STATUS APOPTOSIS KOMPLEKS KUMULUS-OOSIT LEMBU

DALAM MENINGKATKAN PERSENYAWAAN IN VITRO

MENGGUNAKAN ASAI ANNEXIN V

NURHASLINA BINTI HASAN

TESIS YANG DIKEMUKAKAN UNTUK MEMENUHI SEBAHAGIAN

DARIPADA SYARAT MEMPEROLEHI IJAZAH
SARJANA SAINS PERUBATAN

FAKULTI PERUBATAN
UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA
KUALA LUMPUR

2013

ii

PENGAKUAN

Saya akui karya ini adalah hasil kerja saya sendiri kecuali nukilan dan ringkasan yang
setiap satunya telah saya jelaskan sumbernya.

22 Ogos 2013

NURHASLINA BINTI HASAN

P 50277

iv

ABSTRAK

Morfologi kompleks oosit-kumulus (COC) merupakan rujukan utama dalam pemilihan

oosit yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi embrio secara in vitro. Namun
begitu, laporan menunjukan bahawa kaedah pemilihan ini menjurus kepada kesilapan
akibat ralat pemerhatian dan manusia. Terbaru, status apoptosis menggunakan asai
annexin dikatakan mampu mengatasi isu ini. Kajian ini telah membandingkan kadar
persenyawaan di antara COC yang telah ditentukan status apoptosisnya menggunakan
asai annexin berserta dengan COC yang secara morfologinya berkualiti baik. COC
dengan ciri morfologi yang baik di dalam kajian ini merupakan COC dengan jasad
kumulus yang berlapis-lapis dan padat, ooplasma yang homogenus serta keseluruhan
COC kelihatan lutsinar. Masa pengikatan yang sesuai di antara Annexin V dengan COC
ditentukan bagi mengurangkan kebarangkalian gangguan pada pertumbuhan sel tersebut
akibat pewarnaan berpendafluor. Ini dilaksanakan menggunakan 82 COC lembu yang
diinkubasi dengan asai Annexin V selama 5, 15 dan 1440 minit. Hasil menunjukan
pengikatan di antara Annexin V dengan COC apoptosis telah berlaku seawal 5 minit
dengan COC yang ditandai positif dan negatif masing-masing sebanyak 44 (53.7%) dan
38 (46.3%). Sebanyak 157 COC yang lain pula diinkubasi dengan asai annexin V selama
5 minit dan kemudian diasingkan kepada dua kumpulan ; positif (n=76) dan negatif
(n=81) ditanda dengan isyarat berpendafluor Annexin V-FITC dan propidium iodida.
Setelah diasingkan, kedua-dua kumpulan tersebut dan juga COC yang tidak diwarnakan
dengan asai annexin V (n=68; kawalan) dimatangkan. Kumpulan kumulus oophorus
(COC) ini kemudian disenyawakan dan dikulturkan (IVM-IVF-IVC). Selepas 72 jam
post inseminasi , kadar persenyawaan ditentukan. Hasil menunjukan kadar persenyawaan
kumpulan kawalan (66%), kumpulan negatif (79%) dan positif (50%) untuk COC yang
ditanda adalah berbeza dengan signifikan ( (2) = 14.60, p < 0.05). Kesimpulan, COC
yang menunjukan ciri morfologi sihat adalah campuran di antara oosit hidup dan mati.
Asai Annexin ini mampu mengasingkan COC yang mempunyai nilai potensi yang tinggi
untuk disenyawakan.

APOPTOSIS STATUS IN BOVINE CUMULUS-OOCYTE COMPLEX FOR IN

VITRO FERTILIZATION USING ANNEXIN-V ASSAY

ABSTRACT

Cumulus-oocyte complex (COC) morphology is the primary method for viable oocyte
selection. Unfortunately, report has indicated that this form of assessment is prone to
error due to visual and human biasness. Recently, apoptosis status using Annexin-V assay
has been suggested to be able to rectify this issue. This study had compared fertilization
rate between Annexin-V selected COCs with morphologically healthy selected COCs.
Suitable binding time between Annexin-V and COCs was determined to minimize
possibility of the fluorescent stain disrupting oocyte development. COCs with
morphology of compact multi-layered cumulus investment, homogeneous ooplasm, light
appearance and high level of transparency were used as criteria of selection of healthy
oocytes. This was achieved using 82 cattles COCs that were incubated with Annexin-V
for 5 min, 15 min and 24 hours. Results showed binding time between Annexin-V and
nonviable COCs occurred as early as 5 min with positively and negatively tagged COCs
were 44 (53.7 %) and 38 (46.3%) respectively. Another 157 COCs were then incubated
with Annexin-V assay for 5 min and later separated into 2 groups; positively (n= 76) and
negatively (n=81) tagged with annexin-V-FITC and propidium iodide fluorescent signals.
Once separated, non-stained COCs (n=68; control) and the two aforementioned groups
were matured. They were then fertilized and cultured (IVM-IVF-IVC). After 72 hour
post-insemination (hpi), cleavage rates were determined. Outcome indicated that the
fertilization rate of control group (66%), negatively tagged (79%) and positively (50%)
tagged COCs was significantly different ( (2) = 14.60, p < 0.05) between the groups. In
conclusion, our study had indicated a morphologically healthy COCs were a mixture of
viable and nonviable oocytes. The Annexin V assay was able to select viable oocytes that
have significantly high potential to be fertilized.

vi

KANDUNGAN

Halaman
PENGAKUAN

ii

PENGHARGAAN

iii

ABSTRAK

iv

ABSTRACT

KANDUNGAN

vi

SENARAI JADUAL

ix

SENARAI ILUSTRASI

SENARAI SINGKATAN

xi

SENARAI SIMBOL

xii

BAB I

PENDAHULUAN

1.1

Pengenalan

1.2

Objektif Kajian

1.3

Hipotesis Kajian

BAB II

KAJIAN KEPUSTAKAAN

2.1

Pengenalan

2.2

Teknologi Pembiakan Berbantu (ART)

2.3

Proses Pengumpulan Oosit

2.4

Pemilihan Kompleks Kumulus-Oosit

2.4.1 Pemerhatian morfologi

2.4.2 Pewarnaan

9
14

Pematangan Oosit

18

2.5.1 Perubahan biokimia dan fiosiologi

2.5.2 Faktor yang mempengaruhi IVM

18
21

2.6

Persenyawaan In Vitro (IVF)

22

2.7

Pengkulturan In Vitro (IVC)

24

2.8

Annexin-V

26

BAB III

METODOLOGI KAJIAN

3.1

Bahan-bahan Kimia

2.5

29

vii

3.2
3.3

Intrumen

29

3.1.1 Mikroskop Pendaflor

29

Media

30

3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
3.3.7
3.3.8
3.3.9

Persampelan
Aspirasi
Media pencuci
Pematangan in vitro
Media Bracket dan Oliphant
Pencuci sperma
Pencair sperma
Pencuci oosit
Kultur CR1aa

30
30
30
31
31
32
32
32
32

3.4

Penyelidikan Keseluruhan

33

3.5

Kaedah Di Lapangan

36

3.6

Kaedah Di Makmal

37

3.7

Pewarnaan COC Menggunakan Asai Annexin

38

3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.7.4

38
38
38
40

Objektif 1 : Penentuan isyarat status apoptosis

Objektif 2 : Penentuan masa penambatan
Objektif 3 : Kesan proses penyahwarnaan
Objektif 4 : Kadar belahan embrio

3.8

Ujian Statistik

BAB IV

HASIL

4.1

Pengenalan

43

4.2

Objektif 1 : Penentuan Status Apoptosis COC berdasarkan

Pewarnaan Annexin-V

43

4.3

Objektif 2 : Penentuan Masa Penambatan Annexin-V Yang

Optimum

44

4.4

Objektif 3 : Kesan Teknik Penyahwarnaan Terhadap

Pengembangan Jasad Kumulus

46

4.5

Objektif 4 : Perbandingan Peratusan Belahan Embrio

47

BAB V

PERBINCANGAN

49

BAB VI

KESIMPULAN

58

RUJUKAN

42

60

viii

LAMPIRAN
A

Contoh kaedah penentuan gred 1 pengembangan jasad

kumulus menggunakan perisian ImageJ

67

Contoh peringkat belahan (cleavage) yang digunakan dalam

Penentuan peratusan pembentukan belahan embrio

68

ix

SENARAI JADUAL

No. Jadual

Halaman

2.1

Kriteria yang digunakan untuk menilai kualiti oosit

12

2.2

Kriteria Beltsville dalam pemilihan oosit bovin

13

4.1

Bilangan dan peratusan kompleks oosit-kumulus (COC)

yang menunjukan isyarat positif dan negatif oleh pewarnaan
annexin mengikut masa pengeraman

45

4.2

Pengkelasan kompleks oosit-kumulus berdasarkan

pengembangan sel kumulus di antara kumpulan
yang menjalani dengan tidak menjalani proses penyahwarnaan

47

4.3

Kadar persenyawaan yang diwakili oleh kadar belahan

bagi COC secara morfologinya berkualiti tinggi dengan
COC yang menunjukan isyarat annexin positif dan negatif

48

SENARAI ILUSTRASI

No. Rajah

Halaman

2.1

Proses penghasilan embrio secara in vitro (IVP)

2.2

Contoh pengkelasan kompleks kumulus-oosit pra-matang

berdasarkan kriteria morfologi iaitu lapisan sel kumulus

11

2.3

Perubahan morfologi sewaktu peringkat apoptosis awal dan

lewat

15

2.4

Kajian apoptosis mengikut perubahan yang berlaku pada

bahagian-bahagian sel tertentu

16

2.5

A. Germinal vesikel di dalam oosit primer dan B. oosit bovin

pada peringkat GVBD

19

2.6

Peringkat pematangan nukleus menggunakan pewarnaan

DAPI A. Germinal vesikel; B. Metafasa I; C1 dan C2
Metafasa II

20

2.7

Sebelum dan selepas pematangan in vitro oosit lembu.

(A) Sebelum pematangan (B) Pengembangan kumulus
selepas 24 jam pematangan in vitro pada
pembesaran 100X.

21

2.8

Sistem persenyawaan in vitro (IVF) lembu

23

2.9

Peringkat dalam perkembangan embrio bovin

25

2.10

Skema fenomena pengikatan asai annexin di peringkat awal

dan akhir apoptosis

28

No. Gambar

Halaman

4.1

Contoh kompleks sel kumulus yang menjalani proses pewarnaan

Annexin V yang diperhatikan pada kontras fasa yang berbeza
iaitu pencahayaan (a) medan cerah dan (b) berpendarfluor.

44

4.2

Pengkelasan pengembangan sel kumulus a) Gred 1 dan

b) Gred 2.

46

xi

SENARAI SINGKATAN

ART

Teknologi reproduktif berbantu

BME

Media basal eagle

BSA

Serum albumin bovin

BO

Bracket dan Oliphant

CaCO3

Kalsium bikarbonat

COC

Kompleks oosit-kumulus

CO2

Karbon dioksida

EGF

Faktor pertumbuhan epidermal

FBS

Serum fetal bovin

FITC

Fluoroisothyocenide

FSH

Hormon penggalak folikel

hpi

Jam post-inseminasi

IVC

Pengkulturan in vitro

IVF

Persenyawaan in vitro

IVM

Pematangan in vitro

IVP

Penghasilan embrio in vitro

MEM

Media minimal perlu

LH

Hormon luteinizing

PBS

Penimbal fosfat salin

PI

Propidium iodida

PS

Fosfatidilserina

TCM

Media kultur tisu

xii

SENARAI SIMBOL
0

Darjah celcius

Molar

Gram

mg

Miligram

ng

Nanogram

Peratus

Mikroliter

Mikrogram

Mikrometer

Meter

mm

Milimeter

Panjang gelombang

BAB I

PENDAHULUAN

1.1

PENGENALAN

Jabatan Perkhidmatan Haiwan (DVS) melaporkan terdapat peningkatan dalam

permintaan terhadap daging lembu oleh rakyat Malaysia pada kadar 5.4% setahun.
Ianya dipercayai berlaku berikutan peningkatan bilangan populasi dan pendapatan per
kapita serta perubahan gaya hidup akibat urbanisasi. Namun begitu, penghasilan
daging lembu di dalam negara hanya mampu memenuhi 25 peratus daripada jumlah
keseluruhan permintaan terhadap daging lembu. Oleh yang demikian, kerajaan
Malaysia perlu mengimport hampir 75% daripada keperluan daging lembu yang
berjumlah RM 300 juta setahun dari negara luar seperti India, Indonesia dan Australia
(Jabatan Perangkaan Malaysia 2010). Sekiranya ketidakseimbangan di antara nilai
import dan eksport bahan makanan ini berterusan, ini mampu melambatkan proses
pertumbuhan ekonomi negara.

Oleh yang demikian, suatu langkah dalam meningkatkan pengeluaran dan

produktiviti lembu pedaging perlu di ambil bagi menangani masalah ini. Bidang yang
sedang giat dijalankan diseluruh dunia dalam meningkatkan sesuatu produktiviti
sesuatu industri ialah bidang bioteknologi (Azimon & Zeti 2009). Bidang bioteknologi
dirujuk sebagai kegiatan atau kajian yang menggunakan sistem atau proses biologi
dalam industri pengeluaran atau perkhidmatan bagi menghasilkan sesuatu produk
(Dewan Bahasa dan Pustaka 2011).

Pengaplikasian bidang ini di seluruh dunia yang melibatkan integrasi pelbagai

disiplin sains dilihat mampu meningkatkan kualiti hidup manusia di samping menjadi
antara bidang terpenting dalam memacu ekonomi sesebuah negara (Kornberg 2012).
Pembentukan Dasar Bioteknologi Negara yang dilancarkan pada tahun 2005 telah
menunjukan komitmen kerajaan Malaysia dalam memastikan bidang ini berkembang
dengan pesat di negara ini (Rancangan Malaysia Kesembilan 2005).

Di dalam sektor penternakan, salah satunya kaedah bioteknologi yang giat

dikaji dalam meningkatkan produktivitinya ialah teknologi reproduktif berbantu atau
lebih dikenali sebagai ART (assisted reproductive technology). Teknologi ini
merangkumi pelbagai teknik yang secara umumnya digunakan dalam meningkatkan
produktiviti serta menambah baik kualiti embrio (produk) yang dihasilkan. Di antara
teknik yang kerap diaplikasikan dan dikaji bagi penghasilan embrio ini ialah teknik
persenyawaan in vitro atau lebih dikenali sebagai in vitro fertilization (IVF) (Bols et
al. 2010).

IVF merujuk kepada persenyawaan di antara oosit dan sperma yang dilakukan
di luar rahim (in vitro). Kejayaan teknik ini dalam menghasilkan embrio secara in
vitro bergantung kepada beberapa faktor penting. Salah satu faktor tersebut ialah
kualiti sel oosit yang dipilih. Pemilihan kualiti oosit yang berkualiti yang
kemudiannya dimatangkan dan disenyawakan mampu meningkatkan kuantiti dan juga
kualiti embrio yang dihasilkan sebelum ianya dipindahkan ke ibu tumpang (Elder et
al. 2010).

Sehingga kini, secara rutinnya pemilihan kualiti oosit adalah berdasarkan

penilaian visual di mana parameternya adalah berdasarkan beberapa ciri morfologi
seperti keadaan sitoplasmik oosit serta bilangan lapisan sel kumulus (Khandoker et al
2012). Namun, apa yang menjadi isu di dalam mempraktikkan teknik ini ialah ianya
bersifat subjektif, masa yang diperlukan dalam menilai morfologi sel tersebut, ralat
pemerhati dan teknik ini juga hanya dapat dilakukan oleh tenaga mahir. Oleh yang
demikian kajian ini dijalankan bertujuan mencari satu kaedah alternatif yang lebih
objektif dan praktikal bagi membolehkan ianya digunakan secara meluas di dalam

sektor penternakan seterusnya mampu meningkatkan produktiviti ternakan lembu di

negara ini.

Terdapat beberapa ciri yang boleh dijadikan penunjuk dalam menentukan

kualiti oosit yang baik di mana salah satunya ialah pengasingan oosit yang mengalami
apotosis. Di antara teknik yang digunakan dalam pengasingan sel yang mengalami
apotosis ialah melalui pengesanan translokasi fosfatidilserina (PS) ke luar membran
sel yang merupakan salah satu tanda awal berlakunya apoptosis. Di dalam kajian ini,
pendiagnosan apoptosis peringkat awal melalui pengesanan PS menggunakan
pewarnaan berflouresein iaitu Annexin-V flouresin isotiosianat (FITC) dikaji bagi
memberikan kaedah alternatif yang lebih dipercayai dan cepat berbanding kaedah
yang sedia ada (Huerta et al. 2007).

