DETERMINACION DE PREGNANDIOL EN EMBARAZO Y CICLO MENSTRUAL NORMALES R. GUERRA-GARCIA I"), IVONNE PUENTE (7), L.A, LLERENA (7) (7) Deportomento de Ginecologio y Obstetricio Universidad Pervena Cayetono Heredio. INTRODUCCION El pregnandiol es el principal catabolite de lo progesterona, esteroi- de de 21 dtomos de carbono producide por la placenta, cuerpo listeo del ava- rio y corteza suprarrenal; se excreta en pequefia cantidad, alrededor de | mg./24 hs. en hombres, en mujeres en fase folicutar y en nifos prepuberes; el recién nacido no excreta pregnandiol ni aun después de la administracién de 25 mg. de progesterona (1) la determinacién de pregnandiol urinario constituye uno de los méto- dos de verificar la ocurrencia de ovulacién en una mujer, pues en tal situacién se produce un caracteristico incremento del pregnandiol a cifras de 3-5 mg./ 24 hs., este pregnandiol es originado en progesterona producide por el cuer- po Idteo y persiste elevado mientras éste tiene actividad, disminuyendo ci fras de alrededor de 1 m. al ocurrir la menstruacién. Cuando el dvulo es fe cundado; la actividad del cuerpo luteo se extiende hasta el Jer. mes de em barazo, y el pregnandiol incrementado desde la ovulacién continda elevando su excrecién urinaria en cada mes de embarazo. La placenta completamente estructurada tiene lo copacidad de sintetizar progesterona, la cual se catabo- liza a pregnandiol, e! cual continda incrementéndose hasta el final del em barazo. De lo expuesto se deduce la importancia que tiene esta determinacién en Ia clinica ginecolégica, pera diagnosticor problemas de esterilidad por ci- clos anovulatorios, y en la prdctica obstétrice para la evaluacién de la ame- naza de aborto e inadecuada funcién placentaria. Estas son las razones que han movido a presentar este trabajo, el cual emplea un nuevo método, cuya principal ventaja es su rapidez y relative sen (*) Troboje presentodo pora obtener el grado de Bachiller an Farmacio U.N.M.S.M., Diciembre 1966.14 Drs. R. GUERRA-GARCIA, IVONNE PUENTE YL. A. LLERENA —Asni-Acosro 1967 Gisre, ¥ Ons cillez; en nuestro medio se han realizado determinaciones de pregnandiol des- de 1963 (2), pero hasta la fecha careciamos de una curva de normalidad en el emborazo, patrén indispensable para la comparacién de valores oblenidos en potologia. Se ha escogido el primer y tercer trimestre de embarazo por corresponder a las épocas criticas en clinica obstétrica METODO, Hemos usado el método descrito por Sulimovici, Lunenfeld y Shelesnyak (3) que en sintesis supone lo siguiente: Una alicuota de 1/150 - 1/100 en casos ce embarazo} 6 1/25 (en fase luteal 0 folicular) de la orina de 24 hs. se filtra y después hidroliza a refiujo con HCL, concentrado (1/10 del volumen orina usade} por 10 minutos a ebu- llicién; luego se deja enfrior. El hidrolizado es extraide con 25 cc. de una mezcla éter: alcohol absoluto (4:1 v/v) tres veces; el extracto orgénico se lava con, NaOH (20 cc.) y Ivego con agua (2 X 20 cc). Después de deshidra- tada con Nay SO,, lo mezcla de solventes se evapora a sequedad y se trans- fiere cuantitativamente con cloroformo a un tubo de 5 ml, y nuevamente