Capitulo 2 DISOLUCIONES ACUOSAS 1. Propiedades del agua A. Estructura @ interacciones, B.El agua como disolvente ©. Movilidad del protén 2. Acidos, bases y tampones A. Reacciones acido-base B. Tampones C. Acidos poliproticos La vida, tal como la conocemos, tiene lugar en disolu- cién acuosa, En realidad, la vida terrestre aparecié, aparentemente, en algan mar primordial (Seccion 1-4B) y, como indican los restos fosiles, no se aventu- 16 en la tierra firme hasta épocas relativamente re- cientes. Pero aun aquellos organismos que desarrolla- ron la capacidad de vivir fuera del agua todavia arrastran el océano con ellos: las composiciones de sus fluidos intracelulares y extracelulares son notable- mente semejantes a las del agua del mar. Ello es cierto aun en los organismos que viven en ambientes tan poco frecuentes como salmueras saturadas, ma- nantiales sulfurados Acidos y calientes y en petréleo. El agua es tan familiar que la consideramos gene- ralmente como un fluido més bien poco activo de cardcter simple. Se trata, sin embargo, de un liquido activo quimicamente con propiedades fisicas tan ex- traordinarias que si los quimicos la hubiesen descu- bierto en épocas recientes, la habrian clasificado como una sustancia exética, Las propiedades del agua tienen un significado bio: logico profundo. Las estructuras de las moléculas en las, que se basa la vida, las proteinas, los acidos nucleicos, las membranas liptdicas y los hidratos de carbono com- plejos, son la consecuencia directa de sus interacciones con su entorno acuoso. La combinacién de las propieda- des del disolvente, responsable de las interacciones de las asociaciones intramoleculares e intermoleculares de es- tas sustancias, es peculiar del agua, ningiin otro disol- vente, ni aun los mas proximos, se parecen al agua en este aspecto. Aunque la hipétesis de que la vida podriani He i 4 i 4 Hh i i ti if ill32. Seccién 2-1. Propiedades del agua minante en la determinacion de sus estructuras tridi- mensionales y de sus asociaciones intermoleculares. El enlace de hidrogeno se comentara posteriormente en la Seccion 7-4B. Las propiedades fisicas del hielo y del agua liquida son consecuencia, en gran parte, de los enlaces de hidrégeno intermoleculares La estructura del hielo proporciona un ejemplo no- table de la fuerza que se acumula al establecerse muchos enlaces de hidrogeno. Los estudios por ra- yos-X y por difraccién con neutrones han establecido que las moléculas de agua se hallan dispuestas en el hielo en una estructura abierta poco frecuente. Cada molécula de agua se halla rodeada tetraédricamente por las cuatro vecinas mas proximas, a las que se halla unida mediante enlaces de hidrogeno (Fig. 2-3). En dos de estos enlaces de hidrégeno la molécula de H,O central es el “dador” y en los otros dos es el “aceptor”. Como consecuencia de su estructura abier- ta, el agua es una de las poquisimas sustancias que se expansiona al congelarse (a 0 °C el agua liquida posee una densidad de 1,00 g-mL~', mientras que el hielo tiene una densidad de 0,92 g- mL") La expansion del agua por congelacion determina unas condiciones trascendentales para la vida sobre Ia tierra. Supéngase que el agua se contrajese al con- gelarse, es decir, que aumentase su densidad en vez de disminuir. EI hielo se hundiria entonces hasta el fondo de los lagos y de los océanos en lugar de flotar. Este hielo permaneceria aislado del sol de modo que los océanos, a excepcién de una delgada capa superfi- cial de liquido en el tiempo célido, permanecerian congelados, en estado sélido (el agua a gran profundi- dad aun en los océanos tropicales se halla proxima a a temperatura de 4°C, que es la de su densidad maxima). La reflexién de la luz solar por estos océa- nos congelados y su efecto refrigerante sobre la at- mésfera aseguraria que las temperaturas terrestres serian también mucho més frias que las actuales, es decir, que la tierra tendria una edad glacial perma- nente. Ademés, como la vida evolucion6 aparente- mente en el océano, parece improbable que hubiese podido desarrollarse por completo si el hielo se hu- biese contraido al congelarse. ‘Aunque la fusion del hielo es indicio del colapso cooperativo de su estructura de enlaces de hidrogeno, los enlaces de este tipo persisten entre las moléculas de agua en el estado liquido. El calor de sublimacion del hielo a 0 °C es de 46,9 kJ - mol-!, Pero solamente ~ 6kJ- mol” de esta cantidad puede adscribirse a la energia cinética de las moléculas de agua en estado gaseoso. Los restantes 41 kJ- mol’ deben represen tar, por tanto, la energia necesaria para vencer las interacciones de los enlaces de hidrégeno que mantie- nen reunido un cristal de hielo. El calor de fusion del hielo (6,0 kJ - mol-1) es ~ el 15 % de la energia que se necesita para destruir la estructura del hielo. El agua liquida se halla, por tanto, unida por enlace de hidrégeno solamente un ~ 15% menos que el hielo a 0°C. El Figura 2-3. Estructura del hielo. La ordenacién tetraédrica de las moléculas de agua es una consecuencia de la disposicion groseramente tetraédrica de los orbitales hibridos de enlace sp y del que contiene el par de electrones solitario (Fig. 2-2). Los atomos de oxigeno y de hidrégeno se representan, respectivamente, por esferas rojas y blancas, y los enlaces de hidrégeno se indican por las lineas discontinuas. Obsérvese la estructura abierta que contiere al hielo su densidad inferior con relacion a la del agua liquida. [Segin, Pauling, L., The Nature of the Chemical Bond (9 ed.) p. 465, Cornell University Press (1960)] punto de ebullicién del agua es 264 °C superior al del metano (CH,), una sustancia que posee casi