Apabila pemilihan kualiti oosit yang digunakan dalam persenyawaan in vitro

dapat dilakukan dengan lebih tepat dan cepat, maka diharapkan ianya dapat
menyumbang dalam mengekalkan baka terbaik lembu pedaging. Seterusnya
meningkatkan kualiti daging yang dihasilkan serta meningkatkan produktiviti
pengeluaran daging itu sendiri.

1.2

OBJEKTIF KAJIAN

1.2.1 Objektif Umum

Mengkaji

kaedah

pengasingan

apoptotik

kompleks

kumulus-oosit

(COC)

menggunakan asai Annexin-V bagi meningkatkan kadar persenyawaan in vitro.

1.2.2 Objektif Khusus

1. Menentukan status apoptotik kompleks kumulus-oosit (COC) berdasarkan

penambatan Annexin-V.
2. Menentukan masa pengeraman yang optimum bagi proses pengikatan asai
annexin.
3. Menentukan kesan teknik penyahwarnaan terhadap perkembangan
kompleks kumulus.
4. Membandingkan peratusan belahan embrio di antara kumpulan COC yang
diisolasi menggunakan pewarnaan annexin berbanding kawalan.

1.3

HIPOTESIS KAJIAN

Kajian ini menjangkakan bahawa penambatan Annexin-V terhadap kompleks

kumulus-oosit (COC) yang apoptosis boleh berlaku seawal lima minit. Selain itu,
kehadiran pewarnaan berpendaflour annexin dijangkakan tidak mengganggu proses
perkembangan COC. COC yang berkualiti baik hasil pengasingan menggunakan asai
Annexin-V mempunyai kadar peratusan belahan embrio yang lebih tinggi berbanding
kawalan.

BAB II

KAJIAN PERPUSTAKAAN

2.1

PENGENALAN

Sektor pertanian merujuk kepada perihal pengeluaran makanan dan barangan melalui
aktiviti seperti perkebunan, penanaman, perhutanan dan juga penternakan. Di
Malaysia, sektor pertanian merupakan salah satu sektor penting yang menyumbang
kepada pendapatan negara. Pada tahun 2008, sektor pertanian telah menyumbang
sebanyak RM 38,379.5 juta daripada jumlah keseluruhan nilai keluaran kasar negara
dengan pertambahan berjumlah RM 22,543.7 juta (Jabatan Perangkaan Malaysia
2010).

Walaupun nilai keluaran kasar negara secara umumnya menunjukkan

peningkatan sebanyak 96.1 % namun daripada jumlah keseluruhan ini hanya 3%
sahaja yang disumbangkan oleh subsektor penternakan. Di antara tiga industri utama
di dalam subsektor penternakan (ayam, itik, babi dan lembu), industri penternakan
lembu mencatatkan peratusan terendah dengan nilai peratusan 18.4 peratus (Jabatan
Perangkaan Malaysia 2010). Ini menunjukkan subsektor penternakan lembu masih
jauh ketinggalan dalam menyumbang kepada pembangunan ekonomi negara.

Usaha untuk meningkatkan daya saing di peringkat global serta sumbangan

industri ini kepada pembangunan ekonomi negara melibatkan perubahan gaya
pelaksanaan aktiviti ini daripada pendekatan tradisional kepada pengaplikasian
teknologi yang lebih moden seperti teknologi pembiakan berbantu atau assisted
reproductive technology (ART).

2.2

TEKNOLOGI PEMBIAKAN BERBANTU (ART)

Teknologi pembiakan berbantu (ART) merupakan salah satu bioteknologi terpenting

dalam industri penternakan. Terdapat pelbagai kaedah di dalam ART yang tersedia
untuk diaplikasikan oleh para penternak haiwan dalam meningkatkan kualiti dan
produktiviti ternakan mereka. Di antara teknologi yang giat dikaji bagi penghasilan
embrio yang berkualiti tinggi ialah melalui penggunaan teknik persenyawaan di luar
rahim atau in vitro fertilization (IVF) (RodriguezMartinez 2012).

Di antara kelebihan di dalam pelaksanaan teknologi ini secara komersialnya

ialah ia dapat membantu di dalam penambahbaikan genetik embrio yang terhasil
dengan penghasilan lebih banyak anak lembu daripada baka lembu yang berkualiti
tinggi (Hansen 2006). Selain dari itu, teknologi penyejukbekuan embrio yang
merupakan satu cabang ART juga membolehkan embrio yang terhasil di hantar dari
satu negara ke satu negara lain yang mampu mengurangkan pergerakan lembu untuk
jangka masa yang panjang serta kos penghantaran yang tinggi (Gordon 1994).

Seawal 1987, seekor anak lembu telah berjaya dilahirkan menggunakan sistem
penghasilan embrio melalui teknik IVF (Lu et al. 1987). Namun, kajian demi kajian
perlu dijalankan dalam mengatasi pelbagai permasalahan di dalam sistem ini berikutan
bilangan embrio yang dihasilkan hanya sekitar 25% daripada bilangan oosit yang
diperolehi (Lu & Polge 1992). Perlu diketahui bahawa penghasilan embrio
menggunakan sistem ini memerlukan beberapa peringkat pelaksanaan yang
mendedahkan sel yang sedang berkembang kepada persekitaran yang berbeza.

Bermula daripada pengumpulan sel oosit yang diperolehi daripada ovari lembu
yang menjalani rawatan superovulasi mahupun dari ovari lembu yang disembelih,
oosit kemudiannya dimatangkan (IVM) dan disenyawakan (IVF) secara in vitro di
dalam kultur media (IVC) yang khusus (Khandoker et al. 2012). Ilustrasi dalam Rajah
2.1 menunjukan peringkat di dalam proses penghasilan embrio secara in vitro dengan
dpi merujuk kepada hari selepas permanian atau inseminasi.

Penyahbekuan
sperma

Isolasi sperm

Oosit pramatang

Pengumpulan
oosit

Blastosis

Morula

9-16 sel

5-8 sel

2-4 sel

zigot

Persenyawaan oosit matang

Rajah 2.1 Proses penghasilan embrio secara in vitro (IVP)

Sumber : Diolah daripada Vandaele & Van Soom 2008

2.3

PROSES PENGUMPULAN OOSIT

Proses pemulihan oosit di dalam kebanyakan kajian persenyawaan in vitro (IVF)

lembu bermula dengan proses pengumpulan oosit pramatang dari lembu yang
menjalani proses superovulasi mahupun ovari lembu yang disembelih. Namun begitu,
pengumpulan sel oosit daripada lembu yang disembelih lebih menjadi pilihan. Ini
adalah berikutan kesukaran mengendalikan haiwan yang hidup, kadar pemuliharaan
oosit yang rendah, kualiti oosit yang tidak menentu selepas rawatan hormon dan juga
kos yang tinggi dalam mendapatkan sel oosit dari lembu yang menjalani proses
superovulasi (Machaty et al. 2012).

Proses pengumpulan oosit daripada ovari lembu yang disembelih boleh

dilakukan melalui pelbagai teknik yang berbeza. Di antara teknik pengumpulan oosit
yang kerap digunakan dan dikaji ialah teknik tusukan, penyedutan (aspirasi), diseksi
mahupun teknik hirisan. Namun Gordon (1994) mencadangkan agar kaedah hirisan

digunakan di dalam keadaan di mana sampel ovari sukar diperolehi dan bilangan ovari
yang diproses pada masa yang sama adalah sedikit. Ini adalah kerana perbandingan
dari segi aspek jangkamasa pemprosesan mendapati teknik hirisan memerlukan masa
yang lebih panjang berbanding teknik penyedutan.

Selain itu, kajian oleh Hoque et al. (2011) mendapati kaedah tusukan dan
hirisan menunjukkan bilangan kompleks kumulus-oosit (COC) yang diperolehi bagi
setiap ovari lebih tinggi jika dibandingkan dengan kaedah penyedutan. Namun begitu,
kaedah penyedutan menunjukan bilangan COC berkualiti baik yang lebih tinggi jika
dibandingkan dengan kaedah tusukan dan hirisan. Maka apa yang dapat disimpulkan
di sini ialah teknik pengumpulan COC yang berbeza mempunyai kelebihan dan
kelemahannya yang tertentu, namun bilangan oosit yang berkualiti adalah penting
memandangkan ia adalah salah satu faktor terpenting dalam penghasilan embrio.

Setelah oosit pramatang berjaya dikumpulkan, langkah seterusnya ialah

pengkelasan sel tersebut mengikut kualitinya daripada segi potensi dalam
menghasilkan embrio. Langkah penilaian ini sangat penting dalam memastikan
embrio yang terhasil berjaya dikandungkan dan seterusnya mempunyai ciri genetik
yang berkualiti tinggi (Anguita et al. 2007; Khandoker et al. 2012).

2.4

PEMILIHAN KOMPLEKS KUMULUS OOSIT (COC)

2.4.1 Pemeriksaan morfologi

Sehingga kini masih banyak kajian dijalankan dan dicadangkan (Bukowska et al.
2012) dalam menentukan kualiti sesuatu oosit, namun kebanyakan sistem yang
digunakan adalah berdasarkan pemeriksaan morfologi sel tersebut (Goovaerts et al.
2010). Ini adalah kerana morfologi COC yang diperolehi menunjukkan tahap atresia
folikel tersebut (Dadashpour Davachi et al. 2011).

Di antara ciri morfologi yang didasarkan dalam penentuan kualiti sesuatu sel
oosit ialah diameter folikel (Lechniak et al. 2002), kepadatan dan bilangan lapisan sel

10

kumulus (Khurana & Niemann 2000) serta keadaan dan bentuk ooplasmanya
(Salamone et al. 2001). Ini adalah kerana kajian terawal oleh Leibfried dan First
(1979) dan kajian terkini (Dadashpour Davachi et al. 2011) mengakui kehadiran sel
kumulus yang mengembang serta keadaan sitoplasma yang utuh menyumbang kepada
kemampuan oosit tersebut untuk matang. Kehadiran sel kumulus dikatakan penting
dalam membantu pematangan nuklear dan sitoplasmik oosit (Zhang et al. 1995).
Kajian oleh Mingoti et al. (2002) keatas aktiviti steroidogenesis di dalam sel kumulus
mendapati, sel kumulus berkemampuan merembeskan estradiol dan progesteron yang
merupakan elemen penting dalam proses pematangan oosit.

Sebagai contoh, kajian oleh Vassena et al. (2003) membahagikan kualiti COC
kepada tiga kumpulan iaitu oosit yang gondol, mengalami kemerosotan atau atresia
dan yang sihat. Kajian ini mendefinisikan kualiti oosit yang gondol sebagai oosit
dengan ciri kurang daripada satu lapisan lengkap sel granulosa. Bagi oosit yang
dikelaskan mengalami kemerosotan, ianya mempunyai satu atau lebih ciri seperti
kumulus yang sangat mengembang, nukleus sel granulosa piknotik, nukleus oosit
yang berserpih atau cacat, sitoplasma oosit yang lompang atau separa hadir serta zona
pelusida yang kosong. Oosit yang dikelaskan sebagai sihat pula mempunyai tiga
lapisan sel granulosa disekelilingnya, kumulus yang padat, granular sitoplasma oosit
yang licin dan nukleus oosit yang sekata. Jika digambarkan ciri-ciri tersebut dalam
bentuk rajah, ianya mirip kajian oleh Alvarez et al. (2009) (Rajah 2.2).

11

Rajah 2.2 Contoh pengkelasan kompleks kumulus-oosit pra-matang berdasarkan

kriteria morfologi iaitu lapisan sel kumulus.
A1 oosit yang diselaputi oleh kumulus yang padat
A2 oosit diselaputi oleh kumulus yang lut cahaya
B1 oosit yang diselaputi korona radiata
B2 oosit yang separa gondol
C oosit yang gondol
D oosit diselaputi kumulus legap
Sumber : Alvarez et al. 2009

Sehingga kini terdapat pelbagai pengkelasan yang digunakan dalam menilai

kualiti sesuatu COC menggunakan kaedah pemerhatian morfologi (Vassena et al.
2003; Alvarez et al. 2009; Khandoker et al. 2012). Namun apa yang dapat
diperhatikan di sini ialah sedikit sebanyak pengkelasan tersebut berdasarkan ciri yang
sebagaimana yang diringkaskan di dalam Jadual 2.1 dan 2.2. Jadual 2.2 menunjukkan
kaedah pengelasan yang lebih ringkas dari Hawk dan Wall pada tahun 1944
sebagaimana dilaporkan oleh Gordon (2003). Pengkelasan ini diaplikasikan berikutan
bilangan oosit yang perlu diproses terlalu banyak iaitu seribu oosit sehari. Pengkelasan
ini bertujuan mengelakkan jangkamasa pemilihan yang terlalu lama yang dikhuatiri
menggangu proses pematangan dan seterusnya menurunkan potensi atau kualiti sel
tersebut untuk disenyawakan.

12

Jadual 2.1 Kriteria yang digunakan untuk menilai kualiti oosit

Kriteria
1

Ciri

Kumulus padat dan berlapis-lapis; ooplasma homogen; keseluruhan

COC cerah dan lut sinar

Kumulus padat dan berlapis; ooplasma homogen tetapi kelihatan

kasar dan zon gelap pada keliling oosit; keseluruhan COC gelap
sedikit dan kurang lut sinar

Kumulus kurang padat; ooplasma tidak sekata dengan gugusan gelap;

keseluruhan COC gelap berbanding kriteria 1 dan 2

Kumulus mengembang; sel kumulus berserakan di dalam gumpalan

gelap; ooplasma tidak sekata dengan gugusan gelap; keseluruhan
COC gelap dan tidak sekata

Kriteria yang Ooplasma kelihatan homogen dan sel kumulus padat dan melekat
dipilih

kuat pada zona pelusida

Kriteria yang Kategori lain dengan kumulus tidak lengkap dan ooplasma heterogen
tidak dipilih

Sumber : Diolah daripada Gordon 2003

13

Jadual 2.2 Kriteria Beltsville dalam pemilihan oosit bovin

Jenis oosit
Kualiti baik

Ciri kumulus

Ciri ooplasma

Padat dengan kumulus penuh atau Sekata, padat, bergranul

terdapat beberapa lapisan sel kumulus. halus
Granulosa melekat pada kumulus dan
dibolehkan

sekiranya

sitoplasma

kelihatan jernih
Kualiti

Di antara ciri-cirinya termasuk: tebal, Julat

sederhana

kebiasaannya

dengan

terlekat,

tetapi

kelihatan

jernih;

di

granulosa padat,

sitoplasma

antara
bergranul

tidak kepada

kumulus

granul

sekata,
halus
bersaiz

padat, sederhana

lapisan sedikit kepada beberapa lapisan

melitupi

sepenuhnya

atau

hampir

separuh zona pelusida

Kualiti yang Di antara ciri-cirinya termasuk: sebaran Granul
ditolak

kasar

kumulus berkembang sepenuhnya atau bercampur

separuh;

tiada

sel

kumulus

atau
dengan

pada kawasan yang sangat cerah

kerangka bukan selular; pengecualian dan gelap; sitoplasma tidak

oosit kecil atau besar; kumulus tidak berwarna

(perang

cerah

berwarna (hitam atau perang cerah); atau hitam); oosit yang

korona radiata dengan tiada kumulus; tidak
oosit bertelanjang

terbentuk

dengan

baik

Sumber : Diolah daripada Gordon 2003

Namun begitu, kajian yang meneliti perkembangan pematangan oosit lembu

pula mendapati COC menunjukan tanda atresia peringkat awal berserta kumulus
berkembang

sedikit

dan

sitoplasma

sedikit

bergranul

mempunyai

potensi

perkembangan lebih tinggi berbanding COC di bawah kategori berkualiti baik

(Blondin & Sirard 1995; De Wit & Kruip 2001; Bilodeau-Goeseels & Panich 2002).
Begitu juga dengan peratusan pembentukan peringkat blastosis yang tinggi dengan

14

peningkatan atresia pada folikel kecuali folikel yang mengalami atresia yang sangat
ketara (De Wit et al. 2000).

