cavtruco & Enzimas: cinética e inhibicién Los enzimas son proteinas especializadas en la catalisis de las reacciones bioldgicas. Se encuentran entre las mas notables de las biomoléculas conocidas debido a su extraordinaria es- pecificidad y a su poder catalitico, que es mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre. Gran parte de Ja historia de la bioquimica es la historia de la investigacién de los enzimas. El nombre enzima («en la levadura») no se empleé hasta 1877, pero mucho antes ya se sospechaba que ciertos catalizadores biolégicos intervenian en la fermentaci6n del aziicar para formar alcohol (de aqui el nombre inicial de «fermentos»). La primera teoria general sobre la catalisis quimica, publicada por J. J. Berzelius en 1835, incluia un ejemplo de lo que ahora se conoce como enzima, Ja diastasa de la malta, y sefialaba que la hidrélisis del almi- dén se cataliza por la diastasa con mas eficacia que por el cido sulfirico. Aunque Luis Pasteur reconocié que la fermentacién es ca- talizada por enzimas, postulé en 1860 que éstos se hallaban ee ligados de modo inextricable con la estructura y Ia vida de las Cristales de quimotripsina bovina células de la levadura. Constituy6, por ello, un logro impor- tante en la historia de la investigacién enzimatica que, en 1897, E. Biichner consiguiera extraer los enzimas que catalizan la fermentacién alcohdlica de las células de levadura. Este hecho demostraba claramente que estos importantes enzimas, que catalizan una ruta metabélica principial productora de energia, pueden actuar independientemente de la estructura celular. Hasta muchos afios después, sin embargo, no fue ais- lado por vez primera un enzima en forma cristalina; ello lo consiguié J. B. Sumner, en 1926, con la ureasa, aislada de extractos de la alubia Cannavalia enzyformis. Sumner demostr6 que los cristales se hallaban constituidos por proteina y Ileg6 a la conclusi6n, contraria a la opinién que prevalecia por aquel entonces, de que los enzimas son proteinas. Sus puntos de vista no fueron aceptados inmediatamente, sin embargo, y hasta el petiodo comprendido entre 1930 y 1936, durante el cual Northrop aislé la pepsina cristalizada, la tripsina y la quimotripsina (fig. 8-1), no quedé bien establecida la natu- raleza proteica de los enzimas.-En la actualidad se han identi- ficado cerca de 2000 enzimas diferentes. Muchos de ellos se han aislado en forma pura y homogénea, y alrededor de unos M. Kunite 189PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS 200 se han podido cristalizar. Aunque se han identificadd la mayor parte de los enzimas relacionados con el metabolismo basico corriente de la célula quedan por resolver muchos pro- blemas importantes, entre ellos el control genético de la sin- tesis enzimatica, los mecanismos moleculares mediante los que se regula la actividad enzimatica y el papel de las formas miltiples de algunos enzimas en el desarrollo y en la diferen- ciacién, Pero sobre todo, todavia no se conoce en términos moleculares, cémo catalizan los enzimas Jas reacciones qui- micas con tal eficacia, precisién y especificidad. En este capitulo y el siguiente no se hard ningtin intento para catalogar y describir el gran néimero de enzimas dife- rentes conocidos hasta la fecha; se examinaran mas bien las propiedades y caracteristicas comunes a la mayor parte de los enzimas. Los enzimas especificos que participan en diversos ciclos metabélicos se estudiaran, mas detalladamente en capi- tulos sucesivos. Nomenclatura y clasificacién de los enzimas Muchos enzimas han sido designados afiadiendo el sufijo -asa al nombre del sustrato, es decir, de la molécula sobre la cual el enzima ejerce su accién catalitica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrélisis de la urea con produccién de amoniaco y CO, la arginasa cataliza la hidrélisis de la arginina a ornitina y urea, y la fosfatasa cataliza la hidrélisis de los ésteres fos- foricos, Esta nomenclatura, sin embargo, no siempre ha resul- tado practica, lo cual ha ocasionado que muchos enzimas hayan recibido nombres que quimicamente son poco informa- tivos; por ejemplo, la pepsina, Ia tripsina, y la catalasa, Por dicha razén, y porque el niimero de enzimas que se descubren esté aumentando rapidamente, se ha adoptado una clasifica~ cién sistematica de los enzimas segan recomendacién de una comisién internacional de enzimas. E] nuevo sistema divide a los enzimas en seis clases principales, cada una de las cuales se divide a su vez en subclases, de acuerdo con el tipo de reac- cién catalizada (tabla 8-1). Cada enzima es designado por un nombre recomendado, generalmente corto y apropiado para st uso habitual; por un nombre sistemético, que identifica la raccién que cataliza, y por un numero de clasificacién, que se emplea cuando se precisa la identificacién inequivoca del enzima, tal como ocurre en las revistas internacionales de in- vestigacién, en los restimenes y en los indices. Se da como ejemplo, el enzima que cataliza la reaccién ATP + creatina = ADP + fosfocreatina El nombre recomendado de este enzima, el que se emplea normalmente, es creatin-quinasa y el nombre sistematico, que se basa en la reacci6n catalizada, es ATP: creatin-fosfotrans- ferasa. Su niimero de clasificaci6n es EC 2.7.3.2, en donde EC significa, abreviadamente, Comisi6n de Enzimas; la pri- mera cifra (2) representa el nombre de la clase (transferasas), la segunda cifra (7) representa a la subclase (fosfotransfera- sas), la tercera cifra (3) la sub-subclase (fosfotransferasas con un grupo nitrégeno como aceptor) y la cuarta cifra (2) designa a la creatin-quinasa (véase tabla 8-1). En este libro utilizare- mos los nombres recomendados de los enzimas, tal como se 190 ‘Trbta 8-1. Clasificacién internacio- nal de los enzimas (denominaciones de las clases, mimeros de cédigo y tipos de reacciones catalizadas) 1. Oxido-reductasas (Reacciones de 6xido-reduccién) 1 Actdan sobre YoH—OH \ 1.2 Actéan sobre & =O \ 1.3 Actéan sobre c=CH— A 1 Actian sobre oH —NH, 15 Actéan sobre YoH—NH— 1.6 Acttan sobre NADH; NADPH 2. Transferasas (Transferencia de grupos funcio- nales) 2.1 Grupos de un atomo de carbono 2.2. Grupos aldehidicos 0 ceténicos 23 Grupos acilos 24 Grupos glucosilo 2.7 Grupos fosfato 2.8 Grupos que contienen azufre 3, Hidrolasas Reacciones de hidrélisis) 3.1 Bsteres 32 Enlaces glucosidicos 34 Enlaces peptidicos 35 Otros enlaces C_N 3.6 Anhidridos de acido 4. Liasas : (Adicién a Jos dobles enlaces) Vee” 41 Yomcl 42 Sc A cas 5. Isomerasas (Reacciones de isomerizacién) 5.1 Racemasas 6. Ligasas (Formacién de enlaces con escisién del ATP) 61.C-O 62 C-S 63 C-N 64 C-CTapia 8-2. Algunos de los enzimas que contienen iones metélicos 0 los necesitan como cofactores. Za Alcobol-deshidrogenasa Anhidrasa-carbénica Carboxipeptidasa Mg* Fosfohidrolasas Fosfotransferasas Mn* Arginasa Fosfotransferasas Fe o Fe Citocromos Peroxidasa Catalasa Ferredoxina Cu (Cu) ‘Tirosinasa Citocromo-oxidasa Ke Piruvato-quinasa (también necesita Mg") ‘Nav ATPasa de la membrana plas- matica (necesita también K* y Mg”) Capitulo 8 Enzimas: cinética ¢ inhibicion hallan catalogados en la edicién de Enzyme Nomenclature, 1973 (véase Bibliografia), salvo unas pocas excepciones. Cofactores enzimaticos La actividad de algunos enzimas depende solamente de su estructura como proteinas, mientras que otros necesitan, ade- mas uno o mas componentes no proteicos, llamados cofac- tores. El cofactor puede ser un ion metalico, o bien una mo- Iécula organica llamada coenzima; algunos enzimas necesitan de ambos. Los cofactores son generalmente estables frente al calor, mientras que muchas proteinas enzimaticas pierden la actividad por calefaccién. El complejo enzima-cofactor cata- liticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteina restante, que por si misma es inactiva cataliticamente, se designa con el nombre de apoenzima, Ta tabla 8-2 retine algunos enzimas que precisan de iones metélicos como cofactores. En tales enzimas el ion metélico puede actuar como: 1) centro catalitico primario; 2) como grupo-puente para reunir el sustrato y el enzima, formando un complejo de coordinacién; 0 3) como agente estabilizante de la conformacién de la proteina enzimatica en su forma cataliticamente activa. Los enzimas que precisan de iones me- talicos se Ilaman a veces metaloenzimas; en algunos de ellos, el componente metélico, por si solo, ya posee una actividad catalitica primaria, muy incrementada a su vez por la proteina enzimatica; por ejemplo, la catalasa, es un enzima ferro- porfirinico que cataliza la descomposicién muy rapida del peréxido de hidrégeno, en agua y oxigeno; las simples sales de hierro también catalizan esta reaccién, pero a velocidad mucho menor. La’ tabla 8-3 redne los principales coenzimas conocidos y losAipos de reacciones enzimaticas en las que participan. Cada ye de los coenzimas catalogados contiene, como parte de su structura, una molécula de alguna de las vitaminas; éstas son sustancias organicas que, en cantidades minimas (trazas), son vitales para la funcién de todas las células, y deben figu- rar en la dieta de algunas especies. Las vitaminas y sus formas coenzimaticas seran objeto de estudio en el capitulo 13 (pa- gina 341), Los coenzimas actiian, por lo general, como trans- ‘Tapa 8-3, Coenzimas de reacciones de transferencia de grupos. Coenzima Entidad teansferida Nicotinamida-adenina-dinuclestido Fosfato de nicotinamida-adenina-dinu- clestido Atomos de hidrégeno (electrones) Flavin-mononuclestido Atomos de hidrégeno (electrones) Flavin-adenina-dinuclestido Atomos de hidrégeno (electrones) Atomos de hidrégeno (electrones) Coenzima Q. Atomos de hidrégeno (electrones) Pirofosfato de tiamina Aldehidos Coenzima A Grupos acilo Lipoamida Grupos acilo Coenzimas cobamidicos Grupos alquilo Biocitina Didxido de carbono Fosfato de piridoxal Coenzimas tetrahidrofélicos Grupos amino Grupos metilo, metileno, formilo 0 formimino 191PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS portadores intermediarios de grupos funcionales, de atomos especificos o de electrones, los cuales son transferidos en la reaccién enzimatica global. Cuando el coenzima se halla unido intimamente a la molécula del enzima recibe, normalmente, el nombre de grupo prostético; por ejemplo, el grupo biocitina de la acetil-CoA-carboxilasa, que se halla incorporado cova- Ientemente en la cadena polipeptidica (pag. 351). Sin embargo, en algunos casos el coenzima esta unido débilmente y actia, esencialmente, como uno de los sustratos especificos de aquel enzima, Cinética quimica Antes de proceder a examinar la catélisis enzimatica de las reacciones, deben esbozarse algunas relaciones y términos em- pleados para la medicién y expresién de las velocidades de las teacciones quimicas, Las reacciones quimicas pueden clasifi- carse basandose en el niimero de moléculas que en total deben reaccionar pata formar los productos de la reaccién. Asi ten- dremos reacciones monomoleculares, bimoleculares y trimo- leculares, en las que reaccionan una, dos o tres moléculas, respectivamente, Las reacciones quimicas pueden clasificarse también sobre Ficura 8-2 una base cinética, por el orden de reaccién. Tendremos, de _—_Representacién gréfica del curso de una este modo, reacciones de orden cero, de primer orden, de se- _reaceién de primer orden. El tiempo medio gundo orden y de tercer orden, segtin como resulte influida _{(74).e+ ¢/ necesario para que se consuma la velocidad de reaccién por la concentracién de los reaccio- _reaccionante nantes bajo un conjunto de condiciones determinado. Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad exactamente proporcional a la concentra- cién de un reaccionante (fig. 8-2). El ejemplo mas sencillo es cuando la velocidad de la reaccién Pendiente de la tangente —aAL dt A—>P es exactamente proporcional a la concentracién de A. En este caso la velocidad de reaccién en cualquier tiempo ¢ viene dada por la ecuacién de primer orden ty —a[A] wat 7 MAT en la que [A] es la concentracién molar de A y —d[A]/dt es la velocidad a que disminuye la concentracién de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad 0 velocidad de reaccién especifica. Las constan- tes de velocidad de primer orden poseen las dimensiones del reciproco del tiempo habitualmente s-, La forma integrada de esta ecuacién, que es mas util para Ja realizacién de cAlculos cinéticos, es tog [A] —_#t [A] en la que [As] es la concentracién de A al tiempo cero, y [A] es la concentracién al tiempo t. En las reacciones de primer orden, el tiempo mitad (2) de la reaccién viene dado por 0,693 ha =e 192Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion relacién que se deduce facilmente. Obsérvese que en las reac ciones de primer orden, el tiempo mitad es independiente de la concentracién inicial del sustrato. Reacciones de segundo orden son aquéllas cuya velocidad es proporcional al producto de la concentracién de dos reac- cionantes o a la segunda potencia de uno de los reaccionantes. El ejemplo mas sencillo es la reaccién A+B—>P La velocidad de esta reaccién que puede ser designada como —(d[A]/dt), —(4[B]/dt) 0 +(d[P]/dt), es proporcional al producto de las concentraciones de A y de B, y viene dada por la ecuacién de velocidad de segundo orden HAL = aca) en la que k es la constante de velocidad de segundo orden. Si la ‘reaccién tiene la forma 2A—>P y su velocidad es proporcional al producto de la concentracién de las dos moléculas reaccionantes, la ecuacién de velocidad de segundo ‘orden es aa] = K{AJIA) = Kia? Las constantes de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen las dimensiones 1/[concentraci6n x tiempo], 0 M+ s+, La forma integrada de la expresién de segundo orden es 2,303 log IBoLAL *~ifAel = TBD 18 TAB] en donde [Aq] y [By] son las concentraciones iniciales y [A] y [B] las concentraciones en el tiempo t. En las reacciones de segundo orden, cuyas concentraciones de los reaccionantes son iguales, el tiempo mitad es igual a 1/Cok, en donde Cy es la concentracién inicial de los reaccio- nantes y k la constante de velocidad de segundo orden. Es importante observar que una reaccién de segundo orden, tal como A+B—>P puede parecer, en ciertas condiciones, una reaccién de primer orden. Por ejemplo, si la concentracién de B es muy elevada, y la de A muy baja, esta reaccién podria parecer como, de primer orden, ya que su velocidad seria casi proporcional a la concentracién de uno sélo de los reactivos; reacciones de seudoprimer orden © de primer orden aparente. Las reacciones de tercer orden, que son relativamente esca- sas, son aquéllas cuya velocidad es proporcional al producto de tres términos de concentracién. Algunas reacciones qui- micas son independientes de la concentracién de cualquier reactivo; son las llamadas reacciones de orden cero. Muchas 193PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CHLULAS reacciones catalizadas son de orden cero con respecto a los reactantes. Cuando es éste el caso, la velocidad de reaccién depende de la concentracién del catalizador o de algin otro factor distinto a la concentracién de las especies moleculares que experimentan la reaccién. Las velocidades de reaccién no es preciso que sean necesariamente de primer orden puro o de segundo orden puro; en ciertas condiciones se observan con frecuencia ordenes de reaccién mixtos. Energia libre de activacién y efectos de los catalizadores Una reaccién quimica, tal como A —> P, tiene lugar porque cierta fraccién de la poblacién de moléculas A, en cualquier instante dado, posee la suficiente energia como para alcanzar un estado activado, llamado estado de transicién, en el que es muy elevada la probabilidad de que se establezca 0 se rom- pa un enlace. quimico para formar el producto P. Este estado de transicién reside en la cima de la barrera de energia que separa a los reaccionantes y a los productos (fig. 8-3). La velocidad de una reaccién quimica dada es proporcional a la concentracién de estas especies caracteristicas del estado de transicion. La energia libre de activacién AG? (el simbolo + se emplea para representar el proceso de activacién) es la cantidad de energia necesaria para llevar todas las moléculas de 1 mol de sustancia a una temperatura determinada, al estado de transici6n, en la cima de la barrera de activacién. Hay dos métodos generales, mediante los cuales, puede acelerarse la velocidad de una reaccién quimica. Uno de ellos es la elevacién de la temperatura, ya que provoca un incre- Ficura 83 rama de energia para una reaccién quimica, no catalizada y catalizada. Estado de transicion Bergin libre de activacién de la reaccién inversa (a0 catalizada) Energia libre de activacion de la reaccién inversa (catalizada) Energia libre de activacién de Ta reaccion directa: (no catalizada) Energia libre ——> Estado inicial Cambio! lobal de Energia libre al ike i de activacién : dela reaccién catalizada Estado final Curso de la reaccién ——> 194‘Tata 8-4. Energia libre de activacién AG* calculada para Ja descomposicién del peréxido de hidrégeno a 20°C. La catalasa acelera la velocidad de Ja reaccion mas de 10° veces. aG* Condiciones keal mo! Sin catalizar 18 Catalizada con platino coloidal 13 Catalizada por catalasa 7 Figura 8-4 Efecto de la concentracién de! susteato sobre la velocidad de una reaccién catalizada enziméticamente. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion mento del movimiento térmico y de la energia, aumenta el niimero de moléculas capaces de alcanzar el estado de tran- sicién, y acelera, de este modo, la velocidad de las reacciones quimicas. En muchas reacciones la velocidad de reaccién se duplica, aproximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura. La velocidad de una reaccién qui- mica puede verse incrementada también por la adicién de un catalizador; éste se combina con los reaccionan- tes de modo transitorio y se produce un estado de transicién de menor energia de activacién que el correspondiente a la reaccién no catalizada. Asi los catalizadores aceleran las reac- ciones quimicas porque disminuyen la energia de activacién (fig. 8-3). Cuando se forman los productos de la reaccién se regenera el catalizador libre. La tabla 8-4 muestra la energia de activacién para la descomposicién del peréxido de hidré- geno, en ausencia o en presencia de un catalizador. Cinética de las reacciones catalizadas por los enzimas. Ecuacién de Michaelis-Menten Los principios generales de la cinética de las reacciones qui- micas son aplicables a las reacciones catalizadas por los en- zimas, pero éstas muestran también un rasgo caracteristico, que no se observa en las reacciones no enzimaticas: la satu- racién con el sustrato. En la figura 8-4 vemos el efecto de la concentracién del sustrato sobre la velocidad de la reacci6n catalizada por un enzima A —+» P. A una concentracién de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccién vp es casi proporcional a la concentracién del sustrato y la reaccién, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentracién de sus- trato aumenta, Ja velocidad inicial de la reaccién disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentra- cién de sustrato; en esta zona el orden de reaccién es mixto. Con un aumento posterior de la concentracién del sustrato, la velocidad de la reaccién Ilega a ser esencialmente indepen- diente de la concentracién de sustrato y se aproxima asinté- ticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reaccién es esencialmente de or- den cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que el enzima se halla saturado con su sustrato. Todos los enzimas muestran el efecto de saturacién, pero varian ampliamente con respecto a la concentracién de sustrato que se necesita para que se manifieste. El efecto de saturacién condujo a algunos Ku [Sustrato] 195,PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS de los primeros investigadores, en particular a J. Brown y también a V. Henry, a formular la hipétesis de que el enzima y el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un com- plejo, como etapa esencial en la reaccién catalizada. L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron en 1913 una teoria general acerca de la accién y cinética de los enzimas, la cual, fue ampliada posteriormente por G. E. Briggs y J. B. S, Haldane, Esta teoria, que es fundamental para el anali- sis cuantitativo de todos los aspectos de la cinética de los en- zimas y de la inhibicién, se ha desarrollado plenamente para el caso sencillo de una reaccién en la que sélo hay un sustrato. La teoria de Michaelis-Menten supone que el enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuacién este ultimo se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P: be E+S—=Es @ ES E+P @) Se supone que estas reacciones son reversibles; Jas constantes de velocidad para las reacciones directa e inversa poseen un: subindice positivo y otro negativo, respectivamente. Deduciremos a continuacién la ecuacién de Michaelis-Men- ten, que expresa la relacién matematica entre la velocidad inicial de una reaccién catalizada por un enzima, la concen- tracién del sustrato y ciertas caracteristicas del enzima. La ecuacién de Michaelis-Menten es la ecuacién de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que sélo actéan sobre un sustrato. En la deduccién, debida a Briggs y Hal- dane, [E] representa la concentracién del enzima libre 0 no combinado, [ES] la concentracién del complejo enzima-sus- trato, y [Ey] la concentracién total del enzima (suma de las formas libre y combinada). La concentracién del sustrato se representa por [S], la cual se supone que es mucho mayor que [E], de modo que la cantidad de S unida a E en cualquier instante, es despreciable si se compara con la concentraci6n total de S. El objeto de esta deduccién es definir una expresién gene- ral para vp, que es la velocidad inicial de una reacci6n catali> zada enziméticamente, suponiendo que las reacciones de esta clase transcurren en dos etapas, tal como muestran las reac- ciones (1) y (2). La velocidad inicial es, por supuesto, igual a la velocidad de ruptura del complejo enzima-sustrato, ES, de acuerdo con la ecuacién (2); podemos escribir para ella la ecuacién de velocidad de primer orden, Vo = kya[ES] (3) Sin embargo, ya que ni k., ni [ES]. pueden determinarse directamente, debemos encontrar otra expresién para vp en funcién de otras variables que puedan medirse con mas faci- lidad. Para ello escribiremos en primer lugar la ecuacién de velocidad de segundo orden para la formacién de ES a partir de E y de S [véase la reaccién (1)]: ESI. = &, (8x) — (ES) [5] (a) 196Figura 8-5 Transcurso de la formacién de un complejo ‘enzima-sustrato en funcién del tiempo e iniciacién del estado estacionario, tal como se deduce de la resolucién por computador de los datos obfenidos en un experiment real con un enzima tipico. La porcién sombreada del grafico superior es la que aparece ampliada en la grafica inferior. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion en la que k,: es la constante de velocidad de segundo orden. Aunque ES puede formarse también a partir de E y de P por inversion de la reaccién (2), la velocidad de la reaccién inversa puede despreciarse, ya que estamos considerando que 4a reaccién se inicia en el sentido directo, cuando [S] es muy elevado y [P] es cero, o proximo a este valor. A continuacién escribiremos la ecuacién de velocidad para la descomposicién de ES por suma de dos reacciones; en pri- mer lugar, la reaccién que rinde el producto (reaccién directa) y después la reaccién que produce E + S$ [la inversa de la ecuacién (1)]. Tendremos entonces: TAPS — 18 +, .LES] 6 Cuando la velocidad de formacién de ES es igual a su velo- cidad de desaparicion, es decir, cuando el sistema ha alcan- zado el estado estacionario, que se define como aquél en que la concentracién de ES permanece constante, entonces k,.((Er] — [ES)}[S] = k,[ES] + k,2[ES] © Concentracién Concentracién ‘Tiempo 197PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS La figura 8-5 muestra la variacién a lo largo del tiempo de los diversos participantes. Reordenando la ecuacion (6), obtenemos {S}((Er] = (ES}) _ ky + kie [ES] Ku 7) La constante global Ky, que sustituye al término (k-1 + ky) /kuy se llama constante de Michaelis-Menten. A partir de esta ecuacién puede obtenerse la concentraci6n del complejo ES en el estado estacionario, despejando dicho término: —lE/ISI [ES] Ku + [5] (8) Ya hemos visto (anteriormente) que la velocidad inicial de reaccién, vo, de una reaccién enzimatica es Vo = kyo [ES] (3) Podemos sustituir, ahora, el término [ES], que figura en la ecuacién (3), por su valor en la ecuacién (8): kj, als) K+ [6] (9) Cuando la concentracién del sustrato es tan elevada que practicamente todo el enzima del sistema esta presente en forma de complejo ES, es decir, cuando el enzima se halla saturado, se alcanzara la velocidad inicial maxima, Vina, dada por Vinix = keo{Ex] (10) en la que [Ey] es la concentracién total del enzima. Susti- tuyendo ky [Er] por su valor deducido de la ecuacién (10), se obtiene ; — Vis [SI] Ku + [S] 0 (a1) Esta es la ecuacién de Michaelis-Menten; es la ecuacién de Ia velocidad para una reaccién de un solo sustrato, catalizada enzimaticamente. Relaciona la velocidad inicial, la velocidad maxima y la concentracién inicial del sustrato a través de la constante de Michaelis-Menten. Es importante observar que aunque la ecuacién de Michaelis-Menten parece no contener ningiin término para la concentracién del enzima, en realidad ésta se halla contenida en el término Ving, que hemos visto gue es igual a k. [Er]. Dea-eeuacién de Michaelis-Menten se deriva una relacién numérica importante en el caso especial en que la velocidad inicial de la reaccién sea exactamente la mitad de la velocidad maxima; es decir, cuando vp = Y% Vinx (fig. 8-4). Vis _ Vass (S] 2 Ku + (S} Al dividir por Vuux, se obtiene [Ss] Ku + [8] 198Tasta 8-5. Ky de algunos enzimas. Enzima y sustrato Ku (mM) Catalasa HO; 5 Hexoguinasa Glucosa 05 Fructosa 15 Quimotripsina N-Benzoiltirosinamida 25 N-Formiltisosinamida 120 N-Acetiltirosinamida 2 Gliciltirosinamida 122 Anhidrasa carbénica HCO; 9.0 Glutamato-deshidrogenasa Glutamato 0412 aCetoglutarato 20 NH? 7 NAD» 0,025 NADoa 0,018 Aspartato a-amino transferasa Aspartato| 09 ‘e-Oxoglutarato Ot Oxalacetato 0.04 Glutamato 40 Trsta 8.6. Efecto de la estructura del sustrato sobre la Vnu para la D-amino&cido- onidasa (los datos se refieren a la pealanina = 100). Sustrato Ven: relativa p-Tirosina 297 p-Prolina 231 p-Metionina 125, b-Alanina 100 p-Valina 55 p-Histidina 97 Glicocola 0.0 Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion Reordenando, se transforma en Ku + (S] = 2[S] Ku=(S] ‘Vemos asi que la constante de Michaelis-Menten Ky es igual a la concentracién de sustrato en la que la velocidad inicial de la reaccion es la mitad de la velocidad maxima. Las dimensio- nes de Ky para una reaccién de un solo sustrato son moles por litro, y la constante es independiente de la concentracién del enzima. Puede obtenerse con facilidad, una aproximacién al valor de Ky a partir de una serie de experimentos sencillos en los que la velocidad inicial de la reaccién se mide a diferentes concentraciones iniciales de sustrato con una concentracién de enzima constante. El valor aproximado de Ky se obtiene gra- ficamente al representar la velocidad inicial frente a la concen- tracién inicial del sustrato (fig. 8-4); se obtiene una hipérbole rectangular. A concentraciones de sustrato muy bajas, la ve- locidad inicial, vo, es casi proporcional la [S]; es decir, la reaccién muestra esencialmente un comportamiento de primer orden. A concentraciones de sustrato muy elevadas la veloci- dad de la reaccién se aproxima asintéticamente a la Vinx y es esencialmente de orden cero; 0 sea, casi independiente de la concentracién del sustrato, Unos cuantos enzimas, como la catalasa, parecen no mostrar saturacién por el sustrato; ello es debido a que la velocidad de descomposicién del complejo ES para formar productos es tan raépida que no puede con- vertirse facilmente en limitante del proceso. La tabla 8-5 retine los valores de Ky para varios enzimas. Obsérvese que Ky no es un valor fijo, sino que puede variar con la estructura del sustrato, con el pH y con la temperatura. Para los enzimas que poseen més de un sustrato, cada uno de ellos exhibe una Ky caracteristica. En condiciones intracelu- lares, Iés enzimas no se hallan necesariamente saturados por sus sustratos. Recordemos que la velocidad maxima, Vinax que es igual a ke [Er], varia ampliamente de un enzima a otro para una concentracién de enzima determinada. La Vinx varia también con la estructura del sustrato (tabla 8-6), con el pH y con la temperatura. La constante de Michaelis de un enzima constituye una ca- racteristica util e importante, que es fundamental no sélo para la descripcién matematica de la cinética enzimatica, sino también para la determinacién cuantitativa de la actividad en- zimatica en los tejidos y la purificacién del enzima. Ademas, Ja concentracién de sustrato que proporciona la mitad de la velocidad maxima, facilita una indicacién util para el andlisis de algunos mecanismos de regulacién enzimatica (pag. 242). Un notable ejemplo de investigacién médica reciente pone de manifiesto la utilidad de Ky en un nuevo aspecto. Algunos tipos de leucemia humana y animal (forma de cancer en la que los glébulos blancos sanguineos proliferan anormalmente) pueden suprimirse por administracién intravenosa del enzima asparaginasa, que cataliza la reaccién Asparagina + Hj,O = aspartato + NHi¢ Este descubrimiento condujo a la conclusién de que la aspa- ragina presente en la sangre es un principio nutritivo esencial 199PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS para el crecimiento de los leucocitos malignos; la asparaginasa intravenosa produce Ja hidrélisis de la asparagina en aspar- tato, el cual, no satisface las necesidades de aquéllas. Durante la basqueda de fuentes de asparaginasa adecuadas para el tratamiento de la leucemia se hizo el desconcertante descubri- miento de que no todas las asparaginasas son eficaces en la supresi6n de la leucemia experimental. Al final se encontré la raz6n: las asparaginasas de diferentes fuentes, animales, vege- tales o bacterianas, difieren en gran medida en el valor de Ky respecto a la asparagina, Como la concentracién de aspara- gina en la sangre es muy baja, la administracién de una as- paraginasa de otra especie sdlo sera terapéuticamente efectiva si su valor de Ky es lo suficientemente bajo como para hidro- lizar la asparagina rapidamente, dada la pequefia concentra- cién con que esta presente en Ja sangre. El comportamiento cinético de la mayor parte de los enzi- mas es mas complejo que el sencillo e idealizado de la reaccién de un solo sustrato que acabamos de estudiar. En primer lugar, nuestra formulacién ha supuesto que en la reaccién con un solo sustrato, se forma tinicamente un solo complejo enzima- sustrato , pero ahora parece probable que en muchas de las Teacciones con un sustrato puedan intervenir dos 0 tres com- plejos intermedios, tal como indica la secuencia E+S == ES == EZ == EP == E+P en la que EZ es el complejo del estado de transicién, y EP un complejo enzima-producto. Ademas, solamente una mino- ria de las reacciones enzimaticas son de un solo sustrato; en la mayor parte de ellas intervienen dos o mas sustratos, y pueden haber dos o mas productos. E] anilisis cinético de las reacciones enzimaticas en las que intervienen varios reaccio- nantes y productos es complejo; no obstante, la relacién de Michaelis-Menten contintia siendo el punto de partida para el analisis de la cinética de todas las reacciones enzimaticas. Constante de Michaelis, Ky, y constante del sustrato, Ks Tal como hemos sefialado anteriormente, la constante de Mi- chaelis es una magnitud determinada experimentalmente y definida operativamente: es la concentracién del sustrato a la cual la velocidad de la reacci6n es la mitad de la velocidad maxima. En el caso ideal utilizado en la deduccién anterior, equivale a kite Ky (7) pero en algunas reacciones enzimaticas k.; es muy grande en comparacién con k,2, en cuyo caso esta iiltima puede pasar a ser despreciable, y la ecuacién (7) se simplifica a ka Ku en que Ky es aproximadamente igual a la constante de diso- ciacién del complejo enzima-sustrato Ks, que también se de- signa como constante del sustrato: — (EIS) tS} 200Figura 8-6 Representacion (Lineweaver-Burk), doble reciproca, Ky Pendiente = max Ficura 8-7 Representacién de Eadie-Hofstee. Vo Pendiente = —Kx Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Desgraciadamente, Ky y Ks son considerados con frecuen- cia y equivocadamente, como sindénimos, No deberia conside- rarse a Ky como constante de disociacién del complejo ES, a menos que se disponga de informacién especifica que con- firme que el valor de k.2 es muy pequefio comparado con el de ke. Transformaciones de la ecuacién de Michaelis-Menten La ecuacién de Michaelis-Menten [ecuacién (11) ] puede trans- formarse algebraicamente en otras formas que son mas utiles para la expresién de los datos experimentales. Una de las transformaciones mAs corrientes se obtiene, sencillamente, to- mando los reciprocos de ambos miembros de la ecuacién de Michaelis-Menten (11): 1 _ Kw + [8] Vo Vinx [S] Reordenando, tendremos 1__Kky 1S) Vo Vinaxl 5] Vinax[ 5] que se reduce a 1 Ky 1 1 (12) Vo Vinax {s] + Vinax La ecuacién (12) es la ecuacién de Lineweaver-Burk, Cuando 1/vy se representa frente a 1/[S], se obtiene una linea recta. La pendiente de la recta es Ky/Vmix, y la interseccién sobre el eje 1/v% es 1/Vméx: la interseccién sobre el eje 1/[5] es — 1/Ky (fig. 8-6). Tal representacién doble-reciproca tiene la ventaja de que permite una determinaci6n mucho mas exacta del valor de Vinx» ya que en la representacién sencilla de v frente a [S] sélo se obtiene su valor aproximado (obsérvese la figura 8-4), puesto que es un valor limite a una concentracién del sustrato infinita. La representacién doble reciproca puede pro- porcionar también informaci6n valiosa acerca de la inhibicién enzimatica, como veremos mas adelante (pag. 205). Otra transformacion util de la ecuacién de Michaelis-Men- ten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuacién (12) por Ving, y reordenando para dar la ecuacién Vv Vo = —Ku is! + Vindx La representacién de vy frente a v/[S], llamada representa- cién_de Eadie-Hofstee (fig. 8-7), no solamente da los valores de Vinx y de Ky en forma muy sencilla, sino que también amplia las desviaciones del caracter lineal que pueden no aparecer en una representacién doble reciproca. Efecto del pH sobre la actividad enzimatica La mayoria de los enzimas poseen un pH caracteristico al cual su actividad es maxima; por encima o por debajo de ese pH Ja actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en funcién del pH de muchos enzimas son acam- 201PARTE | COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ficura 8-8 Curvas de actividad en funcién del pH de algunos enzimas. a 2 a Colinesterasa u 3 Tripsina 6 3 2 B eG 6 8 10 pH Pepsina Papaina P (sustrato = benzoilargininamida) 2 4 6 pH panados, pueden variar considerablemente de forma (fig. 8-8). La relacién entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende del comportamiento Acido-base del enzima y del sus- trato, asi como de otros muchos factores que son por lo ge- neral dificiles de analizar cuantitativamente. La forma de la curva de actividad-pH varia con la concentracién del sustrato, ya que el valor de Ky de muchos enzimas varia con el pH. ~Las mencionadas curvas son mucho mas significativas si el enzima se mantiene saturado con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinética enzimatica, el pH se mantiene constante al, o muy préximo al, pH dptimo, El pH 6éptimo de un enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede ha- llarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-actividad. Este hecho sugiere que la relacién pH-actividad de un enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad. Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimaticas Al igual que ocurre con la mayoria de reacciones quimicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incre- menta en general con la temperatura, dentro del intervalo en que el enzima es estable y permanece totalmente activo. La velocidad de muchas reacciones enzimaticas se duplica, apro- ximadamente, por cada 10°C de aumento de la temperatura (Qio ~~ 2,0). Sin embargo, el coeficiente de temperatura Qo, varia algo de un enzima a otro segun la energia de activacién 202Ficura 8-9 Efecto de la temperatura sobre la actividad de un enzima. Los enzimas varian con tespecto a su estabilidad térmica. La porcién descendente de la curva se debe a la desnaturalizacién térmica. Porcentaje maximo de actividad = 2 Qo ao Qo 20 60 Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién de la reaccién catalizada; es decir, de la altura de la barrera de energia para pasar al estado de transicién (fig. 8-3). Aunque las reacciones catalizadas por los enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura 6ptima (fig. 8-9), el pico que se observa al representar la actividad catalitica frente a la temperatura se produce porque los enzimas, al ser pro- teinas, se desnaturalizan por la accién del calor y se inactivan cuando la elevacién de temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura «6ptima» es, por tanto, la resultante de dos procesos: 1) el incremento habitual de la velocidad de reaccién con la temperatura, y 2) el incremento en la ve- locidad de desnaturalizacié6n térmica del enzima al sobrepasar una temperatura critica, Aunque la mayoria de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60°C, al- gunos de ellos son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores; por ejemplo, los enzimas de diversas especies de bacterias termofilicas que habitan en las termas de agua y siguen siendo activos a temperaturas superiores a los 85°C. Algunos enzimas, como la ribonucleasa, pierden actividad por calefaccién, pero la recuperan rapidamente por enfriamien- to, lo cual indica que su cadena polipeptidica desplegada vuel- ve rapidamente a adoptar su conformaci6n nativa (pag. 64). Inhibicién de los enzimas A partir del estudio de los inhibidores de los enzimas se ha obtenido informacién de importancia sobre el mecanismo y los caminos de la catalisis enzimatica, la especificidad de sustrato de los enzimas, la naturaleza de los grupos funcionales en el centro activo y la participacién de ciertos grupos funcionales en el mantenimiento de la conformacién activa de la molécula del enzima. Ademas, la inhibici6én de algunos enzimas por metabolitos especificos constituye un elemento importante en la regulacién del metabolismo intermediario. Los tres. tipos principales de inhibicién reversible de los enzimas, competitiva, acompetitiva y no competitiva, pueden distinguirse experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor sobre la cinética de reaccién del enzima, la cual puede analizarse mediante la ecuacién basica de velocidad propuesta por Michaelis-Menten, Para la validez del anAlisis cinético, el inhibidor debe combinarse rapida y reversiblemente con el enzima o con el complejo enzima-sustrato. Los inhibi- dores que reaccionan con el enzima lentamente y/o irreversi- blemente se estudian en otro lugar (pags. 207 y 226). Inhibicién competitiva La caracteristica de la inhibici6n competitiva es que el inhi- bidor puede combinarse con el enzima libre de tal modo que compite con el sustrato normal para unirse al centro activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con el en- zima para formar un complejo enzima-inhibidor (EI) analogo al complejo enzima-sustrato: E+I=— EI 203PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS La molécula del inhibidor no resulta quimicamente alterada por el enzima. Siguiendo el formalismo de Michaelis-Menten, podemos definir la constante del inhibidor K;, como la cons- tante de disociacién del complejo enzima-inhibidor: — LEI A= El La constante del inhibidor, K;, es comparable por tanto a Ks, constante de disociacién del complejo enzima-sustrato. La inhibicién competitiva se reconoce experimentalmente con facilidad, debido a que el porcentaje de inhibicién para una concentracién de inhibidor constante disminuye al incremen- tarse la concentracién del sustrato. En el anAlisis cinético cuan- titativo, el efecto de la variacién de la concentracién del sus- trato [S] sobre la velocidad inicial vo, viene determinada para una concentracién constante del inhibidor. Este experimento se repite de nuevo con una concentracién de inhibidor dife- rente. A menudo se efecttan varias series de tales experi- mentos, cada uno con una concentracién de inhibidor diferen- te; a continuacién, se trazan representaciones de 1/vp frente a 1/[S], para cada una de las concentraciones del inhibidor. Estas representaciones se caracterizan por proporcionar una fa- milia de lineas rectas cuyo punto de interseccién comin se halla sobre el eje de 1/v (fig. 8-10). La presencia de un inhibidor competitivo incrementa, por tanto, la Ky aparente del enzima por el sustrato; es decir, provoca que se precisen concentra- ciones de sustrato superiores para que se alcance la velocidad maxima. E] valor de la Ky aparente del sustrato sera mayor que la verdadera Ky al aumentar el valor de la interseccién sobre el eje 1/[S]. Como la pendiente de la representacién de la reaccién no inhibida es Kyu/Vmax (fig. 8-10; tabla 8-7), y la pendiente de la recta para la reaccién inhibida es Ky/V mix (1 + [I]/K1), se observa que ha experimentado un incre- mento, expresado por el factor 1 + [1]/K;. A partir de esta relacién puede calcularse el valor de K;. Por otra parte, un inhibidor competitivo se caracteriza por no afectar al valor de Vingx, indicando con ello que no interfiere con la velocidad ° de ruptura del complejo enzima-sustrato. El ejemplo clasico de inhibicién competitiva lo constituye la inhibicién de la succinato-deshidrogenasa por el malonato (pa- gina 469), y por otros aniones dicarboxilato (fig, 8-11). La Tasta 8-7. Resumen de los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Burk, 1/V, frente a 1/[S]. a a i ey Interseccién sobre la Pendiente ordenada state Ku 1 Sin inhibidor Vanes Vin Ky ( i) 1 ope. 1 + = — Competitivo Vands K Vendx K, 1 (1) Acompetitivo Vea Vind (1 + ) No competitivo (los valores de ambas Ku (2 4 i) 1 (: 4 i) K,; son idénticos) Vindx K Vind K 204Figura 8-10 Representaciones doble-reciprocas que muestran los efectos de fa inhibicién competifiva, acompetitiva y no competitiva de los enzimas. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Pendiente de la reacci6én inhibida =(1+K) Va Inhibicién competitiva Sin inhibidor Pendiente = Ku Vindx Intersecciones —1 ul) Pendiente Acompetitiva de la reaccién inhibida or or Sin inhibidor Pendiente = Ku max : _ 1 a) Intersecciones = 7 ( + K, mdx ee er Intersecciones 1 tt} Ts] i+ K, _ x Pendiente de la reaccién inhibida =var(+,) Inhibicién no competitiva Sin inhibider Pendiente = e M max Intersecciones— —1— ( Vv. z max 205PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS succinato-deshidrogenasa forma parte del grupo de enzimas responsables de las reacciones del ciclo de los acidos tricarboxi- licos (pag. 469). Cataliza la eliminacién de dos atomos de hi- drégeno de los dos &tomos de carbono metilénicos del succinato (la naturaleza del aceptor del hidrégeno carece de importancia en esta discusién). El malonato, inhibidor competitivo, se pa- rece al succinato en que posee dos grupos carboxilo ionizados a pH 7, pero difiere de él, en que no es deshidrogenado por la succinato-deshidrogenasa. Si se afiade suficiente malonato para inhibir la deshidrogenacién de una concentracién determinada de succinato, en un 50%, por ejemplo el incremento de la concentracién de succinato reducira el porcentaje de inhibicién que produce el malonato. Ademas del malonato, pueden actuar como inhibidores com- petitivos de la succinato-deshidrogenasa los aniones de otros acidos dibasicos que poseen la distancia adecuada entre los dos grupos aniénicos; por ejemplo, el anién pirofosfato. Todo ello conduce a la conclusién de que el centro catalitico de la succi- nato-deshidrogenasa posee dos grupos con carga positiva, se- parados adecuadamente, que son capaces de atraer a los dos grupos carboxilato del sustrato con carga negativa. El centro catalitico muestra, por tanto, que es complementario con res- pecto a la estructura del sustrato. A partir de la relacién entre la estructura molecular de un inhibidor competitivo y de su afinidad por el enzima, expresada por la Ky, se puede obtener informaci6n valiosa acerca de la estructura y la geometria del centro activo, Constituye un mé- todo importante para abordar el trazado de mapas de los cen- tros activos del enzima. N Inhibicién acompetitiva En este tipo de inhibicién, cuya designacién no es muy ade- cuada, el inhibidor no se combina con el enzima libre ni afecta a su reaccién con el sustrato normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo enzima-sustrato para formar un complejo inactivo enzima-sustrato-inhibidor, el cual no experi- menta su transformacién posterior en el producto habitual de la reaccién: ES + I = ESI La constante del inhibidor es, por tanto: _ [ES] [EST] K Estas relaciones demuestran que el grado de inhibicién puede aumentar cuando la concentracién de sustrato se ve aumen- tada. La inhibicién acompetitiva puede reconocerse con gran facilidad en las representaciones de 1/v) frente a 1/[S] para concentraciones constantes del inhibidor, Tal como muestran la figura 8-10 y la tabla 8-7, lo caracteristico de la inhibicién acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece cons- tante al aumentar la concentracién del inhibidor, pero la Wyox decrece. La inhibici6n acompetitiva es poco frecuente en las reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reac- ciones de dos sustratos. 