UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

PRACTICAS DE BIOTECNOLOGIA
PRACTICA N 1
CONSERVACIN DE CEPAS Y PREPARACIN DE INOCULO
RESUMEN:
Esta prctica se realiz con la finalidad de obtener copias de Aspergillus niger para la
generacin de cepas jvenes, las cepas de aspergillus niger adultos fueron facilitados
por el laboratorio de biotecnologa agroindustrial , para cual usamos una preparacin
de extracto de almidn de papa que se prepar en el laboratorio con 200 ml de agua
destilada y 40 g de papa en trozos pequeos , se llevo a Tde ebullicin por 5 min,
luego el liquido obtenido se le agrega 3 gr glucosa, 6 gr agar en un matraz
mezclamos, llevamos a T de ebullicin por 2min, inoculamos 10 ml a los 10 tubos y
autoclavamos transcurrido el tiempo dejamos inclinado para que se solidifique y
replicamos con una aza de siembra todo en inocuidad llevamos a la incubadora a 28
C por 48 h trascurrido el tiempo obtuvimos cepas jvenes que usamos los que hayan
desarrollado en mayor cantidad en dos tubos incorporamos agua destilada y agitamos
para que se desprenda los A. niger y trasladamos a un tubo estril para sacar 1 ml de
la mezcla y colocara a la cmara de newbawer para obtener un inoculo a
concentraciones conocidas, los resultados en el crecimiento de los A. niger jvenes
desarrollaron en la mayora de los tubos y pudimos obtener un promedio de 152
esporas/ml.
OBJETIVOS

Obtener copias fenotpicas idnticas

Generar clulas jvenes
Obtener un inoculo a concentraciones conocidas

INTRODUCCIN
El hongo Aspergillus niger (A. niger) produce diversos compuestos de gran inters
para las industrias farmacutica y de alimentos (enzimas, cidos organicos), y es el
principal productor de cido ctrico a nivel industrial por cultivo lquido. Se ha
observado que se obtiene un alto rendimiento de cido ctrico cuando existe una alta
acumulacin de este en el micelio, que puede estar asociada con una alta
concentracin de glucosa y de oxgeno disuelto en el medio lquido (Papagianni, 2007;
Wolschek y col., 1999). A. niger miembro del grupo de los Aspergilli negros, es una
especie utilizada en las industrias alimentarias, farmacutica, textil y qumica (1, 2, 3).
Se ha reportado la produccin de diferentes enzimas como glucosidasa,
galactosidasa, amilasa, lacasa, fitasa y xilanasa (4, 5) (Anderser, 2008; Andersen y
col.,2008).
Aspergillus muestra algunas ventajas para la produccin industrial de enzimas: tiene
un alto nivel de produccin, presenta buenas propiedades para el cultivo, lo que
posibilita la produccin a gran escala, sus productos son generalmente considerados
como GRAS (generally regarded as safe), lo que permite su aplicacin en la industria
de alimentos tanto para el hombre y animales (de Vries & Visser, 2001).

