CAPITOLUL Il, ACIZIT NUCLEICL Studie fundamentale (1868) ale ui F. Mischerau pus temelia chimiei nucleului celular. Dinsul aextrasnnncleelecelulelor din puroiultifoanclorchirurgicale uilizate si a demonstrat clin aceste nuclee se afl un compus ce confine fosfor, pe care I-a denumit nuclein’. S-a constatat ci aceasta eo nucleoproteida. Drept izvor de nucleoproteide serveste timusul. Aceasti glandi se utlizeazi ca materie experimentald pentru toate investigafile stiintfice. A fost nevoie de decenii de cercetiri, pind cind mai multe generagii de savangi au stabilit compozifia chimica a acizilor nucleici si componentelor lor deb STRUCTURA CHIMICA Aciziinucleici sunt compusi macromoleculari, degrading hidroliticin nucleotide si rmucleozide, dealtel ei suntpolinucleotide, compusi dintr-un numar foarte mare de mononucleotide. La hidroliza completa degradeaza si mononucleotidele, generind baze azotate (putinice $i pirimidinice), pentoze gi acid fosforic in cantitati cchimolare. Bazele azotate pirimidinice sunt detivat ai pirimidinei, se intiInesc in acizii nuckeici. Denotat trei baze majore: wracilul,citozina si timing. o Ctozna Pirimidina 24tioxipiri- S-metil-24-dioxi- 2-oxi-4-amino- ‘midina pirimidina pitrimidina Exist si unele baze minore pirimidinice ca: 5-metit-citozina si S-hidoximetil- citozina, metiluridina, tiouridina, pseudouridina. S-metil-citozina S-hidroximetil-citozina —-Pseudouridina(y) —4-tiouridina -95-Acizii nucleici contin si haze purinice —adenind si guanind. Purina este derivatul pirimidinei: molecula confine inele condensate ale pirimidinei siimidazolulu, NH, ° HN Adenina (G-amino-purina) Guanina (2-amino-6-oxipurina) Purina Se intilnesc in acizii nucleici gi baze purinice minore ca: 2-metil-adenina, 6-metil- adenina, -metil-guanina, 7-metil-gunina si inozina, Bazele minore se contin 5% si difera mult de la o specie laalta. Ge ork 4 6-metil-adenina 2ametil-guanina “-metil-guanina Proprietitile Bazele azotate prezintl fenomenul de tautomerie (structuri ce difera prin poziia unui atom de hidrogen sia unei duble legituri) formele lactim sau lactam, ultimele mai stabile, predomina in structuri. 0 OH oN AN wo oye on? a i Lacan Lain Da atin Bazele azotate sunt slab solubile in apa; cele pirimidinice au o structurd plan’, cele purinice —aproape plana, putin pliata, Bazele pirimidinice sunt mai stabile decit cele purinice. Bazele azotate posed maxima capacitate de absorbtie de ultraviolet (intre 260-280 nm), ceea ce permite determinarea cantititii de acizi nucleici (cu atit- mai multai componentelor-baze, nucleozide). Pentru identificare se uilizeazii si cromatografia ete, La hidroliz menajati nucleotidele degradeaza in nucleozide si acid fosforic. -96-‘Nucleozidul constituie N-nucleovide ale bazelor purinice sau pirimidinice, incare glucidul, pentoza (riboza sau dezoxiriboza) cu atomul stu de C, formeazii legitura glicozidica cu N, (pirimidina) sau, (purina). Legatura glucozidicd in nucleozidele naturale este 6, Pentozele sunt prezente in forma furanozic’, formind legatura cu hidroxilul, semiacetalic. Distingem ribonucleozide si dezoxiribonucleozide. Nucleozidele sunt mai solubile in apa decit bazele azotate, mai stable in solutialcaline si usor se hidrolizeaza la incdlzire in ‘mediul acid, producind baze libere si pentoze. in organism nucleazidele sunt hidrolizate de nucleozidaze specifice. Denumirea nucleozidelor deriva de la bazele azotate prin aaiugarea sufixelor. -ozina, pentru derivati purinivisi~idtinu, pontsu cei pisimnidini Adeninasi riboza rezultiin adenozind, respectiv: guanozina; aceiasi analogi—cu dezoxitiboza; uridina, citidina, timina, cu dezoxiriboza, se numeste timidind, iar compusul timinei din tRNA