DE LA PROBETA A LOS GENES

Hormona de crecimiento, una epopeya

cientfica argentina

Descripcin cientfica
Juan M. Dellacha Y Jos A. Santom.

Nora Br

ndice

Prlogo

Frigorficos y mecheros de Bunsen

10

Carrera contra el tiempo

17

La fabriquita

23

De la mesada al consultorio

29

Cambio de rumbo

37

Una palabra que todava no estaba de moda

40

Una oveja llamada Dolly

46

La ingeniera de la vida

53

La farmacia en el tambo

63

Broche de oro

67

Eplogo

74

Los protagonistas

80

DESCRIPCIN CIENTFICO- TCNICA. HORMONA DE

CRECIMIENTO. | Estudios realizados en Argentina. Juan
M. Dellacha - Jos A. Santom.

85

Sumario

86

Formacin del grupo de trabajo para: el estudio de la hormona de crecimiento / Creacin del Centro para el Estudio
de las Hormonas Hipofisarias (CEHIP)

91

Investigaciones sobre hormonas del crecimiento del perodo 1963-1976

98

Investigaciones sobre hormonas del crecimiento posteriores

a 1976. Divisin del Grupo de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA

111

Colaboracin con la industria de investigadores de hormonas de crecimiento

136

Anexo A. Estructura de protenas

142

Anexo B. Breve descripcin de los fundamentos y metodologa empleada para determinar la estructura primaria de la
hormona de crecimiento bovina

143

Anexo C. Evolucin de las metodologas para determinar la

estructura primaria de protenas

148

Anexo D. Resumen de los conocimientos estructurales actuales sobre hormonas de crecimiento

150

Anexo E. Receptores hormonales

152

Registro fotogrfico

153

PRLOGO

A los nueve aos, despus de perder a su pap, Jseph Boruwlaski fue entregado por su madre como acompaante y entretenimiento de aristcratas. Jseph haba nacido apenas nueve aos antes, en
Polonia, y de all en ms se dedic a recorrer las cortes de Pars, Viena y Londres, deslumbr a prncipes y reyes, y hasta escribi un libro sobre sus aventuras y experiencias. Es ms, su celebridad le vali
una entrada de la clebre Enciclopedia Diderot. All aparece citado
en la definicin de enano: segn las crnicas de la poca y sus propios recuerdos, no lleg a superar el metro de altura.
Se calcula que uno de cada cinco o seis mil de los bebs que nacen
diariamente en el mundo pueden padecer esta dolencia causada en
la mayora de los casos por un dficit hormonal que, sin atencin
mdica, les impedir alcanzar una altura considerada normal. Su hipfisis, una glndula de forma ovalada situada en la base del crneo,
que mide milmetros, y pesa entre 500 y 700 miligramos, produce
una protena vital para que los tejidos se desarrollen, entre otras numerosas funciones: la hormona de crecimiento.
Su carencia no slo se traduce en baja estatura, sino tambin en una
irregular acumulacin de grasa, particularmente en el tronco, hipersensibilidad a la insulina, rasgos infantiles, fragilidad sea. En el
7

recin nacido, puede ocasionar hipoglucemias graves, que a su vez

pueden dejar secuelas cognitivas.
Hasta hace cuatro dcadas, los chicos nacidos con el mismo dficit
que padeci Jseph Boruwlaski (y dos de sus cinco hermanos) no
podan aspirar ms que a una vida de fenmenos. Las sociedades
humanas, se sabe, no perdonan a los que no caben en el molde de lo
previsto.
Hoy, detectado a tiempo, el enanismo hipofisario puede evitarse
reemplazando la hormona faltante por una versin prcticamente
idntica fabricada en el laboratorio.
Basta con realizar el tratamiento adecuado durante la adolescencia
para suplir lo que la naturaleza niega. Este consiste en administrar
una inyeccin subcutnea de la hormona biosinttica tres veces por
semana durante ocho a diez aos.
El resultado es notable: los chicos que responden bien pasan de crecer tres centmetros anuales a doce, y ganan en total unos treinta.
Es la diferencia entre llegar o no a presionar los pedales del automvil, alcanzar los pasamanos de los colectivos y subtes, poder mirar por sobre el mostrador del banco, tener derecho a unas fichas en
la lotera del amor, o poder presentarse a una entrevista de trabajo sin escuchar un no antes de siquiera abrir la boca.
Esos 30 centmetros marcan la distancia, en suma, entre insertarse
en la trama social o quedar relegado a los mrgenes.
La historia de la decodificacin, el desarrollo y la produccin industrial de la hormona de crecimiento humana abarc ms de tres dcadas del ltimo siglo. Como muchos otros logros humanos, fue una
historia de tenacidad, pasin, inteligencia y mucho, mucho traba8

jo. Pero lo ms singular, para los que vivimos en esta parte del mundo, es que tuvo como protagonistas a dos generaciones de cientficos
argentinos que, aunque muchas veces competan con equipamiento
casero y menos recursos que sus colegas del hemisferio norte, marcaron hitos cientficos que ya forman parte sustancial de la gran novela de la ciencia mundial.
Hombres y mujeres que trabajaron sin descanso para desentraar
uno a uno los 191 ladrillos (aminocidos) que componen la estructura de la hormona sintetizada, almacenada, y secretada por las clulas somatotropas de la hipfisis no slo investigaron en las fronteras
del conocimiento de su poca y publicaron sus trabajos en algunas
de las revistas ms prestigiosas del mundo cientfico, sino que al
mismo tiempo hicieron posible que decenas de chicos hasta ese momento excluidos u ocultados por sus propias familias recibieran
un tratamiento mdico que les cambi la vida.
Luego, fueron algunos de sus alumnos de la Universidad de Buenos
Aires, que ya haban abandonado las aulas y perseguan otros horizontes, los que tomaron la posta y siguieron avanzando para producir la hormona no ya manipulando probetas sino insertando genes
humanos en bacterias y hasta desarrollando animales transgnicos
capaces de producir en sus clulas la hormona humana!, una tecnologa que dominan slo un puado de pases.
De esa aventura que tuvo ribetes de epopeya trata este libro.

FRIGORFICOS Y MECHEROS DE BUNSEN

Corre 1958. El clebre Domenico Modugno se consagra en el Festival de San Remo y en la Argentina, Arturo Frondizi acaba de asumir
la presidencia despus de haber sido elegido en elecciones en las que
est proscrito el peronismo.
Es el Ao Geofsico Internacional, y ms de 30.000 cientficos y tcnicos de 66 pases se unen para realizar observaciones sobre la Tierra y sus alrededores csmicos.
Impulsada por la tecnologa, la humanidad avanza a grandes pasos,
tanto a ras del suelo como en el espacio. La expedicin neozelandesa dirigida por Edmund Hillary llega al Polo Sur. Rusos y norteamericanos hacen sus primeros intentos de enviar satlites fuera de la
atmsfera y confirman que no es tarea sencilla. El Sputnik 1 se desintegra a poco de ser lanzado y el cohete Atlas estalla en la plataforma de lanzamiento de Cabo Caaveral; es el quinto fracaso de siete
intentos de lanzamiento. James Van Allen descubre los cinturones
que llevan su nombre, dos zonas de radiacin de alta energa que
circundan la Tierra, probablemente donde el viento solar y los rayos
csmicos interactan con los tomos de la atmsfera. Son los primeros das de la NASA, cuando se pone en rbita el primer satlite de
comunicaciones de la historia.
10

La ciencia empieza a estar cada vez ms presente en los titulares

de la prensa. Por el Decreto Ley 1291, promulgado el 5 de febrero,
ese ao nace en la Argentina el Consejo Nacional de Investigaciones
Cientficas y Tcnicas (CONICET). El doctor Bernardo Houssay, que
en 1947 haba ganado el Premio Nobel de Fisiologa y Medicina por
su trabajo sobre la influencia del lbulo anterior de la hipfisis en la
distribucin de la glucosa en el organismo o, dicho de otro modo,
por demostrar que la hormona de crecimiento es antiinsulnica, es
elegido presidente, y el meteorlogo Rolando Garca, vicepresidente, ambos por unanimidad.
Segn cuentan Diego Hurtado y Adriana Felds en un artculo para
la revista Nmada, slo dos aos ms tarde se crea la llamada carrera del investigador, que por primera vez permitira a cientficos
argentinos dedicarse por completo a la investigacin y la docencia.
Tambin se ponen en marcha un programa de becas destinadas a la
formacin de recursos humanos tanto en el pas como en el extranjero, y un programa de subsidios para investigaciones especficas, y
adquisicin de equipos e instrumental, repatriacin, contratacin de
investigadores extranjeros y viajes al exterior.
En la entonces Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad de
Buenos Aires, en el Instituto de Histologa y Embriologa, dirigido
por el doctor Eduardo De Robertis, integrante del primer directorio del CONICET, el profesor Carlos Gmez, Juan Dellacha y Roberto Mancini empiezan a estudiar la distribucin de ciertas protenas
en los tejidos marcndolas con molculas fluorescentes, una tcnica
que estaba comenzando a utilizarse en el mundo.
Lo que hacan era inyectarles a roedores protenas marcadas con
un colorante que tiene la particularidad de emitir fluorescencia rojiza cuando se lo excita con luz ultravioleta, la lisamina rodamina
B 200. Despus las sacrificaban en distintos momentos y procesa11

ban los tejidos que resultaban de inters para estudiarlos bajo el microscopio.
Haciendo cortes muy delgados, los cientficos podan observar dnde se ubicaba la protena, tcnica esencial para saber cmo acta una
hormona. En esos aos prevaleca la idea que las hormonas no penetraban en las clulas, pero Dellacha y Mancini, trabajando con la tirotrofina (TSH, segn sus siglas en ingls), que es secretada por el
lbulo anterior de la hipfisis y que le indica a la tiroides que debe aumentar su produccin de tiroxina y triodotironina, la inyectaron en
ratas de laboratorio y a los pocos minutos la localizaron en la membrana celular de la tiroides. Instantes ms tarde, la fluorescencia desapareca de la membrana y apareca en el interior de la clula, lo que
constituy una elegante demostracin de que la hormona s ingresaba en el citoplasma celular, donde produce su efecto caracterstico.
Estos experimentos refutaron un dogma de la poca, se publicaron
en Nature y fueron los primeros en demostrar que las hormonas penetran en la clula blanco a los pocos minutos de ser inyectada. Ms
tarde, Dellacha y Mancini marcaran con la protena fluorescente la
hormona de crecimiento, y tambin probaran el mismo efecto.
Dellacha era entonces un joven cientfico que, gracias a esos trabajos, obtuvo la nica beca que ofrecan los Institutos Nacionales de
Salud de los Estados Unidos a la Argentina para formarse en el Instituto Sloan-Kettering de Investigacin del Cncer bajo la direccin
del doctor Martin Sonenberg.
Haba nacido en el barrio porteo de Caballito, sobre la avenida Juan
Bautista Alberdi, salpicada de plazoletas, polvo de ladrillo, canteros
y grandes jarrones con plantas, y bordeada de casas bajas.
Hijo de un empresario textil que haba comenzado a trabajar des12

de muy joven como artesano en herrera y que junto con dos hermanos haba hecho parte de la verja de la Catedral de La Plata, Dellacha
sospecha que recibi de su padre parte de su curiosidad e ingenio
tcnico.
No era cientfico, pero tena una gran inclinacin tcnica recuerda. Le doy un ejemplo: tanto mi padre como mis dos tos solan
guardar en una caja las agujas que se usaban en las mquinas textiles que se rompan por arriba y en otra, las que se rompan por abajo. Cuando estall la Segunda Guerra Mundial, las agujas, que eran
de fabricacin britnica, dejaron de llegar al pas y muchas fbricas
tuvieron que cerrar. Pero ellos inventaron un sistema para unir ambas partes, las soldaban con bronce, y as pudieron mantener la produccin.
Dellacha haba egresado como maestro de la escuela Mariano Acosta. Pero dado que se haban eliminado las equivalencias entre el magisterio y el bachillerato, para dar el ingreso a la Escuela de Farmacia
y Bioqumica de la Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad
de Buenos Aires, rindi todas las materias de cuarto ao entre diciembre y marzo, y curs quinto en el Urquiza, de Carabobo y Pedro Goyena.
Como practicante en la farmacia del Hospital de Nios, fue compaero del legendario Carlos Gianantonio. Si bien en esos das la carrera de cientfico era algo as como una excentricidad, una ancdota
deja ver que ya lo dominaba la pasin del investigador. Al hospital
llegaban muchos chicos deshidratados cuenta. Yo me haba comprado el libro Bioqumica de la Enfermedad, de Bodansky y Bodansky, que en uno de sus captulos desarrollaba el tema de la deshidratacin infantil, y estableca la importancia de la determinacin de la
reserva alcalina para su tratamiento. As que fuimos con Gianantonio al laboratorio de infantes, que era el de los chicos ms chiquitos,
13

y le pedimos al director que en nuestros das de guardia nos dejara hacer el anlisis de las reservas alcalinas de esos chicos para poder formular un pronstico. Ah ya estbamos empezando a investigar...
Otro da, lleg un chico con sntomas que los mdicos no alcanzaban
a reconocer. Finalmente, les pareci que estaban ante un caso de escorbuto, algo excepcional en esta parte del mundo. Pero no haba
cmo probarlo. A Dellacha se le ocurri que los laboratorios Roche
deban tener un reactivo para detectar la deficiencia de vitamina C
y les pidi que se lo proporcionaran. Hicimos el anlisis y se confirm, tena una carencia absoluta, recuerda.
En 1962, Alejandro Paladini, profesor titular de Qumica Biolgica
I en la Facultad de Farmacia y Bioqumica, que haba intervenido en
los trabajos que le valieron el Nobel a Luis Federico Leloir y el nico
que en ese momento haca investigacin desde el punto de vista metablico, lo invit junto con otro joven investigador, Jos Santom,
a un concurso de profesores adjuntos en el Departamento de Qumica Biolgica.
Paladini recuerda haberle propuesto a Dellacha regresar desde Nueva York para incorporarse a su grupo. No tena otro lugar de trabajo, salvo el Hospital de Nios, pero all no tendra ninguna posibilidad de continuar con sus investigaciones dice. Nosotros tenamos
un instituto que habamos armado para estudiar protenas. Adems
tenamos algn instrumental caro, como una ultracentrfuga analtica, que ya no usaba nadie. Con esa centrfuga prob que las dos
hormonas de crecimiento, la humana y la bovina, tenan el mismo
peso aproximadamente.
Santom haba nacido en Parque Patricios y, a pesar de que su padre
tena inclinacin por la literatura, desde chico se sinti deslumbra14

do frente al mundo natural. Tenamos todo tipo de animales: pavos, patos, palomas, y un ao llegamos a criar 53 pollos recuerda,
divertido. Yo estudiaba qu coman, cmo iban creciendo. Me interesaba cmo vivan.
Nunca se haba imaginado que poda dedicarse a la ciencia, pero en
la escuela secundaria Bernardino Rivadavia, despus de haber pasado por un colegio religioso, se interes por la qumica y las ciencias
exactas. Me atraa mucho la evolucin; de hecho, trabaj durante
varios aos en la evolucin de la protena transportadora de cidos
grasos, cuenta.
Cuando lleg el momento de ingresar a la facultad, se decidi por
la bioqumica, una carrera que debi cursar mientras desempeaba
diversos trabajos, porque su padre falleci mientras comenzaba sus
estudios universitarios. Llegu a trabajar en cinco lugares diferentes al mismo tiempo exclama: en una clnica oncolgica, en los laboratorios Dupont, realizando anlisis clnicos en un laboratorio... Y
en todos lados introduca una modificacin en los mtodos existentes. Mis compaeros siempre me decan que tena que dedicarme a
la investigacin.
Uno de los temas del laboratorio de Sonenberg era la hormona de
crecimiento. En esos tiempos era comn utilizar insulina de origen
animal para el tratamiento de la diabetes en personas. Dado que es
casi idntica a la humana, se la extraa del pncreas de la vaca, el caballo, el cerdo y hasta de ciertos pescados, aunque en algunos casos
produca alergia por deficiencias en su purificacin.
De all surgi la idea de estudiar la posibilidad de utilizar la hormona de crecimiento bovina para tratar la deficiencia de la misma protena en chicos, recuerdan hoy los investigadores. Sin embargo, entre muchos otros obstculos derivados de la tecnologa disponible
15

para estudiarla, haba uno fundamental: la hormona de crecimiento distaba mucho de ser homognea; es decir, estaba acompaada de
otros elementos.
Lo saban porque cuando la analizaban por centrifugacin, la velocidad de sedimentacin indicaba que estaban ante varias sustancias.
Y lo mismo ocurra cuando la sometan a electroforesis libre, una
tcnica para separar molculas de acuerdo con su movilidad en un
campo elctrico. El procedimiento se realizaba sobre un acetato o a
travs de una matriz porosa donde se ubican en distintos lugares de
acuerdo con su carga.
Dellacha propuso entonces elaborar un mtodo para preparar, a partir de hipfisis bovinas, hormona de crecimiento homognea para
emplearla en forma teraputica. Aunque lo lograron al cabo de un
par de meses, luego se vio que la idea inicial sera impracticable porque slo la hormona de crecimiento humana y de simio eran activas
en las personas, por lo que sera imposible usar hormonas de crecimiento de otros mamferos en la clnica mdica.
Entre otras causas, se especul con que no actuaban debido a su tamao molecular, ya que se crea que en las hormonas humana y de
simio era aproximadamente la mitad del de otras especies animales.
De hecho, algunos laboratorios en el mundo intentaron modificarlo
mediante digestiones enzimticas controladas para obtener un producto activo en humanos a partir de hormonas animales. Esas manipulaciones permitieron comprobar efectos metablicos y anablicos
(promotores del crecimiento muscular).
Se descubri, por ejemplo, que producan retencin de nitrgeno,
una seal de que haba sntesis de protena. Es decir, haba cierta accin, pero no la accin. No hacan crecer, recuerda Santom.

16

Carrera contra el tiempo

A pesar de las dificultades, a su regreso de los Estados Unidos Dellacha sigui dispuesto a continuar en el tema e invit a Paladini y
Santom a formar un equipo de trabajo para as poder atacar el problema de la hormona de crecimiento bovina desde varios ngulos simultneamente.
El proyecto estaba en la cresta de la ola y posea el atractivo agregado de que poda ayudar a aclarar porqu esa protena no actuaba en seres humanos y, tal vez, permitir su modificacin estructural
para que s lo hiciera. Adems, pensaron los cientficos, tambin podra contribuir al tratamiento de chicos con retardo de crecimiento
de origen hipofisario mediante la obtencin de hormona a partir de
hipfisis humanas cadavricas.
Esta decisin los llev a ser protagonistas de una competencia internacional en la que tendran que medirse con cientficos del mundo
desarrollado que estaban tras la misma meta.
Segn cuenta en Das de Ciencia (Eudeba, 2010), Paladini vena de
trabajar en el Instituto Rockefeller, de Nueva York, con Lyman Craig,
en la purificacin de mezclas complejas con la tcnica de distribucin en contracorriente, y con Moore y Stein, en la determinacin de
17

la composicin en aminocidos de las protenas por cromatografa,

que consiste en filtrar una solucin de la mezcla que se desea analizar a travs de un medio poroso.
Dellacha y Santom recuerdan que el departamento de Qumica
Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA tena
en ese entonces una buena cmara frigorfica que haba hecho construir precisamente Paladini. l la necesitaba porque trabajaba en
angiotensina de origen bovino, cuentan. La angiotensina, hormona
que eleva la presin sangunea y de la que hoy se sabe que hay tres
versiones, haba sido descubierta por el fisilogo argentino Eduardo
Braun-Menndez y su grupo hacia 1939.
Toda protena, y las hormonas lo son, es una cadena lineal de aminocidos. Para poder catalogarlos, un paso ineludible para lograr el
objetivo que se haban planteado, Dellacha y Santom se enfrentaban al desafo de producir y conservar cantidades importantes de
hormona de crecimiento bovina. Y como para poder extraerla es indispensable mantener el tejido a una temperatura constante de entre cero y cinco grados centgrados, esa cmara frigorfica resultaba
un recurso ideal para montar una pequea fbrica.
Lejos del glamour con que hoy los retrata el cine, los cientficos de
esos tiempos estaban obligados a asumir tambin el papel de artesanos. El propio Paladini cuenta en su autobiografa que, tal vez por
las vivencias que le haba transmitido su padre escultor, tena una
inclinacin marcada por las artes manuales y que lo deslumbraba la
tarea de los vidrieros cientficos. Ellos transformaban sencillos tubos en complicados aparatos, dice, que luego se usaban en los laboratorios.
Pero en el proyecto que iban a acometer, los cientficos y tcnicos
que participaron no slo tendran que meter las manos en la masa,
18

sino que adems terminaran enfrentndose a una tarea titnica.

La historia, reconstruida hoy por Dellacha y Santom, haba comenzado con una propuesta de Paladini, que consider que el primer
aporte que el grupo podra hacer sera la separacin de las tres bandas que aparecan cuando se la someta a electroforesis en geles de
poliacrilamida, lo que les permitira verificar la homogeneidad de la
hormona de crecimiento bovina. Para esto, el laboratorio dispona
de un moderno equipo de distribucin en contracorriente de 1.000
tubos, sistema que haba demostrado un elevado poder de resolucin
de mezclas complejas, incluyendo polipptidos (molculas de ms
de diez aminocidos), pero que no se haba probado en protenas.
La distribucin en contracorriente es una tcnica que haba sido desarrollada por Lyman Craig para resolver las dificultades que exiga establecer la pureza qumica exacta de las drogas complejas para
prevenir y tratar la malaria, de elevado peso molecular e inestabilidad qumica, que se introdujeron en la Segunda Guerra Mundial.
Craig transform una operacin clsica en qumica, como es el reparto de una substancia entre dos solventes no miscibles, en un mtodo de purificacin de mezclas complejas, cuya potencialidad es,
tericamente, ilimitada, escribe Paladini en Das de Ciencia.
Segn explica el investigador, la operacin era increblemente trabajosa. Consista en introducir una sustancia pura en la primera ampolla de la serie de 1.000, junto con volmenes iguales de dos lquidos que no se mezclan, como el ter y el agua. Se agitaba la ampolla
durante un tiempo, hasta que se distribua la sustancia entre los dos
lquidos, y luego se pasaba la fase superior a la ampolla siguiente,
que solo contena agua. Luego se agitaban ambas ampollas, y se pasaba el lquido de la primera a la segunda, y se repona la sustancia
pura en la primera. Este proceso se repeta cada vez con una nueva
ampolla, de modo que la sustancia se iba distribuyendo entre dos ca19

pas de lquidos no miscibles que circulaban en direcciones opuestas.

Uno de los primeros frutos de esta tcnica fue la purificacin qumica de la penicilina en la Universidad de Cornell, en Nueva York.
En Buenos Aires, Paladini, Dellacha y Santom trabajaron varios
meses con ese equipo y enviaron las distintas fracciones que obtenan al laboratorio de Sonenberg, en Estados Unidos, para la determinacin de su actividad biolgica. Con gran decepcin, comprobaron que la distribucin en contracorriente desnaturalizaba la
molcula de la hormona y la inactivaba.
Por esos das, Dellacha recibi un subsidio de 4.000 dlares de los
Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Los aport a
todo el grupo y de ese modo pudieron sumar dos nuevos dispositivos
que resultaron fundamentales: un destilador y una centrfuga refrigerada, que todava se guardan entre los equipos del laboratorio.
Con estos insumos, los tres investigadores resolvieron que cada uno
se ocupara de un aspecto distinto del estudio de la hormona bovina
para acelerar la tarea. As, cada uno avanzara en su lnea de trabajo
y luego discutiran en conjunto los resultados para seguir adelante.
A fines de la dcada de 1960 se haba descubierto que las hormonas de crecimiento constituan un grupo de protenas estrechamente relacionadas, pero con una peculiar especificidad de especie en su
actividad biolgica. Quiere decir que las hormonas de otros mamferos no eran activas en primates dice Santom. Estas caractersticas decidieron a varios investigadores a intentar modificaciones en
distintas hormonas de crecimiento para hacerlas activas en humanos. Pero para aspirar a tener xito en esa tarea, era muy importante conocer los engranajes moleculares que explicaban ese comportamiento. Con el objetivo de contribuir a la solucin del problema, el
20

subgrupo de Paladini explor algunas caractersticas diferenciales

de la estructura tridimensional de las hormonas de crecimiento humana, bovina, ovina, porcina y equina.

Con una participacin protagnica del rosarino Csar Cambiaso,
que estaba haciendo su tesis de doctorado, pudieron comprobar, por
ejemplo, que la hormona de crecimiento humana es de dos a diez veces ms permeable al solvente que las otras. Tambin probaron que
existen diferencias de especie en la interaccin de las hormonas de
crecimiento con la membrana de los glbulos rojos de la sangre (eritrocitos).
El subgrupo de Dellacha, por su parte, decidi verificar si era cierta
la asignacin de un peso molecular de 46.000 a la hormona de crecimiento bovina, aproximadamente el doble del correspondiente a las
hormonas de origen humano y de simio. Los resultados, obtenidos
con el nico equipo que tena la UBA para determinar el peso molecular de protenas mediante la tcnica de centrifugacin analtica,
que consista en medir el desplazamiento de una protena en solucin en un campo gravitacional intenso, les permitieron determinar
que rondaba los 22.000, similar al de la hormona humana.
Mientras tanto, Santom y la bioqumica Carlota Wolfenstein incubaron la hormona de crecimiento bovina con diversas enzimas para
determinar la secuencia de los aminocidos del extremo C-terminal
de la hormona. Y hasta tuvieron que destilar, con grandes precauciones, hidracina altamente explosiva (es un compuesto qumico frecuentemente utilizado como precursor de catalizadores de polimerizacin y frmacos, pero que tambin se usa como combustible para
cohetes espaciales y satlites). Estos experimentos confirmaron los
resultados de Dellacha, que el peso molecular era cercano a 20.000,
y rectificaron los datos de otros autores.

21

Wolfenstein recuerda que en esa poca era muy tmida, pero fue invitada a integrar la ctedra de Qumica Biolgica porque haba dado
un examen excelente. A veces creo que el destino decide por uno lo
que va a hacer confiesa. A m me gustaba la medicina, pero me resultaba demasiada la responsabilidad de tener una vida humana en
mis manos. La qumica me gust en cuanto la curs. Esa materia era
lo mximo para nosotros.
Un dato curioso ayuda a imaginar esos das en los que naca la ciencia local: las integrantes del grupo de Santom eran todas mujeres.
El doctor Houssay deca que si uno no tena un ingreso independiente no poda dedicarse a la investigacin, porque de eso no se poda vivir cuenta Wolfenstein. Los hombres, que tenan que mantener una familia no podan darse el lujo de trabajar en ciencia.
Y agrega: Cuando yo empec, ramos dos becarias, una por Dellacha y otra por Santom. Empezbamos por preparar la hormona.
Recibamos las hipfisis congeladas, que venan con cartlago, entonces tenamos que entrar en la cmara fra bien abrigadas y cortarlos con tijera para ir pelando las glndulas. Despus segua todo
el proceso de preparacin que hacamos en la cmara fra. Era muy
trabajoso. Pero el doctor Santom era la persona ms maravillosa
que se pueda imaginar: a l le debo todo lo que soy. Me acostumbr a
opinar y me dio ms confianza. Tiene una personalidad maravillosa,
siempre tuvo un trato muy clido con todos. Cuando trabajbamos
con la hidracina o con soplete, porque todo se haca a mano, siempre
me alejaba porque no quera que corriera peligro.

22

La fabriquita

Una vez ms, el trabajo era lento y agotador.

Primero detallan Dellacha y Santom, haba que hacerse de las
hipfisis, una tarea que, contrariamente a lo que podra pensarse,
no iba a resultar nada sencilla. Decidieron comprar las glndulas bovinas en frigorficos y procesarlas de a dos kilos por vez, utilizando
enormes ollas de acero inoxidable de 20 litros.
All las trituraban y comenzaba el trabajoso proceso de extraccin.
El tejido se dejaba macerar con agitacin continua durante doce horas para que las sustancias proteicas se solubilizaran. Se obtena un
lquido espeso y rojizo, que luego se centrifugaba cuentan.
Lo que no quedaba en solucin, se iba al fondo del recipiente. Se retiraba el sobrenadante, se le agregaban sulfato de amonio y otras sales, y se haca un fraccionamiento para sacar las protenas ms pesadas, que son las que primero se precipitan. Se volva a centrifugar, se
retiraba lo que quedaba en el fondo y comenzaba todo nuevamente.
El mismo proceso se repeta varias veces hasta que se haca un tratamiento con alcohol en muy baja concentracin para llegar al precipitado final, que era el que contena la hormona.

23

Eso se liofilizaba (es decir, el agua pasaba del estado slido al gaseoso sin pasar por el lquido) y se obtenan aproximadamente tres gramos de protena, que se purificaban colocndolos en columnas de
alrededor de un metro de largo de un polmero con esferitas esponjosas que se conoca con el nombre de Sephadex.
De cada partida obtenan entre un gramo, y un gramo y medio de
hormona!
El Sephadex es un polmero que tiene una trama especial hecha
de esferitas esponjosas explican los cientficos. Uno tiene millones de sas, y cuando pone sustancias de distinto peso molecular, algunas van a pasar por afuera porque no entran en los agujeritos, y
otras se deslizan a distinta velocidad segn puedan atravesar agujeritos ms grandes o ms chicos. Por el extremo inferior de la columna van saliendo las protenas, comenzando por las ms pesadas.
Gracias a un registro muy meticuloso, los cientficos podan descubrir por dnde sala la hormona que tena actividad biolgica. Tombamos esa fraccin y, ah s, la volvamos a dializar, volvamos a
liofilizarla y obtenamos un polvito, recuerdan.
Como todas las protenas, la hormona de crecimiento est formada
por una cadena de aminocidos, cada uno de los cuales tiene un grupo carboxilo y un grupo amino, y es capaz de unirse a otro para formar una cadena mediante una reaccin entre el grupo amino de un
aminocido (N-terminal) y el grupo carboxilo (C-terminal) del siguiente. Las protenas son sintetizadas en los ribosomas celulares
desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal.
Despus de llegar a determinar la secuencia del extremo C-terminal, Paladini y Dellacha estimularon a Santom para que se lanzara
a revelar la estructura primaria total de la bGH, ofrecindole el apo24

yo de todos los integrantes del laboratorio, como as tambin la posibilidad de usar los locales y equipos con que contaban.

A la distancia, los cientficos confiesan que por esos aos verdaderamente pareca un despropsito encarar en nuestro pas el problema de comparar las estructuras primarias (la secuencia en que se
unen 20 diferentes aminocidos para formar la cadena caracterstica) de las hormonas de crecimiento humana y bovina, e intentar determinar las razones moleculares de la falta de actividad de la bovina en humanos.

Santom haba iniciado el estudio de la estructura del extremo Cterminal de la hormona de crecimiento bovina en 1963, cuando se
conoca la estructura primaria de muy pocas protenas, diez aos
despus de que Sanger y Thomson publicaran la estructura primaria
de la primera protena en ser secuenciada, la insulina, y tres despus
de que Moore y Stein dieran a conocer la de la ribonucleasa, que fue
la segunda protena cuya estructura se develaba. Choh Hao Li estaba determinando la de la hormona de crecimiento humana, tarea
que le llevara 10 aos.

Hicieron una evaluacin del equipamiento que posean, del nmero de colaboradores con que contaban, de la provisin de hormona
de crecimiento bovina y los subsidios disponibles, y resolvieron encarar el trabajo a pesar de que a primera vista pareca de una magnitud descomunal.
Segn dijo Paladini en su introduccin al Premio de la Academia Nacional de Ciencias a Santom por toda su trayectoria, el problema
qumico que implicaba determinar la secuencia de los aminocidos
que integran la hormona era formidable para la poca.

Si bien no estaban a la altura de los centros de primer nivel, tenan
25

un autoanalizador Technicon, donado a Paladini por la Fundacin

Rockefeller y al que, junto con su tesista Nstor Gonzlez Cadavid,
haban dotado de nuevos mdulos y adaptado al anlisis automtico de aminocidos. Tambin contaban con resinas para el armado
de columnas cromatogrficas destinadas a la separacin de pptidos resultantes de la digestin enzimtica de protenas, un equipo
de electroforesis de alto voltaje para la purificacin de pptidos y cubas para la cromatografa en papel.
Con respecto a la cantidad de hormona necesaria, Moore y Stein
afirmaban que para determinar la estructura primaria de una protena se requera disponer de 1g mensual, cantidad que esperaban
obtener para la hormona de crecimiento bovina (bGH).
As las cosas, Dellacha mont una especie de fabriquita para preparar de un gramo a un gramo y medio de la hormona, de los cuales 300 miligramos mensuales de bGH se destinaban a determinar
la estructura primaria a partir de decenas de kilos de hipfisis bovinas adquiridas en frigorficos que eran congeladas individualmente,
inmediatamente despus de extradas del animal.
Para realizar las innumerables operaciones necesarias, se incorporaron al grupo de Santom y Carlota Wolfenstein, Mirtha Biscoglio,
Clara Pea, Edgardo Poskus y Silvia Daurat. Tambin Zulema Mazzani, Vernica Fontanive y la tcnica Dora Beatti.

