Manual de Métodox Ficabigicos, 199. K. Alveal. ME. Ferrario, ECC. Oliveira y'E. Sar (eds. Universidad de Concepeidn Concepcisn = Chile METODOS DE MICROSCOPIA PARA LA CUANTIFICACION DEL FITOPLANCTON VIRGINIA E. VILLAFANE' y FREDA M. H. REID? Polar Research Program Scripps Institution of Oceanography University of California San Diego La Jolla, CA, 92093-0202, U.S.A °Marine Life Research Group Scripps Institution of Oceanography University of California San Diego La Jolla, CA, 92093-0218. U INTRODUCCION GENERALIDADES MUESTRAS CON ALTA DENSIDAD DE ORGANISMOS, Conteo en una alicuota de muestra Conteo utilizando emaras TRAS CON BAJA DENSIDAD DE ORGANISMOS, Filtracién Centrifugacion Sedimentacién CONTEO DE UNA MUESTRA DE FITOPLANCTON Métodos Citeulo de la concentracién de células CONCLUSIONES.... Notas REFERENCIAS 170 mI 172 172 173 174 14 175, 176 180 180 182 183, 183, 183, 169170 Vary. Rin Mieocopia, Cuumtifcacin itoplantinica INTRODUCCIO! Uno de los problemas bisicos en el estudio del fitoplancton es determinar las especies presentes en una muestra de agua y la abundancia de cada una de ellas. El reconocimiento y clasificaci6n de especies fitoplancténicas utilizando microscopio 6ptico o electrnico ha recibido gran atencién a través de los afios, sin embargo. recientemente se ha puesto un mayor énfasis en la estimacién de su abundancia y distribucidn. La determinacién de la abundancia numérica de especies es particul importante cuando se realizan estudios de trofodindmica, ya que para calcular la biomasa fitoplancténica (Strathmann, 1967: Edler, 1979) es necesario conocer previamente la concentracién de células. También la determinacién de la densidad de células es importante en estudios de sucesién temporal de especies dentro de una comunidad, de caracterizacién de masas de agua y de contaminacién, ya que es de esperar que una especie incremente su concentraci6n en aquella masa de agua en donde las condiciones ambientales sean mas favorables para su crecimiento. Finalmente, la informacisn acerca de la cantidad de células es también importante en trabajos experimentales con cultives, debido a que las variaciones en su nimero puede dar una idea general de la dinamica de su crecimiento. Existen diversos métodos para cuantificar el fitoplancton, Los métodos directos, de cuantificacién involucran el uso de camaras especiales para microscopio compuesto y/o invertido (Lund & Talling, 1957: Lund er al., 1958; Margalef, 1969: Guillard, 1978; Hasle, 1978). Los métodos indirectos incluyen téenicas de dilucién de cultivos (Knight-Jones, 1951: Throndsen, 1969; 1978), técnicas nefelométricas (Butterwick er al., 1982), medicién de clorofila (Yentz & Menzel, 1963: Holm- Hansen e7 al, 1965), medicién de ATP (Holm-Hansen & Booth, 1966), estimacién de DNA (Holm-Hansen ¢7 al., 1968). uso de citometria de flujo (Bérsheim er al., 1989) y de contadores electrénicos de particulas (Hastings ef al., 1962; Maloney et al., 1962: Sheldon & Parsons, 1967). Estos tiltimos son particularmente tiles cuando se necesita una informacién relativamente ripida y precisa de las categorias de tamafos presentes en la comunidad, pero su principal desventaja radica en la imposibilidad de observar ¢ identificar los organismos y de distinguir el material orgnico del inorginico. Por lo tanto, y hasta el momento, las técnicas que parecen ser mas adecuadas para determinar la abundancia numérica de células fitoplancténicas son aquellas que involucran el uso del microscopio. especialmente el invertido (Utermohl, 1958; Hasle, 1978; Sieburth, 1979; Reid, 1983). La ventaja de los métodos de microscopia para realizar conteos de fitoplancton (Lund & Talling, 1957) radica basicamente en: (a) la posibilidad de observar las caracteristicas morfoldgicas propias de cada especie, tales como la presencia de colonias, formacién de esporas y asociacién con otras especies; (b) obtener una estimaciGn del niimero de células por mas baja que sea su abundancia en una determinada comunidad: (c) identificar las especies y determinar su importancia cuantitativa relativa dentro de la comunidad. Enel presente capitulo se consideran los métodos directos para cuantificar la abundancia fitoplancténica, basados en técnicas de microscopfa: partiendo de la nenteVan vast Rise Mironcopia, Cuamtifcacidn itoplanctinica 17 base de que las muestras ya han sido colectadas y fijadas apropiadamente (Throndsen, 1978) para luego contarlas. El mismo estd dividido en cuatro secciones principales, La