Glosario

Resolucin: Los solutos se separan en una columna cromatogrfica cuando sus

velocidades de migracin son diferentes. La eficiencia de una columna se mide en
trminos del nmero del platos tericos (n) o mejor an del nmero de platos
tericos equivalentes (N), mientras que la eficiencia del solvente se cuantifica en
trminos de retencin relativa () dos solutos A y B.

tRA

= tiempo de retencin no corregido de A;

tRB

= tiempo de retencin no corregido de B;

tRA = tiempo de retencin corregido de A;

tRB = tiempo de retencin corregido de B.
El efecto combinado de la eficiencia de la columna y del solvente se expresa en
trminos de la Resolucin (Rm) de la columna.
Rm = 2(tRB - tRB) WA + WB
WA

anchura de la base del peak A;

WB

anchura de la base del peak B.

Si WA = WB
En general la resolucin es funcin del factor de capacidad K' x y la retencin
relativa y el nmero de platos tericos en funcin del segundo soluto (n B):

o en funcin del nmero de platos tericos efectivos (N B)

factor
de
selectividad

factor
de
capacidad

= eficiencia
La resolucin puede modificarse alterando las propiedades termodinmicas del
sistema (el cual cambia y K') o las condiciones de la columna (velocidad de flujo,
tamao de partculas, etc) para cambiar N.
Efecto de la temperatura: ecuacin de Van't Hoff:

Exactitud y precisin
La exactitud depende del mtodo y del procedimiento de medida, por lo que habr
que poner especial inters en elegir mtodos y procedimientos de medida que
proporcionen los errores reducidos.
La definicin de precisin no figura en el Vocabulario Internacional de Metrologa
pero a nuestro entender es un trmino necesario que complementa el de exactitud
a la hora de caracterizar los procedimientos de medida. Usaremos en este trabajo
los siguientes planteamientos:
La precisin es una propiedad del procedimiento de medida.
Denominamos precisin al nmero de cifras significativas con que se obtiene una
serie de medidas.
La precisin es una propiedad cuantitativa y se expresa en funcin de la unidad
de medida.
La precisin est asociada al concepto de resolucin de la escala, entendiendo
que la resolucin es la menor diferencia de indicacin de un dispositivo
visualizador que puede percibirse de forma significativa. Por ejemplo, en un
termmetro analgico, donde la escala est graduada a intervalos de 1 C y la
distancia entre marcas es de 1 mm, la resolucin efectiva estar, en el mejor de
los casos, en C ya que a simple vista no es posible diferenciar menores
distancias. Si el termmetro digital mencionado en un ejemplo anterior posee dos
dgitos decimales su precisin est limitada a 0.01 C. Debe notarse que esta
definicin no se establece en funcin del valor verdadero, como ocurre con la
exactitud.
Precisin y exactitud suelen estar relacionados pero son conceptos diferentes: una
cinta mtrica puede ser muy precisa al presentar divisiones hasta milmetros, o
incluso acompaarse de dispositivos para aumentar esa resolucin de la escala,

pero al mismo tiempo ser poco exacta si presenta un error sistemtico o si la

estabilidad dimensional no es suficiente.
La exactitud describe la diferencia entre el valor registrado y el real. La precisin
describe la variacin que se observa al medir el mismo elemento de forma
repetida y usando el mismo mtodo de medicin. Podemos encontrarnos con
sistemas de medicin que se vean afectados slo por alguno de estos tipos de
errores, y otros que sufran de falta de exactitud y de precisin:

Linealidad
Indica que el valor esperado de la variable dependiente depende linealmente de
las variables independientes
El impacto esperado por un cambio unitario de cada una de las variables
independientes, manteniendo las otras constantes, es siempre el mismo.
Podemos descomponer la exactitud de un sistema de medida en tres
componentes:
1. Linealidad: Indica cmo vara el nivel de exactitud obtenido en la medicin
en funcin del tamao del objeto medido. Da una idea de cmo el tamao
del elemento a medir afecta a la exactitud del sistema de medida.
2. Exactitud: Es la diferencia entre la medicin media observada y un valor
maestro. Da una idea de lo centrado o ajustado que est el sistema de
medida.
3. Estabilidad: Es la variacin total que se obtendra al medir el mismo
elemento repetidas veces usando un mismo aparato de medicin. Nos da
una idea de cmo de exacto o estable es el sistema con el paso del
tiempo.

