y Y en presos de instituciones
penales (Jacobs, 1968; Price, 1970). Sin embargo, los trabajos posteriores muest
ran que la criminalidad, ms probablemente, se deba a la combinacin de mltiples caus
as y que los hombres XYY no son ms propensos a tener una conducta criminal que cu
alquier otro hombre (Witkm, 1976; Pitcher, 1982; Theilgaard, 1984).
Figura 62-22. A la derecha se ve el m a p a del c r o m o s o m a 21. que muestr
a la regin critica del sndrome de D o w n y las posiciones relativas de los locus
asociados a vanos rasgos clnicos. A la izquierda se muestra otro m a p a de los l
ocus (SUH1E = sindrome de Usher P P A = protena |5-precursora amiloidea [asociada
a la enfermeoad de Alzheimer; DS01 = dismutasa superxida-1; ELA1 = esclerosis la
teral amilrpica; DFNB8 = sordera 8: ETS2 = oncogn ETS-2; HPE1 = holoprosencefalia
alobar-1 : COL6A1'COL6A2<COL18A1 = genes de colgeno.) (Los datos proceden de Kore
nberg [1990]; Delabar [1993]: OMIM [1999].)

19
20
21
22
X
T
Figura 62-23. Cariolipos de los sndromes cromosmicos numricos A, Sndrome de Edwards
(trisoma 18): 47.XX.+18.
La ilustracin continua en la pgina siguiente.
Los hombres con sndrome de Klinefelter (47.XXY) tienen tendencia a ser altos y de
lgados, de piernas relativamente largas, aunque en los primeros aos estos hallazg
os rara vez los apartan de los dems nios. A algunos individuos se les identifica e
n el colegio por sus dificultades en el aprendizaje, pero las causas de referenc
ia ms corrientes son hipogonadismo pospuberal. desarrollo del pecho como en una m
ujer, infertilidad debida a la pequenez testicular, tubos testiculares halinizado
s y azoospermia. En individuos con un complemento de cromosoma mosaico, incluida
una lnea celular 46.XY [47.XXY/46.XY], se ve una forma ms leve del sndrome de Klin
efelter con fertilidad potencial a causa de un desarrollo testicular normal. La
llave de la fertilidad es la proporcin relativa de clulas XXY y XY durante la dete
rminacin sexual en el primer zigoto y en los testculos. Un exceso de clulas XXY lle
var al individuo a ser un verdadero Klinefelter, mientras aue un mayor nmero de clu
las XY moderarn el fenotipo y aumentarn las probabilidades de que sea frtil. El sin
drome de Turner: 45,X(Fig. 62-348) es la aneuploidia cromosmica sexual ms comnmente
reconocida, presente en un fenotipo femenino. En la determinacin sexual, el desa
rrollo femenino normal depende de la presencia de dos cromosomas X aclivos. La r
egin critica de la diferenciacin femenina se ha estrechado a una regin del brazo co
rto del cromosoma X, justamente proximal al centrmero. Si esa regin no existe o es
t inactiva, se originar un individuo con el sndrome de Turner. Aproximadamente la m
itad de todos los pacientes con sindrome de Turner tienen el complemento de crom
osoma
45.X clasico, que representa la nica monosomia de los que nacen vivos viable. Nor
malmente, el nico cromosoma X es de origen materno e indica que una no separacin m
etica paterna es el origen del error ms corriente. Tambin puede haber cariotipos ms c
omplejos adems del 45.X (Tabla 625) (Palmer, 1976). A los que ms les atae es a los
individuos que tienen un cromosoma Y, completo o parcial, en al menos una lnea ce
lular: stos tienen un nesgo mayor de gonadoblastoma. El fenotipo del sindrome de
Turner es altamente variable. Los individuos afectados son tpicamente bajos (<1,5
0 m) con disgenia gonadal y dificultades de aprendizaje. Otros rasgos comunes so
n membrana cervical originada por higroma qustico in tero, nacimiento del pelo pos
terior bajo, anomalas renales y del corazn, cubitus valgus (aumento del ngulo de po
rte en el codo) y trax de caparazn. Los pacientes al nacer pueden presentar edemas
en las manos y en los pies. Los pacientes con sndrome de Turner tienen una capac
idad amplia para las habilidades mentales, y muchos tienen una inteligencia norm
al, pero algunos tienen detectos mentales significativos. Ms an, aunque en el sndro
me de Turner la infertilidad se sola aceptar como el estndar, ahora se sabe que al
gunos pacientes se pueden reproducir con xito, normalmente los que tienen carioti
pos mosaicos. Por tanto, y debido a la gran diversidad de las presentaciones, el
asesoramiento prenatal a una pareja con un feto con un sndrome de Turner no iden
tificado es extremadamente difcil. Sin embargo, la mayora de los pacientes nacidos
vivos con sndrome d e Turner, por lo general, pueden tener vidas productivas, y
los individuos afee-

1326
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1327
Tabla 62-5 Distribucin d e los c o m p l e m e n t o s d e c r o m o s o m a dife
rente q u e origina el s n d r o m e de Turner Porcentaje de casos % b 20 15 10 A
nomala cromosmica 45.X 45.X,i(Xq) Deleciones del cromosoma X o anillos. o la prese
ncia de un cromosoma Y Mosaicos 45.X/46.XX 41>.X/46. XY
lados levemente quiz no sepan que estn afectados por el desorden hasta que lleguen
a la pubertad.
Otras anomalas cromosmicas sexuales
En los humanos, la determinacin sexual es el resultado de una va bioqumica compleja
, que conlleva la interaccin de protenas producidas por genes presentes en los cro
mosomas X e Y, as como por los genes en los autosomas. El sexo natural, en los hu
manos, es el femenino, por eso se desarrolla un individuo femenino en ausencia d
e cualquier estmulo que defina a un varn. El primer desencadenante para el desarro
llo de un varn es un gen localizado en el brazo corto del cromosoma Y. denominado
FDT. factor que determina los testculos, que est localizado en la regin determinan
te del sexo del cromosoma Y (RSY) (Fig. 62-24). La protena producida por el FDT i
nicia la va para el desarrollo de un varn. Se han identificado vanos desrdenes asoc
iados a mutaciones en distintos genes dentro de esa va que pueden originar genita
les ambiguos o errores del genotipo o del fenotipo (un hombre fenotpico con un co
mplemento de cromosoma sexual X X o una mujer tenolpica con un complemento XY). E
l origen de un hombre XX se puede atribuir, generalmente, a una o dos causas. La
ms corriente de las dos es la virilizacin de un leto femenino, que con frecuencia
es el resultado del desorden recesivo autosmico hiperplasia adrenal congnita (HAC
). Este desorden lo produce la carencia de la
enzima 21 -hidroxilasa. que origina un bloqueo en la via de biosintesis normal y
produce una acumulacin de andrgenos. Los niveles excesivos de hormonas masculinas
en la circulacin femenina pueden dar origen a una persona de apariencia masculin
a, a pesar del complemento de cromosoma femenino. Adems, un feto femenino normal
puede desarrollar genitales ambiguos, debido a la exposicin a un exceso de hormon
as de la madre afectada de HAC, dado que los andrgenos son capaces de atravesar l
a placenta. Tambin se puede originar un hombre fenotpico con un complemento de cro
mosoma sexual XX a causa de una translocacin crptica entre el cromosoma X y el cro
mosoma Y. Los extremos distales de los brazos cortos de los cromosomas X e Y son
homlogos, e incluyen a las que se denominan regiones seudoautosmicas (Fig. 62-24)
. Este es el primer lugar de apareamiento del cromosoma X y del Y durante la mei
osis y se puede producir la recombinacin entre el alelo X y el Y. De forma ocasio
nal se puede producir un acontecimiento de recombinacin fuera de las fronteras de
la regin seudoautosmica, originando la transferencia de los nicos locus Y, incluye
ndo a la RSY. en la punta del cromosoma X. La cantidad de material cromosmico pre
sente en este intercambio es extremadamente pequea y no puede ser detectada por m
edio de la citogentica. Un hombre con una translocacin tan equilibrada no tendr ano
malas clnicas debido a que todos los genes estn presentes, aunque en localizaciones
alternas. Sin embargo, si este hombre transmite su cromosoma X reordenado a un
hijo que haya recibido un cromosoma X de la madre, el nio tendr un complemento de
cromosoma XX aparente, pero tendr un fenotipo masculino o un fenotipo masculino K
linefelter debido a la presencia del gen FDT, que desencadena la via de desarrol
lo de un hombre. De forma recproca, la translocacin descrita antes puede originar
una mujer Turner con un complemento XY aparente. La va para desarrollar a un homb
re no se iniciar en un individuo con un cromosoma Y que no tenga el FDT y la RSY.
y la determinacin sexual se decantar hacia una mujer. Sin embargo, la ausencia de

dos copias intactas del brazo corto del X proximal impedir el desarrollo de una
mujer "normal" y dar origen a un individuo con sndrome de Turner. Esta situacin es
bastante infrecuente. En una mujer XY el resultado ms comn es la insensibilidad an
drgena, que tambin es conocida como "feminizacin testicular". En estos individuos e
l cromosoma Y est intacto y el FDT est presente y es funcional. El problema surge
en otra parte de la via bioqumica por un defecto del gen receptor de andrgeno que
est localizado en el brazo largo del cromosoma X (Xq21.3). El FDT inicia el desar
rollo de un hombre, pero la va estar bloqueada en el punto donde se necesita el pr
oducto del gen receptor de andrgeno para hacer un compuesto de testosterona con d
ihidrotestosterona. No se puede ir ms lejos en la diferenciacin de un hombre y por
eso el fenotipo se revelar en una mujer. Sin embargo, estos individuos no son frt
iles por la falta de algunos genitales internos funcionales y presentan, comnment
e, una vagina ciega y testculos en el abdomen o conducto inguinal.
Anomalas
cromosmicas
estructurales
Se ha descrito un nmero razonable de sndromes directamente relacionados con una an
omala cromosmica estructural. La mayora de ellos son bastante raros. A continuacin s
e explican algunos de los ms comunes (vase tambin Jones. 1997). El sndrome de Wolf-H
irschhorn. tambin conocido como 4p-sindrome. se debe a una aparente delecin termin
al del brazo corto del cromosoma 4 [del(4)(p16|] (Fig. 62-14). Los resultados cln
icos incluyen microcefalia. micrognalia, hipotonia, pliegues epicnticos y retraso
en el desarrollo. Se asocia la apariencia facial caracterstica de estos individu
os con el casco de un guerrero griego, debido a la nariz larga y a las cejas arq
ueadas. Las personas que tienen este desorden necesitan educacin especial y tiene
n un gran riesgo de padecer convulsiones. El Cri du chat o sndrome 5p- [del(5)(p1
5)j est caracterizado por un llanto como de gato, agudo y distintivo, en la infan
cia. Otros rasgos son poco peso al nacer y el crecimiento lento subsiguiente, hi
potonia. microcefalia. hipertelorismo. pliegues epicntico. anomalas cardiacas y re
traso mental. Los nios afectados tienen un desarrollo retrasado y pueden alcanzar
los niveles sociales y cognitivos a los cinco o seis aos.
Figura 62-24. Diagrama de las localizaciones relativas del FDT, del R S Y y de l
as regiones seudoautosmicas del cromosoma X y del cromosoma t

1328
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR involucrados en el sndrome de Miiler-Dieker. as que es un autntic

o sndrome de genes contiguos originado por una microdelecin. Una delecin ms pequea de
l gen LIS1 origina una lisencefalia aislada (Ledbetler, 1992). Los sndromes de mi
crodelecin mejor conocidos son el sndrome de Prader-Willi (SPW) y el sndrome de Ang
elman (SA). Ambos comparten la misma delecin intersticial del brazo largo proxima
l del cromosoma 1 5 [del(15)(q11.2q11.2)], pero la presentacin clnica es significa
tivamente diferente. Los pacientes con el sndrome de Prader-Willi cuando nacen so
n pequeos e hipotnicos, pero cambian durante el primer ao de vida y empiezan a gana
r peso con rapidez. Si no se les pone una dieta controlada, pueden ser bastante
obesos debido la sobrealimentacin. Tienen otras caractersticas, como manos y pies
grandes, hipogonadsmo y mal genio. Aunque son retrasados en su desarrollo, la may
ora se desenvuelve bien en las clases de educacin especial. A los pacientes con el
sndrome de Prader-Willi se les puede internar en casas para grupos especiales, q
ue les proporcionan un ambiente adecuado, debido a su temperamento y a la dificu
ltad para controlar su dieta. Por otro lado, los pacientes con el sndrome SA tien
en un retraso mental agudo. Aunque son muy amistosos, por lo general no pueden m
antener una conversacin normal y la interrumpen, con frecuencia, con estallidos d
e risa inapropiados. Este desorden est tambin caracterizado por hiperactividad, es
tatura baja, microcefalia, convulsiones y ataxia. La delecin 15q se puede detecta
r en casi un 60% de los individuos con el SPW. y en los pacientes con SA slo entr
e un 10% y un 20%, por medio de un anlisis ordinario o criognico de alta resolucin.
La utilizacin de la HISF ha proporcionado una herramienta para el diagnstico much
o mejor, y ahora se pueden establecer las deleciones en el 80% a 85% de los caso
s. Aunque se aceptaba que no todas las deleciones fueran visibles a nivel citoge
ntico, pareca extrao que la HISF no fuera capaz de detectar una delacin en el 100% d
e los casos. Esto, unido al hecho de que el SPW y el SA parecen compartir la mis
ma delecin aunque tienen fenotipos completamente diferentes,

Sndromes de microdelecin y sndromes de genes contiguos

Por definicin una microdelecin es una delecin muy pequea, normalmente slo una fraccin
de la banda de un solo cromosoma. Las microdeledones pueden ser confundidas con
deleciones moleculares, asi que es importante reconocer que, aunque las microdel
eciones son pequeas, son significativamente ms grandes (>500 kb) que la delecin mol
ecular tpica (1 par de bases [pb] a varios cientos pb), que slo se pueden resolver
por medio de la tecnologa molecular (vase Cap. 66). El tamao real de una micro-del
ecin puede variar de un paciente a otro, y algunas pueden ser lo suficientemente
grandes para identificarlas mediante un anlisis citogentico, aunque la mayora para
ser detectadas necesitarn la utilizacin de la HISF. Aunque al principio se crea que
las deleciones estaban dentro de los genes solos, ahora se ha demostrado que ci
ertos sndromes se deben, en realidad, a deleciones que abarcan porciones de vario
s genes no relacionados adyacentes. La presentacin clnica, por tanto, puede ser un
a combinacin de caractersticas, debido a la ausencia de varios productos gnicos dif
erentes. El tamao de la delecin y el nmero de genes afectados puede variar tanto qu
e el fenotipo expresado puede ser significativamente diferente entre los individ
uos. A estos sndromes se les denomina colectivamente sndromes de genes contiguos y
representan una serie dentro de la categora ms amplia de los sndromes de microdele
cin (Tabla 62-6). El sndrome de Miiler-Dieker ilustra con claridad el solapamiento
entre la microdelecin y los sndromes de genes contiguos. Este desorden se ha asoc
iado con una microdelecin del brazo corto distal del cromosoma 17 (17p13.3), y lo
s rasgos clnicos esenciales son lisencefalia (cerebro liso) y anomalas craneofacia
les. La lisencefalia aislada (LSA) ha sido reconocida como una entidad independi
ente, as que el sndrome de Miiler-Dieker es una presenlacin ms compleja que une el d
efecto cerebral con los rasgos faciales caractersticos. El anlisis molecular muest
ra que hay al menos dos genes

Tabla 62-6 Microdelecin y sndromes de genes contiguos Trastorno Angelman (SA) DiGe
orge (SDG) Icliosis Kallmann Larger-Giedion (SLG) Localizacin 15q11.2 22q1l.2. 10
p, 4q, 6q Xp22.32 Xp22.3 8q24 11-q24.13 Genes UBE3A ?GCSL y otros Rasgos clnicos
RM agudo, retraso en el desarrollo, boca grande, progriatia, ataxia, convulsione
s
7

Cara caracteristica. paladar hendido, hipoplasia del limo y paratiroides, corazn

delectuoso e hipocalcemia Piel escamosa, estatura baja, hipogonadismo, RM Hipogo
nadismo, incapacidad para oler Dismorfismo craneofacial. anomalas esquelticas, def
iciencia mental de moderada a aguda Cerebro liso, retraso mental profundo, convu
lsiones Lisencefalia. microcefalia, trente alta, nariz pequea, micrognatia, oreja
s bajas Hipotonia al nacer, ojos almendrados, RM de moderado a agudo, ausencia d
e saciedad, lo que lleva a comer de ms. manos y pies pequeos, hipogonadismo Tumore
s del relinoblasto del ojo Nariz rota, columela prominente, maxilar superior hip
oplsico, fisuras palpebrales inclinadas hacia abajo, dedos pulgar y primero del p
ie anchos, RM y lenhtud al hablar Braquicefalia, hipoplasia en media cara, puent
e nasal ancho. mandbula prominente, manos pequeas y anchas, hiperactividad. lentit
ud al hablar, conducta autodestructiva, RM
STS KAL1 TRPSI TRPSII EXT LISI LIS1 y otros? SNRPN
Lisencefalia (SIL) Miiler-Dieker (SMD) Prader-Willi (SPW)
17p13,3 17p13.3 15q11.2
Retinoblastoma Rubinstein-Taybi (SRT)
13q14.1-q14.2 16p13.3
Rb1 CBP
Smith-Magenis (SSM)
17p11.2
Sndrome velocardiofacial (SVCF) WAGR
22q11.2 11p13.3
?GCSL WT1 AN2 y otros? ELN
Defectos en el paladar, alae nasi hipoplsica con nariz larga, incapacidad para el
aprendizaje, enfermedad cardiaca congnita Tumor de Wilms, aniridia, defectos gen
itourinarios y retraso mental
Sndrome de Williams (SEW)
7q11?
Cl bajo, hipersensibilidad auditiva, oos azules con un patrn en forma de estrella
en iris, labios prominentes, voz ronca, estenosis artica supravalvular u otro def
ecto cardaco, hipercalcemia y envejecimiento prematuro de la piel
RM = retraso mental.
v
...

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1329
WAGR
entre repeticiones directas que estn contiguas a la regin de delecin comn. Esta reco
mbinacin intercromosmica generar una estructura de asa que, si se escinde, producir
la delecin del segmento intermedio. Tambin se han detectado recombinaciones interc
romosmicas entre repeticiones directas (Edelman, 1998).
Otros fenmenos citogenticos Sndrome del cromosoma X frgil
El sndrome del cromosoma X frgil es la segunda causa ms importante de retraso menta
l y la primera de retraso mental heredado. Herbert Lubs describi por primera vez
este desorden en 1969, cuando se dio cuenta de que en los miembros de la familia
afectados haba una correlacin entre el retraso mental y un cromosoma X "marcador"
(Lubs, 1969). Posteriormente se conoce al cromosoma X marcador como el cromosom
a X frgil, que es una rotura o abertura en la estructura del cromosoma X que se p
uede delectar por medio de la citogentica cultivando clulas en el medio de induccin
adecuado (Fig. 62-26). Desgraciadamente no todos los individuos afectados expre
san el cromosoma X frgil por medio de la citogentica, por lo que el anlisis clnico e
s imperfecto. Sin embargo, durante muchos aos fue el nico ensayo disponible y prop
orcion una muy necesaria confirmacin de los diagnsticos de muchos pacientes. En 199
1 se clon el gen asociado al sndrome del cromosoma X frgil y se identific a la mutac
in como la amplificacin de una secuencia repetida de tnnucletidos, algo que nunca a
ntes se haba visto o asociado como un mecanismo causante de la enfermedad. Afortu
nadamente, esta mutacin se puede detectar a nivel molecular, y se ha desarrollado
un anlisis clnico, altamente competente, que permite la deteccin directa de la mut
acin del sndrome del cromosoma X frgil (Rousseau. 1991; Verkerk. 1991).
11
Figura 62-25. Diagrama del sndrome de genes contiguos WAGR que muestra la posicin
relativa de los diferentes genes en el brazo corto del cromosoma 11.
sugera que pudiera haber otra causa que originara estos desrdenes. Ahora se sabe q
ue el SPW y el SA son ejemplos de impresin gentica y que el proceso de la mutacin q
ue origina las enfermedades es mucho ms complejo que una simple delecin del ADN (N
icholls, 1989; Robinson, 1991) (vase el Cap. 66 donde se explica la deteccin molec
ular y de impresin de los genes impresos). El sndrome de Williams ha sido asociado
a una delecin del gen de elaslina (ELN) del brazo largo proximal del cromosoma 7
(7q11.23). Este desorden se caracteriza por anomalas cardacas, hipertensin, voz ro
nca, envejecimiento prematuro de la piel y anomalas en el comportamiento. La ause
ncia de elastina explica muchas de las anomalas fsicas asociadas a este sndrome, ya
que se sabe que es una protena importante que da elasticidad a tejidos, como los
del corazn, vasos sanguneos, piel y cuerdas vocales. Sin embargo, los problemas d
e conducta no se pueden atribuir a la falta de elastina, por eso actualmente se
cree que el sndrome de Williams es, en realidad, un sndrome de genes contiguos y q
ue la variabilidad del fenotipo est relacionada con el nmero de genes adyacentes q
ue se delecionan en combinacin con el gen ELN. El sndrome de WAGR (tumor de Wlms,
aniridia. defectos genitourinarios, y retraso mental) es un sndrome de genes cont
iguos muy bien caracterizado y est localizado en el brazo corto del cromosoma 11
(11 p13). Excepto por los defectos genitourinarios, que parecen ser debidos a un
a mutacin variante en el locus del tumor de Wilms. cada una de las otras tres ano
malas han sido asociadas a un gen especfico, y stos estn ordenados en tndem en el bra
zo corto del cromosoma 11 (Fig. 62-25). El fenotipo de un individuo afectado var

iar dependiendo del tamao de la delecin. Estadsticamente, alrededor de uno de cada t

res nios diagnosticados de aniridia desarrollarn tambin el tumor de Wilms. Por el c
ontraro, slo 1 de cada 50 pacientes con tumor de Wilms tiene aniridia. Con delecio
nes ms grandes, tambin se pueden ver defectos genitourinarios y retraso mental. El
sndrome velocardioacial es. posiblemente, el sndrome de microdelecin ms comn en los
umanos, pero, muy a menudo, pasa desapercibido, debido al amplio espectro de los
rasgos clnicos y a que puede presentarse de forma bastante leve. Este desorden s
e diagnostica, normalmente, en nios lactantes, debido a las dificultades que tien
en para alimentarse, a los detectas cardiacos y a las dismorfologas faciales cara
ctersticas. Cuando el individuo crece, se advierten discapacidades en el aprendiz
aje, poca estatura y prdida de audicin conductiva. Es interesante hacer notar que
entre un 10% y un 15% de estos pacientes tienen un progenitor afectado, pero muc
ho ms levemente, por la misma delecin. Se cree que la delecin 3 Mb del brazo largo
proximal del cromosoma 22 (22q11.2q11.2) se debe a la recombinacin
Sndromes de rotura
Los sndromes de rotura cromosmicos (Tabla 62-7) son un conjunto de desrdenes recesi
vos autosmicos que se agruparon juntos al principio a causa de que los resultados
tenan en comn la fragilidad o inestabilidad cromosmica (Ariett. 1978). Por esta ra
zn, los anlisis citogenticos fueron de gran ayuda para los diagnsticos. Los estudios
moleculares han demostrado una causa comn adicional entre estos desrdenes, y es q
ue la mutacin en cada uno de ellos origina un defecto en los mecanismos de repara
cin del ADN de las clulas. Esto ayud a explicar otras caractersticas de los sndromes,
ya que la incapacidad para reparar el ADN puede llevar a 1) la rotura o al aume
nto de la recombinacin, que se puede caracterizar por medio de la inestabilidad c
romosmica, y 2) a mutaciones adicionales y defectos en la secuencia del ADN, que
pueden originar el cncer. Con un mejor conocimiento de la mutacin especfica, la ter
apia gnica para el tratamiento se convierte en una posibilidad.
\
Figura 62-26. Cromosoma X frgil. Ideograma del cromosoma X frgil (izquierda) y un
par de cromosomas con bandeo-G representativos que muestran, a la derecha, al cr
omosoma X frgil.

Tabla 62-7 Sndromes de rotura cromosomica Trastorno Anemia de Fanconi (AF) Caract
ersticas clnicas Pancitopenia, retraso en el crecimiento pre o posnatal, hipopiasi
a o falta de dedos pulgares, posibilidad de deformacin en ios brazos, pigmentacin
oscura de la piel Retraso en el crecimienio. erupcin en la piel en forma de marip
osa, posiblemente maligna Ataxia con degeneracin del SNC, telangiectasia en la ca
ra, deficiencia de inmunidad celular, degenerativo, retraso en el crecimiento Lo
cus gnico 1. Grupo A I6q24.3 2. Grupo C9q22.3 3. Grupo D3p22-p26 4. Grupo E6p21-p22 5
. Grupos B E H sin mapa I5q26 1 Manifestaciones citogentcas Aumento de roturas cro
mosmicas detectadas mediante tratamiento con MMC y DEB Tipo de cncer Aumento del r
iesgo de L M A y fallo progresivo de la mdula sea Defecto de reparacin del ADN Misc
elnea Terapia actual trasplante de medula sea
Sindrome de Bloom (BLM)
Aumento de CCH en respuesta a los rayos ultravioleta o incorporacin de BrdU
Actividad anormal de la ADN ligasa I
Alta frecuencia en la poblacin luda ashkenazi: 1 / 1 1 0e s portadora de esa frecu
encia
Ataxia telangiectasia (AT)
1 1 q 2 2 . 3
Xeroderma pigmentos (XP)
Sensibilidad a los rayos solares, anomalas neurologicas. ataxia y espasticidad
Sndrome de Cockayne
Enanismo, envejecimiento prematuro, microcefalia, dficit neurolgico, degeneracin de
la pigmentacin, sordera, sensibilidad a la luz del sol. RM
incidencia: 1 en 250 000 1. A-9q22.3 2. C-653p25 3. D19q13.2-ql3.3 4. E11p11.1-p12
5. F-16p13.1-13.2, 16p13.13-p13.3 5. G13q33 Cromosoma 5
Aumento de las roturas espontneas, aumento de anillos tnrradiaies y translocacion
es, especialmente en el cromosoma 7 y en el 14 inducidas con bleomicma o con rad
iaciones ionizantes Aumento del CCH y reordenamiento cromosomico en respuesta a
los rayos ultravioletas
Vanas leucemias y tumores slidos
Aumento en la incidencia de cancer de piel
i Falta de escisin de los los dmeros de timina 2. Defecto en la reparacin posreplic
acin
Sensibilidad a los rayos ultravioletas
Aumento en la incidencia de cncer de piel
Posible deficiencia de ADN ligasa o defecto de la reparacin de la transcripcin aso
ciada emparejada
MMC mitomicma C: DEB = diepoxybutano: CCH = camOio de la cromdtida hermana: SNC
= sistema nervioso central. RM retraso mental: BrdU = bromodesoxiuridma: LMA = l
eucemia mieloide aguda

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1331
RESUMEN
La citogentica es una ciencia de laboratorio de trabajo intensivo, relativamente
antigua, que todava se ejecuta de la misma manera en la que siempre se ha hecho,
a pesar de que la llegada de los sistemas asistidos por ordenador para hacer car
iotipos y el recolector robtico han aadido un elemento de tecnologa avanzada al lab
oratorio. Aunque una vez se vaticin que los diagnsticos moleculares eliminaran a la
citogentica. eso no ha ocurrido, ya que la citogentica es an el nico ensayo clnico q
ue puede proporcionar una visin general rpida de todo el genoma humano. En lugar d
e ser reemplazada, la citogentica ha cambiado con los tiempos para hacer (rente a
los retos de las enfermedades que se han identificado recientemente y de las nu
evas tecnologas. La utilizacin de la HISF ha rellenado el hueco entre la citogentic
a y los diagnsticos moleculares de tal manera que los dos campos proporcionan inf
ormacin complementaria para muchos casos. La citogentica contina siendo importante
en la valoracin de las anomalas cromosmicas estructurales y numricas, y es el estndar
oro para diagnosticar muchos desrdenes. Su lugar en la medicina de laboratorio c
lnica est asegurado (por lo menos hasta el momento en el que el escner tipo "Star T
rek" est disponible).
BIBLIOGRAFA
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1332
SECCIN V I I

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C A P T U L O
63
Organizando un laboratorio de diagnstico molecular
Andrea Ferreira-Gonzalez, Ph.D. David S. Wilkinson, M.D., Ph.D. Carleton T. Garr
ett, M.D., Ph.D.
INSTALACIONES DEL LABORATORIO Diseo del laboratorio Mtodos de ayuda en el control
de contaminacin EQUIPAMIENTO PERSONAL DE LABORATORIO Director del laboratorio Sup
ervisor tcnico Tcnicos mdicos y tcnicos en biologa molecular Residentes, becanos y es
tudiantes graduados Adiestramiento y acreditacin FORMATOS DE PRUEBAS CLNICAS Prueb
as de desarrollo propio Mtodos manuales basados en equipos Sistemas automatizados
basados en equipos para pruebas moleculares SELECCIN DE PRUEBAS Codificacin CPT e
ICD-9 Patentes
1333
VALIDACIN ANALTICA Y CLNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES Reactivos especficos del sust
rato 1339
1335 1335
Limitaciones especiales en relacin con las pruebas genticas CONTROL DE CALIDAD Y S
EGURIDAD DE LA CALIDAD Control de calidad en el proceso de las pruebas Control d
e calidad del equipo de laboratorio Elementos del programa de seguridad de la ca
lidad 1341
1337
ACREDITACIN DEL LABORATORIO Pruebas de los laboratorios clnicos Pruebas forenses d
e identidad humana y de paternidad CONCLUSIN
1342
1343 1343
1337 BIBLIOGRAFA
Durante la ltima dcada se ha adquirido una enorme cantidad de conocimientos con re
specto a los genes y a sus funciones en las enfermedades humanas. Esle conocimie
nto nos ha permitido una mejor comprensin del proceso de muchas enfermedades. Com
o consecuencia, las enfermedades se definen cada vez ms en trminos de su patogenia
molecular. Esto ha conducido al desarrollo de nuevos mtodos clnicos moleculares p
ara su utilizacin en el diagnstico, pronstico, seleccin de modalidades teraputicas y
vigilancia de las enfermedades (Ferreira-Gonzlez, 1996; Fredericks. 1999; Hodinka
, 1998; Hruban. 1998; Sawyers, 1999; Tsongalis. 1999). Los mtodos clnicos molecula
res representan una serie de tcnicas y reactivos en los que el principal analizad
o es el cido nucleico. Los cidos nucleicos pueden ser cido deoximbonucleico (ADN) o
cido ribonucleico (ARN). Existen mltiples aplicaciones de esta tecnologa a diferen
tes reas del laboratorio clnico. Una de las principales ventajas de utilizar cidos
nucleicos como sustrato analizado es que representa el marcador natural ms especi
fico de todos los organismos vivientes, esto es. el orden de los nucletidos que c
omprenden el genoma de un organismo. El nmero de disposiciones diferentes de los
cuatro diferentes nucletidos, que puede estar presente en una molcula de ADN que sl
o es tan grande como el virus de menor tamao, es muchas veces superior al nmero to
tal de los diferentes tipos de organismos vivos de esle planeta. As. la secuencia
del ADN de cada organismo vivo contiene una informacin peculiar que se puede uti
lizar para su identificacin. Adems, los cambios en las secuencias del ADN son la c
ausa de enfermedades genticas y malignas; por tanto, proporcionan una infor-

macin diagnstica y pronostica m u y importante Hasta hace poco, los principales mto
dos de laboratorio para detectar diferencias en la secuencia de los cidos nucleic
os no haban sido lo suficientemente sencillos o fiables c o m o para utilizarlos
en el laboratorio clnico. Los avances recientes en la tecnologa y en la instrument
acin, asi como los esfuerzos para su normalizacin, han podido vencer muchas de est
as limitaciones.
INSTALACIONES DEL LABORATORIO
La potencia del diagnstico molecular se deriva de la exquisita sensibilidad y esp
ecificidad proporcionada por el uso de cidos nucleicos como sustrato analizado. L
a alta sensibilidad se deriva de la amplificacin m vitro de secuencias especifica
s diana de cidos nucleicos presentes en la muestra procedente del paciente. La am
plificacin in vitro crea millones o billones de copias de la secuencia blanco y p
ermite asi detectar hasta una nica molcula diana en el espcimen del paciente. Al mi
smo liempo, sin embargo, esta alta sensibilidad presenta importantes desafios pa
ra el uso de esta tecnologa. Asi, una de las principales ventajas de esta tecnolo
ga es tambin una de sus principales limitaciones. El cierre y apertura de los tubo
s de la microcenlrilugadora que contienen productos amplificados pueden producir
microgotas en forma de aerosol que pueden transportar entre 10 y 100 copias de
la secuencia diana amplificada. Estas microgotas pueden posteriormente depositar
se en

1334
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR mente el uso de campanas de "aire muerto" para el preparado de

reactivos y organizacin de las reacciones, lo cual es an ms crtico en el caso de qu
e ambos laboratorios deban estar combinados. Las campanas de aire muerto proporc
ionan un medio altamente controlado donde se pueden llevar a cabo el preparado d
e reactivos y reacciones. Es importante intentar localizar esta zona en una secc
in de laboratorio que tenga poco trfico. No se deben introducir ARN, ADN o especmen
es de pacientes tanto genmicos como plsmidos dentro de la caja de aire muerto dond
e se realiza la preparacin de los reactivos. Esta caja de aire muerto debe estar
provisla de una luz ultravioleta para colaborar a esterilizar las superficies in
teriores. Las superficies de las cajas de aire muerto tambin se deben tratar con
una solucin recin preparada de hipoclorilo sdico al 10% (leja) y posteriormente con
una solucin de etanol al 75% despus de trabajar en la zona. Estas reas deberan conte
ner un equipo e instrumentacin especficos que no se deben compartir con ninguna ot
ra rea Esto debera comprender las pipetas, el agitador, las puntas, los tubos y ot
ro instrumental similar. Se debe utilizar un traje y guantes especficos de labora
torio antes de trabajar en esta zona. La segunda rea o habitacin limpia dentro del
laboratorio de preamplificacin es donde se lleva a cabo el acceso de los especmen
es, su procesado y la adicin de cido nucleico a los tubos de reaccin adecuados. Est
a rea debe estar provista con por lo menos un gabinete de bioseguridad ambiental
para procesado de muestras y extraccin de cidos nucleicos adems del equipo de labor
atorio especifico, que slo se debe utilizar para estos fines. Debera disponerse de
otra cabina de bioseguridad medioambiental completamente separada si en este la
boratorio se lleva a cabo cualquier tipo de cultivo tisular, y debera existir equ
ipo de laboratorio separado dedicado a esta labor. Si en el laboratorio se utili
zan extracciones de cidos orgnicos nucleicos, se debera disponer de una cabina de s
eguridad qumica para manejar los pasos que comprenden lenol y cloroformo durante
el proceso de extraccin. Si se llevan a cabo extracciones tanto de ARN como de AD
N en el mismo laboratorio de preampliicacin. se deberan realizar estos procedimient
os en reas separadas del laboratorio y tener instrumentos especficos para cada uno
. as como pipetas y puntas para cada mtodo. En circunstancias donde hay problemas
de espacio y no es posible dedicar dos reas completamente separadas, la extraccin
del ADN y del ARN debe llevarse a cabo en momentos diferentes o en das diferentes
despus de limpiar a fondo las reas antes de trabajar. Como ya se ha descrito, tod
as las reas deberian limpiarse con una solucin al 10% de hipoclorito sdico preparad
o en el da y con una solucin de etanol al 75%. El laboratorio de postamplificacin e
s donde se realiza la amplilicacin in vitro y el anlisis de cido nucleico. Los inst
rumentos que se utilizan en este laboratorio no se deben compartir con las reas d
e preamplificacin Si se utilizan termocicladores para la amplificacin in vitro de
los cidos nucleicos, se recomienda que se coloquen en este laboratorio. Si los te
rmocicladores se colocan en el laboratorio de preamplificacin. bajo ninguna circu
nstancia se deben abrir los tubos de reaccin despus de la amplificacin en este cuar
to. Adems, los termocicladores deben enchufarse en lneas especficas con su propio d
isyuntor de circuito para evitar cualquier fluctuacin en la electricidad que pudi
era afectar a su funcionamiento. Normalmente, este laboratorio necesitar de ms esp
acio que los laboratorios de preamplificacin debido a los requerimientos de espac
io de la instrumentacin y de los mtodos de anlisis del producto amplificado. La ele
ctroforesis en gel. por ejemplo, utiliza con frecuencia una cantidad significati
va de espacio. Se recomienda disponer de una cabina de seguridad biolgica y de un
a incubadora por agitacin si se van a llevar a cabo mtodos de clonacin. Tambin es al
tamente deseable disponer de un cuarto oscuro con una procesadora automtica de ra
diografas y un congelador. Sin embargo, es preferible colocar el cuarto oscuro fu
era del laboratorio de postamplificacin, de manera que se pueda tener acceso al m
i s m o sin tener que entrar en el laboratorio de postamplilicacin.

los puntos de trabajo, instrumentos, mobiliario, suelo, polvo, pelos, piel expue
sta: virtualmente cualquier superficie. Otra importante fuente de contaminacin pu
ede ser el propio cido nucleico diana. Los mtodos de manejo de las muestras siempr
e deben estar protegidos contra la contaminacin cruzada de las muestras de los pa
cientes. La contaminacin por el propio cido nucleico diana nativo puede ser tambin
el resultado del procesado de muestras de pacientes en un ambiente en el que el c
ido nucleico diana sea amplificado biolgicamente bien por clonacin o cultivando la
clula o los microorganismos que lo contienen. As, es necesario disear cuidadosamen
te las instalaciones del laboratorio de diagnstico molecular para asegurar que ha
y un espacio suficiente y adecuado para el personal y el equipo, y tambin para mi
nimizar el potencial problema de la contaminacin de especmenes con cido nucleico di
ana natural y/o cido nucleico procedente de una amplificacin m v//ra(Porter-Jordan
. 1990).
Diseo del laboratorio
El espacio de laboratorio debe disearse para minimizar el riesgo de contaminacin y
maximizar el flujo de trabajo. El uso de barreras de contencin mediante la utili
zacin de reas de trabajo separadas fsicamente para el preparado de reactivos, acces
o de muestras, extraccin de cidos nucleicos y anlisis del material amplificado es a
ltamente deseable. Un laboratorio ideal est compuesto de tres habitaciones comple
tamente independientes. Dos de estas habitaciones se consideran habitaciones lim
pias, dado que todas las tareas y ocupaciones antes de la amplificacin in vitro s
e realizan en estos cuartos. Estos cuartos se llaman habitaciones de preampliicac
in. El tercer cuarto se considera un cuarto sucio, dado que se dedica a la amplif
icacin in vitro y al anlisis del material amplificado. Esta habitacin se llama la h
abitacin postamplificacin. Los sistemas de tratamiento del aire de cada uno de est
os cuartos deben ser completamente independientes uno de otro. Si ello no es pos
ible, el laboratorio de preampliicacin debe localizarse lo ms prximo posible a la fu
ente del aire. Si ello es posible, los laboratorios de preampliicacin deben estar
dotados de filtros electrostticos de aire instalados en la entrada de aire a cada
laboratorio. Estos filtros deben vigilarse de forma peridica, incorporando el ca
mbio y limpieza de los filtros de aire en el programa de control de calidad del
laboratorio. Ademas de los filtros de aire, los laboratorios de preamplificacin d
eben estar a presin positiva de aire. Esto impedir la entrada de cualquier contami
nante areo en el laboratorio de preamplificacin cuando se abra la puerta. El labor
atorio de postamplificacin debe estar a presin de aire negativa para impedir la sa
lida de cualquier partcula de este laboratorio, con la consiguiente contaminacin d
el ambiente circundante. La construccin de una antesala en cada laboratorio es un
a forma barata de crear una presin diferencial en el laboratorio. Una antesala a
presin positiva para el laboratorio de preamplificacin se puede crear utilizando u
n ventilador en el techo de la antesala que extraiga el rea de dentro del laborat
orio y lo empuje hacia la antesala. Esta antesala a presin positiva tiene a grand
es rasgos la misma funcin que tener todo el laboratorio bajo presin positiva. De l
orma parecida, se puede construir fcilmente una antesala a presin negativa para la
habitacin de postamplificacin haciendo que la turbina extraiga el aire de la ante
sala y lo sople hacia dentro del laboratorio. Esta antesala debe disponer de un
mtodo de sellado alrededor de la puerta que separe la antesala del laboratorio pa
ra evitar que el aire que est dentro del laboratorio vuelva a salir hacia la ante
sala. Un punto importante es que la puerta que conduce hacia la antesala desde f
uera y la puerta que comunica con el interior del laboratorio nunca deben abrirs
e a la vez. Un mtodo de seguridad adicional es aadir un suelo adherente en la entr
ada de cada antesala o laboratorio. El tamao de la antesala lo determina las acti
vidades que se llevarn a cabo en la misma. Las antesalas deben tener suficiente e
spacio como para permitir que por lo menos dos individuos entren o salgan del la
boratorio y se cambien las ropas de laboratorio a la vez. Adems, si se utilizan b
atas, gorros y cubrezapatos desechables especiales para el laboratorio, se neces
itar espacio para su almacenamiento. En cada uno de los tres laboratorios se llev
an a cabo diferentes actividades. La amplificacin m vitro nunca se lleva a cabo e
n los dos laboratorios de preamplificacin. Uno de estos ltimos se dedica a la prep
aracin de reactivos, y el otro al acceso y procesado de especmenes y al preparado

de la reaccin. En caso de que el espacio sea limitado, las dos habitaciones de pr

eamplificacin se pueden combinar en un solo laboratorio. Se recomienda altaMtodos de ayuda en el control de contaminacin
La introduccin de prcticas sencillas en las actividades ordinarias puede ser til en
el control de la contaminacin, tanto de las muestras c o m o de la amplificacin.
Se debe seguir estrictamente un flujo de trabajo unidireccional en el que el per
sonal lleve a cabo sus tareas primero en los cuartos limpios, y slo despus de comp
letar su trabajo se muevan a la habitacin de postamplificacin. Ningn personal que h
aya trabajado en el laboratorio de postamplifi-

CAPTULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

1335
cacin debe volver al rea de preamplificacin antes de ducharse y cambiarse de ropa.
Se recomienda el uso de batas de laboratorio, gorros y cubrezapatos de un solo u
so. Si se utilizan batas de laboratorio de tela, es necesario tener batas de lab
oratorio especiales para cada laboratorio, que deben mantenerse dentro de cada l
aboratorio y no se debe utilizar en las reas externas. El uso de batas con ditere
ntes colores para cada zona es una forma de recordar al personal el estricto flu
jo de trabajo. Otro factor importante en el flujo de trabajo del laboratorio es
la limpieza. El mtodo ms seguro es hacer que el personal del laboratorio guarde en
bolsas la ropa sucia de cada laboratorio y lo coloque fuera del mismo para ser
llevado a la lavandera. Si el personal de lavandera entra en los laboratorios, deb
e recibir las instrucciones de quitar primero la ropa sucia del cuarto de preamp
lificacin, despus del espacio de oficinas y despus de la sala de postamplificacin. N
o se recomienda proteger los mostradores de trabajo con papel absorbente que lle
ve plstico detrs, dado que el papel puede recoger polvo y, con l, material amplific
ado si no se cambia a menudo. Si se utiliza, este tipo de papel debe descartarse
de forma inmediata despus de cada uso. El uso de leja parece ser el mtodo ms acepta
do de descontaminar superficies. La descontaminacin de los mostradores, equipos d
e laboratorio y muebles debe llevarse a cabo enjuagndolos con una solucin fresca d
e leja al 10% y despus con una solucin de etanol al 75%, o incluso con agua para di
luir la leja que podra corroer las superficies. Todas las puntas de pipeta deben c
ontener un filtro hidrfobo para evitar cualquier contaminacin de la punta de la pi
peta con las plantillas o con el material amplificado. La evaluacin de la hidrofo
bicidad puede conseguirse haciendo que la pipeta aspire por encima de su lmite su
perior una solucin coloreada, para determinar entonces si la punta de la pipeta s
e ha teido. Las puntas de pipeta deben desecharse en bolsas de plstico sellables,
asegurndose de que las bolsas estn completamente selladas antes de desecharlas. Lo
s guantes se deben cambiar de forma peridica o tan pronto como se sospeche cualqu
ier contaminacin. Otro mtodo de prevenir la contaminacin por amplicones es tratarlo
s qumicamente de manera que no sean capaces de soportar amplificacin incluso si se
transfieren de forma accidental a otra muestra. La contaminacin por amplicones s
e identifica por la presencia de seal positiva en un control negativo. El amplicn
se puede destruir por vanos mtodos. El mtodo ms utilizado es por el uso de irradiac
in UV. El tratamiento con UV del ADN induce el entrecruzamiento de las dos cadena
s por formacin de dimeros de timidina. Este ADN entrecruzado ya no sirve como una
plantilla eficaz. Una desventaja del tratamiento con UV es que es ms eficaz cuan
do el amplicn es de ms de 700 nucletidos de largo, y muchas pruebas comerciales uti
lizan amplicones de tamao ms pequeo. Otro mtodo para inaclivar o esterilizar amplico
nes es por medio de la incorporacin de trifosfato de desoxiuridina en vez de trif
osfato de desoxitimidina en el amplicn durante la amplificacin (Udaykumar, 1993).
En este mtodo se incorpora al amplicn trifosfato de desoxiuridina en vez de timidi
na. Despus de la amplificacin, si este amplicn que contiene uracilo se transfiere a
ccidentalmente a otra muestra, el tratamiento de la muestra antes de la amplific
acin con uracil-rV-glucosilasa (UNG) dar lugar a la destruccin del amplicn que conti
ene uracilo. El amplicn que contiene uracilo es un sustrato para el UNG, mientras
que el ADN nativo que contiene timidina no lo es. El UNG elimina los residuos d
e uracilo del amplicn mientras que inicialmente deja intacta la estructura de fos
fodisler del amplicn. Sin embargo, durante el primer paso de desnaturalizacin del mt
odo de amplificacin, las uniones foslodisler se rompen en los puntos donde se loca
lizaron los residuos de uracilo. El amplicn fragmentado ya no es por tanto capaz
de actual como plantilla. El uso de UTP y de UNG ha demostrado ser eficaz si el
amplicn que contiene uracilo no supera las 10M0 copias por reaccin (Espy. 1993). T
ambin se han utilizado los isopsoralenos con cierto xito. Despus de la amplificacin,

la exposicin a la luz UV de onda larga produce uniones entre los isopsoralenos y

la citosina que existe en el material amplificado, haciendo ineficaz al amplicn
como plantilla para la amplificacin (Jinno, 1990).
7
les a travs de laboratorio y de vuelta hacia el rea administraliva. Es importante
que el servidor de la red se someta diariamente a copias de seguridad.
EQUIPAMIENTO
El equipamiento de laboratorio necesario para llevar a cabo con xito las actuales
pruebas diagnsticas moleculares puede incluir instrumentacin que no se suele enco
ntrar en el tpico laboratorio clnico. Incluso donde hay una superposicin, es import
ante que el laboratorio de diagnostico molecular contenga su propio equipo a fin
es de control de la contaminacin. En la Tabla 63-1 se proporciona una extensa lis
ta de equipo de laboratorio junto con sus precios aproximados. Algn equipo adicio
nal especializado no incluido en esta lista, que pudiera ser til dependiendo de l
a perspectiva del men de pruebas, comprende un secuenciador automtico de ADN (45.0
00-125.000 dlares), un termociclador en tiempo real de la reaccin de polimerasa en
cadena (PCR) (45.000-95.000 dlares), instrumentos de electroforesis capilar (50.
000 dlares) e instrumentacin para la cromatografa lquida de alta resolucin (20.000-40
.000 dlares).
PERSONAL DE LABORATORIO
Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnostico molecular se clasifica
n como laboratorios de pruebas de alta complejidad segn la enmienda de
,
,
Tabla 63-1 Necesidades y c o s t e s a p r o x i m a d o s de equipamiento Descr
ipcin Cantidad Coste' Termociclador de ADN Campanas de flujo laminar Refrigerador
/congelador Congelador sin escarcha manual de 20"C Congelador a 70"C Microcentri
fuga de cabeza angular. 14 O O O rpm Microcentrifuga horizontal. 14.000 rpm j Pl
aca lavadora de micropocillos Lector de placa de micropocillos Balanzas electrnic
as Medidor de pH Agitador/calentador de placas ! Bao de agua Alimentador de elect
ioloresis j Apralos de electroforesis mmi-PAGE Torres de moldeado de geles mini-P
AGE Sistema de fotodocumentacin Aparatos de electroforesis en gel de agarosa Proc
esador automtico de placas radiogrficas l Placas para aulorradiogratia (17 x 14 pu
lgadas) | Placas de autorradiografia (8x10 pulgadas) | Micropipetas normalizadas
(tres tamaos) Sistema do verificacin de temperatura para el termociclador Estacin
de trabajo de PCR Mezcladores por agitacin Sistema de pipetas neumticas Contador r
adiactivo Espectrofotmetro UV Contador Geiger Aparato secuenciador de ADN Aliment
ador para el secuenciador de ADN Hornos de hibridacin Computadoras y programas Ce
ntrifuga refrigerada de sobremesa Incubadora Bao de agua en seco Microcentrifuga
refrigerada T O T A L |^ "Los precios son slo aproximados 2 2 2 2
'
2 1

1
:>
:>
2 I 3 8 2 i 4 i 4 4 18 1 1 3 4
17 000$ 8 000$ 1.600$ 900$ 7000$ 3.200$ 2.500$ 6.500$ 7.500$ 2.000$ 1.000$ 500$
2.000$ 2.000$ 3.200$ 990$ 9 000$ 1.600$ 3.800$ 1.600$ 800$ 3.780$ 1.400$ 1.500$
750$ 800$ 2.500$ 8.000$ 485$ 1 600$ 2 000$ 4 000$ 10000$ 6 000$ 1 000$ 800$ 2800

$ 1 2 8 . 1 0 5 S
1
i
1
2 1 2 IA 1 i 4 1
La transferencia de papel entre los laboratorios y la parte administrativa const
ituye una preocupacin. Esto debe reducirse tanto como sea posible, en especial pa
ra el papel de trabajo utilizado en el laboratorio de postamplificacin. Es m u y
recomendable la instalacin de una red de ordenadores en el laboratorio con un cie
rto nmero de terminales en los diterentes laboratorios y en las reas administrativ
as para reducir o eliminar el movimiento de pape-

1336
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR individuos ganan experiencia en un rea de la medicina de labora

torio de rpido crecimiento, y esto les puede proporcionar una ventaja cuando busq
uen empleo en el futuro. Como parte de su adiestramiento en diagnstico molecular,
es importante para los residentes, becarios y estudiantes ganar experiencia en
cada una de las diferentes reas de pruebas, incluyendo las enfermedades infeccios
as, enfermedades genticas y cncer. El adiestramiento debe incluir los principios bs
icos de biologa molecular: experiencia manual en optimizar, validar y llevar a ca
bo pruebas de diagnstico molecular, en interpretacin de resultados de las pruebas
y en preparacin de informes para su revisin. Los directores de laboratorio deben f
amiliarizar a aquellos que se estn adiestrando con los diferentes temas de tratam
ientos del laboratorio.
mejora de laboratorios clnicos de 1998 (CLIA'88) (Bachner. 1988: CLIA'88.1992). E
sta ley impone unos requerimientos especficos de educacin y entrenamiento para el
personal que trabaja en estos laboratorios. Adems, es importante tener en mente q
ue estas pruebas no slo son ms complejas que las pruebas habituales de laboratorio
, sino que tambin algunas de ellas se han desarrollado dentro de los mismos. Es ms
. eslas pruebas se modifican constantemente para mejorar factores como la especi
ficidad, la sensibilidad, el tiempo de realizacin y el flujo de trabajo como resu
ltado de la introduccin de nuevas tecnologas.
Director del laboratorio
Segn CLIA'88. los directores de laboratorio de laboratorios de pruebas de alta co
mplejidad deben ser bien un MD o un DO con experiencia en patologa clnica o anatmic
a, un MD o DO con dos aos de experiencia en direccin o supervisin de un laboratorio
de pruebas de alta complejidad, o bien disponer de un grado doctoral en alguna
de las ciencias biolgicas y tener dos aos de experiencia supervisando un laborator
io de alta complejidad. Las responsabilidades del director de laboratorio son la
seleccin de pruebas, su implementacin y la resolucin de dificultades tcnicas. El di
rector de laboratorio es tambin el responsable del desarrollo de programas de lab
oratorio para la validacin clnica y analtica de las nuevas pruebas moleculares y el
desarrollo de guas y mtodos de accin que aseguren la realizacin fiable de las prueb
as clnicas. Adems, el director de laboratorio debe ser responsable del desarrollo,
implementacin y revisin del control de calidad y de los programas de calidad del
laboratorio.

Adiestramiento y acreditacin
La certificacin del nivel doctoral del personal que trabaja en los laboratorios d
e diagnstico molecular puede seguir varias rutas diferentes dependiendo del tipo
de grado doctoral, as como de otra experiencia en el adiestramiento. Una va abiert
a a los individuos que tienen bien un grado de licenciatura o que ya son doctore
s lo proporciona el Consejo Americano de Gentica Mdica (ABMG), que est destinado a
individuos que proporcionan servicios en gentica mdica. El Consejo Americano de Ge
ntica Mdica es un miembro del consejo americano de especialidades mdicas, que es la
organizacin "madre" de estas sociedades y que proporciona certificados en patolo
gia, pediatra, medicina interna, ciruga y aproximadamente otras 20 especialidades
mdicas. La certificacin en gentica consiste en un e x a m e n general seguido de un
examen de subespecialidad en gentica clnica, gentica mdica, citogentica clnica, gen
a clnica bioqumica o gentica clnica molecular. Para ser candidato a un certificado p
or el ABMG. un individuo debe cumplir los criterios en el rea de la certificacin d
eseada. Para la certificacin en gentica clnica molecular, el candidato debe poseer
un grado doctoral adecuado y haber completado dos aos de adiestramiento en un pro
grama acreditado. El candidato debe presentar un libro de trabajo de 1 5 0 casos
clnicos moleculares, haber completado una prueba en gentica clnica molecular y ten

er una lisia de competencia en varios mtodos firmada por el director del laborato
rio en donde se ha invertido la milad del tiempo del adiestramiento. El examen s
e ofrece cada tres aos Recientemente, el Consejo Americano de Especialidades Mdica
s aprob la solicitud de la Sociedad Americana de Patologa y de la Sociedad Amencan
a de Gentica Mdica con respecto a crear un certificado conjunto de su especialidad
en patologa gentica molecular. Los candidatos para este certificado deben tener u
n grado de MD o de DO, haber sido certificados por sus respectivos consejos, ten
er una licencia en vigor sin restricciones para practicar la medicina o la osteo
patia en EE.UU. y haber completado un ao de adiestramiento en un programa acredit
ado. Al da de hoy todava no hay programas acreditados, pero se ha anticipado que l
a primera aprobacin de un programa de adiestramiento tendr lugar aproximadamente e
n junio de 2000, con la aceptacin de los primeros candidatos tan pronto como en j
ulio de 2001. Se espera que el examen de candidatos para el certificado de la su
bespecialidad en patologa gentica molecular tenga lugar en el ao 2002. Las normas d
e adiestramiento en patologa gentica molecular estn siendo todava definidas por las
diferentes organizaciones que participan en el certificado. Adems del programa de
certificacin anterior, el Consejo Americano de Bioqumica Clnica (ABCC) ha aprobado
un programa de certificacin en diagnstico molecular que ser ofrecido por primera v
ez en junio de 2000. La ABCC es una corporacin independiente, sin nimo de lucro, q
ue certifica a profesionales con nivel de doctor en bioqumica clnica y bioqumica to
xicolgica. Las normas y regulaciones de la ABCC para certificar en diagnstico mole
cular se han establecido recientemente. Antes de la admisin al examen, el solicit
ante debe tener algn certificado en cualquiera de los siguientes consejos: ABCC.
Sociedad Americana de Microbiologa Mdica, Sociedad Americana de Patologa, Sociedad
Americana de Inmunologa de Laboratorio Mdico. Sociedad Americana de Bioanlisis o So
ciedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogentica. Los solicitantes deben c
umplir unos requisitos de experiencia y de formacin adems de proporcionar tres car
tas de recomendacin que certifiquen la experiencia profesional del solicitante, s
u duracin de experiencia en ese campo, y asi sucesivamente. El examen se realizar
dos veces al ao.
Supervisor tcnico
Segn CLIA'88. un supervisor tcnico debe cumplir uno de los siguientes criterios pa
ra calificarse para este puesto. El individuo debe poseer bien un MD o DO con un
ao de experiencia en un laboratorio de pruebas de alta complejidad, un grado de
maestro con dos aos de experiencia o un grado intermedio con cuatro aos de experie
ncia.
Tcnicos mdicos y tcnicos en biologa molecular
Los tcnicos mdicos y tcnicos en biologa molecular son los responsables de las tareas
necesarias para las operaciones diarias de la agenda de pruebas de laboratorio.
Son los individuos responsables del acceso y procesado de los especmenes, de lle
var a cabo diariamente las pruebas, mantener los registros adecuados de pruebas
y control de calidad, adherirse a los procedimientos escritos y a las polticas de
control de calidad, identificar problemas y documentar el mantenimiento de los
equipos. El mantenimiento de registros de los mtodos de laboratorio est complicado
por el hecho de que los mtodos desarrollados en el propio laboratorio se modific
an constantemente para mejorar el proceso de las pruebas. Adems, algunos instrume
ntos de laboratorio se usan solamente para las pruebas de diagnstico molecular y
existe poca experiencia del laboratorio clnico con ellas. Debido a estos factores
, es importante que el personal tcnico, y en particular el personal tcnico superio
r, tenga un alto sentido de entrega profesional y que muestre un constante inters
y esfuerzo en mejorar su educacin y adiestramiento Es tambin importante que adqui
eran todas las habilidades avanzadas de laboratorio que sea posible y que reciba
n un adiestramiento cruzado en la mayora o todas las diferentes pruebas que se us
en en el laboratorio. Es crucial para el personal tcnico comprender plenamente la
s bases cientficas de la metodologa y las aplicaciones e implicaciones clnicas de l
as diferentes pruebas moleculares.
Residentes, becarios y estudiantes graduados

La captacin de residentes, becarios y estudiantes de ltimos aos puede contribuir de

forma significativa al xito de un laboratorio de diagnstico molecular. El valor d
e estos individuos proviene de su alto nivel de entrega profesional y de su visin
acerca de la utilidad clnica de las pruebas individuales. Si tales individuos di
sponen de tiempo para trabajar en el laboratorio de diagnstico molecular, con fre
cuencia son capaces de desarrollar y validar rpidamente un nuevo mtodo de diagnstic
o molecular. A cambio, estos

CAPTULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

1337
El certificado de subespecialidad en diagnstico molecular est siendo ofrecido a in
dividuos con nivel no doctoral, incluyendo tcnicos mdicos y tcnicos de biologa molec
ular a travs de la Agencia Nacional de Credenciales para el Personal de Laborator
io (NCA). La NCA es una organizacin no lucrativa y no gubernamental que lleva a c
abo el certificado del personal de laboratorio. Los tcnicos mdicos y los tcnicos en
biologa molecular quedan certificados como especialistas de laboratorio en biolo
ga molecular [LSp (MB)]. Existen tres vas para llegar al examen de la NCA. En una,
los candidatos deben haber completado un mnimo de experiencia de trabajo de doce
meses en un laboratorio de diagnstico molecular con todos los servicios. Otra va
es haber completado un programa de licenciatura o poslicenciatura en biologa mole
cular patrocinado por una institucin o universidad acreditadas, que incluya seis
meses de experiencia de trabajo en un laboratorio de diagnstico molecular con tod
os los servicios. La ltima va es ser un cientfico de laboratorio clnico certificado
o equivalente y completar un programa de certificacin poslicenciatura en biologa m
olecular patrocinado por una facultad o universidad acreditadas y completar un e
quivalente de seis meses de experiencia a tiempo completo en un laboratorio de b
iologa molecular con todos los servicios. Este examen se ofrece dos veces al ao en
ms de 80 centros a travs del pas e incluso en centros extranjeros seleccionados. E
s probablemente deseable que todos los tcnicos que trabajen en un laboratorio de
diagnstico molecular con todos los servicios, en particular el personal tcnico sup
erior, dispongan de acreditacin en diagnstico molecular.
paso de la totalidad del mtodo es la responsabilidad del laboratorio que ofrece e
l test y se comenta ms adelante en otra seccin
Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares
La disponibilidad de sistemas automatizados para desempear pruebas moleculares va
en aumento. Estos instrumentos pueden desempear funciones nicas o mltiples en rela
cin con las pruebas moleculares. El ejemplo tpico de un instrumento automatizado d
e funcin nica es un termociclador, que lleva a cabo todos los pasos necesarios par
a la amplificacin de los cidos nucleicos. Otros instrumentos automatizados de func
in nica comprenden los extractores de cidos nucleicos, los sistemas automticos para
la preparacin y dosificacin de reactivos y los secuenciadores automticos de ADN. Ms
recientemente se han desarrollado tambin instrumentos automticos que realizan ms de
una funcin. Un sistema automtico introducido por sistemas moleculares Roche es el
analizador COBAS Amplicor. Este instrumento contiene un termociclador, un brazo
robtico cartesiano en tres dimensiones, bloques de calentamiento, estaciones de
lavado e incluso un lector de colorimetra. Se ha previsto que en un futuro prximo
estn disponibles instrumentos completamente automatizados que incluyan estas tres
funciones, as como la extraccin automtica de cidos nucleicos.
SELECCIN DE PRUEBAS FORMATOS DE PRUEBAS CLNICAS
Existen dos principales formatos de pruebas utilizados en la mayora de los labora
torios que realizan pruebas de diagnstico molecular. Los dos formatos son las pru
ebas propias desarrolladas por cada laboratorio, conocidas tambin como ensayos de
recela propia, y los basados en reactivos proporcionados en forma de equipo por
los fabricantes de sistemas mdicos.
Pruebas de desarrollo propio
Las pruebas de desarrollo propio son aquellos anlisis que se han desarrollado y v
alidado por completo en el laboratorio que las lleva a cabo. Por lo general, est
os anlisis utilizan una combinacin de reactivos que se compran por separado de dif

erentes fabricantes. Cada laboratorio determina las caractersticas de realizacin d

el anlisis para un estudio clnico y para una poblacin en particular de pacientes. L
a validacin analtica y clnica de la totalidad del proceso es responsabilidad de cad
a laboratorio.
Mtodos manuales basados en equipos
Con respecto a los mtodos manuales basados en equipos, el fabricante del sistema
mdico puede proporcionar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la pru
eba, o simplemente proporcionar reactivos de calidad controlada para llevar a ca
bo cualquier paso particular de la prueba. Un ejemplo del primer grupo es el equ
ipo para controlar la carga viral en pacientes infectados por el virus de la inm
unodeficiencia humana (VIH). Estos equipos proporcionan reactivos necesarios par
a todos los pasos del proceso de la prueba, incluyendo el aislamiento de los cido
s nucleicos, la amplificacin y la deteccin. Incluyen tambin informacin con respecto
a la sensibilidad, especificidad y limites de tolerancia para cada proceso clnico
en particular. Estos equipos pueden estar etiquetados por el fabricante como ap
robados por la Food and Drug Administralion (FDA), como despachados por la FDA,
solamente para uso de investigacin o para fines cientficos. La validacin analtica y
clnica de estos equipos por los diferentes laboratorios es diferente dependiendo
del etiquetado. Los mtodos de validacin sern analizados en una seccin posterior. Un
ejemplo de la segunda categora de mtodos basados en equipos son aquellos disponibl
es comercialmente para la extraccin de cidos nucleicos, reactivos de amplificacin q
ue comprenden controles y sistemas de deteccin para cidos nucleicos amplificados m
vilro. En algunos casos un laboratorio desarrollar una prueba molecular combinan
do dos o ms equipos de fabricantes iguales o incluso diferentes. La validacin analt
ica y clnica de cada
El objetivo principal del laboratorio de diagnstico molecular es proporcionar de
forma fiable y en tiempo adecuado resultados de pruebas referentes a muestras qu
e parecen ser importantes para la atencin de los pacientes. Cuando se considera q
u pruebas se deben ofrecer, se deben tener en mente algunas consideraciones clave
. Es importante que cualquier nueva prueba mejore de alguna forma el tratamiento
de los pacientes, y que esto sea adems eficaz con respecto al coste. Una nueva p
rueba puede proporcionar un mtodo ms barato o ms eficaz para diagnosticar o control
ar una enfermedad. Es importante que las decisiones referentes a elegir pruebas
se basen no solamente en el coste de realizar la prueba sino tambin en cmo la nuev
a prueba pueda afectar de forma global a los cuidados y atenciones del paciente.
Hay algunas circunstancias donde las pruebas moleculares puede que parezcan aum
entar el coste del tratamiento de los pacientes aadiendo una prueba nueva a la ba
tera ya existente de anlisis para un proceso clnico particular. Sin embargo, al int
roducir la nueva prueba, el tratamiento de los pacientes podra ser ms eficaz. Por
ejemplo, la introduccin de las pruebas de carga viral para el VIH-1 para controla
r la progresin de la enfermedad y la eficacia del tratamiento farmacolgico en indi
viduos infectados por VIH-1 han colaborado de forma significativa al tratamiento
de estos pacientes. Un gran nmero de pacientes inleclados por el VIH-1 estn siend
o tratados actualmente con una combinacin de entre dos y cinco frmacos diferentes,
que incluyen inhibidores de las proteasas y frmacos no-nucleosidicos. que han re
sultado ser muy eficaces en reducir la morbilidad y la mortalidad en un gran nmer
o de pacientes infectados por VIH-1. Sin embargo, estos frmacos son muy caros, po
r lo que es importante tener medios eficaces de controlar su efectividad si debe
n proporcionar el mximo beneficio al paciente. Sin pruebas de carga viral los clni
cos deberan basarse en recuentos de CD4 y en los sntomas clnicos, que pueden ser en
ambos casos marcadores poco sensibles de efectividad farmacolgica hasta que uno
se encuentra en las ltimas fases de la enfermedad por VIH (Ferreira-Gonzlez, 1995)
. El ejemplo anterior muestra el impacto sobre el tratamiento de los pacientes y
la introduccin de una nueva prueba, pero hay otros ejemplos en los que la rentab
ilidad se ve favorecida sustituyendo pruebas ya existentes de laboratorio. Esto
puede producirse si la prueba molecular proporciona una mejor sensibilidad o esp
ecificidad, o un tiempo de realizacin reducido que impacte directamente sobre el
tratamiento del paciente. Por ejemplo, el tratamiento de pacientes con una posib

le infeccin por Mycobacterium tuberculosis necesita que sean tratados con frmacos
que tengan una potencial toxicidad heptica y que sean aislados hasta que se confi
rme en el laboratorio el diagnostico de presuncin. La prueba habitual de laborato
rio de examinar directamente un espcimen del paciente buscando la presencia de My
cobacterium tubrculo-

1338
SECCIN V I I

P AIOIOGA MOLECULAR nerar una factura. Hasta hace poco slo exista un nUmero limitad
o de cdigos CPT para las pruebas de diagnstico molecular. Los cdigos originales ide
ntificaban mtodos generales que comprendan partes de un estudio molecular, como la
extraccin de cidos nucleicos, la digestin enzimtica, la amplificacin in vitro, y as
ucesivamente. Ms recientemente, se ha aadido un nmero de nuevos cdigos CPT especilic
os de prueba". Sesenta de estos nuevos cdigos son cdigos especficos de reactivos ut
ilizados para las pruebas moleculares microbilogos. Los cdigos especficos de anlisis
, como el que se utiliza para la deteccin del VIH mediante PCR, estn diseados para
incorporar todos los pasos, procedimientos y reactivos utilizados en el anlisis.
Tambin hay diferentes cdigos CPT para la deteccin del mismo microorganismo utilizan
do diferentes mtodos. Por ejemplo, la deleccin mediante una tcnica de sonda directa
frente a la deteccin mediante amplificacin in vitro o la cuantificacin del organis
mo necesitan cada uno un cdigo CPT dilerente. Para las pruebas moleculares sin un
cdigo CPT especfico del anlisis sigue siendo necesario utilizar una combinacin de cd
igos generales CPT de procedimiento. En la Tabla 63-2 se listan ejemplos de cmo s
e pueden facturar pruebas con cdigos CPT especilicos del anlisis y pruebas que tod
ava necesitan una combinacin de cdigos generales CPT d e procedimiento. Los niveles
de reembolso para cualquier prueba individual estn establecidos por los terceros
pagadores y pueden tener poca relacin con el coste real de llevar a cabo la prue
ba. En general, los terceros pagadores tienden a establecer niveles de reembolso
de acuerdo con las tarifas establecidas por Medicare y por Medicaid. Para la fa
cturacin de estas pruebas no se necesita la aprobacin de la FDA Recientemente, la
FDA ha ordenado que para las pruebas no aprobadas por la FDA, donde se utilizan
reactivos especficos del anlisis, y que incluyen esencialmente todas las pruebas m
oleculares, se debe aadir al informe una nota que indique que la prueba se desarr
oll, que sus caractersticas de capacidad se han determinado en el laboratorio y qu
e esta prueba no ha sido ni prohibida ni aprobada por la FDA. Algunos terceros p
agadores pueden negarse al reembolso de las pruebas que llevan u n a nota de est
e estilo, dado que creen que el coste de llevar a cabo tales pruebas debe ser so
portado mediante ayudas de investigacin, incluso aunque las caractersticas y la ut
ilidad clnica de la prueba hayan sido validadas por el laboratorio.
sis carece de sensibilidad pero es extremadamente rpida Por otro lado, el cultivo
es exquisitamente sensible, pero puede tardar hasta seis semanas en proporciona
r resultados. A la vista de este dilema, una prueba molecular que permita un dia
gnstico ms rpido con un mayor grado de sensibilidad y especificidad permitira interr
umpir un tratamiento farmacolgico y un aislamiento en aquellos pacientes que no t
ienen la enfermedad, reduciendo as los costes para el paciente y mejorando la ate
ncin mdica. La identificacin de las pruebas que se deben ofrecer en un centro mdico
es sobre todo la responsabilidad de los directores mdico y tcnico del laboratorio
de diagnstico molecular. A veces se puede ayudar en este aspecto revisando la lis
ta de pruebas que el cenlro mdico realiza fuera del mismo. En otros casos, indivi
duos clave como clnicos y patlogos pueden ser una fuente valiosa para identificar
las necesidades de un centro mdico en particular. Es importante para los director
es de laboratorio identificar claramente un rea donde exista una necesidad percib
ida de mejorar las herramientas disponibles para el diagnstico y el tratamiento d
e los pacientes. Durante el proceso de seleccin de pruebas, se debe llevar a cabo
un ajuste real de las capacidades tcnicas dentro del laboratorio con las necesid
ades del mundo clnico real en cuanto a volumen de las pruebas, tiempo de realizac
in necesario y costes asociados para llevar a cabo el anlisis. Una vez que se ha i
dentificado un anlisis en particular, se deben abordar los diferentes sistemas pa
ra llevar a cabo el anlisis. Por ejemplo, se puede utilizar la hibridizacin de tip
o Southern blot, mtodos de amplificacin in vitro de cidos nucleicos o incluso anlisi
s citogentico o de fluorescencia de hibridacin in situ (HISF) para realizar alguno

s anlisis. Asi. es importante tener en cuenta la condicin clnica y las ventajas e i

nconvenientes de cada uno de los diferentes sistemas para diagnosticar un proces
o clnico en particular cuando se hace la eleccin final. El establecimiento de un p
eriodo de pruebas para evaluar la utilidad clnica de una prueba en particular es
una importante herramienta. S se disea con cuidado, este perodo permitir al laborato
rio trabajar directamente con el usuario final de la prueba y proporcionar una va
para que estos individuos comprendan la utilidad clnica de la prueba y sus limit
aciones. Es importante definir con claridad las medidas que se puedan evaluar al
final del periodo del estudio clnico y que dar lugar en ltima instancia a la reali
zacin o exclusin de la prueba.
Codificacin CPT e ICD -9
La facturacin de las pruebas de diagnstico molecular siguen el mismo procedimiento
que cualquier otra prueba de laboratorio. Por lo general, se necesitan un cdigo
de terminologa de procedimiento de facturacin (CPT) y un cdigo diagnstico de la clas
ificacin internacional de enfermedades (ICD9). Ms all de esto, el procedimiento es
por lo general especfico de cada centro, basndose en los mtodos de facturacin manual
e informatizada que tengan lugar en la institucin. Es importante determinar por
anticipado la documentacin necesaria y los accesos informticos imprescindibles par
a gePatentes
La inmensa mayora de los sistemas de amplilicacin in vitro son procesos patentados
, y se debe obtener una licencia formal para el uso de estos procedimientos, o e
l laboratorio que los use ser susceptible de ser perseguido por inlraccin de paten
te. De forma tradicional, la licencia se obtiene para un procedimiento en partic
ular adquiriendo un conjunto de reactivos, aprobado por la FDA y vendido por un
fabricante que tiene la patente del proceso de amplificacin. Este abordaje es muy
limitado para las pruebas de diagnstico
Tabla 63-2
Facturacin de diagnstico molecular Cdigo CPT 83890 83898 83892 83894 83912 Nmero de
veces que se factura el cdigo CPT 1 Nombre o procedimiento de la prueba Aislamien
to de cidos nucleicos Amplilicacin con sonda Digestin enzimtica Electroloresis en ge
l Interpretacin e informe Aislamiento de cidos nucleicos Transcripcin inversa Ampli
ficacin con sonda Electroforesis en gel Interpretacin e informe VIH cuantitativo C
MV cuantitativo VHC cuantitativo
Nombre de la prueba Factor V Leiden por PCR-RFLP
I

t(9:22) por RT-PCR

83890 83902 83898 83894 83912 87536 87497 87522
1 2 2
1 1
t
VIH-1 carga viral CMV carga viral VHC carga viral
1
1

CAPTULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

133?
molecular, dado que existe un nmero muy limitado de pruebas que hayan sido aproba
das por la FDA. Asi. un laboratorio que utilice un proceso particular patentado
para pruebas clnicas debe primero negociar una licencia con el propietario de la
patente. Es m u y importante darse cuenta de que. dependiendo de la complepdad d
e la institucin que busca el acuerdo y de la complejidad del propio acuerdo, este
proceso puede tardar entre tres meses y un ao para obtener una licencia que perm
ita llevar a cabo y facturar el procedimiento con fines clnicos. Se deben tener u
nas consideraciones prcticamente idnticas con respecto al uso de informacin de secu
encias necesarias para disear un estudio molecular. El uso para fines clnicos de i
nformacin de secuencias para muchos genes de nuevo descubrimiento est frecuentemen
te patentado por los descubridores del gen, y el uso de la informacin de la secue
ncia sin una licencia incurre en las mismas responsabilidades de infraccin de pat
entes. Por desgracia, dado el actual medio y la diversidad de las fuentes de inf
ormacin de secuencias, no est siempre claro si la secuencia se ha patentado o quin
es el propietario de la patente. Es recomendable, antes de llevar a cabo desarro
llos de cualquier prueba basada en secuencias publicadas y donde se est pensando
destinar una gran cantidad de recursos, verificar con los investigadores que pri
mero descubrieron la secuencia el estado real de las patentes.
lizados de referencia, el Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (NIST) ha de
sarrollado uno de los primeros materiales normalizados de referencia de cidos nuc
leicos para las pruebas de identidad humana Ms recientemente, la Organizacin Mundi
al de la Salud (OMS) introdujo un material normalizado de referencia para la hep
atitis C para la validacin de pruebas de cidos nucleicos (NAT) para el estudio de
sangre y productos sanguneos. Estn disponibles en el comercio paneles de referenci
a calibrados con respecto al material de referencia normalizado de la OMS (Bosto
n Biomedica Inc, Boston, MA). Adems, se ha hecho un esfuerzo para desarrollar rea
ctivos de referencia para el VIH-1 tanto por la FDA como por otras diferentes co
mpaas. En ausencia de materiales normalizados de referencia, los laboratorios debe
n desarrollar su propio material de referencia para sus estudios de valoracin ana
ltica y para la posterior vigilancia de los resultados de la prueba. La creacin de
un material de referencia propio comprende el uso de mtodos establecidos de form
a independiente para determinar la concentracin de cidos nucleicos diana. De forma
alternativa, los laboratorios pueden llevar a cabo estudios que comparen sus re
sultados con otros mtodos ya establecidos. Por ejemplo, las muestras se pueden di
vidir para un estudio de comparacin con otro laboratorio que lleve a cabo una pru
eba molecular parecida. Las muestras utilizadas para la validacin analtica pueden
ser de disposicin propia o puede ser necesario obtenerlas de una fuente externa,
como de un laboratorio colaborador, una agencia gubernamental (centros para el c
ontrol y prevencin de enfermedades [CDC], FDA o el Instituto Nacional de la Salud
[NIH]) o incluso de un suministrador comercial. Una vez que se ha organizado un
grupo adecuado de muestras, la validacin analtica sigue las normas habituales uti
lizadas en otra clase de pruebas. La determinacin de la sensibilidad y linealidad
analtica se puede abordar llevando a cabo diluciones seriadas de muestras positi
vas para la diana que han sido estudiadas ya mediante otro mtodo, o analizando es
pecmenes diananegativos a los que se han aadido cidos nucleicos diana purificados,
microorganismos u otras clulas. La precisin de la prueba se valora haciendo determ
inaciones en un nmero de muestras de pacientes muchas veces en el mismo lote o en
diferentes lotes a lo largo de varios das. Las muestras utilizadas para los estu
dios de precisin deberan abarcar el rango lineal dinmico de la prueba. Al igual que
la precisin, la validacin de la linealidad puede llevarse a cabo utilizando diluc
iones seriadas de un espcimen positivo en un espcimen negativo. La valoracin de var

iables preanalticas. como lipidos. hemoglobina, bilirrubina. frmacos teraputicos y

anticoagulantes presentes en el espcimen, puede realizarse aadiendo estas sustanci
as a especmenes negativos a los que se ha aadido una cantidad conocida d e microor
ganismos, clulas o "diana" purificada (Lion. 1996). La validacin clnica requiere la
determinacin de dos probabilidades: la primera, la probabilidad de que si la mue
stra procede de un paciente con la enfermedad la prueba sea positiva (sensibilid
ad clnica); y segundo, la probabilidad de que si la muestra proviene de un pacien
te que no tiene la enfermedad la prueba sea negativa (especificidad clnica). La e
valuacin de la sensibilidad clnica necesita pruebas de una cantidad adecuada de mu
estras de pacientes que hayan sido diagnosticados de la enlermedad La especifici
dad clnica se determina analizando muestras de pacientes diagnosticados c o n una
enfermedad diferente que pudiera confundirse con la enlermedad indicada y que a
parezca en el diagnstico diferencial. Basndose de forma conjunta en la especificid
ad y sensibilidad clnica de la prueba, junto con el conocimiento de la prevalenci
a de la enfermedad, se pueden calcular los valores predictivos positivos y negat
ivos de la prueba y evaluar la probable utilidad clnica del anlisis. Desde el punt
o de vista prctico, la mayora de los estudios de validacin clnica son llevados a cab
o comparando la sensibilidad y especificidad clnica del nuevo mtodo frente a un gr
upo de muestras procedentes de la poblacin objetivo que han sido estudiados media
nte un "estndar oro" con respecto al sustrato analtico en cuestin. En algunos casos
, las pruebas moleculares han parecido ser ms sensibles y/o especficas que las act
uales pruebas "estndar oro". La resolucin de discrepancias entre la nueva prueba y
la que se usa actualmente como mtodo "estndar oro" puede en un cierto nmero de cas
os dar lugar a dilemas que necesitan la utilizacin de un mtodo molecular diferente
para resolver las discrepancias. Recientemente, la Association lor Molecular Pa
thology public un programa detallado de implementacin
VALIDACIN ANALTICA Y CLNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES
La implementacin de una nueva prueba clnica necesita que sea validada tanto analtic
a como clnicamente. Durante la validacin analtica se determinan la sensibilidad ana
ltica, la especificidad, la precisin y. para los estudios cuantitativos, la lineal
idad del mtodo. La sensibilidad analtica de la prueba es una medida del limite inf
erior de deteccin del mtodo en el sustrato diana. La especificidad analtica mide el
grado en el que la prueba reacciona de forma cruzada con cidos nucleicos que no
son la secuencia diana pretendida. La validacin clnica se centra en determinar la
utilidad clnica de una prueba positiva o negativa en una enfermedad especifica. E
s importante cuando se lleva a cabo la validacin clnica examinar una muestra trans
versal completa de los individuos que sern parte de la poblacin en la que se va a
utilizar la prueba. La CLIA'88 define importantes diferencias entre la implement
acin de una prueba aprobada por la FDA y una que no lo est. Los laboratorios que i
mplementan una prueba aprobada por la FDA slo necesitan verificar las caracterstic
as de capacidad de la prueba para las indicaciones en poblaciones parecidas a aq
uellas para las que ha establecido el fabricante. Por otro lado, la implementacin
de pruebas desarrolladas en el laboratorio necesitan una extensa documentacin de
la capacidad de la prueba, adems de los pertinentes programas de control de cali
dad, para asegurar la capacidad diaria de la prueba (Ferreira-Gonzlez, 1997). El
primer paso para introducir un anlisis molecular propio es optimizar cada paso de
l proceso analtico, lo cual incluye la extraccin de cidos nucleicos, amplificacin, d
eteccin, clculos e interpretacin de resultados. Cuando se optimizan por separado ca
da una de las fases, es importante darse cuenta de que en la mayora de los casos
ser necesario volver a optimizar cuando todas las lases se realizan de forma conj
unta. Despus de optimizar el anlisis, es importante valorar el impacto sobre las c
aractersticas de los resultados del mtodo de las diferentes variables preanalticas.
como la clase de espcimen, el transporte, el manejo y la conservacin de la muestr
a y las sustancias que interfieren, como lipidos, hemoglobina, bilirrubina y as s
ucesivamente. Despus de la optimizacin, los laboratorios deben llevar a cabo una v
alidacin analtica del mtodo. Esto puede ser difcil debido a la falta de normalizacin,
paulas y materiales normalizados de referencia para un gran nmero de cidos nuclei
cos diana. Esto impacta de lorma negativa sobre la capacidad de un laboratorio p
ara determinar la sensibilidad y precisin del mtodo. Diferentes organizaciones nac

ionales e internacionales estn dando pasos para desarrollar estndares, pautas y ma

teriales normalizados de referencia. Diferentes sociedades profesionales, agenci
as federales y organizaciones sin nimo de lucro han desarrollado pautas y normati
vas para los diagnsticos moleculares (Tabla 63-3). Con respecto a los materiales
norma-

1340
Tabla 63-3
SECCIN VII
PATOLOGA MOLECULAR
Guas y estndares de las pruebas de diagnstico molecular N o r m a s o estndares Dire
ccin
Organizacin NCCLS
MM1-P Meiodos de diagnstico molecular para enfermedades genticas NCCLS 940 West Va
lley Rd. M M 2 - A Anlisis de redisposicin de genes de mmunoglobulinas y Suile 140
0 receptores de clulas T Wayne. PA M M 3 - A Mtodos de diagnstico molecular para en
fermedades infecciosas 19087-1898 M M - 5 Anlisis de amplificacin de cidos nucleico
s para hematologa Wayne. PA molecular w w w nccls.org M M - 6 Diagnstico molecular
cuantitativo para enfermedades infecciosas M M - 7 Hibrdizacin in situ fluorescen
te para gentica mdica M M - 8 Medida e interpretacin de repeticiones de trinucleOti
dos Poltica de normas de estndares y pautas para los laboratorios de gentica clnica
ABMG/ABGC/ACMG. Hibridizacin in situ fluorescente de mterfaz prenatal Administrat
ive office. Declaracin de la ACMG sobre deteccin de marcadores mltiples en 9650 Roc
kville Pike. Bethesda. MD mujeres de 35 aos y mayores 20814-3998 Sndrome de X frgil
: pruebas de diagnstico y portadores Normas de almacenamiento y uso de materiales
genticos Normas sobre deteccin de marcadores mltiples en mujeres gestantes Normas
sobre el uso de pruebas de apolipoprotena E para la enfermedad de Alzheimer Punto
s a considerar: ticos, legales e implicaciones psicosociales de las pruebas gentic
as en nios y adolescentes Pruebas diagnsticas para los sndromes de Angelman y de Pr
ader-Willi Declaracin sobre deteccin poblacional para la mutacin BRCA-1 en muieres
judias ashkenazi Principios de deteccin: comunicado del subcomit sobre la deteccin
del comil de practica clnica de la Sociedad Americana de Gentica Mdica Comunicado so
bre pruebas en portadores de la enfermedad de Canavan Declaracin sobre pruebas ge
nticas para la fibrosis quistica Normas para la histocompatibilidad molecular y p
ruebas nmunogenticas ASHI PO Box 15804 Lenexa. KS 66285-5804 w w w nhgri.nih.gov/E
LSI/TFGT-linal
ACMG
ASHI
NIII-DOI
Grupo de trabajo de pruebas genticas que promueve unas pruebas genticas seguras y
efectivas en Estados Unidos: comunicado final del grupo de trabajo sobre pruebas
genticas
FDA
Das para la industria sobre la manufactura y valoracin clinica de pruebas m vitro
para detectar in vitro secuencias de acido nucleico del VIH-1 www.fda.gov/cber/g
dlns/nashivpdf Borrador de la gula para la industria y/o personal inspector de l
a FDA. normas previas a la comercializacin para anlisis en relacin con www.fda.gov/
cdrh/ode/1353pdl el virus de la hepatitis C (VHC) que estn indicadas para el diag
nstico o monitorizacin de la infeccin por VHC o enfermedades asociadas: borrador de
guias Recomendaciones para desarrollo y operatividad domstica de pruebas de diag
nstico molecular Guas para un control de mantenimiento de calidad para el anlisis d
e ADN Am J Clin Pathol 1999. 111 449 Crime laboratory Digest 1991; 18 44
AMP

Technical Working Group on DNA Analysis Methods

para la introduccin de la nueva prueba molecular (recomendaciones de 1999 de la A
MP). La Tabla 63-4 proporciona una lista de tareas para llevar a cabo el proceso
de pruebas clnicas.
Reactivos especficos del sustrato
El trmino reactivo analtico del sustrato (ASR) fue desarrollado por la FDA para re
ferirse a los reactivos utilizados en las pruebas clnicas que confieren especific
idad para detectar el sustrato objetivo. La FDA define los ASR como "anticuerpos
, monoclonales y policlonales. receptores especilicos. protenas, lgandos. secuenci
as de cidos nucleicos y reactivos similares que por medio de unin especifica o rea
ccin qumica con sustancias de un espcimen estn diseados para su uso en una aplicacin
iagnstica para la identificacin y cuantificacin de una sustancia qumica individual o
ligando en especmenes biolgicos". Las sondas y cebadores utilizados para detectar
ADN o ARN objetivos se consideran ASR. A fecha de
noviembre de 1998, los laboratorios clnicos que utilizan mtodos de tecnologa propia
que contienen ASR deben cumplir la normativa final d e la FDA acerca de ASR pub
licados en el Registro Federal. Como parte de esta norma final, los laboratorios
son requeridos para incluir una advertencia especfica en sus informes afirmando
que "Esta prueba ha sido desarrollada y sus caractersticas de capacidad determina
das por (nombre del laboratorio). No ha sido aprobada por la administracin de frma
cos y alimentos de Estados Unidos". Pero, al mismo tiempo, la FDA ha permitido a
los laboratorios que aadan a esta coletilla que la prueba que utiliza ASR no pre
cisa la aprobacin de la FDA, que la prueba se utiliza con fines clnicos y que el l
aboratorio ha sido certificado por la CLIA'88 para llevar a cabo pruebas de alta
complejidad. Adems de la definicin de los ASR, la FDA ha propuesto un coniunto de
controles y restricciones que deben aplicarse a su uso para asegurar su calidad
y uniformidad, y para aclarar que los laboratorios que desarrollan ensayos prop
ios son los responsables de vigilar las capacidades de la prue-

CAPITULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

1341
ba. De forma interesante, estos controles se aplican tanto a los laboratorios qu
e desarrollan ensayos propios que utilizan ASR como a los fabricantes de los rea
ctivos para estos ensayos. Se solicita a los laboratorios que cumplan
Tabla 63-4 Actividad
Llevando a c a b o el proceso d e p r u e b a s clnicas Consideraciones Trabajar
en el ambiente ms limpio Almacenar las soluciones de trabajo en alcuotas de un sol
o uso. Realizar control de calidad en cada nuevo grupo de reactivos antes de su
uso en pruebas clnicas Utilizar una muestra con un bajo nmero de copias para valor
ar la sensibilidad Preparacin de las mezclas patrn para reducir errores y variabil
idad. Establecer unos limites de tolerancia aceptables para cada tipo de espcimen
que se deba analizar (temperatura de almacenamiento, tiempo de transporte, anti
coagulanles, etc.) Distribuir protocolos para un adecuado manejo de las muestras
a todos los usuarios potenciales. Recoger informacin clnica y analtica en formular
ios Los especmenes deben ser recibidos y almacenados en el laboratorio de preampl
ificacin (limpio). Desarrollar pautas para asegurarse contra la mezcla de muestra
s y para mantener la integridad de la secuencia objetivo Valorar los mtodos de ex
traccin buscando la presencia de inhibidores y tactores que disminuyen el rendimi
ento del objetivo Control interno aadido a la muestra en el momento de la extracc
in para buscar falsos negativos debidos a inhibidores o determinar esta tasa por
algn otro mtodo Si no se va a evaluar un control interno con cada muestra de un pa
ciente, entonces la tasa de falsos negativos deberia figurar en el informe en un
a nota, en caso de que el resultado sea negativo. Optimizar las concentraciones
de cebadores MgCl.., dNTP; volumen; condiciones del ciclado y del sistema de det
eccin. Desarrollar pautas para reducir al minimo la posibilidad de contaminacin po
r el cido nucleico plantilla o el amplicn (vanse secciones del control de calidad)
Los controles deben procesarse de la misma forma que las muestras de los pacient
es Desarrollar pautas para organizar el anlisis y evitar la contaminacin cruzada d
e la muestra y los controles. Desarrollar guias para la interpretacin y los infor
mes La interpretacin debo ser realizada por lo menos por dos individuos y de form
a independiente. Desarrollar pautas para la distribucin de los informes.
los requisitos de certificacin de alta complejidad de la CLIA'88 y que determinen
las caractersticas de los mtodos propios siguiendo las regulaciones de CLIA'88 Lo
s fabricantes de ASR son requeridos para registrarse ante la FDA, para seguir la
s normas de buena manufactura y para que restrinjan la venta de esta clase de re
activo a los laboratorios certificados bajo la CLIA'88 para pruebas de alta comp
lejidad. Adems, los fabricantes son responsables de comunicar a la FDA cualquier
efecto adverso debido a fallos en el proceso de manufactura.
Preparacin de los reactivos
Limitaciones especiales en relacin con las pruebas genticas
Las pruebas genticas se llevan a cabo para el diagnstico y/o valorar el pronstico d
e trastornos de expresin fenotpica. para el diagnstico prenatal de enfermedades gent
icas, determinacin del estado de portador, y para realizar pruebas predictivas qu
e valoren la probabilidad del futuro desarrollo del trastorno gentico. Cuando se
ofrecen pruebas genticas se debe considerar un cierto nmero de limitaciones. La pr
imera es que una prueba pudiera no detectar todas las posibles mutaciones que pu
edan estar presentes en un gen en particular que produce una enfermedad. Entre e
jemplos de esto figuran el vasto nmero de mutaciones que se han identificado en e

l gen de la fibrosis qustica y los dos genes principales para el cncer de mama. As.
una prueba negativa pudiera no asegurar completamente que la persona examinada
no transporta una mutacin en un gen en particular. Al mismo tiempo, una prueba po
sitiva puede comportar diferentes riesgos para el paciente en relacin con diferen
tes frecuencias de penetracin del trastorno en los distintos pacientes. Debido a
la potencial complejidad con respecto a la interpretacin de resultados de pruebas
genticas, es recomendable que un laboratorio que considere ofertar pruebas gentic
as coordine estrechamente el desarrollo y la oferta de la prueba con el personal
profesional clnico que utilizar los resultados de las pruebas para el cuidado de
los pacientes. Una consideracin aadida en relacin con las pruebas genticas son los e
sfuerzos a niveles tanto estatal como federal para imponer restricciones especia
les en la realizacin de las pruebas genticas. Esto ha sido expresado de la manera
ms frecuente con la proposicin de normas que necesiten un especial consentimiento
informado de los pacientes antes de que su muestra pueda utilizarse en cualquier
prueba que estudie directamente el ADN del paciente en busca de mutaciones o po
limorfismos genticos. Es mas. estas normas propuestas podran restringir el uso de
todas las muestras de cualquier tipo para la investigacin o para controles de pru
ebas clnicas a menos que se haya obtenido un consentimiento informado especifico
para tal uso de lo que quede de las muestras de los pacientes. Esto hace preciso
que los laboratorios que se propongan ofrecer pruebas de consejo gentico estudie
n los requerimientos reguladores actuales de las autoridades tanto federales com
o estatales y de las sociedades profesionales pertinentes.
4. Recogida de especmenes I
2.
3.
Procesado de los especmenes
1.
2.
Anlisis del espcimen a Mtodo de extraccin
1.
b Organizacin del mCtodo, amplificacin y deteccin 2.
CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD DE LA CALIDAD
Control de calidad en el proceso de las pruebas
El establecimiento de pruebas de diagnstico molecular, en particular de los mtodos
de amplificacin, necesita una especial consideracin de cada fase del proceso, inc
luyendo la preparacin de reactivos, la recogida de muestras, la separacin de las m
ismas, la realizacin real del mtodo y la comunicacin de los resultados. Un mtodo de
laboratorio bien elaborado y correctamente escrito es un factor clave para asegu
rar que el mtodo es reproducible. Es una de las ayudas ms importantes durante el a
diestramiento prctico del nuevo personal o cuando el mtodo no se lleva a cabo con
mucha frecuencia. El protocolo del mtodo debe escribirse siguiendo guias especifi
cas del Comit Nacional de Normalizacin de Laboratorios Clinicos (NCCLS). como figu
ra en sus guas GP-A2 para escribir un manual de procedimiento tcnico de laboratori
o clnico. Para la interpretacin de los resultados es vital una cuidadosa seleccin d
e controles. Se utilizan varios tipos de controles durante la ejecucin d e un
Interpretacin e informe
1 2.

1342
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
mtodo para asegurar que un mtodo especfico funciona de manera adediferir en ms de un
par de minutos. Las fluctuaciones en los tiempos de ciclacuada. La CLIA'88 prec
isa controles positivos y negativos que deben llevarse do son un aviso de que el
termociclador necesita ser ajustado y restaurado a a cabo en cada prueba clnica.
El no ser capaz de obtener el resultado correcsu situacin original. Adems, el fun
cionamiento de las neveras y calentadoto para cualquiera de los controles invali
da la prueba y necesita que se vuelres junto con la uniformidad del bloque de te
mperatura tambin se deben verivan a estudiar todas las muestras. Siempre que ello
sea posible, los controficar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
La verificacin de la les positivos y negativos deberan parecerse al espcimen del p
aciente. Es uniformidad del bloque de temperatura se debe llevar a cabo utilizan
do un ms. un control positivo debera contener la secuencia diana de cidos nucleiter
mopar con una sonda trmica. cos a una concentracin clnicamente relevante en un tras
fondo de secuenOtros elementos importantes del equipo que se utiliza en prclicame
nle cias negativas de cidos nucleicos diana. El control negativo debe contener cu
alquier fase del anlisis son las pipetas. Se debe poner un nfasis especial secuenc
ias de cidos nucleicos que se espere estn presentes en una muesen su control de ca
lidad y en su mantenimiento, dado que pueden ser una tra negativa. Adems de los c
ontroles positivos y negativos, en cada anlisis importante fuente de error. Todo
el resto de equipo debe ser igualmente condebera incluirse un control "blanco" qu
e contenga todos los componentes de trolado y mantenido de acuerdo con las recom
endaciones del fabricante. la mezcla de reaccin a excepcin de cidos nucleicos. En c
ircunstancias Siempre que ello sea posible, el calibrado del equipo se debe llev
ar a cabo donde un resultado negativo influya de forma significativa sobre el di
agnstiutilizando normas certificadas o materiales de referencia certificados. co,
se debe incluir un control positivo interno. De otra forma, cuando se obtenga u
n resultado negativo, no estar claro si la ausencia de un amplicn se deElementos d
el programa de seguridad de la calidad be a la ausencia de la secuencia diana en
la muestra del paciente o si se debe Todos los laboratorios de diagnstico molecu
lar deben desarrollar un proa la presencia de inhibidores que supriman la reaccin
de amplificacin. Este grama de seguridad de la calidad exlenso y por escrito. El
objetivo del progracontrol positivo interno puede ser otro gen que siempre est p
resente en cada ma de seguridad de la calidad es vigilar y valorar, de lorma obj
etiva y sisteespcimen de ADN o ARN purificado del husped. De forma alternativa, po
mtica, la calidad y adecuacin de los resultados de las pruebas. El programa dra ser
una secuencia incluida dentro de la muestra de lorma especfica para de seguridad
de calidad (QA) debe tratar cada una de las lacetas del proceevaluar la inhibic
in del mtodo. Estos controles positivos internos son muy so de la prueba, desde la
fase preanalitica hasta la fase analtica y postanatiles para valorar la presencia
de cido nucleico amplficable. la ausencia de ltica del proceso. El programa debe i
ncluir unas polticas y documentacin inhibidores y si las reacciones de deteccin y a
mplificacin se llevan a cabo escritas de la educacin y el adiestramiento del perso
nal, educacin mdica de acuerdo con las normas. continuada, pruebas de eficiencia,
inspecciones internas y externas, incluEl aadir controles para juzgar la sensibil
idad de la reaccin tambin es yendo la documentacin o acciones correctoras de las de
ficiencias ciladas. importante. Se construyen tres o ms diluciones en las que no
se pueda programas de control de calidad para las pruebas clnicas, luncionamiento
del detectar la dilucin ms baja. Esle control es m u y til para vigilar no slo la e
quipo y seguridad. realizacin de la prueba a lo largo del tiempo sino tambin la pr
esencia de El programa QA vigila los aspectos de pruebas clnicas que n o inciden
niveles bajos de contaminacin del amplicn. directamente en la validacin analtica de
los resultados de las pruebas y que Es importante que los mtodos de desarrollo pr

opio implementen un prono son asi por lo general parte del programa del control
de calidad. Algunos grama de control de calidad para valorar la potencia, la pur
eza y la capacide estos parmetros son el tiempo mensual de rotacin, las revisiones
mendad de cada reactivo crtico utilizado en el proceso del anlisis. Cada reacsual
es de los resultados anormales y normales, el desarrollo de criterios de tivo cr
itico debe estudiarse antes de ser utilizado para pruebas clnicas. Se exclusin de
muestras, la revisin del registro de especmenes rechazados y deben establecer lmite
s de tolerancia para cada reaclivo crtico, Siempre los indicadores de calidad de
las pruebas. Adems, y como ya se ha mencioque ello sea posible, se deben establec
er los niveles de tolerancia utilizannado, el laboratorio debe participar en pro
gramas de estudio de eficiencia. do una medida cuantitativa para evitar una valo
racin sujetiva de la caliHay un cierto nUmero de pruebas para las que las diferen
tes asociaciones dad del reactivo critico. profesionales han desarrollado progra
mas de eficiencia. La Coitege ot Amencan Pathologists ofrece diferentes programa
s independientes y combinados Control de calidad del equipo de laboratorio para
el diagnstico molecular en enfermedades infecciosas, oncologa y Todo el equipo uti
lizado en los laboratorios de diagnstico molecular debe gentica. El programa de ef
iciencia en gentica se ofrece en colaboracin con tener un mtodo escrito de control
de calidad que describa para cada parte la American Cotlege of Medical Genetics.
Recientemente, el CDC ha hecho del equipo los mtodos de mantenimiento con sus re
gistros asi como sus disponible un programa de evaluacin de resultados para Mycob
acterium calibraciones. El mtodo de control de calidad debe estar escrito de acue
rtuberculosis y para el VIH-1. Para aquellas pruebas en donde no se ofrece un do
con las normas publicadas por la NCCLS. Al igual que con otro equipo programa o
ficial de eficiencia, se recomienda altamente que se establezcan de laboratorio
clnico, los lmites de tolerancia para juzgar la adecuacin de programas informales d
e eficiencia por medio del intercambio de muestras su funcionamiento y calibracin
clnica, que se debe utilizar durante las entre los laboratorios que ofrecen los
mismos sen/icios. pruebas clnicas, tambin deben estar claramente definidos y vigil
ados de manera peridica. Cuando las verificaciones de capacidad o calibracin caen
fuera de los limites de tolerancia definidos para cualquier equipo en ACREDITACIN
DEL LABORATORIO particular, el instrumento debe quedar inmediatamente fuera de
servicio para reparacin. Despus de la reparacin, el equipo debe ser calibrado antes
de volverlo a utilizar. Como parte del programa del control de calidad Pruebas
de laboratorios clnicos desarrollado en cada laboratorio, todo el equipamiento, r
evisiones, calibraLos laboratorios que realizan pruebas en especmenes humanos con
fines ciones y reparacin de cada parte del equipo deben estar documentados y de
diagnstico, prevencin o tratamiento de una enfermedad estn sujetos a guardados de a
cuerdo con la poltica del laboratorio de retencin de doculas regulaciones federale
s impuestas por CLIA'88. CLIA'88 establece normamentos. tivas diseadas para mejor
ar la calidad en los laboratorios y expande la Los termocicladores son un elemen
to crucial en cualquier laboratorio de supervisin federal a prcticamente cualquier
laboratorio clnico en EE.UU. Es diagnstico molecular que realiza amplificacin in v
itro. Cualquier cambio en importante sealar que los laboratorios que llevan a cab
o investigaciones no la capacidad de los termocicladores tiene un impacto direct
o en la precisin y estn sujetos a la CLIA'88 a menos que el laboratorio de investi
gacin expida sensibilidad del mtodo que se lleva a cabo con ese aparato. Al igual
que con resultados especficos a los individuos analizados, a sus familiares y a l
os cualquier otro instrumento, el mantenimiento, el control de calidad y el cali
mdicos que los tratan. Esto se aplica incluso si en el informe final hay colebrad
o de los termocicladores deben seguir las recomendaciones del fabritillas que es
tablezcan que los resultados de las pruebas deben utilizarse con cante. De forma
breve, y como parte de la vigilancia del funcionamiento de los fines de investi
gacin solamente, o que la prueba sea gratuita CLIA'88 protermocicladores, la dete
rminacin y documentacin del tiempo de ciclado, la porciona normativas especficas qu
e se aplican a lodas las reas del proceso verificacin del punto de error y cualqui
er mensaje de error deberan tambin de la prueba, adiestramiento del personal, prue
bas de eficiencia, control de quedar registrados. Los tiempos de ciclado entre d
iferentes lotes no deberan calidad y aseguramiento de la calidad. La legislacin y
sus regulaciones aso-

CAPTULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

1343
ciadas establecen un sistema de registro, as como sanciones y mtodos disuasorios p
ara asegurarse de que se mantienen las normativas establecidas por las normas fe
derales. Las regulaciones para implementar CLIA'88 fueron desarrolladas por el d
epartamento de salud y servicios humanos (HHS) a travs del servicio de salud pblic
a. Se ha asignado al CDC la tarea de clasificar la complejidad de varias pruebas
para sustratos analticos y para supervisar la implementacin de normativas. Recien
temente, esta responsabilidad se ha transiendo a la FDA. La FDA estaba encargada
de revisar y garantizar la seguridad y eficacia de las pruebas, y la administra
cin de finanzas sanitarias se destinaba a recoger tasas, expedir permisos, invest
igar a los laboratorios e iniciar acciones punitivas cuando era necesario. Bajo
CLIA'88. las pruebas se han dividido como obsoletas, de microscopia, de moderada
complejidad y de alta complejidad. La clasificacin de las pruebas en pruebas de
complejidad moderada y elevada se desarroll asignando una puntuacin numrica a cada
prueba Una prueba se considera como de complejidad moderada cuando recibe una pu
ntuacin de 13 o menos. Cualquier puntuacin superior se considera como altamente co
mpleja. El sistema de puntuacin tiene en cuenta algunos de los siguientes criteri
os: conocimientos necesarios para llevar a cabo la prueba, adiestramiento y expe
riencia, disponibilidad de calibraciones, control de calidad, pruebas de eficien
cia, caractersticas operativas, grado de interpretacin y JUICIO , y asi sucesivame
nte. Las pruebas de diagnstico molecular se consideran pruebas de alta complejida
d y. como tales, los laboratorios que llevan a cabo estas pruebas deben buscar l
a acreditacin del HHS. El HHS ha otorgado a la College ol American Pathologisls u
n nivel adecuado como agencia de refuerzo con respecto a estas normas aceptando
el programa de acreditacin de la sociedad como equivalente o ms estricto en reas de
control y aseguramiento de calidad que las normativas descritas en CLIA'88. Otr
as organizaciones, que tambin han recibido un nivel similar, incluyen la comisin s
obre acreditacin de laboratorios, la comisin conjunta de acreditacin de organizacio
nes sanitarias, la Asociacin Americana de Osteopata, la Asociacin Americana de Banc
os de Sangre (AABB) y la Sociedad Americana de Inmunogentica e Histocompatibilida
d. Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnstico molecular buscan en g
eneral la acreditacin a travs del programa de acreditacin CAP o de alguna de las de
ms organizaciones como un medio para cumplir las normativas reguladoras ya descri
tas. El CAP introdujo en 1993 una lista de patologa molecular que ha sido puesta
anualmente al da desde entonces. Adems, la lista de revisin de patologa molecular co
nstituye un buen recurso cuando se est desarrollando un laboratorio de diagnstico
molecular con respecto al desarrollo de control de calidad, programas de asegura
miento de calidad, requisitos de los especmenes, misin de informes y temas similar
es.
CONCLUSIN
Los mayores conocimientos y las mejoras en la tecnologa han facilitado el rpido de
sarrollo de nuevas pruebas moleculares que ya se han hecho habituales en la prcti
ca mdica (p. ej.. carga viral del VIH-1. pruebas de ADN para enfermedades genticas
). La secuenciacin del genoma humano, que lleg a ser una prioridad nacional con la
creacin del Proyecto Genoma Humano de fundacin general, se anticipa que estar comp
leta para el ao 2002 2003. Ms recientemente, diferentes compaas privadas (Ciencias d
el Genoma Humano, Millenium Pharmaceuticals, Incyte Pharmaceuticals y Celera Gen
omics) se han unido a los esfuerzos de secuenciar el genoma humano. Adems, la cre
ciente disponibilidad de tecnologa fiable de alto nivel, como los secuenciadores
automticos de ADN, la PCR en tiempo real y los chips de ADN (Kunan. 1999). y asi
sucesivamente, debera afectar de forma drstica a las pruebas de diagnstico molecula
r, proporcionando una tecnologa ms slida, un menor tiempo de ciclado y una reduccin

de los costes. Las ciencias clnicas y bsicas se combinan para identificar nuevos m
arcadores moleculares que se puedan utilizar para el diagnstico de enfermedades i
nfecciosas, genticas y neoplasias, asi como para la ciencia forense y la tipifica
cin de tejidos. Analizando cambios sutiles en los genes y/o la expresin de los mis
mos cuando una clula se infecta por un virus o se transforma, es posible ganar un
a informacin importante no solamente para ayudar al diagnstico sino tambin para el
pronstico o incluso vigilar la progresin de la enfermedad. Los actuales esfuerzos
en la estadificacin molecular de las neoplasias tanto slidas como hematopoyticas ap
untan en esta direccin. Adems, el nuevo campo de la farmacogenmica. que busca inter
pretar la influencia del polimorfismo gentico sobre la eficacia y/o efectos secun
darios de los agentes teraputicos, tendr un tremendo impacto en la futura atencin s
anitaria. El diagnstico molecular esta todava en su infancia. El crecimiento y los
cambios en este campo sern una caracterstica habitual en las pruebas clnicas y en
un futuro previsible.
BIBLIOGRAFA
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UNG lo avoid carryover contamination in RNA-PCR. Nucl Acids Res 1993; 21:3917-39
18.
Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad
Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de identidad con ADN o estudios foren
ses con ADN tambin deben estar acreditados para estos fines. Un medio de obtener
la acreditacin es a travs de un programa ofrecido por la Sociedad Americana de Dir
ectores de Laboratorios Forenses (ASCLD) ASCLD ofrece un programa de acreditacin
de laboratorios criminales. Esta acreditacin es un programa voluntario en el que
puede participar cualquier laboratorio forense que realice anlisis con ADN para d
emostrar que sus procedimientos, operaciones, personal, mtodos, equipo, plan de s
eguridad fsica y mtodos de seguridad cumplen con las normas propuestas por el grup
o tcnico de trabajo sobre mtodos de anlisis de ADN (TWGDAM). El Centro Nacional de
Tecnologa en Ciencia Forense (NFSTC) ofrece ayuda a los laboratorios forenses que
se estn preparando para la acreditacin ASCLD/Lab .adems de proporcionar certificad

os a los laboratorios de ADN que cumplen con las guias de la TWGDAM. Adems, la As
ociacin Americana de Bancos de Sangre ha desarrollado pautas para las pruebas de
paternidad que utilizan ADN y ofrece a travs de su organizacin acreditaciones adec
uadas. El programa de acreditacin en pruebas de paternidad se basa en normas para
realizar las pruebas de paternidad y cuida de la acreditacin y valoracin de los l
aboratorios que realizan estas pruebas. Hay ms de 40 laboratorios acreditados por
la AABB para pruebas de paternidad. Esta acreditacin ayuda a los laboratorios a
conseguir un control de calidad.

C A P T U L O
64
Oncoproteins y deteccin tumoral precoz
Matthew R. Pincus, M.D., Ph.D. Paul W. Brandt-Rauf, M.D., Ph.D., D.P.H. William
Koslosky, M.D. William Appruzzse, Ph.D.
BIOLOGA CELULAR Y MITOGNESIS Marcadores tumorales ONCOPROTENAS EN LA DETECCIN TUMORA
L Factores de crecimiento Receptores de factores de crecimiento Protenas G Oncopr
otenas nucleares
1344
EVALUACIN Y CONCLUSIONES Eficacia diagnstica de las oncoprotenas del suero
1351
1345
Orgenes de los tumores malignos Tamao tumoral y niveles de oncoprotena
BIBLIOGRAFA
1353
Deteccin de tumores mediante la medicin de la protena p53 Anticuerpos anti-p53 circ
ulantes en la deteccin tumoral
un proceso de p a s o s mltiples que c o m i e n z a en la m e m b r a n ac e l u
l a rc o m o resultado de la activacin de un r e c e p t o r de f a c t o r de c
recimiento, q u ea c t i v a entonces a otras protenas citoslicas y de m e m b r a
n a y a molculas s e g u n das m e n s a j e r a s que transducen la "seal" mitogn
ica hacia el ncleo. Vas de transduccin de seales. S eh a n podido a c l a r a ra l g
u n o s Marcadores tumorales pasos en la "via de transduccin de seales" implicado
s en la transduccin de la seal iniciada por el f a c t o r de c r e c i m i e n t
o y que va h a s t a el ncleo, p e r o El c o n t r o l del p r o c e s od e la d
ivisin celular en las clulas eucariticas. en u c h o s otros pasos n o estn c o m p
l e t a m e n t e aclarados. U n a va bien estaespecial en las f o r m a s superi
ores de vida, es vital para los p r o c e s o s de proli- m blecida se r e s u m
e en la Figura 64-1 para la va sealizadora mitognica induferacin y diferenciacin cel
ulares. El delicado equilibrio entre estos dos procida p o r el oncogn ras. E s t
a figura m u e s t r a que c u a n d o un r e c e p t o r de faccesos est regula
do por numerosas protenas que interactan en la clula t o r de c r e c i m i e n t o
se activa p o r su f a c t o r de crecimiento, a c t i v a a su v e z para aseg
urarse de que ste se mantiene. Casi todas estas protenas, muvaras protenas intermedi
arias (grb-2 y SOS) que activan la i m p o r t a n t e proc h a s de las cuales
son crticas en la regulacin del ciclo celular, estn codifis t a proteina c a d a sp
o r oncogenes. L a sm u t a c i o n e se n los o n c o g e n e sp u e d e n res
ultar e n tena G (esto es, la protena ligadora de GTP) lamada ras-p21. E de 21 kDa
unida a la m e m b r a n a , que c o n t i e n e1 8 9 aminocidos, se a c t i v a
la produccin de protenas que, o bien se activan de f o r m ap e r m a n e n t e p
ara c u a n d o la protena SOS la i n d u c e para ligar GTP en l u g a r de GDP.
En su e s t a e s t i m u l a r el crecimiento celular y su proliferacin ( c o m
o la protena p21 codido activado (unida a GTP) ras-p21 activa directamente a ras
(Moodie. 1993: f i c a d a por el gen ras), o q u e d a n inactivas para inhibi
r la proliferacin celular Slokoe, 1994), q u e a su v e zi n d u c e nu n ac a s
c a d a secuencial de proleincina( c o m o la protena p53). A m b o s sucesos dan
lugar a clulas tumorales maligsas: e s t o es, M A Pc i n a s a (MEQ) y la cnasa
a c t i v a d a por mitgenos ( M A P ) nas. El c o n o c i m i e n t on o slo d e

la existencia de e s t o so n c o g e n e s y de las codificada p o re lg e n ER

K, c o m os em u e s t r ae nl a Figura 64-1. L aM A Pc i n a oncoprotenas codifi
cadas p o r ellos, sino tambin de los m e c a n i s m o s mediansa activa directa
mente los factores de transcripcin nuclear, s i e n d o ios u n od e te los c u a
l e s ejercen sus efectos, ha d a d ol u g a rau n a sn u e v a s series de ans
t ai m p o r t a n t e protena f o r m a un c o m p l e j o heterodimrico c o no t
r o lisis a l t a m e n t e sensitivos, tanto d el o so n c o g e n e sm u t a
d o sc o m od e sus pro- ellos. E factor de transcripcin nuclear, jun. que se act
iva d i r e c t a m e n t ep o r la cinasa, tenas m u t a n t e s codificadas. Lo
s mtodos que utilizan la amplificacin, c o m o la reaccin en c a d e n a de polimer
asa (PCR) para los o n c o g e n e s mutados, se un cinasa (jnk). El complejo los
-jun. lamado tambin AP1, se une a las region e s especficas del ADN genmico, i n d
u c i e n d o la transcripcin de protenas e x p o n e n en otro p u n t o de e s t
e texto. En este captulo v e r e m o s cmo la detecmitognicas tales c o m o las ci
clinas. De f o r m a interesante, la transcripcin d e cin de estas protenas oncognic
as, u oncoprotenas. que se encuentran en e s t a s protenas se bloquea por la prot
ena antioncogn p53 (Fig. 64-1), que a e ls u e r od el o sp a c i e n t e sc o nt
u m o r e s malignos, permite diagnosticar u n o m o baxy waf. t u m o r maligno
, a m e n u d o en una fase p r e c o z del desarrollo tumoral. D e b i d o su v
ez induce la transcripcin de protenas antimitticas tales c q u ei n d u c e n la ap
optosis. a que el hallazgo de niveles elevados de cualquiera de estas oncoprotena
s o f o r m a sm u t a d a s de e s t a s protenas en el suero de un ser h u m a
n o indica la En la Figura 64-1 se presentan tambin otras diferentes protenas n u
c l e a presencia probable de un t u m o r maligno, nos referiremos en e s t a c
aptulo a res importantes codificadas p o r oncogenes tales c o m o myc. u n a pro
tena d e estas protenas c o m om a r c a d o r e s tumorales. 64 kDa que se sobree
xpresa en el linfoma de Burkitt. E s t e oncogn protenico no est directamente en la
va ras de transduccin de seal. De f o r m a inteLa oncogenesis, el p r o c e s o p
or el que las clulas n o r m a l e s se convierten resante, h a y lneas celulares
que. c u a n d o se transfectan bien con el oncogn en malignas, c o m p r e n d e
mltiples pasos, que se p u e d e n clasificar grosso ras o con el oncogn myc. n o
sufren transformacin celular, pero c u a n d o se modo c o m o iniciacin tumoral
y promocin tumoral. La propia mitognesis es BIOLOGA CELULAR Y MITOGNESIS

CAPTULO 64

ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

1345
Figura 64-1. Esquema de algunos de los componentes conocidos de la va de transduc
cin de seales ras empezando (arriba, a la izquierda) cuando un faclot de crecimien
to se une a su receptor celular. El resto de los acontecimientos se explican en
el texto. Abreviaturas: grb-2 = protena adaptadora que une a la vez p2l y la prot
eina o t a c t o r de intercambio de nucletidos de guanina. SOS: protena ras-p2i.
definida en el texto: PLC = fosfolipasa C; DAG = diacil glicerol: PKC = proteina
cinasa C; IP3 = mositol trifosfato: rat-\ = protena codificada por el oncogn p74.
que funciona c o m o cinasa que fosforila otra cinasa de p e s o molecular 43 k
Da. lamada MAP-2 cinasa cinasa. MEK. o M A P K K en la ligura: MAP-2 kinasa = pr
oteina cinasa activada por mitgenos o protena cinasa-2 asociada a los microtbulos (
MAP-2K en la figura); GAP = protena activadora de GTPasa [GAP], que promueve la h
idrlisis del GTP a GDP unido a p2l : myc. tos y un = oncogenes nucleares que codif
ican protenas nucleares; NMP = protenas de la matriz nuclear
transfectan a la vez con ambos oncogenes. experimentan transformacin celular. Est
os resultados indican que ras y myp pueden ser interdependientes, y son un excel
ente ejemplo prototipico de la naturaleza multifsica de la oncogenesis. Una carac
terstica central de los fenmenos de transduccin de seal que se resumen en la Figura
64-1 es que las cascadas de activacin estn ordenadas y se encuentran bajo un estri
cto control regulador. Asi. por ejemplo, mientras SOS activa a ras-p21. la proten
a activadora de GTPasa (GAP) induce la hidrlisis del GTP unido a ras-p21, dando l
ugar a su inactivacin (Fig. 64-1). El M E K activado regula a la baja a SOS, dism
inuyendo el intercambio GDP; GTP por ras-p21 (Holt. 1996). Si una o ms protenas de
vas como la que se muestra en la Figura 64-1 mutan de manera que no se puedan re
gular a la baja, es posible que se produzca una seal mitognica continua que en ltim
a instancia de lugar a neoplasia. Cuantas ms mutaciones de este tipo se produzcan
, mas probable es que la clula sufra una transformacin maligna. As, lesiones progre
sivas en la via mitognica pueden corresponder con las mltiples fases de la carcino
genesis. La Tabla 64-1 resume los mecanismos por los que cada tipo de elemento d
e transduccin de seal ha resultado inducir la transformacin celular, empezando por
los factores de crecimiento, progresando a los receptores de factor de crecimien
to, despus a las protenas G y a las cascadas de cinasas. y finalmente a las protena
s nucleares. Estos mecanismos se explican con ms detalle en cada seccin de este ca
pitulo destinada a estas diferentes protenas de transduccin de seal.
Bioscience (Houston. TX) y Matritech (Newton. MA) Diferentes estudios utilizan t
ambin la tcnica de Western Blot o de Inmunoblot. como se ha descrito en otro captul
o de este libro. Numerosos estudios han documentado alteraciones en los oncogene
s, oncoprotenas o expresin de factores de crecimiento en lo que se refiere tanto a
cido ribonucleico mensajero (ARNm) o protenas, en tejido tumoral en comTabla 64-1
M e c a n i s m o s para la induccin de la carcinogenesis por e l e m e n t o s d
e la va mitognica Mecanismo de accin a) Sobreproduccin desde la clula y hacia sus pro
ximidades b) Interaccin con factores de crecimiento con receptores de elevada afi
nidad a) Sobreexpresin que conduce a elevadas concentraciones de dimeros b) Prdida
del dominio extracelular que da lugar a una dimerizacn permanente del receptor de
l factor de crecimiento y a una produccin continua de seales c) Sustituciones de a
minocidos en el dominio transmembranoso que dan lugar a una dimerizacin permanente
a) Sobreexpresin de proteina normal b) Sustituciones de aminocidos que cambian de
forma permanente su conformacin a una lorma activada c) Mutaciones que eliminan

dominios reguladores de las cinasas a) Sobreexpresin de las protenas de transcripc

in y replicacin b) Mutaciones de protenas antioncognicas que las mactivan c) Mutacio
nes que eliminan dominios requladores
Elemento de la via 1 Factores de crecimiento
2. Receptores de factores de crecimiento
ONCOPROTENAS EN LA DETECCIN TUMORAL
La deteccin de protenas muladas de Iransduccin de seal o de niveles elevados de prot
enas de tipo "salvaie' en el suero o en los lquidos corporales es altamente sugere
nte de neoplasia: por tanto, se dispone ahora de muchos anlisis para diferentes o
ncoprotenas en forma de kit. incluyendo determinaciones de inmunoabsorcin ligada a
enzimas (ELISA) para los factores de crecimiento como el factor- transformador d
e crecimiento (TGF-a) y factor de crecimiento fibroblslico (FGF). las protenas EGF
r y neu/HER-2. ras-p-21 del receptor de factor de crecimiento y las protenas nucl
eares p53. myc y NMP22 de compaas tales como Oncogene Science (Uniondale. NY). Tri
tn
3
Protenas ciloslicas protenas G y cinasas
I 4 Oncoprotenas nucleares

1346
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR la actividad de TGF-ji es escasamente detectable, sugiriendo q

ue el tumor era la fuente de los niveles elevados del factor de crecimiento del
suero. De forma interesante, en muchos pacientes con carcinoma hepatocelular se
ha observado que TGF-|i est elevado en orina (Tsai. 1997). El uso de un ELISA con
un anticuerpo monoclonal dirigido contra TGF-|j. ha revelado que TGF-p\ est elev
ado en una gran proporcin de pacientes con un cncer de vejiga invasivo pero no en
pacientes con tumores de vejiga no invasivos ni en pacientes sin cncer (Klocker,
1994). Recientemente, se ha descrito un nuevo marcador tumoral para el cncer de v
ejiga que parece ser ms exacto para detectar los cnceres de vejiga tanto invasivos
c o m o no invasivos, y que es la protena de matriz nuclear NMP22. detectada en
orina y de la que se habla ms adelante. Asi, los estudios sricos en busca de TGF-|
i son muy utiles para diagnosticar y hacer seguimiento de carcinomas hepatocelul
ares. Son menos tiles para el diagnstico de carcinoma de vejiga aunque, para el cnc
er de vejiga invasivo, este factor de crecimiento tiene una elevada sensibilidad
y especificidad. TGF-u ha resultado estar elevado en un gran nmero de pacientes
con tumores de clulas epiteliales (Chakrabarty, 1994: Katoh, 1990), de forma pred
ominante en m a m a (casi el 100%), pulmn, estmago, colon e higado. A diferencia d
e ellos, los individuos normales tienen unos niveles sricos m u y baios. En lo qu
e se refiere al higado. TGF-u ha resultado estar elevado en el suero de paciente
s con carcinoma hepatocelular. pero no en pacientes con cirrosis. Los niveles el
evados se redujeron en los pacientes que se habian tratado por un carcinoma hepa
tocelular (Tomiya. 1996). Estudios recientes confirman que TGF-u es un predictor
eficaz de la produccin de tumores malignos en una fase precoz. Por ejemplo, de 3
6 pacientes que tenan una historia de asbestosis y que posteriormente desarrollar
on un cncer, sobre todo un adenocarcinoma o un carcinoma pulmonar de clulas escamo
sas, ms de un tercio resultaron ser seropositives para TGF-u. L a s muestras sang
uneas de todos estos pacientes se recogieron y despus se guardaron en el momento d
el diagnstico de la asbestosis y antes del diagnstico de un tumor maligno. De form
a significativa, todos salvo uno de estos pacientes seropositives resultaron ten
er niveles elevados de TGF-u en la sangre almacenada (Brandt-Rauf. 1998). TGF-u
parece ser as un excelente marcador para la presencia de tumores malignos. A dife
rencia del caso de TGF-p. estas elevaciones no son tumor-especficas. Aun as. parec
e claro que TGF-u es extremadamente til como herramienta de deteccin en pacientes
en los que se busca un lumor maligno.
paracin con el tejido normal (Pimentel. 1989: Brandt-Rauf. 1998). Diferentes estu
dios han estudiado las oncoproteinas o la expresin de factor de crecimiento en lqu
idos biolgicos tales como orina o derrames, y han demostrado la posibilidad de ut
ilizar estos pptidos y protenas como marcadores para la presencia de neoplasia (Ni
man. 1985; Yeh. 1989). Los siguientes estudios han confirmado estos hallazgos in
iciales, dando lugar al uso clnico de estos marcadores para detectar la presencia
de tumores malignos. El enfoque de este captulo se centrar por tanto en la identi
ficacin de diferentes oncoproteinas y factores de crecimiento en el suero, plasma
u orina de pacientes con cncer o con riesgo de desarrollar un cncer. En la Tabla
64-2 se presenta un resumen de algunos de los muchos (ms de 50) oncogenes conocid
os y sus funciones en la clula. Aquellos de la Tabla 64-2 para los que se dispone
de algn mtodo comercial se marcan con un asterisco.
Factores de crecimiento
Dado que varios factores de crecimiento parecen tener una funcin en la proliferac
in celular durante la tumorognesis. y dado que los factores de crecimiento son seg
regados de forma activa al medio extracelular. son potencialmente objetivos atra
ctivos para su deteccin en la sangre durante el desarrollo del cncer. Hasta la fec
ha, son vanos los esludios que han sido capaces de demostrar diferencias en los

niveles sanguneos de factores de crecimient o entre los pacientes con cncer y los
pacientes control que no lo tienen. Factor transformador de crecimiento (TGF) a
y 13. TGF-u es un polipptido con 50 aminocidos que se une al receptor EGF. que se
dimeriza tras unirse con EGF. TFG-|i es una familia de protenas etiquetadas desde
|S. hasta |i . TGF-|, es un homodimero de dos subunidades de 12 kDa unidas por p
uentes disulfuro. Mientras que TGF-p" ha resultado ser elaborado por muchos tipo
s diferentes de tumores humanos malignos, se han encontrado niveles sricos elevad
os de este factor de crecimiento de forma predominante en tumores hepticos y de v
ejiga. Curiosamente, se ha encontrado que TGF-|) inhibe la mitosis de ciertas li
neas celulares especificas en cultivo, tales como las clulas epiteliales bronquia
les del visn. Asi. el suero de los pacientes que tienen tumores que elaboran este
factor de crecimiento se puede analizar en su busca midiendo el grado de inhibi
cin de crecimiento celular.
s
La actividad TGF-ji. determinada por medio de esta tcnica, ha resultado estar not
ablemente elevada en pacientes con carcinoma hepatocelular pero no en pacientes
control de la misma edad (Shirai, 1992). En el suero de los pacientes que se han
sometido a una reseccin quirrgica de estos tumores,

CAPTULO 64

ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

1347
Factores de crecimiento derivados de las plaquetas. El factor de crecimiento der
ivado de las plaquetas (PDGF, una protena de un peso molecular de 28 kDa, exisle
como un dmero de cadenas A y B. en forma de dmeros A-A. A-B o B-B. Cada cadena se
puede glucosilar aumentando su masa molecular hasta 30 kDa. Este factor de creci
miento, que se aisl originalmente de plaquetas, se une a un receptor de factor de
crecimiento transmembranoso. La cadena B se codifica por el oncogn sis. Se ha en
contrado que es un potente mitgeno en lineas celulares linfoides. mieloides y de
fibroblastos. Tambin se ha estudiado en la sangre de pacientes con cncer. De forma
global, este factor de crecimiento ha resultado estar elevado de forma signific
ativa en ms de un 15% de pacientes con carcinomas, sarcomas y linfomas. pero en n
inguno de los individuos normales. En pacientes con cncer de mam a exisle una exc
elente correlacin entre la fase del tumor y el nivel srico del factor de crecimien
to (Ariad. 1991). Los niveles ms elevados predijeron supervivencias ms cortas. Fac
tor de crecimiento fibroblstico bsico. El factor bsico de crecimiento fibroblstico (
bFGF) es una protena que contiene 155 aminocidos. Es un factor de crecimiento para
las clulas mesenquimales, pero tambin tiene concentraciones relativamente elevada
s en el sistema nervioso central (SNC). De forma notable, se ha encontrado que b
FGF est presente en altas concentraciones en el suero de pacientes con tumores de
clulas epiteliales. De entre estos tumores, llama la atencin el carcinoma de clula
s renales. Ms de un 50% de pacientes con esta enfermedad tienen niveles sricos m u
y elevados de bFGF (Fujimoto. 1991; li. 1993), bien se mida mediante ELISA o me
diante mtodos potenciados de quimioluminscencia. Este factor de crecimiento est tam
bin elevado en el suero de ms del 50% de pacientes con tumores del SNC. en el 90%
de pacientes con cnceres de pulmn (li. 1993) y en alrededor del 60% de pacientes c
on linfomas (Kurobe, 1993). No est elevado, sin embargo, en el suero de grandes p
oblaciones de individuos normales (control). Recientemente, los niveles sricos el
evados de bFGF han resultado ser un buen factor pro nstico en pacientes con carci
nomas de pulmn de clulas no pequeas (Brattstrom, 1998). As. TGF-u y TGF-|i. PDGF y
bFGF parecen todos ellos estar elevados en el suero de un nmero significativo de
pacientes con tumores de clulas epiteliales, aunque no son completamente tumor-es
pecficos. TGF- tiene una cierta especificidad para el cncer de mama y TGF-|5 para e
l carcinoma hepatocelular. bFGF se eleva en diferentes tumores malignos, incluye
ndo tumores de clulas no epiteliales, como los tumores del SNC y los linfomas. PD
GF muestra poca especificidad en cuanto al tipo del tumor, pero sus niveles elev
ados en el suero indican la presencia de tumor maligno. Factor de crecimiento ep
idrmico y factor de crecimiento hepatocitario. Se ha observado que el factor de c
recimiento epidrmico est elevado en el suero de algunos pacientes con cncer de estma
go (Pawlikowski. 1989) y cncer de lengua (Bhatavdekar. 1993), pero h a resultado
estar normal o disminuido en otros tumores (Nedvidkova, 1992). Se han descrito n
iveles sricos elevados de tactor de crecimiento hepatocitano en pacientes con car
cinoma hepatocelular. Sin embargo, este factor de crecimiento parece ser nico en
cuanto a que se encuentran tambin niveles elevados en enfermedades hepticas no mal
ignas (Hioki. 1993), disminuyendo su utilidad como marcador tumoral.
Los receptores transmembranosos del factor de crecimiento codificados por la fam
ilia erbB de oncogenes (por ejemplo, erbS. que codifica el receptor EGF, tambin l
lamado EGFr. y neuvHER-2 [erbB-2]), son objetivos particularmente atractivos par
a la deteccin en sangre durante el desarrollo del cncer, ya que se ha observado qu
e. en los tumores humanos inducidos por estos receptores, el mecanismo parece se
r la protelisis del dominio extracelular de unin con el receptor (Figura 64-2, ter
cera ilustracin). Los dominios extracelulares liberados, llamados ECD, entran ent
onces en la circulacin y se pueden detectar lcilmente en el suero utilizando tcnica

s convencionales de inmunoanlisis (Brandt-Rauf, 1994a. 1994b. 1998) Receptor EGF

(EGFr). En pacientes con asbestosis se han estudiado las elevaciones de los nive
les circulantes del ECD de este receptor de factor de crecimiento (Brandt-Rauf,
1992). que se sabe predispone a tumores malignos. Se ha encontrado que en estos
pacientes, aquellos con niveles sricos de ECD de 636 fmol'ml o ms altos, o bien ti
enen un tumor maligno asociado al asbesto (carcinoma de pulmn o mesotelioma). o bi
en posteriormente desarrollan un tumor de esta clase. Se ha observado que muchos
individuos normales tienen unos niveles sricos de ECD mucho ms bajos. As. EGFr par
ece ser un excelente marcador para los tumores inducidos por el asbesto, Estos r
esultados tienen tambin inters porque sugieren que el electo principal del asbesto
como carcingeno es producir mutaciones en el gen EGFr. Receptor neu HER-2. Debid
o a la asociacin firmemente documentada entre el cncer de mama y las mutaciones en
el gen neu'HER-2. muchos estudios han examinado el p185 erbB-2 ECD en la sangre
de pacientes con cncer, en particular cncer de mama. En estudios previos sobre la
sobreexpresin inducida por el oncogn neu de la proteina pl85 (Slamon. 1989). se e
ncontr que el nivel de expresin del oncogn neu en el tejido de biopsias de cncer de
mama se correlacionaba con la extensin del tumor, siendo el mejor indicador pronst
ico de tasas de supervivencia, excediendo la extensin de la afectacin de ganglios
linfticos como indicador pronstico. Los resultados de la cuantificacin del p185 ECD
en el suero de pacientes con cncer de mama corren paralelos con los resultados g
enticos previos Entre un 25% y un 50% de los pacientes con un cncer de mama en est
adios III o IV tienen niveles elevados de p185 ECD en su suero (entre 40 y 1 9 0
veces ms altos que en el suero de los individuos control normales (Mor, 1990: Car
ney, 1991: Kath, 1993). En los pacientes de los que se dispone de un material de
biopsia tumoral. hay una excelente correlacin entre los niveles sricos de ECD y l
a expresin a nivel lisular (Breuer. 1993.1994). Exisle tambin una excelente correl
acin entre los niveles sricos de ECD y la recurrencia de la enfermedad (Brandt-Rau
f, 1998), Los niveles de ECD en el suero tambin han resultado ser un excelente in
dicador pronstico para el cncer de m a m a (Molina, 1996). Dado que los niveles sri
cos de p185 ECD se correlacionan con la carga y con la fase del tumor, la detecc
in del cncer de mama incipiente, utilizando los niveles sricos de p185 ECD. es meno
s eficaz para estos pacientes. De forma global, la tasa de deleccin de los tumore
s mamarios en estadios I y II utilizando los niveles sricos de ECD, basados en tcn
icas ELISA convencionales, oscila entre un 10% y un 15%. Sin embargo, el uso de
un mtodo ELISA sensible para el p185 ECD en pacientes con cncer de m a m a dio lug
ar al descubrimiento de un carcinoma in situ en un 43% de los pacientes con esta
enfermedad (Breuer, 1993). Este ltimo resultado indica que el uso de anlisis ms se
nsibles para p185 ECD identifica un aumento significativo en el nmero de paciente
s con carcinoma in situ (esto es, en una fase precoz de su desarrollo). Neoplasi
as pulmonares, pl 85 ECD est tambin elevado en un alto porcentaje de pacientes con
cncer de pulmn. Las elevaciones de los niveles sricos de EGFr para la deteccin tumo
ral precoz se han empleado para estudiar a pacientes con una predisposicin conoci
da, como los que tienen neumoconiosis, a desarrollar estos tumores. En el 70% de
los pacientes con neumoconiosis, se han encontrado niveles sricos elevados de p1
85 ECD antes del desarrollo manifiesto del tumor maligno. En casi el 1 0 0 % de
los pacientes con este factor predisponente que tienen cncer de pulmn, el p 185 EC
D del suero est bastante elevado (Brandt-Rauf, 1994a). Claramente, esta proteina
es un indicador muy sensible de cncer de pulmn. Por el contrario, no se han encont
rado elevaciones de pl 85 ECD en el suero de muchos individuos normales.
Receptores de factores de crecimiento
En cuanto a los receptores de factores de crecimiento, existen varios mecanismos
por los que puede iniciarse una mitognesis incontrolada. Estos mecanismos se res
umen en la Figura 64-2. Tanto para el receptor EGF como para la proleina del rec
eptor del factor de crecimiento pl85. codificada por el oncogn neu (HER-2), y que
se asocia intensamente con el cncer de mama (Slamon. 1989), el receptor dimeriza
y activa las tirosmas cinasas que estn involucradas en la fosforilacin de protenas
que transducen la seal mitognica hasta el ncleo. Existen tres mecanismos patolgicos
conocidos que pueden dar lugar a una dimerizacin del receptor anormalmente prolo
ngada y que produce una seal continua mitognica. Estos mecanismos son la prdida del

dominio de unin extracelular (ECD); las mutaciones en el dominio transmembranoso

que promueve la dimerizacin (Brandt-Rauf, 1990) y la sobreexpresin del receptor.

1348
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 64-2. Mecanismos de la produccin continua de seales mitogmeas por parte de l
os receptores de factores de crecimiento. El e s q u e m a1m u e s t r a que est
os receptores tienen tres dominios: un dominio extracelular, donde se une el fac
tor de crecimiento (ECD): un dominio transmembranoso (TMD| y un dominio intracit
oplsmico (ICD). Un lactor de crecimiento. GF. se une al receptor haciendo que se
dimerice. poniendo en m a r c h a una cascada de fenmenos mtracelulares que se tr
ansducen h a s t a el ncleo (N). descrito en la Figura 64-1. Hay tres formas cono
cidas por las que se puede producir una seal celular continua a partir del r e c
e p t o r de f a c t o r de crecimiento, dando lugar a una transformacin maligna
de las clulas. El e s q u e m a 2 muestra el primero de ellos: sobreexpresin del r
eceptor que da lugar a muchos procesos de activacin y a seales continuas hacia el
ncleo. El e s q u e m a 3 muestra el segundo mecanismo, donde ECD o bien est ausen
te o bien es eliminado por proleasas intracelulares, dando lugar a una dimerizac
in espontnea. El esquema 4 muestra el tercer mecanismo, en el que una mutacin del g
en del receptor del lactor de crecimiento da lugar a una sustitucin de aminocidos
(X en la Figura) en el dominio transmembranoso. dando lugar a la formacin de hlice
s-ix que se asocian (Brandt-Rauf, 1990) y dando lugar a una dimerizacin espontnea
que p u e d e lener lugar en ausencia o presencia del ligando.
Carcinomas hepatocelulares. Se ha observado previamente que el factor de crecimi
ento TGF-p' puede ser un buen marcador del carcinoma hepatocelular. Hay ahora fu
ertes indicios de que p185 ECD es tambin un marcador sensible para esta enfermeda
d. Se ha encontrado que el p185 ECD del suero est elevado en casi un 100% en los
individuos de raza oriental que tienen factores de riesgo conocidos de desarroll
ar esta enfermedad (Luo, 1 9 9 3 : Yu, 1994). Sin embargo, no se han observado e
levaciones en individuos normales de edad y raza similares o en aquellos con fac
tores de riesgo de tipo
exposicin para esta enfermedad pero que no desarrollaron posteriormente cncer. erb
B-2 (p185) ECD en otros tumores. Se han encontrado tambin elevaciones en los nive
les sricos de erbB-2 ECD en pacientes con cnceres colorrectales. pancreticos, prostt
icos, hepticos y ovricos (Wu, 1993) con frecuencias de deteccin ms bajas (del 15% al
20%). En estos casos se ha encontrado una excelente correlacin entre los niveles
sricos y los niveles tisulares. Hay una correlacin directa entre los niveles srico
s del p185 ECD y

CAPTULO 64

ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

1349
el tamao del tumor para los adenomas premaligos de colon
do que las neoplasias de colon progresan por lo general a
inidas desde adenoma a carcinoma, aumentando el potencial
s con el tamao, los niveles sricos de erbB-2 ECD pueden
to de esta progresin.

(Brandt-Rauf. 1994b). Da
travs de fases bien def
maligno de los adenoma
ser tiles para el seguimien

Protenas G
Como ocurre con los receptores de tactor de crecimiento, las protenas sealizadoras
que se producen aguas abajo de los receptores de crecimiento se hacen oncognicas
sobre todo por la sobreexpresin y sustituciones de aminocidos en posiciones crtica
s en sus cadenas polipeptdicas. Con menos frecuencia, y para algunas protenas, com
o ra (Figura 64-1; Tabla 64-2), la prdida de los dominios de regulacin tambin puede
conducir a la oncogenesis. Las sustituciones de aminocidos en las protenas transdu
ctoras de seal hacen que estas protenas sufran cambios de conformacin que pueden da
r lugar a que queden activadas de forma permanente para estimular la divisin celu
lar (Pincus, 1992,1999). Este mecanismo se ha documentado bien para la prolena p2
1 codificada por el oncogn ras. en el que las sustituciones de la mayora de los am
inocidos por glicina 1 2 o glutamina 61 dan lugar a una protena oncognica. Muchas p
rotenas p21 con tal sustitucin han sido clonadas y microinyectadas directamente en
clulas normales de cultivo tales como las clulas NIH 3T3 (Barbacid. 1987). Las clu
las sufren una transformacin maligna que dura hasta que se melaboliza la protena m
ulante aadida y se elimina de las clulas. Las tormas mulantes oncognicas del gen ra
s y de su protena p2i codificada se han encontrado en aproximadamente uno de cada
tres tumores de clulas epiteliales humanos habituales, en ms de un 90% de los tum
ores pancreticos humanos y en un 75% de los cnceres de colon humanos (Almoguerra,
1988; Forester. 1987). Una de las consecuencias de las sustituciones de aminocido
s en p21 y presumiblemente en otras protenas transductoras de seal es la activacin
anmala de vas alternativas y no reguladas de transduccin de seal. La proteina oncogni
ca ras-p21 (p21 * en la Figura 64-1) ha resultado unirse directamente a un, el ta
ctor de transcripcin nuclear y su cinasa activadora. un cinasa (JNK). Este proceso
de unin da lugar a la activacin directa de estas protenas nucleares inductoras de
transcripcin, cortocircuitanto as los controles celulares normales. Esta derivacin
o via en cortocircuito se muestra en la parte derecha de la Figura 64-1 para p21
' (Adler. 1995: Amar. 1997). Adems, la protena oncognica ras-p21 activa la protena c
inasa C (Pincus. 1992), como se ilustra en la Figura 64-1. Como se mencion previa
mente, las protenas p21 codilicadas por el oncogn ras son protenas G asociadas a la
s membranas de 21 kDa que se han implicado en el proceso de transduccin de seales
de crecimiento desde la membrana celular a las cinasas del citoplasma. Los cambi
os cualitativos (por ejemplo, mutaciones puntuales) y cuantitativas (por ejemplo
, sobreexpresin i en p21 han sido identificadas como contribuidoras a la carcinog
enesis humana (Barbacid. 1987). Gracias a mecanismos an sin definir, las protenas
p21 ganan acceso al ambiente extracelular. As, las mayores cantidades de p2l o la
s formas muladas de lorma puntual de p21 pueden detectarse mediante inmunoblot c
on anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de clulas cultivadas que se sabe s
obreexpresan p21 o que expresan p21 mulante, respectivamente (Brandt-Rauf, 1991)
. De forma anloga, realizando inmunoblot en ratones con tumores que sobreexpresan
p21 o que expresan un p21 mutante se encuentran mayores cantidades de p2i o for
mas muanles de p21 en su suero, respectivamente (Hamer. 1991). Estos resultados s
ugieren que es posible realizar la deteccin de un aumento en p2l o encontrar p21
mutante en sangre de seres humanos. Debido a su papel central en la transduccin d
e seales mitognicas. se podra esperar encontrar protena p2l mulada y'o sobreexpresad
a en una amplia variedad de tumores humanos. De hecho, se ha identificado un p2l

srico elevado en el suero de hasta un 68% de los pacientes con muchos cnceres dif
erentes, incluyendo cnceres de mama, prstata, colon, pulmn e higado. Por otro lado,
slo un pequeo porcentaje de individuos normales han resultado tener niveles sricos
detectables (Weissfeld, 1994). En cnceres humanos de pncreas y colon se ha encont
rado una incidencia muy alta de ocurrencia de formas oncognicas del gen K-ras. Nu
evos anlisis basados en la PCR han detectado en oncogn ras en las heces de un alto porce
ntaje de pacientes con cncer de colon. Se han encontrado resultados igualmente al
eccionadores utilizando el esputo de pacientes con cncer de pulmn. Se han obtenido
ahora resultados paralelos utilizando ELISA para la proteina p21 utilizando el
suero de pacientes con carcinomas de colon y de pulmn. Se han encontrado niveles
elevados (cinco veces superiores al del control) de p21 srico en hasta un 83% de
pacientes con cancer de pulmn, mientras que en los sueros de individuos normales
slo se han encontrado niveles bajos (Brandt-Rauf. 1991. 1998) Adems, se han realiz
ado estudios en los que se ha llevado a cabo una PCR para genes mutantes k-ras c
on cambios de bases en los codones 12 y 13. de forma simultnea en el tejido tumor
al y en el suero de pacientes con diferentes fases de cncer colorrectal (De Kok.
1997). En ms de un 90% de los pacientes con genes ras mulantes especficos encontra
dos en tejidos tumorales, se descubri el mismo gen mulado ras en sus sueros, de f
orma indiferente de la fase del tumor Previamente, cuando se habl de la protena p1
85 codificada por el oncogn neu, se hizo notar que se haban encontrado elevaciones
en los n veles sricos de esta proteina en pacientes con neumoconiosis que progre
saron despus hasta desarrollar tumores malignos sintomticos. Un estudio similar en
los niveles sricos de p2l se ha llevado a cabo en pacientes con neumoconiosis. P
ara los pacientes con esla predisposicin, en un 39% s eh a encontrado mediante in
munoblot (Western blot) que tenan niveles sricos elevados de la proteina p21. Casi
todos estos pacientes desarrollaron un tumor de pulmn maligno despus de haberse o
bservado elevaciones de la proteina p21. As, y al igual que p185 ECD, el p21 srico
elevado es un marcador biolgico precoz de enfermedad maligna en pacientes con un
a predisposicin conocida. Los estudios precedentes estn relacionados con la detecc
in de niveles sricos elevados de p2l como indicadores de tumores malignos. Como se
ha observado antes, un importante mecanismo de la oncogenesis inducida por la p
rotena ras-p2l son las sustituciones de aminocidos en su secuencia que dan lugar a
su activacin permanente. La identificacin de genes ras mutantes mediante PCR y se
cuenciacin directa del ADN aislado del suero o plasma en tres pacientes con cncer
de pncreas ya se ha descrito (Sorenson. 1994). pero, hasta hace poco, no se habia
comunicado la deteccin directa de protenas p2l mutantes en sangre humana (De Kok.
1997). Actualmente, sin embargo, las sustituciones oncognicas de aminocidos en la
protena p21 se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales qu
e reconocen sustituciones oncognicas especificas. Se ha encontrado p21 mutado en
el suero de pacientes con una historia conocida de exposicin a cloruro de vinilo.
un carcingeno. Este produelo qumico ha resultado predisponer a las personas a des
arrollar angiosarcomas. Los estudios tisulares de estos angiosarcomas revelan qu
e en las clulas tumorales un gen ras mutante coditica cido asprtico en lugar de la
glicina que est normalmente en la posicin 1 3 en la cadena polipeplidica. Un antic
uerpo monoclonal que reconoce la forma Aspl3 de la proteina p21 ha podido desarr
ollarse (Oncogene Science). Esta protena p2l mutante h a sido identificada en el
suero del 80% de pacientes con angiosarcomas hepticos inducidos por cloruro de po
livinilo. pero no en individuos normales (DeVivo, 1994). Es ms. existe una correl
acin directa entre el grado de exposicin de los pacientes al cloruro de vmilo y la
probabilidad de descubrir en su suero la forma oncognica de la protena. Se han ob
tenido otros anticuerpos monoclonales anti-p21 mutantes altamente especficos que
reconocen sustituciones especlicas de aminocidos en las posiciones 12. 13, 59 y 61
. El uso de estos anticuerpos en el suero de pacientes con factores de riesgo co
nocidos de desarrollar cncer parece ser muy prometedor para la deteccin precoz de
los tumores.
Oncoprotenas nucleares
Como ya se ha mencionado, dos importantes protenas nucleares que parecen tener fu

nciones crticas en la regulacin del crecimiento celular y la divisin celular son la

proteina p53 que suprime el gen tumoral y la proteina p62'64 codificada por el
oncogn c-m/epara la que se han desarrollado anlisis en suero. Adems, las protenas de
matriz o esqueleto nuclear son los objetivos de las cinasas transductoras de sea
l tales como la cinasa MAP, segn se indica en la Figura 64-1.

1350
SECCIN V I I

PATOLOGIA MOLECULAR
Proteina p53. Se sabe que esta proteina funciona como un homotetrmero y, de esta
forma, se une a secuencias especificas del ADN. El efecto es reprimir el proceso
de la mitosis. As. p53 es una protena antoncogn. Se pueden producir mutaciones en p
53 que lo nactiven. Esta inactivacin puede por s misma ser oncognica debido a que se
elimina el control vital que esta protena ejerce sobre la mitognesis. Entre las m
utaciones inactivantes estn las deleciones de todo el gen, como se ha encontrado
en un nmero de cnceres de colon. Las mutaciones del gen p53 pueden producir sustit
uciones de aminocidos en la protena que, como en la protena p21, dan lugar a cambio
s de conformacin en la protena que resultan en su incapacidad para llevar a cabo s
u funcin antioncognica en la clula (BrandtRauf, 1996). Se han identificado muchas d
iferentes mutaciones puntuales en p53 en tumores humanos (Soussi, 1994). El efec
to de estas mutaciones es la prdida de la funcin inhibitoria del crecimiento norma
l de p53 y. al mismo tiempo, algunas de estas mutaciones dan lugar a protenas p53
con unas vidas medias considerablemente aumentadas, de manera que las protenas m
uladas se acumulan en las clulas transformadas (Soussi, 1994). La oncoprotena c-my
c se activa para dar lugar a la transformacin celular mediante sobreexpresin, de m
anera que, adems, se acumula en las clulas transformadas (Field. 1990). As, tanto p
ara p53 como para myc p62<64. se pueden detectar aumentos en los niveles de esta
s protenas en clulas transformadas y en tumores humanos (Soussi. 1994: Field, 1990
). Esta sobreexpresin da lugar aparentemente a una salida de las protenas hacia el
ambiente extracelular. Estas protenas pueden por tanto no solamente detectarse e
n el suero y otros lquidos corporales, sino que estas protenas normalmente secuest
radas se reconocen como extraas, de manera que algunos pacientes con cncer desarro
llan anticuerpos frente a myc p53 o p62<64. Por tanto, las concentraciones eleva
das de p53 o p62/64 o de anticuerpos frente a estas protenas en sangre perifrica s
on excelentes marcadores para el estudio de la carcinognesis humana.
Anticuerpos circulantes anti-p53 en la deteccin tumoral
Se han descrito anticuerpos sricos frente a p53 como un hecho frecuente en pacien
tes con varios tipos de cncer. La produccin de anticuerpos frente a p53 y otras on
coprotenas se ha atribuido a su acumulacin en clulas necrticas y a su consiguiente l
iberacin hacia la circulacin, donde se reconocen como sustancias extraas. Para p53.
hay todava otra causa para el desarrollo de anticuerpos frente a p53 oncognico. A
l igual que ras-p21 oncognico. las protenas p53 mutantes que contienen sustitucion
es de un nico aminocido en posiciones crticas de la cadena polipeptdica pueden volve
rlas oncognicas. Estas sustituciones de aminocidos inducen cambios importantes en
la conformacin de la protena p53 (Adler. 1998; Brandt-Rauf, 1996). Entre estos cam
bios figura la exposicin de determinantes antignicos especficos que normalmente no
quedan expuestos. Si la proteina difunde hacia la circulacin, es frecuente que se
desarrollen anticuerpos contra estos determinantes. En diferentes estudios impo
rtantes (incluyendo un gran estudio de 1.392 pacientes con cncer), se encontraron
elevaciones en los niveles sricos de anticuerpos anti-p53 en pacientes con cncer
de ovario y de colon (15%); cncer de pulmn, incluyendo tumores de clulas pequeas (ha
sta un 25%), y cncer de mama, incluyendo carcinomas intraductales (hasta un 15%).
Los individuos normales no tenan niveles sricos elevados de estos anticuerpos (An
gelopolou, 1994). En un nmero significativo de pacientes en los que se ha seguido
la presencia de anticuerpos anti-p53 en su suero, la aparicin de estos anticuerp
os ha resultado preceder al desarrollo de tumores malignos. Se encontraron tambin
anticuerpos anti-p53 en ms de un 20% de pacientes con cncer de vejiga (la mayora e
n lases ms avanzadas), en una alta proporcin de pacientes con carcinomas de pncreas
y hepatocelulares, y en linfomas infantiles. Los estudios de seguimiento contin
uado de anticuerpos anti-p53 en pacientes con diferentes cnceres revelan que hast

a la mitad de los pacientes c o n carcinoma hepatocelular. independientemente de

su tamao, tienen niveles sricos notablemente elevados de ant-p53 (Ryder. 1996). Es
tos niveles elevados se correlacionan con la elevacin conocida de p53 en el suero
de pacientes con esta clase de cncer, segn se coment antes. Es ms. los anticuerpos
anti-p53 se han encontrado en el suero de pacientes con lesiones orales, y mucho
s de estos pacientes resultaron tener lesiones premalgnas (Kaur, 1997), indicando
que los anticuerpos anti-p53 son marcadores para la deteccin precoz del cncer ora
l. Se ha encontrado tambin anti-p53 elevado en ms de un 50% de los pacientes con c
arcinoma de clulas escamosas del esfago (Shimada. 1998). En un reciente estudio pr
ospectivo muy extenso de pacientes con cncer de pulmn, se encontraron niveles srico
s de anti-p53 en el 100% de los pacientes con carcinomas de clulas grandes, en un
28% de los adenocarcinomas, en un 55% de carcinomas de clulas escamosas y en un
71% de carcinomas de clulas pequeas (Segawa. 1998). Estos resultados demuestran qu
e los niveles sricos elevados de anti-p53 tienen especificidad para tipo tumoral
para el carcinoma del pulmn, mostrando tasas elevadas de positividad para los car
cinomas pulmonares de clulas grandes y de clulas pequeas. Protenas codificadas por e
l oncogn myc en deteccin de tumores. El gen myc codifica una protena con una masa m
olecular de 6 4 kDa cuya funcin es en gran medida desconocida. Existe una fuerte
evidencia con respecto a que es un factor de transcripcin que. cuando se activa,
desreprime la expresin de otros genes que codifican protenas que participan en la
replicacin. Este oncogn est sobreexpresado en un nmero de tumores, incluyendo el lin
foma de Burkitt, donde el gen myc del cromosoma 8 se trastoca a una larga regin t
erminal parecida a la de las repeticiones en una regin codificadora de nmunoglobul
inas del cromosoma 14. Las regiones con repeticiones terminales largas permiten
la expresin constitutiva de genes que son adyacentes a las mismas. Las protenas en
relacin con c-myc y los anticuerpos trente a la protena c-myc han sido identifica
das, al igual que p53 y sus correspondientes anticuerpos, en el suero de pacient
es con cncer. La deteccin de esta protena de 62.64 kDa est dificultada por su corta
vida media en el suero. Sin embargo, es posible detectar una protena especfica p40
relacionada con c-myc en el suero de estos pacientes, utilizando inmunoblot. La
s frecuencias ms altas
Deteccin de tumores malignos mediante anlisis de la protena p53
Carcinoma hepatocelular. Se han encontrado niveles aumentados de p53 mutante med
iante ELISA (ms de 0,3 ng/ml, en lmite superior en 100 individuos normales) en los
sueros de un 20% de pacientes con carcinoma hepatocelular y en el 30% de pacien
tes con cirrosis, un grupo que se sabe tiene un mayor riesgo de desarrollar carc
inoma hepatocelular (Virji. 1992). Dado que los pacientes con cirrosis tienen ni
veles elevados de p53 en su suero y un factor de riesgo conocido para desarrolla
r carcinoma hepatocelular, los niveles elevados de p53 pueden ser un indicador p
recoz de tumorognesis. Cncer de mama y pulmn. Se han realizado pocos estudios de p5
3 como marcador tumoral en el suero de pacientes con cncer de mama y de pulmn. Se
han comunicado niveles sricos elevados de p53 mutante. determinados mediante ELIS
A en el 8% de pacientes con cncer de mama, disminuyendo los niveles con la resecc
in quirrgica de los tumores (Rosanelli. 1993), indicando que los tumores eran la f
uente del p53 elevado. No se han observado elevaciones de protena p53 en el suero
de un individuo normal. Para el cncer de pulmn, se han observado elevaciones srica
s de los niveles de p53 mutante, determinados mediante ELISA y mediante inmunobl
ot en hasta un 34% de pacientes con cncer de pulmn, pero no en individuos normales
(Fontanini, 1994). En estos pacientes, la tincin inmunohistoqumica de biopsias ti
sulares obtenidas posteriormente mostraron niveles elevados de p53, correlacionnd
ose con los hallazgos sricos. Cncer de colon. Un mecanismo que se cree es importan
te en el desarrollo de los carcinomas de colon es la delecin del gen p53 normal o
las mutaciones de este gen que dan lugar a una protena antioncognica no funcionan
te. Se han encontrado elevaciones en los niveles sricos de p53. determinados medi
ante ELISA, en aproximadamente uno de cada cinco pacientes con carcinoma de colo
n y en aproximadamente uno de cada diez pacientes con adenomas de colon. Los ind
ividuos normales fueron negativos para la protena srica p53. Estos resultados tien
en una sensibilidad relativamente baja de este marcador para el cncer de colon, p
osiblemente debido a que la deleccin del gen p53 se produce en un elevado porcent

aje de los tumores estudiados.

