Parte II Técnicas BasicasORGANIZACAO DO LABORATORIO DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS Silvio Lopes Teixeira Antenio Carlos Torres Introdugdo lividades de cultura de tecidos sao realizadas em ambiente asséptico e com temperatura ¢ iluminagao controlad: indo, principalmente, a otimizagio das respo! os estimulos-termo e€ fotoperiddico aplicados ao material in vitro, além de outros fatores. Para a realizagdo de algumas téenicas, a padronizagio de temperatura ¢ iluminagiio nfo se torna imprescindivel, mas, em outros casos, condigdes ambientais inadequadas podem inviabilizar as respostas, tanto de panto de vista quantitativo quanto qualitativo. Além disso, o estabelecimento de condigées ambientais étimas proporciona melhor crescimento das culturas ¢ as conseqilentes yantagens econdmicas. Elevado grau de assepsia é condicao limitante em qualquer situagao, j& que fungos. bactérias encontram, no meio nutritivo utilizado, ambiente apropriado para se desenvolverem rapidamente, culminando com a morte das culturas. Para evitar isto, as culturas so mantidas em frascos de vidro ou outro material substitutivo, fechados ¢ previamente esterilizados. Algumas espécies em cultura necessitam que haja trocas gasosas do interior dos frascos com o exterior, o que se consegue, normalmente, por meio de um pequeno espaco livre deixado entre a tampa e o frasco, por onde podem penetrar também os microrganismos do ar. Isso pode acontecer também durante a introdugdo dos explantes nos frascos e quando siio feitas as transferéncias de material de um frasco para o outro. Dai surge a importancia de uma instalaco com caracteristicas apropriadas, bem como de equipamentos ¢ normas de trabalho que possibilitem a criagao de um ambiente extemno ao fraseo com elevado nivel de assepsia. Essa necessidade torna-se mais importante 4 medida que aumenta o tamanho do laboratério, pois, com o aumento das atividades cresce também o riseo de contaminagio. 7”S.L Teixeitad& A.C. Torres Laboratérios de grande porte costumam ser dotados de sistema de ‘pressio positiva’, que consiste em pressionar continuamente ar filtrado, externo, para o interior do laboratério, de modo que mantenham uma pressdo interna positiva. Essa estratégia evita a entrada de ar externo contaminado, sendo, também, recomendada em locais de alta umidade relativa, ou de ar externo muito carregado de particulas em suspensiio, Outra forma de se garantir maior assepsia ¢ a compartimentalizagao das atividades dentro do laboratério, separando as atividades que lidam com material contaminade, daquelas que trabalham com material esterilizado ¢ que exigem ambiente mais asséptico, Deve-se, também, limitar a circulagaio de pessoas nas dreas que exigem maior assepsia, Orendimento das operagGes do laboratério fica favorecido quando as alividades so distribuidas em uma seqiléncia natural pelas instalagdes, de tal forma que uma operagao que suceda, imediatamente, a uma outra seja realizada ao lado dela. Dessa forma, se economiza tempo ¢ trabalho, © que resulta em economia de recursos financeiros. Conveém salientar que a capacidade de produgao de um laboratorio de cultura de tecidos ¢ determinada pelo tamanho da sala de cultura ou de incubagiio, sendo as demais dependéncias acessérias e destinadas apenas ao prepararo do material reservado para a sala de cultura, Portanto, durante o planejamento do laboratério, deve-se dimensionar primeiramente a sala de cultura, em fungao da produgao diaria, mensal ou anual desejada. A partir dela, serdo dimensionadas as demais dependéncias, Da mesma forma, o tipo ¢ a capacidade dos equipamentos, a drea de bancadas e o mimero de pias devem-se adequar ao volume do trabalho a ser realizado. Estrutura do Laboratério As atividades a serem desenvolvidas no laboratorio de cultura de tecidos podem ser agrupadas da seguinte forma: limpeza e esterilizagao, preparo de material ¢ de meios de cultura, manipulagao asséptica ¢ incubagio das culturas. A distribuicdo dessas ati vidades dentro da estrutura do laboratério pode ser efetuada de duas formas. Uma delas é distribuir as atividades sobre um circulo imagindrio, seguindo a ordem aqui apresentada, de modo que a ultima atividade (incubagiio das culturas) fique ao lado da primeira (limpeza e esterilizago