A.1.

CULTIVAREA BACTERIILOR PE MEDII SOLIDE

O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din inmultirea unui singur microb pe un mediu,
vizibila in general cu ochiul liber.

Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substante
gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La acest mediu
simplu se pot adauga diferite ingrediente (sange de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc) pentru a putea
cultiva bacteriile pretentioase.

Caracterele culturale sunt foarte importante in identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber,
fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, in general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul,
consistenta, aderenta la mediu, activitatea hemolitica si unele modificari pe care
microorganismele le produc in mediul respectiv.

Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate, care se suspenda omogen in ser fiziologic se
numesc colonii de tip S (smooth), pe cand coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini
neregulate si care aglutineaza spontan in ser fiziologic - colonii de tip R (rough). In general, cu unele
exceptii, coloniile S apartin tulpinilor virulente, pe cand cele R sunt nevirulente.

Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni intr-un anumit
produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece in multe infectii criteriul de implicare etiologic este
numarul bacteriilor in produsul de examinat (infectii urinare).

A.2.

mediu pt. cultivarea micobacteriilor

Medii de cultivare a bacteriilor

Medii de cultivare a bacteriilor

Citrat -
 Medii de cultivare a fungilor

A.3.
Pentru mediile solide:

1.Prin dispersie/epuizare

2.In sector de cerc

3.Prin intepare

A.4.
Medii diferentiale diferentiaza specii si genuri bacteriene pe baza unor caractere biochimice.

TSI:se identifica bacteriile pe bazafermentarii glucozei,lactozei si zaharozei..(lo mevina)

MIU:otility indole urease-identifica bacteriile pe baza motilitatii procedurii de indole

CITRAT:-identifica bacteriile pe baza _(lo mevina)_________ sau nu a citratului

A.5.
Antibiograma

a)difuzimetrica-cea mai folosita in bacteriologie si se bazeaza pe principiul case produc 2

fenomene concomitant in momentul in care o bacteria este depusa pe suprafata unui mediu
de cultura.

Materiale necesare:-cultura bacteriana de insamantare

-pipete

-anse

-tampoane

-ser fiziologic
-Muller-Hinton

-disc dispenser

-pense

-discuri

-bec de gaz

-frigider

-termostat

-rigla

Etapele:1.Se scot din frigider discurile impregnate cu substante antimicrobiene si se mentin la

timp o perioada de 1-2 ore pentru echilibrare termica.

2.Se usuca suprafata mediului de cultura mentinand placile cu capacele intredeschise timp de
20-30 minute latemperatura de 37 grade Celsius

3.Se prepara o suspensie a tulpinii bacteriene de testat in ser fiziologic folosind doar colonii
izolate,suspensie care se adduce la o turbiditate nefelometrica 0,5 unitati Mac_Farlond .

4.Se insamanteaza placile ,se imerseaza un tampon in suspensia bacteriana si se scurge

ecesul prin presarea tamponului de peretii eprubetei,apoi se descarca tamponul pe mediul de
culturain linii paralele pe toata suprafata mediului.

5.Se lasa o placa insamantata 3-5 minute

6.Se dispun cu ajutorul unei pense discuri impregnate cu substanta microbiana pe suprafata
mediului la aprox. 15-20 de minute.

7.Se lasa placile cu mediul de cultura in thermostat la 37 grade Celsius timp de 16-20 ori.

8.Se scot placile din thermostat si se masoara diametrele zonelor de inhibitii(not sure that s
the word)

Interpretarea-3 categorii

1.Sensibila (S)-inseamna ca bacteria este sensibila si poate fii distrusa de calitatea standard a
antibioticului

2.INtermediara(I)-inseamna ca bacteria poate fii distrusa doar la administrarea de doze mari

de antibiotic

3.Rezistenta(R)-bacteria nu poate fi distrusa de antibioticul respective ,indifferent de doza.

A.6.
Se stabileste o valoare a CMI-ului prin utilizarea unui strip care se pune pe suprafata mediului
putand identifica sensibilitatea sau rezistenta la antibiotic.

Strip-ul are o latime de 5 mm , lungime de 60 mm care pe o parte e inscriptionat cu o scala

CMI si 2 litere care indica antibioticul iar pe cealalta parte sunt fixate concentratii de substanta
antimicrobiana uscata.
In momentul in care strip-ul e plasat pe mediu,cantitati de substanta antimicrobiana se
elibereaza in mediu si se obtine un gradient continuu si exponential a concentratiei de
substanta antimicrobiana.

Va aparea o zona numita ELIPSA in jurul strip-ului care va intersecta strip-ul intr-un punct de
pe CMI.

