CAPITOLUL I, BIOENERGETICA ASPECTE GENERALE intreaga biosferi desfasoari o lupti continua pentru mentinerea structurii proprii sia functiilor inerente acestora. Pentru a exista sia supravietui, organis- mele vii se afla intr-un schimb permanent de energie cu mediul inconjuritor. Energia chimica a substantelor nutritive, dupa transformarea ei intr-o forma convenabili, este utlizald pentru efectuarea de travali specifice vieti-crestere, reparatii tisulare, activitate contractiva, osmotic’. Organismele vii poseda dispozitive de transformare a energiei, deosebit de subtile sieficiente Care sunt legile fundamentale ce guvemeazi procesele insotite de_schimbiri energetice? Stiinta care studiazd transformarile si utilizarea energiei se numeste bioenergeticd. Obiectul ei de studiu sunt sistemele termodinamice care constituie portiuni din Univers, separate real sau imaginar. Ceeace nu_ face parte din sistemul considerat (restul Universului), constituie mediul inconjuritor. intre un sistem si mediul inconjuritor se efectuea7 schimburi de energie. Ca sisteme termodinamice pot fi cercetate (in cadrul schimbului de energie) atitindivizii unei specii, celulele izolate, cit si reactiile biochimice. Organismele vii sunt sisteme deschise, traversate de un flux de energie si rmaterie, adie o dat cu mediul inconjurator se schimba ati substan, cit i energia. ‘Termodinamica clasica studiaza sisteme inchise (nu pierd gi nu cistig’ nimic in cazul transformarilorce le sufera). Legile termodinamicii (TD) sunt deduse din dou’ principii fundamentale: . Principiud conservarii energie’ const in faptul cd energia Universului este constant. Energia nu poate fi creat si nici distrusa, e posibila doar transformarea idintr-o forma inalta in cantitati echivalente, energia nu se pierde, 2. Principiul evolujiei stabileste posibilitatea si sensul transformatilor insotite de schimburi de energie. Procescle asociate de transfer de energie se desfisoara de la sine numai inte-o directie si mumai pind la o anumita limita (de exemplu, cdderea unui corp; revenirea la initial a unui arc intns etc). Care este factorul ce determina spontaneitatea unei transformari, de ce la anumiti limita procesul inceteaz: Putem prevedea sensul si limita desfasurarii libere a unui proces eu ajutorul entropiei (S), definiti ca grad de dezordine a unui sistem. Ea reprezint miscarea dezordonati, haotic’ a particulelor, atomilor care alcatuiese acest sistem. Cu cit libertatea de miscare a acestor particule este mai mare, au o distributie mai dezor- ddonati, cu afit entropia sistemului este mai mare, Moleculele organice complexe, proteinele, acizii nucleici sunt compusi cu entropii mici. Celulele vii, xrganismele pluricelulare sunt de asemenea sisteme naturale cu entropii dintre ele mai mici, Principiul al doilea al termodinamicii atest ci entropia Universului creste. rdinea se poate transforma spontan in dezordine. ins procesul invers—diminuarea ordinii —nu poate avea loc decit daca sistemul absoarbe energie din mediu si iminueaziientropia. Ultima(S) poate fi misurati (in calorii/grad/ mol.) Modificarile 1, AG? este negativ; 3)Keq ADP + Fosfat AG°=-7,3 kcal/mol Glucozo-6-fosfat+H,O —» Ghucoza+Fosfat AG?=-3,3 kcal/mol Maltoza+H,O "= 2Glucozi AG°=-3,7 kcal/mol Lactoza+H,O —= Glucozi+Galactozi. —AG°=-3,8 kcal/mol Glucozo-I-fosfat —> Glucozo-6-fosfat AG*=-1,74 keal/mol Fructozo-6-fosfat Glucozo-6-fosfat AG*=-0,40 kcal/mol Malat —> Fumarat + H,0 AG*=+0,75kcal/mol Glucozi + 60, —» 6CO, + 6,0 AG°=-686 kcal/mol Acid paluitie+ 230, 20,+ 16 H,0 AG?=-2338keul/n0l Studiind biochimia, ar trebui si tezolvim doua probleme principale: 1) in ce ‘mod celula receptioneaz energia si capacitatea reduc3toare din mediul ambiant si 2) Cum celulele sintetizeazi blocurile de constructie—baza macromoleculelor? in general, aceste procese au loc datoriti prezentei unor sisteme superintegrate de reactii chimice denumite metabolism. -173-METABOLISMUL Metabolismul este o activitate celulara concordat, determina multor sisteme multienzimatice strins legate intre ele Care sunt functiile metabolismului? 1, Aprovizionarea cu energie chimici, care se formeazala scindarea substantelor nutritive bogate in energie sau ca urmare a transformarii energiei radiatiei solar. 2. Transformarea moleculelor substantelor nutritive in blocuri de constructie necesare pentrusinteza macromoleculelor. 3. Asamblarea proteinelor, acizilor nucleici, polizaharidetor, lipidelor si a altor component celular din aceste blocuri. 