Con el primer analizador automtico de aminocidos, podan obtener la composicin de un pptido cada 26 horas, pero gracias a la renovacin de los equipos, con el pasar de los aos ese tiempo se fue
reduciendo hasta poco ms de un hora.
Como se dijo, eran tiempos de ciencia artesanal, en los que los investigadores no slo deban estar al tanto de lo que se publicaba y del
26

trabajo de otros grupos en el mundo, sino tambin tener habilidad

manual y conocimientos tcnicos que les permitieran lidiar con aparatos nicos en el pas.
Paladini y Dellacha se ocupaban personalmente de su actualizacin,
pero pronto estos dispositivos fueron superados cuando, en 1967,
Pehr Edman dio a conocer un equipo al que no poda aspirar el grupo de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de
la UBA: el primer secuenciador automtico de aminocidos. Era capaz de determinar la secuencia N-terminal de 15 aminocidos en 24
horas con una nfima cantidad de la protena (250 nanomoles).
A poco de iniciado el proyecto, los argentinos se enteraron de que
haba otros dos grupos que tambin estaban determinando la estructura primaria de la hormona de crecimiento bovina: uno de la
Universidad de Sussex, en Gran Bretaa, y otro del Centro Mdico
de la Universidad de Duke, en los Estados Unidos.
Sin quererlo, el Departamento de Qumica Biolgica tuvo que competir con esos dos equipos, tratando de llegar antes a la meta para
no perder un trabajo de semejante magnitud si ellos daban a conocer
antes sus resultados, cuentan Santom y Dellacha.
Y a pesar de las dificultades, los cientficos de la UBA fueron los primeros en publicar el trabajo completo. Tardaron siete aos en completar la estructura primaria de la hormona de crecimiento bovina,
un hito mundial si se tiene en cuenta que hasta ese momento slo se
haban podido secuenciar pocas protenas. Ese mismo ao, Wallis,
de Sussex, present sus resultados en una revista de publicaciones
rpidas.
El esfuerzo rindi sus frutos. Aprovechando la experiencia adquirida y con la activa participacin de nuevos integrantes Horacio Fer27

nndez, Mario Zakin y Pascual Ferrara, los cientficos siguieron

adelante y pudieron determinar mucho ms rpidamente la estructura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y equina.
Detrs de estos estudios en distintos mamferos estaba la necesidad
de responder una pregunta que los inquietaba: porqu las hormonas bovina, ovina y equina no son activas en humanos, a diferencia
de lo que ocurre con la insulina bovina y la porcina, que se utilizaban en el tratamiento de la diabetes. Pensaron que la comparacin
de sus estructuras primarias permitira aclararlo e intentar modificaciones estructurales en la protena para obtener un derivado activo en humanos.
La historia de estos estudios est salpicada de ancdotas que revelan cmo la cotidianeidad y la trascendencia se entretejen en la vida
del cientfico. Una de ellas tiene ribetes entre cmicos e irreverentes. A esta altura de las investigaciones, Li haba finalizado la determinacin de la estructura de la hormona de crecimiento humana y
el grupo argentino las de origen bovino, ovino y equino. El estudio
comparativo mostr un alto grado de homologa entre ellas y no revel diferencias a las que pudiera atribuirse la falta de actividad en
humanos de las hormonas de otras especies. La pregunta segua sin
respuesta.

28

De la mesada, al consultorio

Antes de convertirse en investigador del recientemente creado CONICET, Dellacha haba sido practicante en la farmacia del Hospital
de Nios Dr. Ricardo Gutirrez. A su regreso de los Estados Unidos,
haba sido invitado a exponer sus estudios en el servicio de Endocrinologa Infantil dirigido por Martn Cullen. All trabajaba Csar
Bergad, pionero de esta disciplina en el pas, pero que se haba especializado en endocrinologa infantil en los Estados Unidos, particularmente en el tratamiento de nios con graves trastornos de crecimiento.
De ese encuentro, surgi la idea de obtener hormona de crecimiento a partir de hipfisis humanas. Estudiaron la propuesta con Cullen
y Paladini, y decidieron ir a ver a Bernardo Houssay para solicitarle
el apoyo del CONICET.
Empezamos a conversar con Bergad y con Juan Heinrich a travs
de Dellacha recuerda Paladini. Ellos estaban estudiando a chicos
deficitarios en la hormona; entonces ah surgi la idea de armar, con
ayuda del CONICET, un grupo para analizar la hormona con la finalidad de utilizarla en el tratamiento de esos chicos. Al principio,
Houssay no quiso. El pensaba que el CONICET no tena que dedicarse a hacer investigacin aplicada, deca que tena que hacer investi29

gacin bsica. El que volc la balanza para que se creara un centro

fue Cullen. Lo conoca a Don Bernardo, no s de dnde, pero lo trataba con mucha familiaridad y tena una presencia muy imponente.
Este Cullen se lo llev por delante... Tanto, que salimos con la promesa de que lo iba a pensar. Y al final se convenci de que estbamos en condiciones de hacerlo. As que pusimos en marcha el sistema. Porque la preparacin de la hormona empezaba por conseguir
la glndula humana, que no era fcil.
As naci el Centro para el Estudio de Hormonas Hipofisarias (Cehip), que integraron Paladini, Santom y Dellacha, del Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica;
Cullen, Bergad y Juan J. Heinrich, del Servicio de Endocrinologa
del Hospital de Nios, y Jos Manuel Domnguez, del Instituto de Investigaciones Mdicas de la Facultad de Medicina de la UBA.
El Cehip cont desde su creacin con subsidios del CONICET y apoyo econmico de la Fundacin de Endocrinologa Infantil, conocida
en el ambiente peditrico con el acrnimo FEI. Tena dos sedes: una
en el Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica, y la otra, ubicada en el Servicio de Endocrinologa
del Hospital de Nios.
La de la Facultad tena como misin preparar la hormona de crecimiento humana (hGH) y realizar los ensayos y anlisis necesarios
para asegurar su actividad biolgica y su esterilidad. En el FEI se les
hacan los estudios clnicos a los chicos que asistan al hospital por
trastornos de crecimiento, especialmente a los que por su nivel de
deficiencia hipofisaria deban ser sometidos a tratamientos prolongados con hormona de crecimiento.
Heinrich tena en ese momento 29 aos. Se haba formado en Suiza
con Andrea Prader, uno de los ms grandes endocrinlogos infanti30

les de la poca, y haba regresado a trabajar con Cullen y Bergad. La

causa de consulta ms frecuente para los especialistas de esos das
era la baja estatura. Cuando se deba a la deficiencia de la hormona,
no tenamos respuesta comenta Heinrich, hoy, un nombre de referencia en la especialidad. Se les daba hormona tiroidea, cuando
tambin faltaba, o cortisona, si les fallaba la suprarrenal. Se usaban
extractos de hipfisis de vaca, por ejemplo, pero no hacan crecer.
Dellacha se puso al frente de la obtencin de hormona de crecimiento humana en el Departamento de Qumica Biolgica de la UBA,
para lo cual tuvo que organizar un sistema de recoleccin de hipfisis humanas que permitiera contar con un nmero adecuado para la
purificacin de la hormona, y que asegurara una provisin constante
de glndulas para atender los planes asistenciales y de investigacin.
Claro que, como suele suceder, el plan era ms fcil de enunciar que
de llevar a la prctica.
Lo primero que hizo falta fue un auto recuerda Paladini. Compramos un Citron de tercera mano. Con esas latas, ese Citron, una
persona que se llamaba Roberto Rodrguez, recorra los hospitales y
la morgue judicial.
Rodrguez, frecuentemente con Heinrich, visitaba los hospitales lvarez, Argerich, Cetrngolo, de Nios Ricardo Gutirrez, Durand,
Elizalde, Fernndez, Fiorito, Muiz, Policlnico Alejandro Posadas,
Policlnico de Avellaneda, Policlnico de Lans, Ramos Meja y Rawson, y hablaba del proyecto con los jefes de los departamentos de
anatoma patolgica, recuerdan Santom y Dellacha. Hay que subrayar que todos ellos se mostraron dispuestos a colaborar de forma
totalmente desinteresada subrayan. Particip tambin la Ctedra
de Patologa de la Universidad de Buenos Aires. Y hasta obtuvimos
una acordada de la Suprema Corte de Justicia de la Nacin para poder retirar las hipfisis de los cadveres de la Morgue Judicial.
31

Entre 1970 y 1985, esta red informal permiti recolectar nada menos que 66.000 hipfisis, que se conservaban en termos con nieve carbnica o hielo seco. Una vez por semana, eran retirados y las
glndulas se transferan a una congeladora que se mantena a una
temperatura de -60 C hasta su procesamiento.
Uno de los problemas que tuvieron que analizar fue qu mtodo se
aplicara para extraer la hormona de la glndula y qu procedimiento de purificacin se adoptara.
En esa poca haba otros dos pases que lo tenan resuelto. Uno era
Estados Unidos. Ellos utilizaban un mtodo que ms tarde les traera serias complicaciones. En Inglaterra y Francia tambin se registraron casos similares.
Los investigadores argentinos ensayaron varios mtodos descriptos
en la literatura, pero rpidamente los abandonaron porque obtenan
productos heterogneos. Finalmente seleccionaron uno que permiti producir una protena apta para tratamientos clnicos. Un colector de fracciones, donado al FEI por la Embajada de Suecia, permiti separar del gel la fraccin proteica con actividad hormonal.
La hormona liofilizada se esterilizaba y se fraccionaba en frascos
multidosis de 5 mg de hormona en forma totalmente gratuita, en los
Laboratorios Carlo Erba de Buenos Aires y posteriormente, por gentileza del doctor Zenn Lugones, en el Laboratorio Roux-Ocefa S.A.
En el Servicio de Endocrinologa del Hospital de Nios, esta hormona era aplicada en forma de inyecciones subcutneas, tres veces por
semana, a nios con graves trastornos de crecimiento, que haban
sido seleccionados despus de un riguroso estudio para obtener el
mximo beneficio teraputico.
32

Para determinar si la hormona que se preparaba en el laboratorio tena actividad biolgica, tambin tuvieron que poner a punto la tcnica de la hipofisectoma (extraccin quirgica de la hipfisis) en
ratas criadas en el Bioterio Central de la Facultad de Farmacia y Bioqumica.
A lo largo de ms de quince aos, el Cehip obtuvo en la Facultad
de Farmacia y Bioqumica alrededor de 130 g de hormona de crecimiento humana, con un alto grado de pureza qumica y antignica
que permiti su uso para los estudios estructurales, fisicoqumicos
e inmunolgicos.
Corra la dcada del setenta cuando tuvimos que explicar cules
eran los beneficios de las investigaciones que encarbamos cuenta
Dellacha. Por eso, calculamos aproximadamente cunta hormona
habamos hecho y cul hubiera sido su costo internacional.
El resultado de esa estimacin es apabullante: con esos mtodos
agotadores y trabajando de lunes a lunes, los cientficos y sus equipos haban fabricado 130.000 dosis de hormona de crecimiento.
Se calculaban dos hipfisis por semana y por chico agrega Santom. Y se trataban grupos de treinta chicos.
Eran tiempos convulsionados, de huelgas, toma de ctedras y facultades. A veces tenamos que subir desde la planta baja al sexto
piso con bolsas de veinte kilos por la escalera!, que era la comida
para alimentar a los animales del bioterio.
En 1985, en los Estados Unidos, en Gran Bretaa y posteriormente
en Francia, fallecieron jvenes de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob, un desorden neurolgico mortal cuyos primeros sntomas son
33

fallas de memoria y cambios de comportamiento, pero que a medida

que progresa puede presentar movimientos involuntarios, ceguera,
debilidad de las extremidades y coma.
Todos ellos tenan en comn que haban sido tratados en su niez
con hormona de crecimiento humana. Los directores del Cehip recibieron una llamada telefnica de la Organizacin Mundial de la
Salud ponindolos sobre aviso de lo sucedido y sugirindoles suspender la produccin de hormona a partir de hipfisis humanas hasta tanto se averiguara el motivo de esos decesos, recuerdan hoy los
cientficos.
Tambin suspendieron la provisin de hormona la National Pituitary Agency y el Instituto Nacional de la Salud, ambos de los Estados Unidos, y los laboratorios de Inglaterra, Francia y Suecia que la
producan. Si bien nunca se tuvo evidencia directa acerca del origen
del problema se supuso que estos casos fatales recibieron hormona
de hipfisis provenientes de pacientes con Creutzfeldt-Jacob y que
el mtodo de purificacin utilizado no permiti eliminar los priones
de la preparacin.
En la Argentina, sin embargo, no se registr ningn caso. Posteriormente se comprob que el mtodo de filtrado por columnas de
Sephadex que utilizaron los cientficos argentinos elimin el riesgo,
porque los priones quedaban retenidos en esa estructura.
El esfuerzo realizado durante ms de dos dcadas no slo benefici a 70 chicos hasta entonces marginados y sin posibilidad de tratamiento, sino que contribuy a la formacin de numerosos investigadores, y dio lugar a 28 trabajos de investigacin clnica (ver anexo) y
a innumerables tesis doctorales.
Hasta 1976, Paladini, Dellacha y Santom trabajaron en colabora34

cin, compartieron subsidios y equipos, y tambin sus resultados

en pos de un objetivo comn. Pero como cada uno de los subgrupos
que dirigan encaraba problemas tan distintos, las ideas no siempre
coincidan y comenz a resultarles difcil conducir en conjunto todas
la lneas de trabajo.
Haba llegado el momento de que cada uno dirigiera su grupo en
forma independiente y redistribuyeron a los colaboradores para
que cada uno tuviera a su cargo un nmero equivalente de investigadores.

El grupo de Paladini se consagr principalmente a las hormonas
de crecimiento y la deteccin de sus receptores celulares. Sintetiz
fragmentos hormonales y estudi las caractersticas de la hormona
marcada con yodo radiactivo. En particular, estudiaron los epitopes
de la protena; es decir, las regiones moleculares antignicas, las que
producen anticuerpos.
Plantearon la hiptesis de que cuando se le da hormona de crecimiento a un chico, ste puede producir anticuerpos, porque es desconocida, aunque sea humana cuenta Santom. Algunos la reconocen como propia y no la destruyen, pero para otros es una sustancia
extraa y por eso a veces el tratamiento no surta efecto. No siempre
se elaboran anticuerpos, pero puede suceder.
El equipo de Dellacha aplic tcnicas de marcacin de las hormonas
humana y bovina para analizar cmo se unen a receptores, tanto in
vitro como in vivo, y as confirmaron que el hgado tiene receptores
para la hormona de crecimiento.
Como todava se desconoca la estructura terciaria de las hormonas
de crecimiento, el grupo de Santom contribuy al conocimiento de
la conformacin molecular mediante modificaciones qumicas de
35

distintos aminocidos para establecer el acceso al solvente de cada

uno de ellos y su participacin en el reconocimiento de los receptores en la actividad biolgica.
Con apoyo del Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo,
Santom estudi la hormona de crecimiento de la alpaca, un camlido que vive en los Andes, a entre 4.500 y 5.500 metros de altura.
El problema principal era conseguir las hipfisis recuerda Santom. Como era una colaboracin con cientficos peruanos, ellos se
comprometieron a obtenerlas. Aparentemente, en Cuzco la hipfisis
es comestible, como la carne. En una oportunidad, estaba esperando veinte hipfisis de alpaca y fue una becaria peruana para recolectarlas. Cuando volvi a nuestro pas, voy a buscarla a Ezeiza para
que la dejen pasar, porque traa material biolgico. Cuando subimos
al auto, la becaria me confiesa que haba habido un problema y no
haba podido traer las hipfisis: las haba puesto en el freezer de la
familia del investigador; ellos las haban confundido y se las haban
comido...

36

Cambio de rumbo

En 1985, primero en los Estados Unidos y luego en Gran Bretaa y

Francia, empezaron a llegar a los consultorios mdicos individuos
de entre 25 y 30 aos con signos que correspondan a los de la enfermedad de la vaca loca. Al estudiar las causas de seis muertes,
que fueron simultneas, encontraron que todos ellos haban recibido hormona de crecimiento humana. La Organizacin Mundial de
la Salud emiti inmediatamente un llamado de alerta. Pero a diferencia de lo que ocurri en los pases europeos, en la Argentina nunca se registraron complicaciones por la aplicacin de la hormona
de crecimiento humana producida en los laboratorios del grupo de
Qumica Biolgica.
Recuerdo que estbamos en el laboratorio y nos llamaron de la Organizacin Mundial de la Salud dice Dellacha. Nos comunicaron
que consideraban apropiado detener la produccin o al menos dejar
de aplicar la hormona hasta determinar lo que estaba pasando. Tres
aos despus se supo que en Francia hubo 90 muertos. La hormona
haba sido mal purificada o se haba extrado de personas que habran tenido la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. En una invitacin
que tuve en la Universidad de Oxford, Inglaterra, supe que al revisar el caso se encontraron con que, si inyectaban en ratas la hormona enriquecida que quedaba en la parte superior de la columna du37

rante la produccin, los animales desarrollaban la enfermedad de

CreutzfeldtJacob. Entonces, dejamos de producir, aunque nosotros
hacamos una segunda etapa de purificacin. Lo que quedaba arriba
(hemoglobina y soluciones) se descartaba y usbamos slo la parte
de abajo. Por eso, nunca tuvimos problemas.
En este contexto internacional, entre 1983 y 1992, Paladini, Dellacha y Santom dejaron de investigar sobre hormonas de crecimiento
para dedicarse a otros temas. Adems de la advertencia de la Organizacin Mundial de la Salud, se haba producido un avance determinante: se confiaba su produccin, en grandes tanques con medios
de cultivo, a bacterias que haban sido modificadas para introducirles el gen humano que dirige su sntesis en el organismo.
En 1987, importantes avances internacionales imprimieron un cambio de rumbo en las investigaciones: en los Estados Unidos, Sherin
S. Abdel-Meguid y colegas dieron a conocer la estructura tridimensional (el plegamiento de la cadena de aminocidos en el espacio) de
la hormona porcina recombinante; es decir, producida por ingeniera gentica.
Cuando se conoce bien la estructura tridimensional se puede ver
qu parte de la molcula interacta con los receptores; es decir, con
las distintas regiones que van a producir un efecto biolgico explica Wolfenstein. A veces, los grupos que estn lejos en la estructura
lineal, cuando la protena se pliega de cierta manera pueden quedar
cerca. Por eso las protenas mal plegadas pueden tener otro efecto
biolgico.
En ese momento hubo una revolucin metodolgica y tecnolgica
a partir de la aparicin de la biologa molecular, que permiti determinar la estructura primaria de una protena en un tiempo muchsimo ms breve explica Santom. Si se aislaba un gen cuyo ADN
38

tena una secuencia de bases determinada a partir de la cual se poda deducir toda la secuencia de aminocidos de una protena; es
decir, su estructura primaria. Lo que a nosotros nos haba llevado
diez aos, se poda determinar en unos das! Pero adems, la biologa molecular trajo otra cosa extraordinaria: se pudo expresar ese
gen introducindolo en una bacteria, como la Escherichia coli, por
ejemplo. De all en ms pudieron producirse enormes cantidades de
protenas. En el Laboratorio Nacional de Investigacin y Servicios en
Qumica de Protenas (LANAIS-PRO), que yo diriga, podamos determinar la secuencia de las protenas con gran rapidez. Utilizbamos mtodos automticos muy precisos.
Al tener la hormona pura, pudieron cristalizarla explica Dellacha. Y por eso pudieron determinar, en 1987, la estructura tridimensional de la hormona porcina recombinante, de la hormona
humana recombinante y la del complejo que forma con las dos molculas del receptor, en 1992.
Se iniciaba una nueva era, pero la tarea de los cientficos del grupo
de Qumica Biolgica haba sido literalmente impagable: explorando en las fronteras del conocimiento haban producido hormona de
crecimiento humana por un valor de... cuatro millones de dlares
de esos aos!

39

Una palabra que todava no estaba de moda

A tono con el entusiasmo que produjo el retorno de la democracia al

pas en 1983, un hecho del mundo cientfico local acapar la atencin de los diarios porteos: un grupo de investigadores del CONICET abandonaba el sistema pblico para trabajar en una empresa
privada.
Era una movida indita para la Argentina. Para muchos de sus colegas, los investigaodores se haban vendido al capital privado. Para
otros, eran la punta de lanza de una tendencia que ganaba adeptos
en todo el mundo: agregar valor (tecnologa) a los productos para
mejorar la competitividad. Varios de los protagonistas de esta iniciativa sin precedente haban sido alumnos de los integrantes del grupo de qumica biolgica de la UBA.
La compaa Sidus, una tradicional firma familiar que participaba
del mercado farmacutico local, planeaba desarrollar proyectos en
un rea cuyo nombre sonaba poco conocido: la biotecnologa. Ni siquiera estaba de moda la palabra recuerda Marcelo Criscuolo, hoy
director ejecutivo de Biosidus S.A.. La idea era poder poner a punto la tecnologa recombinante para la expresin de protenas humanas en bacterias o clulas de mamferos.

40

Los investigadores del Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA cumplieron un importante papel en el desarrollo de la hormona de crecimiento recombinante por su experiencia en la purificacin, estabilidad y control de
calidad de la hormona obtenida a partir de Escherichia coli.

En reuniones semanales, Juan Dellacha, se convirti en asesor cientfico de Biosidus S.A. No slo discuta la produccin de la hormona,
sino que aportaba su experiencia a los trabajos que los investigadores
estaban realizando para conocer las propiedades qumicas, fisicoqumicas y biolgicas de las hormonas de crecimiento que le conferan
una mayor estabilidad en determinadas condiciones experimentales.
El grupo de Biosidus S.A. intentaba obtenerla por la bacteria Escherichia coli, pero se descompona, se alteraba explica Dellacha, por
eso, buscaron a quien conociera su funcionamiento y estabilidad.
A partir de estas experiencias y de comn acuerdo, introdujeron modificaciones en ciertos procedimientos y disearon nuevos experimentos.
El doctor Santom se hizo cargo del estudio estructural, la secuenciacin de aminocidos y la determinacin de la masa molecular. As, pudieron comprobar que la protena recombinante de Biosidus S.A. (codificada como HCB-P001) tena idntica secuencia de aminocidos y
puentes disulfuro que la hormona de crecimiento humana natural.
Tambin compar, con participacin de otros investigadores, la inmunorreactividad (su actividad frente a varios anticuerpos y su reconocimiento por receptores celulares especficos, as como la respuesta a cambios conformacionales producidos por anticuerpos) de
la hormona recombinante con la de origen hipofisario y otra de origen recombinante producida por Genentech en los Estados Unidos.
41

Encontr una total identidad inmunolgica entre las tres. Santom

luego asesorara estudios similares para probar la actividad biolgica de la hormona de crecimiento humana producida en leche de vacas transgnicas.
Despus de ms de un lustro de intentos, Biosidus S.A. alcanza su
primer hito en 1990, cuando lanza al mercado la eritropoyetina recombinante, una hormona que estimula la produccin de glbulos
rojos, producida a partir del cultivo de clulas en las que se haba
insertado un gen humano. El siguiente paso fue el interfern alfa,
un medicamento que se utiliza para evitar la proliferacin de clulas tumorales y virus. Entre 1993 y 1994, estos productos empezaron a exportarse a Brasil y Biosidus S.A. se independiz de su empresa madre. Santom determin la estructura primaria de todas esas
protenas recombinantes.
En 1995, lanzaron una droga para combatir las neutropenias (deficiencia de un tipo de glbulos sanguneos llamados granulocitos) generadas por los tratamientos citostticos en cncer o radioterapia: el
factor estimulante de colonias de granulocitos. Al mismo tiempo,
ponan a punto la produccin de hormona de crecimiento humana
fabricada por bacterias recombinantes (modificadas genticamente).
Fue una decisin empresaria que requera una dosis de audacia.
Marcelo Argelles, entonces al mando de la compaa, confiesa que,
ante el desafo, no le faltaron momentos de duda. Las dudas lo asaltan a uno todas las noches afirma. Como deca Steve Jobs, la innovacin no es perfecta al inicio, se hace camino al andar. Los datos con los que uno inicia el trabajo no son 100% efectivos. No es lo
mismo calcular un puente o una usina nuclear, que una hormona
recombinante; cuando se manejan datos biolgicos, las variaciones
que surgen pueden ser la diferencia entre la posibilidad y la imposibilidad de desarrollar un producto.
42

Al recordar esa poca, Criscuolo revive los infinitos contratiempos

que hubo que sortear. Cuando uno tiene que encarar el desarrollo
de un producto, no slo se trata de dominar la tecnologa subraya, saber cmo es el gen, cmo lo ponemos en un plsmido (ADN
extracromosmico), cmo lo ponemos en un clon de bacterias productoras, cmo mejoramos el mecanismo de fermentacin para que
sea rentable para la industria farmacutica, cmo es el mecanismo
de purificacin y su posterior envase. Sino tambin de entender un
poco la fisiologa de la hormona de crecimiento, cmo debe ser su
aplicacin clnica, a qu blanco debe dirigirse, cmo funciona. Y en
eso recurrimos a los acadmicos ms adecuados para que asesoraran a la empresa: al grupo de Santom y de Dellacha. Ms all de su
conocimiento y su probada eficiencia tcnica, eran los que ms conocan la protena. Pero adems, haba un factor humano crucial: la
mayora de los integrantes de Biosidus S.A. haban sido alumnos de
los cientficos en la Facultad de Farmacia y Bioqumica. Era un honor, llegar, recibirse, estar en una empresa, hacer biotecnologa, y
adems, volver a los profesores que nos haban formado y traerlos
como asesores del grupo de desarrollo, dice Criscuolo.
Entre las ancdotas de esos aos, figura una que recuerda con una
gran emocin. Cuando uno tiene que manejar un grupo de gente
trabajando en un tema, algunos ms preocupados por el aislamiento de los clones, otros por producir el nmero ms alto de copias, el
mejor sistema de expresin, otros, el sistema de fermentacin o la
pureza, etctera, etctera, y todos ellos universitarios (que no slo
trabajan para saber hacer, sino que tienen que saber para qu trabajan, cmo funciona lo que estn haciendo), el doctor Dellacha, que
siempre fue un hombre y un profesor de carcter, impona orden y
respeto. Sola decir: yo el mircoles a las diez estoy ah, vengan todos que voy a mostrar el avance de los trabajos, el seguimiento. Y a
las las diez cero uno, Dellacha abra la reunin y el que no estaba, no
estaba. Y aclara no era fcil no estar... Realmente su seguimiento
43

de todo el grupo de desarrollo fue muy importante, no solo desde lo

tcnico, sino tambin desde el punto de vista humano. Y con Santom tambin haba una relacin especial, porque estaba al frente del
LANAIS-PRO, que tena equipos importantes como el secuenciador
de protenas, que nos permiti hacer esa operacin en el pas. Fue
un placer y un honor que precisamente el doctor Santom, manejando ese laboratorio, hiciera para nosotros en la Argentina la secuencia completa de la hormona de crecimiento.
La prueba de fuego lleg tras los estudios clnicos y una vez aprobada por la ANMAT, cuando el grupo de Bio Sidus present la hormona de crecimiento recombinante ante la plana mayor del servicio de
Endocrinologa del Hospital de Nios. All venan a entrenarse mdicos de todos los pases del mundo. Ellos haban participado de la
epopeya de Dellacha, Santom y Paladini. Nos miraban con un poquito de recelo recuerda Criscuolo. Estaban acostumbrados a
trabajar con productos de firmas importantes, de muchsima calidad y nosotros ramos un grupo de jvenes que les estbamos trayendo una hormona fabricada con bacterias recombinantes Hasta que pas algo en las presentaciones. Tenamos al lado nuestro a
Dellacha y Santom como asesores y, bueno, se arm debate y alguna controversia, sobre cmo asegurbamos la calidad. Porque de
alguna manera los bioqumicos tenamos nuestros geles, nuestras
corridas, nuestros cromatogramas, que era un lenguaje que los mdicos no podan entender. Y ellos nos hablaban de los nios, de lo
que pasaba, del riesgo, era casi un dilogo de sordos. Haba que romper eso. Entonces, toman la palabra Dellacha y Santom, y les dicen: Miren, ustedes hace veinte aos confiaron en lo que nosotros
hacamos con nuestras manos. Y trabajamos con este producto que
tuvo mucho xito. Ahora les pedimos que confen en lo que hacen
nuestros alumnos. De una manera u otra las barreras cayeron. Empez un dilogo distinto. La palabra de Dellacha y de Santom fue
muy especial, absolutamente espontnea, pero muy bien dirigida.
44

Fue una emocin tremenda... Nos sorprendieron. Haba una larga

historia de gente de Bio Sidus que haba trabajado en la ctedra con
ellos y que tambin haba conocido el trabajo en la hormona de crecimiento. Fue como tomar la posta... Era 1997.

45

Una oveja llamada Dolly

En 1984 haba regresado al pas despus de una temporada en los

Estados Unidos el doctor Lino Baraao, un qumico de intereses que
abarcaban desde la antropologa hasta las neurociencias y el comportamiento animal, y que jugara un rol decisivo en esta historia y
en la de la ciencia nacional.
Hijo de una maestra y de un empleado de Vialidad, Baraao confiesa que siempre fue muy curioso y que estaba fascinado por la ciencia: Hered esa curiosidad de mi padre afirma, que la conserv
hasta su muerte, a los 89. Alrededor de los 11 aos, le las obras completas de Julio Verne, donde el hroe siempre era un cientfico. Despus devor la coleccin de libros de ciencia de Eudeba, en particular las de comportamiento animal, tema que todava me apasiona.
Aunque la vida es imprevisible, a la distancia, Baraao parece haber
estado predestinado a participar en el desarrollo de la hormona de
crecimiento y en el de vacas transgnicas.
Mi padre tuvo 11 hermanos cuenta. Uno de ellos, mi padrino Arcadio Baraao, era qumico y trabajaba en hormonas. Fue el primero en hacer bioensayos en el pas. Siempre trabaj en el mbito privado. Otro de mis tos, Tefilo Baraao, era profesor de Maquinaria
46

Agrcola en la Facultad de Agronomia de la UBA (hasta hace poco

haba un aula que llevaba su nombre). Mi padre en su juventud tuvo
un tambo. O sea que no es de extraar que yo haya terminado haciendo vacas que producen hormonas en su leche.
Dada la pluralidad de intereses que lo motivaban, el aspirante a cientfico se decidi por la qumica, porque la consideraba la disciplina
ms abarcadora. Curs desde mecnica cuntica hasta anatoma
humana, con cadveres y todo. Su anhelo era contribuir a desarrollar una ciencia orientada al uso, como deca Pasteur.
El sabio francs del siglo XIX realiz algunas de sus contribuciones ms importantes mientras trataba de contestar preguntas que le
planteaban los viateros de su pas.
De chico cuenta Baraao, mi padre me di la Vida de Pasteur, la
biografa escrita por [su nieto], Vallery Radot. Y mi to tena en su
escritorio la frase de Pasteur que deca: Vivid en la paz serena de
los laboratorios y bibliotecas. All no hallars siempre la gloria, jams hallars la fortuna, pero en su seno sentirs la dulzura de ser
cada da ms que el anterior y de haber aportado al mundo tu parte
de verdad. Eso me marc.
Desde su regreso al pas, Baraao tuvo la idea de que haba que hacer algo con biotecnologa animal. Se incorpor al Instituto de Biologa y Medicina Experimental, que comparte edificio con el Instituto de Ingeniera Gentica y Biologa Molecular (INGEBI), donde
tambin trabajaban Hctor Torres, su primer director, y Marcelo Rubinstein, que haba logrado el primer ratn transgnico.
Torres fue el que tuvo la idea de empezar con los animales transgnicos, recuerda. Ya era 1994 cuando decide hablar con Argelles y
Criscuolo, y les propone hacer un bovino transgnico capaz de pro47

ducir hormona de crecimiento en la leche.