CAPTULO 64

ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

1351
de encontrar proteina mycen el suero humano estn en el cncer de colon y de m a m a
(aproximadamente el 20%). El tratamiento de estas dos clases de cncer da lugar a
una notable disminucin en los niveles sricos de esta protena. Las recurrencias ori
ginan niveles elevados: por tanto, la protena c-myc es til para el seguimiento del
curso de los tumores malignos. No se ha detectado en el suero de individuos nor
males Anticuerpos sricos antiproteina c-myc en la deteccin de tumores. Se han enco
ntrado niveles sricos elevados de anticuerpos anti-c-myc en el suero de pacientes
con cncer de colon y de recto (55% al 65%) y en el suero de pacientes tanto con
leucemias mieloides como con linfoma de Burkitt. Se han descrito incidencias ms b
ajas de anticuerpos elevados en pacientes con cncer de mama (aproximadamente un 1
0%) y cncer de ovario (10%). No se han encontrado anticuerpos anti-c-myc en el su
ero de individuos normales. Deteccin del cncer de vejiga mediante las protenas de m
atriz nuclear. Como se puede ver en la Figura 64-1, uno de los objetivos de las
protenas codificadas por oncogenes son las protenas de la matriz nuclear (NMP). co
nocidas tambin como protenas del esqueleto nuclear y protenas del aparato mittico nu
clear. Estas protenas de 236 kDa son vitales para la correcta formacin del huso mi
ttico. Contienen una cabeza globular y una cola separada por un dominio central e
n forma de bastn de hlice-r/. consistente en repeticiones de secuencias de siete e
lementos. Estas protenas varan segn el tipo celular, la fase de diferenciacin y el c
iclo de la clula. De forma crucial, se ha identificado un nmero de NMP asociadas a
tumores, especficas cada una de ellas para uno de cinco tipos tumorales (vejiga,
prstata, mama, colon y hueso). El mejor estudiado es uno que est luertemente asoc
iado con el carcinoma de clulas transicionales de la vejiga (TCC). NMP22. que fun
ciona como una protena del aparato mittico nuclear, y que participa en la separacin
de los cromosomas durante la mitosis (Hughes. 1999). La cantidad de esta protena
en las clulas epiteliales transicionales malignas es entre 10 y 20 veces superio
r a la de las clulas normales. Se han desarrollado anticuerpos especficos para est
a NMP. que se utilizan ahora en un ELISA comercial en la orina (Matritech. Newto
n. MA). La base del anlisis es que. dado que las clulas uroteliales malignas se de
sprenden hacia la orina, y que este NMT es especfico de las clulas cancerosas de v
ejiga, la elevacin de esta protena en orina puede detectarse en pacientes con cncer
de vejiga. Mltiples estudios de pacientes que tienen cncer de vejiga en diferente
s estadios revelan que la sensibilidad es prxima a un 90% en el cncer maligno e in
vasivo y un 75% en el carcinoma in situ. Este ltimo resultado es m u y alentador,
dado que esta lase es la fase ms precoz detectable. Para los carcinomas no invas
ivos papilares y malignos, la sensibilidad es del 62%. La especificidad global p
ara este marcador es superior a un 90%. La comparacin de la sensibilidad del NMP2
2 ELISA con la citologa muestra que los dos mtodos tienen una sensibilidad de un 8
3% para el carcinoma invasivo, pero para el grado I TCC. NMP22 tiene una sensibi
lidad del 61%. mientras que para la citologa aislada es de un 17% (Landman, 1998)
. Para los cnceres de grado II y III. el NMP22 ELISA es ms sensible, con un 78% y
un 93%, en comparacin con la sensibilidad de las citologas de un 50% y 87%, respec
tivamente (Landman. 1998). Estos resultados sugieren que el NMP22 ELISA puede se
r altamente eficaz como una herramienta de deteccin no invasiva para TCC. En la a
ctualidad, este mtodo ha sido aprobado por la FDA como prueba de seguimiento para
TCC en pacientes que han sido tratados para esta enfermedad. Se han llevado a c
abo estudios clnicos en los que se realiz un NMP22 ELISA en la orina de pacientes
que han sido tratados para TCC. entre 20 y 60 das despus del tratamiento, y que fu
eron despus sometidos a una cistoscopia entre dos y seis meses despus del tratamie
nto. Utilizando un punto de corte de 1 0 U/ml, un 86% de los pacientes con valor
es de NMP22 negativos (menos de 10 U/ml) resultaron tener cistoscopias negativas
, y un 71% de los pacientes con valores superiores a 10 U'ml resultaron tener ha

llazgos positivos en la cistoscopia. A la vista del parecido de estas cifras con

las obtenidas utilizando la citologa para detectar nueva aparicin de TCC. parece
razonable concluir que el NMP22 ELISA podra constituir una prueba de deteccin efic
az para el TCC. Hace poco, de hecho, la prueba ha sido aprobada por la FDA para
su uso como herramienta de deteccin. El uso de esta metodologa puede obviar la nec
esidad de llevar a cabo cistoscopias en muchos pacientes que estn seguidos por re
cidivas tumorales (Miyanaga. 1997).
EVALUACIN Y CONCLUSIONES
Existen unas vas bien delinidas para la transduccin de seales mitognicas entre la me
mbrana y el ncleo de las clulas. Estas vias constan sobre todo de proteinas. cuyas
mutaciones o sobreexpresiones pueden dar lugar a unas seales mitognicas no contro
ladas y a cncer.
Eficacia diagnstica de las oncoprotenas del suero
Los resultados de los anlisis para las diferentes oncoprotenas que se co mentaron
antes en suero y en orina (NMP-22) se resumen en la Figura 64-3 en lo que se ref
iere a algunos de los tumores ms (recuentes de clulas epi teliales. Tambin se muest
ran, junto con el carcinoma hepatocelular. los resultados correspondientes a los
angiosarcomas hepticos. Los resultados de las determinaciones de las concentraci
ones de oncoprotenas en los lquidos corporales para grupos control de la misma eda
d y sexo se muestran c o m o las reas blancas en los grficos de barras de esta fig
ura. De la Figura 64-3 parece claro que. de las protenas estudiadas hasta ahora,
se producen altas tasas de positividad en ciertos cnceres, mientras que los grupo
s control muestran unas tasas de positividad m u y bajas. De forma interesante,
y dado que las oncoprotenas estudiadas provienen de vias de transduccin de seal que
participan en muchos tipos celulares diferentes, parece haber una cierta especi
ficidad de oncoprotenas peculiares para ciertos tipos de cncer. Por ejemplo, el fa
ctor de crecimiento TGF-a est elevado en un gran nmero de tumores de mama: FGF est
elevado en una alta proporcin de cnceres de pulmn: la protena p185 ECD (neu) est elev
ada en el suero de muchos pacientes con carcinomas hepatocelulares y cnceres de p
ulmn y en las fases ms avanzadas del cncer de mama; la protena C21 se eleva en carci
nomas hepatocelulares, angiosarcomas hepticos y tumores pulmonares; c53 est elevad
a en los cnceres de pulmn, y el anticuerpo anti-myc est elevado en los cnceres de co
lon. Para estas protenas la sensibilidad en cuanto a deteccin de enfermedad es ele
vada y excede la de cualquiera de los antigenos oncofetales. Asimismo, la frecue
ncia con la que se producen estos factores de crecimiento u oncoprotenas es muy b
aja en el suero de los individuos que no tienen cncer en cada uno de los estudios
llevados a cabo hasta la fecha en varios miles de pacientes. Por tanto, la espe
cificidad al utilizar factores de crecimiento y oncoprotenas como marcadores tumo
rales es tambin relativamente elevada. Esta conclusin no implica que la ausencia d
e una determinada oncoprotena en el suero de un paciente implique la ausencia de
un tumor maligno. Debido a la naturaleza en casos mltiples de la carcinogenesis,
puede haber muchas oncoprotenas potencialmente anmalas. Cualquier otro grupo de oi
rs oncoprotenas puede tambin estar presente en el suero del paciente. De hecho, la
Figura 64-3 indica tambin que la Irecuencia de deteccin de ciertas oncoprotenas en
el suero de pacientes que tienen un tipo determinado de tumor puede ser relativa
mente baja. Por ejemplo, como se ve en la Figura 64-3A se ha encontrado c-myc el
evado en el suero de aproximadamente un 8% de pacientes con cncer de mama: se ha
encontrado la protena p185 ECD (neu) en hasta un 25% de pacientes con cncer de mam
a. Las bajas tasas de deteccin de estas oncoprotenas en estos tipos tumorales son
el resultado del gran nmero de posibles pasos en la va donde se producen proteinas
aberrantes o factores de crecimiento. As. los tumores que se producen en un teji
do determinado pueden tener una multiplicidad de causas diferentes, dando lugar
a la produccin de diferentes proteinas aberrantes en la cadena. Por tanto, el sig
uiente paso al utilizar estos marcadores oncoprotenicos en el diagnstico precoz de
l cncer es buscar mltiples marcadores en el suero de un paciente determinado. El d
escubrimiento de por lo menos un componente aberrante de la via de transduccin de
seales se considera mucho ms probable.

Orgenes de los tumores malignos

La Figura 64-3 indica que el descubrimiento de un nivel elevado de una oncoproten
a en el suero de un paciente no proporciona por lo general una informacin concluy
eme con respecto al origen del tumor maligno. Por ejemplo, aunque se ha encontra
do ras-p21 elevado, y con cierta especificidad, en angiosarcomas hepticos, de col
on y de pulmn: y neuHER-2 (c-ert>2) p185

1352
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 64-3. Grfico de barras con el resumen de resultados de los anlisis del suer
o para diferentes componentes de oncoprotenas de las vas mitogenicas de sealizacin p
ara seis tipos tumorales: pulmn, mama, colon, vejiga e hgado: carcinoma hepatocelu
lar y angiosarcoma hepatocelular. Para cada tipo de tumor, s e muestra la incide
ncia de deteccin en las ordenadas y en forma de porcentaje, y la oncoprotena se li
sta en la abscisa. En el tope de cada grfico de barras se muestra la frecuencia d
e elevacin de la oncoprotena en los grupos control c o m o un rea blanca dentro del
grlico de barras. Para la mayora de los grficos de barras, esta frecuencia es cero
, de manera que no aparece zona blanca. (TGF-ot. TGF-|i, FGF, PDGF y EGF = facto
r transformador de crecimiento u. factor transformador de crecimiento |3. (actor
de crecimiento fibroblstico. factor de crecimiento derivado de las plaquetas y l
actor de crecimiento epidrmico, respectivamente: erbB = receptor del f a c t o r
de crecimiento epidrmico [EGF]; neu = proleina p185 que es parecida a la protena e
rbfl y que tambin se llama erbB-2 y HER-2; ras = proteina p21; NMP22 = protena de
matriz nuclear que se eleva en el suero en los carcinomas de clulas transicionale
s del tracto urotelial; p53 = protena anli-oncogn: anti-p53 = anticuerpo anti-p53;
myc = oncogn nuclear que codifica la proteina myc. y anti-myc = anticuerpo frent
e a la protena myc.)
ECD elevado en cnceres de colon, pulmn y mama, la elevacin de una de estas oncoprot
enas en el suero de un paciente no permite identificar con exactitud el tejido de
origen del tumor maligno. Dado que la va de transduccin de seales en la mayora de l
as clulas es muy parecida a la de otras, una elevacin en cualquier oncoprotena pued
e significar que exisle un tumor maligno en uno de muchos lipos celulares difere
ntes. Adems, quedan an por realizar muchos estudios de las correlaciones que hay e
ntre la presencia de tumores y los niveles sricos de oncoprotenas. Por ejemplo, no
hay datos publicados acerca de la produccin de formas detectables de protena muta
nte p2l en el suero de pacientes con carcinoma pancretico con grupos control form
ados por individuos de edad y sexo similares y con grupos que contengan paciente
s con pancreatitis pero sin tumores. Este es un estudio necesario, dado que un 90% de los cnceres de pncreas expre
san ras-p21 oncognico (Almoguerra. 1988). Una forma de utilizar las oncoprotenas d
el suero para detectar tumores especilicos en una fase precoz de la progresin del
tumor es en poblaciones que se sabe estn en riesgo de desarrollar cnceres especil
icos debido a una historia de exposicin a carcingenos o mulgenos. como se produce e
n la exposicin ocupacional o por procesos mdicos preexistentes, observado en la ex
posicin al cloruro de vinilo que se asocia con el angiosarcoma heptico y en las ne
umoconiosis que se asocian con cncer de pulmn. Ambos procesos se asocian con nivel
es sricos elevados de protena rasp21: la ltima condicin se asocia tambin con niveles
sricos elevados de neup185.

CAPTULO 64

ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

1353
Barbaod M: Ras genes. Ann Rev Biochem 1987; 56:779 Bhatavdekar JM. Palel DD, Vor
a HH, et ai: Circulating markers and growth factors as prognosticators in men wi
th advanced tongue cancer Tumour Biol 1993; 14: s u e r o del paciente. Si por l
o m e n o s se encuentra un resultado positivo, el pacien55-58. te puede seguirs
e en busca de sntomas del desarrollo de un t u m o r . Brandt-Raul PW, Rachovsky
S. Pincus MR: Correlation ol the transmembrane domain of the neu-oncogene-encode
d pl85 protein with its lunclion. Proc Natl AcadSciUSA1990; 87:8660. Tamao del tu
mor y niveles de oncoprotena Brandt-Rauf PW: Oncogene proteins as biomarkers m Ih
e molecular epidemiology ol occupational carcinogenesis: The example of Ihe ras
oncogene encoded p2l En la actualidad, h a y poca informacin acerca del tamao mnimo
de un protein. Inl Arch Occup Environ Health 1991; 63:1. t u m o r que da lugar
a elevaciones sricas d e oncoprotenas. Sin embargo, Brandt-Raul PW. Smith S, Hemm
inki K, el al: Serum oncoproteins and growth lac h a y indicadores de que pequeas
lesiones pueden dar lugar a niveles signitors in asbestosis and silicosis patie
nts. Int J Cancer 1992; 50:881. Brandt-Rauf PW. Pincus MR, Carney WP: The c-erbB
-2 protein in oncogenesis: ficativos de ciertas oncoproteinas. Primero, en un nme
ro significativo de paMolecular structure to molecular epidemiology Crit Rev Onc
og 1994b: 5:313. cientes con factores de nesgo conocidos para el cncer, las oncop
rotenas Brandt-Raul PW, Luo JC, Carney WP, et al: The detection of increaseo amou
nts of s e descubrieron en su suero antes del desarrollo de un cncer detectable.
the extracellular domain of Ihe c erbB 2 oncoprotein in serum during pulmonary A
si. en pacientes con asbestosis. el ECD d e la protena p185 erbB s e elev carcinog
enesis in humans. Int J Cancer 1994a; 56:383 antes del diagnstico de los tumores
pulmonares. La sobreexpresin del ECD Brandt-Raul PW. Chen JM. Marion M-J. et al:
Conformational effects in the p53 pro tem of mutations induced during chemical c
arcinogenesis: Molecular dynamic p185 s e produjo en un nmero de pacientes antes
del desarrollo de un cnand immunologic analyses. J Protein Chem 1996:15:367. c e
r de mama. Los pacientes orientales que tenian niveles sricos elevados de BrandtRauf PW. Pincus MR: Molecular markers of carcinogenesis. Pharmacol Ther pl 85 EC
D desarrollaron despus carcinomas hepalocelulares. Los pacientes 1998: 77:135. c
o n neumoconiosis resultaron tener niveles elevados de pl 85 ECD yo proteBrartst
rom D. Bergvist M. Larsson A, et al: Basic fibroblast growth factor in sera from
non-small cell lung cancer patients. Anticancer Res 1998:18:1123 ina p121 y des
arrollaron posteriormente carcinomas pulmonares. Se descuBreuer B, DeVivo I, Luo
JC, et al: erbB-2 and myc oncoproteins in sera and tumors brieron protenas mulan
tes (Asp13-) p21 en el suero d e un porcentaje m u y ol breast cancer patients.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1994: 3:63. elevado de pacientes con exposicin a
l cloruro d e vinilo que. nuevamente, Breuer B. Luo JC. DeVivo I. et al: Detecti
on ol elevated c-erftB-2 oncoprotein in Ihe desarrollaron despus angiosarcomas. L
os anticuerpos anti-p53 se encontraserum and tissue in breast cancer. Med Sci Re
s 1993; 21:383-384. Carney WP. Hamer PJ. Petit D. et al: Detection and quantitat
ion of the human neu ron en el suero de individuos que posteriormente desarrolla
ron angiosarcooncoprotein. Tumor Marker Oncol 1991; 6:53. m a s o cnceres de pulmn
. T o d o s estos estudios sugieren que lesiones Chakrabarty S. Huang S. Moskal
TL. et al: Elevated serum levels of transforming malignas que son indetectables
por tcnicas convencionales pueden detecgrowth factor u in breast cancer patients.
Cancer Lett 1994: 79:157. tarse midiendo los niveles sricos de oncoproteinas. en
especial en pacientes de Kok JB. van Solinge WW. Ruers TJ, el al: Detection ol
tumor DNA in serum of colorectal cancer patients. Scand J Clin Lab Invest 1997;
57:601. con exposicin conocida o (actores de riesgo de desarrollar un cncer. DeViv
o I. Marion MJ, Smith SJ, et al: Mutant c-Ki-ras p21 protein in chemical carciSe
gundo, parece existir una buena correlacin en algunos pacientes entre nogenesis i

n humans exposed to vinyl chloride. Cancer Causes Control 1994; 5:273. los nivel
es sricos de marcadores oncoproteinicos y el tamao del tumor y/o Field JK, Spandid
os DA: The role ol ras and myc oncogenes m human solid luel nivel de expresin del
marcador en el propio tejido tumoral. A este respec mours and their relevance i
n diagnosis Anticancer Res 1990; 10:1. to, algunos adenomas pequeos (menores d e
1 cm) han resultado dar lugar Fontanini G. Fiore L. Bigmi D. et al: Levels of p5
3 anhgen m serum of non-small lung a niveles elevados de p185 ECD o ras-p21 en e
l suero de estos pacientes. cancer patients correlate with positive p53 immunohi
stochemistry on tumor sec lions, tumor necrosis and nodal involvement. Int J Onc
ol 1994; 5:553. T a n t o para la proteina ras-p21 c o m o para erb8-2-p185 ECD,
existe una exceForester K. Almoguerra C. Han K, et al: Detection of high incide
nce of K-ras oncolente correlacin entre los niveles sricos de estos marcadores y e
l estado clgenes durmg human colon tumorigenesis. Nature 1987: 327:298. n i c o p
re y poslratamiento del paciente. Aun asi. quedan p o r realizar estudios Fujimo
to K. Ichimori Y. Kakizoe T, et al: Increased serum levels of basic fibroblast d
e correlacin entre el tamao del t u m o r y los niveles sricos de oncoprotegrowth fa
ctor in patients with renal cell carcinoma. Biocnem Biophys Res Commun 1991; 180
:386. nas. Un factor de confusin puede ser que un tumor pequeo puede produHamer PJ
, LaVecchio J. Ng S. et al: Activated Val-12 ras p21 in cell culture fluids cir
grandes cantidades del marcador, mientras que tumores de mayor tamao and mouse pl
asma. Oncogene 1991; 6:1609 pueden producir cantidades ms pequeas. Hioki O. Watana
be A, Minemura M. et al: Clinical significance of serum hepatoc/te growth factor
levels m liver diseases J Med 1993; 24:35. Ae s t e respecto, las oncoprotenas s
e elevan en una a l t a proporcin de c a r Holl KH. Kasson BG. Pessin GE: Insulin
stimulation ol MEK-dependent but ERK c i n o m a s in situ. c o m o lo manifies
tan los niveles sricos elevados d e proteina independent SOS protein kinase Mol C
ell Biol 1996:16:577. neu p185 en el cncer de m a m a incipiente y del NMP22 en e
l carcinoma in situ Hughes JH. Cohen MB: Nuclear matnx proteins and their potent
ial applications to de la vejiga. De forma peculiar, los niveles sricos de la onc
oprotena neu estn diagnostic pathology Am J Clin Pathol 1999:111:267. li M, Yoshid
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eros ms pequeos de cnceres de m a m a en fases I y II. fibroblast growth lactor usi
ng a new enhanced chemiluminescence system A pesar de las advertencias anteriore
s sobre la interpretacin de las elevaBiochem Biophys Res Commun 1993.193:540. cio
nes de los niveles sricos de oncoprotenas o de la deteccin de formas Kath R. Hoffke
n K. Olte C, et al: The neu-oncogene product In serum and tissue of anmalas d e e
stas protenas en el suero y d e la necesidad de realizar ms patients with breast c
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e oncoproteinas en el factor alpha in human unne ano plasma Biochem Biophys Res
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e tumo167:1065. res malignos en una fase precoz y para el control de su progresin
, respuesKaur J. Srivastava A. Ralhan R Serum p53 antibodies m palients with ora
l lesions; ta al tratamiento, remisin y recidiva. correlation with p53'HSP70 comp
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1991:20:11 tein from human carcinoma cells. Jpn J Cancer Res 1990: 81 489 Otra
lorma de utilizar las oncoprotenas sricas para d e t e c t a r cnceres prec o c e s
es analizar l a expresin de una amplia variedad de oncoprotenas en el

1354
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Slamon DJ. Godolphin W. Jones LA. et al: Studies on the HER-2/neu proto-oncogene
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Elevated levels ol plasma transforming growth lactor-fi m patients with hepatoce
llular carcinoma. Jpn J Cancer Res 1992: 83:676.

CAPTULO
65
Tcnicas moleculares en el diagnstico de neoplasias hematopoyiicas
David S. Viswanatha, M.D. Richard S. Larson, M.D., Ph.D.
PERSPECTIVA HISTRICA TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LEUCEMIA Le
ucemia mieloide crnica Leucemia linfoblslica aguda Leucemia mieloide aguda TCNICAS
MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LINFOMAS Bases para el anlisis molecula
r gentico en los trastornos linfoides Anlisis de la reorganizacin gentica de los rec
eptores antignicos para la determinacin de la clonalidad Significado y deteccin mol
ecular de traslocaciones comunes cromosmicas asociadas al linfoma 1355 USO DE MAR
CADORES MOLECULARES PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL NUEVAS TECNOLOGAS E
N EL DIAGNSTICO Y CONTROL DE LOS TUMORES MALIGNOS HEMATOLINFOIDES BIBLIOGRAFA
1367
1356
1368 1368
1359
PERSPECTIVA HISTRICA
Las tcnicas utilizadas en el diagnstico de neoplasias hematolinfoides comprenden l
a valoracin morfolgica, tinciones citoquimicas. anlisis de citometria de flujo y anl
isis cariotipico. Aunque no todas estas tcnicas son necesarias en cada uno de los
casos, el uso adecuado de estas tecnologas ha dado lugar a una mejora en la prec
isin diagnstica. An asi. recientemente se han desarrollado tcnicas moleculares ms sen
sibles que pueden detectar alteraciones genticas en las clulas leucmicas y del linf
oma, proporcionando una especificidad y sensibilidad an mayores en el diagnstico.
Estas tcnicas en continua mejora han hecho que se comprenda la amplia heterogeneid
ad clnica y biolgica de las neoplasias hematopoyticas tales como leucemias y linlom
as. Adems, una gran seleccin de agentes quimioteraputicos. as como el trasplante de
mdula sea, estn ahora disponibles para el tratamiento de las leucemias y los Imfoma
s A la vista de una mayor comprensin de la diversidad clnica y biolgica de estas ne
oplasias junto con mayores opciones teraputicas, la seleccin de la terapia ptima y
el momento de administrarla pueden ser complicados. Sin embargo, estudios recien
tes que utilizan estas nuevas tecnologas moleculares han empezado a solucionar es
te dilema. El anlisis de los tumores hematopoyticos en busca de la presencia de tr
aslocaciones de los cromosomas se ha limitado siempre a tcnicas menos sensibles y
que consumen ms tiempo, como las tcnicas citogenticas y de Southern Blot. Los anlis
is basados en la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) del cido desoxiribonucleico
(ADN) se desarrollaron originalmente como una alternativa, y han aumentado de f
orma drstica la sensibilidad de deteccin proporcionando una amplificacin exponencia
l de fragmentos de ADN. Estas tcnicas ADN-PCR se han adaptado a los tejidos tanto
frescos
como fijados con parafina. De esta forma, se pueden detectar inmunoglobulinas y
redisposiciones de genes de los receptores de clulas T y algunas traslocaciones c
romosmicas en las clulas de linfoma. Sin embargo, la mayora de las traslocaciones c
romosmicas de las clulas leucmicas no se pudieron delectar inicialmente utilizando
esta tcnica debido a las grandes distancias genmicas a lo largo de las cuales se p
roducen los puntos de rotura de los cromosomas. La llegada de la reaccin de la tr
anscnptasa inversa de polimerasa en cadena (RT-PCR) ha permitido la deteccin de f
ragmentos de cido ribonucleico (ARN). Asi. los productos de fusin del ARNm transcr
ibidos desde las traslocaciones cromosmicas pueden ahora detectarse en tejidos no
fijados. Actualmente la RT-PCR se usa de forma sistemtica para detectar un gran
nmero de traslocaciones en la leucemia linfoblslica y mieloblstica aguda. Las tcnica
s moleculares tienen una importante funcin en la valoracin diagnstica de los pacien

tes con neoplasias hematopoyticas. Estas tecnologas comprenden el anlisis medanle So

uthern Blot y mtodos basados en PCR para detectar traslocaciones cromosmicas especf
icas. Estas tcnicas proporcionan una mayor sensibilidad diagnstica y tienen unas i
mplicaciones pronosticas y teraputicas esenciales. Este capitulo trata las tcnicas
moleculares diagnsticas que tienen utilidad clnica en el diagnstico de Imloma y le
ucemia. Un punto importante que no se puede enfatizar en exceso en la interpreta
cin de los estudios moleculares es que el anlisis de las pruebas moleculares, en u
n grado muy elevado, es un arte de morfologa. La interpretacin exacta y completa d
e los resultados moleculares se hace mejor en el contexto de los hallazgos histo
lgicos (esto es. cuanto ms se sabe acerca de la morfologa de las clulas, el contexto
clnico y otros estudios complementarios, menos probable es que se cometa un erro
r).

1356
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LEUCEMIA
Las leucemias agudas y crnicas representan expansiones clnales de precursores de cl
ulas neoplsicas. Las leucemias agudas se dividen en dos grupos principales de acu
erdo con una limitada diferenciacin linfocitaria o mieloide de las clulas precurso
ras: leucemia aguda linfoblstica (LAL) y leucemia aguda mieloblstica (LAM). Tambin
existen la leucemia linfoctica crnica (LLC) y la leucemia mieloide crnica (LMC). Da
do que las caractersticas biolgicas, diagnsticas y clnicas de la LLC se superponen c
on los linfomas Imfocilicos de clulas pequeas, la utilidad de las tcnicas de diagnst
ico molecular en casos de LLC se tratan en la seccin de linfomas. La presencia de
traslocaciones cromosmicas especificas y no aleatorias en la leucemia aguda y crn
ica es importante para el diagnstico y el pronstico (Rubnitz. 1999: Melnick. 1999:
Morgan. 1998: Larson. 1996). Las tcnicas de diagnstico molecular se usan sobre lo
do para detectar estas traslocaciones en muestras diagnsticas y para la deteccin d
e enfermedad residual mnima (Tablas 65-1 y 65-2). A diferencia de muchas de las t
raslocaciones cromosmicas de los linfomas. las regiones de rotura entre dos genes
que se transponen son grandes. Esta diferencia impide el uso de tcnicas de PCR b
asadas en el ADN para la deteccin de estas traslocaciones en la mayora de los caso
s de leucemia. Una excepcin notable a esta regla son las tcnicas de ADN-PCR de lar
ga distancia que ya se han descrito, pero que todava no se usan de forma sistemtic
a en los laboratorios diagnsticos. Aun asi, en la mayora de los casos de leucemia
con traslocaciones cromosmicas, se lorma un ARNm de transcripcin quimrico que se pu
ede detectar mediante RT-PCR. Como el ARN no es por lo general estable en tejido
s lijados con paralina, la RT-PCR se lleva a cabo en tejido fresco y no fijado.
das mediante Southern Blot. son comparables con los casos que tienen unos cromos
omas Ph muy claros en el cariolipo. Utilizando tanto tcnicas moleculares como cil
ogenticas. se puede poner de manifiesto Ph en un 99% de los casos. El 1% restante
ha sido llamado LMC Ph (-) o alpica por algunos autores. Sin embargo, es probabl
e que represente otro tipo de trastorno mieloproliferativo crnico, de manera que
no es sorprendente que tengan un comportamiento ms agresivo que LMC. RT-PCR detec
ta productos de diferente longitud que responden a protenas quimricas BCR-ABL de 1
90 kDa. 210 kDa y 230 kDa (Figura 65-1/4) (Kurzrock, 1978: Wada. 1995: Guo. 1991
) Gorska-Flipot, 1990). Los puntos de rotura detectados medante RT-PCR pueden ser
tiles para distinguir LAL. LMC. LAM y la leucemia neutroflica crnica (vase ms adelan
te en Leucemia linfoblstica aguda y Leucemia mieloide crnica). En la gran mayora de
LMC de adultos y prcticamente todos los casos de los nios, est presente un product
o de fusin p210 (Figura 65-1A 6). Los casos de LAL Ph (+) se asocian con la proten
a p190. aunque se han descrito casos raros de LMC y LAM con la protena de fusin ms
pequea. En casos de leucemia neutrfila crnica est presente una gran protena de fusin
230. La p230 se ha comunicado tambin en casos de LMC, pero la revisin retrospectiv
a de estos casos sugiere que pueden en realidad ser CNL. Hay tambin dos tipos de
transcripcin p210. b2a2 y b3a2 (Shtalid. 1988: Kurzrock. 1990). Aunque las difere
ncias definitivas pronosticas entre estos grupos son controvertidas, los pacient
es con transcripcin b3a2 son ms propensos a tener recuentos plaquetanos elevados.
Adems, la frecuencia relativa de b2a2 y b3a2 es diferente en la LMC de la niez y d
e la vida adulta, teniendo b3a2 dos tercios de los adultos y teniendo transcripc
iones de b2a2 una abrumadora mayora de nios con LMC.
Deteccin de la progresin de la enfermedad en la LMC
La progresin de la LMC a la fase acelerada o blstica (esto es. lase terminal) se a
socia con la adquisicin de anomalas adicionales genticas y cromosmicas (Mitelman, 19
93: Morris. 1990: Serra. 1993). La inestabilidad cromosmica del clon maligno es u

na caracterstica fundamental de la progresin de la enfermedad en la LMC. El t(9:22

) sigue siendo la nica anomala de los cromosomas durante la fase crnica, y su expre
sin contina durante la crisis blstica. Sin embargo, del 70% al 80% de los pacientes
desarrollan anomalas cromosmicas adicionales. A veces, estas anomalas de los cromo
somas se pueden detectar en el tejido extramedular antes de las manifestaciones
clnicas y hematolgicas de la crisis blstica. Los cambios cromosmicos secundarios se
han comunicado en ms de 1.500 pacientes con LMC. Aunque n o existe una nica va a la
progresin, la anomala cromosmica adquirida ms comn es la adquisicin de otro cromosom
Ph. Las anomalas que afectan a los cromosomas 8.17.19 y 22 son las siguientes ms
comunes afectadas en la progresin de la enfermedad Dos pruebas moleculares que de
lectan el tamao o cantidad del producto de la transcripcin del ARNm BCR-ABL pueden
ser tiles para evaluar la transformacin de LMC: la PCR cuantitativa y el tamao del
producto del gen BCRABL (Serra. 1993; Lion, 1994: Preudhomme. 1999). Se han det
ectado dos tamaos de proleina de lusin BCR-ABL que corresponden a protenas con peso
s moleculares de 190 kDa y 210 kDa. Por lo general, los casos de transformacin bls
tica en la LMC expresan la forma de 210 kDa. mientras que los nuevos casos de LA
L con un cromosoma Ph expresan la forma de 190 kDa. Debido a que algunos casos d
e transformacin blstica de LMC se presentan sm una fase crnica previamente diagnost
icada, la LMC subyacente se sugerir por la presencia de un producto p210. Adems, l
a presencia de una forma de 190 kDa en conjuncin con un producto de 210 kDa sugie
ren la evolucin a una fase terminal. Aunque ste puede ser el caso, se pueden tambin
generar niveles bajos de productos p190 por medio de una rotura alternativa de
la fusin de transcripcin p210. y no indica de forma universal una transformacin. En
estos casos es crtica la correlacin morfolgica. La cantidad de mensaje BCR-ABL se
puede determinar mediante PCR cuantitativa. Aunque no se utiliza mucho, esta pru
eba puede semi-cuantificar el nivel de transcripcin de ARNm BCR-ABL en pacientes
con LMC. Aunque el nivel absoluto no es predictivo de una transformacin, un aumen
to desde unos niveles bsales previamente documentados para ese paciente puede pre
decir una inminente transformacin, por lo general en el plazo de seis meses.
Leucemia mieloide crnica Diagnstico
La LMC es un trastorno clonal de las clulas madre que se caracteriza por una prol
iferacin aumentada de elementos mieloides en todas las fases de diferenciacin. El
diagnstico de LMC se basa en el examen microscpico de un frolis de sangre perifrica
y de la biopsia de mdula. La documentacin de una traslocacin caracterstica entre lo
s cromosomas 9 y 22. t(9:22) (p34.l :q11.21) (cromosoma Filadelfia [Ph]) confirm
a el diagnstico. La traslocacin recproca coloca el proto-oncogn ABL en el cromosoma
9 y prximo al gen BCR en el cromosoma 22 (Figura 65-1 A) (Kurzrock, 1988: First I
nternational Workshop. 1978; Heislerkamp, 1988:Tymmons. 1989; Chissoe. 1995: Pap
ayannopoulou. 1977). Esta alteracin gentica da lugar a la formacin de una proteina
quimrica. BCR-ABL. El producto de la fusin se expresa por lo general como una prot
eina quimrica de un peso molecular de 210.000 Da (p210) (Wada, 1995: Guo, 1991: G
orska-Flipol. 1990). P210 acta liberando los controles de la proliferacin de clulas
madre o bloqueando la muerte celular programada, de forma que conduce a la prol
iferacin de este clon. Ms recientemente se han descrito puntos de rotura adicional
es BCR-ABL y nuevas protenas de fusin (Wada. 1995). En una pequea proporcin de pacie
ntes con LMC. tambin se ha visto que se producen traslocaciones complejas, en las
que participan de forma universal el cromosoma 22 y. por lo general, el cromoso
ma 9 (Champlin. 1985; Bernstein, 1999: Kurzrock. 1988: First International Works
hop. 1978). El conocimiento de estos ltimos hallazgos es crtico para la interpreta
cin de las pruebas moleculares para la presencia de t(9:22) (McCIure. 1994). Los
pacientes con LMC y con un cromosoma Ph clsico demostrable mediante citogentica ti
enen una fusin molecular de los genes BCR-ABL. Esta traslocacin cromosmica puede ta
mbin ponerse de manifiesto mediante anlisis Southern Blot (Kurzrock. 1988) o bien
detectarse el producto de la transcripcin del ARNm de fusin mediante RT-PCR (Milel
man. 1993). Aunque el Soulhem Blot y RT-PCR pueden no detectar traslocaciones co
mplejas, Southern Blot detecta una traslocacin en una pequea minora de casos de LMC
descritos como falsos negativos utilizando tcnicas citogenticas (Kantarjian. 1990
: Martiat. 1991). Las caractersticas clnicas y hematolgicas de esta pequea cohorte d
e casos que son falsamente normales desde el punto de vista del cariolipo. pero

que tienen redisposiciones BCR detecta-

CAPTUIO 65 TCNICAS MOLECULARES EN El DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYTICAS

Cromosoma 9 Cromosoma 22 1(^:22) (q34;qll)
1357
Q
i
Figura 65-1. A. E s q u e m a de una fusin que afecta a los genes BCR y ABL. El p
anel superior muestra el fenmeno de traslocaon de cromosomas t(9:22) (q34; ql 1).
que dan lugar a la formacin de un gen de fusin BCR-ABL en el cromosoma 22q. El pan
el inferior muestra la estructura molecular del oncogn BCR-ABL. la transcripcin qu
imrica del A R N m y la proteina de fusin bcr-abl. El tipo de fusin-rotura que se m
uestra (una regin principal de rotura de BCR) se encuentra en la leucemia mieloid
e crnica y en un subconjunto de leucemias linfoblsticas agudas con positividad par
a el cromosoma Filadeltia. Como resultado de la fusin gentica, el hbrido de transcr
ipcin BCR-ABL contiene secuencias BCR 5 unidas a casi toda la regin que codifica l
a tirosina cinasa ABL. En este caso, se forma una protena BCR-ABL de 210 kDa c o
n una sobreactividad constitutiva de tirosina cinasa. El comportamiento aberrant
e de esta protena hbrida parece contribuir a la gnesis de la leucemia induciendo un
a transduccin de seal mitognica no supervisada. 8. Anlisis RT-PCR para deteccin de la
fusin BCR-ABL Blot representativo de productos PCR Despus del aislamiento del ARN
. se realiz u n a RT-PCR utilizando cebadores de oligonucletidos que cubren la unin
de fusin de la regin principal de roturas (MBR). Los productos P C R se transfiri
eron a una membrana de nylon y se detectaron en esta situacin con una oligosonda
especifica de la unin b3-a2. En las calles A, C y D: muestras de pacientes positi
vas para la fusin BCRABL b3-a2: en las calles B y E: muestras de pacientes negati
vas para la fusin; calle "" : clulas control negativas: calle V : clulas positivas c
ontrol para la fusin b3-a2: calle Bl': control nulo (sin ARN).
Enfermedad residual y recidiva despus de la terapia
RT-PCR se ha aplicado tambin a la deteccin de enfermedad residual mnim a (MRD) (Tab
la 65-1) (Siever. 1995). RT-PCR amplifica el ARNm quimrico formado por la trasloc
acin enlre el cromosoma 9 y 22 en la LMC. El producto amplificado da lugar a una
banda especfica en la electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa. La sensi
bilidad puede aumentarse aun ms median
le anlisis Southern Blot del gel utilizando una sonda de oligonucletidos. RT-PCR s
e puede hacer como una tcnica de fase nica o de incubacin, ofreciendo cada una cier
tas ventajas frente al anlisis cariotipico o el anlisis Southern Blot. La PCR de f
ase nica permite la deteccin de entre una de cada 10- a 10 clulas. La RT-PCR 'anida
da' permite la deteccin de entre una de cada 10 a 10 clulas. Ambos tipos de RT-PCR
son especilicas. relativamente baratas, tiles fuera del contexto de la investiga
cin y rpidas, estando disponibles los geles entre 24 y 48 horas despus de la obtenc
in del espcimen.
5 r

1358
Tabla 65-1
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
C o m p a r a c i n de los m t o d o s P C R para la identificacin de leucemia re
sidual
1
Anomala cromosomica 1(15:17)
Ventajas La deteccin se correlaciona con la recada Supervivencia prolongada en pru
ebas negativas
Desventajas
seis meses que siguen a un trasplante son difciles de interpretar por varias razo
nes. Se pueden obtener falsos negativos debido a la escasez o "parcheado" del ma
terial celular, y algunos pacientes tienen resultados positivos que desaparecen
despus de seis meses.
Leucemia linfoblstica aguda RT-PCR para t(1;19) (q23;p13)
Se ha observado que las traslocaciones cromosmicas no aleatorias adquiridas que s
e asocian con las leucemias humanas son marcadores fiables de clulas leucmicas. En
la leucemia linfoblstica aguda, las ms comunes son t(1:19) (q23:p13) y t(12;21) (
Tabla 65-2) (Amylon, 1997; Rubmtz, 1997; Privitera. 1996; Hunger, 1998). El uso
de la RT-PCR en casos de LAL con estas traslocaciones puede proporcionar una inf
ormacin pronostica critica, as como el descubrimiento de enfermedad residual mnima.
La t(1:19) Iq23:p13) es una traslocacin frecuente en la LAL infantil (Hunger, 19
98: Privtera. 1996.1994). Esta traslocacin se produce en el 5% al 6% de todas las
LAL infantiles, pero tambin se produce en aproximadamente un 25% de casos pre-B (
positiva para inmunoglobulinas citoplsmicas). En general, la 1(1:19) conduce a la
fusin de E2A. y el gen que codifica la protena hlice-asa-hlice (HLH) en el cromosom
a 19. con PBX1. un "homeobox" que contiene el gen en el cromosoma uno. El hbrido
E2A-PBX-lse expresa c o m o un conjunto de protenas quimricas oncognicas. En la may
ora de los casos, los puntos de rotura genmicos de t( 1:19) se producen en un intrn
nico de E2A y PBX1. dando lugar a ARNm quimricos transcritos que muestran un punt
o de unin uniforme. La presencia de este punto de unin uniforme permite la deteccin
de la mayora de los casos de LAL con t(1:l9) mediante RT-PCR. La t(1:19) se ha a
sociado con un mal pronstico clnico, aunque la quimioterapia intensificada parece
ser eficaz para anular su impacto pronstico adverso, Por tanto, la deteccin de t(1
;19) en un caso de LAL de estirpe B tiene importancia pronostica y lerapulica. A
pesar de su importancia en los especmenes diagnsticos, el anlisis medante PCR no cu
antitativa para enfermedad residual mnima al trmino del tratamiento de consolidacin
no parece ser de valor clnico o pronstico, debido a que no hay diferencia en la s
upervivencia libre de incidencias de los casos positivos o negativos para PCR de
las LAL en remisin (Tablas 65-1 y 65-2).
t(8:21) inv(16) Anomalas 11q23 t(9;22)
t(i;i9) I(12;21) TCR-/ igH

No es prediclora de recada a menos que sea cuantitativa Se desconoce si predice l

a recada Se desconoce si predice la recada La deteccin tarda La deteccin precoz despu
de un cierto (<6 meses) no periodo de tiempo se se correlaciona con correlacion
a con el la recada de la LMC riesgo de recada en la LMC No predice la recada a meno

s que sea cuantitativa La deteccin se correlaciona con el nesgo de recada Se desco

noce si predice la recada
RT-PCR tiene limitaciones en la LMC (Dhingra. 1992). La extrema sensibilidad del
mtodo crea una cierta tasa de falsos positivos, sobre todo debido al arrastre de
productos de reacciones previas a las nuevas muestras. La tasa de falsos positi
vos es normalmente ms alta con la RT-PCR "anidada" en relacin con la de fase simpl
e debido a la mayor sensibilidad de la RT-PCR anidada. Adems, los controles negat
ivos son crticos en ambos tipos de anlisis RT-PCR. Los falsos negativos producidos
por la degradacin del ARN se pueden excluir utilizando una secuencia control de
ARNm en paralelo. Adems, una pequea minora de los casos tienen puntos de rotura com
plejos (<5%), dando lugar a falsos resultados negativos en la RT-PCR. Las tcnicas
de PCR y de Southern Blot parecen tener una sensibilidad similar frente a local
izaciones atipicas de rotura: sin embargo, el anlisis cariotpico probablemente det
ecte estas traslocaciones poco habituales. Un alto riesgo de recidiva se ve anun
ciado por un RT-PCR positivo durante ms de seis meses despus de un trasplante de md
ula sea (Hughes, 1991; Van Rhee, 1994: Xu. 1994). Los resultados positivos o nega
tivos en los
RT-PCR para t(12;21)
Investigaciones recientes han demostrado que una t(12;21) es la traslocacin cromo
smica ms frecuente en la LAL infantil, producindose en el 25% de todos los casos (R
ubnitz. 1997; Amylon. 1997;Hoshino. 1997: Uphofl, 1997). Esta traslocacin es "crpt
ica", queriendo decir que por lo general no se detecta mediante tcnicas citogentic
as. pero que se detecta con frecuencia meTabla 65-2
Traslocaciones recurrentes c
Ph' adulta y peditrica LAL
("estirpe mixta") LAL. LAM y
RARct AML l-ETO CBFji-MYH 1!
E2A-PBX1

o m u n e s y Enfermedad LAM-M3 LAM-M2 LAM-M4EO LAL

pre-B peditrica LAL pre-B peditrica LAL pre-B peditrica
LAM secundaria adultas y peditricas Gen de fusin PMLBCR-ABL

Traslocacin t(15;17)(q24;q22) I(8;21)(q22;q22) invl6(p13;q22)o t(16;16)(p13;q22)

I(9;22)(q34.q11) t(1;19)(q23:p13.3) t(12;21)(p13;q22) I(4;11)(q21:q23) Otras tra
slocaciones 11(q23)

Mecanismo Proteina quimrica Protena quimrica Protena quimrica Sobreexpresin de oncog

roteina quimrica Protena quimrica Protena quimrica Protena quimrica
Deteccin RT-PCR RT-PCR RT-PCR SBH RT-PCR SBH RT-PCR. SBH RT-PCR RT-PCR. SBH RT-PC
R, SBH
Frecuencia (%) 5 10-15 10 20 (adulto) 5 (peditrico) 5 20-25 3-4' Variable'
Sensibilidad" 1/10M0 VIOMO 1/10 -10
a 4
6 ;
1/W-10' 1/1OM0 1/10 1/10
4 4 f
TEL-AML I MLL-AF4 MLUoliOS
1/10'
" "Sensibilidad", tal c o m o se menciona, refleja el mtodo de deteccin ms sensible
(por ejemplo. PCR). ' Casi un 80% de las LAL inlantiles. Variable: el porcentaj

e depende del subtipo de leucemia

!
.
!

C A P T U L O 65

TCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H
E M A T O P O Y T I C A S
1359
diante RT-PCR. El 1(12:21) da lugar a una fusin en el dominio HLH del gen TEL a l
os dominios de Iransactivacin y unin al ADN del gen AML /. El gen TEL es un miembr
o de la familia recientemente descrita ETS de factores de transcripcin, y el gen
AML1 codifica la subunidad de unin al ADN (CBFot) del complejo de transcripcin del
tactor de unin al "core". El gen TEL participa tambin en otras traslocaciones poc
o habituales, incluyendo t(5;12). t(9;l2), t(10;12) y t(12;22), que se encuentra
sobre todo en trastornos mielodisplsicos y mieloprolilerativos. A diferencia de
ello, el complejo del factor de unin al core AML1 'CDFji es el objetivo ms frecuen
te de las traslocaciones cromosmicas en los casos nuevos de LAM. estando alterado
en t(8:21) e inv(16) en hasta un 30% de los casos. La funcin de la oncoprotena TE
UAML1 sigue siendo desconocida, pero datos recientes sugieren que altera directa
mente la actividad transcripcional de AML1. necesaria para una hematopoyesis nor
mal. Los estudios iniciales han indicado que la presencia de esta traslocacin ide
ntifica un subgrupo clnicamente diferente con un pronstico favorable a pesar de la
ausencia de hiperploidia en estos pacientes (Tablas 65-1 y 652) Cuando se estra
tifica de acuerdo con la edad, recuento leucocilario. clasificacin de riesgo y rgi
men teraputico, los pacientes con redisposiciones TEL tienen un pronstico signific
ativamente mejor que aquellos con una lnea germinal TEL. De hecho, el poder predi
ctivo de la redisposicin TEL en la LAL peditrica excede a todos los dems lactores d
e valoracin de riesgo. Las bases biolgicas o moleculares para el buen pronstico son
desconocidas.
TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LINFOMAS Bases para el anlisis g
entico molecular en los trastornos linfoides
Los linfomas no-Hodgkin (LNH) y las leucemias linfticas crnicas constituyen una en
fermedad maligna relativamente comn enlre los adultos, y la incidencia de estos t
rastornos va en aumento (Ries. 1994). El abordaje anatomopatlogo tradicional para
el diagnstico de LNH comprende el reconocimiento de las caractersticas clulas tumo
rales con microscopio ptico, p o r lo general suplementado mediante estudios con
marcadores inmunofenotpicos. La aplicacin de mtodos de fenotipado cada vez ms sofist
icados, incluyendo la citometra de flujo y la inmunoperoxidasa. ha mejorado de lo
rma considerable nuestra precision diagnstica y nuestra capacidad para subclasifi
car los tumores linfoides. Un paradigma central en el diagnostico del linfoma es
la demostracin de la clonalidad. que est relacionada con el estado maligno. De nu
evo, en muchos casos, la clonalidad se puede sugerir o establecer con ayuda de e
studios de inmunofenotipado. mediante la demostracin de restriccin de cadenas lige
ras en el caso de las neoplasias de clulas B o mediante expresin de antgenos aberra
ntes en la proliferacin de clulas T. Sin embargo, hay varios casos en los que los
anlisis previos pueden ser insuficientes y la determinacin de la clonalidad linfoi
de sigue siendo un mtodo diagnstico clave. En este contexto, la valoracin molecular
de las redisposiciones genticas de los receptores clnales de antigenos ha sido ex
tremadamente valiosa en ciedas situaciones tcnicas, como muestras con caracterstic
as fenotpicas poco definidas, biopsias tisulares pequeas y tejidos impregnados con
parafma. Los mtodos habituales de deteccin de clonalidad se emplean tambin ocasion
almente para distinguir los linternas de clulas grandes de la enfermedad de Hodgk
m. para asignar lineas celulares en tumores hematopoyticos no diferenciados (esto
es. de clulas B frente a clulas T) y para ayudar de forma general en el diagnstico
de los trastornos linfoproliferativos de clulas T. Adems, la determinacin molecula
r de la clonalidad es a menudo necesaria para resolver el diagnstico definitivo d
e neoplasias linfoides con caractersticas que potencialmente se parecen a las hyp
erplasias benignas (por ejemplo, linternas centrofoliculares. linfomas de tipo "

MALT" y leucemia linftica de clulas T granulares grandes) La identificacin de anoma

las recurrentes, genticas y no aleatorias de los linfomas, producidas la mayora de
las veces por fenmenos de traslocacin cromosmica. ha proporcionado otro conjunto ad
icional de herramientas diagnsticas y perspectivas biolgicas nuevas Los datos cito
genticos y de gentica molecular de esta clase forman ahora una parle integral de l
as clasificaciones actuales de los linternas (Hams. 1994). La correlacin de redis
tribuciones genticas especficas con subtipos particulares de linterna proporcionan
no solamente unos marcadores moleculares alternativos para la determinacin de la
clonalidad, sino que, de forma ms significativa, ayudan a clasificar de forma pr
ecisa la enfermedad. Segn sigue aumentando nuestro conocimiento de la biologa de l
os linternas, el reconocimiento de entidades especficas basadas en criterios genti
cos moleculares probablemente lorme una faceta integral de los tralamientos "dir
igidos al tumor". La seccin que sigue delalla los abordajes moleculares a la dete
rminacin de la clonalidad de clulas B y T. la deteccin y significado de las trasloc
aciones comunes recurrentes en los linfomas y la aplicacin de tcnicas moleculares
al seguimiento postratamiento de enfermedad mnima.
Leucemia mieloide aguda
Se ha utilizado RT-PCR en la LAM para la deteccin de anomalas 1(15:17), 1(8:21). i
nv(16). y Hq23 Tablas 65-1 y 65-2). Los anlisis basados en RT PCR en la LAM tienen
las mismas ventajas y limitaciones tcnicas que en el LMC: sin embargo, es import
ante evitar la tentacin de aplicar los resultados de un anlisis especifico al grup
o heterogneo de la LAM como todo. La importancia clnica de cada prueba debe determ
inarse individualmente como se explica ms adelante. La caracterstica traslocacin t 1
5:17) (q22:p21) est presente en casi todos los pacientes con leucemia promieloctic
a aguda (sistema de clasificacin de leucemias franco-americano-britnico [FAB] M3 L
AM), constituyendo del 5% al 10% de todas las LAM (Miller. 1992). La traslocacin
entre un receptor de cido retinoico (RAR-a) en el cromosoma 17 con el gen de la l
eucemia promieloctica (pml) en el cromosoma 15 da lugar en ltima instancia a una p
roteina de fusin PMLRAR-rx. L a proteina quimrica contribuye de forma aparente a l
a gnesis de la leucemia inhibiendo la diferenciacin o promoviendo la supervivencia
celular mediante la inhibicin de la apoptosis. Los anlisis RT-PCR persistentement
e positivos tienen una relacin directa con la recada, distinguiendo a un pequeo gru
po de pacientes en los que la recada es casi segura (RT-PCR-posilivos) de un grup
o ms grande en los que la recidiva es poco probable (RT-PCR-negativos). Adems, las
pruebas a intervalos probablemente disminuyan los resultados clnicos ambiguos de
l grupo negativo al identificar pacientes propensos a recaer antes de la aparicin
de una enfermedad manifiesta. La t(8;21) (q22;q22) se observa en el 6% al 18% d
e las LAM, con mayor frecuencia en la LAM FAB-M2 (Nucifora, 1993a; Chang, 1993:
Nucifora, 1993b) A diferencia de t(9;22) y t( 15:17). los investigadores han det
ectado de forma persistente y repetitiva esta traslocacin en pacientes con remisin
de larga duracin. As, a diferencia de p(15;17), en la LAM FAB-M2 la deteccin de t(
8:21) no predice una recidiva inminente; sin embargo, dado que la deteccin de la
traslocacin implica un peor pronstico y probablemente un abordaje teraputico difere
nte, el uso de la RT-PCR en la LAM (FAB-M2) es una posible alternativa al anlisis
citogentico en el momento del diagnstico y terapia inicial. La inv(16) (p13q22) e
st presente en el 2% al 8% de las AMP peditricas, con mayor frecuencia en asociacin
con una leucemia clasificada morfolgicamente como FAB-M4Eo (Liu. 1993: Claxton,
1994). Las anomalas 11q23. incluyendo t(4;11) son tambin comunes en LAM y en la LA
L peditricas (Yamamoto, 1994). Inv(16) es un hallazgo favorable en la LAM. 1lq23
tiene un mal pronstico en la leucemia peditrica y en la LAM secundaria del adulto.
La utilidad de 1lq23 y de inv(16) en la MRD no est bien estudiada hasta la fecha
.
Anlisis de las reorganizaciones de los genes receptores de antgenos para la determ
inacin de la clonalidad Mecanismo de las reorganizaciones de los genes receptores
de antigenos
Los genes de receptores antignicos se redistribuyen precozmente en el desarrollo
de los linfocitos B y T en la mdula sea y en el timo, respectivamente. El proceso
de redistribucin, o recombinacin gentica, afecta especialmente a la divisin y fusin d

e uno de los numerosos segmentos variables (V) del gen con un exn de unin (J). En
algunos puntos, y notablemente en

1360
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
los receptores |5 de las inmunoglobulinas de cadenas pesadas y clulas T, se inter
pone un segmento de diversidad (D) suplementario de los segmentos Vy J-. El segm
ento ensamblado V-J o V-D-J se une despus con la regin constante (C) del gen recep
tor del antgeno para producir una secuencia codificadora intacta capaz de traduci
rse en una protena funcional del receptor de antgenos (Sklar. 1992). Las clulas inm
unes incapaces de producir protenas de receptor funcionales se destruyen mediante
apoptosis. Para las clulas B inmaduras, el gen de las cadenas pesadas de inmunog
lobulinas del cromosoma 14(q32) es el primero en someterse a una redistribucin se
gmentaria, que se sigue a su vez por el gen K de cadenas ligeras en 2(p12). Si e
ste ltimo intento es no productivo en ambos alelos, se selecciona el locus X en 2
2(q11) (Sklar, 1992). Para las clulas T, el receptor de las clulas 8 (T6) (14(q11)
] y y (Ty) [7(p15]) inician este proceso en el timo; sin embargo, muchas de esta
s redistribuciones de los genes 5 o y fracasan en la produccin de receptores prot
enicos funcionales. As. la redistribucin contina en los locus TCR a y -p, localizado
s en los cromosomas 14(q11) y 7(q34). respectivamente, generando un receptor Tct
p en una gran mayora (85% al 90%) de las clulas T (Sklar, 1992). Como punto import
ante en relacin con el anlisis molecular (ms adelante), prcticamente todas las clulas
maduras Tup siguen portando una redistribucin del locus genticos Ty. Existe una e
norme diversidad en los receptores de inmunoglobulinas y clulas T, que surgen del
potencial de recombinacin gentica entre numerosos segmentos de genes V-, (D-) y J
- en estos puntos. Adems, la actividad de la enzima desoxmucleotidil-transferasa
terminal (TdT) aade de forma aleatoria bases de cidos nucleicos a las uniones de l
os segmentos reorganizados de los genes, aumentando an ms la diversidad de las sec
uencias. Como resultado de todo este proceso, los linfocitos individuales B y T
transportan redistribuciones genticas peculiares y expresan en su superficie celu
lar molculas inmunes de receptores de antgenos peculiares. En una expansin lnfoide p
oliclonal, existe por lo general una distribucin altamente variable de redistribu
ciones genticas de receptores antignicos, mientras que en una poblacin monoclonal e
s caracterstica una redistribucin nica e idntica en cada clula. Este concepto se expl
ota tanto en la hibridacin Southern Blot (SBH) como en los mtodos de PCR. para dis
tinguir las proliferaciones policlonales ("benignas") de las monoclonales ("tumo
rales").
nicas SBH para detectar clonalidad linfoide depende de varios factores. Primero,
el locus que se est estudiando debe ser anatmicamente favorable para su estudio m
edante digestin enzimtica e hibridacin con sondas. Ciertos locus, como el gen Ta, so
n muy grandes y difciles de valorar de forma adecuada con una buena sensibilidad
utilizando un nmero prctico de digestin enzimtica restringida y sondas. Por el contr
ario, el locus Ty, y tal y como se explica ms adelante, es relativamente pequeo y
de diversidad limitada, dando lugar a una escasa especificidad e impidiendo su u
so en la SBH. Segundo, las sondas deben estar disponibles con facilidad para su
uso en el diagnstico clnico. Las sondas pueden producirse a partir de un fragmento
de ADNc (complementario) a la regin que nos interesa o mediante clonacin genmica.
y en el comercio existen varias de ellas. Por ltimo, el mtodo SBH precisa del uso
de un ADN no degradado, de alio peso molecular y procedente de fuentes (.Bulares
frescas o congeladas. Dado que para la digestin enzimtica se utiliza una cantidad
uniforme de ADN (por ejemplo, 5 pg), se puede obtener una estimacin de la propor
cin de clulas clnales o de linea germinal en una muestra dada. Para la determinacin
de la clonalidad de clulas B mediante SBH, se han utilizado tanto los genes de la
s cadenas pesadas de inmunoglobulinas (IgH) como los de las cadenas ligeras (K,
X). El gen IgH se valora frecuentemente mediante una sonda para la regin J (Willm
an. 1990: Cossman. 1988). La regin J de IgH es altamente informativa, dado que es

te locus es relativamente compacto, se define con facilidad mediante digestin enz

imtica restringida y siempre participa en los fenmenos de recombinacin de las clulas
B. El gen de las cadenas ligeras ic ha sido tambin estudiado mediante anlisis SBH
. con una sonda de la regin J,, aunque una minora de casos de linfoma (aquellos co
n una recolocacin de las cadenas ligeras X) pueden ser pasados por alto debido a
una delecn especfica del locus K (Medeiros. 1995). Las redisposiciones del gen de l
as cadenas ligeras X puede valorarse con una sonda de la regin constante (C,); si
n embargo, este locus es altamente polimrfico con los estudios habituales de rest
riccin enzimlica y los resultados de las bandas son ms difciles de interpretar (Saue
racker, 1992). El locus (3 de las clulas T (T,J ha resultado ser el ms til para la
deleccin de la clonalidad de las clulas T mediante SBH, y esta regin comparte carac
tersticas estructurales parecidas a las del gen IgH. La complejidad del locus T s
e ve aumentada por la presencia de dos regiones D-, J- y C- disponibles para la
recombinacin con el gran repertorio de segmentos de la regin V . Sin embargo, dado
que las dos regiones C,, son de una secuencia casi idntica, las redistribuciones
del gen T, se pueden identificar mediante SBH utilizando una sonda genmica C y di
gestin restrictiva adecuada del ADN objetivo (Figura 65-2/4) (Medeiros, 1995). Se
ha descrito tambin el uso de sondas especficas de la regin J para detectar clonali
dad en el locus T, (Medeiros. 1995). El locus T-y (T.) es por lo general poco ad
ecuado para el anlisis SBH debido al nmero relativamente pequeo de segmentos redist
ribuidos de las regiones V y J. Esta capacidad limitada para la recombinacin segm
entaria crea un conjunto relativamente pequeo de redistribuciones funcionales del
gen T As, en una poblacin policlonal de clulas T. el SBH con una sonda de regin J,
resuelve potencialmente varias bandas prominentes adems de los fragmentos esperad
os de linea germinal, a diferencia del anlisis SDH del locus T. donde los clones r
eactivos benignos individuales no pasan por encima del umbral de sensibilidad de
deteccin (Cossman, 1988: Medeiros, 1995). Esta situacin conduce a la posibilidad
de lamar errneamente "seudoclonales" a las bandas de los procesos reactivos de clu
las T y, por el contrario, puede oscurecer la identificacin de un autntico gen mon
oclonal T.. en presencia de clulas benignas T coexistentes.
|( |t |( r
Tcnicas para detectar reorganizaciones de los genes de receptores antignicos
Hibridacin Southern Blot. Las tcnicas SBH se pueden considerar un abordaje molecul
ar a "gran escala", que comprende una digestin restringida mediante endonucleasas
de una muestra de ADN de alto peso molecular, seguida de separacin de fragmentos
, inmovilizacin sobre una membrana y deteccin mediante una sonda radioisotpica espe
cfica de uno o ms fragmentos objetivo de ADN (relativamente grandes) (Willman. 199
0; Cossman. 1988). Esta tcnica se describe con detalle en el Captulo 59. De forma
resumida, y para una regin estructuralmente no alterada (no reorganizada) del ADN
objetivo, el anlisis por hibridacin Southern mostrar un cierto patrn de tamaos de fr
agmentos o de bandas, una configuracin de lnea germinal, basada en la distribucin d
e determinados puntos de restriccin enzimtica dentro del locus en cuestin. Si esta
regin del ADN se redistribuye, como en el caso de los locus de receptores antignic
os de las clulas B y T, se producir un patrn de bandas diferente (como resultado de
los cambios en las localizaciones en los puntos de restriccin enzimtica de linea
germinal), y estos cambios se pueden reconocer con facilidad mediante hibridacin
con una sonda especifica. La sensibilidad de SBH es tal que por lo menos un 5% d
e una poblacin de clulas deben contener la misma redistribucin de linea no germinal
para poder detectarse. En una poblacin linlocitaria policlonal, las clulas indivi
duales D o T son portadoras de redistribuciones peculiares de sus genes de recep
tores antignicos, y tericamente se debera esperar que generen una "escalera" o ampl
ia distribucin de las redistribuciones cuando se analiza mediante SBH y con sonda
s adecuadas. Sin embargo, y en la prctica, en las proliferaciones policlonales no
se ve este patrn de redistribucin, dado que incluso grupos expandidos y altamente
seleccionados de clulas lnfoides reactivas no constituyen un 5% de las clulas tota
les en estas situaciones. Por contra, cada clula de una poblacin monoclonal contie
ne una redistribucin de los genes receptores de antgenos idntica, y la SBH identifi
car bandas reorganizadas y claras (lineas no germinales) (Figura 65-24). La aplic
acin con xito de las tc-

Reaccin en cadena de polimerasa. Las recombmaciones de los genes de los receptore

s de inmunoglobulinas y clulas T pueden identificarse tambin por mtodos PCR. A dife
rencia de SBH, que detecta alteraciones genmcas estructurales relativamente grande
s basndose en cambios en los puntos de restriccin enzimtica, la PCR est diseada para
amplificar regiones cortas de ADN correspondientes al rea de fusin de segmentos de
l gen en los genes recombmados del receptor de antigeno. Bajo condiciones estndar
de PCR. la configuracin del gen de receptor de antgenos de lnea germinal se amplif
ica con una baja eficiencia, o no se amplifica en absoluto, debido a las reas de
tamao muy grande intervnientes de ADN entre los puntos d e cebado. Sin embargo, cu
ando los segmentos codificadores V-, (D-) y J se yuxtaponen en un gen recombinad
o, la amplificacin de la regin entre los ceba-

CAPTULO 65
TCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYTICAS
1361
FR3-JH
Figura 65-2. A. Hibridacin Southern Blot en el locus T|i. Se muestra un ganglio l
inftico benigno (L) ADN de linea germinal piacentana (P) y un ganglio linftico a f
e c t a d o por un linloma de clulas T (A). Cada una de las muestras le digenda c
on los enzimas de restriccin B a m H 1 (B), EcoR1 (E) y Hindlll (H) c o m o se in
dica. Despus de una electroforesis en gel y la transferencia a una m e m b r a n
a de nylon, los f r a g m e n t o s del locus especifico T|i de cada digestin se
detectan mediante hibridacin con una s o n d a etiquetada de forma radioactiva y
expuestos a una placa radiogrfica. Los patrones de bandas de lnea germinal (no reo
rganizados) se presentan para las muestras L y P, y estas bandas se ven t a m bin
en la muestra del linfoma (A). Sin embargo, la muestra del linfoma (A) muestra
adems dos bandas concretas de lnea no germinal, o reorganizadas, tanto en las dige
stiones Bamhl c o m o Hindlll (flechas). Dado que se utiliza la m i s m a cantid
ad de ADN en c a d a canal, se p u e d e estim a r la cantidad relativa de enler
medad clonal en la muestra del t u m o r Obsrvese la t e n u e banda de linea ger
minal en la m u e s t r a de nodulo linftico benigno (L) en la digestin BamH1. ind
icando que aqui se us una cantidad insuficiente de ADN. B. E s q u e m a de la es
tructura parcial del gen IgH y de la estrategia PCR para la deteccin de la reorga
nizacin del gen IgH Se indican las regiones determinantes c o m p l e m e n t a r
i a s (CDR) y las regiones m a r c o (FR) de la cadena pesada variable Ig funci
onal. Superpuestas estn las regiones V-, D- y J-. ilustrando la relacin de los s e
g m e n t o s codificadores del gen con la estructura variable IgH de la cadena
de anticuerpos. El s e g m e n t oV _ codifica la mayora de la regin variable en
la molcula IgH. incluyendo la tercera regin m a r c o (FR-lll). El "CDR III" est fo
rmado p o r la unin de los s e g m e n t o s individuales V . D y J y es una regin
a l t a m e n t e peculiar en la secuencia de c a d a clula B. La letra "n" indi
ca focos de inserciones nucletidas n o c o n t e m p l a d a sp o r la enzima TdT
durante la recombmacin VDJ. Para la deteccin m e d i a n t e PCR de la clonalidad
. el ob|etivo es CDR III. Con la m a y o r frecuencia, esto se consigue m e d i
a n t e el uso de un FR III de consenso y un conjunto de cebadores J (y D). Los mt
odos alternativos pueden incluir cebadores de consenso FR ll-JH (B y D) o una fa
milia de cebadores FRI especficos de secuencia para la regin V con un c e b a d o
r de consenso JH (A y D). La PCR de amplificacin a travs de la regin de unin peculia
r IgH produce una m a n c h a o distribucin de producios en un proceso de clulas B
policlonal. o un producto nico de tamao definido en una poblacin monoclonal. C. I
m a g e n representativa d e la PCR F R lll-JH (CDR III) para la deteccin de las
reorganizaciones del gen d e las cadenas pesadas de i n m u n o g l o b u l m a
s (IgH). Despus de la amplificacin de IgH CDR III m e d i a n t e la reaccin de pol
imerasa en cadena, los productos PCR se analizan en un gel de poliacrilamida y s
e ven bajo luz U V tras su tincin con bromuro de etidio. Las calles etiquetadas A
a C representan m u e s t r a s de pacientes analizadas p o r duplicado L a cal
le A del paciente m u e s t r a una banda c l a r a m e n t e resuelta indicando
una poblacin m o n o c l o n a l de clulas B A diferencia de ello, la calle del p
aciente C m u e s t r a una m a c h a dilusa de productos PCR. acordes con un pr
oceso policlonal de clulas B La calle del paciente B no m u e s t r a ningn p r o
d u c t o de amplificacin, indicando una ausencia de poblacin significativa de clul
as B en la m u e s t r a En la ltima situacin, se necesita la amplilicacin de un AD
N objetivo control interno no relacionado para excluir una m a l a calidad del A
DN. Otras calles: L. escalera de peso molecular (tamao): calle *, control positiv
o de ADN: calle Bl. blanco (sin ADN).
H H K

1362
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
dores ahora muy prximos se lleva a cabo muy fcilmente mediante PCR. Los locus de ms
amplio uso para la determinacin mediante PCR de la clonalidad linloide son los g
enes IgH y T . En la Figura 65-2B se muestra un esquema de la IgH PCR. Se han de
scrito varios abordajes para la IgH PCR. La tcnica que se aplica con ms frecuencia
comprende la amplificacin a travs de la tercera regin determinante complementaria
(CDR III) del gen reordenado IgH (Segal, 1994; Slack. 1993). El IgH CDR III est f
ormado por la fusin de los exones V-, D-. y J-. La regin del gen V comprende casi 2
00 segmentos diferentes que se pueden agrupar en seis familias basndose en simila
ndades de secuencia Las regiones D - y J contienen aproximadamente 15 y 6 segmen
tos del gen, respectivamente. La recombmacin aleatoria de estos segmentos crea as
i una diversidad IgH significativa, aumentada an ms por la adicin de nucletidos func
ionales sin plantilla por la enzima TdT. Como resultado, el CDR III es completam
ente nico en cualquier clula B dada y puede utilizarse como un potente marcador de
clonalidad en las neoplasias de clulas B. Aunque el CDR III es extremadamente va
riable entre los linlocilos B, los mtodos de PCR de esta regin estn simplificados p
or el uso de cebadores consensuados. El extremo 3 de la regin contigua V conocida
como la regin marco III (FR III). exhibe secuencias nucleotidicas que estn muy con
servadas en la mayora de los segmentos del gen V . De lorma anloga, cada segmento
J contiene regiones de secuencia idntica de nucletidos. Se pueden asi disear cebado
res complementarios PCR para FR III y J que flanquean el CDR III. En una prolifer
acin policlonal de clulas B. pueden esperarse muchos miles de redistribuciones ind
ividuales CDR III. Dado que ninguna de estas poblaciones reactivas estn normalmen
te presentes por encima del umbral de sensibilidad del anlisis PCR (aproximadamen
te un 1%). en la electroforesis con gel se observa un patrn muy dbil de bandas mlti
ples (Figura 65-2C). En un proceso monoclonal de clulas B todas las clulas son por
tadoras de un CDR III idntico que se amplifica de forma preferencial durante la P
CR. dando lugar a una llamativa banda clonal durante el anlisis con gel (Figura 6
5-2C). De forma ocasional, puede existir una segunda banda, indicativa de redspos
iciones biallicas de IgH.
; H H H H
plo. 0.5 pg a 1 pg) en comparacin con SBH. PCR tiene una sensibilidad nominal de
un 1%. y esto puede extenderse aun ms entre un 0.1% y un 0,001%, mediante optimiz
acin en aplicaciones especiales tales c o m o la deteccin de linfoma o leucemia re
siduales. Adems. PCR se puede llevar a cabo a partir de fuentes tisulares parafin
izadas, frescas o fijadas, aunque algunos fijadores (por ejemplo. B5) o sustanci
as utilizadas por lo comn en el procesado de los ganglios linfticos o de la mdula se
a pueden inhibir la PCR. Aunque los mtodos PCR son ms "simplistas" en comparacin, l
a tcnica es muy lbil frente a alteraciones "micromoleculares de las regiones objet
ivo de los cebadores de oligonucletidos. As. el uso de cebadores de consenso no am
plificar redistribuciones poco comunes IgH o Tg que comprendan segmentos del gen
que carecen de las secuencias complementarias conservadas. Quiz de forma ms signif
icativa, las mutaciones de bases nucleotidicas o las delecciones en el ADN plant
illa pueden impedir una unin eficaz de las secuencias de cebadores complementaria
s, dando lugar al fracaso de la PCR Tales situaciones se producen en algunos tum
ores linfoides B que han sufrido hipermutaciones somticas de la regin CDR III. Los
ejemplos incluyen los linfomas de clulas centrofoliculares, algunos linfomas de
clulas grandes y los linfomas con diferenciacin plasmacitoide. en los que la deter
minacin de clonalidad puede variar de un 35% a un 60% utilizando PCR IgH CDR III
(Lombardo, 1996: Segal, 1995). L a tasa de deteccin de clonalidad en tumores de l
infocitos B pequeos de origen no folicular (por ejemplo, linfoma linfoctico pequeo,
linfomas de clulas del manto) es. por contra, prxima al 100%. Las leucemias Imfob

lsticas agudas de clulas B y los linfomas pueden portar de forma ocasional una red
istribucin clonal aislada D-J. o sufrir deleciones en la regin V., del gen. impidi
endo asi el xito de los mtodos habituales de PCR CDR III (Height. 1996). Para valo
rar la clonalidad Cg existe un problema ms difcil. A pesar de la naturaleza funcio
nal peculiar de cada reorganizacin de los segmentos V-J de Tg. la diversidad limi
tada de este locus puede dar lugar a amplicones PCR con un tamao muy parecido e i
ncluso caractersticas secuenciales m u y similares. Esto puede crear dificultades
para identificar una autntica poblacin clonal de clulas T cuando las clulas T polic
lonales coexistentes son numerosas, dado que las secuencias amplificadas similar
es pero no homologas pueden cear heterodplex" con los amplicones objetivo durante
la electroforesis en gel. disminuyendo de forma notable la capacidad para detec
tar una banda monoclonal. Dadas estas limitaciones de la tcnica PCR, la SBH puede
todava ser necesaria para resolver un problema difcil de clonalidad en una prolif
eracin linfoide. Dado que SBH valora la estructura de regiones genmicas de m a y o
r tamao, la tcnica no es adecuada para aquellos temas mencionados antes para la P
CR. SBH est considerada el mtodo de referencia para la determinacin de clonalidad e
n este contexto diagnstico y. afortunadamente, dado que la PCR es un mtodo m u y rp
ido, uno puede posteriormente revertir al anlisis SBH en caso de que los resultad
os de la PCR no sean determinantes. Sin embargo, la necesidad de cantidades adec
uadas de ADN de tejido fresco o congelado en muchos casos no se pueden satisface
r, y esta limitacin debida a la muestra ha estimulado las mejoras en los anlisis y
tcnicas PCR. Por ejemplo, se han utilizado conjuntos alternativos de cebadores p
ara soslayar el fracaso de la amplificacin debido a alteraciones en las regiones
CDR III o FR III que con una cierta frecuencia aparecen en la PCR del locus IgH.
Se pueden combinar un cebador de la regin II marco (FR II) situado aguas arriba
de esta regin de consenso o un nmero de cebadores VH "especficos de la familia" FR
I con el cebador de consenso JH (Figura 65-20) (Ramasamy. 1992; Aubin. 1995: Dea
ne, 1991). Estas maniobras sirven para aumentar el xito global de la deteccin de c
lonalidad desde aproximadamente un 65% (slo con la PCR estndar IgH CDR III PCR) ha
sta aproximadamente un 90% a expensas de un mayor trabajo y complejidad. Tambin s
e han utilizado de forma efectiva cebadores de PCR especficos de familia" para au
mentar la deteccin de clonalidad en el locus Tg (Greiner, 1999). Los cambios en e
l anlisis de gel pueden tambin afectar de forma significativa la resolucin y. por t
anto, la deteccin, de productos clnales de PCR. El uso de geles de poliacrilamida
es por lo general ms informativo que los geles de agarosa, y las modificaciones e
n la composicin del gel pueden mejorar esto todava ms. En el caso de la PCR Tg. la
generacin potencial de productos competidores pero mespeclicos de tipo heterodplex
puede reducirse de forma sustancial mediante vanos mtodos preanalticos y de electr
oforesis en gel. favoreciendo as la deteccin de una autntica poblacin clonal (Bottar
o.
El locus T aunque no es muy adecuado para SBH. ha sido, sin embargo, utilizado co
n xito para la determinacin de clonalidad de clulas T mediante PCR (Slack. 1993: Wo
od. 1994). Las redistribuciones del gen Tyse producen precozmente en los linfoci
tos T tmicos en desarrollo, y este evento gentico se retiene, aunque la inmensa ma
yora de clulas T inmaduras continan reorganizando los locus Ta y T|i, y en ltima ins
tancia desarrollan un fenotipo Ta(l de receplor. El locus Ty proporciona as un ma
rcador para valorar la clonalidad cuando se sospecha una neoplasia de clulas T. E
l locus Ty comprende once segmentos que codifican la regin V, agrupados en cuatro
lamilias basndose en similaridades de secuencia. Existen cuatro segmentos funcio
nales de la regin J, incluyendo los exones conservados Jyl y Jy2. asi como los ex
ones Jpl y Jp2 (McCarthy, 1992). La PCR de T. tambin se basa en la naturaleza pec
uliar de las redistribuciones luncionales en los linfocitos T individuales; la tc
nica es a menudo informativa a pesar de la diversidad segmentaria limitada de es
te locus, y teniendo en mente algunas limitaciones (analizadas en la prxima seccin
). Se pueden utilizar cebadores consensuados complementarios a las secuencias de
homologa compartida en los segmentos gamma V- y Jpara simplificar el procedimien
to de la PCR. De forma similar al caso de la PCR de IgH, los productos de amplif
icacin de las clulas T policlonales tienden a producir un patrn uniforme, mientras
que la monoclonalidad se pone de manifiesto en forma de una o dos bandas discret

as. Ventajas y limitaciones de SBH y PCR para la valoracin de la clonalidad linfo

ide. La decisin de utilizar PCR trente a SBH conlleva conocer varios factores tal
es como la fuente tisular. el tipo de trastorno linfoproliferativo que se estudi
a, la sensibilidad de cada uno de los mtodos y las frecuencias de falsos negativo
s y falsos positivos. En general, la tcnica PCR ha ganado una amplia popularidad
para la determinacin de la clonalidad. principalmente debido a su relativa facili
dad de llevarse a cabo y a su rapidez. El mtodo SBH es. por contra, m u y laborio
so, ms caro, y necesita de entre dos y tres semanas para completarse. Adems, SBH s
e lleva a cabo por lo general con sondas etiquetadas con radiactividad. Otras de
sventajas de SBH son la necesidad de tejido fresco o congelado de buena calidad
(para obtener un ADN de alto peso molecular) y una sensibilidad relativamente ba
ja, en la proximidad del 5%. La PCR es ventajosa en cuanto a que su tiempo es en
general de das, es ms barata y necesita una cantidad inicial de ADN mucho ms pequea
(por ejem-