poart denumirea de riboziltimind. Din punct de vedere steric, nucleozidele pot avea doud conformati: sin si ati Forma anti este caracteristicd compusilor naturali,fiind ceruta de agezarea corectia bazelor complementare in structura dublu helicoidala a DNA. In forma Z conformatia sin altemneaz cu anti Esterii fosforici ai nucleozidelor egaleaza cu nucleotidele la legaturile C, si C, ale pentozei. in dezoxiribonucleotide se manifesta numai aceste dou pozitii, iar ribonucleotidele se completeaz’ si cu pozitia C,, Modificind condiiile de hidroliza, se pot obtine toate tipurile. Celulele in stare libera coopteaz8, preponderent in poziia 5), grupa fosfat. Structural, pentoza sau dezoxipentoza ocupi o pozitie de legatura intre fosfat si baze azotate. Nomenclatorul nucleotidelor simucleozidelor BAZELE Purinice Pirimidinice Adenia (A) | Guanina (G) | Citozina (C) | Uraeitul (U)] Timina (7)| aq: RNA| Adenozina | Guanozina | Citidina | Uridina Nucleozidul in: DN’) dAdenozina | dGuanozina | dCitidina Timidina tne RNA) Adenilat Guanilat | Citidilat | Uriditat Nucleotidul in: DyaldAdenitat | dGuanilat | acivitt ‘Timiditat Nueleozid ADP. GDP CDP | UDP difosfati GADP dGpp__| dCbP TDP Nucleozid ATP GTP CTP UTP trifosteti dATP dGTP aCTP Tie: Ambele mononucleotide reprezintiacizi deosebit de activi s se afta sub forma de 5'- mono, di- sau trifosfati. Grupa fosfat2 si 3 usor poate fihidrolizata de enzime specifice, fird scindarea altorlegaturi -97-Rolul nucleotidelor 1. Element structural al acizilor nucleic 2. ATP—purtitorul energiei chimice in celuki, serveste la transferul grupelor fosfat macroergice si prezinti cheia de legiiturd intre procesele ce decurg cu eliminarea, degajarea energiei si intre cele ce utilizeaza energia. ADP si AMP se formeaza in reaultatul defosforilisii ATP, fosforiind ping la ATP in procesul respiratie tisulare. Ciclul ADP-ATP in celula constituie sistemul principal de transfer al grupei fosforice. 3. Aciaii nucleic’ iam parte In tennsferal nnor hlocuri de consinuetie (acidnl neetic, ‘glucoza, cholina), ransfonmindu-le in substanfe biologice active —uridinddifsfatghucozi, citinddifosfatchotina ete 4, Servese ca precursori macroergici ai unititilor mononueleotidice a sinteza fermentativi a DNA si RNA, cedind grupa pirofosfat, se transforma in resturi de nucleozidmonofosfat —baza structural’ a lanfului potinucleotidic. 5. Unele mononucleotide primordiale confin si alti compusi-nicotinamida innicotin- amidmononucleotid, precursorul NAD, vit.B, in flavinmononucleotid si FAD. 6. in organisme sunt prezente 2 feluri de esteri fosforici ai nucleotidelor (AMP, ADP, ATP), inalte cazuri fosfatul leagi 2 atomi de O, ai pentozei incadrul aceluiasi nucleotid, founindu-se nucleutide cielice-2,3' $135 \ O—P—O-CHy | | ) 0. AMPe 2.3! AMPe 31,5’ Produsul 23! rezulté ca intermediar la degradarea ribonucleotidetor, pe cind AMPe 31,5" este un ribonucleotid natural, ce poseda proprietati unice si o activitate biologica deosebita, reglind metabolismul ca mesageral efectului hormonal. DNA. Structura primari. Polinucleotidele sunt realizate prin stabilirea legaturilor covalente intre nucleotidele ce se succed in anf. Gruparea 3-hidroxila unui mucleotid este legatii de gruparea 5'-hidroxil a mononucleotidului urmitor prin legiitura fosfo- diestericd. Atit DNA, citsi RNA au proprietiti comune chimice si fizice — sunt greu solubile in solutiiacide, dar usor se extrag din tesut cu ajutorul solutilor de struri neutre sifenol. = 98Bazele azotate sunt responsabile de informatia geneticé, pe cind grupele glucidi- ce gi fosfatul auo functie structural, DNA —conceptul actual structural s-a format prin anii 1950. Moleculele de DNA din celulele tuturor