Etapele E-TEST:

-1->5 comun cu difuzimetrica

-6-> sedepun strip-urile E-test pe suprafata mediului de cultura cu ajutorul unor pense.

Materiale:

-se folosesc strip-uri in loc de discuri si se foloseste congelator in loc de frigider

A.7.
1.etalare-intindere intr-un strat subtire si uniform a produsului pathologic pe suprafata unei
lame de sticla curate

2.uscare-la temperatura camerei pentru catea minute

3.fixare:se face in 2 moduri:-1.chimica folosind lichide fixatoare

-2.termica-trecerea lamemelor de sticla pe o flacara la un bec de gaz

A.8. Genul Staphylococcus

Habitat

S. aureus se poate multiplica la nivelul tegumentelor i mucoaselor (n special n zonele piloase i la nivelul
vestibulului nazal).

Morfologie

Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, cu diametrul de 0,6-1,5 m. Pe frotiul realizat din cultura pe medii solide se
poate remarca o dispoziie n grmezi neregulate. n frotiurile realizate din culturi pe medii lichide sau din produse
patogene, se pot dispune n lanuri scurte, perechi sau coci izolai. n culturile cu o vechime mai mare de 2 zile,
stafilococii pot aprea ca i Gram-variabil sau chiar i Gram-negativi la limit.

Caractere de cultur

Se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, au
diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat. Pigmentarea devine mai pronunat
dup meninerea plcii cu mediul de cultur nc 24-48 ore la temperatura camerei.

Caractere biochimice

Stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza,
lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid.
 Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus
(manit-pozitiv) i SCN (manit-negativ). Stafilococii sunt catalaz-pozitivi

Caractere de patogenitate

S. aureus apare mai frecvent implicat n producerea unor infecii, de obicei la nivelul
tegumentelor i mucoaselor, nsoite de formarea de puroi, dar cu potenial de generalizare.
Tulpinile de S. aureus au capacitatea de a adera la mucoase, epitelii, endotelii, n special
datorit prezenei acidului lipoteichoic, proteinei A i altor adezine.

A.9. Group A Beta Hemolytic Streptococci (S.pyogenes)

These organisms are so-named because they possess the Lancefield group A antigen, and they are beta-
hemolytic on blood agar. They are also called streptococcus pyogenes (meaning pus-producing) and cause the
diseases "strep throat", scarlet fever,rheumatic fever and post-streptococal glomerulonephritis.

Habitat: live on the skin, Upper respiratory tract of humans, Not considered part of normal flora but may be
carried on nasal,pharyngeal, and , sometimes anal mucosa

Transmission: Person to person by direct contact with mucosa or secretions or by contaminated droplets produce
by coughs or sneezes

On culture, morphology: Grayish, white,transparent to translucent, matte or glossy,large zone of beta hemolysis

Identification: The PYR and Camp tests can be used to identify group A and B streptococci, respectively .Use of
the bacitracin disk is no longer recommended for S. pyogenes, because groups C and G streptococci are also
susceptible to this agent.

S. pyogenes is the only species of beta hemolytic streptococci that will give a positive PYR reaction

Virulence Factors - So basically, the antigenic components of this group A strep are located in the bacteria's
cell wall! And they are include:

1. M protein is the major virulence factor for the A group strep, it inhibit the activation of compliment and protect
the bacteria from phagocytosis.

2. Streptolysin O and Streptolysin S This enzymes are able to destroy RBC and WBC and this is the reason for the
beta hemolysis

3. Pyrogenic exotoxin responsible for the "Scarlet fever" disease

4. Streptokinase- activates the enzyme plasmin which breaks down the fibrin blood clots.

A.10. Streptococcus Pneumoniae

Non Lancefield-antigen classification, Gram positive Diplococci , Alpha hemolytic.

This organism is very important one, because is a maor cause of bacterial pneumonia and meningitis in adultsI also
in otitis media in children.

So if Group B strep is for Babys So strep Pneumoniae is to Parent

Important! This Gram positive is not just a strep on the microscope is Diplococci!!!

Habitat: Colonizes nasopharynx of humans

Transmission: Person to person spread by contact with contaminated respiratory secretions. Once exposed,
recipient may become colonized , with potential for subsequent development of infection. Pneumonia occurs
by the aspiration of the organism into the lungs
 On culture, morphology: Small , gray, glistening, colonies tend to dip down in the center and resemble a
doughnut as they age, if organism has apolysaccharide capsule, colony may be mucoid,alpha hemolyitc

Identification: 2 main tests Optochin sensitivity(sensitive) and Quellung reaction.