Apa yang dapat disimpulkan di sini ialah penilaian kualiti oosit berdasarkan
pemerhatian morfologi boleh berubah-ubah mengikut individu yang menilai serta
prosedur makmal yang digunakan. Selain itu juga ianya bersifat subjektif (Bukowska
et al. 2012), kurang sensitif (Blondin & Sirard 1995; De Wit & Kruip 2001; BilodeauGoeseels & Panich 2002), memerlukan masa yang panjang serta ia mampu membuka
ruang kepada penilaian yang bersifat berat sebelah yang kemudiannya memberi impak
pada penghasilan embrio yang tidak diketahui kualitinya. Oleh yang demikian, suatu
kaedah berdasarkan penilaian yang bersifat objektif serta lebih konsisten diperlukan
dalam mengatasi kelemahan kaedah penilaian kualiti oosit yang sedia ada.

2.4.2 Pewarnaan

Salah satu kaedah yang kerap digunakan dalam penentuan kualiti sesuatu COC ialah
kaedah pewarnaan dalam mengidentifikasikan apoptotik COC. Ini adalah kerana
melalui pewarnaan tertentu, COC yang mengalami apoptosis dapat dikenalpasti dan
seterusnya diasingkan daripada menjalani proses yang seterusnya dalam penghasilan
embrio. Proses apoptosis merujuk kepada proses kematian sel tertentu yang telah
terprogram (programmed cell death) yang memerlukan tenaga serta membolehkan sel
tertentu dimusnahkan tanpa tindakan yang provokatif (Kerr et al. 1972).

Terdapat pelbagai aspek kajian dalam mengenalpasti sel yang mengalami

apoptosis dengan lebih terperinci dan kemudiannya dapat menentukan sama ada sel
tersebut berada pada peringkat apoptosis awal atau lewat (Huerta et al. 2007). Di
antara perubahan yang berlaku sepanjang peringkat apoptosis awal atau lewat ialah
seperti pemecahan nukleus, kehilangan simetri membran plasma akibat degradasi
membran serta penghidratan sel yang ketara (Rajah 2.3).

15

Rajah 2.3 Fasa perubahan peringkat apoptosis awal hingga lewat

Sumber : Diolah daripada Huerta et al. 2007

Selain daripada aspek perubahan yang berlaku mengikut peringkat apoptosis,

aspek pengenalpastian mengikut bahagian sel yang mengalami perubahan akibat
proses apoptosis turut mendapat perhatian. Perubahan seperti pemecahan pada
bahagian nukleus, pengaktifan sisteinil aspartat-spesifik protease (caspase) di dalam
sitosol, pembebasan sitokrom C oleh mitokondria dan juga traslokasi fosfadil serina
(PS)

pada membran sel turut dikaji dalam mengenalpasti sel yang mengalami

apotosis.

Rajah 2.4 menyenaraikan kajian yang dikenalpasti mampu mengesan

perubahan yang berlaku pada bahagian tertentu sel yang mengalami apoptosis.

Berdasarkan perubahan-perubahan yang berlaku akibat proses ini, maka

muncul kajian yang menggunakan pewarnaan tertentu dalam mengesan perubahan
tersebut. Di antara kaedah pewarnaan yang digunakan secara meluas dalam
pengenalpastian sel yang mengalami apoptosis ialah TUNEL, Hoechst, propidium
iodida (PI) dan juga Annexin-V floroisothiosianida (FITC).

16

Rajah 2.4 Kajian apoptosis mengikut perubahan yang berlaku pada bahagian-bahagian
sel tertentu.
Sumber : Diolah dari Huerta et al. 2007

Pewarnaan

TUNEL

merupakan

pewarnaan

yang

mampu

mengesan

fragmentasi DNA yang dikatakan berlaku pada peringkat akhir apoptosis (Li &
Darzynkiewicz 2008). Kaedah pewarnaan ini memerlukan sel difiksasi, diwarnakan,
didehidrasi, dibenamkan dan dipotong kepada lapisan yang halus menggunakan
ultramikrotom yang kemudianya diwarnakan sekali lagi sebelum diperhatikan di
bawah mikroskop elektron mahupun berpendaflor (Yuan et al. 2005). Keterbatasan
kaedah ini untuk diaplikasi dalam bilangan sampel yang banyak (Huerta et al. 2007),
keberkesanan dalam menentukan sama ada sel mengalami apoptosis atau nekrosis
(Kraupp et al. 1995; Kelly et al. 2003) serta kesan toksik akibat proses fiksasi
menggunakan formalin dan proses pengendalian sampelnya mengakibatkan keputusan
pewarnaan ini dipertikaikan.

Namun begitu, kaedah pewarnaan ini kerap dilakukan dengan kombinasi

pewarnaan lain seperti Hoechst dan PI bagi tujuan pengesahan (Yuan et al. 2005; Li et
al. 2009). Selain daripada itu, kelemahan proses pewarnaan ini yang memerlukan
kaedah penyediaan slaid, tidak membolehkan sel yang hidup terus bermandiri

17

menyebabkan pewarnaan ini tidak sesuai digunakan di dalam pemilihan COC yang
berkualiti untuk disenyawakan bagi membentuk embrio.

Begitu

juga

dengan

pewarnaan

Hoechst

yang merupakan

pewarna

berpendaflour yang berperanan dalam menggambarkan perubahan yang berlaku pada

nukleus sewaktu proses apoptosis. Ia juga dikenali sebagai penanda DNA (DNA
marker) yang mampu menyerap masuk ke dalam sel hidup menjadikan kodensasi
kromatin diperlihatkan di bawah mikroskop berpendaflor (Huerta et al. 2007).
Sebagaimana keterbatasan pewarnaan TUNEL, pewarnaan ini juga kurang sesuai bagi
jumlah sampel yang banyak serta ia hanya mampu mengenalpasti apoptosis pada satu
peringkat sahaja berikutan pewarnaannya melalui proses penyediaan slaid. Selain itu
juga, kebolehan pewarnaan ini menembusi sel hidup yang tidak mengalami apoptosis
juga dikatakan mampu menganggu kemandirian sel tersebut. Oleh yang demikian,
pewarnaan ini dirasakan kurang bersesuaian bagi menggantikan kaedah penilaian
kualiti COC yang berdasarkan pemerhatian morfologi.
.

Di antara kajian terkini yang mengenalpasti sel yang mengalami apoptosis di

dalam penyaringan COC yang berkualiti menggunakan kaedah pewarnaan ialah
Anguita et al. (2007, 2009) dan Li et al. (2009). Kajian ini mengenalpasti COC dan
juga oosit yang mengalami apoptosis menggunakan pewarnaan Annexin-V dengan
gabungan pewarnaan PI. Berdasarkan teori, gabungan kedua-dua pewarnaan ini
mampu mengenalpasti sel yang mengalami apoptosis peringkat awal mahupun lewat
dan ianya telah bermula seawal tahun 1990-an bagi sel bernukleus yang lain
(Koopman et al. 1994; Martin et al. 1995).

Berbeza

dengan

pewarnaan

TUNEL

dan

Hoechst,

pewarnaan

ini

mengenalpasti apoptosis melalui perubahan pada membran plasma sel yang hilang
sifat simetrinya. Sebagaimana yang diterangkan di bahagian 2.3.1, degenerasi
membran akan berlaku sewaktu proses apoptosis yang kemudianya mengakibatkan
translokasi fosfatidil serina (PS) ke bahagian luar membran plasma yang
membenarkan pengikatan di antara PS dengan Annexin-V (Niu & Chen 2010).
Annexin-V yang berlabel pendaflor (FITC) kemudiannya mampu mengasingkan sel

18

yang mengalami apoptosis menggunakan mikroskop berpendaflor dan juga sitometri

aliran (Kenis et al. 2004).

Ini bermakna, pewarnaan ini hanya mampu mengikat pada sel yang mengalami
apoptosis sahaja dan di anggap tidak menggangu sel hidup yang tidak
mengekspresikan PS (van Engeland et al. 1998). Namun demikian, sehingga kini
pengaplikasian pewarnaan ini dalam mengenalpasti kualiti COC dan oosit hanya
dilakukan menggunakan kaedah penyedian slaid (Anguita et al. 2009; Li et al. 2009).
Oleh yang demikian, ekplorasi terhadap penggunaan pewarnaan ini dalam
menentukan kualiti COC sebelum menjalani proses pematangan, persenyawaan bagi
menghasilkan embrio yang berkualiti mampu memberi alternatif kepada kaedah
penilaian yang sedia ada terutamanya kaedah pemerhatian morfologi.

2.5

PEMATANGAN OOSIT (IVM)

2.5.1 Perubahan Biokimia dan Fisiologi

McGaughey (1983) mendefinasikan pematangan oosit mamalia sebagai proses

pembentukan jasad kutub kedua yang bermula dari peringkat vesikel germinal
sehingga proses pembahagian meosis II berakhir. Namun begitu, proses ini turut
melibatkan beberapa perubahan pada komponen COC yang lain. Sebagai contoh, di
dalam organisasi sitoplasmanya, perubahan yang berlaku termasuklah penyusunan
granul korteks di sepanjang oolema, penyusunan semula mitokondria, pengurangan
pada kompartmen Golgi dan perkembangan berterusan di dalam penyimpanan lipid
(Gordon 2003). Penyimpanan lipid yang berlaku dikatakan perlu sebagai sumber
tenaga bagi menyokong proses pematangan oosit itu sendiri dan juga bagi
perkembagan awal embrio (Kim et al. 2001).

Selain itu, proses pematangan turut menyaksikan berlakunya perubahan pada

nukleus oosit yang bermula dengan penguraian vesikel germinal yang dikenali sebagai
germinal vesicle breakdown (GVBD) (Yoshida & Mizuno 2012). Penghuraian ini
dikatakan memerlukan sintesis protein yang kemudiannya turut berperanan dalam

19

melengkapkan proses pematangan meiosis, penyahkentalan kepala-sperma serta

pembentukan pronukleus jantan (Liu et al. 1998). GVBD boleh dicirikan dengan
penumpatan kromatin secara beransur-ansur, kelenyapan nukleolus padat dan
penyepaian membran nukleus (Rajah 2.5).

Rajah 2.5 A. Germinal vesikel di dalam oosit primer dan B. Oosit bovin pada
peringkat GVBD.
Sumber : Gordon 2003

Perubahan ketiga yang dapat diperhatikan semasa proses pematangan ialah

pembentukan jasad berkutub (polar body) pertama semasa pembahagian meiosis yang
pertama. Setelah terbentuknya jasad ini, oosit tersebut diistilahkan sebagai oosit
sekunder yang kemudianya akan memulakan pembahagian meiosis fasa kedua
sehingga mecapai peringkat metafasa II (MII) (Naruse et al. 2012). Namun, proses
pembahagian ini tidak akan lengkap sehinggalah berlakunya persenyawaan oleh
sperma atau oosit tersebut bertindak balas terhadap rangsangan untuk mengaktifkan
proses berikutnya. Penonjolan jasad kutub yang kedua akan kelihatan sebaik sahaja
proses pembahagian meiosis yang kedua lengkap.

Terdapat beberapa kajian yang menggunakan peringkat pematangan nukleus

oosit sebagai kayu pengukur keberkesanan proses IVM dan juga sebagai

ujian

saringan toksikologi (van Woudenberg et al. 2012). Rajah 2.6 menunjukan tiga
peringkat pematangan nuklear yang utama dengan menggunakan pewarnaan 4,6diamino-2-phenylindole atau dikenali sebagai DAPI. Pewarnaan ini membolehkan

20

peringkat germinal vesikel ditentukan dengan terdapatnya kromatin yang tersebar atau
sedikit padat (Rajah 2.6 A). Manakala bagi peringkat metafasa I pula, pengenalpastian
ditentukan dengan terdapatnya kromatin yang bergumpal serta padat dengan jelas
(Rajah 2.6 B). Peringkat metafasa II pula menunjukan sama ada terdapatnya plat
metafasa (Rajah 2.6 C1) atau plat metafasa berserta jasad kutub (Rajab 2.6 C2).

Rajah 2.6 Peringkat pematangan nukleus menggunakan pewarnaan DAPI. A.

Germinal vesikel; B. Metafasa I ; C1 dan C2 Metafasa II.
Sumber : van Woudenberg et al. 2012

Pada peringkat akhir proses IVM pula, sel granulosa akan mula berhenti
mensintesis estradiol yang kemudiannya menyaksikan peningkatan pada aras
progesteron dan juga pengembangan sel kumulus yang ketara. Rajah 2.7 menunjukan
keadaan sel kumulus sebelum proses pematangan (Rajah 2.7 A) dan perubahan yang
berlaku pada sel kumulus selepas menjalani proses tersebut (Rajah 2.7 B).

21

Rajah 2.7 Sebelum dan selepas pematangan in vitro oosit lembu. (A) Sebelum
pematangan (B) Pengembangan kumulus selepas 24 jam pematangan in
vitro pada pembesaran 100X.
Sumber : Gordon 2003

2.5.2 Faktor yang Mempengaruhi IVM

Proses IVM merupakan langkah pertama dan juga yang paling genting dalam
memastikan kejayaan dalam penghasilan embrio secara in vitro. Secara umumnya
terdapat dua faktor yang utama iaitu faktor sampel (ovari dan oosit) yang diperolehi
dan juga faktor persekitaran yang bersesuaian dengan proses in secara in vivo (Hegab
et al. 2009). Di antara faktor-faktor yang melibatkan sampel ialah jangkamasa dan
suhu semasa persampelan dari tempat penyembelihan ke makmal, saiz folikel (Picton
et al. 2008), diameter oosit dan peringkat perkembangan oosit.

Terdapat banyak faktor yang dirangkumi di bawah faktor persekitaran di

antaranya ialah komposisi media IVM, prosedur IVM itu sendiri serta keperluan lain
yang perlu mirip seperti persekitaran proses pematangan in vivo. Bagi komposisi di
dalam media IVM, bahan tambahan di dalam media tersebut seperti serum, hormon
dan beberapa faktor aktif

dikatakan mampu meningkatkan kualiti oosit matang

(Brackett & Zuelke 1993). Kajian oleh Hsieh dan rakan-rakan (2009) menunjukan
faktor pertumbuhan mirip faktor pertumbuhan epidermal (EGF-like growth factor)
bertumpuk di dalam folikel semasa ovulasi berlaku dan merupakan perangsang yang
sangat berkesan bagi proses pematangan oosit dan pengembangan kumulus.

22

Selain daripada itu, jangkamasa IVM turut dikatakan boleh mengakibatkan

pembentukan kromatin yang abnormal, penuaan oosit serta gangguan pada
perkembangan oosit tersebut (Park et al. 2005).

2.6

PERSENYAWAAN IN VITRO (IVF)

Persenyawaan in vitro (IVF) merupakan proses kompleks yang menghasilkan

penyatuan di antara sperma dengan oosit bagi menghasilkan embrio di luar rahim
(Peippo et al. 2011). Proses yang dijalankan di makmal IVF bermula dengan
pemilihan dan pengkapasitanan sperma yang kemudiannya dieramkan bersama
dengan kompleks oosit kumulus matang di dalam media persenyawaan in vitro di
antara 18 hingga 20 jam (Machaty et al. 2012).

Semasa sela masa ini, sperma akan melepasi lapisan sel kumulus yang
mengelilingi oosit dan kemudiannya menambat pada zona pelusida sebelum
menembusi zona pelusida melalui tindakan akrosom. Sperma yang berjaya
mensenyawakan oosit tersebut kemudiannya mengikat dan bersatu dengan membran
plasma oosit dan diikuti dengan pengaktifan oosit dan pembentukan pronukleus jantan
dan betina (Schultz & Kopf 1995).

Setelah tempoh pengeraman IVF, sel kumulus akan disingkirkan daripada zona
dengan teliti sebelum zigot yang berpotensi untuk membentuk embrio dipindahkan ke
media pengkulturan (IVC). Ringkasan proses persenyawaan in vitro bermula daripada
pemilihan oosit, pematangan oosit, persediaan sperma dan berakhir dengan proses
persenyawaan diringkaskan di dalam Rajah 2.8.

