272 SESSION 2007 7 SECOND CONCOURS ECOLE NORMALE SUPERIEURE BIOLOGIE-BIOCHIMIE Durée : 4 heures Liasage des calculatrices électroniques de poche a alimentation autonome, sans imprimante et sans document d’accompagnement est autorisé Copendant, une scule calculatrice & la fois est admise sur la table ou le poste de travail. Awcun échange n’est permis entre les candidats. Consignes générales Lepreuve est constituée de 7 parties qui peuvent atre traitées de fagon indépendante. Toutefois, attention des candidats est attirée sur le fait que des informations données dans une partie peuvent étre nécessaires dans des parties postérieures. 1 est rappelé aux candidats que la notation prendra en compte non seulement la clarté et la précision de leurs réponses, mais également la qualité de leur expression et de leur présentation. Si, au cours de lépreuve, un candidat repére ce qui lui semble étre une erreur ofénoncé, il le signale ‘sur sa copie et poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives quill a été amené a prendre. Tournez la page S.V.P.L’agrégation des récepteurs cholinergiques nicotiniques : un processus essentiel dans la mise en place de la jonction neuromusculaire La mise en place des synapses constitue un probléme central de la neurobiologie qui peut étre étudié au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM) des vertébrés od, suito au contact avec le motoneurone pré-synaptique, la fibre musculaire squelettique se spécialise dans la région synaptique. Cotte spécialisation se caractérise en particulier par une agrégation des récepteurs cholinergiques fiicotiniques (AChR) au sein de la membrane post-synaptique. Tous les signaux nécessaires & induction de cette agrégation ne sont pas encore identifiés, mais Tun dentre-eux est 'agrine, un protéoglycane & héparane sulfate séorété par le motoneurone pré-synaptique. Le but de ‘ces experiences est d'étudier autres molécules impliquées dans la spécialisation post-synaptique, Adentification de Ia tyrosine kinase MuSK. 1 ~ Llobservation que de nombreux signaux extracellulaires sont convertis par des récepteurs & activité tyrosine kinase (RTK) conduit a rechercher si un tel récepteur qui serait spécifique du musclo savelettique peut étre identifié, Tous les RTK se caractérisent par la présence dans leur séquenca un domaine kinase intracellulaire homologue a celui trouvé dans différentes enzymes a activité tyrosine kinase (TK) (Figure 1). Figure 1 — Alignement du domaine kinase de quatre membres de la famille TK, Les résidus identiques dans toutes les séquences sont indiqués en rouge, les résidus présentant des propriétés similaires sont indiqués en vert. Les pointllés indiquent des lacunes insérées pour optimiser talignement. La recherche d'un ATK spéeifique du muscle squelettique est réalisée par PCR. Dans ce but, une banque d'ADNe est construite en utilisant tous les ARNm purifiés a partir c’un muscle squelettique. Les ADNe codant pour des protéines a activité TK sont recherchés dans cette banque par PCR en utilisant les oligodésoxynucléotides déaénérés suivants amorce 5/ (sens): 51 -TCTTGACTCGAGA(7/C) (1T/C) P(N) GC(N) AC(N) (C/A) G(WN)-3" amozce 3/(antisens): 5’ -GAATTCGAGCICCC (A/G) (A/T) A(N) GACCA(N)AC(A/@)TC-3/ Un oligodésoxynucléotide est cit dégénéré si au moins une de ses positions correspond a plusieurs bases. (N) indique inclusion des 4 bases en proportions équivalentes a une position donnée, (T/C), (CIA), (A/G) ou (A/T) indiquent respectivement insertion des bases T et C, Cet A, Act G ou Aet Ten proportions équivalentes & une position donnée. Les séquences soulignées ne s‘hybrident pas avec les ADNc et sont utilisées pour cloner les produits de PCR obtenus dans un plasmide