Asist, univ, Jonela Neagoe UME “Carol Davila” PRINCIPII TESTE, METODE DE DIAGNOSTIC DE LABORATOR PARAZITOLOGIE [ 7 nh Soon ELON Reames ‘A1) PREPARAT PROASPAT lama + lamela ( L+l) din FECALE cu Ser Fiziologic (SF) caldut sau cu Solutie Lugo! Principiu metodo: = Peo lama de microscop se pune la un copat 1 picatura de SF sila celalt capat 1 picatura solutie Lugo! = Se omogenizeaza cate o contitote mico de fecale in fiecare picatura de SF si solutie Lugo! - Amestecurile se acopera fiecare cu cate o lamela = Se examineaza la microscopul optic (MO) cu obiectivul (0b) de 10-40x Avantal foarte ieftin -se utilizeaza de rutina in screningul de diagnostic - observarea mobilitatiitrofozoitilor vi pe preparatele cu SF = pe preparatele cu solutie Lugol chisti si trofozoiti colorati in maro se disting clar de fondul microscopic Dezavantaj: se usuca foarte repede in 1-2 ore; ~ pe preparatul cu SF, paraziti nu se disting foarte clar de fondul microscopic; + solutia Lugo! contine iod care omoara trofozoiti (nu se mai observa mobilitatea). Observatie: Solutia Lugol este folosita doar in examinarea microscopica o preparatelor proaspete din fecole si nu din alt prelevat biologic ‘A2) FROTIV din FECALE colorat cu Tricrom sau Giemsa Principiu metodo: ~ Peo lama la un copat se pune 1 picatura suspensie fecale; = Culatura unei lame asezata in unghi de 45° se etaleaza fecolele de la un capat la celalat al lame; = Frotul executat se fixeaza chimic cu alcool, = Se coloreaza cu Tricrom seu Giemso, = Se examineaza cu Ob de 100x ata poate fi pastrat ani indelungati fora rise de deteriorare ~ se pot observa mai bine detalile de ultrastructura ole parazitul Dezovanto} = _elorantifolositi sunt mai scumpi B. COPROCULTURA (CULTURA din FECALE) pe MEDIU LOFFLER pentru dezvoltarea trofozoitillor de Entomoeba histolytica Principiu metodo: ‘Mediu Loffler contine ser de bow coagulot in plan inclinat in tuburi - Se insamanteaza pata mediului cu o suspensie de fecale Se adauga amidon (glucid de hranire}+ antibiotic + SF ILAsis. univ. lonela Neagoe UME “Carol Davila” + Se adauga un ultim reactiv = Solutio de Stopare a degradari enzimatice a substratului= vireaza culoarea albastra ta galben + Gitirea placit cu godeurile de analiza se face la spectrofotometru la 0 lumina cu lungimea de unda=450nm + Intensitatea culorii lichidului din godeul cu proba analizata cat si valoarea absorbante! obtinute spectrofotometric este direct proportionala cu concentratia de anticorpi anti parazit din proba analizata [ €-TESERAPIDIMUNOCROMATOGRACIC nen deistre COPROANTIGENE | —— — a Principiu test: = test calitativ de migrare laterala imunocromatografica prin difuziune @ antigenului porazitar din proba de fecale examinata -se executa pe stripurisau casete ~ _Unstrip /caseta este alcatuit din 3zone: zona = extremitatea care vine in contact cu proba de fecale lichida (diluata intr-un tompon) 1 zona = impregnata cu un Conjugat = contine anticorpi specifi antiAg cuplati la particule de Jotex colorat (Daca in proba de fecale sunt Ag parazitare acestea se vor lega la Conjugot) Wlzona = ZONA de CITIRE REZULTATE: Ala 0 extremitate este impregnat cu alti anticorpi specifci antiAg core leaga 1 fixat de ‘ntigenul parazitor = zona de aparitie 0 beni (benzilor test colorate 8. la cealalta extremitate este impregnata cu anticorpi care se leaga Ia conjugatul liber nefixat lo Ag parazitar = zona de oparitie a benzii de control colorate. Obs: Colorarea benzii de control este un indicator obligatoru (indiferent de rezulat) core sugereaza ca testul este valobil sis-a executot corect ~ Interpretore rezulate ezulat poztiv = prezenta Ag parazitare in proba aporitia unei(unor) benzi test colorate in functie de culoarea particulelor de latex din conjugat + banda de contro! Rezultat