Diferencia entre HPLC y UPLC

Quiere actualizar la tecnologa analtica de su laboratorio pero le preocupa tener

que migrar mtodos validados para HPLC.
Waters est preparada para ayudarle a cambiar. La tecnologa UPLC ha sido
diseada para las separaciones de maana ero manteniendo la compatibilidad con
los mtodos actuales. Benefciese hoy de tener el mejor sistema LC del sector en
su laboratorio, diseado con las ltimas innovaciones y la robustez de la UPLC
para simplificar sus flujos de trabajo en HPLC.
Los fundamentos de la UPLC residen en la curva de van Deemter; Los Sistemas
ACQUITY UPLC se han diseado holsticamente para explotar al mximo las
prestaciones y eficacia de las columnas con tecnologa de partculas inferiores a 2m. Basndose en la misma ciencia cromatogrfica, puede estar convencido que
la utilizacin de la UPLC no comprometer su capacidad de efectuar separaciones
HPLC.

El Sistema ACQUITY UPLC H-Class, combina la flexibilidad de un sistema LC

cuaternario y la conveniencia de un inyector con diseo flow-through-needle para
facilitar la transferencia de mtodos entre HPLC y UPLC.

Los kits para transferencia de mtodos de Waters - Waters Method Transfer

Kits - con una oferta en selectividad y tamaos de partcula, y una reproducibilidad
entre lotes sin precedentes, garantiza la integridad de la separacin al ser
transferida entre plataformas HPLC y UPLC.
Escoger la columna y condiciones adecuadas en UPLC no puede ser ms
fcil con las normas de transferencia que facilita la herramienta ACQUITY UPLC
Columns Calculator
Las distintas opciones en compartimentos de columna facilitan un mejor
control de la temperatura para garantizar la eficacia sistema a sistema.
Una vez transferido el mtodo, el programa Method Validation Manager de
Empower 2 puede ejecutar la rutina de validacin de forma automtica.

Mnimo y mximo
El mximo se refiere al valor ms alto; el mnimo, al ms bajo. En Minitab, usted
puede utilizar los estadsticos descriptivos para mostrar los valores ms alto y ms
bajo de una columna (elija Estadsticas > Estadsticas bsicas > Mostrar
estadsticos descriptivos). Tambin puede utilizar MAXIMUM o MINIMUM en la
Calculadora para identificar un valor extremo que podra ser un valor atpico o un
error de entrada de datos.

