Professional Documents
Culture Documents
TESIS
HERONIATY
1006734451
TESIS
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar
Magister Sains Ilmu Kimia
HERONIATY
1006734451
Rasa syukur terindah dan terdalam penulis panjatkan kepada pemilik raga
yang Maha Agung Allah SWT berkat karunia dan izin-Nya maka penulis dapat
menyelesaikan tesis yang berjudul Sintesis Senyawa Dimer Katekin Dari Ekstrak
Teh Hijau Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase Dari Kulit Bawang
Bombay (Allium cepa L.) dengan baik. Tesis ini disusun sebagai salah satu
persyaratan untuk menempuh ujian akhir Program Studi Magister Ilmu Kimia
pada Program Pascasarjana Universitas Indonesia.
Dalam penyusunan tesis ini penulis telah dibantu berbagai pihak baik
berupa dukungan materil maupun moril yang sangat berarti bagi penyelesaian
tesis ini. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dr. Herry Cahyana, selaku pembimbing I penelitian yang telah banyak
membantu dan memberikan bimbingan serta arahan sehingga tesis ini
dapat diselesaikan dengan baik.
2. Dr. Widajanti Wibowo, selaku pembimbing II penelitian yang telah
banyak membantu dan membimbing dalam penyelesaian tesis ini.
3. Dr. Emil Budianto, selaku pembimbing akademis yang telah banyak
memberikan bimbingan selama penulis menjalani masa pendidikan di
Universitas Indonesia.
4. Dr. Endang Saepudin, selaku ketua Program Studi Magister Ilmu Kimia,
Program Pasca Sarjana Universitas Indonesia.
5. Seluruh Bapak Ibu dosen mata kuliah pada Program Studi Magister Ilmu
Kimia yang telah banyak memberikan ilmu yang sangat menunjang dalam
memahami penelitian ini dan sebagai sumber informasi dalam penulisan
tesis.
6. Bapak Jaswanto, dari Pusat Laboratorium Forensik Maber Polri atas waktu
dan bimbingannya dalam penelitian tugas akhir.
7. Ayahanda tercinta di surga, ibunda terkasih, kakak, dan adikku yang telah
memberikan doa, semangat dan dukungan moril yang tiada terkira selama
penelitian ini.
iv
Nama : Heroniaty
Program Studi : Magister Sains Ilmu Kimia
Judul : Sintesis Senyawa Dimer Katekin dari Ekstrak Teh Hijau
Dengan Menggunakan Katalis Enzim Peroksidase dari
Kulit Bawang Bombay (Allium cepa L.)
vii
Name : Heroniaty
Study Program : Magister of Chemistry Science
Title : Synthesis of Catechin Dimer from Green Tea Extract
using Peroxidase as Catalist from Onion (Allium cepa
L.)
This study, aims to examine the activity of peroxidase from skin of onion
(Allium cepa L) to be able to perform oxidative dimerization reaction with the
substrate catechin compounds from green tea extract.
Synthesis of catechin dimer which catalized by peroxidase (EC 1.11.1.7)
from onion skins have been carried out and produce a compound of reaction.
Optimum activity of peroxidase occurs at pH 5 and temperature 30 0C. Peroxidase
is an oxidoreductase group that can transfer hidrogen from phenolic compound to
produce phenoxy radicals. Two phenoxy radicals are joined through the oxidative
coupling reaction, resulting a dimer compound. Compound formed were
identified by GCMS instrument. In a catechin phenolic radical, coupling occurs at
position C-4 'and C-8 "which form the compound 4'-8" dicatechin. Compounds of
reaction and native substrate were identified antioxidant activity by using DPPH
radical scavenger that is known IC50 respectively by catechins: catechin dimer =
60.248: 58.928.
viii
Halaman
ix
Halaman
Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil
pemurnian (b) .................................................................... 34
Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b) .......................... 38
Gambar 4.6 Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin
dengan enzim peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil
reaksi (b)............................................................................ 39
Gambar 4.7 KLT senyawa katekin (a) dan KLT senyawa hasil
reaksi (b)............................................................................ 40
xi
Gambar 4.19 Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol,
(b) senyawa katekin, (d) senyawa hasil reaksi .................. 50
Gambar 4.25 Nilai IC50 antara monomer dimer katekin (1) dan
katekin (2) ......................................................................... 52
xii
Halaman
Tabel 2.3 Sifat Fisika dan Sifat Kimia Senyawa Katekin ..................... 12
xiii
1 Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
1.4 Hipotesis
Hipotesis dari penelitian ini adalah dapat dibuat senyawa dimer katekin
dari ekstrak teh hijau dengan bantuan enzim peroksidase yang berasal dari kulit
bawang bombay dan terdapat aktivitas antioksidan dari senyawa dimer yang
dihasilkan tersebut.