se evapora a sequedad; el extracto diluido en 0.5 ml. de cloroformo es aplicado en una linea de 5 cm. de longitud en una placa de silica gel de 500 u. de espesor; igualmente se aplican a cade lado de esta ploca dos standards de pregnandiol de 25 y 50 ug. ¢/u., que se denominan standard referencia y standard patrén. La aplicacién se hace a 20 mm. una de otra y a 25 mm del borde inferior de la place. Se coloca la placa en un tanque de vidrio que contiene una mezcla de cloroformo: acetona (80: 20 v/v} como fase mévil, y se deja correr por 50 minutos, lo cual es suficiente para que el frente del sol- vente Ilegue hasta el borde superior de lo place. Después de corrida la placa sus bordes loterales son rociades con éci- do ortofosférico al 40% (zona correspondiente a los standards de referencia) protegiendo los standards patrén y extracto problema; después se coloca la placa en una estufa a 110°C por 10 minutos, lo cual determina lo aparicién de manchas gris oscuro en las zonas donde se encuentra el pregnandiol. ta localizacién y tamaiio de Jas manchas orientan las zonas de la placa que se ran removidas, para lo cual puede usarse una navaja como espétula. La si. ica removida se transfiere @ tubos de pruebo a los que se agrega 3 mi. de H,SO, concentrado y més 0 menos 3 mg. de sulfite de sodio anhidro, luego se calienta a bafio-maria a 56°C por 10 minutos, se centrifuga por 5 minu tos a 3,000 rp.m. y se transfiere a las cubetas para las lecturas correspon- dientes 0 380, 425 y 470 mu., en un espectrofotémetro. Los lecturas a 425 mu. sufren la correccién de Allen (4) y una porcién de silica gel de la mismaVowusen XIU DETERMINACION DE PREGNANDIOL EN EMBARAZO 15 Nuseeuoe 1-2 ploca elvida con acido sulfirico sirve como blanco. Hemos usado el espectrofotd- metro Zeiss PMQ lI, Para determinar la creatinina urinaria, se ha empleado el método de Philips (5) Sujetos Se ha realizado un total de 85 determinaciones de pregnandiol urina- rio en 75 mujeres distribuidas en los siguientes grupes: Grupo A: 12 mujeres normales no gestantes de 16-28 afios de edad, a las cuales se les determiné pregnandiol urinario en dos diferentes fechas del ciclo menstrual normal; en la primera fase del 4°-8° dia del ciclo y en 2* del 19°- 23° dia del ciclo menstrual. Sus datos individuales aparecen en los cuadros Nos. 1 y 2 Grupo B: 63 mujeres gestantes normales divididas en 6 sub-grupos de acuerdo al tiempo de gestacién. iempo de embarazo 5*- 8* semana: 1) mujeres normales 9#-12* semana: 10, ” 13?- 16? semana: 10, 17*. 20° semana: 11 25-28" semana: 10 37*- 40% semana: 11, ” TOTAL 63. mujeres normales Grupo C: 1] mujeres normales, dos de las cuales eran gestanies; en todas ellas se hizo la determinacién de pregnandiol urinario por los métodos Sulimovici y Klopper. Las colocames en un grupo aparte por desconocer el tiempo de gestacién y el dia del ciclo, por lo tanto la fase a la cual pertene cen estes determinaciones se realizaron con el objeto de comparar los resul- todos con uno y otro método, los cuales aparecen en el cuadro N° 7 Los muestras de orina correspondieron en su mayoria a gestantes del Hospital Militar Central