2.1.

Introduction

Angiogenesis, the formation and maintenance of blood vessel structures, is essential for the
physiological functions of tissues and is important for the progression of diseases such as
cancer and inflammation.1,2 In recent decades, a variety of signaling molecules, such as
VEGF-VEGFRs, ephrin-Eph receptors, angiopoietin-Tie, and the Delta-Notch system, have
been identified as playing important roles in angiogenesis. Among these, vascular endothelial
growth factors (VEGFs) and receptors (VEGFRs) regulate both vasculogenesis, the
development of blood vessels from precursor cells during early embryogenesis, and
angiogenesis, the formation of blood vessels from pre-existing vessels at a later stage 3 (Fig.
1). The VEGF family of genes contains at least 7 members, including the viral genome
derived VEGF-E, whereas the VEGFR family of genes has 3 to 4 members depending on the
vertebrate species.4,5 VEGF-A and its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 play major roles in
physiological as well as pathological angiogenesis, including tumor angiogenesis. VEGF-
C/D and their receptor VEGFR-3 can regulate angiogenesis at early embryogenesis but
mostly function as critical regulators of lymphangiogenesis. 6

Figure 1.

The VEGF and VEGFR system. VEGF-A and its receptors, VEGFR-1 and
VEGFR-2, play a major role in vasculogenesis and angiogenesis. In
addition, sFlt-1, a soluble form of VEGFR-1, is expressed in various cells
such as trophoblasts and negatively regulates ...

VEGF-A has a variety of functions, including pro-angiogenic activity, vascular permeability

activity, and the stimulation of cell migration in macrophage lineage and endothelial cells.
Recently, antiVEGF-VEGFR drugs such as an antiVEGF-A neutralizing antibody and
multikinase inhibitors have been developed and widely used for the treatment of major solid
tumors.7,8 The clinical efficacy of these medicines has been well evaluated; however, none of
them provide a complete cure for cancer patients. The molecular basis of the refractoriness in
some tumors and the acquisition of resistance to these medicines should be extensively
studied to develop more efficient anti-angiogenic therapies.
On the other hand, VEGFs have pro-angiogenic potential for the maintenance of various
tissues at physiological levels and for the formation of new blood vessels to overcome
ischemic diseases. The utility of VEGF family members in pro-angiogenic medicine,
together with the possible side effects, should be characterized in more detail for clinical
applications.

Go to:

2.2. Structure and Function of the VEGF Family

VEGF, also known as VEGF-A, is a protein with vascular permeability activity that was
originally purified from a fluid secreted by a tumor.9 A few years later, a protein with
angiogenic activity was independently purified and named VEGF.10 Molecular cloning,
however, revealed that these 2 proteins were identical and encoded by a single gene. 3 The
VEGF family includes VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PlGF (placental growth
factor), VEGF-E (Orf-VEGF), and Trimeresurus flavoviridis svVEGF. With the exception of
the latter 2 members, 5 genes of the VEGF family exist in mammalian genomes, including
humans. Essentially, all the VEGFs have 8 conserved cysteine residues at fixed positions,
which are very similar to the PDGF family such as M-CSF (CSF-1), SCF (stem cell factor),
and Flt3L (Flt3 ligand). Among the 8 cysteines, 6 residues form 3 S-S intramolecular bonds
and generate 3 loop structures.11 The remaining 2 cysteines form 2 S-S intermolecular bonds,
contributing to the stable homodimer structure of VEGF. We have shown that a structure
combined with loop 1 and loop 3 in VEGF-A and VEGF-E is essential for the binding and
activation of VEGFR-2.12

VEGF-A

Through alternative splicing, the VEGF-A protein contains subtypes, such as peptides of 121,
165, 189, and 206 amino acids in humans.3 Except for VEGF-A121, the other peptides have a basic
stretch near the carboxyl terminus. The basic stretch of VEGF-A165has a weak affinity for acidic
materials such as heparin/heparan sulfate and to neuropilin-1, a membrane protein involved in
neuronal cell regulation and a coreceptor for VEGF-A. The basic stretch of VEGF-A189 has a
strong binding affinity to heparin/heparan sulfate, and thus, most of the VEGF-A189 molecules
appear to be localized on the cell surface or in the extracellular matrix.

The VEGF-A gene is unique in terms of its haploid insufficiency: even if only a single copy of
the VEGF-A gene is deficient (heterozygotic VEGF-A gene knockout mice;VEGF-A+/ mice),
the mutant embryo dies at early embryogenesis (E10-E11) due to immature formation and
dysfunction of the circulatory system.3 This indicates that the local concentration of VEGF-A in
tissue is tightly regulated in embryogenesis, and half the level of the VEGF-A protein is
insufficient to complete the formation of the closed circulatory system in the body.

Among subtypes of VEGF-A, VEGF-A165 is most important both quantitatively and qualitatively.
Maes et al. reported that VEGF-A165 is essential and sufficient for angiogenesis because VEGF-
A164 transgenic mice in a VEGF-Anull genetic background are alive and essentially
healthy.13 More recently, another subtype of VEGF-A, VEGF-Axxxb, was reported in
humans.14 VEGF-Axxxb activates the receptor much more weakly than the normal VEGF-A,
suggesting that VEGF-Axxxb could be a physiological competitor against VEGF-A.

VEGF-A binds to and activates both VEGFR-1 and VEGFR-2, promoting angiogenesis, vascular
permeability, cell migration, and gene expression.5 In addition, Lee et al. showed that an
autocrine loop of VEGF-A and its receptor system exist within vascular endothelial cells,
contributing to endothelial functions.15

PlGF and VEGF-B

These molecules bind to and activate only VEGFR-1. As will be described later, VEGFR-1 has
the ability to bind tightly to its ligands but has a weak tyrosine kinase activity, generating signals
weaker than VEGFR-2. Both PlGF/ and VEGF-B/ mice are alive at birth with no significant
defects related to angiogenesis, suggesting that these genes are dispensable at embryogenesis.
However, under pathological conditions, synergism between PlGF and VEGF-A has been shown
to contribute to angiogenesis.16VEGF-B/ mice have the phenotype of an atrial conduction
defect.17 In addition, VEGF-B was recently reported to protect against the degeneration of
sensory neurons.18These results indicate that, although PlGF and VEGF-B are not essential at
embryogenesis, they have a variety of functions under pathological or stressed conditions.