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
2.1 Teh
Di zaman dahulu, genus Camellia dibedakan menjadi beberapa spesies teh
yaitu sinensis, assamica, irrawadiensiesis. Menurut Graham HN (1984); Van
Steenis CGGJ (1987) dan Tjitrosoepomo (1989), tanaman teh Camellia sinensis
diklasifikasikan sebagai berikut (Tuminah, 2004).
5 Universitas Indonesia
karena terjadi pemecahan klorofil dan terlepasnya unsur tanin. Proses selanjutnya
berupa pemanasan basah dengan uap panas agar kandungan air pada daun
menguap dan proses oksidasi bisa dihentikan pada tahap yang sudah ditentukan.
Pengolahan daun teh sering disebut sebagai "fermentasi" walaupun
sebenarnya penggunaan istilah ini tidak tepat. Pemrosesan teh tidak menggunakan
ragi dan tidak ada etanol yang dihasilkan seperti layaknya proses fermentasi yang
sebenarnya. Pengolahan teh yang tidak benar memang bisa menyebabkan teh
ditumbuhi jamur yang mengakibatkan terjadinya proses fermentasi. Teh yang
sudah mengalami fermentasi dengan jamur harus dibuang, karena mengandung
unsur racun dan unsur bersifat karsinogenik.
Pengelompokan teh berdasarkan tingkat oksidasi:
Teh putih
Teh yang dibuat dari pucuk daun yang tidak mengalami proses oksidasi dan
sewaktu belum dipetik dilindungi dari sinar matahari untuk menghalangi
pembentukan klorofil. Teh putih diproduksi dalam jumlah lebih sedikit
dibandingkan teh jenis lain sehingga harga menjadi lebih mahal. Teh putih
kurang terkenal di luar Tiongkok, walaupun secara perlahan-lahan teh putih
dalam kemasan teh celup juga mulai populer.
Teh hijau
Daun teh yang dijadikan teh hijau biasanya langsung diproses setelah dipetik.
Setelah daun mengalami oksidasi dalam jumlah minimal, proses oksidasi
dihentikan dengan pemanasan (cara tradisional Jepang dengan menggunakan
uap atau cara tradisional Tiongkok dengan menggongseng di atas wajan
panas). Teh yang sudah dikeringkan bisa dijual dalam bentuk lembaran daun
teh atau digulung rapat berbentuk seperti bola-bola kecil (teh yang disebut
gun powder).
Oolong
Proses oksidasi dihentikan di tengah-tengah antara teh hijau dan teh hitam
yang biasanya memakan waktu 2-3 hari.
Teh hitam atau teh merah
Daun teh dibiarkan teroksidasi secara penuh sekitar 2 minggu hingga 1 bulan.
Teh hitam merupakan jenis teh yang paling umum di Asia Selatan (India, Sri
Universitas Indonesia
Jepang adalah "teh merah" karena air teh sebenarnya berwarna merah. Orang
Barat menyebutnya sebagai "teh hitam" karena daun teh berwarna hitam. Di
Afrika Selatan, "teh merah" adalah sebutan untuk teh rooibos yang termasuk
golongan teh herbal. Teh hitam masih dibagi menjadi 2 jenis: Ortodoks (teh
diolah dengan metode pengolahan tradisional) atau CTC (metode produksi
teh Crush, Tear, Curl yang berkembang sejak tahun 1932). Teh hitam yang
belum diramu (unblended) dikelompokkan berdasarkan asal perkebunan,
tahun produksi, dan periode pemetikan (awal musim semi, pemetikan kedua,
atau musim gugur). Teh jenis Ortodoks dan CTS masih dibagi-bagi lagi
menurut kualitas daun pasca produksi sesuai standar Orange Pekoe.