y Hospital Arzobispo Loayza de Lima.16 Drs. R. GUERRA-GARCIA, IVONNE PUENTE YL. A. LLERENA — Aume-Acosro 1967 Grete, ¥ Ons CUADRO NYT CARACTERISTICAS DE LAS 12 MUJERES NORMALES EN QUIENES SE DETERMINO PREGNANDIOL EN LAS DOS FASES DEL CICLO MENSTRUAL caso EDAD MENARQUIA PESO TALULA DIA DEL ciclo fos edad K. rts, VP fose 2° fase cy 23 2 60.0 1.60 ” ar Pc. 26 13 50.5 1.46 ° 19° Pa 23 2 51.0 184 ° 23° a) 28 12 52.0 156 7 23° eV. 23 M4 63.0 162 r 2a Fa. 2 12 55.0 1.58 s 23° FC 21 12 54.0 1.64 7 a1 mu 7 n 62.0 187 e 29° AE 16 10 64.0 1.87 e ler FN, 22 n 58.0 1.60 7 22° Me. . 9 13 61.0 1.64 ~ 22 Jc. 28 2 55.5 Let a — CUADRO. NT 2 EXCRECION DE PREGNANDIOL POR GRAMO DE CREATININA EN LA 1? y 2° FASE DEL CICLO MENSTRUAL NORMAL caso Ig. de P-Diol/g. Creat. fase cu. 1.21 619 Pc, 0.69 4.22 Pa 1.37 ayy Ps. 0.68 4.06 EV. 198 3.88 FM 1.07 3.12 FC 0.93 3.49 ML 0.87 3.45 AE 0.52 2.64 EN 1.09 245 MB. - 2,83 4c. 124 = MEDIA 1.00 3.65Voeumex XII DETERMINACION DE PREGNANDIOL EN EMBARAZO. 7 Novenaos 1-2 RESULTADOS En el cuadro N° 2 se presentan las cifras obtenidas en mujeres norma- les durante el ciclo menstrual; en 11 casos, lo media obtenida para lo fase folicular fue 1.00 = 0.15 mg. ESt., los valores extremos de 0,33~1.98; en la 2* fase del ciclo ef pregnandiol se determind en 11 mujeres y el valor me- dio fue de 3.65 + 0.33 E.St. con valores extremos de 2,15—6.19; la diferen cia existente entre los valores medios de las dos fases del ciclo menstrual es altamente significativa (p <0.001). CUADRG NP 3 EXCRECION DE PREGNANDIOL POR GRAMO DE CREATININA EN LOS DIVERSOS MESES DEL EMBARAZO NORMAL 2° MES. 3° Mes a? MES Coro diol mg./g. creat. Case Pio! mg./g. creo. ose Palol mg./g. creat Le. 4.33 Vi 855 cM, 9.26 AH, 3.47 IN. 356 me 46 BM 4.03 os. 10.83, cH. 5.86 ET. 10.38 Ca 10.92 cc 9.47 cr 1158 cB. 5.86 om 7.99 LH, 13.21 IC. a Ne. 10.30 RA 4.03 MG. 74 NR 7.30 TA 70 cs. 8.95 mc. oan Mr 7.84 Ua. 10.05 ry 9.24 AS. 7:90 Ss. 12.57 MM, 10.47 AC. 912 MEDIA 754 MEDIA 9.19 MEDIA 8.32 SP MES 7 Mes vor MES Coro diol mg./9. creat. Paiol mg./g. creat Cote mg./g. cree. Dz. 9.30 LB, 9.88 ma. 24.75 RY, 10.18 MM. 26.45 LF, 31.08 RS, 10.56 cs. 26.70 ZG. 13.97 ce 11.26 EG. 36.33 MSG. 26.23 1B. 11159 NG 16.80 YR 31.90 Me. 1170 MY. 17.70 Zi 35.26 LH 13.39 GR, 14.22 LG. 39.38 RS. 14.50 ST. 19.67 cA 42.97 Lv. 12.97 EN. 22.68 6s. 14.30 MG. 12.69 mu 26.00 be, 19.00 AG 19.62 = = MP 33.88 MEDIA 12.48 (MEDIA 20.64 MEDIA 28.9718 Drs, R. GUERRA-GARCIA, IVONNE PUENTE Y L. A. LLERENA — Asm-Acosto 1967 Case. ¥ Onsr En el cuadro N° 3 se presentan los valores de pregnandiol de las mu- jeres gestantes, cifras que estén expresadas en mg. de hormona por gramo de creatinine, en los diversos meses de embarazo, En el 2do. mes la excrecién de pregnandiol tuvo una media en il ca- sos 7.54 + 0,32 Et, teniendo como valores extremos 3.47 al 13.27 mg En el Ser. mes el valor medio fue de 9.19 + 0.65 E.St. con valores extremos de 5.86 o 12.57; este valor medio es significativamente mayor ol hallado en el 2do. mes (p <0.05) En el 4to. mes la media fue de 8.32 + 0.67, valor que no difiere sig- nificativamente del hallado en el 3er. mes (p <0.4 > 0.3); los