Terdapat beberapa kajian yang telah dijalankan bagi menentukan faktor yang
mempengaruhi kejayaan dalam persenyawaan in vitro (Ktska-Ksikiewicz et al.
2009; Plourde et al. 2012). Di antara faktor yang kerap dikaji ialah penambahan
sesuatu bahan atau nutrien ke atas media IVF (Mendes et al. 2003), faktor sperma (Lu
& Seidel 2004) dan yang paling utama ialah faktor oosit (Ktska-Ksikiewicz et al.
2007; Catal et al. 2012). Proses pertama yang mempengaruhi kualiti oosit yang

23

dipilih untuk disenyawakan ialah sewaktu pemilihan COC untuk dimatangkan

sebagaimana yang telah dibincangkan sebelum ini di bahagian 2.4. Namun, sehingga
kini proses penting dalam memastikan kualiti oosit yang dipilih masih bergantung
kepada pemerhatian morfologi yang bersifat subjektif (Bukowska et al. 2012) dan
pemilihannya dipertikaikan (Ktska-Ksikiewicz et al. 2007). Oleh yang demikian
suatu kaedah alternatif perlu dikaji bagi mengatasi permasalahan ini.

Oosit folikular
Oosit
peringkat
germinal
vesikel
(GV)

Penyahbekuan sperma
Pencucian dengan larutan
Percol (500 g dalam 10 min)

Kultur 28 jam pada 39 0C

Di dalam CO2 inkubator
Pelet sperma
Pre-inkubasi selama 6-8 jam pada 39 0C
dalam CO2 inkubator (3 juta per ml)
Oosit matang (10-15)

Pengkapasitan sperma

Permanian (10 juta sperma per ml)

Rajah 2.8 Sistem persenyawaan in vitro (IVF) lembu

Sumber : Diolah daripada Gordon 2003

24

2.7

PENGKULTURAN IN VITRO (IVC)

Semasa pengkulturan embrio, oosit yang telah disenyawakan akan dieramkan sebelum
membentuk belahan pertama seawal 20 jam selepas disenyawakan (Gordon 1994).
Salah satu kaedah yang digunakan dalam mengukur keberkesanan sesuatu proses
penghasilan embrio secara in vitro ialah melalui pengukuran kadar belahan (cleavage)
(Hansen 2006). Kadar belahan ini yang kebiasaanya mengikut prosedur penilaian
piawaian ialah dengan mengambil peratusan oosit yang menunjukan belahan setelah
diinseminasi selama dua hari (Gordon 1994).

Rajah 2.9 menunjukan peringkat perkembangan embrio bovin di dalam masa

enam hari. Embrio bovin boleh mencapai peringkat dua-sel selepas hampir 30 jam
disenyawakan (Rajah 2.9 A) sebelum membentuk empat-sel (Rajah 2.9 B), lapan-sel
(Rajah 2.9 C), 16-sel (Rajah 2.9 D) dan peringkat 16-32-sel (Rajah 2.9 E) di dalam
masa empat hari. Pada hari kelima, pembentukan morula awal yang padat (Rajah 2.9
F) dijangkakan akan berlaku diikuti peringkat akhir morula (Rajah 2.9 G) pada hari
keenam.

25

Rajah 2.9 Peringkat dalam perkembangan embrio bovin

Sumber : Lu et al. 1999

Pelbagai kajian telah banyak dijalankan dalam membuktikan keberkesanan

dalam penghasilan embrio yang membawa kepada penghasilan cecair sintetik
oviduktus (SOF). Media ini yang asalnya berdasarkan analisis biokimia cecair
oviduktus kambing (Tervit et al. 1972) yang kini ia merupakan salah satu media yang
digunakan secara meluas bagi pengkulturan embrio dengan pelbagai pengubahsuaian
seperti penambahan asid amino. Ini adalah berikutan, kebanyakan sistem pengkulturan
menggunakan serum dan bahan ko-kultur ini telah dikenalpasti sebagai sebahagian
penyebab kepada berlakunya off spring syndrome (Young et al. 1998) yang dicirikan
dengan peningkatan berat kelahiran serta malformasi kongenital.

Di samping itu, beberapa kajian yang telah dijalankan mendapati penggunakan

SOF bagi mengantikan sistem pengkulturan yang mengunakan serum dan bahan ko-

26

kultur telah berjaya mengatasi masalah sindrom tersebut di dalam penghasilan embrio
lembu dan kambing (Young et al. 1998; Van Wagtendonk-de Leeuw et al. 2000).
Namun begitu, sebahagian kajian pula melaporkan penggunaan serum yang terhad
sama ada dengan kehadiran atau ketiadaan bahan ko-kultur tidak menunjukan kesan
yang signifikan terhadap peningkatan berat kelahiran dan juga jangkamasa gestasi
yang merupakan ciri off spring syndrome (Hasler 2000).

Kajian oleh Iwata (1998) pula mendapati pencegahan daripada berlakunya

kerosakan akibat oksidasi mampu meningkatkan perkembangan awal embrio.
Pencegahan ini dapat dilakukan dengan mengekalkan fisiologi tekanan oksigen iaitu
di antara lima hingga lapan peratus dan ditambahkan dengan kepekatan glukos yang
rendah.

2.8

ANNEXIN-V

Pada peringkat awal penemuan Annexin-V, ianya diekstrak daripada plasenta manusia
yang kemudianya dipanggil protein plasenta 4 (PP4) (Inaba et al. 1984). Manakala
dalam kajian lain pula, ianya diidentifikasi sebagai protein vaskular yang mempunyai
sifat antigumpal yang tinggi (Reutelingsperger et al. 1985). Namun setelah dijalankan
proses pengklonan dan penjujukan didapati protein ini homologi dengan keluarga
protein annexin (Maurer-Fogy et al. 1988).

Kajian pertama yang menerangkan kaedah penggunaan Annexin-V berlabel

untuk mengesan apoptosis telah dijalankan oleh Koopman et al. (1994). Di dalam
kajian ini sel limfoma Burkitt yang didedahkan dengan keadaan apoptosis
menunjukan pewarnaan Annexin-V FITC yang positif manakala sel yang normal
didapati negatif daripada pewarnaan yang sama.

Mekanisme bagaimana Annexin-V membantu dalam mengesan sel yang

mengalami apoptosis adalah dengan mensasarkan kepada fosfolipid yang kehilangan
asimetrinya pada membran plasma. Di dalam peringkat awal apoptosis, membran

27

plasma yang kehilangan asimetri menyebabkan fosfatidil serina (PS) terdedah ke

bahagian ekstraselular (Huerta et al. 2007).

Annexin-V berlabel yang mempunyai afiniti yang tinggi dan spesifik terhadap
PS membolehkan pengikatan di antara kedua-dua protein ini dikesan menggunakan
sama ada sitometri aliran mahupun mikroskop berpendaflor (van Engeland et al. 1998;
Niu & Chen 2010). Rajah 2.10, menunjukan pengikatan Annexin-V berlabel
floroisothiosianida (FITC) pada PS yang terdedah di bahagian luar membran plasma
sel yang mengalami apotosis dengan kehadiran ion kalsium.

Di peringkat akhir apoptosis ataupun nekrosis sekunder, degradasi membran

akibat tindakan enzim pada peringkat tersebut mengakibatkan pewarnaan propidium
iodida (PI) dapat menembusi membran plasma sel tersebut (Cevik & Dalkara 2003).
Tindakan ini kemudiannya membolehkan pewarna PI yang terdapat pada pewarnaan
annexin menambat pada DNA sel yang mengalami peringkat apoptosis akhir. Hasil
pengikatan ini kebiasaanya dilihat sebagai imej jingga kemerahan di bawah mikroskop
berpendaflour (Kroemer et al. 1998).

28

Rajah 2.10 Skema fenomena pengikatan asai annexin di peringkat awal dan akhir
apoptosis.
Sumber : Diolah daripada University of Dundee 2012

BAB III

BAHAN DAN KAEDAH

3.1

BAHAN-BAHAN KIMIA

Media kultur tisu-199 Earls Salts, serum albumin bovin (BSA) EFAF, penimbal
fosfat saline (PBS) Dulbecco, larutan penicillin-streptomycin, sodium pyruvate,
Gentamicin sulfat, -estradiol, serum fetal bovin, minayak mineral, faktor
pertumbuhan epidermal (EGF), hormon penggalak folikel (FSH), hormon luteinizing
(LH),

Annexin-V FITC dan PI, sodium klorida, potassium klorida, Magnesium

klorida hexahidrate, sodium bikarbonat, kalsium klorida dehidrate, Hypotaurin, DPenicillamine, epinephrin, asid laktik (garam sodium), sodium metabisulphite,
potassium dihidrogen fosfat, L-Glutamine, asid amino BME, asid amino MEM, MyoInositol dan fenol merah (Sigma-Aldrich, Germany).

3.2

INSTRUMEN

3.2.1 Mikroskop Pendaflour

Konsep mikroskop pendafluor adalah berasaskan sesuatu bahan memancarkan tenaga

yang dapat dikesan sebagai cahaya pendafluor apabila diujakan pada panjang
gelombang tertentu. Sampel bahan tersebut boleh samada berpendaflour secara
semulajadi seperti klorofil atau perlu ditambahkan dengan bahan kimia yang
berpendaflour seperti propodium iodida (PI) sebelum dianalisa. Di dalam kajian ini,
sampel bahan yang diperhatikan ialah kompleks kumulus-oosit yang mana ianya
dicampurkan dengan pewarna berpendaflor iaitu pendafluor isotiosianat (FITC) yang
mempunyai panjang gelombang pengujaan pada 490 nm dan pemancaran pada 525

30

nm (Pusat Perkembangan Biologi, Universiti California (UCI DBC) 2011). Bahan

kajian juga dicampurkan dengan pewarna berpendaflour propidium iodida (PI) yang
teruja pada panjang gelombang 536 nm dan menampakkan cahaya berpendafluor pada
617 nm (UCI DBC 2011) apabila diperhatikan di bawah mikroskop pendafluor.

3.3

MEDIA

3.3.1 Persampelan

Media yang digunakan untuk mengangkut ovari daripada rumah penyembelihan

disediakan dengan menambahkan 1 ml larutan penicillin dan streptomycin dalam
setiap 100 ml penimbal fosfat. Media ini kemudiannya dipindahkan ke dalam kelalang
thermos dan dihangatkan sehingga 39 0C menggunakan kaedah rendaman air.

3.3.2 Aspirasi

Media aspirasi yang digunakan bagi mendapatkan sampel oosit daripada ovari
disediakan dengan membiarkan 0.2 g serum albumin bovin melarut di dalam setiap 50
ml media penimbal Dulbecco fosfat. Setelah itu, pH media diselaraskan di antara pH
7.3 sehingga 7.35 dan ditapis ke dalam tiub konikal 15 ml menggunakan penuras
Millipore bersaiz 0.22 M. Tiub konikal dipastikan tertutup rapat dan disimpan di
dalam peti sejuk. Media kemudianya dihangatkan sehingga 39 0C sejam sebelum
prosedur aspirasi dijalankan.

3.3.3 Media Pencuci

Penyediaan media pencuci turut disediakan di bawah aliran laminar bagi mengelakkan
kontaminasi. Media ini disediakan dengan membiarkan 4 mg/ml serum albumin bovin
melarut kepada media kultur tisu (TCM 199). Setelah itu, larutan tersebut diselaraskan
nilai pH nya di antara 7.30 hingga 7.35, ditapis ke dalam tiub konikal 15 ml
menggunakan penuras Millipore 0.22 M dan disimpan di dalam inkubator
berkelembapan tinggi dengan 5% kosentrasi gas karbon dioksida.

31

3.3.4 Pematangan In Vitro

Penyediaan media bagi pematangan oosit secara in vitro sentiasa dijalankan di bawah
kebuk aliran laminar bagi mengelakkan kontaminasi. Media pematangan in vitro, 10
ml disediakan dengan menambahkan 1 ml serum, 9 ml media kultur tisu TCM-199
dan 10 L larutan penicillin streptomycin. Setelah itu, pH dan osmolariti campuran,
masing-masing diselaraskan di antara 7.3 hinggga 7.35 dan 275 hingga 285 mOsm/kg.
Kemudian campuran media dituras menggunakan penuras Millipore 0.22 m dan di
simpan di dalan tiub konikal 15 ml di dalam inkubator berkelembapan tinggi dengan
5% gas karbon dioksida (CO2) pada suhu 38 0C selama 24 jam.

3.3.5 Media Bracket dan Oliphant

Media Bracket dan Oliphant (BO) disediakan bagi menjalankan proses persenyawaan
in vitro. Media ini memerlukan penyediaan stok larutan A dan larutan B yang mana
stok ini boleh disimpan dalam jangkamasa 1 bulan. Penyediaan 250 ml larutan A
memerlukan 0.1546 g sodium klorida, 0.0987 g potasium klorida, 0.1085 g kalsium
klorida dihidrat, 0.042 g sodium dihidrogen fosfat dihidrat, 0.0349 g magnesium
klorida heksahidrat dan 50 L fenol merah bekepekatan 5 mg/ml. Bahan-bahan ini
kemudiannya dilarutkan ke dalam 250 ml air khusus bagi kultur tisu. Bagi penyediaan
larutan B pula 1.2937 g sodium bikarbonat dicampurkan dengan 20 L fenol merah
dan 100 ml air khusus bagi kultur tisu. Media BO yang digunakan sebagai asas dalam
penyediaan larutan pencuci sperma, pencair sperma dan pencuci oosit bagi prosedur
persenyawaan in vitro disediakan dengan mencampurkan 4.6 mg sodium piruvat, 33.3
L larutan antibiotik penisilin streptomicin dan 8 ml larutan B kepada 25.3 ml larutan
A. Larutan ini sebaiknya disediakan sekurang-kurangnya 3 jam sebelum menjalankan
prosedur persenyawaan in vitro.

32

3.3.6 Pencuci Sperma

Media pencuci sperma merupakan media yang digunakan untuk mencuci sperma yang
telah dikrioawetkan. Media ini disediakan dengan mengambil 20 ml media BO lalu
mencampurkannya dengan 20 L heparin. Sebelum media ini disimpan di dalam
inkubator berkelembapan tinggi dengan 5% CO2 pada suhu 38 0C, media ini terlebih
dahulu dituras menggunakan penuras 0.2 m ke dalam 15 ml tiub konikal.

3.3.7 Pencair Sperma

Satu tiub krioawetan sperma secara umumnya mengandungi 26x106 sperma yang
mana ianya perlu dicairkan kepada 1x106 sperma di dalam 100 L larutannya. Oleh
yang demikian penyedian larutan pencair sperma perlu disediakan dengan melarutkan
0.06 g albumin serum bovin di dalam 3 ml media BO media. Kemudian, media ini
dituras menggunakan penuras Millipore 0.2 m sebelum dicampurkan dengan 3 ml
media pencuci sperma dan 30 L kalsium ionofor bagi tujuan pengkapasitaan sperma.

3.3.8 Pencuci Oosit

Larutan pencuci oosit disediakan bertujuan mencuci oosit yang sudah menjalani 24
jam proses pematangan in vitro. Larutan ini disediakan dengan melarutkan 0.05 g
albumin serum bovin ke dalam 5 ml BO media. Setelah itu, larutan yang terhasil perlu
dituras menggunakan penuras Millipore bersaiz 0.2 m sebelum disimpan di dalam
inkubator bersuhu 38 0C pada kosentrasi 5% CO2.

3.3.9 Kultur CR1aa

Penyediaan media kultur CR1aa sebagaimana media lain yang diperlukan dalam
penghasilan embrio in vitro perlu sentiasa disediakan di bawah aliran lamina bagi
tujuan mengelakkan kontaminasi. Stok disediakan dengan menambahkan 0.6700 g
sodium klorida, 0.0232 g potasium klorida, 0.0552 g L-laktat, 0.2200g sodium
bikarbonat, 0.0040 g sodium piruvat dan 0.0152 g L-glutamin ke dalam 100 ml air

33

khusus bagi kultur tisu. Bagi penyedian media CR1aa yang lengkap untuk
perkembangan embrio, 10 ml stok media yang disediakan tadi perlu ditambahkan
dengan 0.03 g albumin serum bovin dan 10 L antibiotik penisilin streptomicin
sebelum ditambahkan dengan 200 L amino asid BME dan 100 L amino asid MEM
Campuran media ini kemudianya dituras menggunakan penuras 0.22 M ke dalam
tiub konikal berisipadu 15 ml sebelum disimpan di dalam inkubator bersuhu 38 0C
dengan 5% kosentrasi gas karbon dioksida.