4, Sinteza si catabolismul biomoleculelor necesare pentru activitatea specific’ a HoC + HyC—C~SCoA CH—SH “CH—SH $ R Ry Acetiltipoamid Dihidrotipoamid Acetil CoA inetapa a IV-aare loc regenerarea formei oxidate a lipoamidei. Reactia e catalizati deE, Oxidantul e NAD‘, §irolul prostetic fi revine FAD, cui sh So™ ur $ 1,6 FADE ADH, HC ‘ens i-s R RR Dihidrolipoamid NADH +H* NAD* Lipoamid Procesul eireversibil, avind aG*=-8 kcal/mol. Etapa descrisi este cheia ireversibila ametabolismului, Animalelenu suntcapabile si transforme acetil-CoA in glucoza. Acetil-CoA se fncadreaz’ incilul Krebs sau in sinteza lipidelor. Reacfile pot fireproduse schematic in felul urmator: R-C=0\, TP x» R-C~S-L coo \ \/ Oo SH \/ E [= \ Ea f Ss /SH as /~ on NE SL NO 0 co, C SS. & DSH R-C~SCoA 2 RCH TPP Be 6. FabH, FAD = Nab’ NADHFH” Complexul fermentativ descris mai sus se regleazi prin: 1 Inhibarea prin rezultantele reaciei(retroinhibitie) de acetil-CoA, NADH—primul compus inhihind F,, NADH-F,. Ffectul este reversihil la actiunea NADY si HSCoA. Inhibifiaalosterica este amplificat& de acizii grasi macromoleculari. 2. Reglarea nucleotidica, prin sarcina energeticd. Este inhibat complexul de GTP si activat de AMP. Activitatea complexului se reduce atunci cind celula contine energie aceesibili i se amplificd, in caz contrar, 3.Complexu! piruvat dehidrogenazic (CPDH) isipierde din activism la fosforilarea serinei de ATP (modulator pozitiv pentru kinaza pirwvat dehidrogenazei) o dati.cu - 184-formarea fosfopiruvat dehidrogenazei (reglarea covalent). Dac ATP se micsorea- 4, are loc scindarea hidroliticd a fosfatului de CPDH. Reactia este catalizaté de ‘fosfataza piruvat dehidrogenazei. Atit kinaza, citi fosfataza persista in complexul piruvat dehidrogenazic. 2ATP —— Proteiokinac | “eo ‘ ——-CH;~OH — CH;-0—Poy mplexut PDA Complexal PDH? activ ‘naciv H,—OH cone eo rotpenin tian 7 3 ci © Acetil-CoA, NADH of no © CoA, NAD, piruvat aoe co l Reglarea covalenta a complecului piruvat dehidrogenasie Fosforilarea se amplifica la raportul inalt de ATP/ADP; acetil-SCoA/HSCoA; NADH/NAD*, iar defosforilarea—la concentratii inalte de piruvat gi ioni de Ca. CICLULKREBS Reprezint& un ciclu primordial pentru functionarea sistemelor vii. Sistemul enzimatic acfioneazi cu finefe deosebitd. Ciclul incepe cu retrocedarea de citre acetil-CoA. —oxaloacetatului grupei acetil,cu formarea compusului de 6 atomi de carbon -citrat Prima reactie este catalizata de citrat sintaza— ferment reglator. Produsul interme- diar il constituie citril-CoA. Reactia sumara deviaza spre dreapta (AG°=-7,7 kcal/ mol), rezultantiahidrolizei. H,C—COO™ CH,—-COO™ C—Coo"+ HyC—6 ~SCoA + Oe BOGS 600" +HS-CoA +H i a oie wien cH,=000 Enzima, aconitaza, catalizeazi transformarea reversibilé a citratului in izocitrat prin formarea produsuluiintermediar cis-aconita, ce ma deviazi de la centrl activ al enzimei Tzomerizarea se realizeaza prin dchidratare, succedatl de hidratare. Confinutul izocitratului emai micde10%,reactia evolueazi de a stinga spre dreapta, si produsul ei se incadreazi rapid, suecesiv, in celelalte stadii ale ciclului, Aconitaza reprezinti o enzimii compus, ce confine fier si sulfacidolabil, formind centre fiero-sulf. = 185-GH,— COO" CH—COO" y,9 OOC--CH—-OH HO—C—CO0* c—coo’ A+ “00C-C-H CH,—COoOo CH)—COO” CH,—COO™ Citrat cis-aconitat Tzocitrat Decarboxilarea oxidativé a izocitratului, catalizati de izocitrat dehidrogenaza- (ICDID, este prima reactic de oxido-reducere din ciclu, cu formarca ulterioard a a cetoglutaratulu . oe ; t f ooc—CH NAD‘) NAPHOP)+H “ooc—-¢ x’ 9: ¢—Co0 00c—cH ‘00C—CH CH, du, —coo” bu,—coo" CH,—COO Trocitat nalosuecinat cecetoghtarat ICDH este o enzima de doua tipuri—NAD* si NADP” dependent: NAD*d — localizat& in mitocondrii; NADP*d—localizata atit in mitocondrii, et siin citozol. ‘Modulator pozitiv al reactiei este ADP, enzima practic nu functioneaza fara ADP; reactia necesiti ioni de Mg” sau Mn’* A doua reactie de oxido-reducere (a patra in ciclu) este decarboxilarea oxidativia cr-cetoglutaratului, catalizata de complexul a-cetoglutarat dehidrogenazic cu forma- reasuccinil-CoA sia CO,, NADH+H, Mecanismul acestei reactii e asemindtor cu ‘ransformarea piruvatuluiinacetil-CoA. Sunt uilizati aceiasi cofactoriai tri enzime: o- cetoglutarat dehidrogenaza, (A'), transsuccinilaza (B') si (C’) dihidrolipoil dedrogenaza, Miezul complexului ¢ subunitatea B', iar subunitatea C’ este identica pentru ambele complexe. Aceste doui complexe reprezinta asociatii omoloage deenzime. CH CHy-C—COOH SGA, {02 CHy~CH,—F~SCoA I a coon 0 - coou cecetoglutarat NADY NADH ——SuecinilCoa Hidroliza succinil-CoA da aproximativ 8 kcal/mol. Scindarea e cuplati cu fosforilarea GDP, catalizati de succinil-Cod sintetaza si formarea GTP. CHa CHy—GE~SCoA * GDP +P, = CHy-CHy + GTP + HSCOA