QUIMICA HOY CHEMISTRY SCIENCES Ce eeu Cees Empleo de modelos de membrana lipidica para el estudio de la funcién de a proteina SP-C del surfactante pulmonar Azucena Gonzilez-Horta"*, Maria Teresa Davalos Romo" y Jestis Pérez- Universidad Alimama de Nuevo Leda, UANI, FCB, Av. Universidad ve Cuda Universitaria San Nicos de los Garca NL Universidad Auénoma de Zacatecas, Campus Jala, Jardin Juire: 147 Centro Itstéico, Zacatecas “Universidad Complutense de Madrid Dept, Bioguimicay Biologia Molecular, Faculad de Ciencias Bioligicat “Email acucena gonalehy@uanledums Recibido 5 de noviembre de 2012, Aceptado 3 de diciembre de 2012 Resumen EI objetivo que se plasteé para este trabajo fue entender a nivel molecular Ia capacidad que tiene Ia proteina SP-C ‘surfactant pulmonar para modular las propiedades biofiscas del surfactant, Se sintetizaron dos péptidas correspondientes 4a secueneia del segmento N-terminal de la proteina, uno eon las cisteinas libres y otro con las cisteinas palmitoiladas, para caracterizar el modo y la extensin de la interacen de Tos péptidos con monocapas fosfolipidieas modelo con especial Enfasis, en el anliss del efecta que la palmitoilacién de este segmento tiene en la estructura y dindmica interfacial Palabras clave: suriactante pulmonar, propisdades tensioactivas, SP-C A. Introduccién Se han identifcado 3 modelos de membrana bioldgica para evaluar la interaccién entre ésta y compuestos bioactives. El primero de ellos, las rmonocapas de tipo Langmuir, que son un excelente sistema modelo para estidiar Ia biofsica de rmembranas en la interfase airelquido [1-4], EL segndo, los liposomas, que son sistemas de auto- nsamblaje compuestos normalmente de moléculas jas que permiten caracterizar la ‘con péptidos y/o. proteinas (5-7) y finalmente, las bicapas lipidicas en soporte sélido (ipo Langmuir-Blodget) que son un sistema que permite reproducir In termodinimica de las rmembranas celulares y la coexistencia de fases (8, 9) Encl presente trabajo se emplearon las monocapas de tipo Langmuir y las de Langmuir-Blodgett para tvaluar las propiedades biofisicas dela proteina SP- Cen ef surfactante pulmonar, ana compleja mezela lipoproteca que forma una fina capa tensioativa en la inferfase aire-iquido previniendo el colapso alveolar {10-12}. El. principal componente del surfactante es la dipalmitoilfsfatiileolina (DPPC) «que representa cetea de un 40 % del peso total (12) siendo el responsable de las propiedades tensioactivas de este material [13], El surfactant cuenta ademas con cuatro proteinas especificas: SP- ‘Avy SP-D proteina hidroflicas implicadas en el sistema de defensainnata del epitelio pulmonar (14, 15] y SP-B y SP-C proteinas hidrofSbicas que interaccionanfuertemente con los lipidos- y promucven Ia formaciény el adecuado ‘omportamiento dindmico de la pelicula tensioactiva en la interfaseaire-tiquido [11, 15] La proteina SP-C del surfactante, es una proteina biofisicamente activa de 35 aminodcidos que es sintetizada exclusivamente en los neumocitos tipo II Estructuralmente contiene una c-hélice ‘ransmembrana y un segmento N-terminal catidnico ‘con dos cisteinas palmitoiladas. La mayor parte de las funciones atribuidas a la SP-C en el surfactante estin relacionadas con cl establecimiento de interacciones bicaps-monocapa que facilitan la transferencia de material tensioactivo durante Ia inimica respiratoria, ya sea promoviendo la adsorcién interfacial de fosfolipidos y estabilizando la monocapa durante los ciclos dinémicos de ‘compresién-expansién © bien participando en la formacién del reservorio superficial de material tensioactivo a partir del cual se restituyen_ las ‘moléculas de surfactante de la pelicula tensioactiva durante los sucesivos ciclos respiratorios [13-1 Con el fin de fue entender a nivel molecular la ‘capacidad que tiene la protcina SP-C del surfactante pulmonar para modular las propiedades biofisicas del surfactante. Se sintetizaron dos __péptidos ‘correspondientes Ia secuencia del segmento N terminal de la proteina, uno con las cisteinas libres (LRIPCCPVNLKRL) y otro con las cisteinas palmitoiladas (LRIPCruinCrsigPVNLKRL), para ccaracterizar el modo y la extensién de la interaccién 4c los péptidos con monocapas fosfolipidicas modelo ‘con especial énfasis, en el andlisis del efecto que la palmitoilacién de este segmento tiene en la estructura y dindmica interfacial. 