Pu-erh (Pu li dalam bahasa Kantonis)
Teh pu-erh terdiri dari dua jenis: "mentah" dan "matang." Teh pu-erh yang
masih "mentah" bisa langsung digunakan untuk dibuat teh atau disimpan
beberapa waktu hingga "matang". Selama penyimpanan, teh pu-erh
mengalami oksidasi mikrobiologi tahap kedua. Teh pu-erh "matang" dibuat
dari daun teh yang mengalami oksidasi secara artifisial supaya menyerupai
rasa teh pu-erh "mentah" yang telah lama disimpan dan mengalami proses
penuaan alami. Teh pu-erh "matang" dibuat dengan mengontrol kelembaban
dan temperatur daun teh mirip dengan proses pengomposan. Teh pu-erh
biasanya dijual dalam bentuk padat setelah dipres menjadi seperti batu bata,
piring kecil atau mangkuk. Teh pu-erh dipres agar proses oksidasi tahap
kedua bisa berjalan, karena teh pu-erh yang tidak dipres tidak akan
mengalami proses pematangan. Semakin lama disimpan, aroma teh pu-erh
menjadi semakin enak. Teh pu-erh yang masih "mentah" kadang-kadang
disimpan sampai 30 tahun bahkan 50 tahun supaya matang. Pakar bidang teh
dan penggemar teh belum menemui kesepakatan soal lama penyimpanan
yang dianggap optimal. Penyimpanan selama 10 hingga 15 tahun sering
dianggap cukup, walaupun teh pu-erh bisa saja diminum setelah disimpan
kurang dari setahun. Minuman teh pu-erh dibuat dengan merebus daun teh
Universitas Indonesia
pu-erh di dalam air mendidih seringkali hingga lima menit. Orang Tibet
mempunyai kebiasaan minum teh pu-erh yang dicampur dengan mentega dari
lemak yak, gula dan garam.
Universitas Indonesia
2. Kafein
3. Theanine
4. Saponin
Universitas Indonesia
berbanding terbalik dengan kadar serum kolesterol total (TC) dan low density
lipoprotein (LDL-C), tetapi tidak terhadap trigliserida (TG) dan high density
lipoprotein (HDL-C).
Antioksidan digunakan untuk mencegah kerusakan tingkat seluler yang
akan mengakibatkan penyakit tertentu, khususnya kanker. Antioksidan dalam
makanan juga digunakan untuk mencegah terjadinya proses oksidasi, seperti pada
lemak.
Potensi antioksidan dari polifenol teh hijau khususnya senyawa katekin
secara langsung berhubungan dengan kombinasi cincin aromatis dan kelompok
hidroksil yang membangun struktur katekin dan sebagai hasilnya adalah mengikat
dan menetralkan radikal bebas oleh grup hidroksil. Sebagai tambahan, polifenol
teh hijau mendorong aktivitas detoksifikasi komponen xenobiotika, dan juga dapat
mengikat (kelator) ion logam seperti besi yang mana dapat mengakibatkan radikal
bebas oksigen (Anonymous, 2000 dalam skripsi Imannulkhan, 2006).
Menurut Ong dan Pocker (1992) dalam skripsi Imanulkhan (2006)
menyatakan bahwa cara kerja flavonoid sebagai antioksidan sebagai berikut:
1. Sebagai Scavenger radikal bebas yang terbentuk baik selama
persiapan bahan pangan atau radikal bebas yang dihasilkan proses
metabolik tertentu di dalam substrat.
2. Sebagai kelator, flavonoid dapat membentuk kompleks dengan logam
transisi seperti tembaga, dan mencegah kerusakan asam askorbat
dengan besi sehingga dapat mencegah reaksi inisiasi radikal bebas.
3. Mencegah peroksida lemak melalui cara mengkombinasikan sifat
kelator dan sifat antioksidan flavonol. Quercetin ditemukan efektif
mengahambat ion besi.
2.5 Katekin
Kunci utama dari khasiat teh pada komponen bioaktifnya, yaitu polifenol
yang secara optimal terkandung dalam daun teh yang masih muda dan utuh.
Katekin merupakan senyawa polifenol utama pada teh sebesar 90% dari total
kandungan polifenol (Anonymous, 2007).
Universitas Indonesia
Katekin adalah senyawa dominan dari polifenol teh hijau yang merupakan
senyawa larut dalam air, tidak berwarna dan memberikan rasa pahit (Alamsyah,
2006). Katekin merupakan kerabat tanin terkondensasi yang juga sering disebut
polifenol karena banyaknya gugus fungsi hidroksil yang dimilikinya. Katekin teh
hijau tersusun sebagian besar atas senyawa-senyawa katekin (C), epikatekin (EC),
galokatekin (GC), epigalokatekin (EGC), epikatekin galat (ECG), dan
epigalokatekin galat (EGCG). Perbedaan dari beberapa jenis katekin dilihat dari
jumlah gugus hidroksilnya (Robinson, 1995).