coon (OO coo coo Succinil-CoA Succinat - 186-Enzima nucleozidfosfo kinaza transfer grupa fosfat dela GTP la ADP cu formarea ATP. Ea este unica reactie a ciclului,fiind insofiti de formarea directa a compusilor macroergici fosfati. E 0 fasforilare la nivel de substrat—drept izvor de energie serveste oxidarea unei substanfe organice. GTP + ADP == ATP + GDP Succinatul este dehidrogenat, cu formarea fimaratului—reactie catalizati de succinat dehidrogenaza (SDH), avind ca acceptor H,-FAD. in molecula de SDH inelul izoaloxazinica FAD-ului e legat covalent de parte proteica cu restul histidinei din centrul activ (CA)alenzimei. Molecula confine 4 atom de fier 4 atomi de sulf, formind proteine fiero-sulf yap ‘FADE u 7‘ a f + = (00C—CH,—CH;—COO" .E-/ oc—c=¢—coo ‘Suecinat Furant H ‘SDH confine dou’ componente: 1. 70 FAD kDa si dou clastere de FSP (proteine fiero-sulf); 2.27 kDa—claster proteic. Enzima SDH este o proteind integral a membranei interne din mitocondrii, iar inhibitor concurent al SDH este malonatul. FADH, format nu se desprinde de enzima, electronii sunt direct transferati pe Fe al enzimei. Acceptor final poate servi O, molecular. ‘Unmitoarea reacfie consti i hidratarea fumaratuluicu formarea L-malatului catalizat de enzima stereospecificd fumaraza (are loc o transaditionare de H gi OH). Enzima e ‘compusd din 4 subunitatiidentice (4L PP), H Bg OHH “ooc-C=¢-coo’ 2 ooc-t_tcoo TI H HH Fumarat — L-malat dehidrogenaza, componenta matricei mitocondriale, catalizeaza dehidroge- narea L-malatului (NAD‘), cu formarea oxaloacetatului (OA), Echilibrul e deplasat (la pH =7,0,concentratie-1,0M) spre stinga, insi in cetulele intacte—spre dreapta, oxaloacetatul se asimileazi rapid si concentratia real e foarte mica in celule (10 mol) HO NAD NADH4H™ 1 _ 3 “00C — CH— CH;- COO" NeA O=¢—Coo" H,—COO L-malat Oxaloacetat -187-in urma acestui ciclu de reactii are loc: 1) regenerarea oxaloacetatului, care interactioneazi cu onoui moleculi de acetil-CoA; 2) gruparea acetilica se asimileazi in doud molecule de CO,; 3) sunt captaf ionii de hidrogen, bogati in energie Stoichiometria ciclului: ‘Acetil-CoA + 3NAD* + FAD + GDP + P, +2H,O —» 2CO,+ 3NADH + FADH, + GTP +2H* +HSCoA. Reactia descrisi confirma cd O, molecular la ciclul Krebs (CK) nu participa nemijlo- cit, ciclulfunctionind numa‘ in conditi aerobe, deoarece NAD" si FAD inmitocondri pot firegenerate numai dup’ transferul electronilor pe O, molecular. Cichul manifesta caracter aerob, spre deosebire de glicoliz’, ce decurge atit in conditii aerobe, cit gi anaerobe. Cauza consti in faptul cd la transformarea piruvatului in lactatin cadrul glicolizei are loc regenerarea de NAD*. r @D __ H~seoa Acctil-CoA Ho Condensarea ay coast — cu-coo ome—coor wo-C-co0" i . ® Plerettina A = a | Alte flavoproteine = Chendinn Q(+004V) Y Complex I | cit bse | Coenzima Q H; et GitocromC Py Croco eS fa Antimicina A Fes cite, CitocromC (+ 0.25 V) Complex IV Citocrom€ oxdam HS Cianida iida,CO é “Sy 20; H0¢-082 yy Figura 3, Lanqul respirator mitocondrial -195-Caracteristica complexelor lantului respirator Complexu! l, NADH-Q-oxidoreductaza. Torentul de electroni din lantul respirator in mare msurd este deteminat de activitatea dehidrogenazelor NAD* sau NADP* dependente si doar foarte putine dintre ele semnificativ (GDH) pot si interactioneze eu ambele coenzime.(fig 3.6) Uncle dehidrogenaze sunt localizate in mitocondrii altele in citozol, dar semnificativ e ». cl dehidrogenazele din citozol cit si cele din mitocondriiinteractioneazé cuNAD*, respectv J) Membrana mitocondriali ¢ impermeabila peniru aceste coenzime. Coenzima NAD are Matrice(N) functia de colector, adunind H, de la diferite substraturi (NADPH, izocitrat, -ceto-glutarat, piruvat,lactat, malat, B-oxibutirat, B-hidroxcacil- HH NAD* CoA) (fig.3.7.). Figura 3.6. NADH: ubichinon ovidoreductaza (Complexul 1) Complesul onl Slicer} 3-fst Glico! 3st 9 5 higrogenaza Ulteriorperechea de echivalenfiredusi —Spayiw ea € transferatd pe flavinproteide (FMN — intermembranar dependente), iar electronii sunt preluati de complexele fiero-sulf cu rol de grupe prostetice. Flavinmononucleotidul formeaza cu acesti compusi un complex. enzimatic NADH-Q-reductaza. Fierul nu ede natura hemica si rezulta ca proteinele poart denumirea fiero-proteinenehemice sau centre fiero-sulf, Se atest tri tipuri de centre FeS: 1. Atomul de Fe e¢ tetraedric coordonat cu SH grupe a patru resturi de cisteind proteicd, FeS, (fig.3.8. (a) 2. Fe.-S, confine 2 atomi de Fe si doi rigura:3.7. Transferu electronilr de te NADH, isultiztnecrganictadigionaf la resttri de uceinany acihCud gf glteerol-tforfat pe cisteina ( fig 3.8. (b)). aces 3.Fe;S,-4 atomi de Fe si4 disulfizi neorganici_ aditionati la 4 resturi de cisteint (fig3.8.