Anlisis de protenes

per espectrometria
de masses
PROTEMICA
Lena Nerea Montaa Ernst
Marina Perea Badia

1. INTRODUCCI

En lassignatura de protmica es van realitzar unes prctiques al laboratori on es va realitzar

lestudi proteomic mitjanant la tcnica de lespectrometria de masses duna protena
desconeguda provinent de la nostra mostra amb lobjectiu didentificar la protena
desconeguda contrastant els resultats amb una base de dades.
Lanlisi per espectrometria de masses es va fer mitjanant dues tcniques, MALDI-TOF-MS i
LC-MS, per tal de comparar i contrastar els resultats entre les dues tcniques diferents.
MALDI-TOF-MS s una tcnica de ionitzaci suau, que permet lanlisi de molcules orgniques
grans que es fragmenten quan sn ionitzades. Per fer-ho, primer sha de tractar la mostra per
tal de posar-la en una matriu slida, que consisteix en molcules cristallitzades, aleshores es
sirradia aquesta matriu amb un lser, el que provoca la ionitzaci dels analits que es dirigiran
cap a lespectrmetre de masses, que en el nostre cas es tracta dun TOF (time-of-flight mass
spectometer).
Per altre banda, la tcnica per LC-MS combina la separaci fsica de la cromatografia lquida
amb lanlisi de masses de lespectrometria. En protemica, sutilitza quan volem identificar
components de una mostra complexa. Per fer-ho, primer haurem de fer una preparaci de la
mostra que consisteix en digerir amb proteases i desnaturalitzar-la. Un cop preparada, es
procedeix a la LC-MS/MS per tal de obtenir la seqencia de cada pptid fragmentat.

2. OBJECTIUS

- Identificaci duna protena prviament desconeguda.
- Aprendre a preparar la mostra segons la tcnica despectrometria de masses utilitzada.
- Aplicar la teoria estudiada a classe per tal de fer un estudi de protenes a nivell prctic.
- Observaci de processament de les mostres al Parc Cientfic de Barcelona (PCB).
- Estudi dels resultats obtinguts amb la ajuda de bases de dades.
- Entendre i comprendre cadascun dels passos del protocol establert en aquest tipus
destudi.

3. METODOLOGIA

Preparaci de les mostres:

1. Quantificaci de protenes per el mtode del cid Bicincrnic (BCA)

La quantificaci s necessria per saber la concentraci denzim de la mostra que
necessitem. Es van fer diferents dilucions de BSA amb aigua Mili-Q i es van reservar en
la placa calefactora a 60C. Parallelament es va preparar el reactiu de quantificaci en
base a les solucions del Micro BCA Protein Assay Kit.
Posteriorment es van barrejar les diferents dilucions amb el reactiu de quantificaci
per aix realitzar la recta patr. Amb la mostra desconeguda es va fer el mateix
procediment.

Desprs de la incubaci es van llegir les absorbncies i amb aquestes dades es va

Recta patr BSA
3

y = 0,0467x + 0,1318
R = 0,99482

Abs

2
2
1

Concentraci Abs

Lineal (Concentraci Abs)

0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

Concentracions de BSA

poder dissenyar una recta patr per finalment poder trobar la concentraci de la
nostra mostra a partir del seu valor dabsorbncia.


2. Digesti de protenes amb tripsina

El primer pas per poder digerir la protena, va ser posar la mostra amb soluci tamp
de Bicarbonat amnic (ABC), seguidament es van reduir els possibles ponts disulfur de
la mostra amb Ditiotreitol (DTT) i es va incubar a 56C per 30 minuts. Finalment es van
alquilar els residus de cistenes de la protena provinent de la mostra, amb
Iodacetamina (IAA) incubant aquest cas a les fosques durant 20 minuts. Aleshores es
va afegir la tripsina segons la concentraci de la mostra calculada en el pas anterior. La
reacci es va detenir afegint cid frmic (FA) a la mostra.

