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Acronyme :
B
Frquences
57 - 64 GHz
300 GHz
Ondes
millimtriques
30 GHz
10 GHz
2,45 GHz
UMTS
GSM
Figure 1 : Systmes de tlcommunications sans fil, A) Pour faire face la saturation des systmes de
tlcommunication actuels qui utilisent des frquences allant de 0,8 5 GHz, les fabricants se
dcalent vers de nouvelles bandes de frquences, notamment celles situes dans le domaine des ondes
dites millimtriques, comprises entre 30 et 300 GHz. B) Les frquences autour de 60 GHz seront
utilises dans des communications intra-btiment pour relier sans fil diffrents appareils
lectroniques.
et les organismes vivants ny ont encore jamais t exposs dans les conditions naturelles,
suggrant quaucun mcanisme dadaptation na jamais t slectionn au cours de
lvolution. De plus, ces ondes sont utilises en thrapie dans certains pays dEurope de lest,
ce qui laisse supposer que des interactions entre ces ondes et les organismes vivants sont
possibles. Lutilisation de nouveaux systmes de communication sans fil 60 GHz pourrait
donc avoir des consquences imprvues sur la population et la connaissance de limpact
potentiel des ondes millimtriques (OMM) de faible puissance sur la sant est de la plus haute
importance.
Les objectifs majeurs de notre projet consistaient dterminer in vitro les effets
potentiels des OMM de faible puissance sur les processus cellulaires lis aux stress.
Loriginalit de ce projet tient principalement son caractre anticipateur et prventif. En
effet, il est important de noter que notre tude sest place en amont et que son but tait de
vrifier linnocuit des OMM avant que ces dernires ne soient mises sur le march. A notre
connaissance, ce ft le premier projet en Europe se proposant dtudier grande chelle, les
effets biologiques potentiels des OMM.
Les matriels et mthodes :
Le systme dexposition que nous avons dvelopp est adapt pour des tudes in vitro,
sur des cellules en culture. Les OMM pntrent trs peu dans lorganisme. De ce fait, la peau
est lorgane principal soumis laction de ces ondes. Cest pourquoi nous avons privilgi les
kratinocytes dorigine humaine comme modle. Les conditions de culture dans ltuve
contenant le systme dexposition ont t optimises de faon ce quelles affectent le moins
possible la croissance et lhomostasie des cellules.
A
Les expositions de culture de cellules aux OMM ont t ralises avec deux types de
gnrateurs diffrents, qui possdent chacun leurs caractristiques propres. Le premier
(Siemens RWON 14) fonctionne dans une bande de frquence comprise entre 50 et 75 GHz
mais il est limit en puissance (puissance maximale (Pmax = 50 mW). Le deuxime appareil
utilis (QuinStar Technology) ne permet de travailler qu une seule frquence prcise (60,4
GHz, ce qui correspond la frquence de rsonance maximale de loxygne molculaire),
mais avec une puissance 20 fois plus forte (jusqu 1 W). Ainsi, en champ lointain, nous
avons pu atteindre une densit de puissance de 1 mW/cm2 (ce qui correspond la limite
actuelle pour le grand public, tablis par lICNIRP International Commission on NonIonizing Radiation Protection). De plus, le passage en zone de champ proche nous a par la
suite permis de monter en puissance jusqu dpasser les valeurs limites autorises pour les
travailleurs, cest dire 5 mW/cm2.
Une tude dosimtrique a t ralise pour optimiser notre systme et les conditions
dexposition. Ceci nous a notamment permis dobtenir une rpartition du dbit dabsorption
spcifique (DAS) (ou specific absorption rate, SAR en anglais) la plus uniforme possible
dans la monocouche cellulaire (notamment lors dexposition en champ proche). Une partie de
ce travail a t fait en collaboration avec le Centre de Physique Biomdicale (Temple
University, Philadelphia, USA). La Figure. 2 montre un exemple de distribution de la densit
superficielle de puissance et du DAS en champ lointain (A), ou en champ proche (B).
Les principaux rsultats scientifiques :
Plusieurs types de stress cellulaires ont dabord t examins lors dexpriences
pilotes. Ces rsultats prliminaires nous ont incits concentrer nos efforts sur le stress du
rticulum. Le rticulum endoplasmique (RE) assure un certain nombre de fonctions cruciales
pour lhomostasie et la survie cellulaire. Ce compartiment cellulaire est vulnrable
plusieurs perturbations : flux ioniques, modifications de membrane ; autant de paramtres
potentiellement influenables, daprs la bibliographie, par des expositions aux OMM.
