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Laboratorio
de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
PRLOGO.
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de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
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PRCTICA No. 1
Revisin de la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Proteccin ambiental
Proteccin Salud - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Manejo y
especificaciones.
OBJETIVO.
Comprender los fundamentos y particularidades de la NOM-087-SEMARMAT-SSA12002, para conocer la importancia de su cumplimiento en el laboratorio.
INTRODUCCIN.
En la antigua Grecia, concretamente en los escritos de Hipcrates, ya se haca patente
la importancia de la salud como representacin de la unidad del ser humano con su
entorno, es decir; que para alcanzar y conservar la salud se tendra que respetar y
conservar el medio ambiente.
Cumplir con tal propsito ha representado un verdadero reto y ha significado la
aplicacin de las ms diversas tcnicas y estrategias para dar solucin a esta
problemtica.
En Mxico durante la poca de la Colonia, ya se aplicaban medidas para evitar la
propagacin de la viruela durante la epidemia que ocurri en esos aos. Para evitar la
transmisin de la infeccin, se orden poner cal viva adentro de los atades de los
cadveres de los enfermos y posteriormente enterrarlos.
En 1847, el mdico Ignaz Semmelweis concluy que la principal causa de las fiebres
puerperales era la exploracin de las pacientes realizada por estudiantes de medicina
cuyas manos estaban impregnadas de los restos de las autopsias de las fallecidas, la
mayora por la misma enfermedad. Con estas observaciones se instituy que los
mdicos deban incorporar a su prctica la obligacin del lavado de manos a fin de
eliminar los residuos infecciosos.
Entre 1980 y 1990 se da el surgimiento de la epidemia del SIDA a nivel mundial, suceso
con el que se pone de manifiesto que deban emprenderse acciones en materia de los
desechos slidos de los hospitales como riesgos potenciales para la salud. El factor
detonante de tal necesidad surge tras el hallazgo de jeringas en playas tursticas de la
Costa este de Estados Unidos, los medios de comunicacin publicaron la noticia
suponiendo que los desechos provenan de hospitales y solicitaron se tomaran medidas
preventivas ante el grave problema de riesgo de contagio de SIDA, hepatitis y otras
infecciones originadas en los centros de atencin mdica.
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de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
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2. Contenedores de RPBI.
4. Agujas de Vacutainer.
6. Algodn.
METODOLOGA.
1. Realizar dibujos de los diversos contenedores y bolsas empleadas en el envasado de los
RPBI.
CUESTIONARIO.
1. Cul es el nombre completo de la Norma Oficial Mexicana en vigencia, que se revis
durante la prctica?
2. En qu radica la importancia de sta Norma Oficial Mexicana, y por qu el personal del
rea de la salud debe conocerla y cumplirla?
3. Qu significan las siglas RPBI?
4. Mencionar de acuerdo a sta NOM, la clasificacin general de los RPBI y el tipo de
envasado para cada uno de ellos.
5. Cules son las Secretaras y a su vez, las instancias de gobierno responsables de
vigilar el cumplimiento de sta NOM por parte de los establecimientos generadores y
terceros implicados?
6. Segn la NOM, cules son los niveles en que se clasifican los establecimientos
generadores de RPBI y, cul es el periodo de almacenamiento sealado para cada uno
de ellos?
7. Considerando el impacto ambiental, por qu se debe hacer un correcto manejo de los
RPBI?
8. Menciona tres ejemplos de contenedores de RPBI.
9. Describe 3 medidas de seguridad para realizar el manejo de RPBI dentro del
laboratorio.
10. Dibuja el Smbolo Universal de los RPBI.
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de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
Lectura recomendada:
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 Link:
http://www.cmic.org/comisiones/Sectoriales/medioambiente/Varios/Leyes_y
_Normas_SEMARNAT/NOM/Residuos%20Peligrosos/8.2003.pdf
Gua para el manejo de los residuos peligrosos biolgico infecciosos en unidades
de salud. Link:
http://www.promocion.salud.gob.mx/dgps/descargas1/influenza/mat/Guia_m
anejo_de_residuos_biologicos.pdf
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de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
PRCTICA No. 2
Preparacin y desinfeccin del material de laboratorio.
OBJETIVO.
Conocer el material empleado en el laboratorio de Microbiologa y los procedimientos
necesarios de preparacin, limpieza y esterilizacin para su uso en el momento en que
requiera.
INTRODUCCIN.
El laboratorio de Microbiologa es un sitio habituado para el manejo y el estudio de los
microorganismos. El trabajo dentro del mismo ha de realizarse de acuerdo a estndares
tcnicos y de seguridad propios de un laboratorio de Microbiologa Clnica.
Es importante recordar que la finalidad del laboratorio de Microbiologa es determinar los
microorganismos presentes en la muestra, por lo que es preciso extremar precauciones
para evitar contaminaciones que den lugar a resultados errneos.
Cada uno de los materiales que se utilizan dentro del laboratorio de Microbiologa tiene
una funcin y uso que debe ser acorde a la tarea a realizar. Para el trabajo rutinario se
debe de disponer de aparatos e instrumental necesario para el correcto desarrollo de su
actividad. Es primordial que todos los recipientes, medios de cultivo y dispositivos de
siembra que se requieren en el estudio de los microorganismos sean estriles, es decir,
libres de vida microbiana. El instrumental empleado en el laboratorio es de diversos
materiales y pueden ser reciclables o de un solo uso. Los materiales que con ms
frecuencia se utiliza en el trabajo rutinario son: cajas, tubos de ensaye, matraces,
pipetas, etc.
El material a esterilizar debe estar perfectamente limpio para garantizar la reduccin de
la carga microbiana y, as contribuir a la efectividad del proceso de esterilizacin.
Los procedimientos de limpieza, desinfeccin y la posterior esterilizacin, son
indispensables para el correcto funcionamiento de zonas de trabajo donde se requiere
tener controlada la carga microbiana presente. Estos procesos son utilizados en los
diferentes establecimientos relacionados al rea de la salud tales como laboratorios,
consultorios, hospitales, quirfanos y clnicas.
Es fundamental contar con una tcnica apropiada para proteger el material que se ha
esterilizado a fin de evitar su contaminacin.
Los procedimientos comunes de esterilizacin incluyen el uso de calor, la filtracin y la
irradiacin.
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Ebullicin.
Calor efluente.
Pasteurizacin.
Ultrapasteurizacin.
Autoclave.
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El xido de etileno y otros vapores se estn haciendo cada vez ms importantes como
agentes esterilizantes. Aunque muchos laboratorios no poseen el equipo especializado
que se necesita para demostrar ste procedimiento de esterilizacin gaseosa.
La desinfeccin ser la destruccin de microorganismos patgenos por agentes
qumicos que van desde el jabn, diferentes alcoholes, soluciones de yodo, soluciones
de sales orgnicas como el merthiolate, entre otros.
Existen varios mtodos por los cuales se puede hacer la validacin del procedimiento de
esterilizacin, estos son:
Mtodos de validacin de la esterilizacin.
Controles fsicos:
Se realiza a travs del control de los parmetros
del equipo en las distintas etapas del proceso,
por ejemplo; temperatura, presin y vaco.
Controles qumicos:
Externos:
Internos:
Controles biolgicos:
MATERIAL:
1. Cajas de Petri.
2. Tubos de ensaye.
3. Matraces de Erlenmeyer de diferente capacidad.
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4. Pipetas volumtricas.
5. Pipetas Pasteur.
6. Papel de envoltura cortado de acuerdo al objeto para envolver.
7. Gasa cortada en cuadros pequeos.
8. Algodn.
9. Cinta masking.
10. Cinta testigo.
11. Mecheros Bunsen.
12. Mechero Fisher.
13. Gradilla.
METODOLOGA.
1. Mostrar el material comnmente utilizado en el laboratorio de Microbiologa.
2. Explicar los procedimientos de limpieza, preparacin y envoltura de cristalera para su
esterilizacin.
3. Exponer los utensilios para el manejo directo de los microorganismos, su conservacin y
su uso.
ACTIVIDADES
1.
2.
3.
4.
Los alumnos de cada equipo deben elaborar tapones para tubos y matraces.
Realizar el etiquetado del material para su almacenamiento o esterilizacin.
Realizar la envoltura de cajas de Petri, de pipetas y su rotulado.
Hacer diagramas y esquemas de las actividades realizadas en el laboratorio.
CUESTIONARIO.
1.
2.
los
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CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.
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PRACTICA
No. 3
OBJETIVOS.
Conocer que es un medio de cultivo, sus usos, sus variedades, as como aprender a
preparar algunos de ellos.
INTRODUCCIN:
Para que un microorganismo (M.O.) se pueda desarrollar, debe tomar del
ambiente, las sustancias necesarias, para la obtencin de energa que ser empleada
para la biosntesis y como consecuencia particular la reproduccin celular. A estas
sustancias se les llama Nutrientes.
Un medio de cultivo debe contener todos los nutrientes necesarios en cantidades
adecuadas para los microorganismos (M.O.). Muchos microorganismos son incapaces
de utilizar protenas como tales, y deben de proveerse de protenas degradadas
(pptido, proteasas, peptonas, aminocidos).