negativ = absenta Ag parazitare in prob paritia numai a benzit de control Avontay foarte rapid = se executa in S-10min = fiind mai ieftin ca ELISA poate fi utlizat si in screening de diagnostic Dezavontai “ sensibilitate de detectie mai scazuta ca ELISA Principiu test: = test de depistare a urmelor de ADN parazitar extras prin metode speciale din proba analizata + se executo pe un aparat cutomatizat (termocycler) + PCR mareste exponential numarul de copit ale unei gene tinta alese din ADN parazitar. + PCRsse realizeaza in cadrul a 3 etape majore care se repeta secvential de 30 - 40 ori | etapa= denaturarea la 94° C, cele 2 catene ADN se despart; etapa 2 secvente nucleotidice denumite primeri se vor lega specific la capetele genei tinto; in prezenta unei enzime termostabile (ADN polimeraza) + dNTP-uri, primerii vor initia copiereo genei tinto; ii etapa = extensia/polimerzareo = la 728C, primerii vor copia complet gen; ~Verificarea + vizualizarea copiilor gene tinta (amplicon ADN/ produs amplifcare ADN) = 3sist univ. fo Neagoe UME “Carol Davila |. TEST WESTERN BLOT pentru depistare ANTICORPI anti PARAZIT din ser sangvin Principiu tes = (Obtinerea stripurilor = Antigene parazitare de diferite greutati moleculareau fost migrate electroforetic ‘sub forma de benzi, Prin electroblotare antigenele au fost transferate pe o membrona nitrocelulozica ‘Membrana nitrocelulozica cu benzile antigenice transferate este taiata in stripur.) Testul W.B: = 1 Un strip cu benziantigenice de diferite greutati moleculare este incubat cu serul sangvin al pacientului ~ 2, Daca anticorpi anti parazit sunt inser, se vor lega la antigenele stripului 3. Spolare pentru indepartare componente ser nelegate = 4. Incubarea stripului cu un Conjugat = Anticorpi anti ig umane din ser cuplati cu o enzima + 5. Spalare + adaugare Substrat enzimatic care precipita sub forma unor benzii violet inchis 6. Se stopeaza dezvoltarea culorif prin spalare cu apa si se lasa sa se usuce stripul = 7. Indicativ poritiv pentru prezenta anticorpilor anti parazit in serul sangvin investigat = Aparitia unor benzii de anumite greutati moleculare (kDa) specifice pentru parazitul suspectot ca agent etiologic. Avantoy = Speeifictate si sensibiitate de detectie superioaro fata de testul ELISA 3. FROTIU din SANGE — coloratie Giemsa Principiu metodo: ~ Lacapatul unei lame de microscop se pune 0 picatura mica de sange = Cuajutorul unei al! lame de microscop asezota in unghi de 30-40°, se etaleaza sangele de la un capat lo celalalt al lame, astfel incat sa se termine in franjuri + Bupa uscare, frotiul este fixat cu alcool metilic + Apoise coloreaza intr-o dilutie opoasa de colorant Giemsa Se examineaza la MO cu objectivul de 100X = Hematii +/-paroziti leucocite colorate in mov K, PICATURA GROASA din SANGE ~ coloratie Giems: ] Principiu metodo = Metoda de concentrare a sangelui direct pe lama = Incentrul unei lame de microscop se pun 3 picaturi de sange + Cucoltul uneia iN a lame se omogenizeaza cele 3 picaturi de sange + se losa sa se usuce la temperature camerei8h ~Ulterior - fara fixare in alcool - lama cu sangele omogenizat se coloreza intr-o dilutie apoasa de colorant Giemsa = Obst: Apa din colorant are efect hipoton de lizare a hematilor sileucocitelor + Dupa spalare cu apa si uscare se examineaza la microscopul optic cu obiectivul de imersie 100X = numai paraziti + nuclei leucocitelor colorati in movAsist uni. lonela Neagoo UMF “Carol Davila” TEST ISAGA limmunoSorbent Agglutination Assay) pentru depistare urme anticorpi de faza acuta IL eM/IgA/igé) anti Toxoplosmagondii Principiv test: este un test bazat pe tehnico aglutinaritindirecte pentru detectie onticorpi ~ 1, se executa pe placa cu gadeuri tapetate cu Anticorpi monoclonal anti igM/igA/IgE