valores extre- mos oscilaron de 4.16 a 10.47. EI promedio obtenido para el Sto. mes fue de 12.46 + 0.88 en 11 mu: jeres; los valores extremos entre 9.30-19.62 y la comparacién de las me- dias con el 4to. mes mostré una diferencia altamente significativa (p < 0.0011. En el 7mo. mes la media de 10 determinaciones fue de 21.64 = 0.80 que es muy superior a ta obtenida en el mes anterior (p < 0,001) los valores extremos entre 9.88 y 36.33 mg. Por ultimo, en el 10mo. mes la media tuvo un valor de 28.37 + 0.91 ESt. que es significativamente superior o la media del 7mo. mes (p <0.001} los valores extremos osciloron entre 13.97 y 42.37 mg CUADRO NY & ANALISIS ESTADISTICO DE LA EXCRECION OF PREGNANDIOL &N £L CICLO MENSTRUAL NORMAL Volores Fase Medio =. E. ST 0. s1 Extremos " n 1.00 + 0.15 0.46 0.33 — 1.98 2 u 3.65 £0.33 1.07 21S — 6.19 CUADRO NY S ANAUSIS ESTADISTICO DE LA EXCRECION DE PREGNANDIOL EN EL EMBARAZO NORMAL Nomero de Valores Mes Determinaciones Media 002 3° Mes de Gestacién < 0.05 3° Mes de Gestorién N=18 P= >0.90 4° Mes de Gestocién <040 4? Mos de Gestocién N= 19 > = <0001 5° Mes de Gestocién 5? Mos de Gestacisn Nae P= <0001 7° Mes de Gestacién 7° Mes de Gestacién N=19 P= <0001 10" Mes de Gestacién CUADRO.-N’ 7 COMPARACION DE LOS VALORES DE PREGNANDIOL OBTENIDOS CON LOS METODOS DE . KLOPPER Y SULIMOVICI N Klopper Sulimoviei 1 6.02 5.89 ona 2 1.8) 14d 0.37 3 2.00 1.83 017 4 9.78 9.12 — 0.64 5 1.90 2.64 + 0.64 6 23.45 23.68 $0.23 7 221 2.03 018 8 2.37 Lad 0.93 ° 0.86 116 + 0.30 10 1.62 1.94 —0.28 uw on 076 + 0.65 MEDIA —0.07 DSi. = 0.5534 ES. = 0.175 P= > 070 < 06020 Drs, R. GUERRA-GARCIA, IVONNE PUENTE Y L. A. LLERENA ——Asnit-Acosro 1967 Giwsc, ¥ Oner El cuadro N° 7 muestra los resultados obtenidos en la comparacién de los valores obtenides pora pregnandiol usando los métodos de Klopper y Suli- movici, la media de las diferencias fue 0.07 + 0.017 ESt., lo cual hace que no sean estadisticamente significatives (p <0.70 > 0.60). La grafica presenta objetivamente los valores medios de lo excrecién urinaria de pregnandiol en embarazo normal realizada en 63 casos. Los ba- rras muesiran el valor medio de pregnandiol = ESt I. Los némeros en las borras representan las determinaciones hechas. DISCUSION Los resultados obtenidos en la determinacién de pregnandio! urinario usando el método de Sulimovici muestran diferencia significative en las dos fases del ciclo mensual, con valores promedio similares a los obtenidos por el mismo autor y par otros laboratorios empleando métodos diferentes. DETERMINACION DE PREGNANDIOL URINARIO SEGUN LOS METODOS KLOPPER MICHIE Y BROWN (1955) ¥ EL METODO SULIMOCIVI APLICADO POR NOSOTROS Autor Tipe de orina N° de deter. Promedio en minaciones mg. /24 hs. Klopper Fose Proliferative 8 ae Sulimoviei (nosotros) Fose Proliferative u 1.00 Klopaer Fase Ivteinico 18 3.90 Sulimoviei (nosotros) Fose luteinico n 3.65 Aparece evidente de esta demostracién que el métode empleado por nosotros es adecuado para distinguir la fose proliferativa de la segunda fase © secre‘era en el ciclo mensvol. Hemos logrado obtener satisfactoriamente cifras de pregnandiol para la primera fase del