Extractos de carnes o carne parcialmente digerida son los nutrientes bsicos de
muchos medios. A algunos se les aaden: Carbohidratos y sales minerales. Estos
medios Basales pueden ser suplementados o enriquecidos con sangre, suero, plasma,
vitaminas o bien determinados aminocidos.
Los medios de cultivo varan ampliamente, de acuerdo con las necesidades particulares
de los organismos estudiados. A veces, se hace una distincin entre medios complejos y
definidos.
Medios complejos. Contienen lo necesario para el crecimiento, en forma cruda,
es decir que no se conocen todos los componentes de los medios ni se sabe las
cantidades exactas en que estn presentes. Muchos de los diversos tejidos de los
vegetales, carnes casena y clulas de levadura segn la sustancia de que se trate,
proporcionan fuentes ricas en polipptidos, aminocidos, vitaminas o sales minerales.
Ejemplos especficos de tales componentes de los medios son peptonas o triptonas, que
son hidrolizados enzimticos de protenas animales y el extracto de levadura, que es
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Agar Sangre.
Preparar 50 ml de Agar Base de sangre, segn especificaciones del frasco. Esterilizar a
121C por 15 min a 1 lb de presin. Una vez estril enfriar el medio y cuando tenga una
temperatura aproximada de 45C agregar sangre de cordero o humana de modo que
quede al 5%. Agitar suavemente y vaciar en cajas de Petri estriles, dejar solidificar y
almacenar de 4 a 8 C.
Agar Chocolate.
Preparar 50 ml de Agar Base de sangre, segn especificaciones del frasco. Esterilizar a
121C por 15 min a 1 lb de presin. Una vez estril enfriar un poco el medio a una
temperatura aproximada de 85C y agregar sangre de cordero o humana de modo que
quede al 5%. Agitar para lisar los eritrocitos y liberar los componentes, posteriormente
vaciar en cajas de Petri estriles. dejar solidificar y almacenar de 4 a 8 C.
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Agar nutritivo.
Preparar 65 ml de Agar Nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente y esterilizar a 121C por 15 min a 1 lb de presin. Vaciar el medio en
cajas de Petri estriles. Dejar solidificar. dejar solidificar y almacenar de 4 a 8 C.
Caldo nutritivo.
Preparar 20 ml de caldo nutritivo como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente. Verter aproximadamente 5 ml del medio a 3 tubos de ensaye, colocar
tapn y esterilizar a 121C por 15 min a 1 lb de presin. Dejar enfriar y almacenar de 4
a 8C.
Medio MIO.
Preparar 20 ml de caldo MIO como lo indica el frasco. Calentar hasta disolver
completamente. Verter aproximadamente 5 ml del medio a 3 tubos de ensaye, colocar
tapn y esterilizar a 121C por 15 min a 1 lb de presin. Dejar enfriar y almacenar de 4
a 8C.
ACTIVIDADES.
Realizar una secuencia esquematizada de todos los pasos que hiciste para la
preparacin de cada uno de los medios de cultivo, el inicio de la secuencia comienza
desde que lees las instrucciones del frasco y realizas las ecuaciones para el pasaje, y
finaliza en el transporte para almacenar los medios de cultivo. (Puedes ir colocando
observaciones que sean importantes al ir preparando los medios).
1.
2.
3.
4.
5.
6.
CUESTIONARIO.
Defina, Qu es un medio de cultivo?
Menciona los diferentes tipos de medios de cultivo y escribe dos ejemplos de cada uno.
A qu temperatura solidifica el Agar?
Qu sucede si se tapa la caja de Petri inmediatamente de vaciar el medio de cultivo?
Podra sembrarse rpidamente?
Qu sucede si el medio est muy fro y se desea vaciar?
Diferencie los trminos: Desarrollo y Crecimiento.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.
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PRACTICA No. 4
CONTAMINACIN AMBIENTAL Y MORFOLOGIA COLONIAL.
OBJETIVOS.
Identificar los componentes del medio que proporcionan las caractersticas de desarrollo
de un microorganismo.
INTRODUCCIN.
Al manejar microorganismos en el laboratorio de Microbiologa, debe considerarse la
existencia en el medio ambiente de diversas formas microscpicas de vida, que se
pueden instalar rpidamente en aquellas reas que las provean de sustancias nutritivas
para lograr su desarrollo.
De lo anterior, se desprende que los medios de cultivo preparados en el laboratorio
cumplen con un propsito en particular. Siempre debe tenerse en cuenta que en el
medio ambiente se encuentran microorganismos que pueden contaminar los medios de
cultivo si no se trabaja en forma adecuada en el laboratorio.
Los factores que pueden provocar dicha contaminacin pueden ser:
a)
b)
c)
d)
e)
Corrientes de aire.
Hablar en el rea de trabajo.
Trabajar fuera de la zona estril.
Manipular incorrectamente los utensilios de trabajo.
Esterilizacin inadecuada de medios de cultivo, etc.
En la naturaleza no encontramos aislado un solo tipo de microorganismos, por ello
cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal, planta,
suelo, agua o alimento se encuentran una gran variedad. Solo raramente se encontrarn
un solo tipo de microorganismos. Si se quiere trabajar con un cultivo puro, deben
obtenerse colonias aisladas o separadas.
La observacin cuidadosa de las colonias muestra que estas varan en apariencia.
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Una colonia microbiana est constituida por individuos de la misma especie provenientes
de una clula o de un grupo de ellas.
Por definicin un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, con
una distancia que permita distinguir y describir la morfologa colonial que incluyen:
1. Tamao. Se describe en milmetros del dimetro y puede variar desde colonias
extremadamente pequeas que miden apenas una fraccin de milmetros hasta aquellas
que llegan a medir 10 mm o ms. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en
toda la superficie de la caja.
2. Color. Las colonias pueden tener varios colores, debido a pigmentos propios o
absorcin de algunas sustancias del medio.
3. Forma. Pueden ser circulares, filamentosas, regulares, puntiformes, entre otras. Las
colonias puntiformes se caracterizan por ser muy pequeas por lo que no se pueden
distinguir el resto de sus caractersticas y otras en las que se pueden definir.
4. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos,
proyecciones como dientes de sierra o enrollados.
5. Elevacin. La colonia puede ser plana o elevada, esta ltima a su vez puede ser
convexa, pulvinada, umbonada, crateriforme o umbilicada.
6. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granular.
7. Aspecto. Puede ser hmedo o seco.
8. Luz reflejada. Puede ser brillante o mate.
9. Luz transmitida. Puede ser transparente, traslcida u opaca.
10. Produccin de pigmento. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua, que
puede difundir el medio de cultivo.
11. Consistencia. Dura o suave, esta ultima puede ser butirosa, mucoide o friable. Esta
caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto debe ser la ltima
en describirse.
12. Otras. En ciertos medios de cultivo el crecimiento bacteriano ocasiona cambios visibles
alrededor de la colonia, como la hemlisis en gelosa sangre. Acidificacin que se
manifieste con indicador de pH incorporado al medio de cultivo y otros efectos similares.
Con la experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa
colonial vienen a constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales
grupos de microorganismos, y tambin permite en muchos casos corroborar la pureza
de un cultivo o alertar sobre posible contaminacin.
MATERIAL.
Medios de cultivo preparados en la prctica anterior (cajas con G.CH, G.S y G.N).
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METODOLOGA.
Sesin 1.
1.
o
o
o
o
o
o
o
Sesin 2 (Reporte).
MORFOLOGIA COLONIAL.
OBJETIVO.
Conocer las diferentes morfologas coloniales que presentan las colonias bacterianas y
aprender que cada una de ellas tiene caractersticas peculiares.
INTRODUCCION.
La evaluacin inicial de la morfologa colonia en las placas de cultivo primarias es muy
importante. Los laboratorios pueden proporcionar a los mdicos informacin preliminar
con respecto a los resultados del cultivo del paciente, Esta informacin tambin es
significativa para determinar los pasos posteriores para la identificacin y caracterizacin
definitivas del microorganismo. De acuerdo a los distintos medios de cultivo cada grupo
de microorganismos presenta una morfologa colonial caracterstica.
En el siguiente esquema se muestra algunas propiedades de crecimiento de las
colonias:
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FORMA
ELEVACIN
BORDE
ACTIVIDADES.
1. Comprobar el crecimiento en los medios de cultivo.
2. Seleccionar dos colonias de cada medio de cultivo.
3. Identificar las caractersticas macroscpicas de las colonias seleccionadas y reportar en
la tabla 4.1.
4. Realizar esquemas de las placas que muestran crecimiento bacteriano.
Cultivos.
Propiedades.
Forma.
Tamao.
Color.
Pigmento.
Borde.
Elevacin.
Superficie.
Aspecto.
Agar:
1
Agar:
2
Agar:
1
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Luz reflejada.
Luz transmitida.
Consistencia.
Hemolisis.
AGAR:_____________________
AGAR:_____________________
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CUESTIONARIO.