umane = 2.se aduga serul sangvin al pacientuluisise losa la incubat; = 3.spalore = 4, adougare reactiv ‘at care contine antigene purificate de Toxoplasma gondii Citire macroscopica Reactie pozitiva = prezenta IgM/IgA/IgE anti Toxoplasma = colorarea uniforma a godeului (formare de complexe Ig umane fixate a anticopi din godeu + antigene) Reactie negativa = obsento IgM/lgA/IgE anti Toxoplasma = buton colorat sedimentat central pe fundul godeului(antigene nelegate, sedimentate) Avantaj~ Sensibilitate mai ridicato decor testul ELISA P, TEHNICA DE CONCENTRARE PRIN FLOTARE WILLIS (pentru depistare oua helminti neoperculate Intr-un pahor Borel se amesteca ~29 fecale + solutie suprasaturota de NaCl ~ Dupo omogenizare, pe suprofota suspensiel se aseaza o lamela sise lasa sa pluteasca 30minate. Dupa expirarea acestei perioade se “pescuieste” lamela cu o penseta, Se aseaza lamela pe o lama si se examineaza la microscopul optic cu Ob 10-40x ‘Ouale (fara opercul) find usoare, plutesc la interfata aer lichid datorita densitatiiridicate a solutiei saline si se fixeaza lo suprofata inferioara a lamelei Q. TEST DE AMPRENTARE ANALA = Scotch Test = Test Graham (pentru depistare oua helmintiin zona perianala| Principiu metodo: ~ La capotul une’ baghete de sticla se ataseaza o bucata de scotch cu partea lipicioasa expusa lo exterior ~ Se tamponeaza pliurile anale Bagheta cu materialul recoltat pe bucata de scotch se transporta intr-un tub de sticla adecvot. ~ Bucota de scotch cu materialul perianal recoltat se desprinde de pe bagheta si se lipeste pe o lama de microscop ~ Lama cu bucata de scotch se examineaza la microscopul optic cu Ob. 10-40x Principiu test: = Se amesteco in canttat egale o paste de carbune vegetal +fecole In mijlocul cutie’ se aseaza amestecul si se modeleaza 0 forma conica astfel incat dupa inchiderea cutie, capacul sa intre in contact cu varful conului. Pe capacul cutie inchise etans se aseara o bucata de vata imbibota in apo. Coprocultura se mentine la temperatura camerei sau la termostat ia 26 of 7Asist univ. lonela Neagoe UMF "Carol Davila” + Se incubeaza la 37°C Citirea coproculturi se face din 24 in 24h timp de 32ile = consta examinarea microscopica 0 preparatelor proaspete L+! realizate din cate o picatura sediment (de trofozoiti de Entamoeba histolytica) dezvoltat la bazo ponte’ medivlui — 7] TEST ELISA pentru depistare COPROANTIGENE (ANTIGENE din FECALE Principiu tes = Test caltativ care se executa pe placi comercialzate cu godeuri “topetate“pe fund cu anticorpl (Ac ‘specifci onti antigene (Ag) parocitare; = Probe de fecale lchide (fecale diluate intr-un tampon) + controlul pozitiv + controlul negativ = se adauga fiecare in cate un godeu (Daca in proba exista Ag, acestea se vor fixa de Ac de pe fundul godeulul) = Se edougo un reactiv= Conjugatul =contine anticorpi specific! antiag cuplati cu o enzima (Daca exista aantigene in proba, acestea vor fi prinse la mijloc “ in sandwich” intre Ac de pe fundul godeului si conjugat) = incabare + spalare ulterioora pentru indepartareo conjugatului nefixat ~ Se adauga un al t-eo reactiv = Substratul pentru enzima din conjugat = este initial incolor (Daca exista ‘Ag in probe, enzima din conjugatl fixat la Ag va degrada substratul cu generarare unui culor albastre) = Se adouga un ultim reactiv = Solutia de Stopare @ degradarii enzimatice a substratulu= vireaza culoarea albastra ia galben ~ Gitirea placii cu godeurile de analiza se face la spectrofotometru fa 0 lumina cu lungimea de sunda=450nm Intensitotea culori lichidului din godeu! cu proba analizata cat si valoarea absorbantei obtinute spectrofotometric este direct proportionala cu concentratia de antigene din proba analizata Avantay Sensibilitote mare de detectie (mai mare decat examenul