4. METODOLOGIA En el presente estudio se utilizé el extracto lipidico de a semilla del capulin, llevandose a cabo la caracterizaci6n fisica y quimica de! mismo de acuerdo al siguiente ‘SEMILLA INTEGRA esquema de trabajo: PARAMETROS. FISICOS Isis PROXIMAL, Es DESENGRASAR FARINA DESENGRASADA ‘PARAMETROS GRASA PERFIL DE FISICOQUIMICOS CRUDA |_AciDos GRasos HIDROGENACION REFINACION GRASA HIDROGENADA ACEITE REFINADO PROCESO DE DESTOXIFICACION IOENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA BIOENSAYO DE TOXICIDAD SUBAGUDA Figura 1. Diagrama de trabajo general 28En la Figura 1, tenemos el plan de trabajo en forma de diagrama de flujo, que muestra un panorama general; por consiguiente, a continuacion se describen los puntos mas relevantes, de cada uno de los bloques de proceso (sombreados). Una vez que se cuenta con suficiente semilla de capulin, se separa de manera manual, la céscara de la almendra. De trabajos previos, se sabe que aproximadamente el 25-30% de la semilla corresponde a la almendra, por lo que si partimos de 4 Kg. de semilla, se podré obtener aproximadamente 1/2 titro de grasa. En esta fase del estudio se obtendran algunos parémetros fisicos (Moreno. 1984). Anilisis proximal Una vez homogéneo nuestro material, se toma una muestra representativa y se muele para obtener una harina de almendra integral, a la cual se le determinaron: humedad, proteina, grasa, fibra, cenizas y carbohidratos, de acuerdo a los métodos establecidos en el AOAC (Bateman, 1970; Herlich, 1990). Desengrasar Contando con suficiente almendra de capulin, se fraccioné en un molino Thomas-Willey Model 4, usando una malla con aberturas de 3mm de diametro. La harina obtenida se colocé en un cartucho de papel filtro y se introdujo en un aparato de extraccion continua tipo Soxhlet, durante 24 horas, aproximadamente, utilizando come disolvente hexano (grado Q.P.), calentando a ebullicién moderada con fa ayuda de una canastilla eléctrica (Lucas, 1985; Akoh and Min, 1998). Una vez que se cuente con la micela el disolvente se elimina en un rotavapor de tal forma que se obtenga tanto la grasa cruda como la harina desengrasada de la respectiva almendra de capulin, la cual fue sometida a otro estudio, Pardmetros Fisicoquimicos Ala grasa cruda, se le determinaron tanto indices fisicos como quimicos mas comunes, como son: punto de fusién, gravedad especifica, Indice de yodo, indice de saponificacién, entre otros (Swern, 1979: Conca, 1995; Akon and Min, 1998), con la finalidad de poder caracterizar la fraccion lipidica de la almendra de capulin. 2»Perfil de acidos grasos Para una mejor caracterizacién de la grasa, se obtendra el perfil de dcidos grasos, contemplando la confirmaci6n de la presencia de un acido graso poli-insaturado no comin de alto peso molecular (Comes et al, 1992; Castillo, 1997; Akon and Min, 1998). Ala vez, este procedimiento se realiz6 en la grasa hidrogenada; asi como en el aceite obtenido det proceso de refinacién: Hidrogenacién Al confirmarse la presencia de un Acido graso altamente poliinsaturado y un alto indice de yodo, a una parte del aceite crudo de capulin, se sometid al proceso de hidrogenacion, donde se realizé un seguimiento, tanto del perfil de acidos grasos y el respectivo indice de yodo (Swem, 1982; Bemardini, 1992) Refinamiento A otra parte del aceite crudo de capulin, se sometid a un proceso basico de refinacion, © sea: desgomado, neutralizacién y blanqueo (Andersen y Williams, 1965; Swern, 1982), con ta finalidad de obtener el aceite de capulin refinado. Desgomado Mezclar el aceite con un 3% de acido fosférico al 0.1%. Calentar la mezcla a 54°C y separar por centrifugacién a 4000 r.p.m. durante 20 minutos Neutralizacin Para neutralizar el total de acidos grasos (expresados como % de acido oleico), adicionar al aceite hidréxide de sodio al 15%. Se celienta la mezcla en bafio Maria a 54°C por 5 minutos. Centrifugar la mezcla a 4000 r.p.m. por 20 minutos. Para realizar el lavado del aceite, éste se mezcla con agua caliente en una proporcién del 3% y se somete a una nueva centrifugacién bajo las mismas condiciones. Blanqueo Afiadir a la mezcla 2% de silicato aluminico y combinarlo con 0.4% de carbén activado. Separar por filtracién rapida con papel Whatman de celulosa del No. 541 y finalmente pasar el aceite por una fitracién al vacio con un embudo milipore de tamafio de poro "M” (ASTM 10-15). 