206 Ficura 8-11 Inhibicién competitiva de la succinato- deshidrogenasa. Reaccion de fa succinato-deshidrogenasa. Goo” | Succinato I. COoOo- + Aceptor de hidrégeno Succinato deshidrogenasa coo- i Fumarato | COo- + Aceptor de hidrégeno reducido © Algunos inhibidores competitivos de la succinato-deshidrogenasa. Obsérvese © que todos contienen dos grupos aniénicos cuyo espaciado se parece al existente en el succinato. COoO- CH, Coo- Malonato CoO- CcCOoO- Oxalato coo- | CH, c=O0 COoO- Oxalacetato v O=F—O" oO O=F—O" O- PirofosfatoFicura 8-12 Quelato del tetracetato de etilendiamina con su catién metalico divalente (Me’*), La porcién sombreada representa el plano de los enlaces coordinados. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Inhibicién no competitiva Un inhibidor no competitivo puede combinarse con el enzima libre o bien con el complejo enzima-sustrato, interfiriendo con la accién de ambos. Los inhibidores no competitivos se unen a un centro del enzima distinto del centro activo, a menudo para deformar al enzima, de modo que no pueda formarse el complejo ES a su velocidad normal y que una vez formado no se descomponga a su velocidad habitual para liberar los productos de reaccién. Sus efectos no se anulan al aumentar la concentracién del sustrato. En la inhibicién no competitiva la reaccién con el inhibidor produce dos formas inactivas, EI y ESI: E+I1=— El ES + I — ESI para las que existen dos constantes del inhibidor: — [END = EN . st — [ES)[] , [ES] que pueden ser iguales o diferentes, La inhibicién no compe- titiva se reconoce también con gran facilidad en las represen- taciones de 1/u frente a 1/[S], en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor, que se mantienen constantes (fig. 8-10; tabla 8-7). Las representaciones difieren en pen- diente pero no comparten un punto de intersecci6n comin sobre el eje 1/vo. El valor de la interseccién sobre dicho eje es mayor para el enzima inhibido que para el no inhibido, lo que indica que la Vinx decrece en presencia del inhibidor y no puede restablecerse su valor a pesar de que la concentra- cién del sustrato pueda ser elevada. El tipo mas corriente de inhibici6n no competitiva es produ- cida por los reactivos que pueden combinarse reversiblemente con algin grupo funcional del enzima (situado fuera del cen- tro activo) que sea esencial para mantener la conformacién tridimensional cataliticamente activa de la molécula del enzima. Algunos enzimas (aunque no todos ellos) que poseen un grupo —SH esencial, son inhibidos no competitivamente por los iones de metales pesados (pag, 88), sugiriendo que tales grupos —5SH deben permanecer intactos para que el enzima conserve su conformacién activa normal. Algunos enzimas que precisan de iones metalicos para su actividad son inhibidos no competitivamente por agentes ca- paces de unirse al metal esencial. Por ejemplo, el agente que- lante tetra-acetato de etilendiamina (EDTA) se une reversi- blemente al Mg” y a otros cationes divalentes, inhibiendo asi de modo no competitivo a algunos enzimas que precisan de tales iones para su actividad (fig. 8-12). Inhibicién irreversible: modificacién del enzima En Ja inhibicién reversible de los enzimas, discutida anterior- mente, el inhibidor interviene en un equilibrio facilmente re- versible, que se establece con rapidez, con el enzima o con el complejo enzima-sustrato, y que puede analizarse mediante 207PARTE I COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS la formulacién de Michaelis-Menten. Sin embargo, algunos enzimas experimentan inactivacion irreversible cuando se tra- tan con agentes capaces de unirse covalentemente y que mo- difican de modo permanente a un grupo funcional, necesario para la catalisis, con lo que se inactiva la molécula del en- zima, Este tipo de inhibicién no puede ser tratada por los principios de Michaelis-Menten, que suponen la formacion reversible de los complejos El o ESI. Con frecuencia, la inhi. bicién reversible se manifiesta lentamente en comparacién con Ja cinética de la reaccién normal del enzima, de modo que al principio Ia inhibicién es incompleta, pero aumenta continua- mente con el tiempo debido a que se produce la modificacién quimica de una fracci6n creciente de las moléculas del enzima. La inactivacién irreversible de los enzimas por modificacién covalente se estudiaré con mas detalle en el capitulo 9 (pagi- na 226), ya que ha proporcionado informacién importante sobre la identidad de los grupos funcionales cataliticos del centro activo. Cinética de las reacciones enzimaticas con dos o mas sustratos Muchos enzimas catalizan reacciones con dos sustratos que se influyen mutuamente; estas reacciones muestran una cinética mucho mas compleja que las reacciones sencillas de un solo sustrato consideradas anteriormente. Entre los enzimas que catalizan reacciones bisustrato se halla la numerosa clase de las transferasas, que catalizan la transferencia de un grupo funcional especifico desde un sustrato al otro (tabla 8-1). EI anilisis cinético de las reacciones de dos sustratos, sim- bolizado por la ecuacién E A+B==P+Q es mas complicado que el de las reacciones con un solo sus- trato puesto que pueden existir varios complejos enzima-sus- trato, tales como los complejos binarios EA, EB, EP y EQ y los complejos ternarios EAB, EPQ, EAQ y EPB. La deter- minacién de Ky y de Vix en los sistemas bisustrato es seme- jante al sistema utilizado para las reacciones con un solo sustrato. La concentracién de un sustrato, por ejemplo B, se mantiene constante normalmente a nivel saturante, mientras que la concentracién del sustrato A se cambia para determinar su efecto sobre la velocidad inicial de la reaccién y se obtiene asi la constante de Michaelis-Menten para el sustrato A; es decir, K&. Para obtener el valor de la citada constante, se emplean tres 0 mas concentraciones constantes del sustrato B. A continuacién se invierte el dispositivo experimental; la con- centracién del sustrato A se mantiene constante a nivel satu- rante, y se determina el efecto que produce sobre la velocidad inicial de la reaccién la variacién de Ia concentracién del sustrato B; se obtiene de este modo el valor de Ky para el sustrato B; es decir, Ki. Los valores de Ki} y Ki se obtienen muy facilmente mediante las representaciones doble-reciprocas. Las reacciones bisustrato se reducen, por tanto, al caso de la reaccién de un solo sustrato cuando uno de los sustratos se mantiene constante a una concentracién saturante. La tabla 8-5 muestra los valores de Ky para los dos sustratos y dos pro- ductos de la aspartato aminotransferasa (véase pag. 575). 208sinética e inhibicion Capitulo 8 Enzimas: La mayoria de las reacciones de dos sustratos pueden in- cluirse en una de las dos clases siguientes: reacciones de de: plazamiento simple y reacciones de doble desplazamiento, las cuales pueden generalmente distinguirse por anélisis cinético, tal como se resume en la figura 8-13. Sin embargo, el andlisis cinético no es infalible, y con frecuencia deben emplearse otros enfoques experimentales para el diagnéstico de la ruta de reaccién. En los parrafos siguientes examinaremos las ca- racteristicas de los casos ideales. Reacciones de desplazamiento simple En este tipo: de reacciones, los dos sustratos A y B, deben hallarse presentes simultaneamente sobre el centro activo del enzima para formar un complejo ternario EAB con objeto de que tenga lugar la reaccion. Las reacciones de desplazamiento simple se producen de dos formas, al azar y ordenadas; ambas difieren en la secuencia con que ambos sustratos se unen al enzima. En las reacciones bisustrato al azar, cualquiera de los dos sustratos puede unirse al enzima en primer lugar, indi- cando con ello, que el complejo ternario EAB (llamado tam- bién complejo central) puede formarse por dos caminos diferentes E+A==EA EA+B == EAB (13) ° E+B== EB EB +A == EAB (aa) Muchas de las fosfotransferasas catalizan reacciones de des- plazamiento simple al azar. Constituye un ejemplo la reacci6n catalizada por la creatina-quinasa (pag. 776). ATP + creatina = ADP + fosfocreatina En esta reaccién tanto el ATP como la creatina se unen al centro activo, en cualquier secuencia, formando un complejo ternario. Después de la transferencia del grupo fosfato, desde el ATP ligado a la creatina ligada, ambos productos aban- donan el centro activo, en una u otra secuencia. En las reacciones de desplazamiento simple ordenado, existe una secuencia de reaccién obligatoria, de modo que un sustrato especifico, el primer sustrato 0 sustrato conductor, es el que se fija en primer Tugar, antes de que pueda unirse el segundo sustrato también llamado sustrato acompafiante. Las reacciones siguientes muestran la secuencia E+A==EA (15) EA+B == EAB (16) en la que A es el sustrato conductor. Muchas deshidrogenasas que utilizan el dinucleétido de nicotinamida y adenina (NAD*) como coenzima para aceptar electrones de sus sustratos (pa- gina 491), catalizan reacciones bisustrato ordenadas. Por 209PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE IAS CELULAS Figura 8-13 Resumen de las caracteristicas de las reacciones bisustrato del tipo A+B=P+Q. Con frecuencia pueden distinguirse los diferentes tipos de reacciones bisustrato por la naturaleza de las representaciones doble reciprocas de 1/v, frente a 1/[S] con el otro susteato que se mantiene constante a una concentracién fija. Los desplazamientos simples al azar habitualmente proporcionan un conjunto de lineas rectas que se cortan, pero a veces son mas complejos y sus representaciones no figuran aqui. Los desplazamientos simples y ordenados por lo general dan representaciones convergentes como figura abajo, mientras que los desplazamientos dobles dan lineas paralelas en las representaciones doble reciprocas. Reacciones de desplazamiento sencillo AL azar: Tanto el sustrato A como el B pueden combinarse con el enzima libre E para dar un complejo Dinario, La adicién del otro sustrato se produce seguidamente, y rinde el complejo terciario EAB. Tal como puede verse aqui, la liberacién de los productos P y Q se verifica en una secuencia al azar, pero este puede no ser necesariamente el caso. a By Bs > P Q EA EB EP EQ pk ad peng He Jy onDENADO: El enzima libre E debe combinarse en primer lugar con el sustrato conductor A para formar un complejo binario. La adicién del siguiente sustrato B produce entonces el complejo ternario EAB. Se indica la iberacién ordenada de los productos aunque no es obligatoria por necesidad. rhea dr La ecuacién general de velocidad para las reacciones ordenadas, en las que A es el sustrato conductor a Vo" REKE_, Kt, Kb Tay(By * Tal * (By * * que despejada en forma de pendiente-interseccién (doble-reciproca) con respecto a A av +S ea v0 Vinx Las representaciones de 1/vs frente a 1/[Al], a diversas concentraciones del sustrato B que se mantiene constante (suponiendo que no existan acciones miituas entre: los centros de unién de A y de B) kg + KEKE) diente Tax ( a B 210 Reacciones de doble desplazamiento (ping-pong) EI sustrato A se combina con el enzima E para formar el complejo EA, del cual se libera el producto P, abandonando al enzima E* substituido covalentemente. EI sustrato B se combina entonces con E, para dar el complejo E* B, que se descompone produciendo el producto Q y el enzima libre E, “ery v= — nix 14K, Ke [a] * [By que en forma de pendiente-interseccién aes (cag) + (4+ ta aca) Las representaciones de 1/vs frente a 1/{A], para diversas concentraciones del sustrato constante B, Pen Kb diente ~ V3, Incremento de la __— |concentracién de B Incremento de la concentracién de BCapitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién ejemplo, la malato-deshidrogenasa, (pag. 471), que cataliza la reaccién Malato + NAD* == oxalacetato + NADH + H* (17) debe unirse, en primer, lugar al NAD* y rinde el complejo E-NAD?