El lmite de deteccin (LDD) se define habitualmente como la cantidad o

concentracin mnima de sustancia que puede ser detectada con fiabilidad por un
mtodo analtico determinado. Intuitivamente, el LDD sera la concentracin
mnima obtenida a partir de la medida de una muestra (que contiene el analito)
que seramos capaces de discriminar de la concentracin obtenida a partir de la
medida de un blanco, es decir, de una muestra sin analito presente. El primer
problema aparece en la palabra fiabilidad, puesto que sta implica la introduccin
de la estadstica en la propia definicin de LDD y en su clculo posterior.
Estndar interno y externo
Cuando se quiere cuantificar un compuesto presente en una muestra por el
mtodo del patrn interno, los pasos a seguir son los siguientes:
1. Preparar una serie de disoluciones de concentraciones crecientes, del patrn
correspondiente al compuesto a cuantificar. El intervalo de concentraciones ha de
ser similar a la concentracin del analito en la muestra problema.
2. Aadir a cada uno de los patrones y a la muestra una misma cantidad o
concentracin de patrn interno. El patrn interno ha de ser un compuesto de
naturaleza similar al analito a determinar, pero que no est presente en la muestra.
Por ejemplo, en un anlisis de azcares en fresas un patrn interno podra ser
lactosa, ya que se trata de un azcar, pero no est presente en las fresas.
3. Inyectar el mismo volumen en el cromatgrafo de cada una de las disoluciones
patrn que contienen el patrn interno, as como del extracto de la muestra que
tambin contiene el patrn interno. De esta forma tendremos los distintos
cromatogramas de los patrones (un cromatograma para cada disolucin patrn) y
el cromatograma de la muestra.
Cuando se quiere cuantificar un compuesto presente en una muestra por el
mtodo del patrn externo, los pasos a seguir son los siguientes:
1. Preparar una serie de disoluciones de concentraciones crecientes, del patrn
correspondiente al compuesto a cuantificar. El intervalo de concentraciones ha de
ser similar a la concentracin del analito en la muestra problema.
2. Inyectar el mismo volumen de cada una de las disoluciones patrn en el
cromatgrafo, as como del extracto de la muestra. De esta forma tendremos los
distintos cromatogramas de los patrones (un cromatograma para cada disolucin
patrn) y el cromatograma de la muestra.
Tiempo de retencin
tR: tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatogrfico. Esta
retencin se ejerce en funcin de las caractersticas moleculares de cada
compuesto.

DETECTOR DE ARREGLO DE DIODOS (DAD DIODE ARRAY DETECTOR)

El detector de arreglo de diodos (diode array) fue introducido a mediados de los aos1970. Es
una variacin de los detectores de la regin ultravioleta. El desarrollo de losdetectores que
cuentan con arreglo de diodos es un gran avance en la espectrofotometraUV. Poseen un
nuevo sistema ptico e introducen el concepto de integracin total deldetector, microprocesador
y procesamiento de datos.La base del funcionamiento de los espectrmetros de arreglo de
diodos es simple: el hazde radiacin que ha atravesado la columna cromatografa, es
dispersado por medio deuna red de difraccin fija, siendo recogidas simultneamente todas las
longitudes de ondadispersadas mediante una matriz de fotodiodos.
Diferencia entre HPLC y cromatografa de gases
Cromatografa de lquidos HPLC
Principios de la tcnica
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el
resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en
ambas fases, mvil y estacionaria

A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto

rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada
por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos
naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos
polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro
parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase
estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una
mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la
separacin.
HPLC preparativa
Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en
las industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la
bioqumica. La cromatografa preparativa comprende un amplio rango de
aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de muestra para identificacin
espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de
100 g.
Aplicaciones
Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrgenos.

Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

Separacin y purificacin de metabolitos

Separacin y purificacin de los metabolitos de las drogas procedentes de
muestras de orina


Purificacin y separacin de enantimeros

Purificacin de compuestos naturales

Purificacin y caracterizacin de enzimas y protenas

Funcionamiento del servicio
Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de servicios generada
en esta pgina web una vez realizado el registro en la misma. El ususario debe
rellenar todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de
obtener el mejor resultado posible.
Equipos
HPLC analtico 1200 Series de Agilent Technologies
Bomba cuaternaria G1311
Detector de longitud de onda variable G1314B
Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D
Detector de ndice de refraccin G1362A
Detector de fluorescencia G1321A

HPLC preparativo 1200 Series de Agilent Technologies

Dos Bombas preparativas G1361A
Detector de diodo y de longitud de onda variable G1315D
Muestreador automtico G1329A
Colector de fracciones G1364B

Referencias

Nielsen, S.S: Food Analysis, Ed. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New
York, 2003, pg. 437460.

Skoog, D.A.; Leary, J.J: Anlisis Instrumental, Ed. McGraw Hill / Interamericana
de Espaa, Madrid, 1994, pg. 674703.

Valcrcel, M.; Gmez, A: Tcnicas Analticas de Separacin, Ed. Revert,

Barcelona, 1994, pg. 655676.