30Toxicidad aguda Contando con aceite crudo, hidrogenado y refinado de la almendra de capulin, se procedié a realizar el bioensayo de toxicidad aguda, ulilizando ratones y administrandoles por via oral, dosis relativamente altas, que nos permitieran considerar, de no presentarse efectos adversos, que nuestro material de ensayo era practicamente no t6xico o relativamente inocuo (Repetto, 1991; Klaassen et al, 1986). Esta fase det trabajo es un punto de decision; ya que aquel material que no produzca resultados satisfactorios, no podra pasar a la evaluacién de toxicidad subaguda y de ser necesario se tendria que realizar un proceso adicional de destoxificacin. Toxicidad subaguda Una vez que se cont6 con material que hubiera pasado satisfactoriamente la evaluacién de toxicidad aguda, se realizo el bioensayo de toxicidad subaguda, utilizando también ratones, pero en este caso se dosificé el material a ensayar, por espacio de minimo un mes 0 28 dias (Repetto, 1991; Klaassen et al, 1986). La dosis fue repetitiva, o sea, diariamente, par lo cual el material a ensayar se incorporé en el alimento normal de estos animales (pellets). En este bioensayo, ademés de evaluar los mismos sintomas clinicos de la toxicidad aguda, se observaron indices de crecimiento y aprovechamiento; asi, como parametros hematolégicos (Rothschild, 1987; Tellez, 1999). 4.4 Caracterizacién Fisicoquimica, 4.4.1 Punto de fusién. a) Materiales. * Capilares de vidrio (1 mm de diémetro interno}. * Lente de aumento de vidrio. + Partilla de calentamiento y agitacién. * Termémetro graduado (minima division de 0.2°C) 31b) Determinacion. Llenar un capilar con fa muestra hasta tener una columna de aproximadamente 10 mm (0.2 mi) de longitud. Sellar el capilar a la flama cuidando de no quemar la muestra. Guardar en condiciones de refrigeracién (4-10°C) durante 16 horas. Tomar el capilar y atarto al termémetro de tal manera que el fondo de la columna de la muestra en el capilar coincida con el bulbo del termémetro. Suspender en un recipiente de 600 mi Ileno a la mitad de agua. En e! caso de tener una idea aproximada del punto de fusién de fa muestra, comenzar la determinacién a 10°C por abajo de! mismo. Comenzar el calentamiento a una tasa de 0.5°C/min, llevando a cabo una agitacién moderada para lograr homogeneidad en dicho calentamiento, Tomar como punto de fusién la iectura en el termometro a la cual la muestra se vuelve transparente. Generalmente, éste no es un punto en ta escala, sino mas bien un rango. Reportar dicho rango. 4.1.2 Indice de refraccién. a) Material. * Refractémetro de Abbé OPL No. 2,154. ¢) Determinacién. Para calibrar la escala del prisma se lleva a cabo la determinacién del indice de refraccién con agua destilada. La escala izquierda debera indicar 0% mientras que la derecha 1.333 a la temperatura de 20°C. La temperatura a la cual debe funcionar el refractémetro es de 20°C. Para tener la escala del prisma a una temperatura constante, se puede usar una circulacién de agua, la cual debe entrar por la parte inferior y salir por la superior. La temperatura del prisma viene indicada por el termémetro. 32Para leer el indice de refraccién se limpia la superficie del prisma mediante un algodén o tela impregnado ligeramente con alcohol o éter. Colocar el refractémetro frente a una fuente luminosa que puede ser de luz natural o artificial, la cual es conveniente ya sea eléctrica 0 de sodio. Levantar el espejo metalico y observar por el ocular. El campo debera aparecer uniformemente iluminado. Girando el botén izquierdo se hard visible una linea fronteriza con una zona clara inferior y una oscura superior. Tal linea debera coincidir con él punto de interseccién de la cruz. En el ocular se lee tanto la concentracién de sdlidos solubles (para e! caso de sustancias azucaradas) como el indice de refraccion. La lectura de mantequilla y grasa se debe hacer con fa escala de! prisma manteniendo la temperatura de 40°C. La del aceite a 25°C. El numero de refracci6n determinado con la mantequilla y margarina no se leen directamente del aparato. Se debe ajustar con {a tabla correspondiente para el indice de refraccién, 4.4.3 Indice de acidez. a) Materiales y reactivos. + Matraces Erlenmeyer de 250 ml + Bureta graduada de 50 mi + Etanol. + Solucion indicadora de fenolftaleina al 1% + Hidroxido de sodio 0.1 N. b) Determinacién, Neutralizar 50 m! de etanol con NaOH 0.1 N, usando fenolftaleina como indicador, hasta obtener una coloracién