1. De qu naturaleza biolgica son los principales microorganismos contaminantes, que
pueden contaminar un medio de cultivo.?
2. Qu otros factores considera usted que pueden ser causa de la contaminacin de tipo
ambiental que afecten los medios de cultivo?
3. Podra existir el riesgo de contaminacin cuando no se lleve a cabo una buena
esterilizacin?
4. De los medios de cultivo que preparo, cual considera que es el que ms riesgo de
contaminacin se expondra?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
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PRCTICA No. 5
SIEMBRA Y DESARROLLO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO.
INTRODUCCIN.
En la naturaleza, los microorganismos generalmente no se encuentran aislados sino
integrados en poblaciones mixtas, tal como se encuentran en una muestra biolgica.
Cuando estas mezclas de microorganismos se siembran en los medios de cultivos
adecuados, se obtienen cultivos mixtos. Para llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas, obteniendo cultivos puros o axnicos. El primer problema en la
identificacin de una bacteria resulta ser su aislamiento del resto de microorganismos
presentes en la muestra. Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la
bacteria de inters en cultivo puro.
En la preparacin de cultivos puros o axnicos a partir de una poblacin microbiana
mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas
durante el siglo XIX.
Para efectuar el estudio de los microorganismos una vez aislados, se han diseado
diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que es
posible obtenerlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo.
Siembra y aislamiento.
Sembrar es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin,
de forma que se logre la separacin de un determinado microorganismo (patgeno) del
resto que lo acompaa (microbiota) para obtener un cultivo puro. Una vez sembrado, el
medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. Ningn
proceso en el diagnstico microbiolgico y sanitario es tan importante como el utilizado
para obtener cultivos puros de los microorganismos.
El procedimiento para el aislamiento ms utilizado es la siembra por estra sobre un
medio slido adecuado, para ello se toma una pequea cantidad de inculo con ayuda
del asa bacteriolgica y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. En el medio
quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. El resultado de la siembra
por lo tanto se denomina cultivo.
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Las bacterias necesitan para su crecimiento de los nutrientes esenciales que se proveen
en un medio de cultivo, adems requieren de condiciones adecuadas de acidez (pH),
presin osmtica y atmsfera; entre algunos.
Despus del periodo de incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable ha de
dar lugar a una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia
bacteriana posee caractersticas particulares en su forma, borde, elevacin, tamao,
consistencia, entre otras.
Para efectuar la siembra o aislamiento, se requiere trabajar aspticamente a fin de evitar
la incorporacin de microorganismos contaminantes. Se precisa que todo el material de
vidrio, los medios de cultivo y los dispositivos de inoculacin como las asas
bacteriolgicas sean estriles.
Los diversos tipos de bacterias presentes en la muestra original es visualizan como
colonias diferentes en el medio de cultivo y es posible obtener un cultivo puro de cada
uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. A partir de un cultivo puro
se procede a realizar los estudios bioqumicos y serolgicos pertinentes para hacer la
identificacin de gnero y especie.
Las siembras pueden ser:
Primarias, cuando el material biolgico es inoculado en los medios por primera vez.
Encender el mechero, ajustar la flama del mechero a que quede completamente azul.
Tomar el asa bacteriolgica por el mango y colocarla en posicin diagonal a la flama del
mechero en la zona de oxidacin en un ngulo de 45 aproximadamente; se inicia el
calentamiento por la base del mango y se termina en la punta. Para asegurar la
esterilizacin del asa, el alambre de debe calentarse hasta que quede al rojo vivo.
Posteriormente se deja enfriar cerca del mechero, en la zona estril, antes de tomar el
inoculo.
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Quitar los tapones con la mano derecha utilizando los dedos meique y anular, con esta
misma mano habr de sostener el asa durante la inoculacin.
Flamear con el mechero la boca de los tubos y matraces una vez que se han abierto y
antes de colocarles su tapn nuevamente para evitar contaminaciones.
Siembra por estras: Aqu se incluyen los mtodos de estra cruzada, estra simple y
estra en costilla (para recuentos semicuantitativos).
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Estra masiva. Puede realizarse con hisopo cuando se trata de cultivos primarios. Se
coloca en inculo en un punto de la periferia de la superficie del agar y se procede a
realizar la diseminacin del inculo con el asa haciendo estras con escasa separacin
entre ellas, se gira la placa de Petri 90 y se realiza el mismo procedimiento.
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Vaciado en placa. Este mtodo proporciona por lo general placas con un nmero
apropiadode colonias y se basa en la dilucin semicuantitativa de la muestra original en
un medio slido.
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NOTA: El crecimiento que se muestra en la figuras es el que se espera observar en la lnea de picadura.
1.
2.
3.
4.
5.
Sin crecimiento.
Turbio.
Floculante.
Membrana o velo.
Membrana con anillo.
32
1.
2.
3.
4.
5.
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Aerobio estricto.
Anaerobio estricto.
Facultativo.
Microaerfilo.
Aerotolerante (anaerobio).
MATERIAL.
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MTODOLOGA.
Medidas generales:
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7. Colocar el tapn.
8. Esterilizar el asa.
9. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del 4 al 8.
10. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.
Inoculacin de tubos con medios lquidos.
1. Tomar 3 tubos de caldo nutritivo o caldo BHI y enumerarlos de manera consecutiva.
2. Utilizando el asa bacteriolgica de aro previamente esterilizada, tomar muestra de la
placa con la cepa problema 1.
3. Destapar el tubo marcado como 1.
4. Flamear la boca del mismo en el mechero.
5. Inocular la muestra en el tubo por la tcnica de inoculacin con asa suspendida
introduciendo el asa de forma verticalmente y una vez en el centro rotar el asa de
izquierda a derecha hasta que se suspenda el inculo en el medio.
6. Flamear el tubo nuevamente.
7. Colocar el tapn.
8. Esterilizar el asa.
9. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del 4 al 8.
10. Inocular el tubo 3 con la cepa problema 3, seguir metodologa de los pasos 4 al 8.
11. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
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10. Tomar el tubo 2 e inocularlo con la cepa problema 2 siguiendo los pasos del 4 al 9.
11. Inocular el tubo 3 con la cepa problema 3, seguir metodologa de los pasos 4 al 9.
12. Al terminar, identificar cada uno de los tubos escribiendo en su etiqueta el nombre del
M.O. con que lo inocul, la seccin, fecha y procedimiento a realizar en este caso,
incubacin a 35C por 24 horas y reportar resultados.
REPORTE DE RESULTADOS.
1. Dibujar al crecimiento observado en las cajas de Petri, despus de la incubacin.
Estra cruzada.
M.O:___________________
Estra simple.
___________________
Estra masiva.
_________________
2. Seleccionar una colonia aislada de cada uno de los microorganismos que se sembraron
en la prctica y realizar la evaluacin de la morfologa colonial.
Caractersticas a evaluar en la
morfologa colonial:
E. coli
Microorganismo:
S. aureus
B. subtillis
Forma.
Tamao.
Color.
Pigmento.
Borde.
Elevacin.
Superficie.
Aspecto
Luz reflejada.
Luz transmitida.
Consistencia.
Otros.
Hemlisis.
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Caractersticas a evaluar en
los medios semislidos:
Movilidad.
Medio
MIO
Lnea de picadura.
SIM.
Pigmento.
E. coli
Microorganismo:
S. aureus
B. subtillis
E. coli
Microorganismo:
S. aureus
B. subtillis
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Caractersticas a evaluar en
los medios lquidos:
Cantidad de crecimiento.
Pigmento.
Forma del crecimiento.
Consistencia.
Otros.
E. coli
Microorganismo:
S. aureus
B. subtillis
CUESTIONARIO.
1.
2.
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PRCTICA No. 6.
MICROSCOPA.
OBJETIVO.
Conocer los principios bsicos y la importancia de la microscopia como herramienta
fundamental en el campo de la Microbiologa.
INTRODUCCIN.
La Microbiologa es una disciplina que se ocupa de organismos tan pequeos que el ojo
humano no puede observarlos a simple vista, por esta razn dentro de la prctica de los
procesos microbiolgicos se hace indispensable el uso y manejo del microscopio. Para
los qumicos del rea de microbiologa es fundamental conocer y comprender el
funcionamiento del microscopio.
La microscopa se define como el empleo de un microscopio para aumentar de tamao
(agrandamiento visual) objetos demasiado pequeos.
La microscopia ocupa un lugar central en el laboratorio. Los microscopios y mtodos de
observacin por microscopio son varios, los tipos de microorganismos a detectar,
identificar y caracterizar determinan los tipos de microscopia ms apropiados a ampliar.
A continuacin de describen algunas
diagnstico microbiolgico.
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El microscopio.
El microscopio se compone de una parte mecnica y una ptica:
Parte mecnica.
La base del microscopio, suficientemente pesada para ser estable, soporta la platina fija,
sobre la que se coloca la preparacin a observar. La preparacin se mantiene por un
carro, con desplazamientos rectangulares, con un vernier. En algunos aparatos la platina
puede tener desplazamientos verticales gracias a una cremallera (tornillos macro y
micromtricos) que regulan la puesta a punto. En otros casos la platina solo se desplaza
horizontalmente.