VEGF-C and VEGF-D

These 2 members of the VEGF family are produced as premature forms and are cleaved by
proteases such as furin in both the amino- and carboxyl-terminal portions.19 After processing,
these molecules develop a higher affinity for VEGFR-3, which is expressed on lymphatic
endothelial cells and stimulates the receptor for lymphangiogenesis. In addition, these proteins
have a weak affinity for VEGFR-2, activating angiogenesis to some extent. VEGF-C is
expressed during embryogenesis, whereas VEGF-D is expressed after birth during adult stages.
This difference in gene expression is thought to be a major cause for lethality in VEGF-C/
mice but not in VEGF-D/ mice. VEGF-C/ mice show severe accumulation of fluid in tissues
due to poor development of lymph vessels.6

VEGF-E, an Angiogenic Protein Encoded in the Pro-Angiogenic Orf Virus Genome

The Orf virus, a parapoxvirus infecting sheep, goats, and sometimes humans, is known to induce
angiogenesis at sites of infection on the skin. In 1994, Lyttle et al. found that a gene in the viral
genome encodes a protein distantly related to VEGF/PDGF.20 The amino acid identity of this
gene product in the NZ7 strain of the Orf virus shows a limited (25%) degree of identity to
human VEGF-A and 19% to human PDGF. This low homology suggested that NZ7-derived
proteins bind weakly to VEGFR and/or PDGFR. However, to our surprise, we found that this
protein (designated VEGF-ENZ7) tightly binds to and activates VEGFR-2, but not other VEGFRs
(VEGFR-1, VEGFR-3) nor PDGFR21 (Fig. 2). Therefore, VEGF-E is unique in terms of its
specificity to VEGFR-2. None of the angiogenic factors encoded in the human genome has been
reported to exhibit such VEGFR-2 specificity. The products of other Orf virus clones, such as
NZ2 and D1701 strains, also show essentially the same specificity.

2.3. Structure of VEGFRs

VEGFRs are typical tyrosine kinase receptors (TKRs) carrying an extracellular

domain for ligand binding, a transmembrane domain, and a cytoplasmic domain,
including a tyrosine kinase domain4 (Fig. 1). The overall structure of VEGFRs is
similar to that of the PDGFR family members; however, these 2 receptor families
have clear differences: the PDGFR extracellular domain contains 5
immunoglobulin (Ig)like domains, whereas VEGFRs bear 7 Ig-like domains.
Both TKRs share a tyrosine kinase domain with a long kinase insert (KI) of 60 to
70 amino acids; however, the amino acid sequences in the KI of these 2 TKRs are
very different from each other. The KIs in PDGFR family members contain 1 or 2
Tyr(Y)-x-x-Met(M) motifs as autophosphorylation sites, and these motifs have
been shown to be strong binding sites for the SH2 domain of the p85 subunit in the
PI3-kinase complex and to activate the PI3K pathway. These autophosphorylation
sites were demonstrated to be crucial for the cell growth signal mediated by
PDGFR and for the cell transformation signal mediated by v-Fms, an activated
form of M-CSFR (a member of the PDGFR family). However, none of the
VEGFRs contain this Y-x-x-M motif in their KI region or in the carboxyl-terminal
region, indicating that the downstream signaling from VEGFRs may be different
from that of the PDGFR family.5
 2.4. Signaling of VEGFRs

VEGF-A binds to and activates VEGFR-1 (Flt-1) and VEGFR-2 (KDR/Flk-1 in

mice). VEGFR-1 has a high affinity for VEGF-A (Kd = 1~10 pM), which is one
order higher than that of VEGFR-2, whereas its tyrosine kinase activity is
approximately 10-fold weaker than that of VEGFR-2.26 The major pro-angiogenic
signal is generated from the ligand-activated VEGFR-2. Within the KI or carboxyl-
terminal region, TKRs have tyrosine autophosphorylation sites, which are
important for the downstream signal. Unlike most of the TKRs that activate the
Ras pathway or PI3K pathway, we found that the PLC-PKC-MAPK pathway is
highly activated in VEGF-bound VEGFR-2 and used as a crucial signal for
endothelial proliferation. An SH2 domain of PLC specifically binds to the 1175-
PY site of VEGFR-2 (1173-PY in mice) and further activates PKC, particularly the
PKC pathway.27,28 An 1175-phenylalanine (F) mutant of VEGFR-2 significantly
decreases the MAPK pathway under stimulation with VEGF and cannot efficiently
activate the endothelial proliferation signal. Furthermore, mice with an amino acid
knock-in at the 1173 site from Y to F (VEGFR-2/flk-1 1173F/F mutant mice) are
embryonic lethal at about E9.0 with no formation of blood vessels similar to
the flk-1/ mice.29 On the other hand, another knock-in mouse (VEGFR-2/flk-
1 1212F/F) was essentially healthy.

Taken together, these results strongly suggest that the PLC-PKC-MAPK pathway
initiated from the VEGFR-2 1175-PY site plays a pivotal role in pro-angiogenic
signaling from VEGFR-2. A spontaneous mutant of zebrafish carrying the lethal
circulatory system abnormality was shown to have a mutation in the
fish PLC1 gene, indicating that the PLC-PKC pathway is also important for
angiogenesis in fish.30 VEGFR-2 stimulates not only angiogenic signals but also
the secretion of various proteins such as the von Willebrand factor (vWF) from
endothelial cells. vWF secretion was recently reported to be dependent on 1175-PY
in VEGFR-2.31 In addition, Sase et al. indicated that the signaling from the 1175-
PY site on VEGFR-2 to PLC is essential for endothelial specification of VEGFR-
2positive vascular progenitor cells in embryonic stem (ES) cell culture.32 On the
other hand, the 951-PY on VEGFR-2 is important for cell migration signals.33
VEGFR-1 has a much weaker kinase activity than VEGFR-2, and the signaling
cascade is not fully understood. The 1169-Y on VEGFR-1 corresponding to 1175-
Y on VEGFR-2 is a PLC activation site from VEGFR-1. However, we found that
1169-PY is not a major autophosphorylation site on VEGFR-1. Consistent with this
finding, direct pro-angiogenic activity from VEGFR-1 is usually weak or
undetectable.34