levemente rosada. Pesar de 1 a 10 g de aceite o grasa fundida en el matraz Erlenmeyer y afiadir el etanol neutralizado. Titular con NaOH 0.1 3BN agitando constantemente hasta que el color rosa permanezca durante 16 segundos, Preferentemente, la titulacién no debe consumir mas de 10 ml, de otra forma se pueden separar las 2 fases. Esto no ocurre si se usa alcohol neutro caliente como disolvente, C) Calculos. Indice de acidez (mg KOH/g muestra)= ml NaQH * N NaOH * 56.1 gmuestra En el caso de querer expresar el indice de acidez como % de acide oleico se usa fa siguiente expresion: % Acido oleico = ml NaQH +N x “100 g muestra Ambas expresiones se retacionan aproximadamente de la siguiente forma: Indice de acidez (mg KOH/g muestra) = 2 x % Acido oleico 4.1.4 Indice de yodo (Método de Hanus). a) Fundamento. El indice de yodo es la cantidad de yodo absorbida por gramo de grasa o aceite. Constituye una medida de! grado de insaturacién (numero de dobles enlaces). Los acilgliceroles de tos Acidos grasos insaturados presentes en la grasa (principalmente los de la serie del dcido oleico) se unen mediante sus dobles enlaces una cantidad definida de monobromuro de yodo (reactivo de Hanus), el cual es afiadido en exceso en la determinacién. La cantidad de halégeno restante es titulada con solucién valorada de Na,S2Ox y por diferencia con un bianco se obtiene la cantidad de monobromuro de yodo adsorbido por la muestra (Egan, 1991; Hart, 1991). 34b) Material y reactivos. + Matraces Erlenmeyer con tapon de teflon de 250 ml + Probeta de vidrio de 10 mi + Buretas graduadas de vidrio de 50 mi + Balanza analitica. « Acido acatico glacial. * Yodo + Tiosulfato de sodio. * Bromo, * Solucién de yoduro de potasio al 15% wiv. * Solucion de almidén al 1% wiv. © Cloroformo, + Acido clothidrico 1N. + Dicromato de potasio c) Preparacién de solucién de tiosulfato de sodio 0.1N. Disolver 25g de NazS2055H20 en 1 litro de agua destilada. Llevar a ebullicién moderada y mantener durante 5 minutos. Transferir en caliente a un frasco contenedor (de preferencia de color mbar) previamente fimpiado con mezela crémica y enjuagado con agua destilada hervida. Guardar en la oscuridad en un lugar templado. No regresar residuos de reactivo al frasco. Pesar en balanza analitica 0.2000 a 0.2300g de K2Cr20; (secado a 100°C durante 2 horas) en matraz Erlenmeyer. Disolver en 80ml de agua destilada junto con 2g de KI. Afiadir 20m! de HC! 1N y guardar inmediatamente en la oscuridad durante 10 minutos. Titular con fa solucién de NazSzOy5Hz0, afiadiendo unas gotas de solucién indicadora de almidén al 1% hacia e! finat de {fa valoracién (pasando de color amarillo paja a azullverdoso primero y al final a azul).(Heltich y Ramos) Calcular la normalidad de la solucién de Na2S203-5H20 mediante la siguiente formula: 38gK26r07.* 1000 ml NazSz03* 49.032 d) Preparacién de la solucién de Hanus. Es posible utilizar directamente el reactivo de Hanus comercial de la marca Hyce! de México S.A. de C.V. con el numero de catalogo 1356. Disolver 13.615 g de yodo en 825 ml de Acido acético glacial, con calentamiento. Enfriar y titular 25 ml de esta solucién con tiosulfato de sodio 0.1N usando almidén como indicador. Por otro lado, se prepara una solucién acética de bromo adicionando 3 mil de bromo a 200 ml de acido acético glacial. Se toman 5 ml de esta solucion y se le adicionan 15 ml de KI al 15% y se titula con tiosulfato de sodio 0.1N usando almidén como indicador. Calcular el volumen de la solucién acética de bromo requerida para adicionarla a los 300 mi de fa solucién acética de yodo, de manera que la solucién final contenga el doble de halégeno, usando la siguiente formula: x= BIC donde: x = mide soluci6n acética de bromo. B = 300 por equivalente de tiosulfato de 1 ml de solucién de yodo. C = Equivalente de tiosulfato de 1 mi de la solucién de bromo. x = 800 * (B/25/C/5) ) Procedimiento. Pesar 0.2500 g de muestra en un matraz Erlenmeyer con tapén de teflon y disolver en 10 mi de cloroformo {CHCk). Con bureta graduada afiadir 25 mi de solucién de Hanus y dejar reposar en ta oscuridad durante 30 minutos, con agitacién ocasional. Para resultados mas precisos, es conveniente cumplir con los mismos tiempos de drenado de bureta y estancia en la oscuridad en todas las determinaciones 36Afiadir 10 ml de la solucién al 15% de KI; agitar vigorosamente y afiadir 100 ml de agua destilada recientemente hervida y enfriada, cuidando