The emergence and rapid rise to dominance of Vibrio cholerae 0139 in India and Bangladesh

in 1992 led to the consideration that choleraphage might serve as both a selective mechanism
and a means for horizontal transmission of genetic information. A filamentous phage 493
from 0139 strain AJ27-493 has been purified and partially characterized. The phage was
inactive on classical biotype V. cholerae 01 but it was active on El Tor biotype strains isolated
prior to 1994 when E l Tor re-emerged in Bangladesh. More recent E l Tor isolates were all
resistant to the phage. The phage was also active on 0139 strains. Unlike the filamentous -4,
the receptor for 493 is not TcpA. The phage genome was a 9 3 kb closed circular singlestranded molecule containing a 0.4 kb double-stranded stem supporting a 2 kb singlestranded loop. A 283 bp fragment was cloned and used as a probe in Southern hybridization,
in parallel with total phage 493 DNA. These probes hybridized both chromosomally and
extrachromosomally with most 0139 strains, but not with 01 strains. Infection of
hybridization-negative E l Tor or 0139 strains resulted in the presence of hybridizing loci
(both plasmid and chromosomal), in the appearance of an 18 kDa protein, and in marked
alterations in colonial morphology. Phage 493 is clearly distinct from other 0139
choleraphages which have been described. Phage 493 DNA hybridized with an encapsulated
non-01 (031) strain (NRT36S) which was isolated before 0139 was recognized. NRT36S also
produces a phage which can infect El Tor strains with low efficiency. Further studies may
reveal whether bacteriophage play a role in the emergence and the territoriality of new
choleragenic vibrios.
INTRODUCTION
Until 1992, out of approximately 140 Vibrio cholerae serogroups only strains of serogroup 01
were known to cause epidemic cholera, while non-01 strains were occasionally associated
with sporadic cases of diarrhoea. In 1992, a new non-01 V. cholerae serogroup, 0139 (syn.
Bengal), emerged in India and Bangladesh, displacing the resident 01 El Tor biotype and
causing a major epidemic of cholera which showed signs of spreading (Albert, 1994).
However, the 01 El Tor biovar re-emerged and is again dominant in India and Bangladesh
(Sharma et al., 1997). The 0139 serogroup is closely related to the 01 El Tor biovar (Kaper et
al., 1995) but there are important differences. V. Cholerae 0139 lacks the Ol-specific antigen
and expresses a polysaccharide capsule as a result of replacement of the 01 antigen rfb locus
DNA by exogenous DNA encoding 0139 antigen and capsular polysaccharide synthesis (Bik
et al., 1995; Stroeher et al., 1995). The mechanism responsible for this DNA substitution has
not yet been identified. 0139 also expresses the mannose-sensitive haemagglutinin which is
characteristic of the El Tor biotype (Albert, 1994). The emergence, rapid rise to dominance
and subsequent decline of V. cholerae 0139 led us to consider choleraphage as both a
selective mechanism and a means for horizontal transmission of genetic information.
Temperate and filamentous bacteriophages (Kar et al., 1996; Pajni et al., 1995a; Reid1 &
Mekalanos, 1995) have previously been identified in V. cholerae 0139. Temperate
choleraphages can integrate randomly into the V. cholerae chromosome, mediate generalized
transduction (Rowe & Frost, 1992), participate in horizontal gene transfer and alter various
host characteristics (Mitra, 1989 ; Siddiqui & Bhattacharyya, 1987). With regard to these
properties, we highlight older observations (Gay, 1935) in which Pasricha, de Monte and

Gupta found in 1931 that 20% of a series of 355 non-agglutinatable (i.e. non-01) water
vibrios were lysable by cholera bacteriophage. In some instances, the secondary cultures,
which appeared after lysis, were agglutinatable with cholera antiserum, possessed a highly
potent agglutinogen for true cholera organisms (which the parent culture did not have) and
completely absorbed the agglutinins from an antiserum to true cholera ... The effect of phage
has been, then, to add an agglutinogen to the antigenic structure of the strain, and to bring the
strain into what appears to be a close serological relationship with V. cholerae.
In this report, we characterize a new filamentous choleraphage, from V. cholerae 0139 strain
A 527-493 ( 493 ), which can infect different serovars and biotypes and integrate into the
chromosome. Its ability to inhibit all but the most recent El Tor strains suggests that it could
play a role in vibrio territoriality, and its ability to integrate chromosomally and exist
extrachromosomally provides a potential mechanism for horizontal transmission of genetic
information.
METHODS
Bacterial strains.
Thirty-three V . cholerae 0139, 46 V . cholerae 01 biotype El Tor, 10 V. cholerae 01 classical,
one atypical 01 strain, M 0 1 (Pajni et al., 1995b), and non-01031 strain NRT36S (Table l ) ,
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio hollisae, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio harveyi
and Aeromonas (Vibrio) damsela were used in this study. Of these, a series of carefully
collected and preserved fresh 0139 and 01 El Tor V . cholerae isolates from Bangladesh,
obtained from 1993 to 1996 from J. Albert (International Centre for Diarrhoea1 Disease
Research, Dhaka, Bangladesh), were lyophilized from the confluent growth streaked from the
primary colony from patients stools on TCBS agar (Oxoid). Unlike other stock cultures
(Finkelstein et al., 1997), these were colonially homogeneous. Other cultures were from
ATCC, J. Johnson (VA Medical Center, Baltimore, MD, USA), J. Mekalanos (Harvard
Medical School, Boston, MA, USA), G. B. Nair (National Institute of Cholera and Enteric
Diseases, Calcutta, India), Y. Takeda (International Medical Center of Japan, Tokyo, Japan),
R. Taylor (Dartmouth Medical School, Hanover, NH, USA), K. Wachsmuth (Centers for
Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA) and our laboratory collection
( University of Missouri, MO, USA). Colony morphology and opacity were evaluated as
previously described (Finkelstein et al., 1997). To evaluate the potential role of TcpA as a
receptor (Waldor & Mekalanos, 1996) for phage 493, ToxR- mutants of A 527-493 were
made according to a modification of a previously described technique (Waldor & Mekalanos,
1994). For this purpose, we used the EcoRI 630 bp internal fragment of toxR labelled with
digoxigenin as a probe for confirmation of the correct integration of pVM55 (Miller &
Mekalanos, 1988). R. Taylor also generously provided strain KHT52, a AtcpA mutant (Thelin
& Taylor, 1996).
Choleraphage techniques.
For isolation of phage, V . cholerae 0139 strain AJ27-493 was grown in 500 ml LB in 21
Erlenmeyer flasks for 48 h at 37 C with shaking (100 r.p.m.). Free phage particles were

