Vitamins

VITAMIN C (ASCORBIC ACID)

B. IODINE TITRATION METHOD

I l

+ I2

Kadar Vitamin C = ml iodine x N iodine X BM Vitamin c x 100%

2 x berat sampel (gr) x 1000
 Prinsip analisis
Oksidasi vitamin C oleh iodin membentuk dehidro asam
askorbat :
C6H8O6(aq) + I2(aq) C6H6O6(aq) + 2 I- (aq) + 2 H+
Vitamin-C (ascorbic acid) (dehydroascorbic acid)

Due to this reaction the iodine formed is immediately

reduced to iodide as long as there is any ascorbic acid
present. Once all the ascorbic acid has been oxidised,
the excess iodine is free to react with the starch
indicator, forming the blue-black starch-iodine complex.
This is the endpoint of the titration
Titration of a colour-free Vitamin C tablet Analysis of Vitamin C in a commercial fruit juice

Analysis of Vitamin C in freshly Analysis of Vitamin C in red capsicum (pepper

squeezed orange juice
 B. 2,6 D TITRATION METHOD

In acidic solutions DCIP is red, but if ascorbic acid is present, it will be reduced
to a colorless substance. The solution will remain colorless as more DCIP is
added until all of the ascorbic acid has reacted. As soon as the next drop of
DCIP solution is added at the solution will be light red, due to the excess DCIP
and the end point of the titration has been reached.
Need standardization of the 2, 6-Dichloroindophenol solution once a day
with a solution of ascorbic acid with a known concentration
 Prinsip analisis
Ox: vitamin Cred vitamin Cox + 2 e +
2 H+ (1)
Red: DCPox + 2 e + 2 H+ DCPred (2)
Overall: vitamin Cred + DCPox vitamin
Cox + DCPred (3)
 Calculation for Reduced Vitamin C

F V
mg Ascorbic Acid/g = (A-B) x x
E X

A= ml of 2,6-dichloroindophenol for sample titration

B= ml of 2,6-dichloroindophenol for blank
F= mg of ascorbic acid equivalent to 1 ml of indophenol standard solution
V= Initial assay solution volume
E= Number of grams
X= Volume sample aliquot titrated
 Contoh soal
Dilakukan analisis kadar vitamin C dengan titrasi iodometri. 20
gram sampel buah mangga dengan kadar air 25% diekstraksi
vitamin Cnya menggunakan aquadest hingga volume totalnya
250 ml, disaring hingga diperoleh sari buah mangga 240 ml.
Diambil 20 ml sari buah dimasukkan dalam erlenmeyer
ditambah 30 aquadest, ditambah 2 ml indikator amilum dan
dititrasi dengan 0,0097 N larutan Iodin yang telah
distandardisasi. Tentukan kadar vitamin C buah mangga
tersebut dalam wb dan db, jika larutan iodin yang diperlukan
untuk mengadisi ikatan rangkap vitamin C (BM 176.12)
sampel adalah 3.7 ml, blanko 0.1 ml
Jawab: kadar vit C (%wb) = 0.185 % , = 1850 mg/kg bb
Kadar Vitamin C (%db) = 0.246 % = 2460 mg/kg bk
 Contoh soal
Kadar Vitamin C buah salak ditentukan dengan metode 2.6D.
25 gram buah salak dengan kadar air 18% dihancurkan
dengan penambahan aquadest 150 ml. Ekstrak buah salak
yang dihasilkan ditambah aquadest hingga valume totalnya
200 ml, disaring dan diperoleh sari buah salak sebanyak 175
ml. 20 ml sari buah salak, ditambah 30 ml aquadest, dititrasi
dengan larutan 2.6D. Warna merah terbentuk saat 5.4 ml
larutan 2.6D ditambahkan. Jika tiap ml larutan 2.6D
equivalen dengan 0.25 mg vitamin C. Tentukan kadar
vitamin C buah salak tersebut dalam wb dan db.
Jawab:
kadar vitC = 0.473 mg/g bb = 473 mg/ kg bb = 0.047% wb
Kadar Vit C = 0.576 mg/g bk = 576 mg/ kg bk = 0.058 % db
 Vitamin A (Retinol)

CH3 CH3
H3C CH3
OH

Retinol
CH3
b - Carotene and Retinol
CH 3
CH 3 CH 3 CH 3
H3 C

CH 3
CH 3 CH 3 CH 3
CH 3

Oxidation

CH 3 CH 3 O
H3 C CH 3
C H

CH 3 Retainal
- 2H

CH 3 CH 3
H3 C CH 3
CH 2 OH

CH 3 Retinol (Vitamin A)
Vitamin A Activity Determnination in Foods

Vitamin A Activity = b-Carotene + Retinol

Vitamin A and b - Carotene Determination
Food
KOH (Alcoholic)
Saponification

3 hrs. at room temperature

Ether for Extraction
Extract (retinol and b-carotene)

HPLC
 Vitamin A

Column: Nova-Pack C18; 150 x 3.9mm

Eluent : 95:5 Methanol: CH3CN
Detection wavelength: 285 nm
 Thiamin Determination

Pyrimidine Thiazole
H3C N NH2 S CH2CH2OH Mono-, pyro-,
N N or triphosphate.
CH2 CH3
Protein