In addition to vascular endothelial cells, VEGFR-1 is expressed on macrophage

lineage cells and facilitates migration of these cells. Recently, we have shown that
a scaffold protein RACK1 is involved in this migration signal and that the
VEGFR-1-RACK1-PI3K-Akt pathway appears to be important for this signal.35

The biological functions of VEGFR-1 have been the topic of several studies.
Fong et al. demonstrated that flt-1null mutant mice (flt-1/ mice) die at
approximately E8.5 due to an overgrowth of vascular endothelial cells and
disorganization of blood vessels.36 This suggests a negative regulatory role of
VEGFR-1 (Flt-1) in angiogenesis at early embryogenesis. To examine whether the
tyrosine kinase of VEGFR-1 is essential to the negative role of this receptor, we
generated a mutant mouse strain that lacks the tyrosine kinase (TK) domain of
VEGFR-1 (flt-1 TK/ mice). To our surprise, the mutant mice were essentially
healthy with an almost normal circulatory system, indicating that the negative role
of VEGFR-1 is independent of its tyrosine kinase activity but dependent on the
ligand-binding domain.37 This flt-1 TK/ mouse is useful for clarifying the role of
the VEGFR-1 signal and to see whether it is important for the progression of
diseases such as cancer. Using the mutant mice, we have found, along with others,
that flt-1 TK/ mice show a slower tumor growth, a lower level of metastasis
(particularly lung metastasis in the carcinogenesis model), and a milder
inflammation reaction in the rheumatoid arthritis model compared with those in
wild-type mice.38-41 Furthermore, we and others have found that the wild-type mice
carrying the flt-1 TK/ bone marrow show slower tumor growth similar to that in
the flt-1 TK/ mice.38,39 Using an antiVEGFR-1 neutralizing antibody, Kaplan et
al. indicated that VEGFR-1positive bone marrow precursor cells play a
significant role in the formation of a premetastatic niche, which promotes tumor
metastasis.42 These results indicate that VEGFR-1 signaling is important for the
progression of tumors in vivo mostly via bone marrowderived VEGFR-1positive
cells. In addition, Wu et al. reported that some human tumors, such as breast
carcinomas, express VEGFR-1 and utilize its signaling directly for tumor growth.43

VEGFR-3 has a typical tyrosine kinase like other VEGFRs, and upon stimulation
with VEGF-C, the PKC pathway and Ras pathway were reported to be activated
for lymphangiogenesis. However, it remains to be clarified which
autophosphorylation site(s) on the tyrosine residues in VEGFR-3 is responsible for
these pathways and is critical for lymphangiogenesis.

1 AntiVEGF/VEGFR Therapy and Anticancer Therapy

The VEGF-VEGFR system is unique in that it consists of a very limited number of

molecules that play a central role in angiogenesis. The major ligand (VEGF-A) is a single
gene product, and it utilizes only 2 TKRs (VEGFR-1 and VEGFR-2), although neuropilin-1
is used as a coreceptor. Other ligands, such as PlGF, VEGF-C, and VEGF-D, and the receptor
VEGFR-3 appear to be partly involved in pathological angiogenesis, such as tumor
vasculature. On the other hand, tumors metastatic to lymph nodes express higher levels of
VEGF-C/D, suggesting that the VEGF-C/D and VEGFR-3 system plays an important role in
lymph vesseldependent tumor cell migration into lymph nodes. The angiopoietin-Tie
system is also involved in pathological angiogenesis, but the details of its role in the process
of carcinogenesis are not fully understood.

On the basis of these results, antiVEGF-VEGFR drugs such as antiVEGF-A neutralizing

antibody and tyrosine kinase inhibitors have been developed, and bevacizumab (antiVEGF-
A humanized monoclonal antibody) has been approved for the treatment of colorectal, breast,
lung (nonsmall cell type), and renal cancers as well as for glioblastoma
patients.3,51 Multikinase inhibitors such as sorafenib and sunitinib are now approved for renal
and hepatic cancer patients.

In addition to these medicines, others that target the VEGF-VEGFR system, including
VEGF-Trap (a fusion protein of VEGFR-1 and VEGFR-2 ligand-binding domains), anti
VEGFR-1 or antiVEGFR- 2 neutralizing antibody, soluble VEGFR-3, VEGFR-1 or
VEGFR-2 peptide vaccine therapy,52 and anti-PlGF antibody,53,54 have been developed and are
undergoing preclinical and clinical trials.

Go to:
 2.5. The Molecular Basis of Anti-Angiogenic Therapy

In 1993, Kim et al. demonstrated that antihuman VEGF-A neutralizing antibody efficiently
suppressed human tumor growth in immune-deficient mice. 55 In this case, the antibody only
suppressed tumor-derived human VEGF-A, but not the host-derived mouse VEGF-A, which
is secreted from mouse bone marrowderived cells as well as tumor-associated fibroblasts.
Furthermore, tumor growth was suppressed by the antibody treatment alone, without
combination with chemotherapy. This indicates that the major effect of the antiVEGF-A
antibody was to block the formation of blood vessels in tumor tissues as well as to suppress
pre-existing tumor vasculature by inducing apoptotic death of endothelial cells by blocking
tumor-derived VEGF-A.

However, in clinical trials, treatment of cancer patients with an antiVEGF-A antibody alone
did not produce significant suppression of tumor growth, except for renal cancer. In contrast
to murine tumor transplantation models, the growth rate of tumors in patients is usually
slower, and tumor angiogenesis may develop more slowly compared with the murine tumor
models. In clinics, the vasculature in tumors might be more stable than that in the murine
system and less sensitive to VEGF-A blockade alone.

Another hypothesis regarding the efficacy of the anti-VEGF antibody and anti-VEGFR
tyrosine kinase inhibitor on tumor growth in patients is termed vascular normalization,
whereby the absorption of VEGF-A induces a transiently normalized vascular structure, more
stabilized and well covered with pericytes with lower vascular permeability.56 These
conditions may result in a lower tissue pressure within tumors, having a better diffusion of
anticancer drugs. It is probable that both vascular normalization and suppression of new
tumor angiogenesis can occur in parallel within the tumors in patients treated with anti
VEGF-VEGFR drugs (Fig. 3).