collected after removing cells by centrifugation at 10000 g for 20 min and 20000 g for 20
min, and then filtration of the supernatant through 0.2 pm nitrocellulose filters. For
preparation of nucleic acids and electron microscopy (EM), phage was pelleted from the
filtrate by ultracentrifugation at 300000g for 3 h and resuspended in buffer (10mM Tris/HCl,
10mM CaCl,, 10 mM MgCl,, 10 mM NaCI, pH 7.4). For heat inactivation, aliquots of filtrate
were placed in a water bath at various temperatures for 5 and 10 min; pH resistance was
tested by changing the pH in aliquots of the filtrate for 5 min then adjusting it back to pH 7.
Chloroform sensitivity was also evaluated. Phage survival rates and sensitivity of strains to
phage were determined by plaque counting. Aliquots (0.01 ml) of serial dilutions of phagecontaining samples were plated on soft LB agar (0.4 %) overlays seeded with indicator
strains. The overlays were prepared by inoculating 5 ml 0.4% LB agar with 10 pl of N- lo8
cells per ml culture of the indicator strain grown for 3 h in LB broth at 37 C with shaking.
DNA analytical methods.
Total DNA was prepared by alkaline lysis with vortexing using an RPM kit (BiolOl). Virion
DNA was extracted according to Sambrook et al. (1989). Plasmid DNA was prepared using
the Wizard Plus SV Miniprep system (Promega). Enzyme digestions were performed as
recommended by the manufacturers (BioLab and Boehringer Mannheim). DNA fragments
were separated by agarose gel electrophoresis in TAE buffer (Sambrook et al., 1989).
Labelling of DNA probes and Southern hybridization were done using the Genius system
(Boehringer Mannheim). For cloning of the phage DNA fragments, pCR-Script Amp SK( +)
Cloning kit (Stratagene) was used.
EM.
Bacteriophage-containing samples were diluted in 2 /o ammonium molybdate (pH 6.5),
incubated for 15 min at room temperature and mounted on freshly prepared Parlodioncoated
grids as previously described by Garon (1982). A formamide modification of the
Kleinschmidt technique (Garon, 1986) was used for DNA microscopy. Grids were examined
in a Philips CM-10 transmission electron microscope.
SDSPAGE.
Preparations of total cell protein were analysed on 10 /o SDS polyacrylamide gels as
previously described by Laemmli (1970) and visualized by the silver staining method (BioRad).
RESULTS
Choleraphage 493
After preliminary examination of several V. Cholerae 0139 strains, strain A 527-493, a
carefully preserved single colony isolate from Bangladesh in 1994, was chosen for further
study. It was grown for 48 h and the culture supernatants were collected for identification of
the phage (493). To confirm that the preparations did not contain any viable bacterial cells,
the supernatants were streaked on LB agar plates which were incubated overnight at 37 "C.

EM of phage 493 revealed the filamentous nature of the particle with an estimated width of
2.6 nm and variable length (Fig. la). In some preparations, one end of the phage appeared to
carry slender fibres. The phage was resistant to pH values of 2.8-11.8 and to heat treatment
up to 60 "C for 10 min, but it was totally inactivated at 75 "C and by chloroform treatment.
Plaque-forming ability was sensitive to proteolytic enzymes (chymotrypsin, Pronase A,
proteinase K and trypsin) and resistant to lysozyme. The phage genome was resistant to
RNase but was completely digested by DNase 1. EM analysis (Fig. l b ) indicated that the
genome of bacteriophage 493 was an approximately 9-3 kb single-stranded closed circle
DNA molecule containing a 0.4 kb double-stranded stem supporting a 2 kb single-stranded
loop.
After partial digestion of virion DNA with HaeIII, a 283 bp fragment, putatively from the
stem region, was cloned into the SrfI site of the pCR-Script SK( +) Amp vector to generate
pEAJ46, which was later used as a probe. The 283 bp fragment had no DNA homology to
known sequences in GenBank. The double-stranded replicative forms of phage DNA isolated
from the host strain were digested with several endonucleases. EcoRI treatment reveled only
a single fragment; the HindIII digest yielded two fragments of approximately 2.3 and 7 kb; no
sites were found for XhoI, PstI, EcoRV or BamHI.
Host range of choleraphage 493
In soft agar overlay assays with indicator strains (Table I), supernatants of strain 493
containing 1Ol1 p.f.u. ml-' produced turbid plaques on 32 out of 33 strains of 0 139, on 31
out of 46 strains of 01 biotype El Tor and on atypical-01 strain M01, but not on the
encapsulated 031 strain NRT36S. With classical biotype 01 strains, inhibition of growth, but
not plaque formation, was rarely ohserved and then only with undiluted 493 (Table 1).
Interestingly, the El Tor biotype strains which were refractory to lysis with phage 493 were
isolated from Bangladesh in 1995-1996, when El Tor strains were again predominant
(Faruque et a/., 1996; International Centre for Diarrhoea1 Disease Research, Bangladesh,
1996; Sharma et al., 1997), and one strain (out of five tested) isolated in 1994. Colonial
opacity or translucency had no effect. Other vibrio species tested, including representative
strains of V. fluvialis, V. harveyi, V. hollisize, V. parahaemolyticus and V. uulnificus and A.
damsrlu, were resistant.
Infection by choleraphage
Phage 493 was temperate. Growing cells were picked from the centre of plaques and streaked
for single colonies. Stereoscopic examination of these colonies using transmitted oblique
illumination (Finkelstein et al., 1997) revealed that marked alteration in colonial morphology
occurred as a result of infection with phage 493 (Fig. La, b). The colonies become
hypervariable in both opacity and size. Other 0139 and El Tor strains examined gave similar
results. All the infected strains and colonial variants tested produced phage DNA. Plasmid
DNA from these strains was compared before and after infection. In all the infected strains,
hybridizing extrachromosomal elements were seen which were not present prior to exposure
to 493 phage. Southern hybridization of total DNA from these strains with the virion DNA
(Fig. 3) indicated the presence of sequences homologous to the phage DNA in both