Virulence Factor: the major virulence factor of S.pneomoniae is the polysaccharide capsule that has 83 different
serotypes, so surviving an infection with this organism provide immunity to 1 out of 83 possible capsule type!.

Pathogenicity: Adult's meningitis, pneumonia and sepsis, also otitis media in childrens.

A.9+10: Genul Streptococcus

n funcie de hemoliza produs pe agar snge, streptococii se mpart n trei grupe: cei care produc hemoliz,
hemoliz i streptococii hemolitici.

3.1. Habitat

Streptococii piogeni se pot gsi la nivelul tractului respirator superior uman. O parte dintre speciile de
streptococi colonizeaz exclusiv suprafaa dentar i devin detectabile numai dup erupia dentar.
3.2. Caractere morfotinctoriale

Sunt coci Gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1 m, imobili, nesporulai. Se divid ntr-un
plan perpendicular pe axa lor lung i sunt aranjai n lanuri (de pn la 50 elemente bacteriene). Unii
streptococi elaboreaz o capsul polizaharidic comparabil cu cea pneumococic.
Cele mai multe din speciile de grup A, B i C produc capsul din acid hialuronic. Capsulele sunt mai evidente n
culturile tinere i mpiedic fagocitoza. Pilii streptococici sunt acoperii de acid lipoteichoic i au rol n
aderen.

Caractere de cultur

Cei mai muli streptococi cresc pe medii solide i formeaz colonii discoide, de tip S, cu diametrul de 1-2 mm.
Streptococul piogen beta-hemolitic de grup A formeaz colonii punctiforme. Speciile care produc material
capsular adeseori dau natere unor colonii mucoide (de tip M). Cei mai muli streptococi sunt aerobi, facultativ
anaerobi. Peptostreptococii sunt strict anaerobi. Necesitile nutritive variaz mult n funcie de specie.
Streptococii implicai n patologia uman sunt n general germeni pretenioi, necesitnd o varietate de factori
de cretere. Un mediu de cultur util (att ca mediu mbogit ct i ca mediu diferenial) este mediul geloz-
snge

3.4. Caractere biochimice

Unul dintre caracterele biochimice importante este reprezentat chiar de producerea hemolizei. Streptococii
piogeni sunt germeni pretenioi care necesit pentru dezvoltare adugarea n mediul de cultur a
vitaminelor, aminoacizilor, glucozei sau cel puin utilizarea ca mediu de cultur a gelozei-snge sau a
bulionului nutritiv. Streptococii degradeaz glucoza pe calea glicolitic. O mare parte dintre specii pot
fermenta i alte tipuri de zaharuri i alcooli zaharai utiliznd o serie de enzime inductibile (sintetizate doar n
prezena carbohidratului respectiv i n absena glucozei). n mod uzual streptococii piogeni sunt
sensibililabacitracin. Sunt catalazo-negativi.

Boli localizate

n acest grup sunt incluse:

Faringita streptococic care este cea mai obinuit infecie datorat streptococilor beta-hemolitici. Streptococii
viruleni de grup A ader la epiteliul faringian prin intermediul acidului lipoteichoic. Impetigo streptococic
reprezint o infecie localizat la nivelul straturilor superficiale ale pielii, n special la copii. La majoritatea
pacienilor nu se gsete o leziune predispozant. Totui, amintim ca factori de risc generali mediul umed i igiena
deficitar. Clinic avem de-a face cu vezicule, pustule sau bule ce se rup i formeaz o crust glbuie, durere uoara
sau disconfort i prurit.
Celulita streptococic (aa cum tim, poate fi i stafilococica) este o infecie acut a pielii i esutului subcutan.
Clinic, pacientul se prezint cu durere, eritem ce se extinde rapid, edem, febr, limfadenopatie regional.

A.11+12.Genul Neisseria.
1. Definiie. ncadrare
 Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exemplu Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella.
n genul Neisseria, speciile importante pentru patologia uman sunt N. meningitidis (meningococul) i N.
gonorrhoeae (gonococul), dar se pot aminti i
N. lactamica, N. sicca, N. subflava, Neisseria bacilliformis etc. Exist i o specie
(N. elongata) n care tulpinile au aspect cocobacilar i sunt oxidaz-negative.

2.1. Habitat. Caractere fiziologice

N. lactamica a fost evideniat la nivel nazal sau faringian n cazul a 3-40% din purttorii sntoi. Studii
epidemiologice arat c prezena acestei bacterii poate avea efecte favorabile (nregistrndu-se activitate
bactericid seric ndreptat mpotriva N. meningitidis; studiul s-a efectuat iniial pe oricei, ulterior pe
oameni

2.2. Caractere morfotinctoriale

Att meningococul ct i gonococul sunt diplococi Gram-negativi, reniformi, imobili, nconjurai de o

structur capsular comun, cu o structur de polifosfat sau polizaharid-polifosfat (n cazul meningococului),
situaie n care capsula este mai evident. n funcie de structura capsulei, exist mai multe serogrupuri.