Figure 3.

A possible response of tumor cells to anti-angiogenic therapy: a model. A

direct suppression of tumor angiogenesis and vascular normalization
results in the suppression of tumor growth. However, after long-term
therapy, tumor cells under ...
 Go to:

2.6. Side Effects and Refractoriness to Anti-Angiogenic Therapy

A variety of side effects, such as hypertension, renal dysfunction, proteinuria, thrombosis,

bleeding, and arrhythmia, have been reported in patients under antiVEGF-VEGFR
therapy.7,8 Among these, the frequency of hypertension and proteinuria is higher than that of
others, suggesting a direct relationship with the blockage of VEGF-A in tissues. A decrease
in the level of VEGF-A in the kidney could induce damage to vascular endothelial cells in
glomeruli, and such a dysfunction of glomerular microvasculature may cause proteinuria.
However, the molecular basis of hypertension under VEGF-VEGFR blockage remains to be
clarified.

Whether tumor cells acquire refractoriness or resistance to anti-angiogenic therapy after

long-term treatment is an important question. In clinical trials, the efficacy of antiVEGF-
VEGFR therapy on the increase in survival time seems sometimes inconsistent. Survival
time did not increase stably during the course of treatment, and in some trials after a long
period, the efficacy appears to decrease, suggesting a resistance or refractoriness of tumors to
this treatment. In addition, in some preclinical and clinical trials, glioblastoma showed an
enhanced invasiveness after anti-angiogenic therapy 57 (Fig. 3).

Many experimental models could be introduced and studied to understand this resistance.
Casanovas et al. reported that gene expression of angiogenic factors such as FGF other than
VEGF is a cause of resistance against anti-VEGF therapy in mice. 58 We hypothesized that,
under a long-term anti-angiogenic therapy, tumor cells may receive at least 2 stresses,
hypoxia and low nutrition conditions. We developed a simple in vitromodel system in which
tumor cells were cultured under these double stresses (double deprivation stress [DDS]).
After approximately 10 cycles of DDS culture, tumor cells showed up-regulation of
phospho-Akt, a higher survival rate, and increased invasiveness. 59 Thus, DDS under anti-
angiogenic therapy might induce, to some extent, a malignant phenotype of tumors. A
strategy should be developed to overcome this possible malignant phenotype after anti-
angiogenic therapy.
1. Pengantar

Angiogenesis, pembentukan dan pemeliharaan struktur pembuluh darah, sangat penting untuk
fungsi fisiologis jaringan dan penting bagi perkembangan penyakit seperti kanker dan
peradangan. 1 , 2 Dalam beberapa dekade terakhir, berbagai molekul sinyal, seperti VEGF-
VEGFRs, reseptor ephrin-Ef, angiopoietin-Tie, dan sistem Delta-Notch, telah diidentifikasi
sebagai memainkan peran penting dalam angiogenesis. Di antaranya, vaskular faktor endotel
pertumbuhan (VEGFs) dan reseptor (VEGFRs) mengatur kedua vasculogenesis, pengembangan
pembuluh darah dari sel prekursor selama embriogenesis awal, dan angiogenesis, pembentukan
pembuluh darah dari pembuluh yang sudah ada pada tahap berikutnya 3 ( Gambar. 1 ). Keluarga
VEGF gen mengandung setidaknya 7 anggota, termasuk virus genom diturunkan VEGF-E,
sedangkan keluarga VEGFR gen memiliki 3 sampai 4 anggota tergantung pada spesies
vertebrata. 4 , 5 VEGF-A dan reseptornya VEGFR-1 dan VEGFR-2 bermain peran utama dalam
fisiologis serta angiogenesis patologis, termasuk angiogenesis tumor. VEGF-C / D dan reseptor
mereka VEGFR-3 dapat mengatur angiogenesis pada embriogenesis awal tetapi kebanyakan
berfungsi sebagai regulator penting dari lymphangiogenesis. 6

2.7.

2.8. Gambar 1.

2.9. The VEGF dan VEGFR sistem. VEGF-A dan reseptor yang,
VEGFR-1 dan VEGFR-2, memainkan peran utama dalam
vasculogenesis dan angiogenesis. Selain itu, sFlt-1, bentuk
larut VEGFR-1, dinyatakan dalam berbagai sel seperti trofoblas
dan negatif mengatur ...

VEGF-A memiliki berbagai fungsi, termasuk aktivitas pro-angiogenik, aktivitas permeabilitas

pembuluh darah, dan stimulasi migrasi sel dalam garis keturunan makrofag dan sel
endotel. Baru-baru ini, obat anti-VEGF-VEGFR seperti anti-VEGF-A antibodi penetral dan
inhibitor multikinase telah dikembangkan dan banyak digunakan untuk pengobatan tumor padat
utama. 7, 8 Efikasi klinis obat ini telah dievaluasi dengan baik; Namun, tidak satupun dari mereka
memberikan obat yang lengkap untuk pasien kanker. Dasar molekul yang refractoriness di
beberapa tumor dan akuisisi resistensi terhadap obat-obatan ini harus dipelajari secara ekstensif
untuk mengembangkan terapi anti-angiogenik lebih efisien.

Di sisi lain, VEGFs memiliki potensi pro-angiogenik untuk pemeliharaan dari berbagai jaringan
di tingkat fisiologis dan untuk pembentukan pembuluh darah baru untuk mengatasi penyakit
iskemik. Utilitas dari anggota keluarga VEGF dalam pengobatan pro-angiogenik, bersama-sama
dengan efek samping yang mungkin, harus ditandai secara lebih rinci untuk aplikasi klinis.