la misma masa molecular que el agua, pero que es incapaz de establecer enlaces de hidrégeno (en ausencia de aso- ciaciones intermoleculares, las sustancias con masas moleculares iguales deberian tener puntos de ebulli- cion semejantes). Todo esto refleja la extraordinaria cohesién interna del agua liquida que es el resultado de sus enlaces de hidrégeno intermoleculares. El agua liquida posee una estructura que fluctia con rapidez Las medidas por dispersion de rayos-X del agua liquida revelan que posee una estructura compleja. En las proximidades de 0 °C, el agua exhibe una distan- cia 0 -- -O media, al vecino mas proximo, de 2,82 que es ligeramente mayor que la distancia de 2,76 A correspondiente en el hielo a pesar de la mayor densi- dad del liquido. Los datos de rayos-X indican, ade- més, que cada molécula de agua se halla rodeada de un promedio de 4,4 vecinos mas préximos, lo queconstituye una fundada sospecha de que la estructura de interaccion corta del agua es predominantemen- te de caracter tetraédrico. Confirman la imagen las distancias intermoleculares adicionales en el agua Ii- quida de cerca de 4,5 y 7,0 A, que son aproximadas a las distancias segunda y tercera de los vecinos mas préximos, en una estructura tetraédrica semejante ala del hielo. El agua Iiquida exhibe, sin embargo, tam- bién una distancia intermolecular de 3,5 A, que no puede explicarse por una estructura como la del hielo. Estas distancias medias, por otra parte, Iegan a ser ‘menos definidas a medida que aumenta la temperatu- ra en el intervalo con significado biologico, con lo que sefialan la ruptura térmica de estructura del agua de interaccién corta. La estructura del agua liquida no puede describirse con sencillez. Ello es debido a que cada molécula de agua se reorienta aproximadamente una vez cada 10" s, lo que hace que la determinaci6n de la estruc- tura instanténea del agua sea un problema dificil, tanto desde el punto de vista experimental como del teorico (muy pocas técnicas experimentales pueden efectuar medidas en expectativas de tiempo tan cor- tas). En realidad, solamente con el acceso reciente de las simulaciones dinamicas moleculares, que calculan las trayectorias de los atomos individuales en un gran, conjunto de moléculas sobre un periodo de tiempo determinado, han sentido los teéricos que alcanzan una comprension razonable del agua Iiquida al nivel molecular, La mayor parte de las moléculas en el agua liquida se hallan unidas cada una de ellas, mediante enlaces de hidrogeno, a las cuatro vecinas més proximas, tal, como lo estan en el hielo. Estos enlaces de hidrogeno se hallan distorsionados, sin embargo, de modo que las redes de moléculas ligadas son irregulares y varia- das. Por ejemplo, en el agua liquida aparecen corrien- temente anillos formados por 4 a 7 miembros, que son moléculas unidas por enlaces de hidrogeno, en contraste con los anillos de seis miembros caracteristi- cos del hielo (Fig. 2-3). Por otra parte, estas redes se estan rompiendo y formando continuamente en pe- riodos de tiempo del orden de 2 x 10°! s, Puede afir- marse que el agua Iiquida esté constituida por una red que ocupa todo el espacio, formada por moléculas de H,0 unidas mediante enlaces de hidrégeno, que experimenta una fluctuacion répida y que a distancias cortas se pare- ce ala red del hielo. B. El agua como disolvente Se dice que el agua es el “disolvente universal”. ‘Aunque esta afirmacion no es literalmente cierta, lo que si es verdad es que el agua disuelve a més tipos de sustancias y en cantidades mayores que cualquier otto disolvenie. En particular, el cardcter polar del agua la convierte en un disolvente excelente de los ‘materiales polares y de los idnicos, de los que se dice, por ello, que son hidroflicos (del griego: hydor, agua + philos, amante). Por otra parte, las sustancias no Capitulo 2. Disoluciones acuosas 33 Tabla 2-1 Constantes dieléctricas y dipolos moleculares permanentes de algunos disolventes corrientes Momento Constante dipolar Sustancia dicléctrica _(debye) Formamida 1100 337 Agua 785 1,85 Dimetil sulfoxido 48,9 3,96 Metanol 32.6 166 Etanol 243 168 Acetona 20,7 272 Amonfaco 169 147 Cloroformo 48 13s Eter dietilico 43 115 Benceno 23 0,00 Tetracloruro de carbono 22 0,00 Hexano 19 0,00 Procedencia: Brey, W. S., Physical Chemistry and Its Biological Ap- plications, p.26, Academic Press (1978). polares son virtualmente insolubles en el agua (“el aceite y el agua no se mezclan”) y, por consiguiente, se describen como sustancias hidrofobicas (del grie go: phobos, repeler). Las sustancias no polares son solubles, sin embargo, en disolventes no polares tales como CCl, o hexano. Esta informacién se resume en otra maxima, “semejante disuelve a semejante”. @Por qué se disuelven las sales en el agua? Las sales como NaCl o K,HPO, se mantienen reunidas porque sus iones se atraen por fuerzas inicas. Los iones de tuna sal, tal como lo hacen las cargas eléctricas, inter- actéan entre si de acuerdo con la ley de Coulomb: kage Po De 2.1] en la que Fes la fuerza entre dos cargas eléctricas, 4: y gz, que se hallan separadas por la distancia r, D es la constante dieléctrica del medio que las separa, y k es una constante de proporcionalidad (8,99 x 10° J-m-C2), En el vacio, Des la unidad y en el aire es, __ solo negligiblemente mayor. Las constantes dieléctri- cas de varios disolventes corrientes, junto con sus momentos dipolares permanentes, aparecen en la Ta- Figura 2-4 Solvatacion de iones por moléculas de agua orientadas.34° Seccidn 2-1. Propiedades del agua bla 2-1. Obsérvese que estas cantidades tienden a aumentar juntas, aunque no lo hagan de un modo re- gular, La