C A P T U L O 65

T C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I
A S H E M A T O P O Y T I C A S
1363
1994; Chhanabhai, 1997; Langerak. 1997). Por ltimo, la demostracin de traslocacion
es cromosmicas recurrentes mediante tcnicas de PCR. sobre todo en un subconjunto d
e tumores de clulas B. proporciona otro marcador adicional de clonalidad si la PC
R inicial de redisposicin de los receptores antignicos no tiene xito; esto se trata
en la seccin siguiente. Para resumir. PCR y SBH son tcnicas clave y complementari
as para la determinacin de la clonalidad en los trastornos lnfoides de clulas B y T
. En general, los mtodos PCR son a menudo considerados como "punteros", reservndos
e la SBH para aquellos casos con un material adecuado y en los que se considera
que un resultado negativo de la PCR no est de acuerdo con otros hallazgos clnicos
o patolgicos. A este respecto, es importante tener en mente los conceptos de "tas
a de deteccin" y "sensibilidad", en relacin con la tcnica PCR. La tasa de deteccin d
e la PCR IgH o Tg ser dependiente de un nmero de factores previamente descritos, c
omo el subtipo de trastorno linfoproliferativo. el mtodo PCR (cebadores nicos fren
te a mltiples) y el tipo de anlisis de gel empleado. La PCR no detectar las redistr
ibuciones clnales en todos los casos de tumores lnfoides malignos, y as el conocimi
ento de la tasa global de deteccin de un cierto mtodo PCR, o las mejoras obtenidas
mediante avances de esta tcnica, es valioso para la interpretacin de resultados.
Un ejemplo es el del linfoma folicular, que se asocia normalmente con una tasa d
e deteccin clonal IgH de un 40% a un 60% utilizando el mtodo PCR IgH CDR III (Sega
l, 1995). Combinando la PCR IgH con un anlisis PCR para identificar las redistrib
uciones del gen BCL 2, se pueden detectar hasta un 80% a un 85% de los casos (Se
gal, 1995). Por otro lado, la capacidad de un mtodo dado de PCR para resolver can
tidades diminutas de un objetivo molecular, o su sensibilidad, se explota a menu
do en circunstancias especficas tales como el seguimiento de la enfermedad residu
al mnima (por ejemplo, linfoma o leucemia) durante o despus del tratamiento. La se
nsibilidad se mide por lo general de forma dilucional, y se optimiza a menudo me
diante secuenciacin de la regin recombinada funcional peculiar del gen del recepto
r de antgenos clonal y diseando cebadores "alelo"-especficos del tumor o sondas par
a utilizarse en la vigilancia de muestras posteriores de un paciente dado. Es es
encial, dado que los estudios moleculares diagnsticos basados en PCR son capaces
de conseguir elevados niveles de sensibilidad, tener gran cuidado para minimizar
y eliminar la posibilidad de contaminacin de muestras en el laboratorio; incluso
una cantidad diminuta de una plantilla contaminante extraa puede convertir un re
sultado PCR policlonal autntico en una interpretacin falsamente positiva de monocl
onalidad, con las correspondientes consecuencias clnicas graves.
menudo proporciona informacin pronostica, o un marcador para la deteccin de enferm
edad residual. En general, las traslocaciones cromosmicas en los linfomas resulta
n de la fusin de dos locus genticos, que se producen con ms frecuencia en el locus
IgH del cromosoma 14(q32), En consecuencia, un protooncogn que normalmente est alt
amente regulado se activa de forma constitutiva, dando lugar a una marcada sobre
expresin de una protena oncognica. En otros casos, por ejemplo, el t(2;5) en un lin
foma anaplsico de clulas grandes, se produce un gen de fusin quimrico y se expresa c
omo un ARNm hbrido y protena. En cada caso, se cree que la interferencia con el cr
ecimiento normal de las clulas lnfoides. su homeostasis o su muerte (apoptosis) pa
rece tener un papel central en la gnesis de los linfomas.
Anomala t(14;18) (q32;q21)
La anomala 1{14:18) es la traslocacin ms comn de los linfomas de estirpe celular B.
A nivel molecular, esta traslocacin da lugar a la yuxtaposicin del gen BCL2 con la
regin J en el locus de las cadenas pesadas de inmunoblobulina (J) (Weiss, 1987; C

leary, 1985: Bakshi, 1985; Tsujimoto, 1985). Como consecuencia, el gen BCL2 qued
a bajo el control del elemento potenciador de IgH altamente activo, dando lugar
a la sobreexpresin de la proteina bcl2. El gen producto de BCL2 es una molcula ant
iapopttica. capaz de abrogar el proceso normal de la muerte celular programada y
proteger a las clulas d e una variedad de eventos citotxicos letales (Yang, 1996:
Hockenberry. 1990). Las redisposiciones del gen BCL2 se encuentran en hasta un 8
5% de los linfomas de clulas foliculares centrales, aproximadamente en un 25% de
los linfomas de clulas B grandes, y raramente en otros trastornos Imfoproliferati
vos B (Weiss, 1987: Horsman. 1995; Kouides. 1994). La estructura genmica parcial
del locus del gen BCL2 se ilustra en la Figura 65-3A La mayor proporcin (60%) de
puntos de rotura-fusin en el gen BCL2 se produce en un rea m u y pequea de aproxima
damente 150 pares de bases (bp) en el segmento no codificador 3' del exn 3, conoc
ido como regin principal de rotura (MBfl) (Cleary, 1985). Se produce un menor nmer
o de roturas (15% al 20%) en una segunda regin ms telomrica que se conoce c o m o l
a regin menor de acumulo (mcr) (Ngan. 1989; Cleary. 1986). Raramente, una regin 5'
de BCL2 descrita como la "regin acumulo variante" (VCR) se redispone en las leuc
emias linfocticas crnicas de clulas B: normalmente, el locus VCR est afectado en tra
slocaciones con los genes de cadenas ligeras de las inmunoglobulinas (Dyer. 1994
; Adachi, 1990). Las reorganizaciones del gen BCL2 pueden detectarse mediante tcn
icas SBH utilizando sondas clonadas de los locus MBR y mcr (mostrado de forma es
quemtica en la Figura 65-3A). aunque esto suele ser un mtodo laborioso (Horsman, 1
995). La hibridacin fluorescente in situ (FISH) tambin ha resultado eficaz en la i
dentificacin molecular citogentica del t(14:18) (Poetsch, 1996; Taniwaki, 1995). S
in embargo, y como resultado del acumulo relativamente agrupado de los puntos de
rotura genmico en los locus MBR y mcr. se pueden emplear mtodos rpidos de PCR para
detectar la mayora de las fusiones BCL2;J (Horsman. 1995; Uu, 1993; Ladanyi. 199
2; Shibata, 1990; Pezella, 1989: Crescenzi, 1988: Lee, 1987). En la mayora de las
situaciones, la regin
II
Significado y deteccin molecular de traslocaciones cromosmicas comunes asociadas a
l linfoma
La comprensin de la biologa de los linfomas no-Hodgkn se ha agrandado de forma sust
ancial con la identificacin de las traslocaciones cromosmicas recurrentes que se a
socian con neoplasias en concreto (Tabla 65-3). La identificacin de estas anomalas
genticas no solamente es muy til para el diagnstico (establecimiento de clonalidad
, clasificacin de los linfomas), sino que a
Tabla 65-3
Traslocaciones c o m u n e s recurrentes en los linfomas n o - H o d g k i n Enf
ermedad FL MCL ALCL-T o nulo LCL, FL Burkilt SLL-P(LPL) Gen de fusin BLC-2/JH BLC
-t/JH NPM-ALK BCL -6/otros c-MYC/lqH PAX5/JH Mecanismo Sobreexpresin de protena an
ii-apopltica Sobreexpresin de protena de ciclo celular (ciclma D1) Sobreexpresin de
oncogn; proteina quimrica Eslado prolongado de centro germinal Sobreexpresin de onc
ogn Sobreexpresin del factor de transcripcin de clulas B Deteccin PCR, SBH. LD-PCR PC
R. SBH RT-PCR, SBH LD-PCR PCR, SBH LD-PCR SBH, LD-PCR SBH Frecuencia* 85%-90% de
FL 20%-30% LCL 70%-100% MCL 30%-40% ALCL 30%-40% LCL 5%-10% FL 100% 70%
Traslocacin I(14:18)(q32;q21) I(11:14)(pl3;q32) t(2;5)(p23;q35) 3(q27)locus I(8;1
4)(q24.q32) t(9;14)(p13:q32)
'La frecuencia indica los genes de lusin deteclados medame mtodos moleculares. PCR
= reaccin en cadena de polimerasa; SBH = hibridacin Southern Blot; LD-PCR = PCR Oe
larga distancia; FL = linloma lolicular; MCL = linloma de clulas del manto; ALCL
= linfoma anaplsico de clulas grandes: LCL = linfoma de clulas grandes. SLL-P = li
nfoma Imlocitico pequeo-plasmaotoide (equivalente al linfoma linfoplasmocitoide |
LPLJ).

1364
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 65-3. A. Esquema de la estrategia de deteccin para la reorganizacin del gen
BCL2. La estructura g e n o m i c a parcial del gen 8CL2y su vecindad se m u e
s t r a n en la tigura. La mayora de los puntos de rotura se producen en la regin
pnncipal de roturas (MBR), localizada en el s e g m e n t o 3' (no codificante)
del exn III del BCL2(recuadro gris claro grande). Una minora de las roturas BCL2se
producen a ms de 20 kb aguas abajo del gen en la regin m e n o r de acmutos (mcr).
Los recuadros s o m b r e a dos cortos ilustran el uso de sondas genmicas para l
a hibridacin Southern Blot Las flechas m u e s t r a n los c e b a d o r e s PCR
BCL2 y m u e s t r a n un mtodo alternativo o e detectar fusiones del gen SC.2-J.,
(que no se m u e s t r a n a escala correcta) C o m o resultado del cmulo de pun
tos de rotura en los p u n t o st a n t o BCL2 M B Rc o m om c r , se pueden uti
lizar cebadores de consenso BCL2 para cada regin, combinados con un cebador de se
cuencia de consenso J., para detectar la mayora de las reorganizaciones BCL2 que
s e producen en i o s linlomas (vase los detalles en el t e x t o ) B, I m a g e
n representativa de una reorganizacin del gen BCL2 (lusn BCL2'V, delectada mediant
e PCR. Las calles A y D representan alcuotas del ADN de la m i s m am u e s tra d
el paciente. Una alcuota (A) se ha analizado en busca de una reorganizacin del loc
us BCL2 MBR, mientras que la otra (D) se ha estudiado en b u s c a de u n a rotu
rafusin del locus SCL2 mcr. Las calles B y E muestran controles ADN-positivos par
a las fusiones MBR-J,, y mcr-J, respectivamente, y las calles C y F representan m
u e s t r a s "en blanco" (sin ADN). Despus de la amplificacin PCR utilizando c e
b a c o r e s adecuados M B Rym c r con un cebador de consenso J los productos P
C R se analizaron en un gel de agarosa. se transfirieron a m e m b r a n a s de
nailon y se d e t e c t a r o n utilizando sondas de secuencia especificas de r
egin M B R y BCR. El anlisis m u e s t r a claramente un producto de fusin MBR-J.,
en la m u e s t r a del paciente (calle A), confirmando la presencia molecular d
e la anomala t(14:18). El producto PCR d el a muestra del paciente difiere en lon
gitud en comparacin con el control M B R p o s i t i v o (calle B). indicando que
los puntos de rotura en la neoplasia individual son nicos al nivel ADN. ( T o m
a d o de vlswanatha DS Detection of trie 1 ( 1 4 : 1 8 ) (q2l ;q32) associated B
CL-2'JH gene lusion in non-Hodgkms l y m p h o m a . En Kiieen A [ed]: M o l e c
u l a r Pathology Protocols Totowa, NJ. H u m a n a Press [septiembre 2000]. co
n autorizacin.)
interviniente de ADN genmico entre los cebadores opuestos es lo suficientemente c
orta como para permitir una amplificacin con xito. Esta estrategia se suele lograr
utilizando cebadores oligonucleticos MBR y mcr colocados aguas arriba de las reg
iones de acmulos. en combinacin con un cebador J de consenso (Figura 65-3 A y B). D
e forma global, una tcnica habitual PCR como sta puede identificar aproximadamente
los dos tercios de todas las fusiones del gen BCL2J., que surgen de t(l4:18) en
los linfomas no-Hodgkin (Horsman, 1995). A diferencia de SDH, PCR se puede real
izar a partir de material fijado y archivado, aunque el ADN extrado de fuentes em
bebidas en parafina puede estar comprometido debido a un entrecruzamiento y degr
adacin de las cadenas de alto peso molecular. Como resultado, la tasa de deteccin
BCL2J para las fusiones de los locus tanto MBR como MCR es por lo general ms bajo
en muestras de tejido incluidas en parafina en comparacin con las muestras de te
jidos frescos o congelados. La aplicacin de la tcnica de ADN PCR de larga distanci
a (LD-PCR) para identificar y caracterizar ms la anatoma molecular de las fusiones
BCL2/J,. ha sido descrita recientemente (Akasaka. 1998). Los anlisis de los prod
uctos LD-PCR han revelado puntos de rotura extendidos que se producen en la regin
lejana 3 MBR y tambin 5' del locus mcr. correspondiendo en gran manera al resto
de fusiones BCL2: que no se identifican mediante las tcnicas PCR normales.

h
(FCC). tal y como se indic previamente (Segal. 1995). Sin embargo, la anomala BCL2
/J,, es por lo general detectable mediante PCR en estos casos, proporcionando un
marcador alternativo clonal para distinguir el linfoma folicular de una hiperpl
asia folicular alpica o florida pero benigna. Como corolario, el anlisis PCR para
la fusin BCL2J,. se puede utilizar para diferenciar subtipos de linfoma no-Hodgki
n de bajo grado de patrones morfolgicos potencialmente similares, c o m o el linf
oma folicular frente a los lirfomas del m a n t o o del tipo de zona marginal. L
as redisposiciones de los genes BCL2 estn m u y pero no absolutamente correlacion
adas con la sobreexpresin de la protena bcl2. Por el contrario, es importante obse
rvar que muchos linlomas y leucemias de clulas B se asocian con una expresin desre
gulada BCL2 en ausencia de alteraciones genticas estructurales, presumiblemente d
ebido a mecanismos epigenticos. La sobreexpresin de la proteina bcl2 parece en par
te estar por debajo de la resistencia primaria del tumor a la quimioterapia (Gas
coyne. 1997; Hill, 1996: Hermine. 1996). El uso de las lusiones BCLZX, c o m o m
arcadores clnales especficos del paciente para la valoracin cuantitativa de la enfe
rmedad residual mnima ha sido descrito recientemente (Luthra, 1998a).
Anomala t(11;14) (q13;q32)
La t(11 ;14) est muy asociada con los linlomas de clulas del manto (MCL), aunque s
e ha encontrado raramente en casos de leucemia prolmfoctica, linfoma esplnco con "l
infocitos vellosos (SLVL) y LLC. El 1(11 ;14) coloca al locus BCL1 adyacente al
gen IgH, afectando casi siempre a la regin J . El gen de la ciclina D1 est localiz
ado a una gran distancia telomrica de la mayora
M
La identificacin de las redisposiciones del gen BCL2 en las proliferaciones linfo
ides neoplsicas es muy til en diferentes contextos clnicos, incluyendo el diagnstico
y la subclasificacin de la enfermedad. Las redisposiciones clnales de los genes d
e las inmunogtobulinas con frecuencia no se detectan con las tcnicas normales PCR
IgH en los linfomas de clulas centrofoliculares

C A P T U L O 65

TCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H
E M A T O P O Y E T I C A S
1365
de puntos de rotura 11(q13)/flC. J. pero aun as es el blanco de desregulaciones tr
anscripcionales o del gen IgH en las fusiones SCL J'J . La ciclina D1 es una pro
tena de la fase precoz del ciclo celular requerida normalmente para la actividad
de las cinasas 4 y 6 ciclina-dependientes (cdk4. tdk6). y este complejo promueve
la progresin a travs de la transicin G,/S del ciclo celular en las clulas que proli
feran. La sobreexpresin oncognica del tipo D1 de ciclinas parece asi tener una imp
ortante funcin en el desarrollo de MCL. Aunque los mecanismos moleculares de tran
sformacin mediante la ciclina D1 desregulada no han sido bien aclarados hasta la
fecha, este concepto se ve apoyado por el aumento de actividad mittica y el compo
rtamiento clnico ms agresivo de MCL. en comparacin con otras neoplasias de Imfocito
s pequeos B (Campo, 1999: Weisenburger, 1999; Argatoff, 1997: Samaha, 1998). La i
dentificacin de t(H;14) o las reorganizaciones del gen BCL1 en la MCL es variable
dependiente de la metodologa empleada y oscila entre menos de un 50% y un 100%.
Independientemente, la expresin de la ciclina DI, bien mediante anlisis de ARNm o
anlisis de protenas, est presente en ms de un 90% de los casos de MCL iRimokh. 1993:
Oka. 1994; Bosch. 1994: De Boer. 1997; Yang. 1994; Zukerberg. 1995: De Boer. 19
95: Alkan. 1995: Vasef. 1997: Soslow. 1997). La estrecha correlacin entre las ano
malas SCLJ'ciclina D1 y las formas de MCL forman una faceta clave en el diagnstico
de este linfoma.
H
FISH han emergido posteriormente c o m o quiz la forma ms completa de resolver las
fusiones BCLhJ,. en MCL (Coignel. 19%: Vaandrager. 1996). Clnicamente, MCL es un
a enfermedad agresiva, a pesar de tener la modologia de un "indolente" linfoma d
e linfocitos B pequeos (Campo. 1999: Argatoff. 1997; Samaha. 1998). De acuerdo co
n ello, el establecimiento correcto de este diagnstico es critico para el pronstic
o y la planificacin del tratamiento. Aunque la protena ciclina D1 puede detectarse
mediante tcnicas inmunohistoquimicas (Yang, 1994; Zukerberg, 1995: De Boer, 1995
: Alkan. 1995: Vasef. 1997; Soslow. 1997). los mtodos genticos moleculares para id
entificar las anomalas del locus BCL1 continan aplicndose ampliamente en esta situa
cin diagnstica. Entre las leucemias crnicas de clulas B, hay cada vez ms pruebas que
indican que la expresin de la ciclina D1 en s misma puede s e r un determinante in
dependente de mal pronstico (Levy, 1999), independientemente de sus clasificacione
s morfolgicas especficas.
Anomalas que afectan al locus del gen 3(q27)
Recientemente se han identificado linfomas con aberraciones citogeneticas del cr
omosoma 3(q27) y del gen BCL6. A diferencia de otras traslocaciones asociadas a
los linlomas. las fusiones del gen BCL6 pueden involucrar a un gran nmero de gene
s compaeros, muchos de los cuales no estn en relacin con los genes receptores de an
tigenos (Ohno, 1997: Chen. 1998; Ohshima. 1997). Un pequeo nmero de casos mostrar u
na clsica anomala t(3;14) q27;q32). que une al gen BCL6 con el locus IgH. mientras
que otros pueden involucrar a los genes de las cadenas ligeras de inmunoglobulin
a. La aparente "promiscuidad' de las traslocaciones del gen BCL6 ha conducido al
concepto de sustitucin promotora heterloga como mecanismo de la desregulacion de
BCL6y la sobreproduccin de la correspondiente proteina bcl6 (Chen. 1998). La expr
esin de la proteina bcl6 se detecta en las clulas normales de los centros germinal
es. Modelos en ratn de "atontamiento" del gen BCL6 han mostrado que este gen es v
ital para la formacin del centro germinal normal y para las respuestas normales d
e anticuerpos dependientes de clulas T (Ye, 1997: Dent, 1997). Adems. BCL6 parece
necesario para el control de las respuestas inflamatorias de tipo Th2 inducidas

por c i t o c m a s mediante una regulacin normal a la baja de la expresin de una

clase de molculas transductoras de seal (las protenas Stat) (Ye, 1997: Dent, 1997).
De forma significativa, se han detectado reorganizaciones del gen BCL6en los li
nfomas asociados a los centros germinales, principalmente los tipos de clulas gra
ndes (30% al 40%) o de clulas de los centros foliculares (10% al 15) (Ohno. 1997:
Chen. 1998: Ohshima. 1997: Otsuki. 1995). Adems, una gran proporcin de estos linf
omas muestran hipermutaciones somticas de la reEl locus gentico BCL comprende una gran regin de la banda cromosmica 11(q13) (Fig.
65-4). Aproximadamente la mitad de las roturas BCL1 se producen en un rea bien de
finida, conocida c o m o la regin del acumulo principal de traslocaciones {MTC) (
Williams, 1993a: Williams. 1991) El MTC est localizado a casi 1 2 C kilobases (kb
) hacia el centrmero del gen de la ciclina DI. Se han definido otros puntos de ro
tura mediante anlisis Southern Blot que son o bien ms distales al MTC o localizada
s en la regin 5' inmediata del gen de la ciclina D1 (Williams, 1991.1993b). El mto
do SBH, utilizando una nica sonda de la regin MTC, detectar casi todas las reorgani
zaciones de BCL1 del punto de rotura MTC, que suponen el 50% de todos los casos
(Williams. 1993a). Con el uso de sondas genmicas mltiples, se puede tambin identifi
car el nmero ms pequeo de roturas que no estn en relacin con MTC. aumentando la tasa
de deteccin SBH hasta un 70% (Williams, 1991). Sin embargo, esta complejidad tcnic
a, asi como la falta de disponibilidad habitual de sondas para mltiples regiones
BCL 1. hace muy poco prctico SBH con fines diagnsticos sistemticos. Se ha utilizado
con xito la tcnica PCR para identificar el subconiunto de fusiones BCL f/J que se
producen en la estrechamente agrupada regin MTC. dando lugar a una deteccin media
nte PCR de las reorganizaciones BCL1 de entre el 40% y el 50% (Pinyol. 1996). De
forma notable, la gran regin de rotura formada por el locus BCL 1 presenta asi s
ustancales difi cultades para estos mtodos de diagnstico molecular. Los anlisis basa
dos en
H
Figura 65-4. E s q u e m a del locus BCL1 y de la estrategia para deteccin median
te PCR de las reorganizaciones SCL-IgH. La organizacin del locus BCL1 se muestra e
n el panel superior, con su orientacin centromrica Icen) y telomrica (tel) El gen d
e la ciclina D1 es el objetivo de la desregulacin por las reorganizaciones de la
regin BCL 1 en el linloma de clulas del m a n t o (MCL), aunque la mayora de las ro
turas ocurren m u y centromncas en relacin con el propio gen. Los recuadros cortos
en color rojo claro muestran dos sondas habituales para la deteccin de las reorg
anizaciones de la regin BCL1. La mayora de las roturas BCL1 se producen en la regin
principal de a c u m u l o de traslocaciones (MTC). suponiendo aproximadamente
un 50% de los casos en el MCL. La organizacin genmica de la regin MTC de la fusin BC
L1-J., que surgen de t(H :14) se muestran en el panel interior. Las flechas vert
icales cortas m o i c a n el rea de cmulos de roturas M T C Debido al acumulo rela
tivamente denso en este punto PCR puede detectar la mayora de las fusiones BCL1-J
en relacin con MTC (vase el t e x t o para detalles). Las localizaciones relativa
s de los cebadores para la PCR BC(.;-J estn indicadas p o r flechas horizontales (
las flechas de gran tamao indican un nico cebador de consenso para la secuencia JH
).
h

1366
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
gin reguladora 5' de BCL6, de lorma independenle de la presencia o ausencia de ano
malas estructurales delectables del gen (Migliazza. 1995). El significado de la a
lteracin mutacional sin reorganizacin gentica est poco claro, dado que las clulas nor
males de memoria B (con linea germinal BCL6). muestran tambin este hallazgo, sugi
riendo que las mutaciones somticas BCL6 se producen durante el proceso de activac
in normal de los centros germinales (Shen. 1998). Aun as. la sobreexpresin de la pr
otena bcl6 parece estar integralmente en relacin con la patognesis de los linlomas
del tipo centro germinal, y esta situacin se puede inducir mediante la traslocacin
de BCL6. o mediante otros mecanismos sin una reorganizacin del propio gen BCL6 (
Allman. 1996). De acuerdo con ello, la presencia de protena bcl6 se observa en la
gran mayora de linfomas de clulas grandes, linfomas foliculares y linfomas de Bur
kitt (Onizuka. 1995: Carbone. 1997; Flenghi, 1996: Pittaluga. 1996: Falim. 1997;
Cattoretti, 1995). La deteccin de las reorganizaciones del gen BCL6 que se produ
cen en los casos traslocados se puede conseguir mediante varios mtodos. Se ha uti
lizado ampliamente el anlisis SBH. dado que la mayora de estos casos muestran un cm
ulo de puntos de rotura que cubren la regin prxima 5'. el primer exn no codificante
y el mtrn uno del gen BCL6 (Lo Coco. 1994; Oflit, 1994; Lee. 1987). Las aplicaci
ones ms recientes comprenden PCR para ADN de larga distancia [especficamente para
la anomala t(3:14)] y tcnicas FISH (Akasaka, 1996; Ueda, 1997). El significado clni
co de las anomalas BCL6 en el linfoma sigue hasta la fecha sin entenderse del tod
o. La desregulacin de BCL6 en el linloma indica un papel central en la patognesis
de la enfermedad, presumiblemente por el atrapamiento de clulas linfoides en un e
stado de centro germinal, creando as un ambiente para la produccin de otros desarr
eglos genticos. Aunque la protena BC.6" est ampliamente expresada en las neoplasias
linfoides asociadas a los centros germinales, la relevancia clnica del estado del
gen BCL6 sigue siendo controvertida. Se ha comunicado una mayor frecuencia de r
eorganizaciones del gen BCL6 en los linfomas extranodales de clulas grandes (Lian
g, 1997: Offit. 1994), y un estudio ha sugerido un mejor pronstico para los linfo
mas de clulas grandes con reorganizacin del gen BCL6 (Offit, 1994). Sin embargo, l
a resolucin definitiva del significado clnico de las anomalas del gen 8CL6en el lin
foma sigue necesitando estudios adicionales a gran escala.
A diferencia de ello, el tipo espordico de BL demuestra roturas C-MYC dentro de l
a regin 5' del gen, y se asocian tipicamente con fusin con la regin de cambio de in
munoglobulina. Estos datos indican que los fenmenos de traslocacin que afectan a C
-MYC en estas variantes BL se producen en fases ligeramente diferentes en una clu
la B inmadura. Clnicamente, sin embargo, estas diferencias parecen ser insignific
antes. L a s reorganizaciones del locus C-MYC o la presencia de 1(8:14) pueden d
etectarse mediante anlisis SDH. FISH. o PCR de larga distancia (Falini. 1997; Cat
toretti. 1995, V a n Kneken. 1992: Siebert. 1998; Akasaka, 1998). Prcticamente, s
in embargo, la presentacin clnica caracterstica y las caractersticas patolgicas de BL
son con mayor frecuencia suficientes para el diagnstico, y la confirmacin molecul
ar o citogentica de la afectacin C-MYC slo es necesaria para aquellos casos con una
enfermedad leucmica primaria (LAL-L3) o en casos con caracteristicas no habitual
es. La presencia de reorganizacin del gen C-MYC en oros linlomas. como en el conte
xto de una transformacin secundaria o inmunodeficiencia, es por lo general indica
tiva de un comportamiento biolgico muy agresivo.
Anomala t(2;5) (p23;q35)
El linloma anaplsico de clulas grandes (ALCL) es un subtipo recientemente reconoci
do de linfoma no-Hodgkm que puede presentarse c o m o una enfermedad cutnea prima
ria, o ms comnmente como una forma sistmica que afecta a ganglios linfticos, viscera

s y piel. Este tumor se clasific con frecuencia en el pasado como una enfermedad
Hodgkin de deplecion linfoctica. como una histiocitosis maligna, o incluso como u
na enlermedad maligna metastsica. Una caracterstica fenotipica en casi todos los c
asos de ALCL es la presencia del antgeno CD30 ("Ki-1"). un marcador de aclivacin y
miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (Smith. 1993). Normal
mente. ALCL es de estirpe de clulas T. aunque algunos tumores no expresan marcado
res de estirpe asociada a clulas B o T (clulas "nulas"). Una minora de tumores son
fenotipica o genticamente de tipo celular B. Se ha generado un sustancial inters e
n ALCL con el hallazgo de una anomala recurrente 1(2:5) en una proporcin significa
tiva de casos de enfermedad sistmica (Rimokh. 1989: Masn, 1990: Kaneko, 1989). A n
ivel molecular, esta traslocacin yuxtapone el gen NPM con un nuevo gen lamado ALK
(cinasa anaplsica de linfoma). El producto normal del gen NPM. llamado nucleofos
mina. es una fosfoprotena nuclear de expresin ubicua que se cree es importante en
el ensamblaje de los ribosomas. El gen ALK codifica una tirosina cinasa previame
nte desconocida que no se expresa normalmente en las clulas linfoides (Shiota, 19
94a). Como resultado de la fusin del gen NPM-ALK. la actividad de tirosina cinasa
de ALK queda sin regular, contribuyendo de lorma ostensible a la gnesis de los l
inlomas. L a fusin NPM-ALK difiere estructuralmenle de otras fusiones genticas aso
ciadas a los linlomas, en cuanto a que se produce una protena y ARNm quimricos. An
asi, la sobreexpresin del gen ALK restringido normalmente parece ser el principal
mecanismo involucrado en la transformacin. Los puntos de rotura genmicos en casos
de ALCL afectan de forma uniforme a las mismas regiones de intrones de ambos ge
nes, dando lugar a la generacin de un ARNm de fusin constante NPM-ALK. Esta situac
in h a permitido el uso de RT-PCR para detectar la transcripcin de fusin con una al
ta especificidad y sensibilidad (Elmberger, 1995: Wellmann. 1995: Ladanyi, 1994;
Yee. 1996:Weiss. 1995; Downmg. 1995;Lamant. 1996). Adems, y dado que los introne
s afectados son relativamente cortos, tambin se ha empleado con xito el LD-PCR genm
ico para identificar la anomala NPM-ALK (Ladanyi, 1996: Sarris. 1996: Lulhra. 198
8b). Este ltimo mtodo necesita un ADN de alto peso molecular, pero elimina la nece
sidad del aislamiento del ARN y de la transcripcin inversa. Otras tcnicas, incluye
ndo el anlisis mediante sondas FISH y el SBH del locus NPM. tambin han sido descri
tas (Bullnch. 1994; MaIhew. 1997). Dado que la citogentica clsica es tcnicamente ex
igente y que se lleva a cabo con poca frecuencia en casos de ALCL, estos mtodos m
oleculares han servido para simplificar e incrementar la tasa de deteccin de esta
lesin gentica. Clnicamente, los primeros dalos con respecto a ALCL indicaron una r
elacin entre la presencia de \{2:5)i NPM-ALK. la edad ms joven, y un pronostico fa
vorable (Kadin. 1986: Nakamura. 1991; Bitter, 1990). De enlre subconjuntos slidam
ente definidos de ALCL (esto es, CD30+, estirpe T, morfologa
Anomalas que afectan al locus del gen 8(q24)
La alteracin gentica del locus C-MYC se ha asociado clsicamente con el linfoma de B
urkitt (y con la leucemia Imfoblstica aguda, tipo LAL-L3): sin embargo, este gen
tambin se ha implicado en la patognesis de tres tumores, incluyendo las transforma
ciones de alto grado (secundarias) de linfomas indolentes, linfomas asociados al
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y ocasionales trastornos linfoproli
ferativos agresivos postransplante. Con mayor frecuencia, el gen C-MYC se traslo
ca al locus IgH por la anomala t(8;14). En otros casos. C-MYC se puede hacer adya
cente a los genes de cadenas ligeras K- [2(pl2)J o X [22(q11)) (Croce, 1985). En
cada uno de estos casos, C-MYC se coloca bajo la fuerte influencia transcripcio
nal de potencador de las inmunoglobulmas. El C-MYC es normalmente un gen altament
e regulado que est involucrado en la respuesta nuclear "precoz" a las seales citop
lasmicas mductoras de crecimiento. El producto del gen C-MYC lorma un complejo q
ue se une al ADN con un compaero proteinco. Max. para iniciar la transcripcin de va
rios genes situados aguas abajo y que son necesarios para su entrada en el ciclo
celular y en la proliferacin celular (Blackwood, 1991). Max est a su vez regulado
por dimerizacin con otras protenas tales como Mad. y estos complejos alternados a
ctan para reprimir la actividad de transcripcin (Ayer, 1993,1995; Zervos. 1993). C
omo resultado de la traslocacin de C-MYCen el linfoma, el control normal de C-MYC
se ve abrogado por el gen IgH. Esto a su vez da lugar a una sobreproduccin no su
pervisada de c-Myc. dando lugar a un aumento de los dimeros c-Myc M a x y a la t

ransactivacin de mltiples genes objetivo cognatos. resultando en ltima instancia en

una proliferacin celular no controlada (Amati. 1993). Los linfomas de Burkitt y
LAL-L3 figuran entre las neoplasias humanas ms agresivas y de divisin ms rpida. La a
natoma molecular de los puntos de rotura de la regin C-MYC ha sido bien estudiada
en el linfoma de Burkitt (BL) con el t(8:14) (Neri. 1988; Yano, 1992). En el BL
endmico, los punios de rotura C-MYC se producen bastante aguas arriba del gen y a
fectan principalmente al locus IgH JH en 14(q32).

C A P T U L O 65

TCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H
E M A T O P O Y T I C A S
1367
caracterstica), la fusin NPM-ALK se detecta entre un 50% y un 60% de los casos (Ch
an. 1999: Wellmann, 1995; Elmberger, 1995; Downing, 1995: Lamant. 1996). Sin emb
argo, las estimaciones acerca de la frecuencia de t2:5i NPM-ALK en la ALCL han va
riado de forma considerable, debido a diferencias en el mtodo de deteccin y en la
definicin exacta de la enfermedad. Por ejemplo, aunque la gran mayora de los casos
de ALCL positivos para 1(2:5). NPM-ALK son de fenotipo celular T o nulo", tambin
se pueden encontrar casos ocasionales de estirpe B (Downing. 1995; Weisenburger
, 1996: Hutchinson. 1997). De forma anloga, el t(2;5) o la fusin NPM-ALK se ha ide
ntificado en casos raros de ALCL que carece de la expresin de CD30 (Hutchinson. 1
997) y de forma infrecuente entre linfomas de clulas grandes de estirpe celular B
o T sin caractersticas otolgicas anaplsticas (Benharroch, 1998). Se han conseguido
avances en los esfuerzos para definir mejor un grupo clnicamente relevante de AL
CL con la aplicacin de anticuerpos especficos que detectan el segmento ALK en la p
rotena de fusin (Benharroch, 1998: Pittaluga, 1997: Nakagawa. 1997: Shiota, 1994b;
Pileri, 1997; Pulford. 1997). La presencia de proteina ALK en la ALCL se correl
aciona estrechamente con la fusin NPM-ALK Es ms, las neoplasias ALK-positivas pare
cen asociarse con un resultado clnico muy favorable, en comparacin con aquellos tu
mores que carecen de esle marcador (Shiota. 1995: Falini. 1999; Gascoyne, 1999).
Dado que la deteccin de la fraccin ALK se puede conseguir por mtodos inmunohisloqum
icos, este mtodo puede servir como una alternativa uniforme y fcil en la evaluacin
molecular, y es capaz de identificar casos raros de linfoma con sobreexpresin ALK
debido a fenmenos genticos alternativos [por ejemplo. t(1:2) (q25:p23), nv(2)(p23)
(q35)] (Masn, 1998: Wlodarska. 1998). Por ltimo, la identificacin de la anomala genti
ca \{2.bv NPM-ALK. o la expresin de la proteina ALK, son tiles para distinguir cas
os de ALCL de la enfermedad de Hodgkin, o de los tumores epiteliales indiferenci
ados (Herbst, 1995; Elmberger, 1995; Wellmann. 1995: Ladanyi. 1994: Yee, 1996: W
eiss. 1995: Sarris. 1996). Sigue siendo controvertida la aparicin de \{2:5);NPM-A
LK en la ALCL cutnea primaria (Wood. 1996; DeCoteau, 1996; Beylot-Barry. 1996).
tracin de transcripcin residual de una fusin EML-RARu despus del tratamiento se ha a
sociado con un riesgo muy elevado de recidiva, normalmente en el plazo de meses
(Diverio, 1994,1998). A diferencia de ello, los pacientes con una AML t(8;21 (-p
ositiva pueden lograr remisiones clnicas muy duraderas, a pesar de la presencia d
e un ARNm de fusin /-ErOdetectable a bajos niveles. Adems, la anomala AML1-ETO puede
etectarse en individuos tratados con xito de forma independiente del tipo de tera
pia empleado (quimioterapia o trasplante de mdula sea) (Kusec. 1994: Jurlander. 19
96) Por ltimo, en el caso de LMC, va emergiendo un cuadro ms complejo, estando en
relacin la importancia pronostica del estado MRD con el intervalo despus del trata
miento (por lo general un trasplante de mdula sea). Los pacientes LMC con una conv
ersin "precoz" a un estado PCR positivo para BCR-ABL (esto es. entre 6 y 12 meses
), o aquellos que manifiestan una positividad persistente de la PCR a lo largo d
el tiempo, parecen tener un m a y o r riesgo de recidiva en un estudio de gran t
amao: sin embargo, la previsin de los casos individuales es difcil y se puede modif
icar por factores adicionales en relacin con el tratamiento (como el tipo de tras
plante o la enfermedad de injerto contra husped) (Radich. 1995). A pesar de la va
riabilidad en el valor prediclivo positivo para la recidiva de la enfermedad uti
lizando deteccin molecular de MRD en estas diferentes leucemias mieloides, como r
egla general, la positividad persistente de la PCR en mediciones seriadas se sue
le correlacionar con un mayor riesgo de recidiva. Es importante tener en cuenta
que la ausencia de una enfermedad detectable mediante PCR se asocia fuertemente
con un estado de remisin clnica. En la leucemia linfoblstica aguda peditrica existen

cada vez ms pruebas que sugieren que la vigilancia de la MRD puede tener un pape
l clave en la identificacin de pacientes con un elevado potencial de recada. A dif
erencia de las leucemias mieloides. las reorganizaciones tumor-especificas de lo
s genes de receptores de clulas T y de inmunoglobulinas (IgH) se han utilizado co
mo marcadores clnales de leucemia linfoblstica residual. La enfermedad residual al
final del tratamiento de induccin y a intervalos posteriores ha resultado correl
acionarse con un peor resultado en la mayora de los estudios (Evan, 1998; Gruhn,
1998; Wasserman, 1992: Nizet. 1991; Jacquy, 1997; Steenbergen, 1995: Goulden, 19
98). Recientes esludios amplios sobre la LAL peditrica son significativos en este
aspecto, demostrando que los niveles de MRD leucmica equivalentes a aproximadame
nte una de cada 100 a 1.000 clulas son fuertemente predictivas de recidiva de la
enfermedad a final del tratamiento de induccin y tambin a intervalos posteriores (
Cave. 1998: Van Dongen. 1998). Adems, los anlisis senados de PCR a intervalos mltip
les parecen aadir valor pronstico, connotando la positividad persistente de un may
or riesgo de recidiva. De nuevo, aquellos pacientes con una PCR persistentemente
negativa en todos los intervalos se asocian con un estado de remisin continuada
y un bajo riesgo de fracaso teraputico. Adems de estos hallazgos, otros investigad
ores, utilizando tcnicas PCR altamente sensibles, han sido capaces de demostrar n
iveles extremadamente bajos de MRD persistente en pacientes que mantienen una re
misin clnica al final del tratamiento e incluso varios meses despus (Roberts. 1997)
. Estos datos sugieren en conjunto que las cantidades diminutas pero cuantiticab
les de LAL residual en los pacientes peditricos pueden ser una caracterstica const
ante a pesar de un tratamiento satisfactorio, pero el nivel relativo de MRD y el
comportamiento de las clulas leucmicas residuales estn definitivamente en correlac
in con el riesgo de un fracaso terapui . La capacidad de resolver cantidades cada ve
z mas pequeas de objetivos moleculares genticos especilicos ha proporcionado nueva
s perspectivas a la biologa de la enfermedad, as como algunos potenciales fallos.
La deteccin de las transcripciones de la fusin t(8;21).'AM/.f-ETO o las redisposic
iones clnales de los genes receptores de antigenos en los supervivientes a largo
plazo de LAM y LAL peditricas, respectivamente, indica claramente que las clulas t
umorales residuales pueden residir en un estado "durmiente' o n o proliferativo.
La distincin de estas clulas de las clulas tumorales con ms agresividad biolgica no
es posible con estos anlisis moleculares, y la informacin clnica relevante puede se
r poco concluyeme o verse oscurecida. Por ltimo, estudios recientes han demostrad
o la existencia en la sangre o en los tejidos de individuos sanos de genes de fu
sin asociados a la traslocacin de leucemia o linfoma, sugiriendo que la recombinac
in gentica aberrante de bajo nivel puede ser un fenmeno relativamente comn, Los ejem
plos comprenden la deteccin del t(9;22)/8Cfi-,48L y de t(14;18)/8CL?-/(jH(Biernau
x,
USO DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL
La aparicin de tcnicas de biologa molecular para la deteccin de redisposiciones de l
os genes receptores de antigenos y de las traslocaciones cromosmicas ha proporcio
nado a su vez unas oportunidades especficas y sensibles para medir el riesgo de e
nfermedad tumoral despus de las intervenciones teraputicas de las leucemias y de l
os linfomas. La valoracin tradicional en esta situacin se ha limitado en gran mane
ra al examen microscpico de puntos tisulares tales como la mdula sea. Sin embargo,
las tcnicas PCR se pueden optimizar para la resolucin altamente sensible de cantid
ades submicroscpicas de enfermedad hemalopoytica, normalmente en las cifras de una
clula anmala por cada 10-10 clulas benignas. La aplicacin de tecnologas basadas en l
a PCR para la deteccin de enfermedad residual mnima (MRD) ha permitido un seguimie
nto muy preciso de la "emtica" del tumor, adems de presentar una plyade de nuevas p
reguntas y precauciones. Los marcadores MRD comprenden los genes de fusin asociad
os a la leucemia o al linfoma, con las reorganizaciones clnales de los genes rece
ptores de antigenos en los tumores lnfoides. Para la deteccin de MRD se han utiliz
ado tanto tcnicas ARN (RT) PCR como ADN-PCR. Las tcnicas pueden dar lugar a una me
dicin cualitativa, estableciendo la presencia o ausencia de un marcador en partic
ular a cierto nivel "umbral" de sensibilidad, o pueden elaborarse para conseguir
varios grados de cuantificacin de las molculas diana. El significado clnico de MRD
en las leucemias ha llegado a ser un lema importante y cada vez ms estudiado. En

tre las leucemias mieloides. muchos subtipos estn caracterizados por genes de fus
in con asociacn-traslocacin recurrente que sirven como marcadores peculiares molecul
ares de enfermedad. Los ejemplos ms comunes comprenden la leucemia promieloctica a
guda (LPA) con la anomala 1(15; 17)'PML-flAflu, la leucemia mieloide aguda con la
fusin t(8;21 )/AM. 1-ETO. y la LMC. asociada con la anomala t(9;22);BCR-ABL. Los
datos generados a partir de los estudios MRD en estas leucemias han resultado se
r intrigantes. Para los pacientes LPA, la demos-

1368
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
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incluyendo el tipo (o biologa) de la mediated by ternar c o m p l e x formation
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ltamente sensible para poner de manifiesto estas anomalas, y las implicaciones pa
ra el seguimiento MRD despus de la terapia y en algunos pacientes son claramente
aparentes. Un desalio clave para la valoracin MRD es. por tanto, conseguir una se
nsibilidad tcnica suficiente para conseguir datos pronsticos significativos, a la
vez que se minimiza el riesgo de resultados falsamente positivos que surjan de c
ontaminacin de las muestras, o la potencial deteccin de eventos raros en clulas "du
rmientes'.

C A P T U L O 65

T C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I
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CAPTULO 65

TCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYTICAS

1371
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C A P T U L O
66
Diagnstico molecular de las enfermedades genticas
Wayne W. Grody, M.D., Ph.D. Walter W. Noll, M.D.
ELECCIN DE TCNICAS ELECCIN DE APLICACIONES CONCEPTOS ESPECIALES NICOS DE LOS TRASTOR
NOS MOLECULARES GENTICOS Heterogeneidad molecular Penetrancia variable y expresiv
idad Entrecruzamiento Disomia uniparental Impronta Anticipacin Influencias epigent
icas y herencia no mendeliana Frecuencias allicas y exploraciones masivas de la p
oblacin
1373 1374
EJEMPLOS ESPECFICOS DE ENFERMEDAD Fibrosis quistica Distrofia muscular de Duchenn
e
1377
Anemia de clulas falciformes y otras hemoglobinopatas 1376 Trombofilias hereditari
as Trastornos por expansin de repeticin de trinucletido Sndromes de Prader-Willi y d
e Angelman Cnceres familiares Hemocromatosis Trastornos del ADN mitocondrial FUTU
RO DEL DIAGNSTICO MOLECULAR BIBLIOGRAFA 1387 1388
L a gentica molecular diagnostica es una de las reas ms recientes y revolucionanas
de la medicina de laboratorio y mantiene la esperanza de convertirse en la herra
mienta de diagnstico y cribado ms poderosa del siglo XXI. Con el ritmo trepidante
del descubrimiento de nuevos genes patolgicos bajo los auspicios del Proyecto Gen
oma Humano (Human Genome Project) y el reconocimiento de que todas las enfermeda
des, incluyendo neoplasias y enfermedades infecciosas, tienen algn componente gent
ico, la utilidad de esta subespecialidad slo puede continuar expandindose. Por otr
a parte, su capacidad nica para diagnosticar enfermedad, tanto prenatal como pres
intomticamente, le confiere un papel primario en la medicina preventiva, un foco
de urgencia en la era actual de contencin en el coste de los cuidados mdicos. Adems
, la gentica molecular diagnstica conduce a la gentica molecular teraputica, ya que.
esencialmente, las mismas secuencias gnicas normales usadas para detectar defect
os genticos moleculares por hibridacin con cido desoxirribonucleico (ADN) pueden se
r usadas para corregir tales defectos mediante terapia de sustitucin gnica. Puesto
que esta ltima actividad incrementa su mbito y rango de utilidad, llegar a estar i
ncluso ms entrelazada con las actividades del laboratorio de diagnstico molecular,
sobre el que recaer la responsabilidad de la monitorizacin adecuada de la insercin
y expresin del gen sustituido. Con todo, dicho progreso no se encuentra frenado
por obstculos apreciables. Adems de la considerable solisticacin tcnica y dificultad
de estos procedimientos, estos avances se ven envueltos inextricablemente con c
iertos dilemas ticos espinosos. La diseccin de la sea constitucional ms fundamental
de un paciente y los defectos innatos contenidos en ella, aumenta la problemtica
acerca de la discriminacin gentica, estigmatizacin, diferencias tnicas, privacidad,
consentimiento informado y confidencialidad. Ya que a nivel gentico molecular tod
o se convierte en una "condicin preexistente", la misma definicin de asegurabilida
d puede necesitar ser revisada; ya existen sujetos sanos que han perdido la cobe
rtura del seguro por haber encontrado ser portadores de una mutacin, incluso una
recesiva (Billings, 1992). El descubrimiento de cualquier mutacin hereditaria en un individuo tiene unas implicaciones ms prolundas, q u e sobre
pasan al paciente mismo que solicito la prueba de ADN (el probando"), extendindos
e al resto de miembros de la familia de esa persona, ninguno de tos cuales pudo
haber consentido la exploracin o revelacin de este tipo de informacin. De hecho, co
n la nueva capacidad de las pruebas de ADN adquirida gracias a las tcnicas de amp
lificacin, como la reaccin en c a d e n a por la polimerasa (PCR). es muy fcil real

izar anlisis genticos sin el consentimiento del paciente o incluso sin su conocimi
ento, ya que las pruebas se pueden h a c e r en diminutas porciones de tejido o
muestras de lquidos obtenidas para otros propsitos no relacionados. El diagnstico p
renatal y. p o r extensin, la deteccin precoz preconcebida de portadores genticos e
n las parejas, estn al da en el apasionado debate tico y religioso sobre el aborto.
La terapia gnica. a pesar del consenso general de que debera dirigirse slo a clulas
diana somticas, ms que a la linea germinal (e incluso este concepto est comenzado
a cambiar), aumenta el espectro de la eugenesia entre los que no recuerdan pocas
pasadas en que tales conceptos no fueron slo aceptados sino activamente defendido
s. Gran parte de la gentica molecular diagnstica implica la evaluacin del riesgo de
frecuencia o recurrencia de un trastorno en un individuo o familia. P o r razon
es que se describen ms detalladamente en este captulo, los resultados obtenidos en
la prueba a menudo no se expresan en trminos de una concentracin numrica o una res
puesta de si o no, sino como una probabilidad. El modo exacto y significativo de
abordar estas complejas dudas en pacientes e incluso en los mdicos solicitantes,
puede ser muy difcil, si no imposible. Por esta razn, y debido a las serias impli
caciones ticas de estas pruebas, c o m o se describi antes, esta rea de la medicina
de laboratorio, quiz ms que cualquier otra, requiere una estrecha comunicacin entr
e el laboratorio y el clnico solicitante o el consejero gentico. De hecho, muchas
de estas pruebas deberan realizarse nicamente a peticin de un mdico genetista o un c
onsejero gentico, ya que son los especialistas mejor cualificados para evaluar la
idoneidad de la prueba y explicar los resultados al paciente. U n a estrecha y
oportuna comunica-

C A P T U L O 66

D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I
C A S
1373
cin asegurar que los pacientes obtengan el mayor beneficio y el menor riesgo de de
svntalas de esta poderosa tecnologa.
ELECCIN DE TCNICAS
Con tantos genes, locus y mecanismos mutacionales conocidos de enfermedades genti
cas, la gentica molecular diagnstica se beneficia de la amplia gama disponible de
tcnicas modernas de biologa molecular. stas incluyen transferencia Southern (Southe
rn blotting). transferencia en mancha (do/ blotting). PCR. hibndacin m situ con f
luorescencia (FISH). secuenciacin de ADN, polimorfismo conformacional de ADN mono
catenario y otras. La eleccin de la tcnica a usar en un caso particular depender, e
n gran medida, del conocimiento actual del gen o genes asociados con la enfermed
ad en cuestin y su grado de heterogeneidad molecular. El primer criterio divide a
casi todas las enfermedades genticas en dos categoras: aquellas en las que se ha
aislado el gen causante y aquellas en las que no. La primera categora a menudo pu
ede abordarse mediante anlisis direclo del gen o la mutacin: la segunda slo pueden
enfocarse mediante anlisis de ligamiento, utilizando marcadores de ADN polimrfico
cercanos en el mismo cromosoma, con tal de que se haya trazado el mapa aproximad
o de la enfermedad. El segundo concepto, la heterogeneidad, se refiere al nmero d
e genes diferentes o a la variedad de mutaciones dentro de un solo gen, que pued
en causar la misma enfermedad. Cuanto mayor es la heterogeneidad, la prueba de A
DN se convierte en ms difcil, laboriosa y cara (y ms compleja para informar los res
ultados). Las mutaciones responsables de algunos trastornos son tan numerosas y
se extienden a travs de genes tan grandes que la deteccin directa no es factible,
y se debe recurrir al anlisis de ligamiento aunque el gen causante haya sido iden
tificado y clonado. En otros trastornos, una o ms mutaciones pueden ser tan frecu
entes en determinadas poblaciones tnicas que su deteccin precoz puede proporcionar
una prueba de suficiente rendimiento que justifique su enfoque directo, aunque
se ignoren bastantes mutaciones informadas menos frecuentes. Para hacer tales pr
uebas practicas y con un coste razonable, se han ideado ciertas estrategias de m
ultiplexacin para la deteccin simultnea de mutaciones, como se describe a continuac
in. Con todo, el lector debera tener en cuenta que todo esto implica cierto compro
miso en cuanto a la sensibilidad total de la prueba. Efectivamente, el campo de
la gentica molecular diagnstica tolera, por necesidad, ciertas pruebas de deteccin
precoz con sensibilidades notablemente por debajo de las que se consideraran acep
tables en otros campos del laboratorio clnico. La decisin de justo cuan bajo debera
ser el valor discriminante aceptable de sensibilidad, se convierte en gran medi
da en una decisin tica. La mayora de los genetistas han defendido que. al menos par
a las pruebas de deteccin precoz, los beneficios potenciales para la salud pblica
de ofrecer una prueba de sensibilidad subptima superan los argumentos en contra d
e negarla, con tal de que se proporcionase una suficiente educacin y consejo a lo
s pacientes de modo que entiendan el riesgo residual inherente en un resultado n
egativo de la prueba. Los anlisis directos de mutaciones se han simplificado de m
odo incalculable con la llegada de la PCR. Mediante la eleccin adecuada de cebado
res [primers), esta tcnica permite al laboratorio acercarse a la mutacin precisa d
e inters o a un "punto caliente" (hot spot) dentro de un gen que contiene varias
secuencias de mutacin posibles, usando cantidades m u y pequeas de muestra. Es val
iosa para la deteccin de mutaciones puntuales y microdeleciones que normalmente p
asan inadvertidas en una tcnica de transferencia Southern, a menos que se encuent
ren casualmente dentro de una secuencia de reconocimiento de la enzima de restri
ccin que est siendo utilizada. Una vez que se amplifica la regin que contiene la mu
tacin sospechada, se puede analizar mediante electroforesis en gel. secuenciacin o

hibridacin con sondas de ADN. Ante una delecn que se sospecha reduce la longitud d
el producto amplificado {amplicn), ser suficiente la separacin molecular exacta de
los productos de la PCR mediante electroforesis y tincin con bromuro de etidio (F
ig. 66-1), De un modo alternativo, si la delecn o mutacin puntual rompe (o crea) un
a secuencia de escisin de una endonucleasa. se puede detectar por anlisis electrof
ortico de los productos de la PCR digeridos con esa enzima (Fig. 66-2). Otra opcin
es hibridar los productos de la PCR con sondas oligonucleotdicas especificas de
un alelo (ASO), fragmentos cortos de ADN que son complementarios a cualquiera de
Figura 66-1. Ejemplo de separacin electrolorlica de productos de PCR para la detec
cin de mutacin. En este caso, las muestras de ADN del paciente se amplificaron usa
ndo cebadores que llanquean el codn 508 del gen de la librosis quistica CFTR), pro
duciendo un solo fragmento de 160 bp procedente de individuos normales (caniles
1. 2. 4. 5 y 6). un solo fragmento de 1 5 7 bp procedente de un paciente homocig
oto para la delecn trmucieolidica \F508 (carnl 7) y ambos fragmentos junto con una
banda heterodplex (H) procedentes de sujetos heteroagotos (carriles 3, 8 y 9).
las secuencias diana normales o mulantes. Si la hibridacin, normalmente en forma
de transferencia en mancha, se realiza ba|o condiciones suficientemente rigurosa
s, el ADN de la diana que contiene la mutacin hibridar slo con la sonda mutante y v
iceversa para el ADN de la diana normal. Para un cribado ms eficiente pueden mezc
larse juntas sondas para varias mutaciones poco frecuentes (Fig. 66-3); mediante
la "PCR multiplex", se pueden amplificar juntos varios puntos calientes de la m
utacin. Como una variacin de este enfoque, muchas sondas allicas se pueden extender
en un soporte slido para su posterior hibridacin con el ADN de la muestra (o los
productos amplilicados). en forma de una "micromatriz" (microarray). Desde hace
poco estn disponibles ciertos equipos de reactivos comerciales e instrumentos que
detectan mutaciones puntuales por hibridacin diferencial con sondas/quencne/' o
por electroforesis capilar y otras tcnicas sofisticadas. Existen disponibles vari
as tcnicas de cribado que exploran de un modo ms amplio varias mutaciones desconoc
idas de un gen patolgico. El polimorfismo conformacional de ADN monocatenario (SS
CP) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) pueden dete
ctar tericamente mutaciones puntuales en cualquier secuencia dentro de un gen; lo
s nucletidos sustituidos debido a una alteracin de la topologa, dan lugar a ADN mon
ocatenario y bicatenano incompatible. Estos mtodos evitan la necesidad de sondas
ASO separadas y especificas para cada posible mutacin, aunque pueden realizarse sl
o con limitaciones, ya que no son 100% sensibles, L a prueba de protenas truncada
s detecta mutaciones que originan la terminacin prematura del producto polipeptdic
o del gen; esto requiere un complicado mtodo de transcripcin/traduccin in vitro y s
olo encontrar mutaciones linalizadoras" (y algunas variantes del marco de lectura
[Irameshifts] y de la eliminacin de intrones [splicing]). mientras pasa por alto
sustituciones comunes de un solo nucletido (mutaciones sustitutivas [missense]).
La nica tcnica que presenta un 100% de sensibilidad en la deteccin de todas las mu
taciones puntuales posibles, al menos en teora, es la secuenciacin completa del AD
N del gen. Desafortunadamente, con la tecnologa actual, este enfoque sigue siendo
uno de los mtodos ms engorrosos y costosos para el uso clnico habitual; adems, se p
erderan mutaciones situadas fuera del gen estructural (p. ej.. en intrones. promo
tores o regiones intensificadoras [enhancer]). Los trastornos debidos a una expa
nsin gnica por una mutacin de repeticin trinucleotidica pueden diagnosticarse median
te transferencia Southern o PCR y. en cualquier caso, por observacin de un fragme
nto diana de ADN mayor de lo normal. Los trastornos debidos a grandes deleciones
se diagnostican a menudo mediante transferencia Southern por observacin de una pr
dida o disminucin en tamao de un fragmento diana, aunque tambin puede usarse la prdi
da de un producto de PCR amplificado normalmente desde esa zona o la aparicin de
un "fragmento de empalme" {"junction ragment). L o s trastornos debidos a grandes
deleciones o inserciones, asi c o m o las traslocaciones, se pueden diagnostica
r a nivel cromosmico mediante FISH.

1374
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 66-2. Ejemplo esquemtico de deteccin de una m u tacin puntual mediante escis
in diferencial con una e n z i m a de restriccin. En este caso, la mutacin de la an
emia falciforme, sustitucin de T en lugar de A en el codn 6 del gen de la globina
B, destruye una secuencia de escisin de la Msll: por tanto, la digestin del product
o de PCR de la regin producir dos fragmentos d e ADN en individuos normales y slo u
no en homocigotos HbS. La mutacin del primer nucletido de este codn, encontrada en
la enfermedad de la hemoglobina C, no elimina la secuencia de reconocimiento de
Msll (ya que la enzima p u e d e reconocer cualquier nucletido en esta posicin), no
pudindose detectar por este mtodo.
Para esos trastornos con numerosas mutaciones desconocidas o en genes desconocid
os, es posible un diagnstico predictivo mediante anlisis de ligamiento en ciertas
familias. Debido a que los anlisis requieren la realizacin A D N d e numerosos pac
ientes mezclado A D N de un solo paciente
de pruebas comparativas de otros afectados y de hermanos no afectados y padres,
no todas las familias sern accesibles o buscarn informacin para esta evaluacin. Tamb
in se requiere el conocimiento de marcadores de ADN polimrfico estrechamente ligad
os, preferiblemente en los flancos o incluso intragnicos, que pueden ser observad
os al cosegregarse de forma constante con cualquier fenotipo, normal o patolgico,
dentro de la familia. Tradicionalmente. los marcadores usados han sido los poli
morfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) detectados median
te transferencia Southern. Ms recientemente, los polimorfismos microsatlite. secue
ncias de oligonucleotides en tndem de longitud repetida variable, detectables med
iante una P C R y una simple electroforesis en gel, son preferidos debido a su a
bundancia a travs del genoma, la naturaleza multiallica de sus polimorfismos y la
relativa facilidad de la metodologa de la prueba. Genes muy grandes, como los de
la neurofibromatosis y la distrofia muscular de Duchenne (DMD). tendrn normalment
e microsatlites intragnicos a los que se puede acceder, minimizando las posibilida
des de recombnacin entre la mutacin y el marcador. Las tcnicas de ligamiento son men
os preferibles que los mtodos de deteccin directa de mutacin debido a la necesidad
de analizar los mltiples miembros de la familia y porque la recombinacin meitica en
tre el gen y el marcador puede romper la fase aparente de ligamiento entre el pa
dre y el descendiente, conduciendo a la interpretacin de los resultados c o m o f
alsos positivos o falsos negativos. Para cada centimorgan de distancia de m a p
a entre los dos locus, se puede esperar un 1% de recombinacin (1 cM = 1 milln de p
ares de bases [bp]). Por ejemplo, en la Figura 66-4 se predijo que el feto estara
afectado, ya que haba heredado el mismo fragmento RFLP superior que el hijo prev
iamente afectado. Si la secuencia polimrfica de la endonucleasa de restriccin que
est siendo analizado est a 5 cM de distancia del gen patolgico, se puede concluir q
ue el feto tiene un 95% de riesgo de estar afectado.
Sonda ASO frente a una sola mutacin rara
Sondas ASO mezcladas frente a mltiples mutaciones raras
Figura 66-3. Estrategia para el cribado eficaz de mltiples mutaciones poco (recue
ntes mediante transferencia en m a n c h a usando sondas oligonucleotidicas espe
cificas de un alelo (ASO). Numerosas muestras de A D N de pacientes se pudieron
mezclar en una sola m a n c h a e hibridar con una sonda ASO: alternativamente,
el ADN de un solo paciente se puede hibridar con una mezcla de mltiples sondas AS
O p o c o frecuentes. En cualquier caso, la prueba ser negativa la mayora de las v

eces, ya que las mutaciones son m u y raras. Si es positiva, se requieren prueba

s adicionales para determinar qu paciente o sonda produjo la seal de hibridacin.
ELECCIN DE APLICACIONES
En cierto grado, la eleccin de la tcnica depender tambin de la aplicacin (es decir, l
a razn por la que se realiza la prueba). En gentica mdica,

CAPTULO 66

DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

1375
dos en edad temprana para poder iniciar el tratamiento (diettico o farmacutico) an
tes de que aparezcan daos irreversibles. Actualmente, se estn empleando mtodos de g
entica molecular de este grupo, principalmente como apoyo para la confirmacin de r
esultados positivos obtenidos por mtodos bioqumicos o enzimticos menos caros, aunqu
e esta situacin podra invertirse en el futuro con mtodos moleculares que puedan aut
omatizarse. Por definicin, la prueba de diagnstico gentico se realiza en un suieto
sintomtico. Debido a que las pruebas de ADN para patologas genticas son absolutamen
te especficas de la enfermedad y las mismas enfermedades muy poco frecuentes, est
os procedimientos no abarcan lo suficiente como para usarse en un extensivo diag
nstico diferencial: los sntomas deben ser lo suficientemente sugerentes del trasto
rno en cuestin como para justificar la realizacin de la prueba. La prueba de ADN s
e debe sopesar frente a mtodos ms tradicionales con respecto al coste, convenienci
a y utilidad. Por ejemplo, la electroforesis de hemoglobina puede ser mas conven
iente y completa para clasificar una hemoglobinopatia sospechada que la prueba d
e ADN especfica para la mutacin de la anemia falciforme. Por otra parte, la prueba
molecular puede ser ms ventajosa para presentaciones clnicas precoces o atpicas. P
or ejemplo, la prueba molecular para mutaciones de la fibrosis qustica se puede r
ealizar en recin nacidos cuando el anlisis tradicional de cloruros en el sudor es
impracticable o poco fiable. Las pruebas de ADN tambin tienen la ventaja de traba
jar bien en la autopsia, cuando los analitos bioqumicos clsicos no se pueden valor
ar. Figura 66-4. Ejemplo de anlisis de polimorfismos de la longitud de los Iragme
ntos de restriccin para el diagnstico prenatal de un trastorno autosmico dominante.
En esta transferencia Southern, la banda superior procedente del padre es la nic
a que se segrega conjuntamente con el fenotipo patolgico, c o m o se observa en e
l hijo afectado. C o m o tambin el feto (?) fia heredado esta banda, se predijo q
ue estara afectado. El riesgo preciso depende de la distancia de m a p a entre el
gen patolgico y el marcador RFLP. Los anlisis presintomticos de ADN se aplican pri
ncipalmente a trastornos dominantes de inicio tardo, en los cuales los descendien
tes de un padre afectado son conscientes de que tienen un 50% de riesgo de hered
ar la enfermedad y desean saber su estado antes del inicio clnico para informarse
sobre decisiones reproductoras y de empleo o iniciar intervenciones de vigilanc
ia y/o preventivas. Prototipos de trastornos de este grupo son la enfermedad de
Huntington y los sndromes hereditarios del cncer, aunque tambin son relevantes enfe
rmedades como la neurofibromatosis, sndrome de Marfan, enfermedad del rion poiiqust
ico en adultos y la esclerosis tuberosa. Este tipo de prueba ha sido la ms proble
mtica de la gentica molecular diagnstica desde el punto de vista psicosocial y tico,
con un riesgo sustancial de graves consecuencias adversas del informe de los re
sultados, incluyendo el suicidio. Debido a esto, los protocolos de pruebas estab
lecidos incluyen la condicin del consentimiento mlormado, la evaluacin clnica simul
tnea, el consejo gentico amplio antes y despus de la prueba y el apoyo psicosocial
{Huntington's
Disease Society ol America. 1989: American College ol Medical Genetics.
estas aplicaciones consisten en cinco reas principales: cribado de portadores, de
teccin precoz en recin nacidos, pruebas diagnsticas, anlisis presintomticos de ADN y
diagnstico prenatal. El cribado de portadores es el trmino aplicado a la deteccin d
e mutaciones recesivas en sujetos sanos con el propsito de consejo gentico y plani
ficacin familiar. Esta aplicacin se subdivide en el cribado de individuos con ante
cedentes familiares del trastorno y el cribado, basado en la poblacin, de gran nme
ro de individuos sin antecedentes familiares pero que tienen nesgo de padecer el
trastorno debido a la prevalencia dentro de su grupo tnico o en la poblacin gener
al. En cualquier caso, el propsito es identificar parejas de riesgo (es decir, ta

nto el hombre como la mujer son heterocigotos para mutaciones dentro del gen), l
as cuales tendran entonces un 25% de posibilidad de tener un hijo afectado en cad
a embarazo, aunque diferirn las estrategias de anlisis de los dos grupos. Obviamen
te, una persona cuyo hermano presenta el trastorno tiene mucho mayor riesgo de s
er un portador que alguien de la poblacin general. Esa persona puede, por lo tant
o, autorizar ms pruebas agresivas (p. ej., cribado para un nmero mayor de mutacion
es o incluso anlisis de ligamiento) ms rentables que para un miembro de la poblacin
general. Por otra parte, el acceso al ADN de un hermano afectado puede permitir
la identificacin anterior de la mutacin, la cual hara posteriormente mucho ms fcil e
l anlisis de otros miembros de la familia. Por el contrario, el cribado basado en
la poblacin se esfuerza, de modo caracterstico, en mantener el procedimiento de l
a prueba tan rpido y barato como sea posible, centrndose quiz en algunas de las mut
aciones ms prevalentes y sacrificando la sensibilidad de la prueba por la rentabi
lidad y la conveniencia. Por supuesto, con antecedentes familiares negativos no
hay miembros de la familia afectados para poder realizar una opcin de anlisis de l
igamiento. Al igual que el cribado de portadores basado en la poblacin, la detecc
in precoz en recin nacidos intenta identificar defectos hereditarios relativamente
prevalentes (como las enfermedades genticas) en distintos individuos asintomticos
. De hecho, las dianas patolgicas ms importantes, como la fenilcetonuria, galactos
emia, anemia falciforme y fibrosis qustica, son trastornos autosmicos recesivos. E
n este caso, la meta es encontrar nios afecta1999). Finalmente, est la aplicacin clnica ms caracterstica de la gentica mdica: el
gnstico prenatal o la deteccin de enfermedad en el feto. Salvo algunas excepciones
(como la hidropesa fetal de la |t-talasemia homocigota, dwarfismo tanatofrico y l
a osteogenesis imperfecta de tipo I), la mayora de los trastornos mendelianos. es
pecialmente los errores innatos del metabolismo, no se expresan ni sintomtica ni
bioqumicamente en el feto; asi. el diagnstico predictivo slo puede realizarse a niv
el del ADN. Incluso para los trastornos que podran detectarse bioqumicamente, el A
DN a menudo se muestra como un sustrato ms accesible, desde el punto de vista obs
ttrico, que los productos proteinicos o sustratos metablicos afectados. Mientras q
ue los anlisis moleculares pueden realizarse en cantidades muy pequeas de lquido am
nitico o muestras de vellosidad corimca obtenidas por mtodos habituales, incluso si
se obtienen para otros propsitos, los anlisis bioqumicos requerirn una biopsia inva
siva de tejido fetal profundo, a m e n o s que los productos proteinicos se expr
esen en fibroblastos (y asi, ammocitos). Por ejemplo, el anlisis de actividad de
la (enilalanina-hidroxilasa para diagnosticar la fenilcetonuria requerira biopsia
de hgado fetal, y la cuantificacin de distrofina para el diagnstico de la distrofi
a muscular de Duchenne requerira biopsia de msculo fetal. Es evidente que el objet
ivo fundamental del diagnstico prenatal es la identificacin de un feto afectado de
una manera oportuna para poder ofrecer una opcin prctica de interrupcin del embara
zo a la pareja. Mientras que algunos pueden argumentar una ventaja de la obtencin
de diagnsticos prenatales para poder instaurar rpidamente una terapia en el nacim
iento o para la tranquilidad psicolgica de una pareja si se observa que el feto n
o est afectado, es difcil justificar el nesgo de aborto en la amniocentesis y la o
btencin de muestras de vellosidad corimca (CVS) realizadas para estos

1376
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
propsitos. Para un feto afectado, a menos que se tenga la intencin de iniciar tera
pia en el tero, es perfectamente aceptable el tratamiento provisional en el nacim
iento mientras se espera la prueba neonatal. Mientras que el consejo gentico pren
atal no es siempre una normativa, con objeciones morales y/o religiosas respecto
al aborto, tanto el consejero clnico como la prueba de ADN del laboratorio tiene
n un derecho legtimo y la responsabilidad para cuestionar la conveniencia de la p
eticin de una prueba prenatal, con su riesgo y coste acompaantes, en una pareja pa
ra quienes la interrupcin no es una opcin (igual se aplicara a las peticiones tardas
de interrupcin del embarazo). Debido a estos problemas, esta prueba prenatal inv
asiva no se ofrece como una herramienta de cribado en la poblacin general a las m
ujeres sin historia familiar del trastorno en cuestin. El poder d e la PCR para p
ermitir anlisis genticos de una sola clula ha abierto recientemente el camino para
el diagnstico preimplante, enfocado normalmente a la realizacin de fecundacin in vi
tro y microdiseccin de un solo blastmero del embrin inicial (vase Cap. 21). Esta est
rategia, ya aplicada a casos seleccionados con riesgo de fibrosis qustica (Handys
ide. 1992) y otros trastornos, podra ofrecerse a algunas parejas de riesgo que no
consideran el aborto como una opcin, aunque tengan sus propias objeciones ticas (
y econmicas). A pesar de estos dilemas mdicos y morales, la prueba d e gentica mole
cular prenatal, realizada en circunstancias apropiadas, se puede ofrecer a parej
as de riesgo, muchas de las cuales han padecido ya el trauma de tener al menos u
n descendiente afectado, uno de los servicios ms valiosos de toda la medicina clni
ca.
de mutaciones que sustituya al anlisis de ligamiento o a tcnicas de exploracin de m
utaciones. La expresividad variable se refiere a la aparicin de diferentes signos
y sntomas del trastorno en sujetos que heredan la misma mutacin o mutaciones. Al
igual que la penetrancia, la expresividad variable probablemente sea un reflejo
de efectos gnicos diferenciales dentro de orgenes genticos distintos (en otras pala
bras, la modulacin de la expresin fenotpica mediante otros genes no allicos). sta tam
bin requiere averiguaciones y dificulta el consejo; adems, plantea cuestiones ticas
en la consideracin del aborto en enfermedades de gravedad variable e impredecibl
e (como la fibrosis qustica).
Entrecruzamiento
El fenmeno de recombinacn meitica entre cromosomas homlogos es, adems de la mutacin
atoria, la principal fuerza conductora despus de la diversidad gentica y la evoluc
in en los organismos de reproduccin sexual. Su importancia en la gentica molecular
diagnstica radica en la ruptura del ligamiento entre un gen patolgico y un marcado
r polimrfico cercano, dando lugar al diagnstico de falsos positivos o falsos negat
ivos en los trastornos analizados mediante pruebas de ligamiento. Como se explic
con anterioridad, se puede minimizar el riesgo eligiendo marcadores ms estrechame
nte ligados o en el flanco del gen patolgico. Esto es ms factible, porque el mapa
del genoma humano presenta numerosos polimorfismos de repeticiones cortas en tnde
m, a los que puede accederse fcilmente con cebadores de PCR.
CONCEPTOS ESPECIALES NICOS DE LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENTICOS
Aunque las tcnicas tratadas en este captulo de anlisis de ADN para el diagnstico de
enfermedades genticas son generalmente las mismas que las usadas para el diagnstic
o molecular del cncer o enfermedades infecciosas, su aplicacin en aqullas ha revela
do ciertos fenmenos inusuales que deben tenerse en cuenta cuando se est tratando c
on determinados trastornos hereditarios. Algunos de estos conceptos se conocen d
esde la poca de Mendel, aunque ahora se comprenden a nivel de ADN; otros han surg

ido ms recientemente como subproductos inesperados de la diseccin molecular de los

genes especficos de enfermedad.
Disoma uniparental
Causa poco usual de trastorno recesivo de un solo gen. descubierta por primera v
ez en un paciente con fibrosis qustica (CF). de cuyos padres slo uno era portador
(Spence, 1988). Mediante haplotipado de ADN usando marcadores polimrficos, se dem
ostr que el paciente haba heredado dos copias del cromosoma 7 del padre portador q
ue contenia el gen mutante de la CF y no el cromosoma 7 del otro padre. El fenmen
o se h a observado en otros casos de CF y tambin en enfermedades que implican a o
tros cromosomas. Para algunas enfermedades, como los sndromes de Prader-Willi y d
e Angelman (vase ms adelante), la incidencia de disoma uniparental (UPD) se aproxim
a a la de otros mecanismos clsicos de mutacin de la patognesis molecular, justifica
ndo una prueba sistemtica para este fenmeno.
Heterogeneidad molecular
Muy pocos trastornos genticos se han asociado con una sola mutacin identificada de
forma constante en todos los casos afectados (p. ej la mutacin sustilutiva en el
codn 6 del gen de la (3-globina que causa la anemia falcforme). La gran mayora de l
os trastornos genticos se originan por ms de una, en ocasiones centenares de mutac
iones diferentes dentro del gen patolgico (ej., el gen CFTR de la librosis qustica
). incluso algunas veces por ms de un gen (ej., los genes TSC1 y TSC2 de la escle
rosis tuberosa o los BRCA1 y BRCA2 del cncer familiar de mama y ovario). Obviamen
te, la identificacin en tales trastornos de las mutaciones causantes es tcnicament
e mucho ms difcil, si no imposible. Una consecuencia de esta heterogeneidad molecu
lar es que no todas las mutaciones producirn enfermedades igual de graves; alguna
s pueden causar slo formas leves, incluso sndromes relacionados con poco parecido
con el fenotipo clsico. Toda esta variabilidad se aade a la gran complejidad del c
onsejo gentico y de los anlisis genticos.
Impronta
La impronta se refiere a la expresin diferente de un gen en un descendiente, depe
ndiendo de si lo ha heredado de la madre o del padre; a veces depende de otros f
actores epigenticos (Hall, 1999). Algunos genes slo se expresan o se desconectan c
uando proceden del ovocito y otros slo cuando proceden del espermatozoide. Si un
individuo hereda el alelo normal a travs de la lnea parental donde no se expresa,
no puede contrarrestar una mutacin recesiva heredada del otro padre. El mecanismo
molecular, al menos en algunos casos, parece ser la metilacin diferencial de reg
iones del cromosoma y elementos reguladores. sta es la base tanto de los casos de
delecn c o m o de UPD de los sndromes de Prader-Willi y de Angelman (vase ms adelant
e).
Anticipacin
Este trmino se refiere al incremento progresivo en la gravedad y/o edad de inicio
de un trastorno gentico en generaciones posteriores de una familia. Se caracteri
za por estar asociada con trastornos por repeticin de trinucleotide como la distr
ofia miotnica y el sndrome X frgil, en los cuales el aumento de la gravedad puede c
orrelacionarse con una mayor expansin de la regin de repeticin. En la enfermedad an
terior, los hijos nacidos de madres afectadas son casos especialmente graves con
inicio en la niez o a edad infantil, dando a entender tambin una influencia media
nte impronta (Lpez, 1994). Lo contrario se observa en la enfermedad de Huntington
, donde la expansin de repeticin de un trplete se produce con mayor probabilidad cu
ando se hereda del padre. Menos frecuentemente, se ha observado el fenmeno opuest
o, la contraccin. Por estas razones es tan importante para el diagnstico y el cons
ejo gentico en estos trastornos la separacin molecular exacta de los fragmentos de
repeticin de trinucletido.
Penetrancia variable y expresividad
La penetrancia se refiere a la proporcin de individuos que, habiendo heredado un
gen patolgico mutante, presentan el fenotipo patolgico. Normalmente se aplica a tr

astornos dominantes, y puede producir en el rbol genealgico de la enfermedad el as

pecto llamativo de "salto generacional". Esto puede complicar tanto el diagnstico
molecular como el consejo gentico, ya que podra no estar claro si el probando her
ed la enfermedad de un padre o en cambio, representa una nueva mutacin en la famil
ia. sta es una caracterstica de trastornos genticos relativamente comunes, como el
sndrome de Marfan y la neurofibromatosis; ambos genes se han identificado, pero e
n la mayora de los casos todava no es tan fcil trabajar con la deteccin directa