3.4

PENYELIDIKAN KESELURUHAN

Bahagian ini membincangkan secara keseluruhan bagaimana kajian ini dilaksanakan

mengikut objektif kajian yang telah direncanakan. Berikut adalah ringkasan
pelaksanaanya.

Objektif 1 : Penentuan isyarat status apoptosis

COC yang terpilih

berdasarkan morfologi

Kawalan

Pewarnaan Annexin V
FITC & PI

Pemerhatian di bawah
mikroskop beza jelas fasa

Tiada isyarat
berpendaflour

Positif
(Kompleks sel
mengalami apoptosis)

Isyarat berpendaflour bagi status apoptosis COC ditetapkan.

Objektif 2

Negatif
(Kompleks sel yang
sihat)

34

Objektif 2 : Penentuan masa inkubasi

COC yang terpilih

berdasarkan morfologi

+ Pewarnaan Annexin
V FITC & PI

A
5 minit

B
15 minit

C
1440 minit

Pemerhatian di bawah mikroskop

berpendaflour

Perbandingan bilangan COC yang menunjukan isyarat berpendaflour di antara

kumpulan kajian dianalisa menggunakan ujian statistik khi kuasa dua.
Masa inkubasi optimum bagi penambatan pewarnaan Annexin-V ditetapkan.

Objektif 3

35

Objektif 3 : Kesan proses penyahwarnaan

COC yang terpilih

berdasarkan morfologi
+ Pewarnaan Annexin-V
FITC & PI

E
Tanpa penyahwarnaan

D
Dengan penyahwarnaan
(Dicuci sebanyak tiga kali)
Pematangan in vitro
(IVM) 24 jam

Analisa pengembangan sel kumulus

menggunakan perisian Imej J

Gred 1

Gred 2

Perbandingan bilangan COC yang berada dalam pengkelasan Gred 1 dan 2 di antara
kumpulan kajian, dianalisa menggunakan ujian statistik khi kuasa dua.
Keperluan proses penyahwarnaan dinilai.

Objektif 4

36

Objektif 4 : Kadar Belahan Embrio

COC yang terpilih

berdasarkan morfologi

Pewarnaan Annexin-V
FITC & PI
F
Kawalan

G
Positif
(Kompleks sel
yang apoptosis)

H
Negatif
(Kompleks sel yang
sihat)

Pematangan in vitro 24 jam

Sperma
Persenyawaan in vitro

Bilangan pembentukan embrio

(belahan)

Perbandingan bilangan belahan embrio di antara kumpulan kajian dan kawalan

dianalisa menggunakan ujian statistik khi kuasa dua.
Keberkesanan isolasi COC menggunakan pewarnaan Annexin-V dalam meningkatkan
kadar persenyawaan dinilai.

3.5

KAEDAH DI LAPANGAN

Sebaik sahaja disembelih dan bahagian abdomen lembu dibuka, organ ovari
hendaklah diambil dengan kadar segera. Organ tersebut dibersihkan dari lebihan tisutisu lain sebelum dimasukkan ke dalam kelalang termos yang berisi media
persampelan yang bersuhu 39 0C. Setelah itu, sampel perlu dihantar ke makmal
kurang daripada 3 jam daripada masa pengumpulan.

37

3.6

KAEDAH DI MAKMAL

Sebelum ovari diaspirasi bagi mendapatkan oosit, masa pemprosesan dan penyediaan
tempat aspirasi adalah penting bagi memastikan sel tersebut masih berfungsi secara
fisiologi. Proses aspirasi dimulakan dengan memindahkan ovari-ovari yang
dikumpulkan dari rumah penyembelihan ke dalam bikar yang berisi media
persampelan yang telah dihangatkan. Kemudian, ovari tersebut ditekan ke arah
dinding bikar bagi mengeluarkan darah yang terdapat di dalam salur darah ovari
tersebut dan dibilas sekurang-kurangnya tiga kali menggunakan media persampelan
sebelum di letakkan semula ke dalam bikar lain yang berisi media persampelan yang
baru.

Setelah itu, ovari tersebut akan dicuci menggunakan media persampelan buat
kali terakhir sebelum ditekan dan dikeringkan menggunakan kertas tisu yang steril.
Ovari yang telah siap dikeringkan, diletakkan ke dalam 90 mm piring petri yang
kemudiannya disiramkan 2 ml media aspirasi di atas ovari tersebut sebelum bahagian
permukaan ovari dihiris bagi membebaskan kompleks kumulus-oosit (COC) yang
terkandung di dalam folikel. Pada akhir proses hirisan, permukaan ovari yang dihiris
disiramkan media aspirasi bagi memastikan COC yang masih berada di dalam ovari
dibebaskan.

Sebelum memulakan isolasi kompleks kumulus-oosit di antara serpihan tisu

daripada langkah aspirasi tadi, piring petri tersebut perlu dipindahkan terlebih dahulu
di atas pentas pemanas. Setelah itu, dengan menggunakan stereomikroskop pada
pembesaran rendah, kompleks sel yang diperolehi di pindahkan ke dalam titisan media
pencuci menggunakan wiretrol. Pada masa yang sama, kompleks sel tersebut
diasingkan berdasarkan morfologinya. Hanya kompleks sel yang mempunyai ciri sel
kumulus yang padat serta ooplasma yang homogenus sahaja yang digunakan di dalam
kajian ini.

38

3.7

PEWARNAAN COC MENGGUNAKAN ASAI ANNEXIN

Pewarnaan kompleks kumulus-oosit (COC) menggunakan asai annexin dilakukan

sebaik sahaja proses aspirasi dan isolasi berdasarkan morfologi siap dijalankan. COC
ini kemudiannya ditambahkan dengan 100 L 1X penimbal penambat, 10 L
propidium iodida (PI) dan 5 L Annexin-V FITC. Masa inkubasi serta teknik
penyingkiran pewarna dilakukan secara berbeza serta berperingkat mengikut objektif
kajian seperti berikut.

3.7.1 Objektif 1 : Penentuan isyarat status apoptosis

Setelah proses pengeraman di antara COC dengan campuran bahan pewarnaan

annexin dilakukan, kompleks sel tersebut yang masih di dalam titisan media
pengeraman kemudiannya diletakan di bawah mikroskop beza jelas fasa. Kehadiran
imej atau isyarat pada kedua-dua fasa medan cerah (bright field) dengan fasa
bependaflour menunjukan isyarat positif. Isyarat negatif pula ditentukan apabila
kehadiran imej atau isyarat hanya pada fasa medan cerah sahaja.

3.7.2 Objektif 2 : Penentuan masa inkubasi

Sampel yang telah siap diisolasi berdasarkan morfologi sebagaimana disebut

dibahagian 3.5 dibahagikan kepada 3 kumpulan iaitu kumpulan A, B dan C. Setiap
sampel menjalani proses pewarnaan Annexin-V FITC dan PI pada suhu 38 0C dan
melalui proses penyingkiran pewarnaan namun setiap kumpulan memjalani
jangkamasa proses inkubasi yang berbeza di mana kumpulan A selama 5 minit,
kumpulan B 15 minit (Johannisson et al. 2009) dan kumpulan C selama 1440 minit
(24 jam) .

3.7.3 Objektif 3 : Kesan proses penyahwarnaan

Penentuan kesan pengikatan pewarnaan Annexin-V FITC dan PI terhadap proses

pematangan in vitro (IVM) dilakukankan bagi memastikan proses pewarnaan ini dapat

39

dioptimumkan bagi mengisolasi sel apoptosis tanpa merencat proses pematanganya.

Bagi menentukan kesan tersebut, COC yang siap diisolasi mengikut ciri morfologi
sebagaimana disebut di bahagian 3.5 dibahagikan kepada dua kumpulan (D dan E)
yang kemudiannya diwarnakan dengan asai annexin selama lima minit pada suhu
inkubasi 38 0C.

Setelah tempoh pengeraman, kumpulan D perlu melalui proses penyingkiran

pewarnaan dengan memindahkan kompleks sel di dalam kumpulan tersebut ke dalam
media IVM yang baru sebanyak tiga kali sebelum menjalani proses IVM. Pemindahan
kompleks sel ini dilakukan dengan menggunakan wiretrol bagi meminimumkan
pemindahan bahan pewarnaani annexin. Bagi kompleks sel di dalam kumpulan E
pula, selepas tempoh pengeraman, kompleks sel tersebut terus dipindahkan ke dalam
media IVM tanpa menjalani proses penyahwarnaan.
Bagi proses IVM, setiap 50 L media IVM, sebanyak tujuh hingga sepuluh
kompleks sel kumulus (COC) dapat ditempatkan di dalam titisan tersebut. Manakala
bagi 400 L media yang sama pula dapat menempatkan di antara 30 hingga 35 sel
kumulus kompleks. Setelah itu, kompleks sel tersebut dieramkan selama 24 jam di
dalam inkubator dengan paras 5% karbon dioksida pada suhu 38 0C.

Penentuan kadar pematangan sel oosit adalah penting bagi memastikan sel
tersebut benar-benar bersedia untuk disenyawakan. Kaedah yang digunakan bagi
menentukan kesan penyahwarnaan annexin terhadap kadar pematangan oosit di dalam
kajian ini ialah menggunakan kaedah pemerhatian pengembangan kumulus
menggunakan stereomikroskop. Kaedah ini adalah hasil pengubahsuaian kaedah
kajian oleh Hunter & Moor (1987) yang mana pengembangan kumulus dibahagikan
kepada dua kumpulan iaitu Gred 1 dan Gred 2. Imej pengembangan lapisan sel
kumulus yang perolehi kemudiannya dianalisa bagi mendapatkan purata ketebalan sel
kumulus menggunakan perisian ImageJ (Lampiran A).

Bagi gred 1, kriterianya ialah jasad kumulus mengembang sekurangkurangnya tiga kali ganda daripada diameter oosit dengan nilai ukuran di antara lebih

40

daripada 300 m sehingga 250 m. Manakala bagi pengembangan gred 2 pula ianya
merujuk kepada jasad kumulus berkembang kurang daripada dua kali ganda diameter
oosit iaitu dengan nilai ukuran kurang daripada 250 m.

3.7.4 Objektif 4 : Kadar Belahan Embrio

Sebelum kadar belahan embrio dapat ditentukan, proses persenyawaan in vitro (IVF)
perlu dijalankan terlebih dahulu. Bagi penyediaan sampel oosit, kompleks sel yang
diisolasi berdasarkan morfologi sebagaimana disebut dibahagian 3.5 di bahagikan
kepada dua kumpulan utama iaitu kawalan (Kumpulan F) dan kumpulan yang
dieramkan dengan pewarnaan annexin. Kompleks sel yang dieramkan dengan
pewarnaan ini kemudiannya dibahagikan pula kepada dua kumpulan berdasarkan
isyarat positif (Kumpulan G) dan negatif (Kumpulan H). Setelah itu, ketiga-tiga
kumpulan ini perlu menjalani proses pematangan sebagaimana disebut pada kaedah
3.6.3.

Sekurang-kurangnya sejam setengah sebelum prosedur IVF dilakukan, kaedah

pengasingan sperma menggunakan kaedah berenang dijalankan sebagai persediaan.
Bagi proses pengasingan sperma, satu hingga dua straw semen beku dicairkan di
dalam rendaman air bersuhu 37 0C selama 45 hingga 60 saat. Kemudian, hujung straw
tersebut dipotong menggunakan gunting yang telah disteril dan semen yang mencair
di letakkan ke dalam tiub klonikal yang mengandungi 6 ml cecair pencuci sperma.

Setelah itu campuran tersebut diempar selama 10 minit pada kelajuan 1800
rpm. Supernatan yang terhasil kemudiannya dibuang dan pelet yang terhasil pada
dasar tiub konikal ditambahkan semula dengan 6 ml pencuci sperma dan diempar pada
kelajuan yang sama selama 10 minit. Ini bagi memastikan media krioawetan
disingkirkan sepenuhnya.

Kemudian, pelet yang terhasil dipindahkan ke dasar tiub klonikal yang

mengandungi campuran 3 ml cecair pencuci sperma, 3 ml cecair pencair sperma dan
30 L kalsium inonofor. Apabila selesai, tiub yang mengandungi sperma itu tadi

41

diinkubasi pada suhu 38

C sekurang-kurangnya 15 minit sebelum proses

persenyawaan in vitro dijalankan dengan kedudukan tiub dicondongkan. Selepas 15

minit, 100 L campuran yang diambil dibahagian tengah tiub tersebut dipindahkan
membentuk titisan ke dalam piring petri yang diliputi minyak mineral. Sementara
menunggu oosit disediakan, piring petri yang mengandungi sperma tersebut
diletakkan di dalam inkubator bagi memastikan kemandirian sperma.

Semasa sampel semen diempar pada kali kedua, pada masa yang sama sel
oosit dari tiga kumpulan yang berbeza (F, G dan H) yang sudah lengkap menjalani
proses

pematangan

ditanggalkan

sebahagian

kumulusnya

secara

mekanikal

menggunakan mikropipet di dalam media pencuci oosit. Apabila kompleks sel

kumulus kelihatan dalam hanya tinggal dalam 2 hingga 3 lapisan, oosit kemudiannya
dipindahkan ke dalam titisan yang mengandungi sperma dan dibiarkan selama hampir
18 hingga 20 jam di dalam inkubator pada kepekatan CO2 5% pada suhu 38 0C.
Selepas di antara 18 hingga 20 jam proses persenyawaan dianggap berlaku,
lebih kurang 50 yang diandaikan zigot dipindahkan daripada media persenyawaan in
vitro ke dalam titisan media kultur bagi proses penggondolan. Zigot yang telah
digondolkan sepenuhnya secara mekanikal kemudiannya dipindahkan ke dalam cecair
CR1aa yang diletakkan di dalam piring 4 telaga dengan setiap telaga diletakkan 20
hingga 30 zigot. Setelah itu bagi setiap 48 jam yang berikutnya, larutan media kultur
in vitro diperbaharui dengan membuang sebahagian daripada media kultur di dalam
telaga tersebut dan kemudian ditambahkan dengan media kultur yang baru pada
isipadu yang sama. Proses pengiraan bilangan belahan embrio (Lampiran B) mula
diperhatikan selepas 72 jam proses inseminasi (hpi).

42

3.8

UJIAN STATISTIK

Bagi mencapai objektif kajian penentuan masa pengeraman minimum, kesan teknik
penyahwarnaan Annexin-V serta kadar persenyawaan in vitro di antara kumpulan
kajian dan kumpulan kawalan, ujian khi kuasa dua (Chi square) digunakan. Nilai yang
digunakan di dalam kajian ini adalah dalam bentuk peratusan (%). Nilai perbandingan
dianggap signifikan secara statistik apabila p<0.05.

BAB IV

HASIL

4.1

PENGENALAN

Bab ini menerangkan hasil keputusan yang diperolehi mengikut susunan objektif
kajian yang direncanakan.

Sebagaimana yang diterangkan dibahagian 2.4 kajian

perpustakaan, terdapat pelbagai pelaksanaan dalam pewarnaan Annexin-V terhadap

oosit lembu. Justeru, penyelarasan seperti imej isyarat positif dan negatif masa
pengeraman dan keperluan teknik penyahwarnaan perlu ditentukan terlebih dahulu.
Setelah itu, pengasingan oosit yang berkualiti dapat dilakukan dan seterusnya
kesannya terhadap kadar persenyawaan in vitro (IVF) dapat dinilai.

4.2

OBJEKTIF 1 : PENENTUAN STATUS

BERDASARKAN PEWARNAAN ANNEXIN-V

APOPTOSIS

COC

Di dalam kajian ini, pengasingan kompleks kumulus-oosit yang mengalami apoptosis

adalah berdasarkan penentuan imej yang terbentuk di bawah mikroskop beza jelas
fasa (phase contrast microscope). Imej ini kemudiannya dikategorikan sebagai isyarat
positif dan negatif hasil pengikatan pewarnaan asai annexin merupakan parameter
utama sebelum parameter lain dapat ditentukan.