constante dieléctrica del agua se halla entre las mas elevadas de cualquier liquido puro, mientras que las de las sustancias no polares, tales como los hidrocarburos, son relativamente pequenas. La fuerza entre dos iones separados por una distancia determinada en liquidos no polares, tales como hexano o benceno, es, por tanto, 30 a 40 veces mayor que en el agua. Por consiguiente, en disolventes no polares (D pequeria), los iones de carga opuesta se atraen entre sf tan fuertemente que coalescen y forman una sal, mientras que las fuerzas mucho més débiles predominan entre os iones en disolucién acuosa (D grande) lo que permite que cantidades significativas de iones perma- nezcan separados. Un ion sumergido en un disolvente polar atrae a los extremos con carga opuesta de los dipolos del disol- vente, tal como aparece en la Fig. 2-4 para el caso del agua. El ion es rodeado por varias capas concénttricas de moléculas del disolvente orientadas. Se dice que tales iones se encuentran solvatados o, si el disolven- te es el agua, hidratados. El campo eléctrico produci- do por los dipolos del disolvente se opone al del ion de modo que, en efecto, la carga inica se difunde en todo el volumen del complejo solvatado. Esta disposi- cién atenéa, en gran parte, las fuerzas de Coulomb entre los iones y es la raz6n por la que los disolventes polares poseen constantes dieléctricas tan elevadas. El efecto orientador de las cargas iénicas sobre las moléculas dipolares esta contrarrestado por los movi- mientos térmicos que, de modo continuo, tienden a reorientar todas las moléculas al azar. Esta es la causa, de que los dipolos sélo se hallen orientados parcial- mente en un complejo solvatado. La raz6n por la que la constante dieléctrica del agua es tan superior a la de los otros iquidos con momentos dipolares compa- rables reside en que la estructura de enlaces de hidr6- geno del agua liquida les permite formar estructuras orientadas que resisten la dispersion al azar térmica y de aqui una distribucion de las cargas idnicas mas eficaz. Los dipolos de las moléculas polares sin carga les permiten disolverse en disoluciones acuosas por las mismas razones por las que las sustancias idnicas se disuelven en el agua. Las solubilidades de las sustan- cias polares y de las i6nicas aumentan si son portado- « @ «© ° @ | H H a / r—¢ Zon woh Figura 2.5 Enlace de hidrogeno entre agua y (a) grupos hidroxilo, (b) grupos ceto, (2) grupos carboxilo y (d) grupos amino. ras_de grupos funcionales tales como hidroxilo (-OH), ceto (>C=0), carboxilo (-CO;H 0 COOH) o amino (-NH,), que pueden formar enlaces de hidr6- geno con el agua, tal como se muestra en la Fig. 2-5. De hecho, las biomoléculas solubles en el agua, tales como las proteinas, los acidos nucleicos y los hidratos de carbono, proyectan al exterior justamente estos grupos. Las sustancias no polares, por el contrario, carecen tanto de enlaces de hidrégeno como de gru- pos aceptores. Los anfifilos forman micelas y bicapas La mayor parte de las moléculas biolégicas poseen segmentos polares (0 con carga iénica) y segmentos no polares y por ello son, simulténeamente, hidrofilicas e hidrofébicas. Este tipo de moléculas, por ejemplo los ones de los Acidos grasos (jabones idnicos, Fig. 2-6), se dice que son anfifilicas o, sinénimamente, anfipa- ticas (del griego: amphi, para ambos + pathos, pasion). Como interactian los anfifilos con un disolvente aciioso? El agua, por supuesto, tiende a hidratar la porcién hidrofilica de un anfifilo, pero también tiende 9 a CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH;C—O- Palmitato (CisHl,C00™) H 1 (CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH,— Figura 2-6 H i ° a — CH,CH,CH,CH,CH,CH,CH;-C—O™ Oleato (C,pH3,C00~) Ejemplos de aniones de Acido graso. Estan constituidos por un grupo carboxilato polar, acoplado a una larga cadena de hidrocarburo no polar.(a) Mesa a excluir a su porcién hidrofobica. En consecuencia, Jos anfifilos tienden a formar agregados ordenados estructuralmente que se dispersan en el agua. Estos agregados pueden adoptar la forma de micelas, que son glébulos de hasta varios millares de anfifilos ordenados con sus grupos hidrofilicos en la superficie del glébulo, de modo que pueden interactuar con el disolvente acuoso, mientras que los grupos hidrofobi- 0s se asocian en el centro de modo que excluyen al disolvente (Fig. 2-72). Otra alternativa es que los anfi- filos pueden ordenarse por si mismos y formar hojas de dos capas o vesiculas (Fig. 2-70) en las que los grupos polares se encaran con la fase acuosa. Las interacciones que estabilizan una micela o una bicapa se describen colectivamente como fuerzas hi- drofébicas o interacciones para indicar que son el resultado de la tendencia del agua a excluir a los grupos hidrofébicos. Las interacciones hidrofobicas son relativamente débiles, si se comparan con los enlaces de hidrdgeno, y carecen de direccién. No obstante, las interacciones hidrofobicas son un pivote de importancia biolégica debido a que, como veremos en capitulos posteriores, son responsables en gran Tabla 2-2 Movilidades i6nicas* en H,O a 25°C Movilidad x 10 Ton H,0° 3624 Lit 40,1 Nat 519 K 761 NHj 760 - Mgi* 550° cate 61,6 OH 197.6 cr 763 Br 78,3 CH,COO- 40,9 soy 798 a ‘Movilidad ionica es la distancia que se desplaza un ion en tun segundg bajo la influencia de un campo eléctrico de un voltio por em. Procedencia: Brey, W. S., Physical Chemistry and Its Biological Ap- plications, p. 172, Academic Press (1978). Capitulo 2. Disoluciones acuosas 38 Figura 2-7 Asociaciones de moléculas anfipéticas en disolucién acuosa. Los grupos polares de “cabeza” se hallan hidratados, mientras