CAPITULO 1 2 Nucleétidos y estructura covalente de los 4cidos nucleicos EI Acido desoxirribonucleico (DNA) y el acido ribonucleico (RNA) son macromoléculas catenarias que actiian en el alma- cenamiento y en la transferencia de la informacién genética. Son componentes principales de las células, y constituyen, en conjunto, entre el 5 y el 15 por ciento de su peso seco. Los acidos nucleicos estan también presentes en los virus, com- plejos de proteina y de acido nucleico infecciosos capaces de dirigir su propia réplica al infectar a una célula huésped especifica, Aunque los acidos nucleicos reciben esta denomi- nacién porque el DNA fue aislado por primera vez, del nucleo celular, tanto el DNA como el RNA se encuentran, también, en otras partes de las células. Al igual que los aminodcidos son los sillares, 0 unidades monémeras, de los polipéptidos, los nucleatidos son las uni- dades monémeras de los acidos nucleicos. La analogia entre las proteinas y los acidos nucleicos puede atin Hevarse mas lejos. Asi como un tipo de molécula proteica se distingue de otra, por la secuencia de las cadenas laterales caracteristicas, © grupos R, de los aminodcidos monémeros, cada tipo de acido nucleico se distingue por la secuencia de las bases heteroci- clicas caracteristicas de sus monémeros nucleotidicos. En este capitulo estudiaremos, en primer lugar, la estructura y las propiedades de los nucleétidos que sirven no solamente de sillares de los acidos nucleicos, sino que también desempe- fian importantes funciones en el metabolismo intermediario. Se examinara después la estructura del esqueleto covalente del DNA y del RNA y el problema de la deduccién de la se- cuencia de las unidades nucleotidicas en los acidos nucleicos. Finalmente examinaremos algunas estructuras particuladas supramoleculares que contienen Acidos nucleicos, especialmen- te los ribosomas y los virus. La estructura tridimensional y la funcién biolégica de los acidos nucleicos en el almacenamiento y en la transferencia de Ja informacién genética, se desarrollan en la parte 4, que comienza en la pagina 865. Estructura general de los nucleétidos Las unidades monémeras del DNA se Ilaman desoxirribonu- cletidos y las del RNA, ribonuclestidos. Cada nucleétido contiene tres componentes caracteristicos: 1) Una base ni- Ee)PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Figura 12-1 Ribonucledtides y desosicribonuclestides principales. (A la derecha) Modelo espacial del acido adenilico. Ribonuclessido-5'- 2/-Desoxirribonucle6sido- smonofosfatos '3’-monofosfatos Base ox HO—F—0-Git, 0 O Nt ou On Estructura general Estructura general Nombres Nombres Acido adenosin-5’-fosférico Acido desoxiadenosin-5'-fosférico (écido adenilico; AMP) (acido desoxiadenilico; dAMP) Modelo espacial compacto de Acido adenilico (forma aniénica ‘Acido guanosin-5'-fosférico Acido desoxiguanosin-5'-fosférico fenilico (forma anténica) (@cido guanilico; GMP) (fcido desoxiguanilico: (GMP) Acido citidin-5'-forf6rico Acido desoxictidin-5-fosf6rico (écido citidiico; CMP) (acido desoxicitidlico; CMP) Acido uridin-5’-fosférico Acido desoxitimidin-5'-fosf6rico (Gcido uridilico; UMP) (acido desoxitimiditico; €TMP) trogenada heterociclica, que es un derivado de la purina o de la pirimidina; 2) una pentosa, y 3) una molécula de acido fosférico, En Ja figura 12-1 se muestran los nucleétidos prin- cipales, Los componentes principales de los DNAs son cuatro des- oxirribonucle6tidos diferentes (fig. 12-1); difieren entre si so- lamente sus bases nitrogenadas componentes, de las cuales teciben el nombre. Las cuatro bases caracteristicas de las uni- dades desoxirribonucleétidas del DNA son los derivados pu- rinicos adenina y guanina y los derivados de la pirimidina citosina y, timina (fig. 12-2), De modo semejante, son cuatro ribonucleotidos diferentes los componentes principales de los RNAs (fig. 12-1); contienen las bases purinicas adenina y guanina, y las bases pirimidinicas citosina y uracilo (figu- ra 12-2), Asi la timina, que es el 5-metiluracilo, se halla pre- sente de modo caracteristico en el DNA, pero no es habitual . en el RNA, mientras que el uracilo se halla normalmente, presente en el RNA, y sélo muy raras veces en e! DNA. La otra diferencia de composicién entré estas dos clases de Acidos nucleicos, es que los desoxirribonuclestidos contienen, como pentosa, a la 2-desoxi-p-ribosa, mientras que los ribonu- cleétidos contienen D-ribosa. Ambos aziicares se encuentran en la forma de furanosa en los nucleétidos. Las propiedades fisi- cas y quimicas de éstos y otros aziicares se describen en el capitulo 10 (pag. 255). La pentosa esté unida a la base por un enlace f-N-glucosilo establecido entre el atomo de car- bono 1 de la pentosa y el atomo de nitrégeno 9 de las bases purinicas 0 el atomo de nitrégeno 1 de las bases pirimidi- nicas. El grupo fosfato de los nucleétidos se halla unido me- diante enlace éster al atomo de carbono 5 de la pentosa. Cuando el grupo fosfato de un nucleétido se separa por hidrélisis, la estructura residual recibe el nombre de nucledsid 316Ficura 12-2 Estructuras y modelos espaciales de las bases purinicas y pirimidinicas corrientes. NZESC | HCG 9 ON 9 / Adenina (6-aminopurina) Oo a Ne ao | of da HNC 9 SO H Guanina (2-amino-6-oxopurina) Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los acidos nucleicos Por tanto, los nuclestidos