See

discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/309116082

Diagnostics and molecular characterization of

plum pox virus

Article April 2016

CITATIONS READS

0 5

2 authors, including:

Zdenka Glov
Slovak University of Agriculture in Nitra - Slovenska posnohospodarska univerzita v Nitre
63 PUBLICATIONS 77 CITATIONS

SEE PROFILE

All content following this page was uploaded by Zdenka Glov on 22 November 2016.

The user has requested enhancement of the downloaded file. All in-text references underlined in blue are added to the original document
and are linked to publications on ResearchGate, letting you access and read them immediately.
Chem. Listy 110, 269275(2016)
DIAGNOSTIKA A MOLEKULRNA CHARAKTERISTIKA VRUSU Plum pox virus
JLIUS ROZKa a ZDENKA GLOVb
a
Oddelenie veobecnej a karantnnej diagnostiky, stred-
n kontroln a skobn stav ponohospodrsky Bratisla-
va, Osada 281, 044 57 Haniska pri Koiciach, b Katedra
biochmie a biotechnolgie, Fakulta biotechnolgie a
potravinrstva, Slovensk ponohospodrska univerzita
v Nitre, Trieda A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovensko
julius.rozak@gmail.com; Zdenka.Galova@uniag.sk
Dolo 26.1.15, prepracovan 12.8.15, prijat 26.11.15
Kov slov: Prunus, molekulrna diagnostika, polyme-
rzov reazov reakcia, vrus, biodiverzita
Obsah
1. vod
2. Molekulrna charakteristika vrusu Plum pox virus
3. Symptomatick prejavy vrusu Plum pox virus
4. Metdy diagnostiky vrusu Plum pox virus
4.1. Biologick diagnostika
4.2. Imunochemick metdy diagnostiky
4.3. Molekulrna diagnostika
5. Biodiverzita vrusu Plum pox virus
6. Zver
1. vod
Plum pox virus (alej PPV) je jednovlknov RNA
vrus o dke 660770 nm s obsahom 7 % RNA. Je zloe-
n z takmer 10 000 nukleotidov, ktor s obalen jedno-
vrstvovm protenovm plom oznaovanm ako obalo-
v protein1 (coat protein; CP). Systematicky sa zarauje
do rodu Potyvirus a eade Potyvirideae. Hlavnm spso-
bom prenosu vrusu je predovetkm vegetatvne rozmno-
ovanie ovocnch drevn, pri ktorom sa pouvaj infiko-
van rastlinn asti. alej je to prenos vokami
a obchodom, kedy mu by infikovan ovocn stromy
transportovan na vek vzdialenosti2.
Vrus napad hospodrsky vznamn dreviny rodu
Prunus, z ktorch najvznamnejmi druhmi s slivky
(Prunus domestica), broskyne (Prunus persica), marhule
(Prunus armeniaca), erene (Prunus avium) a vine
(Prunus cerasus). Na tchto ovocnch druhoch spsobuje
nebezpen chorobu kstovn arku sliviek. Negatvne
ovplyvuje kvalitu a kvantitu produkcie a celkov rast
stromov. Plody s deformovan, obsahuj menej cukru
a zvyajne predasne opadvaj3. Vrus spsobuje vrazn
Refert
straty na hektrovch rodch, ktor pri senzitvnych od-
rodch mu dosiahnu a 95 % (cit.4). alej negatvne
vplva na vitalitu ovocnch stromov a spsobuje ich pred-
asn odumieranie, m sa zniuje ekonomick efektv-
nos ich pestovania. Jedinec infikovan vrusom PPV sa
stva trvalm zdrojom tohto vrusu a predstavuje poten-
cilnu hrozbu pre jeho prenos na okolit zdrav rastliny.
Preto jedinou cestou, ako eliminova infekciu tmto vru-
som v poraste ovocnch drevn, je presn, rchla a cenovo
prijaten diagnostika, ktor odhal infikovan jedince
v poraste5.
Hlavnm spsobom ochrany proti reniu vrusu PPV
pri zakladan ovocnch sadov je pouvanie zdravho,
bezvirzneho vsadbovho rastlinnho materilu
a dodriavanie izolanch vzdialenost od potencilnych
zdrojov nkazy. Takto bezvrozne ovocn vpestky ure-
n pre vsadbu ovocnch sadov je mon zabezpei len
pravidelnm testovanm materskch rastln, z ktorch sa
zskava zkladn mnoitesk materil ako s ok, vrb-
le a podpnky6.
Hlavnm prnosom diagnostiky je preto testovanie
vchodiskovch genetickch zdrojov, z ktorch sa zskava
mnoitesk materil, m sa zabezpe dostatok bezvirz-
neho rozmnoovacieho materilu pre pestovatesk prax.
Diagnostikou sa takto eliminuje hlavn zdroj infekcie
vrusom PPV, ktorm s infikovan matersk rastliny.
Ochrana pred renm vrusu PPV v porastoch ovocnch
drevn je zaloen na fytosanitrnych opatreniach zamera-
