Genetika toksikologija

detekcija genotoksinih agenasa u ovjekovom okoliu

cilj genetike toksikologije je otkrivanje agenasa koji imaju mogunosti izazivanja
genetikih promjena u germinativnim i/ili somatskim stanicama organizama,
prvenstveno ovjeka

Testovi genotoksinosti
- genetike tehnike mjerenja direktnih ili indirektnih oteenja DNA kod bilo kog
organizma
- specifini su jer veliina molekule DNA kao cilj genotoksinih agenasa, te osobine i
dinamika procesa reparacije se razlikuju od organizma do organizma
Svojstva koje moraju imati testovi za genotoksinost
- informirati o stupnju rizika za ovjeka
- osjetljivost
- mogunost ponavljanja
- primjenu ispitivanja veeg broja genotoksinih agenasa
- brzina, jednostavnost izvoenja i ekonomski prihvatljiva cijena
Testovi za detekciju genskih mutacija
- test reverznih mutacija kod Salmonella Typhimurium
- test reverznih mutacija kod E.coli
- test genskih mutacija u kulturi stanica sisavaca
- test spolno vezanih recesivnih letalnih mutacija kod Drosphile Melanogaster
- test genskih mutacija kod Saccharomyces Cervisiae
- spot test kod mia
Testovi za detekciju kromosomskih mutacija
- in vivo citogenetski test
- in vitro citogentski test
- mikronukleus test
- test dominatno letalnih mutacija
- test nasljednih translokacija
- citogenetski test na spolnim stanicama sisavaca
Testovi za detekciju efekatan na razini DNA
- neplanirana sinteza DNA in vitro
- izmjena sestrinskih kromatida (SCE)
Znaajniji testovi
- in vivo nego in vitro
- na eukariotima nego na prokariotima
- na sisavcima nego na niim organizmima

na germinativnim nego na somatskim stanicama

Strategija testiranja na genotoksinost

- testiranje u tri razine (three-tier sistem)
- baterija testova
Prva razina
- na mikroorganizmima (in vitro)
- ako je rezultat negativan, a agens se ne koristi u irokoj uporabi, daljnja testiranja se
ne izvode (osim ako je aditiv hrani ili lijeku); u sluaju pozitivnog rezultata koristi se
bezopasna zamjena, a ako je nema, agens ide na daljnje ispitivanje
Druga razina (korak potvrivanja)
- na viestaninim eukariotima (vinska muica i kulturi stanica sisavaca); in vitro
- agens koji je i u prvom i u drugom koraku negativan smatra se nekodljivim u
genotoksinom smislu; ako je potvren pozitivan uinak smatra se sigurnim
genotoksinim agensom i upuuje na daljnje ispitivanje ako nema bezopasne zamjene
Trea razina (procjenjuje rizik za ovjeka)
- na sisavcima (in vivio)
- negativan rezultat nakon prva dva pozitivna govori o potencijalnom genotoksinom
efektu, ali s malim rizikom za ovjeka
- pozitivan rezulat govori o visokom riziku za ovjeka, a u sluaju opredjeljenja za
koritenje treba procijeniti rizik i korist te odrediti uvjete uporabe
Baterija testova
- sastoji se od nekoliko (ne vie od pet) testova koji se izvode istovremeno na razliitim
razinama detekcije
- krae trajanje ispitivanja ali i vie cijena jer se izvode svi testovi
Test genskih mutacija kod Saccharomyces Cervisiae
- pivski kvasac je jednostanini eukariotski organizam pogodan za detektiranje
kromosomskih i genskih mutacija
- mogue je registrirati genske mutacije na lokusima adenin-1 i adenin-2 pri emu
dolazi so poremeaja u biosintezi adenina to ima svoj fenotipski efekt (normalne
kolonije bijele boje, mutirane crvene boje)
Spot test kod mia
- stop test je in vivo test na mievima u kome su embriji u razvoju izloeni
potencijalnim kemijskim mutagenima a ciljani geni su oni za pigmentaciju dlake;
mutacija u tim genima dovode do pojave recesivnih fenotipova koji se ogledaju u
pojavi mrlja (spotova) na dlaci