Pada peringkat ini, penentuan sama ada kompleks kumulus-oosit (COC)

menunjukan isyarat positif atau negatif adalah dengan membandingkan imej di bawah
pencahayaan medan cerah (bright field) dengan pencahayaan berpendarfluor
(fluorescense) (Rajah 4.1). Rajah tersebut menunjukan dua COC yang dilihat di
bawah

mikroskop

menggunakan

penapis

pencahayaan

medan

cerah

yang

44

kemudiannya, tanpa menggerakkan kompleks sel tersebut, penapis mikroskop tersebut

ditukar ke medan pencahayaan berpendarfluor. Hasilnya, COC bertanda A2
merupakan COC A1 setelah diperhatikan di bawah medan pencahayaan berpendaflour
yang menghasilkan imej berwarna jingga kehijauan. COC bertanda B2 pula
merupakan COC B1 yang tidak menunjukan imej atau imej kelihatan legap apabila
diperhatikan di bawah medan pencahayaan berpendaflour.

A1

A2
B1

(a)

B2
(b)

Rajah 4.1 Contoh kompleks sel kumulus yang menjalani proses pewarnaan AnnexinV yang diperhatikan pada kontras fasa yang berbeza iaitu pencahayaan (a)
medan cerah dan (b) berpendarfluor.
Kehadiran imej COC di bawah pencahayaan medan cerah dan juga
pencahayaan berpendaflour (COC A1) diinterpretasikan sebagai isyarat positif
pewarnaan annexin. Bagi isyarat negatif pula disifatkan apabila kehadiran imej COC
di bawah medan pencahayaan cerah sahaja (COC B1) sebagaimana ditunjukan dalam
Rajah 4.1 (a) dan (b)

4.3

OBJEKTIF 2 : PENENTUAN MASA PENAMBATAN ANNEXIN-V

YANG OPTIMUM

Di dalam kajian ini, masa pengeraman merujuk kepada jangkamasa yang diperlukan
bagi Annexin-V mengikat pada fosfatidil serin (PS) yang terdapat pada permukaan
kompleks oosit-kumulus yang mengalami apoptosis. Parameter ini amat penting
dalam menentukan masa pengikatan atau pengeraman minimum di antara pewarna
asai annexin dengan kompleks yang mengalami apotosis. Ini bagi mengelakkan

45

berlakunya kerosakan atau penurunan kualiti sel yang diproses (kompleks oositkumulus) akibat pendedahan terlalu lama kepada persekitaran yang tidak sesuai bagi
perkembangan sesuatu sel.

Jadual 4.1 menunjukan hasil keputusan pewarnaan asai Annexin-V mengikut

masa pengeraman. Seawal lima minit sebanyak 38 daripada 82 COCs (46%)
menunjukan isyarat negatif manakala selebihnya menunjukan isyarat positif (44 =
54%). Namun apabila masa pengeraman ditambah kepada 15 minit, didapati peratusan
COC yang berisyarat negatif bertambah kepada 56%. Namun demikian, tiada
perhubungan yang signifikan apabila bilangan COCs yang dieram pada masa lima
minit dibandingkan dengan masa pengeraman 15 minit (=0.396, df=1) dengan
p=0.529.

Bagi masa pengeraman selama 1440 minit atau 24 jam iaitu dengan
membiarkan pewarnaan asai annexin di dalam media pematangan sewaktu proses
pematangan in vitro (IVM), tiada isyarat berpendaflour diperhatikan.

Jadual 4.1 Bilangan dan peratusan kompleks oosit-kumulus (COC) yang menunjukan
isyarat positif dan negatif oleh pewarnaan annexin mengikut masa
pengeraman.
Masa

Jumlah kompleks sel

Bil. kompleks sel kumulus (COC)

pengeraman

kumulus (COC)

berisyarat, n (%)

(min)

(n)
Positif

Negatif

82

44 (54)

38 (46)

15

82

48 (56)

36 (44)

1440

82

-*

* menunjukan tiada isyarat Annexin-V FITC

-*

46

4.4

OBJEKTIF 3 : KESAN TEKNIK PENYAHWARNAAN TERHADAP

PERNGEMBANGAN JASAD KUMULUS

Penentuan sama ada teknik penyahwarnaan Annexin-V berpendarfluor diperlukan

atau sebaliknya menyumbang kepada pengurangan masa yang diperlukan bagi
memproses kompleks oosit-kumulus (COC). Sebagaimana yang disebutkan di dalam
perkara 2.5, sebahagian COC diperolehi daripada ovari lembu yang disembelih secara
biologinya sedang atau akan mengalami atresia.

Oleh itu, dalam jangkamasa yang singkat, COC ini perlu dipindahkan ke
dalam media yang sesuai bagi proses pematangannya. Keperluan dalam teknik
penyahwarnaan pewarnaan annexin mampu menambah sehingga 20 minit kepada
jumlah masa yang diperlukan bagi memproses COC dan seterusnya mampu
menyumbang kepada kemerosotan kualiti COC.

Penilaian oosit yang matang di dalam kajian ini adalah berdasarkan

pengembangan sel kumulus mengikut modifikasi skema Hunter dan Moor 1987.
Rajah 4.2 menunjukan contoh klasifikasi oosit Gred 1 dan 2 yang matang berdasarkan
penganalisaan menggunakan perisian ImageJ (Lampiran A).

(a)

(b)

Rajah 4.2 Pengkelasan pengembangan sel kumulus a) Gred 1 dan b) Gred 2.

47

Jadual 4.2 merupakan ringkasan daripada hasil pemerhatian sebagaimana rajah

4.2. Sebanyak 48 COC telah menjalani proses penyahwarnaan Annexin V manakala
64 COC telah menjalani proses persenyawaan tanpa melalui proses penyahwarnaan
annexin. Hasilnya didapati tiada kesan yang signifikan (=0.013, df=1 dan p=0.908)
apabila COC yang menunjukan pengembangan sel kumulus gred 1 dan 2 di antara
kumpulan di mana pewarnaan annexin dibiarkan kekal sepanjang proses pematangan
dibandingkan dengan COC yang melalui proses penyahwarnaan. Bilangan COC yang
menunjukan pengembangan lapisan sel kumulus gred 1 dan 2 bagi kedua-dua
kumpulan kajian adalah seperti ditunjukan dalam jadual 4.2.

Jadual 4.2 Pengkelasan kompleks oosit-kumulus berdasarkan pengembangan sel

kumulus di antara kumpulan yang menjalani dengan yang tidak menjalani
proses penyahwarnaan.
Proses

Jumlah COC

Penyahwarnaan

(n)

Gred 1

Gred 2

Ada

48

32 (67)

16 (33)

Tiada

64

42 (66)

22 (34)

4.5

Bil. COC, n (%)

OBJEKTIF 4 : PERBANDINGAN PERATUSAN BELAHAN EMBRIO

Parameter peratusan terbentuknya belahan embrio hasil proses persenyawaan in vitro

merupakan kayu pengukur yang penting sebelum membolehkan pewarnaan AnnexinV dijadikan sebagai penilai kualiti sesuatu kompleks oosit-kumulus (COC).

Sebagaimana diterangkan pada bahagian 3.3 (kaedah kajian) dan bahagian 4.2
(hasil kajian), COC yang menghasilkan isyarat positif hijau dikatakan mengalami
proses apoptosis awal manakala COC yang menunjukan isyarat positif jingga
dikatakan mengalami apoptosis lewat atau nekrosis sekunder dimana kedua-dua
isyarat positif ini dikatakan tidak sesuai untuk disenyawakan.

48

Hasil kajian ini mendapati terdapat perhubungan yang signifikan di antara

kadar belahan dengan COC yang menunjukan isyarat asai annexin positif dan negatif
serta COC yang dikatakan berkualiti tinggi daripada segi morfologinya (=14.603,
df=2 dan p<0.01).

Jadual 4.3 Kadar persenyawaan yang diwakili oleh kadar belahan bagi COC secara
morfologinya berkualiti tinggi dengan COC yang menunjukan isyarat
annexin positif dan negatif.

COC terpilih berdasarkan

Jumlah oosit

Kadar belahan,

morfologi :

(n)

n (%)*

Kawalan

68

45 (66)

Asai annexin : Negatif

81

64 (79)

Asai annexin : Positif

76

38 (50)

menunjukan terdapat perhubungan yang signifikan ( (2) = 14.603, p < 0.01)

BAB V

PERBINCANGAN

Bab ini membincangkan hasil kajian yang diperolehi melalui perbandingan dengan
kajian terdahulu sebelum dapat membuat kesimpulan dalam bab yang seterusnya.
Perbincangan ini disusun mengikut objektif khas yang direncanakan.

Berdasarkan objektif kajian yang pertama, kajian ini mendapati kompleks oosit
kumulus (COC) yang dieramkan dengan pewarna annexin mampu diasingkan kepada
dua kumpulan. Kumpulan pertama ialah COC yang tidak menunjukan isyarat
berpendaflour (tidak diwarnai). Ini dkenali sebagai kumpulan negatif. Kumpulan
kedua pula ialah COC yang menunjukan isyarat berpendaflour yang kebanyakannya
adalah campuran imej berwarna jingga kemerahan serta kehijauan. Ini pula
diklasifikasikan sebagai COC yang berisyarat positif.

Dalam kajian ini, imej kehijauan berpendaflour yang ditakrifkan sebagai

isyarat positif, dipercayai terbentuk berikutan penambatan di antara Annexin-V yang
bertanda FITC dengan fosfatidil serina (PS). Dalam keadaan normal, kedudukan PS
adalah di bahagian dalam membran sel. Namun, diperingkat awal apoptosis, hasil
pembebasan enzim tertentu akan mengakibatkan membran plasma kehilangan
simetrinya. Kehilangan simetri pada plasma membran mengakibatkan PS mengalami
translokasi ke bahagian permukaan luar sel. Kehadiran PS di permukaan luar sel
membenarkan pengikatanya bersama annexin dengan kehadiran ion kalsium.
Pemerhatian ini disokong oleh Huerta et al. (2007) yang menyenaraikan beberapa
kaedah yang boleh diguna pakai untuk mengenal pasti kehadiran proses apoptosis
termasuk asai annexin.

50

Isyarat yang menghasilkan imej jingga kemerahan di dalam kajian ini pula,
dipercayai berlaku akibat pengikatan propidium iodida (PI) ke atas komponen asid
nukleik sel yang membentuk COC. Oleh kerana sifat pewarna PI yang tidak telap
membran (Cevik & Dalkara 2003), maka membran sel yang mengeluarkan isyarat ini
dipercayai mudah telap terhadap PI. Ini secara tidak langsung merupakan salah satu
ciri yang menandakan sesuatu sel sedang menjalani apoptosis peringkat lewat ataupun
nekrosis sekunder.

Kesimpulan ini turut disokong oleh kajian Cevik dan Dalkara (2003).
Berdasarkan laporan tersebut, didapati bahawa pada peringkat apoptosis lewat,
membran sel akan mengalami degradasi teruk sehingga membolehkan PI melepasinya.
Keadaan ini membolehkan pewarna ini mengikat pada DNA atau RNA. Pengikatan ini
secara tidak langsung akan menyebabkan imej berwarna jingga kemerahan dihasilkan
(Kroemer et al. 1998).

Berdasakan keputusan yang diperolehi serta sokongan daripada pelbagai kajian

terdahulu yang telah dinyatakan di atas, maka kesimpulan awal yang dapat dibuat
ialah COC yang menunjukan isyarat positif dapat ditakrifkan sebagai sel yang
mengalami sama ada proses apoptosis awal atau nekrosis sekunder. Ketiadaan cahaya
berpendaflour setelah COC diwarnai pewarnaan asai annexin membuktikan ketiadaan
translokasi PS mahupun degradasi plasma membran yang membenarkan penyusupan
PI. Oleh yang demikian, ketiadaan isyarat berpendaflour pada COC yang ditakrifkan
sebagai kumpulan negatif pula boleh dianggap sebagai COC yang berkualiti baik.

Perlu ditegaskan di sini bahawa teknik penggunaan pewarna untuk

menentukan kualiti oosit bukan satu teknik yang baru. Terdapat beberapa kajian
terdahulu yang telahpun membuktikan kebolehan pewarnaan annexin dalam
mengenalpasti sama ada oosit ataupun COC sedang mengalami apoptosis dan atau
nekrosis (Anguita et al. 2007; Anguita et al. 2009; Li et al. 2009). Namun begitu,
kesemua kajian ini menggunakan pewarnaan annexin sebagai kaedah pengenalpastian
sahaja dan tidak lebih daripada itu. Ini adalah kerana setiap kaedah yang telah

51

digunakan terdahulu telah menggunakan protokol pewarnaan berasaskan lekapan

menyeluruh (whole mount). Pengunaan teknik ini menyebabkan sel yang digunakan
tidak boleh terus bermandiri. Namun, teknik yang digunakan dalam kajian ini telah
berjaya mengelak penggunaan langkah lekapan menyeluruh.

Jika diteliti secara terperinci, hasil kajian yang diperolehi turut berbeza
dengan dua kajian yang telah dilakukan oleh Anguita et al. (2007; 2009), khususnya
daripada segi pengkelasan COC selepas pewarnaan asai annexin. Perbezaan ini
berpunca daripada klasifikasi

COC kepada empat kumpulan oleh Anguita et al.

(2007). Kumpulan tersebut terdiri daripada COC yang tidak diwarnai, berwarna hijau,
berwarna merah dan campuran warna merah dan hijau. Setiap kumpulan tersebut
masing-masing mewakili COC yang ditafsirkan sebagai sihat, mengalami apoptosis,
nekrosis dan campuran kedua-dua apoptosis dan nekrosis.

Kajian lanjutan Anguita dan rakan-rakan pada tahun 2009 pula telah
memodifikasi pengkelasan tersebut dengan membahagikan ciri pewarnaan yang
dilihat kepada hanya tiga kumpulan sahaja. Tiga kumpulan tersebut ialah negatif
(tiada isyarat), positif hijau yang ditafsirkankan sebagai apoptotik dan positif jingga
yang ditafsirkankan sebagai sel yang mengalami nekrosis.

Sebagaimana perbincangan terdahulu, COC dibentuk oleh beberapa lapisan sel

kumulus yang mengelilingi sel oosit. Berdasarkan pengalaman di dalam kajian ini,
sebahagian sel yang membentuk COC mengalami peringkat apoptosis awal. Manakala
sebahagian yang lain pula boleh mengalami peringkat apoptosis akhir. Oleh yang
demikian, pengkelasan yang dibuat oleh Anguita dan rakan-rakan (2007; 2009)
dianggap agak sukar dilakukan walaupun ianya diakui lebih tepat dalam
mengasingkan COC kepada kumpulan-kumpulan yang mengalami apoptosis,
nekrosis, campuran nekrosis dan apoptotik serta COC yang berkualiti baik.

Hasil kajian yang dijalankan ini pula hanya membahagikan COC yang
diwarnai kepada dua kumpulan sahaja. Ianya dirasakan lebih ringkas serta mudah
diaplikasikan diperingkat kerja lapangan. Kumpulan tersebut ialah COC yang

52

menunjukan isyarat positif yang ditakrifkan sebagai berkualiti rendah tanpa mengira
peringkat apoptosis yang dialami oleh sel-sel tersebut serta kumpulan negatif sebagai
COC yang berkualiti baik iaitu yang berpotensi untuk disenyawakan.

Objektif kajian ini ialah mengasingkan COC yang berkualiti baik maka
dirasakan pengkelasan yang digunapakai di dalam kajian ini sudah memadai serta
berjaya mencapai objektif yang direncanakan. Oleh yang demikian, dapat disimpulkan
pengkelasan yang digunakan di dalam kajian ini lebih mudah diaplikasikan serta lebih
tepat.

Persekitaran yang sesuai bagi kemandirian

COC di dalam kajian adalah

merujuk kepada suhu pengeraman iaitu pada 38 0C serta peratusan kepekatan gas
karbon dioksida (CO2) sebanyak 5%. Namun, secara umumnya suhu persekitaran di
dalam makmal IVF pula ialah 24 0C manakala peratusan kepekatan CO2 pula ialah
sekitar 0.039%. Di dalam kajian ini, pengeraman Annexin V bersama dengan COC
dijalankan di luar inkubator yang mana suhu dan peratusan gasnya adalah mengikut
keadaan di dalam makmal IVF. Oleh yang demikian, objektif kajian kedua dilakukan
bagi mengurangkan pendedahan COC kepada persekitaran yang tidak sesuai dengan
menentukan masa minimum bagi pengikatan asai annexin.