Konsentrasi katekin sangat tergantung pada umur daun. Pucuk dan daun
pertama paling kaya katekin galat. Kadar katekin bervariasi tergantung pada
varietas tanaman tehnya. Sifat-sifat kimia dan fisik pucuk daun teh akan
mempengaruhi perubahan katekin dalam pucuk daun tehnya.
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Tabel 2.4. Kandungan Nutrisi Bawang Bombay (dalam 100 g bawang bombay)
Universitas Indonesia
2.8 Peroksidase
Enzim atau biokatalisator adalah katalisator organik yang dihasilkan oleh
sel.Enzim sangat penting dalam kehidupan, karena semua reaksi metabolisme
dikatalis oleh enzim. Jika tidak ada enzim, atau aktivitas enzim terganggu maka
reaksi metabolisme sel akan terhambat hingga pertumbuhan sel juga terganggu.
Reaksi-reaksi enzimatik dibutuhkan agar bakteri dapat memperoleh
makanan/ nutrient dalam keadaan terlarut yang dapat diserap ke dalam sel,
memperoleh energi Kimia yang digunakan untuk biosintesis, perkembangbiakan,
pergerakan, dan lain-lain.Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul
substrat untuk menghasilkan senyawa intermediat melalui suatu reaksi kimia
organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah, sehingga percepatan
reaksi kimia terjadi karena reaksi kimia dengan energi aktivasi lebih tinggi
membutuhkan waktu lebih lama.
Meskipun senyawa katalis dapat berubah pada reaksi awal, pada reaksi
akhir molekul katalis akan kembali ke bentuk semula. Sebagian besar enzim
bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu
macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur
kimia tiap enzim yang bersifat tetap.
Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama
adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan
suhu dan pH (tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim
adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman
berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja
secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Peroksidase (EC 1.11.1.7) merupakan salah satu enzim yang tahan panas.
Jenis reaksi yang dikatalis oleh peroksidase melibatkan hidrogen peroksida
sebagai penerima, dan senyawa AH2 sebagai donor atom hidrogen, seperti
ditunjukkan berikut ini:
Pada reaksi ini tidak ada oksigen molekul yang terbentuk. Kerja
peroksidase dalam sayuran berguna untuk pendeteksian keefektifan pemutihan,
sedangkan enzim tersebut dapat juga merusak sayuran sehingga mengakibatkan
bau rasa yang menyimpang. Selain itu juga berguna dalam penentuan glukosa
dalam suatu bahan pangan yang dikombinasikan dengan glukosa peroksidase.
Kerja peroksidase dalam buah yaitu mengakibatkan terjadinya pencoklatan.
Dalam buah terdapat peroksidase, itu sebabnya buah dan sayur yang dikupas atau
dipotong akan berwarna kecoklatan jika didiamkan begitu saja.
Dari hasil penelitian diketahui bahwa peroksidase memiliki peranan dalam
proses lignifikasi, cross linking struktur protein pada dinding sel, katabolisme
auksin, dan pertahanan diri terhadap pathogen.
Peroksidase pada tumbuhan mengandung dua ion kalsium (Ca2+) yang
sangat penting untuk stabilitas struktural dan stabilitas termal dari enzim agar
Universitas Indonesia
sama seperti aktivitas in vitro ketika dianalisis (Manu and Prasada Rao, 2009).
Peroksidase secara luas digunakan pada laboratorium kesehatan dan industri
sebagai aplikasi untuk konservasi lingkungan.
Peroksidase merupakan enzim yang mengandung kofaktor heme pada
sisi aktifnya, yang dapat mengkatalisis reaksi oksidasi dari berbagai senyawa
organik maupun anorganik dengan adanya H2O2 sebagai akseptor elektron.
Universitas Indonesia
OH OH
OH OH
O
OH
Universitas Indonesia
Hasil kopling radikal fenoksi ini dapat membentuk dimer fenol, baik pada
posisi orto-orto, para-para, maupun orto-para. Selain itu, juga terdapat
kemungkinan penggabungan O-para, O-orto, O-O, dan C-C.
Reaksi yang dikatalis dengan menggunakan peroksidase dengan
menggunakan H2O2 akan menghasilkan produk radikal dimana radikal tersebut
akan mengalami penggabungan dengan senyawa lain yang memiliki radikal.