(€)). S-aconfirmat ck NADH-Q-reduetaza confine doufi centre: Fe,-S, si Fe8, Dela Fe-S al enzimei electronii iH sunt transferati la coenzima Q. Reducerea de potential constituie 0,42V, aG=-19,4 kcal/mol sie suficient pentru sinteza a2 mol de ATP, dar se sintetizeaz un singur mol de ATP, restul energie risipindu-se sub forma de caldura. Enzima NADH-Q-reductaza e compusi din 16 subunitii polipeptidice. AciL-CoA, Aebidrogcax Matrice (8) =196-Figura 3.8, Centrele fiero-sulf Coenzima Q sau ubichinona are o raspindire vasta in sistemele biologice. Coada izoprenica determina capacititile hidrofobe ale Q, ce permit o difuzie rapida in membrana intemia mitocondriilor. CH; OH | me \ J +. i “—CH, + 2H + 2¢ = a CH, I | ~ rE CoH) cH= —CHi) gH $° (CH CH=C—CHy) oH CH © roms oxidati CH, CH; OH Forma redusi CH, Cocnzina Q Coenzima Q, unicul translator al electronilor fixat nerigid de protein, nu aditioneaza covalent la ea. Ea indeplineste functia de colector, aditionind echivalentele reduse de la NADH ide la complexul succinat-O-reductazd (dependent de FAD), electronii find transferati spre proteinele Fe-S, apoi spre Q. Complexul enzimatic (II) ¢ ‘component integral al membranci intemea mitocondrilor. Transferul electronilor de la QH, mai departe e realizat de proteinele Fe-S side itocromi (1925, David Keilin). Citoctomii sunt proteine ce transfer electroni, molecula ‘continind hemul ca grup prostetic’. in procesul de transfer al electronilor atomul de ese afld fic in stare redust (Fe), fie oxidati (Fe). Grupa hemului, asemiimstoare cu Fe-S centre, transfer mumai un electron. Asadar, lecula de QH, transmite 2 electroni ai sai saturati de energie la 2 molecule de itocrom . Citocromii ,, b, ¢, si proteina Fe-S reprezint complexul QH, — itocrom Creduetaza (11) (ig’3 8), Valoaea de potential in cadrl acest transfer de 0,21V (AG' =-7,75 kcal), ceea ce asigura sinteza unui mol de ATP. Citocromul ¢ transferi electronii de la acest complex la complexul citocrom C ic (F), ce contine citocromii asia, Citocromul C joaca acelasi ol ca sicoenzima adic’ asigura transferul electronilor din diferite complexe ale lantului respirator 3.10) Citocromii difera dupa structural si proprietafi. Grupa prostetica a citocromului b, uluic,, citocromului ceste protoporfirina IX, hemul constituind aceeasi grup -197-Spatiu intermembranar Central 7 Fels Citocrom ¢ Cirocrom Proteing fero-sulf ‘Iu Rieske Matrice (N) ® ) Figure 39. Compleat QF carom C rebecca (I: Compleat xe un dime compas din Pi agra mst rp my ry wen hatmane he sar rife reas Cheer ace eaycnt nines en Se econ ee eee San eee een eee eae Tee ern eee, Pe aed alert rept alert ln pene Sh cre trai acs Ant haenearnt see alee ‘Nmatvice) al membranei. Myxothiazolul previne fluxul electronitar de la QH, la proteina fiero-sul Pilla gh nop a el ral go pars pooner Lapel ane Figura 3.10.Caleaelectronitor prin complaxn! IH. Cole trol ypatiy raige’, Droveine implicate tn ransferat — SP&t el ‘electronilor sunt I, II sé IIL. intermembranar ° 4 Transfert de electron! prin complet IV icope ld Gout Sikuseces oneeal fecre che wn cectron Guudtodarcrbest = (y -electronii tree prin hemul a cétre } { ‘centrul Fe-Cu (citocromul a, si { Cu). Oxigenul legat ta hemul q reste res terval ad \} ‘peraxid (0,7) de doi electroni de (Ut ‘cena eu Pinion a ined “y ai cised de ecterne o c omveeycindout molenie se ape, consuming patra ‘seta “paride inact np nck pars preted , Statpompanictamarice print Matrice(%) sn mecetam in pein elacidat aes (substrat) ai 21,0 -198-prostetic’ ca i la mioglobina si hemoglobina. in citocrom’ hemul nu ¢ legat covalent de proteind, in citocromii csi c, —covalentcu legituri tioesterice (grupele sulfhidrilice a 2 resturi de cisteina la grupele vinil ale hemului). Citocromii a si a, au alt& grupa prostetica (fieroporfirinica), ce se deosebeste de citocromii esic,,avind grupa formil (in loc de meti) si un lang hidrocarbonat (in loc de vinil). Complexul final mai este denumit si citoctom-oxidaza, Citocrom C oxidaza prezinti dimer proteic asimettic, in care fiecare monomer € compus din 13 subunititi diferite, Ca componenti ai subunititilor [sunt 2 heme A, trei atomi, cu raportul Fe/Cu 2:3, un atom de Mg si Zn si citeva molecule de fosfolipide. Se observ ci partea interna a scheletului de o-atomi de carbon a_structurii cristalice e compus dintr-o cantitate vaditi de ct spirale, ce sunt aranjate in 2 suprafete paralele, la depirtarea de 50 A. Acest sector otspiralat prezinta partea proteic’ trans- membranari situatd in membrana intern