nch na likvidciu vektorov, ktor tieto vrusy prenaj,
odstraovan infikovanch stromov a vysdzan rezistent-
nch odrd, ktor sa vyznauj rznym stupom odolnos-
ti. Napr. z odrody slivky Stanley boli zskan transgenn
klony, z ktorch najvy stupe rezistencie k PPV vyka-
zoval klon C5. Po jeho mnohoronom sledovan
v ponch podmienkach bola potvrden jeho odolnos ku
kmeom PPV-D, PPV-M a PPV-Rec. V sasnosti sa pre
tento klon pouva nzov HoneySweet a vyuva sa
v achten novch odolnch odrd a podpnkov sliviek7.
2. Molekulrna charakteristika vrusu Plum
pox virus
Systematicky sa PPV zarauje do rodu Potyvirus
a eade Potyviridae. Je to jednovlknov vrus kyjovitho
tvaru o dke 660 a 770 nm a rke 12,5 a 20 nm
s obsahom 7 % RNA. Je zloen z 9786 nukleotidov, kto-
r s obalen jednovrstvovm obalovm protenovm
plom oznaovanm ako obalov proten (CP), ktor je
usporiadan pirlovite okolo jednovlknovej ssRNA
s pozitvnou polaritou. Genomick RNA vrusu PPV m
na 5-konci VPg protein (viral protein genome-linked)
a dlh polyprotenov reazec je na 3-konci ukonen
269
Chem. Listy 110, 269275(2016)
obalovm protenom8. Tento polyproten je tiepen tromi
protenazami, ktor kduj vrus za vzniku desiatich prote-
nov: P1, HCPro, P3 a 6K1, CI, 6K2, NIa a VPg, NIa
a Pro, NIb a CP. Tieto bielkoviny maj rozlin lohy pri
vrusovej infekcii a interakcii medzi vrusom
a hostiteom9. Determinant patogenity pre infekciu bylin-
nch hostiteov bol izolovan v P3 a 6K1 a drevitch hos-
titeov v P1 a v obalovom protene (CP)10. Nukleotidov
zmeny v P3 a 6K1 kduj sekvencie, ktor s spjan
s adaptciou na N. clevelandii. Poukazuje sa na zodpoved-
nos protenu P1 za adaptciu PPV na hostitea. Tomuto
protenu sa pripisuje aj vplyv na silu virulencie, rchlos
mnoenia a jeho symptomatiku11.
3. Symptomatick prejavy vrusu Plum pox
virus
Symptomatick prejavy ochorenia s variabiln
a zvisia od druhu hostiteskej rastliny a kmea vrusu. S
tie ovplyvovan priebehom poasia. Pri chladnejej jari
a neskorom nstupe leta s prejavy ochorenia vraznejie
a naopak vysok teplota v lete brzd rozmnoovanie
a rozirovanie vrusu v pletivch hostitea12. Pri slivkch
sa prznaky ochorenia prejavuj najm na listoch
a plodoch, priom na listoch vznikaj ltozelen kvrny,
krky alebo ornamentlne kresby. Okraje kvn nie s
ostro ohranien. Prznaky s na napadnutch jedincoch
viditen u od mja danho vegetanho obdobia. Pri
vine odrd sa v lete vplyvom vysokch teplt intenzita
prznakov zniuje13. Na marhuliach a broskyniach s bada-
ten prznaky na listoch, plodoch a kstkach. Na listoch
vznikaj svetlozelen kvrny, krky alebo prky, ktor
iroko lemuj hlavn ilnatinu. Na plodoch sa v obdob
zrelosti prejavuj mramorovit kresby. Na kstkach mar-
h s typick svetlozelen a lt kvrny alebo krky14.
4. Metdy diagnostiky vrusu Plum pox virus
4.1. Biologick diagnostika
Vhodou biologickej diagnostiky je jej citlivos, na-
koko ak je vo vzorke iv vrus, tak sa poas sledovania
v bioindiktore namno, m sa zvyuje jeho koncentrcia
a podpor sa tak tvorba symptomatickch prejavov. Na
druhej strane jej nevhodou je ak vrus z rznych dvodov
v bioindiktore stratil virulenciu. V takom prpade biolo-
gick diagnostika nedoke sprvne detegova sledovan
vrus. alou nevhodou biologickej diagnostiky je jej
pracovn, asov a finann nronos, ktor spova
v prprave a starostlivosti o bioindiktory. V prpade infek-
cie testovacej vzorky viacermi vrusmi je negatvom bio-
logickej diagnostiky neschopnos detegova naraz tieto
vrusy. V takom prpade symptomatika vykazovan bioin-
diktormi zodpoved prtomnosti dominantnho vrusu.
Preto biologick diagnostika neme by hlavnou diagnos-
Refert
tickou metdou, ale sasou viacerch deteknch metd.
Bioindiktory sa asto pouvaj na uchovvanie vrusov
na alie experimenty15.
Na biologick diagnostiku vrusu PPV sa pouvaj
bylinn a drevit bioindiktory. S to rastliny, ktor vraz-
ne reaguj na infekciu sledovanm patognom. Ako bylin-
n indiktory sa pouvaj Chenopodium foetidum
a Nicotiana clevelandii. Tieto indiktory s inokulovan