son los 5'-fosfatos de los nucles- sidos correspondientes (fig. 12-1). Mas adelante veremos que las células también contienen los 5’-difosfatos y los 5'-trifos- fatos de los nucleésidos corrientes; de aqui que se incluya la letra M de mono en las abreviaturas de los nuclestidos (Eigu- ra 12-1). A continuacién examinaremos mas minuciosamente las pro- piedades de los componentes de los nucle6tidos, comenzando por las bases nitrogenadas, puesto que ellas son las que co- munican a las unidades nucleotidicas monémeras del DNA y del RNA sus individualidades quimicas. Purinas y pirimidinas Los compuestos originarios de las dos clases de bases nitro- genadas halladas en los nuclestidos son los compuestos hete- rociclicos pirimidina y purina (fig. 12-2), que poseen acusado caracter aromatico. La propia purina puede considerarse como H < NOON eu neg ot ay Pirimidina, el compuesto originario Uracilo (2.4-dioxopirimidina) G-metil-2 4-dioxopirimidina) Citosina (4-amino-2-oxopirimidina) 317PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS un derivado de la pirimidina; esta constituida por un anillo de pirimidina y otro de imidazol condensados. Las bases nitro- genadas principales que se encuentran en los nuclestidos (figu- ra 12-2), son tres derivados de la pirimidina, el uracilo, la timina y la citosina, y dos derivados de la purina, la adenina y la guanina. En forma libre o no combinada estas bases se encuentran solamente en cantidades minimas o trazas en las células, generalmente como productos de la hidrélisis enzi- miatica de los acidos nucleicos y de los nucleétidos, La estructura tridimensional precisa de las diversas putinas y pirimidinas ha sido deducida por anélisis de difraccién de rayos X. Las pirimidinas son moléculas planares; las purinas son casi aproximadamente planares, con un fruncido muy ligero. En la figura 12-3 se muestran las dimensiones exactas de la adenina, y los modelos espaciales de las purinas y de las _ pirimidinas aparecen en la figura 12-2. Para la funcién biolgi- ca de los acidos nucleicos son de crucial importancia no sola- mente las dimensiones de las bases sino también su capacidad. para la formacién de enlaces de hidrégeno (cap. 31, pag. 877). Los grupos funcionales importantes que intervienen en la for- macién de los enlaces de hidrégeno son los grupos amino de la adenina, la guanina y la citosina, los grupos —NH— del anillo en la posicién 1 de la adenina y de la guanina y la posicién 3 de las bases de pirimidina, asi como los atomos de oxigeno fuertemente electronegativos que estan situados en la posicién 2 de las pirimidinas y en la posicién 6 de la guanina (fig. 12-2). Las bases pirimidinicas y purinicas libres son relativamente insolubles en el agua. Son compuestos basicos débiles que pueden existir en dos 0 més formas taut6meras segin su pH. El uracilo, por ejemplo, aparece en las formas de lactama y de lactima (fig. 12-4); a pH 7,0 la forma lactama del uracilo es la que predomina: Las estructuras de las demés purinas y pi- rimidinas que aparecen en la figura 12-2 son las formas tauté- meras que predominan a pH 7,0. Son éstas, también, las formas responsables de los enlaces de hidrégeno que se esta- blecen entre las bases en Jas moléculas nativas de DNA, como veremos mas adelante (cap. 31, pag. 877). Ademas de las bases corrientes anteriormente mencionadas, existen en algunos Acidos nucleicos pequefias cantidades de otros muchos derivados de la purina y la pirimidina: son las lla- madas bases raras 0 menores. Entre las pirimidinas menores se encuentran la 5-metilcito: y la 5-hidroximetilcitosina; entre las purinas de menor frecuencia se incluyen la 6-metiladenina y la 2-metilguanina (fig. 12-5). Estas y otras bases menores vienen relacionadas en la tabla 12-1; la mayor parte de ellas son derivados metilicos de las bases principales, pero algunas contienen grupos acetilo, isopentenilo o hidroximetilo. Las bases menores tienen especial importancia en los RNAs de transferencia (pag. 327), que contienen de modo caracteristico, hasta un 10 por ciento de estos componentes poco frecuentes. En los tRNAs se han hallado hasta 30 clases diferentes de bases menores. Todas las bases de purina y de pirimidina de los acidos nucleicos absorben fuertemente la luz ultravioleta en la re- gién de 250 a 280 nm. Esta propiedad es muy til para el reconocimiento y determinacién cuantitativa no solamente de las bases libres, sino también de los nucledsidos y nucleétidos. 318 Figura 12-3 Dimensiones de fa molécula de adenina. 0,134 nm 0,132 nm 0,134 nm J 0138 /y Figura 124 Formas tautémeras del uracilo. Doble lactimaTata 12-1. Otras bases poco frecuentes halladas en los Acidos nuucleicos. 