que las “colas” no polares se agregan de modo que excluyen la disolucion acuosa: (a) Agregado esteroidal de moléculas anfipaticas conocido ‘como micela. (b) Agregado plano de molécul ‘anfipaticas llamado bicapa. La bicapa puede formar una cubierta esférica cerrada, conocida como vesicula, que encierra una cantidad pequefia de disolucion acuosa. parte de la integridad estructural de las macromolécu- as biologicas asi como de agregados supramolecula~ ‘es como las membranas. Téngase en cuenta que las interacciones hidrofobicas son peculiares de un entor- no acuoso. Otros disolventes polares no promueven. este tipo de asociaciones. C. Movilidad del proton Cuando una corriente eléctrica atraviesa por una disolucion iéni¢a, los iones emigran hacia el electrodo de polaridad opuesta, a una velocidad que es propor. cional al campo eléctrico e inversamente proporcional ala resistencia a la friccion que experimenta el ion al desplazarse en el seno de la disolucion. Esta altima cantidad, como indica la Tabla 2-2, varia con el tama- fio del ion. Obsérvese, sin embargo, que las movilida- des iénicas, tanto del H,O* como del OH” son anor- malmente grandes en comparacion con las de otros iones. Para el H,O* (el ion hidronio, que se designa abreviadamente por H*; un protén desnudo no existe establemente en disolucion acuosa) esta velocidad de emigracién tan elevada es la consecuencia de la capa- HA : 0 @-0~ i \ a x Figura 2-8 Mecanismo de emigracion del ion hidronio en disolucion ‘acuosa mediante saltos de proton. Estos saltos, que en su mayor parte se producen al azar, suceden con rapidez en ‘comparacién con la emigracién molecular directa, lo que permite interpretar las elevadas movilidades iénicas que se ‘observan en los iones hidronio @ hidroxilo en las disoluciones acuoses.36 Seccién 2-2. Acidos, bases y tampones cidad de los protones de saltar rapidamente desde una molécula de agua a otra, tal como muestra el diagrama de la Fig. 2-8. Aunque un ion hidronio de- terminado puede emigrar fisicamente a través de una disolucién de la manera como lo hace un ion Na‘, la tapidez del mecanismo de salto del proton determina que la movilidad efectiva del ion H,O* sea mucho mayor de lo que seria de otra manera (la vida media de un determinado ion H,O" es 10-5 a 25°C). La movilidad iénica anormalmente elevada del ion OH se interpreta también, de un modo andlogo, por el mecanismo de salto del protén, pero en este caso la direccion aparente de la emigraci6n ionica es la opuesta a la direccién del salto del proton. El meca- nismo del salto del protén es también el responsable de la observacién de que las reacciones écido-base se hallan entre las reacciones mas rapidas de las que suce- den en disoluciones acuosas y es importante, probable- mente, en las reacciones de transferencia de protones biolégicas. 2. ACIDOS, BASES Y TAMPONES Las moléculas biol6gicas como las proteinas y los cidos nucleicos son portadoras de numerosos grupos funcionales, tales como los grupos carboxilo y amino, que pueden experimentar reacciones Acido-base. Por esta raz6n muchas propiedades de estas moléculas varian con la acidez de las disoluciones en las que se hallan inmersas. En esta seccién consideraremos la naturaleza de las reacciones acido-base y como se controla la acidez desde el punto de vista fisiol6gico y en el laboratorio. A. Reacciones acido-base Acidos y bases segan la definicién establecida en los afios 1880 por Svante Arrhenius, son, respectiva- mente, sustancias capaces de dar protones e iones hidroxido. Esta definicién es mas bien limitada, debi- do, por ejemplo, a que no explica la observacién de que el amonfaco que carece de un grupo OH- exhibe propiedades basicas. Una definicién mas general, que fue formulada en 1923 por Johannes Bronsted y Tho- mas Lowry, establece que un dcido es una sustancia que puede ceder protones (lo mismo que en la definicion de Arrhenius) y que una base es una sustancia que puede aceptar protones. De acuerdo con esta definicién en cada reaccion acido-base, HA + H,0 = H,O* + A~ un acido (HA) reacciona con una base (H,O) y forma la base conjugada del acido (A”) y el 4cido conjuga- do de la base (H,0) (esta reaccion se representa habitualmente de modo abreviado HA => H' + A>, de modo que la participacion del agua se considera im- plicita). De acuerdo con lo anterior, el ion acetato (CH,COO>) es la base conjugada del acido acético (CH,COOH) y el ion amonio (NH,‘) es el acido con- jugado del amoniaco (NH;). Una definicidn, todavia mas general de dcidos y bases, formulada por Gilbert Lewis, describia un acido como una sustancia que puede aceptar un par de electrones y una base como una sustancia que puede ceder un par de electrones. Esta definicién, que es aplicable tanto a los sistemas acuosos como a los que no lo son, es de una amplitud innecesaria para la descripcién de la mayor parte de los fenémenos bioquimicos La fuerza de un Acido la especifica su constante de disociacion La reaccién de disociacién de un acido, formulada anteriormente, se caracteriza por su constante de equilibrio, que para las reacciones acido-base se de- signa como constante de disociacién, [HsO* A] [HAJ[H,0] esta cantidad es una medida de las afinidades relati- vas del proton, en los pares conjugados acid-base HA/A“ y H,O*/H,O. Aqui, como a lo largo del texto, las cantidades entre corchetes representan las concen- traciones molares de las sustancias indicadas. Como en las disoluciones acuosas diluidas la concentracion de agua permanece esencialmente constante, siendo [H,O] = 1000 g - L*/18,015 g- mol=55,5M, este término se combina por costumbre con la constante de disociacién que