2.3. Caractere de cultur

Ambele microorganisme au nevoie n vederea izolrii de utilizarea unor medii de cultur mbogite,
necesitile nutritive fiind mult mai mari n cazul gonococului (exist tulpini de meningococ care se pot
dezvolta pe medii simple, cu sruri minerale, lactat i aminoacizi). Principial se pot multiplica n cazul folosirii
mediului Mueller-Hinton (amintit i la antibiograma difuzimetric), la o temperatur de incubare de 35-37C i
n condiiile unei atmosfere de 3-10% CO2. Gonococul nu se multiplic n lipsa unor surse energetice (glucoz,
piruvat, lactat). Coloniile apar n 24-48 de ore, mai rapid n cazul meningococului.

2.4. Caractere biochimice

Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu, gonococul
poate metaboliza glucoza (nu i maltoza), n timp ce meningococul metabolizeaz ambele zaharuri
menionate.

Produc citocrom-oxidaz, ceea ce reprezint un test cheie n identificare; se utilizeaz de exemplu benzi de
hrtie de filtru mbibat cu reactiv, respectiv tetrametil-p-fenilendiamin. Reacia pozitiv apare n circa 10
secunde.

3. Patogenie i patologie specific. Principalele afeciuni produse

Neisseria gonorrhoeae

Infeciile gonococice continu s reprezinte o problem important de sntate public inclusiv n rile cu
o economie dezvoltat. Acest fapt se datoreaz i apariiei/rspndirii tulpinilor de gonococ rezistente la
antibiotice/chimioterapice i existenei unui numr important de infecii asimptomatice (n special la femei).

A.11. Neisseria meningitidis

Also called meningococcus , causing meningitis and life threatening sepsis (meningiococcemia) .When we
suspect for Meningitis CSF will be our specimen of choice.

There are High risk groups for meningococcus which are :

-Infant from 6 month to 2 years

-Army recruits

Habitat: exists as normal flora (nonpathogenic) in the nasopharynx of up to 5-15% of adults.

Transmission: spread through the exchange of saliva and other respiratory secretions during activities like
coughing, kissing.
On culture, morphology: Form transparent, non-pigmented, non-hemolytic colonies on chocolate blood
agar in 5% CO2 , Capsule indicated by large mucoid colonies
 Identification: Neisseria grow best on a heated blood agar called "chocolate agar" but the classic media for
Neisseria culturing is Thayer-Martin VCN its a selective media for Neisseria.Also N.meningitidis is able to
produce acid from glucose and maltose metabolism!-made of chocolate agar with certain antibiotics that
inhibit other organisms.
Virulence Factor: virulence factors include:

1. Capsule: A polysaccharide capsule that surround the bacteria and is antiphagocytic as long as there is no
antibody against the capsule, the meningococcal capsule has 9 serotypes (meningitides caused by typeA, B
and C)

2. Endotoxin Lipopolysaccharide (LPO)- this endotoxine causes destruction of blood vessels

(hemorrhage)and sepsis.

3. IgA1 protease only in pathogenic type of Neisseria,this enzyme cut the IgA to half.

Pathogenecy:
1. Meningococcemia intravascular multiplication od Neisseria meningitides that will cause high
fever, joint pain, and muscle painthat eventually will cause a septic shock (Friderichen Syndrome)
2. Meningitis This is the most common form of meningococcal disease . lumbar puncher will be
performed in order to have a SCF specimen.

A.12. Neisseria Gonorrhoeae

Also called Gonococcus, causes the 2nd most common sexual transmitted disease (after chlamydia)

Habitat: Only present in humans; not present in environment or other animals, and is not present in the
normal flora. Doesnt colonize vagina in post-pubescent girls.Can be also colonized in the throat and
rectum.
Transmission: Sexual transmission - Once attach to non-ciliated cells, multiply rapidlyand spread up
urethra (male) or through cervix (female).
On culture, morphology: Colonies may vary in diameter from 1 to 4.0 mm after 48 hours owing to the
formation of different colony types (designated T1, T2, T3, T4). The colonies are smooth and
nonpigmented.
Identification: N.gonorrhoeae is able to ferment only glucose (not maltose), oxidase positive.
Virulence Factor:

1. Pilli: N.gonorrhoeae has a complex genes coding for their pilii.These genes undergo multiple
recombinations , resulting in the production of a lot of variable of amino acid sequence and thats how it
will protect the bacteria against the specific immune system (the anti-bodies)

2. Protein II outer membrane protein which involve also in adherence of the bacteria to the host cells.

Pathogenecy: is different between male and female:

In male:A man who had unprotected sex with an infected person can acquire Gonococcus infection.The
organism will penetrate the mucus membranes of the urethra(urethritis) some men may be asymptomatic
but most of them will complain of painful burning on urination and purulent ureteral discharge.