Hasil keputusan pengeraman pewarnaan annexin bersama dengan COC selama

lima minit menunjukkan bahawa terdapat peningkatan dari segi bilangan dan
peratusan COC yang menunjukan isyarat positif apabila masa pengeraman pewarnaan
ini ditambahkan kepada 15 minit. Namun, tiada perbezaan yang signifikan dilihat
apabila kedua-dua masa pengeraman dibandingkan secara statistik.

Terdapat beberapa kajian terdahulu yang mengaplikasikan pewarnaan annexin

kepada COC, oosit pra-matang dan oosit matang haiwan ruminan (Anguita et al. 2007;
2009, Li et al. 2009). Namun, jika dibandingkan dari segi masa pengeraman yang
digunakan di dalam kajian ini dengan kajian yang terdahulu, tempoh masa lima minit
merupakan masa yang singkat. Ini adalah kerana, masa pengeraman minimum bagi
asai annexin dalam mengenalpasti oosit yang apoptosis dalam kajian terdahulu ialah

53

hanya seawal 15 minit (Anguita et al. 2007; 2009). Selain itu, terdapat kajian lain (Li
et al. 2009) pula yang membiarkan pewarnaan ini dieram bersama oosit selama 30
minit dalam mengenalpasti oosit yang mengalami proses apoptosis.

Perbezaan dari segi masa pengeraman yang dijalankan di antara kajian

terdahulu dengan kajian yang dijalankan ini, dipercayai disumbang oleh teknik
penyediaan pewarnaan yang dilaksanakan. Sebagai contoh, kajian oleh Li et al. (2009)
dan

Anguita et al. (2007; 2009) mengaplikasikan pewarnaan asai annexin

menggunakan kaedah lekapan penuh (whole mount). Dalam pengaplikasiaan

pewarnaan ini, COC mahupun oosit yang telah diwarnai dilekapkan pada slaid dan
tidak diteruskan bagi proses pembentukan embrio. Oleh yang demikian, kesan
pendedahan yang terlalu lama kepada persekitaran semasa proses pewarnaan ini serta
kesannya terhadap kemandirian COC tidak dititik beratkan di dalam kajian-kajian
tersebut.

Berdasarkan masalah tersebut, kajian ini telah diubah melalui pengurangan

masa pendedahan persekitaran pewarnaan serta teknik pewarnaan yang dilaksanakan.
Ini dilakukan dengan meminimumkan masa pengeraman kepada lima minit serta
teknik pengeraman yang membolehkan pewarnaan Annexin V dicampurkan bersamasama dengan media pematangan. Oleh itu, pewarnaaan annexin yang diaplikasikan di
dalam kajian ini membolehkan COC yang diwarnai terus bermandiri bagi proses IVM
dan seterusnya IVF.

Pendapat untuk meminimakan proses pewarnaan ini disokong oleh kajian oleh
Wu et al. (1998) yang mendapati kadar belahan bagi oosit yang dieramkan pada purata
suhu 31.5 0C adalah lebih daripada 70%. Manakala oosit yang dieramkan pada suhu
yang rendah iaitu di antara 4 dan 0 0C akan menghasilkan kadar belahan yang sangat
rendah iaitu di antara 37 hingga 42% sahaja.

Selain daripada masa pengeraman lima dan 15 minit, pengeraman COC

bersama-sama dengan pewarnaan asai annexin selama 1440 minit (24 jam) turut
dilakukan. Pemilihan 24 jam sebagai salah satu nilai pengeraman adalah berdasarkan

54

proses normal pematangan in vitro (IVM) oosit yang mana ia memerlukan

pengeraman selama

24 jam. Oleh yang demikian, pewarnaan tersebut telah

dicampurkan bersama-sama dengan media pematangan. Secara langsung ini telah

membolehkan langkah pewarnaan dan pengeraman dilakukan bersama-sama.

Malangnya keputusan menunjukkan, tiada isyarat berpendaflour dapat

diperhatikan. Ini dipercayai mungkin akibat fenomena fotoluntur (photobleaching).
Merujuk kepada kenyataan oleh Song et. al (1995), fotoluntur merupakan fenomena
yang berlaku apabila komponen pada molekul yang menyebabkannya berpendafluor,
hilang keupayaan kekal untuk berpendafluor. Ini menyebabkan kerosakan kimia foton
dan juga pengubahsuaian kovalen molekul terlibat.

Secara keseluruhannya, apa yang dapat dibuktikan daripada hasil dapatan ini
ialah asai annexin mampu mengikat pada oosit yang mengalami apotosis seawal lima
minit. Manakala masa pengeraman yang terlalu lama iaitu selama 24 jam (1440 min)
mampu mengakibatkan kehilangan fungsi pewarnaan ini dalam mengenalpasti COC
yang mengalami proses apoptosis.

Menurut Gordon (2003), terdapat beberapa parameter digunakan dalam

menilai pematangan in vitro sesuatu COC. Salah satu di antaranya ialah
pengembangan jasad kumulus. Beberapa kajian terdahulu mendapati sel kumulus
memainkan peranan yang penting dalam memastikan pematangan sitoplasma oosit.
Pematangan ini kemudiannya menyumbang kepada kejayaan dalam persenyawaan
dan seterusnya pembentukan embrio secara in vitro (Yuan et al. 2005, Abdoon et al.
2001).

Berdasarkan hasil kajian 4.4, COC yang menjalani proses penyahwarnaan dan
tanpa melalui proses tersebut tidak menunjukan perbezaan yang signifikan dari segi
pengembangan jasad kumulus mengikut modifikasi skema Hunter dan Moor (1987).
Berdasarkan modifikasi skema tersebut, kumpulan yang diklasifikasikan sebagai gred
1 menghasilkan pengembangan jasad kumulus sekurang-kurangnya tiga kali ganda
daripada diameter oosit dengan nilai ukuran di antara lebih daripada 300 m sehingga

55

250 m. Gred 2 pula ianya merujuk kepada jasad kumulus berkembang kurang
daripada dua kali ganda daripada diameter oosit iaitu dengan nilai ukuran kurang
daripada 250 m.

Secara teorinya, apabila COC yang berkualiti baik dieramkan bersama

pewarnaan Annexin-V FITC dan PI, maka ketiadaan translokasi fosfatidil serina (PS)
tidak akan membolehkan pengikatan asai annexin-V. Begitu juga dengan penyusupan
PI akibat degradasi membran plasma juga dijangkakan tidak akan berlaku. Maka
perkembangan COC yang normal ini secara teorinya tidak akan terganggu walaupun
dengan kehadiran pewarna asai ini disepanjang proses pematangannya. Namun kesan
pewarnaan ini terhadap proses pematangan oosit perlu dipastikan. Ini adalah berikutan
Rittcher et al. (2008) mendakwa bahawa pewarna berpendafluor merupakan bahan
ekstrinsik yang tidak hadir secara semulajadi di dalam sel dan berkemungkinan
memberi kesan terhadap aktiviti sel yang terlibat.

Walaupun

terdapat

kajian

terdahulu

yang

menggunakan

pewarnaan

berpendafluor FITC dan PI secara in vivo mahu pun in vitro (Cevik & Dalkara 2003;
Kenis et al. 2004), namun kesan ketoksikannya kurang dikaji. Ini berkemungkinan
kerana kebanyakan penggunaannya diaplikasikan dalam penyediaan slaid serta
menggunakan subjek haiwan.

Kebanyakan pewarna berpendafluor yang dikatakan mempunyai kesan toksik

adalah pewarna yang digunakan untuk mewarnai nukleus (Rittcher et al. 2008) yang
turut mengambil kira pewarna PI. Namun, jika didasarkan pada hasil kajian ini, maka
boleh disimpulkan di sini bahawa pewarna berpendaflor iaitu FITC dan PI tidak
mengganggu proses kemandirian COC yang diwarnainya.

Oleh yang demikian,

proses penyahwarnaan boleh dianggap tidak diperlukan apabila pewarnaaan asai

annexin dieramkan bersama-sama dengan COC bagi tujuan pengasingan kualiti
kompleks tersebut.
Bagi membuktikan bahawa pengasingan kualiti COC menggunakan kaedah
pewarnaan asai annexin mampu meningkatkan kadar persenyawaan maka objektif
terakhir iaitu perbandingan peratusan belahan embrio yang terbentuk telah

56

dilaksanakan. Di dalam kajian ini, 72 jam selepas permanian (hpi) peratusan sel yang
mengalami pembelahan digunakan sebagai penentu ukur kadar persenyawaaan.

Ini didasarkan kepada hasil kajian Naruse et al. (2012) yang mendapati sebaik
sahaja sesuatu oosit itu berjaya disenyawakan, maka nukleusnya akan meneruskan
proses meiosis fasa II sebelum membelah membentuk dua sel yang serupa. Dua sel ini
kemudiannya akan bermitosis membentuk peringkat empat, lapan dan 16-sel sebelum
berada di peringkat morula (Lu et al. 1999).

Walaupun hasil kajian ini tidak menetapkan peringkat perkembangan embrio

tertentu yang perlu di ambil kira sebagai peratusan kejayaan dalam persenyawaan,
bilangan embrio yang membentuk peringkat dua-sel dan ke atas di ambil kira
(Lampiran A) dalam menentukan peratusan kadar persenyawaan. Ini adalah kerana,
penemuan oleh Gordon (2003) yang menganggarkan pembentukan setiap peringkat
perkembangan awal embrio bovin belaku dalam jangkamasa yang lebih fleksibel.
Sebagai contoh, pembentukan peringkat dua, empat, lapan dan 16-sel masing-masing
dikatakan boleh berlaku di antara 0 hingga dua hari, satu hingga tiga hari, dua hingga
tiga hari, tiga hingga lima hari dan empat hingga lima hari.

Berbeza dengan kajian oleh Ferguson et al. (2012) yang hanya menerima
peringkat lapan-sel ke atas sahaja bagi pemerhatian 72 jam selepas permanian
dijalankan. Manakala kajian lain oleh Van Soom et al. (1992) pula merekodkan nilai
tertinggi peringkat dua, empat, lapan dan 16-sel masing-masing berlaku pada jam ke36, 42, 60 dan 102 selepas permanian (hpi).

Sebagaimana yang dijangka di dalam hipotesis kami, peratusan COC yang

ditafsirkan mengalami apoptosis dengan menunjukan isyarat positif apabila diwarnai
dengan asai annexin menunjukan kadar persenyawaan terendah (50%). Kadar
persenyawaan kumpulan COC yang ditafsirkan sebagai oosit berkualiti baik dengan
menunjukan isyarat negatif apabila diwarnai oleh asai annexin pula menunjukan
peratusan pembentukan embrio tertinggi (79%) diikuti dengan kumpulan COC
ditafsirkan sebagai baik dengan pemerhatian morfologinya (66%).

57

Hasil kajian ini dipercayai berlaku kerana apabila COC yang ditafsirkan
sebagai berkualiti baik berdasarkan morfologinya diwarnakan dengan asai annexin
didapati ianya adalah campuran COC yang mengalami apoptosis serta yang berkualiti
baik. Dengan erti kata lain, penilaian kualiti oosit secara morfologi berbeza dengan
hasil penilaian kualiti oosit berdasarkan pewarnaan asai Annexin-V. Jika didasarkan
kepada hasil perbandingan peratusan belahan yang terbentuk di antara kumpulan
kajian ini, penilaian kualiti oosit berdasarkan pewarnaan annexin adalah lebih tepat.

Di samping itu juga, hasil kajian ini turut menyokong bahawa pengasingan
kualiti COC menggunakan kaedah pewarnaaan asai annexin mampu meningkatkan
kadar pembentukan embrio secara in vitro.

BAB VI

KESIMPULAN

Jika dilihat pada kajian ini secara keseluruhan, maka dapat disimpulkan di sini bahawa
pengasingan kualiti kompleks kumulus oosit (COC) menggunakan asai Annexin-V
secara signifikanya mampu meningkatkan kadar persenyawaan in vitro (IVF).
Pewarnaan asai ini menunjukan isyarat negatif kepada COC yang normal. Isyarat
positif pula menandakan terdapatnya translokasi fosfatidil serina ke permukaan luar
membran plasma COC yang merupakan salah satu tanda apoptosis awal. Dari segi
kaedah pewarnaan asai ini pula, kajian mendapati tempoh pengeraman yang sesuai
bagi mengasingkan COC yang berkualiti ialah selama lima minit. Walaupun begitu,
selepas 24 jam, isyarat positif dan negatif pewarnaan ini akan menghilang dan dengan
itu menghalang penyelidik untuk melakukan proses pengklasifikasi oosit. Bagi kesan
pengekalan pewarnaan ini sepanjang proses pematangan didapati pewarnaan ini tidak
mengganggu proses pematangan yang berlaku berdasarkan kepada pengembanngan
sel kumulus tersebut. Perbandingan kadar persenyawaan di antara COC yang
menunjukan isyarat positif dan negatif mendapati COC yang menunjukan isyarat
negatif mempunyai kadar belahan tertinggi iaitu sebanyak 79%. Manakala, bagi COC
yang dianggap berkualiti baik berdasarkan pemerhatian morfologinya pula
menunjukan kadar persenyawaan sebanyak 66%. Kompleks kumulus-oosit (COC)
yang menunjukan isyarat positif pula menunjukan kadar persenyawaan sebanyak 50%.
Keseluruhanya, asai Annexin-V berjaya mengasingkan COC yang berkualiti dan
seterusnya mampu meningkatkan kadar persenyawaan.

59

CADANGAN KAJIAN LANJUTAN

Secara telusnya, kajian ini masih diperingkat awal sebelum pewarnaan asai AnnexinV dapat digunakan secara meluas dalam meningkatkan kadar penghasilan embrio
secara in vitro. Ini adalah berikutan terdapatnya beberapa kekurangan dalam
membolehkan teknik ini menghasilkan keputusan yang lebih baik dan lebih tepat lagi.
Di antara cadangan penambahbaikan dan juga tambahan kepada kajian yang sedia ada
ialah:
1. Mengurangkan masa pendedahan COC kepada persekitaran sewaktu pengasingan
isyarat positif dan negatif dengan melakukan pengeraman dalam kuantiti yang
sedikit iaitu lima COC di dalam satu-satu masa.
2. Mengunakan penapis gelombang yang khusus bagi Annexin-V FITC dan juga PI
yang mampu mengasingkan isyarat daripada kedua-dua pewarna tersebut.
3. Melakukan kajian lanjut terhadap kesan pewarnaan asai Annexin terhadap proses
pematangan terutamanya daripada segi pematangan nukleus. Parameter yang
boleh digunakan ialah dengan melihat pembentukan peleraian germinal vesikel
(GVBD), peingkat metafasa I dan juga II.
4. Melanjutkan pemerhatian kesan pewarnaan asai ini daripada sekadar kadar
belahan kepada peringkat blastosista dan jika berjaya sehingga membolehkan
embrio yang terhasil dipindahkan ke ibu tumpang.

RUJUKAN

Abdoon, A. S., Kandil, O. M., Otoi, T. and Suzuki, T. 2001. Influence of oocyte
quality, culture media and gonadotropins on cleavage rate and development of
in vitro fertilized buffalo embryos. Animal Reproduction Science 65(3-4): 215.
Alvarez, G. M., Dalvit, G. C., Achi, M. V., Miguez, M. S. and Cetica, P. D. 2009.
Immature oocyte quality and maturational competence of porcine cumulusoocyte complexes subpopulations. Biocell 33(3) : 167-177.
Anguita, B., Paramio, M. T., Morat, R., Romaguera, R., Jimnez-Macedo, A. R.,
Mogas, T. and Izquierdo, D. 2009. Effect of the apoptosis rate observed in
oocytes and cumulus cells on embryo development in prepubertal goats.
Animal reproduction science 116(1-2): 95-106.
Anguita, B., Vandaele, L., Mateusen, B., Maes, D. and Van Soom, A. 2007.
Developmental competence of bovine oocytes is not related to apoptosis
incidence in oocytes, cumulus cells and blastocysts. Theriogenology 67(3):
537-549.
Azimon, A. Z. and Zeti, A.M. H. 2009. Impak bioteknologi ke atas perlindungan
pengguna: Aspek undang-undang berhubung keselamatan produk. Jurnal
Pengurusan. 29: 33-56.
Bilodeau-Goeseels, S. and Panich, P. 2002. Effects of oocyte quality on development
and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal reproduction
science 71(3): 143-155.
Blondin, P. and Sirard, M. A. 1995. Oocyte and follicular morphology as determining
characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular
reproduction and development 41(1): 54-62.
Brackett, B. G. and Zuelke, K. A. 1993. Analysis of factors involved in the in vitro
production of bovine embryos. Theriogenology 39(1): 43-64.
Bukowska, D., Kempisty, B., Piotrowska, H., Walczak, R., Sniadek, P., Dziuban, J.,
Brussow, K., Jaskowski, J. and Nowicki, M. 2012. The invasive and new noninvasive methods of mammalian oocyte and embryo quality assessment: a
review. Veterinarni Medicina 57(4): 169-176.
Bols, P., Langbeen, A., Goovaerts, I., Leroy, J., Estany, J., Nogareda, C. and
Rothschild, M. 2010. Biotechnology of Reproduction in Farm Animals with an
Emphasis on Cattle Assisted Reproductive Techniques. Adapting Animal
Production to Changes for a Growing Human Population: 45.