de lavar cualquier residuo que quede en el tapén de tefldn. Titular con la solucién de Naz$z03'5H,0 0.1N hasta que el color amarillo de ta solucién casi desaparezca (cuando se trate de muestras no convencionales muy coloridas, se debe tener cuidado, ya que puede enmascararse el vire del color). Afiadir unas gotas de solucién de almidén al 1% (si la muestra es muy colorida no se percibe el color azul) y continuar titulando hasta que el color azul de la solucién desaparezca completamente (cuando no se percibe el color azul entonces se titula hasta desaparicién del color de la muestra). Hacia el final de la titulacién, tapar el matraz y agitar vigorosamente para que e! yodo remanente en la solucién en CHCls sea también titulado (Conca, 1995). Se lleva a cabo un blanco bajo las mismas condiciones. f) Calculos. El indice de yodo se determina con la formula: Indice de yodo = (B-S)* N* 12.69 g de muestra donde: B = mide solucién de NazSz03'5H20 gastados en el blanco. § = mide solucién de NazS203°5H20 gastados en la muestra. N = normalidad de la solucién de Naz$,035H20. 4.1.5 Indice de saponificacion. a) Fundamento. El indice de saponificacién se define como el numero de miligramos de KOH necesarios para saponificar por completo 1 gr de aceite. ”Los acidos grasos de acilgliceroles de fa grasa son liberados con una solucién de hidroxido de potasio (KOH) en etanol (la cual se afiade en exceso), obteniéndose glicerol y las sales respectivas de los Acidos grasos. El KOH sin reaccionar se titula con HCI 0.5 N y por diferencia con un blanco se determina la cantidad de KOH empleado para saponificar la muestra b) Materiales y reactivos. + Balanza analitica + Matraces de bola de fondo plano de 250 mi + Matraces de fondo plano con cuello largo de 1 Titra, + Condensador. + Buretas graduadas de 50 mi + Canastilla de calentamiento. * Mortero. + Hidréxido de potasio. * Oxido de calcio granulado. * Etanol. * Acido clorhidrico 0.5N. * Solucién indicadora de fenolftaleina al 1% plv en metanol. c) Preparacién de la solucién etandlica de KOH Triturar 40g de KOH en un mortero junto con 45g de CaO granulado y mezclar. De 1 litro de etanol, afiadir 100 ml a la mezcla en el mortero y transferir a un matraz con cuello argo. Transferir cuantitativamente la mezcla con ayuda de varias porciones de etanol. Afiadir el etanol restante al matraz, agitar vigorosamente durante 5 minutos e invertir el matraz, dejando reposar la solucién. Repetir la agitacién durante varias veces durante el dia, dejar reposar durante toda la noche, filtrar la solucién para eliminar el CaO y guardar en un frasco con tapén de vidrio. 38d) Determinacion. Pesar en una balanza analitica 0.5 g de la grasa en un matraz de fondo plano de 250 ml. Afiadir con la bureta 50 mi de la solucién de KOH. Conectar al matraz condensador de aire y llevar hasta ebullicién, manteniendo ésta hasta que la muestra esté totalmente saponificada (aproximadamente 30 minutos). Enfriar y titular con HC} 0.5N usando fenolftaleina al 1% como indicador. Lievar a cabo un blanco bajo las mismas condiciones que la muestra. e) Calculos, Indice de saponificacion = 28.05 x (B-S) g muestra donde: B = mi de HCI 0.5N gastados en el blanco. S = ml de HCI0.5N gastados en la muestra. 4.2 Refinamiento del aceite crudo Para llevar a cabo el refinamiento del aceite crudo, se emplean en la metodologia porcentajes de los reactivos a adicionar. Estos porcentajes son referidos a la cantidad de aceite por refinar. 4.2.4 Desgomado Mezclar el aceite con 3% de acido fosforico al 0.1% y calentar la mezcla a una temperatura de 54°C durante 5 minutos. Separar por centrifugacién a 2400 r.p.m. 4.2.2 Neutralizacion Para neutralizar el total de acidos grasos expresados como % de acido oleico, adicionar al aceite hidroxido de sodio al 15%. Calentar la mezcla a 54°C por 5 minutos 39y centrifugar la mezcla 2 2400 r.p.m. Para realizar el lavado del aceite, éste se mezcla con 3% de agua caliente y se somete a una nueva centrifugacion {2400 r.p.m. por 20 minutos). 4.2.3 Blanqueo Afadir a la mezcla 2% de silicato aluminico y combinarlo con 0.4% de carbén activado. Separar por fittracién répida con papel Whatman de celulosa del No. 541 y finaimente pasar el aceite a una filracién al vacio con un embudo millipore de tamafio de poro “M" (ASTM 10-15). 