De faon avoir une approche la plus complte possible, plusieurs niveaux de rponse
(promoteur, ARN, protines) ont t analyss. Dabord, nous avons vrifi si lexposition aux
OMM nentrainait pas de dnaturation massive des protines au sein du rticulum. Pour cela,
la phosphatase alcaline SEAP (pour Secreted-Embryonic Alcalin Phosphatase) a t utilise
comme rapporteur (test 1 figure 3). En complment, nous avons galement vrifi si
lexposition aux ondes 60,4 GHz ninduisait pas lpissage du messager codant le facteur
XBP1 (test 2 figure 3). En utilisant un gne rapporteur contenant le gne lucifrase sous
contrle dun promoteur contenant des lments de rponse ERSE (ER-stress element), nous
avons ensuite regard si lexposition aux OMM nactivait pas le facteur de transcription ATF6
(test 3 figure 3). Enfin, nous avons vrifi si lexposition ninduisait pas lexpression des
gnes codant pour les chaperons du rticulum (BiP/Grp78, ORP150 test 4, figure 3). Nous
avons mesur les niveaux dexpression dans les cellules irradies et dans les cellules contrles
(sham), et compar ces niveaux ceux obtenus aprs traitement avec des drogues telles que la
thapsigargine et la brfeldine A, connues pour induire un stress rticulaire aig.
Pour complter notre tude, nous avons regard si les caractristiques physiques des
ondes pouvaient ou non avoir une influence sur linduction du stress rticulaire. Autrement
dit, nous avons tudi le rle des principaux paramtres de rayonnement : frquence, densit
de puissance et rgime dexposition (figure 3). Nous avons commenc par analyser le rle de
la frquence en nous plaant dans la bande de frquences 57-64 GHz (norme IEEE
802.15.3c). Le choix des longueurs dondes testes sest fait selon les donnes de
spectroscopie micro-ondes. En chimie analytique, linteraction ondes-matire est utilise pour
caractriser certaines molcules dilectriques. Au sein des donnes disponibles, nous avons
slectionn 8 frquences spcifiques de groupements molculaires contenant du carbone, de
loxygne ou de lazote, trois atomes fortement prsents dans les macromolcules
biologiques. De plus, nous avons analys leffet de la puissance des OMM sur la rponse au
stress rticulaire. Pour cela, le systme dexposition a t modifi afin de pouvoir exposer les
cellules en champs proche et ainsi monter en puissance, jusqu des niveaux dpassant les
normes requises pour le grand public ou les travailleurs et atteindre les niveaux utiliss en
thrapie dans les pays dEurope de lest.
- Dure de lexposition (20 min, 1h, 6h, 24h, 48h, 72h)
- Frquences (59.00; 59.16; 59.26; 59.41; 59.62; 59.84; 59.87; 60.14; 60.40; 60.53;
OMM
- Densit superficielle de puissance (0.0; 0.3; 1.1, 2.5; 5.0; 10.0; 20.0
mW/cm2)
ATF6
XBP1
Test 2 : Analyse de
lpissage par RT-PCR
IRE1
Noyau
Surexpression des
chaperons du RE
Rticulum
endoplasmique Golgi
maturation
& scrtion
normale des
protines
Test 1 : Test
fonctionnel de la
phosphatase
alcaline scrte
(RE)
Test 4 : Analyse de
lexpression par RTPCR quantitative
Figure 3 : Effet des ondes millimtriques (OMM) sur le stress du rticulum Plusieurs paramtres
dexposition (surligns en bleu) ont t analyss. Le rticulum est impliqu dans la maturation des
protines devant emprunter le systme scrtoire. En cas de stress prototoxique dans ce
compartiment cellulaire, plusieurs voies de signalisation sont actives. Lune conduit la maturation
dATF6 et la seconde induit la synthse du facteur XBP1. Ces facteurs de transcription permettent la
surexpression de protines chaperons spcifiques au rticulum. Plusieurs tests (surligns en jaune)
ont t utiliss pour valuer ltat du stress du rticulum aprs exposition des cellules.
ou tardive (24h). Parmi les 41000 entits gniques prsentes sur les puces, 26301 spots
positifs, correspondant aux gnes exprims dans la cellule ont t obtenus. Plusieurs analyses
comparatives ont t effectues (0h vs 1h ; 0h vs 6h ou 0h vs 24h). De faon renforcer la
robustesse du test statistique utilis par le logiciel GeneSpring (test t), des corrections
statistiques supplmentaires peuvent tre appliques. Dans les conditions statistiques les plus
stringentes (test t avec les corrections de Bonferroni, Wetsfall-Young ou de BenjaminiHochberg), aucun gne nest trouv diffrentiellement exprim. Ce nest quen absence de
correction statistique supplmentaire que 130 gnes cibles potentiels ont pu tre slectionns
(Tableau 1). Curieusement, on peut remarquer que les expositions aux OMM semblent tre
marques majoritairement par des phnomnes de rpression de niveaux dexpression des
gnes (figure 4A et 4B)
1.
Figure 4 : Diagrammes deVenn montrant la rpartition des gnes potentiellement sur- (A) ou sousexprims (B) aprs 1h, 6h ou 24h dexposition 60,4 GHz. C) Validation des rsultats de microarray
par RT-PCR quantitative. Chaque valeur est la moyenne +/- lcart type de 4 expriences
indpendantes. * P < 0.05 compar au contrle (sham).