C A P T U L O 66

D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I
C A S
1377
Influencias epigenticas y herencia no mendeliana
Los cambios epigenticos son cambios hereditarios, pero potencialmente reversibles
, en la expresin gnica que no representan un cambio en la secuencia del ADN genmico
de la clula. Los ejemplos ms destacados de herencia epigentica son las improntas g
enmicas (tratadas anteriormente) y la inactivacin del cromosoma X en mamferos; amba
s implican el silenciamiento transcripcional de genes por metilacin de citosinas
en dinucletidos CpG. El estado de metilacin del ADN se mantiene posteriormente a l
a replicacin del ADN mediante metilasas. que tambin actan sobre el ADN bcalenario h
emimetilado para metilar la cadena de ADN recin sintetizada. El proceso se perpeta
indefinidamente en divisiones celulares sucesivas. Una evidencia reciente sugie
re que la metilacin de novo de los dobletes CpG puede tener lugar en los promotor
es de algunos genes supresores de tumores, silenciando estos genes y constituyen
do esencialmente uno o ambos de los "impactos" en un gen supresor de tumor que c
onduce al desarrollo del tumor (Jones. 1999). Otra categora de herencia epigentica
menos aclarada implica la propiedad de algunas protenas para regular la conforma
cin de protenas recien sintetizadas o ensambladas de forma autoperpetua. Los ejemp
los ms caractersticos en mamferos son las enfermedades por priones, responsables de
la encefalopata espongiforme ovina y la enfermedad de las vacas locas en animale
s y del curu y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos. La enfermedad se p
roduce por la proteina prin, que tiene la misma secuencia de aminocidos que una pr
otena normal pero est plegada con una conformacin anmala, y sirve aparentemente como
una plantilla para la proteina recin sintetizada de tal modo que perpetua la ano
mala conformacional que origina la enfermedad.
una frecuencia de portadores tan elevada como de 1 de cada 30 en los ascendiente
s caucsicos del norte de Europa (y de forma decreciente en el s u r de Europa, hi
spanos, afroamericanos y asiticos), existan suficientes motivos para estudiar fami
liares de pacientes e incluso a la poblacin general con el fin de identificar par
ejas con un riesgo de 1 de cada 4 de tener un hijo afectado en cada embarazo. Pe
ro ya que estos portadores son asintomticos y tienen niveles normales de cloruros
en el sudor, se tuvo que esperar al aislamiento del gen en 1989 (Riordan, 1989:
Kerem. 1989) Algunos aos antes se haba mapeado el cromosoma 7, permitiendo el dia
gnstico prenatal mediante anlisis de ligamiento en familias que buscaban informacin
, realizando exploraciones masivas y analizando en otras familias, especialmente
en las que no presentaban antedecentes familiares del trastorno; esto slo pudo c
onsiderarse una vez que el gen se clon y las mutaciones fueron identificadas. Sin
embargo, el anlisis del ADN para la CF ha estado lleno de problemas y controvers
ias. El gen consta de alrededor de 250.000 bp y codifica una gran protena de cana
l inico denominada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qusti
ca (CFTR) (Collins. 1992). Lo ms notable es que el espectro de mutaciones observa
das es notablemente heterogneo. Mientras que una delecin de tres nucletidos del codn
"508 de la fenilalanina (designado como AF508) explica alrededor del 70% de las
mutaciones en caucsicos (y significativamente menos en otros grupos tnicos), unas
800 mutaciones adicionales han sido informadas hasta ahora. La mayora de ellas s
on tan poco frecuentes que no es factible ni rentable incluirlas en los paneles
de pruebas: slo alrededor de siete (adems de la \F508) explican ms del 1% de las mu
taciones de CF en la mayora de las poblaciones caucsicas (Tsui. 1992) (Tabla 66-1)
. La sensibilidad del cribado de portadores con paneles estndar de mutaciones de
entre 6 y 25 alelos vara desde un 97% en judos asquenazis (procedentes de Europa)
(Abeliovich. 1992), un 75% a un 90% en caucsicos norteamericanos no asquenazis, a
lrededor del 60% en hispanoamericanos, el 50% en afroamericanos y menos del 10%

en asiticos (Ober, 1992; Orozco, 1993; Curtis, 1993; Grebe, 1994; Macek, 1997). T
al sensibilidad variable y subptima en una poblacin tnicamente heterognea como la de
Frecuencias allicas y exploraciones masivas de la poblacin
Ya se ha hecho referencia a la aplicacin de estudios de deteccin de portadores par
a mutaciones recesivas en grupos amplios de poblacin. Para justificar el esfuerzo
y el gasto requeridos al realizar una prueba de ADN en miles o millones de pers
onas desde el punto de vista de la sanidad pblica, la incidencia de esta enfermed
ad debe ser lo suficientemente alta en la poblacin en general o en el grupo tnico
o racial objeto del estudio. La ley del equilibrio de Hardy-Weinberg predice que
la frecuencia del portador ser mucho ms alta para cualquier enfermedad aulosmica r
ecesiva de incidencia apreciable. La enfermedad diana candidata debe ser lo sufi
cientemente grave y/o favorable a alguna intervencin mdica en base a su identifica
cin. Diversos trastornos no parecen corresponderse con estos criterios. Mutacione
s asociadas con hemocromatosis hereditaria y resistencia a la proteina C activad
a (factor V Leiden) se encuentran en el 5% al 7% de la poblacin caucsica, mientras
que la frecuencia de portadores para la mutacin de la anemia falciforme se aprox
ima al 19% en la poblacin de afroamericanos. Las mutaciones de la fibrosis quisti
ca. aunque de menor frecuencia, colocan a tal cantidad de parejas norteamericana
s en riesgo que tambin se ha propuesto en niveles superiores como un objetivo vlid
o de cribado en la poblacin (vase ms adelante). Este desplazamiento de la prueba de
gentica molecular fuera del campo de enfermedades raras y dentro del mbito de est
udios comunes tendr un gran efecto en la medicina preventiva y la sanidad pblica y
conducir a nuevos progresos en la automatizacin de las pruebas de ADN en aos venid
eros.
Tabla 66-1 Mutacin
AF508
Algunas mutaciones predominantes d e fibrosis qustica Comentario
EJEMPLOS ESPECFICOS DE ENFERMEDAD
Fibrosis qustica
Debido a la alta frecuencia de portadores en Amrica del Norte y norte de Europa,
la naturaleza clnica grave, el patrn directo de herencia mendeliana (aulosmica rece
siva) y a su gen bien estudiado aunque bastante complejo, la CF ha surgido como
un trastorno paradigmtico para las pruebas de gentica molecular a gran escala. Den
tro de su mbito se puede encontrar la gama completa de tcnicas de gentica molecular
aplicables y un completo espectro de dilemas cientficos y ticos que surgen de la
variabilidad climca de la enfermedad, la heterogeneidad molecular extrema de las
mutaciones causantes y la llegada de nuevos tratamientos que incluyen la terapi
a de sustitucin gnica. Con

Delecin de 3 bp sm cambio del marco de lectura del codn phe, la principal mutacin d
e la CF presente hasta en un 70% de portadores de algunas poblaciones caucsicas G
542X Mutacin sin sentido, alrededor del 3% de portadores c a u c s i c o s W1282X
Mutacin sin sentido, presente en alrededor del 50% de portadores judos asquenazis
G551D Mutacin sustituliva. alrededor del 3% de portadores c a u c s i c o s N130
3K Mutacin sustituliva, 1-3% de portadores caucsicos y judos asquenazis R553X Mutac
in sin sentido, alrededor del 1.5% de portadores c a u c s i c o s 3849 + 10kbC *T Mutacin de una secuencia de unin exn-mtrn; 1.5 y 4%, respectivamente, de portador
es caucsicos y ludios asquenazis; asociado con enfermedad pulmonar pero con nivel
es normales de cloruros en sudor 3905insT Mutacin insercin/cambio del marco de lec
tura, alrededor del 1.5% de portadores caucsicos R117H Mutacin sustituliva asociad
a con ausencia congnita de los conductos deferentes. frecuencia estimada del t%-5
% 621 + IG -T Mutacin de una secuencia de unin exnintrn, alrededor del 1.5% de portad
ores caucsicos 1717 - IG -A Mutacin de una secuencia de unin exnintrn, alrededor del
% de portadores caucsicos 3120 + IG Ea Mutacin de una secuencia de unin exnintrn enco
trada en el 12% de pacientes afroamericanos

1378
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
Estados Unidos y las dificultades que supone el consejo a pacientes en cuanto al
riesgo residual de un anlisis negativo en un portador, ha hecho que la deteccin d
e portadores de mutaciones de la CF basada en la poblacin sea un tema polmico (Wil
fond, 1990; Williamson, 1993: Grody, 1999). a pesar de que una declaracin consens
uada recomienda que el estudio sea ofrecido a todas las parejas embarazadas y a
aquellas que tienen planes de hacerlo (NIH, 1997). Aunque la mutacin AF508 se pue
de detectar mediante migracin diferencial en gel de poliacrilamida (Fig. 66-1) (C
hong, 1990) y varias mutaciones producen patrones caractersticos de digestin por e
ndonucleasas de restriccin, el estudio de laboratorio para 30 o ms mutaciones depe
nde de estrategias con sondas ASO mezcladas (como la lustrada en la Fig, 66-3) o
transferencias en mancha inversas (en las cuales los productos de PCR marcados d
el paciente se hibridan con una serie de sondas de oligonucletidos 'tipo salvaje"
(wild-type) y mutantes inmovilizadas en un filtro (Chehab, 1992; Shuber, 1997).
Hasta que existan avances tecnolgicos en la secuenciacin rpida y barata del ADN, l
a hibridacin en "micromatriz" y los anlisis de protenas para la funcin del CFTR, la
sensibilidad de la prueba anteriormente citada probablemente seguir siendo la mis
ma. Esto representa un problema especial para el consejo prenatal de parejas en
las cuales la prueba de un cnyuge es positiva y la del otro negativa. No se puede
ofrecer nada ms en cuanto al diagnstico prenatal, incluso si el cnyuge negativo es
un portador, o si l o ella tienen una mutacin que no puede analizarse en el feto,
lo que aumenta la ansiedad con respecto al embarazo en curso. Se ha propuesto e
vitar la cuestin en su conjunto adhirindose a un modelo de deteccin precoz de la CF
basado en la pareja, en el cual los resultados se informan como negativos inclu
so si se observa que un cnyuge es portador (Wald. 1991); sin embargo, este enfoqu
e aumenta las cuestiones ticas acerca de la no revelacin de informacin mdica y otros
asuntos (Miedzybrodzka, 1991). Otro problema con el consejo gentico de la CF es
el de la variable gravedad clnica del trastorno y la discrepancia de correlacione
s entre genotipo y fenotipo. Ms all del hallazgo de que los homocigotos AF508 tien
den a padecer insuficiencia pancretica, se sabe poco acerca de la gravedad de la
enfermedad o complicaciones que puedan predecirse con fiabilidad a partir del co
nocimiento de un individuo afectado con dos mutaciones (Cystic Fibrosis Genotype
-Phenotype Consortium. 1993). Incluso los homocigotos para AF508, considerada la
mutacin "grave" prototpica, pueden mostrar un amplio rango en su grado de afectac
in pulmonar (Burke, 1992). Por el contrario, existen mutaciones que originan enfe
rmedad pulmonar aun manteniendo niveles normales de cloruros en el sudor (Highsmt
h, 1994); hay mutaciones y polimorfismos (como R117H y una extensin intrnica de po
litimidina) que no siempre producen CF sino algo de infertilidad masculina debid
o a la ausencia congenita de conductos deferentes (Gervais, 1993; Anguiano, 1992
). Junto con la probable llegada de terapias efectivas de sustitucin gnica para la
CF (Wilson, 1993), estos factores justifican el consejo gentico debido a la difi
cultad de los padres para tomar una decisin sobre el trastorno. Dada la heterogen
eidad molecular y clnica de la mayora de trastornos genticos, probablemente estos p
roblemas son la regla ms que la excepcin en la gentica molecular diagnstica.
1988: Prior, 1991). Slo con la llegada de la PCR multiplex se desarroll un sistema
para la identificacin rpida y barata de ms del 98% de deleciones del gen y su loca
lizacin en los exones especficos de ste (Beggs. 1990; Multicenter Sludy Group, 1992
). En este sistema se identifica una delecn por la ausencia de uno o ms de los mltip
les amplicones esperados en geles de electroforesis teidos con bromuro de etidio
o en instrumentos de electroforesis capilar (ya que una delecn en el gen diana sup
rimir la secuencia o secuencias de hibridacin de uno o ms cebadores, causando un fa
llo en la PCR) (Fig. 66-5), El mapeado de su estructura fina junto con la secuen

ciacin revel importantes ideas sobre la patognesis molecular de la DMD y la variant

e allica ms leve, la distrofia muscular de Becker (BMD). Mientras que ambas suelen
estar causadas por grandes deleciones en el gen. en la BMD se conserva, de modo
caracterstico, el marco de lectura en el transcrito resultante, en tanto que las
deleciones de la DMD producen ms a menudo mutaciones del marco de lectura y un p
roducto proteinico ms truncado (Monaco. 1998). El tercio restante de pacientes en
los que no se han detectado deleciones presenta normalmente mutaciones puntuale
s o microdeleciones/inserciones. Debido al tamao del gen. no es factible identifi
car estas lesiones directamente, debiendo volver al anlisis de ligamiento; tambin
se ha estudiado el gen por anlisis conformacional (SSCO, DGGE) (Prior. 1993), Com
o en cualquier estrategia de ligamiento, esta aproximacin es posible slo en famili
as que buscan informacin, en las cuales el ADN de un sujeto previamente afectado
est disponible para su estudio. Los protocolos iniciales dependieron de marcadore
s RFLP que flanquean el gen de la distrofina (Williams, 1986); ms recientemente,
marcadores microsatlite intragnicos han permitido el haplotipado ms rpido y exacto d
el cromosoma basado en la PCR (Beggs. 1990). Alternativamente, pueden realizarse
estudios a nivel protenico mediante la observacin de una distrofina disminuida o
ausente en la DMD y una distrofina de peso molecular anmala en la BMD, mediante t
ransferencia Western (Western blot) o nmunohistoqumica de biopsia de tejido muscul
ar (Hoffman, 1988). Este procedimiento tiene limitaciones para el diagnstico pren
atal, para el cual se requerira una biopsia de msculo fetal; sin embargo, el mtodo
ha sido recientemente adaptado para amniocitos y clulas de vellosidad corinica, in
ducidas a diferenciarse hacia clulas musculares mediante tcnicas de transferencia
gnica (Sancho, 1993). El diagnstico molecular de la DMD ha vuelto al punto de part
ida: la identificacin del gen sin conocer el producto proteinico ("gentica inversa
"), para la identificacin y el uso diagnstico del producto proteinico desde el con
ocimiento del gen. Esta clase de evolucin se puede esperar en el diagnstico de lab
o1234512345
Distrofia muscular de Duchenne
Esta miopata progresiva ligada al cromosoma X fue el primer trastorno cuyo gen ca
usante fue aislado mediante el proceso de "gentica inversa" (Rowland, 1988). Ante
s de su descubrimiento, las nicas pruebas que podan ofrecerse a familias de riesgo
eran la deteccin de algunos portadores femeninos, aunque no todos, mediante el h
allazgo de niveles sricos elevados de creatina cinasa, seguido de la determinacin
prenatal del sexo con la opcin de interrumpir el embarazo en fetos masculinos (in
cluso aunque el 50% de estos embarazos fuesen normales). El consejo gentico se pr
esta incluso a mayor problemtica porque alrededor de un tercio de los casos de DM
D surgen a partir de nuevas mutaciones. Incluso despus de su descubrimiento, su t
raslado a la aplicacin clnica no fue fcil debido a que el gen, denominado "distrofi
na", demostr ser ms grande an que el descubierto, abarcando 2,5 millones de bp y co
mpuesto de 79 exones (Ahn, 1993), El uso de sondas de ADNc de longitud completa
o parcial para detectar la variedad de deleciones que se producen en dos tercios
de los casos, fue un trabajo laborioso que llev mucho tiempo (Darras,
Figura 66-5. Anlisis mediante PCR multiplex para deleciones del gen de la distrof
ina en la dislrolia muscular de Duchenne. L a s muestras de A D N de c i n c o p
acientes se amplificaron simultneamente con cinco pares de cebadores (mitad izqui
erda del gel) y nueve pares de cebadores (mitad derecha del gel) y los productos
se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La ausencia de
u n a banda esperada de un producto de PCR es indicativa de una delecn. El pacient
e 2 carece de la banda superior en la plex-5 y de la segunda banda superior en l
a plex-9: stas corresponden, respectivamente, a deleciones en los e x o n e s 50
y 48 del gen de la distrofina. (La banda 4 de la plex-9 es tenue, pero est presen
te en todas las muestras.) (Foto cortesa de Dra. Kathryn E. Kronquisl.)

CAPTUIO 66

DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

1379
ratono de muchas enfermedades genticas, ya que los estudios funcionales del produ
cto de un gen son, por definicin, ms completos que intentar localizar innumerables
mutaciones individuales a nivel del ADN,
Anemia de clulas falciformes y otras hemoglobinopatas
Debido a la larga historia de estudio de su producto proteinico, el diagnstico de
los defectos moleculares de los genes que codifican los polipptidos de la globin
a no se hizo mediante tcnicas de "gentica inversa"; o mejor dicho, estos genes se
clonaron por mtodos clsicos, usando anticuerpos antiglobina en la precipitacin poli
smica para aislar los cidos ribonucleicos mensaieros relevantes (ARNm). De esta ma
nera, las mutaciones de la hemoglobina y en particular la que causa la anemia fa
lciforme. fueron de las primeras en ser diagnosticadas a nivel de ADN. Una mutac
in puntual de la clula falciforme se encuentra dentro (por tanto, destruyndola) de
una secuencia de escisin para endonucleasas de restriccin (Msfll o Ddel) en el codn
6 del gen de la globina [J. proporcionando un mtodo rpido de deteccin usando trans
ferencia Southern o digestin mediante enzimas de restriccin de los productos de PC
R del gen de la globina [i (Hatcher, 1992) (Fig. 66-2). De forma alternativa, la
s secuencias de hemoglobina S y hemoglobina A se pueden distinguir mediante tran
sferencia en mancha usando sondas de oligonucleotides especificas de un alelo co
mplementarias a la secuencia normal o mulante (Conner, 1983). Estas tcnicas se pu
eden usar para el diagnstico, cribado de portadores o diagnstico prenatal; en este
ltimo caso es obvia la necesidad de una obtencin invasiva de sangre letal y la el
ectroforesis clsica de hemoglobinas. La prueba de ADN se vuelve importante para l
a confirmacin de apoyo de los resultados positivos y ambiguos de los estudios, in
cluso si se hacen por mtodos bioqumicos, puesto que ms estados han iniciado los pro
gramas de deteccin precoz de las clulas falciformes en recin nacidos. Una mutacin di
ferente en el codn 6, que origina la enfermedad de la hemoglobina C, no suprime l
a secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restriccin (porque se da en u
na posicin de nucletido flexible para la enzima), por tanto puede distinguirse med
iante sondas ASO (Maggio, 1993). Se debe tener en cuenta que ninguno de estos mto
dos identificar los heterocigotos compuestos clula falciforme/(i-talasemia o hemog
lobina C/p-talasemia. Las talasemias engloban tanto alteraciones cualitativas co
mo cuantitativas en una o ms cadenas de globina; su diagnstico a nivel molecular e
s ms complejo que el de la anemia lalciforme. La u-talasemia es la ms sencilla, ya
que normalmente se origina por la delecin de uno o los dos genes a contiguos en
uno o los dos cromosomas 16. Se puede detectar mediante transferencia Southern o
PCR, permitiendo la diferenciacin del portador imperceptible (prdida de un gen a)
, de la hidropesa fetal muy grave (prdida de los cuatro genes) y de los dos estado
s intermedios (Oron-Karni. 1998). El diagnostico molecular de la |i-talasemia es
bastante ms complicado debido a la gran variedad de secuencias promotoras, de te
rminacin, de delecin, de unin exn-intrn y mutaciones del marco de lectura que se han
documentado. Por esta razn, el anlisis de ADN para este trastorno se ha limitado a
algunos laboratorios especializados.
Figura 66-6. Eiemplo de anlisis electrolortico m e d i a n t e PCR de la mutacin de
l tactor V Leiden. Un fragmento amplificado p o rP C R del gen del factor V que
aparca el codn 506 presentar dos secuencias de escisin para la e n z i m a de restr
iccin Mn en el ADN normal, pero slo una si contiene la mutacin R506Q, que destruye u
na de las secuencias. Los patrones resultantes de la digestin mediante enzimas de
restriccin mostrarn, respectivamente, dos. tres o cuatro bandas, dependiendo de s
i la mutacin es homocigota (carril derecho), esta a u s e n t e (carril izquierdo
) o heterocigota (carril central). El fragmento ms corto m i g r a cerca de la pa

rte inferior de la foto del gel y suele ser difcil de ver.

Trombofilias hereditarias
La fibrosis qustica no es el nico trastorno con una frecuencia de mutacin lo sufici
entemente alta como para justificar un cribado de la poblacin usando mtodos molecu
lares. Algunos genes, recientemente caracterizados, han revelado frecuencias de
portadores de una magnitud superior a las de la CF. En este grupo se incluyen ge
nes implicados en el sistema anticoagulante, que controlan la cascada de la coag
ulacin. El ms notable de tales alelos es la mutacin del factor V de Leiden: se trat
a de un solo cambio nucleotdico que produce la sustitucin de un aminocido (R506Q) e
n la proteina del factor V de la coagulacin, hacindola resistente a la escisin por
la protena C activada (Bertina, 1994). El alelo es portado por el 5% al 7% de la
poblacin caucsica y es responsable de ms del 90% de resistencia clnica a la APC, dan
do como resultado una tendencia al tromboembolismo venoso idioptico (Ridker, 1997
a). Se ha informado que produce un nesgo relativo de trombosis siete veces super
ior al normal cuando se presenta en estado heterocigolo y alrededor de 80 veces
en el estado homocigoto. El anlisis de la mutacin es sencillo porque, al igual que la mutacin de las clulas falciformes. sta elimi
na una secuencia de escisin de una endonucleasa de restriccin (Fig. 66-6); se han
desarrollado mtodos automticos para mejorar el rendimiento de la prueba (Ryan, 199
9). De igual modo que para la CF, existen controversias sobre a qu pacientes se d
ebe proponer el estudio. A pesar del elevado nesgo relativo, el riesgo absoluto
conferido por esta mutacin es ms bajo, con una penetrancia para los sntomas trombtic
os de alrededor del 10% a lo largo de la vida. Por tanto, la mayora de portadores
no serian candidatos a terapia anticoagulanle a pesar del riesgo de hemorragia
e idus; tampoco es seguro si tal estudio cambiara el tratamiento del paciente de
un modo significativo. Se ha propuesto realizar el estudio en sujetos con factor
es de riesgo ambientales conocidos que actan de modo sinrgico con el riesgo del fa
ctor V de Leiden. como las mujeres que toman anticonceptivos orales. Aun aqu podra
discutirse la obligacin de dichas mujeres con una prueba positiva a volver a mtod
os menos eficaces de control del embarazo que podrian causar ms perjuicios que be
neficios, aumentando la tasa de embarazos con sus propias complicaciones de vigi
lancia, algunas de las cuales, de forma irnica, son de naturaleza trombtica (Kupfe
rminc. 1999). Hoy en da, la mayora de peticiones recibidas por los laboratorios de
gentica molecular para el anlisis del factor V de Leiden son de pacientes que ya
han padecido un episodio de tromboembolismo inexplicable. Junto con el factor V
de Leiden. existen otras mutaciones hereditarias de elevada frecuencia allica que
confieren riesgo trombtico. L a variante 20210A de la protrombina. un cambio de
un solo nucletido en la regin 3' no traducida del gen de la protrombina. origina u
nos niveles altos de protrombina circulante y un fenotipo similar al del factor
V de Leiden; se encuentra en el 1% al 2% de la poblacin general (Poort. 1996). La
variante 677C-*T de la metilenoletrahidrofolato-reductasa, una enzima implicada
en el metabolismo de la homocisteina, la portan el 30% al 40% de la poblacin gen
eral y se asocia con niveles plasmticos elevados de homocisteina y riesgo de trom
bosis vascular (incluida la arteriopatia coronaria). Las mutaciones para cada un
o de

1380
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
estos factores pueden actuar de forma sinrgica con las otras, de modo que los pac
ientes que portan dos o incluso tres de estos defectos, incluyendo tambin las def
iciencias menos frecuentes de protenas S y C, tienen mayor riesgo (Halbmayer, 199
9; Ridker, 1997b; Koeleman, 1994), Las pruebas de ADN para varias de eslas mutac
iones tromboflicas se pueden multiplexar en un solo anlisis (Hessner, 1999).
Trastornos por expansin de repeticin de trinucletido
Un tipo importante de mutacin patolgica se revel en 1991 con el descubrimiento de q
ue la atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X (enfermedad de Kennedy
, SBMA) y el sndrome X frgil (FRAXA) estaban asociados, respectivamente, con la am
plificacin de secuencias inestables de repeticin de trinucletido en el gen del rece
ptor de andrgenos (AR) y el gen FMR1 ("retraso mental del cromosoma X frgil"). Des
de entonces, mutaciones patolgicas similares se han asociado con varios trastorno
s neurolgicos y musculares (resumidos en la Tabla 66-2), proporcionando una clasi
ficacin molecular de las ataxias espinocerebelares (La Spada, 1994; Bates, 1994;
Reddy. 1997; Hardy, 1998; vase tambin Online Mendelian Inheritance in Man [OfvllM]
, http;//www3.neb.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html). En cada uno de estos trastor
nos, el gen afectado contiene normalmente una secuencia repetida de 3 bp. por ej
emplo (CGG) en el gen FMR1, donde n es variable pero est claramente limitado en su
intervalo. En el estado patolgico, el nmero de repeticiones del triplete se expan
de por encima del intervalo de normalidad, a veces de forma marcada. Son varios
los mecanismos mediante los cuales estas secuencias de repeticin expandidas origi
nan enfermedad, incluyendo el silenciamiento gnico y el aumento de la funcin txica
de protenas mulantes. Actualmente hay una sola excepcin a la "regla del triplete"
para las expansiones de repeticin patolgicas: una nueva expansin de repeticin de 12
bp en direccin 5' de la secuencia de inicio de transcripcin del gen de la cistatin
a B, asociada con una enfermedad autosmica recesiva poco frecuente, la epilepsia
mioclnica progresiva de tipo 1 (Larson. 1999).
gen ancestral, que tienen un riesgo elevado de sufrir expansiones adicionales ca
da vez que se transmiten a otra generacin. Como el alelo con premutacin aumenta en
tamao, se incrementa la probabilidad de que se expanda ms en la prxima generacin. C
uriosamente, la expansin a una mutacin completa slo sucede en la meiosis femenina,
nunca en la masculina, lo cual se corresponde con la observacin de que las hijas
de hombres normales transmisores son siempre fenotipicamente normales. La Figura
66-78 ilustra u n a familia con FRAXA: un alelo con premutacin se transmite de l
a primera a la segunda generacin, expandindose a una mutacin completa en la tercera
generacin. Se est investigando el mecanismo por el cual la repeticin expandida del
triplete en la regin 5' no codificante del gen FMR1 produce el fenotipo FRAXA. D
ebido al tamao de las expansiones de repeticin, existe una metlacin progresiva de la
regin reguladora del gen FMR1 y una expresin disminuida de la proteina FMR-1. Est
a proteina de unin al ARN se expresa ampliamente durante el desarrollo del cerebr
o y de otros tejidos. Su prdida de expresin en el FRAXA puede alterar el desarroll
o normal del cerebro y originar retraso mental (La Spada, 1994). Un escaso nmero
de pacientes con sndrome X frgil tpico no presentan expansin de repeticin de triplete
s o hipermetilacin gnica, pero presentan mutaciones de inactivacin que dan lugar a
la prdida de expresin de la protena FMR1. Tambin se han descrito dos hermanos fenoti
picamente normales con expansiones de repeticin completas del gen FMR1 y zonas frg
iles visibles citogenticamente. pero sin hipermetilacin gnica y expresin normal de l
a protena FMR1 (Smeets. 1995). Estos hallazgos apoyan la hiptesis de que la respon
sable de este fenotipo patolgico es la prdida de expresin de la proteina FMR1. Fami
lias poco comunes con retraso mental ligado al cromosoma X y una zona frgil demos

trable citogenticamente en la regin cromosmica Xq2728, pero sin hipermetilacin o exp

ansin de repeticin de (CGG)n en el gen FMR1. condujeron al descubrimiento de una s
egunda zona frgil ms distal en la regin Xq28 asociada con hipermetilacin y expansin d
e repeticin de (GCC). Individuos con expansin de la repeticin superior a 200 copias
padecen alteracin mental leve. A diferencia del FRAXA. no existe una predisposicin
sexual aparente en la transmisin del FRAXE (Knight, 1994). Se ha descrito otra z
ona frgil, an menos frecuente, con expansin d e repeticin de un trinucletido en la re
gin Xq28 distal al FRAXE, denominado FRAXF. No est claro si el FRAXF est asociado c
on disfuncin mental (Ritchie, 1994).
Sndromes XA frgil y XE frgil
El FRAXA, la causa ms comn de retraso mental hereditario (1 de cada 1.250 hombres)
, es la segunda causa de retraso mental de moderado a grave en hombres, tras el
sndrome de Down. Los hombres afectados con este trastorno ligado al cromosoma X t
ienen tambin orejas grandes, cara alargada y nariz prominente. Aproximadamente 1
de cada 2.500 mujeres son portadoras heterocgotas de mutacin para el FRAXA, y una
tercera parte de stas puede presentar evidencias de una ligera disfuncin mental. E
l sello citogentico del FRAXA es una "zona frgil" en la regin Xq27.3 del cromosoma
X, causada por un defecto en la condensacin normal de la cromatina durante la mit
osis. Aunque el patrn hereditario de la enfermedad est claramente ligado al cromos
oma X. no se corresponde estrictamente con un patrn dominante o recesivo de expre
sin gnica. La principal caracterstica anmala ha sido la presencia de hombres fenofip
icamente normales ("hombres normales transmisores") que son portadores obligados
de la anomala gentica. Estos hombres son hijos de portadores demostrados del FRAX
A: pasan el estado de portador a todas sus hijas y stas a su vez transmiten la en
fermedad completamente expresada a una alta proporcin de sus hijos. El descubrimi
ento en 1991 de la anomala gentica que produce el FRAXA clarific inmediatamente su
patrn inusual de herencia (Fu, 1991). La regin 5' no traducida del gen FMR1 situad
o en la posicin Xq27.3 del cromosoma X porta un triplete (CGG). repetido un nmero
de veces variable. En sujetos normales, n vara hasta 50, pero en individuos con F
RAXA clnicamente aparente, n es superior a 200 (denominada "mutacin completa"). Ta
nto los hombres como mujeres que portan un cromosoma X con n situado entre 50 y
200 (denominada "premutacin") son fenotipicamente normales, pero tienen un riesgo
elevado de transmitir a sus hijos un alelo incluso de un tamao mayor. Esto se de
be a la inestabilidad de los alelos con premutacin y su tendencia a aumentar en t
amao durante las divisiones celulares meiticas que se producen en los gametos masc
ulinos y femeninos. Los alelos de tamao normal son estables y se transmiten sin a
lteraciones. Parece que existe una mezcla de alelos con pequeas premutaciones en
la poblacin, posiblemente de oriTrastornos
neurodegenerativos:
enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X, a
taxias espinocerebelares y atrofia dentatorubral-palidoluisana
La enfermedad de Huntington (HD), la atrofia muscular bulboespinal ligada al cro
mosoma X (SBMA), las ataxias espinocerebelares (SCA) tipos 1,2,3,6, 7 y 12 y la
atrofia dentatorubral-palidoluisana (DRPLA) son enfermedades autosmicas dominante
s o ligadas al cromosoma X (SBMA), caracterizadas por una degeneracin neuronal se
lectiva en el sistema nervioso central (SCN). En estos trastornos aparece una ex
pansin de repeticin del trinucletido (CAG) en la regin codificante de un nuevo gen. q
ue produce una elongacin anormal de una extensin de poliglutamina (La Spada, 1994)
. La protena anmala resultante forma inclusiones intranucleares en las neuronas. S
e postula que las secuencias expandidas de poliglutamina en estas protenas conduc
en a alteraciones en sus propiedades de unin y a un aumento de su funcin que resul
ta txica para las neuronas de un modo selectivo. Se han observado inclusiones int
ranucleares. producidas por estas protenas anmalas, en vanos de estos trastornos (
Reddy, 1997; Rubinsztein, 1999). Las repeticiones expandidas de los trastornos n

eurodegenerativos, as como otros trastornos de repeticin de tripletes, son inestab

les y tienden a incrementar su nmero en generaciones posteriores. Existe una corr
elacin positiva, aunque no absoluta, entre el nmero incrementado de repeticiones,
el inicio precoz de la enfermedad y la gravedad clnica. Al contrario que el sndrom
e X frgil y la distrofia miotnica, en los que los principales aumentos del nmero de
repeticiones suceden en la meiosis materna, la transmisin paterna produce las ma
yores expansiones en los trastornos neurodegenerativos.

1382
S E C C I N VII

PATOLOGIA MOLECULAR
-o

Figura 6 6 - 7 . Deteccin de la expansin de repeticin de (CGG| en el sndrome X frgil.

A, Diagrama de alelos normales, con premutacin y con m u t a cin completa en el lo
cus del FRAXA. Cuando hay una expansin de la repeticin a una mutacin completa, la s
ecuencia de la enzima de restriccin Eag I se metila y no se corta con la enzima.
6 , La familia de un paciente (cuadrado oscuro) con sndrome X frgil. Una transfere
ncia Southern de ADN digerido con EcoR \IEag I de cada individuo en el rbol genea
lgico se examin con una sonda marcada de ADN que hbrida en 3' con la repeticin. Los
tres sujetos de la parte derecha de la figura son normales (cuadrados y crculos c
laros). Obsrvese que cada uno de los dos hombres presenta una sola banda de 2,8 k
b, mientras que la mujer tiene ambas bandas, una de 2,8 y otra de 5.2 kb. ste es
el resultado esperado. La banda de 5,2 kb de la mujer es el cromosoma X inactivo
normal (y, por tanto, metilado) de cada una de sus clulas. El ADN de este cromos
oma est metilado y no se corta por Eag I. Sin embargo, la banda de 2,8 kb procede
del cromosoma X activo no metilado (en este caso, Eag I cortar el ADN) de la m u
j e r y de los hombres. El hombre afectado presenta una gran banda aumentada, c
o m o consecuencia de una marcada expansin de repeticin de trinucletido adems de me
tilacin en la secuencia de la enzima de restriccin Eag I. Los tres individuos marc
ados por puntos negros son portadores de alelos con premutacin. En las mujeres, l
a distincin entre alelos normales y expandidos se observa ms claramente en el ADN
procedente de sus c r o m o s o m a s X activos (no metilados). Aqu, hay bandas d
istintas de 2,8 kb y 3,0 kb. La resolucin no es tan buena en la parte superior de
l gel y los alelos de 5,2 y 5.4 kb apenas estn separados. Obsrvese que en la muest
ra de sangre perifrica procedente de la m a d r e del paciente afectado, la inact
ivacin del c r o m o s o m a X est sesgada con respecto a la expansin de repeticin:
una proporcin m a y o r de cromosomas X normales de esta poblacin celular se ha in
activado aleatoriamente comparado con los cromosomas X que portan el alelo con p
remutacin. C, Separacin de repeticiones de trinucletido por electroforesis en gel p
osterior a la amplilicacin del locus mediante PCR (Levinson, 1994). Los carriles
del 1 al 6 representan seis individuos diferentes; el carril M contiene un marca
dor de tamaos. Los productos de PCR se marcaron mediante la incorporacin de P-dCTP
durante la reaccin de amplificacin y el gel seco se expuso sobre una pelcula de ra
diografa. Las mujeres heterocigotas presentan dos alelos, los hombres y las mujer
es homocigotas muestran slo un alelo. Las bandas mltiples producidas con cada alel
o se deben al fenmeno de "slippage" ("deslizamiento") de la ADN-polimerasa durant
e la reaccin de la PCR: la banda ms intensa se t o m ac o m o representativa del t
amao real del alelo. (C, Cortesa de Dra. Anre Maddalena. Genetics & IVF Institute,
Fairfax. VA.)
3 ?

C A P T U L O 66

D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I
C A S
1383
En consecuencia, los casos de inicio juvenil de HD, DRPLA y las SCA se transmite
n normalmente a travs del padre (Reddy, 1997). A diferencia de las SCA anteriorme
nte descritas, la SCA 8 autosmica dominante no se asocia con una expansin del frag
mento de poliglutamina, aunque si con una expansin de CTG no codificante (Koob, 1
999), sta tambin difiere de las otras SCA en su patrn de inestabilidad de repeticio
nes, con expansiones predominantemente maternas, algunas m u y grandes. En este
aspecto, la enfermedad se asemeja a la distrofia miotnica.
rar alelos que difieran en tamao por una sola unidad de repeticin. Esto e s de par
ticular importancia cuando se necesita diferenciar entre alelos estables en el lm
ite superior de tamao y alelos con pequeas premiaciones o patolgicos. Sin embargo,
cuando las expansiones de triplete son m u y grandes, como las manifestaciones c
ompletas de FRAXA o DM, puede ser imposible amplificar mediante PCR el gran segm
ento expandido de ADN: en este caso, se prefiere utilizar la transferencia South
ern. La figura 66-7 ilustra el uso de transferencia Southern y PCR para detectar
mutaciones completas del FRAXA y alelos del FRAXA con premutaciones.
Distrofia
miotnica Sndromes de Prader-Willi y de Angelman
Estos dos trastornos, cuyos genes estn situados aproximadamente en el mismo locus
del cromosoma 15, casi siempre se estudian juntos, incluso aunque sean causados
por dos genes diferentes y no tengan fenotipicamente casi nada en comn. El sndrom
e de Prader-Willi (PWS) se caracteriza por obesidad, retraso mental, hipoplasia
genital y rasgos dsmrticos, mientras que el sndrome de Angelman (AS) presenta ataxi
a, rostro similar a una marioneta, retraso mental, sonrisa mantenida y crisis co
nvulsivas. Pero comparten un potente mecanismo de impronta que determina la mani
festacin de la enfermedad. Los dos trastornos suelen ser espordicos. El PWS. cuyo
gen se desconoce, a menudo se origina por una delecn en la regin 15q11-13 del cromo
soma paterno: slo el gen PWS paterno se expresa, por lo que resulta patolgico. Lo
opuesto ocurre en el AS. causado por la delecn de un gen conocido (UBE3A). exclusi
vamente en el cromosoma heredado de la madre, que es el nico alelo que se expresa
(Knoll, 1989; Matsuura. 1997). Por otra parte, el sndrome de Prader-Willi puede
producirse por UPD en el cromosoma 15 materno, que porta slo la copia que no se e
xpresa del gen; asimismo el sndrome de Angelman se origina por UPD en el cromosom
a 15 paterno. Estos tenmenos se pueden delectar mediante FISH, haplotipado cromosm
ico con marcadores microsatlite o transferencia Southern con enzimas de restriccin
sensibles a la mediacin que pueden distinguir la regin crtica materna metilada de
la regin critica paterna no metilada (Lerer, 1994). Ms recientemente, se ha desarr
ollado un sistema de PCR diferencial que amplifica cualquier alelo metilado o no
metilado cercano al gen SNRPN dentro de la regin critica, basado en la resistenc
ia de las citosinas metiladas a la modificacin qumica por bisulfito sdico (Kosaki,
1997) (Fig. 66-8) Sin embargo, es importante tener en cuenta que ni la transfere
ncia Southern ni los mtodos de PCR distinguirn entre los mecanismos de delecn o de U
PD ni detectarn casos (ms frecuente en AS) debidos a mutaciones puntuales dentro d
el gen causante. Estos mtodos tambin distinguirn casos poco frecuentes de AS o PWS
debidos a defectos primarios de impronta (Burger. 1997). los cuales tendran mayor
riesgo de recurrencia.
La distrofia miotnica (DM) es un trastorno multisistmico autosmico dominante con un
amplio rango de manifestaciones clnicas. En la infancia tarda o edad adulta tempr

ana, los pacientes clnicamente ms caractersticos desarrollan miotona progresiva, deb

ilidad y atrofia de los msculos distales de las extremidades y cara. Tambin es fre
cuente la aparicin de: cataratas, defectos en la conduccin cardiaca y atrofia lesl
icular. La enfermedad puede ser leve y consistir nicamente en cataratas que se de
sarrollan durante la vejez, o ser tan grave que presenta al nacimiento una degen
eracin muscular marcada y retraso mental, seguido de muerte a edad temprana, A me
nudo se pueden observar todas las manifestaciones de la enfermedad en la misma f
amilia, sucediendo en un patrn denominado por los genetistas como "anticipacin": e
n generaciones posteriores, la enfermedad se hace ms grave y con su inicio a edad
ms temprana. La anticipacin est presente en todos los trastornos de repeticin de tr
inucletido, pero es ms llamativa en la DM, donde el fenotipo clnico puede progresar
en tres generaciones desde cataratas a enfermedad congnita grave. La DM est causa
da por una expansin de repeticin de (CTG),, en la regin 3' no traducida del gen de
la proteina cinasa miotonina en la regin cromosmica 19q13.3 (Mahadevan. 1992; Fu,
1992). En individuos normales, esta repeticin varia entre 5 y 35. y es genticament
e estable. Las repeticiones CTG superiores a 50 son genticamente inestables y pro
pensas a la expansin cuando se transmiten a generaciones posteriores. En el inter
valo de 50 a 100, estas repeticiones suelen ser asintomticas o producir sntomas mni
mos. Cuando estn presentes repeticiones mayores de 100, el fenotipo tpico de la DM
es el ms probable. Aunque existe una correlacin entre la longitud de las repetici
ones y la gravedad clnica, el nmero de repeticiones no es un indicador de pronstico
fiable en un caso individual. Las expansiones extremas de 1.000 a 2.000 repetic
iones observadas en la DM congnita se dan slo con la transmisin femenina de una rep
eticin inestable; la DM congnita siempre se hereda de la madre. No se conoce el me
canismo por el cual las repeticiones expandidas de trinucletido del gen de la pro
teina cinasa miotonina produce el fenotipo DM. Ya que la repeticin no se localiza
en la regin codificante del gen. es posible que la expresin protenica est alterada
o que estn perturbadas las interacciones reguladoras del ARNm.
Cnceres familiares
En cierto sentido, todos los cnceres son trastornos genticos causados por mutacion
es en genes que controlan la proliferacin y diferenciacin celular. De un modo simp
lificado pero til, estos genes se pueden dividir en dos grupos: los que actan pred
ominantemente para promover la proliferacin (profooncogenes) y los que actan de mo
do que impiden el crecimiento celular (genes supresores de tumores). Frecuenteme
nte, estos sucesos mutacionales tienen lugar en una clula somtica, requiriendo alt
eraciones en varios protooncogenes o genes supresores de tumores antes de que se
desarrolle un cncer caracterstico de esa clula particular (vase Cap. 64 para el est
udio de oncogenes y genes supresores de tumores). En algunos individuos, la muta
cin inicial puede darse en la linea germinal, heredada de un padre y presente en
todas las clulas del organismo. Hasta la fecha, las mutaciones hereditarias cance
rgenas de la lnea germinal normalmente se han encontrado en genes supresores de tu
mores, aunque tambin se han observado en algunos oncogenes y en ciertos grupos de
genes reparadores de ADN (Tabla 66-3). La mutacin hereditaria debera ser vista co
mo un suceso inicial en el desarrollo del tumor y no c o m o suficiente por si s
ola para producir cncer: simplemente como el primer paso en una serie de mutacion
es que finalmente conducen a un crecimiento celular incontrolado, anlogo a la pri
mera mutacin somtica que inicia el desarrollo del tumor en cnceres espordicos.
Ataxia de Friedreich
La ataxia de Friedreich (FRDA) es la ms comn de las ataxias hereditarias, con una
incidencia de 2 por cada 100.000 habitantes. A diferencia de otros trastornos de
repeticin de trinucletido. la FRDA se hereda como una enfermedad autosmica recesiv
a y no muestra evidencias de anticipacin. La repeticin (GAA) expandida se localiza
en el primer intrn del gen FRDA, reduciendo la expresin de la frataxina, una proten
a mitocondrial. Se desconoce la funcin de la Irataxina, aunque la disminucin de su
expresin en pacientes con FRDA se asocia con respiracin mitocondrial defectuosa e
n el msculo esqueltico. El 97% de los alelos FRDA se deben a expansiones de (GAA);
el resto se debe a otras mutaciones inactivantes que incluyen mutaciones puntua
les (Lodi, 1999).

Anlisis de laboratorio de trastornos de repeticin de trinucletido

Las expansiones de repeticiones de trinucletido se demuestran rpidamente mediante
transferencia Southern o PCR. Para la mayora de estos trastornos se prefiere la P
CR, seguida por la separacin de los productos en un gel de electroforesis, debido
a su rapidez, simplicidad y capacidad para sepa-

1384
Neg PWS
SECCIN V i l

PATOLOGA MOLECULAR
AS
desarrolla un solo tumor espordico. En un tercio de los casos, la primera mutacin
del gen RB1 est presente en la lnea germinal del nio afectado, habindose heredado de
un padre igualmente afectado o apareciendo como una nueva mutacin en la gametogne
sis. En este caso, la probabilidad de que el otro gen RB1 sufra una mutacin en al
menos una clula precursora de la relina es superior al 90%. Como observ Knudson.
en la mayora de pacientes con enlermedad familiar los tumores son bilaterales y m
ultifocales (Knudson, 1971). dando a entender que varias clulas han sufrido mutac
iones adicionales en RB1. No se sabe si las mutaciones RB1 por s solas son sufici
entes para la tumorognesis, aunque s parecen ser el suceso que lo inicia. El retin
oblastoma familiar ha servido como un modelo de guia en la investigacin para la c
omprensin de muchos cnceres familiares. Esto ha conducido al descubrimiento de gra
n nmero de genes supresores de tumores importantes, no slo en la patognesis de algu
nos tumores familiares relativamente poco (recuentes, sino tambin en el desarroll
o de tumores frecuentes como el carcinoma de m a m a de inicio precoz (Tabla 663) y el carcinoma de colon espordico (Weinberg, 1991).
Oncogenes: neoplasia endocrina mltiple de tipo 2
Hasta la fecha, slo existen algunos sndromes de cncer familiar, los cuales se sabe
estn originados por una mutacin hereditaria de un oncogn. De ellos, los ms conocidos
son la neoplasia endocrina mltiple de tipo 2A (MEN 2A) y sus variantes, el carci
noma medular de tiroides familiar (FMTC) y la neoplasia endocrina mltiple de tipo
2B (MEN 2B). Mutaciones de activacin en slo un alelo del protooncogn RET son sufic
ientes para iniciar la lumorognesis en esle trastorno (Noli. 1999). Estos tres snd
romes se caracterizan por hiperplasia de las clulas C tiroideas y carcinoma de ti
roides. Las familias que padecen MEN 2A tambin presentan feocromocitomas y/o aden
omas paratiroideos o hiperplasia paratiroidea. MEN 2B se caracteriza por la pres
encia de mltiples neuromas de mucosas de labios, boca y tracto gastrointestinal,
hbito marfanoide, un curso clnico particularmente agresivo y una elevada proporcin
de individuos afectados debido a nuevas mutaciones del gen RET. RET es una molcul
a de sealizacin con una zona receptora extracelular y una zona tirosina cinasa int
racelular. Salvo algunas excepciones, las mutaciones conocidas de FMTC y MEN 2A
son sustituciones de una sola base en uno de cinco codones en la zona extracelul
ar: en cada caso se produce la sustitucin de una cistena por otro aminocido. Se con
oce slo una mutacin de MEN 2B, la sustitucin de una sola base que produce una mutac
in sustituliva en la zona tirosina cinasa. No se ha encontrado mutacin alguna en e
l 5% al 10% de familias afectadas con estos trastornos (Noli. 1999).
Figura 66-8. Anlisis electrofortico mediante PCR de patrones de metilacin de les snd
romes de Prader-Willi y Angelman utilizando el mtodo del bisulfito sdico d e Kosak
i (1997). En el sndrome de Prader-Willi, slo est presente el alelo materno metilado
(banda superior), debido a la delecin del alelo paterno o a disomia uniparental
para el alelo materno. En el sndrome de Angelman, slo est presente el alelo paterno
no metilado (banda interior), debido a la delecin del alelo materno o a disoma un
iparental para el alelo paterno. Tambin pueden realizarse anlisis similares median
te transferencia Soulhern usando enzimas de restriccin sensibles a la metilacin.
En comparacin con sus homlogos espordicos, los cnceres familiares suelen desarrollar
se a una edad ms temprana, son frecuentemente multifocales y aparecen bilateralme
nte en los rganos pares. Knudson postul, observando estas caractersticas distintiva

s entre el retinoblastoma espordico y el familiar, que eran necesarios al menos d

os sucesos mutacionales para producir un tumor (Knudson, 1971). En el caso de un
tumor espordico, son necesarios dos sucesos mutacionales independientes en la mi
sma clula para iniciar el desarrollo del tumor, mientras que en el caso del tumor
familiar, la primera mutacin est ya presente en el nacimiento en cada clula del or
ganismo, haciendo ms probable que un segundo suceso mutacional ocurra a una edad
ms temprana y a menudo en ms de una clula. La hiptesis del "doble impacto" de Knudso
n es un concepto importante que ha guiado muchos estudios sobre la base gentica d
el cncer. La aclaracin de las mutaciones hereditarias en los sndromes del cncer fami
liar ha sido enormemente informativa, no slo para comprender estos trastornos poc
o frecuentes, sino tambin para entender los cambios fundamentales responsables de
los cnceres ms comunes.
Genes reparadores de ADN: cncer de colon hereditario sin poliposis
Durante la bsqueda de posibles genes supresores de tumores c o m o causa de cncer
de colon sin poliposis, se observ que secuencias polimrficas de repeticin de dnucleti
do (tambin conocidas c o m o microsatlites), como (CA), eran inestables en los tumo
res de individuos afectados. Debido a la demostracin de una inestabilidad similar
en los microsatlites de bacterias con anomalas en los genes responsables de la re
paracin de una incompatibilidad del ADN, la atencin se ha dirigido a la posibilida
d de que genes humanos de reparacin del ADN, homlogos a los genes bacterianos, fue
sen los responsables de las anomalas hereditarias del cncer de colon sin poliposis
familiar (Fishel, 1993; Leach, 1993). De un modo anlogo a la iniciacin de la tumo
rognesis mediante genes supresores de tumores, la herencia de una copia de gen de
fectuoso MSH2. MLH1. PMS1. PMS2 o MSH6. seguido por la mutacin somtica de una segu
nda copia, origina clulas deficientes en la reparacin del ADN. Estas clulas acumula
n con el tiempo mutaciones deletreas y se producen transformaciones malignas. No
se comprende la aparente especificidad de tejido.
Genes supresores de tumores: retinoblastoma
Aunque los sndromes de cncer familiar debidos a mutaciones en genes supresores de
tumores siguen un patrn dominante de herencia, los cambios a nivel celular a menu
do parecen recesivos, ya que la tumorognesis se inicia (en la mayora de casos) slo
cuando ambas copias del gen supresor del tumor estn inactivadas. La prdida del gen
normal heredado del padre no afectado puede ser el resultado de una segunda nue
va mutacin, pero ms a menudo es el resultado de la sustitucin por una copia duplica
da del gen mutado heredado del padre afectado mediante mecanismos genticos como l
a no disyuncin cromosmica o la recombinacin mittica. Estos eventos tienen lugar en e
l retinoblastoma, un tumor de la retina originado por la prdida funcional de las
dos copias del gen RB1. que codifica una protena, la RB, implicada en el ciclo ce
lular y en la regulacin de la transcripcin. En la mayora de los casos, estos dos ev
entos mutacionales tienen lugar a nivel somtico y se
Anlisis de laboratorio de mutaciones del cncer familiar
La capacidad de analizar el ADN constitucional de un individuo para mutaciones h
ereditarias predisponentes al cncer tiene un enorme poten-

C A P T U L O 66

D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I
C A S
1385
cial en la prevencin de enfermedades y su Iralamiento precoz: ya se ha convertido
en el estndar de cuidados de algunos trastornos. Si se conoce una proporcin alta
de mutaciones cancergenas en un determinado gen y estas mutaciones son relativame
nte pocas, su anlisis directo es sencillo y barato. De otro modo, si el gen es gr
ande, si las mutaciones cancergenas son numerosas y estn ampliamente dispersadas o
se producen en regiones del gen menos accesibles como intrones o secuencias reg
uladoras, los anlisis de mutacin deben estar menos dirigidos y ser capaces de expl
orar grandes extensiones de ADN en busca de anomalas. En estos casos, se pueden u
tilizar tcnicas como el anlisis SSCP. DGGE. el anlisis de heteroduplex o la secuenciacin directa de ADN. Los anlisis de truncacin de protenas (Pow
ell. 1993) pueden ser tiles si un alto porcentaje de las mutaciones producen un p
roducto protenico reducido. Estos mtodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos
. Sin embargo, una vez que se identifica la mutacin en un sujeto afectado, el anli
sis posterior de otros miembros de la familia es relativamente sencillo, ya que
puede dirigirse especificamente a esa anomala. En la Figura 66-9 se ilustran vari
os mtodos de anlisis de mutaciones en el oncogn RETque origina la MEN 2A. Debido a
que aproximadamente el 95% de familias con MEN 2A presentan una mutacin en uno de
los cinco codones de la zona extracelular de RET. el anlisis de
Tabla 66-3 Trastorno
Cnceres familiares* Tumores asociados Gen APC PTCH BRCA1 BRCA2 PTEN p53 CHK2 CDHI
CDKN2 MEN1 Localizacin cromosomica 5q21 9q22 17q?1 13q12 10q23 17p13 22 I6q22 9p
21 11q13 Tumor genico APC PTCH BRCAt BRCA2 PTEN p53 CHK2 Cadherina 1 p16 Mon na
Genes supresores de tumores Poliposis adenomatosa familiar Sindrome basal-celula
r nevoide (de Gorlin) Cncer de marna familiar 1 Cncer de marna familiar 2 Sindrome
de Cowden Sindrome de Li-Fraumeni
(aulosmicos dominantes) Carcinoma colorrectal. duodenal Carcinoma basal-celular,
meduloblastoma Carcinoma de mama, ovrico Carcinoma de mama, de pncreas Carcinoma d
e mama, de tiroides Sarcomas, carcinoma de mama, leucemia, tumores cerebrales Ca
rcinoma gstrico Melanoma Tumores de clulas de los islotes pancreticos, hipotisarios
, paraliroideos Osteocondromas/sarcomas Neurofibroma/sarcoma, feocromocitoma Neu
roma acstico, meningioma Tumores gastrointestinales Retinoblastoma, osteosarcoma
Hemangioblastoma, carcinoma renal, feocromocitoma Tumor de Wilms
Cncer gstrico familiar Melanoma lamiliar Neoplasia endocrina mltiple tipo 1 ( M E N
1) Exostosis multiples Neurofibromatosis tipo 1 Neurofibromatosis tipo 2 Sndrome
do Peutz-Jeghers Retinoblastoma Enfermedad de Von Hippel-Lindau
EXT1 EXT2 NF1 NF2 STK11 RB1 VHL WT1
8q24 11p12-p11 17q11 22q12 !9p13 13q14 3p25 11p13
EXT1 EXT2 Neurofibromna Merlina STK11 pRB VHL W11
Tumor de Wilms Oncogenes (autosomicos dominantes) Melanoma familiar Melanoma Neo
plasia endocrina mltiple Carcinoma medular de tiroides, tipo 2 ( M E N 2) feocrom
ocitoma. hiperplasia paratiroidea/adenoma Carcinoma renal papilar Carcinoma rena

l papilar hereditario de crecimiento Genes reparadores de ADN (aulosmicos Cncer de

colon hereditario sin poliposis ( H N P C C ) dominantes) Carcinoma colorrectal
. endometrial
CDK4 RET MET
I2q13 I0q12
CDK4 RET Receptor del factor del hepatocito
7q31
MSH2 MLH1 PMS1 PMS2 MSH6
2p16 3p21 2q32 7p22 2p16
MSH2 MLHI PMS1 PMS2 MSH6
Genes reparadores de Ataxia telangiectasia Sndrome de Bloom Anemia de Fanconi
ADN
(aulosmicos
recesivos) Linfomas otros Varios Leucemia mielgena aguda
Xeroderma pigmentoso
Carcinomas de piel de clula basal y de clula escamosa
ATM BLM FANCA FANCC FANCD FANCE FANCF XPA-XPE
11q22 15p26 16q24 9q22 3p26-p22 6p22-p21 I1p15 Varios
ATM BLM FANCA FANCC FANCD FANCE FANCF Varios
' Para una luente de informacin concisa, especialmente til, acerca de los sndromes
del cncer lamillar, vase Lmdor. 1998 Esta disponible una informacin mas amplia en l
a pagina web Online Mendelian Innerilance m Man (OIM). http //www3 neb nlm nih go
v/Omim/searchomim.html

1386
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
mutacin del ADN es muy eficaz en la identificacin presintomtica de portadores del g
en de MEN 2A (Lips, 1994). La situacin es ms compleja con los genes supresores de
tumores y de reparacin del ADN. Las mutaciones patolgicas en estos genes son numer
osas y extendidas, a veces exclusivas de una determinada familia, y suelen neces
itar una bsqueda costosa de mltiples secuencias de ADN hasta encontrar la mutacin.
Desafortunadamente, incluso despus de una bsqueda exhaustiva de secuencias codific
antes y tambin algunas regiones no codificantes, hasta la fecha slo se consigue un
a tasa de deteccin de mutaciones del 90% en el retinoblastoma familiar, siendo ba
stante ms baja en otros trastornos. Una complicacin adicional del anlisis de mutaci
ones de genes predisponentes al cncer est relacionada con el significado funcional
de algunas mutaciones. Mientras que las mutaciones de truncacin de protenas en ge
nes supresores de tumores normalmente son significativas, las mutaciones sustitu
tivas. que producen la suslitucin de un solo aminocido, pueden
ser completamente benignas. En muchos casos, son imposibles o impracticables est
udios funcionales de supuestas mutaciones cancergenas, y el significado potencial
de la mutacin slo puede evaluarse mediante grandes estudios clnicos de poblacin rea
lizados durante largos perodos de tiempo. Por ltimo, el anlisis del riesgo de cncer
slo es til si los resultados pueden afectar de forma positiva al Iratamiento clnico
. En el caso de la MEN 2, el anlisis de mutacin en RET es bastante eficaz en la id
entificacin de sujetos con riesgo y, si la prueba es positiva, el tratamiento rec
omendado (tiroidectoma profilctica, seguimiento clnico durante toda la vida para el
leocromocitoma y la hiperplasia/adenoma de paratroides) puede salvar la vida y t
ener poco riesgo asociado o morbilidad. La colonoscopia peridica y la extirpacin d
e plipos son efectivas en la prevencin del cncer colorrectal en sujetos con mutacio
nes positivas para el cncer de colon hereditario sin poliposis. Por el contrario,
hasta la fecha existen pocas opciones atractivas, o ninguna, para prevenir el d
esarrollo de cncer en otros sndromes predisponentes como el sndrome de Li-Fraumeni
o el cncer de m a m a familiar.
Figura 66-9. Anlisis de mutacin del protooncogn RE de la neoplasia endocrina mltiple
tipo 2 A (MEN 2A). A. U n sujeto control (WT/WT) e individuos afectados de tres
familias diferentes se examinaron, mediante secuenciacin directa, para mutaciones
en el exn 11 del gen RET. En estos individuos se detectaron diferentes mutacione
s sustitutivas heterocigotas en el codn 634, cambiando, respectivamente, la cisten
a normal por tirosina (C634Y), glicina (C634G) y fenilalanina (C634F). S. Explor
acin de m u t a c i o n e s del exn 1 1 mediante anlisis de polimorfismo conformaci
onal de ADN monocatenario (SSCP). La nica banda observada en la m u e s t r a del
paciente indica un alelo mutado. Posteriormente, se identific p o r secuenciacin
directa c o m o u n a mutacin en el codn 6 3 4 (TGC->CGC). Est tcnica suele ser una
alternativa til en la exploracin mediante secuenciacin directa. C. Anlisis de mutacin
p o r PCR y digestin con enzimas de restriccin en sujetos d e riesgo (carriles 1
a 8) de u n a familia q u e porta la mutacin C 6 3 4 Y . Esta mutacin (TGC->TAC) c
rea u n a secuencia de reconocimiento para Rsa I en el exn 11. Se gener un product
o de PCR de 279 bp del exn 1 1 que inclua el codn 634 y le digerido con Rsa I. Norma
lmente, est presente una sola secuencia para Rsa I en este producto de PCR, y la
digestin produce fragmentos de 2 4 4 y 35 bp. Cuando est presente la mutacin C634Y,
se producen fragmentos de 169, 75 y 35 bp (carriles 4, 6, 7 y el control positi
vo). La presencia constante de la secuencia normal para Rsa I es una caracterstic
a de control m u y til, ya que su digestin garantiza que el anlisis est funcionando
adecuadamente. Una vez que la mutacin se h a identificado en u n a familia, se fa
cilita su estudio en el resto de m i e m b r o s familiares. (8, Cortesa de Dr. B

rian Dawson, Universidad de T e x a s Southwesterm Medical Center, Dallas, TX.)

CAPTULO 66

DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

1387

Hemocromatosis
La hemocromatosis hereditaria (HH), reconocida desde el inicio por su manifestac
in clnica completa con la triada cirrosis, diabetes mellitus y piel bronceada, se
pens era un trastorno poco usual de sobrecarga de hierro que afectaba a 1 de cada
5.000 caucsicos. Sin embargo, cuando estudios genticos ligaron el gen causante de
la enfermedad al locus HLA del cromosoma 6 y se utilizaron pruebas bioqumicas de
sobrecarga de hierro (fundamentalmente saturacin de la transferrina), se reconoc
i que era bastante comn la predisposicin gentica subyacente a la sobrecarga de hierr
o. En efecto, la HH actualmente se reconoce como un trastorno autosmico recesivo
con una frecuencia de portadores elevada de uno de cada ocho en personas con asc
endencia del norte de Europa, siendo el trastorno gentico ms frecuente en la pobla
cin caucsica norteamericana. L a incidencia de homocigotos con riesgo es de 1 de c
ada 250, aunque slo una fraccin de ellos acumula suficiente hierro en exceso para
ocasionar el dao histico asociado con el trastorno clsico. El conocimiento de la h
emocromatosis hereditaria entr en una nueva era con la identificacin del gen HFE (
denominado inicialmente HLA-H) dentro del locus del complejo mayor de histocompa
tibilidad en el cromosoma 6 (Feder. 1996). La protena HFE. aunque es una molcula s
imilar a la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad. no se une ni pres
enta pptdos endgenos, y no parece tener ninguna funcin inmunolgica. Es decir, se acum
ulan evidencias de que la protena HFE mteracta con el receptor de la transferrina
y modula la absorcin entrica del hierro de la dieta (Waheed. 1999). Mutaciones en
el gen HFE afectan a esta funcin reguladora, originando una absorcin aumentada de
hierro y su almacenamiento en los tejidos. Una sola mutacin sustitutiva en el gen
HFE. la C282Y. que produce un cambio de lirosma en lugar de cisteina en el amin
ocido 282 de la proteina HFE. est presenta en estado homocigoto en el 80% al 90% d
e caucsicos con hemocromatosis. Un pequeo porcentaje de pacientes con hemocromatos
is son heterocigotos compuestos, portando un cromosoma con una mutacin C282Y y ot
ro con una mutacin H63D. La mutacin H63D es un polimorfismo comn, con una frecuenci
a de portadores del 20%; el nmero de heterocigotos compuestos afectados con hemoc
romatosis todava sugiere que el genotipo H63D contribuye a la sobrecarga de hierr
o. Aunque los homocigotos C282Y claramente presentan un riego elevado de desarro
llar hemocromatosis. est menos claro el riesgo para personas con otros genotipos.
Brandhagen combin los resultados de vanos estudios para estimar las odds ratos (
OR) ("razones de probabilidad") para el desarrollo de sobrecarga de hierro en lo
s genotipos siguientes comparados con el homocigoto "tipo salvaje": homocigoto C
282. OR = 2.300; heterocigoto compuesto C282/H63D, OR = 49,4; homocigoto H63D, O
R = 6,3: heterocigoto C282Y, OR = 3,1; heterocigoto H63D, OR = 1 . 6 (Brandhagen
, 1999), Las mutaciones C282Y y H63D son sustituciones de un solo nuclelido y pue
den analizarse fcilmente mediante una variedad de tcnicas, normalmente inicindose c
on una amplificacin por PCR. El anlisis de mutacin en el gen HFE es ms til para confi
rmar el diagnstico ante una sospecha de hemocromatosis en un sujeto con sobrecarg
a de hierro, y puede eliminar la necesidad de realizar una biopsia heptica, que e
s la tcnica de confirmacin del diagnstico. La flebotoma teraputica es bastante eficaz
, pues reduce los depsitos de hierro en individuos afectados, pudiendo prevenir e
l desarrollo de enfermedad clnica. El anlisis de mutacin tambin es til en la evaluaci
del riesgo en familiares de pacientes positivos para la mutacin. Sin embargo, es
mucho menos efectivo como prueba de cribado, ya que se estima que del 10% al 15
% de individuos que desarrollan hemocromatosis no portan una mutacin conocida en
el gen HFE. Hoy en da, son ms tiles los estudios bioqumicos que calculan la sobrecar
ga de hierro, sobre todo el porcentaje de saturacin de la transferrina (Bacon, 19
99).

requeridos para su traduccin y dos ARN ribosmicos (Hammans, 1994). El ADN mitocond
rial se autorreplica y es transmitido nicamente por herencia materna, ya que la m
itocondria de un espermatozoide no se incorpora al cigoto tras la fertilizacin de
l vulo. Las anomalas patolgicas del ADN mitocondrial pueden producirse por distinto
s mecanismos (Hammans. 1994: Jones. 1999). Grandes deleciones nicas (y menos frec
uentemente duplicaciones) que aparentemente ocurren de forma espordica durante la
oognesis son tpicas del sndrome de Kearns-Sayre, una miopata caracterizada por ofta
lmoplejia progresiva externa y retinopata pigmentaria. Una gran variedad de trast
ornos se caracterizan por pequeas deleciones mltiples y muestran patrones de heren
cia mendelanos autosmicos dominantes o aulosmicos recesivos, ya que aparentemente s
e deben a defectos indeterminados en genes nucleares importantes para la replica
cin del ADN mitocondrial Los trastornos ms caractersticos desde el punto de vista g
entico son los que siguen un patrn estricto de herencia materna, nunca presentan t
ransmisin desde un hombre afectado y pasan de una mujer afectada tanto a sus hijo
s como a sus hijas. Estas enfermedades suelen deberse a mutaciones puntuales en
uno de los genes que codifican un ARN de transferencia (p, ej., epilepsia mioclni
ca y fibras rojas rotas [MERRF] y miopata mitocondrial, encefalopata, acidosis lcti
ca y episodios similares a ictus [MELAS]) o una protena mitocondrial (p. ej neurop
ata ptica hereditaria de Leber). Adems de las encefalomiopatas hereditarias, se cree
que acumulaciones de mutaciones mitocondriales somticas, especficas de tejido, pu
eden contribuir al desarrollo de muchos trastornos degenerativos comunes de inic
io tardo y quiz al mismo envejecimiento (Jones. 1999). La confirmacin de laboratori
o de las grandes deleciones del ADN mitocondnal presentes en el sndrome de KeamsSayre se consigue fcilmente mediante anlisis de transferencia Southern de ADN mito
condrial del tejido afectado, usando ADN mitocondrial completo marcado como sond
a. Las mutaciones puntuales de otros trastornos se pueden analizar mediante otra
s tcnicas.
FUTURO DEL DIAGNSTICO MOLECULAR
De los ejemplos citados en este captulo, que representan algunos de los muchos tr
astornos hereditarios para los cuales se dispone de una prueba de ADN, es eviden
te que el diagnstico molecular de la enfermedad gentica es una de las aplicaciones
ms apasionantes de la patologa molecular, repercutiendo en las dems debido el hech
o de que casi todas las enfermedades presentan algn componente gentico. Se puede a
nticipar que la gentica molecular diagnstica asumir un papel ms predominante en la s
anidad pblica y la medicina preventiva de lo que ha sido hasta el momento, debido
a que el Proyecto Genoma Humano sigue descubriendo importantes genes patolgicos
(sobre todo los de trastornos ms frecuentes) a una velocidad cada vez mayor, a la
tecnologa de secuenciacin rpida del ADN y a que la deleccin multiplex de mutaciones
contina mejorando. La llegada d e los "chips" de ADN que contienen miles de sond
as algn dia podrn permitir el genotipado amplio y la prediccin de enfermedades dura
nte el transcurso de la vida para cientos de trastornos a partir de una sola got
a de sangre (vase Cap. 61). Frente a estos prometedores avances, habr que sopesar
el impacto tico de tal "invasin" gentica y el posible potencial curativo de la tera
pia de sustitucin gnica. De estas inquietudes, ha surgido la opinin generalizada de
que los resultados de las pruebas de gentica molecular son diferentes (principal
mente debido a su poder predictivo) al resto de las informaciones mdicas y deben
someterse a polticas ms rigurosas que protejan la privacidad, la confidencialidad,
el consentimiento informado y la proteccin frente a la discriminacin. Otros creen
que los resultados de estas pruebas, aunque de gran alcance, no necesitan ms car
ga emocional que otros estudios clnicos realizados en la medicina y patologa del l
aboratorio Sin embargo, muchos estados y pases estn buscando soluciones reguladora
s al darse cuenta de sus posibilidades de abuso; en Estados Unidos, estn pendient
es o ya aprobadas una variedad de iniciativas legislativas cuyo objetivo es salv
aguardar la informacin gentica y la privacidad. Cualquiera que sea el acuerdo fina
l alcanzado, no hay duda de que la gentica molecular ser quien conduzca la prctica
mdica del siglo XXI, y prcticamente todo paciente, sano o enfermo, notar su impacto
,
Trastornos del ADN mitocondrial

Adems de los 6 billones de bp del ADN que constituyen el genoma diploide nuclear
en humanos, tambin se codifica inlormacin gentica vital en molculas de ADN mitocondr
ial. Estas molculas de ADN bicatenario circular de 16.500 bp estn presentes en 2 a
10 copias en cada una de las centenares de mitocondrias celulares. El ADN mitoc
ondrial codifica 13 protenas de la cadena respiratoria y la adenosinatrilosfato-s
intasa, 22 ARN de transferencia

1388
SECCIN
VII

P A I O I O G A MOLECULAR
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CAPTULO 66

DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

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C A P T U L O
67
Pruebas de paternidad: empleo del ADN, polimorfismo y otros marcadores genticos
Herbert F. Polesky, M.D.
EXCLUSIN DE LA PATERNIDAD Poder de exclusin Probabilidad de exclusin acumulativa EL
ECCIN DE UN SISTEMA GENTICO PARA USO EN LAS PRUEBAS DE PATERNIDAD SISTEMAS CLSICOS
Sistemas de antgenos eritrocitarios Sistemas de protenas sricas Enzimas eritrocitar
ias Antgeno leucocitario humano POLIMORFISMOS DEL ADN Pruebas de polimorfismos de
la longitud de los fragmentos de restriccin Reaccin en cadena de la polimerasa 13
94 1391 1392 1390 OTROS TIPOS DE PRUEBAS INCLUSIN DE LA PATERNIDAD Clculo del ndice
de paternidad Probabilidad de paternidad Estimacin de la paternidad con un padre
ausente Reconstruccin de familias DOCUMENTACIN E INFORMACIN DE LOS RESULTADOS CONC
LUSIN BIBLIOGRAFA 1398 1398 1401 1397 1397
En casos de paternidad dudosa "el laboratorio utilizar un grupo de pruebas... que
incluye mltiples sistemas genticos independientes. Este grupo de pruebas proporci
onar, salvo raras excepciones, un supuesto padre no excluido con un ndice de pater
nidad de al menos 99" (Standards lor Parentage Testing Laboratories, 1999). En e
l libro de Reyes (3:16-27), aparece una referenda de paternidad discutida citada
con frecuencia, en la cual Salomn toma una decisin sobre la maternidad de un nio,
amenazando con usar su espada para ofrecer un trozo del nio a cada demandante. Cu
ando la paternidad est en discusin, el arbitro de la verdad se suele encontrar ant
e un dilema similar al que se enfrent Salomn: falta de testigos del suceso y la pr
obabilidad de que los protagonistas puedan no saber o decir la verdad. El descub
rimiento del grupo sanguneo ABO por Landsteiner (1900) y el reconocimiento de que
estas caractersticas medibles seguan las leyes genticas descritas por Gregor Mende
l proporcionaron una prueba objetiva de laboratorio que poda usarse para apoyar a
los tribunales cuando deben decidir si una persona ha sido falsamente acusada d
e paternidad. En Estados Unidos, las leyes sobre el uso de marcadores genticos pa
ra demostrar la no paternidad fueron promulgadas en 1935 (Schatkin. 1952). En aos
posteriores aumentaron bastante los conocimientos acerca de sistemas tiles de ma
rcadores genticos. En 1976. pautas conjuntas desarrolladas por una comisin de la A
merican Medical Association-American Bar Association (AMA-ABA) recomendaron siet
e sistemas para las investigaciones de grupos sanguneos en caso de paternidad dis
cutida (ABO, Rh. MNS. Kell, Duffy, Kidd y HLA) (Male, 1976). Tambin se reconociero
n como tiles otros sistemas genticos tales como las protenas polimrficas del suero y
las enzimas de los glbulos rojos. Se recomend el uso de estimaciones matemticas de
la paternidad en los casos en los que no se observase exclusin. En 1983, como un
a continuacin del informe de la AMA-ABA y de la conferencia internacional (Airlie
, 1982) sobre Inclusion Probabilities in Parentage Testing, la comisin sobre prue
bas de paternidad de la American Association
ol Blood Banks (AABB) public Guidelmes lor Reporting Estimates ot Probability ol
Paternity (Walker, 1983). que aconsejaba sistemas mltiples de anlisis (a elegir po
r el experto) para proporcionar pruebas de no paternidad con un 95% de probabili
dad, cuando se analiza a un hombre al que se le ha acusado en falso, La Tabla 67
-1 es un resumen de los sistemas usados en 1988. Cuando estas guas se desarrollar
on, no se apreci la importancia en las pruebas sistemticas de paternidad de los po
limorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) del acido desox
irribonucleico (ADN), descritos en 1980 (Botstem. 1980). Sin embargo, cuando se
public en 1990 la primera edicin de los Standards lor Parentage Testing Laboratori
es, se incluyeron las peticiones especificas de pruebas de RFLP junto con los qu
e actualmente suelen denominarse sistemas clsicos (antgenos de superficie de glbulo
s roios, antigenos leucocitarios humanos, enzimas eritrocitarias y marcadores ge
nticos de protenas sricas). Este documento fue la base para la creacin de un program
a de inspeccin y acreditacin que inclua datos concretos acerca de la identificacin d
e los sujetos analizados, los mtodos de anlisis, los clculos y el informe. En 1999
se public la cuarta edicin de estas normas.