Test spolno vezanih recesivnih letalnih mutacija kod Drosophile Metanogaster

- mjeri frelvenciju genskih mutacija u germinativnim stanicama muijaka vinske muice
- potrebne dvije linije muice: s normalnim i s mutantnim fenotipom to se vidi u
morfolokim promjenama oka; nakon tretiranja mujaka potencijalnim mutagenom i
sparivanjem sa enkama, u potomstvu se prati da li je dolo do uginua mujaka
uslijed recesivnih letalnih mutacija
Testovi genotoksinosti
- citogenetika analiza kromosomskih aberacija
- izmjena sestrinskih kromatida (SCE); SCE = sister chromatid exchange
- mikronukleus-test
- amesov test
Amesov test
- detektira iroki spektar mutagena, ukljuujui promutagene (uvoenjem ekstrakta
jetrenih enzima)
- postoje dva bakterijska soja: his- kome treba za rast prisustvo histidina u podlozi i his+
kome ne treba; metabolika frakcija se pomijea s bakterijskim sojem his- i s
potencijalnim mutagenom te se stavi na podlogu bez histidina
- identifikacija bakterijske kolonije kod kojih je dolo do povratnih mutacija (his- u
his+) to ukazuje na mutagenost ispitivanog agensa
Neplanirana sinteza DNA (UDS)
- UDS = unscheduled DNA synthesis
- manifestacija procesa popravka DNA kao mjera induciranog DNA oteenja, registrira
se autoradiografskom metodom tako da se radioaktivno obiljei timidin koji se
inkorporira u novosintetiziranu DNA molekulu
Izmjena sestrinskih kromatida (SCE)
- u stanicama dolazi do odreene frekvencije spontane izmjene sestrinskih kromatida
koje moemo vizualizirati
- linfociti periferne krvi ovjeka se tretiraju potencijalnim mutagenom nakon ega se
gleda da li se poveao broj SCE
Kromosomske aberacije u stanicama sisavaca
- in vitro: stanice se tretiraju potencijalnim mutagenom u razliitim koncentracijama te
se usporeuju sa pozitivnom i negativnom kontrolom
- in vivo: mievi se tretiraju potencijalnim mutagenom i onda se vri analiza kako
somatskih tako i germinativnih stanica
Mikronukleus-test
- detektira oteenja kromosoma ili mitotskog aparata u stanicama sisavaca, uvjetovana
kemijskim agensima

promatranje ekstranuklearnih tjeleaca u staninoj citoplazmi koja su posljedica

nastanka acentrinih fragmenata nastalih nakon kromosomskih lomova
ivotinje se tretiraju potencijalnim kemijskim mutagenima, uzima se kotana sr i
broje mikronukleirani eritociti i usporeuju s kontrolnom skupinama

Test dominantno letalnih mutacija

- in vivo test na mievima za detekciju genotoksinih agenasa koji induciraju
kromosomske i genske mutacije koje ne sprijeavaju fertilizaciju ali ne omoguavaju
preivljavanje embrija
- djelovanje potencijalnog mutagena se utvruje usporedbom broja mrtvih i ivih
implantanata
Test nasljednih translokacija
- ispituju se efekti zraenja i kemijskih mutagena na svim stadijumima germinativnih
stanica
- tretirani mujaci mieva se sparuju s normalnim enkama i onda se vri testiranje
fertilnosti (broja ivih i mrtvih implantanata, veliina okota po roenju) i citogenetska
analiza u svim stanicama spermatogeneze
Mutacija
-