de vidraria), Uma outra opgio ¢ a distribuigio das atividades em linha, na mesma seqtiéncia 72Organiza; do laboratério de cultura de tecidos de plantas descrita. Além disso, cada atividade citada se divide em subatividades, que devem ser também distribuidas seguindo o mesmo critério, para evitar caminhadas desnecessarias de um ponto a outro do laboratério. Num grande laboratorio, todas as atividades deveriam ser separadas em salas diferentes, para melhor seguranga. Nesse caso, as salas componentes do laboratério se denominariam: sala de limpeza, sala de preparo, sala de transferéncia e sala de cultura. Num pequeno laboratério, com excegfo da sala de limpeza, as demais atividades poderiam ficar num tinico comodo, desde que as regras de limpeza sejam respeitadas. A medida que aumenta o tamanho do empreendimento, ou em fungdio de problemas locais que aumentam o risco de contaminagiio (excesso de umidade ambiental ou pocira), torna-se necessdrio o isolamento de uma ou mais atividades. A separagdo mais freqiientemente encontrada é ada sala de cultura, devido a necessidade de controle de temperatura ¢ iluminagao. Em alguns laboratérios menores, a capela de fluxo laminar tem sido localizada dentro da sala de cultura, para economizar espago € aproveitar um ambiente que, normalmente, é mais limpa de que o restante do laboratério. Quando os riscos de contaminagao aumentam ou a drea do laboratério, a capela de fluxo laminar deve ser localizada em sala prépria (a sala de transferéncia), que deve ser a mais ass¢ptica de todas, A limpeza e a esterilizagdo de vidraria seriam outras atividades que, se colocadas isoladas das demais, trariam mais seguranga quanto aos riscos de contaminagaa, uma vez que ali sao mantidos, por algum tempo, os frascos de cultura contaminados ¢ a vidraria usada, até o momento de serem lavados. Para efeito de planejamento, descrevem-se as caracteristicas desejaveis de cada uma das salas componentes do laboratério: Sala de limpeza - € 0 local destinado ao descarte de meios de cultura utilizados e outros residuos, lavagem de vidraria, autoclavagem de agua, de meios de cultura e de utensilios diversos. Pela propria natureza dessas atividades, esta sala constitui um local onde as condigdes de assepsia deixam a desejar. Por isso ela deve, de preferéncia, localizar-se distante da sala de transferéncia. Deve, também, dispor de um exaustor, para eliminagao dos vapores desprendidos pela autoclave, Precisa ser dotada de bancadas para trabalho em pé, armarios ¢ prateleiras para estocagem temporaria da vidraria a ser lavada, pias com pelo menos uma torneira de Agua quente, autoclave, destilador, deionizador, lavador de pipetas, forno 73S.L. Teixeira & A.C. Torres de microondas (opcional), maquina de lavar vidraria (opeional), estufa de secagem de vidraria e esterilizagao de bisturis e pingas (opcional), aparelho de banho-maria, escorredores para vidraria, instalacdo de agua, esgoto e eletricidade para 110 ¢ 220 volts, E importante que as tomadas para 220 volts tenham configuracio diferente daquelas de 110 volts, de modo que ndo aceitem esses terminais e assim evitem a queima de equipamentos. As pias devem ser fundas, deixando uma distancia de 80 em entre seu fundo ¢ o bico da torneira. Sala de preparo - local destinado ao preparo de meios de cultura e de solugdes diversas, bem como de material vegetal destinado a introdugiio in vitro, Ea drea de maior cireulagaio de pessoal e onde se efetuam as principais atividades do laboratério, servindo de ligacdo com 0 exterior e com as demais salas; por isso deve ter porta de entrada suficientemente larga, para a passagem da capela de fluxo laminar e dos méveis, Deve ser equipada com armadrios, com gavetas de tamanhos diferentes, ¢ estantes para estecagem de vidraria © de todo o material (de consumo e permanente) a ser utilizado, bem como de bancas para trabalho em pée sentado, e balcfo de reagentes composto de pequena pia, geladeira, freezer, balangas de lope e analitica, peagdmetro, agitador magnético e aparclho de vacuo, além de instalagao de eletrividade, com tomadas de 110 2 220 volts. Sala de transferéncia - ¢ onde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo um local exelusivo para a capela de fluxo laminar e as ¢stantes para estocagem