PRCTICA 1: SEPARACI DELS NUCLIS DE LES CLLULES

Observar i identificar el nucli en cllules origen animal.

FONAMENT:
El nucli sol ser l'orgnul ms predominant de la cllula. Es troba envoltat per un
embolcall nuclear i es troba sol en cllules eucariotes, i s la localitzaci de la
majoria dels diferents tipus d'cids nucleics. Per com s esfric o oval i t un
dimetre mitj de 5m. A causa de la seva grandria i al fet que ocupa una posici
relativament fixa al centre de les cllules se li va denominar el centre de regulaci
de la cllula. En el seu interior trobem tota la informaci gentica de la cllula en
forma d'cid desoxiribonucleic (ADN), que presenta diverses organitzacions al llarg
de la vida cellular.
Per aquesta prctica utilitzarem una substncia tamp o amortidor que serveix com
a regulador del pH quan hi afegim l'aigua, tornant-se aquest constant. D'aquesta
manera, si s'agreguen un cid o una base, no tindran cap efecte sobre l'aigua, ja
que aquesta sempre s'estabilitzar immediatament.
GENERALITATS:
El nucli est envoltat per un parell de membranes concntriques, que separen el
contingut nuclear respecte del citoplasma circumdant. Aquestes dues membranes
guarden entre si una distncia de 30 a 40 nm i es fusionen a intervals, en els
anomenats porus nuclears, que regulen el pas de determinats materials cap al
citoplasma des de l'interior del nucli, o la inversa. Dins de la membrana nuclear es
troba un mitj semifluid en el qual estan suspesos els cromosomes. En general es
troben en forma d'estructures molt allargades i no poden ser observats fcilment
amb el microscopi ptic. S'utilitza el terme cromatina per referir-se als cromosomes
quan es troben sota aquesta condici.
Quan la cllula va a dividir-se en dues cllules, es modifica l'aparena dels
cromosomes. Els fils llargs i prims s'enrotllen en forma de cossos espessos,
densos, els quals es poden veure al microscopi ptic amb l'ajuda d'un colorant
apropiat. Durant el procs de la divisi cellular, els cromosomes es distribueixen en
nmeros exactament iguals entre ambdues cllules filles.
Qumicament, els cromosomes estan compostos d'ADN i protenes, anomenades
histones que sn les principals associades als cromosomes. Les histones sn
protenes bsiques, pel fet que sn riques en aminocids com ara lisina i arginina.
Cada un d'aquests aminocids cont un grup amino lliure, capa d'adquirir un prot
per posseir un parell d'electrons no compartit. Per tant, les histones tenen crrega
positiva. L'ADN porta crrega negativa a causa de la presncia de nombrosos
grups fosfat. Per tant, no s sorprenent que les histones s'enllacen fortament amb
l'ADN. Quan es prepara la cromatina de certa manera, el microscopi electrnic
revela la presncia de fils llargs que contenen engruiximents regularment espaiats
que donen l'aparena de nusos sobre una corda. Els engruiximents reben el nom
de nucleosomes. El fil que las uneix s ADN. Cada nucleosoma cont ADN i quatre
dels cinc tipus d'histones. Associades amb l'ADN de la cromatina es troben tamb
altres protenes, encara que en quantitats menors que les histones. Aquestes altres
protenes s'esmenten de vegades com les protenes cides, per potser el terme
no histniques s el ms exacte. Durant el perode comprs entre les divisions
cellulars, quan els cromosomes es troben estesos, un o ms d'ells poden estar
adherits a un cos esfric de bona grandria. Aquest cos rep el nom de nuclol i s
fcilment visible amb el microscopi ptic. En el nuclol es sintetitzen diversos tipus

de molcules d'ARN. Part d'aquest ARN s'utilitza en la configuraci dels ribosomes.

Els ribosomes sn essencials per a la sntesi de protenes en les cllules.
MATERIAL:
Microscopi.
Portaobjectes.
Cobreobjectes.
Llancetes
Vas de precipitats.
Pipetes graduades.

Pipeta pasteur.
Tubs d'assaig
Tub de centrfuga
Centrfuga.
Liquadora.

MATERIAL BIOLGIC
Fetge de xai.

REACTIUS:
Tamp de separaci A: mantenir a la nevera o en un bany de gel:
120 ml d'aigua destillada FREDA
1,5 g de Clorur de Sodi
5 g de Bicarbonat sdic
Colorant: Safranina
FRACCIONAMENT CELLULAR: tcnica per centrifugaci cellular.
1. El fetge s'esbandeix amb aigua de l'aixeta i es colloquen 5g en un got de
precipitat, que contingui 20 ml del medi d'extracci o tamp de separaci A, (la
trobareu a la nevera) s'esmicola amb les tisores.
2. S'aboca el contingut del vas en una liquadora (caldr que ajunteu el contingut de
dos o ms grups fins que el lquid arribi a les aspes de la liquadora) i es liqua (pocs
segons). El lquid es passa per un colador a un vas de precipitats net.
3. Passar 5 cm3 a un tub de centrfuga i es centrifuga a 2000 rpm durant 10 minuts,
posar el sobrenedant en un tub dassaig (decanteu amb molt de compte).
El psit del centrifugat el re-suspeneu (potser caldr afegir unes gotes de soluci
tamp A per ajudar a baixar el contingut) i el poseu a laltre tub dassaig. Conservar
per la propera prctica.
4. Observaci de nuclis: el sediment del tub centrifugat cont els nuclis o cllules
senceres que no es trenquen.
Prendre de cadascun dels tubs un alquota, poca mostra, per exemple el que es
recull amb una llanceta, o la vareta de vidre, i posar en un porta, fer un frotis,
escampant b, fixar deixant assecar a laire, podeu ajudar amb un assecador de
cabell (aire fred).
5. Tenyir amb Safranina uns 5 minuts, rentar amb aigua. Posar una gota daigua
destillada i posar un cobreobjectes.