2, Parte Experimental Vol. 2, N2.1. Compresién dindmica de monocapas Para estos experimentos se uilizé una balanza de superfcies NIMA de 250 mL de capacidad provista con una cinta mévil que permite modificar cl érea que encierra. Se prepararon monocapas de cada uno de los péptidos y se someticron a compresién dinimiea registrando los cambios en la presién superficial. Las muestras peptidicas 6 lipopeptidicas se prepararon mezclando las cantidades adecuadas en CIMctOH (3:1 vi). Para formar las monocapas, se depositaron sobre la subfase (tampén Tris $ mM, NaCl 150 mM pH 7) entre 20 y 30 pL de muestra djando equilibrar Ia monocapa durante 10 min para permitir la evaporacién del disolvente orgénico y la reestructuracién de los. lipidos en. Ia intrfase Posteriormente la monocapa se comprimié desde un frca maxima de 212 cm? hasta un rca de 40 em a uma velocidad de 65 em'/min registrando los cambios en la presién superficial 2.3. Monocapas y microscopia de epif_uorescencia Se prepararon monocapas de DPPC/DPPG (7:3 pip) en ausencia o presencia de 2, 5 y 10 % en peso, de cada uno de los péptidos. Para la realizacién de estos. experimentos se incluyé en las_mucstras lipidicas 0 lipopeptidicas un 1% de la sonds lipfdica luorescente NBD-PC. Se prepararon muestras de DPPC/DPPG (7:3 pip) a una concentracién de 1 mgimL en CIVMetOH (3:1 viv) en ausencia 0 presencia de un 10% en peso de péptido y se formé Ta monocapa como se describié anteriormente, Una vez evaporado cl disolvente se comprimié la ‘monocapa hasta una presién inicial entre 3 y S mN/m, dojindola estabilizar por 15 min, Posteriormente se comprimié la superficie de manera continua a una velocidad de 25 em*/min mientras se clevabasimultincamente un _portaobjetos previamente sumergido en la subfase a una velocidad de 5 mm/min, permitiendo asi la transferencia de la -monocapa al soporte de vidrio, éstos se guardaron en placas de Petri cubiertas con papel aluminio hasta ser analizadas con el microscopio de fluorescencia, Para a cuantificacién de las regiones expandidas y ccondensadas presentes en cada muestra, se tomaron y digitalizaron 5 imégenes para cada _presié. superficial muestreadas a Io largo del soporte de vidrio cada 2 mm. Las imégenes se analizaron utilizando los programas SigmaScan Pro y. AdobePhotoShop. 3. Resultados 3.1. Empleo de monocapas de tipo Langmuir El efecto de los péptidos en el comportamiento interfacial de las peliculas lipopeptidicas se analizé ‘mediante isotermas de compresién las cuales, en el aso de los péptides puros, proporcionan formacién sobre su. estructura y disposicién erfacial. Dos datos importantes pueden obtenerse de estas grificas, En primer lugar, el drea por residuo a la cual la compresién comienza a inducit un incremento en la presién superficial, da idea de lo que ocupa cada molécula de péptide en la disposicién mas extendida. Por otra parte la méxima presién a la que puede comprimirse la pelicula peptidica, india el grado de estabilidad del péptido fen la conformacién mis comprimida. La figura 1 ‘muestra el comportamiento interfacial de monacapas exclusivamente peptidicas sujetas a compresion, Ambos péptidos, con cisteinas libres o palmitoiladas, tienen la capacidad de formar monocapas estables sobre la superficie acuosa como consecuencia de su caricter anfipitico, Puede observarse como en ausencia de la acilacién, la secuencia N-terminal de ‘SP-C presenta una disposicién interfacial mucho mas extendida (21-22 A’/residuo vs 6-7 A"iresiduo). La monocapa de péptide con cisteinas libres colapsa aproximadamente a 24 mN/m, mientras que el péptido palmitoilado puede mantener monocapas a presiones superficiales mayores, en tomo a 46 mN/m, La isoterma del péptido palmitoilado presenta un “plateau” a