4.3 Hidrogenacion Para realizar la hidrogenaci6n del aceite de capulin, se utilizé un hidrogenador marca Parr, modelo 391 EG con 60 Ibfin? y 80°C como capacidad maxima. Utiizando hidrégeno de tanque de fa casa INFRA y como catalizador Pd/C al 5% de la casa Aldrich 20568-0. Este aparato cuenta con botellas de 250 mi de capacidad. Dentro de esta botella se pesaron 5 g de muestra; se le agregaron 50 ml de Hexano, ya que se sabia que el aceite es miscible en este disolvente, por ser éste el medio con el que se extrajo de la almendra. Finalmente, de acuerdo al peso de la muestra, se le agreg6 el 5% de catalizador. Antes de montar el equipo se debe cerciorar el correcto funcionamiento del vacio y que el equipo esté conectado a él. Una vez hecho esto, se cierra el vacio y se proceds a montar el aparato. Es de suma importancia manejar el equipo cuidadosamente y avisar que se esta utlizando, ya que al estar manejando Hidrégeno, se corre el riesgo de un accidente con cualquier chispa o flama que pueda haber. Una vez tomadas las precauciones necesarias, se coloca la botella en el soporte del hidrogenador después de haberta tapado herméticamente con el tapén de hule que contiene el tubo que le suministra el hidrégeno. Es por esto que se debe sellar firmemente y para lograrlo se humedece ef tapdn con un poco de agua (Unicamente la 40que se pueda untar con el dedo indice); después de sellar el frasco y colocario en su lugar correspondiente, se le coloca fa chaqueta de proteccién, sujetandola con 2 bandas de contacto, al tubo del columpio para evitar cualquier inestabilidad del frasco. Una vez montado el aparato se abre el tanque de hidrégeno hasta que el primer manémetro llegue a una presién de 80 Ibfin”, cerrandose posteriormente el tanque fuertemente para evilar mas paso de hidrégeno. Una vez hecho esto, se abre el mandémetro que se conecta con el frasco hasta una presién de 60 tb/in?, cerrandose inmediatamente la valvula. Ya que se tiene todo listo, se enciende el equipo, registrando cada 5 minutos el consumo de hidrégeno, por medio de la lectura de la presin que marca el manémetro en contacto con el frasco. Asi se dejé correr la hidrogenacién hasta el consumo total de hidrégeno, donde ya no bajaba la presién del manémetro que coincidié con una hora desde que se inicié la hidrogenacién (aceite hidrogenado 100%). Se hicieron otras hidrogenaciones parciales por 30 y por 5 minutos para observar su efecto en el perfil de acidos grasos obtenidos con la cromatorgrafia de gases. Y finalmente se hizo una hidrogenacién con menor cantidad de catalizador (1%) para ver su efecto (aceite hidrogenado 10 minutos con 1% de catalizador}; pero. se comprob6 que no corria bien la hidrogenacion por lo que al obtener el perfil de dcidos grasos de esta muestra, no se notaron cambios en ella. Para desmontar el equipo una vez que se apaga, se abre la llave de vacio para dejar salir el hidrégeno que no se consumid dentro de ia botella. Se quitan las tiras de contacto y se retira ia chaqueta de proteccién. Finalmente se retira el tapén del frasco y se vacia su contenido, ayudéndose del disolvente necesario, a un matraz para filtrar el catalizador por filtracién al vacio con un embudo milliipore de tamafio de poro “M" (ASTM 10-15), y después se elimina el disolvente en un rotavapor a una temperatura de 60°C. 4.4 Perfil de dcidos grasos (Cromatografia de gases). a) Materiales y reactivos. * KOH reactivo analitico J.T. Baker® S.A. de C.V. a1+ MeOH reactive analitico J.T. Baker® S.A. de C.V. + HCI (36.5-38.0 %) de J.T. Baker® S.A. de C.V. + 1,0 destilada * BCI; en MeOH al 10% wiv de Alltech Associates, Inc. + Hexanos de Mallinckrodt ARO * Cromatégrato de gases HP 5890 con detector de ionizacién de flama. Se emplearon viales de reaccion marca SUPELCO con capacidad de 15.0 ml, matraces aforados de 25 ml, vasos de precipitados, pipetas graduadas de 2.0 mi, pape! pH MERCK. b) Preparacién de la muestra. Se pesaron aproximadamente 15mg de muestra en un vial de reaccién. Para llevar a cabo la hidrélisis se le adicionéd 1.5 ml de KOH al 15% en MeOH y se colocé directamente en ia estufa a 100°C durante 30 minutos. Se dejé enfriar a temperatura ambiente para adicionarie 1.5 ml de HCI al 10% en MeOH, se comprobé que la muestra presentara un pH Acido (1.0), se le adicioné 1,0 ml de BCls, se puso nuevamente en la estufa a 100°C durante 30 minutos, se dejé enfriar a temperatura ambiente y se extrajo tres veces con 1.0 ml de hexano cada vez. Se aford a 5 ml. Se injectd 1ul de esta solucién en el cromatégrafo. ©) Condiciones