primera. trata temas concernientes a la planificacién como asi también consideraciones generales a tener en cuenta antes del conteo. La segunda, incluye la preparacién de muestras con alta densidad de células, que no requieren obligadamente una previa concentracién del material. En esta seccién se describen las cémaras de conteo mas comunes que pueden utilizarse con un microscopio compuesto. La tercera, incluye la preparacién de muestras con baja densidad de células que requieren obligadamente una concentracién previa del material, con particular énfasis en la técnica del microscopio invertido. La cuarta, trata del procedimiento general para contar muestras de fitoplancton, que es valido cualquiera sea el tratamiento previo de las muestras. GENERALIDADES EI proceso de cuantificacién de células fitoplancténicas necesita de una planificacién previa para cada estudio en particular. La eleccién de un método u otro de conteo depende de varios Factores, tales como la disponibilidad de equipamiento, tiempo y lugar de trabajo, ya sea en un Laboratorio o a bordo de un buque de investigacién. Cualquiera sea el método utilizado, el caso ideal es poder enumerare identificar anivel especifico todas las células fitoplancténicas presentes, reconociendo ademas lay que estaban “vivas” y “muertas” al momento de colectar la muestra, aunque Gsta haya sido previamente fijada. Es imprescindible tener un conocimiento previo del origen de la muestra (por ejemplo, procedencia, método de muestreo, profundidad), como asi también del fijador utilizado (reactivo de Lugol. formaldehido o glutaraldehfdo). El uso de un tipo u otro de fijador, y su concentracién puede conducir a una incorrecta identificacién de las células. ya sea por deterioro, distorsin y/o pérdida de flagelos en algunas especies. Las células no identificadas a nivel especitico deben también ser tomadas en cuenta. En este caso, es posible incorporarlas en grupos y/o categorizarlas de acuerdo al tamaiio (por ejemplo: diatomeas pennadas 10-20 pm, flagelados 2-5 um). Una muestra de una comunidad natural siempre incluye una fraceién variable de células vacfas de varios tava, Estas células se consideran muertas al momento de muestreo y usualmente no se cuentan: sin embargo, existen casos en los cuales el investigador necesita conocer la fraccién de células vivas con respecto al “total” en ka muestra, La distinei6n entre células vivas y muertas es a veces dificil. por lo tanto es conveniente tefiir las células (por ejemplo. con rosa de Bengala si las muestras estin fijadas con formaldehido o glutaraldehido), o bien observar otras caracteristicas, tales como presencia de clorofila o intensidad de pigmentaci6n, y/ © utilizar microscopfa de epitluorescencia. Muchas especies de diatomeas (de los géneros Chaetoceros, Melosira, Nitzschia) forman colonias. por lo cual es necesario decidir previamente si se van a contar las colonias como unidad o las células que las componen. En general,172 Vussmase, Rian: Mieroscopfa. Cuantificacidn fitoplanetsnica deberfa contarse cada célula individualmente ya que la unidad que se replica es la célula y no la colonia, Cuando se estudia una comunidad natural, es normal que exista un variado espectro en el tamaiio de las células presentes. Utilizando un microscopio dptico comin © uno invertido existe un Ifmite de deteccién, por debajo del cual la observacién ¢ identificacién de células es muy dificil. Por lo tanto, es necesario decidir cual va a ser el tamafio mas pequefio de células que van a contarse. En general, este limite inferior se encuentra alrededor de los 2 jum, Es importante considerar la posibilidad de uso de equipamiento adicional, por ejemplo una unidad de epifluorescencia (Vargo, 1978), en el caso de que sea necesaria la distincién entre células autétrofas y heterdtrofas. Los métodos de epifluorescencia en fitoplancton han sido especialmente titiles en el estudio de comunidades naturales, particularmente en aquellas que contienen una alta proporcién de nanoflagelados y dinoflagelados. Otro equipamiento adicional incluye cémaras fotograticas, contadores y programas de computacién. Hamilton (1990), por ejemplo, ha creado un programa de computacién que permite calcular los valores de densidad y biomasa de organismos plancténicos al mismo momento en que se analiza la muestra. MUESTRAS CON ALTA DENSIDAD DE ORGANISMOS Sila muestra tiene una alta densidad de organismos, puede contarse en un volumen relativamente pequefo, ya que