speciilor sunt compuse din 4 ‘mononucleotide dAMP, (GMP, dCMP si TMP, legate intr-o secventi variatd cu puntile 3'-fosfodiesterice. Dar raportul si suecesiunea nucleotidelor, greutatea moleculard a DNA din diferite organisme vor fi diferite, Se inregistreaza sio cantitate nu prea mare de derivati metilati ai bazelor DNA cun polimer cu ocateni extrem de mare—zeci de mii de unitati monomere. Lanful poate fi reprezentat schematic in felul urmator: pentru baze servesc simbolurile: A,G,CIT nile vertcale corespund pentozelor, iar linia diagonal cu simbolul P reprezint& legatura fosfodiesterici —ca leagii capiitul uneiliniiverticale cu mijlocul celeilalte Locusul legirii corespunde 3'-OH si S-OH. alolololok., Lantul are o directie gio polaritate specific’ —capetele 5-OH si 3-OH care mu sunt angajate intr-o legdturd internucleotidicd. S-a convenit cd structura unei catene polinucleotidice va fi indicatia stricta de la capitul 5 spre stinga, iar cel 3'—spre dreapta. Directia 5* —- 3. Pina la mijlocul secolulni trecut enigma DNA nu era descoperiti, pe cind istoria DNA incepe cu F. Mischer. fn 1944, O.Colin, C.McLeod si M.MeCarty au demon- stat c& acizii nucleic de tipul dezoxi sunt factorul determinantin transformatile extractului de_pneumococi IIT —formele nevirulente se transformau in virulente, la adjugarea DNA extrase din formele virulente ale pneumococilor. Proprietatile virulente se transmit prin ereditate. Cuajutorulizotopilor radioactivi, Alfred Hershey si Martha Chase au demonstrat ci informatia genetica pentru replicarea virusului T, in celulele Escherichia coli e ‘transmis nu de componenta proteic’, dar de DNA. S-a constatat ef anume DNA este ‘componenta cromozomilor, purtitoarea informatiei genetice in celulele vii ‘Un merit majorla descoperitea tainelor structurii DNA ti apartine lui Erwin Chargatf, care, la sfirsitul anilor 40 al secolului trecut, a ajuns la urmStoarele concluzii: 1.Preparatele de DNA obtinute din fesuturile aceleiasi specii de organisme au componenta nucleotidic’ identicd. 2. Componenta nucleotidicd a DNA e diferita la diferite speci 3. Componenta nucleotidiedaDNA la aceeasi specie imu se modifica’ cu virsta, na depinde de alimentare side influenfa mediului ambiant. 4, Numirul resturilor de adenin’ in orice DNA, indiferent de specie, este egal cu cel altiminei A=T; G=C. Din acest raport rezultd ci A+G=T+C. Acesterelaii au faciltat infelegerea coclficari informatie’ genetice in DNA sitransmiteri de la o generatie la alta. Secventa mononucleotidelor in lanqul polinucleotidic al -99-DNA reprezinté structura sa primard, structura covalent. Aceasta structura & stabilizati: de legiturile fosfodiesterice. Structura secundara. in 1953, J.Watson si F.Crick au depistat structura tridimensional DNA si au propus mecanisimul posibil al replicatiei —un fenomen exceptional in istoria biologiei, ce a deschis calea conceptului functionarii genei la nivel molecular. Fi au analizat tabloul diffactiei razelor X, efectuate pe cristale de DNA de catre R-Franklin si M.Wilkins, au propus modelul structural, care in linii generale e justificat si consta in urmatoarele caracteristici: 1. Dou’ lanturi polidezoxiribonucleotidice se risucesc helicoidal in jurul unei axe comune, Lanfurileau sens opus, sunt antiparalele, formind o dubla elice cu orientare spre dreapta (fig,2.1). 2. Bazele azotate, hidrofobe sunt orientate spre interior gi perpendicular pe axa elicei, inelele glucidice, legate prin resturi fosfat, constituie scheletul extern al dublului helix si sunt orientate aproape sub un unghi drept fat de baze. Toate grupiirile fosfat la pH=7 sunt ionizate si incarcate negativ (fig. 2.2). 