2.10. Pergi ke:

2. Struktur dan Fungsi dari VEGF Keluarga

VEGF, juga dikenal sebagai VEGF-A, merupakan protein dengan aktivitas permeabilitas
vaskuler yang awalnya dimurnikan dari cairan yang dikeluarkan oleh tumor. 9 Beberapa tahun
kemudian, protein dengan aktivitas angiogenik adalah independen dimurnikan dan bernama
VEGF. 10 kloning Molekuler, Namun, mengungkapkan bahwa 2 protein yang identik dan
dikodekan oleh gen tunggal. 3 Keluarga VEGF meliputi VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D,
PlGF (faktor pertumbuhan plasenta), VEGF-E (Orf- VEGF), dan Trimeresurus
flavoviridis svVEGF. Dengan pengecualian dari yang terakhir 2 anggota, 5 gen dari keluarga
VEGF ada di genom mamalia, termasuk manusia. Pada dasarnya, semua VEGFs memiliki 8
residu sistein dilestarikan di posisi tetap, yang sangat mirip dengan keluarga PDGF seperti M-
CSF (CSF-1), SCF (faktor sel batang), dan Flt3L (Flt3 ligan). Di antara 8 sistein, 6 residu
membentuk 3 ikatan intramolekul SS dan menghasilkan struktur 3 lingkaran. 11Sisa 2 sistein
membentuk ikatan antarmolekul 2 SS, berkontribusi terhadap struktur homodimer stabil
VEGF. Kami telah menunjukkan bahwa struktur dikombinasikan dengan lingkaran 1 dan loop 3
di VEGF-A dan VEGF-E sangat penting untuk aktivasi mengikat dan VEGFR-2. 12
2.11. VEGF-A

2.12. Melalui splicing alternatif, VEGF-A protein mengandung subtipe, seperti

peptida dari 121, 165, 189, dan 206 asam amino pada manusia. Kecuali VEGF-
3

A 121, peptida lain memiliki hamparan dasar dekat ujung karboksil. Peregangan
dasar VEGF-A memiliki afinitas yang lemah untuk bahan asam seperti heparin /
165

heparan sulfat dan-neuropilin 1, protein membran yang terlibat dalam regulasi sel
saraf dan coreceptor untuk VEGF-A. Peregangan dasar VEGF-A memiliki
189

afinitas ikatan yang kuat untuk heparin / heparan sulfat, dan dengan demikian,
sebagian besar VEGF-A molekul tampaknya lokal pada permukaan sel atau
189

dalam matriks ekstraselular.

2.13. The VEGF-A gen unik dalam hal insufisiensi haploid yang: bahkan jika
hanya satu salinan dari VEGF-A gen kekurangan (tikus knockout
heterozygotic VEGF-A gen; VEGF-A +/- tikus), embrio mutan mati di
embriogenesis awal (E10-E11) karena pembentukan matang dan disfungsi dari
sistem peredaran darah. Hal ini menunjukkan bahwa konsentrasi lokal VEGF-A
3

dalam jaringan diatur ketat dalam embriogenesis, dan setengah tingkat VEGF-A
protein tidak cukup untuk menyelesaikan pembentukan sistem peredaran darah
tertutup dalam tubuh.

2.14. Di antara subtipe VEGF-A, VEGF-A adalah yang paling penting baik
165

secara kuantitatif dan kualitatif. Maes et al.melaporkan bahwa VEGF-A adalah 165

penting dan cukup untuk angiogenesis karena VEGF-A tikus transgenik di-A
164

VEGFlatar belakang -null genetik yang hidup dan pada dasarnya sehat. Baru- 13

baru ini, subtipe lain VEGF-A, VEGF-A xxxb,dilaporkan pada manusia. VEGF-
14

A mengaktifkan reseptor yang jauh lebih lemah daripada normal VEGF-A,

xxxb

menunjukkan bahwa VEGF-A bisa menjadi pesaing fisiologis terhadap VEGF-A.

xxxb

2.15. VEGF-A mengikat dan mengaktifkan kedua VEGFR-1 dan VEGFR-2,

mempromosikan angiogenesis, permeabilitas vaskuler, migrasi sel, dan ekspresi
gen. Selain itu, Lee et al. menunjukkan bahwa loop autokrin VEGF-A dan sistem
5

reseptor yang ada dalam sel endotel vaskular, berkontribusi terhadap fungsi
endotel. 15

2.16. PlGF dan VEGF-B

2.17. Molekul-molekul ini mengikat dan mengaktifkan hanya VEGFR-1. Seperti
yang akan dijelaskan nanti, VEGFR-1 memiliki kemampuan untuk mengikat erat
ligan tetapi memiliki aktivitas tyrosine kinase yang lemah, menghasilkan sinyal
lemah dari VEGFR-2. Kedua PlGF - / - dan VEGF-B - / - tikus yang hidup saat
lahir tanpa cacat yang signifikan terkait dengan angiogenesis, menunjukkan bahwa
gen ini dibuang di embriogenesis. Namun, dalam kondisi patologis, sinergisme
antara PlGF dan VEGF-A telah terbukti berkontribusi angiogenesis. VEGF-B - /16

-. tikus memiliki fenotip cacat konduksi atrium Selain itu, VEGF-B baru-baru ini
17

dilaporkan untuk melindungi terhadap degenerasi neuron sensorik. Hasil ini

18

menunjukkan bahwa, meskipun PlGF dan VEGF-B tidak penting di embriogenesis,

mereka memiliki berbagai fungsi dalam kondisi patologis atau stres.

2.18. VEGF-C dan VEGF-D

2.19. Ini 2 anggota keluarga VEGF diproduksi sebagai bentuk dini dan dibelah
oleh protease seperti furin di kedua bagian amino dan karboksil-terminal. Setelah19

pengolahan, molekul ini mengembangkan afinitas yang lebih tinggi untuk VEGFR-
3, yang dinyatakan pada sel endotel limfatik dan merangsang reseptor untuk
lymphangiogenesis. Selain itu, protein ini memiliki afinitas yang lemah untuk
VEGFR-2, mengaktifkan angiogenesis sampai batas tertentu. VEGF-C dinyatakan
selama embriogenesis, sedangkan VEGF-D dinyatakan setelah lahir selama tahap
dewasa. Perbedaan dalam ekspresi gen diduga menjadi penyebab utama untuk
mematikan di VEGF-C - / - tikus tapi tidak dalam VEGF-D - / -. Tikus VEGF-C - / -
tikus menunjukkan akumulasi cairan yang parah pada jaringan karena miskin
pengembangan pembuluh getah bening. 6