puede asumirse que en este volumen hay un nimero suficiente de células como para permitir una buena estimacién estadistica (Venrick, 1978). Este es el caso de cultivos, algunas zonas costeras o dreas de surgencia, 0 bien el caso de una muestra que fue previamente concentrada y que no va a ser contada en microscopio invertido. En este caso, se puede opiar por uno de los siguientes métodos: a) Observz y conteo de células en una alcuota de muestra y b) Conteo utilizando cémaras que contienen un volumen conocido de muestra. Existen varios tipos diferentes de cAmaras (ver | en notas al final del capitulo), siendo las mas apropiadas en estudios cuantitativos de fitoplancton las siguientes: i) Palmer-Maloney ii) Sedgwick-Ratter, iii) Hematocimetro y iv) Petroff-Hauser. Conteo en una alicuota de muestra El método se describe en detalle en Semina (1978). Consiste en contar las células en una alicuota o submuestra de volumen conocido. Para obtener una submuestra homogénea, es necesario agitar previamente la muestra original. Entonces, se toma una alicuota de volumen conocido y se la coloca entre porta y cubreobjetos, en la platina del microscopio. El volumen de la alicuota o gota puede ser variable, pero es muy importante conocerlo exactamente. Para este fin, se recomienda el uso de pipetas de precisién, tales como Stempel, Eppendorf, o similares. Las principalesVins vrasi. Reap: Microscopia, Cuantificacivin Ftoplanetiniea 173 ventajas de este método radican que no se requiere equipamiento especial ni cdmaras. También, a través de este método es posible cambiar la orientaci6n espacial de las células al mover suavemente el cubreobjetos y de esta manera facilitar su observacisn, lo cual es especialmente importante en aquellos taxa de determinacién dificultosa. Conteo utilizando camaras i) Cémara Palmer-Maloney (Fig. 1a): La camara se describe en detalle en Palmer & Maloney (1954), Consiste en una camara de vidrio circular, de 17.9 mm de didmetro y 0,4 mm de profundidad, y con una capacidad para 0,1 ml de muestra. Es buena para realizar conteos tanto de microplancton (> 20 um) como asi también de células nanoplancténicas (<20 |im). La cdmara se lena por una de las dos ranuras que posee en su parte media y luego se la cubre con un cubreobjetos. ii) Camara Sedgwick-Ratter (Fig. 1b): El uso de esta cémara se describe en Serfling (1949) y MeAlice (1971). Tiene 50 mm por 20 mm de lado y | mm de profundidad, con una capacidad de | ml de muestra. Es apta para conteos de célutas relativamente grandes, ya que el alto de la cémara no permite realizar observaciones con gran aumento (generalmente menos de 200x). Para Henar la cdmara se recomienda colocar el cubreobjetos en forma diagonal. y colocar la muestra por el espacio libre que queda entre éste y el portaobjetos. De esta manera se evita la formacién de burbujas de aire, que podrian introducir una fuente de error al medir el volumen de muestra. iii) Hematoeimetro: Existen diferentes tipos. Uno de ellos tiene 0,1 mm de profundidad y posee una grilla Neubauer, dividida en nueve cuadrados de | mm de lado cada uno, algunos de los cuales tienen subdivisiones, con lo cual es posible contar células en un érea conocida, El volumen de muestra en cada una de estas reas es de 0.0018 ml. Otro tipo de hematocimetro (Fig. Ic) tiene 0, 2 mm de profundidad y posee una grilla Fuchs- Rosenthal. Esta grilla consiste en dieciséis cuadrados, cada uno de 1 mm de lado, que estan a su vez subdivididos en otros 16 de 250 wm de lado cada uno. Una variacién de este tipo de cdmaras posee una grilla Neubauer en vez de una Fuchs-Rosenthal Para colocar la muestra en un hematocimetro, se recomienda usar una pipeta Pasteur. La cémara se Nena a través de la ranura tratando de que la muestra se distribuya homogéneamente y sin dejar espacios de aire. Se recomienda el uso de este tipo de cémaras si se desea contar células pequefias en un cultivo. iv) Camara Petroff-Hausser (Fig. 1d): Esta cémara ha sido utilizada principalmente para conteos de células sanguineas y su uso no es frecuente en trabajos de planctologia. Sin embargo, puede utilizarse si se tienen cultivos densos de organismos muy pequefios. Tiene 0,02 mm de profundidad y posee una grilla Neubauer; el volumen total de muestra es de 0,00018 ml.174 Vuniarase, Rew: Microscopia. Cuantiticacidn fitoplanctinica VISTA SUPERIOR VISTA LATERAL cubreobjetos ™ ——_————— (a) (b) (4) 1: Diagrama que muestra diferentes cdmaras para recuento de