cromatograficas. Cromatégrafo de gases Hewlett Packard modelo 5890, integrado con detector de ionizacion de flama e inyector split-spiitles. Integrador Hewlett Packard modelo 3396A. Columna: Omega-WaxTH 320 (30m x 0,32 ID) , 0.25 mm. Gas acarreador: Hidrégeno. Temperatura del Detector: 220°C. a2Temperatura del Inyector: 220°C. Programa de Temperatura:150°C incrementando 10°C/min hasta 240°C manteniendo por § minutos. Velocidad: 0.5 Atenuacién: 3.0 Los dcidos grasos en las muestras fueron identificados mediante comparacion de sus tiempos de retencién con los tiempos de retencién de estandares. Por medio de los cromatogramas se obtuvieron también, las 4reas que presentaban los mismos. Con estos datos se pudo determinar el porcentaje correspondiente a cada acido graso que se encuentra en el aceite, de acuerdo a la siguiente formula:(Helrich, 1990) % del acido graso = Area parcial x 100 Area total 4.5 Evaluacién Biolégica indices biolégicos nutricionales. 4.5.1 Prucha de Toxicidad aguda. Ya que se contaba con el aceite de capulin sometido a los diferentes tratamientos, se efectu6 la prueba de toxicidad aguda; para la cual se contd con 28 ratones que también fueron marcados por medio de perforaciones en las orejas (ver apéndice 7.8) y distribuidos segin el método de la culebra japonesa (ver apéndice 7.7) en 7 lotes (aceite de maiz como control, aceite crudo, aceite refinado, aceite hidrogenado durante 10 minutos con 1% de catalizador, aceite hidrogenado durante 5 minutos con 5% de catalizador y aceite hidrogenado 100% con 5% de catalizador). Se utiizaron esos intervalos de hidrogenacién para poder observar el efecto de los mismos en diferentes grados de saturacién. Asi, pudimos contar con aceites con poca saturacion (hidrogenado 10 minutos con 1% de catalizador), una saturacién intermedia {hidrogenado 5 minutos con 5% de catalizador)y un aceite completamente saturado. 43{hidrogenado 100%, es decir, hasta que no hubo consumo de hidrégeno, con 5% de catalizador). Los ratones se colocaron en cajas de plastico, manteniendo las condiciones originales, es decir, se les proporcioné comida y agua ad libitum; sin embargo, antes de comenzar el estudio se les dejé durante 12 horas en ayuno, al cabo de las cuales se les administra una dosis unica de 15 g/kg. de peso corporal (p.c.) del aceite previamente atemperada a 39° C en bafio Maria por via oral mediante jeringas de vidrio y aguias curvas sin bisel con punta redonda de 1 ml de capacidad. Se observé entonces el comportamiento de los animales cada hora durante las primeras 10 horas y posteriormente a las 24,48 y 72 horas. Las caracteristicas buscadas fueron lordosis, xifosis, ataxia, piloereccién, ereccion caudal, agresividad, aletargamiento, disnea, cianosis @ hipotermia (el apéndice 7.9 describe brevemente cada una de las caracteristicas mencionadas). Si se observaba la presencia de alguna de ellas, se marcaba mediante cruces lo acentuado que se notaba dicha caracteristica. De no presentarse la muerte de algun animal, nos permitiria, entonces, proseguir con ia prueba de toxicidad subaguda, y, ademas, nos determinaria qué tratamiento de hidrogenacién seria el mas adecuado para el estudio. Tanto para la prueba de toxicidad aguda como la subaguda, se utilizaron ratones de la cepa NIH. Cabe sefalar que en la prueba de toxicidad aguda se emplearon ratones del bioterio del edificio "E" de la Facultad de Quimica de la UNAM; mientras que para la prueba de toxicidad subaguda, se emplearon ratones del bioterio de la facultad de ciencias biolégicas del IPN, debido a que no se contaba con ratones en el bioterio de la UNAM, ya que éste permanecié cerrado por algun tiempo. En ambos casos, se manejé_un ciclo de oscuridad de 12 horas de luz/12 horas de coscuridad y se les proporcioné alimento nutricubos de la marca Harlan con la siguiente composicién: agTabla No. 5 Composicién de alimento (Harlan Teklad LM-485) utilizado en el estudio. Proteina 19.92% Grasa 5.67% Fibra 437% Extracto libre de nitrégeno 53.66% {equivalente a los carbohidratos) 4.5.2 Prueba de Toxicidad Subaguda. Una vez que se observé que los aceites no presentaron toxicidad aguda, se pudo continuar con el estudio de toxicidad subaguda. Sin embargo, esta vez sdlo se utiliz6 un tipo de aceite hidrogenado (con 5% de catalizador e hidrogenado durante 5 minutos), ya que se contaba con el perfil de 4cidos grasos también y ahi se observd que desde los 