El brazo, es una parte rgida que soporta el dispositivo porta-ocular y el revlver o portaobjetivos. En el microscopio monocular los dos dispositivos estn separados por un tubo,
de manera que la distancia entre el ocular y el objetivo sea de 170 mm. En los
binoculares, un sistema de prismas reemplaza al tubo.
El dispositivo porta-ocular es un tubo simple en el monocular o en el binocular, es donde
se encuentran los prismas. Los dos oculares se pueden desplazar de acuerdo a la
distancia entre ambas pupilas del observador, y adems uno de los oculares es mvil
sobre su eje para corregir las diferencias de convergencia entre los dos ojos.
El porta-objetivo o revlver, permite su desplazamiento por rotacin y permite
sustituirlos. Bajo la platina se encuentra el porta-condensador mvil, conteniendo el
diafragma. Debajo de l, un espejo permite regular la fuente luminosa.
Parte ptica.
La fuente luminosa, es de filamento de Tngsteno. El espejo, que tiene una cara plana y
la otra cncava, debe, a partir de una fuente luminosa, enviar un haz de rayos paralelos
al eje ptico del microscopio.
El condensador, es una lente que enfoca la luz en el preparado permitiendo la formacin
de un cono con el vrtice en el preparado y la base en el lente frontal del objetivo. La
entrada de luz se regula con el diafragma iris. El dimetro de abertura del diafragma
depende del campo y debe coincidir con l.
La abertura de luz debe ser menor a la abertura del objetivo usado. Se regula por medio
de diafragmas anulares.
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n= ndice de refraccin del medio a travs del cual pasa la luz desde el porta al objetivo.
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Objetivos acromticos, que corrigen las aberraciones cromticas para las longitudes
de onda de mxima sensibilidad visual.
Objetivos apocromticos, que no presentan aberracin cromtica en toda la escala del
espectro visible, siempre que haya una distancia ptima entre el objeto y la lente del
objetivo. Son designados por esa distancia en mm o en fracciones de mm.
Objetivos a campo plano, que corrigen la aberracin esfrica.
El ocular, est formado por dos lentes simples o compuestas montadas en las dos
extremidades de un tubo. La lente inferior se llama colectora o vidrio de campo y se
encarga de aplanar y aclarar la imagen real obtenida por el objetivo y completa por lo
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tanto la accin del objetivo. La lente superior agranda esa imagen dando una imagen
virtual.
Si el aumento del ocular es de 10x y la del objetivo de 40x, el aumento total de 400x.
Poder resolvente del microscopio (d), es la capacidad de ver dos puntos como
objetos separados. Cuanto menos es la distancia entre esos dos puntos, mayor es el
poder resolvente del microscopio.
Frmula de Abbe:
= longitud de onda
AN= apertura numrica =n sen
k= constante
Cuanto menor es la longitud de onda y mayor la AN, mejor es el poder resolvente, o sea,
menos la distancia mnima entre dos puntos para que se aprecien como tales.
Aumentando el ndice de refraccin del material, intermedio entre el preparado, (d)
mejora.
Longitud de onda:
Teric
ament
e (d)
es
mejor
con
luz azul que verde, pero la agudeza visual del ojo humano es mayor con luz verde.
Resumen.
El objetivo produce una imagen del preparado dentro del microscopio. El observador
mira esa imagen a travs de un ocular. As, si el objetivo aumenta la imagen 100
dimetros (100x) y el ocular otros 5x (dimetros), el aumento total es de 500x.
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El poder resolvente del microscopio es la capacidad de ver como objetos separados dos
puntos. Cuanto ms cercanos estn esos puntos, mejor es el poder resolvente. El ojo
humano a 25 cm puede distinguir la separacin de 0.1 mm (100mu). El microscopio
ocular 0.2 mm= 200mu.
Para formar una imagen clara el lente debe enfocar cada rayo de luz desde un punto del
preparado dando un punto de la imagen. Cuando falla se llama aberracin. Si es
cromtica separa los componentes del espectro, si es esfrica separa los puntos de la
imagen en su distancia de la lente.
MICROSCOPIO ELECTRNICO
El microscopio, depende de la longitud de onda de la luz visible (0.4 a 0.7). Sea cual
sea el sistema de lentes utilizado, no puede emplearse la luz para distinguir netamente
la estructura de objetos que no estn separados entre s por distancia mayor de la mitad
de la longitud de onda (pongamos 0.2).
Como el ojo a simple vista puede distinguir lneas finas separadas en aproximadamente
0.2 mm, no interesa mucho emplear una amplificacin mayor de 1000 veces con el
microscopio del luz, porque el ojo humano con esta amplificacin puede distinguir lo que
revela la luz de la misma longitud de onda (0.2 x 1000 = 0.2 mm). Amplificaciones
mayores de 1000 brindan imgenes de mayores dimensiones, pero no muestran ms
detalles.
El desarrollo revolucionario del microscopio que aumento su poder de resolucin ms de
cien veces, solo se logr despus que los fsicos, contrariados por las limitaciones que
les imponan las longitudes de onda luminosa se dirigieron a los electrones. La longitud
de onda de estos es muy corta, tanto que hasta hoy este factor no ha limitado el poder
de resolucin del nuevo instrumento.
Para obtener una imagen ampliada con el microscopio de luz, se aprovecha el hecho de
que, en general, los rayos de luz se desvan cuando pasan de un medio a otro con
diferente ndice de refraccin. Utilizando vidrios con superficies curvas (lentes), la luz
proveniente de un objeto pequeo puede desviarse de manera que produzca una
imagen voluminosa. En el microscopio electrnico se recurre al hecho de que las vas
seguidas por los electrones pueden influirse de manera similar por campos magnticos:
la fuerza de estos puede variarse segn la intensidad de corriente que pasa a travs de
las bobinas que excitan dichos campos.
Para describir el microscopio electrnico conviene comparar su sistema de lentes con
los que tienen el microscopio de luz.
En el microscopio ordinario, la luz de una fuente adecuada se enfoca mediante una
fuente condensadora. La lente del condensador dirige un haz poderoso de luz a travs
de la abertura de la platina y a travs de la muestra, por ejemplo, un corte teido situado
en dicha platina: la muestra recibe el nombre de objeto. La luz que ha atravesado la
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muestra se enfoca luego por el objetivo. Tal objetivo proporciona una imagen del objeto
en el foco, a cierta distancia entre el objetivo y la lente de proyeccin. La lente de
proyeccin, una de las que hay en el ocular del microscopio ordinario, puede ampliar
ms la imagen todava, hasta 10 a 15 veces, y utilizarse para enfocar la imagen
agrandada sobre una pantalla.
La ptica de un microscopio electrnico es sencilla: el instrumento es esencia es un tubo
de rayos catdicos desmontable, en el cual debe mantenerse el vaco por bombeo
constante. Desde el ctodo, un filamento de tungsteno en forma de V que puede
calentarse elctricamente, se emiten electrones que son atrados hacia el nodo (por
una diferencia de potencial de 50,000 a 100,000voltios). El nodo tiene una abertura, de
manera que es atravesado por un haz divergente de electrones. El haz divergente es
enfocado por la lente condensadora (un campo magntico) y dirigido hacia el objeto,
cuando los electrones atraviesan la preparacin unos son desviados ms que otros. El
haz de electrones que sale del objetivo es enfocado primeramente por la lente objetiva y
se obtienen una imagen aumentada del objeto. Esta imagen se agranda ms todava por
la lente de proyeccin.
Al igual que la luz ultravioleta y los rayos X, los electrones no afectan el ojo como lo hace
la luz. Sin embargo, al igual que aquellos producen fluorescencia en determinadas
substancias y tambin afectan pelculas fotogrficas. As pues, (como en el caso del
microscopio ultravioleta) debe utilizarse una pantalla fluorescente para enfocar la imagen
obtenida con el microscopio electrnico, y dicha imagen puede fotografiarse.
Las partes de la imagen final correspondientes a zonas del objeto donde los electrones
han sido muy desviados no resultaran muy intensas en la pantalla fluorescente, sern
ligeras en el negativo fotogrfico y de color obscuro en el positivo. Inversamente, las
partes de la imagen del objeto correspondientes a porciones que no desvan mucho los
electrones darn imagen brillante sobre la pantalla fluorescente, sern negras en el
negativo y claras en el positivo.
Los electrones atraviesan tan poco la materia que no pueden franquear ni los objetos
ms finos utilizados con el microscopio de luz. Para el microscopio electrnico los
objetos deben tener menos de 1/10 de micra de espesor de preferencia 1/40 de micra
(casi exactamente la millonsima parte de una pulgada) para obtener los mejores
resultados.
Como el microscopio electrnico resuelve detalles tan finos, tiene gran inters que el
objeto a observar sea fijado de la manera ms perfecta posible. Hace un tiempo se
comprob por Strangeways y Candi que la mayor parte de fijadores causan precipitacin
macroscpica de la protena en las clulas, y grados variables de formacin de los
componentes celulares. De todos los fijadores ensayados comprobaron que el que
menos alteraba la clula era el tetraxido de osmio. Estos resultados fueron confirmados
plenamente en los primeros estudios del microscopio electrnico; desde entonces se
han utilizado soluciones tampn de tetraxido de osmio como fijador de eleccin.