frekvencija spontanih mutacija

frekvencija induciranih mutacija

/bp/generaciji
do
/bp/generaciji

Inducirane mutacije:
- fiziki mutageni (zraenje): neionizirajue (UV); ionizirajue (X, atomsko, kosmiko)
- kemijski mutageni: analozni baza; modifikatori baza; interkalirajui agensi
- bioloki mutageni: virusi
Fiziki mutageni (zraenje)
- neionizirajue (UV) zraenje stvara pirimidinske dimere i T6-4T fotoprodukt
- ionizirajue zraenje zraenje koje ima dostatno energije da razbije neutralne
molekule u elektriki nabijene estice ione; tj. da izazove ionizaciju kroz neku
materijalnu sredinu; nastaje elektromagnetskim valovima (rengen i -zrake) ili estice
kao to su elektroni, nutroni ili ioni
- promjene koje zraenje izaziva na ivim tkivima nazivamo biolokim djelovanjem
zraenja
- ionizirajue zraenje fizikalna zbivanja (meudjelovanje zraenja i materije,
neznatno povienje temperature i pojava ionizacije u tkivima); kemijske reakcije
(ionizirane molekule kemijski su vrlo aktivne, direktno i indirektno djelovanje
zraenja); bioloko djelovanje
- efekti zraenja: direktni i indirektni; reverzibilni i ireverzibilni; somatski i genetski

uzroci oteenja stanice: promjene na molekulama vode (70-80%) idirektno

djelovanje zraenja; promjene na organskim molekulama direktno djelovanje
zraenja
oteenja DNA molekule koja remete njenu replikaciju ili prijenos ifre na RNA:
hidriranje baza (dolazi do trazicije i transverzije); nedostatak purinske baze; promjena
baze (npr. deaminacija); prekidanje vodikovih veza meu bazama; dimerizacija;
unakrsni povezivanje DNA i proteina; dvostruki ili jednostruki prekid lanaca izmeu
eera i fosfata (lom) ili eera i baza
kromosomske aberacije citogenetika analiza ovih aberacija prema potrebi se
provodi u osoba koje rade s izvorima ionizirajueg zraenja
mutacije (tokaste) izazvane radijacijom najee su recesivne

Kemijski mutageni (prvi dokaz)

- 1942. Charlotte Auerbach uoila slinost izmeu promjena na koi izazvanih mustrad
plinom i promjena izazvanih zraenjem
- 1961. Conen i Lansky prikazali nalaz kromosomskih aberacija u osoba tretiranih
mustrad plinom
- metabolika konverzija promutagena / prokarcinogena u mutagen / karcinogen
- velika grupa genotoksinih agenasa tek u organizmu metabolikom transformacijom
(djelovanje enzima) postaju mutageni / karcinogeni agensi
- analozi baza ubacuju se u DNA umjeto baza uzrokuju mutaciju tipa supstitucije
baza (5-bromuracil umjesto timina
- modifikatori baza kemijski modificiraju baze uzrokuju mutaciju tipa supstitucije
baza (EMS = etil-metanesulfonat alkilira guanin; duina kiselina uzrokuje
deaminaciju baza)
- interkalirajui agensi ubacuju se u DNA izmeu baza uzrokuju frameshift
mutaciju
Genotoksini agensi prirodnog podrijetla
- grupa alkaloida koja ini prirodni sadraj veine biljaka
- produkti metabolizma nekih gljiva
- ekstrakti nekih vrsta paprati
Industrijski genotoksini agensi
- alkilirajui agensi, organska otapala, teki metali
- aldehidi (formaldehid), epoksidi (etilenoksid u tekstilnoj industriji), soli arsea, kroma,
kobalta, kadmija, nikla, olova
- azbest kao karcinogen
Pesticidi
- posebice su vani bromidi i kloridi, npr. dichloromethane ijom kemijskom
tranformacijom nastaje vinil-klorid
- od insekticida poznat DDT koji ima visoku kemijsku stabilnost te se akumulira u
masnom tkivu ivotinja i ljudi