toma entonces la forma TA] re (2.2) K, = K(H,0] Para abreviar, sin embargo, de aqui en adelante omi tiremos el subindice “a”. Las constantes de disocia cin de los acidos tities para la preparacion de disolu- ciones bioquimicas aparecen en la Tabla 2-3. Los acidos pueden clasificarse de acuerdo con su fuerza relativa, es decir, de acuerdo con sus capacida- des para transferir protones al agua. Los acidos con constantes de disociacion menores que el H,O* (que, por definicién, es la unidad en disoluciones acuosas) se hallan solamente ionizados parcialmente en diso- lucién acuosa y se conocen como Acidos débiles (K <1). Reciprocamente, los acidos fuertes poseen constantes de disociacién mayores que la del H,O* de modo que se hallan ionizados casi por completo en disoluciones acuosas (K > 1). Los acidos que apare- cen en la Tabla 2-3 son todos Acidos débiles. Sin embargo, muchos de los Iamados ““acidos minera- les”, tales como HCIO,, HNO,, HCI y H,SO, (en su primera ionizacién) son acidos fuertes. Como los aci- dos fuertes transfieren todos sus protones al H,O répidamente, el cido més fuerte que puede existir con estabilidad en las disoluciones acuosas es H,O*. Anélogamente, en disolucién acuosa no puede existir base més fuerte que OH~ ‘Como el agua es un Acido pose una constante de disociacionxo OH (H.0) ‘Como se indicé con anterioridad, la concentracién de agua es constante, [H,] = 55,5M y puede incorporar- se ala constante de disociacién, con lo que la expre- sion de la constante de disociacién del agua se con- vierte en, K,=[H*YOH] Ray El valor de K, a 25°C es 10-M. El agua pura debe contener, por tanto, cantidades equimolares de H* y de OH" de modo que [H*] = [OH] = (K,)}/? = 107M. Como [H*] y [OH"] se hallan en relacion reciproca mediante la Ec. [2.4], si [H*] es mayor que este valor, [OH] debe ser correspondientemente menor y vice- versa, Las disoluciones con [H*] = 10-7M se dice que son neutras, en las que [H*] > 10-7M se dice que son acidas y aquellas con [H") < 10°M se dice que son basicas. La mayor parte de las disoluciones fisio- logicas poseen una concentracién de ion hidrégeno proxima a la neutralidad. Por ejemplo, la sangre hu- mana es, normalmente, ligeramente basica con [H’ 4,0 10-M, Los valores de [H*] de la mayor parte de las disolu- ciones son muy pequeftos lo que constituye un incon- veniente para poderlos comparar. Una magnitud mas préctica es la conocida como pH, que fue ideada por Soren Sorensen en 1909: pH =—logiH*] (25) El pH del agua pura es 7,0, mientras que las disolu- ciones acidas poseen un pH < 7,0 y las disoluciones basicas poseen un pH > 7,0. En una disolucion 1M de un Acido fuerte, pH = 0 y en una disolucion 1M de una base fuerte, pH = 14. Téngase en cuenta que si dos disoluciones se diferencian en una unidad de pH, su diferencia en [H*] es de un factor de 10. El pH de tuna disolucién puede determinarse con exactitud y facilidad por medidas electroquimicas, mediante un aparato llamado medidor de pH (pH-metro). El pH de una disoluci6n se halla determinado por las concentraciones relativas de acidos y de bases La relacién entre el pH de una disolucién y las concentraciones de un acido y de su base conjugada pueden deducirse con facilidad reordenando la Fe. (2.3] HA : =) a) ia) que sustituida en la Ec. (2.5) A] pH =—log K +k (4) 8 og [HA], Si se define pk = ~ logk, en analogia con Ec. [2.5], obtenemos la ecuacién de Henderson-Hasselbalch: pH = pK + log (2) AAI 2.6 Capitulo 2. Disoluciones acuosas 37 Esta ecuacion indica que el pK de un dcido es numéri- camente igual al pH de una disolucién cuando las concentraciones molares del Acido y de su base conju- gada son iguales. La Tabla 2-3 relaciona los valores de pK de varios acidos. B. Tampones La adicién de 0,01 mL de HCI 1M a 1L de agua pura cambiaré el pH desde 7 a 5, lo que representa un incremento de 100 veces de la [H']. Pero como las propiedades de las sustancias biolégicas varian signi- ficativamente con variaciones pequenias del pH, preci- san aquellas de entornos en los que se conserve el pH cuando se aftaden acidos o bases. Para entender como es posible conseguirlo consideremos la valoraci6r! de tun Acido débil con una base fuerte. La Fig. 2-9 muestra cémo varian los valores de pH de 1 L de disoluciones de acido acético 1M, H,PO; e ion amonio (NH{) cuando se van aftadiendo diversas cantidades de OH". Deben observarse varios detalles: 1. Las curvas muestran una forma semejante, pero se van desplazando a lo largo del eje de pH. 2. El pH en el punto de equivalencia de cada valora- cion (en el que los equivalentes de OH afiadidos son iguales a los de HA inicialmente presentes) es > 7, debido a la reaccion de A“ con el H,O, para formar HA + OH; andlogamente, cada pH inicial es <7, 3. El pH en el punto medio de cada valoracién es numéricamente igual al pK de su acido correspon- diente, de aqui que, de acuerdo con la ecuacién de Henderson-Hasselbalch, [HA] = [A]. 