6. Observar al microscopi localitzant l'estructura dels nuclis (cossos discoides de

color rosa). Tamb es veuen uns grumolls dun color vermell dADN alliberat del
nucli.
PRCTICA 2: EXTRACCI DADN
Mtode 1
OBJECTIU: Extracci i allament dADN.
FONAMENT:
Els cids nucleics reben aquest nom perqu van ser els primers que es van
descobrir en el nucli de les cllules, es tracta de molcules orgniques gegants
que contenen carboni, nitrogen, hidrogen, oxigen i fsfor. Els cids nucleics sn de
dos tipus: el primer, l'cid desoxiribonucleic (ADN), constitueix el material gentic
dins de la cllula. Cada gen s un segment d'una molcula d'ADN. Els nostres
gens determinen els trets que heretarem i, que mitjanant el control de les sntesis
de protenes, regulen les activitats que tenen lloc en les nostres cllules al llarg de
la vida i, el segon l'cid ribonucleic (ARN). (1)
GENERALITATS:
La molcula d'ADN s lineal sense ramificacions, forma fibres llargues, est
formada per dues cadenes de polinucletids enrotllades al voltant d'aquest eix,
comunament coneguda com a doble hlix amb gir a la dreta, cadascuna d'elles
est formada pels fosfats a l'exterior en contacte amb el medi aqus, aquests
s'uneixen al C5 i C3 d'un sucre de cinc toms de carboni anomenat desoxiribosa
s'uneix a cada base en l'ADN. Les bases priques i pirimdiques s'enllacen en
l'extrem oposat del sucre; les quatre bases sn: Adenina (A), Guanina (G), Tiamina
(T) i citosina (C). L'adenina i la guanina sn bases grans d'anells dobles
anomenades purines, la timina i la citosina sn bases ms petites d'un sol anell
denominades pirimidines, se situen a la part interna de la molcula, quedant
perpendicularment a l'eix, s'enllaa una base prica amb una pirimdica mitjanant
ponts d'hidrogen, la qual cosa li dna major resistncia a la desnaturalitzaci. Les
cadenes d'ADN sn antiparalleles, s a dir segueixen direccions oposades, una va
en sentit 5 'a 3' i l'oposada en direcci 3 'a 5'
En enrotllar les cadenes, es formen dos solcs o esquerdes paralleles als girs de
l'hlix, un ms gran que l'altre. En aquests llocs les protenes interactuen amb els
toms dels nucletids i controlen l'expressi de gens especfics.

o
o
o
o
o

MATERIAL:
Microscopi
Cobreobjectes
Portaobjectes
Pipetes
Proveta.
Soluci tamp + dispersant de lpids B:
120 ml d'aigua destillada FREDA
1,5 g de Clorur de Sodi
5 g de Bicarbonat sdic
5 ml de detergent lquid
Dodecilsulfat de sodi (SDS)

 Els tubs dassaig de la prctica anterior, un amb el sediment del centrifugat i

laltre amb el sobrenadant.
1.
2.

En els dos tubs hi afegirem 10 ml de la soluci tamp B que es troba a la nevera.

A continuaci s'afegeix a cada tub una punta desptula de Dodecilsulfat de sodi
(SDS). Aix ens quedar l'ADN lliure de les protenes que t associades.
3.
Tapant el tub amb el dit es sotmet a una vigorosa mescla.
4.
Afegir mitjanant una pipeta 10 ml d'alcohol de 96fred. S'ha de deixar escrrer
lentament l'alcohol per a la cara interna del tub, de manera que l'alcohol rellisqui
per les parets, tenint el tub en una gradeta. Els tubs han destar ben estables.
L'alcohol quedar surant sobre el tamp. En un parell de minuts es veur com es
forma una capa blanquinosa en la interfase brou-alcohol. s lADN
5.
Observeu si hi ha diferncies, en la quantitat de ADN obtingut, comparant els dos
tubs.

PRCTICA 3: EXTRACCI DEL VOSTRE ADN.

Mtode 2.
Material:
Got de plstic transparent
Cullera de plstic
Vareta de vidre fina
Dissoluci de sab de rentar plats al 25% en aigua (la trobareu preparada)
Dissoluci de sal comuna al 6% en aigua. (tamb la trobareu preparada)
Realitzaci:
1. Posarem una cullerada daigua de laixeta al got de plstic.
2. Amb aquesta aigua glopejarem durant ms o menys un minut i la tornarem al got.
Daquesta manera aconseguirem les cllules que necessitem que provenen de la
mucosa bucal.
3. Afegirem al got una cullerada de la dissoluci de sal i una cullerada de la
dissoluci de detergent. Aix aconseguirem trencar les membranes cellulars i
alliberar lADN del nucli.
4. Desprs de barrejar una mica, dipositarem el got sobre un fons negre, el
deixarem reposar mig minut i amb molt de compte afegirem uns 10 ml dalcohol
deixant-lo relliscar per la paret del got, cal emprar la pipeta Pasteur per evitar
turbulncies
5. Al cap dun minut lADN sha concentrat i s visible, (poseu el got sobre el taps
negre del microscopi per contrastar) ja que forma uns filaments llargs de color
blanc. El podeu concentrar remenant amb molta cura amb la vareta de vidre.
ACTIVITATS
Quin tipus de crrega elctrica posseeixen les molcules de DNA en
suspensi?

Quin efecte tenen els ions salins sobre el comportament en suspensi

de les fibres de DNA?
Raona la funci de tots els components del tamp dextracci (soluci
sal/detergent).
Qu ha estat possible visualitzar al microscopi?. Raona el resultat de
lobservaci.