EXCLUSIN DE LA PATERNIDAD
El objetivo lundamental de los anlisis de marcadores genticos en casos de paternid
ad discutida es identificar al padre biolgico de un determinado nio. Aunque esto n
o puede realizarse con absoluta certeza, los anlisis de marcadores genticos pueden
proporcionar pruebas objetivas de no paternidad. Mediante el uso de mltiples sis
temas genticos, es posible excluir a la mayora (> 99%). pero no a todos los que no
son padres. En sistemas que siguen las leyes de la gentica mendeliana, las exclu
siones se identifican mediante el hallazgo de excepciones al patrn hereditario es
perado. Cuando se cuestiona la paternidad, la interpretacin de los resul-

CAPTULO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

1391
Tabla 67-1
Informe de los s i s t e m a s utilizados p o r los laboratorios d e p r u e b a
s d e paternidad: 250.000 casos a p r o x i m a d a m e n t e * Marcadores genti
cos Anlgenos erilrocitarios H LA serolgico Enzimas erilrocilarias Protenas sricas AD
N RFLP PCR .,
en el padre en cuestin. El hallazgo de exclusin indirecta al menos en dos sistemas
independientes suele ser una prueba suficiente para llegar a una conclusin de no
paternidad.
Poder de exclusin
2-3 2-3 <1 <1 94 44 54 Antes del anlisis es posible proporcionar una estimacin de
la posibilidad media de que el anlisis demuestre no paternidad si el acusado n o
es el padre. Para cada sistema gentico se puede calcular un poder de exclusin medi
o (A) basado en las frecuencias gnicas (p,g) de los alelos en el sistema. En 1930
, Wiener inform de una ecuacin general para un sistema de dos alelos: A - pq(j-pq)
. Se requieren frmulas ms compleas cuando el sistema presenta mltiples alelos (Walke
r, 1978). La ecuacin general tambin se ha adaptado (Brenner, 1990) para determinar
A en sistemas que no presentan alelos diferenciados, como los sistemas de RFLP
de ADN, del siguiente modo: A = h (1-rW)
2
T a s a de exclusin global. 28.3%. Porcenlaie de casos analizados por el mtodo Dato
s procedentes de American Association ol Blood Banks. Bethesda. MD. 1998.
(67-1)
tados de la prueba depende normalmente de que se asuma que la muestra definida c
omo materna procede de la madre biolgica del nio. Deben compararse los fenotipos d
el nio y de la madre para determinar si los resultados son coherentes con los pat
rones hereditarios esperados. Un alelo presente en el nio pero no en la madre se
denomina "gen obligatorio paterno" (OG). Si tanto el alelo del nio como el de la
madre son idnticos, existen posibilidades alternas (dos) para el gen paterno. Si
el hombre analizado no presenta la posibilidad de transmisin del OG y el marcador
para el gen est ausente en la supuesta madre, la exclusin observada se denomina "
directa" (Tabla 67-2). Este tipo de exclusin en uno de los sistemas clsicos, norma
lmente es suliciente para concluir que el hombre analizado no es el padre biolgic
o del nio en cuestin. En los sistemas de ADN. debido a que la frecuencia de mutacin
es bastante superior a la observada en los sistemas clsicos, la exclusin de un so
lo locus no se considera prueba suficiente para establecer la no paternidad {Sla
ndards. 1999). Tambin hay una exclusin directa cuando el nio o el hombre analizados
son heterocigotos y los dos marcadores identificados estn ausentes en la otra pe
rsona. Este tipo de exclusin directa a veces se denomina "exclusin de dos haplotip
os". En los casos en los que slo estn disponibles para el anlisis el nio y un supues
to padre, es posible establecer la no paternidad si el individuo estudiado o el
nio tienen dos haplotipos. ninguno de los cuales est en el otro. La ausencia de un
marcador gentico esperado en el nio cuando el padre en cuestin parece ser homocigo
to para el gen se denomina "exclusin indirecta", tambin denominada a veces como ho
mocigosidad inversa. Una exclusin indirecta no es prueba suficiente para concluir
que el sujeto analizado no es el padre. La interpretacin de la homocigosidad inv
ersa como una exclusin indirecta supone que los sujetos analizados presentan los

dos alelos del locus idnticos. Este resultado puede representar la presencia de u
na mutacin en uno de los individuos analizados o es posible que est presente un in
usual alelo nulo (nuil) (u otro alelo no detectado) tanto en el nio como
donde H es el porcentaje de homocigosidad y h el porcentaje de helerocigosidad o
bservados del locus. En la Tabla 67-3 se muestran valores de A para sistemas sel
eccionados Un sistema altamente polimrfico tiene un poder de exclusin mayor que un
sistema con slo algunos alelos o que presente uno o dos alelos frecuentes y nume
rosos alelos poco frecuentes.
Probabilidad de exclusin acumulativa
Cuando el anlisis incluye varios sistemas genticos independientes, se puede calcul
ar la probabilidad de exclusin acumulativa (CPE) usando la frmula siguiente: CPE =
1-(1-P1) (1-P2) (1-P3)... (1-P/7) (67-2)
donde P es el A para cada sistema usado. Tal como se muestra en la Figura 67-1.
como cada vez se usan ms sistemas, con cada prueba adicional se excluye a algn ind
ividuo ms. Con una batera de sistemas de marcadores de ADN apropiadamente seleccio
nada, es posible conseguir fcilmente u n a CPE igual o superior a 0,995.
ELECCIN DE UN SISTEMA GENTICO PARA USO EN LAS PRUEBAS DE PATERNIDAD
El modelo de sistema gentico para las pruebas de paternidad seria aqul en el que s
e puede encontrar un nico marcador tanto en el nio como en el supuesto padre. Actu
almente, salvo la secuenciacin gmca, ninguno de los sistemas de marcadores proporc
iona hallazgos tan especficos. Por tanto, se usan mltiples sistemas genticos que ren
en ciertos criterios para las prueTabla 67-2
Exclusin d e p a t e r n i d a d : fenotipo (genotipo) Hijo AB(ab) 3.25:4.76 11.1
2 A(aa, a"x") 3,25:4,76 11 (11.11 u 11,"x") 7.8 Jk(a+b-)[aa o a"x") 3,25 (3.25:3
,25 o 3.25:"x" 11 (11,11 u 11, "x") 11 (11.11 u 11, "x") R2r (cDE/ce) Madre A(aa
. ah) 3.25 5,31 8(8,8 o 8,"x") A(aa. a"x") 3,25.4,76 11.12 no disponible Jk(a+b+
)(ab] 4.76 (4.76:4.76 0 4.76:"x") 11,12 no disponible R2 (cDE/cE) Hombre analiza
do O(hh) 3,25:5.66 12,14 BR 4,95:5.66 8.9 11.12 Jk(a-b+)|bb o b"x") 3.25:5.66 12
(12.12 0 12, V) 12(12,12 0 12,"x") R1R2(CDe/cDE) o Rzr (CDE/ce)OG b 4.76* 11 (ma
terno) a o V 3,25 o 4.76 11 o "x" 7u8 a o "x" 3.25 o "x" (materno) t 1 0 "x" 11
0 " X " r(ce) o Ro (cDe)
Tipo de exclusin Directa
Dos haplotipos
Indirecta
Probable
'Supone que la secuencia de restriccin es un alelo diterenciado La Irecuencia de R
z (CDE) esta entre 0.02 y 0.004. OG gen obligatorio paterno

1392
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Tabla 67-3 Poder de exclusl (A): sistemas de p r u e b a s seleccionados* Sistema
ABO RH ACP D2S44 D7S467 D10S28 HUMvWA D7S820 DI3S317 "Los valores varan en pobla
ciones diferentes. A 0.166 0.283 0.239 0,95 0.93 0,96 0.65 0,523 0,417
SISTEMAS CLSICOS Sistemas de antgenos eritrocitarios
Los seis grupos sanguneos (ABO, Rh. MNS. Kell, Duffy y Kidd) han sido utilizados
en las pruebas de paternidad. Las tcnicas de tipado utilizadas son las que se rea
lizan de forma sistemtica en los laboratorios de inmunohematologia que incluyen l
as pruebas en tubo y en placas microtiler. Las normas de la AABB requieren que e
stas pruebas se hagan por duplicado, de forma independiente y con distintos reac
tivos. Cuando se utilizan reactivos de antiglobulina, deben realizarse pruebas p
ara demostrar que las clulas no son reactivas. Slo es necesaria una prueba especfic
a de antiglobulina directa cuando todas las pruebas que utilizan antiglobulina s
on reactivas. Siempre que sea posible, debe hacerse un control de calidad de los
reactivos de tipado, usando clulas control heterocigticas para demostrar la react
ividad y especificidad del mtodo utilizado. Tradicionalmente. el grupo sanguneo AB
O ha sido un estndar en los casos de paternidad discutida. Cuando se realiza el t
ipado de clulas y del suero, normalmente los resultados de las pruebas son inequvo
cos. Se debe tener cuidado cuando se utilizan reactivos monoclonales y los resul
tados no son los esperados (Stroup, 1990). Para la interpretacin de la paternidad
basada en pruebas serolgicas, hay que tener en cuenta que slo se puede deducir un
probable genotipo a partir del fenotipo observado, a no ser que el hombre anali
zado sea O (OO.hh), AB o si la supuesta madre es A o B y el hijo es O. Cuando la
s clulas lipan como A o AB, el subtipado, si se realiza, debe interpretarse c o n
precaucin. En una variante poco frecuente, el fenotipo Bombay, existe un fallo e
n la expresin del antgeno esperado A o B: sin embargo, el suero de estos individuo
s contiene anti-H, lo cual sera detectado fcilmente utilizando clulas del grupo O p
ara la determinacin inversa de grupo. Otro raro fenotipo informado es el cis AB,
en el que se heredan A y B como un solo alelo AB (Salmn, 1984). El sistema Rh es
uno de los sistemas de antgenos eritrocitarios ms informativos. Mediante las prueb
as habituales con anti-D, -C, -E, -c, -e (en E-positivos) y -Cw (en C-positivos)
, es posible identificar 10 fenotipos comunes y numerosos genotipos probables. L
a secuenciacin gnica de la regin RH del cromosoma 1 indica la presencia de dos gene
s, uno para D y otro para CcEe (Colin, 1991). Cada persona presenta dos haplotip
os, cada uno de los cuales tiene mltiples marcadores reconocidos por los reactivo
s de tipado. Los resultados de la prueba slo pueden sugerir el fenotipo ms probabl
e de una persona. Tambin debe considerarse la raza de la persona que est siendo an
alizada, ya que las frecuencias de haplotipos difieren entre los grupos raciales
. Aparte de los haplotipos ms comunes, se han descrito varios haplotipos poco fre
cuentes con antgenos esperados que se han perdido o suprimido (Tippett, 1987). La
aparicin de uno de estos haplotipos en un tro puede originar una aparente exclusin
materna o una exclusin indirecta del padre biolgico. Algunos anticuerpos anti-Rh
reconocen antigenos compuestos (p. ej.. los antiC suelen contener anti-Ce [rhi]
y no reaccionan con clulas que contienen el haplotipo CDE [Rz]). Cuando se encuen
tran hallazgos inusuales en el tipado de Rh, es importante usar antisueros y mtod
os diferentes, junto con el estudio de otros miembros familiares. Con et sistema
MNS es ms probable la identificacin de padres falsos que con cualquier otro siste
ma de antigenos eritrocitarios. Es importante ser cauto cuando se interpretan lo
s resultados de la prueba, a la hora de asignar un genotipo a partir de un fenot
ipo observado. En sujetos de raza negra, un alelo observado frecuentemente, el S
", puede ser mal interpretado como ausencia de un producto gnico esperado. Las pe
rsonas que parecen ser homocigticas para Sos pueden ser realmente SS o sS". Este

hallazgo puede producirse con M y N, pudindose lipar algunas personas como S nega
tivo, s negativo. Normalmente, estas personas tambin son U negativo (Holliman, 19
89). Otros alelos poco frecuentes, como M- y M', pueden dar resultados que parec
en excluir la paternidad, cuando, de hecho, su existencia en un padre y un nio ca
si demuestran la paternidad.
U
bas de paternidad. Lo ideal es que el sistema presente mltiples alelos distribuid
os en la poblacin, de modo que tenga un elevado poder de exclusin y el fenotipo me
nos usual presente una frecuencia que puede determinarse con fiabilidad. Todos l
os marcadores del sistema deben expresarse como codominantes (sin alelos nulos),
deben conocerse las frecuencias de mutacin y stas deben ser bajas; los fenotipos
deben ser estables en condiciones habituales de almacenamiento. Los mtodos para l
a deteccin de marcadores deben ser fiables, reproducibles y factibles para la gra
n mayora de laboratorios. Debe conocerse la gentica del sistema y a continuacin est
ablecerse los patrones hereditarios (leyes mendelianas). El sistema debe ser ind
ependiente de otros marcadores analizados habitualmente. Si el sistema se crea p
ara calcular estimaciones de paternidad, deben establecerse las frecuencias gncas
en varias poblaciones. La mayora de los sistemas clsicos descritos anteriormente p
resentan uno o ms problemas que deben considerarse antes de su inclusin en la bate
ra de pruebas. Es comn a estos sistemas el problema de los alelos nulos o variante
s cuantitativas que dificultan la interpretacin cuando existe homocigosidad inver
sa. En algunos sistemas, las variantes se detectan por un mtodo o grupo de reacti
vos pero no por otro. Puede haber una variacin biolgica en la estabilidad de vario
s marcadores durante el transporte o almacenamiento. En algunos sistemas en los
que se requiere el uso de anticuerpos, la variacin en los reactivos puede crear p
roblemas a menos que se utilicen procedimientos de control de calidad apropiados
. Algunos marcadores no se expresan completamente hasta una cierta edad, poniend
o limitaciones en el uso de los sistemas seleccionados. En los sistemas de ADN,
la mutacin o recombinacin es ms frecuente que en los sistemas clsicos, lo cual debe
tenerse en cuenta en la interpretacin de los resultados. La terapia mdica, como la
transfusin o el trasplante de clulas madre progenitoras (stem cell). puede dar co
mo resultado la deteccin de caractersticas del donante en vez de marcadores heredi
tarios del sujeto analizado.
Figura 67-1. Poder de exclusin acumulativo.
por cada prueba adicional se vuelve cada vez
global de las seis pruebas es del 95,3%. Si
A = 0,5, slo se excluira un 2,4% adicional
35).

El porcentaje de la poblacin excluido

ms pequeo. La probabilidad de exclusin
s e realizase una sptima prueba con
de la poblacin ([1 - 0.953] x 0,5 = 0,02

Los reactivos para tipar los antigenos de los sistemas Kell, Duffy y Kidd suelen
requerir antiglobulina para su deteccin. Cuando una muestra se analiza como hete
rocigtica para todos estos marcadores (Kk, Fy(a+b+) y JK(a+b+)j, es esencial dete
rminar que la muestra es negativa en u n a prueba directa de antiglobulina. Todo
s estos sistemas presentan alelos nulos; son poco frecuentes en Kell y Kidd y mu
y frecuentes en Duffy. En sujetos de raza negra, el fenotipo ms comn es Fy(a-b-) (
68%), y el gen FY tiene una fre-

CAPITUIO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL ADN, POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

1393
cuencia de 0,80. Es frecuente la homocigosidad inversa; tambin es comn la aparente
exclusin materna o una nica exclusin indirecta de paternidad. En la mayora de los e
studios, raramente se encuentra el gen FY en sujetos blancos (Martin, 1983). Tam
bin se han utilizado para la determinacin de paternidad otros sistemas de grupos s
anguneos como P , Lutheran. Lewis. Xg y pruebas para algunos de los antgenos de gr
upos sanguneos con alta y baja frecuencia. La posibilidad de obtener informacin til
a partir de estos marcadores es limitada.
obtienen y almacenan de un modo apropiado. Las clulas recogidas en tubos con flor
uro no son tiles para el fenotipado de enzimas. Antes de la prueba, se prepara un
hemolizado lavando los glbulos rojos con una solucin salina isotnica y diluyendo l
a mueslra (1:1) con agua destilada. La fosfatasa acida de los glbulos rojos (ACP1
), tambin denominada EAP, presenta tres alelos comunes (A, B y C) y algunas varia
ntes poco frecuentes (Miller. 1988). El tipado requiere la observacin tanto de la
posicin de las bandas como de su intensidad de tincin. L a fosfoglucomutasa (PGM1
) es una enzima polimrfica de los eritrocitos que presenta ms de 30 variantes (Dyk
es. 1984.1985). La prueba de IEF identifica cuatro alelos comunes (1Ao 1+ y 1B o
1-, 2Ao 2+ y 2B o 2-) y diez lenctipos. El fenotipado se determina haciendo rea
ccionar el gel con un sustrato que contiene glucosa-1-fosfato, glucosa-1 -6-dfosf
ato, mcotinamida-adenmadinucletido-fosfato (NADP) aceptor de hidrgeno, un preparad
o aceptordonador de electrones (monotetrazolio [MTT]. glucosa-6-fosfato deshidro
genasa) y un colorante (azul medola). Se ha informado de recombmacin en el locus
de la PGM1 (Wetterling, 1990), aunque es m u y poco frecuente. El locus de la PG
M1 se encuentra en el cromosoma 1; se han identificado otros dos subsistemas de
PGM, el PGM2 y el PGM3. controlados respectivamente por genes situados en los cr
omosomas 4 y 6. Estos dos subsistemas son muy poco polimrficos. Otras enzimas eri
trocitarias utilizadas en la prueba de paternidad son la esterasa D (ESD) que pr
esenta dos alelos frecuentes [ESD't. ESD'2). codificados por genes situados en e
l cromosoma 13; la glioxalasa 1 (GL01) con dos alelos comunes {GLOfl GL0t'2) cod
ificados por genes del cromosom a 6 cercanos al MHC, pero independientes; la glu
tamato-piruvato transaminasa (GPT), una enzima lbil que requiere el mantenimiento
fresco de las muestras, y la glucosa-6-foslato deshidrogenasa (G6PD), de utilid
ad limitada por encontrarse ligada al sexo. La ademlato-cinasa (AK), la adenosma
-desaminasa (ADA) y la 6-foslogluconato deshidrogenasa (6PGD) son sistemas de en
zimas eritrocitarias que se utilizan en los laboratorios forenses. Existen mtodos
para la deteccin simultnea de estos marcadores independientes (Brinkmann. 1971).
Estos sistemas no son demasiado tiles para la prueba de paternidad, ya que la may
ora de las poblaciones presentan un alelo de alta frecuencia {AK'1 = 0.96-0.99; A
DA'1 = 0.96-0,98: 6PGD'A = 0,97).
Sistemas de protenas sricas
Se emplean numerosos sistemas de polimorfismo gentico de las protenas sricas en la
determinacin de la paternidad. En la mayora de estos sistemas, el tipado de los pr
oductos allicos se realiza mediante separacin electrofortica de las bandas proteini
cas. que se detectan por tincin, inmunofijacin o reaccionando con un sustrato espe
cfico. Cuando se encuentran variantes poco frecuentes, deben compararse con contr
oles especficos o verificarse en un laboratorio independiente. En algunos sistema
s se puede requerir la identificacin de alotipos comunes mediante isoelectroenfoq
ue (IEF) y tcnicas convencionales. L a haptoglobma (HP), una ,-globulina que lija
hemoglobina libre, fue la primera proteina descrita como polimdica. basndose en su
separacin electrofortica en gel de almidn (Smithies. 1955). El sistema del compone
nte especifico de grupo (GC) es uno de los sistemas de marcadores protencos ms info

rmativos, excluyendo ms del 30% de hombres acusados en falso. Se puede realizar l

a separacin de los tres alotipos comunes 1s, 1f y 2. por isoelectroenfoque (Dykes
. 1984) o usando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Existen numerosas v
ariantes muy raras que se han identificado como marcadores en poblaciones especfi
cas. Estas variantes no se distinguen de los alelos comunes mediante el mtodo de
transferencia en mancha utilizado para detectar los productos de la PCR. El fact
or B properdina (BF), una protena de la cascada del complemento, es fenotipado po
r electroforesis en gel de agarosa (Dykes. 1980). Los genes del BF y los marcado
res del sistema C4 se localizan en el brazo corlo del cromosoma 6, dentro de la
regin que codifica el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Mauff, 1988).
Debido a este ligamiento, las proporciones de probabilidad de los resultados de
la prueba de estos sistemas y el HLA no son independientes y no deben multiplica
rse para calcular el ndice de paternidad (Pl). Las molculas de mmunoglobulinas pre
sentan varios polimorfismos detectados por inhibicin de la hemaglutinacin. Los pol
imorfismos de marcadores gamma (Gm) estn asociados con secuencias especificas de
aminocidos de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina G (IgG). Cada una de las
cuatro subclases de IgG presentan un grupo diferente de marcadores Gm (De Lange.
1988); por tanto, dependiendo del alcance del anlisis, una persona puede present
ar un fenotipo complejo de Gm. Se han encontrado haplotipos diferentes en varios
grupos raciales, haciendo de ellos un sistema til en los casos en que se sospech
a un componente racial: estos marcadores estn presentes en las cadenas pesadas de
IgM e IgA. no son tan polimrficos como los marcadores Gm y no son m u y tiles en
las pruebas de paternidad. Los marcadores Km. anteriormente conocidos como Inv.
son determinantes de las cadenas ligeras comunes a todas las clases de mmunoglob
ulnas. Otros sistemas de protenas sricas que se han empleado en pruebas de paternid
ad son: la transferrina (TF): el plasmingeno (PLG): el factor de estabilizacin de
la fibrina (FXIII). constituido por dos subunidades independientes de pptidos pol
imrficos (FXIIIA y FXIIIB): la a-1 -antitripsina (Pl); la amilasa; el C3, y el C4
.
Antgeno leucocitario humano (vase Cap. 40)
El sistema HLA. localizado en el brazo corto del cromosoma 6 humano, contiene va
rios locus: HLA-A. -B, -C. -D. -DR, -DP y -DQ Se ha publicado la secuenciacin com
pleta del ADN de las regiones HLA-A y -B (Zemmour. 1992). Antes del uso extenso
de las pruebas de ADN. la determinacin de antgenos HLA-A. -B por mtodos serolgicos f
ue el segundo sistema, tras los antgenos eritrocitarios, ms frecuentemente utiliza
dos en las pruebas de paternidad en Estados Unidos (Polesky, 1999). Los marcador
es DOA1 detectados por PCR tambin se utilizan en algunos laboratorios para prueba
s forenses y de paternidad. El sistema H L A es m u y potente para la prueba de
paternidad, debido a la gran diversidad de estos antgenos en la poblacin. Basndose
en el estrecho ligamiento de las especificidades 40 A y 70 B, es posible identif
icar alrededor de 700 haplotipos y unos 180.000 fenotipos. Existe un desequilibr
io de ligamiento entre HLA-A, -B (es decir, ciertas combinaciones de haplotipos,
como HLA-A2, -B44 o -A1.-B8, suceden ms de lo esperado segn la frecuencia de los
antgenos A1, A2, B8 y B44), Los AABB Standards requieren que el tipado serolgico d
e H L A para la prueba de paternidad incluya todos los antigenos HLA-A y -B reco
nocidos oficialmente en 1980 por el Committee on Nomenctature de la Organizacin M
undial de la Salud (OMS). Tambin recomend que se realizase el tipado de otras espe
cificidades conocidas de HLA si el laboratorio dispona de sueros apropiados de ti
pado. El tipado serolgico de HLA-. -B se realiza mediante un mtodo de hnlocitotoxi
cidad dependiente del complemento. Una suspensin de linfocitos, que contiene al m
enos un 80% de clulas viables, se incuba con mltiples antisueros. Si el anticuerpo
es especfico para un antgeno presente en las clulas estudiadas, stas son destruidas
en presencia de una cantidad adecuada de complemento reactivo. Se mide por la i
ncapacidad de las clulas para excluir un colorante (Ray. 1982). Se recomienda el
uso de muestras hepariniEnzimas eritrocitarias
Los principios y los mtodos generales usados en el fenotipado de protenas sricas me
diante electroforesis se aplican al polimorfismo de enzimas eritrocitarias. Los

sistemas de deteccin dependen de la reaccin de la enzima con un sustrato. Se produ

ce una prdida de actividad si las muestras no se

1394
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
zadas para el tipado de HLA. que no se deben refrigerar antes de la separacin de
los linfocitos. Lo ideal es que los Imfocitos se separen en una gradiente de den
sidad Hypaque-Ficoll en las 24 horas tras su obtencin. Los linfocitos, una vez se
parados, pueden conservarse durante algunos das en un medio de cultivo. Algunos d
e los reactivos disponibles en la actualidad son monoespecficos; los AABB Standar
ds requieren que cada antgeno sea definido al menos por dos sueros monoespecficos
diferentes o por tres sueros multiespecficos. En un caso de paternidad, todos los
individuos deben tiparse en el mismo laboratorio, con el mismo mtodo y los mismo
s reactivos, para minimizar la variabilidad que se da cuando las clulas son upada
s con reactivos diferentes. La interpretacin de los resultados de la prueba de HL
A puede complicarse por un entrecruzamiento entre los locus A y B. Otro problema
con el tipado de HLA es el fracaso para encontrar un 'MI house" (cuatro marcado
res distintos). Pueden encontrarse blancos (alelos no definidos por los reactivo
s disponibles), dependiendo de la raza de la persona analizada. En la mayora de l
os casos, se observan blancos aprenles cuando la persona analizada es homocigtica
para el marcador A o B. En otros casos, los antisueros reaccionan de forma cruza
da con el marcador indefinido o los antigenos esperados no se expresan completam
ente (Lamm, 1983).
thern. 1975). Los fragmentos que representan los locus de inters se detectan medi
ante sondas marcadas que se unirn a una secuencia de bases complementaria entre d
os secuencias de restriccin adyacentes. Antes de aadir la sonda, el ADN separado e
n el gel es despurinado y desnaturalizado. El ADN monocatenario resultante se tr
ansfiere desde el gel a una membrana (transferencia Southern) Una sonda marcada
se hbrida con el ADN en la membrana. Usando determinadas temperaturas y otras con
diciones definidas, la sonda de los locus se fijar a los fragmentos de ADN unidos
a la m e m brana que comparten la misma secuencia (Maniatis, 1982). La localiza
cin de los fragmentos marcados en la membrana se consigue aadiendo un sustrato que
reaccionar con una enzima fijada a la sonda o exponindola sobre una pelcula fotogrf
ica sensible (autorradiografia). si la marca es radiactiva (normalmente -^P) o q
uimioluminiscente. Es importante estandarizar los procedimientos e incluir contr
oles adecuados cuando se realizan anlisis de sistemas de RFLP. Debe controlarse l
a cantidad de ADN extrado y usado en el sistema de prueba, debe verificarse la re
actividad de la enzima utilizada para asegurar la digestin completa del ADN y cad
a recorrido electrofortico debe incluir un control de ADN humano de tamaos conocid
os. Es importante emplear marcadores de tamao con mltiples fragmentos distintos qu
e abarquen el rango de alelos observados normalmente en el locus del ADN que est
siendo analizado. Los AABB Standards requieren que se realice la electroforesis
de una mezcla del ADN del supuesto padre y del nio en el mismo carril. Esto es til
para evaluar la presencia o ausencia de fragmentos de peso molecular parecido.
La interpretacin de los resultados de un sistema de RFLP depende de la coincidenc
ia de las bandas observadas en el nio y en los supuestos padres (Figs. 67-2 y 673). El nio debe presentar fragmentos que coincidan con caPOLIMORFISMOS DEL ADN
La prueba de polimorfismos del ADN es el mtodo utilizado con ms frecuencia para la
prueba de paternidad por los laboratorios (Polesky. 1999). Normalmente, los anli
sis de estos polimorfismos se basan en pruebas de RFLP y/o amplilicacin por POR.
Los AABB Standards han definido los criterios para que un sistema de marcadores
de ADN sea aceptado para su utilizacin en las pruebas de paternidad. Mediante est
udios familiares, debe comprobarse que cada locus presenta herencia mendeliana y
una baja frecuencia de mutacin y/o recombinacin. Su localizacin cromosmica debe est

ar registrada por el International Human Gene Mapping Workshop. Lo ideal es que

las caractersticas del locus (sonda, enzima de restriccin, secuencia del cebador y
tamaos de los fragmentos) estn documentadas en la bibliografa y exisla la posibili
dad de pruebas confirmatorias en un laboratorio independiente. Las ventajas de l
os mtodos de ADN consisten en la disponibilidad de numerosos sistemas altamente p
olimrficos y con una probabilidad de exclusin muy alta; la posibilidad de sistemas
de pruebas mltiples en un recorrido electrolortico; la capacidad para usar muestr
as que contengan clulas nucleadas, incluyendo sangre perifrica, frotis bucal y tej
idos; el tamao minimo de muestra requerido y la detectabilidad de los marcadores
desde el momento de la concepcin (Polesky, 1999).
Caso I
m M C AF nV M
Caso 2
C AF m
Sonda
Pruebas de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin
Se han descrito numerosos locus polimrficos de RFLP como parte de la investigacin
llevada a cabo en el mapeo del genoma humano (Walson, 1992). La identificacin de
un locus especfico requiere una corta secuencia marcada de nucletidos, complementa
ria a una nica secuencia de la regin del ADN que est siendo analizada. Las sondas ti
les en la prueba de paternidad detectan fragmentos de restriccin polimrficos en un
solo locus (diallico simple, insercin/delecin o repeticiones en tndem de nmero varia
ble [VNTR]) (Baird, 1986). El ADN se extrae y purilica a partir de una muestra q
ue contiene clulas nucleadas, como sangre perifrica o un frotis bucal. En ocasione
s, la nica muestra disponible es tejido fijado. Deben utilizarse mtodos especiales
para la obtencin y purificacin del ADN de estas muestras (Forsthoefel, 1992). Se
emplea una enzima bacteriana especfica para escindir asimtricamente el ADN bicaten
ario aislado en las zonas donde est presente una secuencia definida de nucletidos
(p. ej.. Eco Rl. la nucleasa de Escherichla col! RY 13 escinde AG o GA). El proc
eso de restriccin rompe el ADN en mltiples fragmentos de peso molecular variable.
En numerosos locus. el tamao de estos fragmentos est determinado genticamente. La e
lectroforesis en gel se emplea para separar los fragmentos de acuerdo con su tam
ao molecular (SouFigura 67-2. Membrana hibndada con dos sondas m a r c a d a s que detectan los l
ocus de RFLP D12S11 (A) y D17S79 (8). ADN procedente de dos tros digeridos con Ps
t 1. Escalas de tamao flanquean los dos tros. Se muestran la m a d r e (M), el hij
o (C), el supuesto padre (AF) y u n a mezcla de supuesto padre/hijo (m'). En el
caso 1, el AF se excluye mediante la sonda A. Mediante una cuidadosa observacin,
se demostr que el carril de la mezcla presentaba cuatro bandas. En el caso 2, exi
ste coincidencia para ambos locus entre el hijo y el supuesto padre. L o s alelo
s se designan por sus tamao en kilobases: los tamaos mayores estn situados en la pa
rte superior de la membrana.

CAPTULO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

1395
M
Cl
A P m* L C2 m
a que est fuera del rango de tamaos de deteccin utilizado (Chakraborty, 1994). El u
so de pruebas de locus de RFLP junto con marcadores clsicos ha demostrado que los
sistemas de RFLP presentan probabilidades de exclusin similares a los valores es
perados (Endean, 1990b). Si se observa una coincidencia entre el hijo y el supue
sto padre, se realizar el clculo de un ndice del sistema, similar a los presentados
anteriormente en este captulo. Para calcular los ndices de paternidad utilizando
los resultados de estas pruebas, se necesitan las frecuencias gnicas determinadas
en muestras de poblacin adecuadas. Un problema frecuente con los sistemas de RFL
P, no encontrado en los sistemas de marcadores clsicos, e s que los fragmentos (a
lelos) presentan una continuidad de tamaos, en vez de ser marcadores diferenciado
s. Es m u y difcil distinguir entre dos alelos de tamao parecido que puedan diferi
r slo en unos pocos pares de bases. Los errores de medicin y otras variaciones tcni
cas menores del mtodo pueden afectar al tamao asignado a un alelo. Un laboratorio
que realice pruebas de RFLP necesita determinar sigma (capacidad para reproducir
resultados intra- e nterrecorrido electrofortico. usando las mismas muestras) y d
elta (diferencia de tamao mnima entre dos bandas que puede detectarse de modo sist
emtico) para cada locu&sonda/combinacin enzimtica (Endean. 1990a) (Fig. 67-4). En l
a determinacin de las frecuencias allicas se emplean tcnicas de compartimentacin par
a compensar estas variaciones antes de asignar un valor a y (Alien, 1990). Uno d
e los mtodos divide el rango de tamaos de los alelos esperados en una serie de int
ervalos fijados de igual tamao. Para determinar la frecuencia allica de un "hombre
al azar" (y), se usa el valor de la frecuencia del intervalo en el cual se encu
entra la banda. Con este mtodo, la asignacin de valores a bandas cercanas al extre
mo superior o inferior del intervalo puede requerir la combinacin de datos proced
entes de dos intervalos y dar c o m o resultado valores bajos del ndice. Un segun
do mtodo, preferido por el autor, utiliza un intervalo variable. La frecuencia de
y se determina contando todas las bandas observadas en un intervalo determinado
por el tamao del fragmento delta (Tabla 67-4. Fig. 67-4). Usando este mtodo, el t
amao del intervalo vara en relacin al tamao del alelo. Un tercer mtodo, conocido c o
m o el principio del limite superior, fue propuesto por el National Research Cou
ncilen 1992 para garantizar que los datos forenses de identidad presentados a lo
s tribunales fuesen prudentes. Consiste en fijar un lmite superior para el valor
de y. Asi. incluso si el alelo es muy poco frecuente, el valor del ndice no exced
er de un valor fijado (esto es, 20). Este mtodo contrarresta los errores de mueslr
eo y las posibles subestructuras de una poblacin. El Committee on DNA Forensic Sc
ience public en 1996 una actualizacin donde explica por qu este mtodo es mapropiado.
asi como otras consideraciones estadsticas y de poblacin sobre las pruebas forens
es y de paternidad.
Figura 67-3. M e m b r a n a con una sonda multilocus (DNF24) ADN procedente de
un c a s o con dos hijos analizados. L o s carriles de izquierda a derecha muest
ran la madre, el hijo 1, el supuesto padre, una mezcla supuesto padre/hijo 1. la
escala de tamaos, el hijo 2, una mezcla supuesto padre/hijo 2. El hijo 2 se excl
uy debido a que no se encontr coincidencia con las bandas marcadas por el signo +.
da uno de sus padres biolgicos. L a presencia de un fragmento del nio ausente tant

o en la madre como en el hombre analizado es una prueba de no paternidad. Del mi

smo modo, cuando el hombre analizado slo tiene un nico fragmento detectado, se esp
era que est presente en su hijo. No debe excluirse la paternidad por los resultad
os de un solo sistema de ADN. Estos marcadores presentan una mayor frecuencia de
mutacin que los sistemas clsicos, y pueden existir alelos nulos o un segundo frag
mento no identificado debido
Reaccin en cadena de la polimerasa
La reaccin de la PCR, descrita inicialmente por Mulls y cois, en 1986, utiliza la
termociclacin para desnaturalizar el ADN icatenario y promover la (jacin de cebadore
s especficos a secuencias diana que flanquean la regin de inters. Esta tcnica ha per
mitido definir un gran nmero de alelos difeTamaflo de banda (kb) D I 2 S I 1 Pst 1
Figura 67-4. Determinacin de sigma y delta. Representacin grfica de mediciones en c
inco muestras recorridas 10 veces para determinar la reproducibilidad (sigma) y
l a capacidad para distinguir entre dos bandas (de'a) que tienen un tamao similar
(AF-1, AF-2). Basndose en estas observaciones, sigma es 0,094 para la banda compa
rtida por el hijo y la m a d r e (C-M. M2). Delta es 11,7. Esta figura se utiliz
a para seleccionar el tamao del intervalo que determina la frecuencia de y, utili
zada para calcular el ndice de paternidad.

1396
Tabla 67 -4
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Frecuencia de g e n e s obligatorios en s i s t e m a s de R F L P : u s o de de
lta para determinar el t a m a o del intervalo OG
3.54 1.85-3,54 3,95 1,96 6 68 14.95
Sistema
D2S44 D2S44 D7S467 D10S28 D12S11 D12S11
Delta
2.0 2,0 2,3 2,5 1,8 1.8
Intervalo
0,071 (3,47-3,61) 0 , 0 3 7 (1,81-1,89) 0,071 (3.47-3,61) 0,091 (3,86-4,04) 0,049(1,
91-2,01) 0,120(6,56-6.80) 0,269(14,68-15.22)
Frecuencia'
18/2.500 = 0,007 (250/2.500 + 18/2.500) = 0,107 375/1 800 = 0,208 65/1.200 = 0.0
54 28/900 = 0.031 4/900 = 0.004
'Nmero de bandas observadas en el intervalo/bandas loiales del sistema en la base
de dalos
rendados nicamente por cambios mnimos en su secuencia. Las ventajas de la PCR para
las pruebas forenses y de paternidad son: necesita m u y poca cantidad de muest
ra de ADN genmico; no tiene que aislar previamente la secuencia para su amplifica
cin y ofrece una disponibilidad rpida de los resultados de la prueba y condiciones
de almacenamiento de la muestra no demasiado rigurosas. Cuando se utilizan sist
emas de PCR, es necesario monitorizar y validar el funcionamiento del termocicla
dor. Debido a que minimas cantidades de ADN en la etapa de postamplilicacin puede
n causar la contaminacin de muestras en la (ase de preamplificacin, es esencial se
r cuidadoso en el diseo del laboratorio y del flujo de trabajo para separar los p
asos de preamplilicacin de las reas en las que se realizan la amplificacin y detecc
in de resultados (Budowle, 1995: Dieffenbach, 1993) (vase Cap. 63). Debe procesars
e y analizarse un control negativo con cada lote de muestras para verificar que
no haya contaminacin. Un problema asociado con la PCR es que si no se encuentra n
ingn producto, debemos asegurarnos de que la muestra no contiene ninguna sustanci
a que inhiba la amplificacin.
escalas allicas que contienen fragmentos de peso molecular conocido. Es posible e
l anlisis simultneo de varios sistemas si existen diferencias en el rango de tamaos
de los alelos de cada locus Estos sistemas genticos no son tan polimrticos como l
os sistemas de RFLP. El primer sistema de AFLP usado en casos forenses y de pate
rnidad fue la regin 3' hipervanable del locus de la apolipoprotena B (ApoB) formad
a por unidades de repeticin de 15 pares de bases (bp) de adenina y timina. Este s
istema de marcadores contiene 23 alelos que varan entre 611 y 931 bp y una hetero
cigosidad media de 0,8. D1S80, un locus del cromosoma 1 (26 alelos de 16 repetic
iones con un rango de tamaos entre 430 y 782 bp). se utiliza con frecuencia en lo
s laboratorios de pruebas de paternidad. Existen en el genoma otros locus formad
os por unidades de repeticin de tres a siete nucletidos (Weber. 1989). Los alelos
de estos locus de STR se definen por el nmero de unidades de repeticin del product
o amplificado por PCR. Las muestras se mezclan con cebadores que se fijarn con el
ADN del locus que presente la secuencia especifica. La mezcla se amplifica en u

n termociclador usando parmetros definidos cuidadosamente para maximizar la detec

cin de los alelos. En una mezcla, pueden utilizarse varios cebadores con distinta
s marcas fluorescentes para detectar alelos de varios locus en u n a sola amplif
icacin. Los productos de PCR que difieren en longitud se separan por electrofores
is en poliacrilamida utilizando capilares o geles. La deteccin se realiza mediant
e un explorador lser que detecta la m a r c a incorporada en el cebador o por tin
cin del gel con plata. La determinacin de tamaos se basa en la comparacin con una es
cala allica y/o inclusin de un estndar de tamaos para cada locus que se marca de for
ma diferente a la muestra Los AABB Standards tambin requieren que se incluya una
muestra mezclada del hijo y del padre en cuestin. Se ha estandarizado una combina
cin de 13 locus de STR para su uso en la obtencin de perfiles genticos de individuo
s condenados por varias causas criminales. Muchos de estos locus tambin se utiliz
an en pruebas d e paternidad. Los sistemas de marcadores de STR presentan alelos
diferenciados y. por tanto, no son tan polimrficos como los sistemas de marcador
es de RFLP. En algunos casos, estos sistemas tienen tres o cuatro alelos comunes
(frecuencias de 0.15 a 0,25) y varios alelos inusuales (frecuencias menores de
0.01). Asi, para obtener una CPE y un ndice de paternidad altos, s e requiere ana
lizar seis o ms locus de STR; Allord y cois, informaron en 1 9 9 4 de que ambos mt
odos excluyeron a los mismos 13 supuestos padres (basados en dos o ms locus). Segn
los sistemas de STR, la probabilidad de paternidad en 36 de los 37 hombres no e
xcluidos estuvo por encima del 99%.
DQA1. polimarcador
La deteccin de los ocho alelos del locus HLA-DQA1 (Erlich. 1986) fue una de las p
rimeras aplicaciones de la PCR en pruebas forenses y de paternidad. Los genes re
sponsables de estos antigenos HLA de clase II fueron identificados mediante el u
so de cebadores biotinilados especficos de secuencia (SSP) y de sondas oligonucle
otdicas especficas de un alelo (ASO) en un sistema de transferencia en mancha inve
rso ("reverse dot blof). El ADN de la muestra se amplilica con los cebadores mar
cados. Posteriormente, la mezcla de reaccin se transfiere sobre una membrana que
contiene una sene de sondas ASO inmovilizadas. Si un alelo est presente en la mue
stra, la secuencia amplificada hibridar con la mancha que contiene el ADN complem
entario. Despus de lavar para eliminar el ADN no fijado, las manchas que presenta
n ADN fijado se detectan por la reaccin de la biotina de la secuencia amplificada
con un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina. Se dispone de un equip
o de reactivos (AmpliType PM) que utiliza el mtodo de transferencia en mancha par
a detectar marcadores en los siguientes locus: LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC. La m
ayora de estos locus no son muy polimrficos (slo presentan dos o tres alelos). Dos
de estos sistemas de marcadores detectan alelos encontrados por los mtodos clsicos
(GYPA es igual que los antigenos eritrocitarios M. N; GC es igual que el sistem
a de protenas sricas).
ADN
mitocondrial
Repeticiones cortas en tndem (STR) y repeticiones largas en tndem (LTR)
Los polimorfismos del ADN suceden en locus con variaciones de la longitud. Estos
sistemas con marcadores que presentan VNTR se identifican por PCR. Los polimorf
ismos de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) se separan usando ele
ctroforesis en gel de alta resolucin (Boerwmkle. 1989). Los fragmentos producidos
por la reaccin de la PCR se comparan con
La amplificacin por PCR seguida de secuenciacin puede utilizarse para identificar
el polimorfismo de procedencia materna presente en la regin hipervariable del buc
le D del ADN mitocondrial. En situaciones complicadas, las secuencias de ADN amp
lificado extradas de tejidos y huesos encontrados se comparan con las secuencias
de ADN de descendientes maternos (Holland, 1994). Usando este mtodo, se ha demost
rado que los posibles huesos de la familia del zar Nicols II (recuperados en Yeka
terimburgo, Rusia) presentan un ADN materno similar a los descendientes vivos de

la reina Victoria, la abuela materna de la zarina Alexandra (Ivanov. 1993).

CAPTULO 6 7

P R U E B A S DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

1397
OTROS TIPOS DE PRUEBAS
El estudio de la longitud del cromosoma Y se utiliz para excluir la paternidad (D
e la Chapelle, 1967). Tambin se ha usado la comparacin de marcadores fluorescentes
sobre varios cromosomas para excluir la paternidad o proporcionar estimaciones
de inclusin (Grtler, 1986). Se encontraron una serie de locus de STR en el cromoso
ma Y. Estos marcadores son tiles en la determinacin de la linea paterna. Se han de
scrito sondas mutlilocus para la identificacin de rboles genealgicos que detectan r
egiones hipervariables (Jeffreys. 1986). El mtodo utilizado es similar a la tcnica
empleada para detectar marcadores de RFLP. Las relaciones entre los individuos
se determinan comparando el nmero de bandas compartidas. Algunos investigadores h
an utilizado las repeticiones en minisatlites (MVR) (Jeffreys. 1991). Se han desc
rito sistemas de pruebas para el estudio de los genes del locus MHC. que emplean
combinaciones de amplificacin gnica por PCR con cebadores especficos de secuencia,
sondas oligonucleotidicas especficas de secuencia (SSOP) y secuenciacin directa,
aunque no se usan en pruebas forenses o de paternidad de modo sistemtico (Alien.
1994: Bunce. 1995). Se han desarrollado mtodos para detectar polimorfismos de un
solo nudetido (SNP). tambin denominados genetic bit analysis (GBA) (Nikiforov. 199
4). Estos sistemas determinan el cambio de una sola base de una secuencia en una
localizacin especfica. Debido a la limitada variabilidad de estos locus. se preci
sa analizar unos 50 para conseguir el mismo nivel de informacin que el proporcion
ado por un muitipiexe varios locus de STR.
efecto significativo sobre la conclusin de paternidad. En estas situaciones, tamb
in pueden ser tiles las comparaciones con las frecuencias de determinados grupos r
aciales. Si el hombre analizado no es excluido, siempre se puede argumentar que
el nmero de pruebas fue insuficiente, que la prueba de exclusin se encontrar median
te el anlisis de otro sistema gentico o que el verdadero padre es un familiar cerc
ano del hombre analizado. Esta linea de razonamiento slo sera correcta si el hombr
e analizado ha sido acusado en falso. Adems del poder de exclusin medio descnto co
n anterioridad, tambin es posible calcular la frecuencia con la cual un hombre no
ser excluido al azar (RMNE), basndose en los fenotipos observados en la pareja ma
dre-hijo (Salmn. 1983). Este valor est relacionado con el poder real de exclusin de
las pruebas realizadas.
Clculo del ndice de paternidad
En los casos en los que se analiza un trio, normalmente se utiliza un enfoque ge
neral denominado "comparacin del mtodo del esperma" (Walker, 1978). Este clculo com
para la probabilidad (x) de que un esperma procedente de un hombre con el fenoti
po del hombre analizado pueda fertilizar el vulo de la supuesta madre y la probab
ilidad (y) de que lo haga el esperma de un hombre de la poblacin elegido al azar
(Tabla 67-5). Las proporciones de probabilidad (x/'y) se calculan independientem
ente para cada sistema gentico, comparando el hombre analizado mediante las frecu
encias de los OG o mediante la contribucin gentica paterna a una poblacin elegida a
l azar de la misma raza del hombre analizado. Posteriormente, estos valores se m
ultiplican para calcular el Pl, que refleja las probabilidades genticas a favor d
e la paternidad, teniendo en cuenta los fenotipos del trio. En la Tabla 67-5 se
muestran frmulas para el clculo de los ndices con vanas combinaciones de fenotipos.
Los valores del ndice de paternidad en casos en los que n o se observa exclusin p
ueden tener un valor numrico desde mayor de cero hasta un nmero prximo a infinito.
Los AABB Slandards actuales requieren para determinar la paternidad que la prueb
a tenga al menos un Pl de 99. Esto significa que la probabilidad de que el hombr
e analizado sea el padre es de 99 a 1.

INCLUSION DE LA PATERNIDAD
Si despus de mltiples sistemas independientes de pruebas el supuesto padre no es e
xcluido, debe calcularse entonces una estimacin sobre la posibilidad de que la pe
rsona analizada pueda ser el padre biolgico. Se deben utilizar tablas adecuadas d
e frecuencias gnicas que proporcionen estimaciones de inclusin de la paternidad. E
n general, esto significa que se ha fenotipado al azar una poblacin de personas,
que el tamao de la muestra es lo suficientemente grande como para proporcionar co
n mnimos etrores una estimacin de las frecuencias gnicas de los alelos del sistema
y que los hombres analizados y los padres biolgicos proceden de la misma poblacin.
Cuando se analizan mltiples sistemas, las diferencias observadas en las frecuenc
ias gnicas de poblaciones procedentes de varias localizaciones geogrficas no son r
elevantes en el clculo de la probabilidad de paternidad (Hummel. 1981). En casos
en los que el hombre estudiado tiene origen multirracial o procede de una poblac
in para la que no existen tablas de frecuencia apropiadas, puede ser imposible pr
oporcionar una estimacin precisa de la paternidad. Sin embargo, cuando se utiliza
n mltiples sistemas con un alto poder de exclusin y los valores del ndice de patern
idad son altos usando una poblacin de referencia, existe un riesgo mnimo de que la
s frecuencias de una poblacin ms definida presenten un
Probabilidad de paternidad
Otra estimacin til, la probabilidad de paternidad, combina las pruebas genticas con
suposiciones acerca de sucesos anteriores. Essen-Mller describi en 1938 este clcul
o basado en el teorema de Bayes (Tabla 67-6). La estimacin utiliza el Pl para res
umir la informacin gentica y P (un valor para la probabilidad previa) para explica
r las suposiciones de que el hombre analizado: 1. 2. 3. 4. No era estril Tuvo acc
eso durante el periodo de concepcin No es un familiar cercano del padre (primer g
rado) Otros posibles padres proceden de una poblacin con frecuencias gnicas simila
res
Si se utiliza una P de 0,5; sta asigna igual posibilidad previa al hombre analiza
do y a cualquier hombre no analizado. Usando este valor, la probabilidad de pate
rnidad (W) es igual a (PI/PI + 1)100. Se pueden utilizar en este clcuTabla 67-5 Clculo d e la proporcin del sistema* (ndice d e paternidad) Madre A A A
A AB AB AB AB BC AC Hijo A A AB AB AB Al! AB AC BC AD Genes obligatorios (OG) a
i
0
Hombre analizado A AB B AB A B AB AC BC BD
X 1 0.5 1 0,5 1 1 1 0,5 1 0.5
Y 0,25 0.25 0,4 0,4 0,65 0,65 0.65 0,3 0.7 0,05
Frmula para la frecuencia de Y P P g o p+q p+q p+q
r
X/Y 4 2 2,5 1.25 1,54 1.54 1.54 1.67 1.43 10
b aob aob aob c boc
q+r s
"Sistema hipottico con cuatro alelos codominantes p, q, ry s medidos por los marc
adores A B, C y D

1398
s ' ' "
_
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
Tabla 67-6 F r m u l a de la probabilidad de paternidad (W) Se utiliza el teorem
a de Bayes para combinar p con Pl p = probabilidad previa de sucesos no genticos
Pl = resumen de los resultados de las pruebas genticas
compartir el gen obligatorio paterno en todos los sistemas. Se puede calcular un
ndice de paternidad utilizando una frecuencia para x que tiene en cuenta la posi
bilidad de que el difunto pudiera transmitir el marcador (Fig. 67-5). Tambin se p
ueden realizar reconstrucciones utilizando datos procedentes de numerosos famili
ares supuestos, como se muestra en la Figura 67-6.
DOCUMENTACIN E INFORMACIN DE LOS RESULTADOS
Los resultados de las pruebas de paternidad suelen utilizarse en los procedimien
tos jurdicos. Aunque la mayora de las disputas de paternidad son acciones civiles,
algunas jurisdicciones requieren documentos que muestren la cadena de custodia
de las muestras de modo similar a los que se usan en asuntos cnmnales. Por tanto,
deben documentarse todos los aspectos relacionados con los procedimientos utili
zados, puesto que pueden estar expuestos a recusacin por alguna de las partes. Es
muy importante documentar la identificacin de los individuos analizados, la obte
ncin y etiquetado de las muestras, los procesos analticos y la revisin de los resul
tados. Debe conseguirse la historia de transfusiones recientes (anteriores a tre
s meses) o de trasplante de clulas m a d r e hematopoyticas. Tambin se debe acompaar
cada muestra con una identificacin fotogrfica y el adecuado consentimiento inform
ado. Para un menor, el consentimiento debe proceder del tutor legal de la custod
ia del nio.
lo otros valores de probabilidad previa, aunque introducen un sesgo contra el ho
mbre analizado si son superiores a 0.5 y contra la madre si son menores de 0.5.
Los valores matemticos obtenidos a partir del clculo del Pl o de la probabilidad t
ienen una significacin especial debido a que en muchas jurisdicciones los valores
informados pueden cambiar el estado legal de los interesados. Por ejemplo, la M
innesota Statute Section 257.55 transfiere el peso de la paternidad al hombre si
la prueba indica que l es el padre con una probabilidad superior al 99%.
Los AABB Standards requieren que el informe de los resultados de la prueSe puede
proporcionar una estimacin de la paternidad aunque uno de los ba incluyan lo sig
uiente: padres no est disponible para el anlisis. La situacin ms comn es aquella en 1
. El origen racial/tnico asignado a los supuestos padres la cual se dispone de mu
estras del hijo y del supuesto padre, pero no de la 2. Los fenotipos de cada per
sona analizada madre. En esta situacin el hijo debe compartir al menos un gen de
cada locus 3. Una opinin sobre si el supuesto padre puede ser excluido y la base
con el hombre analizado. Las frmulas (Tabla 67-7) para estimar el ndice de para la
exclusin, si la hubiera paternidad y su probabilidad son similares a las emplead
as en el anlisis de tros, 4. El ndice de paternidad del individuo para cada sistema
informado con la excepcin de que las estimaciones deben incluir un ajuste para l
a fre5. El ndice de paternidad combinado y la probabilidad d e paternidad cuencia
del alelo transmitido por la madre ausente (Brenner, 1993). El clculo es expresa
da como un porcentaje, as como la probabilidad previa utilizams complicado si la m
ujer ausente y el hombre no analizado son de razas difeda en el clculo rentes (Tr

aver, 1996). S el hombre analizado o el nio presentan dos marcado6. Una explicacin
de los resultados no concluyentes o inusuales (posible res en un locus, ninguno
de los cuales est presente en el otro individuo analimutacin observada) zado, el h
ombre analizado es excluido. Tambin se sugiere la no paternidad si el La informac
in acerca de los locus de RFLP de los individuos analizados nio y el hombre analiz
ado presentan homocigosidad inversa. debe incluir la endonucleasa de restriccin u
tilizada y la designacin d e la sonda usada. El fenotipo de los individuos debe i
nformarse c o m o el tamao Reconstruccin de familias de los fragmentos de restricc
in en pares de bases o pares de kilobases o el Existen numerosas situaciones para
las que es importante establecer una nmero de repeticiones en sistemas de STR'AF
LP. Una opinin de no paterrelacin entre los individuos. Esto ocurre cuando individ
uos, como los inminidad no es adecuada si existe una sola exclusin indirecta en u
n sistema clgrantes, intentan conseguir una condicin, descubrir si tienen en comn u
n sico o una exclusin aparente en un nico locus de ADN. En algunos casos, padre o
cuando existe una cuestin relacionada con la herencia. Los familiares cuando el P
l residual es alto (vale para todos los sistemas excepto los que pueden presenta
r sistemas en los cuales no se comparte ningn gen, ya que presentan exclusiones a
parentes), puede ser necesario realizar pruebas en nicamente un padre y un hijo c
omparten al menos un marcador de cada locus. sistemas adicionales cuando slo dos
locus tienen resultados discrepantes. Se utilizan frmulas que tienen en cuenta lo
s marcadores que pueden ser compartidos por descendientes para estimar la cercana
de la relacin entre dos individuos (Wenk, 1986). Los hermanos verdaderos present
an una posibilidad CONCLUSIN de 0,25 de no compartir un marcador en un sistema, m
ientras que los hermanastras, tas o tios presentan una posibilidad de 0.5. En cas
os en los que el Mediante anlisis de mltiples sistemas genticos, pueden obtenerse p
ruesupuesto padre ha fallecido, se puede reconstruir su probable fenotipo si se
rea- bas cientficas que ayuden a resolver los casos de paternidad discutida y liz
a la prueba en sus padres (Mayr. 1983). El hijo y los supuestos abuelos deben cu
estiones sobre las relaciones de parentesco Aunque la tecnologa actual Tabla 67-7
Clculo de la p r o p o r c i n del sistema* (ndice de paternidad) c u a n d o slo
se analiza un padre Hijo A A A AB AB AC BC AD Padre analizado A AB BC B AB AB A
BD G e n e s paternos del hijo a a b ao b a d G e n e s obligatorios de otro p a
d r e a a a ao b ao b ao c boc aod Frmula para calcular la proporcin del sistema
1/P 1/2p Exclusin M2q (p + q)IApq 1/4p Exclusin 1/4s
Estimacin de la paternidad con un padre ausente
a r c a c t o r e s A. B. C y D (frecuencias gnicas a = p. b = q. c = r y d = s)
-Sistema hipaetico con cuatro m

CAPTULO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES. HIJO

Madre (Hi ..Abuelo.'* /.Abuela.'* Fenotipos posibles del presunto F r m u l a par
a calcular el ndice del
1399
Sistema
padre?
sistema
D12S11 (Pst1)
11.47; 12.85
12.85; 13,76
11,47
9,75; 11.47
11.47; 12,5
9.75; 12,5 11,47; 12,5 9.75; 11,47 11,47
0.5/p
D17S79 (Pst1)
3.31; 3.45
3,37; 3.45
3.31
3,45: 3,82
3,31; 3.52
3,31; 3.31; 3.45; 3.52:
3,45 3.82 3.52 3.82
0,25/p
vWA
16. 17
16. 17
16o 17
14. 15

16
14. 16 15. 16
0,5/p q
TPOX
8, 11
10, 11
8
8. 10
8
8, 10 8(8.8)
0.75/p
D7S820
10
10. 13
10
10
10
10(10. 10)
1/p
"La interpretacin asume que el supuesto padre fallecido es el rujo de las persona
s analizadas: p y g son las frecuencias de los genes obligatorios. En este caso
se analizaron los supuestos padres del presunto padre fallecido para reconstruir
su genotipo probable. En cada uno de los sistemas analizados, el gen obligatori
o paterno (OG) est presente en uno de los supuestos abuelos del hijo. Nota: para
vWA. cualquier alelo del hijo pudo ser materno. El ndice de paternidad y la proba
bilidad de paternidad se obtienen multiplicando los valores de cada sistema.
Figura 67-5. Anlisis de una familia para establecer la paternidad. En este caso,
los supuestos padres del presunto padre fallecido fueron analizados para reconst
ruir su genotipo probable. En cada uno de los sistemas analizados, el gen obliga
torio paterno (OG| est prsenle en uno de los supuestos abuelos del hijo Nota: pata
vWa. cualquier alelo del hijo pudo ser materno. El ndice de paternidad y la prob
abilidad de paternidad se obtienen multiplicando lo valores de cada sistema.

1400
Sistema
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
Presunto padre 1 1,56. 3,24
Presunto padre 2 2,12. 2,61
Hijo 1
Hijo 2
Hijo 3
Hijo 4
D2S44
1,75. 3,24
1,75, 2,61
1,75. 2,12
1.75, 2,61
D7S467
3,71, 4.32
3,54
3.62. 3.71
3,54, 3,80
3,54, 3,62
3.54, 3,62
DI0S28
1,53, 1.92
1,75,2,42
1.53. L84
1.84, 2,42
1.75. 1.98
1.98, 2,34
vWA

14. 20
16. 17
15. 20
15. 17
16, 18
17, 18
IHOl
8, 9
6, 9
8, 9,3
6 9.3
6, 7
8, SL3
TPOX
8. 11
8, 10
8 (8,8)
8. 12
10, 12
8 (8.8)
CSF1PO
10, 11
11. 12
10, 14
12. 14
9. 12
11. 14
D5S818
13, 14
11, 12

10, 14
10. 12
12 (12, 12)
12(12, 12)
D7S820
8, 9
IO.
13
8, 11
io. u
10, 14
13, 14
D13S317
11. 12
8. 10
12, 14
8, 10
10 14
10 (10, 10)
D16S539
12. 15
9, 11
8, 15
8. 11
11, 13
9, 13
L o s cuatro hijos de este estudio familiar pudieron tener la m i s m a madre. E
l probable marcador materno de cada sistema se muestra en negrita y subrayado. E
l presunto padre 1 comparte un m a r c a d o r con el hijo 1 en todos los sistem
as analizados. l fue excluido como el posible padre de los hijos 2, 3 y 4 (D2S44,
D7S467. D10S28, vWa, D5S818, D7S820. D13S317 y D16S539). El presunto padre 2 se
excluy c o m o el posible padre del hijo 1 (D2S44, D7S467, D10S28, vWa, TH01, CS
F1P0, D5S818. D7S820, D13S317 y D16S539). Tambin tue excluido el presunto padre 2

c o m o el padre del hijo 4 debido a los hallazgos en D10S28 (el hombre analiza
do carece de 1,98 y de 2.34) y en TH01 (el hijo no presenta ni el 6 ni el 9 enco
ntrados en el hombre analizado). Los hallazgos de una posible coincidencia entre
el hijo 4 y el presunto padre 2 en nueve de los once sistemas sugieren que el v
erdadero padre podra ser un familiar o que se han producido dos mutaciones.
Figura 67-6. Estudio de u n a familia (la supuesta madre ha fallecido). Los cuat
ro hijos de este estudio familiar pudieron tener la m i s m a madre. El probable
m a r c a d o r materno de cada sistema se muestra en negrita y subrayado. El p
resunto padre 1 comparte un m a r c a d o r con el hijo 1 en todos los sistemas
analizados. l fue excluido c o m o el posible padre de los hijos 2.3 y 4 (D2S44,
D7S467. D10S28. vWa. D5S818. D7S820, D13S317 y D16S539). El presunto padre 2 se
excluy como el posible padre del hijo 1 (D2S44, D7S467, D10S28. vWa. TH01, CSF1PO
, D5S818, D7S820, D13S317 y D16S539). Tambin fue excluido el presunto padre 2 c o
m o el padre del hijo 4 debido a los hallazgos en D10S28 (el hombre analizado c
arece de 1 , 9 8 y de 2,34) y en TH01 (el hijo no presenta ni el 6 ni el 9 encon
trados en el hombre analizado). L o s hallazgos de una posible coincidencia entr
e el hijo 4 y el presunto padre 2 en nueve de los once sistemas sugieren que el
verdadero padre podra ser un familiar o que se han producido dos mutaciones.

C A P T U L O 67

P RUEBAS D E P A T E R N I D A D : E M P L E O DEL ADN, P O L I M O R F I S M O

Y O T R O S M A R C A D O R E S .
1401
proporciona exclusiones de ms del 99% de hombres acusados en falso, no es posible
excluir a todos los que no son padres, y tampoco es posible demostrar la patern
idad mediante pruebas de laboratorio. Cuando no se encuentra exclusin, las estima
ciones matemticas derivadas de las pruebas de marcadores genticos son una fuente s
ignificativa de datos que puede utilizarse para establecer la paternidad.
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C A P I T U L O
68
Pruebas forenses de identidad mediante anlisis del ADN
Victor W. Weedn, M.D., J.D. Rhonda K. Roby, M.P.H.
USOS DEL ADN VENTAJAS DEL ADN FRENTE A LA SEROLOGA TRADICIONAL POLIMORFISMOS MTODO
S DE ANLISIS DEL ADN Anlisis de RFLP Pruebas de PCR Transferencias en mancha basad
as en la PCR AFLP y STR Marcadores de gnero y del cromosoma Y Secuenciacin del ADN
mitocondrial Instrumentacin 1403 1404 1404 1402 DEGRADACIN DEL ADN Y DAO AMBIENTAL
RECOGIDA DE MUESTRAS EXTRACCIN DEL ADN NORMAS DE GARANTA DE LA CALIDAD DESAFOS LEG
ALES BASES DE DATOS DE ADN BIBLIOGRAFA 1410 1411 1411 1411 1412 1412 1413
El primer uso a gran escala de las pruebas de cido desoxirribonucleico (ADNI no s
e realiz en los diagnsticos mdicos, sino en los forenses (cnminalisticos y de anlisi
s de la paternidad) (Weedn, 1993). Se atribuye a Sir Alee Jeffreys el primer inf
orme aparecido en la bibliografa cientfica, en el cual propone que el tipado de AD
N podra ser de utilidad en la identificacin forense y acu el trmino "huella de ADN" e
n su articulo de Nalure (Jeffreys, 1985b, 1985c). Los laboratorios comerciales c
omenzaron el estudio de casos de paternidad y criminalisticos mediante el empleo
de la prueba de ADN en 1986, (fecoes. 1986: Cellmark. 1987: Forensic Science Asso
ciates, 1986); a (males de 1988. los laboratorios criminalsticos gubernamentales
incorporaron estas pruebas (FBI. diciembre de 1989, Virginia, marzo de 1989). La
s pruebas forenses de ADN han reemplazado prcticamente por completo a la serologa
tradicional como medio de anlisis de las muestras biolgicas. El conjunto de las pr
uebas forenses de ADN ha estado sometido a numerosos cambios en cuanto a mtodos y
tecnologas, aunque parece haberse decidido actualmente por un grupo de 12 locus
de STR, que sern los pilares de estas pruebas en un futuro prximo. Este grupo de l
ocus se complementa con el anlisis de gnero (amelogenna) y con la secuenciacin del A
DN mitocondrial. La principal plataforma instrumental es la electroloresis capil
ar, aunque tambin se estn empleando otras plataformas.
por diversas razones: 1) est presente en todas las clulas del organismo (excepto e
n los glbulos rojos maduros). 2) es el mismo en todas las clulas del organismo (ex
cepto en los gametos sexuales haploides). 3) no cambia durante el curso de la vi
da (excepto mutaciones) y 4) es diferente en todos los individuos (excepto en ge
melos idnticos). Slo recientemente, se ha considerado la prueba de ADN como una pr
ueba de identificacin positiva, ms que nicamente una prueba estadstica (aunque firme
) de identificacin. El FBI considera actualmente el resultado del perfil de ADN c
on un poder de discriminacin de 10 veces la poblacin de Estados Unidos, lo que per
mite asegurar que una determinada muestra de ADN procede de un determinado indiv
iduo. De acuerdo con el principio de transferencia de evidencias de Locard, norm
almente se dejan restos biolgicos en la escena del crimen que pueden vincularse c
on el autor. La prueba de ADN vincula al sospechoso con la escena, pero no es po
r si misma una prueba del delito. Por ejemplo, la evidencia de restos de semen n
o demuestra una violacin (p. ej., el semen recuperado de una presunta vctima de vi
olacin puede haberse depositado a travs de un contacto sexual consentido). Seguro
que sera evidente un mayor impacto de la prueba del anlisis de ADN. con la salveda
d de que en numerosos delitos: 1) no se encuentran pruebas biolgicas para analiza
r. 2) no existen muestras de ADN de referencia para su comparacin o no hay sospec
hoso, y 3) el tipado del ADN no es trascendente para el caso, el ADN no demuestr
a culpabilidad o inocencia. No obstante, la prueba de ADN ha supuesto una revolu
cin en los anlisis criminalsticos. Actualmente la prueba de ADN se realiza de modo
sistemtico en el laboratorio criminalstico y es admitida en los tribunales. En Est
ados Unidos, se aplica aproximadamente a tres cuartas partes de los abusos sexua
les y a u n a gran proporcin de homicidios. Las pruebas de ADN exculpan al sospec
hoso acusado en un tercio de los casos, no son concluyentes en u n a cuarta part
e y descubren al sospechoso del delito en algo menos de la mitad de los casos. Sl
o son litigados una parte de los casos en los cuales se analizan restos de ADN.
puesto que la mayora son acordados entre las partes. La escena del crimen present

a una gran cantidad de pruebas fsicas; sin embargo, muchas no se recuperan y otra
s no son remitidas a los laboratorios
USOS DEL ADN
Salvo por la presencia de testigos o en caso de confesin, la capacidad para ident
ificar a una persona en la escena del crimen slo puede llevarse a cabo mediante l
a huella digital o una prueba de ADN (Peterson, 1991). Cualquier otra prueba slo
sugiere una conexin sospechosa. Por ejemplo, los "pequeos detalles" de las marcas
que el can de la pistola deja en una bala, pueden vincular especficamente esa bala
con una determinada pistola, aunque no implicarn al presunto sujeto que la dispar.
Las huellas digitales y el ADN permiten la identificacin directa del individuo,
debido a que son personales y. como sucede normalmente en biologa, presentan vari
acin biolgica. Concretamente, el ADN es til como marcador de identidad

CAPTULO 68

P R U E B A S FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL A D N

1403
de criminalstica (Parker, 1970), En un estudio, Parker y Peterson descubrieron qu
e se podan recuperar objetos fsicos en el 95% de los casos de atracos residenciale
s, en el 85% de robos, en el 83% de lesiones y en el 100% de asesinatos. Durante
el periodo que dur el estudio, slo se revisaron en el laboratorio 489 de los 8.20
3 casos delictivos informados. En un estudio posterior, Peterson (1984) slo encon
tr informes de laboratorio en una cuarta parte de los archivos liscales (la gran
mayora de los delitos nunca se convirtieron en archivos fiscales), aunque con dif
erencias segn el tipo de delito (p. ej., cerca del 100% de asesinatos y menos del
20% de robos). Parker observ en su estudio que la mayora de escenas del crimen pr
esentaban numerosas clases de pruebas fsicas, encontrndose de forma frecuente "san
gre', "pelo" y "manchas de material orgnico, vegetal, animal y desconocidas" en p
rcticamente todas las categoras de delitos. Se registraron restos de sangre en el
2% de atracos residenciales, en el 14% de robos, en el 60% de lesiones y en el 6
0% de asesinatos. Se encontr material orgnico, vegetal y animal, junto a manchas d
esconocidas en el 35% de atracos residenciales. 15% de robos, 20% de lesiones y
40% de asesinatos. Se hall pelo en el 6% de atracos residenciales y en el 10% de
robos. Se encuentra ADN tanto en semen y sangre como en saliva, pelo, clulas de l
a piel, orina, heces y otras muestras biolgicas. La saliva puede recuperarse a pa
rtir de chicles, colillas de cigarros, cartas o un vaso. Las raspaduras de uas y
las uas rotas son tiles por s mismas como muestras con restos de ADN. La cinta del
pelo y posiblemente otras ropas pueden presentar restos de ADN. Se han recogido
muestras de referencia de ADN en cepillos de dientes, mquinas de afeitar, mechone
s de pelo de beb, muestras de biopsia. sobres y sellos. En el contexto criminalsti
co, se puede utilizar ADN para vincular un sospechoso a un delito, para exculpar
a sospechosos falsamente acusados, para reconocer crmenes en serie y distinguir
crmenes inspirados en otro; tambin pueden emplearse en la reconstruccin de un accid
ente, por ejemplo, para determinar quin conduca el coche medante la identificacin de
las gotas de sangre en el lado izquierdo del parabrisas. Adems del uso del ADN c
omo prueba en las escenas de los delitos, tambin se emplea en la identificacin de
restos, cuando no estn disponibles las huellas digitales, dentales u otros medios
tradicionales de identificacin (Weedn, 1998a). Los mtodos tradicionales de identi
ficacin son dificultosos porque estn sujetos a la descomposicin, fragmentacin, incin
eracin parcial o ausencia de datos premortem de comparacin. Cualquier fragmento de
tejido o hueso puede identificarse por anlisis de ADN. La disponibilidad de las
familias como fuente de material de referencia para propsitos de comparacin supera
los grandes obstculos de la identificacin mediante la huella digital y dental y l
a falta de datos premortem de comparacin. En la actualidad, algunos institutos fo
renses conservan una muestra de ADN, en forma de un pequeo carn con una gota de sa
ngre, en el archivo procedente de las autopsias, por si posteriormente se cuesti
ona la identificacin o por si se necesita como material de referencia para invest
igaciones forenses. El ADN se utiliza en la determinacin de la especie y del gnero
, as como en la identificacin del grupo y del individuo (Sensabaugh, 1999). Los anl
isis de ADN de plantas y animales han sido fundamentales en la resolucin de algun
os delitos. La identificacin de especie es importante en los casos de caza furtiv
a. En algunas ocasiones, se han localizado ciertos lugares o personas a travs de
restos de animales y plantas dejados como prueba. El ADN se emplea para la prueb
a de paternidad (vase Cap. 67). Aunque normalmente se aplica en pruebas civiles d
e paternidad para apoyo econmico del hijo, tambin se realiza con propsitos criminals
ticos, como en el caso del embarazo provocado por una violacin o en el caso de un
beb abandonado. Las pruebas de identidad de ADN pueden usarse en la separacin de
muestras muy mezcladas (Weedn, 1993b). Los laboratorios de patologa encontrarn una
aplicacin de la prueba de identidad de ADN cuando las muestras son involuntariam

ente cambiadas o el material patolgico vara en una preparacin histolgica o citolgica.