mitocondtrial E stabilit c& primele trei subunititi codificate de genele mitocondriale formeaz’inucleut monomerutui, celetalte 10 subunitati codate de gene nu- cleare formeaza_ spatiul perinuclear fig.3.11). Functiile subunititilor I iT constau in formarea centrelor metalice de oxido-reducere sia terminatilor ddetransfer al protonilor, funcfile celorlalte subunitati sunt Fighra 3.11. Organizareairidimensionald in monomer a Subunit colin de pencle nuclear din stricture iscutabile, E confirmat ci Stommanal Condor. Subunit oat fe gene) protoniiantrenatiin formarea miacandriate,b— hemal a yr gradientului transmembranar siin sinteza apei sunt transportati pe cdi diferite. Caile efective de transport al H* sunt determinate de cavitii in care sunt fixati aminoacizii capabili de formarea legdturii de hidrogen. Alte cavitti orientate haotic, pot contine molecule de api miscitoare. Cavititile potsi-sindeplineascii rolul la modificarile conformationale ale resturilor de aminoaci Jainductia lor sub influenta proceselor de oxido-reducere sau a modificarilor fxr legi- turilorin centrele metalofixatoare. Controlul riguros la viteza de intrare a oxigenului joac’ rolul decisiv la functionarea enzimei, daca torentul dee’ e suficient, apoi surplusul de oxigen in centrul de reducere al iu favorizeaz’ formarea particulelor de oxigen activ. Sunt depistate 2 canale pentru nxigen in subunitatea III si in hemul A, Molecula de oxigen nu poate trece liber prin, wvitatea canalelor, ceea ce confirma controlul riguros al difuziei de oxigen prin ele. Expulzarea moleculelor de apa sintetizati in centrul de reducere a oxigemului in 12a citoplasmicd e, de altfel, strict controlata. Sunt depistati aminoacizii hidrofili, ijati liniar in jurul hemului A, si pind la atingerea cu subunitatile I si Ise e474 0 cale hidrofila—canal posibil pentru ap. Aminoacizii sunt compact aranjati, fiecare manamer -199-aga ineft torentul invers al apei e practic imposibil. Analiza RS confirma lipsa unor alte structuri, c¢arindeplini aceasta functie, Modificarile conformationale ale acestor canale sunt induse de modulatori starilor de oxido-reducere si ligandofixatoare ale centrului de reducerea oxigenului. ‘Transferul schematic al electronilor in lantul respirator este prezentat in felul urmator- 1 NADHS 7 PMN, 9 FeSilD-@ \ samte:?ro-en® nap s FM ™~ Feg- $13) QH2 ‘Complexul enzimatic NADH-Q reductaza ™y cit 3). Fe~S(42) + ei Prlesinelen — (+3) Fates cite (+3) mule laeieeeeenaiiteet ce edie 3, Complexul enzimatic — OH - citocrom C reductaza 11,0 cite Gay - sta Gd , si Thc _ site (wy stacy \ cit ates) ® cus) “Complexul enzimatic ~”citocrom C oxidaza Revenind la langul respirator, ne-am referi la unele probe ce confirma faptul ci proteinele acestuia functioneazi\ in secventa descrisd mai sus a) Valoarea potenfialului redox devine pozitiv la deplasarea spre oxigen b) Fiecare proteind din acest lante specifica numai pentru un anumit donator si un anumit acceptor de hidrogen. c)Din membrana mitocondriala s-au extras complexe structurale izolate functional legate intre ele prin transferul de electroni (4 complexe si doi componenti de legitur’),. Inhibitoriilantului respirator. Studiul tansferului de electroni s-a facilitat datoriti utilizirii metodei de inhibitie specifica, ce blocheaz& etapa concreti a procesului (fig3.5). 1.Complexul Leste inhibat de rotenona (insecticid de origine vegetal folosit de indienii americani ca otrava pentru pesti), Na amital-(barbiturat), pericidina (antibiotic), care blocheaza transferul electronilor pe segmentul NADH" la coenzima Q. 2.Antimicina A (antibiotic foarte toxic) comporté actiune de blocaj transportuluide electron intre QH, si citocromul c 3.Cianida blocheazA funetia citocromului aa, (aa, este blocat si de CO). 4, Complexul II este inhibat de citre malonat, care actioneazi ca inhibitor competitiv Coenzima Q este inhibati de doxorubicina, preparat din clasa antracictinelor. 5. ATP sintetaza este blocata si de compusii arsenicului, care in forma ionilor de arseniat substtue ion fosfaji blocind formarea ATP. -200-6. Componentele lantului respirator pot fi inactivate in deficit de fier, deficit al vit. B, hipoxie sau prin atacul radicalilor liberi asupra coenzimei Q. S-a constatat ca pind la fiecare blocaj proteinele sunt mai reduse, iar dupa blocaj — mai oxidate. Cind echivalentii de reducere intra in lanul respirator prin complexul I, se ‘consider cd lantul functioneaza prin “ramura lung&”, intrarea prin complexul IIe asigur& prin “ramura scurta” (fig,3.5) Fluxul de electroni de la NADH la O, ¢ un proces exergonic si poate fi exprimat pein: NADH + H* +20, +3P,+3ADP —— NAD*+3ATP+4H,O (-52,6keal/mol) ‘Trei moli de ATP confin numai 21,9 kcal/mol. Rezulti ci randamentul utiliziiri energiei libere va fi de 42%. Procesul de transfer al electronilor e cuplat de fosforilarea ADP si sinteza ATP. Potentialul redox in punctele de fosforilare trebuie sa fie mai mare decit, 0,224V necesar pentru sinteza de ATP. Lantul respirator e o cascada, datoriti cfrei celula acumuleazii energia liberi climinati de combustibilul celular intr forma accesibil Generarea radicalilor liberi. Procesul de transferare a patru clectroni finalizeaz cu formarea apei, insise stie ci hemul transferd mumai un electron, Modul incare jonctioneaza patra electroni pentru reducerea moleculei de oxigen nu este distinct: 0, + 4H" + 4e —» 2H,0 La reducerea incompleti, cuaditiaa 2e,se formeazi api oxigenati (H,O,). La aditia unui electron se formeaza radicalul superoxid (:O,). Ultimele doug substanfe sunt toxice gi, interactionind cu restul acizilor grasi din lipidele membranare, lezeazit ‘membranele celulare. Celulele aerobe se protejeazi gragie actiunii enzimelor: 1) Superoxiddismutaza —enzim-metal ce transform’ superoxidul in HO, 20; (0,) + 2H* —» H,O, + 0, 2) Catalaza transforma HO, in H,0 si, 2H,0, —~ 2H,0 + 0, 3) Peroxidaza: HO, + RH, —~ 2H,0 +R Interactiunea oxigenului poate evolua in felul urmator: 0, = :0," OL 11,0;51H45 of oon, H,0 < HO Arscnalul mecanismelor de protejare mu dispune de enzime ce ar ncutraliza OIT, ‘dar benefice suntsistemele de neutralizare a: O, sil1,O,, sistind formarea OH. Deosebit de expuse efectelor nocive ale radicalilor liberi sunt mitocondrille—compartimentul celular unde se efectuea7a reacfiile de oxido-reducere in prezenta oxigenului molecular. ‘Suntafectate primordial fagocitel geritrocitele. Deficitul unuia dintresistemele de protectic Julard are consecinte severe si inposibilitatea de neutralizare a radicalilor liberi este iplicata in patogenia diferitelor afectiuni, ca:ateroscleroza, bolile mitocondrale, bronsitele -201-cronice, emfizemul pulmonar, cancerul, diabetul zaharat, distrofile musculare, insuficienta, renal, maladiile degenerative neurologice, accidentele cerebrovasculare, = 1/20 + Hj0 -Peraxitars hs % 2GSH Glutation GSSG \__ Rehtaan 7 Pa + 2NADP 2NADPH+2H Mecanismele fosforiliii oxidative (cuplarea oxidiirii cu fosforilarea) Se postuleaz mai multe ipoteze: a) Una din ipoteze este c& in cadrul procesului de transfer al electronilorare loc formarea unui procdus intermediar covalent, mactoergic, precursoral ATP (in analogie cu procesele similare). b) Oalta ipoteza presupune ca energia oxidari este preluata de o protein ce se iiseste intr-o conformatie activ’, care ulterior stimuleaza sinteza ATP. Investigafiile n-au confirmat atare ipoteza. ) Piter Mitchell postuleaza, in 1961, mecanismul hemiosmotic. Savantul a presupus c& anume cuplarea transferului de electron i sinteza ATP se datoreaz4 gradientului de protoni, ce se stabileste intre partea interioara si cea exterioar amembranei interme mitocondriale, Anume transferul electronilor (energia eliberati la transferul lor) pompeaza H" din interior spre exterior, sporind concentratia ionilor H” in exterior -regenereazi potentialul membranar cu semnul (4) 32, Modelul hemio- smotic. In’ aceasta. simpli tue Precentareaicorie hemiosmoice —S nihinndobroinonnnna gk “plicaté mivocondveh, electron _ age din NADI salt substrat * che Spatiut oxldabi tree primtr-un lant de v aed '@ inertembranar proveine arenjate simetri in secre rity, membrana Interna.” Flusul lee tlecironilor este cuplat de transferul de protoni de-alungul 4 ¥ tmembranel, producind a pata OeL CRORES tte = ‘gradient chimie(3p1D, ct sun soccinge Famer 120,+210"4° Grerad mitocondrtat este NADASICNAD i inpermeah ‘proton protonii pot reintra in matrice doar prin canalele proton spocifice (F). Forte motrice ce conduce protonti inapat in ‘maurice asiguri energia pentru sinteza ATP, catalizaté de . complesal F, asocat eu F, Matrice (N) ern ApH a pi -202-Energia electronilor se stocheaza, deci, initial in gradientul protonilor, apoi apare 0 fort proton-motrice ce conditioneaza sinteza ATP in complexul enzimatic ATP- azic (fig.3.12.) Esenta general a mecanismului consti in faptul cd actul primar de stocarea ener- gici ilconstituie transferul protonilor prin ‘membrana inten’, cu formarea gradientu- lui proton. ‘Numeroasele date experimentale con- firma conceptul lui Mitchell: 1)S-aconfirmat generarea gradientului in cele trei puncte ale lanfului respirator. Gradientul protonie generat in ele se utili- zeaziilasinteza moleculelor de ATP. 2) S-a demonstrat ed pH matricei ‘mitocondriale cregte, iar amediului extern