Ejercicio 9: Espectrofotometria Objetivos: Utilizar adecuadamente soluciones madre para preparar diluciones. Describir el funcionamiento general de un espectrofotémetro. Preparar una grafica que represente una curva de calibracién. Determinar la concentracién de un desconocido mediante espectrofotometria. er Introduccién La técnica de espectrofotometria nos permite determinar la cantidad de material ‘© concentracién de un preparado biolégico. Esta técnica se basa en el hecho de que las sustancias absorben luz. Esta luz, que proviene de una fuente de luz ubicada dentro del instrumento llamado espectrofotémetro, incluye la luz visible (la que podemos detectar con nuestra vista) y dos tipos de luz invisible (la luz ultravioleta y la luz infrarroja). Estos tipos de luz difieren entre s{ en cuanto a su largo de onda. La luz ultravioleta (UV) tiene largos de onda de 230 a 380 rnm, la luz visible tiene largos de onda de 380 a 750 nm y la luz infrarroja (TR) tiene largos de onda mayores de 750 nm. La luz que incide sobre una sustancia puede ser absorbida o transmitida por la sustancia. Mientras més luz es absorbida por la sustancia, menos luz es transmitida. Las sustancias tienen capacidad de absorber (0 transmitir) luz a diferentes largos de onda. Existen sustancias que absorben luz de un largo de onda correspondiente a la luz ultravioleta y otras que absorben luz de un largo de onda correspondiente a la luz visible. Por ejemplo, una solucién de la base nitrogenada adenina absorbe luz a 260 nm, mientras que una solucién del aminodcido triptéfano absorbe luz a 280 nm. Puedes referirte a un texto de biologia para informacién adicional sobre sustancias biolégicas que absorben a otros largos de onda, como por ejemplo, los pigmentos fotosintéticos. La capacidad de absorber luz a determinados largos de onda también se puede utilizar para determinar la concentracién de diversas sustancias en solucién. En general, a mayor concentracién de una sustancia, mayor serd la cantidad de luz absorbida (absorbancia). Por ejemplo, cuando tratamos ciertas soluciones de proteinas con sales de cobre, se forma un complejo de color azul-pirpura, que absorbe a 550 nm. En este tipo de prueba, bajo condiciones especificas y en un rango de concentracién particular, la intensidad del color formado es proporcional a la cantidad de proteinas. Dependiendo de la sustancia bajo estudio, podemos llevar a cabo pruebas directas o indirectas en las cuales, mediante la detecci6n de la absorbancia, podemos determinar la concentracién de la sustancia. En ambos tipos de pruebas se puede relacionar la concentracién de soluciones conocidas del 94compuesto que nos interesa con su absorbancia (Ley de Beer-Lamber). A base de esta relacién se puede construir una gréfica de la concentracién (eje de x) versus la absorbancia del compuesto (eje de y). Esta grafica deberd resultar en una linea recta, que nos permitiré entonces relacionar cualquier absorbancia con la concentracién del desconocido que nos interesa estudiar. Este tipo de grafica se conoce como una Curva de Calibraci6n. Para prepararla, se utilizan soluciones estandares o de concentracién conocida con diferentes concentraciones de la sustancia bajo estudio _y una solucién que contiene solamente el reactivo que permite el desarrollo del color (Ilamado blanco). A cada una de estas soluciones, incluyendo el blanco, se les mide su valor de absorbancia. Los estudios de espectrofotometria se llevan a cabo utilizando un espectrofotémetro. Este es un instrumento que contiene las siguientes partes: 1. fuente de luz — emite luz con energia correspondiente a los largos de onda requeridos para el andlisis. La fuente de luz puede ser una lampara de tungsteno (largo de onda visible) o una lampara de hidrégeno (largo de onda ultravioleta). 2. selector de largo de onda — consiste de filtros que absorben la luz de largos de onda menores o mayores al deseado para llevar a cabo el analisis. Por ejemplo, si vamos a tomar lecturas a 550 nm, el selector bloqueard los largos de onda diferentes a ese largo. 3. apertura — sirve para controlar la intensidad de luz que incide o impacta la muestra. En general, los espectrofotémetros sencillos tienen una apertura que no varia en tamafio. 4. cuveta (celda) ~ es el recipiente donde se coloca la muestra del material que se va a analizar y por el que pasa la luz a través de la muestra. La cuveta o celda puede estar hecha de vidrio o plastico en el caso de largos de onda en la regién visible y de cuarzo en el caso de largos de onda en la regién ultravioleta. 5. fotocelda — es la parte del espectrofotémetro que detecta la cantidad de luz transmitida (que atraviesa la cuveta). La fotocelda absorbe la luz transmitida por el material que se va a analizar y esto causa un cambio en el movimiento de electrones, lo que es detectado en un metro. En este laboratorio utilizaras el espectrofotémetro para determinar la concentraci6n de proteinas en unas soluciones de concentracién desconocida. 