3. Cilindnul ce incadreaz dublul helix are un diametru de 20A, distanta intre bazele azotate invecinate e de 3,4 A, iar pozitia uneia fafa de alta este de 36 grade. Structura se repeti dup’ 10 nucleotide, avind o perioada de identitate (pasul) de 34A (3,4nm) (fig. 2.3.) Figura 2.1.Spirale de DNA, Figura 2.2. Medelul spiralei Figura 2.3. Modetul schematic at potrivi axel spiratet duble de DNA — bazele veupi —dubtului helte de DNA. Structura se a lee erp enh eee ~100-4. Stabilitatea dublului helix e asigurata de interacfiunile hidrofobe intre bazele azotate, precum side legiturile de hidrogen ce se stabilese intre bazele azotate de peo caten’ si cele complemen- tare de pe cealalti. Dublul helix este de tip plecto- nemical—(adied transversal in acelagi plan), simu paranemical (adica longitudinal). Legaturile de hidrogen determin primordial imperecherea spe- cificd abazelor. 5. inseetiune, dublul helix are trei straturi: a) unul inte, cu bazele nucleice; +b)unul mijlociu—glucidic—cu planurile dispu- seradiar; ) alt periferic — resturi de acid fosforie; 4) cele doud catene delimiteazi pe suprafata ‘moleculei 2 canehuri: mare si mic (fig. 2.4.. 6. Nuexisti limita in suecesiunea bazelarazo- tate din lantul polinucleotidic; 0 anumiti secven- Figura 24, Modelul spatial al dblului {8 determin’ o informatie geneticd concreti. elie de DNA. Se vdd cele 2 caneluri~ O proprietate primordial: a dublului helix mare(e) stmic(@) ¢ impachetarea specifica a bazelor azotate. 0,28 nm Hs Oven HN ON “eH atin S (ene od Ass T A | catene antiparalele- 0,29 nm A f 4 v . oO \ 029 nm ° ¢ G oH ‘Struetura unui fragment din dublul helix de DNA -101-Reiesind din limitarile sterice si din capacitatea de a forma legatura de hidrogen, se postuleazii ci adenina se imperecheaz numai cu timina, guanina cu citozina. Acest spatiu poate fi ocupat numai de perechea purin-pirimidinic’: pentru 2 purine e mic, pentru 2 pirimidine—e mare si nu pot forma legaturi de hidrogen. impachetarea depin- de si de regulile de formare a legiiturii de hidrogen. Hidrogenul ocupa o anumita pozitiein baze. Adenina nu se poate imperechea cu citezina, la fel cum guanina nu se poate imperechea cu timina, fiindcd in locul unei legituris-ar gisi doi atomi de hidro- gen, iar in alt loc—nici unul. Adenina formeaza cu timina dou legaturi de hidrogen, pe cind guanina cu citozina — trei, Orientarea acestor legituri si depirtarea dintre ele e optima pentru o interactiune puternica intre baze, Ede mentionat ca cele doud catene antiparalele ale dublului helix de DNA nu sunt identice nici dupa succesiunea bazelor, nici dupa componenta lor. Ele sunt ‘numai complementare una faja de alta, Una contine adenina, cealalté neaparat timina; guanine’ fi corespunde citozina, Investigatile efectuate la dou Universitit din Cambridge au confirmat cis-a sinttizat, ccristalizat si descifrat structura a doui fragmente de DNA deosebite. in mijlocul lor se nfli a seeventi, in care catena contine multe A, iar cen complementarii—T. F.curios faptul cd aceasti DNA are proprietiti uimitoare —e rezistent la actiunea factorilor externi. Care-i cauza? Aceeasi ot-clice de dreapta, in care A si Tin fiecare pereche sunt dispuse una fati de alta aidoma elicelor la elicopter, adic. nu sunt in acelasi plan. Efectul este neordinar: 1) mai ingust canelul spiralei; 2) NH, aA ocupiio pozitie de mijloc intre O, a dou T invecinate, formind legaturi de hidrogen in plus cu T din tan — legitura vertical ce jonctioneazi longitudinal stivele de baze azotate. Rezultio revistent mai mare la factoriinocivi ai mediului. Astfel, egiturile sunt propri i proteinelor, dar in DNA s-au stabilit pentru prima data. independent de cantitatea de apa gi forta ionicd a mediului, configuratia dublului helix al