fitoplancton. a) Palmer-Maloney; by Sedgwick-Rafter; ¢) Hematocimetro (con grilla Fuchs-Rosenthal); d) Petroff-Hausser (con grilla Neubauer) MUESTRAS CON BAJA DENSIDAD DE ORGANISMOS Si las muestras tienen poco material fitoplanct6nico, es necesario considerar algin método alternativo para concentrarlo, de manera de obtener un ntimero estadisticamente considerable de células a censar. En general, las células pueden concentrarse por filtracién, centrifugacién y sedimentacién. Estos tres métodos se deseriben a continuacién: Filtraci6n El uso de filtros de membrana como forma de concentrar células de fitoplancton ha sido sugerido por varios autores (Cole & Knight-Jones, 1949; Goldberg et al., 1952; Holmes, 1962). Las principales ventajas de las técnicas de filtracién (Fournier, 1978) es que posibilitan observar los organismos con aumentosVus.vrast, Reap: Microscopia, Cuantificacion fitoplanetonica 175 relativamente altos y que permiten analizar un rango especifico en el tamafio de células, debido a que existe una gran variedad en cuanto al tamafio de poro de los filtros. Otra ventaja se relaciona con Ia posibilidad de usar filtros negros para colectar células con objeto de diferenciar, con microscopfa de epifluorescencia, células autétrofas de heterdtrofas. Esta observacién puede hacerse directamente sobre los filtros (Booth, 1987), 0 bien con una posterior transferencia de éste a un medio de glicerina (Geider, 1987). Por otro lado, estos métodos pueden resultar particularmente ttiles si se necesita trabajar a bordo de un barco. y permiten obtener preparados permanentes que pueden ser analizados después de cierto tiempo de obtenida la muestra. Sin embargo, los métodos de filtracién presentan algunas desventajas, Entre ellas se encuentran la imposibilidad de manipular las células y la dificultad de identificar algunos organismos, especialmente aquellos que sufren algdn tipo de distorsién por efecto de Ia filtracién, como por ejemplo, algunos nanoflagelados. Por otro lado, existe también el problema de la distribucién no al azar de los organismos, que tienden a agruparse en la periferia de los filtros (Holmes, 1962). Una de las técnicas mas simples (Fournier, 1978) consiste en filtrar una cantidad variable de muestra (dependiendo de la concentracién de fitoplancton) usando un filtro de acetato de celulosa; luego se lo deja secar sobre un portaobjetos, y se le agrega aceite de inmersi6n para clarificarlo. Finalmente se le coloca un Cubreobjetos y se observa en el microscopio. También es posible hacer una tincién con Fast Green, previa a la filtracién, para facilitar la observacién de organismos pequefios. La resolucién éptica en este método no es muy buena, pero existen otras técnicas, que aparentemente dan mejores resultados, en las que se usan medios de montaje solubles en agua, por ejemplo 2-hidroxipropil metacrilato, HPMA (Crumpton, 1987). Hewes & Holm-Hansen (1983) desarrollaron la técnica FTF (Filter- Transfer Freeze) en la cual es posible separar el filtro de la materia particulada (después de congelacién), lo que permite una mejor resolucién éptica. Esta técnica da buenos resultados en estudios cuantitativos de fitoplancton marino, incluso cuando se trata de células nanoplanténicas (Hewes et al., 1984). Centrifugacién Las centrifugas pueden utilizarse como equipamiento para concentrar fitoplancton, ya sea que se trate de material vivo o fijado (Throndsen, 1978). En el tipo ma comiin de centrifugas de laboratorio, se coloca un volumen conocido de muestra y se lo centrifuga por 20 minutos a aproximadamente 1.000 rpm, La velocidad de centrifugacién es especialmente importante, ya que si es excesiva puede causar rotura de células y/o pérdida de flagelos. Luego de la centrifugacién se elimina el sobrenadante cuidadosamente, hasta llegar a un volumen concentrado de muestra de 0,1-0,2 ml, si la muestra va a ser contada con un hematocimetro, o 1,0 ml si va a ser contada con cémara Sedgwick-Ratter. Si bien este método es répido y conveniente, especialmente cuando se trabaja176 Vau.ssone. Ren: Micoscopta, Cuantticacdn foplanetinica a bordo de un barco, es necesario tener en cuenta ciertas precauciones para obtener conteos confiables. Entre ellas estén la exactitud al medir el volumen inicial de muestra, como asf también el de la muestra centrifugada. Finalmente, hay que tener especial cuidado al homogeneizar el material centrifugado y al Ilenar la cmara de conteo. Sedimentacién EI método més conocido es aquel que involucra