temporaria dos meios de cultura jd autoclavados, além de outros materiais esierilizados destinados ao uso imediato. Nao deve ser permitida a circulagaio de pessoas nesta sala; ela deve ser acessada por meio da sala de preparo e dotada de porta suficientemente larga para passagem da capela de fluxo laminar, com grande visor de vidro, para evitar a abertura freqtiente da porta por motivos diversos, Se dotada de Jancla para o exterior, ela deve oferecer boa vedac&o contra a entrada de are poeira externas ao laboratorio, Deve ser instalada ao lado da sala de cultura e seria vantajosa a colocagao de uma janela na parede que as separa, de modo que permita a transferéncia dos frascos de cultura diretamente de uma sala paraaoutra. Em Tegides quentes, deve ser dotada tambem de ar condicionado. 74‘Organizacso do Iaboratdria de cultura deteeidos de plantas Sala de cultura - é a drea onde as culturas serdo mantidas até o momento de serem retiradas dos frascos. Deve ser dotada de estantes iluminadas, com prateleiras de 50 cm de largura e distanciadas entre side 40-45 cm, num total de 5 prateleiras por estante. As estantes devem ser colocadas em fileiras simples, quando encostadas a paredes, e em fileiras duplas na area mais central da sala. Os intervalos para passagem entre as fileiras de estantes devem ser de 70 cm. A temperatura desta sala deve ser mantida em torno de 27°C (dependendo da espécie), mediante o emprego de aparelhos de ar condicionado. Os reatores das lampadas devem ser colocados fora da sala de cultura, para que o seu calor se ipe naturalmente no exterior, evitando, assim, gastos extras no dimensionamento dos aparelhos de ar condicionado, O fotoperiodo ¢, normalmente, mantido em 16 h, por meio de comutadores eletrénicos. A intensidade luminosa pode ser conservada proxima de 50-60 mmol m” Basta que as estantes sejam iluminadas por duas fileiras de lampadas flu entes, por pratelcira, ¢ que estas mantenham entre si a distancia de 40-45 cm ja citada. As lampadas sfio fixadas sob cada prateleira, com uma camada de material isolante térmico entre elas, para evitar aquecimento desigual da prateleira, em conseqiléncia de temperatura mais elevada ao longo das linhas em contato com as lampadas. Outra op¢aio de iluminagdo das culturas é mediante a utilizagéio de bancas de limpadas dispostas de maneira vertical. As culturas que precisam se desenvolver no escuro pedem ser simplesmente cobertas com pano preto, Esta sala precisa ser dotada de tomadas de 100 ¢ 220 volts, em locais destinados a agitadores orbitais e roladores, necessdrios 4 condugao de algumas praticas. Em locais de alta umidade relativa, € necessaria a utilizagaio de desumidificadores. E aconselhdvel que uma das paredes desta sala tenha um visor de vidro para permitir a observacao externa ¢, assim, limitar a. entrada de visitantes. Outras dependéneias - em laboratérios de maior porte, justifica-se a. incluso de owtres compartimentas de apoio as atividades principais, como escritério, instala¢o sanitaria e almoxarifado. Este tiltimo compartimento torna-se imprescindivel em laboratérios maiores, em virtude da maior quantidade de material de consume e permanente a ser estocado, jd que a manutengdo de caixas e outros artigos na sala de preparo pode constituir fonte de contaminagao. Instalagao sanitaria é outro compartimento 75SL. Tetxeina & AC. Torres imprescindivel sempre que nao houver outra instalagao proxima para ser utilizada, Um escritério, também, n&o pode faltar em um laboratério comercial instalagées de Apoio Em um laboratério destinado & pesquisa, o ntimero de plantas que sio produzidas ¢ geralmente pequeno; ds vezes, o objetivo da pesquisa nem visa a regeneragao de plantas, o que dispensaria gastos com instalagdes extras para a ultima fase do trabalho. Ja em um laboratério comercial a situagao é diferente, pois o produto final é sempre um grande numero de plantas que precisam ser adaptadas ao ambiente externo e ai serem mantidas até o momento da comercializagido. Nesse caso, algumas instalagées de apoio, externas ao laboratério, so nece: sarias, como uma varanda para fazer o transplante das plantas dos frascos para os vasos; uma cdmara de nebulizagao, para adaptagao inicial das plantas as condigdes externas, ¢ um local para o crescimento