2.20. VEGF-E, sebuah Protein Angiogenik Pengkodean dalam Pro-Angiogenik Orf Virus
Genome
 2.21. The Orf virus, sebuah parapoxvirus menginfeksi domba, kambing, dan
kadang-kadang manusia, yang dikenal untuk menginduksi angiogenesis pada situs
infeksi pada kulit. Pada tahun 1994, Lyttle et al. menemukan bahwa gen dalam
genom virus mengkode protein jauh dengan VEGF / PDGF. Identitas asam amino
20

produk gen ini dalam strain NZ7 virus Orf menunjukkan terbatas (25%) tingkat
identitas manusia VEGF-A dan 19% untuk PDGF manusia. Homologi rendah ini
menunjukkan bahwa protein NZ7 diturunkan mengikat lemah untuk VEGFR dan /
atau PDGFR. Namun, mengejutkan kami, kami menemukan bahwa protein ini
(ditunjuk VEGF-E NZ7) erat mengikat dan mengaktifkan VEGFR-2, tetapi tidak
VEGFRs lainnya (VEGFR-1, VEGFR-3) atau PDGFR ( Gbr. 2 ). Oleh karena itu,
21

VEGF-E adalah unik dalam hal kekhususan untuk VEGFR-2. Tak satu pun dari
faktor angiogenik dikodekan dalam genom manusia telah dilaporkan menunjukkan
seperti VEGFR-2 spesifisitas. Produk Orf klon virus lainnya, seperti NZ2 dan strain
D1701, juga menunjukkan dasarnya kekhususan yang sama.

3. Struktur VEGFRs

VEGFRs reseptor khas tyrosine kinase (TKRs) membawa domain ekstraseluler

untuk ligan mengikat, domain transmembran, dan domain sitoplasmik, termasuk
tyrosine kinase domain 4 ( Gbr. 1 ). Struktur keseluruhan VEGFRs mirip dengan
anggota keluarga PDGFR; Namun, 2 keluarga reseptor ini memiliki perbedaan
yang jelas: domain ekstraseluler PDGFR berisi 5 immunoglobulin (Ig) -seperti
domain, sedangkan VEGFRs menanggung 7 domain Ig-seperti. Kedua TKRs
berbagi domain tirosin kinase dengan insert kinase panjang (KI) dari 60 sampai 70
asam amino; Namun, urutan asam amino dalam KI ini 2 TKRs sangat berbeda satu
sama lain. KIS di PDGFR anggota keluarga mengandung 1 atau 2 Tyr (Y) XX-Met
(M) motif sebagai situs autofosforilasi, dan motif ini telah terbukti menjadi situs
mengikat kuat untuk SH2 domain dari subunit P85 di PI3-kinase kompleks dan
untuk mengaktifkan jalur PI3K. Situs autofosforilasi tersebut terbukti sangat
penting untuk sinyal pertumbuhan sel dimediasi oleh PDGFR dan untuk sinyal
transformasi sel dimediasi oleh v-Fms, bentuk aktif dari M-CSFR (anggota dari
keluarga PDGFR). Namun, tak satu pun dari VEGFRs mengandung motif YxxM
ini di wilayah KI atau di wilayah karboksil-terminal, menunjukkan bahwa sinyal
hilir dari VEGFRs mungkin berbeda dari keluarga PDGFR. 5
4. Signaling dari VEGFRs

VEGF-A mengikat dan mengaktifkan VEGFR-1 (FLT-1) dan VEGFR-2 (KDR /

FLK-1 pada tikus).VEGFR-1 memiliki afinitas tinggi untuk VEGF-A (Kd = 1 ~
22:00), yang merupakan salah satu rangka lebih tinggi dari VEGFR-2, sedangkan
aktivitas tyrosine kinase adalah sekitar 10 kali lipat lebih lemah dibandingkan
VEGFR-2. 26 Sinyal pro-angiogenik utama yang dihasilkan dari ligan-diaktifkan
VEGFR-2.Dalam KI atau wilayah karboksil-terminal, TKRs memiliki situs
autofosforilasi tirosin, yang penting untuk sinyal hilir. Tidak seperti kebanyakan
TKRs yang mengaktifkan jalur Ras atau PI3K jalur, kami menemukan bahwa jalur
PLC-PKC-MAPK sangat aktif di VEGF-terikat VEGFR-2 dan digunakan sebagai
sinyal penting untuk proliferasi endotel. Sebuah SH2 domain PLC khusus
mengikat ke situs-1175 PY dari VEGFR-2 (1173-PY pada tikus) dan selanjutnya
mengaktifkan PKC, terutama jalur PKC. 27 , 28 An 1175-fenilalanin (F) mutan dari
VEGFR-2 secara signifikan mengurangi jalur MAPK bawah stimulasi dengan
VEGF dan tidak bisa efisien mengaktifkan sinyal proliferasi endotel. Selanjutnya,
tikus dengan asam amino knock-in di 1173 situs dari Y ke F (VEGFR-2 /-FLK
1 1173F / F tikus mutan) adalah embrio mematikan di sekitar E9.0 tanpa
pembentukan pembuluh darah yang mirip dengan FLK yang -1 - / -. tikus 29 Di sisi
lain, mouse knock-in lain (VEGFR-2 / FLK-1 1212F / F) pada dasarnya sehat.

Secara bersama-sama, hasil ini sangat menyarankan bahwa jalur PLC-PKC-

MAPK dimulai dari VEGFR-2 situs 1175-PY memainkan peran penting dalam
signaling pro-angiogenik dari VEGFR-2. Sebuah mutan spontan ikan zebra
membawa mematikan peredaran darah sistem kelainan terbukti memiliki mutasi
padaPLC ikan 1 gen, yang menunjukkan bahwa jalur PLC-PKC juga penting
untuk angiogenesis pada ikan. 30VEGFR-2 merangsang tidak hanya sinyal
angiogenik tapi juga sekresi berbagai protein seperti faktor von Willebrand (vWF)
dari sel endotel. sekresi vWF baru-baru ini dilaporkan tergantung pada 1175-PY di
VEGFR-2. 31 Selain itu, perangko balasan et al. menunjukkan bahwa sinyal dari
situs 1175-PY di VEGFR-2 untuk PLC sangat penting untuk spesifikasi endotel
sel progenitor vaskular VEGFR-2-positif di induk embrio (ES) kultur sel. 32 Di sisi
lain, 951-PY pada VEGFR-2 adalah penting untuk sinyal migrasi sel. 33
VEGFR-1 memiliki aktivitas kinase lebih lemah dari VEGFR-2, dan kaskade
sinyal tidak sepenuhnya dipahami. The 1169-Y dari VEGFR-1 sesuai dengan 1175-
Y dari VEGFR-2 adalah situs aktivasi PLC dari VEGFR-1. Namun, kami
menemukan bahwa 1169-PY bukan situs autofosforilasi besar pada-VEGFR
1.Konsisten dengan temuan ini, aktivitas pro-angiogenik langsung dari VEGFR-1
biasanya lemah atau tidak terdeteksi. 34