el uso del microscopio invertido. Este método fue introducido por Utermohl en 1931, aunque la versién utilizada actualmente es aquella descripta por Utermoh! en 1958. El principio de la técnica del microscopio invertido consiste en dejar sedimentar una muestra en un cilindro de sedimentaci6n, de manera tal que después de un cierto tiempo se puede asumir que todos los organismos presentes en la muestra se encuentran en la base de vidrio de la cémara de sedimentacién. El cilindro se separa entonces de la ciara, la cual tiene una altura menor que la distancia focal del condensador, con lo que es posible observar los organismos con el microscopio invertido. i) Equipamiento: 1) Microscopio (Fig. 2): El microscopio es invertido en el sentido de que la fuente de luz y condensador iluminan la cmara desde arriba y con los objetivos se pueden ver los especimenes desde abajo a través del vidrio de la camara. La platina tiene que estar especialmente adaptada para alojar la cémara que contiene el material a contar. 2) Camaras y cilindros de sedimentacién (ver 2 en notas al final de! capitulo): Los cilindros que se usan mas comtinmente tienen 10, 50 6 100 ml de capacidad (Fig. 3a), aunque también se fabrican cilindros de 5625 ml. La cdémara consiste en una base rectangular de Perspex con un vidrio en la parte central que se sujeta con un anillo metélico (Fig. 3b). Este vidrio (del espesor de un cubreobjetos) puede reemplazarse en caso de fractura o rotura, utilizando una herramienta que permite desatornillar el anillo metilico. La base rectangular posee un pequefio orificio en uno de sus extremos (por donde se va a climinar el sobrenadante de la muestra), y una abertura circular de aproximadamente 26 mm de didmetro, sobre la cual se va a colocar el cilindro y posteriormente la muestra. Una variante de este sistema de cilindro y cémara consiste en un cilindro con base de vidrio que, luego de un tiempo de sedimentacién de la muestra, se coloca directamente en la platina del microscopio (Fig. 3c). ii) Preparacin de la muestra: La muestra debe estar bien homogeneizada antes de colocarla en el cilindro de sedimentacién, para esto es necesario agitarla suavemente para no destruit las colonias. Una vez colocada la muestra en el cilindro, se lo tapa en la parte superior (Fig, 4a) para evitar la pérdida de material por la parte inferior debido a la presién hidrostatica. Después de un tiempo (variable de acuerdo al volumen de muestra, ver iii), mas adelante) el cilindro con el sobrenadante se separa de la base usando un vidrio cuadrado, que sirve también para tapar la muestra que contiene el fitoplancton (Fig. 4b). El sobrenadante de la muestra se elimina por el pequefio orificio que tiene la base rectangular,Vianase, Rio: Mieroscopta. Cusmiificacién Ftoplanetonica 177 = bf at oculares unidad de epifivorescencia _ll camara fotografica Fig. 2: Diagrama esquemético de un microscopio invertido, indicando algunas partes importantes y detalles de accesorios tales como e1 equipo de epifluorescencia y cmara fotogrifica. i or fee 8a ia @) anita o | ‘ataico (b) 25m mi sss. a Fig. 3: a) Cilindros y bases para sedimentacisn de fitoplancton; b) Detalle de la base de sedimentaciGn; e) Sistema fijo de cilingro y base para uso en un microscopio invertio.178 Vousiost, Rito: Microscopia. Cuantiticaeién ftoplancténica cuando se saca la tapa circular que se encontraba sobre el cilindro de sedimentaci6n (Fig. 4c). La camara, cubierta con el vidrio cuadrado, contiene los organismos que van a contarse (Fig. 4d). Cuando es necesario sedimentar varias muestras, es posible usar una “mesa de sedimentaci6n” (Tangen, 1976), que proporciona una base firme durante el lenado, sedimentacién y drenaje del sobrenadante, Esta mesa tiene dos tipos de orificios, uno que corresponde a la cmara, y otro que coincide con aquel de drenaje de la muestra, por el que el sobrenadante se recoge en una caja de Petri dispuesta debajo de la “mesa”. Tiempo de sedimentacién: El problema del tiempo necesario para lograr una completa sedimentacién de todos los organismos de la muestra ha sido tratado en varios trabajos (Lund et al., 1958; Margalef, 1969; Evans, 1972; Furet & Benson- Evans, 1982). El tiempo de sedimentacién depende no slo de la cantidad de muestra, sino también del fijador utilizado. En general, se considera que las muestras fijadas con reactivo de Lugol sedimentan més répidamente que aquellas fijadas con formaldehido (Hasle, 1978) Utermohl (1958) proponia