chromosomal and extrachromosomal loci. Total and plasmid DNA preparations from
hybridizing strains digested with several restriction enzymes were subjected to Southern blot
analyses using virion DNA as a probe. These analyses revealed the presence of a single
EcoRI site in the phage RF DNA (plasmid) as evidenced by a single hybridizing band of 9.3
kb. However, in the total DNA preparations, this 9.3 kb fragment was superimposed on a
ladder of chromosomal restriction fragments (data not shown). The chromosomal
hybridization pattern was suggestive of random phage insertions as has been demonstrated
with phage VSK (Kar et al., 1996). All infected cells were able to produce phage particles.
Comparison of total protein profiles by SDS-PAGE revealed an 18 kDa protein in infected
strains Peru 6707 and AJ27-404 (selected as examples of non-hybridizing strains; Table 2)
(results not shown). Phage from 0139 strain PO7 had somewhat different effects on colony
morphology than 493 (Fig. 2c). Although colonies infected with PO7 phage were
hypervariable with regard to opacity, unlike +%infected strains, colony size was more
uniform. It should be noted that the sensitivity of indicator strains to phage infection
increased after additional broth passages and that only young cultures of the indicator strains
were sensitive to phage in the overlay assay; overnight cultures were resistant (results not
shown). This may be related to expression of the phage receptor.
Distribution of 493-phage-related sequences
The virion DNA hybridized with 21 out of 32 0139 strains examined (Table 2 ; Fig. 4).
Southern hybridizations were performed repeatedly with both total and plasmid DNA
preparations and the results are summarized in Table 2. Differences can be seen in
hybridization patterns between 0 139 isolates from the same year and the same location (Fig.
4). Interestingly, DNA homology - both plasmid and chromosomal - was observed with the
capsulated 031 strain, NRT36S, isolated at Narita Airport, Japan, before 1990 (Johnson et al.,
1992). No DNA homologous to the phage was found in any of the 16 01 serogroup El Tor or
classical biotype strains isolated at different times or places, or strain M01 (Table 2). No
homology was observed in representative strains of other vibrio species (see above). pEAJ46
was also used as a probe to detect phage 493 sequences in these strains. Under low stringency
conditions (Litwin et al., 1992), the spectrum of hybridization was the same as that seen with
total phage 493 DNA as a probe; however, with high stringency, only cells infected with the
phage gave positive signals. Therefore, although phage 493 DNA was found to be widely
distributed among 0139 (but not 01) vibrios, some variability existed in its sequence.
Other phages
Phage 493 is not the only phage we have observed in our collection. 0139 strain P07, isolated
in India in 1993, produces both a filamentous phage, VSK, which has been partially
characterized, and a kappa-type phage (Kar et al., 1996). In the present study, strain PO7
DNA was shown to hybridize with total DNA from phage 493 (Table 2) but not with the
specific probe pEAJ46 derived from phage 493 (Fig. 5 ) .
Search for 493 phage receptor

Because TcpA was demonstrated to be the receptor for the filamentous ctx4, we examined the
possibility that TcpA could also be the receptor for 493. TcpA is known to be under control of
ToxR (Waldor & Mekalanos, 1994). Three independent ToxR- mutants were obtained by
integration of plasmid pVM55 ; the phenotypes of these mutants were confirmed by SDSPAGE analysis as previously described by Waldor & Mekalanos (1994). These mutants, in
addition to the AtcpA mutant KHT52, were equally as sensitive to 493 as their wild-type
parents, thus indicating that TcpA is not involved.
DISCUSSION
The vibrios which cause epidemic cholera have a highly developed ability to present new and
challenging problems to those who would study them. They are also a highly conserved
group. More than 150 serotypes of V. cholerae have now been identified but, until 1961, as
far as we know, all epidemic cholera was caused by only two serotypes, Inaba and Ogawa, of
0 group 1 of the classical biotype first described by Robert Koch in 1883 (Anonymous,
1883). In 1961, the El Tor biotype (first recognized in 1905) emerged, presumably from
Indonesia (de Moor, 1939), to cause what is regarded as the seventh great cholera pandemic.
It is noteworthy that cholera patients in India before 1964 had classical 01 whereas, by 1965,
89O/0 of 2000 strains tested were phage-typed as El Tor (Mukerjee, 1974). How did the ' new
' El Tor biotype displace the classical biotype from its home in India ? Similarly, in 1992, the
0139 serotype emerged in India and Bangladesh and soon outnumbered, for a while, the
resident El Tor biotype which, aside from the loss of the 01 antigen and the gain of a capsule,
it closely resembled. How did 0139 arise (from El Tor?) and how did it gain - and then lose ascendancy ? We are interested in the possibilities that choleraphage( s) could have played
significant roles in the horizontal transmission of genetic information and in the
manifestations of ' bacteriological warfare ' which ensued.
Large numbers of choleraphages, mostly lytic ones, have previously been identified and been
useful in distinguishing biotypes and in typing V. cholerae strains (Guidolin & Manning,
1987). Others, including recent isolates from 0139 strains, have been associated with: (a)
virulence (Parker et al., 1970; Takeya & Shimodori, 1963) ; (b) induction of toxinogenesis
(Siddiqui & Bhattacharyya, 1987) ; and (c) biotype transition (Mitra, 1989). Most recently,
Waldor & Mekalanos (1996) have shown that the ' virulence cassette ' of choleragenic vibrios
is carried by a chromosomally integrated filamentous phage using TcpA as a receptor. Hacker
et al. (1997) have recently summarized the potential role of bacteriophage in horizontal gene
transfers involved in ' pathogenicity islands ' of other pathogenic bacteria.
In the present work, we have found that 0139 strains produce bacteriophage which could be
involved in horizontal genetic exchange and could provide some selective advantage. One
phage (493) was selected for extensive study. Phage 493 is a lysogenic filamentous phage
which produces turbid plaques and has characteristics which are similar to those of other
filamentous phages (Rasched & Oberer, 1986). It is moderately thermostable and resistant to
a broad range of pH, but it is sensitive to chloroform and proteolytic agents. Like other
filamentous phages, it has single-stranded closed circular DNA but some molecules have an 2.3 kb stem-loop structure (Fig. l b ) which could represent a transposable element. This