et réaliser une nouvelle banque, Cette nouvelle banque est alors criblée dans le but d'éliminer les séquences codant des protéines & activité TK déj& connues et le séquengage des clones restants révéle une unique séquence ucléotidique codant une partie de domaine kinase, Cette nouvelle séquence permet disoler 'ADNe complet correspondant dans la banque initiale construite a partir des ARNm totaux. Cet ADNe complet code une protéine d'environ 100 kDa appelée MuSK (Muscle-Specific Kinase). Lanalyse de expression de MuSK révele que cette proteine est bien exprimée uniquement dans le muscle squelettique. Rappelez le principe de la POR. En vous appuyant sur les annexes 1 & 2, alnsi que sur Ia Figure 1, justifiez le choix des oligodésoxynuciéotides employés.ll: Etude du phénotype de souris invalidées pour le gene MuSK 2— Afin d'étudier la fonction de la protéine MuSK au cours du développement du muscle squelettique, des souris invalidées pour le gene MuSK sont consiruites (Figure 2). Le domaine kinase de la protéine MuSK comprend 11 sous-comaines (SD1-11) codés par 3 exons. Le sous-domaine 1, comprenant le domaine de liaison de TATP, est codé par Texon 1, Les sous-domaines 5-11, ‘comprenant la région catalytique, sont codés par Fexon 3. Figure 2 — (A) Représentation schématique de l'aliéle sauvage du géne MuSK et de fallale mutant correspondant obteny eprés recombinalson homologue avec le vecteur de ciblage au niveau des zones encadrées par les pointilés. Les 3 exons codant le domaine TK de la protéine MuSK sont figurés par des bottes nolres. Les cassettes de résistance (neo: néomycine & tk: thymidine kinase) qui servent & la sélection des cellules souches embryonnaires ayant recombiné Valléle sont représentées par des boltes blanches. La taille des fragments de restriction oblenus aprés digestion EcoR! (R) ou Neo! (N) des ADN génomiques est précisée dans chaque cas. Les positions a'hybridation de la sonde 5° et de la sonde kinase employées pour détecter les ADN. génomiques sauvages et mutants sont indiquées. (B) Transfert de type Southern (Southern biot) Feprésentaif obtenu avec les ADN génomiques de trois sours différentes digérés par EcoRI ou Nool et hybridés avec la sonde 5' ou la sonde kinase. Quelle région du domaine kinase est supprimée lors de la construction des souris Invalidées pour te géne MuSK ? Déduisez les génotypes des souris 1, 2 & 3 en utilisant le schéma expliquant Ja construction réalisée. Indiquez ces génotypes en utilisant la convention classique : +/+: sauvage, +/- : hétérozygote, -/-: homozygote invalidé. 3 — Les souris mutantes MuSK -/- sont immobile & la nalssance et meurent immédiatement apres. Diférentes analyses histologiques sont conduites sur ces mutants. (Figure 3) Figure 3 — Analyses histologiques post mortem de poumons (A.B) et de muscles des membres inférieurs (C,D) de souriceaux nouveaux-nés de génotypes MUSK -/- et MuSK +/+, La coloration employée est un rouge-éosine qui permet de colorer respectivement noyau et cytoplasme. ‘Comparez ces analyses histologiques. Lanalyse histologique des poumons permet-elle d'expliquer la mort des souriceaux mutants MuSK -/- ? 4 ~ La localisation de différentes protéines caractéristiques de la JNM est analysée ensuite sur des diaphragmes entiers pour étudier Forganisation des synapses chez les souris mutantes MuSK -/- (Figure 4). Le choix du diaphtagme se justifie en raison de son organisation simple et de sa structure fine permettant de visualiser tes synapses dans des préparations de muscles entiers. Le nerf Phrénique est orients perpendioulairement au long axe des fibres musculaires et s'Stend a travers la région centrale du muscle. Figure 4 — Des diaphragmes entiers de souris