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MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas substancias (fluorocromos)
de poder absorber energa lumnica de una determinada longitud de onda y emitir
energa lumnica de onda de mayor longitud. Por lo tanto, pueden utilizarse substancias
fluorescentes para descubrir los rayos ultravioletas y los rayos X invisibles, porque
substancias fluorescentes adecuadas expuestas a las ondas relativamente cortas de la
luz ultravioleta, o a las ms cortas de los rayos X, las absorben y emiten ondas ms
largas de luz visible. Ejemplo: Auramina recibe luz azul (400-490mu) y emite verdeamarillo (560-590mu).
Hay varios colorantes como el anaranjado de acridina que presentan fluorescencia y
pueden utilizarse para teir componentes celulares y tisulares que de ordinario no tienen
fluorescencia, de manera que estos ltimos pueden despus ser demostrados. Otros
colorantes fluorescentes utilizados con fines determinados son la tioflavina S, la
tioflavina T, la rodamina B y la primulina.
Para localizar zonas de fluorescencia con el microscopio, no se requieren tipos
especiales de objetivos y oculares de cuarzo de otros material que transmitan la luz
ultravioleta, pues el observador que busca la fluorescencia descubre la luz visible
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emitida por diversos puntos del corte y, claro est, esta luz visible es perfectamente
transmitida por objetivos y oculares corrientes. Sin embargo, si estos puntos del objeto
deben hacerse fluorescentes, hay que iluminarlos desde abajo con luz de longitud de
onda menor que la que ellos emiten. En consecuencia, la fuente de luz que se utiliza ha
de emitir luz ultravioleta.
Toda la luz ultravioleta emitida debe filtrarse; de hecho, mediante filtros especiales,
pueden seleccionarse luces en varias partes de las longitudes de ondas ms breves. Las
longitudes de onda del espectro ultravioleta que se utilizan en el microscopio de
fluorescencia suelen ser suficientemente grandes para pasar en cantidades
considerables a travs de un condensador ordinario y uno del tipo de campo obscuro
como los generalmente utilizados, de manera que los puntos fluorescentes puedan verse
fcilmente sobre fondo negro. Como utilizamos luz ultravioleta para iluminar el objeto,
parte de la misma despus de atravesar las pociones no fluorescentes del objeto pueden
seguir a travs de objetivos y oculares. En consecuencia, para evitar la lesin de los ojos
por esta luz invisible, hay que insertar en el ocular filtros que impida el paso de los rayos
ultravioletas permitan el paso de luz del espectro visible (filtro amarillo).
MANEJO DEL MICROSCOPIO
Debe ajustarse a las siguientes normas:
1. La preparacin u objeto a examinar, debe colocarse en el centro de la laminilla portaobjetos y debe ser lo suficiente delgada para permitir a su travs el paso de la luz.
2. La generalidad de las preparaciones deben cubrirse con agua (unas gotas) sobre la cual
a su vez se deposita un cubre-objetos, procurando que no se formen burbujas de aire.
3. La laminilla porta-objetos, ya lista, debe colocarse en la platina procurando que la
preparacin quede en el centro del orificio de la misma platina, con ellos se conseguir
quede en el centro la preparacin, en el centro de la lente objetiva.
4. La observacin inicial debe hacerse, rutinariamente, con el objetivo de menor aumento
(10x) as cuidara que este objetivo se halle en el eje ptico del microscopio.
5. Enseguida se bajar el tubo del microscopio, accionando los tornillos o botones
macromtricos o rpidos, lo ms bajo posible, hasta poner el objetivo casi en contacto
con la preparacin. Con el fin de evitar el bajar demasiado, hasta el punto de que toque
el objetivo con la preparacin, es necesario que la maniobra anterior, se realice
observando por un lado (no se debe bajar el tubo estando mirando por el ocular). Este
tiempo es importante.
6. Se procede a iluminar el campo. Procurar que el campo quede bien uniformemente
iluminado, para ellos es necesario recordar que exista el condensador y exista el
diafragma; se subir el condensador, procurando obtener una luz de intensidad media;
se abrir y se cerrara el diafragma con el mismo propsito.
7. Acto seguido asomndose al microscopio, mediante los botones se subir lentamente el
tubo del microscopio hasta encontrar la imagen deseada.
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1)
2)
3)
4)
49
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de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
5) Cuando se limpie el objetivo de inmersin usar papel especial (papel seda) para lentes o
un trozo de algodn suave ligeramente impregnado de xilol (xilene) y dejarlo secar.
6) El microscopio no debe desmontarse. Si falla, llame al tcnico.
7) Al final de la jornada las partes pticas del microscopio deben limpiarse
cuidadosamente, en especial el objetivo de inmersin.
MATERIAL.
1. Microscopio ptico.
2. Frotes teidos.
3. Aceite de inmersin.
METODOLOGA.
1. Hacer la observacin de laminillas, siguiendo las instrucciones descritas anteriormente.
2. Dibujar los objetivos y escribir la informacin que se encuentra detallada en cada uno de
los objetivos.
3. Anotar observaciones.
ACTIVIDADES.
1. Dibuja un microscopio e identifica cada una de sus partes.
CUESTIONARIO.
1. Describir cada una de las caractersticas de los diferentes objetivos y su aplicacin.
2. Investigar las diferentes variedades de los aceites de inmersin.
3. Cuntos aumentos (x), totales se tienen si se hace la observacin con el ocular de 10x
y objetivo de 40x?
4. Describe la secuencia para la hacer la observacin al microscopio de una laminilla con
una preparacin bacteriana.
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PRCTICA No. 7
TINCIN SIMPLE. (FORMA Y TAMAO)
OBJETIVO.
INTRODUCCION
Las tcnicas de tincin que se usan en Microbiologa se desarrollaron como una
necesidad para poner de manifiesto a las bacterias y sus estructuras, como ya se haba
hecho en la observacin de las clulas y tejidos diversos desde mucho tiempo antes.
Los colorantes fueron usados para mejorar el contraste de los objetos que se observan
al microscopio y el medio que los rodeaba. De tal modo que se desarrollaron
procedimientos de fijacin que favorecan la unin de los colorantes con las estructuras
celulares y procedimientos adicionales con el mismo propsito para el cual se aplicaban
ciertas sustancias, como los taninos, a los que se denomin mordentes, las cuales
favorecan a la tincin. Se desarrollaron tcnicas muy variadas, que tuvieron un fuerte
impacto en las observaciones microscpicas, pues se utilizaron con gran xito en las
tinciones de la clula, que tomaban las sustancias colorantes permitiendo distinguir no
solo las clulas sino, a muchas de las estructuras intracitoplsmicas en numerosos
tejidos animales, vegetales y organismos microscpicos, lo que propicio un gran avance
en las ramas del saber cmo la histologa, patologa, botnica, zoologa y protozoologa.
Tomando en cuenta que las bacterias son clulas pequeas y casi transparentes, que
escapan a la observacin microscpica, su tincin es indispensable para conocer su
forma, tamao y agrupacin.
Los colorantes son sustancias que originalmente se derivaron de anilina o del alquitrn;
qumicamente estn constituidos por uno o ms anillos aromticos. Los cuales tienen
sustituyentes diversos llamados cromforos, que dan la cualidad del color; a estos
compuestos se les llama cromgenos; adems tienen un grupo funcional ionizable,
llamado auxcromo, que permite su unin a componentes de carga contraria presentes
en las estructuras celulares y tejidos que se desea observar. Algunos ejemplos de
colorantes usados en las tcnicas microbiolgicas son los siguientes: cristal violeta, azul
metileno, verde de malaquita, safranina, fucsina, azul de algodn y algunos que no se
usan para visualizar directamente bacterias pero se utilizan para contrastar estructuras
en otros tipos de clulas son el cido pcrico, el rojo neutro, y la eosina. Se utilizan
preferentemente algunos colorantes porque son bsicos, es decir, al ionizarse la porcin
de la molcula que tiene color est cargada positivamente, lo cual le da afinidad por las
estructuras celulares de carga negativa; las bacterias en superficie tienen una carga neta
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Laboratorio
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negativa en medio neutro o alcalino, por lo cual los colorantes cidos no son adecuados
para teirlas.
La tincin simple es aquella en la que se aplica un solo colorante. Las soluciones
empleadas para teir las bacterias son generalmente acuosas. En ocasiones se prepara
una solucin concentrada en alcohol para favorecer la rpida disolucin del colorante y
despus se diluye con agua. La concentracin final del colorante vara de 0.5 hasta el
5%, segn sea la intensidad del color. Se obtienen mejores resultados de coloracin si
se utilizan soluciones de baja concentracin por un tiempo largo en vez de soluciones
concentradas por un tiempo corto.
MATERIAL.
1.
2.
3.
4.
I.
1.
2.
3.
4.
5.
II.
3.
4.
1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
III.
52
IV.