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Muchos hongos filamentosos estn naturalmente adaptados al crecimiento sobre
superficies. Los hongos requieren un contacto cercano con el sustrato debido a su
nutricin hetertrofa, secrecin de enzimas extracelulares, absorcin de nutrientes a
travs de la pared celular y el crecimiento apical de sus hifas (Jones, 1994). Sin
embargo, algunos sistemas de produccin como la fermentacin sumergida no
consideran estos importantes aspectos de su fisiologa, citado por Collatz, L.
(1966).Para el aislamiento del producto de A.niger, el mejor lugar es un birreactor
puede ser definido como un recipiente o ambiente biolgicamente controlado en el que
se pretende obtener un crecimiento celular o un producto con una eficiencia optima, el
objetivo principal es lograr una alta productividad a bajos costos, las principales
Caractersticas del biorrearctor son:Proporciona un medio o ambiente controlado que
permita el crecimiento de clulas y la formacin de producto Cada biorreactor est
diseado de acuerdo a las necesidades, especificaciones de un proceso de
produccin particular, no es posible construir un sistema nico que cumpla
adecuadamente las necesidades de todos los sistemas biolgicos.Tanto el biorreactor
y las tuberas asociadas deben esterilizarse a la temperaturas y presin adecuada, un
mnimo de 121C/15Psi durante 15-30mint. Entre los organismos eucariotas, se
encuentra el hongo Aspergilus nger. Este hongo pertenece al gnero Aspergillus, que
fue descrito por primera vez por Micheli en 1729 en su obra Nova Plantarum genera,
siendo validado por Haller, en sus tratados de 1742 y 1768 y ms tarde, por Link en el
ao de 1809. Estos hongos, causan el deterioro de muchos productos alimenticios
(ajo, alimentos para aves, arvejas, avena, berenjena, bananas, cebolla, harina de trigo,
entre otros). Los productos metablicos de la invasin fngica suelen ser muy txicos,
tanto para el hombre como para otros animales
Al comienzo de su crecimiento Aspergillus niger forma colonias miceliales lanosas
blancas o amarillentas; a medida que ste se desarrolla la superficie micelar se va
cubriendo de puntos negros: son las cabezas aspergiares que pueden llegar a medir
hasta 1 mm de dimetro, stas se encuentran cargadas de esporas negras. Este
hongo es un importante agente productor de cidos orgnicos, principalmente
glucnico, ctrico y oxlico; tambin es utilizado para la obtencin de enzimas como la
glucoamilasa y del 1--galactosidasa, por lo que es ampliamente cultivado para la
produccin industrial de estos compuestos qumicos (Accensi, 2000).
El inters por estas enzimas se ha acrecentado en los ltimos aos debido a sus
diversas propiedades catalticas. Ello ha causado que se conviertan en catalizadores
valiosos en diferentes aplicaciones industriales, tales como: aditivos en la formulacin
de detergentes, en la industria alimenticia para la elaboracin de productos dietticos
con bajo nivel de grasas y colesterol, en la industria del papel con el objetivo de
eliminar la cera de la pulpa del papel, en la industria farmacutica en la obtencin de
molculas bioactivas, as como en procesos de sntesis qumica para la obtencin de
compuestos pticamente puros [3], modificacin de grasas y otros lpidos por hidrlisis
y esterificacin
Los hongos filamentos son un grupo de inters industrial en la produccin de enzimas
aspergillus es un organismo ampliamente utilizado en la produccin de una gran
variedad de glucanasas con un espectro tal que puede lograrse la completa
degradacin de la celulosa. Las glucanasas son utilizadas en muchos procesos
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industriales, como bioblanqueo, panificacin, extraccin y clarificacin de jugos,
elaboracin de alimento animal, industria textil, entre un alto nivel de produccin,
presenta buenas propiedades para el cultivo, lo que posibilita la produccin de a gran
escala, sus productos son generalmente considerados como GRAS (generally
regarded as safe), lo que permite su aplicacin para alimentos tanto para el hombre y
animal (Vries y visser, 2001).

OBJETIVOS

Obtencin de copias fenotpicas del aspergillus niger.

Regenerar clulas jvenes.
Obtener un inoculo a concentraciones conocidas.

MATERIALES, EQUIPOS Y MTODOS

Materiales
14 tubos con tapa
1 matraz Erlenmeyer
1 probeta 250 ml
1 Embudo de vidrio
2 Vaso precipitado
2 botellas de 475 ml
Cepa de aspergillus niger
40g de papa
Mecheros
1 esptula
1 cuchillo
Equipos
Microscopio
Balanza analtica
Cocina elctrica

Metodologa

Preparamos agar papa dextrosa

Se pelo la papa para poder trozar en cubitos pequeos, pesamos 40 gr
Colocamos en un vaso precipitado 200 ml de agua destilada y 40 gr de papa
trozada.
Durante 5 min agitamos y ocurre la lixiviacin del almidn.
Separamos en un matraz el lquido de extracto de papa .
En un matraz Erlenmeyer colocamos almidn 200 ml, 3 gr de glucosa, 6 gr
agar agar

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Llevamos a ebullicin por dos minutos

En 10 tubos con tapa inoculamos 10 ml del agar y en dos botellas de 475 ml
agua ms 4 tubos vacos.
Autoclavamos por 15 min dejamos que se enfri el autoclave
Lugo sacamos los 10 tubos y lo colocamos inclinados para que forme una
diagonal, dejamos que se solidifique.
Prendemos los mecheros y calentamos al rojo vivo la aza de siembra dejamos
que se enfri
Usamos las cepa de Aspergillus niger que el laboratorio de Biotecnologa nos
proporciono y sacamos con una aza de siembra las muestras para sembrarlas
Sembramos en los tubos todo con esterilidad luego calentamos el aza de
siembra y dejamos que se enfri.