Las pruebas sanguneas de anlisis clnicos pueden ser variables. Las pruebas de estu
pefacientes en orina, cuya eficacia se ha puesto en duda debido a supuestos camb
ios de muestra, pueden resolverse mediante pruebas de ADN. El anlisis puede
emplearse para confirmar o refutar la identificacin de muestras de biopsia. Se pu
ede determinar que un pequeo fragmento de tejido cancergeno ("variable") en una pr
eparacin microscpica procede de alguien distinto al paciente.
La reina contra Pitchfork
La primera investigacin criminal b a s a d a en el tipado de ADN le realizada por
A l e e Jeffreys utilizando una f o r m a inicial de anlisis de RFLP en un c a s
o doble de violacin y asesinato en Inglaterra. En 1983, Linda Mann, d e1 5 aos d e
edad, fue violada y estrangulada en el tranquilo c o n d a d o de Leieestersrii
re. N o se encontr ningn sospechoso. E n 1986. D a w n Ashworth. d e1 8 aos d e eda
d, le violada y estrangulada a una mila del primer asesinato. Richard Buckland, q
ue s e haba c o m p o r t a d o de f o r m a sospechosa, fue a c u s a d of o r m
a l m e n t e del s e g u n d o asesinato y declarado s o s p e c h o s o del p
rimero. Jeffreys demostr que las m u e s t r a sd e s e m e n procedan del m i s m
o hombre, a u n q u e no de Buckland. De este m o d o , antes de que el A D N l
uese u s a d o para c o n d e n a r a alguien p o r un crimen, sirvi p a r a d e
m o s t r a r que alguien era inocente. La polica no tenia pistas, a p e s a r de
las m i l e s de declaraciones, d a t o s informatizados y las 20.000 libras de
r e c o m p e n s a . Pensando que el responsable deba ser un h o m b r e de la
localidad, la polica pidi a todos los h o m b r e sd e la zona d e entre 1 3y3 0 ao
s que presentaran de f o r m a voluntaria una m u e s t r a de s a n g r e para
su anlisis; prcticamente t o d o s los h o m b r e s lo hicieron; de hecho, un tot
al de 4.500 h o m b r e s ofrecieron la m u e s t r ar e q u e rida (un h o m b
r e se neg p o rm o t i v o s religiosos). Colin Pitchfork falt dos v e c e sa sus
citas para dar sangre en enero de 1987. En la tercera cita, despus de intentar p
a g a r a varias personas para sustituirle, persuadi con xito a su compaero de tra
bajo, lan Kelly, explicndole que le p r e o c u p a b a que l p u d i e s es e r "
incriminado" debido a sus c o n d e n a s anteriores por exhibicionismo. P i t c
h f o r k coloc la loto de K e ly en su pasaporte, hizo que K e ly practicase su
firma y le instruy en detalles de su familia. Pitchfork consigui eludir a las aut
oridades. Sin embargo, m e s e s ms tarde, en septiembre de 1987, Kelly, m i e n
t r a s beba en un bar, se jact a n t e sus amigos de cmo l habia donado sangre en l
ugar de su a m i g o Pitchfork. La polica se enter de la sustitucin. Kelly fue c o
n d e n a d o por conspiracin para tergiversar el curso de la justicia. Posterior
mente, Pilchfork fue analizado a d e c u a d a m e n t e . En unas semanas, la h
uella de ADN identific al seor Pitchfork c o m o el violador. E n la primavera de
1988, fue declarado culpable y sentenciado d ep o rv i d a a prisin (Wambaugh, 19
89).
VENTAJAS DEL ADN FRENTE A LA SEROLOGA TRADICIONAL
Los marcadores genticos han sido m u y utilizados en medicina forense. Los anlisis
criminalsticos de muestras biolgicas comenzaron con la aplicacin del grupo sanguneo
ABO en estudios forenses a finales del siglo XX. Las pruebas serolgicas se ampli
aron para incluir el tipado de antgenos y grupos sanguneos, isoenzimas de protenas
sricas y anlisis de HLA. Muchas de estas pruebas tradicionales emplean reacciones
inmunolgicas que presentan genes nulos y supresores, antigenicidad dbil, reaccione
s cruzadas, desnaturalizacin, agentes bloqueantes y modificacin microbiana. La pru
eba de ADN carece de estos impedimentos caractersticos de las reacciones inmunolgi
cas (Weedn, 1993a). Adems, el ADN es el determinante fundamental de todos los mar
cadores genticos. Un gen nulo o supresor es slo otra secuencia de ADN. Analizando
el ADN. se estudia el cdigo gentico, ms que una informacin secundaria. Asimismo, deb
ido a la degeneracin del cdigo gentico, existen ms diferencias en el ADN que las ref
lejadas en las protenas que ste codifica. La primera gran ventaja de la prueba de
ADN frente al anlisis serolgico tradicional es que puede aplicarse a cualquier mat

erial de origen biolgico. El anlisis serolgico completo (los laboratorios criminalst

icos han empleado tradicionalmente 12 marcadores genticos) slo puede realizarse en
sangre y no en otros tejidos o lquidos biolgicos. Por ejemplo, los caractersticos
mtodos tradicionales de serologa de un frotis vaginal en un caso de violacin, slo in
cluiran factor secretor. ABO si el factor secretor es positivo y fosfoglucomutasa
(PGM). Prcticamente se puede utilizar cualquier vestigio de material biolgico par
a el anlisis de ADN, incluyendo sangre, pelo, saliva, semen e incluso orina. La s
egunda gran ventaja de la prueba de ADN, la ms divulgada, es el gran potencial de
discriminacin de los perfiles de ADN, permitiendo una identificacin positiva. El
anlisis del grupo sanguneo ABO puede distinguir aproxi-

1404
SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR ADN. Se emplean distintos mtodos de anlisis de ADN para detectar
los dos tipos de polimorfismos. Se encuentran polimorfismos de la longitud en e
l ADN repetitivo. Ms del 90% del genoma humano est compuesto de ADN no codificante
o "junk", del cual, aproximadamente del 20% al 30% est compuesto de regiones rep
etitivas. Muchas de las regiones repetitivas varian en el nmero de repeticiones e
ntre individuos diferentes, denominados locus de repeticiones en tndem de nmero va
riable (VNTR). Los fragmentos de ADN que contienen VNTR vanan en longitud y por
tanto son tiles para el anlisis. Las repeticiones de dinucletido son las ms comunes,
aunque las repeticiones ms grandes son de mayor utilidad para los propsitos foren
ses. Los RFLP. los polimorfismos d e la longitud de los fragmentos amplificados
de ADN (AFLP) y las repeticiones cortas en tndem (STR), son ejemplos de tcnicas an
alticas de la longitud de los fragmentos. Existen polimorfismos de secuencia en f
ragmentos de ADN con un tamao similar. Los polimorfismos de secuencia consisten e
n diferencias de u n ao ms bases en la secuencia de ADN de una regin determinada d
el genoma. Las variaciones de secuencia pueden manifestarse como regiones de ale
los alternativos o de delecciones. adiciones o susliluciones de bases. La mayora
de los polimorfismos de secuencia son simples mutaciones puntuales dentro de reg
iones repetitivas y no repetitivas, conocidos como polimorfismos de un solo nucl
etido (SNP). Los SNP. las transferencias en mancha y las pruebas de ADN mitocondr
ial son ejemplos de pruebas basadas en la secuencia.
madamente uno de cada tres individuos y otros marcadores serolgicos pueden difere
nciar uno entre miles, mientras que los perfiles de ADN actualmente presentan va
lores de discriminacin de uno entre trillones. Una tercera ventaja de las pruebas
de ADN est en su sensibilidad, que es bastante superior a la de los marcadores s
erolgicos tradicionales. El anlisis mediante PCR es muy sensible, por encima de la
s pruebas iniciales de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restric
cin (RFLP). La prueba se puede realizar con xito a partir de muestras diminutas e
incluso con restos imperceptibles de trazas de ADN. U n a cuarta ventaja del ADN
es su resistencia a los factores ambientales (Kobilnsky. 1992). Es una molcula ba
stante resistente a los cidos fuertes, lcalis y detergentes, mientras que no lo so
n los determinantes de las protenas, lpidos e hidratos de carbono. Las protenas se
desnaturalizan con relativa facilidad, siendo la conformacin de su estructura ter
ciana muy importante para el tipado. Sin embargo, la informacin que se tipa en el
ADN se encuentra dentro de la secuencia de nuclelidos. que es independiente del
estado conformacional de la molcula. Asi, las pruebas de ADN se pueden realizar s
atisfactoriamente en muestras que son ms antiguas y que han estado expuestas a im
portantes agresiones ambientales, a diferencia de los marcadores tradicionales.
U n a quinta ventaja es la capacidad para distinguir entre el ADN de los esperma
tozoides, el procedente de otras clulas y el bacteriano La mayor parte de los est
udios realizados por los laboratorios crimnalsticos en Estados Unidos son de abuso
s sexuales. Los frotis vaginales contendrn bacterias, clulas epiteliales de la muj
er y esperma del hombre. Esto representa un problema para las tcnicas de tipado s
erolgico tradicionales; en dos terceras partes de los casos, el semen no puede id
entificarse debido a que la mezcla de lquidos origina una mezcla de tipos serolgic
os (Davies, 1982). Sin embargo, el ADN procedente del esperma se puede distingui
r de otros ADN. mediante un procedimiento de lisis diferencial, debido a la cpsul
a de proteccin del espermatozoide (vase en el apartado "Extraccin del ADN"). Esto p
ermite la individualizacin de la procedencia del semen, sin la confusin de datos q
ue originan los restos distintos al semen. Las sondas de ADN son especificas de
humanos o primates, de tal modo que la presencia de ADN bacteriano no es trascen
dente.
MTODOS DE ANLISIS DEL ADN Anlisis de RFLP

Durante la primera dcada de su aplicacin en los esludios de casos de individuos, e

l anlisis de RFLP ha sido el mtodo ms utilizado en los anlisis forenses de ADN (Sout
hern. 1975; Weedn. 1989). Esta tcnica permite la separacin y visualizacn de los frag
mentos de ADN por su tamao. La diana de los anlisis forenses de RFLP es el ADN rep
etitivo, los locus de VNTR. en los cuales el nmero de unidades de repeticin difier
e entre los individuos. Los fragmentos de ADN que contienen VNTR se obtienen a p
artir de enzimas de restriccin que cortan el ADN cromosmico. La longitud de cada f
ragmento se denomina "alelo". Por tanlo. se analizan los fragmentos de ADN corta
dos ("restriccin") que difieren (son polimrficos) en tamao (longitud) entre los ind
ividuos (Fig. 68-1). Las primeras sondas empleadas por Jeffreys hibndaban de mod
o no especfico con numerosos locus dentro del genoma y producan un patrn complejo p
arecido a un cdigo de barras, especfico de cada individuo (Jeffreys, 1985b, 1985c)
. La comunidad forense propuso cambiar estas sondas multilocus (MLP) por sondas
de un solo locus (SLP), en las cuales slo se originan un par de alelos, uno mater
no y otro paterno. Las SLP son ms sensibles, ms constantes y producen resultados q
ue se manejan mejor mediante la estadstica de poblaciones tradicional. Una SLP de
RFLP caracterstica puede tener aproximadamente una secuencia de repeticin de VNTR
de 70 bases. Los fragmentos de RFLP varan en tamao entre 0.5 kb y 1 0 kb. Los sei
s pasos del anlisis de RFLP, despus de la extraccin de ADN y la cuantificacin, son:
1) digestin del ADN en fragmentos mediante enzimas de restriccin; 2) separacin de l
os fragmentos por tamao, utilizando electroforesis en gel de agarosa: 3) desnatur
alizacin de los fragmentos de ADN bicatenaro en formas monocatenarias, mediante so
luciones con pH bsico y transferencia e inmovilizacin de los fragmentos de ADN en
una m e m b r a n a de nailon, un proceso conocido como transferencia Southern;
4) permitir que sondas radiactivas hibriden con los fragmentos inmovilizados en
la membrana; 5) exposicin de la radiactividad procedente de las sondas sobre una
pelcula de rayos X en un proceso denominado autorradiografia y 6) determinacin del
tamao de los fragmentos, mediante comparacin de las bandas de la muestra con las
bandas de fragmentos de un control en el autorradiograma resultante. El autorrad
iograma originado a partir de una sonda de un solo locus presenta dos bandas (al
elos materno y paterno) en c a d a carril, en el c a s o de un sujeto heterocigo
to, o una sola banda, en el caso de un individuo homocigoto. Aclualmente. la aut
orradiograla ha sido reemplazada por tcnicas de deleccin fluorescente o quimiolumin
iscenle. Se han desarrollado sistemas automticos de proyeccin de imgenes analticas (
Fig 68-2).
Caso de inmigracin ghans
L ap r i m e r a ocasin en la q u es e emple la p r u e b a de ADN fue en el e s t
u d i od eu n c a s o de inmigracin en 1985 U nc h i c op r o c e d e n t e de G
h a n a intent e m i g r a r a Gran Bretaa, a f i r m a n d o que s um a d r e ya
era residente. Las a u t o r i d a d e ss o s p e c h a r o n q u e el c h i c
o era u np r i m oL o sm a r c a d o r e s genticos c o n v e n c i o n a l e s (
16 s i s t e m a s q u ei n c l u y e n el H L A ) indicaron q u e el chico y la
m a d r ee s t a b a n relacionados, p e r o n op u d i e r o n distinguir si l
a m u j e r era su ta o su m a d r e .P a r ac o m p l i c a r la cuestin, la m a
d r e tuvo alguna d u d a en c u a n t o al p a d r e biolgico del chico y no exi
stan musIras del p a d r e de G h a n a ni de n i n g u n a de sus h e r m a n a s
. Jeffreys determin q u e el c h i c oyl a s tres h e r m a n a s tenian el m i
s m op a d r e y la m i s m am a d r eT o d a s las b a n d a sd el ah u e la d
eA D N del joven s o s p e c h o s on oe n c o n t r a d a se nl am a d r e coin
cidan con las b a n c a sd e t e r m i n a d a sc o m o paternas, p r o c e d e n
t e s de las tres hijas. L a s posibilidades d eq u eu n ah e r m a n ad el am
a d r e produjese e l mismo g r u p od eb a n d a s m a l e r n a s fueron insig
nificantes y. p o r consiguiente, se permiti al c h i c oe n t r a r en el pas p a
r a unirse a su m a d r e (Jeffreys. 1985a).
POLIMORFISMOS
El ADN de cada persona es nico (excepto para gemelos idnticos), debido a la presen
cia de "polimorfismos", diferencias en el ADN entre los individuos. Sin embargo,
gran parte de la secuencia del ADN es idntica entre los individuos; lo refleja e

l hecho de que tengamos dos brazos, dos piernas, una nariz, etc.. siendo ms parec
idos que diferentes. Slo 1 de cada 1.000 pares de nucletidos difiere de media entr
e los individuos. No obstante, esto equivale a una media de 3 millones de pares
de bases que difieren entre dos individuos cualesquiera, lo cual explica la gran
variacin gentica entre individuos en cuanto al tipado sanguneo, color de ojos, col
or del pelo, temperamento y otras caractersticas. Aunque es grande la diversidad
de las regiones codificantes del ADN (genes), tambin las regiones no codificantes
del ADN dan lugar a una gran diversidad, soliendo utilizarse en las pruebas for
enses de

CAPTULO 68
P R U E B A S FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL A D N
1405
RFLP clsico
i
RFLP de VNTR
Figura 68-1. Dos tipos de anlisis de RFLP. El RFLP clsico est basado en el tamao del
fragmento cortado por u n a enzima de restriccin en la secuencia de una mutacin o
un polimorfismo. El anlisis de RFLP basado en locus hipervarlables varia en tamao
debido a las repeticiones en tndem d e nmero variable (VNTR). (Modificado de Nati
onal Research Council: ADN Technology in Forensic Science. Washington, DC. Natio
nal Academy Press. 1992, con autorizacin.)
Los anlisis de RFLP o transferencia Southern son muy potentes y representan la te
cnologa ms poderosa de tipado del ADN, produciendo valores de discriminacin de uno
entre cientos de millones o incluso superiores. No obstante, es un proceso labor
ioso que lleva mucho tiempo (de seis a ocho semanas). Adems, requiere una cantida
d sustancial de ADN no degradado (alto peso molecular) para el anlisis. La resolu
cin y la imprecisin de la medicin de los sistemas de RFLP no permiten determinacion
es exactas diferenciadas por una sola repeticin. Esta imprecisin de la medicin orig
ina una distribucin continua de las determinaciones allicas de tamao, en lugar de b
andas allicas diferenciadas. Por tanto, empleando el anlisis tradicional de RFLP.
no puede decirse con certeza que un fragmento determinado con un tamao de 4,32 kb
sea el mismo u otro diferente que un fragmento determinado con un tamao de 4,33
kb. Aunque el anlisis de RFLP es una excelente tcnica forense, ha sido desplazada
por tcnicas basadas en la PCR debido a su gran sensibilidad, aphcabilidad a muest
ras degradadas, produccin de resultados allicos diferenciados, procesamiento ms rpido, simplicidad y capacidad para ser automatizadas.
Florida contra Andrews
T o m m i e Lee A n d r e w s se convirti en la p r i m e r ap e r s o n a en ser
c o n d e n a d ap o r un crim e n de violacin, utilizando la p r u e b a de tip
ado de ADN. D u r a n t e la p r i m a v e r a de 1986, s ec o m e t i e r o nu
n as e n ed ev i o l a c i o n e se nl az o n as u rd e Orlando, Florida. L ap r
i m e r a victima fue N a n c yH o d g e . de 27 aos de edad. D u r a n t e 1986
, se pens que el m i s m o h o m b r e haba sido el r e s p o n s a b l e de 23 in
cidentes, c o m oa c o s a r , forzar y e n t r a r en h o g a r e s de m u j e
r e s y por t e n t a t i v a s de a b u s o ss e x u a l e s o violaciones. El
modus operan* era caracterstico. P a s a d a la m e d i a n o c h e , el a g r e
s o r , empuando un cuchilo, se introduca en el h o g a r de la victima, sorprenda
a a m u i e r en la o s c u r i d a d y cubra su c a b e z ac o nu n a sbana o u n
a manta. D u r a n t e el a b u s o sexual, l encenda y a p a g a b a la luz. T r
a s la agresin, sola levarse su p e r m i s o de c o n d u c i r . En 1986. se r e
g i s t r a r o n 23 incidentes. En lebrero de 1987, u n am u j e r de 27 aos de
e d a d fue g o l p e a d a ,a c u chilada y r e p e t i d a m e n t e violada,
m i e n t r a s sus dos hijos pequeos dorman en la h a b i tacin de al lado. Su c
a b e z a le e n v u e l t a por un s a c o de d o r m i r .A g e n t e sv e s t
i d o sd e

1406
Carril 12 3 4 5 6 7 8
SECCIN V I I

PATOIOGA MOLECULAR
9
Pruebas de PCR
La prueba de la PCR no slo ha revolucionado las ciencias biolgicas, sino tambin los
anlisis forenses de ADN. Las pruebas de RFLP del ADN han sido reemplazadas por mt
odos basados en la PCR, que incluyen sistemas de transferencia en mancha, AFLP,
STR y secuenciacin directa del ADN mitocondnal. La PCR fue descrita por primera v
ez en 1985 (Saiki. 1985); su invencin se atribuy a Kary Mulls, que fue distinguido
con el premio Nobel de qumica en 1993. El concepto inicial se demostr mediante el
tipado de la cadena < < de la hemoglobina, aunque su primera aplicacin comercial
fue el anlisis de transferencia en mancha del sistema H L A DQA1. El primer caso
en el que las pruebas de ADN se introdujeron en un juzgado de Estados Unidos fue
el de Pennsylvana contra Pestinikas en 1986. que consisti en el anlisis del sistem
a HLA DQ-H (Commonwealth ol Pennsylvana v Pestinikas. 19881 La PCR permite tipar
el ADN de un modo rpido y sensible. La sensibilidad puede ser critica en temas lo
renses. ya que ciertos tipos de pruebas no tienen el suliciente ADN como para po
derse analizar mediante tcnicas tradicionales de serologa o anlisis de RFLP. Adems,
el ADN diana, amplificado a partir del ADN original, puede detectarse incluso me
diante tinciones no especificas de ADN, como la tincin con plata: asi, se evita l
a necesidad de emplear sondas marcadas frente a los fragmentos del ADN diana. Po
r consiguiente, los anlisis de PCR no requieren ni hibridacin ni transferencia Sou
thern, permitiendo su automatizacin. Durante el proceso de amplificacin, los ampli
cones de ADN tambin se pueden marcar especficamente o modificar mediante una molcul
a seal (p. ej un fluorforo). Las pruebas basadas en la PCR. a diferencia de los RFL
P. normalmente producen resultados tipables cuando la muestra de ADN est muy degr
adada, como en los tejidos de cadveres, sangre expuesta al medio ambiente e inclu
so tejidos teidos, fijados con formalina e incrustados con parafma en un portaobj
etos de vidrio. Las tecnologas de PCR no son sensibles a la degradacin porque, en
primer lugar, los locus del ADN diana son pequeos, y porque slo se necesita que al
gunas copias permanezcan intactas para producir cantidades detectables de produc
to amplificado. Por el contrario, los anlisis de RFLP son muy sensibles a la degr
adacin. Los fragmentos ms cortos, analizados mediante tcnicas de tipado del ADN bas
adas en la PCR. requieren sistemas de deteccin de alta resolucin. Estos sistemas d
e mayor resolucin presentan la gran ventaja de producir resultados dilerenciados
(o semidiferenciados), es decir, resultados allicos, a diferencia de los anlisis d
e RFLP, que originan una gama de tamaos repartidos en distintos intervalos de con
fianza, ya que la imprecisin real es menor que la del tamao de los fragmentos allic
os.
Figura 68-2. Autorradiografia de RFLP de un solo locus gentico en un caso de viol
acin. Los carriles de izquierda a derecha son: 1) escala de tamaos de fragmentos e
stndar de ADN: 2) K562, una linea celular estndar con dos bandas de peso m o l e c
u l a r conocido; 3) muestra del control de calidad interno del laboralono: 4)
m u e s t r a de referencia estndar del sospechoso: 5) m u e s t r a de referenci
a estndar de la victima; 6) escala de tamaos de fragmentos estndar; 7) fraccin de clu
las epiteliales procedentes del frotis vaginal; 8) fraccin de espermatozoides pro
cedentes del frotis vaginal; 9) escala de tamaos de fragmentos estndar de ADN. El
perfil de ADN generado a partir de la fraccin de clulas epiteliales (carril 7) coi
ncide con el perfil de ADN de la m u e s t r a de referencia estndar de la victim
a (carril 5). El perfil de ADN generado a partir de la fraccin de espermatozoides
(carril 8) coincide con el perfil de ADN de la muestra de referencia estndar del

sospechoso (carril 4). No se p u e d e excluir al sospechoso c o m o posible do

nante del ADN extrado de los espermatozoides del Irolis vaginal.
Las pruebas basadas en la PCR son potentes, aunque presentan algunas desventajas
. En general, los sistemas genticos analizados mediante tecnologas basadas en la P
CR tienen m e n o r poder de discriminacin (son m e n o s informativos) que los s
istemas genticos de RFLP. No obstante, el p o d e r de discriminacin es aceptable,
y se incrementa con sistemas adicionales. Otra desventaja es su susceptibilidad
a la inhibicin por medio de diversos factores, como el hemo de la sangre. Tambin
puede producirse una amplificacin preferente de un alelo sobre otro, onginando un
a "marginacin allica". Igual que en las pruebas de RFLP. los alelos de mayor peso
molecular pueden no detectarse si la muestra de ADN est muy degradada. Adems, los
cebadores especficos pueden ser ms eficaces con un alelo que con otro, provocando
u n aumento en la produccin del alelo favorecido. Por otra parte, la sensibilidad
p a i s a n o vigilaron el v e c i n d a r i o El c o c h e patrulla d er e c o
n o c i m i e n t o descubri un vehextrema de los sistemas de PCR hace que sean s
usceptibles de contaminacin c u l oq u eh u i aat o d av e l o c i d a dp r o c e
d e n t ed e la z o n a y lo sigui d u r a n t em i la sa n t e s d eq u es ee s
t r e la s ec o n t r au np o s t eE lc o n d u c t o r .T o m m yL e eA n d r
e w s ,f u ed e t e n i d o por ADN. De hecho, esta facilidad de contaminacin cru
zada es la nica preocupacin importante de las pruebas de PCR. por lo cual deben to
marse las prec o m os o s p e c h o s o de m e r o d e a r ,t r a s la persecucin
a e l e v a d av e l o c i d a d y el a c c i d e n t e . cauciones apropiadas.
Aun asi. la PCR puede realizarse con fiabilidad, incluso l viva a tres m i la sd
e la p r i m e r a vctima. N a n c yH o d g e .d e 27 aos de edad. A la maana sigui
ente, H o d g e le identific de e n t r e una s e n e de fotos. El t i p a d o sa
nguneo con pruebas no tiles en los anlisis de RFLP, slo demostr q u e l y el v i o l
d o rf o r m a b a np a r t e del t e r c i o de l a poblacin c o n el m i s m o
tipo sanguneo Ni su cara, ra su voz fueron r e c o n o c i d a sp o r la seorita
H o d g e . Pennsylvana contra Pestinikas L a habitacin e s t a b ao s c u r a y e
l violador h a b l a b a en voz b a j a El seor A n d r e w tenia u n ac o a r t
a d a y la polica slo c o n t a b ac o nu n ap a r de h u e la s digitales en u n
ap a n t a la L ap r i m e r av e zq u es e introdujo l ap r u e b ad eA D Ne nu
n; u z g a d od eE s t a d o sU n x l o s e x t e n o r de la c a s ad e la vic
tima. En o c t u b r ed e 1987. Lifecodes determin q u e el A D N fue en u nc a s
o de 1986, a u n q u e la p r u e b a no fue la b a s ep a r a la disposicin del
c a s o . de la s a n g r e de A n d r e w coincida con las m u e s t r a s de s
e m e no b t e n i d a s de las v i c t i m a s . L o st r a b a j a d o r e sd
eu n asilo h a b i a ns i d oa c u s a d o s del h o m i c i d i op o rn e g l
i g e n c i ad eu n U nm e s ms tarde, s e perdi el juicio a p e s a r de q u eH o
d g e identilic de f o r m a positia n c i a n oq u e pareca h a b e rm u e r t o
de h a m b r e .S ec u e s t i o n a r o n los r e s u l t a d o sd el a va a A
n d r e w s . Sin e m b a r g o , el 6 de n o v i e m b r e de 1987. A n d r e
w sf u ec o n d e n a d o y sen- a u t o p s i a y se procedi a la exhumacin. En r
e s p u e s t a , el mdico de la a u t o p s i a inicial t e n c i a d oa2 2 aos
d e crcel en un j u i c i od e violacin d i s t i n t o .D u r a n t e1 9 8 8 en u
n aleg que los rganos i n t e r n o sh a b i a ns i d oc a m b i a d o sp o r los
de o t r oc u e r p o . El c u e r n u e v o juicio s o b r e su acusacin inicial
, se p r o d u j o un v e r e d i c t od ec u l p a b i l i d a dys e le po haba
sido e m b a l s a m a d oye n t e r r a d o haca un ao L ap r u e b a de A D N de
l s i s t e m a conden a 78 aos a d i c i o n a l e s de prisin [State v Andrews. 1
987| H L A DQ-a fue realizada p o r Ed B l a k e de la Forensic Soence Associate
s. El A D N esta-

CAPTULO 6 8

P R U E B A S FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL A D N

1407
ba m u y degradado (el tamao m e d i o de los f r a g m e n t o s fue de 1 0 0 bp
). L o s fragmentos amplilicados del l o c u sH L A de 82 bp p r o c e d e n t e
s de los rganos internos coincidieron c o nl o sd eo t r o s tejidos del organis
mo. L o sa c u s a d o st u e r o nc o n d e n a d o sp o r h o m i c i d i o ne
gligente, a u n q u e absueltos de la acusacin de m a n i p u l a r con el cuerpo
.
(Commonwealth ol Pennsylvania v Pestinikas, 1988)
Transferencias en mancha basadas en la PCR
El protolipo de ejemplo de tcnicas de deteccin de polimorfismos de secuencia es la
transferencia en mancha. La transferencia en mancha consiste en una serie de so
ndas de ADN para detectar secuencias diana. Una sonda oligonucleotdica especfica d
e secuencia (SSO), tambin denominada sonda oligonucleotidica especfica de un alelo
(ASO), es un fragmento de ADN monocatenario lo suficientemente grande como para
conferir especificidad, aunque lo bastante corto para desestabilizarse por un s
olo nucletido incompatible, uniendo asi nicamente la secuencia complementaria exac
ta. Las sondas SSO se emplean para detectar la presencia o ausencia de tipos alt
ernativos de secuencias.
clsico de tipado del grupo sanguneo MN. GC es un polimorfismo de protenas sricas en
humanos que ha sido isotipado durante aos por los laboratorios criminalsticos, emp
leando mtodos de anlisis de protenas. Los otros tres sistemas no han sido utilizado
s con anterioridad en estudios de casos criminalsticos. Cada uno de los sistemas
Polimarker delecta nicamente dos o tres aletas. Cuando el sistema Polimarker se c
ombina con DQA1. el poder de discriminacin se incrementa hasta uno entre dos mil.
Las transferencias en mancha tambin se han utilizado en el anlisis de las regione
s hipervariables del ADN milocondrial.
Illinois contra Dotson
La p r i m e r a vez que un a c u s a d o us la p r u e b a de ADN fue a partir d
e la apelacin de l ac o n d e n ad eG a r y Dotson p o r la violacin de C a t h l
e e nW e b b en Illinois. 1977. D o t s o n le c o n d e n a d o por las a c u s
a c i o n e sd e la seorita W e b b y el t e s t i m o n i od e imposicin legal en
base al g r u p o sanguneo ABO. por el que f o r m a b a parte del 1 0 % de la p
oblacin caucsica con el m i s m o tipo de s e m e n que el e n c o n t r a d o en
la r o p a interior d e la seorita Webb. Ms tarde. W e b b se relract de su acusacin
c o n t r a Dobbson. Se descubri e n t o n c e s un error en el tipado del grupo
ABO, r e v e l a n d o que, de hecho, el s e m e n poda p e r t e n e c e r al 6
6% de la poblacin. No obstante, D o t s o n no fue indultado. El profesor Jeffrey
s no fue c a p a z de tipar la m u e s i r a de 1 0 aos de antigedad usando la hue
lla gentica de RFLP. Ed Blake, de la Foiensic Associates, e m p l e a n d o la p
r u e b a del s i s t e m aH L A DQ-r< m e d i a n t e PCR, le c a p a z de e s t
a b l e c e r una exclusin creble. Dotson le indultado en 1989 {Illinois v Dotson.
1989).
En los formatos tradicionales de transferencia en mancha, la muestra amplificada
de ADN se fija a una membrana y se explora con una sonda ASO (cualquier sonda n
o fijada se lava); observndose un resultado positivo de la prueba por medio de la
reaccin colorimtrica producida por una enzima ligada a la sonda. Los equipos de r
eactivos comerciales utilizan una transferencia en mancha inversa, en la cual la
sonda se fija a la membrana y posteriormente se aade la muestra amplifica de ADN
. Los resultados, positivos o negativos, de la pre- AFLP y STR sencia de una det

erminada secuencia se determinan visualmente; por tanto, los El anlisis de AFLP c

onsiste en la separacin electrofortica por tamao de patrones de manchas azules de l
a tira indican un genotipo especifico. fragmentos polimrfcos de ADN producidos por
amplificacin, en lugar de por escisin (anlisis RFLP). El HLA DQA1 (anteriormente c
onocido como DQ-) y el Amplitype Los locus de VNTR empleados en el anlisis de AFLP
son ms pequeos PM+DQA1 (comnmente conocido como el sistema Polimarker) son sistema
s que los locus de RFLP: por tanto, los fragmentos diana amplificados son ms come
rciales de transferencia en mancha inversa empleados en criminologa pequeos. En co
nsecuencia, los AFLP requieren geles de poliacrilamida de (PE 6/osysfems). Los e
quipos de reactivos de la prueba han demostrado ser alta resolucin, en vez de los
geles de agarosa de baja resolucin utilizados en potentes anlisis, fciles de reali
zar. No se necesita ms equipo que un terlos anlisis de RFLP. La poliacrilamida es
lo bastante fuerte como para que mociclador. El analista puede realizar la prueb
a en menos de un da. El anpueda manipularse, al contrario que la agarosa. evitando
asi la necesidad de lisis se realiza de modo satisfactorio a pesar de que la mu
estra est degrala transferencia del ADN (transferencia Southern) a una membrana d
e nylon. dada, aunque los locus genticos ms grandes pueden no amplificarse cuanLa
concentracin de productos amplificados por PCR es tan superior al ADN do estn pres
entes locus genticos ms pequeos. Estos sistemas de transpresente incialmente que no
es necesaria la hibridacin del ADN diana ferencia en mancha se han introducido de
modo generalizado en los tribunamediante una sonda marcada, pudindose teir direct
amente el contenido total les, y han recibido la aceptacin de los juzgados. de AD
N con una tincin de plata u otra tincin no especifica. De modo alterEl HLA DQA1 es
un sistema gentico nico. En la versin inicial, existan 21 nativo, se puede marcar e
l ADN durante el proceso de amplificacin, aadiengenotipos posibles del sistema, pr
ocedentes del emparejamiento de seis aledo una marca fluorescente. La imagen de
los geles resultantes puede proyectas: 1.1, 1.2,1.3, 2, 3 y 4: el poder de discr
iminacin resultante sera de uno tarse automticamente sobre un escner de fluorescenci
a. Debido a la elimientre veinte. Posteriormente, el alelo 4 se fraccion en tres
aletas distintos (4.1, nacin de la transferencia Southern y de la autorradiografi
a, el anlisis de 4.2 y 4.3). dando lugar a un mayor poder de discriminacin (Fig. 6
8-3). La lira AFLP se puede realizar en uno o dos das, en lugar de las semanas ne
cesade transferencia en mancha Polimarker analiza cinco locus genticos diferenria
s para tas anlisis de RFLP. tes: el receptor de lipoprotenas de baja densidad (LDL
R), la glucoforina A (GYPA), la cadena y de la hemoglobina (HBGG). D7S8 y el com
ponente especfico de grupo (GC) (Fig. 68-4). La glucoforina A es el sistema gentic
o Figura 68-3. Tiras de sondas de ADN del sistema AmpliType H L A DQA1 que muest
ran los resultados obtenidos en un caso de asesinato. Las tiras de la parte supe
rior a la parte inferior son: 1) muestra de referencia estndar de la vctima (4.1,4
.2/4.3); 2) muestra de reterencia estndar del sospechoso #1 (1.1); 3) muestra de
referencia estndar del sospechoso #2 (4.1,4.2/4.3); 4) prueba de gota de sangre r
ecuperada del apartamento del sospechoso (4.1. 4.2/4.3); 5) prueba de u n a mues
tra de pelo recuperada del cuerpo de la victima (4.1. 4.1); 6) control #1 o mues
tra de control de calidad positivo (1.1,4.1): 7) A D N de control #2 o control n
egativo (sin ADN). El perfil de ADN generado a partir de la prueba de la gota de
sangre (tira 4) recuperada del apartamento del sospechoso coincide con el perfi
l de ADN de la muestra de referencia estndar de la victima (tira 1). No se puede
excluir al sospechoso #2 (tira 3) c o m o el donante de la m u e s t r a de pelo
(tira 5) procedente del cuerpo de la victima. La vctima no puede ser excluida c
o m o donante de la prueba de la gota de sangre. Se puede excluir al sospechoso
#1 (tira 2) c o m o el donante de la prueba de la muestra de pelo y de la mancha
de sangre.
Puesto que se pueden separar las repeticiones de cada individuo, es posible la d
eterminacin de aletas diferenciados. Los resultados de RFLP se

1408
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 68-4. Tiras de sondas de ADN del sistema A m p h T y p e PM que muestran
los resultados en un caso de robo. T a n t o el sospechoso #1 c o m o el sospech
oso #2 pueden s e r excluidos c o m o los donantes del material de la prueba. in
forman como determinados tamaos de banda con cierto grado de imprecisin; los resul
tados de AFLP se informan como alelos, determinados por el nmero de repeticiones.
Lo ideal es que los alelos consten de secuencias repetidas con fidelidad, pero
algunos alelos no concuerdan en la secuencia y otros presentan una repeticin parc
ial. Los sistemas de PCR actuales alcanzan la suficiente resolucin como para reve
lar diferencias ocasionales en la regin de repeticin, originando una ligera varanci
a de longitudes o cambio de movilidad, tambin denominado microheterogeneidad de a
lelos microvariantes. Los primeros AFLP descritos incluan: D1S80. DI7S30 (tambin d
enominado D17S5), colgeno A (ColA) y APOB (un polimorfismo 3' de repeticin de secu
encia del locus de la apolipoprotena B). Estos AFLP iniciales consistan en secuenc
ias de repeticin mayores de 8 bp, conocidos como "minisatlites" o regiones de "rep
eticin larga en tndem" (LTR). En la actualidad, el D1S80 es el sistema mejor desar
rollado y est disponible comercialmente (Fig. 685). El locus D1S80 presenta un el
emento de repeticin de 16 bp y sus fragmentos amplificados varan entre 369 bp y ms
de 801 bp. Las regiones que presentan secuencias de repeticin de 2 bp a 8 bp. se
denominan "microsatlites" o regiones de "repeticin corta en tndem" (STR)
Carril
(Butler, sitio web; Weedn, 1998c). Los fragmentos de STR son bastante ms pequeos q
ue los de LTR, con longitudes medias del orden de 200 bp. En el genoma humano, e
xisten ms de 30.000 locus distintos de STR conocidos. Se prefieren los fragmentos
de STR ms cortos a los AFLP iniciales de LTR. debido a su menor susceptibilidad
a la degradacin y a su amplificacin preferente. La "marginacin allica" no se observa
con las pequeas STR. aunque se produce con los alelos de L T R ms grandes. Sin em
bargo, las repeticiones de dinucletido. bastante utilizadas en el mapeo gentico, n
o s e emplean en los laboratorios de medicina forense, debido a la produccin d e
las denominadas "bandas shadow" y "bandas slutter". La mayora de las STR utilizad
as son repeticiones de tetranucletido. Los Iragmentos ms pequeos de STR son ms aprop
iados para el anlisis por instrumentos automticos que los fragmentos de ADN ms gran
des de los sistemas de RFLP. El anlisis automatizado de STR emplea ADN marcado co
n fluorescencia. Los fragmentos de ADN migran a un detector, donde cualquier pro
ducto de amplificacin marcado se lee en tiempo real o se lee off-line en un escner
, tras completarse la electroforesis. El anlisis es bastante rpido debido a la amp
lificacin simultnea y al anlisis multiplexde grupos de sistemas genticos (Figs. 68-6
y 68-7).
1
2
3
4
5
6
7

s
> >
lo
41
Figura 68-5. Gel oe la P C Rm a n u a l del sistem a AFLP D1S80 q u em u e s t r
al o s productos del locus D1S80 procedentes de n u m e r o s o s individuos ti
pados m e d i a n t eG e n e A m pD e t e c lion System, seguidos por tincin con
plata. La escala allica del sistema A m p l i F L PD 1 S 8 0 comienza con el alel
o 14 y c o n t i e n e los alelos comprendidos entre el 16 y el 41. L o s carril
es 1. 4. 7 y 10 son la escala allica del s i s t e m a AmpliFLP D1S80; el carril
2 es un control de tipo 16,31: el carril 3 prsenla el tipo 24.37; el canil 5 pres
enta el tipo 18; el carril 6 p r e s e n t a el tipo 28.31: el carril 8 presenta
e tipo 1 8 , 2 5y el carril 9 p r e s e n t a el tipo 1 7 . 2 8

C A P I U I O 68

P R U E B A S F O R E N S E S D E I D E N T I D A D M E D I A N T E A N L I S I
S D E I ADN
1409
Figura 68-6. Imagen de gel generada por ordenador de un anlisis multiplex de STR
automtico a partir de numerosos individuos. Cada fragmento amplificado de telos ST
R s e ha marcado c o n un fluorforo. Se han amplificado simultneamente nueve siste
mas de STR. Aqu se demuestra la gran variacin existente entre los individuos.
Las STR fueron utilizadas en 1991 por el Armed Forces Institute o Pathology para
identificar a las vctimas de la Guerra del Golfo, pero slo de modo reciente estn di
sponibles comercialmente. Se venden como sistemas multiplex. en los cuales se an
alizan simultneamente varios locus genticos (es decir, STR). El poder de discrimin
acin que se consigue, mediante la combinacin de ocho o nueve sistemas, es similar
al de los anlisis de RFLP. Recientemente, el Federal Bureau o Investigatlon (FBI)
Technical Workmg Group on ADN Analysls Methods (TWGDAM). junto con el FBI's Comb
ined ADN Index System (CODIS) Workmg Group (el grupo de usuarios que supervisa l
a red informtica federal de base de datos del ADN). han publicado las paulas por
las cuales se emplearn las STR especficas en los perfiles de ADN de los delincuent
es condenados, para su inclusin en el CODIS. Se han seleccionado trece STR, con e
l objetivo de conseguir la potencia estadstica necesaria para identificar a un in
dividuo entre el gran nmero de perfiles de STR incluidos en la base de datos naci
onal. Cada STR de las que constituyen este grupo fue elegida de acuerdo con los
resultados de un estudio exhaustivo de colaboracin entre el FBI y el estado, quie
nes analizaron las STR disponibles en numerosos laboratorios bajo determinadas c
ondiciones. Los 1 3 locus de STR se han convertido en el mtodo estndar de anlisis p
ara el funcionamiento de la base de datos, as como para los estudios sistemticos d
e casos de individuos. Actualmente, se dispone de equipos de reactivos comercial
es que incluyen los 1 3 locus de STR (PE Blosystems Protiler/Coliler. Promega Po
wer Plex I & //).
Marcadores de gnero y del cromosoma Y
En la actualidad, la determinacin de gnero se realiza mediante el sistema de la am
elogenina. Se han reconocido otros marcadores de gnero, aunque no se utilizan de
forma generalizada, La amelogenina es til como determinante de gnero porque los al
elos del cromosoma X y del cromosoma Y son de distinto tamao, diferencindose en lo
s sistemas electroforticos. Por tanto, dos bandas indican un hombre y una sola ba
nda indica una mujer. La determinacin de gnero supone una innovacin frente al resto
de marcadores de identidad habituales, ya que proporciona informacin biolgica del
fenotipo especifico del individuo de origen. La informacin sobre el gnero de la m
uestra de ADN puede ser esencial en la investigacin de los posibles sospechosos.
La determinacin de gnero tambin es importante para clasificar las muestras como pro
cedentes de la victima o del sospechoso. Los marcadores polimrficos del cromosoma
Y se estn empleando en Europa, y estn investigndose en Estados Unidos, no para la
determinacin de gnero, sino porque parecen tiles en el tipado de los frotis vaginal
es, donde la fraccin femenina contamina el ADN del esperma. Tambin se pueden emple
ar para caracterizar el linaje paterno (del mismo m o d o que el ADN mitocondria
l se utiliza para caracterizar el linaje materno). La descripcin del linaje famil
iar de Thomas Jefferson se consigui empleando marcadores del cromosoma Y (Foster.
1998).

1410
SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
Figura 68-7. Electroferograma de STR de un grupo multiplex de S T R procedente d
e un solo individuo (el original es en color). L o s electroferogramas consisten
en una presentacin cuantitativa de los datos, u n a alternativa a la imagen virt
ual del gel, c o m o se m u e s tra en la Figura 68-6. El eje horizontal se m a
r c a con unidades de tiempo arbitrarias y el eje vertical con unidades de fluor
escencia arbitrarias. En este caso, se muestran nueve S T R y el m a r c a d o r
de gnero amelogenina. Todos las STR muestran dos picos que indican alelos hetero
cigotos (cada alelo se reprsenla en un cuadrado junto al nmero de repeticiones): e
l marcador amelogenina representa un homocigoto X que indica una mujer. Las reas
sombreadas indican las regiones en las cuales puede encontrarse el rango de alel
os para cada locus de STR. Los sistemas multiplex se construyen para ser disting
uidos mediante rangos de tamaos no superpuestos y separacin mediante colores (azul
, verde y amarillo).
Secuenciacin del ADN mitocondrial
La secuenciacin del ADN mitocondrial (ADNmt) es una tecnologa accesoria reciente,
que se aplica cuando existen cantidades muy pequeas de muestra de ADN o cuando ste
est muy degradado, sobre todo en pelo (que prcticamente no contiene ADN nuclear)
y en restos m u y reducidos (Butler. 1998a; Holland, 1999). El ADNmt tambin es til
cuando existen limitaciones de las muestras de referencia, ya que se puede util
izar un nico familiar distante como referencia de la lnea materna (el anlisis del A
DN nuclear requiere varios familiares cercanos). El ADNmt consta de una molcula c
ircular de ADN de 16.569 bp de longitud. Slo se tipan polimorfismos de la secuenc
ia, puesto que no contiene regiones significativas de ADN repetitivo. La regin de
l ADNmt que se analiza en la identificacin humana es el "bucle de desplazamiento"
("displacement loop") {D-loop). tambin conocido como "regin de control". Este loc
us abarca 1.100 bp y contiene dos regiones hipervariables. La secuenciacin direct
a es el mtodo ms eficaz para tipar el ADNmt, aunque tambin se han empleado los sist
emas de transferencia en mancha. Una sola clula contiene desde cientos a miles de
copias de ADNmt, pero slo una copia de ADN nuclear. Por tanto, cuando no puede u
parse el ADN nuclear, en algunas ocasiones, puede tiparse el ADNmt. Las mitocond
rias se heredan estrictamente de madre a hijo sin contribucin paterna, a diferenc
ia del ADN nuclear. Slo existe una nica secuencia de ADNmt en la clula ("homoplasmi
a"), mientras que el ADN nuclear se encuentra en pares de cromosomas. En consecu
encia, no hay recombinacin gentica. Una secuencia exacta de ADNmt se puede localiz
ar a travs del linaje materno de una familia durante numerosas generaciones. Sin
embargo, el poder de discriminacin de la secuenciacin del ADNmt est limitado, alred
edor de uno entre cientos. Esta prueba es muy cara, y se realiza actualmente en
m u y pocos laboratorios.
Inicialmente, los mtodos de STR empleaban tcnicas manuales de tincin con plata. En
la actualidad, el anlisis de STR se realiza mediante electroforesis capilar con d
eteccin fluorescente en tiempo real (p. ej., PE-Bio 310): en cambio, una pequea pa
rte de la comunidad realiza lectura del gel olf-tne mediante un escner (p. ej., Hi
tachi FMBio. Molecular Dynamics Fluorlmager. BioRad Multilmager). Para el funcio
namiento de las grandes bases de datos se emplean instrumentos multicanal de det
eccin en tiempo real (p. ej., PEBio 377 o 3700). Adems de la determinacin de los fr
agmentos, estos instrumentos tambin pueden utilizarse para la secuenciacin del ADN
(p. ej., anlisis del ADNmt). Los anlisis por espectrometra de masas por tiempo de
vuelo producen resultados de una gran precisin y de modo ms rpido (Butler, 1998b. 1
999). Los sistemas basados en microchip han originado un gran entusiasmo. Alguno
s dispositivos de microchip permitirn el anlisis del ADN de modo sistemtico (p. ej.

, Nanogen. Cepheid). Las tcnicas de Taqman y beacon molecular son mtodos alternati
vos de biologa molecular que se utilizan en las plataformas actuales. La automati
zacin completa no se limita a las plataformas de anlisis del ADN, Numerosos labora
torios emplean estaciones de trabajo robticas con circuito web, que pueden extrae
r, preparar y amplificar el ADN diana. Tambin han aumentando los sistemas de gest
in de la informacin del laboratorio (LIMS).
DEGRADACIN DEL ADN Y DAO AMBIENTAL
El ADN es una molcula resistente que puede tolerar un notable rango de temperatur
as, pH, concentracin salina y otros factores que destruyen los marcadores serolgic
os clsicos. La validacin inicial de pruebas, realizada por los laboratorios de med
icina forense, demostr que la mezcla de ADN con detergentes, aceites, gasolinas y
otros adulterantes, no alteraba su tipado. No obstante, el ADN de la mayora de m
uestras sufre una progresiva fragmentacin aleatoria o "degradacin", que transforma
el ADN de alto peso molecular en ADN de bajo peso molecular (Kobilinsky, 1992).
La fragmentacin del ADN se debe fundamentalmente a la accin de enzimas autolticas
tras la muerte celular, pudiendo participar tambin las desoxirrbonucleasas bacteri
anas. Transcurridos unos das, prcticamente no se aisla ADN de alto peso molecular
de los tejidos. El ADN de alto peso molecular procedente de materiales desecados
o congelados puede conservarse durante aos. Fragmentos residuales ms pequeos de AD
N pueden persistir a pesar de la degradacin. El ADN mitocondrial suele conservars
e cuando ya no se puede
Instrumentacin
Aunque la comunidad ha escogido un grupo de locus de STR para el anlisis sistemtic
o, las plataformas instrumentales en las que se realiza el anlisis no se han deci
dido. Las pruebas de RFLP se realizaban como tcnicas manuales muy laboriosas. La
primera instrumentacin automatizada utilizada por la comunidad forense fue el lec
tor de imagen computarizado para la autorradiografa de RFLP. La tecnologa basada e
n la PCR, junto a la separacin de fragmentos, transferencia en mancha y secuencia
cin, son ms fciles de automatizar.

CAPTULO 68

PRUEBAS FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL ADN

1411
recuperar ADN nuclear, debido a su elevado nmero de copias (a menudo miles en cad
a clula). En consecuencia, el anlisis de ADNmt se emplea en la identificacin de res
tos de esqueletos antiguos. Se puede producir una degradacin rpida o un dao en el A
DN bajo determinadas circunstancias (Parsons, 1997). La hidrlisis qumica del ADN e
s muy lenta y normalmente no es significativa. Sin embargo, los iones metlicos pu
eden catalizar la hidrlisis oxidativa. L a radiacin ultravioleta origina dimerizac
in de timidina. Se ha descrito la despurinacin en el "ADN antiguo". A pesar de la
fragmentacin, la informacin de la secuencia an est presente dentro de los fragmentos
de ADN. La degradacin afecta sobre todo a las pruebas basadas en la determinacin
de Iragmentos y a las pruebas que requieren secuencias grandes. Las pruebas trad
icionales de RFLP requieren ADN de alto peso molecular no degradado, mientras qu
e los anlisis de PCR pueden realizarse en muestras degradadas: se puede obtener A
DNmt a partir de restos de esqueletos en los que no puede recuperarse ADN nuclea
r.
do adecuado de almacenamiento de algunas muestras de ADN (p. ej., gotas de sangr
e y huesos). Los tejidos fijados con formalina no son apropiados, aunque pueden
emplearse para el anlisis de ADN por PCR. No debe desecharse ningn tejido ni liqui
do biolgico sin un previo anlisis de ADN.
EXTRACCIN DEL ADN
El paso inicial y ms crtico en cualquier prueba de ADN es la extraccin de ste a part
ir de la sangre u otras fuentes biolgicas. El ADN procedente de una muestra de sa
ngre, un frotis vaginal u otra fuente histolgica, debe aislarse de otros componen
tes celulares y contaminantes ambientales mediante una tcnica de extraccin. El mtod
o clasico y ms usual es la extraccin con cloroformofenol y la posterior precipitac
in con etanol. Es un mtodo eficaz y fiable que ha resistido el paso del tiempo, au
nque es engorroso. Un nuevo mtodo ms simple y rpido es el mtodo "Chelex" (Walsh, 199
1). La muestra se hierve para liberar su contenido celular y posteriormente se aa
de Chelex-100 que fija los iones metlicos, inactivando nucleasas y polimerasas. S
e obtiene bastante ADN. aunque relativamente de escasa pureza; no obstante, es s
uficiente para la mayora de pruebas basadas en la PCR. Est aumentando el uso de la
extraccin con columna en fase slida (p. ej., las columnas Quiagen) c o m o medio
de purificacin, sobre todo cuando se trabaja con grandes volmenes de muestras. El
ADN obtenido es mucho ms puro que el separado con Chelex. sin embargo, es relativ
amente caro. Pueden ser eliminados contaminantes como los encontrados en cigarri
llos y en ciertas pinturas. El empleo de partculas de silicona es otro excelente
mtodo de purificacin del ADN cuando se precisa eliminar inhibidores. Numerosos lab
oratorios eliminan la fase de extraccin mediante la realizacin de la PCR directame
nte a partir de un triturado del material manchado. Esta tcnica es la ms empleada
en papeles de liltro con manchas conocidas de sangre, procedentes de muestras de
bancos de datos de delincuentes. Los frotis vaginales representan una considera
cin especial de extraccin El ADN masculino se separa del ADN femenino mediante un
proceso de lisis diferencial (Crouse, 1993). La traccin femenina se obtiene fcilme
nte a partir de las clulas epiteliales, por un procedimiento de extraccin estndar.
La fraccin masculina se obtiene mediante la rotura de los puentes de hidrgeno de l
a cpsula protectora del espermatozoide con una solucin de ditiotreitol (DTT). Este
sistema es eficaz en el anlisis de RFLP. para el cual se desarroll inicialmente;
sin embargo, los sistemas ms sensibles basados en la PCR presentan "contaminacin"
femenina en la fraccin masculina.
RECOGIDA DE MUESTRAS

L a obtencin apropiada de muestras es m u y importante en la medicina legal. En l

a escena del crimen, se debe reconocer la prueba antes de recogerla adecuadament
e. Esto se suele conseguir con la ayuda de sustancias qumicas que hacen visibles
las gotas de sangre. El patrn de salpicaduras de sangre se emplea para ayudar al
investigador a interpretar y recoger de un modo inteligente las muestras procede
ntes de una pltora de gotas de sangre. La documentacin adecuada de la custodia, el
embalaje y el precintado son tan importantes como la recogida inicial. Los lquid
os biolgicos derramados en artculos que pueden recogerse (p. ej., sangre en un tro
zo de ropa) se deben obtener y empaquetar por separado. Cuando los lquidos biolgic
os estn depositados sobre superficies u objetos que no pueden recogerse, el liqui
do se obtiene limpindolos con torundas estriles humedecidas con agua destilada estn
l, hasta que la mancha sea recogida en su totalidad. Se ha descrito una tcnica pa
ra las marcas de mordiscos en el cuerpo (Sweet, 1997), que consiste en lavar con
una torunda humedecida y a continuacin utilizar una torunda seca. Se debe recoge
r una torunda de control a partir de zonas no manchadas adyacentes a la mancha d
e lquido. Las torundas de las manchas y las torundas de control se secan al aire
y se empaquetan por separado. La sangre no coagulada procedente del organismo si
gue siendo la muestra de eleccin para los laboratorios de ADN; tambin la sangre an
ticoagulada con cido etilendiaminotetraactico (EDTA) y citrato-fosfato-dextrosa (C
PD). La sangre anticoagulada con hepanna no se recomienda para la prueba de ADN.
Aunque los glbulos rojos maduros no poseen ADN (ni nuclear ni mitocondrial). se
obtiene bastante ADN de la circulacin a partir de los leucocitos. A pesar de que
el hemo inhibe la reaccin de la PCR, la sangre es una buena luente de ADN para la
prueba de PCR, ya que la actividad inhibitoria del hemo se diluye fcilmente. No
obstante, en caso de una putrefaccin significativa, se prefieren otras fuentes de
ADN. Prcticamente cualquier tejido puede emplearse para el tipado de ADN. Alguno
s tejidos de los que podra pensarse que son mejores fuentes de ADN debido a su ma
yor densidad celular y. por tanto, mayor concentracin de ADN, en la prctica son me
nos recomendables debido a su mayor velocidad de degradacin posmortem (Kobilinsky
, 1992). Entre los tejidos blandos, el ADN heptico se degrada rpidamente mediante
enzimas autolticas. mientras que el tejido cerebral constituye una buena fuente e
n periodos de tiempo intermedios posmortem. El hueso y los dientes son las fuent
es ms estables de tejido posmortem. Se obtiene ADN informativo a partir de restos
de esqueletos con decenas de aos. Generalmente, cuanto ms tiempo transcurrido pos
mortem y mayor descomposicin del cuerpo, la degradacin del ADN procedente de los t
ejidos del cadver es mayor. Hay que tener un especial cuidado para evitar la cont
aminacin de la muestra por otras fuentes de ADN. Las muestras se deben recoger ut
ilizando guantes e instrumentos estriles. Siempre que sea posible, se debe obtene
r una biopsia de tejido no expuesto mediante una incisin. Las muestras se mantend
rn refrigeradas, preferiblemente congeladas (aunque las congelaciones y descongel
aciones repetidas destruyen los fragmentos grandes de ADN). La desecacin, incluso
un sencillo secado al aire, puede ser un mtoNORMAS DE GARANTA DE LA CALIDAD
Los laboratorios que realizan anlisis forenses de ADN son conscientes de que las
normas forenses son muy estrictas y cuentan con la posibilidad de exmenes judicia
les exhaustivos de sus procedimientos y prcticas. Existe un acuerdo general sobre
los procedimientos de laboratorio apropiados para los anlisis forenses de ADN. L
a comunidad forense es pequea y esl bien comunicada: aunque los mtodos de tipado de
ADN no estn estandarizados, los procedimientos son bastante uniformes. Cualquier
variacin significativa o aparicin de un nuevo mtodo requiere una validacin. El FBI'
s TWGDAM. actualmente conocido como Scientitic Workmg Group on ADN Analysls Meth
ods (SWGDAM). public las pautas iniciales de los procedimientos analticos del ADN
que se convirtieron de tacto en normas ( Technical Worklng Group. 1989,1995). Es
tas normas fueron modificadas por el FBI's DNA Advisory Board (DAB) y aceptadas
por el FBI Director de conformidad con el DNA Idenlilicalion Acl. un componente
del proyecto de ley Crime, aprobado en 1994 (Federal Bureau ol Investigalion. 19
98). Estas normas suponen la pnmera regulacin gubernamental en el campo de la cri
minalistica, aplicndose a los laboralonos criminalsticos que remiten los resultado
s del ADN al F8/'s National DNA Index System o que admiten ciertas cesiones fede

rales. La American Society ol Crime Laboratory Directors (ASCLD) tiene un progra

ma de acreditacin de los laboratorios de criminalstica. El American Board ol Crimi
nalists (ABC) certifica a los criminalistas; adems tiene una categora especial par
a los analistas de ADN. Los analistas que trabajan en muestras de casos de indiv
iduos deben estar colegiados (o equi-

1412
S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR
valenle) en gentica, bioqumica y biologa molecular, y deben tener un ao de experienc
ia en biologa forense. Todas estas normas requieren pruebas de competencia, dispo
nibles comercalmente (es decir, Coltege of American Pathologisls. Cellmark Diagno
slies y Collaborative Tesling Services) dos veces al ao para cada analista. Las c
omparaciones entre laboratorios han demostrado una gran precisin en las pruebas d
e RFLP realizadas por la comunidad forense de tipado del ADN. El estudio de comp
etencia informa de las determinaciones medias del tamao de los fragmentos de RFLP
que difieren en unas pocas bases y el rango de resultados situado dentro del in
tervalo de confianza 2.5%, empleado en la mayora de los laboratorios de criminalst
ica (Mudd, 1994). La exactitud y la reproducibilidad de las diferentes pruebas b
asadas en la PCR tambin son bastante buenas.
DESAFOS LEGALES
Nunca antes una prueba cientfica haba supuesto un desafo legal tan grande y tan div
ulgado como la prueba de ADN. La prueba de ADN es tan potente que la defensa no
ha tenido ms remedio que acometer la prueba con gran vigor. El drama del tribunal
se ha forjado en gran parte por las personalidades significativas implicadas. E
l furor pblico del debate legal ha conducido a percepciones errneas por el pblico p
rofano acerca de la controversia que rodea a la tecnologa; aunque los casos legal
es son un mal camino para evaluar cualquier tecnologa, los temas legales no son c
uestiones cientficas (Wooley, 1992). A pesar de los desafos del tribunal (Roberts,
1991,1992), la comunidad forense ha acogido esta tecnologa y la aceptacin judicia
l es actualmente habitual (Office of Technology Assessment, 1990; National Resea
rch Council, 1992,1996: Attorney General Jane! Reno's National Commisston on the
Future olADN Evidence, sitio web). El primer desafio significativo y satisfacto
rio para la prueba de ADN fue el caso de Nueva York contra Castro en 1989, basad
o en la percepcin del juez de que el anlisis se haba realizado sin el rigor suficie
nte (People v Castro, 1989).
lidad de una coincidencia al azar. La discusin cientfica trata sobre lo grande que
debe ser la estadstica, a menudo sutilezas sobre diferencias de un par de rdenes
de magnitud en estimaciones de 1 entre 1 0 billones; aunque, a menudo, los tribu
nales han percibido la discusin como una falta de consenso y han dictaminado la i
nterpretacin estadstica como totalmente inadmisible. Actualmente, existe un acuerd
o general entre los genetistas de poblacin y los estadistas sobre la validez de l
a estadstica, disminuyendo los desafos de la defensa en este tema (Chakraborty, 19
91; Lander, 1994). Una mezcla sustancial de datos de tipados del ADN, procedente
s de poblaciones aisladas, demuestra que la variacin entre los individuos es bast
ante mayor que la variacin entre los grupos de poblacin; en consecuencia, las frec
uencias generadas a partir de grandes grupos raciales son estimaciones suficient
es. El National Research Council (NRC) ha publicado dos informes sobre el anlisis
de ADN, dirigidos particularmente a temas estadsticos (National Research Council
, 1992, 1996). El segundo informe del NRC indica pautas especficas sobre el mtodo
estadstico de tratamiento seguido en la actualidad por los laboratorios criminalst
icos (Technical Working Group. 1990; Attorney General Janet Reno's National Comm
ission on ADN Analysis Methods, sitio web). Hoy en da, la defensa raramente desafa
la admisin de la prueba de ADN, aunque reta, en menor medida, el peso de la prue
ba. El empuje de la defensa se dirige a la garanta de calidad, a la tasa de error
es y, en el caso de las pruebas de PCR. a temas de contaminacin. Por otra parte,
la recogida de pruebas y la manipulacin son objeto de mayor impugnacin que la prue
ba por s misma. Por ejemplo, la fundacin de la defensa de O. J. Simpson postul que
la prueba haba sido colocada o manipulada. Por supuesto, se desafiar nuevamente a

la tecnologa, le mismo que se introducen nuevos mtodos de tipado del ADN. Finalmen
te, hay que reconocer que la prueba de ADN es ms eficaz que los relatos de testig
os presenciales y las pruebas de confesin.
BASES DE DATOS DE ADN
A lo largo de la historia, no se han podido investigar un gran nmero de casos, so
bre todo de abusos sexuales, debido a la falta de sospechosos. Los El a c u s a
d o Jos Castro y s u sa b o g a d o s defensores Neufeld y S c h e c k organizaro
n agresores sexuales son conocidos por presentar una alta tasa de reincidencia;
el p r i m e r desafio con xito a la admisin de la p r u e b a de ADN. En 1987, el
seor por ello, algunos estados empezaron a establecer bancos de datos de abusaCa
stro, un hombre hispano de 38 aos de edad, fue acusado del apualamiento dores sexu
ales, que se utilizarn para comparar perfiles serolgicos de conoh a s t al am u e
r t e de su v e c i n aV i l m aP o n c e y de su hija de 2 aos de edad. Una pequ
ea g o t a de s a n g r e del reloj que levaba el seor Castro le analizada por la c
idos agresores sexuales con pruebas de casos de abusos sexuales. Aunque Ufecodes
Corporation, determinndose que no perteneca a Castro, aunque si coinesto fue til e
n numerosas ocasiones, la eficacia de los bancos de datos estacida con la sangre
de la vctima. La posibilidad de que otro h o m b r e hispano escogiba obstaculiza
da por el bajo poder de discriminacin de la prueba serolgica do al azar tuviese el
m i s m o perfil de A D N le de 1 entre 1 8 9 millones. El juez decladel semen.
Sin embargo, el anlisis de ADN, debido a su mayor poder de disr ser admisible la p
rueba de que el ADN no coincida con el de Castro, a u n q u e la criminacin, ha au
mentado el poder investigador de tales bancos de datos al p r u e b a de que ste
coincida con el ADN de P o n c e no le a d m i t i d a debido a fallos nivel de lo
s archivos de huellas digitales. del laboratorio en el e m p l e o de tcnicas de
anlisis aceptables. N o obstante, frente A partir de junio de 1998, todos los est
ados tienen la obligacin de poseer ao t r a prueba, el seor Castro se declar culpab
le de los asesinatos a finales de una base de datos de delincuentes condenados.
La mayora de bancos de 1989. Tras l a conclusin del estudio y la declaracin d e cul
pabilidad, el juez Shendlm se inclin s o b r e el asiento y pregunt al a c u s a d
o si la sangre era de la vcdatos estatales obtienen y tipan muestras de ADN proce
dentes de delincuentima, a lo que l contest que si, c o n f i r m a n d o los resu
ltados de la prueba de ADN tes sexuales condenados. Tambin suelen incluirse los d
elincuentes violentos [People v Castro. 1989). condenados, sobre todo los autore
s de homicidios. La tendencia es ampliar el requerimiento de la obtencin de muest
ras de ADN en los delitos. A menudo, los delincuentes violentos ya han sido cond
enados por delitos anteriores. La La tecnologa forense del tipado de ADN ha exper
imentado progresos sigrecopilacin no slo sirve para capturar a grandes delincuente
s, sino tambin nificativos y mejoras a partir de los procedimientos de garanta de
calidad para intervenir antes de que se intensifique la conducta criminal del au
tor. (Mudd, 1994). Las autorradiografias de los casos iniciales, como las de Cas
tro, no son representativas de las autorradiografias de calidad obtenidas poster
iormente por la comunidad forense. Del mismo modo, los argumentos de la defensa
han evolucionado con el tiempo. Inicialmente, la defensa desafiaba la validez de
la tecnologa en s misma, aunque esto nunca ha sido un argumento vlido. La estrateg
ia de la defensa que mayor xito reuna estaba en el reto de la interpretacin estadsti
ca de una coincidencia de ADN. Aunque han planteado muchos condicionantes estadst
icos, los argumentos actuales se han centrado en "la subestructura" y en el empl
eo de bases de datos adecuadas de frecuencias de poblacin; sta debera ser una base
de datos caucsica, una base de datos italiana o una base de datos de Nueva York.
Las diferencias en las frecuencias allicas entre los subgrupos tnicos pueden subes
timar la posibiLos bancos de datos facilitan la comparacin de casos y sospechosos
a travs de organismos y limites jurisdiccionales, incluso sin pistas o sospechas
. El FBI ha creado un sistema de soware, el Combined ADN Index System (CODIS) y u
na red, conocida como National ADN ndex System (NDIS). que permite a las jurisdic
ciones comparar perfiles de ADN de casos de individuos sospechosos conocidos y d
e sospechosos desconocidos, con bases de datos de delincuentes condenados. El Re
ino Unido ha tomado medidas ms drsticas para establecer u n a completa base de dat

os
de
os
ir

nacional de ADN de criminales. Las muestras se obtienen de un rango ms amplio

categoras de delitos, a diferencia de la mayora de programas estatales de Estad
Unidos, que se centran en los abusos sexuales. Las muestras se recogen a part
de detenidos, mientras

Nueva York contra Castro

C A P T U L O 68

P RUEBAS
F O R E N S E S DE I D E N T I D A D M E D I A N T E
ANLISIS
DEL
ADN
1413
que en Estados Unidos slo se obtienen de condenados. Los britnicos afirman que las
posibilidades de encontrar al autor de un crimen, mediante una coincidencia de
ADN, son de uno entre cada dos delitos (Weedn. 1998b).
BIBLIOGRAFA
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Apndices
Soluciones fisiolgicas, tampones, indicadores cido-base, materiales de referencia
estndar y tabla de conversin de temperaturas.
Pesos ideales, superficie corporal e ndice de masa corporal (IMC)
Clculo aproximado del volumen sanguneo total (VST)
Tabla peridica de los elementos
Unidades del Sistema Internacional (SI)

A P N D I C E
Soluciones fisiolgicas, tampones, indicadores cido-base, materiales de referencia
estndar y tabla de conversin de temperaturas
SOLUCIONES FISIOLGICAS
Una solucin fisiolgica es aquella que contiene varias sales a una concentracin apro
ximadamente equivalente a la de los lquidos corporales del hombre. La ms sencilla
es la solucin salina fisiolgica que tiene la misma presin osmtica que la sangre. Tam
bin existen soluciones ms complejas, como por ejemplo, las que mantienen a los tej
idos en un estado de metabolismo activo durante periodos prolongados. La Tabla A
1-1 proporciona las frmulas de algunas soluciones isotnicas en relacin a la sangre.
Como la concentracin total de tampn/litro es de 0,1 M [acetato] + [cido actico] =
1 M Sustituyendo el valor del acetato en la Ecuacin 2; 1,38 [cido actico] + [cido
ico] = 0,1M Por tanto, [cido actico] = 0,042 M [cido actico] = 2,52 g/l [acetato]
= 0,058 M = 4,76 g/l Ejemplo 2. Si se mezclan 648 mi de cido dietilbarbitrico 0,02
5 M y 10 mi de dietilbarbiturato sdico 0,5 M y se diluyen hasta un litro, calcula
r el pH de la solucin (pK del cido dietilbarbitrico = 7,98 y concentracin molar =
les/litro). Existe la siguiente relacin entre la molandad y el volumen de una sol
ucin: M1V1 = M2V2 (3) (2)

0,
act
'
mo

TAMPONES*
Los tampones permiten controlar los cambios de pH. En general, los tampones estn
compuestos por un cido dbil y su sal o por una base dbil y su sal. La ecuacin de Hen
derson-Hasselbach pH = pK + log [sal]/[cido] (1)
donde M1 = molaridad de la solucin inicial V1 = volumen de la solucin inicial M2 =
molaridad de la solucin final V2 = volumen de la solucin final Emplear la Ecuacin
3 para calcular los cambios de concentracin de la sal y el cido despus de diluir ha
sta un litro: [dietilbarbiturato sdico] = 0,025 x 0,648 = 0,0162 mol/l [cido dieti
lbarbitrico] = 0,5 x 0,01 = 0,005 mol/1 Calcular el pH de la solucin mediante la E
cuacin 1:
es til para calcular la relacin entre el cido (o base) y su sal correspondiente y e
s necesaria para obtener el pH deseado de un sistema tampn. Ejemplo 1. Si sabemos
que el pH de un tampn acetato 0,1 M es de 4,9; calcular la concentracin de cido act
ico y acetato sdico del tampn (pK del cido actico = 4,76). Sustituyendo los valores
de pH y pK en la Ecuacin 1: log [acetatojVfcido actico] = 4,9 - 4,76 = 0,14 |acetat
o]/[cido actico] = 1,38 acetato] = 1,38 [cido actico]
' Para un anlisis razonado, que incluye la preparacin de soluciones lampn con una l
uerza inica definida, consultar Bates RG: Determination ot pH-Theory and Practice
, 2nd ed. New York. John Wiley and Sons, 1973.
pH =7,98-log (0,0162/0,005) = 7,98 - log 3.24 = 7,98 - 0,51 = 7,47 La mxima capac
idad tampn se obtiene en el valor de pK del cido o la base dbiles. Por ejemplo, en
el caso del cido actico con un pH de 4,76, es necesaria una mayor cantidad de cido
para modificar el pH de un tampn acetato desde 4,76 hasta 4,66 que desde 4,2 hast
a 4.1. La capacidad de tamponamiento eficaz abarca un rango de pH de, aproximada
mente, una unidad a ambos lados del valor de pK del cido o base dbiles. En el caso
del cido actico, sta se sita entre pH 3,8 y pH 5,8.
Tabla A1 -1
Soluciones fisiolgicas Salina Solucin de Locke 0,9 g 0,024 g 0,042 g 0,01-0,03 0,0
1-0,25 g

Solucin de Ringer 0.7 g 0,0026 g 0,035 g Solucin de Tyrode 0,8 g 0,02 g 0,02 g 0,1
g 0,1 g 0,01 g 0,005 g

Cloruro 0,85 g sdico Cloruro calcico Cloruro potsico Bicarbonato sdico o-Glucosa Cl
oruro de magnesio Fosfato monosdico Agua destilada 100 mi
Tampones fosfato de Sorensen
En general, estas soluciones tampn son tiles porque el rango de las mezclas vara en
tre pH 5 y 8. Pareparar soluciones 0,1 M de fosfato potsico monobsico (13,6 g/l) y
fosfato sdico dibsico (14,2g/l). Mezclar ambas soluciones en las proporciones ind
icadas en la Tabla A1-2 para oblener el pH deseado del tampn.
100 mi
100 mi
100 mi

1418
Tabla Al-2
;
APNDICES
Tabla de S o r e n s e n para la mezcla d e t a m p o n e s KHjPCJ, Solucin (mi)
9,75 9,5 90 8,0 7.0 6.0 5.0 4.0 30 2.0 1.0 0,5 PH 5.288 5.589 5,906 6,239 6.468
6.643 6.813 6.979 7.168 7.381 7.731 8.043
Tabla A1-3 T a m p n tris (hidroxymetil) a m i n o m e t a n o mi 0,1 N HCI aadid
os 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 200 225 25.0 275 30.0 32 5 35.0 37.5 40.0 42.5 45
,0 pH resultante a23C 9,10 8,92 8,74 8.6? 8,50 8.40 8,32 8.23 8,14 8,05 7,96 7,87
7,77 7,66 7,54 7,36 7,20 pH resultante a 37 C 8,95 8,78 8.60 8,48 8.37 8.27 8.1
8 8.10 8.00 7.90 7.82 7,73 7,63 7,52 7,40 7,22 7,05
NA..HPO Solucin (mi) 0.25 0,5 1.0 2.0 3.0 4.0 5,0 6.0 7.0 8.0 9.0 9,5

Tabla A1 -4 Indicadores c i d o - b a s e COLOR Indicador"' Azul de timol (A) Na

rania de melilo (B) Azul de bromolenol (A)' Verde de Bromocresol (A)' Rojo de me
tilo (A)' Prpura de Bromocresol (A) Azul de Bromotimol (A) Rojo lenol (A)" Rojo n
eutro (B) Azul de Timol (A)' Fenolftaleina (A) Timolftaleina (A)
1 1
Rango de pH 1.2-2.8 3.1-4,4 3.0-4.6 4,0-5.6 4.4-6.2 5.2-6.8 6.2-7.6 6.4-8.0 6.88.0 8.0-9.6 8.0-10.0 9.4-10,6
Cantidad de indicador por 10 mi 1-2 golas de solucin acuosa al 0.1% 1 gota de sol
ucin acuosa al 0,1% 1 gota de solucin acuosa al 0,1 % 1 gota de solucin acuosa al 0
.1 % 1 gota de solucin acuosa al 0,1 % 1 gota de solucin acuosa al 0,1 % 1 gola de
solucin acuosa al 0,1 % 1 gola de solucin acuosa al 0,1% 1 gota de solucin al 0.1%
en alcohol al 70% 1-5 gotas de solucin acuosa al 0,1% 1-5 gotas de solucin al 0.1
% en alcohol al 70% 1 gota de solucin al 0.1% en alcohol al 90%
cido Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Roio Amarillo In
colora Incolora
Alcalino Amarillo Naranja Azul-violeta Azul Amarillo Violeta Azul Rojo Amarillo
Azul Roja Azul
1
Las letras A o B que figuran a continuacin del nombre del indicador significan qu
e el indicador es un acido o una base respectivamente ' Para el rango cido i Sal
sdica Para ei rango alacaimo
1
/ Tabla A1-5 cidos - y lcalis d e u s o f r e c u e n t e '
Solucin Concentracin de HCL Concentracin de H,SO Concentracin de HNO, Concentracin de
cido lctico Concentracin de cido actico glacial Concentracin de NH,,OH
;
Peso molecular 36,46 98,08 63.02 90.08 60.08 35,05
Densidad especifica' 1,19 1,84 1,42 1.21 1.06 0,90
g/l' 440 1.730 990 1 030 1 060 250

Molaridad' 12 18 16 11 17.5 15
Normalidad' 12 3 1 6 11 17,5 15
Cantidad aproximada de mi para obtener 1.000 mi de una solucin 1 N 83 28 64 87 57
67
" Disponible comercialmonte ' Las cifras pueden variar ligeramente dependiendo d
ol lote o labricante
Tampn de tris (hidroximetil) aminometano*
El lampn de tris (hidroximetil) aminometano se utiliza en un rango de pH entre 7,
0 y 9,0, pero su mejor capacidad tampn se sita entre 7,5 y 8,5. Es prcticamente ine
ficaz por debajo de pH 7,0 y por encima de pH 9,0. Una de las ventajas de este t
ampn es su excelente estabilidad. El
* Cuando se requieren tampones de molaridad superior, sustituir el HCI 0.1N por
HCI 1N.
tampn puede prepararse pesando la cantidad apropiada de tris (hidroximetil) amino
metano, disolvindola en agua, y ajustando el pH hasta el valor deseado con HCI. P
or ejemplo, si se quieren obtener 100 mi de tampn 0,05 M, se colocan 0,6057 g de
tris (hidroximetil) aminometano en un Irasco volumtrico de 100 mi. Se disueleven
en unos 50 mi de agua. Se aade el HCI 0,1N, tal y como se indica en la Tabla A1-3
. y se enrasa hasla el volumen final con agua destilada. La tabla muestra los va
lores de pH obtenidos al mezclar 0.6057 g de tris (hidroximetil) aminometano dis
uelto en agua con las cantidades indicadas de HCL 0.1 N y diluido con agua hasta
100 mi de volumen final.

APNDICE 1

SOLUCIONES FISIOLGICAS, TAMPONES, INDICADORES C I D O BASE,

1419
Tabla A 1 - 6 MRE 40h 83d 84k 136e 350a 723c 911b 912a 913 914a 915a 916a 917a 9
18a 919a 930e 931 934 937 955b
Materiales de referencia estndar ( M R E ) p a r a d e t e r m i n a c i o n e s
clnicas Tipo de MRE % de la fraccin estoiquiomtrica de pureza de masa 99,972 99,992
6 99,9911 99,984 99,9958 99,901 99.8 99,9 99.7 99,7
99.9

Uso certificado Estndar reduclomtrico Estndar reductomtrico Estndar acidomtrico Estn

de oxidacin Estndar acidomtrico Estndar acidimtrico Identidad y pureza Identidad y p
ureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y purez
a Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Rango de longitud de
onda (440-635 nm Rango de longitud de onda (302-678 nm Temperatura
Cantidad de unidad (iNg) 60 60 60 60 30 50 2,0 25 10 10 20 01 25 30 30 3 filtros
Ampollas Uno de cada 50 Conjunto de 4 ampollas

Oxalato sdico Trixido de arsnico Ftalalo polsico cido Dicromato potsico cido benzoic
ris (hidroximetil) aminometano Colesterol Urea cido rico Creatinina Carbonato calc
ico Bilirrubina D-Glucosa (dextrosa) Cloruro potsico Cloruro de sodio Filtros de
vidrio, transmitancia Filtros lquidos, absorbencia Termmetros clnicos de laboratori
o (0, 25. 30, 37) Hierro (metal) Plomo en sangre
98,3 99.7
99,9817
99,89
99.90
Tabla A1 -7 Centgrado 110 100 95 90 85 80 75 70 65 60
!)h
C o n v e r s i n de t e m p e r a t u r a s Fahrenheit 230 212 203 194 185 176 1
67 158 149 140 131 122 113 111.2 109.4 107,6 1058 104,9 104 103.1 102.2 101.3 1F
= -17,2C 1C = 33,8F Centgrado 38" 37,5 37 36,5 36 35,5 35 3 4 33 32 31 30 25 20 15 1
0 +5 0 -5 -10 -15 -20 Fahrenheit 100,4" 99.5 98,6 97.7 96,8 95,9 95 93,2 91,4 89
,6 87,8 86
7
50
Ah
7
44 43 42 41 40,5 40 39,5 39 38,5
68 59 50 41 32 23 1 4 +5 -4
Para convertir los grados Fahrenheil en centgrados, restar 32 y multiplicar por 0
.555. Para convertir los grados centgrados en Fahrenheil. multiplicar por 1,8 y s
umar 32

INDICADORES CIDO-BASE*
Un indicador cido-base es un cido dbil o una base dbil, que en estado no disociado p
resenta un color y composicin diferentes a los de la forma ionizada. El cambio de
color se produce en un rango estrecho de concentracin de iones de hidrgeno. Este
rango se denomina intervalo de cambio de color y se expresa en trminos de pH (log
aritmo negativo de la concentracin de iones de hidrgeno). Gran nmero de sustancias
presentan propiedades de indicador, sin embargo, son pocas las empleadas en la p
rctica para neutralizar reacciones y determinar el pH. La Tabla A1-4 muestra algu
nos indicadores cido-base de uso frecuente. En general, los cidos dbiles deben titularse en pre
sencia de indicadores que cambian en soluciones levemente alcalinas. Las bases db
iles deben titularse en presencia de indicadores que cambian en soluciones levem
ente acidas. La Tabla A1-5 incluye ciertos cidos y lcalis de uso comn. La disponibi
lidad de medidores de pH de precisin permite titular el pH deseado y puede rempla
zar el uso de indicadores en determinadas aplicaciones. Dean JA (ed): H a n d b
o o k ot Chemistry, 1 3 t h ed. N e w York, McGraw-Hil, 1985. F a s m a n GD (ed
): H a n d b o o k of Biochemistry and Molecular Biology. 3rd ed. Cleveland. CRC
Press, 1976. Meinke WW: Standard Reference Materials for Clinical Measurements.
Anal C h e m 1971;43:28A. The M e r c k Index: An Encyclopedia of Chemicals and
Drugs. 1 2 t h ed. Whitehouse Station. NJ. M e r c k and Co., 1996.
B a s a d o en D e a n JA (ed): H a n d b o o k ol Chemistry, revised 1 3 t h ed.
N e w York, McGraw-Hil, 1985.