Figura 3.139, Complexul mitocondrial ATP sintaza almitocondriilor scade, mediul fiind mai acid. 3) A fost argumentatiteza cd transferul 1’ din mitocondrii in timpul transferului elec tronilor sirevenirii lorprin moleculele de ATP-sintaza sunt comparabile cu viteza lor din cadrul proceselor de fosforilare oxidativa in mitocondriile intacte. Teoria hemiosmotic’ postuleazi ci ionii de H* translocati in exterior datorit& energici de transfer electronilor revin in mitocondrii prin canale speciale, ionice, localizate in complexul ATP-azie. Acest flux de protoni este forta mottice care determina sinteza cuplatiia ATP din ADP si Pi. ‘Complexul enzimatic, denumit A7P-sintaza sau FF, -ATP-aza,se compune din factorii F, si F,. Ultimul se afld in matricea mitocondriala. Savantul Efraim Racker La izolat si in aceast® stare izolats de F, scindeazi ATP (F,- ATPaza). Masa molecularie de 380 kDa gi confine nou subunitii incluse in cinci tipuri diferite, fiind jonctionate si confinind citeva locusuri de fixare pentru ADP si ATP. F, e fixati deF., ‘aceasta fiind parte component’ a membranei inteme,o transverseaza complet. Zero (nit edecito litera) inseamni ci aceasta parte a complexului leagi un antibiotic toxic — oligomicina ce simultan inhibi fosforitarea oxidativa. Structura complexului FF, dedusd prin studi biochimice si cristalografice de John E Walker, este redati in fig 3. 13a, fn P, tei subunitiq si 3 fi sunt aranjate precum felile altemate ale unei portocale. In centru se fl& subunitatea Cele doud subunit ale F, se asociaza ferm cu subunitiile c. si Bale F,, mentininducle tris ling membrand. In F.cilindral membranaral subunititilor este atasat la subunititiley, si eae Iu F,. in timp ce protonii «curg» prin membrana din diectiaP spre N- via F,,complexul cilindrie se roteste si subunitatile f F, isi schimba conformatia; subunitatea y se asociaz’ cu fiecare in parte, -203 -in fig. 3.13b este redata conformatia lui F,, vazut& din directia Nmembranara, cu cele rei subunititi fl si 3 ola periferie si subunitatea y in centru, Pe fiecare subunitate B, la interfata ei cu ct, este prezent un site de legare nucleotidic, Subunitatea y se asociazi primar cu una din cele trei perechi of, forgind treceres lor in diferite conformatii cu generare de ATP. In cursul evolutiei, s-au dezvoltat citeva tipuri de transportatori activi ATP- dependenti, diferenjiindu-se in structura, mecanism, localizarea in fesuturi specifice si compartimente intracelulare (vezi tab.3.1) ATP-azele de tip P sunt ‘transportatori ai ATP-ului ce Figura 3136, Conformatia complexulul Fy vical conduc cationii fosforilati din diretia N membranara reversibil de cdtre ATP, ca parte a ciclului de transport. Toate ATP-azele de transport de tip P au asemaniri in secvenfa aminoacidica, mai ales in apropierea reziduului Asp ce sufer’ fosforilare, si toate sunt sensibile la inhibifie de citre analogul fosfat ~ vanadatul. Fiecare este o proteind integral cu multiple regiuni de _deschideri” membranare intr-un singur polipeptid, unii avind si oa doua subunitate (fig.3.14a). ‘Transportatorii de tip P sunt larg raspinditi. iu fesuturile animale, Na”, K*- ATP-aza, un anticonductor pentru Na", K~; Ca°*- ATP-aza, un uniconductor pentru Ca. Tipul P al ATP-azei mentine dezechilibrul in compozitia ionica dintre citozol si mediul extracelular Celulele parietale ale stomacului mamiferelor au o ATP-azi de tip P ce pompeazi H’ si K* de-a lungul membranei plasmatice, deci acidific’ si continutul stomacal. La plantele superioare, ATP-aza de tip P pompeazi protonii afara din celul,stabilind o diferentd de 2 unititi pH si250mV de-a lungul membranei plasmatice. OATP-aza de tip P similara din mucegaiul piinti, Neurospora, pompeazi protonii din celula pentrua stabil un potential negativ pe partea interndia membranei, utiliza pentru a ceoneduce aport desulstratr gi ianii din medil Inconjuasitor prin transport activ secumdar Bacteria foloseste ATP-aza de tip P pentru pompa in afard ionii metalelor grele, precum si Cd, Cu +204‘Tabelul 3.1, Localiarea, tinal de membrana srolulcelor patra tipuri de transportatord ATP-aciet ‘Organism Rolul sau fesut___membrana ATP-acele det P Nek Tera Pras ENTIRE ERAT NT ATTA animale Kin interiorul celle, ereaz8 potential transmembranar eleetrolitic HK" Colule acid- secretorii Plasma Acidifiaza continutul stomacal (parietale)ate smamiferclor ce Fungi Plasma Creaza gradientul FT pentru a (Neurospora) + dinije transport! secundar HY Plante Plasmi | exttacelular in interiorul celulei superioare } ca Tesutun Plasma Mentine Ca® seézut in animale citozol ca Mivcite Reticuls Sechestreazi Ca? intracelular animale