*; el malato se combina con este iiltimo, con lo que se forma el complejo ternario E-NAD*-malato. Las reacciones bisustrato al azar pueden distinguirse de las ordenadas experimentalmente. La reaccién es de tipo orde- nada si es inhibida globalmente por el dltimo producto de la reaccién y éste compite solamente con el primer sustrato (sus- trato conductor). Por ejemplo, la reaccién de la malato deshi- drogenasa (17), que es ordenada, resulta inhibida por un ex- ceso de NADH, que compite con el primer sustrato conductor normal, el NAD*, en su unién al enzima; sin embargo, el NADH no compite con el malato. En ciertas condiciones, el complejo ternario de algunas reac- ciones bisustrato ordenadas, se halla en concentraciones infi- mas, de suerte que los productos de la reaccién parecen pro- venir directamente de la reaccién entre el complejo binario EA (formado por el enzima y el sustrato conductor) y el segundo sustrato B, sin que aparentemente se forme un com- plejo EAB, La lactato-deshidrogenasa dependiente del NAD y la alcohol-deshidrogenasa en determinadas condiciones ex- perimentales presentan este tipo de comportamiento, que fue descubierto y analizado por primera vez por H. Theorell y B. Chance (pag. 495). Reacciones (ping-pong) de doble desplazamiento En las reacciones bisustrato de este tipo, un sustrato debe hallarse unido al enzima y debe liberarse un producto, antes de que tenga lugar la entrada del segundo sustrato y la parti- da del segundo producto. En estas reacciones el primer sus- trato reacciona con el enzima y origina una forma modificada del mismo, habitualmente por transferencia de un grupo fun- cional. En la segunda etapa este grupo funcional se transfiere desde el enzima al segundo sustrato. Constituye un ejemplo de reaccién de doble desplazamiento la catalizada por la aspar- tato-amino-transferasa, también Hamada aspartato-transami- nasa, que cataliza la reaccién Aspartato + a-oxoglutarato = oxalacetato + glutamato El aspartato, sustrato conductor, es el primero que se combina con el enzima. El grupo amino del aspartato se transfiere des- pués al fosfato de piridoxal (pag. 350), que es el grupo pros- tético del enzima al que se halla intimamente unido. A conti- nuacién, el oxalacetato, primer producto de la reaccién, abandona el centro activo en el que es sustituido por el se- gundo sustrato, el «-oxoglutarato, al cual el enzima transfiere el grupo amino para formar glutamato, el cual entonces, aban- dona el centro activo. A estas reacciones bisustrato que se verifican en dos etapas, se las ha designado con el descriptivo apelativo de reacciones ping-pong (fig. 8-13). Variaciones de equilibrio en las reacciones bisustrato Las reacciones bisustrato de desplazamiento, simple o do- ble, pueden distinguirse con frecuencia por su comportamien- to cinético caracteristico, tal como se indicé anteriormente 211PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS en la figura 8-13; sin embargo, el analisis cinético, por si solo, no conduce siempre a conclusiones infalibles. Existe otro criterio importante que, a veces, permite distinguirlas. Lo aclararemos comparando dos reacciones enzimaticas que muestran un parecido formal: la reaccién catalizada por la sacarosa-fosforilasa, de doble desplazamiento, y Ja de la mal- tosa-fosforilasa, que es de desplazamiento simple. La fosforilasa de la sacarosa cataliza la reaccién Sacarosa + P, = a-p-glucosa-I-fosfato + -v-fructosa en la que el disacarido sacarosa, que contiene a-D-glucosa y f--fructosa (pag. 267) experimenta una escisién fosforoli- tica reversible y produce a-D-glicosa-I-fosfato y D-fructosa libre. El mismo enzima, actuando en la direccién inversa, par- ticipa en la biosintesis de la sacarosa. El estudio detallado de este enzima muestra que puede catalizar una reaccién de intercambio en la que el fosfato inorganico libre se cambia con el grupo fosfato de glucosa-I-fosfato cuando no estan presentes ni la sacarosa ni la fructosa, sin que se produzca ninguna variacién neta del fosfato 0 de glucosa-I-fosfato. EI curso de esta reaccién de variacién de equilibrio, puede seguirse si se inicia con un fosfato inorganico marcado con el isétopo radiactivo 2P (indicado en color) y una glucosa-1- -fosfato sin marca Fosfato-+ a-v-glucosa-I-fosfato =: fosfato + a-D-glucosa-I- fosfato La glucosa-1-fosfato va quedando marcada con el isétopo a medida que transcurre el intercambio. De modo analogo, la fosforilasa de la sacarosa cataliza también una reaccién de variacién del equilibrio entre una fructosa marcada isotépi- camente (en color) y la porcién de fructosa de la sacarosa no marcada, en ausencia de fosfato o de glucosa-1-fosfat Fructosa+ glucosa-fructosa = fructosa + glucosa- fructosa (Secaros) {Sxcarota) A partir de éstos y otros hechos, se ha deducido que la reac- cién catalizada por la fosforilasa de la sacarosa es una reaccién de doble desplazamiento que se produce en dos etapas distintas y en la que interviene un intermediario covalente enzima-glucosa, Estas etapas son las siguientes: E + sacarosa = E-glucosa + p-fructosa E-glucosa + P; = E + a-D-glucosa-1-fosfato La variacién de equilibrio de la fructosa libre marcada con la porcién de fructosa de la sacarosa, se alcanza con la primera reaccién, que puede tener lugar con independencia de la se- gunda, y el intercambio de fosfato isotépico con el grupo L-fosfato de la a-p-glucosa-I-fosfato, ocurre en la segunda reaccién, que puede transcurrir con independencia de Ja pri- mera, Esta formulacién de la reaccién de la fosforilacién de la sacarosa se funda en la demostracién directa de la forma- cién por el enzima de un intermediario covalente enzima- glucosa. La reaccién de la maltosa-fosforilasa, ejemplo de desplaza- miento simple, ofrece un contraste notable: Maltosa + P; = p-glucosa + -p-glucosa-1-fosfato 212Capitulo 8 Enzimas: cinética ¢ inhibi La maltosa que es un disacarido constituido por dos molé- culas de p-glucosa, experimenta una ruptura fosforolitica que muestra semejanza formal con la reaccién de la fosforilasa de la sacarosa, Sin embargo, la fosforilasa de la maltosa no cataliza el cambio isotépico entre el fosfato y la 4-p-glucosa 1-fosfato en ausencia de maltosa y de p-glucosa, ni tampoco cataliza un intercambio entre la D-glucosa isotépica libre y un resto de glucosa de la maltosa en ausencia de fosfato y de glucosa-I-fosfato, Adems, no se ha puesto de manifiesto la existencia de ningiin intermediario no covalente enzima- azticar, en la accién de la fosforilasa de la maltosa. A partir de ésta y de otras evidencias, se ha Ilegado a la conclusién de que la reaccién de la maltosa-fosforilasa es una reaccién de desplazamiento simple en la que tanto la maltosa como el fosfato, deben hallarse presentes, simultaneamente, en el cen- tro activo, Cuando tanto las experiencias cinéticas como las de variacién de equilibrio estan en concordancia, puede for- mularse una decisién segura acerca de si una reaccién enzi- matica es de desplazamiento simple o doble. Determinacién cuantitativa de la actividad enzimatica La cantidad de un enzima en una disolucién determinada o en un extracto de tejido, puede determinarse cuantitativa~ mente en relacién al efecto catalitico que produce. Para este objeto es necesario saber: La estequiometria global de la reaccién catalizada, 2. Si el enzima precisa de Ja adicién de cofactores, tales como los iones metélicos 0 coenzimas. 3. Su dependencia de las concentraciones de sustrato o de los cofactores; es decir, el valor de Ky para el sustrato y para el cofactor. 4, Su pH éptimo. 5. Una zona de temperatura en que sea estable y muestre actividad elevada. 6. Un procedimiento analitico sencillo para determinar la desaparicién del sustrato o la aparicién de los productos de la reaccién, Siempre que sea posible, los enzimas se ensayan empleando sistemas en que el pH es éptimo y la concentracién del sus- trato se halla por encima del nivel de saturacién, de tal modo que la velocidad inicial de la reaccién es de orden cero res- pecto al sustrato. En estas condiciones, la velocidad inicial de la reaccién solamente es proporcional a la concentra- cién del enzima. En el caso de enzimas que necesitan el con- curso de cofactores, tales como iones metalicos o coenzimas, éstos deben afiadirse también en concentraciones que sean superiores a la de saturacién, de modo que el verdadero factor limitante de la velocidad en el sistema sea la concentracién del enzima. Generalmente, la medida de la velocidad de for- macién del producto de la reaccién es mas segura que la medida de la desaparicién del sustrato, ya que éste debe estar, con frecuencia, en concentraciones bastante elevadas para garantizar la cinética de orden cero. La determinacién cuantitativa de la actividad enzimatica se efectta del modo mas rapido y conveniente cuando el sus- 213PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS trato 0 el producto son coloreados o absorben Iuz,en la region del ultravioleta, ya que la velocidad de aparicién o de des- aparicién de un producto o de un sustrato que absorbe la Juz puede seguirse con un espectrofotémetro, y permite efec- tuar un registro continuo del curso de la reaccién si se emplea un registrador provisto de una banda de papel mévil. No deberén hallarse presentes otros componentes que absorban 0 dispersen la luz, pero en caso contrario, deberén prepararse los correspondientes blancos para efectuar la adecuada sus- traccién. Por ejemplo, tenemos la medida de la actividad del enzima lactato-deshidrogenasa, que transfiere electrones des- de el lactato a la forma oxidada del dinucleétido de nicotina- mida y de adenina (NAD*) (tabla 8-3; véase también pagi- na 493) y rinde piruvato, el coenzima reducido NADH, y un protén: Lactato + NAD* = piruvato + NADH + H* La forma reducida del coenzima, NADH, absorbe luz en el ultravioleta a 340 nm (pag. 492), mientras que la forma oxi- dada NAD*, el lactato y el piruvato no lo hacen. El progreso de la reaccién, en el sentido directo, puede seguirse midiendo el incremento de absorcién de la luz del sistema a 340 nm en un espectrofotémetro lo cual es mucho mas sencillo que la determinacién quimica de cualquiera de los sustratos o de los productos. Las determinaciones dpticas son tan sencillas y cémodas, que se emplean a menudo para seguir la variacion de una reaccién enzimatica con el tiempo, en la que ni el sustrato(s) ni el producto(s), exhibe ningiin maximo de absorcién de luz caracteristico; para ello, se ha acoplado la reaccién con otra reaccién enzimatica, en la que pueda medirse con facilidad, algan cambio éptico. Tenemos como ejemplo la reaccién entre el fosfoenolpiruvato y el ADP que proporciona piruvato y ATP por transferencia de un grupo fosfato, catalizado por Ja piruvato-quinasa: Fosfoenolpiruvato + ADP = piruvato + ATP Aunque los sustratos y los productos de tal reaccién no absorben la luz en la zona de 300 a 400 nm, ésta es facil de medir si se afiade al sistema un exceso del enzima lactato- deshidrogenasa y de NADH para dar las siguientes reac- ciones acopladas, cuyo intermediario comin es el piruvato: Fosfoenolpiruvato + ADP = piruvato + ATP Piruvato + NADH + H*= lactato + NAD* En presencia de excesos de lactato-deshidrogenasa y de NADH, la formacién de piruvato en la primera reaccién va seguido por la rapida reduccién del piruvato a lactato en la segunda. Por cada molécula de piruvato que se forma y se reduce, se oxida una molécula de NADH a NAD‘, lo cual produce una disminucién de la absorcién de la luz a 340 nm, maximo de absorcién del NADH. En esta experiencia _aco- plada el enzima cuya actividad se mide constituye el compo- nente limitante de la velocidad por ajuste adecuado del sistema reaccional. 