BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri
berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada
spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat
menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu
sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna
pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa
diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi,
yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi,
2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi
data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar
mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.
1.2 Perumusan Masalah
Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan
pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta
bagaimana teknik pengecatan
1.3 Tujuan
Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentukbentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan
dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode
ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang
didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora
Gambar Struktur Dasar Bakteri
Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif
(Edukasi, 2008).
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan
berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna
staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang

berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic
pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45
derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim
coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis
beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran
kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan
melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens
ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering
ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35
derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi
keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah
(asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya
memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814
(4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu
mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang
termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di
dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri
patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan
penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air
serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary,
2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi,
yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi,
2008).
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat
menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu
sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora dilaksanakan pada
hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Pewarnaan Bakteri
Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades
steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu
difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci
denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan air
mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air
mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian
dicatat bentuk dan warna sel bakteri
3.2.2 Pewarnaan Endospora
Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades
steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu
difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan
preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai

pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (12 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya
spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan
perbesaran.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisis Prosedur
Pewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok
yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri
gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan
membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak
kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan
dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar
bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen
yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur
bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora,
2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi
dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama
30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian
dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk
melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat
primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat
sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang
berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar
pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak
berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat
luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna
merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non
target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage,
2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna dan tidak
tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila
diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah
mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri
gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.
Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian
preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk
melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air
mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora
dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan
bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani
(1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel
yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna
safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.
4.2 Data Hasil Penelitian
No.
Nama dan Gambar
Karakteristik

Gram
1.
Staphlococcus aereus
2.
Bacillus subtilis
3.
Escherichia coli
4.3 Analisis Hasil
Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang berbentuk
kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1m, koloninya berbentuk seperti buah
anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit erpisah-pisah bahkan
membentuk rantai panjang (hasil pengamatan). Pada Eschericia coli, koloninya tersusun rantai
memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora, pada saat diwarnai menunujukkan warna
merah.
1.Staphylococcus aureus.
Gambar. Staphylococcus aerreus
Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk bakteri
gram positif. Bakteri ini berbentuk basil. Koloninya tersususn berjajar seperti rantai memenjang. Jenis
ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylacoccus aereus adalah gram positif yang
berbentuk kokus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel mencapai 1 m, dan koloninya
seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan racun sebagai penyebab sindrom trauma
yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak. Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang,
pingsan, turunnnya tekanan darah (Textbook, 2008).
Klasifikasi Staphylococcus aureus.
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Cocci
Famili : Staphylococcaaceae
Genus : Staphylacoccus
Spesies : Staphylacoccus aereus (it is, 2008)
2.Bacillus subtilis
Gambar Pengamatan Bacillus subtilis (1000 x)
Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil (batang)
dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di tengah. Bacillus
subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif (Perez 2000). Bakteri ini
tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam amino. Peptidoglycan
yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang
antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel dan withstanding
sel yang tinggi internal tekanan turgor (Schaechter 2006).
Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang kekurangan
nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation. Contohnya polymyxin,
difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus dapat menurunkan Polymers seperti

protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan penyumbang penting kepada siklus karbon
dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi, dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan
pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau
(Schaechter 2006).
Klasifikasi Bacillus subtilis.
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Order : Bacillales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis (itis, 2008)
3.Escherichia coli
Gambar 5. Pengamatan Escherichia coli. (1000 x)
Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang pendek. Bakteri
tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya tersusun seperti rantai
memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia
coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang
fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem
pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli
merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta
hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di
air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang
disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).
Klasifikasi Escherichia coli.
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escheriachia
Spesies : E. coli (itis, 2008)
4.Pewarnaaan endospora
Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat, yang
terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi, lokasi, dan
ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada sel, dimana sel
tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008).
Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi. Tipe utama
diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan lokasi dari sel
vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki penngertian letak el vegetatif diantara
ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi endosporanya diantara tengah dan
pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang
terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin. Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap
pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora
merupakan metode pertahanan hidup yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus
subtilis memiliki endospora yang terletk di subterminal (Ncbi, 2008). Hasil pengamatan pada
endospora Bacillus subtilis berbeda dengan literatur karena terdapat kesalahan pengamatan dan
pengidentifikasian.

Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip yang selalu harus diingat dan
dipatuhi adalah (Edukasi, 2008) :
Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)
Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan bakteri
dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan cat gram A,
gram B, gram C, dan gram D. pewarnaan endospora dengan menggunakan malakit. Bentuk sel bakteri
yang ditemukan adalah basil (Bacillus subtilis., Escherichia coli., Staphylococcus aereus), dan kokus
(tidak ada). Bakteri yang termasuk gram positif adalah Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia
coli dan Staphylococcus aereus. Lama pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus
diperhatikan. Etanol terhindin adap bakteri dapat menyebabkan tereksistasinya lapisan lipid sehingga
memperbesar daya serap atau permiabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal
iodium yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat
tereksistasi. Karena itu organisme gram negatif pewarnaan kehilangan warna tersebut, disebabkan
kandungan lipidnya yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama
perlakuan dengan etanol.
5.2 Saran
Sebaiknya pada saat praktikum benar-benar diperhatikan prosedur pewarnaan terutama pada lama
waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal. Pada saat
pengembalian isolat juga diperhatikan apakah isolat tersebut benar-benar sudah diangkat sehingga
preparat apusan yang dihasilkan baik.