56-Dihidrouracilo 1-Metiluracilo 3-Metiluractlo 5-Hidroximetiluracilo 2-Tiouracilo N-Acetilcitosina 3-Metilcitosina 5-Metilcitosina 5-Hidroximetileitosina 1-Metiladenina 2-Metiladenina 7-Metiladenina N*-Metiladenina NN*Dimetiladenina ‘N‘(62-Isopentent) adenina 1-Metilguanina 7-Metilguanina NMetilguanina N4N-Dimetilguanina Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los écidos nucleicos Fioura 12-5 Algunas bases menores. Des purinas menores Dos pirimidinas menores ead fe nese nANo—cy, oko aL Hq H 6-Metiladenina 5-Metilcitosina a “ nyc “a we “ig coH CH.NH—C3 3 omc, aH 2-Metilguanina 5-Hidrotimeicttosina Las bases de purina y de pirimidina libres pueden separarse con facilidad por métodos cromatagraficos o electroforéticos, Nucledsidos Existen dos series de nucleésidos: los ribonucledsidos, que contienen D-ribosa como componente glucidico, y los desoxirri- bonucledsidos, que contienen 2-desoxi-p-ribosa (fig. 12-6). Al igual que las purinas y las pirimidinas libres, los nucleésidos libres slo se encuentran en cantidades minimas en la mayoria de las células, como productos de la hidrélisis quimica o en- zimatica de los nucledtidos, Los nucleésidos son mucho mas solubles en el agua que las correspondientes bases libres. Pue~ den separarse e identificarse con facilidad por métodos croma~ tograficos. Al igual que los glucésidos (pag. 262), los nucles- sidos son relativamente estables frente a los Alcalis. Los nu- cle6sidos purinicos se hidrolizan con cierta facilidad con los Acidos para liberar la pentosa y la base libre. Sin embargo, los nucleésidos pirimidinicos son resistentes frente a la hidré- lisis 4cida. Ambos tipos de nucleésidos se hidrolizan por nucleosidasas especificas, Figura 12-6 Nucledsidos de adenina. 2’-Desoxiadenosina 2'-desoxi-D-ribofuranosiladenina) (9-f-p-ribofuranosiladenina) @-f 319PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ficura 12-7 Ley de Lambert-Beer, espectros de absorcién de los nucledtidos corrientes € indices de absorbancia molar a 280 nm. La medida de ta absorcién de la luz constituye un instrumento importante para el anilisis de los nucledtidos y fos acidos nucleicos (pags. 346, 886 y 887). La fraccién de la luz incidente absorbida por una disolucion, a una determinada longitud de onda, esté relacionada con el espesor de la capa absorbente y con la concentracién de la especie que absorbe. Ambas relaciones se combinan en la ley de Lambert-Beer, que aparece en forma integrada: Jog el donde I, es la intensidad de la tuz incidente, I la intensidad de la luz transmitida, e el coeficiente de absorcién molar (en unidades de litzos por mol-m), c la concentracién de la especie absorbente en moles por litro y | ell espesor de la muestra absorbente de luz, en centimetros. La ley de Lambert-Beer supone que la luz incidente es paralela y monocromética, y que las moléculas del disolvente y ef soluto estén orientadas al azar. La expresion log Io/I se denomina absorbancia y se designa por A. Es importante observar que cada milimetro de espesor de una disolucién absorbente en una cubeta de 1,0 cm no absorbe una cantidad constante, sino més bien una fraccién constante de la luz incidente. Sin embargo, con una capa absorbente de espesor constante absorbancia A es directamente proporcional a la concentracién del soluto absorbente. El coeficiente de absorcién molar varia con 1a naturaleza del compuesto absorbente. con el disolvente y con la longitud de ond: y puede variar también con el pH si la especie absorbente de la luz se halla en equilibrio con otras especies poseedoras de diferentes espectros mediante pérdida 0 ganancia de protones. A Ia derecha se muestran los espectros (pH 7,0) de los ribonuclestidos de purina (superior) y de los nucledtides de pirimidina (inferior). Los espectros de los correspondientes ribo- y desoxirribonucledtidos, ast como de los nucledsidos, son esencialmente idénticos. Cuando se miden mezclas de nuclestidos se emplea generalmente la longitud de onda de 260 nm (ineas verticales punteadas). La Tabla da los valores de ¢ a 260 nm y pH 7.0. Nucleétidos Los ribonuclestidos y los desoxitribonucleétidos se encuentran libres en las células en cantidades significativas. Sus grupos fosférico son Acidos relativamente fuertes, a pH 7,0 los nu- cleétidos libres pueden existir principalmente en la forma N—O—PO;, en la que N es el grupo nucleésido. Debido a la presencia de una base purinica o pirimidinica, todos los nuclestidos muestran una fuerte absorcién en Ja zona de 250 a 280 nm del ultravioleta, lo que resulta muy dtil para su andlisis cuantitativo. La figura 12-7 muestra el espectro ultra- violeta caracteristico de algunos nucledtidos. Los nucleétidos pueden separarse con facilidad y determinarse cuantitativa- mente mediante cromatografia de intercambio iénico. Tanto los nucleésidos como los nucleétidos contienen dos anillos casi planares, el de la base y el de la ribofuranosa. En la conformaci6n mas estable de los nucleésidos estos ani- Mos no son coplanares, sino que practicamente forman entre Jos dos un Angulo recto, situando al hidrégeno 0 al hidroxilo 2’, del anillo de ribofuranosa, muy préximo al atomo de nitrégeno 3 de las purinas o al &tomo de oxigeno 2 de las pirimidinas. Veremos més adelante (cap. 31, pag. 875), que esta con- formacién de los nucleétidos aparece también en las moléculas intactas de los cidos nucleicos. 320 1 1 1 x10 230 240 250 260 270 280 Longitud de onda 2 9] 230 240 250 260 270 280 Longitud de onda Coeficiente de absorcién molar de los nuclestidos AMP 15 400 GMP * 11700 CMP 7.500 UMP 9.900 aTMP 9.200Ficura 12-8 Estructura general de los 5'-mono, 5'-di xy S'-trifosfatos de los nucledsidos (NMPs, NDPs y NTPs). En los correspon- dientes fosfatos de desoxirribonucleésidos (aNMPs, dNDPs y dNTPs) la pentosa es la 2desoxi-o-ribosa. Los atomos de hidrogeno disociables (pH 7.0) aparecen en color. Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los acidos nucleicos Nucledsido 5'-difosfatos y 5'-trifosfatos Todos los ribonucleésidos y desoxirribonucleésidos corrientes aparecen en las células no solamente en forma de 5’-monofos- fatos, como se ha dicho anteriormente, sino también en forma de 5’-difosfatos y 5’-trifosfatos, es decir, como ésteres 5’-piro- fosforicos y 5'-trifosféricos de los nucledsidos (fig. 12-8) Tenemos, por tanto, tres series de nucledsidos 5’-fosforilados; esto es, para la adenosina hay el 5’-monofos| nosina (AMP), el S'difosfato de adenosina (ADP) y el S‘trifosfato de adenosina (ATP). Los restos fosféricos de estos compuestos se designan mediante los simbolos @, 8 y y (fig. 12-8). Los acidos 5’-difosféricos de los nucleésidos y los 5’-trifos- foricos, designados genéricamente por NDPs y NTPs, son acidos relativamente fuertes, que en su disociacién producen tres 0 cuatro protones, respectivamente, procedentes de sus grupos fosféricos condensados. Los grupos fosféricos conden- sados de los NDPs y NTPs forman complejos con cationes divalentes tales como el Mg* y el Ca*, Debido a la relativa- mente elevada concentracién de Mg’ del citoplasma, los nu- cleésido-5’-difosfatos y 5’-trifosfatos se dan fundamentalmen- te en forma de complejos con el magnesio en la célula intacta. EI significado de estos complejos se estudiard ms adelante en el capitulo 15 (pg. 412). El grupo fosfato terminal de los NDPs y NTPs, puede separarse selectivamente por la accién de enzimas especificos sin que se escindan los demas enlaces. Ademas, los grupos fosfato 8 y y de los NTPs y el grupo B-fosfato de los NDPs se hidrolizan para rendir fosfato inor- Abreviaturas de los ribonucledsido 5'-fosfatos Base Mono- Die Tri- Adenina = AMP ADP ATP. Guanina = GMP GDP_—s GTP Citosina = CMP = CDP_— CTP. Uracilo UMP UDP_—sUUTP Abreviaturas de los desoxi rribonucledsido 5'-fosfatos Base Mono- — Di- Tri Adenina = dAMP dADP_— dATP Guanina © dGMP_-=—«dGDP_—s dGTP Citosina © dCMP = dCDP_— dCTP. Timina dTMp = dTDP_ dTTP 321PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS ganico por calefaccién a 100°C en HCI 1 N durante 7 min; en contraposicién, el grupo a 6 5’-fosfato de los NMPs es estable frente a este tratamiento. Esta diferencia permite un simple analisis de la suma de los NTPs y NDPs en las mez- clas con NMPs. Los NTPs desempefian cierto mimero de funciones impor- tantes. El ATP es un transportador de fosfato y de pirofos- fato en diversas reacciones enzimaticas importantes implicadas en la transferencia de energia quimica (cap. 15). Después de la desfosforilaci6n del ATP en tales reacciones, el ADP for- mado se refosforila a ATP durante la respiracién. Aunque el sistema ATP-ADP es el sistema primario.o principal para la transferencia de grupos fosfato en la célula, los demas NTPs,.a saber, el GTP, el UTP y el CTP, canalizan tam- bién la energia quimica hacia rutas biosintéticas especificas (cap. 15). Una segunda funcién principal de los NTPs y NDPs es la de actuar a modo de coenzimas como transportadores ener- gizados de tipos especificos de moléculas sillares. Por ejemplo, el difosfato de uridina (UDP) es un transportador especifico de los restos de azicar en la biosintesis de los polisacaridos; asi, el uridin-difosfo-glucosa (fig. 12-9) es el dador especifico de restos de glucosa en la biosintesis enzimatica del glucégeno. De un modo anélogo, el citidin-difosfo-colina, es un dador de fosfocolina en la biosintesis enzimatica de los fosfoglicéridos de colina (fig. 12-9), La tercera funcién principal de los NTPs y NDPs es la de actuar como precursores de elevado contenido energético de las unidades mononucleotidicas en la biosintesis enzimatica del DNA y del RNA. Durante estas reacciones, los dNTPs y los NTPs pierden sus grupos pirofosfato terminales trans- formandose en restos de monofosfatos de nucledsidos de los acidos nucleicos. En estas tres funciones de los NTPs y los dNTPs, la energia quimica inherente a los grupos fosfato 8 y y se utiliza para ayudar a formar nuevos enlaces covalentes (caps. 23 a 26 y 31). Otros nuclestidos Ademés de los nucleésidos 5’-fosfatos que acabamos de des- cribir, se encuentran biolégicamente nucledtidos que tienen sus grupos fosfatos en otras posiciones (figs. 12-10 y 12-11). Los 2',3'-fosfatos-ciclicos de_ribonucledsidos son intermedia- ios y los 3’-fosfatos de ribonucledsidos son productos finales de la hidrélisis de ciertos enlaces del RNA por la accién de algunas ribonucleasas. Estos compuestos se forman también durante la hidrélisis del RNA por los 4lcalis, tal como ocurre con los 2'-fosfatos de los ribonucleésidos (fig. 12-10). Dos nucleétidos muy importantes desempefian un papel clave en la accién bioquimica de cierto nimero de hormonas: el 3'5'-fosfato ciclico de adenosina (abreviadamente AMP ci- clico, o cAMP) y el 3’5'-fosfato ciclico de_guanosina (abre- viadamente GMP ciclico, 0 cGMP) (fig. 12-11). El AMP ciclico se produce en las células eucariéticas a partir del ATP por un enzima localizado en la membrana celular, la adenilato- ciclasa, que es estimulada por ciertas hormonas aportadas por el torrente sanguineo (cap. 29, pag. 822). El AMP ciclico recibe el nombre de segundo mensajero porque transmite y 322 Ficura 12-9 Uridin-difosto-glucosa y citidin-difosfo- colina. Las porciones de glucosa y de colina aparecen en color. OH OH ‘Uridin-difosfo-glucosa (UDPG) CH CH,—N—CH, Gt un Ge Ce 0-botos ry Citidin-difosfo-colinaFigura 12-10 Algunos monofosfatos de adenosina. Los fosfatos 2- 3'- y 2.3'-ciclicos de