Metilacin de ADN y respuesta

ambiental en especies forestales

Enrique Sez Laguna

Dpto. de Ecologa y Gentica Forestal
I Maratn Cientfico CIFOR-INIA

Cambio climtico
Aumento de las temperaturas medias
globales con periodos de sequa ms
largos y duros.

Adaptacin
necesaria para
sobrevivir

Cambio rpido en trminos histricoevolutivos

Posibilidades en la
respuesta adaptativa de
las especies forestales

DEMASIADO
Extincin
DRSTICO

DEMASIADO
Migracin
LENTO

Variabilidad gentica
+ plasticidad
fenotpica

Metilacin de ADN
Qu es?
Modificacin qumica covalente consistente en la
adiccin de grupos metilo a nucletidos de citosina. Es
llevada a cabo por enzimas metiltransferasas.

Metiltransferasas
(MET1, CMT, DRM)
Citosina

Para qu sirve?
Mecanismo epigentico de regulacin de la expresin gnica asociado a
silenciamiento gnico por cambios en la estructura de la cromatina.
Interviene en procesos como:
- Regulacin de la transcripcin
- Impronta gentica
- Poliploidizacin
- Control de elementos mviles
- Silenciamiento de transgenes

Epignesis:
Mecanismo que controla el desarrollo y la respuesta de la planta al
medioambiente.

5-metil-Citosina

Estudio de la metilacin en especies forestales

Fagus sylvatica L.: distribucin euroasitica. Dos poblaciones con
respuestas diferentes a estrs hdrico:
- Poblacin espaola (Hayedo de Montejo), lmite sur de la
distribucin de la especie
- Poblacin sueca (sur de Suecia), limite norte de la distribucin
Diseo experimental: plantas control (humedad sustrato al 30%) frente
a plantas sometidas a sequa (humedad sustrato al 13% , 45 das)

Estudio de la metilacin en especies forestales

Pinus pinea L.: distribucin mediterrnea. Especie caracterizada por
una variabilidad gentica prcticamente nula y una elevada
plasticidad fenotpica.
Material: Cinco poblaciones representativas de la distribucin de
esta especie en Espaa:
- Poblaciones costeras: Doana, Palafrugell y Bihar
- Poblaciones de interior: Tordesillas y Borraga
Empleo de material propagado vegetativamente en el ensayo.

Tordesillas

Palafrugell

Bogarra
Doana

Bihar

Estudio de la metilacin en especies forestales

Mtodo de estudio: anlisis de la variabilidad y de los patrones de metilacin
Tcnica: Polimorfismos de amplificacin sensitivos a metilacin (M-SAP). Conceptualmente similar a
la tcnica de AFLPs.
-Digestin de ADN utilizando enzimas cuyo corte esta condicionado por el estado de metilacin de las
secuencias diana
-unin de adaptadores
para posibilitar la
amplificacin.

EcoRI

5 GAATTC

- uso de primers con

nucletidos de seleccin
(reduccin del nmero de
fragmentos amplificados)
y marcados con un
fluorocromo.
- visualizacin de
fragmentos en analizador
LiCor.

HpaII

5mCCGG

5CmCG

G
G GCmC5

Metilacin
completa

MspI

5mCCGG

CTTAAG 5

GGCC5
5CmCGG

GGCCm5
5 mCCGG

G GCC5

GGCC

hemimetilacin

C externa
metilada

5CmCG

G
G GCmC5

5CmCGG

G GCC5
C interna
metilada

Adaptador de
EcoRI

Fragmentos
de restriccin

Adaptador de
HpaII/MspI

Productos de PCR
finales

- anlisis de fragmentos

5 GAATTC

5mCCGG

GGCCm5

CTTAAG 5

EcoRI

Ligacin de adaptadores

Amplificacicin
selectiva

Primers de
preseleccin

Primers selectivos
marcados

Separacin por PAGE y visualizacin

Preamplificacin

Productos de
preamplificacin

Fagus sylvatica L.
EcoRI/MspI
Sweeden

Spain

EcoRI/HpaII
Sweeden

Spain

Combinacin de primers

- Diferencia significativa
de los patrones de
metilacin entre las
poblaciones (Fst=0,16).

EcoRI-AAC EcoRI-AAC EcoRI-AAC EcoRI-ACG Totales

HpaII-AAT HpaII-ATC HpaII-ACT HpaII-ACT

N total de fragmentos MSAP

48

60

64

63

235

N de fragmentos analizados
Polimorfismos insensibles a
metilacin (genticos)

30

54

45

59

188

16

10

29

Polimrficos

21

26

29

29

105

Monomrficos

12

15

16

50

Marcadores sensibles a metilacin

Marcadores monomrficos

AMOVA Locus a Locus

-No hay diferencia significativa entre los

niveles de metilacin de los dos
tratamientos.
Suecia
Diana de restriccin CCGG

Sequa

Irrigacin

- Identificacin de MSAPs
asociados con poblacin y con
respuesta a sequa.

Espaa
Sequa

Irrigacin
1 5 6 7 10 11 13 14 15 19 8 20 21 23 26 27 33 34 36 38 39 40 41 42 44 47 48 49 1 2 5 9 11 12 14 16 17 18 19 20 21 24 25 26 33 35 37 38 40 41 42 43 46 49 50

Citosinas internas
metiladas

Citosinas externas hemimetiladas

Total

30.5 3.2% 31.0 2.8% 30.8 2.5% 30.1 2,1%

1.4 1.0 %

1.6 1.0%

1.2 1.1%

2.4 1.7%

31.9 3.0% 32.6 3.0% 32.0 2.7% 32.5 2.6%

Locus

% Variacin % Variacin
entre
entre
poblaciones tratamientos

120

-14.93

31.10

127

-11.41

17.80

12

-14.63

22.98

100

-4.52

41.83

20

-0.28

15.38

26

67.08

-2.59

50

67.08

-2.59

87

57.83

-3.51

29

52.31

-1.67

126

46.42

-0.56

79b

43.37

11.66

42

42.44

-4.54

Pinus pinea L.
- 55% de MSAPs polimrficos frente al < 1% AFLPs polimrficos.

M-SAP

AFLP

Combinaciones de primers
EcoRI-AAC
HpaII-AAT

EcoRI-ACA
HpaII-AAT

Totales

N MSAPs totales

123

86

209

N MSAPs analizados

69

66

135

N MSAPs polimrficos

41

34

N MSAPs monomrficos

28

32

59.42%

55.55%

55.55%

% Polimorfismo

Combinaciones de primers

EcoRI-ACC
MseI-CAT

EcoRI-ACC
MseI-CCA

EcoRI-ACG
MseI-CCA

Total

N AFLPs totales

33

34

40

107

N AFLPs analizados

33

34

40

107

75

N AFLPs polymrphicos

60

N AFLPs monomrficos

33

33

40

106

% Polimorfismo

2,9%

0.93%

EcoRI-ACA HpaII-AAT

EcoRI-ACG HpaIICCA

- Identificacin de marcadores
especficos de individuos!

Muchas gracias!
Preguntas?