vo fze klnych listov inokulom, ktor sa priprav zo a-
vy mladch symptomatickch listov, kvetov alebo kry.
Nana sa na mlad lstky indiktorovch rastln, ktorch
pokoka bola naruen abrazvom. Pri pozitvnych vzor-
kch sa prznaky objavuj vo forme deformcii listov,
vhonkov a kvrnami na listoch16. Hlavnm drevitm indi-
ktorom, ktor sa pouva na biologick diagnostiku PPV,
je Prunus persica cv. GF 305. Diagnostika na tomto indi-
ktore spova v jeho inokulovan okami, ktor sa zska-
vaj z testovanch rastln. Pouva sa dvojit okovanie do
tvaru psmena T alebo pomocou Forketovho okovania.
Vyhodnotenie sa rob v tdennch intervaloch, priom sa
sleduj deformcie a farebn zmeny listov17.
4.2. Imunochemick metdy diagnostiky
(Srologick diagnostika)
Pri srologickej diagnostike sa pouva enzmov
imunoanalza ELISA (enzyme linked imuno sorbent
assay) test, ktorho podstatou je vzba medzi antignom
a pecifickou protiltkou, ktor prebieha v jamkch mikro-
titranch platniiek. Pre samotn testovanie sa pouva
pribline 0,5 g erstvho rastlinnho materilu, ktor sa po
odobran udruje v chlade. Najastejie sa pouvaj listy,
ale mu sa pouva aj in asti rastln, ako s piky,
kra alebo kvetn lupene18. Testovan rastlinn materil sa
vlo do pecilnych plastovch skov a pridva sa fosf-
tov tlmiv roztok. Vzorky sa homogenizuj, priom sa
zskava substrt, ktor sa pouije pri samotnom ELISA
teste. Pri diagnostike PPV sa najastejie pouva nepria-
ma metda ELISA testu19, kedy sa monoklonlna protilt-
ka pre PPV 5B-IVIA napipetuje do jamiek mikrotitranej
platniky. Nsledne sa pridva substrt (o je vzorka) ob-
sahujci antign. Po premyt mikrotitranej platniky,
ktorm sa odstrnia nenaviazan zloky, sa prid konjugt,
o je protiltka znaen enzmom. Vytvor sa komplex,
ktor sa preuke v podobe farebnho produktu. Intenzita
zafarbenia poukazuje na pozitivitu vzorky a je priamo
mern k mnostvu antignu. Dleit je termn odberu,
kedy ako najvhodnejie sa uvdzaj jarn mesiace pred
prchodom vysokch letnch teplt. Tto metda sa odpo-
ra pri skrningovom testovan vekho potu vzoriek. Jej
vhoda spova v jednoduchosti, rchlosti a prijatenej
cene20.
alou vyuvanou srologickou metdou je DASI-
ELISA (double antibody sandwich indirect ELISA). Pri
tejto metde je protiltka viazan na pevnom povrchu mik-
rotitranej platniky, ku ktorej sa pridva vzorka, ktor
obsahuje antign a nsledne konjugt. Vytvor sa komplex
za vzniku farebnho produktu, ktor sa najastejie analy-
270
Chem. Listy 110, 269275(2016)
zuje spektroforeticky na zklade fluorescencie. Touto me-
tdou je mon zisti koncentrciu detegovanho vrusu
v pletivch rastln. Vhodou DASI-ELISA testu je jej jed-
noduchos, rchlos a spoahlivos, pokia je uskutonen
v jarnch mesiacoch. Nevhodou tejto metdy je nzka
spoahlivos detekcie vrusu PPV zo vzoriek odobranch
v zime21.
Na detekciu PPV sa vyuva aj metda TAS-ELISA
(triple antibody sandwich ELISA), ktor sa od DASI-
ELISA li v pouvan monoklonlnej protiltky MAbs,
ktor umouje viu schopnos detekcie jednotlivch
kmeov vrusu PPV. Pri tejto metde nedochdza ku kr-
ovej reakci so zdravmi rastlinami22.
alou imunochemickou metdou, ktor umouje
detekciu vrusu PPV, je imunochromatografick test zalo-
en na pouit monoklonlnej protiltky mABs. Tto
protiltka spolu s konjugtom, ktor tvor protiltka s ko-
loidnm zlatom (colloidal gold; CG), vytvra spolu
s PPV virinmi komplex, ktor sa preuke v podobe fa-
rebnho produktu23.
Jednou z metd, ktor sa pouva pri diagnostike vru-
su PPV je aj metda bimolekulrnej fluorescennej kom-
plementcie (BiFC), ktor je zaloen na zklade rekon-
trukcie monomernho ervenho fluorescennho prote-
nu (mRFP). Interagujci protenov komplex me by
vizualizovan v ivch bunkch. Ke s k jednmu
z interagujcich protenov pripojen sekvencie pribline
jednej polovice monomernho ervenho fluorescennho
protenu (mRFP) a k druhmu interagujcemu protenu
druh polovica mRFP sekvencie, dochdza k tvorbe fluo-
rescennho signlu. Tto metda bola optimalizovan pre
vyhadvanie interakci medzi protenmi vrusov z eade