adenosina son productos intermedios en la hidrélisis del acido ribonucleico por Sicali, Véase también la figura 12-11. Adenina Ht HO—p—o—CH, Nt ‘OH OH Acido adenosin-5'-fosférico + Adenina Acido adenosin-3'-fosférico Adenina HO—CH, 0. HOH, Ho—f—oH ° Acido adenosin-2'-fosforico Adenina HO—CH, 0, H Ht on Acido adenosin-2',3'-fosférico ciclico Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los écidos nucleicos Figura 12-11 Tres ruclectidos que muestran actividad en los mecanismos reguladores, Adenina Ca, 0, Ney o=p—o du on Acido adenosin-3',5'-fosf6rico ciclico (AMP-ciclico; cAMP) o=P. Acido guanosin.3'5'-fosférico ciclico (GMP ciclico, cGMP) 5'-difostate-3'-difestato de guanosina (lamado también tetrafosfato de guanosina) amplifica en el interior de la célula las sefiales quimicas que le Ilegan a través de la sangre mediante las hormonas, que son los primeros mensajeros, Otros dos nucleétidos importan-, tes, cuya participacién en la regulacién de la transcripcién de Jos genes en las bacterias es conocida en la actualidad, son el 5'-difosfato 3'-difosfato de guanosina (abreviadamente ppGpp) (fig. 12-11) y el 5'-trifosfato-3'-difosfato de sina (pppGpp) (fig. 12-11). Muchos coenzimas son nucledtidos o derivados de nucle6- tidos; se estudiaran en el capitulo siguiente (pag. 341). Acidos nucleicos El Acido desoxirribonucleico (DNA) esta constituido por ca- denas de desoxirribonucleétidos unidos covalentemente, y el Acido ribonucleico (RNA) esta integrado por cadenas de ri- bonucleétidos. El DNA y el RNA tienen en comin cierto 323PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CBLULAS ntimero de propiedades quimicas y fisicas, debido a que en ambos, las sucesivas unidades nucleotidicas se hallan unidas covalentemente de idéntica manera mediante puentes fosfo- diéster establecidos entre el grupo 5’-hidroxilo de un nucleé- tido y el grupo 3’-hidroxilo del siguiente (fig. 12-12). De este modo, el esqueleto de ambos, DNA y RNA, esta constituido por grupos alternantes de fosfato y de pentosa, en los que Jos puentes fosfodiéster proporcionan una continuidad cova- lente. Las bases de purina y de pirimidina de las unidades nucleotidicas no se encuentran en la estructura del esqueleto, sino que constituyen cadenas laterales diferenciadas, lo mismo que los grupos R de los restos aminoacidos son las cadenas laterales distintivas de los polipéptidos. Antes de proceder a un examen ulterior de las propieda- des quimicas de Ia estructura del esqueleto de los acidos nu- cleicos, esquematizaremos brevemente la clasificacién, la com- Base Base | I » CH, 0. CH, NE BAL NE BAL oH ° on HO—P=0 HO—P=0 4 Base | Base I ‘CH, 324 Figura 12-12 Estructura del esqueleto covalente de las cadenas de los &cidos nucleicos.Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los acidos nucleicos posicién quimica y la funcién de los tipos principales de acidos nucleicos, temas que se desarrollaran mas adelante en la Par- te 4 (pag. 865). DNA El DNA fue aislado por primera vez de las células de pus y del esperma de salmén) e intensamente estudiado por el suizo Friedrich Miescher, en una serie de investigaciones co- menzadas en 1869, Lo llamé de la estructura de los polinuclestidos. Las lineas verticales representan el esqueleto de la pentosa, los nimeros 3’ y 5° los étomos de carbono de la pentosa, y P el grupo fosférico. Los diagramas siempre muestran los enlaces fosfodiéster 3, 5’ que van de izquierda a derecha. La notacién taquigrafica para los oligodesoxirribonuclestidos puede incluir el prefijo d si se necesita. término 5 término 3° a 5 » |e |e P| ‘ep | ‘pe | Sp sv Ne Ne No Adenina Citosina Guanina Guanina pU-A-C-Gp Los enlaces a (3) y b (5') (en color) de los enlaces internucleotidicos.Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los acidos nucleicos El DNA no resulta hidrolizado por los 4lcalis diluidos, mientras que el RNA si lo es, debido a los grupos 2'-hidro- xilo que contiene. La disolucién diluida de hidréxido sédico produce, a partir del RNA, una mezcla de 2’- y 3'-fosfatos de nucleésido (fig. 12-10). Los primeros productos de la ac- cién de los Alcalis sobre el RNA son los 2’,3’-monofosfatos ciclicos, que son intermediarios obligatorios; son hidrolizados ulteriormente por el alcali, que ataca a uno o a los dos en- laces P—O—C, para rendir una mezcla de 2’ y 3’-monofos- fatos de nucleésido (fig. 12-10). El descubrimiento de este mecanismo explica por qué el DNA no se hidroliza por las bases: el DNA no posee grupos hidroxilo 2’, y por ello no puede formar los 2’, 3’-monofosfatos ciclicos intermedios; estos fosfatos ciclicos nucleosidicos son también intermediarios en la accién de algunas ribonucleasas (véase mas adelante). La ruptura hidrolitica selectiva de los polinucledtidos por métodos quimicos o enzimaticos se emplea en la determinacién de la secuencia de bases de los acidos nucleicos, que se aborda, en principio, con la misma légica que la empleada en el ana- lisis secuencial de las proteinas (pag. 101). Hidrélisis enzimAtica de los acidos nucleicos Los Acidos nucleicos ingeridos por los animales experimentan hidrélisis enzimatica en el intestino por la accién de las nu- cleasas secretadas por el pancreas. Estos y otros enzimas capaces de hidrolizar a los acidos nucleicos constituyen im- portantes instrumentos para el anilisis de la secuencia nucleo- tidica. Los puentes fosfodiéster