Laboratorio
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Agrupacin
Ejemplo
Pares (diplococos)
Neisseria
Racimos (estafilococos)
Staphylococcus
Cadenas (estreptococos)
Streptococcus
Ttradas
Pediococcus
Cubos de 8 (sarcinas)
Micrococcus
Lminas
Lampropedia
Escherichia
Bacillus
Bacillus, Lactobacillus
Corynebacterium
Caulobacter
Helicoidal
Aislado
Treponema
Curva
Aislado
Vibrio
Espiral
Aislado
Beggiatoa
Plana
Mosaicos cuadrados
Haloarcula
Aislado
Stella
Esfricas (cocos)
Cilndrica
Estrella
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Laboratorio
de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
ACTIVIDADES
1. De acuerdo con sus observaciones, indique en la siguiente tabla la morfologa
microscpica de cada microorganismo.
Morfologa microscpica.
Forma
Agrupacin
Esporas
Microorganismo
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFAS.
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Laboratorio
de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
PRCTICA No. 8
TINCIONES DIFERENCIALES.
TINCION GRAM.
Objetivo.
Introduccin.
La observacin microscpica de las bacterias es ms fcil cuando se tien. Sin
embargo, es fcil confundir un punto o bastn teido sobre un fondo del mismo color con
algn artefacto. Este problema apareci cuando las muestras de tejido infectados se
tean con azul de metileno incluidas las bacterias. El primer intento para resolver el
problema fue decolorar los cortes despus de la coloracin. En los tejidos que tenan el
bacilo tuberculoso, esto fue efectivo pero en otros las bacterias se decoloraban igual que
los tejidos y no se ganaba nada. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram,
patlogo dans que en 1884 introdujo un colorante de contraste despus de la
decoloracin. En esta tincin diferencial las bacterias se tean de color prpura obscuro
usando la llamada solucin de Ehrlich, violeta de genciana con anilina y los tejidos
circundantes con caf de Bismarck o vesuvina. Originalmente la coloracin Gram se
desarroll para visualizar las bacterias en los tejidos animales pero pronto se advirti
que era til para la diferenciacin de bacterias teidas por esta coloracin y se dividen
en dos grupos: las que requieren el violeta de genciana o cristal violeta o Gram positivas
y las que se decoloran y se tien con el colorante de contraste (generalmente) de color
rojo como la safranina o la fucsina bsica aunque puede usarse verde de malaquita para
los observadores daltnicos o Gram negativas.
La afinidad tintorial seguramente se debe a numerosas diferencias en la
estructura y composicin qumica de muchos componentes celulares entre los que
destaca la pared celular. Las bacterias Gram positivas tienen una pared compuesta
principalmente de una capa de peptidoglicano relativamente gruesa (20-80 nm). En
cambio, las Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano delgada (5-10 nm)
adems de una membrana externa constituida de fosfolpidos y lipolisacrido.
En general, las bacterias Gram positivas son susceptibles a la penicilina y varios
agentes qumicos y son ms resistentes a la desintegracin por tratamiento mecnico
que las Gram negativas, que como grupo, son ms susceptibles a otros antibiticos
como la estreptomicina. Las diferencias bsicas en las estructuras superficiales de las
bacterias Gram positivas y las Gram negativas contribuyen a aclarar la diferencia en la
respuesta de la coloracin de Gram. Durante la tincin Gram, ambos grupos de
bacterias se tien con el colorante primario (Cristal violeta) y mordente (yodo). El
55
Laboratorio
de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
MATERIAL.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
METODOLOGA.
I.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Tincin Gram.
Hacer frotis de cada bacteria y fijarlos con calor.
Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante un minuto. Escurrir el
colorante y lavar con un chorro suave de agua.
Cubrir los frotis con solucin de Lugol y dejarlo actuar durante un minuto.
Escurrir el reactivo y lavar con un chorro suave de agua.
Colocar el frotis en forma vertical y usando un fondo blanco, decolorar aadiendo gota a
gota el alcohol-acetona durante 5 a 15 segundos. El momento exacto para terminar la
decoloracin con agua es cuando de fluir hilos de colorante por el frotis. Este es el
paso crtico de la tincin. Lavar inmediatamente con un chorro suave de agua.
Cubrir los frotis con safranina y dejarla actuar durante un minuto. Escurrir el colorante y
lavar con un chorro suave de agua. Dejar secar al, aire.
Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
ACTIVIDADES.
1.- Despus de aplicar la tcnica de Gram a las cepas proporcionadas y de acuerdo con
sus observaciones, indique en la tabla siguiente:
56
Microorganismo.
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus epidermidis.
Laboratorio
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Morfologa microscpica.
Forma.
Agrupacin.
Gram.
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus epidermidis.
3.- Elabore esquemas a colores de una preparacin con una mezcla de bacterias Gram
negativos y positivos en cada uno de los pasos de la tincin Gram
Paso 1
Cristal violeta.
Paso 3
Cristal violeta + Lugol + decoloracin
Paso 2
Gram violeta + lugol.
Paso 4
Gram completo.
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CUESTIONARIO.
1.- Podras sustituir el colorante primario por algn otro colorante si no? Por qu?
2.- Cul es la composicin de la pared celular en bacteria Gram positiva y como es en
una Gram negativa, adems menciona sus componentes principales de cada una?
3.- Cul es la funcin del Lugol en la tincin Gram?
4.- Qu otros colorantes se pueden emplear en lugar de safranina?
5.- Qu sucedera si agregara el colorante secundario ms concentrado o por un
tiempo ms prolongado?
6.- Qu inconveniente encontrara si agregase primero la safranina en la tcnica?
7.- Qu es una coloracin supravital?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.
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Prctica No. 9
TINCIN ZIEHL- NEELSEN.
OBJETIVOS.
Laboratorio
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MATERIAL.
1. Muestra problema.
2. Fucsina fenicada.
3. Alcohol-cido.
4. Azul de metileno.
5. Portaobjetos.
6. Papel filtro.
7. Aplicador de madera.
8. Mechero de Bunsen.
9. Solucin desinfectante.
10. Charola para la tincin.
11. Puente de tincin.
METODOLOGA.
1. Hacer un frotis de la muestra problema. Dejar secar al aire y fijar al calor.
2. Colocar portaobjetos en charola de tincin y colocar el papel filtro sobre el frotis de
muestra.
3. Agregar la fucsina fenicada hasta cubrir totalmente el papel filtro.
4. Con el mechero calentar hasta la emisin de vapores, mantenindose as durante 5 a 10
minutos, agregar varias veces colorante de fucsina fenicada sobre la laminilla para evitar
que se deseque.
5. Lavar con chorro de agua suavemente.
6. Decolorar con alcohol-cido por 30 segundos.
7. Lavar abundantemente.
8. Agregar azul de metileno y dejar actuar entre 30 segundos y un minuto.
9. Lavar con chorro de agua suave.
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Laboratorio
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Observacin a:______x
1. Elabore un esquema que represente la pared celular de los BAAR destacando las partes
que lo constituyen.
CUESTIONARIO.
1. Qu es una coloracin diferencial?
2. La tincin de Gram, es una sustitucin adecuada para teir bacilos cido-alcohol
resistente?. Si no, por qu?
3. Qu coloracin toma el BAAR y cul el resto del campo?
4. A qu se le atribuye la facultad del cido-alcohol resistencia?
5. Cul es el mordente en la tcnica de Ziehl-Neelsen y por qu se le considera as?
6. En el Mycobacterium tuberculosis encontramos lpidos estructurales, mencinelos:
7. Adems de los lpidos, Qu otros componentes se han encontrado en el mismo
microorganismo?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.
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Laboratorio
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Prctica No. 10
TINCIONES SELECTIVAS.
(CPSULA Y ESPORAS).
OBJETIVOS.
INTRODUCCIN.
Algunas estructuras bacterianas superficiales como: la cpsula o los flagelos y los
componentes interiores como: esporas, grnulos, grnulos metacromticos. Pueden
tener un valor taxonmico y ayudar a la identificacin de los microorganismos conforme
a la presencia de estas estructuras.
Para poder observarse se utilizan tcnicas de coloracin especiales.
A) ESPORAS (METODO DE SHAFFER FULTON).
Algunos gneros bacterianos entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en
su interior formas de resistencia denominadas esporas. Se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas
extremas, compuestos txicos, etc.), estas bacterias pueden pasar de un estado
vegetativo a un estado latente o espora.
Las esporas poseen unas cubiertas exclusivas y la localizacin en el interior de la clula
constituye una caracterstica de cada bacteria, las esporas aparecen en el microscopio
ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin.
Ciertas bacterias responden a los cambios desfavorables del medio ambiente. El grupo
de bacterias que presentan tal capacidad son: bacilos gram positivos aerobios y
anaerobios facultativos del gnero Bacillus entre los se encuentran: B. subtilis, B.
cereus, B. anthracis; y los bacilos gram positivos anaerobios estrictos del gnero
Clostridium: C. perfringens, C. botulinum, C. difficile.