Potyviridae s desiatimi protenmi PPV. Na zklade tchto
interakci je mon pomocou fluorescennho signlu
mikroskopicky detegova prtomnos PPV vo vzorkch24.
4.3. Molekulrna diagnostika
Pri spracovan tejto kapitoly boli pouit validovan
metdy a protokoly EPPO (cit.25) a diagnostick protokoly
pre detekcie PPV (cit.26). Na molekulrnu diagnostiku
vrusu PPV sa vyuva metda PCR spojen s reverznou
transkripciou oznaovan ako RT-PCR (reverse transcrip-
tion polymerase chain reaction), ktor umouje ampli-
fikciu RNA. Prvm krokom je izolcia RNA z tkaniva
napr. infikovanch listov. Na matrici RNA sa potom po-
mocou enzmu reverznej transkriptzy syntetizuje kom-
plementrne vlkno DNA (complementary DNA;
cDNA), ktor sa nsledne amplifikuje pomocou PCR
s dvoma pecifickmi primermi P1 (5-ACC GAG ACC
ACT ACA CTC CC-3) a P2 (5-CAG ACT ACA GCC
TCG CCA GA-3)27. Ich cieom amplifikcie je obalov
proten, ktor je sasou genmu PPV. Vhodou
RT-PCR je vysok citlivos vyznaujca sa schopnosou
detekcie nzkych koncentrci vrusu PPV v rastlinnom
pletive. Nevhoda reverznej transkriptzy je jej termolabi-
lita a prtomnos enzmov degradujcich RNA (RNz).
Na potlaenie termolability sa dnes pouva termostabiln
Refert
Tth DNA polymerza, ktor je schopn previes RNA do
DNA pri teplote 72 C. Aby nedolo k degradci RNA
psobenm RNz, je potrebn pri manipulci so vzorkami
pouva rukavice. Na spracovanie vzoriek sa pouva
voda zbaven RNz, o sa realizuje psobenm inhibtora
RNz diethylpyrokarbontu (DEPC). Na odstrnenie
RNz z povrchu laminrneho boxu a nradia sa pouva
sprej RNase Away a vzorky sa pri spracovan ukladaj
na ad. Izolovan RNA je potrebn hne spracova alebo
zmrazi a skladova pri teplote 70 C. Na analzu PCR
produktu sa pouva elektroforza v agarzovom gli za
prtomnosti ethidium bromidu, ktor je vak karcinognny.
Konen vizualizcia prebieha pod UV lampou, priom sa
pouva pozitvna a negatvna kontrola. Ak je PCR pro-
dukt na rovni pozitvnej kontroly, analyzovan vzorku
oznaujeme ako pozitvnu. V prpade pouitia priemerov
P1 a P2 je dka PCR produktu 243 bp.
V sasnosti nachdzaj uplatnenie modifikovan
metdy RT-PCR. Immunocapture PCR (IC-PCR) je
metda kombinujca PCR a ELISA (cit.28). Pri tejto met-
de sa do mikroskmavky nana PPV pecifick mono-
klonlna protiltka 5B IVIA a inkubuje sa 3 hodiny pri
teplote 37 C. Mikroskmavky sa premvaj dvakrt ste-
rilnm PBS-Tween (washing buffer). Nsledne sa op
dvakrt vyplchnu s vodou zbavenou RNz. alej sa pipe-
tuje rastlinn extrakt z testovanch rastln. Inkubuje sa
2 hodiny pri teplote 37 C. Po premyt sa do nich pipetuje
premix (reakn zmes) pre PCR spolu so pecifickmi
primermi. Nsledne prebieha samotn PCR reakcia. Tto
metda s pouitm monoklonlnej protiltky 5B-IVIA bola
validovan v kruhovch testoch s presnosou detekcie
PPV 82 % (cit.29). Pri pouit IC-PCR s 5B-IVIA
v zimnch mesiacoch sa udva 95,8 % pravdepodobnos
sprvneho pozitvneho vsledku. Jej vhodou je rchlos
reakcie a jej vysok spoahlivos pri detekcii vrusu PPV
zo vzoriek, ktor boli odobran v zimnch mesiacoch30.
alou metdou je co-operational amplification
RT-PCR (Co-RT-PCR). Ide o typ RT-PCR, ktor vyuva
tri alebo tyri pecifick primery v jednej reakcii: P1 (5-
ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC-3), P2 (5-CAG
ACT ACA GCC TCG CCA GA-3), P10 (5-GAG AAA
AGG ATG CTA ACA GGA-3), P20 (5-AAA GCA TAC
ATG CCA AGG TA-3)31. Vyznauje sa vysokou citlivos-
ou. Tto metda je citlivejia ako RT-PCR s pouitm
primerov P1 a P2 a bola validovan v kruhovch testoch
s spenosou 94 % (cit.32).
Print capture PCR (PC-PCR) je test, ktor umou-
je rchlu a citliv detekciu PPV z infikovanch rastln bez
potreby drvenia vzoriek33. erstv asti detegovanch
listov alebo stoniek s lisovan na Whatman 3MM papier.
Takto odtlaky mu by spracovan priamo alebo sa
uskladuj pri izbovej teplote a do 1 mesiaca bez negatv-
neho efektu na amplifikciu nukleovch kyseln. Pre
PC-PCR sa stvorek papiera s odtlakom rastlinnho pleti-
va umiestni do mikroskmaviek za pridania 120 l 0,5 %