Senyawa katekin dapat mengalami proses kopling oksidatif yang sama dengan
senyawa fenolik.
Universitas Indonesia
OH
OH OH
O
HO O
OH HO OH
OH
OH HO
OH
OH
OH
HO O
OH
HO O O
OH
OH OH
OH HO OH
HO O
OH
OH
HO
OH
O OH
HO OH
HO O
OH
OH
HO OH
O
OH
HO
OH
Universitas Indonesia
2.4 Antioksidan
Antioksidan merupakan zat yang mampu memperlambat atau mencegah
proses oksidasi. Zat ini secara nyata mampu memperlambat atau menghambat
oksidasi zat yang mudah teroksidasi meskipun dalam konsentrasi rendah.
Antioksidan juga sesuai didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi
sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif jika berkaitan dengan
penyakit, radikal bebas ini dapat berasal dari metabolisme tubuh maupun faktor
eksternal lainnya. Radikal bebas adalah spesies yang tidak stabil karena memiliki
elektron yang tidak berpasangan dan mencari pasangan elektron dalam
makromolekul biologi. Protein lipida dan DNA dari sel manusia yang sehat
merupakan sumber pasangan elektron yang baik. Kondisi oksidasi dapat
menyebabkan kerusakan protein dan DNA, kanker, penuaan, dan penyakit
lainnya. Komponen kimia yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa
golongan fenolik dan polifenolik. Senyawa-senyawa golongan tersebut banyak
terdapat dialam, terutama pada tumbuh-tumbuhan, dan memiliki kemampuan
untuk menangkap radikal bebas.
Tipe radikal bebas turunan oksigen reaktif sangat signifikan dalam tubuh.
Oksigen reaktif ini mencakup superoksida (O2-), hidroksil (OH), peroksil
(ROO), hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet (1O2), oksida nitrit (NO),
peroksinitril (ONOO) dan asam hipoklorit (HOCl).
Sumber radikal bebas, bisa berupa sumber endogen maupun eksogen.
Sumber endogenous berasal dari hasil metabolism tubuh. Hal ini berlangsung
secara normal, dan tubuh memiliki enzim antioksidan alami yang dapat
menangkalnya. Sedangkan sumber radikal bebas eksogen berasal dari luar system
tubuh, diantaranya sinar UV dan zat kimia polutan.
Keberadaan radikal bebas yang membahayakan ini dapat ditangkal oleh
antioksidan. Antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim, vitamin, dan
senyawa-senyawa fenolik. Antioksidan vitamin lebih popular sebagai antioksidan
dibandingkan enzim. Antioksidan vitamin mencakup alfa tokoferol (vitamin E),
beta karoten dan asam askorbat (vitamin C). Sedangkan senyawa fenolik
merupakan antioksidan yang banyak terdapat pada teh, buah-buahan dan sayuran.
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Penelitian ini terbagi menjadi empat tahap utama, yaitu isolasi enzim
peroksidase dari kulit bawang bombay, karakterisasi enzim peroksidase, sintesis
senyawa dimer katekin dengan menggunakan katalis enzim peroksidase dari kulit
bawang bombay yang telah diisolasi dan uji aktivitas antioksidan dari senyawa
dimer yang terbentuk.
24 Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
memisahkan molekul enzim ekstrak kasar dari debris (serpihan sel). Supernatan
yang diperoleh dipisahkan dari endapannya.
Supernatan dalam beaker glass yang dilengkapi dengan ice salt bath
ditambahkan ammonium sulfat 0-30% sedikit demi sedikit pada suhu 0-50C, lalu
diaduk selama 2 jam. Kemudian larutan dibiarkan mengendap selama 1 malam di
lemari pendingin. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada 3400 rpm selama 6
menit pada suhu ruang.
Hal yang sama juga dilakukan untuk penambahan (NH4)2SO4 30-50% dan
50-70%. Pada penambahan garam dengan kejenuhan 50-70% endapan yang
diperoleh melalui sentrifugasi kemudian ditentukan aktivitas enzim dan kadar
proteinnya.