Las esporas de estos grupos pueden encontrarse situadas a diferentes distancias dentro
del bacilo: para poder distinguirlas se acude a diversas tcnicas de coloracin. La forma
ms simple de observar a las esporas es como cuerpos refringentes intracelulares, en
suspensiones de bacterias sin teir o como reas incoloras dentro de las clulas
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de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
METODOLOGA.
1. Hacer un frotis, dejar secar y fijar al calor.
2. Cubrir el frotis completamente con la solucin de Verde de Malaquita al 5%; Hervir por
20 segundos, cubriendo de colorante la preparacin para no dejar secar. Seguir por 30
segundos ms, hasta completar 3 minutos.
3. Dejar enfriar. (Evita que se rompa el portaojetos)
4. Lavar con agua corriente por 30 segundos.
5. Se cubre con Safranina al 0.5% por 30 segundos.
6. Se lava y se deja secar al ambiente.
7. Observar al microscopio.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1.
2.
3.
4.
METODOLOGA:
Colocar en un portaobjetos una gota de tinta china
Tomar muestra de la cepa problema e inocular directamente sobre la tinta china.
Colocar un cubreobjetos.
Observar a 40x.
ACTIVIDADES.
Esquematizar los pasos de la tincin de esporas y la tincin negativa.
Dibujar e identificar la forma y posicin de la espora en la tincin realizada.
Dibujar lo que se observo en la tincin negativa.
CUESTIONARIO.
1.Qu es una tincin especial?
2.Qu funcin desempea la cpsula en la infertilidad de un organismo?
3-Se puede correlacionar siempre la presencia de cpsula en una especie patgena
con la virulencia?
4.Qu tipo de monosacridos se encuentran formando la cpsula?
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5. Hacer una lista de varias especies patgenas aerobias y anaerobias que formen
esporas as como enfermedades que ocasionan:
6. Cul es la funcin de las esporas?
7. El primer organismo que era agente etiolgico de una enfermedad fue formador de
esporas, De cul se trata?Cmo y quin lo descubri?
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
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PRCTICA No. 11
METABOLISMO DEL CARBONO.
OBJETIVO.
Realizar las pruebas bioqumicas para poner de manifiesto las actividades metablicas
que llevan a cabo los microorganismos sobre algunos azucares y cidos orgnicos, que
son tiles en la identificacin.
INTRODUCCIN.
El estudio de los microorganismos con base en la descripcin colonial y microscpica no
es suficiente para hacer una identificacin satisfactoria, es por ello que se tiene que
recurrir al estudio de su comportamiento fisiolgico, es decir, cmo se utilizan los
nutrimentos y qu sustancias producen. Para lograr esto existe un gran nmero de
pruebas metablicas que nos permiten llegar a la caracterizacin de un microorganismo
dado. El metabolismo es la suma de todos los procesos qumicos que ocurren dentro de
un individuo, es decir las reacciones qumicas que se producen en la clula y tiene tres
funciones, obtener energa del entorno, convertir nutrientes exgenos en precursores de
los componentes macromoleculares de las bacterias y degradar molculas necesarias
para cumplir funciones especficas. Para su estudio se divide en anabolismo y
catabolismo, el primero se refiere a las reacciones bioqumicas que suceden en la clula
para formar macromolculas y el segundo representa las reacciones que estn
involucradas en la conversin de los sustratos a formas ms simples y generalmente
ms oxidadas con el que se obtiene la energa requerida por el anabolismo.
Los tres principales procesos que conducen a la obtencin de energa y su conversin
en ATP, son la fermentacin, en el cual se obtiene ATP por fosforilacin oxidativa a nivel
de sustrato; la respiracin, en la que se obtiene ATP por fosforilacin oxidativa con el
oxgeno como aceptor final exgeno; y la fotosntesis que forma ATP mediante foto
fosforilacin.
La fermentacin es un proceso anaerbico en el cual tanto donadores como los
aceptores de electrones son compuestos orgnicos. Estos compuestos incluyen
carbohidratos, cidos orgnicos, aminocidos y otros ms. Existen varios tipos de
fermentaciones efectuadas por microorganismos. Los productos de fermentacin de
carbohidratos son principalmente cidos orgnicos, alcoholes, cetonas, y CO2. (Tabla
11.1)
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Tabla 11.1
Ejemplos de algunos tipos de fermentacin y microorganismos que las realizan.
Tipo de
Productos principales.
Ejemplos.
fermentacin.
Alcohlica
Etanol y CO2
Algunas levaduras y Zymomonas.
Lactobacillus, Streptococcus
Homolactica
cido lctico
Lactobacillus.
Heterolctica
cido lctico, etanol y CO2
Enterobacterias: Shigella sp,
2,3-Butanodiol, butanol,
Salmonella sp, Klebsiella sp,
cido mixta
succinato, lactato, acetato,
Escherichia coli
formiato, H2 y CO2
Clostridium butyricum
Butrica
Butirato, acetato, H2 y CO2
Propionibacterium, Clostridium
Propionica
Propionato, acetato, CO2
propionicum.
Clostridium aceticum, Acetobacterium.
Actica
Acetato.
Por otro lado se tiene la oxidacin, en este proceso hay un aceptor final exgeno que es
el oxgeno y se denomina respiracin aerobia y cuando es un compuesto inorgnico es
respiracin anaerobia. Algunas bacterias denominadas aerobias estrictas, solo pueden
crecer en presencia de oxgeno porque las vas fermentativas no producen suficiente
energa para su crecimiento. Otras, solo poseen la va fermentativa anaerobia y adems
la presencia de oxgeno es letal para ellas, estas bacterias denominadas anaerobias
estrictas, deben mantenerse y cultivarse en una atmsfera carente de oxgeno.
Por ltimo algunas bacterias denominadas microaerfilas activan su metabolismo a
concentraciones bajas de oxgeno, pero no crecen en la concentracin atmosfrica y lo
hacen muy lentamente en anaerobiosis estricta. Esta caracterstica referente a la
necesidad de oxgeno de una bacteria para desarrollar su catabolismo se denomina tipo
respiratorio.
MATERIALES.
1.
2.
3.
4.
Cepas problema.
Juego de bioqumicas (TSI, RM-VP, Malonato, Citrato)
Reactivo Rojo de metilo.
Asa, mechero.
METODOLOGA.
1. Ordenar las pruebas bioqumicas para inocular.
2. Seleccionar una colonia aislada de la cepa problema.
3. Tomar la colonia aislada con el asa.
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4. Con la misma colonia, sin volver a tomar, inocular toda la batera de las pruebas
bioqumicas proporcionadas.
5. Incubar 24 horas 37C.
No todas las pruebas bioqumicas se incuban durante 24 horas se necesita conocer los
fundamentos, detalles bioqumicos, de incubacin, forma de interpretacin, etc. Hay que
considerar que hay microorganismos de crecimiento lento que requieren incubaciones
ms prolongadas y que hay algunos incapaces de crecer en los medios de cultivo de las
pruebas.
Notas: Forma correcta para inocular las bacterias en las pruebas bioqumicas.
1.
2.
3.
4.
Picadura y estra.
Estra.
Picadura.
Suspensin.
Asa en punta.
Asa en aro.
ACTIVIDADES.
1.- Dibuja toda la batera original de tubos de las pruebas bioqumicas proporcionadas.
2.- Pasadas las 24 horas de incubacin dibuja la batera de pruebas bioqumicas con los
resultados obtenidos.
Importante: Algunas pruebas bioqumicas para poder interpretar su resultado es
necesario agregar reactivos: al tubo de Rojo de metilo se necesita adicionar dos a tres
gotas del reactivo rojo de metilo.
3.- Complementar la tabla de reporte de resultados del metabolismo del carbono.
Tabla.
Tubo
Resultado
Tubo
Resultado
Tubo
RM-VP
Resultado
Tubo
K.
pneumoniae
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Escherichia
coli
Shigella
Salmonella
CUESTIONARIO.
1.- Cul es el fundamento de las 4 pruebas bioqumicas utilizadas en la prctica?
2.- Escriba cada una de las reacciones que se presentan en cada una de las pruebas.
3.-Realiza un esquema de un tubo de TSI e indica en que parte del tubo se lee la
fermentacin de la glucosa, la lactosa y sacarosa.
4.- Dibuja e interpreta todos los resultados posibles de una prueba de TSI.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.
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PRCTICA No. 12
METABOLISMO DEL NITROGENO.
OBJETIVOS.
INTRODUCCIN.
Los microorganismos adems de requerir de una fuente de carbono y una de energa,
necesitan de una fuente de nitrgeno para construir su propio material celular. Esta
fuente de nitrgeno puede ser orgnica (protenas, aminocidos y bases nitrogenadas).
Dentro del metabolismo de los aminocidos existen algunas enzimas capaces de
descarboxilar, desaminar o desulfurar completamente y la presencia o ausencia de
dichas enzimas son criterios de identificacin.