Selain sel endotel vaskular, VEGFR-1 diekspresikan pada sel-sel garis makrofag
dan memfasilitasi migrasi sel-sel ini. Baru-baru ini, kami telah menunjukkan
bahwa RACK1 protein perancah yang terlibat dalam sinyal migrasi ini dan bahwa
jalur VEGFR-1-RACK1-PI3K Akt tampaknya penting untuk sinyal ini. 35

Fungsi biologis VEGFR-1 telah menjadi topik dari beberapa

penelitian. Fong et al. menunjukkan bahwa flt-1-null tikus mutan (-flt 1 - / - tikus)
mati di sekitar E8.5 disebabkan oleh pertumbuhan berlebih dari sel endotel
vaskular dan disorganisasi pembuluh darah. 36 Hal ini menunjukkan peran regulasi
negatif VEGFR-1 ( FLT-1) di angiogenesis pada embriogenesis awal. Untuk
menguji apakah kinase tirosin dari VEGFR-1 sangat penting untuk peran negatif
reseptor ini, kami menghasilkan strain tikus mutan yang tidak memiliki tyrosine
kinase (TK) domain dari VEGFR-1 (flt-1 TK - / - tikus). Mengejutkan kami, tikus
mutan pada dasarnya sehat dengan sistem peredaran darah hampir normal,
menunjukkan bahwa peran negatif VEGFR-1 adalah independen dari aktivitas
tyrosine kinase, tetapi tergantung pada domain ligan mengikat. 37 flt-1 iniTK - / -
mouse berguna untuk mengklarifikasi peran VEGFR-1 sinyal dan melihat apakah
itu penting bagi perkembangan penyakit seperti kanker. Menggunakan tikus mutan,
kami telah menemukan, bersama dengan orang lain, yang-flt 1 TK - / - tikus
menunjukkan pertumbuhan yang lambat tumor, tingkat yang lebih rendah dari
metastasis (terutama metastasis paru-paru dalam model karsinogenesis), dan lebih
ringan peradangan reaksi di Model rheumatoid arthritis dibandingkan dengan
mereka di alam liar-jenis tikus. 38 - 41 Selain itu, kami dan lain-lain telah
menemukan bahwa tikus tipe liar membawa-flt 1 TK - / - sumsum tulang
menunjukkan pertumbuhan tumor lebih lambat mirip dengan yang di flt- yang 1
TK - / - tikus. 38 , 39Menggunakan anti-VEGFR-1 penetral antibodi,
Kaplan et al. menunjukkan bahwa sel-sel prekursor sumsum tulang VEGFR-1-
positif memainkan peran penting dalam pembentukan ceruk premetastatic, yang
mempromosikan metastasis tumor. 42 Hasil ini menunjukkan bahwa VEGFR-1
sinyal penting bagi perkembangan tumor in vivo sebagian besar melalui sumsum
tulang sel -derived VEGFR-1-positif. Selain itu, Wu et al. melaporkan bahwa
beberapa tumor manusia, seperti karsinoma payudara, mengungkapkan VEGFR-1
dan memanfaatkan nya sinyal langsung untuk pertumbuhan tumor. 43

VEGFR-3 memiliki tirosin kinase khas seperti VEGFRs lainnya, dan setelah
stimulasi dengan VEGF-C, jalur PKC dan Ras jalur dilaporkan diaktifkan untuk
lymphangiogenesis. Namun, masih harus diklarifikasi situs yang autofosforilasi (s)
pada residu tirosin di VEGFR-3 bertanggung jawab untuk jalur ini dan sangat
penting untuk lymphangiogenesis.

1. Anti - VEGF / VEGFR Terapi dan Anti Kanker Terapi

Sistem VEGF-VEGFR adalah unik karena terdiri dari jumlah yang sangat terbatas molekul yang
memainkan peran sentral dalam angiogenesis. Ligan utama (VEGF-A) adalah produk gen
tunggal, dan menggunakan hanya 2 TKRs (VEGFR-1 dan VEGFR-2), meskipun-neuropilin 1
digunakan sebagai coreceptor a. Ligan lainnya, seperti PlGF, VEGF-C, dan VEGF-D, dan
reseptor VEGFR-3 tampaknya sebagian terlibat dalam angiogenesis patologis, seperti pembuluh
darah tumor. Di sisi lain, tumor metastatik ke kelenjar getah bening mengungkapkan tingkat
yang lebih tinggi dari VEGF-C / D, menunjukkan bahwa VEGF-C / D dan VEGFR-3 sistem
memainkan peran penting dalam getah bening migrasi sel tumor tergantung kapal ke kelenjar
getah bening. Sistem angiopoietin-Tie juga terlibat dalam angiogenesis patologis, tapi rincian
perannya dalam proses karsinogenesis tidak sepenuhnya dipahami.

Atas dasar hasil ini, obat anti-VEGF-VEGFR seperti anti-VEGF-A antibodi penetral dan tyrosine
kinase inhibitor telah dikembangkan, dan bevacizumab (anti-VEGF-A manusiawi antibodi
monoklonal) telah disetujui untuk pengobatan kolorektal , payudara, paru-paru (jenis non-sel
kecil), dan kanker ginjal serta untuk pasien glioblastoma. 3 , 51 inhibitor multikinase seperti
sorafenib dan sunitinib sekarang disetujui untuk pasien kanker ginjal dan hati.