P e s o s ideales, superficie corporal e ndice de masa corporal (IMC)

Tabla A2-1
C o m p a r a t i v a de las tablas de peso-estatura a partir d e datos actuaria
les: r e c o m e n d a c i o n e s de la c o m p a a d e seguros d e vida Metrop
olitan sin corregir por e d a d y r e c o m e n d a c i o n e s edad-especficas d
el centro de investigacin gerontolgica
METROPOLITAN 1983 PESOS* 25-59 a o s Hombres Mujeres 45-59 46-61 47-62 56-66 5767 58-68 59-70 59-72 60-74 61-76 62-78 63-79 64-81 65-83 67-85 68-87 69-89 71-92
48-64 49-65 50-67 52-69 53-71 54-73 56-74 57-76 59-77 60-78 61-80 CENTRO DE INV
ESTIGACIN GERONTOLGICA" (RANGO DE PESO E D A D - E S P E C F I C O PARA HOMBRES Y
MUJERES) 20-29 a o s 38-50 39-52 41-54 42-56 44-58 45-59 46-61 48-64 49-65 51-67
53-69 54-71 55-73 57-76 59-78 60-80 62-82 64-84 65-87 30-39 a o s 42-54 43-56 4
4-58 46-59 48-62 49-64 51-66 52-68 53-70 54-72 55-74 59-76 61-78 62-81 64-83 6685 68-88 69-90 71-93 40-49 a o s 45-58 47-59 48-61 50-64 51-65 53-68 55-70 57-72
59-74 60-77 64-79 64-81 66-83 68-86 69-88 71-91 73-93 75-96 78-99 50-59 a o s 4
9-61 50-63 52-65 54-67 55-69 57-72 59-74 61-76 53-79 65-79 67-81 68-83 71-86 7391 75-94 77-97 79-99 81-102 83-105 60-79 aos 52-64 54-67 56-69 58-71 59-74 61-76
64-78 65-79 67-81 71-83 72-89 73-91 76-94 78-97 80-99 83-102 85-105 87-108 89-11
1
Estatura (cm) 147 150 152 l!>!) 157 160 162 165 168 170 173 175 178 180 183 185
188 190 193
eV i d a Metropolitan (1983 Metropolian H e i g h ta n dW e i g h tT a b l e s .
S t a t Bull ' Los valores de e s t a tabla se refieren a estaturas m e d i d a
s sin calzado y pesos obtenidos sin ropa. La Compaa de Seguros d o m ou n a tabla
de estatura y p e s o en sujetos veslidos ( T a b l a 1). Meiropol Lile ins Co,
1983; 64 (|Jan-Jun]:2) present u n a tabla de estatura y peso t o m a d o s en su
jetos desnudos ( T a b l a 4), as c Ettinger WH Jr. Halter JB (eds): Principles
ol Geriatric M e d i c i n ea n d Geronde Andres R: Mortality and obesity: T h e
rationale for age-specific height-weight tables. In Hazzard WR. B i e r m a n E
L, Blass JP. tology. 3rd ed N e w York, McGraw-Hil, 1994. p847. reproduccin autor
izada.

APNDICE 2

PESOS IDEALES, SUPERFICIE CORPORAL E NDICE DE MASA CORPORAL ( I M C )

1421
Tabla A2-2 Tabla de ndice de masa corporal (IMC) Para utilizar esta tabla buscar
la estatura apropiada en la columna de la izquierda y localizar en esa lnea el pe
so. La cifra que figura en la parte superior de la columna correspondiente equiv
ale al IMC para ese peso y estatura. Se ha redondeado el peso en kilogramos IMC
1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Peso corporal (kilogramos) 147 150 152 155 157 160 163 165 168 170 173 175 178 1
80 183 185 188 190 193 36 41 43 44
--13
Estalura (cm)
47 49 50 52 54 55 57 58 60 62 64 65 67 69 71 37
-4 45 46 48 40 51 53 54 56 58 59 61 63 00 67 68 70 73 74 38
45
47
(9 50 52 54 55 57 59 61 63
4
66 68 70 /1 74 76 78 39
48 1 9 51 53 54 56 58 60 62 64 65 68 69 71 73 75 78
8 0
B2 40
50 52 54 55 57 59 0I 63 I 4 66 68 70 73 75 77 79 81 83
52
I-i
56 58 59 61 64 00
54 56 58
0 0
00' 04 66 68 70 72 74 77 79 81
07
69 72 73 76 78 80 83
56 58 60 62 64 00 68 71 73 75 78 80
59 60 63 64 67 69 73 76 78
61 63 65 67 69 72 74 76 78 81
80
63 65 67

00
65
0 ,7
72 74 77 79 81
69 72 74 79 82 84 87 89 92 95 98
07 69 70
41
80
83 80
B6
8 0
84 87 0) 92 94
8 8
91 93 96 99 102 104 46
8 8 ;
90 00 95 98 100 45
8 0
86 88 01 93 43
8 4
8 , 7 89 43
8,
4!
0 7
44
y4 86 B9 92 94 97 too oo 103 102 106 105 109 108 112 47 48
77 79 80 84 87 90 92 95 98 101 103 107 109 112 115 49
69 72 74 77 79 80 87
'JO
93 95 98 101 104 107 110 113 116 119 0o
72 74 76 79 82 84 87 90 93 96 98 101 104 107 110 113 116 120 123 51
73 76 79 82 84 87
8 0
93 95 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 52
76 79 8! 84 87 80 93 95 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 130
IMC
Peso corporal (kilogramos) 147 150 152 155 157 160 163 165 168 170 173 175 178 1
80 183 185 188 190 193 78 -I 83 B e 89 92 95 38 101 104 107 110 113 117 120 122

127 130 134 80 B 3 86 88 92 04 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 130 134 13
8 82 85 88 91 94 97 100 103 107 110 113 117 120 123 127 131 134 137 142 84 B 8 9
0 93 97 100 103 106 109 113 116 119 123 127 130 134 137 141 145 B . 7 30 93 96 9
9 102 105 109 112 116 119 122 126 130 133 137 141 145 149 80 92
JO
Estatura (cm)
98 102 105 108 112 115 118 122 126 129 133 137 140 145 148 15?
91 94 98 101 104 108 111 1 14 118 122 125 129 132 137 140 144 148 152 156
93 96 100 103 107 110 113 117 121 124 128 132 136 140 143 147 151 156 160
95 98 102 105 109 112 116 120 123 127 131 135 139 143 147 151 155 159 164
98 101 104 108 112 115 119 122 126 130 134 138 142 146 150 154 159 163 168
100 103 107 110 114 117 121 125 129 133 137
11
145 149 153 158 162 166 171
102 105 109 112 116 120 124 128 132 136 140 144 148 153 157 161 166 170 174
104 108 111 115 119 122 127 131 135 139 143 147 151 156 160 165 169 174 170
106 110 113 117 121 126 129 133 137 142 146 150 155 159 164 168 173 177 182
108 112 116 120 124 128 132 136 140 145 149 153 158 162 167 171 176 181 186
111 114 118 122 126 130 134 139 143 147 152 156 157 166 170 175 180 184 190
112 117 121 125 129 133 137 142 146 150 155 159 164 169 174 178 183 188 193
Fuente
http//www.nhlbi.nih.gov/guidelines/obesity/bmi_lbl htm

I 422
APNDICES
Figura A2-1. Nomograma para determinar la superficie corporal en nios y adultos.
De Boothby WM. Sanditord RB: Boston M e d Surg J 1921; 185:337, con permiso.

APNDICE 2

PESOS IDEALES, SUPERFICIE CORPORAL E NDICE DE MASA CORPORAL ( I M C )

1423
Figura A2-2. Nomograma para determinar la superficie corporal en ninos. (De DuBo
is EF: Basal Metabolism in Health and Disease. Philadelphia. Lea & Febiger, 1936
.)

A P N D I C E
3
Clculo aproximado del volumen sanguneo total (VST)
Para calcular el volumen sanguneo total (VST) de un paciente, una de las aproxima
ciones habituales considera que a cada kilogramo de peso corporal le corresponde
n 70 mi de VST. Es til en muchos pacientes, sin embargo, en otros, especialmente
en nios y adultos con sobrepeso, la cifra obtenida mediante este clculo proporcion
a una aproximacin inexacta del VST real. Para estos pacientes existen mtodos de es
timacin del VST ms adecuados.
volumen sanguneo ms ajustada a cada individuo que la regla de 70 ml/ kg (Gilcher,
1996). Obeso Varones ! Mujeres 60 55 Delgado 65 60 Normal 70 65 Atltico 75 70
ADULTOS
NIOS
El clculo de Nadler y Alien es particularmente inexacto en nios, y en especial en
varones prepuberales, a los que se recomienda aplicar los valores del sexo femen
ino para mejorar la estimacin (Kim. 2000). Pueden emplearse los siguientes valore
s de VST por kilogramo de peso corporal (Oski. 1993). Neonatos prematuros Neonat
os a trmino Bebs y preescolares 89-105 ' 82-86 ml/kg 73-82 ml/kg
El Espectro de COBE emplea la frmula de Nadler y Alien para calcular el VST aprox
imado de los pacientes (COBE Spectra Apheresis System Operator's Manual, 1997).
Esta frmula utiliza la estatura, el peso y el sexo del paciente para calcular el
VST. La frmula especfica es la siguiente: Varones: VST(ml) = 604 + [367 x estatura
(m)] + [32,2 x peso (kg)] Mujeres: VST(ml) = 183 + [356 x estatura (m)] + [33,1
x peso (kg)] EL VST tambin puede calcularse empleando el rea de superficie corpor
al (Shoemaker, 1989): Varones: VST = 2.740 ml/m Mujeres: VST = 2.370 ml/m
2 3 3
2
Otra aproximacin relativamente sencilla, que se muestra a continuacin, emplea la d
enominada "regla del cinco" de Gilcher, y es una estimacin de
COBE" Spectra'" Apheresis System Operator's Manual: Lakewood, CO, Gambro* BCT, 1
997, p1. Shoemaker WC: Fluids and electrolytes in the acutely ill adult. In S h
o e m a k e r WC, Ayres S. Grenvik A, et al. (eds): T e x t b o o k of Critical
Care, 2nd ed. Philadephia, WB Saunders Company, 1989, p 1130. Gilcher RO: Aphere
sis: Principles and practices. In Rossi EC, Simon TL, M o s s GS, Gould SA (eds)
: Principles of Transfusion Medicine. 2nd ed. Baltimore, Wiliams & Wilkins, 1996
, p 542. K i m HC: Therapeutic pediatric apheresis. J Clin Apheresis 2000; 15:12
9-157. Oski FA: The erythrocyte and its disorders. In Nathan DG, Oski FA (eds):
H e m a t o logy ot Infancy and Childhood. 4th ed, Philadelphia, WB Saunders C o
m p a n y , 1993, p 28.

El nuevo lormato IUPAC numera los grupos del 1 al 18. Tambin se mueslra el sistem
a numrico IUPAC previamente empleado por el Chemical Abstract Service (CAS). Para
los elemenios radiactivos no presentes en la naturaleza, se muestra enlre parnte
sis el nmero de masa del isotopo ms es'able De Lide DR. Fredenkse HPR CRC Handbok
ol Chemislry and Physics. 74ih ed 1993-1994. Boca Raion. FL. CRC Press. 1993. Le
igh GJ (ed). Nomenclalure ol Inorganic Chemistry. Oxford. Blackwell Scientific P
ublications. 1990. Chemical and Engineering News. 1985,63:27.

A P N D I C E
5
Unidades del Sistema Internacional (SI)
H. Peter Lehmann, Ph D. John Bernard Henry, M.D.
El SI consiste en siete unidades bsicas de dimensin independientes que se enumeran
en la Tabla A5-1, junto con los simbolos que corresponden a dichas unidades. La
Tabla A5-2 muestra una serie de unidades derivadas del SI utilizadas en el labo
ratorio clnico. Hay dos tipos de unidades derivadas: las unidades coherentes, que
derivan directamente de las unidades bsicas sin emplear (actores de conversin, y
las unidades incoherentes, generadas a partir de las unidades bsicas y que contie
nen un factor numrico con el fin de obtener cifras ms prcticas. La Tabla A5-3 muest
ra los prefijos que se refieren a las fracciones o mltiplos de las unidades SI bsi
cas o derivadas. L a descripcin completa de las unidades SI y su aplicacin en medi
cina se encuentra en la publicacin de la Organizacin Mundial de la Salud The SI fo
r the Health Proflessions (Worid Health Organization, 1977). Un compendio de can
tidades y sus unidades SI recomendadas se describe en Tietz (1995). Para la conv
ersin de las unidades SI recomendadas (Tablas A5-4 hasta A5-13). se aplicaron las
siguientes normas: 1. Todos los intervalos de refencia se han convertido a unid
ades SI excepto en los casos en que las determinaciones no son cuantitativas. 2.
Los nombres qumicos no se han modificado; por ejemplo, se mantiene el trmino urea
en lugar de carbamida. 3. Los factores son los publicados por el Consejo Mtrico
Nacional Americano (Lundberg, 1986; Young, 1987: Beeler, 1987), basado en los fa
ctores de la Comisin Mtrica de Canad (1981). 4. Los factores para la unidad bsica se
calculan para un volumen de 1 litro. 5. El orden de magnitud de los factores se
calcula para que los valores de las unidades SI rindan cifras convenientes- por
ejemplo, se emplean prefijos para valores superiores a 1.000 o inferiores a 0,0
01. 6. El valor de las unidades SI recomendadas es equivalente al valor que resu
lta de aplicar el factor a las unidades convencionales. 7. Para compuestos de ma
sa molecular relativa no definida (por ejemplo, protenas), los intervalos de refe
rencia se convierten en cantidad de masa por litro. 8. Para mezclas de composicin
indeterminada (por ejemplo, los fosfolpidos), los intervalos de referencia se co
nvierten en cantidad de masa por litro o se basan en un estndar determinado -por
ejemplo, DHEA para 17-cetosteroides. 9. Las cantidades de naturaleza relativa, n
ormalmente expresadas en porcentaje -p. ej., fracciones de isoenzimas de LD- se
representan como fracciones. 10. Las unidades enzimticas se reflejan como Unidade
s Internacionales por litro (U/litro). A pesar de que el katal es la unidad del
SI que corresponde a la actividad cataltica (incluidos los enzimas), y se define
como el nmero de moles de sustrato transformados por segundo en condiciones deter
minadas, sin embargo, su empleo es limitado.

Tabla A5-2 U n i d a d e s S I derivadas Cantidad rea Volumen Nombre de la unidad

metro cuadrado* metro cbico' litro'
T
Smbolo de la unidad m-' m' L = dm '
: J
Concentracin masa kilogramo/litro' suslanca mol/litro Molalidad mol/kilogramo Dens
idad kilogramo/litro Fraccin de masa kilogramo/kilogramo Fraccin molar mol/mol Con
centracin numrica nmero/litro Temperatura grado Celsio" Presin pascal' Frecuencia he
rzio" Aclaramiento litro/segundo Potencial elctrico voltio" Energa julio" ' Unidad
derivada coherente I Unidad derivada incoherente Tanto ' L" como "I" son smbolos
del litro.
1 :
kg/l mol/l kg/l kg/l kg/kg mol/mol L C = K - 273.15 Pa = kg/ms Hz = 1 cycle/s Us
V = kg m7s A J = kg m /s

1 3 2 ?
11. Se mantiene la escala de pH para medir la concentracin de iones de hidrgeno. 1
2. Actualmente, se recomienda mantener la unidad de mm de Hg para referirse a la
presin (P , P ). 13. Los porcentajes se expresan en el SI como fracciones, donde
una fraccin es una cantidad indefinida que viene dada por el nmero de partculas de
finidas que constituyen un componente especfico dividido por el nmero total de par
tculas definidas del sistema.
c02 02
Beeler MF: SI Units and the AJCP Am J Clin Pathol 1987; 87:140. Lundberg GD, Ive
rson C. Radulescu G: N o w read this: The SI units are here. AJAMA 1986. 255:232
9. The SI manual in health care. Ottawa, Sector 9.10 Health and Welfare. M e t r
i cC o m mission of Canada, 1981. Tietz NW (ed): Clinical Guide to Laboratory T
ests, 3rd ed. Philadelphia, WB Saunders Co., 1995. World Health Organization: Th
e SI lor the Health Professions. Geneva. WHO, 1977. Y o u n g DS: Implementation
of SI units for clinical laboratory data: Style speciications and conversion ta
bles. Ann Intern Med 1987, 106:114, Tabla A5-3 Prefijo exa peta fera giga mega k
ilo heclo deca deci centi mili micro nano pico femto atto Prefijos Simbolo del p
refijo E P T G M k h da d c m M n P f a Factor 10'" 10 tO 10 > i 10' 10' 10' 10 '
10 10' 10 10 10 IO'
15 14 ( ; ? 9 , ? 5
_.
_
Tabla A5-1 U n i d a d e s bsicas d e l S I Cantidad Longitud Masa Tiempo Intensi
dad de corriente elctrica Temperatura termodinmica Intensidad lumnica Cantidad de s
ustancia Nombre metro kilogramo segundo amperio kelvin candela mol Smbolo m kg s
A K ed mol
tt>"

APNDICE 5

U N I D A D E S DEL S I S T E M A I N T E R N A C I O N A L (SI)
1427
Tabla A5-4
Parmetros qumicos e n sangre total, suero y plasma I N T E R V A L O S DE R E F E
R E N C I A TPICOS
COMPONENTE cido acatoactico cualitativa cuantitativa Acetona cualitativa cuantitat
iva Alb mina cualitativa Alcohol etlico Aldolasa
SISTEMA Suero Suero Suero Suero Suero Suero y sangre total Suero adultos nios neo
natos
U n i d a d e s convencionales Negativa 0.2-1,0 mg/dl Negaliva 0.30-2 0 mg/dl
Factor' 97,95

Unidades del SI recomendadas' Negativa 20-100 Mmol/I Negativa 20-340 pmol/l 32-4
5 g/l 32-56 g/l 38-50 g/l Negativa, pero representada como mmol/l 22-59 mU/l a 3
7 C Aproximadamente 2 veces los niveles del adulto Aproximadamente 4 veces los ni
veles del adulto 2.6-5.0 mmol/l 0.8-2.3 umol/1 12-70 pmol/l 23-47 Mmol/l 7-28 Mm
ol/l 30-220 U/1 0-40 U/1 < 0,4 Mmol/l 34-91 Mmol/l 40-114 Mmol/l Negativa -3.3 a
+1.2 mmol/l -2.4 a +2.3 mmol/l 145-160 mmol/l 21-28 mmol/l 3.0-30.0 mg/l < 5 Mm
ol/l 2-17Minol/l 2-21 Mmol/l 17-205 MOI/I 7,38-7.44 7.36-7,41 4.7-5,3 kPa 5.3-6.
0 kPa 12.7-13,3 kPa < 0,63 mmol/l 1.00-1.20 mmol/l 0.30-1.58 del total 2,30-2.74
mmol/l 19-24 mmol/l 21-28 mmol/l
172.95
3.2-4.5 g/dl (Iraccionamiento salmo) : 3,2-5.6 g/dl (electroforesis) 3.8-5.0 g/dl
(unin a colorante) Negativa, pero representada como mg/dl 0,2171 3-8 Sibley-Lehn
inger U/dl a 37" C Aproximadamente 2 veces los niveles del adulto Aproximadament
e 4 veces los niveles del adulto 3.6-7.0 mg/dl 0.01-0.03 mg/dl 20-120 ng/dl (dif
usin) 40-80 ng/dl (mtodo enzimatico) 12-48 pg/dl (mtodo con resina) 16-120 unidades
Somogy/dl 0-4 U/dl < 7 ng/dl 0.6-1.6 mg/dl 0.7-2.0 mg/dl Negativa -3,3 a +1,2 m
Eq/l -2,4 a +2,3 mEq/l 145-160 mEq/l 21-28 mmol/l 0,3-3,0 mg/dl < 0.3 mg/dl 0.11,0 mg/dl 0,1-1,2 mg/dl 1.0-12,0 mg/dl 7,38-7,44 (arterial) 7.36-7,41 (venosa) 3
5-40 mm Hg (arterial) 40-45 mm Hg (venosa) 95-100 mm Hg (arterial) < 5 mg/dl 4.0
-4,8 mg/dl 2.0-2,4 mEq/l 30-58% del total 9,2-11,0 mg/dl 4,6-5,5 mEq/l 19-24 mmo
l/l 21-28 mmol/l 22-26 mmol/l 24-30 mmol/l 24-30 mmol/l 35-40 mm Hg 40-45 mm Hg
1.05-1,45 mmol/l 1.15-1,50 mmol/l 1 1 0,1333
!
7,4
Nitrgeno ct-amino cido Acido S-aminolevulinico Amoniaco Amilasa Arginmsuccinico- l
iasa Arsnico cido ascrbico (vitamina C)
1
Suero Suero Plasma Suero Suero Sangre total Plasma Sangre total Suero, plasma o
sangre total Sangre total varn mujer Suero Plasma Suero Suero
07139 76.26 0.5872 1,85 10 0.05055 56 78 1 1 1 10 17.10

Barbit ricos Bases, exceso

Base total Bicarbonato cidos biliares Bilirrubina directa (conjugada) indirecta (
no conjugada) total total en neonato Gases en sangre (vase Cap 9) PH Sangro total
Pco
? ?
1 0,1333 0.1333 0,125 0,2500 0.5000 0,01 0,2500 0,5000 1
Sangre total Sangre total Suero Suero Suero Sangre total (arterial) Plasma o sue
ro (arterial) Sangre total (venosa) Plasma o suero (venosa) Plasma o suero (veno
sa) Sangre total (arterial) Sangre total (venosa) Sangre total (arterial) Sangre
total (venosa)
Po Bromuro Calcio ionizado total Dixido de carbono (contenido en CO,) Dixido de ca
rbono
22-26 mmol/l 24-30 mmol/l 24-30 mmol/l 4.7-5,3 kPa 5.3-6.0 kPa 1.05-1.45 mmol/l
1.15-1.50 mmol/l La labia continua en la pagina siguiente
Capacidad de combinacin del CO. Presin parcial de CO.. (Peo,)
cido carbnico (CO ,H,)

428
Tabla A5-4
APNDICES
P a r m e t r o s q u m i c o s en sangre total, s u e r o y p l a s m a (contin
uacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE
SISTEMA Plasma (venoso) Sangre total suburbano no fumador fumador gran fumador S
uero Suero Suero Suero Suero Eritrocitos Plasma Suero o plasma Suero, plasma varn
mujer Plasma 8 A.M. - 10 A.M. 4 P.M. - 6 P.M. Suero o plasma varn mujer Suero va
rn mujer Suero o plasma Suero o plasma y orina varn mujer Suero Suero
Unidades c o n v e n c i o n a l e s 1,02-1,38 mmol/l < 1,5% saturacin de hemoglo
bina l ,5-5.0% saturacin 5,0-9.0% saturacin 40-200 ug/dl 23-50 mg/dl 95-103 mEq/l
150-250 mg/dl (vara con la dieta, el sexo y la edad) 65-75% del colesterol total
0,65-1.3 pH unidades 0.5-1.3 pH unidades 8-18 U/l a 37 C 1.7-3,0 mg/dl 70-140 u.
g/dl 80-155 ug/dl 5-23 ug/dl 3-13 (i g/dl 0,1-0,4 mg/dl 0,2-0,7 mg/dl 55-170 U/l
a 37 C 30-135 U/l a 37" C 0,6-1,2 mg/dl (adulto) 0,3-0.6 mg/dl (nios < 2 aos) 107139 ml/min 87-107 ml/min Negativa 52-65% de la proteina total 2,5-5,0% de la pro
tena total 7,0-13.0% de la proteina total 8,0-14.0% de la proteina total 12.0-22,
0% de la protena total Concentracin 3,2-5,6 g/dl 0.1-0,4 g/dl 0.4-1,2 g/dl 0,5-1,1
g/dl 0,5-1,6 g/dl
Factor"
Unidades del SI recomendadas* 1.02-1.38 mmol/l
Carboxihemoglobina (monxido de carbono hemoglobina)
0,01
Fraccin de hemoglobina saturada 0,015-0.050 0,050-0 090 0,7-3,7 timol/l 230-500 m
g/l 95-103 mmol/l 3.88-6,47 mmol/l Fraccin de colesterol total: 0.65-0,75 0,65-1,
3 unidades' 0.5-1,3 unidades 8-18 U/l a 37" C 88-156 umol/l 11-22 Mmol/l 13-24 u
.mol/1 138-635 nmol/l 83-359 nmol/l 8-31 umol/l 15-53 Mmol/l 55-170 U/l a 37 C 30
-135 U/l a 37 C 53-106 nmol/l 27-53 u.mol/1 1,78-2.32 ml/s 1.45-1.78 ml/s Negativ
a Fraccin de protenas totales: 0,52-0,65 0.025-0.05 0.07-0,13 0.08-0.14 0,12-0,22
32-56 ql 1 4 gl 4-12 gl 5-11 gl 5-16 gl
Beta caroteno Ceruloplasmina Cloruro Colesterol total (vase Cap. 12) esteres Coli
nesterasa (seudocolnesterasa) Citrato Cobre
0,01863 10 1 0.02586 0,01 1 i
52,05
0,1574
Cortisol
27,59
Crea li na
76,25
Creatina quinasa (CK)

Creatmina (vase Cap. 10) Aclaramiento de creatinina (endgena) (vase Cap. 9) Crioglo
bulinas Electroforesis de protenas alb mina alfa-1 alla-2 beta gamma alb mina alfa-1
alfa-2 beta gamma Grasas neutras (ver triglicridos) cidos grasos total (libres y e
sterificados) libres (no esterificados) Ferritina
1 88,40
1
0.01667
0,01 0,01 0,01 0,1 0,01 10
Suero
Fibringeno Fluoruro Folato
Suero Plasma Suero varn mujer Plasma Sangre total Suero Eritrocitos
9-15 mmol/l 300-480 uq/l 15-200 ng/ml 12-150 ng/ml 200-400 mg/dl < 0,05 mg/dl > 3
,5 ng/ml (anlisis isotpico) 166-640 ng/ml (bioensayo) > 140 ng/ml (anlisis isotpico)
Ninguna < 20 mg/dl 0,5-1,6 g/dl 2,3-3,5 g/dl 70-110 mg/dl 60-100 mg/dl
1 1 1 1 0,01 0,5263 2,266
9-15 mmol/l 300-480 umol/l 15-200 MO/' 15-150 M Q / I 2,00-4.00 g/l < 0,027 mmol
/l 11-57 nmol/l > 5 nmol/l 376-1.450 nmol/l > 317 nmol/l Ninguna < 1,11 mmol/l 5
-16 g/l 23-35 g/l 3.9-6,1 mmol/l 3,3-5.6 mmol/l
J
Galactosa
Gammaglobulina Globulinas totales Glucosa, en ayunas
Sangre total adultos nios Suero Suero Suero o plasma Sangre total
0,05551 10 10 0,05551
La tabla contin a en la pgina siguiente

Tabla A5-4
P a r m e t r o s q u m i c o s en sangre total, suero y plasma (continuacin) I N
T E R V A L O S DE R E F E R E N C I A TPICOS
COMPONENTE Tolerancia a la glucosa oral
SISTEMA Suero o plasma en ayunas 30 min 60 min 120 min 180 min Suero o plasma en
ayunas 5 min 60 min 120 min 180 min Eritrocitos Suero Sangre total Suero Suero
Suero Suero o plasma cualitativo cuantitativo Sangre total varn mujer Suero
Unidades c o n v e n c i o n a l e s 70-1l0mg/dl 30-60 mg/dl sobre nivel en ayun
as 20-50 mg/dl sobre nivel en ayunas 5-15 mg/dl sobro nivel en ayunas Igual o in
ferior al nivel en ayunas 70-110 mg/dl Mximo de 250 mg/dl Descenso signiticativo
Inferior a 120 mg/dl Nivel en ayunas 250-500 unidades/10' clulas 1 200-2 000 mlU/
ml de concentrado de eritrocitos 5-40 IU/I 24-37 mg/dl < 10 ng/ml < 3 nmol/ml/mi
n 60-270 mg/dl Negativa 0.5-5.0 mg/dl 12.0-16,0 g/dl 13,5-18,0 g/dl 140-350 U/ml
Factor* 0,05551
Unidades del SI r e c o m e n d a d a s 3.9-6.1 mmol/l 1.7-3.3 mmol/l por encima
de nivel en ayunas 1.1-2.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas 0.3-0.8 mmol/l
por encima de nivel en ayunas Nivel en ayunas o inferior 3.9-6.1 mmol/l Mximo de
13.9 mmol/l Descenso significativo Inlenor a 6.7 mmol/l Nivel en ayunas 250-500
punidades/clula 1 200-2 000 U / 1 de concentrado de eritrocitos 5-40 U/1 a 37 C 0,
78-1.20 mmol/l
1
intravenosa
Glucosa- 6-loslato deshidrogenasa (G6PD) y-Glulamiltransferasa Gluiatin Hormona de
l crecimiento Guanasa Haptoglobina Hemoglobina
1 1 I 0,03254 1 1 0,01 10 10 1 25,59'
<10|ig/l
<3 U/l a 37 C 0.6-2.7 g/l Negativa 5-50 mg/1 120-160 g/l 135-180 g/l 140-350 kU/l
193-524 mmol/l 248-579 mmol/l 966-1.517 mmol/l
(i-hi roxibutirico deshiclrogenasa 17- hidroxicosticosleroides
Inmunoglobulinas: IgG IgA
IgM
IgM igD igE Insulina Tolerancia a la insulina (0.1 unidades/kg)
Plasma varn 7-19 ug/dl mu|er 9-21 ug/dl tras 24 unidades USP de ACTH IM (tniramus
cular) 35-55 ug/dl Suero 800-1,801 mg/dl 113-563 mg/dl 54-222 mg/dl 0,5-3,0 mg/d
l 0,01-0.04 mg/dl Plasma anlisis isotpico bioensayo Suero en ayunas 30 min 11-240
plU/ml 4-24 ulU/ml Glucosa de 70-110 mg/dl Descenso hasta el 50% de los niveles
en ayunas Nivel en ayunas 60-150 pg/dl 250-400 ug/dl 20-55% 50-240 unidades/ml a
25" C (unidades Wolfson-Williams Ashman) Negativa 25-125 ug/dl 5-20 mg/dl 3-7 m
g/dl (lactato-piruvato) 80-120 unidades a30C (piruvato->lactato) 185-640 unidades
a 30 C (lactato-piruvato) 100-190 U/l a 37 C 17-27% 27-37% 18-25% 3-8% 0-5%
0,01
III
8,0-18.0 g/l 1,1-5.6 g/l 0,5-2,2 g/l 5.0-30.0 mg/l 0.1-0,4 mg/l 79-1722 pmol/l 2

9-172 pmol/l Glucosa de 3,9-6 1 mmol/l Descenso hasta 0.5 de los niveles en ayun
as Nivel en ayunas 10.7-26.9 jimol/l 44,8-71,6 umol/l Fraccin de la capacidad tot
al de fijacin de hierro; 0,20-0,55 0,83-4,18 U/l a 25 C Negativa 866-4.334 nmol/l
0.6-2.2 mmol/l 0.3-0.8 mmol/l 38-62 U / 1 a 30" C 90-310 U/l a 30 C 100-190 U/l a
37 C Fraccin de LDH lotal 0.17-0,27 0 27-0,37 0 18-0.25 0 03-0.08 0.00-0.05
La labia contin a en la pagina siguiente
7,175" 0.05551 0.01 0.1791 0.1791 0,01 0,0166

90 min Hierro lotal Suero Capacidad de fijacin de hierro Suero Saturacin de hierro
Suero Isocitrico deshidrogenasa Cuerpos cetnicos 17-Ketosteroids cido lctico (como
lactato) Lactato deshidrogenasa (LD) Suero Suero Plasma Sangre total venosa art
erial Suero
34,67* 0,1110 0 48 048 1
Lclalo deshidrogenasa isoenzimas LD.(nodo) LD, LD, LD, LD, (ctodo)
Suero 0.01

1 4 3 0
APNDICES
Tabla A5-4
Parmetros qumicos e n sangre total, suero y p l a s m a (continuacin) INTERVALOS DE
REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE Lclalo deshidrogenasa (termoeslable) Tolerancia a la lactosa
SISTEMA Suero Suero
Unidades convencionales 30-60% del total Cambios en la glucosa srica a los de la
prueba de tolerancia a la glucosa < 50 ug/dl 80-200 U/ml (Goldbarg-Rutenberg) 75
-185 U/ml (Goldbarg-Rutenberg) 0-1.5 U/ml (Cherry-Crandall) 14-280 mlU/ml 400-80
0 mg/dl 150-250 mg/dl 10-90 mg/dl 150-380 mg/dl 9,0-15,0 mmol/l 8,0-11,0 mg/dl N
egativa 0,5-1,4 mEq/l Indetectable
Factor* 0.01
Unidades del SI recomendadas Fraccin de LDH total: 0,30-0 60 Cambios en la glucos
a srica similares a los de la pruea de tolerancia a la glucosa < 2.41 umol/l 19.248,0 U/l 18.0-44,4 U/l 0-417 U/l 14-280 U/l 4,00-8,00 g/l 3.88-6,47 mmol/l 0,112.15 mmol/l 1.50-3,80 g/l 9.0-15,0 mmol/l 2.58-3.55 mmol/l Negativa 0.5-1.4 mmol
/l Indetectable
1
Plomo Leucina-aminopeptidasa (LAP) Lipasa Lpidos totales colesterol (vase Cap. 12)
triglicridos (vase Cap. 12) fosfolpidos cidos grasos (libres) Fsloro en (oslollpidos
Litio intervalo teraputico Hormona estimulante del tiroides de accin prolongada (
LATS) Hormona luteinizante (LH)
Sangre total Suero varn mujer Suero Suero
0,04826 0,24 278 1 0,01 0,02586 0.01129" 0.01 1 0.3229
I
Suero Suero

Suero varn mujer

Magrogiobulinas totales Magnesio Metahemoglobina Mucoprotena Muraminidasa Mioglob
ina Nitrgeno no proteico (NPN) 5-Nucleotidasa Orntina-carbamiltransterasa Osmolali
dad Oxgeno (vase Cap 9) presin (PO )
?
Suero Suero Sangre total Suero Suero Suero Suero o plasma Sangre total Suero Sue
ro Suero Sangre total (arterial) Sangre tolal (arterial) Sangre total (arterial)
Sangre total (arterial) Sangre tolal (venosa) Suero o plasma (venoso) Suero adu
ltos neonatos (a trmino) Suero Suero
6-30 mlU/ml Pico en la mitad del ciclo: 3 veces el valor basal Premenopusico < 30
mlU/ml Posmenopusico > 35 mlU/ml 70-430 mg/dl 1,3-2,1 mEq/l 1,8-3,0 mg/dl < 0,24
g/dl < 1% de la hemoglobina lotal 800-200 mg/dl 4-13 mg/l < 90 ug/l 20-35 mg/dl
25-50 mg/dl 0-1.6 unidades a 37 C 8-20 mlU/ml a 37 C 280-295 mOsm/kg 95-100 mm Hg
15-23% de volumen 94-100% 7,38-7,44 7,36-7.41 7,35-7,45 < 3,0 mg/dl 1,2-3.5 mg/

dl 0,13-0.63 U/la 37" C (p-nitrofenilfosfato) 20-130 IU/I a 37" C (p-nitrofenilf

osfato en lampn AMP)
1
0,01 0,5000 0,4114 10 0.01 0.01
0.7139
:
6-30 IU/I Pico en la mitad del ciclo: 3 veces el valor basal Premenopusico < 30 I
U/I Posmenopusico > 35 IU/I 0,7-4,3 g/l 0,65-1,05 mmol/l 0,74-1,23 mmol/l < 2,4 g
/l Fraccin de hemoglobinal total <0,01 0,8-2,0 g/l 4-13 mg/l < 90 ug/l 14,3-25.0
mmol/l 17,8-35.7 mmol/l 0-1.6 unidades a 37" C 8-20 U/l a 37 C 280-295 mmol/kg 12
.7-13.3 kPa Fraccin del volumen: 0,15-0,23 Fraccin saturada: 0,94-1.00
l 0.1333 0,01
contenido saturacin PH
I
7.38-7,44 7.36-7,41 7,35-7,45
Fenilalanina
60,54
< 182|imol/l 73-212 umol/l 2,2-10,5 U/l a 37" C 20-130 U/l a 37" C
Fosfatasa loslatasa acida toslatasa alcalina Fsloro en fostolipidos (vase lpidos to
tales) Fostolpidos (vase lpidos totales) Fsforo inorgnico
16,67 l
Suero adultos nios
2,3-4,7 mg/dl 4,0-7,0 mg/dl
0.3229
0,74-1.52 mmol/l 1,29-2,26 mmol/l La tabla contin a en la pgina siguiente

Tabla A5-4
Parmetros qumicos en sangre total, suero y plasma (continuacin/ INTERVALOS DE REFER
ENCIA TPICOS
COMPONENTE Potasio Prolactina Protenas (ver Cap 13) totales alb mina globulina Frac
cionamiento de protenas Protoporlirina Piruvato Saliciiatos intervalo teraputico S
odio Sulfato inorgnico Sullohemoglobina Sulfamidas Testoslerona Tiocianato Prueba
s de hormona tiroidea (vase Cap. 169 tiroxina total (T ) tiroxina libre (T, libre
) captacin de T por resina
4 3
SISTEMA Plasma Suero varn mujer Suero
Unidades convencionales 3,8-5.0 mEq/l 1-25ng/ml 1-20 ng/ml 6.0-7.8 g/dl 3.2-4.5
g/dl 2.3-3.5 g/dl Vase electroforesis 15-50 mg/dl 0.3-0,9 mg/dl Negativa 15-30 mg
/dl 136-142 mEq/l 0,2-1,3 mEq/l 0,9-6.0 en mg/dl as SO, Negativa Negativa
Factor" 1 1 10
Unidades del SI recomendadas' 3,8-5,0 mmol/l 1-25 ug/l 1-20 ug/l 60-78 g/l 32-45
g/l 23-35 g/l Ver eleclroforesis 0.27-0.89 nmol/l 34-102umol/l Negativa 1.08-2,
17 mmol/l 136-142 mmol/l 0.10-0,65 mmol/l 0.09-0.63 mmol/l a SO, Negativa Negati
va 10.4-41.6 nmol/l 1.0-3.3 mmol/l Negativa 71-161 nmol/l 12-30 pmol/l Fraccin de
captacin relativa 0.25-0,38 100-260 ug/l 0.5-5 ulU/l 1.23-3 de nmol/l
Eritrocitos Sangre total Suero Plasma Suero Sangre total Suero o sangre total Su
ero o plasma varn mujer Suero Suero
0.01777 113.6 0.07240 1 0.5 0.1042
300-1.200 ng/dl 30-95 ng/dl Negativa 5.5-12.5 ug/dl 0,9-2,3 ng/dl 25-38% relativ
o de captacin 10-26 ug/dl 0.5-5 ulU/ml 80-200 mg/dl
0.03467 12,87 12,87 0,01 10
Suero Suero
tiroxina fijadora de globulina (TBG) tirotropina Iriyodotironina (T,) Transleras
as aspartato amino-transferasa (AST o SGOT) alanina amino-transferasa (ALT o SGP
T) gamma glutmicotransferasa (GGT) Triglicridos (vase Cap. 12) Troponina I Nitrgeno
urico Aclaramiento de urea aclaramiento mximo aclaramiento estndar cido rico
0.0154 8-33 U/l a 37 C 1 1 1 0.01129' 0.357 0.01667 4-36 U/l a 37 C 5-40 U/l a 37 C
0.11-2.15 mmol/l 0.06 ug/l 0.01 ug/l 2.9-8 2 mmol/l 1.07-1.65 l/s 0.68-1,08 l/s
o superior al 0,75 del aclaramiento normal 0,24-0,51 mmol/l 0,16-0,43 mmol/l 0,
52-2,09 umol/l 0.52-2.09 nmol/l
Suero Suero
8-33 U/l a 37 C 4-36 U/l a 37" C 5-40 IU/I a 37 C 10-190 mg/dl < 2.0 mg/ml 8-23 mg
/dl 64-99 ml/min 41-65 ml/min. o ms del 75% del aclaramiento normal 4,0-8,5 mg/dl
2,7-7,3 mg/dl 15-60 ug/dl 15-60 ng/dl
Suero Suero Suero Suero y orma
Vitamina A Tolerancia a la vitamina A
Suero varn mujer Suero Suero ayuno de 3 horas o 6 horas despus de 5000 unidades de
vitamina A / kg en 24 horas Suero Suero Plasma Suero normal en malabsorcin

0,05948 0.03491 0.03491

Vitamina B,, Vitamina B,, no saturada capacidad de fijacin Vitamina C Xilosa, abs
orcin
200-600 ug/dl Valores en ayunas o ligeramente superiores 160-950 pg/ml 1.000-2.0
00 pg/ml 0.6-1.6 mg/dl 25-40 mg/dl entre 1 y 2 horas Mximo aproximadamente de 10
mg/dl Dosis: adultos 25 g de o-xilosa nios 0.5 g de o-xilosa/kg 50-150 tag/dl
0.7378 0.7378 56.78 0,06661
6,98-20.95 nmol/l Valores en ayunas o ligeramente superiores 118-701 pmol/l 7381475 pmol/l 34-91 nmol/l 1.67-2.66 mmol/l entre 1 y 2 horas Mximo aproximadamente
de 0.67 mmol/l 7,7-23,0 nmol/l
Zinc
1 1
Suero
0,1530
" Ficlor = tactor numrico (observar que no se presentan las unidades) Valor en uni
dades del SI = valor en unidades convencionales x tactor. Generalmente no determ
inado en sangre (las muestras de eleccin son la orina, el pelo o las uas, en los c
asos agudos se analiza el contenido gstrico) Unidad basada en la concentracin del
ion de hidrgeno Como cortisol " Como DHEA "* Como trioleina Una (1) Unidad Intern
acional de insulina corresponde a 0.04167 mg del Cuarto Estndar Internacional (me
zcla del 52% de insulina bovina y el 48% de insulina porcina)
1

1432
APNDICES
Tabla A5-5
Orina INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE cido aceloaclico Acetona Addis, recuento de
SISTEMA
Unidades c o n v e n c i o n a l e s
Factor* i l 1 0,001 2,774 0,07139 76,26 7,626 1 0.07139 0.1850 0.01335 56,78 5,6
78
Unidades del SI recomendadas' Negativa Negativa 1,8 x 10 12 h 0,5 x 10 12 h <5,0
x 10 12 h
1 3
Al azar Negativa Al azar Negativa recogida de 12 horas Leucocitos y clulas epitel
iales 1.800.000/12 h RBC 500.0000/12 h Moldes hialinos: <5.000/12 h Al azar 24 h
24 h Al azar 24 h Al azar adulto nios 24 h 24 h 2h 24 h Al azar 24 h Al azar 24
h Al azar Al azar 24 h Al azar 24 h dieta normal dieta baja en calcio dieta rica
en calcio Al azar 24 h Negativa 15-150 mg/d 2-26 ug/d Negativa 100-290 mg/d 0,1
-0.6 mg/dl <0,5 mg/dl 1,5-7,5 mg/d 20-70 mEq/d 500-1.200 mg/d 35-260 unidades So
mogyi/hora <50 pg/i 1 7 mg/dl >50 mg/d Negativa <0,5 pg/d Negativa Negativa <2 m
g/l 1 + turbidez 100-240 mg/d < 150 mg/d 240-300 mg/d <14 pg/dl <100 ug/d (varia
con el ejercicio fsico) <10 ng/d <100 ng/d 4-126 pg/d 0,1-1,6 mg/d 140-250 mEq/d
Alb mina cualitativa cuantitativa Aldosterona Cuerpos alcaptnicos Nitrgeno u-aminocid
o cido 6-aminolevuilnico
Negativa 0,015-0,150 g/d 6-72 nmol/d Negativa 7,1-20,7 mmol/d 8-46 pmol/l <38 pm
ol/l 11-57 u.mol/d 20-70 mmol/d 35.6-85.7 mmol/d 6,5-48.1 U/h <0,67 j-mol/l 57-3
97 u.mol/1 >284 pmol/d Negativa <5,55 nmol/d Negativa Negativa <32 pmol/l 1 + tu
rbidez 2,5-6,0 mmol/d <3,7 mmol/d 6,0-7,5 mmol/d <828 nmol/d <591 nmol/d <55 nmo
l/d <591 nmol/d 24-745 nmol/d 0.5-8,7 pmol/d 140-250 nmol/d

Nitrgeno amnico Amilasa Arsnico cido ascrbico Protena de Bence-Jones Berilio Bilirrub
na cualitativa Sangre oculta Borato Calcio cualitativo (Sulkowitch) cuantitativa

111,0

16,44

0.02495 59.11* 5,911* 5,458 5,911 5.911* 5,458* 1

Catecolaminas
epinelnna norepinefrina catecolaminas libres totales metanefrinas totales Clorur
o 24 h Prueba de concentracin Al azar - despus de restriccin de (Fishberg) lquidos g
ravedad especifica osmolalidad Cobro 24 h Coproporfinna Al azar adulto 24 h adul
to nios 24 h Creatina varn mujer

> 1.025 >850 mOsm/kg <50 pg/d 3-20 pg/dl 50-160 pg/d <80 pg/d <40 mg/d <100 mg/d
Superior en nios y durante el embarazo 20-26 mg/kg/d 1,0-2,0 g/d 14-22 mg/kg/d 0
,8-1,8 g/d Negativa 10-100 mg/d 0,2-2.0 mg/d 0,2-1,8 mg/d Negativa <20 pg/d
1 1
0,01574 15,27 1,527
> 1,025 >850 mmol/kg <0,8 pmol/d 46-305 nmol/d 76-244 nmol/d <122 nmol/d <305 pm
ol/d <763 pmol/d Superior en nios y durante el embarazo 177-230 pmol/kg/d 8,8-17,
7 mmol/d 124-195 pmol/kg/d 7,1-15,9 mmol/d Negativa 42-416 pmol/d 0,7-6.9 pmol/d
0.7-6.2 pmol/d Negativa <109 nmol/d La labia contin a en la pgina siguiente
7,625
Creatinina
24 h varn mujer
8,840 8,840 8.840 8 840 4.161* 3,467
Cistina cualitativa Cistma y cisteina Deshidroepiandrosterona
cido dactico Epinelnna
Al azar 24 h 24 h varn mujer Al azar 24 h
5,458

APNDICE 5

UNIDADES
DEL
SISTEMA
INTERNACIONAL
DE
(SI)
1433
Tabla A5-5 Orina (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Eslrgenos
lolales SISTEMA Unidades convencionales Factor* Unidades del SI recomendadas*
Iraccionados estrona (E,) estradiol (E.,) estriol (E ) Grasa cualitativa FIGLU (
Acido Nformiminogiutmico)
3
h varn hembra ovulacin mximo luteinico menstrual embarazo posmenopusico 24 h. no emb
arazo mitad del ciclo
24
5-18
ug/d
3,468
S
1 7 - 6 2 nmol/d
97-347
28-100 22-80 4-25 ug/d 0.003468 3,468
ug/d Hasta 4 5 . 0 0 0 ug/dia Hasta 10 ug/dia
nmol/d nmol/d 1 4 - 8 7 nmol/d Ms de 1 5 6 nmol/d Ms de 35 nmol/d
76-364
Al azar 24 h tras 15 g de L-histidina 24 h 24 h adulto prepuberal posmenopusico m
itad del ciclo 24 h Al azar 24 h
2 - 2 5 iig/d < 1 0 ug/d 2 - 3 0 ug/d Negativo < 3 mg/d
4 mg/8 <1
3.699 3.671 3.468

5,740
7 - 9 3 nmol/d < 3 7 nmol/d 7 - 1 0 4 nmol/d Negativa < 7 , 2 umol/d
2 3 . 0 umol/8 h

h
52,63 1

Fluoruro Hormona foliculoestimulante (FSH)

mg/d U/l U/l
U/l mg/d
< 5 3 umol/d
4-25 4-30
4-25 4-30
IU/I IU/I
IU/I
40-50 30-65
40-50
2 x basal
1 0,005551
Fructosa Glucosa cualilativa cuantitativa sustancias reductoras del cobre glucos
a en azucares totales Gonadotropinas pituitarias (FSH y LH) Etiocolanolona
2 x basal 0 , 1 7 - 0 . 3 6 mmol/d Negativa
0,5-1,5 g/d
Negativo
0.5-1.5 g/d

1 1 0,005551 1
24
h
Media de 2 5 0 mg/d Media de 1 3 0 mg/d 1 0 - 5 0 U/l
Media de 2 5 0 mg/da Media de 0 . 7 2 mmol/da 1 0 - 5 0 lU/d
11hidroxiandrosterona
11hidroxietiocolanolona
11cetoandrosterona
11-

celoeliocolanolona
Lactosa Plomo Magnesio Melanina cualitaliva Mucina Muramidasa (lsozima) Mioglobin
a cualitativa cuantitativa Osmolalidad Pentosas pH Fenosullataleina (PSP)
h varn mujer 24 h varn mujer 24 h varn mujer 24 h varn mujer 24 h varn mujer 24 h 24
h 24 h Al azar 24 h 24 h
24
1.4-5,0 0.8-4,0 0.1-0,8 <0,5
mg/d mg/d mg/d
3.443
4,8-17,2 2,8-13,8
umol/d nmol/d
3.263
0,3-2,6
mg/d
mg/d mg/d mg/d mg/d mg/d mg/d 3.274 2.291 0,004826 0.5000 3.274 3.26
nmol/d < 1,6 nmol/d nmol/d nmol/d
0.2-0,6 0.1-1,1 0.2-1,0 0,2-0,8 0.2-1,0 0.2-0,8 14-40 < 100
0,7-2,0
0,3-3,63 0,7-3,3 0,7-2,6 0,7-3,3 0,7-2,6
nmol/d nmol/d
mg/d ug/d 6 . 0 - 8 , 5 mEq/d Negativa
100-150 1 3-36 mg/d
I
nmol/d nmol/d 4 1 - 1 1 7 nmol/d < 0 , 4 8 nmol/d 3 . 0 - 4 , 3 mmol/d Negativa
100-150 1.3-36 mg/d mg/d
mg/d
Al azar 24 h Al azar 24 h Al azar Orina recogida tras administracin de 6 fng de P
SP i.v. 1 5 min min 6 0 min 1 2 0 min Al azar
30
Negativa < 4 mg/l 5 0 0 - 8 0 0 mOsm/kg de agua 2 - 5 mg/kg/d
4.6-8,0

I
1 1 1
Negativa < 4 mg/l 5 0 0 - 8 0 0 mmol/kg 2 - 5 mg/kg/d
4,6-8.0

20-50% 16-24%
colorante excretado
0.01
Fraccin de colranle excretado:
0.20-0.50 0.16-0.24 0.09-0.17 0.03-0,10
cido fenilpir vico. cualtitativo
colorante excretado 9 - 1 7 % colorante excretado 3 - 1 0 % colorante excretado
Negativa
Negativa La tabla continua en la pgina siguiente

1434
APNDICES
Tabla A5-5 Orina (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Fsforo Po
rfobilingeno cualitativo cuantitativo Potasio Pruebas de embarazo SISTEMA Al azar
Al azar 24 h 24 h Muestra matutina concentrada 24 h varn mujer pico embarazo nios
24 h varn mujer nios Al azar 24 h 24 h 24 h 24 h Al azar Unidades convencionales
0,9-1,3 g/d Negativa <1,0 mg/d 40-80 mEq/d Positiva en embarazo normal o en pres
encia de tumores productores de gonadotropina corinica <1,5 mg/d 1 -8 mg/d 1 sema
na despus de la ovulacin <50 mg/d Negativa 0,4-2,4 mg/d 0,5-2,0 mg/d Ms de 1 mg/d N
egativo 40-150 mg/d 0,5-1,5 mg/d 75-200 mEq/d 55-70 g/d Disminuye con la edad ha
sta 30 g/da 1,016-1,022 (ingesta lquida normal) 1,001-1,035 (rango) Negativo 20-50
mEq/d 6-17 g/d 250-750 mg/d 0,3-1,0 unidades Ehrlich 0,05-2,5 mg/d o 0,5-4,0 un
idades Ehrlich/dia 15-45 unidades/hora (Anson) 1.500-5.000 unidades/da (Anson) 2,
972 Factor* 32,29

Unidades del SI recomendadas 29-42 mmol/d Negativa <4,4 pmol/d 40-80 mmol/d Posi
tiva en embarazo normal o en presencia de tumores productores de gonadotropina c
orinica <4.7 pmol/d 3-25 pmol/d 1 semana despus de la ovulacin <156 pmol/d Negativa
1
4,420 1

Pregnanediol
3.120 3.120
Pregnanetriol
Protena, cualitativa Sustancias reductoras, total Sodio Slidos, totales Peso espec
ifico

1 1 1 1 1
Az cares (excepto glucosa) Acidez titulable Nitrgeno ureico cido rico Urobilingeno Uro
pepsina Uroporfirinas cualitativa cuantitativa cido vanilmandlico (VMA) Volumen, t
otal Zinc ' Como norepinetrina " Como normetanerina Basado en cistina * Basado en
estriol
:
Al azar 24 h 24 h 24 h 2h 24 h Al azar 24 h

1 35 70 0,005948 1 1,693 1 7,37

1,2-7.1 nmol/d 1,5-5,9 nmol/d Ms de 3 j-mol/d Negativa 40-150 mg/d 0,5-1,5 mg/d 7
5-200 mmol/d 55-70 g/d Disminuye con la edad hasta 30 g/dia Densidad relaliva (U
20 C/agua 20 C) 1,016-1,022 (ingesta liquida normal) 1,001-1,035 (rango) Negativo
20-50 mmol/d 214-607 mmol/d 1.5-4,5 mmol/d 0,3-1,0 U 0.1-4,2 pmol/d 0.5-4,0 U/d
111-332 U/h 11-37 kU/h Negativo 12-36 nmol/d 7,6-37.9 umol/d 0,6-1,6 l/d 2,3-18
,4 pmol/d
Al azar 24 h 24 h 24 h 24 h

Negativa 10-30 pg/d 1,5-7,5 mg/d 600-1.600 ml/d 0,15-1,2 mg/d

1,204
5,046 0.001 15,30
f~
Tabla A5-6
Lquido sinovial INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS Unidades convencionales <10 mg/dl
Granulocitos <25% de clulas nucleadas Ausente Abundante <200 clulas/ml Elevado <3.
5 mi Factor 0,05551 0.01 Unidades del SI recomendadas <0,56 mmol/l Fraccin del n me
ro de granulocitos: <0.25 de clulas nucleadas Ausente Abundante <200 x 10* clulas/
litro Elevado <0,0035 1
COMPONENTE Diferencia de glucosa entre la sangre y el liquido sinovial Recuento
celular diferencial Cogulo de fibrina Cogulo de mucina Recuento de clulas nucleadas
Viscosidad Volumen
10" 0,001

APNDICE 5

UNIDADES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE (SI)

1435
Tabla A5-7
Liquido seminal INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE Licuefaccin Morfologa espermlica
Unidades convencionales A los 20 minutos >70% de espermatozoides normales y madu
ros
Factor
Unidades del SI r e c o m e n d a d a s A los 20 minutos
0,01 0,01 1 io 0.001
3
Fraccin numrica : >70% de espermatozoides normales y maduros Fraccin numrica: >0.60
>7,0 (valor medio = 7,7)
Motilidad espermlica PH Recuento espermtico Volumen
>60%
>7.0 (valor medio = 7,7) 60-150 x 10 /ml
f c
1,5-5,0 mi
60-150 x 10 /l 0,0015-0.005 I
9
Tabla A5-8
Lquido gstrico INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE Volumen residual en ayunas pH Secrecin acida basal (BAO)' Secrecin acid
a mxima (MAO) (tras estimulacin con histamina) Relacin BAO/MAO * Varia en luncin del
sexo y la edad
Unidades c o n v e n c i o n a l e s 200-100 mi <2,0 0-6 mEq/h 5-40 mEq/h <0,4
Factor 0.001 1 1 1 1
Unidades del SI recomendadas 0,02-0,101 <2,0 0-6 mmol/h 5-40 mmol/h <0,4
Tabla A5-9
Hematologa INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE Volumen de hemates varn mujer Volumen plasmtico varn mujer Pruebas de coa
gulacin y hemostasis tiempo de hemorragia

Unidades convencionales 20-36 ml/kg peso corporal 19-32 ml/kg peso corporal 25-4
3 ml/kg peso corporal 28-45 ml/kg peso corporal Depende de la localizacin y orien
tacin de la incisin y del instrumento empleado, generalmente de 2 a 8 minutos. Dep
ende de los reactivos de activacin y (osfolipidos empleados. generalmente de 25 a
35 segundos. 20-30 mg/dl 80-120 U/dl 1"M horas a 37 C Ninguno a las 24 horas y a
37 C Completo a las 4 horas y a 37 C 0.50-1.50 u/ml Cogulo insoluole en 5 mol/litr
o de urea a las 24 horas 200-400 mg/dl
Factor 0,001
Unidades del SI r e c o m e n d a d a s 0,020-0.036 l/kg peso corporal 0,019-0 0
32 l/kg peso corporal 0,025-0,043 l/kg peso corporal 0,028-0.045 l/kg peso corpo
ral
0,001

Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) Antitrombina III inmunolgica fun

cional Tiempo de lisis del cogulo (actor de euglobina sangre tolal Retraccin del c
ogulo Factores de coagulacin Factor XIII (prueba de rastreo) Fibringeno Productos d
e degradacin de la fibrina (fibringeno) FDP srico D-dmeros plasmticos Plasmingeno inm
nolgica funcional Proteina C Proteina S (total) Tiempo de protrombina
id 1 0
200-300 mg/l 800-1.200 U/l
1.000 0,01
500-1.500 U/l 2,0-4,0 g/l
<10 ug/ml <200 ng/ml 10-20 mg/dl 80-120 U/dl 0.7-1,4 u/ml 0.7-1,4 u/ml Depende d
el reactivo de tromboplastina empleado generalmente de 10 a 13 segundos Depende
de la concentracin del reactivo de trombina empleado, generalmente de 17 a 25 seg
undos
I I I!)
<10 mg/l <200 ug/i 100-200 mg/l 800-1.200 U/l 700-1 400 U/l 700-1 400 U/l
I0 1 0 1 0
Tiempo de trombina
La tabla contin a en la pgina siguiente

1436
APNDICES
Tabla A5-9
Hematologa (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE
Faclor de von Willebrand mmunolgica actividad del cofactor ristocelina Recuento s
anguneo completo (CBC) hematocrito varn mujer hemoglobina varn mu|er recuento de er
itrocitos varn mujer recuento leucocitario ndices de eritrocitos volumen corpuscul
ar medio (MCV) Hemoglobina corpuscular media (MCH) Concentracin media de hemoglob
ina corpuscular (MCHC) Recuento diferencial de leucocitos (adulto) neutrfilos seg
mentados bandas eosinlilos basfilos linfocitos monocitos Hemoglobina A., Hemoglobi
na F Fragilidad osmtica
Unidades convencionales
Factor
10 10
Unidades del SI recomendadas
500-1 500 U/l 500-1.500 U/i
50-150 U/dl 50-150 U/dl
41.5-50.4% 35.9-44.6% 14.0-17.5 g/dl 12.3-15.3 g/dl 4.5-5.9 x 10"7pl 4.5-5.1 x 1
0"/|il 4.4-11,0 x 107pl 80-96 |_m
:
0.01
Fraccin de volumen: 0.415-0.504 0.359-0.446 140-175 g/l 123-153 g/l 4.5-5,9 x 10'
TI 4,1-5,1 x 10'7I 4.4-11.3 x 1071 80-96 fL 27.5-33,2 pg Fraccin de concentracin:
0.334-0,355
10
10* 10' 1 1 0.01
27.5-33.2 pg 33.4-35.5%
Porcentaje medio 56% 3% 2,7% 0.3% 34% 4%
Rango de recuentos absolutos 1800-700/! 0-700/pl 0-450/1 0-200/1 1000-4800/pl 0-800
/pl 1.5-3,5% de hemoglobina total
1010 10" 10r> 10' 0.01 0,01 % NaCI-171 % de Lsis-0,01
<2% & ci LISIS % (p/v) NaCI Fresco 0,2 0.3 97-100 0.35 90-99 0.4 50-95 0.4b 5-45
0,5 0.6 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 150 000-450 000/pl 0.5-1.5% 25.000-75.000 clulas/|
il 24 loras a 37 95-100 85-100 75-100 65-tOO 55-95 40-85 15-70 0-40 0-10 0-5 0
Fraccin de Rango de media numrica recuento absoluto t,8-7.8 x 1071 0.56 0-0,70 x 1
071 0,03 0-0.45 x 1 0 7 1 0.027 0-0,20 x 1071 0,003 1.0-4.8 x 1071 0.34 0-0.80 x
1071 004 Fraccin de masa: 0,015-0.035 de hemoglobina total Fraccin de masa: <0.02
Fraccin lisada NaCI 24 horas mmol/l Fresco a 37" 342 0,95-1,00 51.3 0.97-1,00 0,
85-1.00 59 8 0.90-0,99 0,75-1.00 68 4 0,50-0,95 0,65-1.00 770 0.05-0,45 0,55-0,9
5 85.5 0-0,06 0,40-0,85 94 1 0 0,15-0,70 1026 0-0.04 111.2 0,010 1197 0-0,05 128

3 0 150-450 x 1 traccin numrica: 0.005-0.015 25-75 x 1071

Recuento plaquetario Recuento de reticulocitos Velocidad de sedimentacin (ESR) (W
estergren) varones menores de 50 aos varones de 50 a 85 aos varones mayores de 85
a o s mujeres menores de 50 anos mujeres de 50 a 85 aos mujeres mayores de 85 a o
s Viscosidad ndice de sedimentacin Zeta
106 0,01 10
6
< 15 mm/h <20 mm/h <30 mm/h <20 mm/h <30 mm/h <42 mm/h 1 4-1,8 veces la del agua
41-54% 1 0.01 14-1.8 veces la fraccin del agua: 0.41-0.54
Todos los porcenlaies se multiplican por 0.01 para obtener la traccin

APNDICE 5

UNIDADES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE ( S I )

1437
Tabla A5-10
Lquido amnitico INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS
COMPONENTE Aspecto periodo temprano de gestacin a trmino Albmina periodo temprano d
e gestacin a trmino Bilirrubina periodo temprano de gestacin a trmino Cloruro period
o temprano de gestacin a trmino Creatinma periodo temprano de gestacin a trmino Estr
iol periodo temprano de gestacin a trmino Lecitina / estingomielina temprano (inma
duro) a trmino (maduro) Osmolalidad periodo temprano de gestacin a trmino Pco perio
do temprano de gestacin a trmino
2
Unidades convencionales
Factor
U n i d a d e s del SI r e c o m e n d a d a s Claro Claro o ligeramente opalesc
ente 3,9 g/l 1,9 g/l
Claro Claro o ligeramente opalescente 0.39 g/dl 0.19 g/dl <0,075 mg/dl <0,025 mg
/dl Aproximadamente equivalente al cloruro srico Generalmente 1-3 mEq/litro infer
ior al cloruro srico 0.8-1,1 mg/dl 1.8-4,0 mg/dl (generalmente >2 mg/dl) <10ug/dl
<60 ug/dl <1:l >2:1 Aproximadamente equivalente a la osmolalidad srica 230-270 m
Osm/kg 33-55 mm Hg 42-55 mm Hg (aumenta al llegar a trmino) 7,12-7.38 6,91-7,43 (
disminuye al llegar a trmino) 0.60 0,24 g/dl 0.26 0,19 g/dl Aproximadamente equiva
lente al sodio srico 7-10 mEq/litro inferior al sodio srico (aumenta al llegar a tr
mino)

17.10 1
<1.3 umol/l <0.41 iimol/l
Generalemente 1-3 mEq/litro inferior al cloruro srico 71-97 umol/l 159-354 umol/l
(generalmente >177 umol/l) <347 nmol/l >2 081 nmol/l <1:1 >2:1 Aproximadamente
equivalente a la osmolalidad srica 230-270 mmol/kg 4,4-7,3 kPa 5.6-7,3 kPa (aumen
ta al llegar a trmino) 7.12-7,38 6,91-7,43
88,40
3,468
I 1 1
1 0.1333
riUI
PH periodo lemprano de gestacin a trmino Proleina total periodo temprano de gestac
in a trmino Sodio periodo lemprano de gestacin a trmino

1
I
60 2.4 g/l 2.6 1.9 g/l
1
7-10 mmol/l inferior al sodio srico
Tincin, citolgica Rojo aceite 0 periodo temprano de gestacin a trmino Sulfato azul N
ilo periodo temprano de gestacin a trmino Urea periodo lemprano de gestacin a trmino
cido rico periodo temprano de gestacin a trmino Volumen periodo temprano de gestacin
a trmino
s .
<10% >50% 0 >20% 18,0 5.9 mg/dl 30.3 11,4 mg/dl 3.72 0,96 mg/dl 9.90 2,23 mg/dl
450-1 200 mi 500-1.400 mi (aumenta al llegar a trmino)
0,01

Fraccin teida: <0,1 >0.5 Fraccin teida: <0,0 >0,2 3,00 0,98 mmol/l 5,04 1.90 mmol/l
221 57 nmol/l 589 133 umol/l 0,45-1,2 I 0.5-1.4 I (aumenta al llegar a trmino)
0,01
0,1665
59,48
0.001

1438
APNDICES
Tabla A5-11 Liquido cefalorraqudeo INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Albmi
na Recuento celular Glucosa Lactato deshidrogenasa (LDH) Protenas Electrotoresis
de protenas prealbmina albmina alfa-1-globulina alfa-2-globulina beta glubulina gam
ma globulina Xantocroma Unidades convencionales < 10-30 mg/dl <5 clulas/uI 40-80 m
g/dl Aproximadamente el 10% del nivel en suero 12-60 mg/dl 2-7% 56-76% 2-7% 4-12
% 8-18% 3-12% Negativo Factor 10 10 005551
6
Unidades del SI recomendadas 100-300 mg/l <50 x 10-71 2.8-4,4 mmol/l Fraccin de l
a actividad: aproximadamente 0 1 del nivel en suero 120-600 mg/l
10 0,01 Fraccin: 0,2-0.07 056-0,76 0,02-0,07 0.04-0,12 0 08-0.18 0,03-0,12 Negati
vo
Tabla A5-12 Miscelnea INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Bilis, cualitativ
a Cloruro Aclaramientos creatinina, endgena Diodrast inulina PAH Azul de Diagnex
(anlisis gstrico sin sonda) Grasa grasa total grasa neutra cidos grasos libres cidos
grasos combinados/ conjugados Nitrgeno, total Sodio Tripsina, actividad Captacin
de I " en el tiroides Urobilingeno cualitativo cuantitativo
V
|:
SISTEMA Heces al azar Sudor Suero y orina (pautados)
Unidades convencionales Negativo en adultos Positivo en nios 4-60 mEq/l 115 20 ml
/mn 600-720 ml/min 100-150 ml/min 600-750 ml/min cido libre presente <5 g/24 h 1025% de materia seca 1-5% de materia seca 5-13% de materia seca 5-15% de materia
seca
Factor

Unidades del SI recomendadas Negalivo en adultos Positivo en nios 4-60 mmol/l 1,9
2 0.33 ml/s 10.00-12.00 ml/s 1.67-2.50 ml/s 10.00-12.50 ml/s cido libre presente
<5 g/d Fraccin de la masa: 0,1-0,25% de materia seca 0.01-0,05% de materia seca 0
.05-0,13%de materia seca 0,05-0,15% de materia seca Fraccin de masa: 0,1 de la in
gesta 71-143 mmol/d 10-80 mmol/l Positivo (2+ a 4+) Fraccin de la ingesta: 0,0750,25 en 6 horas Positivo 68-339 umol/d

1 0.01667
Orina Heces. 72 h

1 0,01 0.01 0.01 0.01 0.01 71,39 1 0.01

Heces. 24 h Sudor Hocos frescas, al azar
10% de la ingesta 1-2 g/24 h 10-80 mEq/l Positivo (2+ a 4+) 7,5-25% en 6 horas
Heces al azar Heces. 24 h
Positivo 40-200 mg/24 h 80-280 unidades Ehrlich/24 h


1 693

Tabla A5-13 Seleccin de valores de referencia peditricos S'-Fosfatasa cida neonato

2-13 aos S-Aldolasa neonato nio S-Foslatasa alcalina neonato nio S-a-fetoprotena neo
nato 2 semanas S-Amilasa neonato 1 ao S-Aspartato aminolransterasa neonato 1-3 aos
S-Bilirrubina neonato
24 h 48 h 7,4-19,4 U/l 6,4-15,2 U/l
4 veces el valor del adulto 2 veces el valor del adulto
40-300 U/l 60-270 U/l
hasta 100 mg/l ndetectable actividad amilasa escasa o nula valores del adulto
16-74 U/l 6,30 U/l
PRETRMINO
A TRMINO 34-103 nmol/l (20-60 mg/l) 103-120 nmol/l (60-70 mg/l) 68-205 nmol/l (40
-120 mg/l)
17-30 nmol/l (10-60 mg/l)
103-137 umol/l (60-80 mg/l) 171-257 umol/l (100-150 mg/l) 1,50-2,50 mmol/l 1.753,00 mmol/l 2.50-3,00 mmol/l 2,25-2,87 mmol/l (60-100 mg/l) (70-120 mg/l) (100-1
20 mg/l) (90-115 mg/l)
3-5 dias S-Calcio pretrmino. primera semana a trmino, ltima semana 1-2 aos 2-16 aos U
-catecolaminas
:
NOREPINEFRINA 1 ao
EPINEFRINA
1-5 aos 6-15 aos > 1 5 aos U-Cloruro (varia con la ingesta de cloruro) beb nio S-Cole
slerol sangre umbilical 1-2 aos 2-16 aos U-Cortisol (libre) 4 meses-10 aos 11-20 aos
S-Creatina quinasa neonato 3 semanas-3 meses >1 ao
30-90 nmol/d (5,4-15.9 ng/d) 50-180 nmol/d (8,1-30,8 ug/d) 110-420 nmol/d (19 ,0
-71.1 ug/d) 200-510 nmol/d (34,4-87.0 ug/d)
1-23 nmol/d (0.1-4,3 ng/d) 4-50 nmol/d (0,8-9 ,1 ng/d)
7-339 nmol/d (1.3-10.5 ng/d)
19-72 nmol/d (3,5-13,2 ng/d)
1,7-8.5 mmol/d
17-34 mmol/d
1,2-2,5 mmol/l (460-980 mg/l) 1.8-4.9 mmol/l (700-1900 mg/l) 3.5-6.5 mmol/l (1.3
50-2 500 mg/l)
6-74 nmol (2-27 ug/d)
2-152 nmol/d (0,7-55 ug/d)
3 veces el valor del adulto 1,5 veces el valor del adulto valores del adulto

S-Creatinina Valor de referencia superior hasta los 5 aos hasta los 6 aos hasta lo
s 7 aos hasta los 8 aos hasta los 9 aos hasta los 10 aos > 10 aos S-Estradiol 0-2 aos
2-4 aos 4-6 aos 6-8 aos 8-10 aos 10-12 aos 12-14 aos 14-16 aos 16-26 aos Grasa feca
nato pretrmino neonato a trmino 3 meses-1 ao 1 ao P-cios grasos no esterificados neon
to 4 meses-10 aos S-Glucosa neonato pretrmino neonato a trmino beb S-Y-glutamicotran
sferasa neonato prematuro neonato-3 semanas 3 semanas-3 meses 1-5 aos 6-15 aos 16
aos-adulto S-Haptoglobina neonato 1 ao y mayores de 1 ao S-Inmunoglobulina IgG 0-5

semanas 6 meses 1 ao 5 aos 10 aos

44 nmol/l (5.0 mg/l) 53 nmol/l (6.0 mg/l) 62 nmol/l (7,0 mg/l) 71 nmol/l (8,0 mg
/l) 80 nmol/l (9,0 mg/l) 88 nmol/l (10.0 mg/l) 106 nmol/l (12,0 mg/l) 0-26 pmol/
l (0.7-pg/ml) 0-26 pmol/l (0-7 pg/ml) 0-51 pmol/l (0-14 pg/ml) 0-37 pmol/l (0-10
pg/ml)
0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml)
26-385 pmol/l (7-105 pg/ml) 26-1.175 pmol/l (7-320 pg/ml)
z o
o
m
cz
z
O >
hasta 0,40 excretado hasta 0,20 excretado hasta 0,15 excretado hasta 0,085 excre
tado
0-1,845 mmol/l 300-1.100 mmol/l
1,1-3.6 mmol/l (200-656 mg/l) 1,1-6,1 mmol/l (200-1.100 mg/l) 3.3-5.8 mmol/l (60
0-1.050 mg/l) 56-233 U/l 10-103 U/l 4-111 U/l 2-23 U/l 2-23 U/l 2-35 U/l
5 >
z o
>
o z >
haptoglobina detectable slo en 0,1-0,2 de valores del adulto
7.500-15.000 mg/l 1.500-7000 mg/l 1.400-10.300 mg/l 3.700-15.000 mg/l 4.400-15.5
00 mg/l
.a rab/a contina en la pgina siguiente
fe es -o

Tabla A5-13
Seleccin de valores de referencia peditricos* (continuacin) IgA ninguno 200-1.300 m
g/l 200-1.300 mg/l 300-2.000 mg/l 500-2.300 mg/l IgM <200 mg/l 300-600 mg/l 3001.600 mg/l 200-2.200 mg/l 300-1.700 mg/l Inulina 29-88 ml/minutos por 1,73 m de
superficie corporal 40-112 ml/minutos por 1,73 nV de superficie corporal 62-121
ml/minutos por 1,73 m' de superficie corporal 78-164 ml/minutos por 1,73 m de su
perficie corporal
J ?
S-Inmunoglobuima 0-5 semanas 6 meses 1 ao 5 aos 10 aos S-Inmunoglobulina 0-5 semana
s 6 meses 1 ao 5 aos 10 aos Aclaramiento de <1 mes 1-6 meses 6-12 meses >1 ao U-17-C
etosteroides 0-3 dias 1-3 aos 3-6 aos 6-9 aos 10-12 aos Adolescente
4 meses 1 ao 2-16 aos S-Potasio neonato pretrmino neonato a trmino 2 dias-2 semanas
2 semanas-3 meses 3 meses-1 ao 1-16 aos S-Testosterona
EDAD
1,55-2,62 mmol/l (48-51 mg/l) 1.26-1.94 mmol/l (39-60 mg/l) 0.84-1.61 mmo/l (2650 mg/l) 4,5-7,2 mmol/l 5,0-7.7 mmol/l 4,0-6.4 mmol/l 4,0-6.2 mmol/l 3,7-5.6 mmo
l/l 3.6-5,2 mmol/l
VARN MUJER
:
0-0.2 u.mol/d (0-0.5 mg/d) <7,0 pmol/d (<2.0 mg/d) 2-10 pmol/d (0,5-3.0 mg/d) 314 prnol/d (0.8-4.0 mg/d) varn: 2-21 pmol/d (0,7-6,0 mg/d) mujer 2-17 pmol/d (0,7
-5,0 mg/d) varn 10-52 nmol/d (3-15 mg/d) mujer: 10-42 pmol/d (3-12 mg/d) hasta 2
veces los valores del adulto
PRETRMINO A TRMINO
S-Lactato deshidrogenasa 1-3 dias S-Fsforo (inorgnico) neonato 6-10 das

0-2 aos 2-4 aos 4-6 anos 6-8 aos 8-10 aos 10-12 aos 12-14 aos 14-16 aos 16-18 aos 1
aos 20-25 aos S- Tiroxina 1-3 dias 1 semana-1 mes 1 4 meses 4-12 meses 1 -6 aos 6-1
0 aos
0,14-1.28 mmol/l (0-0.4 ng/ml) 0,17-5.55 nmol/l (0-1.6 ng/ml) 0,28-1,39 nmol/l (
0,1-0,4 ng/ml) 0.21-9.72 nmol/l (0.1-2,8 ng/ml) 0,31-1,74 nmol/l (0,1-0,5 ng/ml)
0.29-10,06 nmol/l (0.1-2.9 ng/ml) 0.17-26.37 nmol/l (0-7.6 ng/ml) 3.12-19.43 nm
ol/l (0.9-5.6 ng/ml) 9.02-25.33 nmol/l (2,6-7,3 ng/ml) 13.88-24,98 mol/I (4,0-7,
2 ng/ml) 11.80-38,86 nmol/l (3.4-11,2 ng/ml) 142-296 nmol/l (11,0-23,0 pg/dl) 11
6-232 nmol/l (9.0-18.0 pg/dl) 97-212 nmol/l (7,5-16.5 pg/dl) 71-187 nmol/l (5,514.5 pg/dl) 71-174 nmol/l (5,5-13,5 pg/dl) 64-161 nmol/l (5,0-12,5 pg/dl)
0.24-0,62 nmol/l (0,1-0.2 ng/ml) 0.24-0,69 nmol/l (0,1-0 2 ng/ml) 0.35-0,69 nmol
/l (0,1-0.2 ng/ml) 0.52-1.04 nmol/l (0.1-0.3 ng/ml) 0,69-1.39 nmol/l (0.2-0.4 ng
/ml) 0.69-1.74 nmol/l (0.2-0,5 ng/ml) 1,04-2.43 nmol/l (0.3-0,7 ng/ml) 1.21-3.30
nmol/l (0,3-1,0 ng/ml) 1.39-3.30 nmol/l (0,4-1,0 ng/ml) 1 39-3.30 nmol/l (0,4-1
,0 ng/ml) 1.39-3,30 nmol/l (0,4-1.0 ng/ml)
1.81-2.58 mmol/l (56.0-80.0 mg/l) 1,97-3,78 mmol/l (61-117 mg/l)
1.61-2,52 mmol/l (50.0-78,0 mg/l) 1.58-2,87 mmol/l (49-89 mg/l)
* Inlormacin basada en Melles S (ed): Pediatric Clinical Chemistry. Washington, D
C. American Association lor Clinical Chemistry. 1977. ' S = suero; U = orina; P
= plasma ' Como DHEA. v __