Universitas Indonesia
Bagan 3.1. Isolasi dan Pemurnian Enzim Peroksidasi dari Kulit bawang
Bombay
Kulit bawang bombay diblender
dengan larutan buffer fosfat pH 7
disaring
Endapan Filtrat
Endapan Supernatan
Endapan Supernatan
Endapan Supernatan
Endapan Supernatan
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Cairan kental
Uji KLT
Isolat
Identifikasi
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 10 ppm dalam metanol
(kontrol)
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 20 ppm dalam metanol
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 30 ppm dalam metanol Diukur absorbansinya pada
maks 515 nm
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 40 ppm dalam metanol
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 50 ppm dalam metanol
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 60 ppm dalam metanol
2 mL DPPH 0,4 mM + 2 mL
sampel 70 ppm dalam metanol
Universitas Indonesia
Pada penelitian ini, dilakukan sintesis suatu senyawa dimer katekin dengan
menggunakan katalis peroksidase dari kulit bawang bombay. Setelah peroksidase
berhasil diisolasi, kemudian dilakukan pemurnian dengan menggunakan
ammonium sulfat pada berbagai tingkat konsentrasi. Kemudian dilakukan
karakterisasi enzim meliputi pH optimum, dan suhu optimum.
Untuk mengetahui aktivitas dari peroksidase yang diperoleh maka
dilakukan uji aktivitas dan kadar protein dari enzim. Sedangkan penentuan kadar
protein pada peroksidase dilakukan dengan menggunakan metode Lowry.
Peroksidase yang diperoleh kemudian digunakan untuk mensintesis
senyawa dimer katekin dari daun teh. Pada senyawa hasil reaksi kemudian
dilakukan uji kromatigrafi lapis tipis (KLT), untuk mengetahui kehadiran senyawa
baru yang terbentuk. Untuk mengetahui struktur senyawa yang terbentuk maka
dilakukan pengujian dengan menggunakan Gas chromatography mass
spectrometry (GC-MS).
Hasil reaksi yang diperoleh, kemudian diuji aktivitas antioksidannya
dengan menggunakan metode radical scavenger menggunakan larutan DPPH
dalam metanol.
33 Universitas Indonesia
(a) (b)
Gambar 4.1 Enzim kasar (a) dan enzim fraksi III hasil pemurnian (b)
Universitas Indonesia
0.012
0.01
Absorbansi (nm)
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0 2 4 6 8 10
pH
0.004
0.0035
0.003
Absorbansi (nm)
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Suhu (0C)
Gambar 4.2 Grafik Penentuan pH optimum (atas) dan grafik penentuan suhu optimum
(bawah)
Universitas Indonesia
Fenol
4-aminoantipirin Kuinonimina
Gambar 4.3 Pembentukan Kuinonimina
Propagasi
Universitas Indonesia
Terminasi
Universitas Indonesia
menghasilkan warna yang jelas, namun saat ditambahkan Follin terbentuk warna
ungu muda dan lebih sensitive dibanding reaksi Biuret saja.
(a) (b)
Gambar 4.4 Uji aktivitas enzim (a) kadar protein (b)
mg/mL
y = 1.5942x + 0.0721
Absorbansi (nm)
1.5
R = 0.9871
1
0.5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Konsentrasi (mg/mL)
Universitas Indonesia
Setelah menentukan kadar protein pada enzim, maka dapat dihitung aktivitas
spesifik enzim dengan menggunakan persamaan Wortington Manual Enzyme yang
dimodifikasi:
(a) (b)
Gambar 4.6. Senyawa katekin (kiri (a)) hasil reaksi antara katekin dengan enzim
peroksidase (kanan (a)), Ekstrasi hasil reaksi (b).
Universitas Indonesia
Katekin
(monomer)
Hasil reaksi
Gambar 4.7. KLT senyawa katekin dan KLT senyawa hasil reaksi
Universitas Indonesia
Dari hasil pengujian, diperoleh 3 spot yang terdiri dari spot 1 dengan Rf =
0,91 (spot ini sama dengan spot katekin, berarti menunjukkan bahwa masih ada
katekin yang belum bereaksi), spot 2 dengan Rf = 0,60 (berukuran lebih kecil
daripada spot ketiga, berarti menunjukkan hasil samping reaks, by product). Spot
3 dengan Rf = 0,45 (berukuran lebih besar dibandingkan dengan spot kedua,
berarti menunjukkan hasil reaksi utama, main product).