Ellos ya estaban produciendo hormona con bacterias aclara Baraao. En realidad, no sabamos si convendra una hormona de crecimiento u otra protena recombinante. La primera en la que se pens
fue el activador tisular de plasmingeno (TPA), que se usa para combatir los infartos, una enzima que destruye el cogulo.
Haba que hacer la construccin [del segmento de ADN], e infiltrarlo con un promotor en la glndula mamaria. Ya se haba demostrado en algunos casos que si se le pona un gen a un promotor de la casena, la sustancia codificada por ese gen se segregaba en la leche de
la vaca, agrega.
Inicialmente, presentaron el proyecto de poner una protena de inters en la glndula mamaria de vacas al Fondo Tecnolgico Argentino (FONTAR) de la Agencia Nacional de Promocin Cientfica y Tecnolgica, que ofreca crditos de devolucin contingente: si todo
iba bien haba que devolverlos y si no funcionaba, no se devolva
nada. Pero como la conclusin del proyecto deba respetar los plazos del crdito, se inclinaron por probarlo en cabras, cuya gestacin
dura cinco meses. Ese tiempo, ms lo necesario para esperar a la madurez, un lapso que sumaba aproximadamente tres aos, coincida
con el perodo mximo estipulado en el crdito.
Mientras tanto, Baraao y Daniel Salamone, un veterinario graduado en la UBA y apasionado por los desafos ambiciosos, haban logrado los primeros terneros por fecundacin in vitro. Lo hicimos trayendo ovarios de mataderos, fecundndolos en una cpsula de Petri
y luego implantndolos en vacas, comenta el primero.
Cuando se conoci que haba nacido el primer bovino producido
in vitro [Brackett et al. 1982] dije Guau, sta es nuestra oportuni48

dad recuerda hoy Salamone. Tuve la suerte de recibir una beca

de la Agencia Internacional de Japn (JICA) para viajar a ese pas y
aprender a hacer terneros in vitro. Al volver, en 1983, puse en prctica el mtodo y cuando quise darme cuenta haba producido ms
de 60.000 [embriones] vacas en un mes! Por supuesto que no todos
los embriones podan implantarse, pero habamos hecho la prueba
de concepto.
Pero... para qu hacer fertilizacin in vitro de bovinos?
Entre otras cosas, en ese momento se pensaba que era una manera de mejorar genticamente el ganado. Como en la Argentina se
faenaban vacas de calidad relativamente buena, se podan producir embriones de alta calidad y los costos eran nfimos comparados
con los que exiga fecundar una vaca a la manera tradicional detalla Baraao. Uno produca cientos de embriones, y aunque despus
se vio que stos bajaban de precio y finalmente las cuentas no cerraban, era bueno dominar esa tecnologa.
Los terneros nacidos en la Argentina fueron los primeros de Amrica latina, y para los cientficos tenan una doble utilidad: por un
lado, les permitan desarrollar una aplicacin biotecnolgica, y por
el otro, estudiar los procesos de maduracin y fertilizacin de ovocitos en una especie distinta del ratn, con caractersticas ms parecidas al ser humano.
Y ya que lo hacan en cabras... por qu no probarlo simultneamente en vacas? Era un desafo ambicioso, entre otras cosas, porque haba que disear toda la logstica, desde la biologa molecular, hasta la biologa celular, la veterinaria explica Baraao Haba que
comprar cabras criollas, un chivo de una raza lechera... Adems, el
chivo slo se reproduce en determinada poca del ao. Un detalle
colorido es que tuvimos que alojarlo en Veterinaria, reparar un co49

rral... Los investigadores tenamos que hacer de todo: desde arreglar

un alambrado, hasta bajar los fardos de pasto y preparar los medios
de cultivo. Era divertido, pero...
El Fondo Tecnolgico Argentino (FONTAR) les dio cerca de 800.000
dlares con los cuales montaron el laboratorio de Marcelo Rubinstein en el Ingebi y tambin arreglaron gran parte del resto del Instituto. Pero el camino que haban decidido tomar no careca de obstculos. Haba que sincronizar el celo de las hembras, fertilizarlas
por laparoscopa, esperar 48 horas hasta que estuviera fecundado
el vulo, hacer la ciruga, lavar la trompa (de Falopio), y recoger los
huevos fecundados.
Despus de colocarlos en un tubito, haba que correr de la veterinaria al laboratorio, donde Rubinstein los esperaba con su microscopio, los examinaba y deca: No, estn pasados, ilustra Baraao. Y
as todas las semanas.
Las vacas eran un poco ms previsibles... Pero una vez que los embriones llegaban a la etapa de blastocistos [embriones que se desarrollaron durante 5 o 6 das], haba que llevarlos al campo, en Baradero,
donde tenan que esperar al equipo encargado de realizar la transferencia; es decir, de insertarlos en el tero de las vacas portadoras.
Eso implicaba sincronizar el da en que haba que ir al matadero a
conseguir los vulos, con el momento en que se trataba a las vacas
en el campo con (hormonas) prostaglandinas para que estuvieran
listas para cuando llegara la camioneta con el embrin.
Me acuerdo de un da que tenamos listos unos animales buensimos
y pararon a la camioneta en la Aduana, viniendo de Uruguay, porque
tena una lupa que no estaba registrada o algo as rememora Baraao con una sonrisa. Y mientras tanto, el tiempo pasaba y pasaba...
50

Finalmente, hicieron decenas de transferencias de embriones de cabras y dos transferencias de vacas. De ellas, nacieron tres cabritos y
dos terneras.
Con Lino queramos producir animales con material de matadero,
pero esas vacas no eran muy atractivas porque no contaban con un
material gentico especial dice Salamone. En cambio, si a esas vacas se les sumaba valor agregado, algo que las hiciera nicas, el embrin resultara mucho ms valioso. As fue como Baraao empez
a intentar la transgnesis para convertirlas en fbricas de protenas
de inters farmacolgico.
Los primeros animales podan o no ser transgnicos. Haba que inyectar 2.500 ovocitos, de los cuales, una vez fecundados solo sobreviva un 10 %. De stos se implantaba un 20%, y de sos haba
chances de que un animal fuera transgnico. Pero transgnico en
el sentido de que tuviese el gen, porque an as poda no expresar la
protena de inters, ya que si el gen que insertbamos no llegaba al
tejido o al rgano correspondiente..., detalla el cientfico.
Suele decirse que la ciencia es un largo camino de fracasos salpicado por un xito de tanto en tanto. Esta aventura no fue la excepcin.
Exigi un perodo de muchsimo trabajo, en el que nacan los animales, pero no lograban lo que haban planeado y pareca que no iban
a llegar a la meta. Finalmente, Biosidus S.A. decidi seguir adelante con otra metodologa, la clonacin, no obstante lo cual devolvi
el subsidio como si el proyecto hubiera sido exitoso, porque se haba desarrollado tecnologa y se haban formado recursos humanos.
Naci s, un toro Aberdeen Angus de alta calidad, que se us como
caso control.
A mediados de 1996, la idea original comenz a languidecer. Para
entonces, Salamone estaba deseoso de volver al campo para empa51

parse de los problemas propios de los animales y de la logstica de

la explotacin ganadera, y decidi viajar al exterior a hacer un posgrado.
Luego de algn tiempo, haba estado trabajando mucho y no saba muy bien cul iba a ser mi prximo paso, cuando viajo a Niza
para participar en un congreso cuenta. Deambulando por los pasillos, escucho [al cientfico argentino] Jos Cibelli. Exclamaba: Lo
logr! Qu maldito! Y encima es buena persona!.
Los diarios del mundo haban anunciado el nacimiento del primer
mamfero clonado de clulas adultas de la historia, la oveja Dolly.
Ah me dije: yo tengo que trabajar en esto, dice Salamone. Un ao
y medio ms tarde, en enero de 1998, precisamente Cibelli lograra el nacimiento de los primeros terneros clonados transgnicos del
mundo.

52

La ingeniera de la vida

Dolly naci al caer la tarde, el 5 de julio de 1996, cerca de Edimburgo, Escocia. Tena la apariencia de una tpica oveja de raza FinnDorset, pero lo cierto es que era absolutamente extraordinadria: Ian
Wilmut, un embrilogo ingls (y marinero frustrado), y Keith Campbell, un bilogo de 42 aos de la misma nacionalidad, la haban
creado aplicndole una diminuta descarga elctrica a una clula de
ubre de una oveja ya muerta y a un vulo sin fertilizar desprovisto
de sus cromosomas. Si bien su embrin haba sido implantado en el
tero de otra oveja, en rigor, no tena ni madre ni padre: fue una hermana gemela de la oveja donante del material gentico.
A pesar de que evoca argumentos de ciencia ficcin, la clonacin es
una maniobra aparentemente sencilla. Una aguja penetra a travs
de la membrana exterior de un vulo. Con una maniobra diestra,
un tcnico extrae su ncleo y luego utiliza una segunda aguja para
inyectar en su lugar otro ncleo, extrado esta vez de una clula diferenciada (con un juego completo de cromosomas). Una descarga
elctrica los fusiona. Y el embrin empieza a dividirse...
Muy pronto, la comunidad cientfica vislumbr las potencialidades
de este desarrollo que, tras repetidos fracasos durante un cuarto de
siglo, pocos haban credo posible. El artculo que lo describa fue
53

publicado en Nature el 7 de marzo de 1996, y una semana ms tarde un editorial adverta que el poder creciente de la gentica molecular nos enfrenta a la perspectiva futura de ser capaces de cambiar
la naturaleza de nuestra especie y plantea cuestiones que afectarn
a la humanidad.
Para apreciar el impacto que este avance tuvo en todo el mundo
baste con recordar que, poco tiempo despus, el presidente norteamericano Bill Clinton recomend adoptar una mora en las investigaciones y prohibi el empleo de fondos federales para la experimentacin con embriones humanos. Varios pases europeos hicieron
lo mismo. La Iglesia conden el uso inescrupuloso del cuerpo humano, y hasta los mismos Wilmut y Campbell se opusieron al uso de la
clonacin con fines reproductivos: Todo tipo de manipulacin de
embriones humanos debera ser prohibida, declararon.
Los investigadores estaban asombrados porque veinticinco aos de
intentos los haban convencido de que, una vez que las clulas haban comenzado a diferenciarse hacia sus roles de adultas en el embrin temprano, no podan volver atrs. Dolly demostr lo contrario
(despus de 276 intentos fallidos) y abri la puerta a un sinnmero
de innovaciones biotecnolgicas. Una, en particular, acapar el inters de los cientficos: los clones transgnicos presentaban la posibilidad de convertirse en fbricas de medicamentos. Como la hormona de crecimiento...
Richard Palmiter, de la Universidad de Washington, y Ralph Brinster, de la de Pensilvania, haban obtenido el primer animal transgnico en 1983. Los cientficos crearon un ratn gigante implantando
el gen responsable de la hormona de crecimiento humana en vulos de ratn fertilizados. Luego transfirieron los huevos a hembras
portadoras y documentaron que el gen funcionaba en varias de sus

54

cras. Tambin demostraron que el gen poda transmitirse de generacin en generacin.

Los transgnicos podan producirse insertndoles o suprimindoles
un gen por medio de la tecnologa de recombinacin del ADN. Esas
modificaciones pueden agregar o suprimir una funcin.
El gen poda insertarse por microinyeccin en el proncleo de un cigoto (clula resultante de la unin de los gametos femenino y masculino), utilizando un vector retroviral o transformando clulas embrionarias.
En 1996 viene a la Argentina Alan Trounson, lder de la fertilizacin in vitro en Australia, un pope, y nos dice que ya no se hace ms
microinyeccin, que lo que deberamos estar haciendo era clonacin, cuenta Baraao.
Pero cambiar de caballo en medio del ro no era sencillo. Entonces, a fines de 2000, Salamone, que haba estado trabajando en el ciclo reproductivo de bovinos en Canad y luego haba pasado a trabajar con Jim Robl, otro referente en clonacin en cuyo laboratorio
precisamente el argentino Jos Cibelli haba producido las primeras
vacas transgnicas, le escribe a Baraao diciendo que quiere volver
a la Argentina.
En los Estados Unidos, Salamone haba aprendido una tcnica que
consista no en microinyectar vulos, sino en tomar fibroblastos de
feto (las clulas ms comunes y menos especializadas del tejido conjuntivo), transfectarlos con (introducirles) un gen de resistencia a
los antibiticos, seleccionar las clulas transgnicas y luego hacer
el transplante nuclear. As se tienen altas probabilidades de obtener
embriones transgnicos.

55

Esa tecnologa era un boom que incluso haba dado lugar a la creacin de una empresa, Advanced Cell Technologies precisa Baraao. As que volv a Biosidus S.A. y les dije: Vamos por esto.
Y all fueron. Segn cuenta Salamone, l volvi en enero, consigui
el equipo en julio, al mes tena los primeros clones y cinco meses ms
tarde los primeros transgnicos.
Desde su regreso al pas, Baraao haba tenido la idea de que era prioritario desarrollar la biotecnologa animal. Los bioqumicos preferan trabajar con plantas, porque eran ms sencillas y las tenan en la
maceta, pero yo quera trabajar en transgnesis con vacas... aunque
la verdad es que no tena mucha idea, confiesa. Haba desarrollado
un mtodo para valorar de actividad biolgica de las hormonas que
se usan para superovular, haba trabajado con estas protenas para
inducir la superovulacin en yeguas y tambin haba intentado trabajar con las empresas aportando elementos para la produccin animal, aunque sin mucho xito. Era tal la oscilacin de la economa,
que nadie quera embarcarse en proyectos de riesgo, apunta.
Entonces, decidi escribir un proyecto de dos carillas en el que estableca que no iban a desarrollar ratones, ni cabras: haran la prueba
de concepto en cultivos de glndula mamaria de vaca. No sera necesario afrontar un proceso largo y costoso para crear un ratn transgnico que permitiera probar si la construccin funcionaba o no. Lo
probaran in vitro. Y con la hormona de crecimiento.
Baraao seleccion un reducido grupo de trabajo integrado por Leonardo Bussman, que se ocupara de las transfecciones (la insercin
de genes) y el cultivo de los fibroblastos, Daniel Salamone, para el
trasplante nuclear, y la empresa Munar y Asociados, para la transferencia de embriones.

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La entretela de esta historia no carece de suspenso y hasta de condimentos humorsticos. Mientras Salamone todava estaba en los Estados Unidos, mandaron a un abogado a que lo convenciera de volver cuenta Baraao. Me acuerdo que ese verano yo estaba en Mar
del Plata con mis hijos, en [los juegos de] Sacoa y, ante la suspicacia
de los chicos, usaba las fichas para mandarle mails a Salamone que
cada tanto se arrepenta...
Finalmente, en diciembre de 2001, empezaron a trabajar. El pas se
caa a pedazos y nosotros lanzndonos a esta aventura!, recuerda.
Para los primeros intentos, utilizaron tejido de una oreja del toro que
haba resultado del embrin implantado en el experimento de aos
antes. La primera vez se dej sacar la muestra dcilmente comenta, la segunda ya miraba con desconfianza, y despus empezaba a
raspar el suelo con la pata con nimo amenazante en cuanto vea al
tcnico que se acercaba con el sacabocado como si le dijera: Ac no
te acercs.
Sin embargo, de esas clulas bovinas se logr el primer embrin clonado. Al mes y medio de transferido e implantado en el tero de la
vaca portadora, una ecografa mostraba la imagen del ternerito en
gestacin.
Fue maravilloso comenta Baraao: nunca haba puesto ecografas de mis hijos en la pantalla de la computadora, pero todo el grupo tena la imagen del ternerito en sus mquinas.
Lgicamente, la noticia provoc una enorme algaraba, entre otras
cosas, por la celeridad con que se obtuvo un resultado positivo, si se lo
compara con los casi 280 intentos que haba requerido clonar a la oveja Dolly, el primer mamfero obtenido por esta tcnica de la historia.

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El parto estaba previsto para los primeros das de marzo de 2002. La

vaca, que pastaba en medio del campo rigurosamente vigilada, haba sido revisada por un batalln de especialistas en neonatologa
bovina y se encontraba en ptimas condiciones para dar a luz.
Pero (siempre hay un pero) un par de semanas antes de la fecha indicada, Quelo Gmez, el encargado del campo, les advirti que segn su experiencia el parto se adelantara.
Me acuerdo que dijo: Esta vaca pare en una semana, asegura Baraao. Con la autosuficiencia que otorga una carrera universitaria,
los investigadores, por supuesto, confiaron ms en sus propios clculos que en la intuicin y la experiencia de Quelo e hicieron caso
omiso de sus advertencias.
El sbado siguiente, sin ningn integrante del equipo cientfico
presente, la vaca entr en trabajo de parto cuenta. Cuando lleg el primero de nosotros, el ternero estaba atascado en el canal de
parto. Para cuando lograron sacarlo, ya haba muerto. Para colmo,
sabamos que en Balcarce haba vacas preadas por clonacin y en
Brasil tambin se estaba intentando. Finalmente, todas abortaron.
Un artculo de La Nacin dio a conocer la noticia de este modo: Inesperadamente, a fines de enero de 2002, el equipo de investigacin
de Biosidus S.A., que algo ms de nueve meses antes haba logrado
clonar terneros a partir de clulas adultas por primera vez en Amrica latina, tuvo que trasladarse de urgencia al campo.
La vaca de raza Jersey que se encontraba en ms avanzado estado
de gravidez haba comenzado a tener sntomas de parto inminente, dos semanas antes de la fecha prevista, que era el 11 de febrero.
Como se haba convenido de antemano, fue sometida a una cesrea, pero, a pesar de los esfuerzos de reanimacin y de que estaba
58

completamente formado, el ternerito falleci durante el parto, que

se haba producido el 28 de enero. De todos modos, y ms all de la
frustracin lgica, el equipo hizo un balance positivo de la experiencia: en apenas un ao de trabajo haban logrado dominar la tcnica de la clonacin y cumplir todos los pasos que permiten producir
un animal totalmente formado. Y ya estaban preparados para seguir
adelante.
El ternerito clonado se haba producido insertando el ncleo de una
clula del toro Aberdeen Angus (un fibroblasto de la oreja) en un
vulo bovino. El embrin resultante fue incubado durante algo ms
de una semana antes de transferirlo a la vaca portadora.
Se gest como corresponde y lleg a tener todos sus rganos y tejidos explic en esa oportunidad Carlos Melo, de Biosidus S.A., a La
Nacin. Despus del nacimiento, se realizaron los estudios genticos e histopatolgicos. Era normal, anatmica y fisiolgicamente.
Slo tena lo que se conoce como hgado graso, algo tambin habitual en estos animales. Las pruebas muestran de manera indudable
que era un clon. Mandamos muestras con varias trampas cruzadas
(una muestra del toro original, dos del ternero, dos de la madre nodriza y una del hijo biolgico del toro) para tener la certeza, y los resultados fueron irreprochables. Indican una identidad del 99,95%
(el 100% es imposible). Sobre 16 regiones del ADN que se estudiaron, las 16 coinciden. Es decir, la probabilidad de que por casualidad
haya habido un error es de 5 en 10.000.
Pero el plan seguira como estaba previsto. La meta era clonar vacas
transgnicas capaces de producir hormona de crecimiento humana,
y el equipo ya tena otra decena de preeces en marcha.
Si tenan xito, las vacas clonadas y modificadas genticamente seran capaces de producir entre 15 y 20 litros de leche diarios. Cada li59

tro de esta leche podra contener hasta cinco gramos de hormona de

crecimiento, lo que dara entre 75 y 100 gramos diarios.
Bastaran dos o tres vacas para abastecer la demanda mundial de
hormona de crecimiento. Es decir, que entre una vaca que produce una protena recombinante y una gallina que produce huevos de
oro, es ms conveniente la vaca, brome en ese momento Baraao.
Esta fue una prueba de que nuestra receta funcionaba... y llegamos
al parto. La moneda cay del otro lado, pero es chance. Significa que
dominamos la tecnologa, lo que es notablemente exitoso. Ahora es
cuestin de repetir. Estamos en un nivel avanzado. Pero tenemos
que ir paso a paso, agreg.
Una vez superada la frustracin, decidieron seguir adelante, pero
esta vez con fibroblastos fetales de raza jersey, de menor tamao,
para evitar los riesgos asociados a la particularidad de los terneros
clonados de ser ms grandes que los nacidos de forma natural.
Por fin, de las primeras clulas nace exitosamente Pampa, la primera ternera clonada en la Argentina. Para no dejar nada librado al
azar se haba instalado un verdadero quirfano en medio del campo
y el equipo encargado del parto inclua a ocho personas.
De all en ms, casi semana por medio se haca un asado para asistir al nacimiento de un ternero clonado recuerda Baraao. Y aunque eran partos de alto riesgo, salan bien...
Con diferencia de meses nacen dos descendientes de esa dinasta,
con un valor agregado: son transgnicas. Las llaman Pampa Mansa y
Pampa Clara. Se les toman muestras de ADN y todas tienen el transgen, pero la que arroja una seal ms potente es la primera.

60

El xito fue motivo de otro festejo cuyo registro fue una foto Polaroid de la bandita de barras oscuras y claras que mostraba la presencia del gen humano en medio del genoma bovino.
En cuanto la vaca lleg a la madurez, sus ubres comenzaron a dar
leche que contena la hormona humana, dato que se prob por radioinmunensayo.
De todas maneras, haba que probar que era exactamente igual a la
que ya produca Biosidus S.A. y se hizo: era bioqumicamente idntica y biolgicamente activa, dice Baraao. Y acota que, ms all
del logro cientfico, fue una muestra notable de cmo dos docenas
de cientficos, empresarios, veterinarios y gente de campo argentinos pudieron trabajar juntos en pos de un objetivo comn. Era la primera vez que se estableca una asociacin tan directa entre la ciencia y la empresa.
Cinco aos despus de que hubiera nacido el primer animal clonado
de la historia, haba apenas cuatro o cinco grupos en el mundo que
dominaban esta tecnologa y haban desarrollado el conocimiento
haciendo grandes inversiones.
No hay muchas tecnologas que cinco aos despus de ser desarrolladas ya se dominen en el pas dice Baraao. Para entender la
trascendencia de este logro podra decirse que es como si cientficos
espaciales argentinos hubieran podido lanzar el Sputnik en 1962.
El proyecto tambin result ejemplar para comprender el valor de la
inversin en innovacin, si se tiene en cuenta que, al crear una importante plataforma tecnolgica, Biosidus S.A. no tuvo problemas
para gestionar financiacin ni siquiera en plena crisis.

61

Para m fue una experiencia muy importante dice Baraao, la coronacin de ms de 18 aos de esfuerzo. Siempre tuve un tiempo de
mi laboratorio dedicado a esto. Y pudimos mostrar cmo una asociacin de fracasos puede conducir al xito. Como dice Pasteur: la casualidad slo favorece a espritus preparados.

62

La farmacia en el tambo

Entre el 10 y el 24 de septiembre de 2002 nacieron en un campo de

la provincia de Buenos Aires tres terneritas de raza Jersey que hicieron historia: Clara, Dulce y Mansa, los primeros bovinos clonados
transgnicos del pas. El logro ubic a la ciencia argentina en la vanguardia de la biotecnologa mundial.
Las tres fueron la copia fiel de Pampa, la primera ternerita clonada
en la Argentina, que haba nacido dos meses antes. Pero diferan en
un detalle fundamental: sus clulas poseen el gen de la hormona de
crecimiento humana, por lo que se espera que sean capaces de producir grandes cantidades de esa protena de uso teraputico que resulta imprescindible para los chicos que sufren de enanismo hipofisario, y a la que da a da se le encuentran nuevos usos.
En el programa de clonacin de vacas transgnicas que haba lanzado
un lustro antes la empresa de biotecnologa local Biosidus S.A. intervinieron cientficos de distintos grupos de investigacin del CONICET,
la UBA y el Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA).
Las protenas humanas de inters farmacolgico se venan clonando
desde alrededor de dos dcadas antes. Pero no en mamferos superiores, sino en bacterias y clulas.
63

As se haban podido fabricar frmacos como el interfern, la eritropoyetina o la insulina, que antes haba que obtener por mtodos
extractivos. Pero hay un problema: existen protenas de las que se
requiere mucha masa para que ejerzan su efecto teraputico. Por
ejemplo, en una ampolla de interfern hay entre 10 y 20 microgramos de la sustancia de inters; en una de insulina, entre 30 y 40 miligramos. O sea, que con el mismo fermentador se pueden producir
2.000 veces ms ampollas de interfern que de insulina. Evidentemente, los mtodos que resultaban tan fascinantes en 1980 no son
adecuados para satisfacer las necesidades actuales, explic Criscuolo en declaraciones para el diario La Nacin.
El nuevo avance introducira posibilidades industriales revolucionarias. Por ejemplo, el fermentador de la planta de Biosidus S.A. del barrio de Boedo tiene 250 litros de capacidad. La relacin teraputica
entre el interfern, por ejemplo, y la hormona de crecimiento es de
100 a uno. Es decir explica Criscuolo, que si uno puede abastecer un mercado de interfern con ese fermentador, para producir la
misma cantidad de hormona necesitara un tanque de 25.000 litros.
Y no slo hay que pensar en el tamao del tanque, sino en todas las
complicaciones asociadas: en lugar de agregar dos kilos y medio de
glucosa, voy a tener que agregarle una tonelada; adems, tendr que
disponer de una planta de tratamiento capaz de purificar miles de
litros de cultivo... En cambio, si yo reemplazo todo eso por un tambo, y en cada litro de leche obtengo cinco gramos de hormona, tengo
cinco mil dosis por litro. Una vaca me da veinte litros por da... Los
nmeros son asombrosos.
En el plano estrictamente econmico, la inversin necesaria para
instalar una planta ronda los cincuenta millones de dlares; un tambo, los cuatrocientos mil. Y hay otro tema agrega Criscuolo: la
flexibilidad. Cuando se hace una planta de produccin, se corre un
gran riesgo porque hay que evaluar muy bien el mercado. Si la pre64

paro para producir una cierta cantidad, tengo que vender por lo menos el 70% de esa cifra. Si la demanda es mayor, puedo invertir cincuenta millones de dlares y no alcanzar a abastecer el mercado.
Pero si me queda muy grande, tambin es complicado, porque el lucro cesante va al costo del producto y lo encarece. En el caso del tambo farmacutico, es muy fcil: ordeo una vaca y si no me alcanza,
pongo dos. O tres. Tengo una forma mucho ms flexible de acomodarme al mercado. Adems, el tiempo de ordee de una vaca es de
tres minutos. Puedo ordear veinte vacas en una hora. Tambin es
posible amoldar la purificacin de acuerdo al tamao del lote que se
necesite. Y no hay que comprar medios de cultivo, los pone la vaca.
O sea, vemos una cantidad enorme de ventajas. La vaca transforma
pasto, agua y un poco de maz en un producto farmacutico.
Proyecciones internacionales estiman que la demanda de productos
biotecnolgicos superar ampliamente la capacidad instalada global.
Las bacterias es decir, los reactores biolgicos para los que ya hay
aprobacin de las autoridades sanitarias argentinas tienen una capacidad de produccin limitada. Era necesario pasar a otra dimensin y los bovinos ofrecan una salida inmejorable: basta una sola
vaca transgnica para abastecer la necesidad local de hormona de
crecimiento.
Era la oportunidad ideal para conjugar dos de las riquezas que el
pas a pesar de las crisis posee en abundancia: know-how cientfico de alto nivel y tecnologa ganadera de avanzada, ambos saberes
cultivados a lo largo de dcadas.
Melo se encarg de subrayarlo en sus declaraciones a periodistas interesados por el anuncio de la clonacin de la dinasta Pampa. Todo
esto no solo requiere dominio de ciencia bsica, sino tambin un
complejo trabajo de coordinacin en el campo mismo dijo. All
65

mantenemos constantemente 200 vacas nodrizas preparadas para

ser implantadas con los embriones. Semanalmente se van poniendo
en fase 15 o 20, lo que requiere un trabajo muy delicado para que los
animales estn preparados en tiempo y forma. Por otro lado, los individuos clonados requieren cuidados especiales, y en esto los peones de campo cumplen una tarea fundamental, con guardias de 24
horas para que no les falte atencin ni un instante.
Igual que Pampa, Clara, Dulce y Mansa fueron creadas a partir de
una clula fetal de raza Jersey y de un vulo de descarte.
Ambas clulas se cultivaron y se fundieron in vitro, y en ese cultivo
se introdujo el gen humano de la hormona de crecimiento disfrazado de otro que se expresa normalmente en la glndula mamaria bovina, el de la betacasena vacuna. De ese modo, nos aseguramos de
que se expresara precisamente en el lugar que queramos, explica
Salamone.
A los seis meses, las terneritas fueron estimuladas hormonalmente
para que produjeran leche, lo que permiti verificar si el gen humano cumpla con su funcin. Dos aos ms tarde, cuando estuvieron
en condiciones de ser preadas y tener descendencia, comenzaron a
producir leche con la hormona medicinal.

66

Broche de oro

Dos aos ms tarde, Biosidus S.A. le puso el broche de oro a su programa tambo farmacutico del tercer milenio: en el corral asptico que la compaa posee en la provincia de Buenos Aires, naci
Pampero, el primer bovino de sexo masculino cuyo ADN contiene el
gen humano de la hormona de crecimiento.
Pampero es el macho que asegura la perpetuacin de la estirpe
transgnica y un logro que volvi a poner a la Argentina en la primera lnea de la investigacin mundial en este tema.
De color miel y con los ojos dulces de su madre biolgica, Pampa
Mansa, difera como el da de la noche de la vaca que lo haba gestado en su tero durante 39 semanas. Se trat de un ternero absolutamente extraordinario: al madurar, cada uno de sus espermatozoides tendra el gen humano de la hormona de crecimiento, que su
progenie heredara de acuerdo con la rigurosa lgica de las leyes de
Mendel.
Con un programa constante de obtencin de semen, que puede guardarse congelado en nitrgeno lquido, se aseguraba la conservacin
de la estirpe.

67

La ecuacin tecnolgica haba sido impecable. El producto de una

eyaculacin de Pampero alcanzara para inseminar entre doscientas y trescientas vacas normales con las tcnicas de rutina. La mitad de los hijos seran transgnicos. De stos, la mitad sera de sexo
femenino; es decir, vacas productoras de grandes cantidades de hormona de crecimiento humana en su leche.
Avanzar en el conocimiento de cmo manipular los engranajes de la
naturaleza resultaba infinitamente ms rendidor que ensamblar los
de la ingeniera tradicional. Mientras que una vaca puede dar hasta
tres kilos de hormona sin purificar por mes, un fermentador de 500
litros, trabajando seis das por semana, puede producir como mucho
sesenta gramos.
Con unas 14 vacas, se puede abastecer el mercado mundial de esta
protena. Con esta produccin, la Argentina podra ser el primer fabricante mundial de hormona de crecimiento.
Nosotros tenamos un sistema muy eficiente, pero costoso, basado
en la clonacin, la generacin de embriones, la transferencia embrionaria, el parto por cesrea... Ahora, para este frmaco no necesitamos
seguir produciendo vacas por clonacin, porque el semen de Pampero puede generar todas las vaquitas transgnicas que uno quiera, con
la identidad gentica asegurada y por el mtodo ms econmico que
pueda pensarse, que es la inseminacin, explica Criscuolo.
El nacimiento de Pampero represent la culminacin de un programa que se haba iniciado siete aos antes, poco despus de que la
oveja Dolly se convirtiera en el primer mamfero de la historia obtenido a travs de la clonacin de un animal adulto.
El 6 de agosto de 2001 haba nacido Pampa, la primera vaca clonada
del pas; en 2002, Pampa Mansa, primera vaca clonada transgnica;
68

el 5 de enero de 2004 nacieron Pampa Mansa I y II, y el 7 de diciembre naci Pampero. Todos los animales se mantuvieron en perfecto
estado de salud y aunque nacen en condiciones de estricta asepsia se
criaron de una forma lo ms parecida posible a la habitual.
Con el nacimiento del macho transgnico perpetuador casi todas
las posibilidades que tiene esta tecnologa fueron exploradas con
xito, subraya Criscuolo.
Para Marcelo Argelles, en ese momento presidente de BioSidus, el
logro no slo se debi al nivel cientfico de los investigadores locales,
sino tambin a la pericia y experiencia del personal de campo, que
tena un entrenamiento fenomenal.
Por ejemplo, el doctor Roberto Salaberry, que haca las cesreas, era
capaz de sacar al ternero en menos de tres minutos. Para evitar
riesgos, el equipo haba trabajado en un corral asptico, con veterinarios vestidos con traje de astronauta y paisanos de guardapolvo
blanco. Tambin haba participado un neonatlogo y haba hasta un
desfibrilador disponible.
Cuando en el laboratorio se preparan embriones para ser implantados, no hay mucho tiempo, de modo que los cientficos mantenan
ms de doscientas madres receptoras en ciclo, listas para ser utilizadas y bajo el control de los encargados que las revisaban dos veces por da.
Cuando Salaberry vio el primer ternero clonado dice Argelles,
un bichito color beige de una madre negra, lo primero que dijo fue
Es hembra!, y lo segundo, Es [raza] Jersey!, con lo cual se cumplan las dos premisas que confirmaban que habamos logrado lo
que nos habamos propuesto y que se trataba efectivamente de un
animal clonado.
69

Llegar a la meta exigi compatibilizar dos culturas y conocimientos

muy diferentes: los del campo y los del laboratorio, unos tan importante como los otros. La gran experiencia de nuestra gente de campo fue vital para poder estimular la superovulacin en las vacas, lavarles el tero, extraer los vulos e insertar los embriones clonados
en las hembras receptoras, subraya Criscuolo.
Para Baraao, la experiencia dej mucho ms que un rdito cientfico y tecnolgico. Esto muestra lo que es posible hacer en la Argentina y tambin que podemos participar en la nueva manera de hacer ciencia que se est viendo en los pases desarrollados afirma.
Pasamos de la investigacin fundamentalmente acadmica, con financiamiento exclusivamente estatal, a un trabajo grupal. Proyectos tan ambiciosos como ste slo son posibles con la participacin
de grupos multidisciplinarios capacitados para resolver cada una de
las etapas del proceso. Adems de aumentar el conocimiento bsico,
tienen como objetivo la obtencin de un producto concreto. Paradjicamente, si bien sta es la nueva manera de hacer ciencia, es tambin volver a Pasteur, que sent las bases de la microbiologa, pero
resolviendo problemas de los productores.
Y agrega: Armonizar grupos de trabajo y evitar el tradicional individualismo argentino en funcin de un proyecto comn es un hecho
inusual y promisorio... Y un logro tanto o ms importante que obtener vacas transgnicas.
Despus de cerrar el ciclo de la hormona de crecimiento, el equipo de Biosidus S.A. sigui adelante con su proyecto de tambo farmacutico, y desarroll la dinasta Patagonia, que produce insulina
[para el tratamiento de la diabetes], y present a Portea, la primera
ternera del mundo capaz de producir hormona de crecimiento bovina en su leche; es decir, le agregaron una construccin gentica (un
fragmento de ADN) para que esta hormona se exprese en un lugar
70

en el que no lo hace naturalmente, la glndula mamaria de las vacas.