5 minutos de hidrogenacién se eliminaba el acido graso desconoctdo. De acuerdo con esto, se manejaron entonces 5 lotes con 5 ratones cada uno. Los lotes. que se manejaron fueron: aceite de maiz © control, aceite crudo, aceite refinado y 2 otes de aceite hidrogenado. Cabe mencionar, que solamente con el aceite crudo y el hidrogenado se manejaron dos dosis (de 15 g/kg. p.c. y 30 g/kg. p.c.); mientras que para los otros, se manejé Unicamente la dosis maxima permisible que es de 30 g/kg p.c. Se utlliz6 este criterio de dosis maxima en todas las muestras para tener la menor cantidad de lotes pero aseguramos, a la vez, que de ser toxico algun aceite, se manifestaria la toxicidad en el ratén, lo que probablemente no sucederia a una dosis menor, Sin embargo, se decidié manejar ambas dosis para el caso del aceite de capulin crudo e hidrogenado porque no se contaba con la seguridad de que fuese relativamente inocuo el aceite crudo ni atin con el tratamiento de hidrogenacién. 45De igual manera que para la prueba de toxicidad aguda, se distribuyé a los ratones por medio del método de la culebra japonesa (ver apéndice 7.7) y se les marcé también para tener un mayor control sobre ellos, a pesar de que en este estudio cada rat6n se encontraria en jaulas individuales. Los aceites en sus dosis respectivas fueron adicionados al polvo de pellets con to que normalmente se alimentaban ios ratones para que la nica variante manejada fuera el aceite utilizado. El experimento dur 4 semanas durante jas cuales se les proporciond alimento y agua ad libitum. Se les colocé a cada jaula una charola de papel para recoger el alimento que se caia. Se registré cada tercer dia tanto el peso del animal como el peso del alimento remanente, sacando por diferencia el alimento consumido. Ademas, se observaba Ia presencia de las mismas caracteristicas que se observaron en ja prueba de toxicidad aguda (ver apéndice 7.9), Se midié también el volumen de agua ingerida cada semana y se les cambiaba en ese momento para evitar la aparicién de hongos. Ourante la ultima semana de estudio, se colectaron las heces, separandolas del alimento para determinar, mediante la bomba calorimétrica, la Energla Digerible Aparente y la Eficiencia Energética Para poder conocer el efecto de las muestras en estudio comparadas con el control, a nivel sanguineo, se les realizaron 2 sangrias de un volumen minimo de 0.5 mi (una al principio 6 dia 9 y otra al final del estudio 0 dia 28). La sangre se obtuvo por medio de puncién ocular con tubos capilares heparinizados y ésta era recibida en tubos Microtainer con EDTA-K como anticoagulante. Era necesario que el ratén estuviera anestesiado, lo cual se lograba introduciendo al ratén a un desecador con algodén impregnado de éter etilico, hasta que el ratén se durmiera, pero teniendo cuidado de que siguiera respirando pausadamente. Una vez obtenida fa sangre en el microtainer, se agitaba suavemente para homogenizarla con el EDTA y fue llevada de inmediato al lugar donde se llevaria a cabo el andlisis por medio de un equipo Sysmex EN 1500. A\ final del experimento, se llevd a cabo la diseccién de los animales y se les extrajo e| bazo, rifdén y estémago, se les peso y se determind la relacion del peso del 466rgano, con respecto al peso corporal final del ratén como lo muestra la siguiente expresion: Peso corporal final del animal (g) En donde: RP = Relacién porcentual de! érgano con relacién al peso corporal Ademiés se observé si se presentaban anormalidades en los organos extraidos. 4.6 Indices caléricos 4.6.1 Energia gruesa. a) Fundamento. La energia gruesa, denominada también densidad calérica de un alimento o dieta, es la cantidad de energia en términos de kilocalorias que proporciona un gramo de alimento 0 dieta Para obtener la energia gruesa se somete una muestra a combustidn total, dentro de un racipiente cerrado en presencia de un exceso de oxigeno que asegure la completa combustion. En el caso especifico de la bomba GALLENKAMP, el aumento de temperatura por efecto de la combustion es detectado por un galvanémetro de alta sensibilidad, traduciendo dicho aumento en una sefial eléctrica, la cual se puede leer en la escala del galvanémetro, Es necesaria la elaboracién de una curva patron de una sustancia de densidad energética conocida para poder, a su vez, traducir las lecturas del galvanémetro en unidades de energia 7b) Material y reactivos. * Bomba calorimétrica