das plantas até @ momento da comercializagao, como um telado, Conforme as condigées climaticas da regido, uma casa de vegetacfio poderia ser necessaria e, dependendo das espécies a setem exploradas, até mesmo um viveiro mais amplo para o. erescimento final das plantas. Camara de nebulizagiio - é uma instalagdo da maior importancia para abrigo das plantas recém-saidas dos frascos de cultura, ¢ deve ser construida sob um telado ou dentro da casa de vegetagao. Em instalagSes mais modernas, de grandes laboratérios comerciais, este sendo usadas para esta finalidade casas de vegetagdio equipadas com atomizadores, que dividem a 4gua em microgotas ainda menores do que as produzidas por nebulizadores ¢ mais eficientes na manutengdio de um teor permanente de umidade elevada em todo o ar na instalagao. Telado - instalagdo destinada 4 manuteng&o das plantas em vasos, provenientes da camara de nebulizag3o, assim que termina a fase de aclimatagdo. Ali elas permanecem por tempo variavel, dependendo da sua natureza: ou até o momento da comercializaco (plantas de interior), ou até completarem a aclimatagio, para serem transferidas para o viveiro (plantas de exterior), onde permanecerao até 09 momento da comercializagio. 76Organizagde do laboratOrio de cuftura de teeides de plantas O telado é uma instalacdo simples, constituida por uma armagio metalica ou de madeira, ou mesmo de canos plasticos, envolvidos lateral superiormente por tela de nylon de cor cinza, para reduzir a incidéncia de luz de 25 a 50%, e com pé-direito entre 1,80 m e 2,5 m. Em pequenos laboratérios, as vezes se usam ripados, que siio instalagdes mais baratas, cobertas com bambu ou madeira roliga, em substituiglo aos telados. Os bambus sao colocados lateral ¢ superiormente, mantendo-se entre cles uma distancia igual 4 da espessura dos colmos, para deixar passar 50% dos raios solares, O chao dessas instalagdes deve ser coberto com uma camada de 5-10 cm de pedregulho ou areia grossa, para evitar encharcamento. Em laboratérios que realizam limpeza clonal, hanecessidade de ‘telados a prova de insetos’, que so cobertos com tela de malha bem fina, para impedir a recontaminagao de plantas das quais tenham sido eliminados patégenos sistémicos. Casa de vegetagao - esta instalagao nem sempre é necessdria, podendo ser substituida, com vantagem, pelo telado, que é mais barato, exceto em regides muito frias, para protegao das plantas no inverne. No verio ha sempre © inconveniente de aquecimento excessivo. Quando necessario proteger as plantas contra o excesso de chuvas, seria mais vantajoso usar uma instalagdo mista, com cobertura de plastico, telha transparente ou vidro € laterais de tela de nylon. Nesse caso a altura do pé-direito deve ser de 2,50 m ou mais, para evilar que o calor excessivo irradiado pelo material de cobertura atinja as plantas, além do uso de lanternim, para dissipagao do ar quente, no verao. Equipamentos Autoclave - utilizada para esterilizagao de meios de cultura, vidraria, agua e outros materiais. Este aparelho pode produzir calor seco ou calor umido, que é mais eficiente para esterilizagao, e ja vem, normalmente, regulado para trabalhar a uma pressao de 1,05 kg/cm*, o que resulta numa temperatura de 121°C, que ¢ a ideal. Pode ser do tipo horizontal ou vertical, com camara de no minimo 30 cm de altura. As autoclaves horizontais sio normalmente preferidas por permitirem trabalho mais confortavel ao operador. Aparelhos muito grandes levam mais tempo para aquecer, por isso, deve-se substituir um aparelho muito grande por a7dois menores, com a vantagem adicional de um deles poder atender, parcialmente, ds necessidades mais urgentes do laboratério, em caso de defeito tempordrio no outro. Algumas marcas de autoclaves mais sofisticadas, fabricadas em outros paises. possuem um sistema para liquefazer o vapor que soltaria para o exterior, resultando em um gasto exeessivo de agua. Em laboratérios muito pequenos, a autoclave pode set substituida por simples panelas de pressdo domésticas, especialmente aquelas com 15 litros de capacidade, dotadas de mandémetro que funciona exalamente como uma autoclave. Apesar de sua capacidade reduzida, apresentam a vantagem de aquecer e esfriar mais rapidamente. Destilador - juntamente com o deionizador, este