DNA se poate modifica. Este elocventi prezenta citorva forme de DNA. Forma B— spirala clasicd a lui Watson si Crick — confine 10 resturi, ca perioada de identitate e de dreapta si planul bazelor e perpendicular pe axa spiralei. Forma A - pasul —ecompus din 11 resturi si planul deviaz3 aproximativ cu 20 grade fay de perpendicular de pe axa spiralei. Se formeazii la dehidratarea formei beta. Dack A indeplineste rolul de matrice in transcriptie, apoi B —rolul de matrice la replicarea DNA (ambele sunt in confomatia anti). Forma Z ¢ risucit& spre stinga, congine 12 resturi la pas (fig. 2.5). Dublul helix are o rezistenti deosebit’, concordat cu rolul de purtitor al informatiei genetice. Nu este o structur’ rigid’, fixati pe toati lungimes ci. Ea este supus& permanent unor deformatii inteme, ce oscileazii de lao parte a moleculei laalta, adic posed’ un anumit dinamism. Acestor devieri le e caracteristicd dependenta de anturajul external moleculei de DNA. Structura tertiara, In procesul de izolare a DNA s-astabilitca in unele segmente dublul helix poate fi impachetat intr-o structurd «ridimensionali —superhelix sau forma deschisd - inelar8, ce presupune integritatea catenei, dar nu form’ geometric’. -102-ae ee Forma negativa superspralizata deDNA on mer Formarelaxati de DNA, Nigra Fe Forma poztivi superspiralizata de DNA Figura 2.6, Superspiralicarea DNA sub factlunea DNA-ginaced Figura 2.5, Compararea formelor A,B siZ de DNA. Siructarle x denschese dupa pated Spratt omentaren percha de ion, domeat @ohe 0h, ical aoa areca okt sake 30 b) Figura 27. LK mumir. In posiia(e) este gal cw I iarin )=6Dx relaxer as J — ¥ a Figura 27a, Superspirala negativa $i pocitva ‘Unele molecule ale DNA sunt liniare, altele, la virusuri, se pot transforma in inelare, cApdtind o proprietate noua, Forma inelara, fird spire, e denumité relaxatd, Pentru transformarea ei in spirale nevoie de energie. Se consideri c& energia unei_ DNA. spiralate © proportional cu pAtratul numérului de spire in helix (fig. 2.6). ‘Superspiralizarea denota functii biologice: 1) impachetarea DNA intr-o forma mai compacta decit cea relaxati; 2) determina gradul de desfacere a du- blului helix si interactiunea cu alte molecule. Superspiralizarea negativa favorizeaza desfacerea helixului. Aproape toate formele inelare din natura sunt negativ superspiralizate. O caracteristica esentiala a DNA inelar este numéarul derasuciri, adicd de cite ori un lantil va intretiiia pealtul, daca se vor proiecta pe acelasi plan (fig.2.7). ‘Acest numir (Lk: linking number) trebuic sf fic intreg, €o caracteristica tipologica si poate varia, daca intr-un lant sau in ambele se fac rupturi. S-au izolat enzime ce au atare functie.Densitatea superhelicalé (6) reprezint& relatia dintre diferent numarului de spiraliziri ALK) fafadenumarul de spire prezentein DNA relaxati (Lks) O=ALK/ Lk», Semnul negativ al densitatii superhelicale indicd superspiralizarea negativi a DNA —underwound, iar 6 pozitiv—superspiralizarea pozitiva. overwound (fig 2.7.) O particularitate distinctiva a mole- culei de DNA naturale e lungimea ei Tanful DNA al omului constituie aproxi- ‘mativ2 m; organismul dispune de apro- ximativ 10" celule. Lungimea tuturor DNA ale omului este de 2x10" km, ‘Comparim cu distanta ping la Soare— 1,44x108 km si perimetrul Pamintului 4x10 km, Unitatea de lungime egala cu 1000 perechi sau nucleotide este 0 kilo- bazi (aproximativ areo mas moleculara egald cu 660 kDa gi o lungime de 3,4 mkm) Incalzind solutia de DNA, adzugind acid sau baz, putem disocia catenele DRAW RIRORIM, SPRILIBIVIWOWA ‘DNA dibtheix / | wa 6S \A oa o~. PREG > DNA partial denaturatd hy, es \ re Cn DY ear some 2 ol Separarea completa catenclor