structure was not observed in the recently described filamentous phage VSK from V. cholerae
0139 (Kar et al., 1996). Two fibres reminiscent of attachment fibres of non-filamentous
phages (Fraenkel-Conrat, 1985) were visualized at one end of some particles (not shown).
The infection and propagation of phage 493 within host cells is not affected by tcpA deletion
or toxR mutations. Therefore, ToxR-regulated components can be excluded as being
necessary for active infection (attachment, entry, replication, assembly, etc.), although we can
not rule out the possibility that some of these components were constitutively expressed at
low levels in the ToxR- insertional mutant. The importance of TcpA as the phage receptor can
categorically be eliminated, thus clearly distinguishing this phage from the previously
described filamentous ctx4 phage (Waldor & Mekalanos, 1996). Preliminary data suggest that
another type IV pilus, the mannose-sensitive haemagglutinin, may be the receptor for phage
493 (work in progress).
The phage had an interesting spectrum of activity (Table 1). All but one of the 33 strains of
0139 were highly sensitive. Thirty-one of the 46 strains of 01 biotype El Tor tested were
sensitive. The observation that only the recent El Tor isolates were resistant raises the
possibility that choleraphage such as 493 could have played a significant role in the
emergence and the subsequent decline of 0139 in India and Bangladesh. The potential role of
choleraphage in the evolution of epidemic V. cholerae strains was summarized recently by
Mooi & Bik (1997). It should be recognized that the dramatic population changes - El Tor
over classical biotype since 1961 and 0139 over El Tor in 1992 (and back) - must be
dependent on the ability of the invading strain to exert a superior survival advantage over the
resident strain in the environment. Recognizing that a single infected bacterium could
generate hundreds of phage particles, phage could play the role by reducing the quantum of
infection of a phage-sensitive resident strain in the environment while the invading strain
propagates. The emergence of the phage-resistant El Tor biotype in Calcutta was recently
demonstrated to coincide with the appearance of a hitherto unknown ribotype of 01 El Tor
(Sharma et al., 1997).
The ability to infect and co-exist in the same cell was demonstrated with phages 493 and P07.
It is obvious that PO7 is related to 493 because of cross-hybridizing sequences contained
within their genomes (Fig. 4). However, the two phages have some differences as evidenced
by the observations that PO7 DNA did not hybridize to pEAJ46 derived from 493 and the
P07- and 493-associated plasmids have distinctive migration patterns on agarose gels (Fig. 6).
These observations, taken together, raise the intriguing prospect of constant genetic exchange
between 493-related phages, thus generating ' new ' phages with slightly different properties.
These new phages may then serve as important vehicles in the maintenance of genetic
diversity and exchange among V. cholerae strains.
Our observations indicate that 493 may participate in horizontal transmission of genetic
information (at least under laboratory conditions). Homologous DNA was detected, both
chromosomally and extrachromosomally, in infected strains. Infection is also accompanied by
expression of an - 18 kDa protein in boh El Tor and 0 139 strains which were previously nonhybridizing, and by marked alteration in colonial morphology of infected strains (Fig. 2).

Homologous DNA is widely, but not universally, distributed among 0139 but not 01 strains
(Table 2; Fig. 4). It is not yet clear, from our observations, why 0139 strains are
heterogeneous in their content of 493 homologous DNA sequences or whether 493 could
have been involved in the evolution of 0139. It is not unlikely that a 493-like phage was
involved. We should take note that 493 DNA alsohybridized with a non-01 (031) strain
(NRT36S) which was isolated before 0139 was recognized. NRT36S also produces a phage
which can infect El Tor strains with low efficiency (results not shown).
The fact that 493-related sequences existed in non-01 vibrios prior to the emergence of 0139
suggests the possibility of a cause/effect relationship. However, NRT36S does not react with
anti-0139 antiserum (Sengupta et al., 1996) (results not shown) so it is not a progenitor strain
for either 0 139 somatic antigen or capsule. Other strains and species which are serologically
cross-reactive (Isshiki et al., 1996; Knirel et al., 1996) have not yet been examined for DNA
homologies, but filamentous phages such as 493 could provide a mechanism for horizontal
transmission of the essential genetic information. While it is unusual that 0139 emerged with
epidemic capability, such genetic exchange may be more common than previously
recognized.

Munculnya dan peningkatan pesat untuk dominasi Vibrio cholerae 0139 di India dan
Bangladesh pada tahun 1992 menyebabkan pertimbangan bahwa choleraphage bisa berfungsi
baik sebagai mekanisme selektif dan sarana untuk transmisi horisontal informasi genetik.
Sebuah fag filamen '493' dari 0139 regangan AJ27-493 telah dimurnikan dan sebagian
ditandai. fag itu tidak aktif pada biotipe klasik V. cholerae 01 tapi itu aktif di strain biotipe El
Tor terisolasi sebelum 1994 ketika E l Tor kembali muncul di Bangladesh. Lebih E terbaru
isolat l Tor semua resisten terhadap fag. fag yang juga aktif di 0139 strain. Tidak seperti
berserabut -4, reseptor untuk 493 tidak TCPA. Fag genom adalah 9 3 kb ditutup melingkar
molekul untai tunggal yang mengandung 0,4 kb untai ganda batang mendukung 2 kb
lingkaran untai tunggal. Sebuah fragmen 283 bp dikloning dan digunakan sebagai probe
hibridisasi Southern, secara paralel dengan jumlah phage 493 DNA. Probe ini hibridisasi baik
kromosom dan extrachromosomally dengan kebanyakan 0139 strain, tapi tidak dengan 01
strain. Infeksi hibridisasi-negatif E l Tor atau 0139 strain mengakibatkan adanya hibridisasi
lokus (baik plasmid dan kromosom), dalam penampilan 18 protein kDa, dan perubahan
ditandai dalam morfologi kolonial. Fag 493 jelas berbeda dari 0139 choleraphages lain yang
telah dijelaskan. Fag 493 DNA hibridisasi dengan dikemas non-01 (031) galur (NRT36S)
yang diisolasi sebelum 0139 diakui. NRT36S juga menghasilkan fag yang dapat menginfeksi
strain El Tor dengan efisiensi yang rendah. Penelitian lebih lanjut dapat mengungkapkan
apakah bakteriofag berperan dalam munculnya dan teritorial dari vibrio choleragenic baru.
PENGANTAR
Sampai tahun 1992, dari sekitar 140 Vibrio cholerae serogrup hanya strain serogrup 01 yang
diketahui menyebabkan epidemi kolera, sementara non-01 strain yang kadang-kadang
dikaitkan dengan kasus sporadis diare. Pada tahun 1992, non-01 V. cholerae serogrup baru,
0139 (syn. Bengal), muncul di India dan Bangladesh, menggusur warga 01 El Tor biotipe dan
menyebabkan epidemi besar kolera yang menunjukkan tanda-tanda penyebaran (Albert,
1994) . Namun, 01 El Tor biovar kembali muncul dan lagi dominan di India dan Bangladesh
(Sharma et al., 1997). The 0139 serogrup erat terkait dengan 01 El Tor biovar (Kaper et al.,
1995) tetapi ada perbedaan penting. V. cholerae 0139 tidak memiliki Ol-specific antigen dan
mengungkapkan kapsul polisakarida sebagai akibat dari penggantian 01 antigen RFB lokus
DNA oleh eksogen DNA encoding 0139 sintesis antigen dan kapsuler polisakarida (Bik et al,
1995;. Stroeher et al,. 1995). Mekanisme yang bertanggung jawab untuk substitusi DNA ini
belum diidentifikasi. 0139 juga mengungkapkan hemaglutinin mannose-sensitif yang
merupakan karakteristik dari El Tor biotipe (Albert, 1994). Munculnya, peningkatan pesat
untuk dominasi dan penurunan berikutnya dari V. cholerae 0139 membawa kita untuk
mempertimbangkan choleraphage baik sebagai mekanisme selektif dan sarana untuk
transmisi horisontal informasi genetik. bakteriofag beriklim sedang dan berserabut (Kar et al,
1996;. Pajni et al, 1995a;. Reid1 & Mekalanos, 1995) sebelumnya telah diidentifikasi dalam
V. cholerae 0139. choleraphages beriklim dapat mengintegrasikan secara acak ke dalam
kromosom V. cholerae, memediasi transduksi umum (Rowe & Frost, 1992), berpartisipasi
dalam transfer gen horizontal dan mengubah berbagai karakteristik host (Mitra, 1989;
Siddiqui & Bhattacharyya, 1987). Sehubungan dengan sifat ini, kami menyoroti pengamatan
yang lebih tua (Gay, 1935) di mana Pasricha, de Monte dan Gupta ditemukan pada tahun