61

Catal, M. G., Izquierdo, D., Rodrguez-Prado, M., Hammami, S. and Paramio, M. T.

2012. Effect of oocyte quality on blastocyst development after in vitro
fertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in a sheep
model. Fertility and sterility.
Cevik, I. U. and Dalkara, T. 2003. Intravenously administered propidium iodide labels
necrotic cells in the intact mouse brain after injury. Cell Death &
Differentiation 10(8): 928-929.
Dadashpour Davachi, N., Kohram, H. and Zainoaldini, S. 2011. Cumulus cell layers
as a critical factor in meiotic competence and cumulus expansion of ovine
oocytes. Small Ruminant Research.
De Wit, A. and Kruip, T. A. M. 2001. Bovine cumulus-oocyte-complex-quality is
reflected in sensitivity for -amanitin, oocyte-diameter and developmental
capacity. Animal Reproduction Science 65(1): 51-65.
De Wit, A., Wurth, Y. and Kruip, T. 2000. Effect of ovarian phase and follicle quality
on morphology and developmental capacity of the bovine cumulus-oocyte
complex. Journal of animal science 78(5): 1277-1283.
Dewan

Bahasa
dan
Pustaka.
http://prpm.dbp.gov.my/Search.aspx?k=bioteknologi [2 Jan 2011].

2011.

Elder, K., Dale, B., Mnzo, Y., Harper, J. and Huntriss, J. 2010. In-vitro fertilization.
Cambridge University Press.
Ferguson, C., Kesler, D. and Godke, R. 2012. Progesterone enhances in vitro
development of bovine embryos. Theriogenology 77(1): 108-114.
Goovaerts, I., Leroy, J., Jorssen, E. and Bols, P. 2010. Noninvasive bovine oocyte
quality assessment: possibilities of a single oocyte culture. Theriogenology
74(9): 1509-1520.
Gordon, I. R. 1994. Laboratory production of cattle embryos, CAB International
(Wallingford, Oxon, UK).
Gordon, I. R. 2003. Laboratory production of cattle embryos: I. Gordon. CABI.
Hansen, P. 2006. Realizing the promise of IVF in cattlean overview.
Theriogenology 65(1): 119-125.
Hasler, J. F. 2000. In-vitro production of cattle embryos: problems with pregnancies
and parturition. Human Reproduction 15(suppl 5): 47-58.
Hawk, H. and Wall, R. 1994. Improved yields of bovine blastocysts from in vitroproduced oocytes. I. Selection of oocytes and zygotes. Theriogenology 41(8):
1571-1583.

62

Hegab, A., Montasser, A., Hammam, A., El-Naga, E. M. A. A. and Zaabel, S. 2009.
Improving in vitro maturation and cleavage rates of buffalo oocytes. Anim.
Reprod 6(2): 416-421.
Hoque, S. A. M., Kabiraj, S. K., Khandoker, M. A. M. Y., Mondal, A. and Tareq, K.
2011. Effect of collection techniques on cumulus oocyte complexes (COCs)
recovery, in vitro maturation and fertilization of goat oocytes. African Journal
of Biotechnology 10(45): 9177-9181.
Hsieh, M., Zamah, A. M. and Conti, M. 2009. Epidermal growth factor-like growth
factors in the follicular fluid: role in oocyte development and maturation. 27:
52
Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S. and Livingston, E. H. 2007. Screening and
detection of apoptosis. Journal of Surgical Research 139(1): 143-156.
Hunter, A.G and Moor, R.M. 1987. Stage-dependent effects on inhibiting ribonucleic
acids and protein synthesison meiotic maturation of bovine oocytes in vitro.
Journal of Dairy Science. 70: 1646-1651.
Inaba, N., Sato, N., Ijichi, M., Fukazawa, I., Nito, A., Takamizawa, H., Lben, G. and
Bohn, H. 1984. The immunocytochemical location of two membraneassociated placental tissue proteins in human and cynomolgus monkey
placentae. Tumour biology: The Journal of the International Society for
Oncodevelopmental Biology and Medicine 5(2): 75.
Iwata, H., Akamatsu, S., Minami, N. and Yamada, M. 1998. Effects of antioxidants on
the development of bovine IVM/IVF embryos in various concentrations of
glucose. Theriogenology 50(3): 365-375.
Jabatan Perangkaan Malaysia. 2010. Laporan Banci Pertubuhan Pertanian Tahunan
2009.
Ktska-Ksikiewicz, L., Opiela, J. and Ryska, B. 2007. Effects of oocyte quality,
semen donor and embryo co-culture system on the efficiency of blastocyst
production in goats. Theriogenology 68(5): 736-744.
Ktska-Ksikiewicz, L., Opiela, J. and Ryska, B. 2009. Effects of oocyte quality
and semen donor on the efficiency of in vitro embryo production in cattle.
Journal of Animal and Feed Sciences 18: 257-270.
Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A. and Dagher, P. C. 2003.
A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL
reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Physiology-Cell
Physiology 284(5): C1309-C1318.
Kenis, H., van Genderen, H., Bennaghmouch, A., Rinia, H. A., Frederik, P., Narula,
J., Hofstra, L. and Reutelingsperger, C. P. M. 2004. Cell surface-expressed

63

phosphatidylserine and annexin A5 open a novel portal of cell entry. Journal

of Biological Chemistry 279(50): 52623-52629.
Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H. and Currie, A. R. 1972. Apoptosis: a basic biological
phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal
of cancer 26(4): 239.
Khandoker, M., Jahan, N., Asad, L., Hoque, S., Ahmed, S. and Faruque, M. 2012.
Qualitative and quantitative analysis of buffalo ovaries, follicles and oocytes in
view of in vitro production of embryos. Bangladesh Journal of Animal Science
40(1-2): 23-27.
Khurana, N. and Niemann, H. 2000. Effects of oocyte quality, oxygen tension,
embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and
morula/blastocyst formation of bovine embryos. Theriogenology 54(5): 741756.
Kim, J., Kinoshita, M., Ohnishi, M. and Fukui, Y. 2001. Lipid and fatty acid analysis
of fresh and frozen-thawed immature and in vitro matured bovine oocytes.
Reproduction 122(1): 131-138.
Koopman, G., Reutelingsperger, C., Kuijten, G., Keehnen, R., Pals, S. and Van Oers,
M. 1994. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine
expression on B cells undergoing apoptosis. Blood 84(5): 1415-1420.
Kornberg, A. 2012. International Conference. Biotechnology in Public: Dna and the
Quality of Life. Electronic Journal of Biotechnology 2(1).
Kraupp, B. G., RuttkayNedecky, B., Koudelka, H., Bukowska, K., Bursch, W. and
SchulteHermann, R. 1995. In situ detection of fragmented DNA (TUNEL
assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death:
a cautionary note. Hepatology 21(5): 1465-1468.
Kroemer, G., Dallaporta, B. and Resche-Rigon, M. 1998. The mitochondrial death/life
regulator in apoptosis and necrosis. Annual review of physiology 60(1): 619642.
Lechniak, D., Kaczmarek, D., Stanisawski, D. and Adamowicz, T. 2002. The ploidy
of in vitro matured bovine oocytes is related to the diameter. Theriogenology
57(4): 1303-1308.
Leibfried, L. and First, N. 1979. Characterization of bovine follicular oocytes and
their ability to mature in vitro. J Anim Sci 48: 76-86.
Li, H., Liu, D., Cang, M., Wang, L., Jin, M., Ma, Y. and Shorgan, B. 2009. Early
apoptosis is associated with improved developmental potential in bovine
oocytes. Animal Reproduction Science 114(1): 89-98.

64

Li, X. and Darzynkiewicz, Z. 2008. Labelling DNA strand breaks with BrdUTP.
Detection of apoptosis and cell proliferation. Cell proliferation 28(11): 571579.
Liu, L., Ju, J. C. and Yang, X. 1998. Differential inactivation of maturation-promoting
factor and mitogen-activated protein kinase following parthenogenetic
activation of bovine oocytes. Biology of reproduction 59(3): 537-545.
Lu, K., Gordon, I., Gallagher, M. and McGovern, H. 1987. Pregnancy established in
cattle by transfer of embryos derived from in vitro fertilisation of oocytes
matured in vitro. The Veterinary record 121(11): 259.
Lu, K. and Polge, C. 1992. A summary of two-year's results in large scale in vitro
bovine embryo production.
Lu, K. and Seidel, G. 2004. Effects of heparin and sperm concentration on cleavage
and blastocyst development rates of bovine oocytes inseminated with flow
cytometrically-sorted sperm. Theriogenology 62(5): 819-830.
Lu, S., Wade, M. and Kelly, G. 1999. Effects of taurine, glutamine and culture dishes
on the in vitro development of bovine embryos. Theriogenology 51(1): 244244.
Machaty, Z., Peippo, J. and Peter, A. 2012. Production and manipulation of bovine
embryos: techniques and terminology. Theriogenology.
Martin, S. J., Reutelingsperger, C., McGahon, A. J., Rader, J. A., Van Schie, R.,
LaFace, D. M. and Green, D. R. 1995. Early redistribution of plasma
membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of
the initiating stimulus: inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl. The
Journal of Experimental Medicine 182(5): 1545-1556.
Maurer-Fogy, I., Reutelingsperger, C., Pieters, J., Bodo, G., Stratowa, C. and
Hauptmann, R. 1988. Cloning and expression of cDNA for human vascular
anticoagulant, a Ca2+-dependent phospholipid-binding protein. European
journal of biochemistry 174: 585-592.
McGaughey, R. 1983. Regulation of oocyte maturation. Oxford Reviews of
Reproductive Biology 5.
Mendes, J., Burns, P., De La Torre-Sanchez, J. and Seidel, G. 2003. Effect of heparin
on cleavage rates and embryo production with four bovine sperm preparation
protocols. Theriogenology 60(2): 331-340.
Mingoti, G., Garcia, J. and Rosa-e-Silva, A. 2002. Steroidogenesis in cumulus cells of
bovine cumulus-oocyte-complexes matured in vitro with BSA and different
concentrations of steroids. Animal Reproduction Science 69(3-4): 175-186.

65

Naruse, K., Iga, K., Shimizu, M., Takenouchi, N., Akagi, S., Somfai, T. and Hirao, Y.
2012. Milrinone treatment of bovine oocytes during in vitro maturation
benefits production of nuclear transfer embryos by improving enucleation Rate
and developmental competence. The Journal of Reproduction and
Development.
Niu, G. and Chen, X. 2010. Apoptosis imaging: beyond annexin V. Journal of
Nuclear Medicine 51(11): 1659-1662.
Park, Y. S., Kim, S. S., Kim, J. M., Park, H. D. and Byun, M. D. 2005. The effects of
duration of in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent development,
quality and transfer of embryos. Theriogenology 64(1): 123-134.
Peippo, J., Machaty, Z. and Peter, A. 2011. Terminologies for the pre-attachment
bovine embryo. Theriogenology 76(8): 1373-1379.
Picton, H., Harris, S., Muruvi, W. and Chambers, E. 2008. The in vitro growth and
maturation of follicles. Reproduction 136(6): 703-715.
Plourde, D., Vigneault, C., Lemay, A., Breton, L., Gagn, D., Laflamme, I., Blondin,
P. and Robert, C. 2012. Contribution of oocyte source and culture conditions
to phenotypic and transcriptomic variation in commercially produced bovine
blastocysts. Theriogenology. 77:1767-1778
Rancangan Malaysia Kesembilan 2006-2010.
Reutelingsperger, C. P. M., Hornstra, G. and Hemker, H. C. 1985. Isolation and partial
purification of a novel anticoagulant from arteries of human umbilical cord.
European journal of biochemistry 151(3): 625-629.
RodriguezMartinez, H. 2012. Assisted Reproductive Techniques for Cattle Breeding
in Developing Countries: A Critical Appraisal of Their Value and Limitations.
Reproduction in Domestic Animals 47: 21-26.
Salamone, D., Damiani, P., Fissore, R., Robl, J. and Duby, R. 2001. Biochemical and
developmental evidence that ooplasmic maturation of prepubertal bovine
oocytes is compromised. Biology of reproduction 64(6): 1761-1768.
Schultz, R. M. and Kopf, G. S. 1995. 2 Molecular basis of mammalian egg activation.
Current topics in developmental biology 30: 21-62.
Song, L., Hennink, E., Young, I. T. and Tanke, H. J. 1995. Photobleaching kinetics of
fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal
68(6): 2588-2600.
Tervit, H., Whittingham, D. and Rowson, L. 1972. Successful culture in vitro of sheep
and cattle ova. Journal of Reproduction and Fertility 30(3): 493-497.

66

University
of
Dundee.
2012.
Cell
death
and
apoptosis.
http://www.lifesci.dundee.ac.uk/services/flow_cytometry/ca/cell-death [5 Mei
2012]
van Engeland, M., Nieland, L. J. W., Ramaekers, F. C. S., Schutte, B. and
Reutelingsperger, C. P. M. 1998. Annexin V-affinity assay: a review on an
apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry
31(1): 1-9.
Van Soom, A., Van Vlanenderen, V., Mahmoudzadeh, A.R., Deluyker, H., and de
Kruif, A. 1992. Compaction rate of in vitro fertilized bovine embryos related
to the interval from insemination to cleavage. Theriogenology. 38: 905-919.
Van Wagtendonk-de Leeuw, A., Mullaart, E., De Roos, A., Merton, J., Den Daas, J.,
Kemp, B. and De Ruigh, L. 2000. Effects of different reproduction techniques:
AI, MOET or IVP, on health and welfare of bovine offspring. Theriogenology
53(2): 575-597.
van Woudenberg, A. B., Grllers-Mulderij, M., Snel, C., Jeurissen, N., Stierum, R.
and Wolterbeek, A. 2012. The bovine oocyte in vitro maturation model. A
potential tool for reproductive toxicology screening. Reproductive Toxicology.
Vandaele, L. and Van Soom, A. 2008. Intrinsic factors affecting apoptosis in bovine in
vitro produced embryos. Doctora Thesis.
Vassena, R., Mapletoft, R. J., Allodi, S., Singh, J. and Adams, G. P. 2003.
Morphology and developmental competence of bovine oocytes relative to
follicular status. Theriogenology 60(5): 923-932.
Wu, J., Zhang, L. and Liu, P. 1998. A new source of human oocytes : preliminary
report on the identification and maturation of human preantral follicle from
follicular aspirates. Human Reproduction. 13: 2561-2563.
Yoshida, N. and Mizuno, K. 2012. Effect of physiological levels of phytoestrogens on
mouse oocyte maturation in vitro. Cytotechnology: 1-7.
Young, L. E., Sinclair, K. D. and Wilmut, I. 1998. Large offspring syndrome in cattle
and sheep. Reviews of Reproduction 3(3): 155-163.
Yuan, Y., Van Soom, A., Leroy, J., Dewulf, J., Van Zeveren, A., de Kruif, A. and
Peelman, L. 2005. Apoptosis in cumulus cells, but not in oocytes, may
influence bovine embryonic developmental competence. Theriogenology
63(8): 2147-2163.
Zhang, L., Jiang, S., Wozniak, P. J., Yang, X. and Godke, R. A. 1995. Cumulus cell
function during bovine oocyte maturation, fertilization, and embryo
development in vitro. Molecular reproduction and development 40(3): 338344.

67

LAMPIRAN A

Contoh kaedah penentuan gred 1 pengembangan jasad kumulus menggunakan

perisian ImageJ

68

LAMPIRAN B

Contoh peringkat belahan (cleavage) yang digunakan dalam penentuan

peratusan pembentukan belahan embrio