Tritonu X100 s nslednm premieanm a ponechanm na
dvojmintov inkubciu pri izbovej teplote. V alej fze
sa 100 ml extraktu prenesie do mikroskmaviek, kde bol
271
Chem. Listy 110, 269275(2016)
nanesen uhliitanov pufor a 5B IVIA monoklonlnej
protiltky. Tento extrakt je inkubovan 2 hodiny pri 37 C
a nsledne dvakrt premyt PBS pufrom. Po pridan pri-
merov a premixu nasleduje jednokrokov RT-PCR.
PC-PCR metda je jednoduch, rchla, lacn a vemi citliv
s monosou pouitia aj pre in vrusov fytopatogny34.
alou metdou je drt-PCR (direct real-time PCR).
Ide o priamu real time PCR, ktor vyuva macerciu suro-
vho supernatanu zskanho z listov testovanej rastliny
v pufry, ktor bol vyvinut pecilne pre tento el. Pou-
va pecifick primery a TaqMan sondy, ktor doku dete-
gova viacer kmene vrusu PPV (PPVC-D, PPV-M,
PPV-C, PPV-EA a PPV-W). Pri porovnan tejto metdy
s metdou ELISA bola dokzan sto a tiscnsobne vy-
ia citlivos a schopnos detegova PPV v skorch t-
dich infekcie35.
Jednou z novch metd je NASBA-FH. Ide o metdu
zaloen na amplifikci sekvenci nukleovch kyseln
spojenej s prietokovou hybridizciou. Metda je vhodn
na detekciu molekl RNA a je desakrt citlivejia ako
Co-RT-PCR a tisckrt citlivejia ako RT-PCR (cit.29).
alou monosou na detekciu Plum pox virus je
metda Real-time RT-PCR, pri ktorej je patogn detegova-
n a kvantifikovan ete poas reakcie, priom umouje
sledova prrastky DNA poas kadho cyklu. Zistenie
prtomnosti nami sledovanho patogna spova
v zaznamenan fluorescennho signlu po kadom cykle
do kriviek, o umouje priame sledovanie priebehu reak-
cie a vsledky sa zaznauj do kriviek v relnom ase.
Ako fluorescenn inidl sa v prpade detekcie PPV pou-
vaj pecifick sondy, o s fluorescenn znaen
a synteticky pripraven sekvencie nukleotidov, ktor s
zodpovedajce k hadanmu seku. Pouvan primery
a TaqMan sondy pre detekcie PPV s Forward primer (5-
CCA ATA AAG CCA TTG TTG GAT C-3), Reverse
primer (5-TGA ATT CCA TAC CTT GGC ATG T-3),
TaqMan sonda (5-FAM-CTT CAG CCA CGT TAC TGA
AAT GTG CCA-TAMRA-3)36.
Obr. 1. Mapa s distribciou kmeov Plum pox virus na zem SR48
Refert
Pri detekcii viacerch vrusovch patognov naraz sa
pouva metda multiplex RT-PCR (mRT-PCR), pri ktorej
sa do reaknej zmesi pridva niekoko prov primerov, o
umouje detegova niekoko gnov naraz v jednej reak-
nej zmesi. Hlavnou vhodou je spora nkladov a asu na
diagnostiku37.
K novm metdam patr aj metda nazvan High-
throughput. Pri tejto metde sa vyuvaj priame spsoby
spracovania rastlinnho materilu urenho k testovaniu
prtomnosti PPV. Umouje rchle testovanie pomocou
real-time RT-PCR, pri ktorej extrakt z testovanch rastln
sa nanesie na nylonov membrnu alebo Whatman 3MM
papierov filter. Takto sa me skladova alebo poui na
alie spracovanie30.
Medzi alie nov metdy detekcie vrusu PPV patr
aj metda Apmlify RT, ktor vyuva reverzn transkrip-
ciu a rekombinciu polymerzovej amplifikcie (RPA), o
je izotermick alternatva k PCR. Pri tomto teste vetky
reakcie prebiehaj pri kontantnej teplote 3742 C, m
odpad potreba pouitia termocyklra. Vsledky testu sa
zaznamenvaj v relnom ase pomocou prenosnho fluo-
rescennho zariadenia. Hlavn prnos tohto testu spova
v jeho rchlosti. Cel test od prpravy vzorky po vsledok
me by kompletn do 20 min a me by prevdzan
jednoducho v laboratrnych aj ponch podmienkach. Je
schopn detegova vetky doteraz znme kmene PPV38.
Novo vyvjan molekulrne technolgie sa oznauj
ako metdy alej genercie NGS (next generation sequ-
encing). Vychdzaj zo Sangerovej metdy sekvenovania
DNA, ktor je od svojho objavenia zlepovan
a automatizovan. Patr sem sekvenovanie syntzou, ktor
umouje sekvenovanie jednotlivch molekl a dka sek-
venovanho seku me by len okolo 32 nukleotidov39.
V sasnosti sa na sekvenciu DNA najastejie vyuva
metda automatickho sekvenovania s fluorescennmi
farbami a nslednou laserovou detekciou. Pouva sa
k sekvenovaniu celho vrusovho genmu, o umouje
stanovi jeho primrnu truktru a linerne usporiadanie
272
Chem. Listy 110, 269275(2016) Refert