3. Preparaci de la mostra per anlisi despectrometria de masses MALDI-
TOF_MS o LC_MS

Es va treballar amb les columnes Zip-Tip, de fase reversa C18 prviament equilibrades
amb Acetonitril (ACN) i cid Tridluroactic (TFA) on es van fixar els pptid trptics
aspirant i dispensant la nostra mostra a la columna. El segent pas va ser rentar la
mostra amb cid Trifluroactic . Si la mostra es volia processar per MALDI-TOF MS/MS,
seluen els pptids retinguts a la columna amb la soluci de matriu CHCA i es posava 1
microlitre sobre la placa de MALDI i es deixava assecar. En canvi, si la mostra era per
processar per LC_MS/MS seluen els pptids retinguts a la columna amb la soluci de
ACN/H20, sassecaven en speed-vac i es res suspenien en soluci dcid frmic.

4. Es processen les mostres dacord amb el protocol establert de lanlisi de
espectrometria de masses MALDI-TOF-MS i de espectrometria de masses LC-
MS/MS, i es guarden les dades obtingudes per ser processades posteriorment.
4. RESULTATS

Per poder obtenir els resultats de lestudi, les dades obtingudes es van introduir en el
programa Mascot Search Results, on sha de indicar tots els parmetres possibles en relaci

amb lexperiment realitzat per tal de que la cerca tingui ms validesa. En el cas de la cerca per
lexperiment realitzat mitjanant la tcnica de MALDI-TOF-TOF, els parmetres introduts van
ser:
-
-
-
-
-
-
-
-
-

Database: SwissProt ( ja que les dades estan ms contrastades)

Enzyme : Trypsin
Missed cleavages: 2
Fixed modifications : Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Peptide tolerance: 100 ppm
Instrument: MALDI-TOF-TOF
MS/MS tolerance: 0.6 Da
Peptide charge: +2

Podem observar com la nica protena que es va trobar amb una alta puntuaci (133) s la
Serum albumin bovina, i que per tant s molt probable que la mostra inicial correspongus a
aquesta protena.
Per a realitzar lanlisi dels resultats per la mostra processada, mitjanant LC-MS/MS els
parmetres introduts a la base de dades van ser els segents:
-
-
-
-
-
-
-

Database: SwissProt ( ja que les dades estan ms contrastades)

Enzyme : trypsin
Missed cleavages: 2
Fixed modifications : Carbamidomethyl (C)
Variable modifications: Oxidation (M)
Peptide tolerance: 100 ppm
Instrument: ESI-QUAD-TOF

-
-

Peptide charge: +2, +3, +4

MS/MS tolerance: 0.6 Da

En aquest cas, ens surten ms resultats possibles, encara que el resultat amb major puntuaci
(907) tamb es correspon a la albmina bovina. En aquest cas per, amb una puntuaci major
amb lanterior tcnica utilitzada. Els altres resultats obtinguts, amb scores ms baixos (200
aprox) tamb corresponen la protena albmina, per provinents daltres organismes: Felis
Catus, Canis Lupus, Homo Sapiens i Mus Musculus.

5. CONCLUSIONS
Segons els resultats obtinguts conclum que el ms probable s que la protena present en la
mostra problema inicial correspongui a la protena albmina bovina, ja que tant en la anlisis
mitjanant MALDI-TOF-TOF, com en el segon anlisis mitjanant ESI-Quadrupole-TOF, les dos
cerques en la base de dades (en concret, SwissProt), donen com a resultat aquesta protena. Ja
que encara que en els resultats del segon estudi, ens apareix la mateixa protena daltres
organismes, la que t una puntuaci ms alta s la bovina i a ms es contrasta amb el resultat
de la MALDI.
Per tant, tot i que amb la nostra mostra problema mitjanant lexperiment ESI-Quadrupole-
TOF, la puntuaci de lalineament va ser major, les dues tcniques ens poden ser molt tils i
eficients a lhora de identificar una protena desconeguda.