del DNA y del RNA son atacados por dos clases de enzimas, designados por a y b (0 3’ y 5‘) en la figura 12-14, y en la tabla 12-4, segin cual sea el lado del puente fosfodiéster que es atacado. Los en- zimas a, 6 3’ hidrolizan especificamente el enlace éster entre el carbono 3’ y el grupo fosférico, y los enzimas b, 6 5’, hidro- lizan el enlace éster entre el grupo fosférico y el carbono 5° del puente fosfodiéster, (fig. 12-14). El enzima mejor cono- cido de la clase 2 es una fosfodiesterasa del veneno de ser- piente de cascabel 0 vibora’de Russell, que hidroliza todos Tanta 12-4, Especificidad de algunos enzimas que actéan sobre los acidos nucleicos. Enzima Exonucleasa Acido nucleico Especi Clase a (3°) nucleasas Fosfodiesterasa de veneno de serpiente DNA y RNA Parte del extremo 3° Endonucleasa Desoxirribonucleasa I DNA Algunos enlaces 3” Clase b (5') nucleasas Exonucleasa Fosfodiesterasa de bazo DNA y RNA Parte del extremo 5” Endonucleasas Desoxirribonucleasa IL DNA Algunos enlaces 5 Ribonucleasa I (péncreas) RNA Enlaces 5” en los que el enlace 3’ esta establecido con un nuclestido de piri- midina Ribonucleasa T, (hongos) RNA Enlaces 5’ en los que el enlace 3’ se establece con un nuclestide de quanina 329PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Jos enlaces 3’ en el RNA 0 en el DNA, liberando casi todas las unidades de nucleétido en forma de 5’-fosfatos de nucle6- sido. El enzima necesita un grupo hidroxilo 3’ libre situado en el resto nucleotidico terminal, avanza escalonadamente par- tiendo de aquel extremo de la cadena polinucleotidica. Este enzima y todas las demas nucleasas que atacan solamente por los extremos de las cadenas polinucleotidicas se Maman exo- snucleasas. Los enzimas de la clase b estan representados por una fosfodiesterasa de bazo de buey, que es también una exonucleasa, la cual hidroliza todos los enlaces b, 6 5’ tanto del DNA como del RNA y libera asi solamente 3’-fosfatos de nucledsido, Comienza su ataque por el extremo de la ca- dena que posee un grupo 5’-hidroxilo libre. Las endonucleasas no necesitan la existencia de ningin grupo 3’ 6 5'-hidroxilo libre en el extremo de la cadena; ata- can a ciertos enlaces 3’ 6 5’ en cualquier punto de la cadena polinucleotidica en que se hallen. La desoxirribonucleasa I del pancreas de buey, que es una endonucleasa, cataliza la hidr6- lisis de algunos de los enlaces a, 6 3’ del DNA para rendir oligonuclestides que contienen por término medio unos cuatro restos nucleotidicos. Otra endonucleasa, la desoxirribonuclea- sa II, aislada del bazo, del timo o de diversas bacterias, hidro- liza algunos de los enlaces b 6 5’, (tabla 12-4). EI RNA puede también ser degradado de modo anélogo por nucleasas especificas del RNA. La ribonucleasa I cristalizada del pancreas de buey (pag. 233) es una endonucleasa; hidro- liza los enlaces 5’ del RNA en los que el enlace 3’ est fijado a un nucle6tido de pirimidina (fig. 12-14 y tabla 12-4). Por tanto, los productos finales de la accién de la ribonucleasa son 3'-fosfatos de nucleésidos de pirimidina y oligonucledtidos que finalizan en restos de 3’-fosfatos de pirimidina. Un inter- mediario obligatorio es un resto de 2’, 3’-fosfato de pirimidina ciclico, que luego es hidrolizado selectivamente para dar el resto de 3’-fosfato de pirimidina terminal. La ribonucleasa T; del hongo Aspergillus oryzae hidroliza enlaces b 6 5’ entre los restos 3’-guanilato y el carbono 5’ del residuo adyacente. Cierto nimero de otras nucleasas con diferentes tipos de es- pecificidad nucleotidica son importantes instrumentos para la fragmentacién de los acidos nucleicos y para la determinacién de sus secuencias nucleotidicas. Analisis de la secuencia nucleotidica en: los acidos nucleicos Puesto que la secuencia nucleotidica de los diversos tipos de Acidos nucleicos es el método. primario del almacenamiento y transmisién de la informacién genética, la identificacién expe- rimental de tales secuencias constituye un problema capital de la genética bioquimica. Igual que la hidrélisis selectiva de algunos enlaces pepti- dicos por enzimas especificos ha hecho posible la fragmenta- cién dirigida de los polipéptidos para el anélisis de la se- cuencia aminoacida (cap. 5, pag. 108), la hidrélisis selectiva de los enlaces internucleotidicos permite la fragmentacién di- rigida de los acidos nucleicos. Sin embargo, el andlisis de la secuencia es generalmente ms dificil en el caso de los acidos nucleicos. Dado que solamente son cuatro los nuclestidos principales de los acidos nucleicos, mientras que las proteinas contienen 20 aminodcidos, el reconocimiento de las secuencias 330 Ficura 12-15 Anilisis de la secuencia nucleotidica del alanin-tRNA de levadura. En primer lugar se aislé el alanin-tRNA de todos los demés tRNAs mediante distribucién en contracorriente. La cadena intacta del tRNA (77 restos) fue después fragmentada en dos series de oligonuclestidos por la accién de dos ribonucleasas, una de pancreas (a, b,c, d) y la otra de un moho (e. £ g). Estos fragmentos fueron separados por cromatografia en columna. Después se hidrolizs completamente cada uno de los fragmentos para determinar su contenido en bases. A fin de analizar la secuencia de bases del tinico fragmento que se muestra, se emples fosfodiesterasa de veneno de serpiente para la sucesiva separacién de mononucledtidos de un extremo de la cadena (derecha). La cromatogeafia de la compleja mezcla resultante (parte inferior derecha de la figura) permitié la identificacién de la secuencia de bases en dicho fragmento. Se necesitaron repetidas escisiones y etapas cromatograficas. [R. Holley, Scientific American, 214: 30 (1966).]tRNA —_Fragmentos intacto oligonucleotidicos " 104 | 304 40+ 60. 