1931 bahwa 20% dari serangkaian 355 non-agglutinatable (yaitu non-01) vibrio air yang
lysable kolera bakteriofag . Dalam beberapa kasus, budaya sekunder, yang muncul setelah
lisis, yang agglutinatable dengan kolera antiserum, memiliki sebuah agglutinogen sangat
ampuh untuk organisme kolera benar (yang budaya orang tua tidak memiliki) dan benarbenar menyerap aglutinin dari antiserum kolera benar .. . "pengaruh fag telah, kemudian,
menambahkan agglutinogen dengan struktur antigenik dari ketegangan, dan membawa
ketegangan dalam apa yang tampaknya menjadi hubungan serologis dekat dengan V.
cholerae. '
Dalam laporan ini, kami mencirikan choleraphage filamen baru, dari V. cholerae 0139 saring
A 527-493 ( '493'), yang dapat menginfeksi serovar yang berbeda dan biotipe dan
mengintegrasikan ke dalam kromosom. kemampuannya untuk menghambat semua tapi strain
El Tor terbaru menunjukkan bahwa hal itu bisa memainkan peran dalam vibrio teritorial, dan
kemampuannya untuk mengintegrasikan kromosom dan ada extrachromosomally
menyediakan mekanisme potensial untuk transmisi horisontal informasi genetik.
METODE
strain bakteri.
Tiga puluh tiga V. cholerae 0139, 46 V. cholerae 01 biotipe El Tor, 10 V. cholerae 01 klasik,
salah satu atipikal 01 galur, M 0 1 (Pajni et al., 1995b), dan non-01031 regangan NRT36S
(Tabel l), Vibrio parahaemolyticus, Vibrio hollisae, Vibrio vulnificus, Vibrio fluvialis, Vibrio
harveyi dan Aeromonas ( 'Vibrio') damsela yang digunakan dalam penelitian ini. Dari jumlah
tersebut, serangkaian hati-hati dikumpulkan dan diawetkan segar 0139 dan 01 El Tor V.
cholerae isolat dari Bangladesh, diperoleh 1993-1996 dari J. Albert (Pusat Internasional untuk
Penyakit Diarrhoea1 Penelitian, Dhaka, Bangladesh), yang liofilisasi dari pertumbuhan
konfluen melesat dari koloni primer dari kotoran pasien pada TCBS agar (Oxoid). Tidak
seperti budaya saham lainnya (Finkelstein et al., 1997), ini adalah kolonial homogen. budaya
lain berasal dari ATCC, J. Johnson (VA Medical Center, Baltimore, MD, USA), J. Mekalanos
(Harvard Medical School, Boston, MA, USA), GB Nair (National Institute of Cholera dan
enterik Penyakit, Calcutta, India ), Y. Takeda (International Medical Center of Japan, Tokyo,
Jepang), R. Taylor (Dartmouth Medical School, Hanover, NH, USA), K. Wachsmuth (Pusat
Pengendalian dan Pencegahan Penyakit, Atlanta, GA, USA) dan koleksi laboratorium kami
(University of Missouri, MO, USA). Morfologi koloni dan opacity dievaluasi seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Finkelstein et al., 1997). Untuk mengevaluasi peran potensial TCPA
sebagai reseptor (Waldor & Mekalanos, 1996) untuk fag 493, ToxR- mutan dari A 527-493
yang dibuat sesuai dengan modifikasi dari teknik dijelaskan sebelumnya (Waldor &
Mekalanos, 1994). Untuk tujuan ini, kami menggunakan EcoRI 630 bp fragmen internal toxR
berlabel digoksigenin sebagai probe untuk konfirmasi integrasi yang benar pVM55 (Miller &
Mekalanos, 1988). R. Taylor juga murah hati memberikan regangan KHT52, mutan AtcpA
(Thelin & Taylor, 1996).
teknik Choleraphage.

Untuk isolasi fag, V. cholerae 0139 regangan AJ27-493 ditumbuhkan dalam 500 ml LB di 21
labu Erlenmeyer selama 48 jam pada 37 "C dengan gemetar (100 r.p.m.). partikel fag gratis
dikumpulkan setelah menghapus sel-sel dengan sentrifugasi pada 10000 g selama 20 menit
dan 20000 g selama 20 menit, dan kemudian filtrasi dari supernatan melalui filter
nitroselulosa 12:02. Untuk persiapan asam nukleat dan mikroskop elektron (EM), phage
pellet dari filtrat dengan ultrasentrifugasi di 300000g selama 3 jam dan diresuspensi dalam
buffer (10mm Tris / HCl, 10mm CaCl ,, 10 mM MgCl ,, 10 mM NaCl, pH 7,4 ). Untuk
inaktivasi panas, aliquot dari filtrat ditempatkan dalam bak air pada berbagai suhu selama 5
dan 10 menit; resistensi pH diuji dengan mengubah pH dalam aliquot dari filtrat selama 5
menit kemudian menyesuaikan kembali ke pH 7. sensitivitas Kloroform juga dievaluasi.
tingkat kelangsungan hidup fag dan sensitivitas strain untuk fag ditentukan oleh
penghitungan plak. Aliquot (0,01 ml) dari pengenceran serial sampel fag yang mengandung
berlapis pada lembut LB agar (0,4%) overlay unggulan dengan strain indicator. Hamparan
disusun oleh inokulasi 5 ml 0,4% LB agar dengan 10 pl sel lo8 N- per budaya ml dari strain
indikator tumbuh selama 3 jam dalam LB broth pada 37 "C dengan gemetar.
metode analisis DNA.
Total DNA disiapkan oleh lisis alkali dengan vortexing menggunakan kit RPM (BiolOl).
Virion DNA diekstraksi menurut Sambrook et al. (1989). Plasmid DNA dibuat menggunakan
Wizard Ditambah sistem SV Miniprep (Promega). digestions enzim dilakukan seperti yang
direkomendasikan oleh produsen (Biolab dan Boehringer Mannheim). fragmen DNA
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa di TAE penyangga (Sambrook et al., 1989).
Pelabelan probe DNA dan hibridisasi Southern dilakukan menggunakan sistem Genius
(Boehringer Mannheim). Untuk kloning fragmen DNA fag, pCR-Script Amp SK (+) Kloning
kit (Stratagen) digunakan.
EM.
sampel bakteriofag yang mengandung diencerkan dalam 2 '/ o amonium molibdat (pH 6,5),
diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar dan dipasang pada serves Parlodioncoated grid
seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Garon (1982). Modifikasi formamida dari teknik
Kleinschmidt (Garon, 1986) digunakan untuk mikroskopi DNA. Grid diperiksa di Philips
CM-10 mikroskop elektron transmisi.
SDSPAGE.
Olahan dari total protein sel dianalisis pada 10 '/ o SDS poliakrilamida gel seperti yang
dijelaskan sebelumnya oleh Laemmli (1970) dan divisualisasikan dengan pewarnaan perak
(Bio-Rad).
HASIL
Choleraphage 493
Setelah pemeriksaan pendahuluan dari beberapa V. cholerae 0139 strain, saring A 527-493,
satu koloni hati-hati diawetkan mengisolasi dari Bangladesh pada tahun 1994, dipilih untuk