Tabuka I
Primery pouvan pre detekciu jednotlivch kmeov PPV36,43,4951

Metda Kme vrusu

Primery
RT-PCR PPV
P1 (5-ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC-3)
PPV-D
PD (5-CTT CAA CGA CAC CCG TAC GG-3) alebo PM (5-CTT CAA CAA CGC CTG
PPV-M
RT-PCR TGC GT-3)
mD5 (5-TAT GTC ACA TAA AGG CGT TCT C-3)
PPV-Rec
mM3 (5-CAT TTC CAT AAA CTC CAA AAG AC-3)
Co-RT- PPV-D PPV-D pecifick sonda: 5-CTT CAA CGA CAC CCG TAC GGG CA-DIG-3
PCR PPV-M PPV-M pecifick sonda: 5-ACC GCC TGT GCG TGC ACG T-DIG-3
PPV-MGB-F (5-CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA-3)
PPV-D PPV-MGB-R (5-CTC AAT GCT GCT GCC TTC AT-3)
PPV-M MGB-D sonda (5-FAM-TTC AAC GAC ACC CGT A-MGB-3)
Real time MGB-M sonda (5-FAM-TTC AAC AAC GCC TGT G-MGB-3)
RT-PCR
PPV-C P1 (5-ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC-3)
PPV-EA PPV-U (5-TGA AGG CAG CAT TGA GA-3)
PPV-W PPV-RR (5-CTC TTC TTG TGT TCC GAC GTT TC-3)

jednotlivch duskatch zsad v relatvne krtkom ase40.
Tto metda sa vyuva aj na zistenie mutcii, ktor vzni-
kaj pri replikcii. Umouje odli zmutovan sekvencie
DNA potomstva vrusov od genmu rodiov. Pomocou
metd NGS je mon uskutoni klasifikciu jednotlivch
izoltov vrusov zskanch z rznych geografickch oblas-
t do jednotlivch kmeov a nslednho zostavenia fyloge-
netickho stromu. Sekvenovanie molekl DNA sa vyuva
v diagnostike na urenie gnov, ktor podmieuj patoge-
nitu vrusu a naopak rezistenciu hostitea. Tieto poznatky
sa vyuvaj v achten rezistentnch odrd41. NGS
umouj detekciu vetkch patognov, ktor sa nach-
dzaj v danej vzorke. Maj vak obmedzenie pri vyhad-
van podobnost v sekvenanch dtach, o predluje as
potrebn na stanovenie diagnostickho vsledku. Aby sa
minimalizoval as potrebn na spracovanie bioinformatic-
kch dt, boli navrhnut tzv. e-sondy (e-probe diagnostic
nucleic assay), o s pecifick sekvencie pre urit pato-
gny. Bola vyvinut tatistick metda stanovenia prtom-
nosti danho patogna, v ktorej sa zaznamenva detekn
signl e-sondy, ktor sa porovnva s Decoy sborom elek-
tronickch sond42.
5. Biodiverzita vrusu Plum pox virus
V sasnosti poznme 9 kmeov vrusu Plum pox
virus. Kmene PPV-M (Marcus), PPV-D (Didern) a PPV-
Rec (Recombinant) prevldaj v Eurpe a pokladaj sa za
hlavn kmene43. Medzi alie kmene patria PPV-EA
(El Amar) izolovan v Egypte, PPV-C (Cherry)
z Moldavska44, kme PPV-CR (Cherry Russian), ktor bol
izolovan z eren v Rusku45, kme PPV-W (Winona
3174) izolovan v Ontriu v Kanade, kme PPV-T
(Turkey) pochdzajci z Turecka46 a ako posledn bol
uren kme PPV-An (Albania) z izoltov PPV pochdza-
jcich z Albnska41. Na Slovensku je znmy vskyt kme-
ov PPV-Rec, PPV-D a PPV-M. V eskej republike do-
minuje kme PPV-D, ktor je menej patognny a je nm
infikovanch cca 95 % napadnutch stromov47.
Na identifikciu jednotlivch kmeov Plum pox virus
je mon poui serologick alebo molekulrny test
a sekvenciu. Pri srologickch testoch sa pouva DASI-
ELISA so pecifickmi protiltkami pre kmene C, D, EA,
C, M. Pri molekulrnych testoch sa pouvaj pecifick
primery pre jednotliv kmene.
6. Zver
Metdy detekcie Plum pox virus zaznamenali
v poslednom obdob vek pokrok. V zaiatkoch diagnos-
tiky sa pouvali bioindiktory, na ktorch sa sledovali
symptomatick prejavy vrusovej infekcie. Metdy sa po-
stupne zdokonaovali, priom dolo k vvoju od biologic-
kch metd k imunochemickm za pouitia testu ELISA
a po dnen molekulrne metdy s pouitm RT-PCR,
Real Time PCR a sekvenovania DNA. Sbor tchto metd
sa pouva na vasn a presn diagnostiku, o nm umo-
uje eliminova zdroje vrusu z mnoiteskch porastov
pomologickch vsadieb a zo achtiteskch porastov
ovocnch drevn. Len preruenm kolobehu prenosu vrusu
z infikovanej materskej rastliny na potomstvo meme
zska vo vrobnom procese zdrav vsadbov materil.
Prca vznikla vaka podpore KEGA projektu .
021SPU-4/2015 (100 %).