aparelho ¢ uti para a eliminag’o de sais minerais da dgua. Recomenda-: aparelho tenha reservatério de vidro especial, porque os metal © metal correspondente na égua. Este problema deixa, porém, de ser importante, quando o aparelho ¢ conectado entre o deionizador e a fonte de dgua, Deionizador - deve ser instalado de forma que permita conexio alternativa com o destilador ou com a fonte de dgua. Quando situado apos o destilador, o deionizador recebe a 4gua com baixissimo teor de sais, o que resulta no aumento da vida util de suas colunas. Deve-se, de prefer€ncia, adquirir aparelhos que disponham de mostrador com escala € ponteiro indicadores da condutividade elétrica da agua e do limite maximo aceitavel. Forno de microondas - Equipamento utilizado cada vez mais em laboratérios de cultura de tecidos, devido a sua rapidez de operagdo. O seu principal uso tem sido para fusdo de agar ou de outros agentes Bclificantes, mas ja vem sendo estudada a possibilidade de sua utilizagiio para esterilizar meios de cultura, vidraria e outros materiais, Estufa de secagem - é um forno elétrico comum, que produz calor seco, eficiente para secagem rapida de vidraria e outros materiais nao liquidos, Como seu aquecimento ¢ rapido, é eficiente, também, para esterilizagao destes mesmos materiais, devendo para tanto produzir temperaturas de no minimo 160°C. Dependendo do material, uma aduas 78= A AL LLLP LLL LALA LLL Organiza;odo laborat brio de cultura de tecidos de plantas horas de calor seco sob essa temperatura corresponde a 10-15 min de autoclavagem a 121°C. E um equipamento ttil, masndoabsolutamente necessirio. Maquina de lavar vidraria - outro equipamento Gtil em um grande laboratério, mas dispensavel em outros de menor porte. Consiste numa modificagio de maquina de lavar pratos, que funciona com agua quente ¢ fria, sendo muito eficiente para lavagem da vidraria de laboratério, Aparelho de banho-maria - util para aquecimento moderado de solugées, meios de cultura ¢ fusio de agar, mas nem sempre necessario, principalmente quando se dispée de forno de microondas. Aquecedor de agua - imprescindivel para a lavagem eficiente de frascos contendo meio de cultura semi-sélido. Aquecedores de torneira, elétricas, esto hoje substituindo os velhos aquecedores de dgua, com eficiéncia e simplicidade. Uma tinica torneira dotada de aquecedor, é, em geral, suficiente. Lavador de pipetas - equipamento de baixo custo ¢ muito ttil para simplificar o trabalho de lavar pipetas. Refrigerador doméstico - de preferéncia do tipo ‘frost-free’, para manutengao de solugdes-estoque ¢ reagentes diversos. Freezer - utilizado para estocagem de reagentes que exigem temperatura abaixo de zero grau centigrado, deve produzir temperaturas de até 10 graus centigrados negativos, podendo ser do tipo horizontal ou vertical e, de preferéncia, do tipo ‘frost-free’, Balanga - necessdria para a pesagem de macronutrientes e outros reagentes usados em maior quantidade. Em geral, tém capacidade para pesar até cerca de 4 kg, e precisio de 0,1 g. Balanga de precisio - ¢ um dos equipamentos mais caros, juntamente com a autoclave e a capela de fluxo laminar, e pouco acessivel a um pequeno laboratério comercial, embora seja imprescindivel para a pesagem de quantidades minimas de fitorreguladores. Tem capacidade para pesar até 200 g, e precisfic de 0,1 mg. 795, L. Teixeira A.C. Torres Medidor de PH - necessario para a determinagado e ajuste do pH de meios de cultura e deve ter precisao de 0,1 unidade. Pode ser substituido, em pequenos laboratories, embora com resultados precarios, por papéis: indicadores, cuja precisdo nao ultrapassa 0,5 unidades. Agitador magnético - util como auxiliar na dissolugdo de reagentes e determinagdo de pH, sendo ideal que seja conjugado com aquecimento, Todavia, nfo é imprescindivel. Aparetho de vacuo - titil na operagdo de desinfestagao de material vegetal. Para isso, basta um aparelho de pequeno porte, que produza vacuo moderado, e seja provido de campanula, Dessecador - para a manutengio de frascos de certos reagentes muito higroseépicos, em pd, apds abertos = Capela de fluxo laminar - imprescindivel para os trabalhos de manipulagiio asséptica, deve ser mantida em local com bom nivel de assepsia, para preservar a vida Util do filtro, que é