endoplasmatic _menjinind Cs setzut in citozol CaP, Hee, Cu —Bacteri Plasma Pompea2i ionii metalelor grele sin colule ATPoazele de tip V iF inal eaicile endozomale > —_compartiment, activind 8 Plame ‘vacuolar | proteazele si alte enzime superioare | hee Fun Vacuol F joie Paviea at amitocondriei Catalizeaz formarea de ATP Plante Tilacoid =} din ADP + Pi superioare | Procariote Plasma} Celule Plasma’ Tndepirieazi’ o mare varietate de | animale produse naturale hidrofobe si tumorale droguri sintctice din citozol, inclusiv vinblastina, doxoru na, actinomicina D, mitomicina wxolul, colchicina, =205-O clasi diferiti de ATP-aze responsabile de transportul ionilor este corelati cu acidfierea compartimentelorintracelulare la multe organisme. Vacuolele fungilor si ale uunor plante superioare mentin un pH intre 3 516, cu mult sub cel ce inconjoara citozolul (plI=7,5), prin activitatea ATP-azei de tip V—pompa de protoni. ATP-azele de tip V (V de la vacuole) sunt responsabile si de acidifierea lizozomilor, endozomilor, complexului Golgisiveziculelor seeretori din celulete animale, Structural, nu sunt inrudite cu ATP-azele de tip P, nu sufera fosforitarea ciclica gi defosforilarea, nici nu sunt inhibate de vanadat. Toate ATP-azele detip V auostructuri, complex similar’, cu un domeniu integral (transmembranat) (V,) ce serveste drept canal protonic, siun domenin periferic (V, )ce confine site-ul ATP de legare gi activitatea ATP- azici (fig.3.14.b). Mecanismul prin care ATP-aza de tip V cupleaza ATP —hidrolizarea pind la transportul protonic, nu este ined pedeplin cunoscut. Pompele protonice detip V sunt aseménitoare structural si, probabil, ca mecanism, cu o treia familie de pompe protonice, ATP-azele de tip F. Figurad.t4, Sructura subunttard a trettipurt de ATP-azetransportatoure. a) ATPoacele de ip Pau, in general, dowd tipuri de subunit protece integrae. Subunitatea a care este fxenfial, are un recidu Asp fosforila in tinpul wransportului medicamentelor. B)ATP-acete de tip V au wn domeniu periforie V, compus din 7 tipuridiferite de subunit, inctacind fret A sited B, sin domenia integral Vy cu trl tipurt de subunit ce includ multiple copit ale lu e ©) ATP-azele de'rp Faw un domentu periferic F omolog cu V, al ATP-azelor de tip ¥z Porflanea integrala a ATP-acelor de tip F, Fy de asemened are wei tipurl de subunit eu multiple copi ale tui P,cum ar iNav, ATPeaca mised dot toni tn direct opuse. Pempele de ip V si F ‘ged protonié nero direetie. ATP-azele de tip F joac.un rol central in reactia de conservare a energie’ la bacterii, ‘mitocondri si cloroplasti Ele catalizea7a trecerea transmembranar&a protonilor, condusd -206-prinhidrolizarea ATP, ca sireactiainversd in care fluxul de protoni determin’ sinteza ATP (fig.3.14c). inal doilea caz, ATP-azele de tip F sunt denumite ATPsintaze. Gradientul protonic in fosforilarea oxidativa si fotofosforilare este stabilit de o alti categorie de pompe proto ‘ce au ca sursi substratul oxidativ sau lumina solara. ATP-azele de tip F/ATP-sintazele sunt complexe multisubunitare ce asigur’ por transmemranari (proteina integrala F,) pentru protoni si molecule (proteina periferica F, ),ce fololsesc energiea cliberata din protoni (F,) pentru a forma ‘puntifosfoanbidridice de ATP. Sintetizarea ATP gi activitatea ATP-azicd se afl in proteina F, (fig.3.14c). La mijlocul anilor 1980 a devenit evident ci unele tumorisuntrezistente la un numar de compusi antitumorali. Investigatiile au ardtat cA membranele plasmatice ale acestor tumori congin un transportator— ATP-dependent ce poate exporta multi compusi medicamentosi diferiti, prevenind acumularea lor in celulele tumorale si efectelelordeinhibitic tumorala. Medicamentele transportate difera chimic, dar sunt hidrofobe. ‘Transportatorii de medicamente prezinta oproteini integral, cu masa molecular de 170 kDa, 12 segmente membranare si dowd site-uri de legare a ATP-ului. Ele sunt responsabile de eliminarea medicamentelor din citozolul celulei tumorale. Exportul de medicamente are loc prin hidrolizarea ATP-ului. ‘Transportatorii de medicamente sunt, de asemenea, si canale ionice, care favorizeazi in mod specific trecerea Ct Jadiminuarea gradientului de concentrafie independent de ATP. in boala geneticd fibroza cisticé defectul determinant este in gena care decodeaza o proteina transportatoare de Cl (reglator transmembranar CFTR), ce poate fi inrudita cu transportatorul de medicamente in celulele tumorale. + NO, Matricea ! NO, H el 4 vce | ey chaeet oa pit tr oO , NO, , woo Hoyt .#H t Hoos H H f fs No, H a H NO, 2,4 Dinitrofenol Figura 3.15, Influenya DNP la rransportul de in mitocondrli =207-