alrededor de 30mN/m antes de aleanzar las mayores presiones superficiales lo que indica la expulsién de la interfase de los Segmentos peptidicos. La transicién interfacial del péptido palmitoilado condueiria a una pelicula en la que, tras la expulsién de la mayor parte de péptido, permanecerian orientadas hacia el aite las cadenas de palmitico, permitiendo todavia aleanzar presiones superficiales de casi 50 mNim. Este resultado confirma el papel que tiene la palmitoilacién para estabilizar la asociacién de la secuencia N-terminal de la SP-C en la interfase, en estados de elevada ccompresion. E : Figura 1, Isotermas de compresin de monocapas de cada uno de los péptidos formadss en ausencia de lipid. €3.2. Empleo de monocapas de tipo Langmt Blodgett Para analizar Ios efectos que la interaccin lipido- éptido tine sobre el empaquctamientoy organizacién de las moléculas.lipidicas ena inerfase, se transfireron monocapas de DPPC/DPPG 7:3 (pip) en ausencia © presencia de cada uno de los péptidos a un soporte siido y se analizaron por microscopia de epifluoreseencia, En ln figura 2 puede observarse como ambos péptidos producen un aumento en el tama de os dominios y reducen su nimero debido a que el establesimiento de interacciones clectrostitcas permite una mayor condensacin favoreciendo la nucleacién de regiones condensadas El péptido palmitoilado muestra un efecto bifisico, por debajo de ~18 mN/m el péptide no perturba el empaquetamiento lipidico de la ‘monocapa como se deduce del tamaito y nimero de los dominios observades en las imégenes de epifluorescencia, Sin embargo a presiones mayores, el péptido produce una dristca disminucin del rea total ocupada por fase condensada lo que ocure posiblemente como consecuencia de la insercién de los palmiticos en las regiones mis condensadas de la ‘monocapa una vez que la regién peptidica ha sido expulsada de la interfase, Estos resultados sugicren que durante la compresién, los segmentos peptdicos son expulsados de la interfise mientras que el péptido palmitolado mantiene la interaccién de los palmiicos en las peliculas interfaciales altamente ccomprimidas. DPPCIDPPS. No-palmitoiado Palmitollde Figura 2, Imigenes de epifluorescencia de monocapas de DPPC/DPPG 7:3 (p/p) comprimidas hasta ls presiones indicadss (mN/m) en ausencia o presencia de 10% en peso de las soeuencias peptidicas empleadas, Cada imagen ‘bre una distancia de 350m, 4. Discusion Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteina SP-C del surfactante pulmonar es capaz por si sola de promover la insercién de moléculas fosfolipidicas desde los complejos lipoproteicos en que el surfactante es secretado a Ia interfase aire liguido [16-18]. El segmento transmembranal de la ‘SP-C es fundamental para la funcién de la proteina, sin embargo algunas caracteristicas funcionales esenciales de la SP-C pueden residir en las {nteracciones lipido-proteina en las que participa cl segmento N-terminal, especialmente si se considera que este sezmento puede ser Ia tinica parte de la estructura que la SP-C proyecta hacia el exterior de las membranas y monocapas de surfactante [19]. El segmento N-terminal de la SP-C inicia posiblemente su contacto con Ia interfase aire-liquido durante cl proceso de adsorcién de los complejos lipoprotcicos dol surfactante a Ia interfese, Este proceso de adsorcién debe estar necesariamente relacionado con la perturbacin que el segmento N-terminal es capaz de producir en el empaquetamiento lipidico de bicapas y monocapas [20, 21]. La mayor parte de los ‘modelos planteados sobre Ia estructura y disposicin de la SP-C en las bicapas y monocapas de surfictante suponen que el segmento N-terminal de la proteina se asocia con las membranas a través de la palmitoilacién de sus cisteinas [22]. Sin embargo, al realizar las cinsticas de adsorcién interfacial de los péptidos (datos no mostrados) pudo observarse que la inclusion del péptido palmitoilado en membranas fosfolipidicas mo resulta muy eficiente para promover la transferencia de especies fosfolipidicas tensioactivas desde las