studi lebih lanjut. Itu tumbuh selama 48 jam dan supernatan budaya dikumpulkan untuk
identifikasi fag ( '493'). Untuk mengkonfirmasi bahwa persiapan tidak mengandung sel-sel
bakteri yang layak, supernatan yang melesat di LB piring agar yang diinkubasi semalam pada
37 "C. EM dari fag 493 mengungkapkan sifat berserabut dari partikel dengan lebar sekitar 2,6
nm dan variabel panjang (Gambar. la). dalam beberapa persiapan, salah satu ujung fag
muncul untuk membawa serat ramping. fag itu tahan terhadap nilai pH 2,8-11,8 dan
perlakuan panas hingga 60 "C selama 10 menit, tapi itu benar-benar dilemahkan pada 75 "C
dan dengan pengobatan kloroform. Plak-membentuk kemampuan peka terhadap enzim
proteolitik (chymotrypsin, pronase A, proteinase K dan tripsin) dan tahan terhadap lisozim.
The fag genom adalah tahan terhadap RNase tapi benar-benar dicerna oleh DNase 1. analisis
EM (Gambar. lb) menunjukkan bahwa genom bakteriofag 493 adalah sekitar 9-3 kb untai
tunggal lingkaran tertutup DNA molekul yang mengandung 0,4 kb untai ganda batang
mendukung 2 kb lingkaran untai tunggal.
Setelah pencernaan parsial DNA virion dengan HaeIII, fragmen 283 bp, putatively dari
daerah induk, kloning ke situs SrfI dari SK pCR-Script (+) vektor Amp untuk menghasilkan
pEAJ46, yang kemudian digunakan sebagai probe. 283 bp fragmen tidak homologi DNA
untuk urutan dikenal di GenBank. Bentuk-bentuk replikatif beruntai ganda DNA fag diisolasi
dari strain tuan rumah yang dicerna dengan beberapa endonuklease. pengobatan EcoRI
bersukaria hanya sebuah fragmen tunggal; yang HindIII digest menghasilkan dua fragmen
sekitar 2,3 dan 7 kb; ada situs yang ditemukan untuk XhoI, PstI, EcoRV atau BamHI.
Tuan rumah berbagai choleraphage 493
Dalam lembut tes overlay agar dengan strain indikator (Tabel I), supernatan strain 493 yang
mengandung 1Ol1 p.f.u. ml- 'diproduksi plak keruh pada 32 dari 33 strain 0 139, pada 31 dari
46 strain 01 biotipe El Tor dan atipikal-01 galur M01, tapi tidak pada encapsulated 031
regangan NRT36S tersebut. Dengan klasik biotipe 01 strain, penghambatan pertumbuhan,
tetapi tidak pembentukan plak, jarang ohserved dan kemudian hanya dengan murni 493
(Tabel 1). Menariknya, strain biotipe El Tor yang tahan api untuk lisis dengan phage 493
diisolasi dari Bangladesh pada tahun 1995-1996, ketika strain El Tor yang lagi dominan
(Faruque et a /, 1996;. Pusat Internasional untuk Penyakit Diarrhoea1 Penelitian, Bangladesh,
1996 ;. Sharma et al, 1997), dan satu strain (dari lima diuji) diisolasi pada tahun 1994. opacity
Colonial atau tembus tidak berpengaruh. spesies vibrio lainnya diuji, termasuk strain wakil
dari V. fluvialis, V. harveyi, V. hollisize, V. parahaemolyticus dan V. uulnificus dan A.
damsrlu, resisten.
Infeksi oleh choleraphage
Fag 493 adalah sedang. Sel-sel yang tumbuh dijemput dari pusat plak dan melesat untuk
koloni tunggal. Pemeriksaan Stereoscopic koloni ini menggunakan ditransmisikan iluminasi
miring (Finkelstein et al., 1997) mengungkapkan bahwa perubahan yang nyata dalam
morfologi kolonial terjadi sebagai akibat dari infeksi dengan fag 493 (Gambar. La, b). Koloni
menjadi hypervariable di kedua opacity dan ukuran. Lainnya 0139 dan El Tor strain diperiksa
memberikan hasil yang sama. Semua strain yang terinfeksi dan varian kolonial diuji
menghasilkan DNA fag. Plasmid DNA dari strain ini dibandingkan sebelum dan setelah