un tiempo de sedimentacién de al menos 24 h, mientras que Lund et al., (1958) recomendaba 18 h para cilindros de 100 ml, 3h para los de 10 ml, y 1 h para los de 1 ml. Willén (1976) sugerfa 8 h para cilindros de 10 ml y 48 h para los de 50 y 100 ml. Nuestra propia experiencia (utilizando como fijador formaldehido neutralizado, con una concentracién final en la muestra del 0,4%) aconseja 48 h para cilindros de 50 y 100 mil, y al menos 12 h para los de 10 ml. Sin embargo, cada investigador debe evaluar cual es el tiempo adecuado de sedimentacién, de acuerdo al volumen, tipo de muestra y fijador utilizado. En cualquier caso, es importante mantener una consistencia para el conjunto de muestras que van a contarse. iv) Volumen de la submuestra: La eleccién del volumen de muestra depende basicamente de la concentracin del material a examinar. Si la muestra puede considerarse relativamente densa (como en el caso de cultivos, algunas dreas costeras 0 zonas de surgencia) se recomienda el uso de cilindros de 5.6 10 ml de capacidad. El principal problema de utilizar un volumen excesivo de muestra consiste en la dificultad de observar las células claramente cuando hay superposicién entre ellas. Otro problema que debe tenerse en cuentaes la presencia de detritus, que en altas concentraciones pueden tapar total o parcialmente a los organismos. Cuando la concentracién de fitoplancton se considera relativamente baja se pueden usar cilindros de 25 6 50 ml de capacidad. Ante la duda, y siempre que sea posible, es aconsejable sedimentar dos submuestras de voliimenes diferentes de manera de hallar el volumen més apropiado para las muestras a analizar. Si uno no posee el cilindro mas apropiado para sedimentar la muestra, se puede utilizar, en el caso de una muestra con relativamente alta densidad de células, un cilindro de 50 ml, y Ilenarlo con 25 ml de muestra y 25 ml de agua de la muestra, la cual fue previamente filtrada dos veces a través de un filtro de 0,2 um de poro. En el caso opuesto, cuando la concentracién es muy baja, pueden sedimentarse, por ejemplo, 50 ml de muestra dos veces en una misma cémara.Vusarawe, Rib Mierowcopia, Cuantiticacidn fitoplanetinica 179 vex SexmsEsv77777774 (Cd) Fig. 4: Diagrama que muestra el proces imentacién de una muestra de fitoplancton, a) La muestra se coloca en el cilindro de sedi ion y éste se tapa; b) Después de un tiempo, el fitoplancton ha sedimentado en la edmara iro se destiza hacia el orificio pequeio de la bas. ¢¢) El cilindro se destapa para eliminar el agua: d) La cémara contiene ahora solamente el 1 sedimentado,180 Var arse, Rtn: Mieroscopia, Cus icacién fitoplaneténiea En general, no es recomendable el uso de cilindros de sedimentacién muy altos (por ejemplo de 100 ml), debido a la tendencia de algunos organismos (especialmente coloniales) a adherirse a sus paredes (Paasche, 1960). Otra razén es la formacién de corrientes de conveccién (Nauwerck, 1963), que es inevitable en cilindros altos. En este caso, algunas células estarfan circulando en el cilindro y no sedimentarfan en la camara, lo cual resulta en definitiva en un error en defecto al momento de efectuar el conteo. v) Precauciones: Debe evitarse la formaci6n de burbujas de aire en los cilindros © la cdmara; para esto es importante colocar muy lentamente la muestra por las paredes de los cilindros, y evitar temperaturas relativamente altas en el lugar de trabajo. Sin embargo, si quedaran burbujas de aire en la cémara (después de la sedimentacién de la muestra), se puede colocar una gota del Iiquido sobrenadante, de manera tal que no existan problemas al enfocar los especimenes. Se aconseja no utilizar ningiin tipo de grasa siliconada para mantener el cilindro unido a la base. Este tipo de grasa puede arruinar la muestra y también el material con el que est construida la base. Si el cilindro esté bien colocado sobre la base no deberia existir pérdida de material. Sin embargo, debe tenerse especial cuidado de no crear ningiin tipo de movimiento que pueda provocar resuspensién e incluso pérdida del material (con esto se elimina la posibilidad de trabajar con microscopio invertido a bordo de un barco). En cuanto a la limpieza de cilindros y cémaras, se recomienda lavarlos con un detergente normal de laboratorio inmediatamente después de utilizarlos, CONTEO DE UNA MUESTRA DE FITOPLANCTON Métodos Antes de comenzar a contar una muestra de fitoplancton, es necesario observar si existe algiin tipo de distribucién no al azar