Figura 2.7b, Denanurareareversibila $i renaturarea DNA = 104-de DNA. La o anumiti tempera- turd are loc procesul de desfacere a dublului helix - denaturarea lui. fata isne Degradarea unei Bai ‘core jumititi de structurd spitalicd are loc la Nucleazomn temperatura de topire. Dublul helix BOCAS session un i grad mare de coo- perativitate, Temperatura de topire depinde de compo- nenfa nucleotidic’. Moleculele bogate in C si G au 0 temperatur mai inal decit cele innobilate cu A si T.Dacd temperatura e mai joasi decit cea de topire, lanturile de DNA reasociaza cu formarea dublului helix, producindu- se regenerarea —renaturarea (fig 2.7.b). Aproape tot DNA in celula cucariotelor se afla in cromatina nucleului, care formeaz cromozont inaintea mitozei. Cromatina contine DNA (35%), RNA (5%), proteine specifice (60%). DNA in cromatind este legat de proteine-histone, care impacheteazi compact DNA gi formeazi unitati structurale—nucleozomi. Ble sunt sta- Dilizate de forte clectrostatice. Nucleozomii au o struc- tur asemengitoare formei discului. DNA “incolaceste” histonele. Intre nucleozomi se situ- eazi DNA de legiitura (linker) (fig. 2.8.). Nucleozomii ocupa o anumita pozitie in spatiu. Modelul impachetarii DNA innucleozomi,, cromatina, cromatide —cromozomi. mitotici este redatin fig. 2.8.a. Impachetarea DNA cu proteinele in spatiu reprezint& structura sa cuaternard. Unrol deosebit il au hertonele —proteine nehistonice. Diametrul unei superspirale de DNA cegal inmedie cu 90 A —intr-o spird sunt localiza- fe 80 de perechi de baze — pasul ei Cristalografia cu raze Roentgen a constatat ca buclele pecarese incoliceste DNA reprezinti octameri,fiecare fiind constituit din 8 molecule proteice a cite 2H, 2H., HLA siH,B (fig 2.8.b). Octamerul este infigurat de DNA (dublul helix) cu lungimea de 146 nucleotide — ieleozomul, ce recent s-a confirmat, cu ajutorul Linker DNA | Histone = 105- Cromazomi mitotic: cima | (Giametrul~ 600m) | pas Fibra de (@iametrul 30 om tS (iam 1D Figura 2.89. Modelul inpachetarii DNA inFigura 2.9. Polinucteozomii constituind tun solenoid et diametral de 30 nm HR 4 @ Figura 2.8b, Representarea spatial aproteinetor in nucleozom nucleazelor. fn cromatina eucariotelor polinucleozomii formeaza un superhelix, dispunin- du-se dupa un solenoid cu un pas de 10 nm si diametrul de 30 nm (fig. 2.9.). Molecula H, de histone este atagati de partea exterioard a catenei de DNA si de ambele capete ale DNA de legaturd. S-a stabilit c& proteinele ce formeazi octamerul nucleozomului nu se deosebesc mult la diferite specii—nu existd o diferenta esenfiald a succesiunii aminoacizilor, cea ce confirma cd nu doar impachetarea DNA constituie functia acestor proteine. in caz contrar, n-ar fi fost nevoie de a pastra timp de milioane de ani consecutivitatea aminoacizilor, fiinded orice protein cu un continurt mare de aminoacizi pozitivi, ar determina impacherarea DNA incareat negativ. in alte capitole vom examina rolul acestor histone in reglarea genelor. J.Watson F.Ctick -106-STRUCTURA RNA Acizii ribonucleici sunt produsi macromolecular, find rezultantiai_ policondensarii ribonucleatidelor. Nucleotidele se racordeaza prin fosfatdiesteric3'5'. Numarul de nucleotide variaza dela 75 ln multe mii. Structura covalenti a RNA se deosebeste de DNA prin urmitoarele 1. Restul de zahire riboza, dar nu dezoxitiboza, 2. Una din bazele azotate in RNA e uracilul si nu timina care formeazi o pereche cu adenina, De rind cu aceste baze majore, RNA mai confine baze “minore”, rezultind din | metilarea, tiolarea celor majore. 