Selain obat-obatan, yang lain yang menargetkan sistem VEGF-VEGFR, termasuk VEGF-
Perangkap (protein fusi VEGFR-1 dan VEGFR-2 ligan mengikat domain), anti-VEGFR-1 atau
anti-VEGFR- 2 penetral antibodi , larut VEGFR-3, VEGFR-1 atau VEGFR-2 peptida terapi
vaksin, 52 dan antibodi anti-PlGF, 53 , 54 telah dikembangkan dan sedang menjalani uji praklinis
dan klinis.
 2.22. Pergi ke:

2. Dasar Molekuler Anti-Angiogenik Therapy

Pada tahun 1993, Kim et al. menunjukkan bahwa antihuman VEGF-A antibodi penetral efisien
menekan pertumbuhan tumor manusia pada tikus kekebalan kekurangan. 55 Dalam hal ini,
antibodi hanya ditekan tumor yang diturunkan manusia VEGF-A, tetapi tidak host yang
diturunkan tikus VEGF-A, yang disekresikan dari sumsum tulang tikus yang diturunkan sel serta
fibroblast tumor terkait. Selanjutnya, pertumbuhan tumor ditekan oleh pengobatan antibodi
sendiri, tanpa kombinasi dengan kemoterapi. Hal ini menunjukkan bahwa efek utama dari anti-
VEGF-A antibodi adalah untuk memblokir pembentukan pembuluh darah di jaringan tumor serta
untuk menekan pembuluh darah tumor yang sudah ada dengan menginduksi kematian apoptosis
sel endotel dengan menghalangi tumor yang diturunkan VEGF-A .

Namun, dalam uji klinis, pengobatan pasien kanker dengan anti-VEGF-A antibodi sendiri tidak
menghasilkan penekanan yang signifikan dari pertumbuhan tumor, kecuali untuk kanker
ginjal. Berbeda dengan model transplantasi tumor murine, tingkat pertumbuhan tumor pada
pasien biasanya lebih lambat, dan angiogenesis tumor dapat mengembangkan lebih lambat
dibandingkan dengan model tumor murine. Di klinik, pembuluh darah pada tumor mungkin lebih
stabil daripada yang dalam sistem murine dan kurang sensitif terhadap VEGF-A blokade saja.

Hipotesis lain tentang kemanjuran antibodi anti-VEGF dan anti-VEGFR tyrosine kinase inhibitor
pada pertumbuhan tumor pada pasien disebut "normalisasi pembuluh darah," dimana penyerapan
VEGF-A menginduksi struktur pembuluh darah secara sementara normal, lebih stabil dan baik
ditutupi dengan pericytes dengan permeabilitas pembuluh darah yang lebih rendah. 56Kondisi ini
dapat mengakibatkan tekanan jaringan yang lebih rendah dalam tumor, memiliki difusi yang
lebih baik dari obat antikanker. Besar kemungkinan bahwa kedua normalisasi pembuluh darah
dan penekanan angiogenesis tumor baru dapat terjadi secara paralel dalam tumor pada pasien
yang diobati dengan obat anti-VEGF-VEGFR ( Gbr. 3 ).
 2.23.

2.24. Gambar 3.

2.25. Sebuah respon yang mungkin dari sel tumor terhadap

terapi anti-angiogenik: model. Sebuah penekanan langsung
angiogenesis tumor dan "normalisasi vaskular" hasil dalam
penindasan pertumbuhan tumor. Namun, setelah terapi jangka
panjang, sel tumor di bawah ...

2.26. Pergi ke:

Efek Samping dan Refractoriness untuk Anti-Angiogenik Therapy

Berbagai efek samping, seperti hipertensi, disfungsi ginjal, proteinuria, trombosis, perdarahan,
dan aritmia, telah dilaporkan pada pasien di bawah anti-VEGF-VEGFR terapi. 7 , 8 Di antaranya,
frekuensi hipertensi dan proteinuria lebih tinggi dari orang lain, menunjukkan hubungan
langsung dengan penyumbatan VEGF-A pada jaringan. Penurunan tingkat VEGF-A pada ginjal
bisa menyebabkan kerusakan sel endotel vaskular pada glomeruli, dan disfungsi seperti
mikrovaskulatur glomerular dapat menyebabkan proteinuria. Namun, dasar molekul hipertensi
bawah VEGF-VEGFR penyumbatan masih harus diklarifikasi.

Apakah sel-sel tumor memperoleh refractoriness atau resistensi terhadap terapi anti-angiogenik
setelah pengobatan jangka panjang adalah pertanyaan penting. Dalam uji klinis, khasiat terapi
anti-VEGF-VEGFR pada peningkatan waktu kelangsungan hidup tampaknya kadang-kadang
tidak konsisten. Waktu kelangsungan hidup tidak meningkat secara stabil selama pengobatan,
dan dalam beberapa uji coba setelah lama, khasiat muncul menurun, menunjukkan resistensi atau
refractoriness tumor terhadap pengobatan ini. Selain itu, dalam beberapa uji praklinis dan klinis,
glioblastoma menunjukkan invasif ditingkatkan setelah terapi anti-angiogenik 57 ( Gbr. 3 ).

Banyak model eksperimental bisa diperkenalkan dan dipelajari untuk memahami perlawanan
ini. Casanovas et al. melaporkan bahwa ekspresi gen faktor angiogenik seperti FGF selain VEGF
merupakan penyebab perlawanan terhadap anti-VEGF terapi pada tikus. 58 Kami berhipotesis
bahwa, di bawah terapi anti-angiogenik jangka panjang, sel tumor dapat menerima setidaknya 2
tegangan, hipoksia dan kondisi gizi rendah. Kami mengembangkan sederhana dalam sistem
model vitro di mana sel-sel tumor yang dibudidayakan di bawah ini tekanan ganda (stres kurang
ganda [DDS]). Setelah sekitar 10 siklus budaya DDS, sel tumor muncul regulasi phospho-Akt,
tingkat kelangsungan hidup yang lebih tinggi, dan meningkatkan invasi. 59 Dengan demikian,
DDS bawah terapi anti-angiogenik mungkin menyebabkan, sampai batas tertentu, fenotipe ganas
tumor. Strategi harus dikembangkan untuk mengatasi hal ini fenotipe ganas mungkin setelah
terapi anti-angiogenik.