La hormona de crecimiento bovino, aprobada por la Food and Drug
Administration de los Estados Unidos (FDA) en 1994, se utiliza para
estimular la produccin de leche en el ganado. Se sabe que puede
aumentarla alrededor de un 25%. La utilizan Estados Unidos, Mxico y Brasil, y probablemente lo harn pases como Venezuela, Per y
Chile. El mercado mundial ronda los 500 millones de dlares. Y hasta ahora hay slo dos compaas que la fabrican.
Poco a poco, y con todo los recaudos que corresponden, el mundo
les est abriendo las puertas a las nuevas tecnologas. Las autoridades sanitarias europeas ya aprobaron el primer producto transgnico para uso en seres humanos producido en la leche de cabras. Y
la FDA, en los Estados Unidos, public una gua para la aprobacin
de drogas y alimentos producidos tambin por animales transgnicos, y los lineamientos que deben observarse para su cuidado, tratamiento, conservacin y regulacin.
Pero los comienzos fueron diferentes. El equipo de Biosidus S.A. debi enfrentar cuestionamientos que muchas veces se pasan por alto
cuando se trata de juzgar productos importados. Tuvimos que dar
muchos exmenes cuenta Criscuolo. Cuando presentamos la hormona recombinante [producida en bacterias] el cuerpo mdico nos
exigi mucho ms por el prejuicio de que si es importado, tiene que
ser mejor. Cmo estos muchachos de Almagro, a tres cuadras de la
ex cancha de San Lorenzo, bamos a tener la protena recombinante?
La hormona de crecimiento est indicada para nios que no crecen
en altura en los ritmos considerados normales. El dficit se puede
comprobar con facilidad: bastara con que los maestros midieran a
sus chicos cada tres o seis meses en los colegios, algo que ayudara a
la deteccin precoz.
71

Sera importantsimo, porque solo hay tiempo para tratarlos hasta

que termina la adolescencia. Y si se los individualiza tardamente no
alcanzan su altura potencial. Si uno detecta a un chico afectado de
enanismo hipofisario a los 12 aos, tiene seis ms para tratarlo. En
cambio, si lo detecta a los quince, tiene tres, afirma.
Pero esta protena no solo podra utilizarse para estos cuadros. Entre otros usos, tambin se estudia en la vejez para generar msculo,
en los casos en que hay deficiencia comprobada de hormona. Muchas veces, hay viejitos que se caen y se fracturan, porque la cola
tambin es el colchn para no fracturarse, entonces cuanto menos
msculo, menos colchn. Con un buen colchn, disminuimos el nivel de cadas y de fracturas.
Internacionalmente tambin est aprobado su uso en casos de disminucin de estatura que pueden llevar a la discriminacin, como
cuando una persona tiene una talla que no le permite alcanzar las
manijas del subte o la altura de los mostradores para trmites.
La discriminacin puede llevar a una enfermedad por la angustia
que causa agrega. Entonces, con aprobacin de los padres, el mdico puede tratar estos casos para agregar varios centmetros de altura.
Un chico tratado con hormona de crecimiento gana alrededor de
cinco centmetros por ao, dependiendo de su respuesta al tratamiento.
En la Argentina, se venden actualmente ms de seis marcas de hormona de crecimiento. El Estado atiende a los nios hasta los veinte aos, que es cuando, se calcula, se cierran las epfisis (cada uno
de los extremos) de los huesos largos y ya no crecen ms. Sin embargo, hay que tener en cuenta que desde el punto de vista fisiolgi72

co, si una persona tiene deficiencia de hormona de crecimiento, sigue siendo deficiente aunque tenga veinte aos aclara Criscuolo.
La protena no sirve slo para los huesos. Quien es hormonodeficiente empieza a aumentar de peso, sufre cambios en la forma del cuerpo y la distribucin de la grasa. Esto permite anticipar que habr un
grupo de nios que fueron tratados y salvados del problema de estatura, pero luego enfrentan otro. Por eso, se espera que en algn momento la ley cambie y permita prolongar el tratamiento cuando sea
necesario.

73

Eplogo

Por esa curiosa trama de hechos, personas y acontecimientos que

suelen entretejerse en la vida de un pas, desde hace medio siglo la
epopeya de la hormona de crecimiento no solo permiti destilar el talento de investigadores brillantes y audaces, sino tambin desarrollar
tecnologas para la salud que permiten mejorar la calidad de vida,
crear puestos de trabajo y competir en el mercado internacional.
Bastan un par de cifras para comprender la diferencia entre tener o
no el conocimiento desarrollado a lo largo de estas dcadas. El tratamiento de un chico con enanismo hipofisario con hormona de crecimiento importada cuesta alrededor de tres mil dlares mensuales;
con la producida localmente, dos mil pesos por mes. La dosis estndar es de un miligramo y medio diario. Solo para esta indicacin, el
mercado mundial ronda los mil millones de dlares, o aproximadamente 70 kilos anuales... La hormona producida por vacas transgnicas podra bajar alrededor del treinta por ciento el costo del producto. Existe adems un mercado potencial en crecimiento por la
suma de nuevas indicaciones: baja talla, sndrome de deficiencia de
hormona de crecimiento en mayores de 65 aos, prevencin del envejecimiento.
Concluidos los exmenes preclnicos que mostraron que la prote74

na producida por las vacas transgnicas es estructural y funcionalmente idntica a la producida por bacterias recombinantes, en 2012
comenzaran los ensayos clnicos finales y comparativos con un
producto de referencia para su aprobacin por las autoridades regulatorias. Esto exige un enorme esfuerzo dice Criscuolo. Slo
comprarle el frmaco a la competencia implica una inversin de un
milln de dlares.
A la distancia, resulta fascinante comprobar cmo el azar y la necesidad fueron encadenando las diferentes etapas que llevaron desde
el inters por desentraar la estructura ntima de una protena, con
los medios precarios con que contaba la bioqumica de la poca de
las probetas, hasta su produccin mediante la manipulacin del genoma de animales superiores.
En realidad, bamos a hacer activador tisular del plasmingeno
(TPA, segn sus siglas en ingls, una protena tromboltica) en cabras y terminamos haciendo hormona de crecimiento en vacas dice
Criscuolo, como si observara en perspectiva las insondables vueltas
del camino recorrido. Cuando pareca imposible producirla con clulas, porque hubiera sido necesario tener una fbrica inmensa y hubiera involucrado costos muy altos, nos dimos cuenta de que tenamos lo ms importante para desarrollar la hormona de crecimiento:
todo el conocimiento de nuestros maestros y de la gente de campo.
De alguna manera se alinearon los planetas.
As, mientras los bovinos clonados ocupaban las primeras planas de
los diarios e inspiraban la imaginacin y frecuentemente los temores del pblico, detrs de escena los cientficos podan contestar
las preguntas que los atormentaban. Por ejemplo, si los clones tienen descendencia, si los animales transgnicos tambin pueden reproducirse, si los ltimos individuos de la estirpe tienen ms errores
genticos que los primeros, si los clones nacen con la edad de la c75

lula adulta de la que provienen sus dos juegos de cromosomas y se

mueren antes...
Cuando decidimos avanzar en ese camino, Santom y Dellacha fueron nuestros asesores y cumplieron un papel fundamental subraya. Nosotros tenamos que entender cmo funcionaba la mama, la
betacasena, si nos serva usar un promotor de esa materia blanca de
la leche, sus interacciones... Ellos nos ayudaron en cada nuevo intento e inspiraron mucho respeto entre los jvenes.
Acaban de cumplirse 100 aos de la publicacin, en 1911, de la tesis
doctoral de Bernardo Houssay, considerada la piedra basal de la endocrinologa en el pas. Por una curiosa pirueta del destino, la investigacin del primer Premio Nobel argentino versaba sobre la glndula hipfisis, encargada de producir nada menos que la hormona
de crecimiento. Se llam Estudios sobre la accin de los extractos
hipofisarios. Ensayos sobre la fisiologa del lbulo posterior de la hipfisis.
Acerca de su trabajo Houssay, que entonces tena 23 aos, escribi
un texto que sorprende por su clarividencia:
Desde el ao 1907 form el propsito de ocuparme del estudio de
las funciones de la hipfisis, tema que atrajo mi inters por las grandes lagunas de nuestros conocimientos al respecto. Mi propsito fue
aplaudido y alentado por mi maestro doctor H. G. Piero, quien luchando desde hace largos aos ha hecho comprender, respetar y estimar entre nosotros los estudios fisiolgicos habiendo conseguido
instalar un buen laboratorio y puesto su ctedra a tal altura que es
sin disputa una de las ms brillantes de la escuela. Habiendo dedicado a los estudios de fisiologa la mejor parte de mi tiempo a su lado,
me ha parecido justo escribir mi tesis inaugural sobre algn asunto de esta materia. La casi totalidad de experiencias de este estudio
76

han sido realizadas por el Laboratorio de Fisiologa de la Facultad de

Agronoma y Veterinaria cuya direccin, junto con la ctedra, furonme encargadas interinamente.
Este trabajo, en realidad, representa una de las direcciones de mi
labor experimental. Pudirasele con justicia considerar como un estudio parcial sobre las funciones de la hipfisis, ya que se ocupa casi
nicamente de las del lbulo nervioso, que hasta hace poco se tena por rgano rudimentario. (...) los estudios de Histologa y Fisiologa comparadas; el rol de esta glndula en la acromegalia, gigantismo, distrofia adiposo-genital, etc.; su papel en las toxiinfecciones;
los sndromes de hiper e hipofuncin y las aplicaciones teraputicas
de los preparados opoterpicos, etc., son temas que motivaron mi inters, habiendo sido, alguno de ellos, objeto de mis investigaciones.
He preferido, sin embargo, no hacer mencin de ellos hasta obtener
resultados bien seguros, convencido como estoy de la nocuidad de
las publicaciones prematuras que no han sido siempre bastante meditadas, que casi siempre estn sembradas de errores y cuyo material principal est a menudo formado por una abundante copia, no
siempre prolija, de materiales ajenos. Como esto sucede entre nosotros con tal frecuencia, que pudiera decrsele el principal defecto
de nuestra literatura mdica nacional, he credo prudente salvar el
escollo en lo posible. La abundante bibliografa, bastante completa,
que acompaa a cada tema aqu tratado, se justifica por el carcter
de monografa de este estudio; por la utilidad de contraponer opiniones unas veces encontradas y otras complementarias, etc.; adems por la facilidad que reportar a quienes deseen estudiar estos
temas, evitndoles el largo y pesado trabajo de buscar uno por uno
los datos bibliogrficos.
Las dificultades materiales con que he debido luchar para proseguir estos estudios han sido muchas, queriendo dejar aqu anotada
slo una: la falta de perros en 1908-09, y comienzos de 1910, cuan77

do por una medida inconsulta, nos lo negaba la perrera municipal.

Tengo adems la satisfaccin personal de haber costeado estos estudios con mis recursos personales.
La creacin de institutos cientficos de investigacin no puede hacerse bruscamente como por obra de magia, se impondr seguramente cuando por el persistente esfuerzo de nuestros investigadores, que felizmente los tenemos buenos y decididos, se imponga
claramente su necesidad, y cuando haya verdaderos espritus disciplinados y con ideal nacional, capaces de dirigirlos consciente y
fructferamente. Hoy que nuestro pas ha alcanzado ya una posicin
econmica brillante y est destinada a mejorarla constante y rpidamente por su prodigiosa potencialidad productora, es necesario que
nuestro progreso cientfico, que no est an a la par con el material,
merezca una atencin preferente del Estado y de las grandes fortunas particulares. Estas encontraran mejor empleo para sus excedentes, destinndolos a sostener institutos de investigacin o de beneficencia social bien entendida, que emplendolos como sucede hoy en
numerosas obras infinitamente menos provechosas para el adelanto
material e intelectual del pas y que no pueden proporcionar iguales
satisfacciones a espritus verdaderamente cultos. En rigor ms que
una caridad sera a mi juicio un acto de justicia social. (...)
Hago pues votos porque pronto se consiga mejorar las condiciones
pecuniarias de los Laboratorios y que las mejores remuneraciones
permitan a los profesores de ciencias experimentales dedicarse exclusivamente a ellas, sin necesidad de ejercer la profesin mdica
que forzosamente resta la mayor parte del tiempo, en materias que
por su ndole exigen una labor constante y de todos los momentos.
Dcadas ms tarde, sus alumnos tomaran la antorcha para seguir
avanzando precisamente en el conocimiento de los ms ntimos engranajes de la glndula que lo haba intrigado: no slo desentraa78

ron la estructura de una de las hormonas que secreta y que resulta vital para el desarrollo del organismo, sino que adems lograron
producirla en bacterias genticamente modificadas y luego en vacas
transgnicas.
Aquel da en que Alejandro Paladini invit a Juan Dellacha y a Jos
Santom a sumarse a su ctedra de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA y les ofreci un laboratorio, una cmara helada sin
otro mobiliario que una mesada y un mechero de Bunsen, pocos hubieran sospechado que llegaran tan lejos.

79

Los protagonistas

Jos A. Santom
Durante ms de cuarenta aos, se dedic al estudio de las protenas, a la enseanza de la bioqumica y a la formacin de decenas de discpulos. Hoy, es profesor emrito de la Universidad
de Buenos Aires, ex Coordinador del Laboratorio
Nacional de Investigacin y Servicios en Qumica de Protenas (LANAIS-PRO), miembro de la Academia Nacional de Farmacia y Bioqumica, la Academia de Ciencias de Buenos Aires, la Academia de
Ciencias del Mundo en Desarrollo (TWAS), en Trieste, y la Academia
Latinoamericana de Ciencias, en Caracas. Tambin es aficionado a la
nutica, a recorrer el pas en automvil y a la observacion de pjaros.

Juan M. Dellacha
Fue durante dcadas investigador del CONICET
profesor titular del Departamento de Qumica
Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica. Profesor Honorario de la Universidad de Buenos Aires, miembro de la Academia Latinoamericana de Ciencias, en Caracas. Integr el directorio de la Agencia
Nacional de Promocin Cientfica y Tecnolgica y de la Comisin de
Investigacines Cientficas de la Pcia de Buenos Aires. A su retiro, se
80

convirti en Director Cientfico del Foro Argentino de Biotecnologa,

creado en 1986, veinte aos despus de la primera aplicacin de la
hormona de crecimiento a un chiquito argentino afectado de enanismo en el Cehip, puesto que ocupa hasta hoy.

Alejandro C. Paladini
Fue farmacutico (recibido con medalla de oro),
bioqumico y profesor de matemtica. Trabaj
con Leloir, Braun Menndez y Houssay. Despus
de recibir numerosos premios y de una vida dedicada a la ciencia, estuvo hasta su fallecimiento
(15/09/2012), a cargo de la organizacin del Museo Bernardo Houssay de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA.

Carlota Wolfenstein
Naci en Checoslovaquia, pero lleg a la Argentina a los dos aos. Se declara ms argentina que
los argentinos, a pesar de que vivi 13 aos en
Nueva York, donde se cas y tuvo una hija. Fue la
primera becaria que integr el grupo de Santom, apodado cariosamente por sus colegas Las Santoms Girls,
dado que estaba conformado slo por mujeres. Hoy, ya jubilada, es
investigadora ad honorem del CONICET en el Laboratorio Nacional
de Investigacin y Servicios en Pptidos y Protenas (LANAIS-PRO)
en el Instituto de Qumica y Fsicoqumica Biolgicas de la Facultad
de Farmacia y Bioqumica de la UBA.

Mirtha Biscoglio
La intrigaban la msica y la investigacin. Quiso ser concertista de piano, pero se decidi por la
ciencia para no tener que emigrar a Europa para
proseguir su carrera. Se recibi en Rosario y lleg a Buenos Aires con la ilusin de trabajar con
81

Agustn Marenzi, autor del libro con el que en su poca estudiaban

qumica biolgica. Cuando se encontr con l, el cientfico le dijo que
ya estaba muy mayor y abandonando el cargo, pero le sugiri ir a verlos a Paladini, Leloir o Stoppani. Fue as como se integr a la ctedra
de Qumica Biolgica. Primero entr con una beca Biscoglio, porque
me sostena mi pap recuerda. Pero despus tuve la suerte de trabajar con Santom y Paladini, y fue algo que agradec toda mi vida.
Yo llegu a vivir en la facultad: fui la primera mujer que ocup el departamento de residentes. Siempre am lo que hago con pasin. Dirigi 16 tesis doctorales. Actualmente, es coordinadora del Laboratorio Nacional de Investigacin y Servicios en Pptidos y Protenas
(LANAIS-PRO) en el Instituto de Qumica y Fsicoqumica Biolgicas
de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA.

Daniel Salamone
Se define como un gran provocador al que le gusta internarse en caminos que no fueron recorridos. Una vez habl con un antiguo amigo que
haba estudiado en la Universidad de Cornell y
cuando le plante lo que iba a hacer en clonacin, me contest que eso no era para la Argentina, sino para Gran
Bretaa o los Estados Unidos afirma. Esto siempre fue como un
sueo. Sin embargo, a veces me cuesta convencer a los estudiantes de
que hay que soar con lo imposible. Hoy es profesor de la Facultad
de Agronoma de la UBA e investigador independiente del CONICET.

Lino Baraao
Parece haber estado predestinado a participar en
esta historia. Su padre le hablaba de Alexis Carrell, el mdico, bilogo y Premio Nobel francs
que desarroll los primeros medios de cultivo y
logr mantener un corazn de pollo latiendo durante meses. Carrell mantena correspondencia con el to de Baraao
82

y su viuda le leg los trabajos. El cientfico argentino se dedic al desarrollo de medios de cultivo y en 2007 una becaria suya, que haba
trabajado en Francia, logr obtener los primeros cardiomiocitos (clulas cardacas) diferenciados a partir de clulas madre embrionarias
que latan en una placa de cultivo.
Baraao reconoce, sin embargo, que adems de la influencia positivista de estos dos tos, fue sensible a la influencia de un to poltico
llamado Honorio Serrano, salteo y coya, conocido como El brujo,
que lea las manos y adivinaba el futuro. Desde los ocho aos, l me
repeta que me vea hablando en pblico y que tena que prepararme
leyendo a Demstenes, afirma. Su profeca se cumpli: aunque todava no ley a Demstenes, habla en pblico casi todos los das. Hoy
es el primer Ministro de Ciencia, Tecnologa e Innovacin Productiva
de la Repblica Argentina.

Marcelo Criscuolo
Se interes en la investigacin mientras cuidaba
a su padre en la seccin Hipertensin del Instituto Lanari. All integr un grupo que intentaba fabricar interfern leucocitario y se vincul con la
compaa Sidus. Junto con Alberto Daz, lanz
la rama biotecnolgica de la empresa, Biosidus S.A., que en menos
de dos dcadas logr dominar la manipulacin de genes de utilidad
en salud humana, y la clonacin animal y vegetal, y aplicar esas tcnicas a la produccin de frmacos y especies vegetales. Hoy es su director ejecutivo.

...Y decenas de cientficos, estudiantes avanzados, tecnlogos, mdicos, empresarios y gente de campo que sumaron su esfuerzo y conocimiento para llegar a la meta...

83

DESCRIPCIN CIENTFICO - TCNICA

HORMONA DE CRECIMIENTO
Estudios realizados en Argentina

Juan M. Dellacha Jos A. Santom

85

SUMARIO

I FORMACIN DEL GRUPO DE TRABAJO PARA: el estudio

de la hormona de crecimiento / creacin del centro
para el estudio de las hormonas hipofisarias (cehip)
1. Antecedentes
2. Orgenes del grupo de trabajo del Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA
3. Creacin del Centro para el Estudio de las Hormonas Hipofisarias
3.1 Caractersticas del CEHIP
Publicaciones
Trabajos publicados con el grupo de Mancini Trabajos publicados con Sonenberg
Trabajos de investigacin clnica

II INVESTIGACIONES SOBRE HORMONAS DE CRECIMIENTO

DEL PERODO 1963-1976
a) Primeras experiencias
b) Formacin de subgrupos de trabajo
1. ESTUDIOS SOBRE CONFORMACIN MOLECULAR
1.1 Intercambio de hidrgeno
1.2 Prediccin de estructura secundaria
2. RESIDUO N-TERMINAL Y ESTUDIOS FISICOQUMICOS
2.1 Determinacin del residuo N-terminal
2.2 Estudios fisicoqumicos
2.2.1 Agregacin y disociacin de la bGH. Determinacin del peso molecular
2.2.2 Purificacin y caracterizacin de hormonas de crecimiento de otras especies
2.2.3 Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos

86

3. ESTUDIOS SOBRE ESTRUCTURA PRIMARIA (SANTOM)

3.1 Caractersticas moleculares de las hormonas de crecimiento humana y bovina, conocidas cuando el grupo de qumica biolgica inici sus investigaciones
3.2 Extremo C-terminal
3.3 Composicin en minocidos
3.4 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona de la bGH
3.4.1 Tcnica utilizada para la determinar la estructura primaria de la bGH
3.5 Estructura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y equina
3.6 Influencia de la modificacin qumica de residuos de amino cidos de las distintas hormonas de crecimiento sobre su comportamiento inmunolgico
Publicaciones
Conformacin molecular Prediccin de estructura secundaria Determinacin
del residuo N-terminal Estudios fisicoqumicos Obtencin de hormonas Extremo C-termina Estructura primaria de la bGH Estructura primaria de la oGH and
eGH Estudios inmunolgicos
TESIS DOCTORALES
Estudios conformacionales Estudios fisicoqumicos y purificacin de hormonas Estructura primaria
CONFERENCIAS INTERNACIONALES

III INVESTIGACIONES POSTERIORES A 1976

Divisin del grupo de Qumica Biolgica de la UBA
1. GRUPO DIRIGIDO POR PALADINI
1.1 Estudios inmunolgicos
1.1.1 Deteccin de zonas inmunolgicas en las hormonas de crecimiento humana, bovina y equina
1.1.2 Deteccin de anticuerpos contra hormonas de crecimiento humana, bovina y equina en pacientes tratados con hGH
1.1.3 Obtencin de anticuerpos monoclonales y su aplicacin
1.2 Receptores
Publicaciones
Estudios inmunolgicos Receptores Otros estudios
2. GRUPO DIRIGIDO POR DELLACHA
2.1 Marcacin de las hormonas de crecimiento
2.2 Receptores

87

Publicaciones
Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos Receptores
TESIS DOCTORALES
3. GRUPO DIRIGIDO POR SANTOM
3.1 Hormona de crecimiento de alpaca
3.2 Aportes al conocimiento de la conformacin molecular
3.2.1 Modificacin qumica de aminocidos
3.2.1.1 Identificacin de los residuos modificados y porcentaje de modificacin
3.2.1.2 Modificacin qumica de aminocidos y actividad biolgica
3.3 Modificacin qumica de distintos residuos
3.3.1 Formacin de subgrupos de investigacin
3.3.2 Modificacin qumica de lisinas
3.3.3 Modificacin de tirosinas y triptofano
3.3.4 Modificacin de metioninas
3.3.5 Modificacin de histidinas
3.3.6 Modificacin de grupos carboxilo
3.3.7 Modificacin de argininas
3.4 Introduccin de haptenos en el estudio de estructura y funcin
3.5 Determinacin de la proximidad de residuos con reactivos qumicos
3.6 Finalizacin de los estudios estructurales que realizaba el grupo de Santom
Publicaciones
Hormona de crecimiento de alpaca Modificaciones qumicas
4. APORTES DE OTROS GRUPOS SIN INTERVENCIN DE PALADINI, DELLACHA
O SANTOM
4.1 Biscoglio- Cascone
4.2 Fernndez- Delfino
4.3 Pea
4.4 Poskus
4.5 Retegui
4.6 Turyn
Publicaciones
Biscoglio-Cascone Fernndez-Delfino Poskus Retegui Turyn

88

IV COLABORACIN CON LA INDUSTRIA

1. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA RECOMBINANTE
1.1 Asesora de Dellacha
1.2 Asesora de Santom
1.2.1 Convenios epecficos de prestacin de servicios con la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA
1.2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona
hGH recombinante Biosidus S.A. (1996)
1.2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre hGH recombinante
producida por Biosidus S.A. y otras de diferente origen. (1995)
2. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA DE LECHE DE VACAS TRANSGNICAS
2.1 Convenios especficos de prestacin de servicios con la Facultad de Farmacia
y Bioqumica de la UBA
2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la hGH de leche
de vacas transgnicas. BIO-SIDUS S. A. (2003)
2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre la hGH obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgnicas y hormonas de diferente origen. Actividad de las mismas frente a receptores de origen humano y sobre la proliferacin de clulas Nb2 (2004)
2.1.3 Determinar la capacidad de la hGH de leche de vacas transgnicas de
iniciar la transduccin de seales (2004)
2.1.4 Estudio comparativo por dicroismo circular y fluorescencia entre la
hGH (Biosidus S.A.), de leche de vacas transgnicas y hormonas de diferentes
orgenes. Anlisis de la estabilidad conformacional
2.1.5 Obtencin de sueros en conejos hiperinmunes hacia sistemas antignicos complejos (2006)

ANEXO O ADDENDA
A. Estructura de protenas
B. Breve descripcin de los fundamentos y metodologa empleada para determinar
la estructura primaria de la hormona de crecimiento bovina
C. Evolucin de las metodologas para determinar la estructura primaria de protenas
D. Resumen de los conocimientos estructurales actuales sobre hormonas de crecimiento
E. Receptores hormonales

89

I FORMACIN DEL GRUPO DE TRABAJO PARA: el estudio

de la hormona de crecimiento / creacin del centro
para el estudio de las hormonas hipofisarias (cehip)

1. Antecedentes
En 1958, el Instituto de Histologa y Embriologa de la Facultad de Ciencias Mdicas
de la UBA, dirigido por el Dr. Eduardo De Robertis, estaba interesado en estudiar la
distribucin tisular de ciertas protenas, cuando stas eran marcadas con molculas fluorescentes.
Dellacha comenz a trabajar en el Laboratorio que el Dr. Roberto Mancini, perteneciente a dicho Instituto, quin contaba con un microscopio de fluorescencia apto
para este tipo de estudios. Utilizaron el colorante Lisamina Rodamina B 200 que
tiene la particularidad de emitir fluorescencia rojiza cuando se lo excita con luz ultravioleta. Las protenas marcadas se inyectaban a ratas las que eran sacrificadas
en distintos tiempos y los tejidos de inters eran procesados histolgicamente y observados con el microscopio de fluorescencia. Por este procedimiento estudiaron
la distribucin tisular de la hormona tirotrfica (TSH). A los pocos minutos de inyectada la localizaron en la membrana celular de la tiroides y minutos ms tarde la
fluorescencia desapareca de la membrana y apareca en el interior de la clula. Estos experimentos fueron publicados en Nature, 184, 1788 (1959) y fueron los primeros en demostrar que las hormonas penetran en la clula blanco a los pocos minutos de ser inyectado el animal. En esos aos prevaleca la idea que las hormonas
no penetraban en las clulas. Dellacha y Mancini tambin marcaron la hormona de
crecimiento.
Posteriormente Dellacha trabaj con una beca del National Institutes of Health
(NIH) en el Sloan-Kettering Institute for Cancer Research bajo la Direccin de Martin Sonenberg. Estudiaban porqu la hormona de crecimiento acetilada era un inhibidor de dicha hormona. Sin embargo, la hormona de crecimiento bovina que haban obtenido de un prestigioso laboratorio distaba mucho de ser homognea. Ante
esta situacin Dellacha propuso elaborar un mtodo para preparar, a partir de hipfisis bovina, hormona de crecimiento homognea. Despus de un par de meses lograron obtener hormona homognea analizada por ultracentrifugacin analtica y
electroforesis libre.
En ese tiempo se saba que slo la hormona de origen humano y de simio son biolgicamente activas en el humano. El dogma de la poca indicaba que se deba a su tamao molecular, ya que se crea que las hormonas humana y de simio tenan un peso
molecular que era aproximadamente la mitad del de las otras especies animales. La
falta de actividad de las hormonas de crecimiento de otros mamferos en el humano,
no permita utilizarlas en clnica mdica, como se haca con la insulina. Ante esta li90

mitacin algunos laboratorios en el mundo intentaron, mediante digestiones enzimticas controladas, obtener a partir de hormonas animales un producto activo en
humanos. Dellacha y Sonenberg intentaron, con la hormona bovina homognea que
haban obtenido, digestiones enzimticas controladas. Obtuvieron en humanos algunos efectos metablicos y anablicos. Ninguno de estos estudios permiti obtener productos capaces de reemplazar a la hormona de crecimiento humana en el tratamiento de nios, por lo tanto este abordaje se abandon.

2. ORGENES DEL GRUPO DE TRABAJO DEL DEPARTAMENTO DE QUMICA

BIOLGICA DE LA UBA
En 1962 Paladini, Profesor Titular de Qumica Biolgica I de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires, invit a Dellacha y Santom a
presentarse a un concurso de profesores adjuntos en el Departamento de Qumica
Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica, concurso que ganaron y fueron
designados en 1963. Dellacha recin haba regresado de trabajar en Estados Unidos
con hormona de crecimiento bovina (bGH) y estaba dispuesto a continuar en Buenos Aires con ese tema de investigacin. Invit a Paladini y Santom a formar un
equipo para trabajar con esa hormona. El tema, de gran actualidad en ese momento, era muy interesante porque la hormona bovina no es activa en humanos, a diferencia de lo que ocurre con la insulina bovina y porcina que son activas en humanos
y muy utilizadas en el tratamiento de la diabetes. La investigacin cientfica sobre
hormona de crecimiento bovina podra aclarar ese comportamiento y posiblemente
permitir su modificacin estructural para hacerla activa en humanos.
El grupo de trabajo formado, como complemento de su actividad cientfica, resolvi
contribuir al tratamiento de los nios con retardo de crecimiento de origen hipofisario, mediante la obtencin de la hormona a partir de hipfisis humanas de cadveres. Antes de describir los aportes cientficos al conocimiento de las hormonas de
crecimiento, realizados por el grupo constituido en la Facultad de Farmacia y Bioqumica, se har una breve descripcin de las tareas realizadas para cumplir con el
objetivo social mencionado.

3. CREACIN DEL CENTRO PARA EL ESTUDIO DE LAS HORMONAS HIPOFISARIAS (CEHIP)

Dellacha haba hecho su carrera de practicantado en Farmacia en el Hospital de Nios Dr. Ricardo Gutierrez. All conoci, en 1963, a Csar Bergad que acababa de
llegar de Estados Unidos despus de haberse especializado en endocrinologa infantil, especialmente en el tratamiento de nios con severos trastornos de crecimien-

91

to. Bergad se haba incorporado al Servicio de Endocrinologa Infantil dirigido por

Martn Cullen. Dellacha fue invitado a contar sus investigaciones en dicho Servicio
y all surgi la idea de obtener hormona de crecimiento a partir de hipfisis humanas. Estudiaron la propuesta con Cullen y Paladini y decidieron entrevistar a Bernardo Houssay para solicitarle el apoyo del CONICET. As naci el Centro para el Estudio de Hormonas Hipofisarias, que integraron Paladini, Santom y Dellacha, del
Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica; Cullen, Bergad y Juan J. Heinrich, del Servicio de Endocrinologa del Hospital de Nios y Jos Manuel Domnguez, del Instituto de Investigaciones Mdicas de la Facultad de Medicina de la UBA.
3.1 Caractersticas del CEHIP
El Centro para el Estudio de Hormonas Hipofisarias cont desde su creacin con
subsidios del CONICET y apoyo econmico de la Fundacin de Endocrinologa Infantil, conocida en el ambiente peditrico con el acrnimo FEI.
El CEHIP tena dos sectores bien diferenciados. Uno de ellos ubicado en el Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA y
el otro con asiento en el FEI ubicado en el Servicio de Endocrinologa del Hospital
de Nios Dr. Ricardo Gutirrez. El establecido en la Facultad tena como misin la
preparacin de la hormona de crecimiento humana (hGH) y los ensayos y anlisis
necesarios para asegurar su actividad biolgica y la esterilidad del producto. En el
FEI se realizaban los estudios clnicos en los nios que asistan al Hospital por trastornos relacionados con su anormal crecimiento, seleccionando aquellos que por su
nivel de deficiencia hipofisaria deban ser sometidos a tratamientos prolongados
con hormona de crecimiento.
La obtencin de hGH en el Departamento de Qumica Biolgica, cuyo principal responsable fue Dellacha, demand organizar un sistema de recoleccin de hipfisis
humanas que asegurara contar con un nmero adecuado y una provisin constante
de glndulas para atender los planes asistenciales y de investigacin. En primer trmino visitaron numerosos hospitales y se interes a los jefes de los departamentos
de anatoma patolgica del alcance del proyecto. Adems se obtuvo una acordada de
la Suprema Corte de Justicia de la Nacin para retirar las hipfisis de los cadveres
de la Morgue Judicial. As obtuvieron la colaboracin desinteresada que brindaron
la Morgue Judicial y los Servicios de Anatoma Patolgica de los Hospitales: Alvarez, Argerich, Cetrngolo, de Nios Ricardo Gutirrez, Durand, Elizalde, Fernndez, Fiorito, Muiz, Policlnico Alejandro Posadas, Policlnico de Avellaneda, Policlnico de Lans, Ramos Meja, Rawson y la Ctedra de Patologa de la Universidad
de Buenos Aires. Las hipfisis se conservaban en termos que contenan nieve carbnica y una vez por semana eran retirados y las glndulas se transferan a una congeladora a -60 C hasta su procesamiento. Desde 1970 a 1985 se recolectaron alrededor de 66.000 hipfisis.