95Ejercicio de laboratorio Materiales agua destilada y equipo: solucién madre de albtmina de suero bovino (20 mg/mL) solucién de albimina de suero bovino (desconocido) pipetas seroldgicas de 1 y de 5 mL micropipetas papel de lente 5 tubos de ensayo de 10mL gradillas reactivo de Biuret 10 cuvetas para espectrofotémetro papel de gréfica espectrofotémetro agitador mecénico ‘SEGURIDAD: Se requiere el uso de gafas o espejuelos de seguridad para este ejercicio. Procedimiento: Ac Preparacién de estandares 1. Afiade 1 mL de agua destilada a un tubo de ensayo. Rotula este tubo como “blanco”. 2. Utilizando la solucién madre de albtimina de suero bovino (50 mg/mL) , afiade suficiente soluci6n a cuatro tubos de ensayo, para que cada tubo tenga 10, 20, 30 y 40 mg de albimina de suero bovino (recuerda calcular el volumen necesario utilizando las conversiones). Completa el volumen de cada tubo hasta 1.0 mL. Rotula cada uno de estos cuatro tubos como estdndares para cada concentraci6n (10 mg/mL, 20 mg/mL, etc.) B- Dilucién y anélisis de la solucién desconocida 1. Diluye la solucién desconocida en la serie V2, Y4, 1/8 y 1/16, siguiendo el diagrama que aparece en la Figura 9.1 a continuacién. Recuerda cambiar de pipeta cada vez que vas a transferir 1 mL de un tubo a otro, y descartar 1 mL. del Ultimo tubo para que al final este también tenga un volumen de 1 mL. 96iusén 44, Figura 9.1 Esquema de dilucién en serie, 2. Aflade 4.0 mL del reactivo de Biuret a cada uno de los nueve tubos (uno de agua, cuatro de solucién estandar y cuatro de las diluciones del desconocido). Mezcla utilizando un vortex. El volumen final de cada tubo debe ser de 5.0 mL. 3. Incuba los tubos por 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Determina la absorbancia de cada solucién (estdndares y desconocidos) a 550 nm, siguiendo este procedimiento: a. Enciende el espectrofotémetro y permite que el mismo se caliente por unos minutos. Selecciona el largo de onda (550 nm) para el estudio. b. Mientras esperas, limpia cuidadosamente con papel de lente la superficie de 9 cuvetas que utilizarés para el analisis espectrofotométrico (pasos ¢ al e), c. Deposita en una cuveta 1 ml de reactivo de Biuret con agua (el blanco) en el espectrofotémetro. Ajusta la transmitancia a 100% presionando el botén de 100% T/O. En este momento el instrumento ya esta calibrado. Remueve la cuveta. d. Deposita en una cuveta 1 ml del estandar que contiene 10 mg/mL de albimina de suero bovino. Inserta la cuveta en el espectrofotémetro y determina su absorbancia. Debes alinear la punta de flecha de la cuveta ae5 con la punta de flecha que esta en el orificio para cuvetas en el espectrofotémetro. Anota tus observaciones en la Tabla 9.1. e. Utilizando el “blanco”, reajusta el espectrofotémetro a 100% de transmitancia y determina la absorbancia de los restantes tubos (estandares y desconocidos). Completa la Tabla 9.1. Tabla 9.1. Absorbancia de las soluciones estandar. Concentraci6n de la Absorbancia soluci6n estandar (A=550 nm) (mg/mL) 10 20 30 40 6. Prepara una curva de calibracién con los datos obtenidos de la lectura de los estndares (absorbancia vs. concentracién de estandares). 7. Utiliza esta grafica para determinar la concentracién de las diluciones del desconocido, buscando en la grafica la concentracién que corresponde a cada lectura de absorbancia. Entonces completa la Tabla 9.2. Tabla 9.2. Absorbancia de las diluciones del desconocid Dilucién del_| Absorbancia | Concentracién desconocido (mg/mL) a2 1/4 18 1/16 8. Determina la concentracién de proteinas en un mililitro de la solucién desconocida original. Recuerda que si el desconocido fue diluido, tienes que considerar el factor de dilucién. 98Preguntas y Problemas A, Preguntas sobre el ejercicio 1, éTienes alguna lectura de absorbancia sobre o menor que las de los estandares? De ser asf: explica a qué se debe y qué harias para que la lectura se encuentre dentro de la curva de calibracién. 2. €Qué harias para detectar 0.5mg/mL de proteinas? B. Busque en Internet referencias que indiquen para que se utiliza la espectrofotometria en el campo de la biologia y la medicina C. Problemas sobre graficas Utiliza papel cuadriculado para trazar las gréficas representadas por las siguientes tablas. Recuerda utilizar una escala adecuada. 1, Un empleado monta x equipos, entonces el pago por hora es y. Numero de Pago por equipos hora ($) montados 9 9.25 10.25, 2. Porciento de miisica que se produce en cassettes es y, para cada afio x dado. Afio Porciento de Musica producida en cassettes a 50 (a991) : 3 (1993) 38 5(1995)| 26 993. Un arbolito que se siembra en Puerto Rico a la edad de x afios tiene un tronco que mide y pulgadas de diametro. Edaden | Diametro del tronco del Afios arbolito en pulgadas 8 2 2 5 rasa 65 4, El-costo por dia y para la renta de un carro depende del numero de dias x que se rente, Nimerode | Renta por dias Dia 24 5 20 10 13.33 Referencias 1- Heidcamp, WH. 1995. Cell Biology Laboratory Manual, Appendix G: rtometry. 100