214‘Tapia 8-8. Actividad molecular} de algunos ‘enzimas en el intervalo de 20 a 38°C. Actividad Brzima molecular + Anhidrasa carbénica C 36 000 000 4°3-cetosteroide-isomerasa 417 100 000 Catalasa 5.600 000 B-Amilasa 1100 000 B-Galactosidasa 12500 Fosfoglucomutasa 1240 Succinato-deshidrogenasa 1150 + La actividad molecular de un enzima es el nimero de moléculas de sustrato trans- formadas por una sola molécula del enzima por minuto en condiciones éptimas. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Unidades de actividad enzimtica La unidad de actividad enzimatica empleada mas corriente- mente se define como Ia cantidad de enzima que origina’ la transformacién de 1,0 wmol (10-° mol) de sustrato por minuto a 25°C, en condiciones 6ptimas de medida, La actividad espe- cifica es el numero de unidades del enzima por miligramo de proteina. Constituye una medida de la pureza del enzima, que aumenta durante el proceso de su purificacién, y llega a ser maxima y constante cuando éste se halla en estado puro, La actividad molecular o molar, que antiguamente se llamaba ni- mero de recambio, es el nimero de moléculas de sustrato trans- formadas por minuto por una sola molécula de enzima (0 por un solo centro activo), cuando el enzima es el factor limitante de la velocidad (tabla 8-8). La actividad molar de un enzima con un centro activo dnico puede calcularse a partir del valor de su Vix y de su peso molecular. El enzima anhidrasa car- bénica posee la actividad molar mas elevada de cualquiera de los enzimas conocidos, 36 000 000 min“ por molécula. La Comisién de Enzimas (véase Bibliografia) ha recomen- dado una nueva unidad internacional para la actividad enzi- matica el catal (abreviadamente cat), que se define como la cantidad de actividad enzimatica que transforma 1 mol s“ de sustrato, La nueva unidad se halla en correlacién con las di- mensiones de las constantes de velocidad en la cinética qui- mica, las cuales se basan en el segundo, en lugar del minuto. Las actividades pueden expresarse también en microcatales (ucat), nanocatales (ncat) 0 picocatales (peat). Una unidad enzimética antigua (véase mas atras) es, por tanto, igual a 1/60 peat o bien a 16,67 ncat. En la nueva convencién la actividad especifica se expresa en catales por kilogramo de proteina, equivalente a microcatales por miligramo de proteina, y la actividad molar en catales por mol de enzima. Purificacién de los enzimas La aplicacién de métodos de determinacién cuantitativa, como los descritos anteriormente, a la determinacién de la magnitud de Ja actividad catalitica presente en las diferentes fracciones proteicas obtenidas de las células o de los tejidos por los métodos que se describieron detalladamente en el capitulo 7 (pag. 161), permite purificar los enzimas y obtenerlos, al final, en forma homogénea, Los métodos de abordar la purificacion y los procedimientos que se utilizan para ello fueron aclara- dos (pag. 177) mediante algunos datos reales obtenidos du- rante la purificacién del enzima acetilcolinesterasa. Debe te- nerse presente que un extracto crudo de células bacterianas, © de un tejido animal, o vegetal, puede contener centenares de proteinas diferentes, siendo la mayor parte de ellas enzimas cuya solubilidad y propiedades Acido-base no difieren mucho. Por ello, la purificacién de un determinado enzima a partir de un extracto de esta naturaleza precisa de la eleccién empirica de una secuencia de procedimientos de separacién que apro- vechen las diferencias de propiedades entre el enzima que se desea aislar y todas las demas proteinas presentes, 215PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Complejos enzima-sustrato y compuestos covalentes enzima-sustrato Como hemos visto, la evidencia cinética da a entender clara- mente que todos los enzimas se combinan de modo transitorio con sus sustratos para formar complejos enzima-sustrato du- rante su ciclo catalitico, Pero debido a la inestabilidad de los complejos enzima-sustrato que, por definicién, se descomponen rapidamente, podria esperarse que hubiese dificultad en obte- ner pruebas de su formacién, No obstante, la evidencia de que se forman tales complejos se ha conseguido mediante medidas fisicas y quimicas. El problema puede abordarse mediante la observacién espectroscépica de las variaciones espectrales pasajeras que se producen cuando se mezcla el sustrato con el enzima. La catalasa y la peroxidasa son hemo-enzimas que poseen espectros de absorcién caracteristicos debido a sus grupos prostéticos hemo, y muestran cambios transitorios en sus espectros cuando se mezclan con su sustrato, el perdxido de hidrogeno, lo cual es el reflejo de la formacién y la descom- posicién de sus complejos enzima-sustrato. De modo analogo, algunos enzimas, al mezclarse con sus sustratos, experimentan cambios de rotacién éptica a ciertas longitudes de onda (pa- gina 154), los cuales se interpretan como manifestaciones de los cambios de conformacién del enzima que acompafia a la pro- duccién del complejo enzima-sustrato. Es especialmente convincente la demostraci6n-de la existen- cia de complejos enzima-sustrato bastante estables, como cuando algunos enzimas reaccionan con un sustrato perezoso, es decir, uno que forme con facilidad un complejo no cova lente enzima-sustrato, pero que se descomponga muy lenta- mente en comparacién con el sustrato biolégico normal. La existencia de tales complejos enzima-sustrato perezosos se ha observado en la lisozima (pag. 239), en la D-aminoacido-oxi- dasa y en otros varios enzimas. De hecho, un complejo pere- zoso enzima-sustrato de la lisozima ha sido cristalizado y so- metido al analisis por rayos X, proporcionando algunos rasgos reveladores acerca de la estructura del centro activo (pag. 238). También es posible demostrar la formacién de complejos es- tables de algunos enzimas, con inhibidores competitivos, cuya estructura se parece a la del sustrato y que se unen al mismo centro del enzima sobre el que lo hace el sustrato. La forma- cién de complejos enzima-sustrato puede observarse también directamente en algunas reacciones con dos sustratos, cuando se afiade uno de ellos en ausencia del otro. Por ejemplo, la alcohol-deshidrogenasa forma un complejo con el dinucledtido de nicotinamida y de adenina oxidado en ausencia de etanol, que es el otro sustrato. Es probable que todos los enzimas formen complejos enzima- sustrato reversibles no covalentes del tipo de Michaelis-Men- ten, cuya descomposicién constituye la etapa limitante de la velocidad cuando la concentracién del sustrato es la satu- rante. Ademés, algunos enzimas forman como intermediarios compuestos covalentes enzima-sustrato, sobre todo los que ca~ talizan reacciones de doble desplazamiento. Un ejemplo clasico lo constituye el enzima fructosa-difosfato-aldolasa (pag. 435), gue cataliza la reaccién reversible 1,6-difosfato de fructosa = fosfato de dihidroxiacetona + 3-fosfato de gliceraldehido 216Fioura 8-14 Reduccién del compuesto enzima-substrato entre la fructosa-difosfato-aldolasa y el osfato de dihidroxiacetona. Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Enzima con un grupo e-amino del resto de lisina esencial Fosfato de dihidroxiacetona (substrato) 4 Compuesto enzima-substrato i (base de Schiff) HOCH,—C—CH,OPO,H, [Fisezo de boro Enz i Compuesto eazima-substrato " reducido HOCH,—CH—CH,OPO;H, | Hiseotste COOH H,N—C—H I e-N-gliceriLlisina libre HOCH,—CH—CH,OH La adicién de borohidruro sédico, poderoso reductor a una mezcla de aldolasa y de fosfato de dihidroxiacetona marcado origina la formacién de un compuesto covalente, mar- cado isotépicamente, a fosfato aldolasa-dihidroxiacetona, que es cataliticamente inactivo, Por hidrélisis completa de este compuesto con un Acido, se encuentra en el hidrolizado un derivado estable €-N-glicerilo de un solo resto de lisina (fi- gura 8-14). Este derivado no se forma en ausencia del reduc- tor. De la estructura del compuesto marcado se dedujo que Ja aldolasa se combina de modo covalente, aunque reversible, con el fosfato de dihidroxiacetona formando una base de Schiff inestable (pag. 436) entre el grupo €-amino de un resto de lisina situado en el centro activo del enzima y el grupo carbonilo del sustrato. El tratamiento con borohidruro reduce a este intermediario, que es muy labil, a un derivado cova- lente pero inactivo. De esta manera se han aislado con éxito compuestos enzima-sustrato covalentes y muy labiles, de varios enzimas que actian sobre sustratos con grupos funcionales amino 0 carbonilo, transformandolos en sus formas reducidas y estables. En algunas reacciones bisustrato de doble desplazamiento, puede aislarse un compuesto enzima-sustrato si el otro sus- trato esta ausente del sistema. Por ejemplo, cuando la fosfo- rilasa de Ja sacarosa actéa sobre la sacarosa en ausencia de fosfato, se forma un compuesto enzima-glucosa (pag. 212). 217PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CALULAS Enzimas y sustratos en las células vivas Los enzimas pueden actuar en las células vivas en condiciones muy diferentes de las que lo hacen en los sistemas experimen- tales, tales como las experiencias cinéticas in vitro descritas en este capitulo. Si una célula hepatica contiene 1000 enzimas diferentes y su peso molecular medio es de alrededor de 140 000, la concentracién media en que cada enzima se hallara en el citoplasma seré menor que 10 M (1,0 uM). Algunos enzimas, sobre todo los que catalizan las reacciones en las tutas centrales, pueden existir en concentraciones muy supe- riores: por ejemplo, la hexoquinasa, que cataliza la fosforila- cién de la glucosa por el ATP, esta presente en el misculo en cantidad que excede a 10+ M (100 »M). Por otra parte, algunos enzimas, como por ejemplo los que catalizan 1a bio~ sintesis de los coenzimas estan presentes, probablemente, en concentraciones tan bajas como 10* M (0,01 »M). Se han efectuado también medidas de la concentracién cito- plasmica de diversos metabolitos que acttian como sustratos. La mayoria se hallan presentes en una concentracién total comprendida entre 5 y 500 uM. En muchos casos, por no decir la mayoria, la concentracién del sustrato en las células intactas es insuficiente para saturar al enzima; de hecho, en algunos de ellos, la concentracién del sustrato, no es mucho mayor que la concentracién del enzima. Esta claro que los enzimas, en la célula intacta, no exhiben necesariamente el comportamiento cinético clasico de Michaelis-Menten, que supone que la concentracién del enzima es despreciablemente pequefia comparada con Ia concentracién del sustrato. El ana- lisis cuantitativo de la cinética de los enzimas en la célula intacta constituye un campo de la enzimologia apenas iniciado y reviste la maxima importancia para la comprensién de la regulacién biolégica de la actividad enzimatica (cap. 9, pagi- na 240). Resumen Los enzimas se clasifican basdndose en la reaccién que catalizan. Algunos enzimas son proteinas