92

Un aspecto a destacar fue estudiar qu mtodo se aplicara para extraer la hormona de la glndula y qu procedimiento de purificacin se adoptara. Ensayaron varios mtodos descriptos en la literatura (Raben, Wilhelmi, etc) que abandonaron
por dar productos heterogneos. Finalmente seleccionaron el mtodo de Roos al que
le aadieron una filtracin por gel, que permiti obtener una protena apta para
tratamientos clnicos. Un colector de fracciones, donado al FEI por la Embajada de
Suecia, transferido al laboratorio de Qumica Biolgica, permiti separar del gel, la
fraccin proteica con actividad hormonal. La hormona liofilizada se esterilizaba y
fraccionaba en frascos multidosis conteniendo 5 mg de hGH. Este procedimiento se
llev a cabo en forma gratuita, en los Laboratorios Carlo Erba de Buenos Aires y posteriormente por gentileza del Dr. Zenn Lugones en el Laboratorio Roux-Ocefa S.A.
En el FEI ubicado en el Servicio de Endocrinologa del Hospital de Nios, esta hormona era aplicada a nios con severos trastornos de crecimiento, que haban sido seleccionados despus de un riguroso estudio, para obtener el mximo beneficio teraputico, al suministrar la hormona extrada de hipfisis humanas.
Otro aspecto de importancia fue poner a punto en ratas Sprague Doley, provenientes de una colonia cerrada criadas en el Bioterio Central de la Facultad de Farmacia
y Bioqumica, la tcnica de hipofisectoma e instalar en el Departamento un bioterio
especializado, donde un tcnico realizaba esta operacin y era el encargado del cuidado de estos animales. Era imprescindible contar con ratas hembras hipofisoprivas
para determinar la actividad biolgica de la hormona producida en el laboratorio.
En el CEHIP de la Facultad de Farmacia y Bioqumica se obtuvo alrededor de 130 g
de hGH durante un perodo de 15 aos aproximadamente. La hormona preparada en
el CEHIP cumpla con un alto grado de pureza qumica y antignica que posibilit su
utilizacin para los estudios estructurales, fisicoqumicos e inmunolgicos realizados
en el Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica.
En 1985, en Estados Unidos, Reino Unido y posteriormente en Francia, fallecieron
jvenes de la enfermedad de Creutzfeldt - Jacob. Todos ellos tenan en comn haber
sido inyectados en un perodo de su niez con hormona de crecimiento humana. El
CEHIP recibi un llamado telefnico de la WHO que le advirti de lo sucedido y le sugiri suspender la produccin de hormona a partir de hipfisis humanas hasta tanto se supiera el motivo de esos decesos. Tambin suspendieron la provisin de hGH
la National Pituitary Agency y el Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos
de Norteamrica y los laboratorios de Inglaterra, Francia y Suecia que la producan.
Si bien nunca se tuvo evidencia directa acerca del origen del problema se supuso que
estos casos fatales recibieron hormona de hipfisis provenientes de pacientes con
Creutzfeldt - Jacob y que el mtodo de purificacin utilizado no permiti eliminar de
la preparacin los priones presentes. Posteriormente a este hecho se comprob que
los priones eran retenidos en una columna de gel filtracin como la utilizada en Buenos Aires. Afortunadamente se puede asegurar que en nuestro pas no se registraron
casos de esta enfermedad, relacionados al uso de la hGH de origen pituitario.

93

Publicaciones.
Trabajos publicados con el grupo de Mancini:
Histological study of distribution of fluorescent serum proteins in connective tissue. Mancini RE, Vilar O, Gmez C, Dellacha JM, Davidson OW, Castro A. J Histochem
Cytochem 9:356-62 (1961).
Histological localization in rat tissues of intravenously injected thyrotrophin labeled with a fluorescent dye , Vilar O, Dellacha JM, Davidson OW, Castro A. J Histochem
Cytochem 9:271-7 (1961).
Localization of fluorescent proteins in the follicles during growth of the rat ovary
Heinrich J. Davidson OW, Vilar O, Dellacha JM, Mancini RE. Rev Soc Argent Biol
37:63-4 (1961).
Participation of the kidney in the incorporation of fluorescent proteins and pituitary
hormones. Mancini RE, Dellacha JM, Davidson OW, Alvarez BJ. . J Histochem Cytochem 9:614- (1961)
Trabajos publicados con Sonenberg:
Purification of bovine growth hormone. Dellacha JM, Sonenberg M J. Biol. Chem.,
239, 1515 (1964).
The metabolic effects in man of bovine growth hormone digested with tripsyn. Sonenberg M, Free CA, Dellacha JM, Bonadonna G, Haymowitz A. Naddler AC. Metabolism.
14, 1189-213 (1965).
Anabolic effect in man of papain digests of bovine growth hormone. Sonenberg M, Dellacha JM. J. Clin. Endocrinology and Metabolism. 27, 1035-40 (1967).
Chemical Analysis of acetylated bovine growth hormone, a growth hormone inhibitor. Oikawa A, Dellacha JM, Sonenberg M. Biochem. J. 104:947 (1967).
Chemical and biological characterization of clinically active tryptic digest of bovine growth hormone. Sonenberg M, Kikutani M, Free CA, Nadler AC, Dellacha JM. Ann.
New York Acad. Sci., 148, 532-58 (1968)
Growth hormone activity in man of chymotryptic digest of bovine growth hormone.
Sonenberg M, Dellacha JM, Free CA, Nadler AC. J. Endocr. 44, 255-65 (1969).
Trabajos de investigacin clnica:
Growth hormone treatment in younger than six years of age short children born small
for gestational age. Bergad I, Blanco M, Keselman A, Domen HM, Bergad C. Arch
Argent Pediatr. 2009; 107:410-6. Spanish.
Growth hormone insensitivity associated with a STAT5b mutation. Kofoed EM, Hwa
V, Little B, Woods KA, Buckway CK, Tsubaki J, Pratt KL, Bezrodnik L, Jasper H, Tepper
A, Heinrich JJ, Rosenfeld RG. N Engl J Med. 2003; 349:1139-47.
Estrogen priming effect on growth hormone (GH) provocative test: a useful tool for the
diagnosis of GH deficiency. Martnez AS, Domen HM, Ropelato MG, Jasper HG, Pennisi

94

PA, Escobar ME, Heinrich JJ. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85:4168-72.
Psychosocial outcome in growth hormone deficient patients diagnosed during childhood. Keselman A, Martnez A, Pantano L, Bergad C, Heinrich JJ. J Pediatr Endocrinol Metab. 2000; 13:409-16.
Reproducibility and comparison of growth hormone secretion tests. Ropelato MG,
Martnez A, Heinrich JJ, Bergad C. J Pediatr Endocrinol Metab. 1996;9:41-50.
Growth of Argentinian girls with Turner syndrome. Garcia Rudaz C, Martnez AS,
Heinrich JJ, Lejarraga H, Keselman A, Laspiur M, Bergad C. Ann Hum Biol. 1995;
22:533-44.
Heterologous humoral immune response in patients treated with human growth hormone from different sources. Cardoso AI, Llera AS, Iacono RF, Domen HM, Martnez
AS, Heinrich JJ, Pea C, Poskus E. Acta Endocrinol (Copenh). 1993; 129:20-5.
Detection of autoantibodies against hGH in sera of idiopathic hypopituitary children.
Llera AS, Cardoso AI, Stumpo RR, Martinez AS, Heinrich JJ, Poskus E. Clin Immunol
Immunopathol. 1993;66:114-9.
High serum sex hormone-binding globulin (SHBG) and low serum non-SHBG-bound
testosterone in boys with idiopathic hypopituitarism: effect of recombinant human
growth hormone treatment. Belgorosky A, Martinez A, Domene H, Heinrich JJ, Bergada C, Rivarola MA. J Clin Endocrinol Metab. 1987; 65:1107-11.
High incidence of thyroid disturbances in 49 children with Turner syndrome. Grueiro de Papendieck L, Iorcansky S, Coco R, Rivarola MA, Bergad C. J Pediatr. 1987;
111:258-61.
Etiology and association of growth hormone deficiency. Heinrich JJ, Martinez AS,
Bergada C. Acta Endocrinol Suppl (Copenh). 1986; 279:113-7.
Pubertal development in male hypopituitarism. Martnez AS, Heinrich JJ, Rivarola
MA, Bergad C. Eur J Pediatr. 1986; 145:384-8.
Antibodies against animal growth hormones appearing in patients treated with human growth hormone: their specificities and influence on growth velocity. Prez AR,
Pea C, Poskus E, Paladini AC, Domen HM, Martnez AS, Heinrich JJ. Acta Endocrinol (Copenh). 1985; 110:24-31.
Comparison of single and combined tests for the evaluation of plasma growth hormone secretion in normal short children. Bazn MC, Domen H, Heinrich JJ, Barontini M,
Bergad C.J Endocrinol Invest. 1984; 7:295-8.
Phenotypic heterogeneity in familial isolated growth hormone deficiency type I-A.
Rivarola MA, Phillips JA 3rd, Migeon CJ, Heinrich JJ, Hjelle BJ. J Clin Endocrinol Metab. 1984; 59:34-40.
Somatomedin activity in patients with short stature due to hypopituitarism or constitutional-familial growth retardation. Jasper HG, Martnez A, Heinrich JJ. Medicina
(B Aires). 1983; 43:308-14. Spanish.
Human, bovine, and equine growth hormone antibodies in patients treated with human growth hormone. Poskus E, Pea C, Prez AR, Vita N, Heinrich JJ, Paladini AC. J

95

Clin Endocrinol Metab. 1982; 55:13-7.

Patterns of TSH response to TRH in children with hypopituitarism. Grueiro de
Papendieck L, Iorcansky S, Rivarola MA, Heinrich JJ, Bergad C. J Pediatr. 1982;
100:387-92.
Evaluation of short stature in children. Martnez A, Coianis L, Heinrich JJ, Rodrguez
A, Bergad C. Helv Paediatr Acta. 1982; 37:563-70.
Body growth and lymphocyte DNA polymerase activity in patients with hypopituitarism. Jasper HG, Bergad C. Medicina (B Aires). 1982; 42:238-42.
Effects of alpha-bromoergocryptine on pituitary hormone secretion in children. Bazn MC, Barontini M, Domen H, Stefano FJ, Bergad C. J Clin Endocrinol Metab.
1981; 52:314-8.
The renin-angiotensin system in chronic idiopathic pituitary insufficiency. Levin GM,
Moyano MB, Bergad C. Medicina (B Aires). 1978; 38:519-23. Spanish.
Ovarian differentiation in Turners syndrome. Rivelis CF, Coco R, Bergada C. J Genet Hum. 1978; 26:69-83.
Cytogenetic findings in 125 patients with Turners syndrome and abnormal karyotypes. Coco R, Bergada C. J Genet Hum. 1977; 25:95-107.
Levels of plasma growth hormone in children with congenital heart disease. Fahrer
M, Grueiro L, Rivarola M, Bergad C. Acta Endocrinol (Copenh). 1974; 77:451-9.
Effect of hypopituitarism and ACTH on the urinary excretion of norepinephrine in
man.Moyano MB, Hauger-Klevene J, Soto RJ, Bergada C. J Clin Endocrinol Metab.
1973; 37:1-5.
Abnormal sex chromatin pattern in cryptorchidism, girls with short stature and
other endocrine patients. Bergad C, Farias NE, Romero de Behar BM, Cullen M. Helv
Paediatr Acta. 1969; 24:372-7.
Congenital anterior pituitary insufficiency with absence of the corpus callosum. Response to human somatotropin. Bergada C, Heinrich JJ, Cullen M. Medicina (B Aires).
1969; 29:269-73. Spanish.

96

II INVESTIGACIONES SOBRE HORMONAS DE CRECIMIENTO

del PERODO 1963-1976

a) Primeras experiencias
Dellacha puso en marcha su mtodo de obtencin de la bGH a partir de hipfisis bovinas suministradas por frigorficos que las haban sometido a un congelamiento rpido e individual, inmediatamente despus extradas.
Paladini consider que el primer aporte que el grupo poda encarar era verificar la
homogeneidad de la hormona intentando separar ambas cadenas y eliminando las
impurezas que podran contener las preparaciones de bGH. Para ello el laboratorio
dispona de un moderno equipo de Distribucin en Contra Corriente de 1.000 tubos,
sistema que haba demostrado un elevado poder de resolucin de mezclas complejas, incluyendo polipptidos, pero que no se haba probado en protenas. Paladini,
Dellacha y Santom trabajaron varios meses con ese equipo y enviaron las distintas
fracciones que obtenan al laboratorio de Sonenberg, en Estados Unidos, para la determinacin de la actividad biolgica de las fracciones obtenidas. Con gran decepcin comprobaron que la distribucin en contra corriente desnaturalizaba la molcula de la hormona con la consiguiente prdida de actividad.
b) Formacin de subgrupos
Frente a los resultados descriptos, los tres investigadores resolvieron que cada uno
se ocupara de un aspecto distinto del estudio de la bGH y discutir en conjunto la planificacin y estado de avance de los experimentos. Encararon los siguientes temas:
1. Subgrupo de Paladini: Estudios sobre conformacin molecular.
2. Subgrupo de Dellacha: Determinacin del residuo N-terminal y estudios fisicoqumicos que incluan la determinacin del peso molecular en la ultracentrfuga
analtica y la electroforesis libre en el aparato de Tiselius.
3. Subgrupo de Santom: Determinacin de la secuencia de aminocidos del extremo C-terminal y de la composicin en aminocidos de la bGH.

1. ESTUDIOS SOBRE CONFORMACIN MOLECULAR (PALADINI)

1.1 Intercambio de hidrgeno.
A fines de la dcada de 1960 se conoca que las hormonas de crecimiento constituan
un grupo de protenas estrechamente relacionadas pero con una peculiar especificidad de especie en su actividad biolgica. As, por ejemplo, las hormonas de otros
mamferos no eran activas en primates. Estas caractersticas indujeron a distintos
investigadores a intentar modificaciones en distintas hormonas de crecimiento de
mamferos con la intencin de hacerlas activas en humanos. Para lograrlo era muy
97

importante conocer las razones moleculares de ese comportamiento. El subgrupo de

Paladini con el objetivo de contribuir a la solucin del problema explor algunas caractersticas diferenciales de la estructura terciaria de varias hormonas de mamferos midiendo la cintica del intercambio de H, en varias condiciones experimentales, en las hormonas de crecimiento humana, bovina, ovina, porcina y equina. Para
realizar estos estudios utilizaron la tcnica de dilisis inventada por Craig, la cual
permite realizar la dilisis en forma continua y en contracorriente.
Con especial participacin del tesista rosarino Csar Cambiaso realizaron interesantes observaciones sobre los cambios conformacionales que ocurren en esas hormonas,
midiendo la cintica de intercambio de hidrgeno por tritio. Comprobaron que la hormona de crecimiento humana es de dos a diez veces ms permeable al solvente que
las otras hormonas, justificando que sea la nica activa en humanos. Midiendo la velocidad de intercambio de tritio, tambin comprobaron que existe especificidad de especie en la interaccin de las hormonas de crecimiento con membranas de eritrocitos.
1.2 Prediccin de estructura secundaria.
En colaboracin con John M. Stewart aplicaron el mtodo de Chou y Fasman para
predecir la estructura secundaria de las hormonas de crecimiento humana, bovina y
equina, del lactgeno placentario humano y de la prolactina ovina.

2. RESIDUO N-TERMINAL Y ESTUDIOS FISICOQUMICOS (DELLACHA)

2.1 Determinacin del residuo N-terminal.
Determinaron por mtodos qumicos que la mitad de las molculas de bGH tiene alanina en el extremo N-terminal y en la otra mitad fenilalanina.
2.2 Estudios fisicoqumicos.
2.2.1 Agregacin y disociacin de la bGH. Determinacin del peso molecular.
El subgrupo de Dellacha encar estas investigaciones para verificar si era cierta la
asignacin de un peso molecular de 46.000 a la bGH, aproximadamente el doble del
correspondiente a las hormonas de origen humano y de simio. Comprobaron por filtraciones a travs de geles de Sephadex G-100, en medio neutro, que la hormona de
crecimiento bovina (bGH) se comporta con un perfil de elucin correspondiente a
un peso molecular (PM) de 22.000 aproximadamente.
El Departamento de Qumica Biolgica contaba con el nico equipo existente en la
UBA para determinar el peso molecular de protenas mediante la tcnica de centrifugacin analtica, consistente en medir el desplazamiento de una protena en solucin en un campo gravitacional intenso. Con ese equipo determinaron el PM de la
bGH en una solucin reguladora donde la hormona no se agregaba. Determinaron

98

que el PM era similar a la de la hGH, confirmando el resultado obtenido por filtracin en Sephadex.
Para determinar las razones que indujeron a atribuir un peso molecular erroneo a
la bGH, realizaron numerosos estudios fisicoqumicos que permitieron establecer la
influencia de ciertos aniones en los procesos de agregacin-disociacin de la bGH.
Utilizaron las tcnicas de ultracentrifugacin analtica, gel filtracin, viscosidad y
difusin a travs de membranas porosas.
2.2.2 Purificacin y caracterizacin de protenas de la familia de las hormonas de
crecimiento.
Dellacha fue el principal responsable del aislamiento, purificacin y caracterizacin
de las hormonas de crecimiento ovina y equina.
2.2.3 Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos.
A mediados de los 70, pusieron a punto las tcnicas de marcacin de hGH y bGH
con molculas radiactivas. Marcaron la bGH con C14 mediante una reaccin qumica con O-metilisourea C14, consistente en transformar los residuos de lisina en homoarginina, conservando la hormona su actividad biolgica. Con ella estudiaron su
distribucin tisular en ratas, midiendo la concentracin y los productos de digestin
radiactivos en diferentes tejidos.

3. ESTUDIOS SOBRE ESTRUCTURA PRIMARIA (SANTOM)

En este libro se utilizan una serie de trminos vinculados a estructura de protenas y
material gentico que para algunos lectores puede ser conveniente recordar. Se describen en forma muy reducida en el Anexo A.
3.1 Caractersticas moleculares de las hormonas de crecimiento humana y bovina, conocidas cuando el grupo de qumica biolgica inici sus investigaciones.
Hormona

PM

Residuo N-terminal Residuo C-terminal

hGH Phe Phe

bGH

46.000 (Li y Pedersen, 1953) Phe, Ala Phe

20.000 (Andrews y Folley, 1963) Ala

Tambin se haban realizado determinaciones sobre la secuencia de aminocidos

del extremo C-terminal (Harris et al. 1954, Li, 1956) de acuerdo con las cuales se
haba sugerido la secuencia: (Val, Thr, Ser) Leu-Ala-Phe-Phe, considerando el peso
molecular 46.000.

99

La presencia de dos residuos N-terminales en la bGH, cuando se le atribua un peso

molecular de 46.000, hizo suponer la presencia de una cadena ramificada de aminocidos, pero cuando se inform un peso molecular de 20.000 se pens en la existencia de dos cadenas, una de ellas con Phe N-terminal y la otra con Ala. Estos conocimientos escasos y confusos sobre la molcula de bGH ponan de manifiesto la
necesidad de nuevos estudios.
El laboratorio de Qumica Biolgica estaba en condiciones para encarar estos temas
por disponer del Autoanalizador Technicon con el que Gonzles Cadavid y Paladini
haban elaborado un mtodo de anlisis automtico de amino cidos (Gonzalez Cadavid N. and Paladini AC. Automatic amino acid analysis: Reagent and instrumental improvements. Analytical Biochemistry. 9: 170-174, 1964).
3.2 Determinacin de la secuencia C-terminal de la bGH.
Santom y la bioqumica Carlota Wolfenstein, incubando la bGH durante 20 horas
con carboxipeptidasas (enzimas que liberan en forma sucesiva los residuos C- terminales) slo consiguieron liberar un residuo de fenilalanina por mol de hormona,
atribuyendo a sta un peso molecular de 20.000. Llam la atencin que las carboxipeptidasas solo liberaran la fenilalanina y no continuaran con los siguientes residuos. Ante la posibilidad de que la conformacin molecular de la bGH impidiera el
acceso del extremo C-terminal a las carboxipeptidas, repitieron el experimento en
presencia de 0,1 % de dodecil sulfato de sodio, detergente que no haba sido utilizado previamente para facilitar el ataque enzimtico a protenas. La carboxipeptidasa-A liber rpidamente y en forma sucesiva fenilalanina y alanina del extremo Cterminal. Resultados que se confirmaron con un mtodo qumico, la hidrazinolisis,
que se practic sobre la bGH nativa y sobre la bGH previamente desprovista de la fenilalanina C-terminal por accin de la carboxipeptida-A. Tuvieron que destilar, con
grandes precauciones, hidrazina altamente explosiva. Por hidrazinolisis de la bGH
desprovista de la alanina y de la fenilalanina C-terminales y oxidada con cido perfrmico, comprobaron que el tercer residuo es una media cistina.
Estos resultados constituyeron una fuerte evidencia del PM cercano a 20.000, que
Dellacha haba determinado experimentalmente, y rectificaron los datos de otros
autores.
En el siguiente trabajo determinaron la secuencia del pptido C-terminal: Phe-(GluGly)-Ala-Ser-Cys-Ala-Phe, al que aislaron por electroforesis en papel a partir de la
bGH oxidada y digerida con tripsina. Planificaron su obtencin considerando que es
el nico pptido trptico carente de arginina y/o lisina y que tiene carga fuertemente negativa por poseer, adems del carboxilo C-terminal, cidos cisteico y glutmico.
3.3 Determinacin de la composicin en aminocidos.
Determinaron la composicin en aminocidos de la bGH preparada por el mtodo
de Dellacha y Sonenberg y la expresaron considerando el peso molecular 20.800.

100

3.4 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona de crecimiento bovina.

Despus de los xitos en la determinacin de la secuencia del extremo C-terminal,
Paladini y Dellacha estimularon a Santom para que encarara la determinacin de
la estructura primaria total de la bGH, ofrecindole el apoyo de todos los integrantes
del laboratorio, como as tambin de la utilizacin de los locales y equipos existentes.
Pareca un despropsito encarar tal problema en nuestro pas, pero era demasiado
tentador poder comparar las estructuras primarias de las hormonas de crecimiento
humana y bovina e intentar determinar las razones moleculares de la falta de actividad de la bovina en humanos.
Wolfenstein y Santom haban iniciado el estudio de la estructura del extremo Cterminal, en 1963, cuando se conoca la estructura primaria de muy pocas protenas, diez aos despus de que Sanger y Thomson publicaron la estructura primaria
de la primera protena, la insulina, y tres despus de que Moore y Stein dieran a conocer la de la ribonucleasa, la segunda. Li estaba determinando la de la hormona de
crecimiento humana, tarea que le llev 10 aos.
Resolvieron encarar un trabajo de tal magnitud considerando que se podra afrontar con el equipamiento, el nmero de colaboradores, la provisin de bGH y los subsidios disponibles.
El equipamiento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica, si
bien no estaba a la altura del de los laboratorios internacionales de la especialidad,
haca posible encarar el problema por disponer de:
Un autoanalizador Technicon (donado a Paladini por una fundacin norteamericana). Recientemente, Paladini y su tesista N. Gonzlez Cadavid haban armado sus numerosos mdulos adaptndolos al anlisis automtico de
aminocidos.
Resinas para el armado de columnas cromatogrficas destinadas a la separacin de pptidos resultantes de la digestin enzimtica de protenas.
Un equipo de electroforesis de alto voltaje para la purificacin de pptidos.
Cubas para cromatografia en papel.
Con respecto a la cantidad de hormona necesaria, Moore y Stein afirmaban que para
determinar la estructura primaria de una protena se requera disponer de 1 g mensual de esa protena, cantidad que esperaban producir para la bGH. Dellacha mont
una especie de fabriquita para preparar 300 milgramos mensuales de bGH a partir de kilogramos de hipfisis bovinas adquiridas en frigorficos que las congelaban
individualmente, inmediatamente despus de extradas del animal.
Para realizar las innumerables operaciones tcnicas necesarias se incorporaron para
trabajar con Santom y Carlota Wolfenstein: Mirtha Biscoglio, que se ocup principalmente de las degradaciones de Edman, Clara Pea del extremo N-terminal de la
molcula, Edgardo Poskus de la determinacin de los puentes disulfuro y Silvia Daurat, del estudio de los pptidos hidrofbicos, poco solubles en los solventes conven-

101

cionales. Adems, todo el grupo, incluyendo a Zulema Mazzani y Vernica Fontanive,

que trabajaban hasta ese momento con Paladini y Dellacha, particip en la realizacin de las electroforesis, cromatografas, digestiones enzimticas y de todas las otras
tcnicas requeridas diariamente. En las determinaciones de la composicin en aminocidos contaban con la valiosa colaboracin tcnica de Dora Beatti, ya fallecida.
En el transcurso del trabajo la metodologa fue perfeccionndose. El primer analizador automtico de aminocidos permita tener la composicin de un pptido cada
26 horas, tiempo que se fue reduciendo hasta poco ms de 1 hora, gracias a que la
casa Technicon reemplaz el primer modelo por otro ms perfeccionado y finalmente con la incorporacin de un equipo Beckman. Paladini y Dellacha se ocupaban del
mejoramiento de los equipos. Sin embargo, este equipamiento fue superado internacionalmente por la aparicin del primer secuenciador automtico de aminocidos
presentado en 1967 por Edman, capaz de determinar la secuencia N-terminal de 15
aminocidos en 24 horas con 250 nanomoles de protena. Equipo al que no poda aspirar el grupo de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la
Universidad de Buenos Aires.
Poco despus de iniciado el proyecto se conoci la existencia de otros 2 grupos que
estaban determinando la estructura primaria de la BGH:
Wallis, M. y col. Biochemistry Laboratory, School of Biological Sciences,
University of Sussex, Falmer, Brighton, U.K.
Robert E., Fellows, Jr. y Alan D. Rogol. Department of Physiology and Pharmacology, Duke University Medical Center, Durham, North. Carolina.
Sin quererlo, el Departamento de Qumica Biolgica tuvo que competir con esos dos
grupos, procurando finalizar primero para no perder un trabajo de tal magnitud, en
el caso que los otros grupos lo publicaran antes, y las revistas no aceptaran el realizado en Buenos Aires. El grupo de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y
Bioqumica tard 7 aos en completar la estructura primaria y fue el primero en publicar el trabajo completo en 1973.
Ese mismo ao Wallis present sus resultados en una revista de publicaciones rpidas: The primary structure of bovine growth hormone. Wallis, M.FEBS Lett.
35:11-14(1973).
3.4.1. Tcnica utilizada para la determinacin de la estructura primaria de la hormona de crecimiento bovina.
En el Anexo B se describen brevemente:
La metodologa accesible en esa poca, para determinar la estructura primaria de una protena.
La metodologa empleada para determinar la estructura primaria completa de la bGH.
En el Anexo C:
La evolucin que experimentaron posteriormente esas metodologas.

102

3.5 Estructura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y

equina.
Aprovechando la experiencia adquirida y con la activa participacin de nuevos integrantes del grupo: Horacio Fernndez, lamentablemente fallecido, Dr. Mario Zakin,
proveniente del Instituto Pasteur de Pars y Pascual Ferrara, que posteriormente hizo
su tesis con Paladini, el grupo de qumica biolgica determin la estructura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y equina en un tiempo mucho ms breve.
Los estudios estructurales se realizaron con las hormonas de crecimiento ovina y
equina preparadas por los mtodos de Dellacha y colaboradores, que permitieron tener protenas homogneas, a diferencia de las resultantes de los mtodos precedentes.
Una de las razones que motivaron el estudio de la estructura primaria de las hormonas de crecimiento de distintos mamferos fue procurar aclarar porque las hormonas bovina, ovina y equina no son activas en humanos, a diferencia de lo que ocurre
con la insulina bovina y la porcina, que se utilizan en el tratamiento de la diabetes.
Pensaron en la posibilidad de que la comparacin de sus estructuras primarias podra aclarar ese comportamiento y en intentar realizar modificaciones estructurales
para obtener un derivado activo en humanos. A esta altura de las investigaciones C.
H. Li haba finalizado la determinacin de la humana y el grupo de Qumica Biolgica las de origen bovino, ovino y equino. El estudio comparativo mostr un alto grado
de homologa entre ellas y no revel diferencias a las que pudiera atribuirse la falta
de actividad en humanos de las hormonas bovina, ovina y equina.
hGH:XFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQT
bGH:AAMSGAVQHAFKRTEGRIXTV
oGH:AAMSGAVQHAFKRTEGRIXTV
eGh:XAMPSAVQHAKREGRIXAA
hGH:SLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANS
bGH:AFTATGKNAEDQXGXT
oGH:AFTATGKNAEDQXGXT
eGH:AFTPATGKNARDMEFGLXT
hGH:LVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNS
bGH:FTRXEKLARETALDM
oGH:FTRXEKLAREVALDM
eGH:FTRXEKRARERALDL
hGH:HNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRXSVEGSCGF
bGH:RSSLHTYVMKRRFGAA
oGH:RSSLHTYVMKRRFGAA
eGH:RSSKKLHAYVMKRRFSSA
Los residuos idnticos se indican con guiones y los residuos faltantes con X.

103

3.6 Influencia de la modificacin qumica de algunos residuos de

las distintas hormonas de crecimiento sobre su comportamiento inmunolgico.
La incorporacin de Zakin, inmunlogo proveniente del Instituto Pasteur de Pars,
motiv la aplicacin de esa disciplina al estudio de las diferencias entre las hormonas estudiadas.
Se comprob que la modificacin de cistena, metionina, triptfano y tirosina, en las
hormonas humana y equina, tienen poca influencia sobre la respuesta inmunolgica al suero de conejo, en cambio, la bovina es muy sensible a la modificacin de cistena, metionina y triptfano, pero no as a la de tirosina.

Publicaciones
Conformacin molecular
H-exchange behaviour and extent of reversible conformation changes in human, bovine, ovine, porcine and equine growth hormones. C.L. Cambiaso, L.A. Retegui, J.M.
Dellacha, J.A. Santom, A. C. Paladini. Biochim. Biophys. Acta, 221: 290 (1970).
Species-specific interaction of growth hormone with erythrocyte membrane. C.L.
Cambiaso, J.M. Dellacha, A.C. Paladini, J.A. Santom. FEBS Lett., 12: 236 (1971).
Prediccin de estructura secundaria
Conformational analysis of growth hormones and synthesis of a fragment of human growth hormone. C. Pea, J.M. Stewart, A.C. Paladini, J.M. Dellacha, J. A. Santom. Peptides: Chemistry, Structure and biology (R. Walter and J. Malenhofer eds.).
Proc. Fourth American Peptide Symposium, Ann. Arbor, Science Publishes, Mich. p.
523-528 (1975).
Determinacin del residuo N-terminal: Thin layer
Quantitative N-Terminal amino acid analysis by thinlayer chromatography. J.M
Dellacha, V. Fontanive. Experientia, 21:351-2 (1965)
Estudios fisicoqumicos
Molecular weight of bovine growth hormone. Dellacha, JM, Enero, MA, Faiferman, I.,
Experientia, 22, 16-7 (1966).
Physicochemical behaviour and biological activity of bovine growth hormone in acidic solution. Dellacha JM, Enero MA, Paladini AC. Biochim Biophys Acta 168::95-105
(1968).
Physicochemical and structural sudies of bovine growth hormone. Dellacha JM, Santom JA, Paladini AC, Ann. New York Acad. Sci. 148:313-27 (1968).

104

Obtencin de hormonas
Isolation, characterization and C-terminal sequence of ovine growth hormone. Dellacha JM, Enero MA, Santom JA, Paladini AC. Eur J Biochem12:289-95 (1970).
Isolation, purification and characterization of equine growth hormone. Conde RD,
Paladini AC, Santom JA, Dellacha JM. Eur J Biochem 37:164-170 (1973).
Extremo C-terminal
C-terminal sequence of amino acids in bovine growth hormone. J.A Santom,
C.E.M. Wolfenstein, A. C. Paladini. Biochem. Biophys. Res. Commun., 20: 482 (1965).
Partial sequences of the first nine amino acids from the C-terminal end in bovine
growth hormone. J. A. Santom, C.E.M. Wolfenstein, A.C. Paladini. Biochim. Biophys.
Acta, 111: 342 (1965).
Estructura primaria de la bGH
Amino acid composition of purified bovine growth hormone. C.E.M. Wolfenstein,
J.A. Santom, A.C. Paladini. Acta Physiol. Lat. amer., 16: 194 (1966).
Sequence of thirteen amino acids in the C-terminal end of bovine growth hormone
and localization of a disulfide bridge. J.A. Santom, C.E.M. Wolfenstein, M.J. Biscoglio, A.C. Paladini. Arch. Biochim. Biophys., 116: 19 (1966).
Disc electrophoresis of proteins in the presence of sodium dodecyl sulphate. E. De
Vito, J.A. Santom. Experientia, 22: 124 (1966).
Physicochemical and structural studies on bovine growth hormone. J.M. Dellacha,
J.A. Santom, A.C. Paladini. Ann. New York Acad. Sci., 148: 313 (1968).
Structural studies on bovine growth hormone. J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C.
Paladini.Biochim. Applicata, 14: 359 (1967).
Evidence for non-allelic origin of the two chains in ox growth hormone. C. Pea,
A.C. Paladini, J.M. Dellacha, J.A. Santom. Biochim. Biophys. Acta, 194: 320 (1969).
Growth hormone. Bovine (fragments). J.A. Santom, J. M. Dellacha, A.C. Paladini,
C.E.M. Wolfenstein, C. Pea, E. Poskus, S.T. Daurat, Z.M.M. Ses, A.V.F. Sanguesa, M.
J. Biscoglio. Atlas of Protein Sequence and Structure, 4: D-159(1969).
Biochemical and conformational studies on growth hormones. A.C. Paladini, J. M.
Dellacha, J.A. Santom. Miami Winter Symposia, I (1970) 270 North-Holland Publishing Co., Amsterdam (Holanda).
Growth hormone. Bovine. J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini,C.E.M. Wolfenstein, C. Pea, E. Poskus, S.T. Daurat, M.J. Biscoglio, Z.M.M. Ses, A.V.F. Sanguesa, H.N. Fernndez. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5: D-203. (1970/71).
Amino acid sequence of bovine growth hormone. J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C.
Paladini, C.E.M Wolfenstein, C.Pea, E. Poskus, S.T. Daurat, M.J. Biscoglio, Z.M.M.
Ses, A.V.F. Sanguesa. FEBS Lett., 16: 198 (1971).
Localization of a microheterogeneity in the amino acid sequence of bovine growth
hormone. H. N. Fernndez, S.T. Daurat, C. Pea, J.M. Dellacha, J.A. Santom, A.C.