Sacamos otra muestra de aspergillus niger con el aza y a otro tubo colocamos
se repite para los tubos restantes.
Una vez terminado la siembra colocamos en la incubadora a 28 C por 48 h.

Obtenemos cepas jvenes

Cogemos el que tiene mayor crecimiento de cepas jvenes
Aadimos agua destilada en dos tubos que tengan mayor crecimiento de A.
niger jvenes y agitamos
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Tapamos la cmara de Neubawer con un cubre objeto

colocamos en un tubo los dos que agitamos sacamos con una pipeta 1ml para
colocar un par de gotas a la cmara de newbawer.

Contamos en ambos lados de la cmara de newbawer sacamos un promedio

Luego C1V1=C2V2, sacamos el volumen V1 que usaremos para hacer las
diluciones necesarias hasta llegar a contar un promedio de

10

esporas/ ml.

Obteniendo el inoculo.

RESULTADOS
Obtuvimos una generacin de cepas jvenes de Aspergillus. niger en la siembra que
se realizo en los tubos de ensayo , escogimos para el conteo los tubos que estaban
con mas proliferacin de Aspergillus niger , llevamos a la cmara de newbawer para
hacer el conteo de ambos lados y sacamos el promedio teniendo un resultado de 152

Con el repicado del aspergillus Nger. Se logr rejuvenecer o regenerar clulas

jvenes, con las siguientes caractersticas; buena poblacin y color negro intenso.

Conteo respectivo de colonias en la cmara de NEW BUAWER

1
2
3
4
5

CUANDRANT
E1
11
16
8
6
22

CUADRANT
E2
10
20
40
4
7
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6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
TOTAL

15
9
6
18
5
7
35
13
10
10
14
11
8
6
4
15
3
17
7
22
293

11
4
5
8
5
25
8
13
11
8
31
14
6
14
7
8
2
33
5
22
282

PROMEDIO; 287.5

Obteniendo un promedio de 262. 5 entonces reemplazando en la formula par a

obtener el inoculo.

C 1V 1=C 2V 2

Donde

287.5V 1=10010 ml
V 1=3.47 ml
Diluimos con 6.53 ml de agua para completar el inoculo a 10 ml de inoculo. Tenemos
el inoculo de nuevo realizamos el conteo en la cmara de NEW BAUWER
Segunda dilucin

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Cuadrante
1
0
2
0
18
9
3
12
10
3

Cuadrante
6
13
6
4
8
3
5
6
9
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PRACTICAS DE BIOTECNOLOGIA
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
total

3
3
7
16
12
13
2
1
11
13
2
19
10
8
0
2
179

1
6
4
3
2
11
7
6
4
3
3
1
5
3
2
5
126

Promedio. 152.5*
Se muestra en el siguiente cuadro 3.41 ml es la cantidad de concentracin conocida
completando agua destilada para que llegue a 10 ml, sacamos un promedio en el cual
nos quedamos de 152.5 esporas/ml ser nuestra concentracin conocida.

DISCUSIN
Segn Accensi, 2000 el hongo apergillus niger forma colonias miceliales lanosas
blancas o amarillentas; a medida que ste se desarrolla la superficie micelar se va
cubriendo de puntos negros en ese entender pudimos obtener esas caractersticas
que tiene en hongo A. niger en nuestra practica realizada como son cepas jvenes
usaremos para la generacin de enzimas
Vries, R. P. y J. Visser. 2001. Los aspergillus son hongos filamentos, son un grupo de
inters industrial en la produccin de enzimas ambos autores mencionan que es un
generador de enzimas el aspergillus niger aplicable para produccin de una gran
variedad de glucanasas con un espectro tal que puede lograrse la completa
degradacin de la celulosa efectivamente al inducirle almidn degrada los azucares
para su desarrollo y mejor plabacion en un medio.

BIBLIOGRAFA
Vries, R. P. y J. Visser. 2001. Aspergillus Enzyme Involved in Degradation of Plant cell
Wall Polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology Reviews 65:497-522

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