um acessorio de prego clevado, Esse equipamento forca a passagem de ar por meio de um filtro bacteriolégico, de modo que seja criado um ambiente estéril com pressiio positiva, que evita a entrada de ar externo contaminado. Todavia, esta pressiio é pequena e insuficiente para evitar a entrada de ar em certos casos. Por isso, é importante que a capela no seja colocada em frente de uma porta, ventilador ou aparelho de ar condicionado, que podem eriar correntes de ar capazes de vencer a presto positiva gerada na capela, mesmo estando a uma distancia aparentemente consideravel dela. Por exemplo, em algumas situagdes, um aparelho de ar condicionado pode contaminar o ambiente da capela de fluxo laminar estando a 4+ m de distancia dela. Algumas capelas de fluxo laminar vém equipadas com uma lampada ultravioleta, que deve ser ligada por cerca de. 30 min. antes do inicio do trabalho, para esterilizagdo do ambiente. A capela deve ser dotada, internamente, de tomadas elétricas para 110 e 220 volts Dispensador de meio de cultura - consiste em uma pequena bomba aspirante-premente, acionada eletricamente e capaz de dispensar o meio de cultura em um ou mais frascos de uma sé vez, no volume desejado e 80OrganizagSo do laboratério de culturade tecides de plantas em poucos segundos, E um equipamento de alto rendimento e muito util quando se lida com grandes quantidades de meio de cultura. No caso de pequenos volumes de meio, 0 enchimento dos frascos pode ser feito satisfatoriamente com o auxilio de uma bureta de 250 ml, com graduagdo- de 5 em 5 ml. Bico-de-bunsen - utilizado na esterilizagao dos instrumentos cinirgicos ¢ flambagem de boca de frascos, por meio de chama produzida pela queima de gas de cozinha. Constitui equipamento essencial na capela de fluxo laminar, mas pode ser substituido por lamparina de alcool. Esterilizador de instrumentos cirtirgic equipamento elétrico, que produz. temperaturas de 270 a 370°C, capaz de esterilizar ferramentas cirargicas em poucos segundos. Ultimamente vem substituindo eficientemente o bico-de-bunsen, na capela de fluxo laminar, Microseépio estereoscépico - necessario apenas em laboratérios de pesquisa ou laboratérios comerciais que efetuem limpeza clonal, sendo suficiente um pequeno equipamento que permita aumento de até 30 vezes. Desumidificador - em geral dispensdvel, pode ser titi] em regides muito quentes e umidas, onde a umidade relativa (U.R.) do ar atinge niveis elevados em certas épocas do ano. Nessas regides, o uso de desumidificadores ¢ imprescindivel, nos dias em que a U.R. atinge 100% Umidificador - é um equipamento quase nunca utilizado, mas pode resolver o problema de desidratago muito rapida do meio de cultura, que pode ocorrer, excepcionalmente, em regides de U.R. do ar extremamente baixas em certas épocas do ano. Carrinho de laboratério - muito itil para o transporte de vidraria de um ponto a outro do laboratério. Agitador orbital - necessério a condugao de algumas técnicas que exigem meio liquido agitado, com ciclos de até 150 rpm. E conveniente que o equipamento venha com bandeja dotada de suportes para erlenmeyers de 250 ml, além de bandeja extra para erlenmeyers de 125 ml. 81SL. Teixeira & A. C. Torres Rolador de tubos de ensaio e/ou rolador de roletes - sao aparelhos destinados a movimentar vagarosamente o meio de cultura liquido contido em tubos de ensaio ou em frascos do tipo conserva, para o caso do rolador de roletes que giram com ciclos de 1 a 3 rpm. Esterilizadores de ar - consiste num pequeno aparelho elétrico, cuja agiio esterilizadora é realizada pela oxidacao das proteinas no interior dos capilares de bloco ceramico refratario. O tempo de permanéncia das particulas orgdnicas ambientais, arrastadas pela corrente de convecgao natural do ar, associada a uma elevada concentragdo de raios infravermelhos no interior dos capilares cerdimicos, faz com que todas as proteinas sejam degradadas, © ar contaminante penetra pelas aberturas inferiores sterilizado pela grelha superior. Dessa forma, ¢ indicado para reduzir a populag&o de microrganismos nos ambientes. Usa-se um aparelho para cada 20-35 m' da sala, de acordo como modelo do aparelho. Os aparelhos devem ser colocados no lade de dentro da porta de entrada das salas de cultura e de transferéncia, além