105

Paladini. FEBS Lett., 18: 53 (1971).

Chemistry of growth hormones: structure-biological activity relationships. J.M. Dellacha, J.A. Santom, A.C. Paladini. In Endocrinology Proc. Fourth International Congress of Endocrinology (Washington, 1972) Excerpta Medica. ICS No. 273 p. 636-641.
Primary structure of bovine growth hormone. J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C.
Paladini, C. Pea, M.J. Biscoglio, S.T. Daurat, E. Poskus, C.E.M. Wolfenstein. Eur. J.
Biochem., 37: 164 (1973).
Studies on growth hormones. A.C. Paladini, J.M. Dellacha, J. A. Santom. Molecular and Cellular Biochem., 2: 153 (1973).
Chemistry of growth hormones, J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini. Pharmac. Therap.B. 2: 571:590 (1976).
Somatotropin-bovine. J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini, C. Pea, M.J.
Biscoglio, S.T. Daurat, E. Poskus, C.E.M. Wolfenstein. Atlas of Protein Sequence and
Structure, Vol. 5, Suppl.2, p.139 (1976).
Structure activity relationships of growth hormones. A.C. Paladini, J.M. Dellacha,
J.A. Santom. In Growth Hormone and other biologically active peptides. Excerpta Medica, Amsterdam ICS 495, p.37-44 (1980).
Estructura primaria de la oGH and eGH
Isolation, characterization and C-terminal sequence of ovine growth hormone. J.M.
Dellacha, M.A. Enero, J.A. Santom, A.C. Paladini. Eur. J. Biochem., 12: 289 (1970).
Structural studies on ovine growth hormone. Cyanogen bromide fragments; N-and
C-terminal sequences. C. Pea, A.C. Paladini, J.M. Dellacha, J.A. Santom. Eur. J. Biochem., 17: 27 (1970).
Growth hormone. Ovine (fragments). C. Pea, A.C. Paladini, J.M. Dellacha, J.A.
Santom. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5: D-204 (1970/71).
Structural studies on ovine growth hormone. Sequence of a cyanogen bromide fragment. H.N. Fernndez, A.C. Paladini, J. M. Dellacha, J.A. Santom. FEBS Lett., 17:17
(1971).
Structural studies on ovine growth hormone: Complete amino acid sequence, partially
based on homology with bovine growth hormone. H.N. Fernndez, C. Pea, E. Poskus,
M.J. Biscoglio, A.C. Paladini, J.M. Dellacha, J. A. Santom. FEBS Lett., 25: 265 (1972).
Growth hormone: Sheep. H.N. Fernndez, C. Pea, E. Poskus, M.J. Biscoglio, A.C.
Paladini, J.M. Dellacha. J.A. Santom. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5,
Suppl. I p. 50 (1973).
Amino acid sequences around the cystine residues in equine growth hormone. M.M.
Zakin, E. Poskus, J.M. Dellacha, A.C. Paladini, J.A. Santom. FEBS Lett., 25: 77 (1972).
Isolation, purification and characterization of equine growth hormone. R.D. Conde, A.C. Paladini, J. A. Santom, J.M. Dellacha. Eur. J. Biochem., 32: 563 (1973).
The amino acid sequence of equine growth hormone. M.M. Zakin, E. Poskus, J.M.
Dellacha, A.C. Paladini, J.A. Santom. FEBS Lett., 34: 353 (1973).

106

 Primary structure of equine growth hormone. M.M. Zakin, E. Poskus, A.A. Langton, P. Ferrara, J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini. Intl. J. Peptide Protein Res.
Vol. 8: 35-444 (1976).
Somatotropin-horse. M.M. Zakin, E. Poskus, A.A. Langton, P. Ferrara, J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol.5,
Suppl.2, p. 138 (1976).
An Equine growth hormone molecular species lacking the 76-92 peptidic fragment
O. Cascone, J.G. Fukushima, V. Mihajlovich, J.A. Santom and M. Biscoglio. Int. J. Peptide Protein Res. 39:397-400 (1992).
Estudios inmunolgicos
Influence of some chemical treatments on the inmunological properties of various
mammalians growth hormones. M.M. Zakin, E. Poskus, A.C. Paladini, J.M. Dellacha,
J.A. Santom. Inmunochemistry 12: 125-129 (1975).
TESIS DOCTORALES
Estudios conformacionales
ESTUDIO SOBRE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Isidoro Faiferman,
1967. Director Alejandro C. Paladini. Calificacin: Sobresaliente
LA MEDIDA DEL INTERCAMBIO DE HIDRGENOS EN DISTINTAS HORMONAS DE
CRECIMIENTO Y LA RELACIN ENTRE LA ESPECIFICIDAD DE ESPECIE Y LA CONFORMACIN DE SUS PROTENAS. Csar L. Cambiaso. 1971. Director Alejandro C.
Paladini. Calificacin: Sobresaliente.
Estudios fisicoqumicos y purificacin de hormonas
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO OVINA. Mara Amelia Enero. 1971. Director Juan M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.
AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE LA PROLACTINA OVINA Rubn D. Conde. 1972. Director Juan M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.
Estructura primaria
ESTUDIO QUMICO Y ESTRUCTURAL DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Carlota E.M. Wolfenstein, 1967. Director Jos A. Santom. Calificacin Sobresaliente.
ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA DEL EXTREMO AMINO-TERMINAL DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Clara Pea, 1972. Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente
LOCALIZACIN E IMPORTANCIA BIOLGICA DEL RESIDUO DE TRIPTOFANO
PRESENTE EN LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Mirtha J. Biscoglio, 1972.
Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.

107

 ESTRUCTURA PRIMARIA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. ESTUDIOS SOBRE UNO DE SUS PUENTES DISULFURO. Edgardo Poskus, 1972. Director:
Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.
ESTRUCTURA PRIMARIA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA: ESTUDIO DE LOS PPTIDOS POCO SOLUBLES EN LOS SOLVENTES CONVENCIONALES.
Silvia Teresa Daurat, 1974. Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.
ESTUDIOS ESTRUCTURALES SOBRE LA HORMONA DE CRECIMIENTO OVINA.
SECUENCIA DE AMINOACIDOS. Horacio N. Fernndez, 1974. Director J.A. Santom.
Calificacin Sobresaliente.
APLICACIN DE ANTICUERPOS ANTI-HAPTENES EN EL ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Cristina Nowicki,
1981. Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.
CONFERENCIAS INTERNACIONALES SOBRE bGH DICTADAS POR EL GRUPO DE

108

QUMICA BIOLGICA DE BUENOS AIRES.

Ao
1965

Orador
J.M. Dellacha

Lugar
VI Congreso Panamericano de
Endocrinologa. Mxico

1966

J.M.Dellacha

New York Academy of Sciences.

New York, USA

1967

J.A. Santom

1967

J.A. Santom

1967

J.A. Santom

1967

J.A. Santom

1967

J.A. Santom

1967

J.A. Santom

1970

A.C. Paladini

Instituto G. Maraon. Madrid,

Espaa
Instituto de Qumica Biolgica.
Univ. de Npoles. Npoles. Italia
Universidad Rockefeller. Nueva
York, USA
Laboratorio de Investigaciones
Monsanto. St. Louis, USA
Departamento de
BioqumicaUniv. de Emory.
Atlanta, USA
Inst. de Qumica Biolgica. Fac de
Ciencias. Marsella. Francia
Miami Winter Symposia

1971

J.A. Santom

1971

J.A. Santom

1972

J.A Santom

1972

J.M. Dellacha

1972

J.M. Dellacha

1973

J.A. Santom

1978

J.M. Dellacha

1979

J.M. Dellacha

1981

J.A. Santom

Fac. de Qumica y Farmacia Univ.

Nac. de Asuncin. Paraguay
Inst. de Ciencias U. N. de
Asuncin. Paraguay
II International Symposium on
Growth Hormone. Miln. Italia
IV International Congress of
Endocrinology. Washington, USA
Laboratorio de I & D Upjohn
Kalamazoo. USA.
Dep.de Bioq. y Fisiologa. U. N
Mayor de San Marcos. Lima. Per
1 Jornada de la Soc. Argentino
Hispnica de Medicina y Ciencias
Afines. Madrid, Espaa
VII Congreso Latinoamericano de
Soc. de Biol. y Med. Nuclear Vias
del Mar, Chile
III Reunin Regional de PAABS
Cono Sur. Caxamb. Brasil

Ttulo
Estudios fisicoqumicos
sobre la hormona de
crecimiento bovina.
Physicochemical and
structural studies on bovine
groth hormone.
Estructura y funcin de
protenas.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Biochemical and
conformational studies on
growth hormones.
Estructura y funcin de
protenas.
Estructura de protenas.
Hormona de Crecimiento.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Structural studies on bovine
growth hormone.
Physicochemical studios on
bovine growth hormone.
Estructura primaria de la
hormona de crecimiento
bovina.
Unin especfica in vivo
de 125 I Hormonas de
Crecimiento Bovinas.
Estudios Estructurales
de 125 I Hormona de
Crecimiento Bovina
Hormona de Crecimiento
Relacin entre estructura y
funcin

109

III INVESTIGACIONES SOBRE HORMONAS DE CRECIMIENTO

POSTERIORES A 1976 | Divisin del grupo de Qumica Biolgica de
la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA
Hasta 1976, los profesores titulares de los tres cursos de Qumica Biolgica, Paladini, Dellacha y Santom, trabajaron en colaboracin, pero en esa fecha, cada uno
de los subgrupos que dirigan encaraba problemas tan distintos del estudio de las
hormonas de crecimiento, que resultaba difcil conducir en conjunto todas la lneas
de trabajo y las ideas no siempre coincidan. Por tal motivo, consideraron conveniente que cada uno de los profesores dirigiera a su grupo en forma independiente.
Convinieron redistribuir a los colaboradores para que cada uno tuviera a su cargo
un nmero equivalente. A los colaboradores C. Pea, E. Poskus y M. Zakin, les correspondi trabajar con Paladini; mientras que H. Fernndez y D. Turyn colaboraran con Dellacha, adems, Fernndez continuara los trabajos que estaba realizando con Santom.

1. GRUPO DIRIGIDO POR PALADINI

Trabaj principalmente en inmunologa de las hormonas de crecimiento y en la deteccin de sus receptores celulares. Adems sintetiz fragmentos hormonales y estudi las caractersticas de la hormona marcada con yodo radioactivo.

1.1 Estudios inmunolgicos

1.1.1 Deteccin de zonas inmunolgicas en las hormonas de crecimiento humana,
bovina y equina.
Mario Zakin con el propsito de adquirir experiencia en qumica de protenas haba
participado activamente en la determinacin de la estructura primaria de la eGH e
iniciado la aplicacin de sus conocimientos inmunolgicos al estudio de las hormonas de crecimiento. Cuando a partir de 1976 se incorpor al grupo de Paladini, junto con Edgado Poskus, contino hasta su regreso al Instituto Pasteur con esa lnea de
trabajo, asociada con qumica proteica. Con el grupo de Paladini obtuvo fragmentos peptdicos de la eGH mediante su escisin con bromuro de ciangeno y determin la actividad inmunolgica de los fragmentos frente a antisuero de conejo contra
la hormona nativa. Comprobaron que la mayor actividad antignica corresponda al
fragmento 73-123, por ellos purificado, homlogo al 86-123 de la oGH y al fragmento 73-123 de la hGH. Comprobaron que los tres segmentos peptdicos poseen actividad inmunolgica equivalente frente a antisueros contra hGH. Con este hallazgo

110

comprobaron la reactividad inmunolgica cruzada de las tres hormonas, e incluso,

del fragmento 87-124 de la bGH.
1.1.2. Deteccin de anticuerpos contra hormonas de crecimiento humana, bovina y
equina en pacientes tratados con hGH.
La inmunidad cruzada que revelaron fragmentos equivalentes de las cuatro hormonas de crecimiento mencionadas, frente a antisueros contra la humana, indujo a sospechar que el suero de los nios tratados con hGH podan poseer anticuerpos capaces de reaccionar con bGH, oGH y eGH.
1.1.3 Obtencin de anticuerpos monoclonales y su aplicacin.
El grupo de Paladini obtuvo anticuerpos monoclonales contra hGH y bGH los cuales
tambin mostraron reaccin cruzada con distintas hormonas de crecimiento.
1.2 Receptores
En el anexo E se describen algunos conceptos sobre receptores. En 1977 los grupos
de Paladini y Dellacha inyectaron ratas con hormona marcada con C14 para medir
su localizacin en los distintos tejidos y comprobaron que se fijaba preferentemente
en hgado y rin. Al ao siguiente el grupo de Paladini aisl de microsomas de hgado de rata, la hGH marcada con I125 unida a un receptor. Estudi las caractersticas del complejo y comprob que la unin es inhibida por hormonas lactognicas
(estimulantes de la produccin de leche) pero no por las somatognicas (estimulantes del crecimiento). Por consiguiente la bGH que solo tiene actividad somatognica
no compite en esas condiciones con la hGH que posee ambas. No detectaron receptores somatognicos. Tambin comprobaron que la hGH marcada se une a microsomas de rin de coneja.
No detectaron correlacin entre la actividad de crecimiento de la bGH, en ratas hipofisoprivas y la capacidad de esta hormona de unirse in vitro a receptores hepticos, posiblemente porque en esas condiciones de reaccin solo detectaban receptores lactognicos.

Publicaciones
Estudios inmunolgicos
Detection of immunologically active zones in equine growth hormone. Poskus E, Zakin MM, Fernndez HN, Paladini AC. Eur J Immunol. 6:409-17(1976).
Immunological properties of two related fragments from human and equine growth
hormones. Zakin MM, Pea C, Poskus E, Stewart JM, Paladini AC. Eur J Immunol.
7:701-4 (1977).

111

 Immunologically active zones in bovine growth hormone. Ferrara P, Zakin MM,

Pea C, Paladini AC. Eur J Immunol. 9:1020-3 (1979).
A relevant antigenic site in human growth hormone localized in sequence 98-128.
Pea C, Poskus E, Paladini AC. Mol Immunol. 17:1487-91 (1980).
Preparation of 125I-labeled human growth hormone of high quality binding properties endowed with long-term stability. Biscayart PL, Paladini AC, Vita N, Roguin LP. J
Immunoassay. 10:37-56 (1989).
Human, bovine, and equine growth hormone antibodies in patients treated with human growth hormone. Poskus E, Pea C, Prez AR, Vita N, Heinrich JJ, Paladini AC. J
Clin Endocrinol Metab. 55:13-7(1982).
Specificities of antibodies to human growth hormone (hGH) in patients treated with
hGH: longitudinal study and comparison with the specificities of animal antisera. Retegui LA, Masson PL, Paladini AC. J Clin Endocrinol Metab.60:184-90 (1985).
Antibodies against animal growth hormones appearing in patients treated with human growth hormone: their specificities and influence on growth velocity. Prez AR,
Pea C, Poskus E, Paladini AC, Domen HM, Martnez AS, Heinrich JJ. Acta Endocrinol (Copenh).110:24-31(1985).
Epitopes in human growth hormone and chorionic somatomammotropin studied
with monoclonal antibodies. Vita N, Poskus E, Pea C, Prez AR, Paladini AC. Arch
Biochem Biophys. 225:436-45(1983).
Heteroclitic behaviour of some monoclonal antibodies against bovine growth hormone. Retegui LA, Paladini AC. Mol Immunol. 23:119-2(1986).
Stochastic humoral expression of human growth hormone epitopes. Etcheverrigaray
M, Paladini AC, Retegui LA. Immunology. 63:595-601(1988).
Receptores
Rate of concentration and digestion of radioactive growth hormone preparations injected in rats, as measured by the amount and nature of radioactivity in the tissues.
Retegui-Sardou LA, Scaramal LO, Dellacha JM, Paladini AC. Mol Cell Biochem. 16:8796 (1977).
Solubilization of the lactogenic receptors from rat liver microsomes. Bonifacino JS,
Snchez SH, Paladini AC. Biochem Biophys Res Commun. 85:62-9 (1978).
Characterization of human somatotropin binding to detergent-solubilized lactogenic receptors from rat liver. Bonifacino JS, Snchez SH, Paladini AC. Biochem J.
194:385-94 (1981).
Human somatotropin binding to rabbit kidney microsomal fraction. Roguin LP,
Snchez SH, Bonifacino JS, Paladini AC. Biochem J. 200:257-64(1981).
Effect of the incomplete separation of bound and free ligand on binding measurements. Bonifacino JS, Paladini AC. Anal Biochem. 1981 Dec;118(2):213-20 (1981).
Formation of complexes between 125I-labelled human or bovine somatotropins and
binding proteins in vivo in rat liver and kidney. Bonifacino JS, Roguin LP, Paladini AC.
Biochem J. 214:121-32(1983).

112

 Properties of human growth hormone binding sites solubilized from female rabbit kidney. Roguin LP, Bonifacino JS, Paladini AC. Biochim Biophys Acta. 715:2229 (1982).
Specificity of covalently stabilized complexes of 125I-labeled human somatotropin
and components of the lactogenic binding sites of rat liver. Caamao CA, Fernandez
HN, Paladini AC. Biochem Biophys Res Commun. 115:29-37 (1983).
Binding in vitro to rat liver receptors does not correlate with activities in vivo of bovine somatotropin. Use of chemically modified derivatives as probes. Roguin LP, Delfino JM, Vita N, Paladini AC. Biochem J.224:535-40 (1984).
Otros estudios:
Human growth hormone active site for membrane cooperative enzymes. Faras RN,
Uates LE, Moreno H, Pea C, Paladini AC. Biochem Biophys Res Commun. 85:85-91
(1978).
Synthesis and properties of human growth hormone fragments. Pea C, Stewart
JM, Ferrara P, Paladini AC. Int J Pept Protein Res.18:289-96 (1981).
Molecular biology of growth hormone. Paladini AC, Pea C, Poskus E. CRC Crit Rev
Biochem.15:25-56 (1983).
Proteolytic modification of growth hormone by a rat kidney lysosomal protease
Retegui LA, Scaramal LO, Paladini AC. Acta Physiol Pharmacol Latinoam. 37:521-32
(1987).

2. GRUPO DIRIGIDO POR DELLACHA

2.1 Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos.
Aplicaron las tcnicas de marcacin de hGH y bGH con molculas radiactivas que
pusieron a punto a mediados de los 70. Con la bGH marcada con C14 estudiaron su
distribucin tisular en ratas, midiendo la concentracin y los productos de digestin
radiactivos en diferentes tejidos.
Utilizaron las hormonas humana y bovina marcadas con I125 para radio-inmunoensayos y para realizar estudios de unin a receptores, tanto in vitro como in vivo.
2.2 Receptores
Al referirnos a los trabajos del grupo de Paladini mencionamos que junto con Dellacha, en 1977, comprobaron que inoculando ratas con hGH marcada con carbono
radioactivo, la radioactividad se detecta principalmente en hgado y rin, y que,
adems, que el grupo de Paladini demostr que los receptores mitocondrales de hgado son de naturaleza lactognica en las condiciones de la experiencia.
En 1983, el grupo dirigido por Dellacha demostr que el hgado de rata tambin tiene receptores somatognicos porque fija bGH marcada con I125 y que esa fijacin se
reduce significativamente cuando compite con un exceso de bGH sin marcar, hor-

113

mona que solo tiene actividad de crecimiento.

En 1985 confirm, en hepatocitos aislados de ratones macho, que la hGH marcada
con yodo radioactivo se une especficamente a receptores lactognicos y somatognicos y que los primeros se revelan en un medio conteniendo iones calcio y magnesio, mientras que los segundos se detectan en ausencia de esos iones.
El grupo realiz, adems, estudios estructurales y de caracterizacin biolgica e inmunolgica de las protenas asociadas a los receptores.
Dellacha desde 1976 hasta 1990, en calidad de Profesor Visitante en el Departamento de Fisiologa del Instituto de Biociencias de la Universidad Federal de Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil, dict clases y realiz investigaciones con la Prof.
Mara Marques y sus colaboradores. Producto de esta interaccin publicaron 10 trabajos de investigacin, 2 de ellos sobre hGH y el resto sobre insulina, tema que Dellacha incluy en sus investigaciones pero cuyas publicaciones y tesis dirigidas no figuran en este libro.
Invitado por el investigador R.S. Bartke de la Southern Illinois University de Estados
Unidos realiz, en colaboracin, investigaciones sobre receptores somatotrpicos y
lactotrpicos de hormona de crecimiento en ratones transgnicos.

Publicaciones
Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos.
Specific binding of human and bovine growth hormones to hypophysectomized rat
hepatocytes. Turyn D, Santom JA, Dellacha JM, Stringa de Muzzio IG, Domergasso
CS. Acta Phys. Lat. 26: 395-402 (1976).
Rate of concentration and digestin of radioactive growth hormone preparations injected in rats, as mesured by de amount and nature of radioactivity in tisssues. Retegui-Sardou LA, Scaramal IO, Dellacha JM, Paladini AC. Mol. Cell Biochem. 16: 87-96
(1977).
Receptores
Specific binding of iodinated growth hormone to rat liver in vivo. Turyn D, Dellacha
JM. Endocrinology 103:1190-5 (1978).
Structural characterization of iodinated bovine growth hormone. Matera R, Turyn
D, Fernndez HN, Dellacha JM. Intl. J. Peptide Prot. Res. 19: i72-80 (1982).
Biological and immunological characterization of iodinated bovine groth hormone. Matera R, Dellacha JM, Intl. J. Peptide Prot. Res. 19, 181-6 (1982).
Influence of divalent cations on the detection of somatogenic and lactogenic binding
sites in the Mouse liver cells. Ciccia-Torres GN, Dellacha JM. Biochem. J. 228: 761-4
(1985).
Proteins associated with somatogenic and lactogenic receptors in microsomal mem-

114

branes and intact rat hepatocytes. Robetto EJ, Caamao CA, Fernndez HN, Dellacha
JM. Biochim. Biophys. Acta 1013: 223-30 (1989).
Distribution and specific binding in vivo of iodinated growth hormones in the turtle Chrysemys dorbigni. Marques M, Silva RS, Turyn D, Dellacha JM. Gen Comp Endocrinol, 37:487-92 (1979).
In vivo effect of temperature on the specific liver uptake and renal degradation of labeled human growth hormone in turtle Chrysemys dorbigni.Turyn D, Marques M, Dellacha JM. Gen Comp Endocrinol. 44: 171-6 (1981).
Somatotropic and lactotropic receptors in transgenic mice expressing human or bovine growth hormone genes. Aguilar RC, Fernndez HN, Dellacha JN, Calandra RS, Bartke A, Ghosh PK, Turyn D. Transgenic Res 1:221-7 (1992).
Identification of somatogenic binding sites in liver microsomes from normal mice and
trangenic mice expressing human growth hormone gene. Aguilar RC, Fernndez HN,
Dellacha JN, Calandra RS, Bartke A, Turyn D. Life Sci 50:615-20 (1992).
TESIS DOCTORALES
ESTUDIO ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA IODO HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Rafael Matera, 1982. Director: J.M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.
SITIOS DE UNIN ESPECFICOS PARA LA HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA EN HGADO DE RATN. Graciela Ciccia-Torres, 1985. Director: J.M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.
CARACTERIZACIN DE LOS RECEPTORES LACTOGNICOS Y SOMATOGNICOS
DE HEPATOCITOS AISLADOS DE RATA MEDIANTE UN DERIVADO FOTO-REACTIVO
DE SOMATOTROFINA HUMANA Eduardo Robetto, 1989. Director: J.M. Dellacha. Calificacin: Bueno.

3. GRUPO DIRIGIDO POR SANTOM

3.1 Hormona de crecimiento de alpaca.
Los estudios sobre la estructura primaria de esta hormona se realizaron con el apoyo de un Programa PNUD/UNESCO destinado a fomentar la relacin entre investigadores latinoamericanos. Participaron los siguientes laboratorios:
Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires. Investigadores J.A. Santom, M.J. Biscoglio, O. Cascone, C. Pea y P. Ferrrara.
Instituto de Bioqumica y Nutricin de la Universidad Nacional Mayor de
San Marcos, Lima, Per. Investigadores M. Villavicencio, I.F. Arnao de Nu,
D. Snchez, R. Or, y J. Capdevielle.
La hormona se obtuvo de hipfisis de alpaca (Lama pacos) el primer miembro del

115

infraorden Tylopoda. Vive en la Cordillera de los Andes entre 4.500 y 5.500 metros
de altura.
3.2 Aportes al conocimiento de la conformacin molecular y determinacin de la importancia biolgica de los distintos aminocidos de las hormonas de crecimiento.
3.2.1 Modificacin qumica de aminocidos.
Durante varios aos, investigadores de distintos laboratorios internacionales intentaron cristalizar las hormonas de crecimiento obtenidas de hipfisis sin conseguirlo;
posiblemente, debido a que las hormonas aisladas no eran totalmente homogneas
por poseer cierto porcentaje de molculas que diferan de las restantes por la falta de
algn residuo de aminocido o por su reemplazo por otro. Como ejemplo mencionaremos que en la mitad de las molculas nativas de las hormonas bovina y ovina falta
la alanina N-terminal y que el grupo de Qumica Biolgica demostr que el 30 % de
las molculas de bGH tiene valina en lugar de leucina en la posicin 125.
Ante el desconocimiento de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento,
el grupo de Santom, con la colaboracin de M. Biscoglio, S. Daurat, H. Fernndez y
C. Wolfenstein, y la incorporacin de Osvaldo Cascone, Cristina Nowicki, Jos Mara Delfino, Mario Ermcora y Perla Kaliman, decidi contribuir al conocimiento de
la conformacin molecular de esas hormonas, mediante modificaciones qumicas.
Para ello tuvieron en cuenta que varios residuos de aminocidos de las protenas poseen grupos qumicos susceptibles de reaccionar frente a reactivos especficos y que
esas reacciones son posibles cuando esos residuos estn ubicados en regiones moleculares a las que pueden llegar esos reactivos. Por consiguiente, los residuos de mayor accesibilidad son los que sufren un mayor grado de reaccin, es decir los que se
modifican en mayor porcentaje. En realidad, esto es vlido cuando los reactivos son
hidroflicos y no se cumple con los hidrofbicos, capaces de penetrar en regiones moleculares no accesibles a los solventes acuosos. Lgicamente, es fundamental que las
condiciones de las reacciones qumicas no alteren la conformacin de las molculas.
Los siguientes son los residuos de aminocidos susceptibles de ser modificados qumicamente: N-terminal, C-terminal, Tirosina, cido asprtico, cido glutmico, Lisina, Arginina, Metionina, Histidina y Cistena.
3.2.1.1 Identificacin de los residuos modificados y determinacin del porcentaje
de modificacin.
En general, con el objeto de lograr una modificacin gradual de cada residuo, hicieron reaccionar las hormonas de crecimiento con los reactivos especficos, variando
el tiempo de reaccin o la concentracin del reactivo. Para identificar los residuos
modificados en cada caso, digeran con enzimas proteolticas a las protenas modificadas y aislaban cada uno de los pptidos obtenidos. La determinacin de la compo-

116

sicin en aminocidos de los pptidos resultantes les permita establecer su posicin

en la molcula de la hormona y, en aquellos pptidos que contenan los residuos modificables, establecer el porcentaje de modificacin.
3.2.1.2 Modificacin qumica de aminocidos y actividad biolgica.
La obtencin de hormonas de crecimiento con distintos grados de modificacin qumica, les permiti determinar si los distintos aminocidos modificados alteraban
el reconocimiento de los receptores celulares y la expresin de la actividad biolgica. Lgicamente, para dar validez a los resultados obtenidos, tenan que asegurarse
que las condiciones de reaccin no alteraban la conformacin molecular. Recurran
para ello a procedimientos tales como las medidas de dicrosmo circular en el ultravioleta lejano y cercano, capaz de detectar variaciones en hlices-, cadenas- y estructura terciaria.
3.3 Modificacin qumica de distintos residuos.
3.3.1 Formacin de subgrupos de investigacin.
A esta altura de las investigaciones, Biscoglio, Daurat, Fernndez y Wolfenstein, haban aprobado sus tesis doctorales y estaban en condiciones de co-dirigir lneas de
investigacin. Se les asign la realizacin de las siguientes modificaciones qumicas:
Lisinas: M. Biscoglio.
Tirosinas y triptfano: S. Daurat.
cidos glutmicos y asprticos: H. Fernndez.
Argininas: C. Wolfenstein.
Posteriormente otros colaboradores tambin adquirieron la experiencia requerida
para co-dirigir investigaciones, por lo cual se les asign responsabilidad en la realizacin de otras modificaciones qumicas:
Introduccin de haptenos y obtencin de anticuerpos: C. Nowicki.
Metioninas: O. Cascone, colaborando con M. Biscoglio.
Histidinas: O. Cascone, colaborando con M. Biscoglio.
Determinacin de la proximidad de residuos unindolos con reactivos qumicos bifuncionales: C. Nowicki, M. Ermcora y C. Wolfenstein.
La determinacin de la accesibilidad de los distintos aminocidos a los reactivos especficos permiti que el grupo elaborara modelos de conformacin molecular de
las hormonas de crecimiento.
NOTA ACLARATORIA. A continuacin de la descripcin de cada una de las modificaciones qumicas realizadas en el Departamento de Qumica Biolgica, se harn comentarios sobre la validez de los resultados frente a los conocimientos estructurales actuales. Para facilitar la comprensin de esos comentarios, en el anexo D se describen
brevemente los conocimientos actuales.

117

3.3.2 Modificacin qumica de lisinas

Biscoglio y colaboradores comenzaron con hormona de crecimiento equina. Utilizaron cido 2,4,6-trinitrobenceno sulfnico que reacciona con el grupo -amino del
residuo N- terminal y con los grupos -amino de las lisinas.
Utilizaron distintos tiempos de reaccin para estudiar el efecto de la modificacin
gradual de esos residuos sobre el crecimiento de ratas hipofisoprivas y sobre la conformacin molecular controlada por dicroismo circular.
El residuo N-terminal fue el que mostr mayor reactividad, seguido por las lisinas
179, 156, 143, 63 y 165. No pudieron establecer una correlacin entre la modificacin de cada residuo y la prdida de actividad biolgica debido a que sta se pierde
por la nitracin parcial del conjunto de residuos. No obstante, dedujeron que el residuo N-terminal y la lisina 179 no son importantes para la actividad biolgica. En
cambio, observaron una cierta correlacin entre la nitracin de la lisina 156 y la perdida de actividad de crecimiento.
Con la intencin de aclarar la participacin de la lisina 156 resolvieron estudiar el
efecto de la trinitrofenilacin en la hormona de crecimiento bovina. El residuo Nterminal tambin fue el ms reactivo, seguido en orden decreciente por las lisinas
178, 142, 64, 112, 169 y 165. Estos resultados coincidieron con los de la hormona
de crecimiento equina, excepto que la lisina 156 no se trinitrofenila en la hormona bovina.
Nowicki contribuy a estudiar los efectos de la modificacin de los grupos amino,
carbamilando la hormona de crecimiento bovina en condiciones de asegurar la total reaccin del grupo N-terminal. Tambin se produjo la carbamilacin del 28% de
la lisina 179 y del 7 % de la lisina 143.
La hormona as modificada retuvo una importante actividad de crecimiento y fue tan
activa como la nativa en el ensayo de competicin in vivo por los receptores de hgado de rata. Sin embargo, tuvo que producirse algn cambio conformacional porque la lisina 69 que habitualmente reaccionaba poco con el cido trinitrobenceno
sulfnico, lo hizo fcilmente en la hormona carbamilada, con total destruccin de la
capacidad de unin a los receptores celulares y de la actividad promotora de crecimiento. Este resultado sugiri la importancia de la lisina 69 en la actividad biolgica.
Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.
La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
El residuo N-terminal y las lisinas 63 y 143 de la eGH, 64, 70 y 142 de la bGH
estn expuestas al solvente, sin integrar las hlices-.
La lisina 69, sugerida como importante para la actividad biolgica, est ubicada en el extremo del sitio 1 de reconocimiento del receptor, al cual debe alterar cuando se trinitrofenila.

