Ada penggalan dari laporan praktikum tentang Mikrobiologi Lingkungan yang sudah pernah

saya buat bersama teman-teman saya. Nah, pada praktikum tersebut sebenarnya
menggunakan metode Most Probable Number yang Umum digunakan, anda dapat
mencarinya di Internet dengan bantuan search engine yang biasa anda gunakan. atau Anda
dapat membacanya Di SINI, atau Di SINI, atau juga DI SINI.

Analisis Prosedur

Sampel air yang digunakan dalam praktikum Uji MPN ini didapatkan dari beberapa tempat,
yaitu daerah mata air Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang, air dari
aliran sungai Brantas, dan air sumur di daerah Kelurahan Ketawanggede. Ketiga sample
tersebut digunakan untuk mendapatkan hasil yang berbeda dan didapatkan perbandingan
diantara sampel tersebut. Uji MPN digunakan digunakan karena uji tersebut sangat efektif
untuk analisis kualitas air berdasarkan adanya koliform. Uji MPN tersebut terdiri dari
beberapa tahapan, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test) dan
uji kelengkapan (completed test).

1. Uji Pendugaan (Presumptive Test)

Uji pendugaan didasarkan pada dugaan adanya bakteri koliform pada suatu sampel air yang
ada di suatu tempat. Uji pendugaan ini dilakukan dengan cara menginokulasikan sampel ke
dalam media yang berupa LBG (laktosa broth ganda) dan LBT (laktosa broth tunggal).
Semua tabung yang berisi LBG kemudian diberi tabung durham untuk mengetahui adanya
gas yang dihasilkan oleh bakteri yang ada dalam sampel air. Sampel air yang digunakan
dibuat menjadi 3 seri perlakuan. Seri pertama diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan dalam
5 tabung reaksi berisi media LBG 10 ml, seri kedua diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan
dalam LBG 10 ml, sedangkan seri ketiga diambil sebanyak 0,5 ml dalam 10 ml LBG. Ketiga
seri larutan uji kemudian diinkubasi selama 24 jam. Inkubasi dilakukan untuk memberikan
waktu bagi bakteri untuk tumbuh berkembang serta melakukan aktivitas metabolisme.
Setelah masa inkubasi berakhir, setiap tabung reaksi diamati. Pengamatan yang dilakukan
meliputi ada atau tidaknya gas yang terperangkap dalam tabung durham. Terbentuknya gas
tersebut menunjukkan hasil yang positif dan dapat digunakan untuk dasar pengujian
berikutnya. Selain terbentuknya gas, pengamatan juga dilakukan terhadap perubahan warna.
Perubahan warna media menjadi kuning menunjukkan hasil yang positif.

2. Uji Konfirmasi (Confirmed Test)

Uji konfirmasi ini dilakukan untuk mengetahui adanya bakteri dalam air sampel. Satu
mililiter dari masing-masing kultur yang menunjukkan hasil positif diinokulasikan ke dalam
2 media baru, yaitu BGLB (Brilliant Green Lactose Broth). Media ini mempunyai
kemampuan untuk membatasi pertumbuhan mikroba yang tidak diharapkan yang dapat
mengganggu pengamatan. Sebelum dilakukan inokulasi biakan atau kultur, semua tabung
yang berisi BGLB kemudian diberi tabung durham untuk mengetahui adanya gas yang
dihasilkan oleh bakteri yang ada dalam sampel air. Kemudian media yang telah diinokulasi
dengan biakan dari media sebelumnya di bagi kembali menjadi dua perlakuan, yaitu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu yang berbeda (44oC dan 37oC). Hal ini dilakukan untuk
menggolongkan jenis bakteri koliform yang ada dalam air sampel termasuk dalam golongan
coli fekal atau tidak. Jika biakan dalam inkubasi 44oC tersebut menghasilkan gas, maka dapat
diartikan bahwa bakteri koliform yang ada dalam media adalah coli fekal. Sedangkan jika
terbentuk gas pada kultur yang diinkubasi pada 37oC, maka bakteri yang ada di dalamnya
bukan termasuk golongan coli fekal.

Untuk mengetahui definisi dari koliform fekal silakan baca DI SINI

Uji penguat ini juga dilakukan dengan inokulasi bakteri yang ada dalam media ke media agar
berupa EMB (Eosin Methylene Blue). Inkubasi dilakukan selama 24 jam hingga bakteri
tumbuh. Pengamatan yang dilakukan meliputi warna koloni bakteri yang tumbuh. Hasil yang
positif ditunjukkan dengan adanya warna hijau metalik pada koloni bakteri yang dapat
diasumsikan bahwa koloni bakteri tersebut adalah koloni E. coli.

3. Uji Pelengkap (Completed Test)

Uji pelengkap dilakukan jika uji sebelumnya menunjukkan hasil yang positif. Koloni yang
menunjukkan hasil positif, yaitu koloni yang berwarna hijau metalik pada media agar EMB
kemudian diinokulasikan pada media yang baru dalam tabung reaksi yang sebelumnya sudah
diberi tabung durham, yaitu LB dan diinkubasi dalam suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan
yang dilakukan meliputi perubahan warna dan terbentuknya gas dalam tabung durham. Hasil
yang positif kemudian dicatat dan kemudian dilakukan uji pewarnaan Gram. Hasil yang
diperoleh digunakan untuk menghitung jumlah bakteri koliform yang ada dalam sampel air
dengan bantuan tabel MPN yang ada.