de outros locais, dependendo do volume da sala, Como o custo de aquisigao e de funcionamento de um esterilizador é muito baixo nao deve ser dispensado, Podem ser encontrados no comércio com o nome de ‘sterilair’ Estabilizadores de voltagem - para a protegdo de aparelhos sensiveis, como balangas de preeisio, medidores de pH, dentre outros. Urtenstlios Diversos Frascos de cultura - destinados 4 criagao do ambiente estéril para a manutengdo das culturas. Sao constituidos de material transparente e incolor, de vidro ou plastico auteclavavel, principalmente polipropileno, Para essa finalidade tém sido usados os mais diferentes tipos de frascos, desde os tradicionais frascos de conserva, de 250 a 500 ml, até tubos de ensaios, frascos de alimento e recipientes de polipropileno desenhados especialmente para cultura de tecidos. em diferentes volumes e formats. Alguns desses frascos possuem tampas herméticas; ou outras tampas que deixam pequena abertura entre elas e o frasco, ou siio detadas de material porose para permiitir trocas gasosas entre o interior eo exterior do frasco. Isto € importante no caso de sc trabalhar com tecidas desorganizados ou injuriados. que liberam quantidade elevada de etileno no ambiente. 82(Organizag3oda laboratérin de cultura detecidos de plantas Todavia, as lampas nao herméticas permitem também a penetragiio de contaminantes do ar e sé podem ser usadas em ambiente com elevado nivel de assepsia; se este nfo for elevado, o simples transporte dos frascos. da autoclave até a sala de transferéncia, ou desta para a sala de cultura, pode resultar em contaminagao. Pequenos frascos so muito usados em pequenos laboratérios de orquid6filos, para a germinagio de sementes de orquideas. Tubos de ensaio de 25 x 150 mm, com tampa de polipropileno transparente ou colorida sio muito usados em laboratérios de pesquisa e, em laboratérios comerciais para a iniciagao das culturas. Eles devem ser desprovidos de orla, para permitir a adaptagdo da tampa, ¢ terem fundo curvo, para maior eficiéncia na limp Na fase de multiplicagao ¢ de enraizamento, os laboratérios comerciais usam frascos maiores que abrigam maior nlimero de plantas, sendo muito usados os de conserva de 250 a 500 ml ¢ os de polipropileno de mesmo volume. Os frascosde conserva podem ser usados com as lampas originais metalicas que permitem fechamento hermético, ou com tampas de polipropileno desenhadas especialmente para este fim. Esses frascos maiores permitem maior rendimento do trabalho do operador na capela de fluxo laminar, mas exigem que o ambiente do laboratério seja bastante asséptico, pois qualquer contaminagao em um deles resulta em perda de todas as plantas do frasco. As tampas herméticas, nesse e850, So mais aconselhaveis e funcionam sem problemas para a maioria das espécies. No caso de tubos de ensaio, as tampas nado devem ter comprimento inferior a 3,8 cm ¢ devem ser bem ajustadas ao tubo. As contaminagdes sao mais freqilentes quando se usam tampas de menor comprimento, ou que deixem um espa¢o muito grande entre elas e as paredes dos tubos. Suporte para tubos de ensaios - sao apetrechos normalmente de material plastico que podem ser autoclavados, Destinam-se a manter os tubos de ensaio na sala de cultura, reunidos em grupos de deze inclinados de 45°C, de modo que aproveite melhor a luz. E muito comum a uso de suportes improvisados que mantém as tubos de ensaio na posicao vertical, o que é desaconselhavel, principalmente quando esses suportes tém capacidade para 4 a $ fileiras de 8 a 10 tubos de ensaio; nesse caso, a iluminagao dos tubos da area central do suporte fica muito reduzida,“Teixeira & A, C, Torres Termémetros - para monitorar a temperatura da sala de cultura, so usados termémetros de maxima-e-minima; para outras determinagGes de temperatura, sfio empregados termémetros comuns de laboratério Frascos para reagentes - silo frascos de 250 a 500 ml, de boca estreita, com tampa de pressio, de vidro esmerilhado ou de material plastico, utilizados para armazenar solugSes-estoque. Quando destinados a reagentes sensiveisa agao da luz, devem ser de cor Ambar. Frascos comuns, adquiridos com reagentes, podem ser usados satisfatoriamente para esse fim, Frascos para Agua - destinados a armazenar dgua destilada ¢ deionizada