118

 Las lisinas 63, 165 y 179 de la eGH, 112, 165, 169 y 178 de la bGH, tambin se
trinitrofenilaron, aunque en menor grado, a pesar de integrar hlices-, porque
stas, si bien tienen una cara hidrofbica con residuos que interactan fuertemente entre s formando el ncleo hidrofbico de la molcula, esas lisinas estn
ubicadas en la cara hidroflica, en contacto con el solvente.
La trinitrofenilacin parcial de las lisinas 156, 165 y 179 de la eGH, en conjunto, justifica la prdida de actividad biolgica por que estn ubicadas en el sitio 1
de unin de la hormona al receptor.

Sitio 1
Sitio 2

Diagrama de la estructura de la hGH sealando los sitios I y II de unin al receptor.

N: Residuo N-terminal; C: Residuo C-terminal; I, II, III y IV: Hlices .
Estn indicados los residuos iniciales y terminales de cada hlice.
3.3.3 Modificacin de tirosinas y triptfano.
Los primeros estudios que realiz el grupo de Santom sobre la modificacin e importancia biolgica de esos residuos se realizaron con la principal participacin de
Daurat y Moya Portuguez, pasante de la Ciudad Universitaria Rodrigo Facio de
Honduras.
Las hormonas de crecimiento bovina y equina tienen el triptfano en posicin 85 y
las tirosinas en las posiciones: 35, 42, 109, 141, 158 y 174. Con tetranitrometano modificaron el 55-60 % del triptfano, el 38-100 % de la tirosinas 35, 42, 109, 141 y 174
sin alterar la actividad de crecimiento ni la capacidad antignica. La inaccesibilidad
de las tirosinas 28 y 158 al tetranitrometano no permitieron determinar su importancia en la actividad biolgica.
Teniendo en cuenta que el tetranitrometano, por su naturaleza hidrofbica no es un
reactivo adecuado para determinar la accesibilidad de las tirosinas, la becaria Blumgrund acetil las tirosinas de la bGH con N-acetilimidazol, previa proteccin de las
lisinas mediante su amidinacin. Todas las tirosinas se acetilaron, incluso la 158, en
un porcentaje que vari entre 24 y el 81%. Estos resultados y los anteriores permitieron postular que todas las tirosinas son accesibles al solvente y que la integridad
de las mismas no es indispensable para la actividad promotora de crecimiento de las
hormonas bovina y equina.
Otros autores (Ma L., Brovetto-Cruz J. y Li, C.H., 1971, Biochem. Biophys. Acta 229,
444-450; Kawauchi, H. y Li, C.H. Arch. Biochem. Biophys. 165: 255-262) haban in-

119

formado que la modificacin de las tirosinas de la hGH disminuye su actividad promotora de crecimiento pero no determinaron que tirosina era responsable. El grupo
de Santom confirm esa informacin y propuso que la disminucin de la actividad
en la hGH se deba a la modificacin de las tirosinas 160 y/o 164. Esta ltima no est
presente en las hormonas bovina, ovina y equina.
Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales
La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
Todas las tirosinas son accesibles al solvente porque la mayora est ubicada fuera de las hlices- o en el extremo de stas. Las que integran la hlice IV
no forman parte de los residuos que interaccionan para formar el core hidrofbico.
La tirosina 164 de la hGH, debe ser la responsable de la prdida por acetilacin
de su capacidad de reconocer los receptores, porque slo est presente en esa hormona y est ubicada en el sitio 1 de reconocimiento del receptor. Las tirosinas de
las hormonas bovina y equina no son importantes para la actividad biolgica.
3.3.4 Modificacin de metioninas.
Cuando se inici el estudio de la modificacin de los residuos de metionina de la
hGH, con la principal participacin de Cascone y Biscoglio, no existan datos concluyentes en la literatura. En 1972 Wallis (Wallis M., 1972, FEBS Lett. 21: 118-122)
haba informado que la carboxilacin de las 4 metioninas de la bGH produca un
derivado prcticamente inactivo y el grupo de Li (Glaser C.B. y Li C.H. 1974. Biochemistry 13: 1044-1047) oxid a metionilsulfxido las metioninas 4, 123 y 148 sin alteracin de la actividad biolgica, pero cuando modificaba la 178 en presencia de
urea, se produca una significativa prdida de actividad.
El laboratorio de Buenos Aires seleccion cloramina-T para oxidar las metioninas
debido a su alta especificidad en ausencia de grupos sulfidrlos y a su capacidad de
ingresar en regiones hidrofbicas en ausencia de agentes desnaturalizantes como
la urea utilizada por Glaser y Li. El grupo argentino, contradiciendo los trabajos de
otros autores, demostr que la integridad de las metioninas no es indispensable para
la actividad biolgica de la hormona. Consiguieron oxidar las 4 metioninas sin alterar la actividad promotora de crecimiento.
3.3.5 Modificacin de histidinas.
El principal ejecutor de esta investigacin fue el becario Fukushima que trabaj en
colaboracin con Biscoglio y Cascone. Comenzaron determinando la reactividad de
las 3 histidinas de la bGH frente al anhdrido etoxifrmico y establecieron que las
histidinas 20 y 22 tenan una cintica rpida de reaccin, mientras que la 168 lo ha-

120

ca con lentitud. La etoxiformilacin de las 3 histidinas condujo a la prdida total de

la capacidad de la hormona para competir con la hGH, marcada con iodo 125, por
los receptores de hgado de rata y que la modificacin de aproximadamente la mitad
de las histidinas de reaccin rpida produca una importante disminucin de esa capacidad. Este resultado permiti sugerir que una de ellas, o las dos, eran las responsable de la prdida. La modificacin de las histidinas no produjo cambios conformacionales detectables por dicrosmo circular y la hormona etoxiformilada recuper
la capacidad de reconocer los receptores de hgado, cuando se revirti la modificacin por tratamiento con hidroxilamida. Anlogos resultados obtuvieron por etoxiformilacin de la eGH.
Con la intencin de determinar cual de las dos histidinas es importante para la actividad biolgica realizaron un estudio semejante con hGH, considerando que sta
tiene dos de sus histidinas con distinta ubicacin que las de origen bovino y equino.
La histidina ms accesible al reactivo fu la 151 que ocupa una posicin molecular
distinta a la que ocupan esos residuos de aminocidos en las hormonas de origen bovino, ovino y equino. La segunda fue la 18 ubicada en la hlice-1 a semejanza de las
histidinas 20 y 22 de la bGH y 19 y 21 de la eGH. La histidina 21 de la hGH no reaccion en las condiciones de la reaccin.
La histidina 151, exclusiva de la hGH, no parece importante para el reconocimiento
de los receptores de hgado porque cuando se etoxiformil totalmente, la hGH conserv el 53 % de su capacidad de reconocer esos receptores. La histidina 18 tampoco
parece indispensable porque despus de su modificacin total la hormona conserv
el 35 % de su capacidad de unin al receptor. Este ltimo resultado llam la atencin
por que la histidina 18, aunque reemplazada por glutamina en las hormonas bovina,
ovina y equina, se encuentra en el mismo segmento molecular que las histidinas 20
y 22 de la bGH y sus equivalentes 19 y 21 de la eGH, una o ambas importantes para
reconocer al receptor.
Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales
La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
La histidina 151 de la hGH es muy accesible al solvente porque est ubicada
en una regin molecular muy expuesta. Est reemplazada por una arginina en
las otras tres hormonas y es evidente su irrelevancia en la actividad biolgica.
Las cuatro hormonas tienen dos histidinas muy prximas en la hlice-I. El
grupo de Argentina demostr que las ubicadas en posicin 20 y/o 22 de la bGH
y las 19 y/o 21 de la eGH son importantes para la actividad biolgica y que la 18
de la hGH, reemplazada por glutamina en las otras hormonas, no es indispensable. Es probable que la histidina 22 de la bGH y la 21 de la eGH sean las que intervienen en la unin con los receptores, porque ocupan posiciones equivalentes

121

y en esa misma posicin est la histidina 24 de la hGH. No pudieron demostrar

su importancia porque no pudo ser modificada. Puede llamar la atencin que estas histidinas se encuentran en la hlice-I, que forma parte del Sitio I de reconocimiento del receptor y que haya variaciones en la secuencia de las hormonas de
distintas especies, pero debe considerarse lgico porque las hormonas de otros
mamferos no reconocen los receptores humanos.
3.3.6 Modificacin de grupos carboxilo.
La ejecucin de los estudios realizados sobre esta modificacin qumica estuvo a cargo de Fernndez y el becario J. M. Delfino.
Estudiaron la reactividad de los grupos carboxilos hacindolos reaccionar con 1-etil3-(3 dimetilamino propil) carbodiimida en presencia de glicinametilester para obtener las amidas de los amino cidos con carboxilos libres. Los grupos carboxilo que
se modificaron con mayor velocidad fueron los correspondientes a Glu 30, Glu 124,
Glu 126 y Asp 127, seguidos por Glu 66, Asp 105, Asp 150, Asp 151, Glu 184 y Phe
C-terminal.
La modificacin de aproximadamente el 20 % de los grupos carboxilos condujo a
una importante disminucin de la actividad promotora de crecimiento en ratas hipofisoprivas y de la capacidad de competir con hormona marcada con I-125 por los
receptores de hgado de rata, tanto in vivo como en hepatocitos aislados. Estos investigadores sugirieron que la modificacin de la carga es la responsable porque recuperaron la mayor parte de la actividad biolgica por desmetoxilacin, reaccin
que deja los glutmicos y asprticos unidos a glicina con el carboxilo libre.
Los derivados que contenan 1.5 a 2.6 carboxilos modificados conservaron la mayor
parte de la actividad biolgica, mientras que los que tenan un promedio de aproximadamente 5 residuos experimentaron una brusca reduccin de la actividad. Estos
resultados indicaron que los residuos responsables estn dentro de los de reaccin
rpida. Realizaron un estudio cintico de las curvas experimentales y llegaron a la
conclusin que la prdida es la consecuencia del efecto de la modificacin acumulativa de 2 o 3 carboxilos de un conjunto de 3 a 8 residuos relevantes.
Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.
La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
Los posibles residuos relevantes pueden ser el glutmico 184 y la fenilalanina
C-terminal pertenecientes al sitio-1 de reconocimiento del receptor y los glutmicos 124 y 126 del sitio-2.
3.3.7 Modificacin de argininas.
C. Wolfenstein fue la principal responsable de la modificacin de estos residuos. Es-

122

tudiaron los efectos de la modificacin de los residuos de arginina de las hormonas

de crecimiento bovina y humana. Tal como corresponde a residuos hidroflicos, generalmente expuestos al solvente, lograron modificar por tratamiento con 1.2 ciclohexanediona la totalidad de los residuos de arginina, con excepcin de la 183 de
la hGH y 180 de la bGH. La modificacin produjo la prdida total de la capacidad de
unirse a los receptores de hgado de rata. La hormona humana, capaz de reconocer
receptores lactognicos, adems de los de crecimiento, dej de reconocer a ambos.
El dicrosmo circular no evidenci cambios conformacionales y la actividad biolgica se recuper eliminando los grupos unidos a las argininas. Dedujeron que la modificacin de dos argininas provoc la prdida de actividad.
Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.
Evidentemente las argininas cuya modificacin provoc la prdida de capacidad de unin a los receptores deben estar en el sitio-1 o en el sitio-2. Es interesante sealar que en ambas hormonas, el residuo que no se modifica se encuentra en el sitio-1.
3.4 Introduccin de haptenos en el estudio de estructura y funcin.
La principal ejecutora de este proyecto fue la tesista C. Nowicki. El objetivo del estudio fue la introduccin de haptenos en un nico residuo de la hormona y unirlo a anticuerpos antihaptenos, previamente obtenidos, para investigar la importancia de la
regin molecular bloqueada, en la actividad biolgica.
Obtuvieron bGH con su residuo N-terminal bloqueado con un grupo trinitrofenilo,
al que unieron anticuerpos especficos para ese hapteno. El derivado obtenido conserv la actividad promotora de crecimiento de la hormona y su capacidad de reconocer los receptores celulares. Este resultado indic que el residuo N-terminal no es
fundamental para la actividad biolgica como as tampoco la regin hormonal en
contacto con el anticuerpo.
Interpretacin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.
A pesar de que los primeros residuos de la hlice-I, que comienza en el residuo 6,
forman parte del sitio-1 de reconocimiento del receptor, el anticuerpo unido al residuo N-terminal no alter la actividad biolgica. Posiblemente, la flexibilidad del
segmento constituido por los cinco primeros residuos de la hormona impidi el bloqueo del sitio-1.
3.5 Determinacin de la proximidad de residuos unindolos con
reactivos qumicos.
Los principales responsables de la ejecucin de estas investigaciones fueron Nowicki, Ermcora y Wolfenstein. La idea del proyecto consisti en la utilizacin de reactivos bifuncionales, que otros autores haban utilizado en distintas molculas para

123

determinar que grupos estaban estericamente cercanos. Su utilizacin en las hormonas de crecimiento permita obtener informacin relacionada con la conformacin molecular, desconocida hasta entonces.
Escogieron como reactivo bifuncional al 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno con el que
lograron obtener bGH con la tirosina 173 unida a la lisina 110 por un puente constituido por el grupo qumico dinitrofenileno. Este resultado indic que la distancia
que separa esos dos residuos en la molcula es aproximadamente la de la longitud
del dinitrofenilo (3 a 5 A).
Repitieron la experiencia variando las condiciones experimentales y comprobaron
que la tirosina 173 tambin se uni con un puente dinitrofenileno a las lisinas 30 y
169. Estos resultados les permitieron inferir que las lisinas 110, 30 y 169 estn localizadas a una distancia de aproximadamente 5 A de la tirosina 173.
Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.
Los resultados obtenidos son correctos si se tiene en cuenta que la tirosina 173 de
la hGH est ubicada en la hlice-IV, prxima a la lisina 169 de la misma hlice,
cercanas a la lisina 30 de la hlice-I, la cual integra con la IV, el Sitio-1 de reconocimiento del receptor. El puente entre la tirosina 173 y la lisina 110, tambin
es posible si se considera que est ubicada en el segmento de estructura poco rgida que une las hlices II y III.
3.6 Finalizacin de los estudios sobre hormonas de crecimiento
que realizaba el grupo de Santom.
Los trabajos mencionados, conducentes a obtener informacin sobre la conformacin de la molcula de la hormona, dejaron de tener significado a partir de 1987
cuando Abdel-Meguid y col. dieron a conocer la estructura tridimensional de la hormona porcina recombinante y en 1992 de Vos y col. la estructura cristalina de la hGH
unida al dominio extracelular de su receptor.

Publicaciones
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125

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TESIS DOCTORALES
ESTUDIO DE LA REACTIVIDAD DE LOS AMINOGRUPOS EN LA HORMONA DE
CRECIMIENTO EQUINA Y DE SU IMPORTANCIA EN LA ACTIVIDAD BIOLGICA. Osvaldo Cascone. Director Jos Alberto Santom.
ACETILACIN DE RESIDUOS DE TIROSINA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO
HUMANA. SU EFECTO SOBRE LA CAPACIDAD DE UNIN A RECEPTORES LACTOGNICOS Y SOMATOGNICOS. PERLA KALIMAN, 1990. Director: Jos Alberto Santom.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA REACTIVIDAD DE LAS TIROSINAS DE LAS HORMONAS DE CRECIMIENTO BOVINA Y EQUINA HACIA EL TETRANITROMETRANO.
TESIS DE LICENCIATURA EN QUMICA. Manuel Enrique Moya Portuguez. Ciudad
Universitaria Rodrigo Facio. Honduras. Director: Jos Alberto Santom.
ESTUDIO DE LA REACTIVIDAD DE LOS RESIDUOS DE HISTIDINA DE LAS HORMONAS DE CRECIMIENTO DE MAMFEROS Y DE SU IMPORTANCIA EN LA ACTIVIDAD BIOLGICA DE ESAS PROTENAS. Jorge Guillermo Fukushima, 1986. Directora: Mirtha Biscoglio.
MODIFICACIN QUMICA ESPECFICA DE LOS GRUPOS CARBOXILATOS DE LA
SOMATOTROFINA BOVINA. Jos Mara Delfino, 1985. Calificacin: Sobresaliente.
Director: Jos Alberto Santom.
APLICACIN DE ANTICUERPOS ANTI-HAPTENES EN EL ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Cristina Nowicki,
1981. Director: Jos Alberto Santom.

126

4. APORTES DE OTROS GRUPOS SIN INTERVENCIN DE PALADINI, DELLACHA Y SANTOM

En las ltimas etapas de los trabajos dirigidos por Paladini, Dellacha y Santom, se
fueron formando, entre sus colaboradores, nuevos grupos de investigacin, algunos
de los cuales continuaron trabajando en temas relacionados con las hormonas de
crecimiento. A continuacin se resumen los aportes que realizaron.
4.1 Biscoglio-Cascone
Cuando Santom dej de trabajar en hormonas de crecimiento, Biscoglio y Cascone constituyeron un grupo independiente que en los comienzos de su actividad continu trabajando sobre hormonas de crecimiento. Realizaron los siguientes aportes
en ese campo.
Crearon un mtodo de purificacin de pptidos que contienen histidina basado en la modificacin de esos residuos con anhdrido etoxifrmico, reactivo que haban utilizado en la modificacin de las histidinas en hormonas de
crecimiento.
Utilizaron un mtodo de prediccin de homologa conformacional que permiti postular al fragmento 42-49 como vinculado a la especificidad de especie en la familia de las hormonas de crecimiento.
Continuaron trabajando en la determinacin de la estructura primaria de
la hormona de crecimiento de alpaca. Estudiaron los pptidos trpticos de la
hormona reducida y carbamido-metilada. Con los datos obtenidos y los resultados anteriores propusieron la estructura primaria total, parcialmente basada en su homologa con la hormona equina.
Estudiaron la reactividad de las metioninas de la eGH frente a cloramina-T
y comprobaron que es semejante a la de la bGH.
En colaboracin con el grupo de Retegui detectaron regiones moleculares
de la hGH reconocidas por anticuerpos monoclonales. Determinaron, adems, qu anticuerpos monoclonales interferan en la unin de la hGH con receptores lactognicos.
4.2 Fernndez- Delfino
En trabajos realizados sin la participacin de Dellacha, Paladini y/o Santom estudiaron el equilibrio monmero-dmero de la bGH. En otros experimentos unieron el
receptor lactognico de hgado de rata con un derivado fotoactivable de hGH.
Comprobaron que:
La tirosina 142 est involucrada en el rea de contacto.
La estabilizacin covalente del dmero diminuye fuertemente la actividad
promotora de crecimiento y la unin a receptores en hgado de rata in vivo y
en microsomas de hgado de conejo.

127

 Aportaron evidencias de que los grupos amino involucrados en la unin covalente no son relevantes para la actividad biolgica.
La estabilizacin covalente del dmero no altera la actividad inmunolgica
medida por radioinmunoensayo.
Determinaron la presencia de una protena asociada al receptor lactognico.
4.3 Pea
Se dedic principalmente a investigaciones que involucraban la sntesis de pptidos,
convirtindose en una reconocida especialista de nuestro pas en ese tema. Su participacin en los estudios sobre hormonas de crecimiento se limit a los trabajos en
colaboracin con otros grupos.
4.4 Poskus
Cuando integraba el grupo de Paladini, detect anticuerpos contra hormonas de
crecimiento humana, bovina y equina en pacientes tratados con hGH. Al constituir
su propio grupo de trabajo contino trabajando en el tema, al mismo tiempo que encaraba otros problemas inmunolgicos y estructurales.
El grupo de Poskus comprob que mientras que los pacientes tratados con hGH producan un elevado tenor de anticuerpos, el tratamiento con la hormona recombinante no los produca. Consider muy factible que la obtencin de la hormona de hipfisis y su purificacin podan alterar su estructura molecular desencadenando una
respuesta inmune heterloga.
4.5 Reteghi
Anticuerpos monoclonales
Durante su estada en el laboratorio de PL Masson en la Unit of Experimental Medicine, de Duve Institute (ex Institute of Cellular and Molecular Pathology, ICP), Universit Catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique, Retegui adquiri experiencia en
la obtencin y estudio de anticuerpos monoclonales, en especial contra las hormonas de crecimiento. Obtuvieron en ratones cinco anticuerpos monoclonales contra
la hGH que tambin reaccionaron con el lactgeno placentario humano y tres de
ellos con prolactina humana. Cuatro de los 5 anticuerpos no reconocieron a la bGH.
Comprobaron que:
Los anticuerpos monoclonales reconocen una regin antignica principal.
La secuencia 98-129 est involucrada en el reconocimiento de los receptores.
La misma regin de la hGH est involucrada en la unin a los receptores de
hgado de conejo y de linfocitos humanos.
A su regreso al pas continu trabajando en ese tema, al principio con el grupo de Paladini (Ver investigaciones posteriores a 1976) y poco despus con su propio grupo
de trabajo. Realiz colaboraciones con los doctores Mirtha Biscoglio, Leonor P. Roguin y Natalio Vita, todos miembros del Departamento de Qumica Biolgica. Las

128

principales contribuciones fueron las siguientes:

Utiliz 20 anticuerpos monoclonales contra hGH, que cubran la totalidad
de la molcula, para establecer la topografa antignica de la hormona. Obtuvo esa informacin midiendo la habilidad de pares de anticuerpos monoclonales para unirse simultneamente o no a la hGH marcada con yodo radioactivo.
Los resultados indicaron que los epitopes estudiados ocupaban toda la superficie de la hormona.
La unin de algunos anticuerpos monoclonales a la hormona le induce cambios conformacionales.
Establecieron qu monoclonales se unen a la regin de reconocimiento del
receptor y cuales no estn involucrados en la unin.
Cada una de las tres hormonas lactognicas: hGH, prolactina ovina y lactgeno placentario humano al unirse al receptor prolactnico de hgado de rata
o de clulas Nb2 (provenientes de un linfoma de rata que prolifera en presencia de hormonas lactognicas) impide la unin de las otras dos. Sin embargo,
comprobaron que los sitios de unin no son exactamente los mismos.
Ubicacin molecular del sitio de unin de los anticuerpos monoclonales
En colaboracin con Pea:
Examin el comportamiento inmunolgico de fragmentos de hGH, obtenidos por escisiones enzimticas y qumicas y purificados por HPLC, frente a anticuerpos monoclonales dirigidos contra la hormona nativa. Comprobaron inmunocidad en los dos tercios N-terminales de la molcula y falta de ella en la
secuencia 135-191.
Estudiaron el comportamiento de fragmentos de la eGH frente a distintos
anticuerpos y comprobaron que las zonas antignicas de la hormona se encuentra en las posiciones 5-72 y 73-123 y que algunos anticuerpos reconocen
pequeos pptidos tales como 52-72 y 110-123.
4.6 Turyn
En 1990, Dellacha fue invitado por el investigador norteamericano R.S. Barke de la
Southern Illinois University de Estados Unidos para realizar trabajos, en colaboracin, sobre receptores somatotrpicos y lactotrpicos de hormona de crecimiento en
ratones transgnicos. Turyn, tuvo una predominante participacin en los dos trabajos que se publicaron (Ver Grupo dirigido por Dellacha). En relacin con esa colaboracin Turyn se asoci con Bartke para acceder a modelos de animales transgnicos
que le permitan estudiar los efectos de altas concentraciones de hormonas de crecimiento sobre sus efectos en el animal y sobre la actividad de la insulina.
Los ratones deficientes en hormona de crecimiento o en su receptor son enanos y
ms sensibles a la accin de la insulina, mientras que los ratones que sobreexpresan
hormona de crecimiento tienen mayor tamao corporal que los controles y son insulinorresistentes. Sin embargo, el aumento de tamao corporal no es tan marcado, lo

129

que sugiere que existen mecanismos que atenan el exceso de hormona. Turyn resolvi estudiar esos mecanismos. Antes de mencionar sus aportes debemos recordar
que la hormona de crecimiento se une a su receptor de membrana (GHR) para desencadenar una respuesta y que la hormona circulante, en parte, se une con alta especificidad a una protena transportadora de la hormona, la GHBP, cuya estructura
coincide con la porcin extracelular del receptor. La GHBP funciona como modulador de la actividad de la GH y disminuye la tasa de eliminacin de la hormona, aumentando su vida media. La GHBP tambin se encuentra asociada a membranas microsomales hepticas (MA-GHBP) donde funcionara como competidor del receptor.
El grupo de Turyn estudi la fisiopatologa del sistema GHR, GHBP y MA-GHBP
frente a elevadas concentraciones de hormona, para determinar cmo son compensados esos altos niveles de hormona circulante. Realiz los aportes siguientes:
En los modelos de sobreexpresin de GH se observa mayores niveles de
GHR, MA-GHBP, GHBP circulante y mayor capacidad de unin de la hormona a membranas hepticas. Esto implica que en estos modelos hay mayor cantidad de receptores que en los animales normales, lo que indica que la hormona induce la sntesis de su propio receptor.
Ratones enanos que no expresan hormona de crecimiento, tienen protena transportadora, lo que sugiere que su sntesis no es totalmente regulada
por la hormona.
Comprob que el aumento de las concentraciones de GHBP srica y de la
asociada a membranas constituye un mecanismo compensador para contrarrestar las altas concentraciones de GH circulante ya que disminuyen la disponibilidad de la hormona para su unin al receptor. Sin embargo, a pesar de
esa disminucin de la hormona libre, los niveles de GH circulante siguen siendo muy elevados en los animales que la expresan en grandes cantidades, por
lo cual consider probable que tambin existan otros mecanismos intracelulares que contribuyan a atenuar las consecuencias de la alta concentracin.
Para investigar dicha posibilidad, el grupo tuvo en cuenta que la hormona de crecimiento pertenece al tipo de hormonas que al unirse al receptor, le induce un cambio conformacional que activa las quinasas denominadas JAK, las que a su vez activan factores de transcripcin citoplasmticos denominados STATs y que stos son
los que activan en el ncleo celular la transcripcin de genes especficos, responsables de la actividad hormonal. El grupo de Turyn evalu, en modelos que expresan
distintas concentraciones de hormona como responde la principal va de sealizacin JAK2/STAT5. Comprob que:
La sobreexpresin de hormona se asocia con la desensibilizacin de la seal, mientras que su deficiencia aumenta su sensibilidad.
Al evaluar los posibles mecanismos implicados, detect que la protena supresora de la seal de citoquinas CIS aumenta ante el exceso de hormona
pero disminuye en su ausencia.

130

Finalmente, realiz estudios sobre los efectos adversos que resultan de niveles crnicamente elevados de la hormona, entre los cuales se encuentra el desarrollo de tumores, como el hepatocarcinoma.
Describi que el hgado de ratones transgnicos que sobreexpresan GH presenta lesiones preneoplsicas que se asocian a la expresin de diversas protenas involucradas en proliferacin y supervivencia celular

Publicaciones
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Up-regulation of growth hormone (GH) binding protein by mouse GH in transgenic
mice overexpressing GH releasing hormone. Gonzlez L, Sotelo AI, Bartke A, Turyn D.
J Endocrinology 163:299-307 (1999).
Compensatory alterations of insulin signal transduction in liver of growth hormone
receptor knockout mice. Dominici FP, Arostegui Diaz G, Bartke A, Kopchick JJ, Turyn
D. J Endocrinol. 166:579-90 (2000).
Growth hormone (GH) and estradiol regulation of membrane-associated GH binding protein and GH receptors in GH releasing hormone transgenic mice. Gonzlez L,
Sotelo AI, Bartke A, Turyn D. GH & IGF Res 11: 34-40 (2001).
CIS up-regulation is associated with desensitization of growth hormone (GH) signaling in GH releasing hormone transgenic mice. Gonzlez L, Miquet JG, Sotelo AI, Bartke A, Turyn D. Endocrinology, 143:386-94 (2002).
Increased insulin sensitivity and upregulation of insulin receptor, insulin receptor
substrate (IRS)-1 and IRS-2 in liver of Ames dwarf mice. Dominici FP, Hauck S, Argentino DP, Bartke A, Turyn D. J Endocrinol. 173:81-94 (2002).
Suppression of growth hormone (GH) JAK2/STAT5 signaling pathway in transgenic mice overexpressing bovine GH. Miquet JG, Sotelo AI, Bartke A, Turyn D. Endocrinology 145:2824-2832 (2004).
Increased sensitivity to GH in liver of Ames dwarf (Prop1df/ Prop1df) mice related to
diminished CIS abundance. Miquet JG, Sotelo AI, Dominici FP, Bonkowski MS, Bartke
A, Turyn D. J Endocrinol 187:387-397 (2005).
Differential regulation of membrane associated-growth hormone binding protein
(MA-GHBP) and growth hormone receptor (GHR) expression by growth hormone (GH)
in mouse liver. Gonzlez L, Curto LM, Miquet JG, Bartke A, Turyn D, Sotelo AI. GH &
IGF Res 17:104-12 (2007).
Transgenic mice overexpressing GH exhibit hepatic upregulation of GH-signaling
mediators involved in cell proliferation. Miquet J, Gonzlez L, Matos M, Hansen C,
Louis A, Bartke A, Turyn D, Sotelo A. J Endocrinol. 198: 317-330 (2008).
Growth hormone (GH) modulates hepatic epidermal growth factor (EGF) signaling in the mouse. Gonzlez L, Daz ME, Miquet JG, Sotelo AI, Dominici FP, Bartke A,
Turyn D. J Endocrinol, 204:299-309 (2010).

134

IV COLABORACIN CON LA INDUSTRIA DE INVESTIGADORES DE HORMONAS DE CRECIMIENTO

Los investigadores del Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA fueron requeridos por la industria biotecnolgica (Biosidus S.A.) para aplicar su experiencia en la purificacin, estabilidad y control de calidad de la hormona de crecimiento humana recombinante, obtenida a partir de E.
coli y de la proveniente de leche de vacas transgnicas.
La colaboracin se brind a travs de asesoras (Dellacha y Santom) y de convenios
con jefes de grupo, en los que intervenan los respectivos colaboradores. Mencionaremos las siguientes:

1. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA RECOMBINANTE

1.1 Asesora de Dellacha.
Particip en calidad de Asesor Cientfico de Biosidus S.A. con el equipo de profesionales a cargo de la obtencin de la hormona de crecimiento recombinante en E.
coli (hGHr), en las etapas de purificacin y estabilidad de la mencionada hormona.
En reuniones semanales se discuta la experiencia que los investigadores del Departamento de Qumica Biolgica haban adquirido en la purificacin de la hGH proveniente de hipfisis humanas, en trabajos subsidiados por el CONICET, la Fundacin
de Endocrinologa Infantil y la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA. Adems, se volc la experiencia resultante de una serie de trabajos que dichos investigadores estaban realizando acerca de las propiedades qumicas, fisicoqumicas y
biolgicas de las hormonas de crecimiento, que hacan a su mayor estabilidad en determinadas condiciones experimentales.
En funcin de estas experiencias y de comn acuerdo, se introdujeron modificaciones en ciertos procedimientos y se disearon nuevos experimentos, cuyos resultados fueron discutidos en las reuniones semanales. De ellas surgieron conocimientos
que contribuyeron a concretar la formulacin farmacutica de la hGHr.
1.2 Asesora de Santom
1.2.1 Convenios especficos de prestacin de servicios con la Facultad de Farmacia
y Bioqumica de la UBA
1.2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la Hgh recombinante
(HCB-P001) producida por Biosidus S.A. (1996)
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Jos Alberto Santom. Profesor
Emrito de la Universidad de Buenos Aires y Coordinador del Laboratorio Nacional
135

de Investigacin y Servicios en Qumica de Protenas (LANAIS-PRO).

El objeto del convenio fue realizar el estudio estructural y secuencia de aminocidos
de protenas obtenidas por la tcnica de ADN recombinante, consistente en escindirlas con distintas enzimas y reactivos qumicos, purificar los fragmentos resultantes, determinar las correspondientes secuencias de amino cidos, masa molecular
y composiciones de aminocidos. Con los datos obtenidos establecer si la secuencia
de aminocidos de la protena estudiada era correcta. Los anlisis de composicin
de aminocidos y de microsecuenciacin de pptidos se entregaban al LANAIS-PRO
para su realizacin.
Colaboradores:
Lic. Susana Linskens
Bioq. Evangelina Dacci
Ayudante ad-honorem Brian Cavagnari
Ayudante ad-honorem Santiago Di Pietro
Comprobaron que la protena recombinante codificada por Biosidus S.A. como HCBP001 tiene idntica secuencia de aminocidos y puentes disulfuro que la hormona de
crecimiento humana natural. (Hans Flodh, Acta Pediatr. Scand. Supp. 1986).
1.2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre la hGH recombinante producida
por Biosidus S.A. y otras de diferente origen. Control de calidad mediante el uso de
anticuerpos y receptores biolgicos. (1995)
1.2.1.3 La responsabilidad tcnica estuvo a cargo de la Dra. Lilia A. Retegui. Profesora Asociada de Qumica Biolgica. Investigador Independiente del CONICET.
Colaboradores:
Bioq. Viviana C. Blank.
Bioq. Karina A. Gmez.
Silvia A. Longhi.
El objetivo del trabajo fue estudiar en forma comparativa la inmunoreactividad de
la hormona de crecimiento humana recombinante producida por Biosidus S.A. con
respecto a la hormona de crecimiento humana de origen hipofisario (hGH-NIH lote
AFP-9775A) y la hGH Genotropin (hGH-KABI) de origen recombinante producida
en Estados Unidos por Genentech. El estudio consisti en evaluar la reactividad de
las diferentes hormonas frente a varios anticuerpos poli y monoclonales, su reconocimiento por receptores celulares especficos y la respuesta a cambios conformacionales producidos por anticuerpos.
El estudio realizado demostr total identidad inmunolgica entre la hormona de
crecimiento humana recombinante producida por Biosidus S.A. y sus similares de
origen hipofisario (estndar) y recombinante (Genotropin).
La capacidad de unirse a los receptores celulares fue idntica en las tres hormonas.