273
Chem. Listy 110, 269275(2016)
LITERATRA
1. Garca J. A., Glasa M., Cambra M., Candresse T.:
Mol. Plant Pathol. 15, 226 (2014).
2. Nmeth M.: Virus, Mycoplasma and Rickettsia disea-
ses of fruit trees. Akadmiai Kido, Budapest 1986.
3. Miloevi T., Glisic I. P. Miloevi N. T., Glisic I.:
Eur. J. Plant Pathol. 126, 73 (2010).
4. Jaroov J., Polk J., Kumar J.: Metodika molekularni
detekce viru peckovin pomoci RT-PCR a multiplex
RT-PCR. Vzkumn stav rostlinn vroby, v.v.i.,
Praha 2008.
5. Shors T.: Understanding viruses. Jones and Barlett
Publishers, Subdury 2009.
6. Malinowski T., Cambra M., Capote N., Zawadzka B.,
Gorris M. T., Scorza R., Ravelonandro M.: Plant Dis.
90, 1012 (2006).
7. Polk J., Kumar J., Jaroov J.: Metodika hodnocen
rezistence transgenn vestky, Prunus domestica L.,
klon C5 k viru arky vestky a ke smsnm infekcm
s dalmi viry. Uplatnn certifikovan metodika.
Vzkumn stav rostlinn vroby, v.v.i. Praha 2009.
8. Reichmann J. L., Lan S., Garca J. A.: J. Gen. Virol.
70, 2785 (1989).
9. Sochor J., Babula P., Adam V., Krska B., Kezek R.:
Viruses 4, 2853 (2012).
10. Dallot s., Quiot-Dounne L., Senz P., Cervera M. T.,
Garca J. A., Quiot B.: Phytopathology 91, 159
(2001).
11. Pacheco R., Garca-Marcos A., Barajas D., Martinez
J., Tenllado F.: Virus Res. 165, 231 (2012).
12. Garca J. A., Cambra M.: Plant Viruses 1, 69 (2007).
13. Zacha V., Vanek G., Novkov J.: Atlas chorb
a kodcov ovocnch drevn a vinia. Vydavatestvo
Prroda, Bratislava 1989.
14. Polk J.: Bull. OEPP 36, 225 (2006).
15. Glasa M., Matisov J., Hriovsk I., Kdela O.: Acta
Virol. (Engl. Ed.) 41, 341 (1997).
16. ubr Z., Glasa M.: Acta Virol. (Engl. Ed.) 57, 217
(2013).
17. Adam M., Krka B.: Metodika pouit devinnch
indiktor pro zjitn ptomnosti vir ACLSV;
ApMV; PDV; PNRSV; PPV. Zhradncka fakulta,
Brno 2005.
18. Adam M.: Nov poznatky z genetiky a achtenia
ponohospodrskych rastln, Pieany, 23.-24. no-
vember 2005, Zbornk z 12. odbornho seminra
(Uk M., ed.), s. 139, Vskumn stav rastlinnej
vroby Pieany, 2005.
19. Cambra M., Asensio M., Gorris M. T., Prez E., Ca-
marasa E., Garca J. A., Moya J. J., Lpez-Abella D.,
Vela C., Sanz A.: Bull. OEPP 24, 569 (1994).
20. Dickinson M.: Molecular Plant Pathology. BIOS
Scientific Publisher, London 2003.
21. Hilgert I., Ciknek D., Krisrofov H., Karesov R.,
Navrtil M.: Hybridoma 12, 215 (1993).
22. Nmeth M., Klber M.: Acta Hortic. 130, 293 (1983).
23. Byzova N. A., Safenkova I. V., Chirkov S. N., Av-
274
Refert
dienko V. G., Guseva A. N., Mitrofanova I. V., Zher-
dev A. V., Dzantiev B. B., Atabekov J. G.: Bioche-
mistry Mosc. 75, 1393 (2010).
24. Zilian E., Maiss E.: J. Gen. Virol. 92, 2711 (2011).
25. EPPO Standards. Bull. OEPP 34, 155 (2004).
26. International standards for phytosanitary measures.
ISPM 27 Diagnostic protocols. DP2: Plum pox virus
(2012).
27. Wetzel T., Candresse T., Ravelonandro M., Dunez J.:
J. Virol. Methods 33, 355 (1991).
28. Wetzel, T. Candresse, T. Macquaire G., Ravelonandro
M., Dunez J.: J. Virol. Methods 39, 27 (1992).
29. Olmos A., Bertolini E., Cambra M.: J. Virol. Methods
139, 111 (2007).
30. Capote N., Bertolini E., Olmos A., Vidal E., Martnez
M. C., Cambra M.: Int. Microbiol. 12, 1 (2009).
31. Olmos A., Bertolini E., Cambra M.: J. Virol. Methods
106, 51 (2002).
32. Cambra M., Capote N., Olmos A., Bertolini E., Gorris
M. T., Africander N. L., Levy L., Lenardon S. L.,
Clover G., Wright D: Acta Hortic. 781, 181 (2006).
33. Olmos A., Das M. A., Candresse T., Cambra M.:
Nucleic Acids Res. 24, 2192 (1996).
34. Lpez-Moya J. J., Fernndez-Fernndez M. R., Cam-
bra M., Garca J. A.: J. Biotechnol. 76, 121 (2000).
35. Kim W. S., Stobbs L. W., Lehman S. M., James D.,
Svircev A. M.: Can. J. Plant Pathol. 30, 308 (2008).
36. Schneider W. L., Sherman D. J., Stone A. L., Damste-
egt V. D., Frederick R. D.: J. Virol. Methods 120, 97
(2004).
37. Carbonell A., Dujovny G., Garca J. A., Valli A.: Mol.
Plant-Microbe Interact. 25, 151 (2012).
38. Zhang S., Ravelonandro M., Russell P., McOwen N.,
Briard P., Bohannon S., Vrient A.: J. Virol. Methods
207, 114 (2014).
39. Pushkarev D., Neff N. F., Quake S. R.: Nat. Biotech-
nol. 27, 847 (2009).
40. Kehoe M. A., Coutts B. A., Buirchell B. J., Jones R.
A. C.: PLoS One 9 (2014).
41. Glasa M., Prihodko Y., Predaja L., Nagyov A.,
Shneyder Y., Zhivaeva T., ubr Z., Cambra M., Can-
dresse T.: Phytopathology 103, 972 (2013).
42. Stobbe A. H., Schenider W. L., Hoyt P. R., Melcher
U.: Phytopathology 104, 1125 (2014).
43. Glasa M., Matisov J., Kdela O.: Acta Virol. (Engl.
Ed.) 42, 226 (1998).
44. Predaja L., ubr Z., Candresse T., Glasa M.: Virus
Res. 167, 112 (2012).
45. Mavrodieva V., James D., Williams K., Negi S., Var-
ga A., Mock R., Levy L.: Plant Dis. 97, 44 (2013).
46. Glasa M., Predaja L., ubr Z.: J. Plant Pathol. 92,
267 (2010).
47. Polk J., Komnek P.: Plant Prot. Sci. 45, 144 (2009).
48. Kdela O., Glasa M. Inovatvne prstupy v diagnosti-
ke rastlinnch vrusov a ich prnos pre ponohospo-
drsku prax. V. slovensk rastlinolekrske dni Ochra-
nou vd k dosiahnutiu ich priaznivho stavu, Nitra, 9.
10. oktber 2013. Slovensk rastlinolekrska spo-
 Chem. Listy 110, 269275(2016) Refert

