3.

2 DETERMINACION DE PPTIDOS SOLUBLES

3.2.1 DETERMINACIN A 280nm
La absorcin mxima de protenas a 280 nm se produce debido a la
presencia de aminocidos aromticos como tirosina y triptofano. Estos
aminocidos estn presentes en todas las protenas de la leche.
Esta determinacin se realiz de la siguiente manera:
1. Despus de homogenizar la muestra se transfirieron 6 mL de esta mezcla a
tubos para centrfuga, se centrifugaron a 18,000 rpm a 4C por un tiempo
de 15 min.
2. Se pusieron 2 mL del sobrenadante en celdas de cuarzo y se tom lectura a
280nm, en un espectrofotmetro Shimadzu UV-160A.
3.2.2 DETERMINACIN POR MTODO DE LOWRY
Se utiliz la tcnica de Lowry, (Lowry y col., 1951), la cual se basa en la reaccin
del pptido con Cu++ en condiciones alcalinas para formar Cu+ (Reaccin de
biuret) y de la produccin del cido fosfomolibdato fosfotngstico (reactivo de
Folin) por aminocidos aromticos. La preparacin de los reactivos se decribe en
el Apndice 1.
La tcnica se llev a cabo de la siguiente manera:
1. Se mezclaron 50mL de reactivo A ms 1mL del reactivo B y 1mL del
reactivo C (ver apndice 1 para descripcin de reactivos).

2. Se tomaron 5 mL de la mezcla anterior y se adicion 1 mL de las muestras

preparadas.
3. Se dej reposar diez min en la oscuridad.
4. Se agregaron 0.5 mL de reactivo D.
5. Se dej reposar 30 min en la oscuridad.
6. Las muestras se leyeron en el espectrofotmetro (Shimadzu UV-160A) a
una longitud de onda de 590 nm, contra un blanco de reactivos y agua.
La concentracin de pptidos se determin comparando las absorbancias
contra una curva patrn de seroalbmina (SA) con un intervalo de 0 a 500 gSA/mL
P(gSA/mL)= (Abs590-0.04351)/0.002008
R=0.9909

3.3 SEPARACIN DE PPTIDOS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA TRICINA-SDS (TSDS-PAGE)
Este mtodo es una modificacin del sistema de la tricina-base de Shgger y von
Jagow (1987) por que fue diseado para la mejor resolucin de protenas de bajo
peso molecular en un rango menor de 10 kDa (Apndice 2).
3.3.1 PREPARACION DE LAS MUESTRAS.
Se tomaron 4 mL de muestra y se centrifugaron a 18000 rpm por 15 min,
para con esto separar los componentes ms pesados de la muestra y mejorar la
resolucin de las bandas en el gel. El sobrenadante se deposit en ampolletas
para ser liofilizado a -50C y con un vaco de 133X10 -3 mbar en una liofilizadora
Labconco DrySystem/Freezone 4.5. El liofilizado resultante se resuspendi en
100l de agua desionizada, se tom una alcuota de 40L y se deposit en viales

de 1mL, se agregaron 20L de buffer de corrida con -mercaptoetanol, se

incubaron por 30 min a 40C. Al trmino de la incubacin se depositaron las
muestras en cada uno de los carriles formados de los geles de acrilamida.
3.3.2 FIJACIN Y TEIDO DE LOS GELES DE ELECTROFORESIS.
Para fijar los pptidos se sumergieron los geles en una solucin de 50%
metanol y 10% cido actico por una hora. Se sumergieron en una solucin de
Sypro orange de Bio-Rad (5l de sypro en 25mL de cido actico 7.5%), por
espacio de 30min, se enjuagaron con agua desionizada, para tomar imagen en
Gel-Doc 100 de Bio-Rad.
3.3.3 DETERMINACIN DE
CONSTRUCCIN

DE

PESO MOLECULAR, CONCENTRACIN Y

PERFIL

DE

PPTIDOS

DE

LECHES

FERMENTADAS.
Se utiliz como patrn de peso molecular conocido, una preparacin directa
de proveedor (BIO-RAD), este se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Pesos moleculares de los pptidos del patrn de amplio rango de pesos
moleculares (Bio-Rad)

PROTENA
Miosina
-galactosidasa
Fosforilasa b
Seroalbmina
Ovalbmina
Anhidrasa carbonica
Inhibidor de tripsina
Lisozima
Aprotinina

PESO MOLECULAR (Da)

200,000
116,250
97,400
66,200
45,000
31,000
21,500
14,400
6,500

De la imagen de los geles en GelDoc de Bio-Rad se calcul el Rf de las

bandas separadas. A partir de los Rf de cada uno de los pptidos teidos, se
realiz una extrapolacin siguiendo la ecuacin de la recta

generada para el

patrn de pesos moleculares. Con estos datos se gener una curva patrn. La
grfica de Rf contra log del PM del patrn de pesos moleculares, se observa en el
Apndice 3. Se obtuvo la siguiente ecuacin:

Rf= (log PM-5.2114)/-1.7512

R=0.9459
Para la determinacin de la concentracin de pptidos, se tom como
referencia la -LG que se inyect, 1mg/ml. Con el software Molecur Analyst de
Gel-Doc se determin el rea generada por las bandas de la separacin de -LG
en el gel. Las reas calculadas de los pptidos se compararon con las de -LG,
para determinar su concentracin.
Con la imagen capturada en el Gel-Doc, se construy el perfil de pptidos.
Despus de haber obtenido los perfiles de todos los productos, las grficas se
sobrepusieron para determinar coincidencias entre pptidos generados en cada
uno de estos productos.