Pada senyawa substrat (katekin) dan senyawa hasil reaksi dilakukan uji
dengan menggunakan instrument GC-MS untuk melihat berat molekul senyawa
yang dihasilkan. GC-MS adalah metode yang menggabungkan kromatografi gas
(pemisahan senyawa) dan spektrometer massa untuk mengidentifikasi zat-zat
yang terdapat dalam sampel dan menentukan berat molekulnya serta pola
fragmentasinya untuk mengetahui struktur molekul suatu senyawa. Saat sampel
diinjeksikan dalam injector GC, kemudian sampel diubah menjadi gas pada suhu
tinggi. Gas yang terbentuk dibawa oleh fase gerak, gas nitrogen melewati kolom
kapiler yang berisi fasa diam. Zat yang memiliki afinitas lebih rendah terhadap
fasa diamnyanakan keluar terlebih dahulu sehingga waktu retensinya rendah.
Sebaliknya zat yang memiliki afinitas lebih besar akan keluar lebih lama sehingga
waktu retensinya tinggi.
Universitas Indonesia
Setelah zat terpisah dalam GC, dalam bentuk aliran gas akan masuk
kedalam separator jet, yang akan mempercepat momentum molekul analit yang
berat, sedangkan atom nitrogen yang ringan sebagai fasa gerak akan dibelokkan
oleh pompa vakum. Molekul analit akan masuk dan ditembak oleh sumber ion
dalam spektrometer massa, sehingga terbentuk spektrum massa berbagai puncak
dalam bentuk fragmen-fragmen. Setelah pemisahan selesai, rekonstruksi spektrum
massa untuk tiap puncak dapat ditampilkan pada komputer. Senyawa katekin dari
ekstrak teh hijau dianalisis dengan GC-MS, menghasilkan kromatogram sebagai
berikut:
Universitas Indonesia
Dari data ini dapat terlihat bahwa terdapat senyawa dengan merat molekul 290
dengan pola fragmentasi seperti ditunjukkan pada Gambar 4.11 di bawah ini:
OH OH
H+
O OH
HO O
OH
HO CH2
OH
OH HO OH
Universitas Indonesia
Setelah diperoleh senyawa katekin dari ekstrak teh hijau, maka dilakukan
reaksi dimer senyawa katekin. Pada senyawa hasil reaksi dilakukan analisis
dengan menggunakan instrumen yang sama yaitu GC-MS. Hasil analisis
ditunjukkan oleh Gambar 4.12 di bawah ini:
Dari kromatogram di atas dapat dilihat bahwa ada satu puncak tertinggi
dengan waktu retensi 13,878 menit. Pada waktu retensi tersebut diketahui terdapat
senyawa dengan berat molekul 578,1. Senyawa ini diduga sebagai senyawa dimer
katekin. Data m/z sebesar 578,1 ini menunjukkan terbentuknya kopling dari 2
molekul katekin yang masing-masing kehilangan 2 atom H, dengan perhitungan:
2 x (Mr katekin) 2H = (2 x 290) 2 = 578. Gambar spektrum massa hasil reaksi
dapat dilihat pada Gambar 4.13 di bawah ini:
Universitas Indonesia
Tabel 4.3 Perbandingan antara spektum massa hasil sintesis senyawa dimer katekin dengan
hasil penelitian Angelyne Benavides dan Paola Montoro
Universitas Indonesia
OH
OH
HO O
OH
OH
HO
OH
O OH
HO OH
Universitas Indonesia
OH
OH
HO O
OH
OH
HO
OH
_
O OH
_ HO OH m/z = 170
m/z = 126
m/z = 578
_
m/z = 152
m/z = 408
m/z = 452
OH
_
HO O
m/z = 426 OH
OH
OH
m/z = 120
m/z = 332 m/z = 290
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
Gambar 4.19. Hasil uji aktivitas antioksidan (a) dan (c) kontrol, (b) senyawa katekin, (d)
senyawa hasil reaksi
DPPH memberikan warna ungu karena adanya radikal bebas pada atom N
yang dapat membentuk diazo, dimana absorbansi maksimumnya adalah 515 nm.
Adanya penambahan sampel yang diduga berperan sebagai antioksidan dapat
menangkap radikal bebas DPPH. Penangkapan ini menurunkan terjadinya
pembentukan diazo, sehingga penurunan warna warna ungu selaras dengan
kemampuan aktivitas sebagai radical scavenger. Proses perubahan warna dari
ungu menjadi kuning ini diukur pada panjang gelombang 515 nm.