4, La pendiente de cada una de las curvas de valora- cién es mucho menor en la proximidad de su pun- to medio que en los extremos de cada una de ellas. Ello indica que cuando [HA] ~ [A], el pH de la disolucién es relativamente insensible a la adicion de base 0 dcido fuertes. Este tipo de disolucién, que se conoce como tampén dacido-base, resiste alas vari ciones de pH, ya que la adicién de cantidades peque- fas de H’ u OH, respectivamente, reaccionan con los iones A- 0 con HA presentes sin gran cambio en el valor de log ((A-]/[HAD. Curvas de valoracién como las de la Fig. 2-9, asi como las curvas de distribucién como las de la Fig. 2-10, pueden calcularse empleando la ecuacién de Henderson-Hasselbalch, Cerca del comienzo de la valoracion, una fraccién significativa de A” que se halla presente procede de la disociacion de HA. De modo analogo, en las proximidades del punto final, la mayor parte de HA procede de la reaccién de A- con H,O. A lo largo de la mayor parte de la valoracién, sin embargo, el OH" aftadido reacciona esencialmente por completo con HA para formar A- de modo que Ay = 2. ‘ 7)38 Seccién 2-2, Acids, bases y tampones Tabla 2-3. Constantes de disociacion y pK’ 25°C de algunos acidos que se emplean habitualmente en el laboratorio como tampones bioquimicos Acido K pK Acido oxélico 537 «107 1.27 (pk) HPO, 7,08 x 10° 2,15 (PK) Acido citrico 7A1 x 10 3,13 (pk) Acido formico 178 x 10+ 3,75 ‘Acido succtnico 6,17 x 10° 4,21 (pK) Onalato~ 5,37 x 105 427 (pk) Acido acético 1,74 x 10% 4,76 CCitrato™ 1,74 x 10° 4.76 (pky) Succinato™ 2,29 x 10° 5,64 (pK) Acido 2-(N-morfolino)-etano sulfonico (MES) 7,94 x 107 610 Acido cacodilico 5,37 x 107 627 H,CO, 447x107 635 (pK) Citrato™ 3,98 x 10-7 6,40 (pK) ‘Acido N-(2-acetamido)-iminodiacético (ADA) 2,82 x 1077 655 Piperacina-N, N’-bis(acido 2-etanosulfénico) (PIPES) 1,78 x 107 6,75 Acido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfonico (ACES) 1,58 x 107 6,80 Acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico (MOPS) 7a7 HPO; 7,20 (pK) Acido N-2-hidroxietilpiperacina-N’-2-etanosulfonico (HEPES) 748 Acido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-3-propanosulfonico (HEPPS) 7,96 ‘Tris(hidroximetil) aminometano (TRIS) 8,32 x 107 8,08 N-[Tris(hidroximetil) metillglicina (Tricina) 8,91 x 10° 8,05 N, N-Bis(2-hidroxietil) glicina (Bicina) 5,50 x 10° 8,26 Glicilglicina 5,50 x 10° 8,26 ‘Acido bérico 5,75 x 10° 924 NH; 5,62 x 10° 9,25 Glicina 1,66 x 10" 978 HCO; 4,68 x 10 10,33 (pK) Piperidina 7,58 x 10°? 1112 HPO} 4,17 x 10-8 12,38 (PK) Procedencia: Dawson, RM. C,, Elliott, D. C., Elliott, W. H., y Jones, K, M., Data for Biochemical Research (28 ed), pp. 481-482, (Oxford University Press (1969) y Good, N.E., Winget, G.., Winter, W., Connolly, T.N., Izawa, S., y Singh, R. M.M., Biochemistry 5, 467 (1966). en la que x representa los equivalentes de OH” aftadi- dos y V es el volumen de la disolucion. Represente- mos por ¢, los equivalentes de HA presentes al co- mienzo, fa) ="; Incorporando estas relaciones a la Ec. [2.6] se convier- teen [2.8] pH = pK + log (z ) [29] que describe con exactitud una curva de valoracién excepto en sus extremos (estas regiones precisan de tratamientos mas exactos que tengan en cuenta las ionizaciones del agua). Los tampones estabilizan el pH de una disolucion La capacidad de un tampén para resistir las varia- ciones de pH cuando se afade Acido o base es directa- mente proporcional a la concentracién del par conju- gado acido-base, [HA] + [A"]. Es maxima cuando pH = pK y decrece con rapidez al variar el pH desde dicho punto. Un buen método aproximado, que aconseja la préctica, es el considerar que un Acido débil se halla en su intervalo atil como tampén dentro de 1 unidad de pH de su pK (son las regiones sombreadas de las, Figs. 2-9 y 2-10). Por encima de este intervalo, en el que la relacion [A"]/[HA] > 10, el pH de la disolucion varia répidamente con la adicién de base fuerte. Un tampé6n se muestra impotente, de modo analogo, por adicion de un Acido fuerte cuando su pK supera al pH en més de una unidad.Punto de partida Punto medio Punto (oH = pk) final ' ' ' <— HA] > (8 | —+}+— [HA] < (8 ] —+] 14 13 12 a 10 0 01 02 03 04 08 06 07 Equvalentes de OH" 08 09 10 Figura 2-9 Curvas de valoracién acido-base de disoluciones de 1L de 4cido acético 1M, HPO; y NH; con una base fuerte. En el punto de partida de cada valoracién, la forma acida del par 4cido-base conjugado predomina abrumadoramente. En el punto medio de la valoracién, en el que pH = pK, la ‘concentracion del dcido es igual a la de su base conjugada Finalmente, en el punto final de la valoracion, en el que los equivalentes de base fuerte que se afiaden se igualan a los equivalentes de acido en el punto de partida, la base conjugada se encuentra en gran exceso. Las bandas somibreadas indican los intervalos de pH sobre los cuales la disolucién correspondiente acta efectivamente como un tampon, Los fluidos biologicos, tanto los que se encuentran intracelularmente como extracelularmente, se hallan fuertemente tamponados. Por ejemplo, el pH de la sangre en los individuos sanos se halla controlado con rigor a pH 7,4. Los iones fosfato y carbonato que son componentes de la mayor parte de los fluidos biolégicos son importantes en este aspecto. demas, muchas moléculas biolégicas, tales como proteinas, Acidos nucleicos y Iipidos, asi como numerosas molé- culas orgénicas pequerias, portan multiples grupos acido-base, que son eficaces como componentes de tampones en el intervalo de pH fisiologico. Capitulo 2. Disoluciones acuosas 39 El concepto de que las propiedades de las molécu- las biologicas varian con la acidez de la disolucion en la que se disuelven no fue apreciado plenamente antes del comienzo del siglo actual, de modo que las acideces de las preparaciones bioquimicas efectuadas con anterioridad a dicha época se controlaban rara- mente. En consecuencia, estos primeros experimentos bioquimicos dieron resultados escasamente reprodu- cibles. Mas recientemente, las preparaciones bioqui- micas se han tamponado de un modo rutinario para simular las propiedades de los fluidos biologicos que se hallan en la naturaleza. Muchos de los acidos débiles que aparecen en la Tabla 2-3 se emplean co- rrientemente como tampones en las preparaciones bioquimicas. En la practica, el Acido debil escogido y una de sus sales solubles se disuelven en la