sauvages (A,C) ou de souris mutantes MuSK 7+ (B,D) sont marqués simuitanément avec des anticorps anti-synaptophysine (SYN) couplés & la fluorescéine et avec de I'a-bungarotoxine (a-BGT) couplée & la thodamine. Les fisches en A et B indiquent la position du nerf phrénique. luorescence est présente en D, mais elle est diffuse. Echelle : 100 jum, identique pour fous les clichés. La synaptophysine est une protéine transmembranaire majeure des vésicules synaptiques considérée ‘comme un marqueur de la terminaison nerveuse. Quelle est la molécule marquée avec I'a-bungarotoxine ? (Que pouvez-vous conclure de vos observations quant au réle de MuSK ? Pouvez-vous faire un lien entre vos conclusions et les analyses histologiques précédentes pour expliquer la mort des souriceaux mutants MuSK -/- ?lle La tyrosine kinase MuSK : un récepteur de l'agrine ? 5 ~ L'agrégation des ACHR induite par l'agrine est étudiée in vitro sur des myotubes. Les myotubes sont des cellules plurinucléées qui résultent de la fusion de cellules embryonnaires mononucléées, les myoblastes. Cette fusion s'accompagne de acquisition par les myotubes des_marqueurs moléculaires caractéristiques de la différenciation musculaire. Lés fusions successives entre myoblastes et myotubes permettent la croissance progressive des myotubes et leur différenciation en fibres musculaires responsables de la contraction musculaire. Les expériences qui suivent cherchent préciser le réle joué par le ATK MuSK dans le processus d'agrégation des AChR (Figure 5). Figure 5 ~ Des myotubes prélevés a partir de souris sauvages ou mutantes MuSK -/ sont treités avec des concentrations oroissantes dagrine (0,01 — 100.:nM). Aprés marquage avec de a: BGT coupiée & la rhodamine ils sont photographiés (A: traitement avec 100 nM agrine, bao we to sae > Oe ste 12101Figure 3 -c'aprés DeChiara et al. Col 85 (1996) MuSK -I- MuSK +/+ ae Figure 4 —c‘aprés DeChiara etal. Coll 85 (1996) MuSK +/+ MuSK -I- a-BGT 13721Figure 11 ~ capras Herbst et al. EMBO u. 19 (2000) A *églonjuctamembranaire v576 domaine kinase | F vogo, yrs4, v755 ver B 100 = 0 = & g g 0 $ 5 2 2 a F Y7S0F ysze 812F WT Yssar Yossr Y7S0E STO v% Yer c Agrégats ACHR (%) WT NEGOA PSBIA Y553A 17124Figure 12 - depree Herbst et el. EMBO J. 19 (2000) A MMM MTT MMT MuSK ecto MuSK ecto Musk ecto [) MuSK NPXY TrkA NPXY MuSK NPXY MuSK dk TrkA dk TrkA dk B c Rx ek: = MMM Tn eee aorine: TT = sso’ Biot: Biot: ani-Psye ant-Paye antePaye anti musk| en-THHA aNteACHRR w. D g MMM MIT MMT z 10 10: 10 g E = 8 8 S 5 5 2 ole ° ole Agrine: = + - + ace 18/21Figure 13 - caprés Weston eta. J. Col ot. 150 (2000) & Weston etal. J. Bot. Chem. 278 (2008) A 40 B 3,0 £30 3 z 2 20 5 - 5 20 a g i 10 10 | E oO = 0 posh trie Fach2 aging = = Contrdle RacN17 c en I mcroogrégats Baste 3g 40 g 3,0 Zao 2 210 ol Ges novi acvi2 hove faevi2 Figure 14 - adapté d'aprés Weston et al. J, Cell Biol. 150 (2000) & Weston etal. J. Biol. Chem. 278 (2003) A Myoblastes Myotubes ee eeee eee Agrne - + = + i | <— rac-PEDiié = | Rac total Myoblastes Myotubes Agine - + = + oo _|<— Rho-TRBD lié [oe eet sme ama | <— Rho total 19/21Figure 15 - c'aprés Weston et al. J. Cell Bio, 150 (2000) Myoblastes Myotubes HEK IE Sp PERRET peepee [SS recon Agine = # = = + os = te Anisomycine - - + = = + = = + Figure 16 ~ adapts depres Lacazette etal. J. Cel Biol, 161 (2008) * 1 oven : : : activité luciférase 20/21Figure 17 - adapté daprés Hoch et al. Nature Medicine 7 (2001) A ‘Sujet sain Sujet NG-Ac-a-ACHR séronégatit +aorine FON ait o ° Agrégate / champ ‘Agrégats / champ Be 1 2 3 4 6 He Pos 3 cones ~harine Figure 18 ~ adapté daprés Hoch et al. Nature Medicine 7 (2001) > oe oN ot WW GS GO WP ew oF 118 kDa — sia iii RR 90 kDa —' 70 kDa — 55 kDa — 221