coproparazitologi) + specifictate ridicata Dezovantaj: foloseste reactivi scumpi- se utiizeaza mai frecvent in confirmarea diagnosticului dureozo ~2h ‘organismulul (Ser sangvin, LCR, Umoare apoasa} = test calitativ se executa pe placi cu godeuri “tapetate” cu Ag specifice parazitare + Prob lichida (ser sangvin diluat cu un tampon) + controlul pozitiv + controlul negativ se adouga fiecore in cate un godeu (Daca in proba exista anticorpi anti parazit (IgG/IgM), acestia se vor fixa de Ag de pe fundul godeului) + Incubare + spalore uiterioara pentru indepartarea rezidurilor din proba + Se adauga un reactiv= Conjugatul =contine anticorpi specifici anti IgG/lg@M umane cuplati cu o enzima (Oaca exista IgG/igM anti parazit in proba acestia vor fi prinsi la mijloc intre Ag de pe fundul godeului si conjugat) + Incubare + spalare ulterioara pentru indepartarea conjugatului nefixat + Se adauga un al Iilea reactiv = Substratul pentru enzima din conjugat = este initial incolor (Daca exista 1g6/IgM anti porazit in proba, enzima din conjugatul fixat va degrada substratul cu generarare unui culorialbastre)Asst. univ, lonela Neagoe UMF “Carol Davila’ A. Produsul de amplificare PCR se incarca sise migreaza electroforetic pe un gel de agaroza colorat cu bromura de etidium B. Ampliconul ADN migrat este_vizibil in gelul de agaroza in prezenta luminei UV sub forma unei benzil albe, = Interpretare dimensiunii ampliconului AON vizualizat electroforetic = se face utilizand un marker sou control de dimensiuni af benzilor de ADN core este migrat electroforetic paralel cu produsul de amplificare PCR. Avonto} ~ specifcitateridicata si sensibilitate foarte mare de detectie Dezavantaj - foarte scump - din acest motiv este folosit exclusiv pentru confirmarea diagnosticului ~ Se executa intr-o “punga” de plastic, speciala, dublu compartimentizata (inchisa ermetic lo capatul superior) care contine un media lichid ster = Se deschide pungo in condi sterie, si se insamanteaza mediul cu ajutoru! tamponului de vata pe care s- 2 recoltat secreta ~ Se comprima medial proospat insamantat in camera inferioaro a “pungii” = Compartimentul inferior a! pungii cu medi proaspat insamntat se fixeaza intr-un suport de plastic special si fie 1. Se examineoza microscopic direct, imediat, pentru depistarea troforoitilor 2. Se incubeaza lo 37° C. Dupo 24h, cultura de trofozoiti denvoltata in compartiment se examineaza microscopic direct. Avantal: = Mediul In Pouch TV este folosit atat ca mediu de transport al probei cat sica mediu de cultivare ~ Spre deosebire de metodele clasice de cultivare pe media - se poate face si 0 examinarea microscopica fata a mediului proaspot insamanta || H. CULTURA PE MEDIUL WNW - Nowy, MacNeal, NVicolle (pentru izolarea Leishmaniei sia Trypanosomelor Lu by Principiv metoda: = mediul speciol NNN = mediu solid ce contine agar + sange defibrinat de iepure (repartizat in plan inclinat jn tuburi de cultura}. = se insamanteaza panta mediului cu o suspensie din aspiratul tisular recoltat sou cu sange + Se incubeaza la temperatura camerei (25°C) - Dupa 1 saptomana se recolteaza lichidul de cultura dezvoltat la suprafata mediuluisise centrifugheaza Din sedimentul format se fac preparate directe L+/si frotiuri colorotie Giemsa = La MO se pot depista promastigoti de Leishmania sau epimastigoti de Trypanosoma.Asist div, lonela Neagoe UME “Carol Davila” T, TEHNICA LEUCONCENTRATULUI Principiu metodo = | Metoda de concentrare a sangelui in tub de centrifuga Inte-un tub de centrifuga se amesteca Iml sange + 2m serfiziologic + 3 picaturi saponina 2% (soponina are efect hemoliic) - Solutia sangvina diluata si hemolizata se centrifugheaza = din sediment se fac preparate proaspete L+l si frotiuri colorate Giemsa TEST NSRE COMPLEMENT