Genotoksini agensi u hrani

- tehnologija prerade suenjem uvjetuje pojavu nitrozamina u hrani (u mesnim
preraevinama, suenoj i prenoj ribi, slanini)
- policiklini aromatini ugljikovodici nastaju u procesima pripreme hrane ivotinjskog
podrijetla dimljenjem ili peenjem na otvorenom plamenu, dospijevaju u tlu, te se
nau u svim namirnicama biljnog i ivotinjskog podrijetla i imaj karcinogeni uinak
- nitrati i nitriti, zatim fosfati i polifosfati koji se koriste u mesnoj industriji
- aditivi hrane u cilju poboljanja ukusa, mirisa, boje, fizikih svojstava i trajnosti su
predmet istraivanja
Genotoksini agensi u vodi
- u sluaju sirove vode osnovni mutageni agensi su podrijetlom iz industrijskih procesa
ili poljoprivrede, a takoer u uzorcima vode za pie je dokazana mutahenost vie
grupa kloriranih organskih agenasa
Farmaceutska sredstva
- antibiotici (pr. Streptomycin u bakterija)
- citostatici (pr. Metatrexat, Mitomycin C)
- narkotici i anestetici (LSD, halotan, fluoren)
- kontraceptivi
- kozmetika sredstva (boje za kosu)
Bioloki mutageni virusi
- 1958. Alikhanian i Iljina pokazali prvi put virusna inducirane mutacije kod gljiva
Actinomyceta
- 1964. kod D. melanogaster
- 1975. u stanicama ovjeka
- i parcijalno inaktivirani virusi mogu biti induktori mutacija (Herpes simplex)
- uzrokuju kromosomske aberacije (lomove, delecije, translokacije)
- DNA i RNA virusi uzrukuju genske mutacije (insercija dijelova viralnog gena u DNA
domaina izaziva mutaciju pogoenih gena)
Podjela DNA oteenja s obzirom na njihovu detekciju
- makrolezije detektabilne citogenetskim analizama kromosoma
- mikrolezije na razini nukleotida
- izloenost zraenju se ne mjeri samo u okoliu, ve i u genetikoj podlozi izloenih
osoba
Nastajanje strukturnih aberacija kromosoma
- kao posljedica loma ili prekida (ouvan kontinuitet ali reducirana kromatidna masa) na
kromosomu
- kromosomski dijelovi nakon loma tee ponovnom spajanju
- pravilno spajanje = restitucija
- nepravilno spajanje ili gubitak kromosomskog dijela = strukturna

jednolanani lom DNA izazvana zraenjem je samo na jednom lancu, a dvolanani

lom na oba lanca
lom se moe dogoditi: prije DNA replikacije oteene obje kromatide,
izokromatidni (kromosomski) lom; nakon DNA replikacije oteenja jedna
kromatida, kromatidni lom
uzroci kromosomskih lomova: fiziki agensi, kemijski agensi, bioloki agensi
mutageni

Citogenetika analiza kromosomskih aberacija

- pouzdan test procjene oteenosti DNA kao posljedice izloenosti ionizirajuem
zraenju
- strukturne abracije: simetrine i asimetrine; stabilne i nestabilne
Strukturne aberacije kromosoma kao posljedica ionizirajueg zraenja
- kromatidne aberacije: kromatidni prekid (gap), kromatidni lom, jednostruke minute
- kromosomske aberacije: kromosomski prekid (gap), kromosomski lom, acentrini
fragment, dvostruka minuta, dicentrini kromosom, ring kromosom
Nalazi koji odstupa od kontrolnih vrijednosti
- pet ili vie acentrinih fragmenata ili dva ili vie dicentrinih kromosoma ili jedan
prstenasti kromosom ili ukupan zbroj acentrinih fragmenata i dicentrinih
kromosoma jednak ili vei od 5
Granini nalaz
- ukupan zbroj acentrinih fragmenata i dicentrinih kromosoma jednak 4
Test izmjene sestrinskih kromatida (SCE test)
- test procjene oteenja DNA induciranih kemijskim mutagenima
- citogenetska tehnika detektira recipronu izmjenu fragmenata izmeu sestrinskih
kromatida (rekombinacijski popravak)
- analogne baze: 4-bromouracil umjesto timina
- SCE test se bazira na ugradnju BrdU (5-krom-2-deoksiuridin); BrdU analogan timinu
- tzv. harlekin tehnika sestrinske kromatide razlikuju se kao svijetlo i tamno obojene
- normalan nalaz ukljuuje 4-10 izmjena po stanici (ovisno o standardu utvrenom u
laboratoriju)
Izmjena sestrinskih kromatida
- u stanicama dolazi do odreene frekvencije spontane izmjene sestrinskih kromatida
koje moemo vizualizirati
- limfociti periferne krvi ovjeka se tretiraju potencijalnim mutagenom nakon ega se
prati poveanje broja SCE