GALLENKAMP, MOD. CBB-330-010L * Galvanémetro GAM METRIC LTD. * Balanza anatitica + Estufa de vacio * Crisoles de acero inoxidable de 2.54 cm de diametro * Mecha de algodén de 7cm de longitud * Mango metalico prensador * Acido benzoico (usado como estandar termoquimico, de la British Chemical Standards, cuyo valor calérico es de 26,454.3 Joules/gramo). ¢) Procedimiento. Es importante que las muestras a emplear en ésta determinacién estén finamente molidas y secas (el secado es conveniente, pero éste depende de las caracteristicas propias de la muestra). La cantidad de muestra estard determinada por el tipo de material y como referencia se debe pesar una cantidad de muestra que proporcione aproximadamente 4.0 Kcal. Asi, se tiene que para materiales con alto contenido calérico, con 0.4 g seré suficiente; mientras que para muestras como la urea, se requerira hasta 1.5 g como maximo. La muestra se coloca en el crisol junto con la mecha de algodén y se le toma un peso preliminar (PP). Después, se compacta con el mango prensador, se eliminan fos residuos que no se compactaron con el resto de la muestra, y se toma el peso final (PF). El crisot se coloca en la parte superior de! pilar central de la bomba y el extremo de la mecha se introduce en el alambre de ignicién. Revisar que el anillo sellador de la bomba esté en perfectas condiciones y se encuentre en su lugar (canal circular). Levantar el anillo estriado y enroscar el cilindro de la bomba hasta que coincidan ambas roscas. Bajar el cilindro de la bomba y sin 48mover el cilindro, terminar de girar e! anillo hasta que esté completamente cerrado. Introducir la terminal del termopar en el orificio superior del citindro de la bomba. Abrir el tanque de oxigeno, previo ajuste de la valvula de reduccién de flujo. Girar la perilla de paso de oxigeno en el panel de control de la bomba y dejarla abierta hasta tener una presién dentro del cilindro de 25 atmésferas en aproximadamente 20-30 seg.; en caso contrario, sera necesario ajustar la vaivula de reduccién. Una vez alcanzada la presi6n, se cierra la perilla de paso de oxigeno y se checa que no halla reduccién en la resin, lo cual seria indicio de la existencia de una fuga en alguna de las conexiones. A continuacién se ajusta el galvanémetro a cero con el ajuste grueso (parte inferior del mismo) y de ser necesario se lleva a cabo el ajuste fino con la perilla central. Se espera aproximadamente 30 seg. para cerciorarse de que la temperatura se ha estabilizado. Se presiona el botén de ignicién en el panes central de la bomba y se espera a que inicie 1a combustién, lo cual se vera por una notable deflexion de ta aguja del manometro. Se toma la lectura (maxima deflexién) y se abre la valvula del lado derecho de la base, para que se liberen los gases de combustién, Se quita el termopar y el cilindro de la bomba en forma inversa a como se realizé el cierre. Finalmente se cierra la valvula de liberacion de gases de combustién y el cilindro de la bomba se enfria por inmersién en un bafio de agua-hielo y se enjuaga con agua destilada, y se seca para utlizarlo nuevamente. Es recomendable realizar las determinaciones por duplicado. d) Caleulos. Efaborar una curva patron con diferentes cantidades de acido benzoico (valor calérico certificado). Es recomendable tener suficientes puntos en la curva de modo que se cubra toda la escala en el galvanémetro (0.1 a 0.8 gramos). Ademas, es necesario hacer una combustién exclusivamente de la mecha, de tal manera que posteriormente se haga la correccion en la lectura de las muestras. 49Se elabora una grafica colocando en las abscisas el contenido energético y en las ordenadas la lectura. Una vez obtenida la lectura, se convierte en términos caléricos, de acuerdo a los siguientes factores: 1g de dcido benzoico = 26,254.3 Joules. ‘1g de Acido benzoico = 6,270.7 Calorias. 1Keal = 4.1868 Kjoules. Para obtener los demas indices caléricos, se determinaron los contenidos energéticos del alimento ingerido y heces en la bomba calorimétrica y los datos obtenidos se emplearon en las siguientes ecuaciones. Energia digerible aparente (ED,): ED,= Ei-Efx 100 Ei Eficiencia energética (EE) EE = aPx 100 Ei Energia digerible te6rica (ED): ED, = TND x 18.55 Donde: Ei = Energia ingerida expresada en Kjig Ef = Energia fecal expresada en Kj/g AP = Incremento en peso expresado en gramos (peso final ~ peso inicial) TND = Total de nutrientes digeribles