para uso diario, Podem ser de vidro ou de plastico de boa qualidade (sem cheiro) ¢ devem ter capacidade compativel com o volume de trabalho, para evitar o armazenamento de dgua por muitos dias. Devem ser lavados freqlentemente, com detergente, para evitar actiimulo de impurezas ¢ microrganismos. Bandejas - destinadas ao acondicionamemto dos frascos de cultura, vidraria ¢ outros materiais a serem autoclavados, ou a serem transportados de um pento a outre do laboratério. Devem, portanto, ser de material autoclavayel e de dimensdes compativeis com as da camara da autoclave. Vidraria de laboratério - inclui-se aqui a vidraria tipica de laboratirio, como béqueres, erlenmeyers, provetas, buretas, pipetas e placas de Petri. Os béqueres e os erlenmeyers sao usados normalmente parao preparo de solugdes, devendo-se dispor de um conjunto deles, variando de 25a 2.000 ml, ou até mais, dependendo do volume de solugGes a ser prepararado. Em laboratorios comerciais, esses utensilios s40, 4s vezes, substituidos por vasilhas de cozinha, de ago inoxidavel, ou mesmo de plastico. As provetas séio usadas para medigdes mais precisas de volumes, devendo por isso, ser graduadas. Deve-se dispor de um ou mais conjuntos de cada um desses utensilios, com volumes variando de 25 a 2.000 ml. Nao se deve medir volume utilizando erlenmeyers ¢ béqueres cuja graduagdo no € precisa, As buretas de 250 mi sao usadas principalmente para dispensar meios nutritives nes frascos de cultura. SZ muito usadas em laboratérios de pesquisa, onde sfo preparadas pequenas quantidades de meio. Em 84‘Organizagsa do laboratoria de eultnen de tweidos és plantas laboratdrias comerciais esses utensilios sao normalmente substituidos por dispensadores automatices de meio de cultura, que permitem rendimento mais elevado da operacao, mas que 86 se justificam quando sio preparados maiores volumes de meio. As pipetas sao empregadas para dosar pequenos volumes de reagentes, devendo-se dispor de um conjunto variando de 1 a 10 ml ¢ serem graduadas de 0,01 ml. As pipetas comuns hoje esto dando lugar as automaticas que, embora mais caras, podem ser reguladas no volume desejade e proporcionar maior facilidade de trabalho e maior rapidez, quando se necessita dispensar um mesmo volume de um determinade reagente repetidas vezes. Além de outros usos menos freqtientes no laboratério, as placas-de- Petri autoclavadas constituem a base estéri] sobre a qual o operador, na capela de fluxo laminar, mantém o material vegetal a ser preparade para entrar nos frascos de cultura, ou para ibdividide e transferido para outros frascos, nas fases de multiplicagdo € enraizamento, Usam-se normalmente placas de Petri de 9 em de didmetro e 1-2 cm de altura, embora placas de maiores dimensdes também sejam usadas menos freqdientemente. Em alguns laboratorios, essas placas so substituidas, com vantagem, por discos de outros materiais autoclavaveis, ou forradas com diseos de papel de filtro ou papel toalha autoclavado, que sao repostos 4 medida que vao sendo usados, Pissetas - sfio frascos plasticos que, quando pressionados, liberam um fino jato de agua; usados para lavacdo de eletrodos de peagametros, remogao delicada de precipitados ¢ outros fins semelhantes. Outros Materiais Além dos equipamentas e utensilios deseritos, outros materiais, como funil, papel-toalha, guardanapo de papel, algodo, gaze, papel aluminio, filmes plasticos do tipo parafilme e PVC, fita crepe, etiquetas, vasos para plantas, sacos plasticos pretos e incolores, bandejas de propagacdo, caixas plasticas para o transporte de mudas, fertilizantes, material de limpeza come palha de ago, escovas de crina para lavar vidraria e detergente devem ser previstos no planejamento do laboratério. 85SL, Teixeirad A.C, Tomes Referéncias BIONDI, S.; THORPE, T.A. Requirements for a tissue culture facility. In: THORPE, T.A., ed. Plant tissue culture: methods and applications in agriculture. New York: Academic Press, 1981. p-1-20. CALDAS, L.S.: PEREIRA, A.V.; MACHADO, M.A. Protocolo: um suporte yertical para bancas de lampadas em sala de incubagao. ABCTP Noticias, v.17, p.2-4, 1992. GEORGE, E.F, Plant propagation by tissue culture, Edington: Exegeties, 1993, 574p, JONA, R.; MENINE, U.G. 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