Mikronukleus test (MN)

- pokazatelj citogenetikog oteenja i genotoksinog uinka raznih fizikalnih i
kemijskih mutagena
- mogu biti klastogeni uinci ili aneugeni uinci
- mikronukleus citoplazmatski kromatin vidljiv u stanici kao mala jezgra uz normalnu
interfaznu jezgru
- mikronukleus nastaje dekondenzacijom acentrinih kromosomskih fragmenata ili
cijelih kromosoma koji se nisu ukljuili u glavnu jezgru nakon anafaze
- kultura limfocita periferne krvi 72h na 37C cytochalasin-B se dodaje nakon 44h
i blokira citokinezu daljnja inkubacija od 28h
- krv se uzima unutar 10 dana od izloenosti mutagena
- analiza: 500-1000 binuklearnih interfaznih stanica
- mikronukleus test detekcija strukturnih kromosomskih aberacija (npr. delecija);
detekcija aberacija koje nastaju uslijed poremeaja funkcije diobenog vretena
(kromosom zaostao u anafazi)
- detekcija oteenja kromosoma ili mitotskog aparata u stanicama sisavaca, uvjetovana
raznih agensima
- promatranje ekstranuklearnih tjeleaca u staninoj citoplazmi koja su posljedica
nastanka acentrinih fragmenata nastalih nakon kromosomskih lomova
- ivotinje se tretiraju potencijalnim kemijskim mutagenom, uzima se kotana sr i broje
mikronukleirani eritrociti i usporeuju s kontrolnom skupinom
Metode molekularne biologije
-

tehnologija rekombinantne DNA, genetiko inenjerstvo

znaaj: proizvodnja velikog broja identinih kopija gena ili DNA sekvence
(kloniranje); nova saznanja o strukturi i funkciji prokariotskog i eukariotskog genoma;
dijagnostika genskih bolesti i primjena u njihovom lijeenju
modificiranje nekog organizma da proizvede protein koriszan ovjeku (inzulin);
promjena svojstva biljaka ili ivotinja
ispitivanje gena i mutacija odgovornih za specifine bolesti (model mia s distrofijom)

Izolacija DNA
- genomska DNA izdvaja se iz raznih tkiva postupkom koji seodvija u nekoliko
standardnih koraka: uzimanje uzoraka homogenizacija tkiva inkubacija uzoraka
u odgovarajuem puferu s Proteinazom K izdvajanje proteina (fenol/kloroform,
isoljavanjem) taloenje, ispiranje i otapanje dobivene DNA
Odreivanje kvalitete DNA
- elektroforeza u 1% gelu agaroze i forografiranje uzoraka u gelu agaroze
- provjera koncentracije i istoe DNA molekule spektrofotometrom
- istoa DNA: omjer apsorbance DNA i proteina (260 nm/280 nm) > 1.7
- koncentracija DNA: apsorbacija naDNA 260 nm x 50 x razrjeenje