bicapas @ Ia interfase. La diferencia en actividad debe necesariamente estar relacionada con la diferencia que introduce la palmitoilacién en Ia extensién y modo de interaceién del segmento N-terminal con las superficies lipidicas. La adsorcién interfacial de fosfolipidos desde las bicapas probablemente requiere la perturbacién simultinea del _empaquetamiento lipidico en bicapas y monocapa. Esta perturbacién podria ser mis accesible al péptido desacilado, con ‘na conformacién aparentemente més extendida, que al péptido palmitoilado. La eficiente actividad interfacial de la SP-C nativa, a pesar de poscer su segmento N-terminal estequiométricamente palmitoilado, podria depender de la simulténca presencia del scgmento helicoidal, que ‘mantenigndose integrado en la memirana permite cl acercamiento y perturbacién por parte del segmento N-terminal cn una monocapa adyacente. Sin ‘embargo, una vez en la pelicula interfacial, cl péptido palmitoilado resulta asociarse con. la interfase de una manera mas estable que el péptidono palmitoilade, como habfa sido propuesto, mediante estudios de IRRAS [23], manteniéndose a presiones mucho mayores que las necesarias para ‘expulsar el péptide desacilado, 5. Conclusion Los experimentos aqui presentados demuestran ‘que el empleo de modelos de membrana es itil para cevaluar las propiedades biofisicas de una proteina de interés, En este caso en particular, los resultados sugieren que durante los ciclos de compresién del ‘material tensioactivo, primero son expulsados los segmentos peptidicos de Ta proteina SP-C para posteriormente permitir su integracién a través de la intercalacién de los palmiticos en las regiones hidrofobicasaltamente empaquetadas de los fostolipidos comprimidos de tas peliculas, interfaciales, Esta asociacion podria entonces ‘antenerse hasta las mayotes presiones superficiales yy ser consistente con un papel de la palmitoilacién en Ja eapacidad de Ia SP-C para sostener Ia asociacién de los complejos ipoproteicos del surfactante con las fases altamente comprimidas que se forman al final de la espiracién, facilitando su posterior reextensién, tras cada ciclo respiratorio. 6. Referencias 1. Kaganer VM, Malvald H, Duta P. Rey Aad Pips, 1999, 71,779.85, 2. Brezsinski G. Mobwald H, Adv Colloid Ineface Se. 2008, 100-102, 563-88 3. Malis A. LijerothP, Kontu K. Anal Sei. 2001, 17, 345- % 4. Gambinossi B, Mecheri B., Nocentnt M., Pugeell M,, CCaminas G. Biphys Chem 2004, 110, 101-13. 5. Pask LW. Colloid Su B Bionterfaces 010, 78,2903. 6. Pany MJ, Jala A, Kinnunen PK, Alakoskla IM, 2007, 17, 7-103 7. Jorgensen K., Hoymop P., Pedersen TB, Mourisen 06. 2001, 6,255.85, 8, Tamm LK, MeConnell HM Biophys J 1988, 47, 108-13, 9. Kieslg V., Domanska MK., Murray D., Wan Tarim LK, Wiley Freylopadia of Chemical Biology. USA’ John Wiley sand Sons, 2008. Supported Lipid Bilyers: Development and ‘Applications in Chemical Biology. 10, Danii, D.B. and S. Orgeig, News Physiol Sci 2003, 18: 11 m5 11, Goer, J. Biochim Biophys Acta, 1998. 1408 79-89, 12, Veldhuizen, JA. and ILP Haagsman, Biochim Biophys Acta 2000, 1467, 255.270 13, Van Golde, LIM.G. and Casals, C. 1997, Philadelphia WI Crusal RG, Wide! ER, Bares PJ Lippiacot-Raven Publishers, 14, Lawson, RR and Red, KB. Immuno! Rev. 2000, 173, 66-78, 1S, Possmayer F, Nag K. Rodvguez K., Qanbar 8, Shirch S| Comp Biochem Physiol 2001. 129: 208-220. 16, Peril J, Nag Ke, TanevaS., Keough KMW, Biophys J 1992, 63, 197.204, 117, Lakovie D, Plena L, Tabemer FI; Salgado 1, Calvete 1, PeterGil J, Mingano L. Biochim Biophys Acta 2006, 1758 500518 2a, BR Oostaken-Disterhuis MA, van Fk M, van Buel BL, van Golde LM, Hsagsmana HP. Biochem J 191,273, 115-119, Plasencia , Cz A, Casals C, Perez J. Biochem J 2001, 359, 651-659, Plasencia | Keough KM.W, Peez-Gil J. Biochim Biophys Aca 2005, 1718, 118128, Plasencia 1, Rivas, Keough KML, Marsh D, Peer Biochin.J 2004, 377, 188-195, Johansson, J Biochim Biophys Acta 1998, 1408, 16-172. Bi, X, Fash CR, PereGil J, Plasocis L, Andou D., Olivera E., Mendelsohn R.” Biochemistry 2002, 41, 8385. 8595,