simples; otros son proteinas conjugadas y contienen grupos prostéticos constituidos por iones metélicos, por coenzimas, 0 por ambos. Los coenzimas y los grupos prostéticos actian como transporta- dores intermediarios de grupos funcionales especificos, de atomos o de electrones. Muchos coenzimas contienen una molécula de una vitamina determinada, nutriente orgénico del que sélo se precisan vestigios para Ja funcion celular normal, En las reacciones catalizadas por enzimas, un incremento de la con- centracién del sustrato aumenta la velocidad de reaccién hasta que se alcanza un punto en que dicha velocidad se hace independiente de la concentracién del sustrato, En este punto el enzima se halla saturado y Ia reaccién es de orden cero con respecto al sustrato. Para cada enzima hay una concentracién de sustrato caracteristica (Kw la constante de Michaelis-Menten) a la que la velocidad de reaccién es la mitad de la velocidad maxima, La relacién cuantitativa entre la velocidad inicial de la reaccién, la concentracién del sustrato Ku y la velocidad maxima de un enzima vienen dadas por la ecuacién de Michaelis-Menten. Su deduccion se basa en Ia suposicién de que se forma un complejo enzima-sustrato que es reversible, como etapa esencial de la catalisis, Los enzimas exhiben también un pH dptimo y un intervalo de temperatura en el gue son esta- bles y activos. Los inhibidores competitivos de los enzimas son aquéllos que reaccionan reversiblemente con el enzima libre en competencia con el sustrato para formar un complejo enzima-inhibidor; su accién puede invertirse por in- eremento de la concentracién del sustrato. Los inhibidores acompetitives 218Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicion no reaccionan con el enzima libre, pero se combinan reversiblemente con el complejo enzima-sustrato, impidiendo la formacién de los productos. Los inhibidores no competitivos reaccionan reversiblemente tanto con el enzima libre como con el complejo enzima-sustrato. Los inhibidores irre- versibles producen una modificacién quimica permanente de algin grupo funcional esencial en Ia molécula del enzima. Las experiencias cinéticas se utilizan para distinguir entre los diversos tipos de inhibicion reversible de los enzimas; Jas representaciones doble reciprocas son especialmente tiles para el anélisis de estos datos cinéticos. En las reacciones bisustrato de desplazamiento simple al azar, el enzima forma un complejo ternario con ambos sustratos, los cuales pueden adicionarse en cualquier orden, En las reacciones de desplazamiento sim- ple ordenadas, existe una secuencia obligatoria en la adicién de los sus- tratos para formar el complejo temnario. En las reacciones de doble des- plazamiento, o ping-pong, un sustrato reacciona con el enzima y st corres- pondiente producto se libera antes de que se combine el otro sustrato, Las experiencias con enzimas se efectian normalmente midiendo la velocidad inicial de la reaccién bajo condiciones en las que el enzima esté saturado con el sustrato y el pH es éptimo. La existencia de complejos enzima-sustratos y de compuestos covalentes se ha deducido de estudios cinéticos, de experiencias de captacién, y de mediciones espectrofotomé- tricas. Bibliografia Libros BARMAN, 1.: Enzyme Handbook, vol. 1, Springer, Nueva York, 1969. Importante resumen de las propiedades principales de los enzimas cla- sificados de acuerdo con las normas internacionales. BENDER, M. L., y 1. J. BRUBACHER: Catalysis and Enzyme Action, McGraw- Hill, Nueva York, 1973, Ensayo de introduccién. aover, p. p.: The Enzymes, 3* ed., vols. 1-10, Academic, Nueva York, 1970-74, Importantisima coleccién de extensas resefias sobre multiples aspectos de la bioguimica de los enzimas. COLOWICK, 5. P., YN. 0. KAPLAN (eds.): Methods in Enzymology, Acade- mic, Nueva York. Valiosa serie continuada de volémenes sobre técnicas experimentales de valoracién de enzimas, aislamiento y preparacion de sustratos. DIXON, M., y E. . WEBB: Enzymes, 2.* ed, Longmans, Londres, 1964. Con- tina siendo un texto clésico sobre las propiedades generales de los enzimas. Enzyme Nomenclature, American Elsevier, Nueva York, 1973. Recomen- daciones de 1972 de ld Commission on Enzyme Nomenclature, que contiene las unidades y simbolos cinéticos. curenEunp, x.: Enzymes: Physical Principles, Wiley-Interscience, Nueva York, 1972. Quimica-fisica y cinética de los enzimas. Tratamiento corto excelente y de fécil lectura. HALDANE, J. B. St The Enzymes, MIT Press, Cambridge, Mass, 1965. Reimpresién de un clasico. LAIDLER, K. J.: The Chemical Kinetics of Enzyme Action, 2.* ed., Oxford, Nueva York, 1973. meister, A. (ed.): Advances in Enzymology, Academic, Nueva York. Volimenes anuales con revisiones sobre temas especializados de la bioquimica de los enzimas. PLOWMAN, K.: Enzyme Kinetics, MacGraw-Hill, Nueva York, 1972. wenp, J. Li: Enzyme and Metabolic Inhibitors, 3 volimenes, Academic, ‘Nueva York, 1963-1966. westtey, J.: Enzymic Catalysis, Harper & Row, Nueva York, 1969. Los fenémenos cinéticos complejos son objeto de una descripcién verbal precisa, asi como de un tratamiento matematico detallado. oePARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Articulos CLELAND, w. w.: B, la concentracion de A en el tiempo cero es de 0,50 mM. Al cabo de 2 s, es de 0,25 mM. 2Cudl sera al cabo de 5 8? 2, En la reaccién de segundo orden A +B—*C, las concentraciones de los reactivos en el tiempo cero son las siguientes: 1a del reactivo Aves de 5,0 mM y la del reactivo B de 4,0 mM. Cuando ha trans- currido 1s, la concentracién de A es de 4,0 mM y la de B de 3,0 mM. ,Cual seré al cabo de tres segundos la relacién de las concentraciones entre A y B? 3. a) Cua seré la constante de velocidad k de una reaccion de pri- mer orden cuyo tiempo mitad es de 0,3 s? 5) 1Qué intervalo de tiempo deberia transcurrir para que desapare- clese el 95% del reactivo? 4, Los datos siguientes se refieren a la reaccién RSO,S~ + CN- —> SCN- + RSO,~ [SCN-], x 10¢ M-* Caletlese 1a constante de velocidad de seudo primer orden de la reaccién, si la concentracién inicial de CN™ era 0,125 M, y la RSO,S~ de 0,0035 M. 5. jQué relacién existe entre Ky y [S], cuando una reaccién catalizada enzimaticamente, alcanza el 80% de la Vas? 6. Demuéstrese que en la inhibicién competitiva de una reaccién enzi- mética, las intersecciones sobre el eje horizontal en la representacién del 1/v frente a 1/[S], para diferentes concentraciones del inhibidor, es igual a =1 Kul + (1/Ki) 7. A 10,0 ml de una disolucién de un enzima puro que contiene 1,0 mg de proteina por mililitro, se Je afiade la cantidad de AgNO; exacta- mente precisa para inactivar el enzima. Se necesitaron en total 0,342 aM de AgNO. Calcilese un peso molecular minimo del enzima. 8. La transaminasa cataliza la reaccién Glutamato + oxaloacetato —> «-oxoglutarato ++ aspartato EI fosfato de piridoxal (PP) actiia como coenzima en el proceso catalitico, Calculese la Ky para el complejo apoenzima-coenzima a partir de los datos siguientes, obtenidos al variar la concentracién de PP mientras que las concentraciones de glutamato y de oxalace- tato y las demés condiciones, se mantuvieron constantes: Glutamato que desapa- rece por mi- auto, en.mg a accion catalitica de la glutamato-deshidroge- nasa. a) Determinese el tipo de inhibicion mediante el analisis gré- fico de los siguientes datos. Supéngase que la concentracién de sali- cilato se mantiene constante y es de 40 mM. Calcdlese también 6) la Ku para el sustrato y c) la K; constante de disociacién para el com- plejo enzima-inhibidor. 22010. ML. 12, 13, 14, Capitulo 8 Enzimas: cinética e inhibicién Concentracién Producto por minuto, en mg de sustrafo mM Sin salicilato Con salicilato 15 O21 0,08 2.0 0,25 0,10 3,0 0,28 0,12 40 0,33 0.13 8.0 Oat 0.16 16.0 0,40 018 A partir de los siguientes datos de una reaccién enzimatica, deter- minese a) el tipo de inhibicién, 6) la Ky del sustrato y c) la Kr para el complejo enzima-inhibidor. Concentracién Producto por hora, en 1g de sustrato§ ——————__ mM Sin inhibidor Inhibidor 6 mM 2.0 139 88 3.0 179 121 4.0 213 149 10.0 313 257 15,0 370 313 La gliceroquinasa cataliza la reaccién Glicerina + ATP —> glicerofosfato + ADP Por adicién a la mezcla de reaccién de Ia sal de cromo del ATP, se obtuvieron los resultados siguientes: Concentracion ¥% (unidades arbitrarias) de ATP-cromo ae ae 2M 0,100 0050 0033 0,025 mM glicerina ° 500 40.0 333 333 10 625 6,06 6,06 5.88 20 345 313 308 3.23 30 238 2.27 235 2,33 a) Clasifiquese Ja inhibicién con respecto a su tipo. ) Caleilese el valor de la constante de inhibicién, K. En una reaccién de desplazamiento simple y ordenada, en la que Aves el sustrato conductor (primer sustrato) y B el sustrato siguiente; formilese la expresién algebraica de: a) la pendiente, 6) la intersec- cién, ¢) la coordenada horizontal del punto de interseccién y d) la coordenada vertical del punto de interseccién cuando 1/vg se re- presenta como funcién de 1/[B], a diferentes concentraciones cons- tantes de A. La nuclessido difosfato quinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato terminal del ATP a un difosfato de nucledsido que actia como aceptor. Los estudios cinéticos referentes a la reaccion ATP + UDP—> ADP + UTP han proporcionado los resultados siguientes, Las representaciones de i/vp frente a 1/[ATP], a diversas concentraciones constantes de UDP proporcionan rectas paralelas, y lo mismo ocurre con las representaciones de 1/vy frente a 1/{UTP] a concentraciones cons- tantes diferentes de ADP. Pudo verse que el ADP y el UDP son inhibidores mutuamente competitivos, igual que el ATP y el UTP. ‘Se vio también que el enzima cataliza reacciones de intercambio isot6pico entre el UTP y el UDP, y entre el ATP y el ADP. Propéngase un mecanismo compatible con estas observaciones. La glicerol deshidrogenasa cataliza la reaccién Glicerina + NAD* = dihidroxiacetona + NADH + Ht Se han descrito las siguientes propiedades del enzima procedente de Aerobacter aerogenes: las representaciones de 1/v) frente a 1/[glicerina] a diversas concentraciones constantes de NAD" pro- porcionan lineas rectas cuya interseccién se efectéa a la izquierda del eje 1/vq Andlogamente, las representaciones de 1/vo frente a 1/[NADH] 2 diversas concentraciones constantes de dihidroxiacetona muestran una interseccion a la izquierda del eje 1/vq El NADH resultS ser un inhibidor competitive con respecto al NAD", y la 221PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Gihidroxiacetona era un inhibidor acompetitivo con respecto al NAD‘, al igual que la glicerina con respecto al NADH a concentraciones clevadas de los sustratos constantes. Propéngase un mecanismo que sea compatible con las observaciones anteriores. 15. La citrato sintetasa cataliza la reaccion Acetil-CoA + oxalacetato = CoA + citrato ‘Al estudiar las propiedades cinéticas del enzima de cerebro de rata, se obtuvieron los siguientes resultados. Las representaciones de 1/vs frente a 1/[acetil-CoA] a diversas concentraciones constantes de oxalacetato proporcionan un conjunto de lineas rectas cuya inter- seccién estaba a la izquierda del eje 1/v. Se obtuvieron resultados semejantes cuando se emplearon como sustrato variable el oxalace- tato, el coenzima A y el citrato. Los estudios de inhibicién mostraron que el acetil-CoA y el Coenzima A eran mutuamente competitivos, mientras que el citrato era un inhibidor competitivo del oxalacetato y del acetil-CoA. Propéngase un mecanismo cinético que sea compa tible con estas observaciones. 222