Labsence de correction statistique lors de la slection implique que sur les 130 gnes
trouvs, nombre dentre eux doivent correspondre des faux positifs. Cest pourquoi nous
avons effectu une validation par RT-PCR en temps rel. Nous avons slectionn les 24 gnes
qui prsentaient la meilleure combinaison par rapport : 1) leur niveau dexpression
diffrentielle enregistre par les puces ADN ; 2) leur valeur p lors des tests statistique sans
correction, 3) leur niveau dexpression (pas trop proche du bruit de fond, afin dviter toute
source de faux positif). Notre analyse par PCR (figure 4C) a mis en vidence 5 gnes qui sont
confirms comme tant rellement diffrentiellement exprims en cas dexposition. Ces gnes
sont :
- CRIP2 (CYSTEINE-RICH PROTEIN 2) Code une zinc ion binding protein, ayant
un rle dans la prolifration cellulaire et lhmopose
4/
C Le Qument, C Nicolas Nicolaz, M Zhadobov, R Sauleau, D Thouroude, D Michel, and Y
Le Dran. Investigation of Potential Power-Dependent Effects of Millimeter-Wave Radiations on
Various Aspects of Human Cell Functioning BioEM 2009 - Davos, Switzerland, June 15-19, 2009.
5/
M Zhadobov, R Sauleau, C Nicolas Nicolaz, D Thouroude, D Michel, C Le Qument, and Y
Le Dran. Millimeter-wave exposure setup and dosimetry for in vitro studies BioEM 2009 - Davos,
Switzerland, June 15-19, 2009.
6/
M Zhadobov, R Sauleau, D Thouroude, C Nicolas Nicolaz, C Le Quement, and Y Le Dran.
Methodology for Local and Average SAR Evaluation at Millimeter Waves. Progress In
Electromagnetics Research Symposium - PIERS 2009 in Moscow, RUSSIA, 18-21 August, 2009.
7/
M Zhadobov, R Sauleau, D Thouroude, C Nicolas Nicolaz, C Le Qument and Y Le Dran.
NEAR-FIELD Electromagnetic dosimetry for in vitro studies at millimeter waves European
Conference on Antennas and Propagation, Barcelona, 12-16 April 2010
8/
M. Zhadobov, R. Sauleau, D. Thouroude, Ch. Nicolas Nicolaz, C. Le Qument, D. Michel,
and Y. Le Dran (2010). Numerical near-field dosimetry for in vitro experiments at millimeter waves.
32nd Annual Meeting of BEMS, Seoul, South Korea, June 14-18.
9/
C. Le Qument, C. Nicolas Nicolaz, M. Zhadobov, F. Desmots, R. Sauleau, D. Thouroude, D.
Michel, Y. Le Dran. Gene expression profiling of primary human keratinocyte cells exposed to 60GHz millimeter waves. 32nd Annual Meeting of BEMS. Seoul, Korea. June 14-18, 2010
Thse :
Thse d'universit, soutenue le 26 novembre 2009 Rennes, par Christophe NICOLASNICOLAZ Contribution ltude du stress cellulaire potentiellement induit par les ondes
millimtriques . 1er prix de thse de lUniversit Europenne de Bretagne 2010, sur le thme
de linterdisciplinarit.
Conclusions et retombes :
La principale conclusion de ce projet est que, dans la limite de faibles puissances ne
gnrant pas deffets thermiques, lexposition des OMM ninduit pas de stress cellulaire,
notamment de stress du rticulum. Cette hypothse peut donc tre carte, ce qui est rassurant
quant lutilisation future des OMM en tlcommunication sans fil.
Lanalyse par puces ADN montre qu court terme, limpact des OMM sur
lexpression gntique est trs limit. Seuls 5 gnes sur 26301 (0.02%) ont t trouvs comme
ayant une expression modifie aprs 6 h dexposition, avec un retour la normal aprs 24h.
Ce rsultat confirme que lexposition aux OMM de faibles puissances a peu dimpact sur
lhomostasie cellulaire. Nanmoins la mise en vidence de quelques gnes cibles nous a mis
sur de nouvelles pistes de travail et les perspectives lissu de ce projet sont multiples. Il faut
noter que sur les cinq gnes confirms par RT-PCR, deux sont impliqus dans la rponse
immunitaire ou dans la perception sensorielle, ce qui confirme des observations antrieures,
suggrant que les OMM, dans certaines conditions, pourrait avoir un impact potentiel sur les
cellules. Des expriences seront ncessaires pour savoir si cette rponse biologique peut avoir
des consquences sur lorganisme.
Il faut souligner que nous avons diffus nos travaux dans la socit civile. Certains
membres de notre consortium ont donn des sminaires grand public (confrences lEspace
des Sciences de Rennes, Festivals des Sciences, Matinales Rennes Atalantes, etc.), afin de
rpondre localement la forte demande socitale concernant les effets des ondes sur la sant.
De plus les rsultats de ces travaux ont t largement cits dans le rapport dexpertise
collective de lAFSSET sur lvaluation des risques sanitaires lis lutilisation du scanner
corporel ondes millimtriques (Fvrier 2010).