3.Molecula de RNA este monocatenari (cu exceptia virusilor). De aceea, compozi- | ianucleotidicd au se supune legitifi complementare—confinutul deadening nue egal | cualuraciluluisial guaninei cu citozina, adicd structura dubli catenari complementari | pentru RNA este exclusa. Se evidentiazit inst unele portiuni, unde complementaritatea bazelor permite organizarea in structuri duble helicoidale. Portiunile de baze necomplementare sunt expulzate in forme de bucle in afara zonelor de dublu helix. Jmpachetarea bazelor nue perfect, unele inte ele nefiind complementare, Cota dublului helix in diferite RNA variaza mult, atingind 50%. Cantitatea de RNA, spre deosebire de cea de DNA. variaza de la o celula la alta si chiar in cadrul aceleiasi celule. in functie de intensitatea proceselormetabolice. ‘Deosebim 3 tipuri de RNA: RNA mesager (mRNA) (informational, matriceal) — fiecdrei gene fi corespunde molecula sa de mRNA, de aceea acest tip de RNA este foarte heterogen. Conceptul de mRNA a fost postulat de F.Jacob si J.Monod in 1961. Studiind reglarea sintezei proteinelorla £.coli, auajuns la conctuzia prezentei unui mesager structural de durat scurtice transmite mesajul genetic din nucleu in citoplasma sare urmatoarea caracteri 1 -acest intermediar trebuie sa fie polinucleotid; 2. componenta nucteotidicd trebuie si corespundi celei din DNA ce o codificd; 3.este foarte heterogen dup lungime. Savantii nominalizati au presupusca trei nucleotide codified un aminoacid si au constatat cd masa mesageruluiinu emaimare de 500 kDa; 4. easociat temporar cu ribozomii — loc de sintezi a proteinelor; 5. se sintetizeaza si degradeazi foarte rapid. Savantii au demonstrat experimental cele argumentate si, ca rezultat, au mai conclu- zionat: ribozomii sunt structuri nespecializate ce sintetizeazé in anumit moment acea protein cate este codificati de mRNA sise afld in ribozomi, Folosind metoda hibridizarii propusa de Sol Spiegelman (1961), s-a constatat ci secventa bazelor in mRNA e complementara secventei din DNA matriceal. Lungimeacatenei de mRNA edependenta de lanful polipeptidic ce implics sintetizarea, mRNA poate si mai contind secvente neinformative la capitul 5! terminal de diferit Jungime (lider). Dacd mRNA conduce un singur mesaj, enumité monogend, dackimai multe — poligend. Ea poate contine regiuni intergene netranslabile denumite “linker” Timpul de supraviefuire e variabil (minute - ore). Nucleazcle reprezint3 enzimele ce degradeazB acizi nucleici. - 107RNA de transfer (tRNA) reprezinta 10-20% din RNA celular, fiind molecule mici (70-90 nucleotide) cu 0 mas moleculara de circa 30,000 Da. in structura primar, pe Ting cele 4 mucleotide majore (A,G,C,U), se mai intiinese pseudouridina, A,G,C metilate. Pseudouridina (vezi mai sus)-C-1 al ribozei este legata in pozitia 5 (C5) a uracilului (nu elegitura N-glicozidied, ci C-C), Sunt prezente dihidrouridina, inozina—nucleozidul ribozei sial hipoxantinei. mpi Abne HOHC As ny? HOH2C om A HO OH HO OH Inozina Dihideouridina Moleculele de tRNA reprezinti o conformatie aidoma “foil de tif", unde mai mult de 1/2 din baze sunt complementare. Toate moleculele de tRNA poseda particulartati structurale comune, fiindca toate interactioneazi in acelasi mod cu mRNA si ribozomii ‘cuenzimele ce catalizeazA activarea aminoacizilor si formarea legaturilor peptidice (fig. 2.10.) Caracteristica RNA: 1. Suntinonocatenare eu un numiir mic deribonucleotide. a» OHS 2. Contin baze minore (metilate) — Capital ‘metiarea impiedicd impachetarea unor baze capabile de alte intcractiuni, modifica “sp capacitatea hidrofoba a unor segmente de RNA, 3. Posed 4 zone de perechi comple- mentare si 3 necomplementare, expulzate in forma de bucle: a) capatul S' terminal are rest guanilic fosforilat, b) capatul 3 terminal ~ seeventa nucleotidi CCA. Aminoacidul activat se Jeaga de 