704 fl Capitulo 12 Nucletidos y estructura covalente de los dcidos nucleicos distintivas de los nucleétidos es mas dificil porque las posibi- lidades de ambigiiedad son también mayores. El problema fue inicialmente abordado con los tRNAs, puesto que tienen cadenas relativamente cortas y pueden aislarse en forma pura. En 1965, R. W. Holley y colabora- dores, dedujeron la primera secuencia completa de un RNA, Jo cual constituy6 un logro experimental muy notable. El método de abordaje empleado fue, en principio, el introducido por Sanger para la determinacién de la secuencia aminoacida de las cadenas polipeptidicas (fig. 12-15). La cadena poli- nucleotidica de 77 términos del alanin-tRNA de la levadura se escindié en una serie de pequefios fragmentos oligonucleoti- dicos por la accién de nucleasas especificas. Una vez sepa- rados los fragmentos, se determinaron sus secuencias por la accién de exonucleasas (fig. 12-15), y la secuencia completa de la cadena del tRNA por encaje de los fragmentos, fue conseguida utilizando un segundo método de fragmentacién que proporcioné «solapados». El alanin-tRNA contiene nueve restos nucleotidicos con bases menores que sirven como mar- cadores de las diferentes partes de la cadena polinucleotidica. En la figura 12-16 aparece la secuencia de bases completa de este alanin-tRNA concreto de la levadura. En los tiltimos afios se han determinado las secuencias nu- Degradacién de un fragmento oligonucleotidico GCGG-AG-AG CCGAGA CECAG GCGGAGAGU = CCGA Coc cc Concentraciéa ——se G-GG-A-G-A-G-U Eluidos —— 331PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS Ficura 12-16 Secuencia de los nucledsidos del alanintRNA de levadura. Ademés de los simbolos A, G, U y C, se utilizan los siguientes para los mucleésidos que se indican: y = seudouridina, I = inosina, T = sibotimidina, hU = 5.6-dihidrouridina, mI = 1-metilinosina, mG = I-metilguanosina, m’, G = N'-dimetilguanosina. Los simbolos para los nucledsidos poco frecuentes aparecen en color. Los puntos entre las secciones paralelas muestran los puntos donde se establecen enlaces de hidrgeno entre bases complementarias (pig. 877). Todos los tRNAs tienen una estructura de hoja de trébol semejante. El anticodén especifico mostrado es el triplete nuclestido capaz de reconocer un codén para la alanina en la molécula de mRNA. En el capitulo 33 (pag. 947) se dan otras caracteristicas de la estructura del RNA [Reproducido de E. W. Holley, J. Apgar, G. A. Everett, J. T. Madison, M. Marguisee, S. H. Merril, J. R. Penswick y A. Zamir, Science, 147, 1462 (1965)]. A Hi c i c 1 A f PG +c a GeG tot Gesu try C+G il Gc an uo to GHG GS u once P ~e-° OA Triplete anticodén cleotidicas completas de cerca de 40 moléculas diferentes de tRNAs de cierto nimero de aminoacidos diferentes, en varios organismos. A partir de esta informacién acerca de la secuencia se han deducido algunas conclusiones importantes sobre la conformacién de las moléculas de tRNA (pag. 947), la estructura de los anticodones de diversos aminodcidos (pa- gina 982), la evolucién de los tRNAs (pag. 983), asi como de la posible funcién de sus bases menores distintivas (pagi- na 982). Poco después de abrir brecha en la estructura del tRNA, F. Sanger y colaboradores determinaron la secuencia del RNA ribosémico 5S de E. coli, problema mas dificil ya que es de mayor longitud que los tRNA y no contiene bases poco fre- cuentes (fig. 12-17). Utilizaron la cromatografia bidimensio- 332Capitulo 12 Nuclestidos y estructura covalente de los acidos nucleicos Ficura 12-17 Secuencia nucleotidica del RNA 5S de E, coll. Contiene 120 restos nucledtidos. pU-G-C-C-U-G-6-C-6-6-C-6-6-U-A-G-C-6-C-6-G-U-G-G-U-CO-CA-CCUGACOCCAUGE-CGAACUCAGAAGU- -C-0-6-0-0-6-A-U-G-G-U-A-G-U-G-U-G-6-G-G-U-C-UCOC-CAUG-COG-AGAGUAG-EGAA- C-U-G-C.C-A-G-G-C-A-Usg OH GAAACG-C-CG. nal por ser un poderoso instrumento para la separacién de los fragmentos oligonucleotidicos. S. Spiegelman y sus cola- boradores han descrito la secuencia nucleotidica de un RNA que contiene 218 restos nucleotidicos. La determinaci6n de la secuencia nucleotidica de los DNAs es mucho mas dificil, ya que aun las menores moléculas de DNA contienen por lo menos 5000 unidades de nucleétido y. son, por tanto, mucho més largas que el tRNA y el RNA 5S. Ademis, las desoxirribonucleasas son mucho menos espe- cificas para ciertos enlaces internucleotidicos que las ribonu- cleasas. Sin embargo, se han conseguido ya avances de cierta importancia. Se ha descubierto una nueva clase de desoxirri- bonucleasas, llamadas endonucleasas de restriccién. que han resultado muy dtiles para la fragmentacién especifica del DNA. Estos enzimas bacterianos, éon especificidad de especie, pue- den escindir en ciertos puntos determinados, moléculas de DNA distintas de las que aparecen naturalmente en las células de las que derivan (pag. 893). Las endonucleasas restrictivas funcionan biolégicamente protegiendo a un organismo deter- minado de los efectos deletéreos de un DNA extrafio intro- ducido en Ia célula. Otro