Gambar 4.20. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan antioksidan
(Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010)
Universitas Indonesia
0.8
Absorbansi (515 nm)
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
Universitas Indonesia
60
50
40
%inhibisi
y = 0.4953x + 20.159
30
R = 0.9708
20
10
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
60.000
50.000
% inhibisi
40.000
y = 0.4265x + 24.867
30.000 R = 0.9787
20.000
10.000
0.000
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
60.5
60
59.5
59
58.5
58
Katekin Hasil Reaksi
Gambar 4.25. Nilai IC50 antara katekin dan senyawa hasil reaksi
Universitas Indonesia
Universitas Indonesia
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa:
1. Bawang bombay (Allium cepa L.) mengandung enzim peroksidase dengan
aktivitas spesifik 0,284 unit/mg protein.
2. Senyawa dimer dari katekin berhasil disintesis dengan katalis enzim
peroksidase dari kulit bawang bombay dengan kondisi optimum
peroksidase pada pH 5 dan suhu 300C.
3. Reaksi antara katekin dan H2O2 yang dikatalisis oleh peroksidase
menghasilkan produk berupa padatan hijau tua dengan berat 0,2170 gram.
4. Produk dimer yang terbentuk merupakan senyawa 4-8 dikatekin, melalui
mekanisme reaksi kopling oksidatif radikal katekin pada posisi C-4 dan
C-8.
5. Senyawa 4-8 dikatekin mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih
besar dibandingkan dengan katekin dengan perbandingan IC 50 adalah
60,248 : 58,928. (katekin : dimer katekin).
5.2. Saran
Berdasarkan hasil dan kesimpulan yang diperoleh, maka disarankan
sebagai berikut:
1. Belum maksimalnya hasil yang diperoleh dari sintesis senyawa dimer
katekin yang telah dilakukan, maka disarankan untuk melakukan
penelitian lanjutan dengan menggunakan optimasi terhadap perbandingan
substrat, H2O2, dan enzim yang dipakai, serta optimasi kondisi reaksi yang
berlangsung.
2. Perlu dilakukan pemurnian kristal yang diperoleh dari hasil reaksi
sehingga bisa dianalisis dengan menggunakan alat yang lain.
54 Universitas Indonesia
D Archivio M., Filesi C., Di Benedetto R., Gargiulo R., Giovanni C and Masella
R. (2007). Polyphenols, dietary sources and bioavailability. Ann Istituto
Superior di Sanita 43(4), 348-361.
Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N.,
2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A
Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochemical Analysis,
13, 8-17.
55 Universitas Indonesia
Sonia, Mousounni. 2011. Crude Peroxidase From Onion Solid Waste as a Tool
For Organic Synthesis. Part II: Oxidative Dimerization-Cyclization of
Methyl p-Coumarate, Methyl Caffeat and Methyl Ferulate. Greece:
Elsevier.
Tuminah, S., 2004. [(Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast)] Sebagai
Salah Satu Sumber Antioksidan, Pusat Penelitian dan Pengembangan
Pemberantasan Penyakit, Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta, Cermin Dunia Kedokteran No. 144,
2004.
Universitas Indonesia
Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination of
Scavenger Properties, http://www.baltic-analytics.de/index.
php?id=7&L=1, diakses tanggal 14 April 2012.
Zaveri, Nurulain. 2005. Green tea and its polyphenolic catechins: Medicinal uses
in cancer and noncancer applications. USA: Science direct.
Universitas Indonesia
0.5000
0.0000
0.0000 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000
Konsentrasi (mg/mL)
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
0.8405
0.7265
0.6815
0.636
0.5895
0.543
0.4965
Katekin 10 ppm:
, ,
% = 100 % = 21,788 %
,
%inhibisi
30 36.546 y = 0.4953x + 20.159
30
40 40.782 R = 0.9708
20
50 45.112
60 49.441 10
70 53.771 0
0 20 40 60 80
Konsentrasi (ppm)
y = 0.4265x + 24.867
30 36.173 30.000
R = 0.9787
40 40.642 20.000
50 45.577 10.000
60 50.000 0.000
0 20 40 60 80
70 56.611
Konsentrasi (ppm)
59.5
59
58.5
58
Katekin Hasil Reaksi
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50
Time-->
Abundance
# 1 1 8 2 7 4 : C a t e c h in
1 3 9 .0
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000 2 9 0 .0
6 9 .0
1000
3 9 .0
1 0 7 .0 1 6 7 .0
8 8 .0 1 8 7 .0 2 0 8 .0 2 4 5 .0 2 7 1 .0
0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
m / z -->
T IC: CA T E CH IN S CA N .D \ d a ta .m s
1 3 .8 7 8
600000
550000
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0 1 6 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0 2 2 .0 0
T im e -->