136

2. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA DE LECHE DE VACAS TRANSGNICAS

2.1 Convenios especficos de prestacin de servicios con la Facultad de Farmacia y Bioqumica DE LA UBA
El Dr. Santom, en calidad de asesor, particip con la Dra. Susana Dabsys de Biosidus S.A. en la elaboracin de los proyectos y en el control de la marcha de los siguientes convenios con la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA, en los cuales la
responsabilidad tcnica estuvo a cargo de:
1. Dr. Jos Alberto Santom (2003).
2. Dras. Lilia Retegui y Leonor Roguin (2004).
3. Dr. Daniel Turyn (2004).
4. Dr. Jos Mara Delfino (2004)
5. Dr. Edgardo Poskus (2006).
2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona de crecimiento humana de leche de vacas transgnicas (protena HCL-E 02), obtenida en
Biosidus S.A. (2003).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Jos Alberto Santom.
El objeto del convenio fue realizar el estudio estructural y secuencia de aminocidos
de la hormona de crecimiento humana obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas
transgnicas. Dicho estudio consisti en escindir las hormonas con distintas enzimas y reactivos qumicos, purificar los fragmentos resultantes, determinar las correspondientes secuencias de aminocidos, masa molecular y composicin en aminocidos. Con los datos obtenidos establecer si la secuencia de aminocidos de la
protena estudiada era correcta (los anlisis de composicin de aminocidos, de microsecuenciacin y de espectrometra de masa se entregaban al LANAIS-PRO para
su realizacin).
El Dr. Santom designaba los colaboradores necesarios para cada caso.
Comprobaron que la hormona de crecimiento humana proveniente de leche de vacas transgnicas, codificada por Biosidus S.A. como HCL-E 02, tiene idntica secuencia de aminocidos y ubicacin de los puentes disulfuro que la hormona de crecimiento humana natural. (Hans Flodh, Acta Pediatr. Scand. Supp. 1986).
2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre la hormona de crecimiento humana obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgnicas y hormonas de diferente origen. Actividad de las mismas frente a receptores de origen humano y sobre la
proliferacin de clulas Nb2 (2004)
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo de la Dra. Lilia Retegui, Profesora Asociada de Qumica Biolgica, Investigador Independiente del CONICET y la Dra. Leonor
Roguin, Profesora Adjunta, Investigador Asistente del CONICET. Previamente am-

137

bas investigadoras haban establecido con anticuerpos monoclonales la topografa

antignica de la hGH y haban obtenido 20 de esos anticuerpos que cubran la totalidad de la molcula de la hormona.
El objetivo del convenio fue:
Medir la reactividad de la hGH, obtenida de vacas transgnicas, en forma
comparativa con el estndar europeo de la protena recombinante y con el
producto comercial obtenido por Biosidus S.A., frente a varios anticuerpos
monoclonales dirigidos contra diferentes regiones de la superficie molecular.
Medir la reactividad de las mismas frente a receptores de origen humano.
Determinar el efecto de distintas concentraciones de la protena y de los dos
estndares sobre la proliferacin de clulas Nb2, provenientes de un linfoma
de rata que prolifera en presencia de hormonas lactognicas (hGH, lactgeno placentario y prolactinas).
Participaron los siguientes investigadores:
Bioq. Viviana C. Blank, Ayudante 1 D.E.
Bioq. Vernica J. Marino, Ayudante 1 D.E.
Bioq. Patricia A. Mathieu, Ayudante 1 D.E.
Bioq. Mara E. Loudeiro, Ayudante 1 D.E.
Comprobaron que el estndar europeo de la protena recombinante, el obtenido
por Biosidus S.A. y la hGH obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgnicas (HCL-E 02) son esencialmente idnticos en su capacidad de ser reconocidas por
los anticuerpos monoclonales 3C11, 10D6 y AC8 (Mazza y Retegui, Mol Immunol
26:231-239, 1989). Las tres hormonas tuvieron un comportamiento esencialmente
idntico en su capacidad de estimular el crecimiento de las clulas Nb2, por lo cual
concluyeron que la actividad biolgica de las tres hormonas ensayadas es similar.
2.1.3 Determinar la capacidad de la hGH de leche de vacas transgnicas de iniciar la
transduccin de seales (2004).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Daniel Turyn. Profesor Asociado D.E.
Su grupo de trabajo tena experiencia en la transduccin de la seal de la hormona de crecimiento conducente a la transcripcin de los genes responsables de las actividades estimulante del crecimiento y metablica de la hormona. Es decir, en la
unin de la hormona a su receptor y la dimerizacin del mismo, la cual inicia la serie
de fosforilaciones de protenas que resultan en la activacin de enzimas y factores
de transcripcin. La quinasa JAK2, activada luego de la dimerizacin del receptor,
fosforila a las protenas activadoras de la transcripcin y transductoras de seales
(STATs), que son varias. Las STATs penetran en el ncleo y activan a distintos genes.
El objetivo del convenio fue evaluar, en forma comparativa con el estndar europeo
de la protena recombinante y con el obtenido por Biosidus S.A., la capacidad de la
hGH de vacas transgnicas de iniciar la transduccin de seales midiendo la fosforilacin en tirosina del STAT5.

138

Participaron los siguientes investigadores:

Dra. Ana Sotelo, Jefe de trabajos Prcticos. D.E.
Bioq. Johanna Miquet: Ayudante de Primera. D.E.
Las tres hormonas tuvieron un comportamiento esencialmente idntico en su capacidad de estimular la fosforilacin en tirosinas del STAT5, por lo cual concluyeron
que la actividad biolgica de las tres hormonas ensayadas es similar.
2.1.4 Estudio comparativo por dicrosmo circular y fluorescencia entre la hormona
de crecimiento humana obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgnicas y
hormonas de diferentes orgenes. Anlisis de la estabilidad conformacional (2004).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Jos Mara Delfino. Prof. Asoc.
Reg. D.E. Investigador con experiencia en conformacin de protenas, especialmente en la metodologa requerida para detectar cambios conformacionales.
El objetivo del convenio fue comparar la conformacin de la hGH obtenida de leche
de vacas transgnicas con la del estndar europeo de la protena recombinante y la
del obtenido por Biosidus S.A., por espectroscopa CD (UV lejano y UV cercano) y
por fluorescencia intrnseca (espectro de emisin), y evaluar la estabilidad conformacional de las muestras mediante curvas de desnaturalizacin por efecto de urea
o cloruro de guanidinio.
Participaron los siguientes investigadores:
Dr. Juan Pablo F.C. Rossi. Prof. Asoc. Reg. D.E.
Bioq. Lucrecia Mara Curto. Ayud. 1/Becaria.
Bioq. Gabriela Elena Gmez. Ayud. 2/Becaria.
Realizaron medidas espectroscpicas de dicrosmo circular en las zonas UV lejana
y cercana con el propsito de evaluar el contenido de estructura secundaria y la integridad de la estructura terciaria. Asimismo, colectaron los espectros de emisin
de fluorescencia a fin de comparar el entorno de los residuos de triptfano. Por ambas espectroscopias las muestras resultaron indistinguibles unas de otras y compatibles con datos bibliogrficos. Result particularmente significativa la coincidencia entre los espectros de CD en la zona UV cercana, de lo que se deduce un entorno
idntico para los residuos aromticos. Del mismo modo, comprobaron similitud en
el valor de longitud de onda mxima de emisin de fluorescencia: 335 nm, que coincide con el valor publicado. Siguieron el proceso de desnaturalizacin a travs de la
medicin de la intensidad de fluorescencia a 370 nm y de la posicin del centro de
masa espectral.
De acuerdo con los datos informados, las tres muestras resultaron indistinguibles
entre s y coherentes con los datos correspondientes a la hormona de crecimiento humana informados en la literatura.

139

2.1.5 Obtencin de sueros en conejos hiperinmunes hacia sistemas antignicos complejos (2006).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Edgardo Poskus. Investigador
Principal CONICET. Director Interino del Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Profesor Ricardo A. Margni (IDEHU CONICET-UBA).
Objetivo del convenio: realizacin de los procedimientos necesarios para el desarrollo de sueros en conejos hiperinmunes hacia tres sistemas antignicos complejos de
protenas extractivas, con ejecucin de los respectivos anlisis de titulacin.
Participaron los siguientes investigadores:
Dr. Rubn F. Iacono. Profesional Principal, CONICET.
Dra. Silvia Noem Valdez. Docente Auxiliar. Investigador Asistente CONICET
Bioterista Mara Dolores Campos: Tcnica Asistente, CONICET.

140

ANEXO A

ESTRUCTURA DE PROTENAS
Las protenas son biopolmeros que se originan por la combinacin repetida de
aproximadamente 20 aminocidos diferentes. En la cadena polipeptdica formada (alrededor de 190 en las hormonas de crecimiento), los aminocidos estn enlazados por la llamada unin peptdica entre los grupos -amino y -carboxilos
de aminocidos adyacentes. El primer aminocido de la secuencia tiene el grupo
-amino libre y se denomina extremo N-terminal y el ltimo llamado extremo Cterminal tiene el grupo -carboxilo libre. Las protenas suelen tener puentes disulfuro, tambin llamados puentes azufre, constituidos por la unin de los grupos
sulfidrilos de cistenas, no adyacentes en la secuencia pero prximos en el espacio.
Hasta aqu se ha descripto la llamada estructura primaria. Estructura secundaria es
la distribucin regular y peridica que adopta en el espacio esa cadena de aminocidos (hlice-, estructura-) y estructura terciaria al plegamiento de la cadena en
el espacio, para adquirir la forma globular, de estas protenas.
La informacin gentica para la sntesis de las protenas en la mayora de los organismos, est contenida en forma codificada en las molculas de cido desoxirribonucleico (DNA) que se presenta en una estructura de doble cadena. La informacin
contenida se copia bajo la forma de RNA de cadena nica. Los productos de esta
transcripcin son el RNA ribosmico, de transferencia y el mensajero. La traduccin
del RNA mensajero conduce a las protenas.
Se muestran, a continuacin, los dos tipos de abreviaturas que se utilizan para los
20 aminocidos:

Glutamina

Alanina

Arginina

Ac.asprtico

c. Glutmico Asparragina Cistina

Ala

Arg

Asp

Glu

Asn

Cys

Gln

Glicina

Histidina Iso leucina

Leucina

Lisina

Metionina

Fenilalanina

Gly

His

Ile

Leu

Lys

Met

Phe

Prolina

Serina

Treonina

Triptofano

Tirosina

Valina

Pro

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

141

ANEXO B

BREVE DESCRIPCIN DE LOS FUNDAMENTOS Y METODOLOGA EMPLEADA PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE LA HORMONA DE
CRECIMIENTO BOVINA
El objetivo de este anexo es explicar a quienes no son especialistas en el tema, las
razones por los cuales Li necesit en la Universidad de California, 10 aos para determinar la estructura primaria de la hormona de crecimiento humana y el grupo
de la Facultad de Farmacia y Bioqumica siete aos para determinar la de la hormona bovina.
En primer lugar daremos una idea del proceso de determinacin que poda llevarse
a cabo, con la metodologa en esa poca, para determinar la estructura primaria de
una protena. Tomaremos, como ejemplo, una protena terica pequea, representada en el siguiente esquema como una lnea recta en la que aparecen los residuos
de aminocidos como guiones, con excepcin de los bsicos: arginina y lisina, que se
representan con sus smbolos: R y K.
1
2
3
4
5
H2N-------------R---------R---------K---------------R------6
---K----------COOH

Etapas posibles de la determinacin:

1. El primer paso para la determinacin de la estructura primaria de esta protena
terica, poda ser su fraccionamiento por incubacin con una enzima proteoltica,
la tripsina por ejemplo, la cual escinde las uniones peptdicas en las que participa
el grupo carboxilo de las argininas y lisinas. Se obtendran los siguientes fragmentos o pptidos:
1
H2N-------------R
4
---------------R

2
---------R
5
----------K

3
---------K
6
----------COOH

2. Los 6 pptidos resultantes podran separarse mediante columnas de intercambio

inico especialmente preparadas para esas funciones.
3. Comprobada la pureza de los pptidos podra determinarse la secuencia de ami142

nocidos de cada uno de ellos, para lo cual los aminocidos se liberarn uno a uno
a partir del extremo N-terminal, mediante el proceso qumico conocido como degradacin de Edman. Los aminocidos liberados en cada degradacin podran caracterizarse en un analizador automtico de aminocidos o por cromatografa, generalmente en capa delgada. Con estas degradaciones de Edman manuales solo era
posible establecer la secuencia de pocos residuos de aminocidos. Para determinar
la secuencia a partir del extremo C-terminal poda recurrirse a las carboxipeptidasas, enzimas que liberan uno a uno los residuos de aminocidos; eran necesarios distintos tiempos de incubacin para determinar el orden de liberacin y caracterizar
los aminocidos liberados en cada etapa. Frecuentemente, la longitud del pptido,
no permita tener su secuencia total utilizando los procedimientos indicados; en estos casos el pptido deba escindirse con otra enzima, separar los pptidos resultantes y determinar la secuencia de cada uno de ellos.
4. Obtenida la secuencia de aminocidos de los 6 pptidos trpticos de esta protena terica, sera necesario determinar su ubicacin en la molcula proteica, para lo
cual se escinda la protena con enzimas que rompan las uniones peptdicas de residuos distintos a los de la tripsina, por ejemplo, en los puntos sealados en el esquema, dando lugar a los pptidos que designamos con letras.
1
2
3
4
H2N---/ ------/ ----R----/ -----R---------K---/ ------/ ---a
b
c
d
e
5
6
--R------/ ----K-------/ ---COOH
f
g
h
Los nuevos pptidos tambin deban separarse en columnas de resinas, purificarlos
y determinar su secuencia de aminocidos.
Los residuos comunes a los pptidos numerados y los indicados con letras permitiran establecer la ubicacin de los 6 pptidos en la protena.
Este ejemplo terico de determinacin de estructura primaria es muy sencillo; las
protenas reales son de mayor peso molecular y suelen tener puentes disulfuro y regiones hidrofbicas que dan origen a pptidos de difcil purificacin. Generalmente era necesario, adems de emplear distintas enzimas proteolticas, recurrir a escisiones qumicas.
Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona de crecimiento bovina
La bGH tiene una molcula mucho ms compleja que la correspondiente al ejemplo
terico descrito en el Anexo B. Como veremos ms adelante, es una mezcla de cantidades semejantes de dos cadenas polipeptdicas que slo difieren en que a una de
143

ellas le falta la alanina del extremo N-terminal. Para la numeracin de los residuos
y dems descripciones moleculares nos referiremos a la molcula provista de esa
alanina, tambin existente en algunas hormonas de crecimiento de otras especies
La bGH posee:
189 residuos de aminocidos.
21.617 de masa molecular.
2 puentes disulfuro.
13 argininas y 11 lisinas
Con el objetivo de hacer una breve descripcin de la determinacin de la estructura primaria de la bGH, omitiremos la descripcin de los solventes utilizados, su pH y
concentracin, como as otras condiciones experimentales que no sean indispensables para entender este somero resumen. Seguiremos los pasos indicados en el ejemplo terico:
1. Digestin con tripsina. De acuerdo con el nmero de residuos bsicos se obtendran 25 pptidos trpticos, pero en realidad el nmero fue mayor porque cuando
no se rompe el 100% de una unin peptdica de arginina o lisina se originan productos con dos pptidos trpticos unidos. Para encarar el aislamiento, purificacin y
posterior estudio de cada uno de los pptidos, utilizaron en cada digestin, 200 mg
de hormona, previamente oxidada con cido perfrmico, cantidad de bGH que junto con la utilizada en otros procedimientos justific la necesidad de disponer de suficiente produccin de hormona pura.
2. Aislamiento de los pptidos trpticos. Liofilizaron el digerido trptico y lo extrajeron con una solucin de acetato de piridina. Sembraron la fraccin soluble en una
columna de resina sulfnica Aminex AG 50W-X2 (0,9cm X 1,80cm) termostatizada
a 40 C, y convenientemente preparada. A continuacin, hicieron pasar a travs de
la columna 1.600 ml de un gradiente de solventes, con un flujo de 11 ml/hora. Recogieron fracciones numeradas, de 1,60 ml cada una, utilizando un colector automtico. Los distintos pptidos trpticos tuvieron distintos grados de retencin en la
columna, por lo cual fueron eluyendo a distintos tiempos, permitiendo as, el aislamiento de cada uno de ellos. Detectaron la presencia del material peptdico por
reacciones qumicas, en alcuotas de las fracciones. Unieron las fracciones que aparentemente correspondan a cada pptido y examinaron su complejidad por electroforesis de alto voltaje en papel Whatman 3MM, a pH 6.45 en un sentido y a pH 2.00
en el normal. Las fracciones que por este procedimiento presentaron un solo componente, las purificaron por electroforesis de alto voltaje en las condiciones mencionadas. La siembra en el papel la hicieron en lnea y despus de la electroforesis revelaron una tira del papel para detectar la ubicacin del material y proceder a su elucin
con solventes y posterior anlisis de aminocidos en el analizador automtico. Si el
resultado indicaba que el pptido no estaba puro, lo sometan a una cromatografa
en papel durante 14 horas. Por este procedimiento aislaron y purificaron a homogeneidad, 22 pptidos solubles del digerido trptico de la bGH.

144

3. Determinacin de la secuencia de aminocidos de los pptidos trpticos solubles.

Tal como se describi al tomar como ejemplo una protena terica, liberaron uno a
uno los aminocidos del extremo N-terminal como feniltiohidantonas, mediante
degradaciones de Edman y las caracterizaron por cromatografa en capa delgada.
Para determinar la secuencia a partir del extremo C-terminal, utilizaron carboxipeptidasas. As lograron determinar la secuencia total o parcial de los pptidos trpticos mencionados.
4. Digestin con otras enzimas de la bGH nativa o qumicamente modificada. Despus
de determinar la secuencia total o parcial de los pptidos trpticos solubles, deban:
Aislar y determinar la secuencia del resto de los pptidos trpticos.
Digerir la hormona con otras enzimas proteolticas, o con mtodos qumicos,
y aislar y determinar la secuencia de aminocidos de los pptidos resultantes.
Determinar la ubicacin de los puentes disulfuro.
Con la secuencia parcial o total de todos los pptidos obtenidos establecer
la estructura primaria de la bGH mediante el solapado de los residuos comunes de esos pptidos.
Para cumplir con ese programa de trabajo, escogieron la quimotripsina como segunda enzima proteoltica a utilizar. Aplicaron el procedimiento utilizado para la tripsina, adaptado a las caractersticas de la nueva enzima. Lograron determinar la secuencia total o parcial de 26 pptidos quimotrpticos solubles.
Toda la informacin obtenida de los pptidos trpticos y quimotrpticos solubles les
permiti determinar la secuencia de 139 aminocidos. Para determinar la secuencia
de los 50 restantes siguieron varios caminos:
En primer lugar digirieron el material insoluble de los digeridos trpticos y quimotrpticos con Pepsina, enzima proteoltica que escinde un considerable nmero de
uniones peptdicas. Los pptidos resultantes se trataron en igual forma que los digeridos solubles de tripsina y quimotripsina. Determinaron as, la secuencia total o
parcial de 19 pptidos, la mitad de los aminocidos faltantes.
El mayor problema a resolver lo constituy la insolubilidad de varios pptidos trpticos que por su hidrofobicidad se agregaban fcilmente. Para solucionarlo repitieron
la digestin con tripsina utilizando bGH qumicamente modificada para evitar la insolubilidad de los pptidos. Se recurri alternativamente a digerir hormona reducida, carbamidometilada y maleinizada. El estudio de los pptidos resultantes y el empleo de tcnicas especiales para determinar los puentes disulfuro y la ubicacin del
nico residuo de triptfano y de las 4 metioninas, permitieron la determinacin de
la estructura primaria completa de la bGH.
Magnitud del trabajo. Esta resumida descripcin de los procedimientos utilizados
para determinar la secuencia de aminocidos de la bGH, explica porque el grupo de
Buenos Aires necesit 7 aos para completarla y porque C.H. Li demor 10 aos con
la humana.
Dijimos que la bGH nativa o qumicamente modificada se someti a varias digestio-

145

nes enzimticas y qumicas. Los pptidos resultantes se sometieron a un complejo

procedimiento para su aislamiento y purificacin, incluyendo resinas de intercambio, electroforesis de alto voltaje y cromatografa en papel. Las numerosas fracciones provenientes de las resinas contenan pptidos o mezcla de pptidos muy diluidos, por lo cual se requera su concentracin en evaporadores rotatorio antes de
sembrarlos en los papeles Whatman 3 MM y someterlos a electroforesis de alto voltaje. Las nuevas fracciones obtenidas tenan que eluirse del papel, concentrarse y determinar la composicin en aminocidos en una alcuota para averiguar si se trataba
de un pptido puro, en caso contrario lo sometan a otra electroforesis de altovoltaje
a distinto pH, cada una de las nuevas fracciones obtenidas deban someterse a anlisis automtico de aminocidos para establecer si era un pptido puro, un componente desechable o una mezcla que justificaba ser eluda, concentrarse y someterse a un
fraccionamiento por cromatografa en papel.
De los centenares de fracciones estudiadas seleccionaron 124 pptidos para determinar sus secuencias en aminocidos.
"Primary structure of bovine growth hormone". J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini, C. Pea, M.J. Biscoglio, S.T. Daurat, E. Poskus, C.E.M. Wolfenstein. Eur. J. Biochem., 37: 164 (1973).
La metodologa utilizada para determinar la estructura primaria de las protenas,
experiment desde entonces una intensa evolucin, como puede apreciarse en el
Anexo C.

146

ANEXO C

EVOLUCIN DE LAS METODOLOGAS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE PROTENAS

Mencionamos que en 1967, Edman haba presentado el primer secuenciador automtico de aminocidos, capaz de determinar la secuencia N-terminal de 15 aminocidos en 24 horas con 250 nanomoles de pptidos o protenas, cantidad muy pequea
para la metodologa de la poca. Ese aparato redujo considerablemente el tiempo y
la cantidad de protena necesaria para determinar la estructura primaria. Hizo posible determinar la secuencia de un nmero elevado de residuos del extremo N-terminal y secuenciar pptidos de mayor tamao molecular, reduciendo la necesidad de
fragmentar pptidos y protenas con enzimas productoras de fragmentos pequeos.
En la misma dcada tuvieron lugar una serie de descubrimientos en un campo muy
distinto al de la secuenciacin de protenas, pero que permitieron deducir numerosas estructuras primarias a partir del DNA o del RNA mensajeros. En 1960 Nirenberg, Khorana y Ochoa describieron el cdigo gentico; ese mismo ao Sanger cre
un mtodo rpido para secuenciar RNA y, en 1975, el primer mtodo para secuenciar DNA; en 1977 Maxan y Gilbert presentaron un mtodo para secuenciar DNA
por degradacin qumica y Sanger un nuevo mtodo para secuenciar DNA, que lo
hizo acreedor de su segundo premio Nobel. Adems, entre 1976 y 1980 aparecieron mtodos rpidos para sintetizar oligonucletidos. Estos descubrimientos hicieron ms rpido deducir la secuencia de aminocidos de una protena determinando
la del DNA, que secuenciando la protena directamente (semanas en lugar de meses o aos).
Sin embargo, en sus comienzos, este procedimiento enfrent el problema de requerir el aislamiento del DNA gentico o el RNA mensajero, generalmente presentes en
mezclas muy complejas. La solucin del problema surgi en 1980 cuando Fiddes y
Goodman a partir de la secuencia de 5 aminocidos de la subunidad b de la gonadotropina corinica humana obtuvieron su DNA complementario. Por consiguiente, a
partir de la secuencia de un fragmento de la protena fue posible sintetizar oligonucletidos utilizables como:
una sonda especifica para detectar el RNA mensajero de la protena.
un iniciador (primer) para sintetizar el DNA complementario.
una sonda para detectar el gen de una protena a partir de una genoteca.
En 1981, Hankapiller y col. crearon un secuenciador de aminocidos en fase gaseosa, capaz de determinar por degradaciones de Edman, la secuencia de numerosos
residuos de aminocidos con solo picomoles de protena. Es decir, con una cantidad
que puede obtenerse por elucin de una bandita de un gel de poliacrilamida. Este
aparato provoc un regreso a la secuenciacin qumica. El costo elevado de adquisi147

cin y mantenimiento del aparato y la necesidad de personal tcnico especializado,

hizo conveniente que este secuenciador estuviera a cargo de un grupo de investigacin en qumica de protenas. Para solucionar este problema numerosas universidades y centros de investigacin crearon laboratorios especializados para ofrecer servicios en una o ms de las siguientes determinaciones:
Composicin en aminocidos.
Secuenciacin de pptidos y protenas.
Sntesis de pptidos.
Sntesis de polinucletidos.
Secuenciacin de DNA.
Espectrometria de masa.
En nuestro pas, el CONICET, con un prstamo del BID, cre en 1990 el Laboratorio Nacional de Investigacin y Servicios en protenas (LANAIS-PRO), cuyo organizador y Coordinador fue Santom, que estuvo a su cargo hasta su designacin como
Coordinador Honorario en 2003. Como todo LANAIS deba brindar sus servicios a
todos los investigadores y a la industria. Entre otros equipos fue provisto de un secuenciador derivado del creado por Hankapiller. El LANAIS-PRO contina prestando sus servicios a numerosos investigadores y a la industria biotecnolgica.
La prestacin de servicios por el LANAIS-PRO, por ejemplo, permitieron a Santom
y sus colaboradores (Santiago Di Pietro, Christian Schleicher, Osvaldo Crdoba, Esteban DellAnglica, Mario Ermcora y Brian Cavagnari) aislar y determinar la estructura primaria total o casi total de: 23 protenas transportadoras de cidos grasos, 4 protenas ligadoras de calcio y 1 puente disulfuro isomerasa. Adems de otras
3 protenas en colaboracin con otros grupos.
Con respecto a las hormonas de crecimiento obtenidas por la industria biotecnolgica, Santom determin, por convenio con Biosidus S.A., la estructura primaria completa de la hormona de crecimiento humana obtenida por la tcnica de DNA recombinante y la de dicha hormona obtenida en leche de vacas transgnicas.
En los ltimos aos los mtodos basados en las degradaciones de Edman estn siendo reemplazados por los que utilizan espectrometra de masa.

148

ANEXO D

RESUMEN DE LOS CONOCIMIENTOS ESTRUCTURALES ACTUALES SOBRE

HORMONAS DE CRECIMIENTO
La molcula de las hormonas de crecimiento contiene 4 hlices- de 21 a 30 residuos
cada una. Forman un manojo con las dos primeras hlices paralelas entre s y antiparalelas con las otras dos. Para que esta conformacin sea posible las cadenas de amino cidos que unen las cadenas laterales son largas, mientras que la que une las hlices antiparalelas es corta.
La hormona de crecimiento se une a las dos molculas de receptor en forma secuencial. A travs del sitio 1 de la hormona (ver grfico) se une a la primera molcula de
receptor y por el sitio 2 a la segunda.

Sitio 1
Sitio 2

Diagrama de la estructura de la hGH sealando los sitios I y II de unin al receptor.

N: Residuo N-terminal; C: Residuo C-terminal; I, II, III y IV: Hlices .
Estn indicados los residuos iniciales y terminales de cada hlice
Residuos de las hormonas de crecimiento involucrados en la unin a los receptores
Cunningham y Wells, en 1989, utilizaron la tcnica conocida como alanine-scanning mutagenesis para identificar los residuos de aminocidos de la hGH recombinante que se unen al receptor. Mutaron por alanina cada residuo contenido en los
tres segmentos discontinuos de la hGH considerados implicados en el reconocimiento del receptor: residuos 2 a 19, 54 a 74 y 167 a 191. El trabajo revel la importancia
de doce residuos de cadena lateral larga. Muchos de esos residuos estn cambiados
en las prolactinas y lactgenos placentarios, hormonas homlogas que no reconocen
el receptor de la hGH. Los residuos mencionados pertenecen al sitio 1, el cual se une
a la primera molcula del receptor, pero la unin de la hormona a la segunda molcula del receptor se hace a travs del sitio 2. El sitio 1 involucra la regin N-terminal de la hlice 1, los residuos 54-68 y el extremo carboxilo terminal de la hlice 4.
El sitio 2, adyacente al primero comprende la regin N-terminal y central de la hlice 3 (Wells y de Vos, 1993)
149

Interaccin de cadenas laterales de aminocidos

El core de las 4 hlices de la hGH est constituido por los residuos L6, F10,A13,
A17, L20, A24, T27 y F31 de la hlice 1, N72, L76, S79, I83, W86 y V90 de la hlice 2,
V110, L114, L117, I121, L124 y L128 de la hlice 3, y N159, L163, F166, M170, V173,
L177, V180 y S184 de la hlice 4 (Ultsch et al, 1994). Sealados en negrita. X representa los residuos faltantes.
Hlice I
.
6
10 13 17 20 24 27 30
hGH:XFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQT
bGH:A--AMS--G--A--V---QH-----A--FK---RT---EG-R--IX--T-V
oGH:A--AMS--G--A--V---QH-----A--FK---RT---EG-R--IX--T-V
eGh:X--AMP--S--A--V---QH-----A---K---R----EG-R--IX--A-A
Hlice II
.
72
76 79 83 86 90
hGH:SLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANS
bGH:AF----T--A-TGKN-A-E--D---------------Q-XG---X--T-oGH:AF----T--A-TGKN-A-E--D---------------Q-XG---X--T-eGH:AF----T-PA-TGKN-A--R-DME---F---------G---L--X--T-.
Hlice III
.
110 114 117 121 124 128
hGH:LVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNS
bGH:--F-T--RX--EK--------LA--RE----T-A---L----D-----M
oGH:--F-T--RX--EK--------LA--RE----V--A---L----D-----M
eGH:--F-T--RX--EK-R-------A--RE------RA---L----D-----L
.

Hlice IV
.
159 163 166 170 173 177180 184
hGH:HNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRXSVEGSCGF
bGH:RS-----------S-----LH-T--Y--VMK-RRFG-A--AoGH:RS-----------S-----LH-T--Y--VMK-RRFG-A--AeGH:RS-----------S--KK-LH-A--Y--VMK-RRF--SS-A-

150

ANEXO E

RECEPTORES HORMONALES
Las hormonas del sistema endocrino se pueden clasificar de acuerdo a su solubilidad
en dos grandes grupos: las solubles en lpidos y las que no lo son. Para ejercer su accin, las hormonas solubles en lpidos se desplazan libremente a travs de la membrana celular externa, mientras que las hormonas insolubles no la atraviesan, sino
que necesitan de una estructura compleja, constituida mayoritariamente por protenas o glicoprotenas ubicadas en la membrana plasmtica, denominada receptor
endocrino.
Para iniciar su accin las hormonas interaccionan especficamente con el receptor,
desencadenando en el interior de la clula una cascada de reacciones (activacin de
enzimas o factores, modificacin en la permeabilidad de la membrana, transcripcin, etc) que definen su respuesta biolgica.
Los receptores transmembrana son aquellos que atraviesan todo el espesor de la
membrana plasmtica de la clula, conservando un extremo libre en la cara externa de la membrana plasmtica (dominio extracelular) y otro ubicado en la cara interna (dominio intracelular). Existen distintos tipos de receptores transmembrana
a saber: receptores asociados a protenas G, receptores con actividad tirosina quinasa intrnseca, receptores que no presentan actividad intrnseca y activan quinasas. Cuando el dominio extracelular de este ltimo tipo de receptores interacciona
con citoquinas, interferones, eritropoyetina, hormona de crecimiento o prolactina,
el receptor sufre un cambio conformacional que afecta al dominio intracelular, lo
que provoca la activacin de miembros de la familia de las quinasas denominadas
Janus quinasas JAK (por su sigla en ingls Janus Activation Kinases), las que a su vez
activan factores de transcripcin citoplasmticos denominados STATs (por su sigla
en ingls signal transducers and activation of transcription) responsables en el ncleo de activar la transcripcin de genes especficos. En otros casos estos receptores activan la cascada de las MAP quinasas (por su sigla en ingls mitogen-activated proten).

151

REGISTRO FOTOGRFICO

153

154

Una de las vaquitas clonadas en el

programa de "tambo farmacutico" es
alimentada por su cuidador.

En la pgina opuesta, una nota

aparecida en La Prensa describe los esfuerzos para sintetizar la hormona en
la Facultad de Farmacia y Bioqumica.
155

156

Los doctores Jos Santom, Juan

Dellacha y Alejandro Paladini,
reunidos varios aos despus de los
sucesos que cuenta este libro.

En la pgina opuesta, foto superior.

El equipo que trabaj en la produccin biotecnolgica de la hormona de
crecimiento. De izquierda a derecha:
Ada Prync, Mara Teresa Pellerano,
Juan Zimmermann, Miguel Carcagno,
Csar Carbonetto, Susana Dabsys,
Miriam Denegri, Humberto De Pasquale, y Marcelo Criscuolo.

En la pgina opuesta, foto inferior.

Protagonistas del desarrollo de la
hormona de crecimiento aplicando
biotecnologa: de izquierda a derecha,
doctor Daniel Salamone, ingeniero
Carlos Werning, doctor Claudio Santos y doctor Carlos Melo.

157

158