relacion molar necesaria (aproximadamente igual) para pro- porcionar el pH deseado y con ayuda de un pH- metro, se “ajusta” por valoracion con Acido 0 con base fuertes. C. Acidos poliproticos Las sustancias portadoras de mas de un grupo aci- do-base, como H;PO, 0 H;CO,, asi como.la mayor parte de las biomoléculas, se conocen como acidos poliproticos. Las curvas de valoracion de estas sus- tancias, como se muestra en la Fig.2-11 para el H,PO,, se caracterizan por varios valores de pK, uno para cada etapa de ionizacion, Los calculos exactos de las concentraciones de las diversas especies iénicas presentes a un pH determinado constituyen, clara- mente, una tarea més compleja que cuando se trata de un acido monoprético. Los valores de pK de dos grupos dcido-base relaciona- dos intimamente no son independientes. La carga ionica resultante de la disociacién de un protén inhibe elec- trostaticamente la disociacién ulterior de un proton de la misma molécula, con lo que se incrementan los valores de los pK correspondientes. Este efecto, de acuerdo con la ley de Coulomb, disminuye a medida que aumenta la distancia entre los grupos que se ionizan. Por ejemplo, los pK de los dos grupos carbo- xilo adyacentes del acido oxélico difieren en 3 unida- des de pH (Tabla 2-3), mientras que los del Acido succinico, en el que los grupos carboxilo se encuen- tran separados por dos grupos metileno, s6lo se dife- rencian en 1,4 unidades. °° 9 ° ii i H—-0—C—C—0—H — H—0—C—CH,CH,—C—o—H elo oxlico Acido suceinico De modo anélogo, las ionizaciones sucesivas desde el, mismo centro, como ocurre en HyPO, y en H,CO,, poseen valores de pK que se diferencian entre 4 a 5 unidades de pH. Si los valores de pK de las ionizacio- nes sucesivas de un acido poliprotico se diferencian en 3 unidades de pH, por lo menos, puede aceptarse, con seguridad, que a un pH determinado solamente40 Seccién 2-2. Acidos, bases y tampones 476 ok [CH,COOH) [CH,coo™ Fracciin de las especies presentes Primer Segundo Punto de punto de punto de partie equiaencia equiaiencia ub Be L segundo punto ® ‘medio b (HPO; } = [HPOF} A a |b Ae Primer punto 08 10 18 20 Equivalents de OF los miembros del par conjugado acido-base caracteri- zado por el pK mas préximo son los que se hallan presentes en concentraciones significativas. Esto sim- plifica, por supuesto, en gran manera los célculos en Ia determinacion de las diversas especies inicas pre- sentes Tercer punto Figura 2-10 Curvas de distribucién para el acido acético y el ion acetato. La fraccién de las especies presentes viene dada por la relacion de la concentracion de CH,COOH 0 de CHCOO- con la ‘concentracién total de estas dos especies. El intervalo de tamponamiento util de pk * 1, que se ‘acostumbra a aceptar, esta indicado por la regién sombreada. Teco Figura 2-14 Bee Curva do valoracon do HyPO, Los dos puntos de equivalencia intermedios aparecen en las partes mas pendientes de la curva. Observese ol aplanamiento dela curva fen las proximidades del punto de partiga'y del punto final, en Comparacion con los finales curvados de las curvas de valoracion de la Figura 2-9. Esto constituye una ingicacién de que H,PO, (DK, = 2,19) esta bordeando un acido fuerte y POS (pk = 12,38) bordea una base fuerte. 28 30 Los Acidos polipréticos con valores d espaciados poseen constantes de ionizacion moleculares Si los valores de pK de un Acido poliprotico se diferencian en ~ 2 unidades de pH, como ocurre, quiz, en la mayoria de las biomoléculas, las constan-HAH “SS Figura 2-12 lonizacién de un acido que posee dos sitios de protonacion que no sén equivalentes. os, tes de ionizacién medidas por valoracién no son las, verdaderas constantes de ionizacién del grupo, sino mas bien reflejan la ionizacién media de los grupos que intervienen. Por esta raz6n, las constantes idnicas resultantes se conocen como constantes de ioniza- ci6n moleculares. Considérese el equilibrio écido-base que se muestra en la Fig. 2-12, en el que hay dos sitios de protona- ‘ign que no son equivalentes. Aqui, las cantidades Ky, Ky, Kc y Kp, constantes de ionizacion de cada grupo, reciben alternativamente el nombre de constantes de Resumen del capitulo Capitulo 2. Disoluciones acuo ionizacin microsc6picas. La constante de ionizacion molecular para la separacion del primer proton de HAH es kK (H*\(AH7] + (HAT) [HAH] Andlogamente, la constante de ionizacién molecular K,, para la eliminacién del segundo proton es (HtTA2] a [AH™]+ [HA] (1/Ke) + (1/Ko) =KytKy [2.10] K Si Ky > Key, entonces K, © Ky; es decir, la primera constante de ionizacion molecular es igual a la cons- tante de ionizacién microscépica del grupo mas acido. Andlogamente, si Kp > Ko, entonces K; * Ke, de modo que la segunda constante de ionizacién molar es la constante microsc6pica de ionizacién del grupo menos Acido. Si las etapas de ionizacién se diferen- cian lo suficiente en sus valores de pK, las constantes moleculares de ionizacién, tal como podria esperarse, son idénticas a las constantes de ionizacién microsc6- picas. El agua es una sustancia extraordinaria, cuyas propieda- des son de gran importancia biologica. Una molécula de ‘agua puede participar en hasta cuatro enlaces de hidrogeno simultaneamente: en dos de ellos se comporta como un dador y en los otros dos como un aceptor. Estos enlaces de hidrégeno son los responsables de la estructura abierta y de la baja densidad del hielo. Gran parte de la estructura de enlaces de hidrogeno permanece en el agua en fase liguida, como ponen en evidencia el elevado punto de ebullicién del agua en comparacién con los otros liquidos, La evidencia fisica y tebrica indica que el agua liquida mantiene una estructura