método de abordar el problema de la secuencia de los especimenes de DNA ha resultado posible por la modificacién quimica del DNA, por ejemplo, con obten- cién de dcidos apurinicos 6 apirimidinicos (pag. 328). Complejos supramoleculares proteina-Acido nucleico Algunos acidos nucleicos se encuentran en las células en forma de asociaciones no covalentes con proteinas especificas, constituyendo complejos supramoleculares (pag. 21). Entre estos sistemas proteina-dcido nucleico, que poseen estructuras y funciones biolégicas muy complejas, los ribosomas y los virus vienen a ser los mejor conocidos. Los sistemas proteina- 4cido nucleico mas complejos son quizé los cromosomas de las células eucaridticas (pag. 881). Ribosomas Los ribosomas son particulas de ribonucleoproteina que se en- cuentran en todos los tipos de células (pag. 21); son esencia- les en la biosintesis de las proteinas (pag. 941). Los ribosomas de las células procariéticas poseen un diémetro de alrededor de 18 nm, una masa de cerca de 2,8 megadaltones y un coefi- ciente de sedimentacién de 70 S. Estan constituidos por un 60 6 65 % de rRNA y alrededor de un 35 a 40 % de proteina (fig. 12-18). Una célula de E. coli contiene cerca de 15000 ribosomas, lo cual corresponde casi a un 25 % del peso seco de la célula. Los ribosomas citoplasmicos de las cé- lulas eucariéticas son mayores y varian algo en tamafio en 333PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS los diferentes organismos; poseen un didmetro de 20 a 22 nm y un coeficiente de sedimentacién de 73S a 80S. La mayor parte de los ribosomas se encuentran en el citoplasma, en forma libre o unidos a la superficie del reticulo endoplasma- tico (pags. 35 y 962). En las células eucaridticas, se encuen- tran también ribosomas en el ntcleo celular y en organulos como las mitocondrias y los cloroplastos; los ribosomas mito- condriales son menores que los ribosomas citoplasmicos (pa- gina 962). Muchos de los ribosomas, tanto procariotas como eucariotas, se hallan asociadas en forma de rosarios Ilamados polirribosomas o simplemente polisomas, que se forman por Ja unién de cierto nimero de ribosomas a una molécula inica de mRNA durante Ia sintesis proteinica (pag. 959). Los ribosomas de todas las células estén construidos de acuerdo con un mismo plan arquitecténico. Poseen dos sub- unidades de tamafio desigual (fig. 12-18). En los ribosomas de E. coli, las subunidades poseen coeficientes de sedimenta- cién de 30S y 50S (peso de particula de 1,0 y 1,8 megadalto- nes, respectivamente). La subunidad 50S contiene una molé- cula de RNA 23S y una molécula de rRNA 5S; la subunidad 30S contiene una molécula de rRNA 16S. Ambas subunida- des contienen un gran ntimero de cadenas polipeptidicas dife- rentes. Los ribosomas eucariéticos contienen moléculas de rRNA mayores y mas cadenas polipeptidicas que los riboso- mas procariéticos (fig. 12-18). Los ribosomas son estables en disoluciones que contengan una concentracién relativamente alta de Mg’, pero pueden disociarse en sus subunidades cuan- do la concentracién de Mg? disminuye. En los capitulos 33 y 36 se estudia la estructura y funcién de los ribosomas de manera mas detallada. En la actualidad se sabe ya mucho acerca de la organizacién estructural y del modo cémo se ensamblan los ribosomas pro- cariéticos. La exposicién de las subunidades ribosémicas a disoluciones concentradas de sales determina la extraccién secuencial de una serie de componentes proteicos especificos. La eliminacién de estas proteinas proporciona un niicleo que contiene el rRNA y cierto nimero de proteinas mas intima- mente unidas. El ribosoma completo puede reconstituirse en- tonces a partir de estos niicleos, reponiendo las proteinas previamente extraidas. En el capitulo 36 (pag. 1037) se des- cribe el ensamblaje completo de los ribosomas bacterianos. Virus Los virus, que han sido descritos con toda propiedad como estructuras situadas en el «umbral de la vida», son particulas compuestas principalmente por acido nucleic y cierto ntimero de subunidades de proteina especifica; poseen la capacidad de dirigir su propia replicaci6n en una célula huésped espe- cifica. Pueden infectar a las células animales, a las vegetales y a las bacterianas. Los virus bacterianos se Ilaman también bacteriéfagos. Muchas enfermedades humanas como por ejem- plo la poliomielitis, la gripe y el resfriado comin, se transmi- ten por virus. Existe evidencia suficiente como para sugerir que algunos tipos de cdncer son causados o transmitidos por virus, al menos en algunas especies animales. Aunque los virus poseen pesos de particula muy grandes, pueden aislarse en forma homogénea y muchos han sido in- oar Fioura 12-18 Estructura de los ribosomas de las células procaristicas y eucaristicas. Estas tiltimas contienen dos tipos distintos de ribosomas: los citoplasmicos, que se ven abajo, y los mitocondriales. Estos iltimos guardan gran semejanza con los ribosomas procariéticos Ribosoma procariético (E. coli) 18 nm — 70s 28 megadaltones) ‘Subunidades 50S 30S (8 a megadaltones) ‘megadalton) 5S sRNA 16S rRNA + + 238 :RNA 20 cadenas + polipeptidicas 30 cadenas polipeptidicas Ribosomas eucariéticos (citoplésmicos) 20-22 nm —— 73-80S, a megadaltones) / soma 60S, 40S 7 (3 smegadaltones) megadaltones) 5S rRNA 18S rRNA + + 78 RNA >30 + cadenas 28S rRNA polipeptidicas + >50 cadenas polipeptidicas