en eure ANTICORE Geant Tamenosomecal || L 1 TESTE DETERMINARE A AVIITAT4G ant Tooniesme cond i rincipiu metoda = Intrun tub de centrifuga, serul pacientuluj se incubeaza cu I reactiv = Antigene de Trypanosoma cruzii + Se adouga cel de-al li reactiv = Complement ~ Se adauga cel de-al Il reactiv = un indicator = Hematii de oale tapetate cu Anticorpi anti hematii + Citire macroscopica: A. reactie pozitiva = sediment de hematii nelizate pe fundul tubului = Anticorpi anti Teruaii prezentl in serul pacientului leaga antigenul si complementul; B. reactie negativa = liza bsenta Ac antiT. cruzii din ser, faciliteaza liza hematiilor de catre complement. hematiilor ~ este un test bazat pe tehnica ELISA apreciazo daca o infectie toxoplasmica este dobandita mai recent sou mai demult de 3 luni 1.se executa pe placa cu godeuri tapetate cu antigene purficate de Toxoplasma + 2.serulsangvin al pacientei este transferat in 2.qodeur!silasat la incubat ~ 3.spalare + 4, adaugare intr-unul din godeuri Tampon de aviditote (uree) si in celolalt godeu Tampon de spalore [obs = tamponul de avidtate vo disocia complexele sabe antigen-anticorp 1gG_{IgG cu aviditate de leqore scazuta la antigen de Toxoplasma, - 5. spalare + adaugare Conjugat (anticorpi monoclonali anti {gG umane cuplati cu 0 enzima) = 6 Spalare + adaugore Substrot enzimatic = apartia unei culori a carei intensitate este direct proportionala cu concentratia de IgG anti Toxoplasma (din serul sangvin pacientei) legati la antigenul de fundul godeului = 7. Adaugare Solutie top - 8. Citire la spectrofotometru = 8 Roportul dintre valoarea absorbantet din godeul cu tampon de oviditate si voloarea absorbantei din godeu! cu tampon de spalare este exprimat in procente si indica gradul de aviditate a anticorpilor IgG anti Toxoplasma la ontigenele de Toxoplasma din godeur ‘% Aviditate scazuto IgG anti Toxoplasma = Infectie dobandita mai recent de 3 luni % Aviditate ridicata IgG anti Toxoplasma = Infectie dobondita mai demult de 3 luniAsst univ. lonela Neagoc UMF ‘arol Davila’ upa 24h se face prima examinore a coproculturii cu 0 lupa binoculara sou la stereomicroscop pentru depistarea larvelorstrongiloide += in cazul une infect cu Strongiloides stercoralis se vor dezvolta in 24-48h in cazul unel infectii cu Acylostoma duodenalis sou Necator americanus in 7zile Larvele_strongiloide se depisteaza in picoturile de apa condensate sub capacul cutie (prin evaporarea ope’ din vata, cutia se raceste, apa din fecale se evapora si condenseaza sub capac; lorvele strongiloide au geotropism negativ -se indeparteaza de amestecul de carbune, au hidrotropism pozitv si tigmotropism poritv se acumuleaza in picaturile de apa condensate sub copac). — 5._COPROCULTURA CU CARBUNE VEGETAL IN PLACIIPETRLCU AGAR \ Principiu test: ‘Se amesteca in cantitati egale o pasta de carbune vegetal + fecale In mijlocul plac Petri cu agar se aseaza amestecul se lasa la temperatura comerei sau la termostat la 26 oC. upa 24h se face prima examinare a coprocultui Pe suprofata mediului agor se observa macroscopic o extindere a colonillor bacteriene de2voltate prin migrareo larvelor strongioide cu geotropism negati care se indeparteaza de amestecul cu corbune Folosind un stereomieroscop sau lupa binoculara - in cazul une’ infect cu Strongilokes stercoralis: in primele 24-48h pe suprofata agarului se depisteaza larvele strongiloide; = dupa 72h pe suprafata agarului se pot depista viermi adulti +/-oua + larve rhobditoide Pentru 0 exominare detailata a stadilor dezvoltate ~ suprofata mediului agar este inundata si spalata cu formol 25% lichidul de spolore formolizot este aspirat si centrfugat inte-un tub de centrifuge din sedimentulrezultat se fac preparate proaspete Lv! care se examinaza la microscopul optic.