ciclo mensual, no osi Sulimovici, el cual dice que su mé- todo es adecuade para los determinaciones de pregnandiol y allopregnan- diol durante la fase luteinica y embarazo pero no durante la fase folicular. Esta diferencia creemos que se debe a una ligera modificacién: Este grupo de muesiras en su proceso fueron calentadas por 30 minutos ontes de la lectura en el fotocolorimetro, a diferencia de los 10 minutos que indica Sulimovici, lo cual suponemos que no es suficiente pare una buena elucién y adecuado de- sorrollo de color de pequefias cantidadss de hormona, como en el caso de la primera fase del ciclo menstrual.Vosmes XII DETERMINACION DE PREGNANDIOL EN EMBARAZO. 2 Nuisinoe 1 Durante el embarazo las cifras de pregnandiol aumentan progresiva- mente con el tiempo de gestacién a excepcidn del cuarto mes que existe una caida en las cifros de pregnandiol, lo cual no tiene significacién estadistica y cuya interpretacién debe ser cuidadose; esta disminuida excrecién de preg- nondiol en la semana 14* ha sido descrita anteriormente por Ronnan y Wotiz {6}, quienes la atribuyen @ menor produccién de pregnantriol, el cual después de hidrolisis acide y en los sistemas cromatograticos por ellos usados tiene idéntico RF. al pregnandiol; los mismos autores han demostrado que la hidro- lisis acide transforma al pregnantriol en una sustancia con propiedades cro- matograficas similares al pregnandiol, siendo una interferencia en su dosaie. Para dilucidar si algo similar ocurre con le cromatogratia en capa fina, hemos hidrolisado 500 ug. de standard de pregnantriol (por duplicade} con &cido clorhidrico y hemos seguido el mismo proceso seguide por Sulimovici y obtenido lectures de 25.92 ug. en la zona correspondiente al pregnanciol y en cambio muy pequefia cantidad de pregnantriol en su zona respectiva; esta determinacién se hizo por reaccién colorimétrica con dcido sulfGrico; cuando inyectamos una alicuota de los standards de pregnontriol asi procesodos en el cromatagrafo de gas no logramos obtener ningin registro de masa, lo cual sefiala que la hidrélisis del pregnantriol produce: a) cambios en su molécula y origina compuestos con Rf. similares a los del pregnandiol en el sistema de cromatogratia que hemos usado; b) estos compuestos son capaces de produ- cir cromogenicidad con dcido sulfirico pero no se registran como molécula de esteroide en cromatografia de gas. Nuestras cifras de pregnondiol urinario son inferiores a los de otros au- lores, pues el método tiene una alta especificidad, como lo demuestra el si- guiente experimento: Se procesaron las muestras en idénticas condiciones a las descritas por Sulimovici, pero la silica fue eluide con etanol y éste evaporado bajo nitré- geno; el extracto diluido en acetona fue inyectado al cromatégrafo de gas, dando como resultado un solo pico en el trazado con un Rt. que corresponde ol stondard de pregnondiol. La columna usada fue de acero inoxidable y contenic como fase es- tacionaria SE-30 al 3% sobre Diotoport S. grano 80-100; la temperatura de la columna se mantuvo a 245°C, el detector a 250°C y el inyector a 255°C; la presién de nitrégeno fue de 30 libras