La Descarboxilacin se lleva a cabo por enzimas como las descarboxilasas de los
aminocidos bsicos como: lisina, ornitina y Arginina. Este es un proceso anaerbico
irreversible y requiere de la coenzima fosfato de piridoxal. Como productos de la
descarboxilacin de la lisina se produce cadaverina y CO2 y de la ornitina se produce
putrescina y CO2. La accin microbiana sobre la Arginina puede llegar a producir
putrescina despus de varias reacciones, por un lado por la descarboxilasa se produce
agmatina, la cual se puede seguir hacia putrescina con agmatina ureohidrolasa (o
agmatinasa), o bien con agmatina dihidrolasa forma amonio por desaminacin y
monocarbamil putrescina y esta a su vez se descarbamila para dar putrescina, CO 2 y
amoniaco.
Los aminocidos pueden sufrir tambin desaminacin. En el caso de la Arginina la
separacin hidroltica de un grupo amino produce citrulina y amonio, despus la citrulina
se descompone para producir ornitina y carbamil fosfato, este ltimo por accin
enzimtica produce NH3, CO2 y ATP. El amoniaco proviene tambin de la
descomposicin enzimtica de la urea por ureasa que tiene algunos microorganismos.
La Descarboxilacin subsecuente de la ornitina producida por esta va tambin puede
dar lugar a putrescina.
Algunas bacterias son capaces de liberar cido sulfhdrico como producto de la
degradacin de los aminocidos que contiene azufre (cistena y metionina) o de otros
azufrados como el tiosulfato. La enzima que libera el grupo sulfhdrilo de los
aminocidos es la cisteinasa y del tiosulfato la tiosulfato reductasa.
El Indol es uno de los productos del metabolismo del aminocido triptfano. Las
bacterias que posee la enzima triptofanasa son capaces de degradar tal aminocido, con
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1.
2.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
4.
5.
MATERIALES.
Cepas problema.
Juego de bioqumicas (LIA, FEN, MIO, gelatina, Urea).
Reactivo de Kovacs.
Reactivo de cloruro frrico.
Asa, mechero.
METODOLOGA.
Ordenar las pruebas bioqumicas para inocular.
Seleccionar una colonia aislada de la cepa problema.
Tomar la colonia aislada con el asa.
Con la misma colonia, sin volver a tomar, inocular toda la batera de las pruebas
bioqumicas proporcionadas.
Incubar 24 horas 37C.
Notas: Forma correcta para inocular las bacterias en las pruebas bioqumicas.
Picadura y estra.
Estra.
Picadura.
Suspensin.
Asa en punta.
Asa en aro.
ACTIVIDADES.
1.- Dibuja toda la batera original de tubos de las pruebas bioqumicas proporcionadas.
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CUESTIONARIO.
1.- Diga cul es el fundamento de las pruebas bioqumicas con formulas y reacciones de
las siguientes: LIA, MIO, UREA, gelatina, Fenilalanina.
2.- Defina los siguientes conceptos: enzima, sustrato, metabolito primario y metabolito
secundario.
3.- Escriba los nombres de dos especies bacterianas que produzcan alguna algunas
de las siguientes enzimas a) Ureasa, b) Catalasa, c) Gelatinasa, d) Fenilalanina
desaminasa, e) Lisina-descarboxilasa, f) Lisina-desaminasa g) Triptofanasa.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
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PRCTICA No. 13
ACCIN DE LOS ANTIBITICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO
Conocer los fundamentos y la metodologa para la realizacin de las pruebas de
sensibilidad a los antibiticos (antibiograma) sobre determinadas cepas de laboratorio.
INTRODUCCIN
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por ciertos microorganismos que en
bajas concentraciones tienen la capacidad de inhibir el crecimiento o matar otros
microorganismos. Son metabolitos secundarios no esenciales que sintetizan cuando el
microorganismo productor se encuentre en la fase estacionaria. La mayora de los
antibiticos son producidos por bacterias del suelo, principalmente actinobacterias del
gnero Streptomyces y algunas especies de Bacillus, entre los organismos eucariticos
se pueden mencionar a diversos hongos de los gneros Penicillium, Cephalosporium y
Aspergillus. Los antibiticos constituyen una clase especial de agentes
quimioteraputicos naturales, aunque actualmente existen antibiticos semisintticos,
que tienen modificaciones en la molcula original, y antibiticos sintticos, obtenidos
mediante procedimientos qumicos aunque originalmente fueran producidos por
microorganismos.
Existe una gran cantidad de antibiticos, sin embargo, menos del 1% han tenido alguna
utilidad prctica en la medicina, zootecnia, agricultura o ingeniera gentica. Los
antibiticos se producen a escala industrial a travs de procesos de fermentacin con
cepas sobre-productoras mejoradas genticamente. Por otra parte, la modificacin
qumica o por ingeniera gentica y la bsqueda de nuevos antibiticos ms eficientes
continua, debido a que siguen apareciendo cepas de microorganismos con resistencia
inherente o adquirida a los antibiticos de uso corriente en agricultura, alimentacin
animal y medicina, ya que prevalece la utilizacin indiscriminada e irresponsable de
muchos de ellos. El problema se ha vuelto tan grave que algunos cientficos creen que la
era de los antibiticos est cercana a su desaparicin.
Al conjunto de grupos de bacterias que un antibitico en partculas afecta se le conoce
como espectro de accin. En general, las bacterias Gram positivas son ms sensibles
que las Gram negativas. Aun as, existen antibiticos de amplio espectro que actan
sobre ambos grupos.
Los antibiticos suelen agruparse con base en su estructura qumica o en su forma de
accin.
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los Estados Unidos, es el de Kirby-Bauer, en que se colocan discos de papel filtro con
concentraciones conocidas de diferentes antibiticos sobre una placa sembrada con el
microorganismo en estudio. Despus de incubar se ponen de manifiesto halos de
inhibicin para los antimicrobianos hacia los cuales son susceptibles los
microorganismos. Tambin se emplean los mtodos de diluciones en tubo, en
microplaca y en agar. Estas tcnicas permiten determinar la concentracin mnima
inhibitoria (CMI) que es la ms baja concentracin de una cantidad determinada de
bacterias. Permite asignar a un organismo en las categoras de sensible, resistente o
intermedio y brinda al mdico la posibilidad de elegir el antibitico ms apropiado para
cada caso en particular.
MATERIAL
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Mechero de Bunsen.
Sensidiscos para bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Cepa de Staphylococcus aureus,
Cepa de Escherichia coli.
METODOLOGA.
Procedimiento de difusin del antibitico en agar empleando sensidiscos.
(procedimiento de Kirby Bauer)
1. Realizar la preparacin del inculo de la siguiente forma: tomar con el asa bacteriolgica
una colonia aislada de la cepa pura.
2. Hacer una suspensin de la colonia, utilizando para ello un tubo con caldo Mueller
Hinton. En caso de que se trate de una suspensin de microorganismos Gram
negativos, se lleva el tubo a incubacin por un lapso de 1 a 2 horas a 37C para su
posterior utilizacin. En caso de tratarse de una cepa de microorganismos Gram
positivos la suspensin no requerir de incubacin.
3. La suspensin bacteriana se debe ajustar la turbidez del tubo 0.5 de la escala de Mc
Farland.
4. Posteriormente, tomar un hisopo estril e introducirlo en el caldo Mueller Hinton.
5. Antes de sacar el hisopo del caldo, eliminar el exceso de lquido apoyndose de las
paredes del tubo de ensaye.
6. Tomar la placa de Petri con la Gelosa Mueller Hinton e inocular con el hisopo toda la
superficie del medio con una estra masiva. Girar el hisopo durante el estriado.
7. Finalmente, pasar el hisopo por la periferia de la placa con gelosa.
8. Dejar secar la superficie de la placa.
9. Antes de 15 minutos, realizar la colocacin de los discos de antibiticos con ayuda de
una pinza previamente desinfectada con la flama del mechero. (Los discos tiene que
estar previamente atemperados).
10. Tomar los discos con las pinzas en forma asptica. Un disco no debe ser removido una
vez que tom contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibiticos se
difunden rpidamente.
11. Al aplicar el disco en el agar hacer una presin con ayuda de la pinza a fin de dejarlo
fijo.
12. Incubar a 37C por 24 horas.
13. Medir con ayuda de una regla el dimetro en milmetros de las zonas de inhibicin.
14. Reportar observaciones y resultados.
Distribucin de los discos sobre las placas de gelosa Mueller Hinton, de acuerdo su
clasificacin Gram.
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AN
SxT
CC
FOX
CIP
SxT
CIP
AmC
CAZ
CRO
AM
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RESULTADOS.
1. Anotar en la tabla siguiente el efecto de los diferentes antibiticos sobre el crecimiento
de cada uno de los microorganismos utilizados durante la prctica.
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CUESTIONARIO.
1. Cmo influye el medio de cultivo en el antibiograma?
2. La respuesta que se observa in vitro (antibiograma), es la misma que in vivo?
3. Mencionar los factores que pueden influir en la actividad de los antibiticos in vivo?
4. Describir brevemente otros mtodos que pueden emplearse en la determinacin de la
sensibilidad a los antimicrobianos.
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OBSERVACIONES.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFA.
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Laboratorio
de Microbiologa. Manual de Microbiologa I.
BIBLIOGRAFA.
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