de los organismos. La distribucién al azar debe verificarse cualquiera sea el método utilizado para contar células fitoplancténicas (con cdmaras, en filtros, etc.). Para obtener la informacién mds confiable en un perfodo relativamente corto de tiempo, pueden contarse los organismos presentes en una parte de la cémara, en vez de hacerlo en su totalidad. Sin embargo, cada investigador debe hacer un balance entre el tiempo que va a disponer para llevar a cabo el censo, y la exactitud y precision de los datos a obtener. Una vez que uno ha decidido cémo se van a contar las colonias, cual va a ser el tamafio minimo de células a censar, ete. (ver seccién Generalidades) uno puede: (i) contar un nimero minimo de células en un rea de la cdmara que puede ser variable o (ii) contar células en un Area fija (por ejemplo, la mitad de la cémara, © un nimero constante de transectas 0 campos) En cualquier caso es necesario ser consistente para el conjunto de muestras que se van acontar. Los fundamentos estadisticos del conteo de fitoplancton se describen en detalle en Venrick (1978).Vatavane, Rib: Mieroscopta. Cuantificacinfitoplancténics 18] Los hematocimetros y la camara Petroff-Hausser tienen areas delimitadas de conteo (grilla Fuchs-Rosenthal o Neubauer), a diferencia de las Sedgwick-Rafter, Palmer-Maloney, y as del microscopio invertido. Para estas tiltimas es necesario obtener un “érea conocida” a partir del campo de observacién del microscopio (el rea total de observacién o una grilla Whipple colocada en el ocular). En principio, es posible usar el campo que se observa a través del ocular como “Area conocida”, pero en la practica es mejor utilizar una grilla Whipple, que posee un campo cuadrado. Una vez colocada esta grilla en el ocular, es necesario determinar el rea que representa midiéndola con un micrémetro colocado en la platina, para cada objetivo a utilizar. Basicamente, existen dos formas de contar células fitoplancténicas: 1) por transectas (un caso especial de conteo por transectas consiste en contar las células en toda, la mitad 0 un cuarto de la cémara), 0 2) por campos delimitados por la grilla Whipple (0 secciones de la grilla del hematocimetro o de la cdmara Petroff- Hauser). En general, si uno trabaja con comunidades naturales, existen diferentes categorfas de tamaiios de células, por lo tanto es aconsejable hacer un conteo de células pequefias (< 20 jim) con un aumento relativamente alto (por ejemplo, 400x), y otro de células grandes (> 20 [im) con bajo aumento (20x). Ambas categorfas deben tratarse independientemente, ya que las areas “barridas” con distintos objetivos serdn diferentes. Conteo de células por transectas: Si se desean contar las células presentes en toda la camara, se posiciona el campo delimitado por la grilla Whipple en la esquina izquierda de la cémara (Sedgwick-Rafter), 0 bien en el campo en la tangente izquierda (cémara de sedimentacién del microscopio invertido). Entonces se comienza a mover lentamente la platina horizontalmente, contando los organismos presentes en cada campo de observacién, como asf también aquellos que se encuentran cruzando en su limite superior y derecho (los organismos que se encuentran cruzando el limite inferior e izquierdo se van a contar en la transecta 0 campo siguiente), Cuando se Hega al final de la transecta, se mueve la platina verticalmente, de manera de que la grilla Whipple se ha movido hacia abajo (aparentemente) su propio ancho. En general, se utiliza cualquier particula cerca de la tltima linea de la grilla como marca para ubicar la grilla en la nueva posicién Entonces, se comienza a mover la platina horizontalmente en el sentido opuesto, y manteniendo el mismo criterio de cémo contar los organismos que aparecen cruzando los limites de la grilla. Este procedimiento se repite hasta contar los organismos presentes en el drea deseada. Si se decide contar los organismos presentes en toda la camara, es mejor contar transecta por medio hasta cubrir su totalidad, También es posible contar los organismos en la transecta central de la cdmara (0 en la transecta en el didmetro de una cémara de sedimentacién) si la densidad de organismos es relativamente alta. Conteo por campos: Este tipo de conteo se recomienda sélo si la densidad de élulas es alta. Antes de comenzar es necesario decidir un sistema para seleccionar los campos que van a ser censados, ya que éstos tienen que ser determinados al azar. Una de las maneras mas comunes de decidir