Analisis Hasil

Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam
tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri Escherichia coli dapat dilihat dengan
menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan
dibandingkan dengan tabel MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba
di dalam contoh yang berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif, maka
dilanjutkan dengan inkubasi 2 x 24 jam pada suhu 35oC. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak
terbentuk gas dalam tabung Durham, dihitung sebagai hasil negatif (Widiyanti dan Ristanti,
2004). Jumlah tabung yang positif dihitung pada masing-masing seri. Dari tabung yang
positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1x24 jam, suspensi ditanamkan
pada media Eosin Methylen Biru Agar (EMBA) secara aseptik dengan menggunakan jarum
inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilat
metalik atau koloni berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok koliform lainnya.
MPN penduga dapat dihitung dengan melihat tabel MPN. Setelah dilakukan serangkaian uji
dalam metode MPN ini, maka didapatkan hasil pengamatan sebagai berikut. (klik untuk
memperbesar)
Berdasarkan Tabel 4.2.1 diatas, terdapat perbedaan antara masing-masing sampel air. Uji
penduga yang dilakukan menunjukkan hasil positif pada semua sampel. Namun, untuk
sampel mata air kelompok 2 menunjukkan hasil yang paling sedikit untuk masing-masing seri
LBG dan LBT. Kemudian setelah dilakukan uji konfirmasi, terdapat perbedaan antar sampel
air. Pada kultur BGLB dengan inkubasi 44oC, hasil positif yang paling tinggi adalah dari
sampel mata air kelompok 1 dan air aliran sungai Brantas kelompok 4 (semua biakan).
Namun setelah uji konfirmasi lainnya, yaitu kultur dalam agar EMB dilakukan, sampel mata
air menunjukkan hasil positif yang paling kecil, hanya 2 yang positif dengan menunjukkan
warna hijau metalik, sedangkan hasil positif yang paling tinggi adalah dari sampel air sungai
Brantas kelompok 4, sebanyak 14.

Gambar 4.1 Hasil uji konfirmasi (kultur dalam media BGLB)

Kanan = hasil negatif; Kiri = hasil positif ditunjukkan adanya gas (tanda panah)

Gambar 4.1 Hasil positif uji konfirmasi (media agar EMB)

Koloni bakteri E. coli dalam agar EMB akan berwarna hijau metalik jika terdapat reaksi
fermentasi dengan media. Hal ini dikarenakan E. Coli merupakan bakteri fermentasi. Bakteri
yang menfermentasi dengan lambat akan menghasilkan koloni berwarna merah muda dalam
media agar EMB. Media EMB adalah media selektif diferensial untuk mendeteksi
keberadaan bakteri koliform fekal dan mikroorganisme lainnya. Bakteri koliform
memfermentasi laktosa yang dapat membuat warna koloni bakteri menjadi berwarna hijau
metalik atau merah muda (Dad, 2000).
Uji selanjutnya yang telah dilakukan adalah uji pelengkap, yaitu dengan pewarnaan Gram.
Hasil pewarnaan Gram yang dilakukan menunjukkan bahwa semua bakteri tergolong dalam
bakteri Gram negatif dan berbentuk basil dan basil pendek. Penentuan koliform fekal menjadi
indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan
keberadaan bakteri patogen karena pada dasarnya bakteri koliform adalah bakteri indikator
keberadaan bakteri patogenik lain. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat,
dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Makin sedikit kandungan
koliform, artinya, kualitas air semakin baik (Friedheim, 2001).
Penghitungan MPN organisme dapat dilakukan dengan menghitung banyaknya tabung positif
pada setiap pengenceran. Kemudian jumlah tabung positif dari masing-masing pengenceran
(seri 1, 2 dan 3) di cocokkan dengan angka pada Tabel McCrady metode 3 tabung. Nilai yang
didapat ini dikalikan dengan faktor pengenceran pada tabung dengan pengenceran yang
paling rendah untuk mendapatkan kelimpahan MPN pada sampel.
Metode untuk menduga jumlah bakteri dalam suatu produk atau sampel dapat menggunakan
metode hitungan mikroskopis, metode plate count dan most probable number (MPN).
Organisme yang mati maupun hidup dapat dihitung dengan metoda hitungan mikroskopis,
akan tetapi pada MPN hanya organisme hidup yang dapat dihitung. Metode MPN adalah
metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung
reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan
perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statisitik (Fardiaz,1989).

PUSTAKA

Dad. 2000. Bacterial Chemistry and Physiology. John Wiley & Sons, Inc., New York, p. 426
Fardiaz, S.,.1989. Analisis Mikrobiologi Pangan, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan,
IPB.
Friedheim, E., and Michaelis, L. 2001. J. Biol. Chem., 91,55-368. Cit. Porter, Jr.
Widiyanti, N.L.P.M. dan N.P. Ristanti. 2004. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform pada Depo
Air Minum Isi Ulang di Kota Singaraja Bali Jurnal Ekologi Kesehatan Vol 3 No 1, April 2004
: 64 - 73