infeksi. Dalam semua strain yang terinfeksi, hibridisasi elemen ekstrakromosomal terlihat
yang tidak hadir sebelum paparan 493 fag. hibridisasi Southern total DNA dari strain tersebut
dengan DNA virion (Gambar. 3) menunjukkan adanya urutan homolog dengan DNA fag di
kedua kromosom dan lokus ekstrakromosomal.
Total dan DNA plasmid persiapan dari hibridisasi strain dicerna dengan beberapa enzim
restriksi menjadi sasaran blot Southern analisis menggunakan DNA virion sebagai probe.
Analisis ini mengungkapkan adanya sebuah situs EcoRI tunggal di fag RF DNA (plasmid)
yang dibuktikan dengan band hibridisasi tunggal 9,3 kb. Namun, dalam persiapan DNA total,
fragmen 9,3 kb ini ditumpangkan pada tangga fragmen restriksi kromosom (data tidak
ditampilkan). Pola kromosom hibridisasi adalah sugestif dari sisipan acak fag seperti yang
telah ditunjukkan dengan phage VSK (Kar et al., 1996). Semua sel yang terinfeksi mampu
menghasilkan partikel fag. Perbandingan total profil protein dengan SDS-PAGE
mengungkapkan protein 18 kDa di strain yang terinfeksi Peru 6707 dan AJ27-404 (terpilih
sebagai contoh strain non-hibridisasi; Tabel 2) (hasil tidak ditampilkan). Fag dari 0139
regangan PO7 memiliki efek yang agak berbeda pada morfologi koloni dari 493 (Gambar.
2c). Meskipun koloni terinfeksi PO7 phage yang hypervariable berkaitan dengan opacity,
tidak seperti strain +% terinfeksi, ukuran koloni lebih seragam. Perlu dicatat bahwa
sensitivitas strain indikator infeksi fag meningkat setelah ayat-ayat kaldu tambahan dan
bahwa budaya hanya muda dari strain indikator yang sensitif terhadap fag dalam uji overlay;
budaya semalam resisten (hasil tidak ditunjukkan). Ini mungkin berhubungan dengan
ekspresi reseptor fag.
Distribusi 493--fag terkait urutan
DNA virion hibridisasi dengan 21 dari 32 0139 strain diperiksa (Tabel 2; Gambar 4.).
hibridisasi Southern dilakukan berulang kali dengan kedua persiapan DNA total dan plasmid
dan hasilnya dirangkum pada Tabel 2. Perbedaan dapat dilihat pada pola hibridisasi antara 0
139 isolat dari tahun yang sama dan lokasi yang sama (Gambar. 4). Menariknya, DNA
homologi - baik plasmid dan kromosom - diamati dengan capsulated 031 regangan, NRT36S,
terisolasi di Bandara Narita, Jepang, sebelum 1990 (Johnson et al, 1992.). Tidak ada DNA
homolog untuk fag itu ditemukan di salah satu 16 01 serogrup El Tor atau strain biotipe
klasik diisolasi pada waktu yang berbeda atau tempat, atau ketegangan M01 (Tabel 2). Tidak
ada homologi diamati pada strain perwakilan dari spesies vibrio lainnya (lihat di atas).
pEAJ46 juga digunakan sebagai probe untuk mendeteksi fag 493 urutan dalam strain
tersebut. Dalam kondisi keketatan rendah (. Litwin et al, 1992), spektrum hibridisasi adalah
sama seperti yang terlihat dengan jumlah phage 493 DNA sebagai probe; Namun, dengan
keketatan tinggi, hanya sel yang terinfeksi dengan fag memberi sinyal positif. Oleh karena
itu, meskipun fag 493 DNA ditemukan didistribusikan secara luas di antara 0.139 (tapi tidak
01) vibrio, beberapa variabilitas ada di urutan nya.
fag lainnya
Fag 493 bukan satu-satunya fag kami telah mengamati dalam koleksi kami. 0139 regangan
P07, terisolasi di India pada tahun 1993, menghasilkan baik fag filamen, VSK, yang sebagian
telah ditandai, dan kappa-jenis fag (Kar et al., 1996). Dalam penelitian ini, ketegangan PO7

DNA terbukti berhibridisasi dengan DNA total dari fag 493 (Tabel 2) tetapi tidak dengan
pEAJ46 penyelidikan spesifik berasal dari fag 493 (Gambar. 5).
Cari 493 fag reseptor
Karena TCPA ditunjukkan untuk menjadi reseptor untuk ctx4 berserabut, kami meneliti
kemungkinan bahwa TCPA juga bisa menjadi reseptor untuk 493. TCPA diketahui berada di
bawah kendali ToxR (Waldor & Mekalanos, 1994). Tiga mutan ToxR- independen diperoleh
dengan integrasi plasmid pVM55; fenotip mutan tersebut dikonfirmasi oleh analisis SDSPAGE seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Waldor & Mekalanos (1994). Mutan ini,
selain AtcpA mutan KHT52, yang sama-sama sensitif terhadap 493 sebagai mereka tipe liar
tua, yang mengindikasikan bahwa TCPA tidak terlibat.
DISKUSI
The vibrio yang menyebabkan wabah kolera memiliki kemampuan yang sangat maju untuk
menyajikan masalah baru dan menantang bagi mereka yang akan mempelajari mereka.
Mereka juga kelompok yang sangat dilestarikan. Lebih dari 150 serotipe V. cholerae kini
telah diidentifikasi tetapi, sampai 1961, sejauh yang kita tahu, semua wabah kolera
disebabkan oleh hanya dua serotipe, Inaba dan Ogawa, 0 golongan 1 dari biotipe klasik
pertama kali dijelaskan oleh Robert Koch pada tahun 1883 (Anonim, 1883). Pada tahun 1961,
biotipe El Tor (pertama kali diakui pada tahun 1905) muncul, mungkin dari Indonesia (de
Moor, 1939), menyebabkan apa yang dianggap sebagai pandemi kolera besar ketujuh. Perlu
dicatat bahwa pasien kolera di India sebelum 1964 memiliki klasik 01 sedangkan, pada tahun
1965, 89O / 0 2000 strain yang diuji fag-diketik sebagai El Tor (Mukerjee, 1974). Bagaimana
'baru' El Tor biotipe menggantikan biotipe klasik dari rumah di India? Demikian pula, pada
tahun 1992, 0139 serotipe muncul di India dan Bangladesh dan segera kalah jumlah, untuk
sementara waktu, warga El Tor biotipe yang, selain dari hilangnya 01 antigen dan keuntungan
dari kapsul, itu sangat mirip. Bagaimana 0.139 timbul (dari El Tor?) Dan bagaimana hal itu
mendapatkan - dan kemudian kehilangan - kekuasaan? Kami tertarik pada kemungkinan yang
choleraphage (s) bisa memainkan peran penting dalam transmisi horizontal informasi genetik
dan manifestasi dari 'perang bakteriologis' yang terjadi.
Sejumlah besar choleraphages, sebagian besar orang-orang litik, sebelumnya telah
diidentifikasi dan berguna dalam membedakan biotipe dan mengetik strain cholerae V.
(Guidolin & Manning, 1987). Lain, termasuk isolat terbaru dari 0139 strain, telah dikaitkan
dengan: (a) virulensi (Parker et al, 1970; Takeya & Shimodori 1963.); (B) induksi
toxinogenesis (Siddiqui & Bhattacharyya, 1987); dan (c) biotipe transisi (Mitra, 1989). Barubaru ini, Waldor & Mekalanos (1996) telah menunjukkan bahwa 'virulensi kaset' dari vibrio
choleragenic dilakukan oleh fag filamen kromosom terpadu menggunakan TCPA sebagai
reseptor. Hacker et al. (1997) baru-baru ini telah diringkas peran potensial dari bakteriofag di
transfer gen horizontal terlibat dalam 'patogenisitas pulau' dari bakteri patogen lainnya.
Pada penelitian ini, kami telah menemukan bahwa 0.139 strain menghasilkan bakteriofag
yang bisa terlibat dalam pertukaran genetik horizontal dan bisa memberikan beberapa
keuntungan selektif. Satu fag (493) dipilih untuk studi ekstensif. Fag 493 adalah fag filamen