lonos a VVH, Nitra 2013. Uverejnen na http://
www.srsweb.sk/dokumenty/5RLD/2%20den/ 09%
2040%20K%C3%BAdela,O.%20SAV%
20Bratislava%2010.10.pdf , stiahnut 20.6.2015.
49. ubr Z., Pittnerova S., Glasa M.: Acta Virol. 48, 173
(2004).
50. Olmos A., Cambra M., Dasi M. A., Candresse T.,
Esteban O., Gorris M. T., Asensio M.: J. Virol. Met-
hods 68, 127 (1997).
51. Varga A., James D.: J. Virol. Methods 132, 146
(2006).
J. Rozka and Z. Glovb (aThe Central Controlling
and Testing Institute in Agriculture, Bratislava, bSlovak
University of Agriculture in Nitra): Diagnostics and Mo-
lecular Characterization of Plum pox virus
Plum pox virus (PPV), the agent responsible for shar-
ka disease, is the most important viral pathogen of stone
fruit trees. The fruits of these fruit species are widely used
in the processing industry, thus being economically very
attractive. This viral disease significantly reduces the vital-
ity of the fruit trees and the quantity and quality of fruits.
The present review describes recent methods used for the
identification and characterization of economically im-
portant Plum pox virus. Understanding the diversity of
plant viruses is an essential step to design efficient ma-
nagement strategies to eliminate economical losses.

275

View publication stats