In females:Like men women also develop a ureteral infection with painful burning on urination andpurulent
ureteral discharge. But in women is more likely to be asymptomatic with minimal ureteral discharge. And has
some serious complication.

B.2.Sterilizarea prin cldur umed; metode, presiune,

temperatur, aplicaii
Sterilizarea prin caldura umeda este cea mai eficienta metoda de sterilizare si are ca mecanism coagularea
proteinelor si degradarea enzimelor..

Metode:autoclavare(120,30 min,variante),tindalizarea(65-70,o ora 3 zile succesiv)

Pasteurizare si fierberea.
B.3. Sterilizarea prin cldur uscat; metode, presiune,
temperatur, aplicaii.

Sterilizarea prin caldura uscata are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene:

-incalzire la incandescenta(la rosu)-ansabacteriologica,spatula;flambare(nu se atinge

incandescenta)-portansa,eprubete,flacoane,pipete Pasteur

-sterilizare cu aer cald(in etuva, 180,o ora)-obiecte de sticla,portelan,pulberi inerte

termostabile,uleiuri anhidre,instrumentar chirugical

-incinerare(ardere cu obtinere de cenusa)-materiale de plastic,reziduuri organice solida,cadavre

gunoi.

B.1.Periculozitatea si masuri de protective in laboratorul de

bacteriologie
Mediul de cultivare reprezint un substrat nutritiv, de complexitate diferit, care favorizeaz
creterea i dezvoltarea microorganismelor n condiii artificiale, de laborator.

Cerine minime, obligatorii:

1. S asigure cantiti optime de ap i substane nutritive necesare creterii i multiplicrii

microorganismelor;

2. S asigure sursa de carbon i energie;

3. S asigure sursa de azot necesar biosintezei acizilor nucleici i proteinelor;

4. S conin sruri minerale, cu rol n meninerea echilibrului ionic al celulei (Na +, K+, Ca2+,
Mg2+, Mn, Fe2+, Co2+);

5. S asigure factori de cretere necesari pentru dezvoltarea unor microorganisme cu exigene

de cretere;

6. S ofere un pH optim pentru dezvoltarea microorganismelor;

7. S ofere condiii de aerare corespunztoare tipului de metabolism respirator al

microorganismului care urmeaz a fi cultivat;

8. S fie steril i repartizat n recipiente sterile.

B.5.Clasificarea mediilor de cultura

1.Dup consisten:
medii lichide;

medii solide;
 medii semisolide (ex. mediu OMS, mediu cu gelatina);

medii deshidratate.

2.Dup provenien:
medii naturale -lichide: must de mal, lapte;

-solidificate: cartof glicerinat

medii artificiale sunt medii cu compoziie chimic semidefinit, care conin o baz natural
(lichide: bulion, ap peptonat; solidificate: geloz, gelatin).

3.Dup complexitate i scopul utilizrii:

Medii uzuale simple (ex. bulion simplu, agar nutritiv);

Medii speciale (sunt medii cu grade diferite de complexitate care permit creterea
preferenial a anumitor specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme dintr-o prob
sau evidenierea anumitor caractere particulare de metabolism ale microorganismului
cultivat):

medii selective conin unul sau mai muli ageni inhibitori reprezentai de colorani,
antibiotice, sruri biliare care pot limita sau inhiba multiplicarea anumitor specii de
microorganisme dintr-o prob cu ncrctur microbian mixt (mediu BSA, mediu
MacConkey);

medii de mbogire -ofer condiii prefereniale de cretere pentru anumite specii

bacteriene, care se vor multiplica mai rapid dect microorganismele asociate (ex.
geloz-snge, geloz chocolat);

medii difereniale - evideniaz anumite particularitai metabolice, utile n identificarea

unei anumite specii de microorganisme: sistemele multitest;

medii de transport care asigur supravieuirea tulpinilor microbiene n proba recoltat

pn n momentul nsmnrii (ex. mediu Cary-Blair);

medii de conservare sau de ntreinere care asigur supravieuirea microorganismelor n

laborator pe o anumit perioada de timp (ex. mediu OMS, mediu YPG).