lisogenik yang menghasilkan plak keruh dan memiliki karakteristik yang mirip dengan fag
berserabut lainnya (Rasched & Oberer, 1986). Hal ini cukup termostabil dan tahan terhadap
berbagai pH, tetapi sensitif terhadap kloroform dan agen proteolitik. Seperti fag berserabut
lainnya, ia memiliki DNA melingkar untai tunggal tertutup tetapi beberapa molekul memiliki
- 2,3 kb struktur stem loop (Gambar l b.) Yang bisa mewakili elemen transposabel. Struktur
ini tidak diamati dalam fag VSK filamen baru-baru dijelaskan dari V. cholerae 0139 (Kar et
al., 1996). Dua serat mengingatkan serat lampiran non-filamen fag (Fraenkel-Conrat, 1985)
divisualisasikan di salah satu ujung beberapa partikel (tidak ditampilkan).
Infeksi dan propagasi dari fag 493 dalam sel inang tidak terpengaruh oleh TCPA penghapusan
atau mutasi toxR. Oleh karena itu, komponen ToxR-diatur dapat dikecualikan sebagai
diperlukan untuk infeksi aktif (attachment, entri, replikasi, perakitan, dll), meskipun kita tidak
bisa mengesampingkan kemungkinan bahwa beberapa komponen tersebut konstitutif pada
tingkat rendah di ToxR - insersional mutan. Pentingnya TCPA sebagai reseptor fag dapat
kategoris dihilangkan, sehingga jelas membedakan fag ini dari ctx4 fag berserabut dijelaskan
sebelumnya (Waldor & Mekalanos, 1996). Data awal menunjukkan bahwa jenis pilus IV lain,
hemaglutinin mannose-sensitif, mungkin reseptor untuk fag 493 (work in progress).
fag memiliki spektrum yang menarik dari kegiatan (Tabel 1). Semua kecuali satu dari 33
strain 0139 yang sangat sensitif. Tiga puluh satu dari 46 strain 01 biotipe El Tor diuji sensitif.
Pengamatan bahwa hanya baru-baru ini isolat El Tor resisten menimbulkan kemungkinan
bahwa choleraphage seperti 493 bisa memainkan peran penting dalam munculnya dan
penurunan berikutnya 0139 di India dan Bangladesh. Peran potensial choleraphage dalam
evolusi epidemi strain cholerae V. diringkas terakhir dengan Mooi & Bik (1997). Harus
diakui bahwa perubahan populasi yang dramatis - El Tor lebih biotipe klasik sejak tahun 1961
dan 0139 lebih dari El Tor pada tahun 1992 (dan belakang) - harus bergantung pada
kemampuan strain menyerang mengerahkan manfaat kelangsungan hidup lebih unggul di atas
strain penduduk di lingkungan. Menyadari bahwa bakteri yang terinfeksi tunggal bisa
menghasilkan ratusan partikel fag, fag bisa memainkan peran dengan mengurangi kuantum
infeksi penduduk regangan fag-sensitif dalam lingkungan sementara strain menyerang
merambat. Munculnya fag-tahan El Tor biotipe di Calcutta baru-baru ini menunjukkan
bertepatan dengan munculnya ribotype yang sampai sekarang belum dari 01 El Tor (Sharma
et al., 1997).
Kemampuan untuk menginfeksi dan hidup berdampingan dalam sel yang sama ditunjukkan
dengan fag 493 dan P07. Hal ini jelas bahwa PO7 terkait dengan 493 karena urutan lintas
hibridisasi terkandung dalam genom mereka (Gambar. 4). Namun, dua fag memiliki beberapa
perbedaan yang dibuktikan dengan pengamatan yang PO7 DNA tidak berhibridisasi untuk
pEAJ46 berasal dari 493 dan P07- dan 493-terkait plasmid memiliki pola migrasi berbeda
pada gel agarosa (Gambar. 6). Observasi ini, diambil bersama-sama, meningkatkan prospek
menarik dari pertukaran genetik konstan antara fag 493-terkait, sehingga menghasilkan 'baru'
fag dengan sifat yang sedikit berbeda. Ini fag baru kemudian dapat menjadi kendaraan
penting dalam pemeliharaan keragaman genetik dan pertukaran antara strain cholerae V..

pengamatan kami menunjukkan bahwa 493 dapat berpartisipasi dalam transmisi horizontal
informasi genetik (setidaknya di bawah kondisi laboratorium). Homolog DNA terdeteksi,
baik kromosom dan extrachromosomally, di strain yang terinfeksi. Infeksi ini juga disertai
dengan ekspresi dari - 18 kDa protein dalam boh El Tor dan 0 139 strain yang sebelumnya
non-hibridisasi, dan dengan perubahan ditandai dalam morfologi kolonial strain yang
terinfeksi (Gambar 2.). DNA homolog secara luas, tetapi tidak universal, didistribusikan di
antara 0.139 tapi tidak 01 strain (Tabel 2;. Gambar 4). Hal ini belum jelas, dari pengamatan
kami, mengapa 0139 strain heterogen dalam konten mereka dari 493 urutan DNA homolog
atau apakah 493 bisa terlibat dalam evolusi 0139. Hal ini tidak mungkin bahwa fag 493seperti terlibat. Kita harus perhatikan bahwa 493 DNA alsohybridized dengan (031) strain-01
non (NRT36S) yang diisolasi sebelum 0139 diakui. NRT36S juga menghasilkan fag yang
dapat menginfeksi strain El Tor dengan efisiensi yang rendah (hasil tidak ditunjukkan).
Fakta bahwa 493 terkait urutan ada di non 01-vibrio sebelum munculnya 0139 menunjukkan
kemungkinan hubungan sebab akibat / pengaruh. Namun, NRT36S tidak bereaksi dengan
anti-0139 antiserum (Sengupta et al., 1996) (hasil tidak ditampilkan) sehingga tidak strain
progenitor untuk baik 0 139 antigen somatik atau kapsul. strain dan spesies lainnya yang
serologis cross-reaktif (Isshiki et al, 1996;.. Knirel et al, 1996) belum diperiksa untuk
homologi DNA, tetapi fag berserabut seperti 493 bisa menyediakan mekanisme untuk
transmisi horizontal penting informasi genetik. Sementara itu tidak biasa bahwa 0139 muncul
dengan kemampuan epidemi, pertukaran genetik tersebut mungkin lebih umum dari
sebelumnya diakui.