Molekularni genetiar koristi

- DNA kare restrikcijski enzimi reu DNA
- DNA sortere gel-elektroforeza razvrstava DNA molekule prema veliini
- DNA kopirka PCR proizvodi mnoge kopije ciljne DNA
- DNA itae DNA probe omoguavaju vizualiziranje DNA
DNA kare
- restrikcijski enzimi reu DNA unutar lanaca na mjestu specifinih sekvenci
restrikcijska mjesta (slijed od 4 do 8 nukleotida)
- broj restrikcijskih fragmenata ovisi o tome koliko je prepoznatljiva sekvenca prisutna
u DNA
- restrikcijski enzimi neki enzimi reu oba lanca izmeu istih nukleotidnih kopija
dajui ravne (tupe) krajeve, dok drugi cik-cak proizvodei ljepljive krajeve
- izoshizomeri razliiti restrikcijski enzimi koji prepoznaju istu nukleotidnu sekvencu
Elektoforeza
- elektroforeza je proces pokretanja nabijenih molekula u elektrinom polju
- molekule se u elektinom polju kreu u ovisnosti o naboju, obliku i veliinu
- najee koriteni medij za elekroforezu: poliakrilamid i agaroza
DNA separator
- gel je horizontalni pravokutni sloj agaroze kroz koji e prolaziti DNA u elektrinom
polju
- negativno nabijena DNA migrira prema pozitivnom polu
- krai DNA fragmenti migriraju bre od duih fragmenata
- gel se formira kada se mjeavina akrilamida i umreujuih (cross-linker) bisakrilamida
polimerizira u duge lance kovalentnih vezama
Poliakrilamidni gel (page)
- elektroforeza u denaturirajuem poliakrilamidnom gelu
- smjesa fragmenata DNA razdvaja se elektroforezom u denaturirajuem
poliakrilamidnom gelu
- SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis) metoda
u kojoj se proteini razdvajaju po molekularnoj teini
DNA kopirka 1
- rekombinantni DNA eksperiment
- DNA izolacija
- cijepanje DNA pomou restikcijskih enzima
- ugraivanje DNA fragmenata u vektor (rekombinacija)
- uvoenje vektora u pogodnog domaina (transformacija)
- kultiviranje na hranjvoj podlozi pri emu se identificiraju transformirane i
netransformiranje stanice

Plastidi
- okruglaste dvolanane DNA molekule u bakterijama
- sekvenca ori dirigira umnoavanje plazmida u stanicama domaina
- selektivni markeri doprinosi otpornosti na toksine supstance; kada plazmidi
tranformacijom uu u stanicu domaina njihova se prisutnost oituje
- jedinstvena mjesta cijepanja (MCS) da bi se ubacile DNA sekvence koje elimo
klonirati
DNA kopirka 2
- PCR = lanana reakcija polimeraze
- prvi korak je denaturacija na 94C pri emu se razdvajaju lanci; drugi korak je
annealing na 54C pri emu se vezuju za lance primeri (forward reverse); trei korak
je ekstenzija na 72C pri emu se uz pomo DNA polimeraze stvara nove DNA
molekule
RT-PCR (real time PCR)
- detektira nakupljanje prokukta kroz reakciju
- eksponencijalna faza optimalna za analizu produkata
- primjena: kvantifikacija ekspresije gena, viralna kvantifikacija, potvrda microarray-a,
djelotvornost lijeenja lijekovima, mjerenje oteenja DNA, detekcija patogena,
genotipizacija (conventional RT-PCR), detekcija GMO
DNA itai
- hibridizacija sonda ili proba
- jednolaani DNA fragment komplementaran traenom dijelu DNA se obiljei
(radioaktivno ili neradioaktivno) i vezuje se za eljenu DNA sekvencu
- southern blot detekcija specifinih gena
- northern blot tehnika koja se koristi za ispitivanje genske ekspresije
- western blot metoda detekije jednog proteina, u mjeavini puno razliitih proteina,
razdvojenih SDS-PAGE-om; nakon SDS-PAGE proteini se prenose na membranu na
kojoj se izvode imunodetekcija
- hibridizacija s DNA-mikroipovima
Tehnika molekulare biologije (PCR-RFLP)
- PCR u dijagnostici hemokromatoza: poremeaj taloenja eljeza u organizmu
- poveana crijevna apsorcija eljeza prekomjerno odlaganje eljeza u stanicama
oteenja jetre, guterae, srca i hipofize
- hereditarna hemokromatoza (HH): oblik primarne hemoromatoze; autosomnorecesivna bolet, prevalncija oboljenih u europi populacije od 1/300 do 1/700
- gel za hemokromatozu: simbol gela HFE, genski lokus 6p21,3, veliina 10000 bp 7
egzona, produkt gela hemokromatozni protein

mutacije HFE gena: C282Y zamjena aminokiseline cistein s tirozinom na mjesto

282 HFE proteina; H63D zamjena aminokiseline histidin s asparaginom na mjsetu
63 HFE proteina
metode: izolacija DNA iz limfocita periferne krvi, analiza mutacija C282Y, H63D
metodom PCR-RFLP, provjera restrikcijskih fragmenata elektroforezom i utvrivanje
homozigota divljeg tipa, heterozigota i homozigota za svaku mutaciju