molecular enlazada por hidrégeno, que fluctéa répidamente y que en intervalos de distancias cortas se parece a la del hielo, Las propiedades disolventes singulares del agua derivan de su polaridad, ast como de las propiedades conferidas por los enlaces de hidrogeno. En disoluciones acuosas las sustancias iGnicas y polares se hallan rodeadas por miiltiples capas de hidratacién coneén- tricas de dipolos de agua orientados que actian atenuando las interacciones electrostaticas entre las cargas existentes en la disolucién. La desordenacién al azar de las moléculas de agua orientadas, provocada térmicamente, la evitan por sus asociaciones mediante enlaces de hidrogeno, que permi- ten, ademés, explicar la elevada constante dieléctrica del agua. Las sustancias no polares son esencialmente insolu- bles en el agua. Sin embargo, las sustancias anfipaticas se agregan en disoluciones acuosas para formar micelas y bicapas debidas a la combinacién de interacciones hidrof6- bicas entre las porciones no polares de estas moléculas y las interacciones hidrofilicas de sus grupos polares con el disol- vente acuoso, Los iones H,0° y OH” poseen movilidades ignicas anormalmente elevadas en disoluciones acuosas de- ido a que la emigracién de estos iones en el seno de la disolucién se produce, en gran parte, mediante el salto del proton de una molécula de agua a otra Un acido de Bronsted es una sustancia que puede ceder protones. Al perder un proton, un acido de Bronsted se transforma en su base conjugada. En una reaccién Acido- base, un acido cede su proton a una base. El agua puede reaccionar como un acido y forma ion hidréxido OH, 0 como una base para originar el ion hidronio, H,O°. La fuerza de un Acido est indicada por la magnitud de su constante de disociacién, K. Los acidos débiles, que poseen tuna constante de disociacion inferior a la de H,O" se hallan disociados solo parcialmente en disolucién acuosa. La cons- tante de disociacién del agua es 10°“M a 25 °C. Una canti- dad prictica para expresar la acidez de una disolucion es el pH = log [H*]. La relacién entre pH, pK y las concentracio- nes de los miembros de su par écido-base conjugados est expresada por la ecuacién de Henderson-Hasselbalch. Un tampén dcido-base es una mezcla de un acido débil con su base conjugada en una disolucién cuyo pH es préximo al valor de pK del acido. La relacién [A”]/[HA] en un tampén no es muy sensible a la adicién de acidos o de bases fuertes de modo que el pH de un tampén no resulta afectado ‘mucho por estas sustancias. Los tampones s6lo son eficaces, desde el punto de vista operativo, en el intervalo de pH de pK + 1, Fuera de este intervalo, el pH de la disolucion cambia rapidamente al aftadir acido 0 base fuertes. La capa- cidad de tamponamiento depende también de la concentra- cién total del par conjugado acido-base. Los fluidos biol6; cos estan tamponados en general, prOximos a la neutraln. 2. 1B siguientes composiciones formales: (a) Acido acético 0,01M; (b) cloruro de amonio 0,25M; (c) Acido acéti- co 0,05M + acetato de sodio 0,10M y (d) acido borico [B(OH),] 0.20M + borato de sodio [NaB(OH),] 0,05M. Los indicadores Acido-base son acidos débiles que ‘cambian de color al cambiar los estados de ionizacion. Cuando se afiade una pequetia cantidad de un indica- dor apropiado a una disolucién de un Acido o de una base fuerte que se esté valorando, el cambio de color “indica” el punto final de la valoracién. La fenolfta- Ieina es un indicador acido-base empleado corriente- ‘mente que, en disolucién acuosa, cambia desde incolo- 10 a rojo violaceo en el intervalo de pH entre 8,2 y 10,0. Tomando como referencia las Figs. 2-9 y 2-1i, indicar la eficacia de la fenolftaleina para determinar con exactitud el punto final de una valoracién con una base fuerte de: (a) écido acetico, (b) NH,CI y () HjPO, (en cada uno de sus tres puntos de equivalencia) La composicion formal de una disolucién acuosa es K,HPO, 0,12M + KH;PO, 0,08M, Empleando los datos de la Tabla 2-3 calcular las concentraciones de todas las especies ionicas y moleculares presentes en la diso- lucion y el pH de la misma. El agua destilada en equilibrio con el aire contiene disuelto didxido de carbono cuya concentracion es de 1,0 x 10°M, Empleando el dato de la Tabla 2-3 calcu- lar el pH de dicha disolucion. Capitulo 2. Disoluciones acuosas 43 14, Calcular las concentraciones formales de acido acético y de acetato de sodio que son necesarias para preparar luna disolucién tampon de pH 5 que es 0,20M en acetato total. El pK del acido acético se halla en la Ta- bla 23. 15. Una reaccién enzimética transcurre en 10 mL de una disolucién cuya concentracién total de citrato es de 120 mM y su pH inicial es de 7,00. Durante la reaccion se producen 0,2 miliequivalentes de un acido. Em- pleando los datos de la Tabla 2-3, calcular el pH final de la disolucion. {Cual seria el pH final de la disolu- ion en ausencia del tampén de citrato, suponiendo que los demés componentes de la disolucion no po- seen capacidad de tamponamiento significativa y que Ia disolucién se halla al comienzo a pH 7? "16. La capacidad de tamponamiento B, de una disolu- cion, se define como la relacion de la cantidad de incremento de base afadida, expresada en equivalen- tes, y el cambio de pH correspondiente. Es el reciproco de ia pendiente de la curva de valoracion, Ec. (2.9} Deducir la ecuacion para B y demostrar que su valor es maximo a pH = pK 17, Empleando los datos de la Tabla 2-3, calcular las cons- tantes de ionizacion microscOpicas para el Acido oxali- co y el acido succinico, {Como se comparan estos valores con sus constantes de ionizacién moleculares corespondientes?