estos campos es utilizando niimeros al azar como coordenadas X - Y de la platina, Entonces se cuentan todos Jos organismos presentes en la grilla Whipple de observacién, como asf también182. Vunarash, Rio: Microscopia, Cuantificucidn Fitoplanetdniea aquellos que cruzan las lineas de sus bordes variable, de acuerdo a diferentes autores, y v: El numero de campos a contar es fa generalmente entre 10 y 50. CAlculo de la concentracién de células La concentracién de organismos (en células ml, o eventualmente colonias ml") de la muestra se obtiene de la siguiente manera: Sea N el ntimero de células contadas en el volumen “barrido” (V,, en ml) de la cémara (ver ecuacién 2, mds adelante). Entonces, la concentracién de células (C, en en células mr") es igual a: Ecuacién |: Siendo V,: Ecuaci6n 2: Con A, = Area “barrida” (obtenida a partir de la medicién utilizando el micrémetro); V = Volumen de muestra (1 ml en cémara Sedgwick-Rafter, volumen sedimentado cuando se utiliza microscopio invertidoy; A,= Area total de la cémara de conteo. Ejemplo: Si se han sedimentado 50 ml de una muestra de una poblacién natural y se han contado en una transecta 200 células utilizando un objetivo de 20x, y 400 células utilizando un objetivo de 40x, la concentracién se calcula de la siguiente forma: 1) para el conteo usando el objetivo de 20x: A, = 12,95 mm; V = 50 ml; A, = 527 mm®, entonces (segtin la ecuacién 2) V, = 1,23 ml. Por lo tanto C = 163 cél mt (ecuacién 1). 2) Concentracién para el conteo usando el objetivo de 40x: A, = 6,47 mm’; V = 50 ml; A, = 527 mm’, entonces V, = 0,61 ml. Por lo tanto C = 656 cél mI. La concentracién total de células en la muestra es, por lo tanto, de 819 cél ml", (Notese que las dreas A, y A, deben determinarse para cada microscopio y objetivo a utilizar, tal como se mencioné anteriormente). La concentracién de células ml (0 colonias ml") cuando se trabaja con campos se obtiene de manera similar a cuando se trabaja con transectas, entonces si: A, es el rea total de la camara; V el volumen de la muestra, A, es el drea del campo de la grilla Whipple (determinada con cada objetivo); N es el nimero promedio de células por campo. Entonces la concentracién de células C (en células mI") se obtiene de la siguiente manera: Ecuacién 3 (NxA) (A,xV)Vus.arase, Rea: Microscopia, Cuamtficacién fitoplancténica 183 Ejemplo: en una cdmara Sedgwick-Rafter, si A, = 1.000 mm?; V= 1 ml; A, = 0, 49 mm, entonces C (células ml") = (1.000 mm?x N) / (0,49 mm x | ml) 2.041 x N; [células ml] Es importante considerar en los cdleulos la posibilidad de agregar un factor si la muestra ha sido concentrada (0 diluida). CONCLUSIONES Los métodos descriptos aqui pueden llevar un tiempo considerable, especialmente si uno necesita tomar las dimensiones de las células previo a una estimacién de biomasa (ver Booth, en este texto). Sin embargo, con estos métodos se puede obtener més informacién que utilizando sistemas automatizados. Por lo tanto, es importante tener en claro las preguntas que pretenden responderse en el trabajo para poder decidir la metodologia mas eficiente a utilizar. Asi, en algunos casos es posible que no sea necesaria una taxonomfa detallada; agrupar las células en categorfas de tamafios puede ser suficiente. De cualquier forma, siempre es bueno utilizar algin tipo de descripei6n (alfabética, numérica u otra) para aquellas células que tienen una posicién taxonémica incierta al momento de conteo. Si el organismo resulta ser importante en algiin aspecto, uno siempre puede analizar en mas detalle su taxonomia; una identificacién incorrecta puede dar lugar a interpretaciones errdneas, especialmente si se realizan estudios ecoldgicos 0 biogeogrficos. Notas 1. Disponible para la venta en varios lugares, por ejemplo Thomas Scientific (99 High Hill Road, Box 99, Swedesboro, NJ, 08085-0099, U. S. A) 2. Estas cmaras y cilindros son caros y a veces resultan dificiles de conseguir. En Estados Unidos se encuentran para la venta en Schlueter Instruments Corporation (Gunbarrel Square, Suite 320, 6525 Gunpark Drive, Boulder, Colorado, 80301, U.S. A). REFERENCIAS Booth, B. C., 1987. The use of autofluorescence for analyzing oceanic phytoplankton communities Bot. Mar. 30: 101-108 Borsheim, K. Y., T. Harboe, T. Johnsen, $. Norland & K. Nygaar, 1989. Flow cytometric characterization and enumeration of Chrysochromulina polylepis during a bloom along the Norwegian coast. Mar. Ecol. Prog. 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