3'-OH al adenozinei; ©) la capatul buclei inferioare se afl portiunea anticodon compusa din 7 baze Foes Pir-Pir-X-Y -Z, purind modificati, baz ‘Bocla antiondom variabilé, Tripletul (XYZ) ecomplementar Figura 2.1, Sirctara RNA alacu serena secvenfei nucleotidice din mRNA; Bueladihidro Bucla aditionala = 108-BuclaTyC___Buclaaminoaciiet Figura 2.14, Fotografie structurit Figura 21D, Imagineaschematicd a stcturt tridimensionate a RNA Phe din drojdi tridimensionale aiRNA Phe din drojait 4d) secventele normale din bucla TC riboziltimidilat asiguré legarea in ribozom a complexului AA -tRNA sintetazic curRNA; €) secventa de nucleotide din bucla dihidrouridinic’ recunoaste o anumita seeventa din FRNA cess leagl cu AA (RNA sintetazi. Studiile cristalografice au stabilit structura tridimensional’ a tRNA (fig.2.11.a sib). 1. Are forma de L. 2. Molecula include 2 segmente de dublu helix situate perpendicular—fiecare helix are circa 10 perechi de baze. 3. Majoritatea bazelor formeaza in afara spiralei legaituri de hidrogen deosebite. Intoractiuni tertiare apar intrc baze necomplementarc (A-A, C-G, A-C). Resturile ribozofosfat pot interactiona cu baze si intre cle (2-OH pentoza). Multe baze sunt aranjate in stive, Aceast§ interactiune hidrofoba determina arhitectonica moleculard ‘Virusii segrega RNA mono sau bicatenarin molecule native impachetate in membrana proteica (specifictate). rRNA (RNA ribozomal) sunt macromolecule flexibile si deformabile, contin mai pufine baze metilate decit tRNA; zonele duble catenare sunt intrerupte de zone monocatenare, extrem de heterogene dupa forma si marime. in functie de constanta de sedimentare distingem mai multe tipuri. Fiecare tip are structura sa tridimensional. Din totalul de RNA celularrRNA tirevine aproximtativ 75%. rRNA se leag’ cu diverse proteine, constituind o particuld ribonucleoproteick denumiti ribozom, care este atasat reticulului endoplasmatic (fig. 2.12). Ribozomii pot disocia reversibil in 2 subunitati 50S si 30S la procariote (A) si 60S- 40S la eucariote (B). Subunitatea mare integreazi RNA 238, 5S si 34 tipuri de proteine L34 (large-mare). Subunitatea mic - rRNA - 16S 5i 21 proteine S21 (small- mic’). La cucariote —respectiv, vezi fig 2.12 -109-Hho ' ag l aon 2 Nes sos x 00 mas 30s 4.300.000 Ds 1.600000 be oo De 28a Da JAN y ian uN 6 Ss = = Ss Ss > = = — wo =! i all] Te cleotide == | mutoide nti mace pace mucice 58° ®A etc 8 RNA SSRNATY TS RNA [OS RNAT TS RAT 5s RNAT 34 protene Bi proteine 45 protine 33 protine Figura 2.17. Siwetiva vibazomuli la procariote (A) yi la encariots (B) in 1987 a fost elaborat harta situarii celor 21 proteine in subunitatea 30S la E.coli. Modelul tridimensional al proteinelor e practic canonizat sie inclusin manualele contemporane de biochimic. Utilizarea metodei bombardéirii cu tritiu (planigrafii cu tritiu) a permis stabilirea perfect a proteinelor expuse la suprafata subunitatiiribozomale sicelor din interior. S-a constatat ca suprafetele de contact ale subunitatilor la asociere in ribozomul integru nuau proteind, adicd subunititileinteractioneazi numai cu RNA tl lor. Studiile mai recente (1996) au confirmat conturul subunititii 30 S in corespundere cu ultimele date ale microscopiei crioelectronice, ceea ce a permis corectarea hartii ‘ridimensionalea interporitiei proteinelor in aceasti subunitate. Pe suprafata fiecatui ribozom se profileazi 2 situsuri: situsul aminoacidic (A) si situsul peptidilic (P). Experientele efectuate de Masayasti Nomura, prin metoda asambtarii subunitatii mici, au demonstrat ci: 1) Toatd informatia necesarii pentru asamblare se confine in componentele ei structurale. 2) Pentru asamblare nu sunt necesari factorii neribozomali -110-