por pulgada cuadrada Es'a nueva prueba de le especificidad del método cuando se aplica a orinas de embarazo viene a symarse a las demostraciones de Sulimovici que fueron la determinacién del punto de fusién y el espectro infrarrojo del pro- ducto final, El pregnandiol puro y las muestras de orina fueron tlevadas o través de todo el procedimiento. Los puntos de fusién de los productos fina- les asi como el punto de fusién mixto fueron similares.22° Drs: R. GUERRA-GARCIA, IVONNE PUENTE y L. A. LLERENA Ati Acosto 1567, Ginec. ¥ Onsr [a fovogeafia muestra de izquierds > derecho: Standard de pregnandiot (1 ug.) Muestea deb extracto urinario equivalente a ¢¢. orina pracerado, de acuerdo lay condiciones ya. deseritas Gromatdsrafo Perkin Elmer 801 Columna SE-39 39% 2 230°C. Detector de Iams Na-38 1b. La aceptocién de un método depende de la demostracién de su espe- cificidad acumulando tanta evidencia como sea posible; de la sensibilidad, 0 sea la mas pequefa cantidad de sustancia que es distinguible de cero; de la exactitud que se mide por los experimentos de recuperacién y de la precisiénVouunsen XIU DETERMINACION DE PREGNANDIOL EN EMBARAZO 2B Nuaerwos 1-2 al realizar una serie de dosajes por duplicado y verificando el coeficiente de variacién; todo esto es discutide por el autor al hacer la publicacién de su meétodo. Nuesiras muestras fueron procesados inmedia'amente después de la co- leccién debide a que la congelacién de muestras de orina puede llevar c fal sos _menores valores de pregnandiol (7). Hemos empleado la determinecié de creatinina para verificar que la coleccién urinaria era correcta, sin embar- go, debemos tener presente que se ha demostrado que en embsrazo normal hay un aumento de la excrecién de creatinina, el cual guarda buens correla cién con la produccién de hormona coriénica (8) SUMMARY The authors have studied the excretion of pregnandiol in 85 normal women by using the method of Sulimovici. During the menstrual cycle the mean values +: $.£, for 12 women were 1.0 + 0.15 and 3.65 + 0.33 mg./24 hr, for the proliferative and secretory phases respectively The mean values in 63 pregnant women were 7.54 = 0.32, 9.19 + 0.65, 8.32 + 0.67, 12.46 + 0.88, 21.64 + 0.8 and 28.37 + 0.91 mg./g. creati- nine for the months 2nd., 3rd., 4th., 5th., 7th. and 10th, The procedure was compared to Kloppers method and no differences were detected, As additional proof of the specificity of the method employed, the urine extracts were analyzed by gas-liquid chromatography ond, preg- nandiol was found to be the principal component of the final extract. BIBLIOGRAFIA, 4. ZANDER, J. and SOLTH. Klin. Wshe, 31 317, 1953, 2. GOMEZ, MARIA, Tesis Br. Facultad de Farmacia y Bioquimiea, UNMSAI, 1968 SULIMOVICI, S., LUNNENFELD, B. and SHILESNYAK, M. Acta Endocrinol. 49: 97, 1965, ALLEN, W. J. Clin. Endocrinol, 10: 71, 1980 PHILIPS, R. Quantitative Clini) Chemistry, vol 2, 1943, RONAN, F,, PARSONS, L.. NAMIOT, R. and WOTIZ, H, J. Clin, Endocrinol, 20; 385, 1960. COOPER, W., COYLE, M., JAMES, V. and NICHOLAS, ML J. of Endacrinol. 38: pg. XXI, 1966, SIMS, EAH. and KRANTZ, KE. J. Clin tnvest. 37: 1764, 1958,