K 3Fe(CN) 6
Oxidation

H3C N N S CH2CH 2OH

N N
CH2 CH3
measure the absorbance at 435 nm
THIOCHROME (Fluorescent)
Thiamin Determination in Flour

1. 5 g flour
2. 75 ml 0.1 N HCl
3. Make volume to 100 ml
4. Digest at 100oC for 30 min
5. Centrifuge and filter
 Thiamine

Column : 250 x 4.6 mm, Spherisorb

Eluent : 90:10 chloroform:methanol
Wavelength: 435 nm
Penentuan thiamin dapat dilakukan secara fisis dengan pengukuran
fluoresensinya berdasarkan oksidasi thiamin oleh ferrisianida 1% menjadi
thiokrom yang berfluorosensi dengan memancarkan sinar UV. Bila bebas dari
senyawa berpendar lainnya maka tingkat fluoresensi thiamin proporsional
dengan kadarnya. Untuk itu diperlukan standar. Perbandingan konsentrasi
thiamin sampel dengan konsentrasi thiamin standar dapat dihitung sbb:
Konsentrasi thiamin sampel = F (sampel) F (blanko sampel)
Konsentrasi thiamin standar F (standar) F (blanko standar)
Penentuan thiamin juga bisa dilakukan dengan kolorimeter, dengan
mereaksikan thiamin dengan garam reinecke (NH-4-4(Cr(NH3)2)(SCN)4.
H2O) maka akan terbentuk endapan yang dapat dilarutkan dalam aseton dan
dapat diukur kadarnya dengan kolorimeter pada panjang gelombang 525
nm.Untuk perhitungannya diperlukan standar thiamin.

Thiamin juga dapat ditentukan dengan cara gravimetri dengan menimbang

endapan yang terbentuk bila thiamin direaksikan dengan garam reinecke atau
dengan asam tungstosilikat. Cara ini hanya cocok untuk sampel yang banyak
mengandung thiamin yaitu sekitar 50 mg.
Penentuan thiamin dengan volumetric dilakukan dengan menitrasi thiamin
dalam sampel dengan asam tungtosilikat yang telah diketahui konsentrasinya.
Untuk perhitungannya 1 ml asam tugtosilikat 0,05N sebanding dengan 8,43 mg
thiamin hidroklorida = 3,33 x 8,43 IU.
 Water-Soluble Vitamins
2
Pyridoxin

Riboflavin
3

Niacin Thiamin
Inject 4
1

Column: u Bondapak C18

Solvent: M eOH
Sample: Water-Soluble Vitamins
0 5 10 15 20
 Riboflavin Determination

Flavinmononucleotide(FMN)
CH2 OH
Flavoadeninedinucleotide (FAD)
HOCH Flavoprotein
HOCH
HOCH
HCH
CH 3
N N O
8 9 1
7 2
6 10 3
5 4
CH 3 N
O

6,7 Dimethyl-9-D-1-Ribitylisoalloxazine
 Sample Preparation

Autoclave in 0.1 N HCl for 30 min

1. Adjust pH to isoelectric point to precipitate proteins
2. Filter
3. Dilute to 100 ml in volumetric flask
 Penentuan riboflavin dapat dilakukan secara spektrofotometrik,
dengan mengukur absorbansinya dalam larutan netral atau asam
lemah pada sinar Uv: 223, 267, 300 dan 373nm, bila
menggunakan sinar tampak pada 444nm. Untuk menentukan
kadarnya dibuat kurva standar riboflavin.
Penentuan riboflavin dengan fluorometer dilakukan dengan
mengukur fluoresensinya pada 440 500 nm pada pH 6 - 7.
Intensitasnya sebanding dengan kadar riboflavin.
Penentuan riboflavin dengan lumiflavin, dilakukan dengan
memberikan radiasi pada larutan riboflavin dalam suasana alkalis
sehingga berubah menjadi lumiflavin yang larut khloroform.
Lumiflavin ini dapat diukur fluoresensinya pada 513 nm.
Penentuan secara mikrobiologis dengan menggunakan
Lactobacillus casei. Dasarnya adalah bakteri lactobacillus casei
akan merombak riboflavin menjadi asam laktat. Selanjutnya
dapat ditentukan kadarnya dengan titrasi menggunakan NaOH
0,1N.
 Riboflavin Analysis by HPLC

Column: 250 x 4.6 mm 5m; Spherisorb

Eluent : 50:50 methanol : water
Wavelength: 510 nm
 Niacin

O O
C OH C NH2

N N

Ribose Ribose

Nicotinamideadeninedincleotide (NAD)
 Niacin Determination
1. Digestion and Hydrolysis
Autoclave
Sample + Ca(OH) 2 2 Hours

2. PPT Protein with (NH4)2SO4

3. Centrifuge and Filter
4. Rupture of Pyridine Ring with CNBR (Cyanogen Bromide)
5. Color Formation with Sulfanilic Acid
6. Determine the Absorption at 470 nm
7. Plot the Standard Curve of Niacin vs. Concentration
8. (Straight Line of Best Fit)
 Niacine Determination

1 O
O
C OH + CNBr C OH REARRANGEMENT
REARRANGED
RING IS OPENED DERIVATIVE
N N
Br CN

2
O
RERRANGED +
H2 N S OH
DERIVATIVE
O
O
C-OH O
R-N-CH=CH-CH=C-CH=N S OH
O
Niacine Standard Plot

mg Niacin